CN107531759B - 非膜破坏性p53活化装订肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及非膜破坏性的p53活化装订肽以及涉及使用这些肽的癌症治疗方法。在一个实施方案中，所述肽包含TSFXaa₁EYWXaa₃LLXaa₂的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁是(R)‑2‑(7′‑辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)‑2‑(4′‑戊烯基)丙氨酸或其衍生物；以及Xaa₂和Xaa₃独立地是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含TSFXaa₁EYWXaa₃LLXaa₂ENXaa₅的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₃是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸；Xaa₂是S或P或(S)‑2‑(4′‑戊烯基)丙氨酸或(S)‑2‑(4′‑戊烯基)丙氨酸的衍生物，以及其中Xaa₅是F或Y。

Description

非膜破坏性p53活化装订肽

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年2月13日提交的新加坡临时申请No.10201501119W的优先权权益，其内容出于所有目的而在此通过引用整体并入。

技术领域

本发明一般性地涉及蛋白质化学领域。特别地，本发明涉及装订肽的应用。

背景技术

p53:Mdm2相互作用的抑制是一个治疗靶标。能够阻断所述相互作用的分子可以通过阻断Mdm2的两种抑制活性来激活p53应答，所述两种抑制活性即其封闭N-末端p53反式激活结构域和其靶向p53进行泛素化和蛋白酶体降解。这样的分子可用于重新激活p53野生型肿瘤细胞中的p53功能。

已经开发了抑制p53与Mdm2之间的这种相互作用的几类分子(例如Nutlin、MI-219)。这些分子模拟来自p53 N-末端中序列部分的与Mdm2的N-末端p53结合结构域相互作用所必需的保守残基。然而，这些肽对无p53细胞显示出脱靶毒性，并且在血清存在下不具有功能。

因此，需要提供能够抑制p53:Mdm2相互作用的经改进肽。

发明概述

在一个方面，本发明涉及包含TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2的氨基酸序列或由其组成的肽，其中Xaa₁是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或其衍生物；以及Xaa₂和Xaa₃独立地是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸。在另一方面，本发明涉及包含TSFXaa₁EYW Xaa₃LLXaa2ENXaa₅的氨基酸序列或由其组成的肽，其中Xaa₁和Xaa₃是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸；Xaa₂是S或P或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物；以及其中Xaa₅是F或Y。在另一方面，本发明涉及包含TSFXaa₁EYW Xaa₃LLXaa₂的氨基酸序列或由其组成的肽，其中Xaa₁、Xaa₂和Xaa₃独立地选自任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸；以及其中肽的N-末端(即T)与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。

在另一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子，其编码根据前述权利要求中任一项所述的肽。在另一方面，本发明涉及一种载体，其包含如本文所述的分离的核酸分子。在另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含如本文所述的核酸分子或如本文所述的载体。

在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的肽、如本文所述的分离的核酸分子或如本文所述的载体。在一个方面，本发明涉及如本文所述的肽在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及在患者中治疗或预防癌症的方法，其包括施用药物有效量的如本文所述的肽或如本文所述的分离的核酸分子或如本文所述的载体。

附图简述

当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，在附图中：

图1是显示在Mdm2表面上鉴定到的辅助结合位点(圆圈)的图像。来自apo Mdm2的配体映射模拟的苯占据图(网格)覆盖在其与a)p53肽(PDB 1YCR)和b)nutlin-2(PDB 1RV1)的复合物的晶体结构上。

图2示出了描绘延伸的装订肽的设计的图像。a)示出了附加至p53肽(PDB 1YCR)的C-末端的苯基(Phe)残基，使得其与结合在第二nutlin相互作用位点中的苯重叠。b)示出了苯基(Phe)残基附加到SAH-p53-8(PDB 3V3B)的C-末端，使得其与结合在近端Pro27位点中的苯重叠。c)示出了在50纳秒分子动力学(MD)模拟后YS-01的构象。d)示出了在50纳秒分子动力学(MD)模拟后YS-03的构象。

图3示出了在A)不存在10％胎牛血清(FCS)下和B)存在10％胎牛血清(FCS)下进行的YS-01至-04装订肽的鼠T22 p53报道子筛选结果。在不存在血清下(C，E)或存在血清下(D，F)用50μM、25μM或12.5μM肽处理T22细胞或ARN8细胞，并在2小时后确定释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶(LDH)的水平。乳酸脱氢酶(LDH)释放到培养基中指示该肽对细胞膜的不利的去稳定作用。

图4在(A)中示出了T22细胞的western印迹分析的结果，所述T22细胞已经在存在胎牛血清下(+)或不存在胎牛血清下(-)用25μM和50μM的YS-03处理18小时的时间。(B)用于确定在不存在胎牛血清下和存在胎牛血清下YS-03和YS-04的IC₅₀值的滴定曲线。

图5示出了与YS-01和YS-02结合的Mdm2的晶体结构的图像。(a)示出了与YS-01结合的Mdm2；(b)示出了与YS-02结合的Mdm2。(c)示出了YS-02的Tyr30与Mdm2的近端Pro27位点的结合，其中氢键以虚线表示。

图6示出了将YS-02与其他肽进行比较的棒状图。YS-02与(A)野生型(WT)p53(PDB1YCR)以及(B)M06(PDB 4UMN)和SAH-p53-8(PDB 3V3B)的比较。

图7示出了描绘在A)存在10％胎牛血清(FCS)下和B)不存在10％胎牛血清(FCS)下进行并与YS-01和02类似物肽比较的YS-07、YS-08、YS-09和YS-10装订肽的鼠T22 p53报道子筛选的数据的图。在不存在血清下(C)用50μM、25μM或12.5μM肽处理T22细胞，并在2小时后，确定释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶(LDH)的水平。还在不存在血清下(D)用50μM、25μM或12.5μM的肽处理人ARN8细胞，并还在2小时后确定其释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶(LDH)的水平。用于确定T22 p53报道子细胞系中在不存在胎牛血清下和存在胎牛血清下YS-07至YS-10的IC₅₀值的滴定曲线(线图E和F)。

图8示出了描绘在无血清条件下针对ARN8细胞滴定并确定其相应的p53活性和乳酸脱氢酶(LDH)释放水平的YS-07(A)和YS-09(B)的图。所得曲线重叠(浅色曲线表示p53活性，深色曲线表示乳酸脱氢酶释放)。在不存在血清下(C)或存在血清下(D)用50μM、25μM或12.5μM的YS-07、sMTIDE-02和Nutlin处理T22和ARN8细胞，并在2小时后确定其释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶的水平。确定YS-07在不同血清条件下在T22和ARN8报道子细胞系中激活p53的活性，并与Nutlin和sMTIDE-02进行比较：(E)在无血清条件下的T22细胞，(F)具有10％血清的T22细胞，(G)在无血清条件下的ARN8细胞，以及(H)具有10％血清的ARN8细胞。细胞处理18小时。

图9示出了在50纳秒分子动力学(MD)模拟期间与a)YS-01、b)YS-02、c)YS-03和d)YS-04的MDM2复合物的原子位置的Cα均方根偏差(RMSD)的数据。对每种复合物使用两种不同的初始结构。

图10示出了YS-01至06变体肽的圆二色谱。

图11示出了装订肽的2F_o-F_c电子密度图。示出了(A)YS-01和(B)YS-02的图，并且其以1.3σ为等高线。蛋白质A和肽F均显示在两个图中。在两种装订肽上都观察到良好密度，除Glu28和Asn29的侧链之外，其显示出有限的密度。

图12示出了Mdm2/YS-01结构的不对称单元的带状图像，突出了链A和B之间的链交换。由于晶体接触，这种交换不会发生在链C和D中。

图13示出了在晶体结构中Mdm2-YS-01复合物(白色)与链交换二聚体(灰色)在100纳秒分子动力学(MD)模拟结束时轨迹结构的比较结果。轨迹结构和链交换配偶体二者的Mdm2 N-末端盖显示为围绕Phe30(白色棒)支架。

图14示出了描绘在A)存在10％胎牛血清(FCS)下和B)不存在10％胎牛血清(FCS)下进行并与YS-01和02脯氨酸类似物肽比较的P27S突变携带钉书肽(YS-05至-06)的鼠T22p53报道子筛选的图。在不存在血清下(C)或存在血清下(D)用50μM、25μM或12.5μM的肽处理T22细胞，并在2小时后确定释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶的水平。还在存在血清下(E)或不存在血清下(F)用50μM、25μM或12.5μM的肽处理人ARN8细胞，并还在2小时后确定其释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶(LDH)的水平。

定义

如本文所定义，术语“肽”、“蛋白质”、“多肽”和“氨基酸序列”在本文中可互换使用，是指任意长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包含经修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且其可以被除氨基酸之外的化学部分中断。该术语还包括已经天然或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。术语肽包含通过共价键(例如酰胺键)连接的两个或更多个天然存在或合成的氨基酸。

在本公开内容的上下文中，术语“氨基酸”定义为具有至少一个伯、仲、叔或季氨基和至少一个酸基，其中酸基可以是羧酸、磺酸或磷酸，或其混合物。相对于酸基，氨基可以为“α”、“β”、“γ”至“ω”。合适的氨基酸包括但不限于在肽中发现的20种常见天然存在氨基酸(例如A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V(如单字母或三个字母缩写所知))以及通过有机合成或其他代谢途径制备的天然存在和非天然存在氨基酸的D和L-异构体

“氨基酸”的骨架可以被选自卤素、羟基、胍基、杂环基的一个或更多个基团取代。因此，术语“氨基酸”在其范围内还包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸和组氨酸、牛磺酸、甜菜碱、N-甲基丙氨酸等。包括氨基酸的(L)和(D)形式。

术语“氨基酸侧链”是指与氨基酸的α-碳连接的部分。例如，丙氨酸的氨基酸侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧链是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸侧链是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟基苯基甲基等等。还包括其他非天然存在的氨基酸侧链，例如天然存在的那些(例如，氨基酸代谢物)或合成制备的那些(例如，α二取代的氨基酸)。

本文使用的术语“翻译后修饰”是指在蛋白质上发生的通常在其核糖体翻译完成之后通常由酶催化的修饰。翻译后修饰通常是指如在磷酸化和类泛素化中向蛋白质共价添加官能团，而且还指蛋白质在功能上成熟所必需的蛋白水解加工和折叠过程。蛋白质翻译后修饰通过官能团或蛋白质的共价添加、调节性亚基的蛋白水解切割或整个蛋白质的降解来提高蛋白质组的功能多样性。这些修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂化和蛋白水解，并且影响正常细胞生物学和发病机理的几乎所有方面。翻译后修饰可以在蛋白质的“生命周期”的任何步骤中发生。例如，许多蛋白质在翻译完成后不久被修饰，以介导适当的蛋白质折叠或稳定性，或者将新生蛋白质引导到不同的细胞区室(例如细胞核或细胞膜)。在折叠和定位完成后发生其他修饰以激活或失活催化活性或者以其他方式影响蛋白质的生物活性。蛋白质通常与靶向蛋白质降解的标签共价连接。除单修饰之外，还通常通过蛋白质成熟或活化的逐步机制经由翻译后切割和官能团添加的组合来对蛋白质进行修饰。根据修饰的性质，蛋白质翻译后修饰也可以是可逆的。例如，激酶在特定氨基酸侧链使蛋白质磷酸化，这是催化激活或失活的常见方法。相反，磷酸酶可以水解磷酸基团以将其从蛋白质中除去，从而逆转所述蛋白质的生物活性。肽键的蛋白水解切割是热力学上有利的反应，并且因此永久性地去除肽序列或调节结构域。

本文使用的术语“交联接头”或其语法变化形式是指两个肽结构域(即例如螺旋肽的两个环)的分子内连接(也称为“钉”)。当肽具有螺旋二级结构时，交联接头是大环，其是外源核心(不是核心的部分)或固有(非交联)螺旋肽结构。大环可以包含全烃键环，并且包含与肽的至少两个氨基酸的α-碳连接的侧链。大环的大小由环中螺旋肽氨基酸的数量和连接肽的至少两个氨基酸的α-碳的部分中的碳基团的数量决定。交联肽具有至少一个交联接头。在不同实例中，交联肽具有1、2或3个或者至少1、2或3个交联接头。在一个实例中，本文公开的肽仅包含一个接头。

交联肽(即，装订肽)是这样的肽：包含选定数量的标准(天然)或非标准(不是天然或非天然或合成)氨基酸，还包含至少两个能够进行必要反应以促进碳-碳键形成的部分，其已经与试剂接触以在至少两个部分之间产生至少一个交联。至少两个部分之间的这种交联可以调节例如肽稳定性。

可以使用本领域已知的任何交联接头。示例性的交联接头可以包括但不限于烃键、一种或更多种醚、硫醚、酯、胺或酰胺部分。在一些情况下，可以向交联接头中并入天然存在的氨基酸侧链。例如，可以是交联接头与例如丝氨酸中羟基、半胱氨酸中硫醇、赖氨酸中伯胺、天冬氨酸或谷氨酸中酸或者天冬酰胺或谷氨酰胺中酰胺的官能团偶联。因此，还可以使用天然存在的氨基酸产生交联，而不是使用通过偶联两个非天然存在氨基酸产生的交联接头。还可以将单非天然存在氨基酸与天然存在氨基酸一起使用。

因此，烃键的一个实例是使用烯烃。本文使用的术语“烯烃”及其语法变化形式(也称为烯或烯基)表示由直链或支链烃部分衍生的单价基团，其通过除去单个氢原子而具有至少一个碳-碳双键。烯基部分包含指定数目的碳原子。例如，C₂-C₁₀表示可以具有2至10个(包括端值)碳原子的基团。这意指其具有C2、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀烯基。术语“低级烯基”是指C₂-C₈烯基链。这意指其具有C2、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇或C₈低级烯基。在不存在任何数字表示的情况下，“烯基”是具有2至20个(包括端值)碳原子的链(直链或支链)。

烯烃基团包括例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等，其可以具有一个或个多个取代基。烯烃基团取代基包括但不限于本文所述导致形成稳定部分的任何取代基。取代基的实例包括但不限于以下基团：脂族、烷基、烯族、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫代氧代、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤素、脂族氨基、杂脂族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷基芳基、芳基烷基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫氧基、杂脂族硫氧基、烷基硫氧基、杂烷基硫氧基、芳基硫基、杂芳基硫氧基、酰氧基等，其各自可以被进一步取代或可以不被进一步取代。

术语“烷基”在其含义内包括具有1至10个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的单价(“烷基”)和二价(“亚烷基”)直链或支链饱和脂族基团。例如，术语烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1,2-二甲基戊基、1,3-二甲基戊基、1,4-二甲基戊基、1,2,3-三甲基丁基、1,1,2-三甲基丁基、1,1,3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基等。

术语“烯基”在其含义内包括单价(“烯基”)和二价(“亚烯基”)直链或支链不饱和脂族烃基，其具有2至10个碳原子，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，并且在烷基链中的任意位置具有至少一个E、Z、顺式或反式立体化学(如果适用)的双键。烯基的实例包括但不限于次乙基、乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1,3-戊二烯基、2,4-戊二烯基、1,4-戊二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、2-甲基戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、1-癸烯基等。

本文使用的术语“炔基”在其含义内包括具有2至10个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)碳原子并且在碳链中的任意位置具有至少一个三键的单价(“炔基”)和二价(“亚炔基”)直链或支链不饱和脂族烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-甲基-2-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、甲基戊炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基、1-壬基、1-癸炔基等。

本文使用的术语“环烷基”是指环状的饱和脂族基团，并且在其含义内包括具有3至10个碳原子，例如3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的单价(“环烷基”)和二价(“亚环烷基”)的饱和的单环、双环、多环或稠合多环烃基。环烷基的实例包括但不限于环丙基、2-甲基环丙基、环丁基、环戊基、2-甲基环戊基、3-甲基环戊基、环己基等。

本文使用的术语“杂环烷基”在其含义内包括单价(“杂环烷基”)和二价(“亚杂环烷基”)的饱和的单环、双环、多环或稠合烃基，其具有3至10个环原子，例如3、4、5、6、7、8、9或10个环原子，其中1至5个环原子(例如1、2、3、4或5个环原子)是选自O、N、NH或S的杂原子。实例包括吡咯烷基、哌啶基、奎宁环基、氮杂环丁烷基、吗啉基、四氢噻吩基、四氢呋喃基、四氢吡喃基等。

本文使用的术语“杂芳族基团”和变体如“杂芳基”或“亚杂芳基”在其含义内包括单价(“杂芳基”)和二价(“亚杂芳基”)的单、多核、共轭和稠合芳族基团，其具有6至20个原子，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子)，其中1至6个原子(例如1、2、3、4、5或6个原子)是选自O、N、NH和S的杂原子。这样的基团的实例包括吡啶基、2,2'-联吡啶基、菲咯啉基、喹啉基、噻吩基等。

本文使用的术语“卤素”或变化形式如“卤化物”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。

本文使用的术语“杂原子”或变化形式如“杂-”是指O、N、NH和S。

本文使用的术语“烷氧基”是指直链或支链烷氧基。实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基等。

本文使用的术语“氨基”是指-NR_aR_b形式的基团，其中R_a和R_b独立地选自包括但不限于氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基和任选取代的芳基。

本文使用的术语“芳族基团”或变化形式如“芳基”或“亚芳基”是指芳族烃的单价(“芳基”)和二价(“亚芳基”)的单、多核、共轭和稠合残基，其具有6至10个(例如6、7、8、9或10个)碳原子。这样的基团的实例包括苯基、联苯基、萘基、菲基等。

本文使用的术语“芳烷基”在其含义内包括与二价的饱和直链和支链亚烷基连接的单价(“芳基”)和二价(“亚芳基”)单、多核、共轭和稠合芳烃基。

本文使用的术语“杂芳烷基”在其含义内包括与二价的饱和直链和支链亚烷基连接的单价(“杂芳基”)和二价(“亚杂芳基”)单、多核、共轭和稠合芳烃基团。

本文使用的术语“任选取代的”意指该术语所指的基团可以是未取代的，或可以独立地被选自但不限于以下的一个或更多个基团取代：烷基、烯基、炔基、硫代烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤代、羧基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫代烷氧基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔基氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰氨基、二酰氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基亚磺酰基、烷基羰氧基、烷硫基、酰硫基、含磷基团如膦酰基和氧膦基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、C(O)NH(烷基)和C(O)N(烷基)₂。

本文包括本文公开的化合物的所有异构体形式，包括所有非对映异构体、外消旋体和对映体。因此，本文公开的肽应理解为包括例如但不限于化合物的E、Z、顺式、反式、(R)、(S)、(L)、(D)、(+)和/或(-)形式，当在每种情况下适当时。

术语“取代的”旨在表示使用“取代的”的表述中所指基团上的一个或更多个(例如，1、2、3、4或5个；在一些实施方案中1、2或3个；以及在另一些实施方案1或2个)氢原子被来自指示的有机或无机基团的选择取代或者被本领域技术人员已知的合适的有机或无机基团取代，条件是不超过所指原子的正常化合价，并且取代产生稳定的化合物。合适的指示的有机或无机基团包括例如烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、芳基、杂芳基、杂环、环烷基、烷酰基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟甲硫基、二氟甲基、酰基氨基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、羧基烷基、酮基、硫代、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基甲硅烷基和氰基。另外地，合适的指示的基团可以包括例如—X、—R、—O-、—OR、—SR、—S—、—NR₂、—NR₃、═NR、—CX₃、—CN、—OCN、—SCN、—N═C═O、—NCS、—NO、—NO₂、═N₂、—N₃、NC(═O)R、—C(═O)R、—C(═O)NRR—S(═O)₂O-、—S(═O)₂OH、—S(═O)₂R、—OS(═O)₂OR、—S(═O)₂NR、—S(═O)R、—OP(═O)O₂RR、—P(═O)O₂、RR—P(═O)(O-)₂、—P(═O)(OH)₂、—C(═O)R、—C(═O)X、—C(S)R、—C(O)OR、—C(O)O-、—C(S)OR、—C(O)SR、—C(S)SR、—C(O)NRR、—C(S)NRR、—C(NR)NRR，其中每个X独立地为卤素(或“卤代”基团)：F、Cl、Br或I；以及每个R独立地为H、烷基、芳基、杂环、保护基或前药部分。如本领域技术人员将容易理解的，当取代基是酮基(即，＝O)或硫代(即，＝S)等时，则被取代原子上的两个氢原子被取代。

化合物可以包含一个或更多个不对称中心，并且因此作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单独非对映体和非对映体混合物存在。这些化合物的所有这些异构体形式均明确地包括在内。化合物也可以以多种互变异构体形式表示，在这样的情况下，本文所述化合物的所有互变异构体形式均明确地包括在内(例如，环系的烷基化可导致多个位点的烷基化，所有这些反应产物均明确地包括在内)。这样的化合物的所有这样的异构体形式均明确地包括在内。本文所述化合物的所有晶形都均明确地包括在内。

提供了编码本文公开的肽的分离的核酸分子。此外，本公开内容还提供了编码用作本文所公开肽的模板的肽的核酸分子。由于遗传密码的简并性允许通过指定相同氨基酸并因此产生相同蛋白质的其他密码子取代某些密码子，因此本公开内容不限于特定核酸分子，而是包括所有包含编码肽的核苷酸序列的所有核酸分子。由核酸分子编码的肽可以被化学或酶修饰以获得如本文所述的交联肽。

本文公开的核酸分子可以包含编码用作本文所公开肽的模板的肽的核苷酸序列，其可以与调节序列可操作地连接以允许表达核酸分子。如果核酸分子如DNA包含含有转录和翻译信息的调节核苷酸序列并且这样的序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，则其被认为是“能够表达核酸分子或编码核苷酸序列”或者能够“允许表达核苷酸序列”。可操作连接是其中调节DNA序列和试图表达的DNA序列以例如允许基因序列表达的方式连接的连接。基因序列表达所需的调节区的精确性质可因生物体而异，但通常应包括启动子区，其在原核生物中仅含有启动子或者引导RNA转录起始的启动子以及当转录成RNA时将传导合成起始信号的DNA序列二者。这样的区域通常包括位于待表达核苷酸序列的5'和3'并且参与转录和翻译起始的非编码区，例如TATA框、加帽序列和CAAT序列。这些区域可以例如还含有增强子序列或翻译的信号和前导序列，其用于将产生的多肽靶向至用于产生上述肽的宿主细胞的特定区室。

包含编码本文所公开肽的核苷酸序列的核酸分子可以包含在载体，例如表达载体中。除上述调节序列和上述编码肽的核酸序列之外，这样的载体还可以包含编码限制性切割位点的序列，其5'和/或3'方向上邻近编码肽的核酸序列。这种载体还可以允许引入编码待表达蛋白质或蛋白质部分的另一核酸序列。表达载体优选地还含有复制位点和控制序列，其来源于与用于表达的宿主相容的物种。表达载体可以基于本领域技术人员公知的质粒，例如pBR322、puC16、pBluescript等。

可以将含有核酸分子的载体转化到能够表达基因的宿主细胞中。转化可以根据标准技术进行。因此，本公开内容还涉及含有如上限定的核酸分子的(重组)宿主细胞。在本文中，可以将转化的宿主细胞在适于表达编码上述肽的核苷酸序列的条件下培养。可以在无血清条件下以及任选地在不含任何动物来源的蛋白质/肽的培养基中建立、适应和完全培养宿主细胞。市售的培养基如RPMI-1640(Sigma)、经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Sigma)、最低必需培养基(MEM；Sigma)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、无血清CHO培养基(Sigma)和无蛋白质CHO培养基(Sigma)是示例性的合适营养溶液。任何培养基可以根据需要补充有多种化合物，其实例是激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等同能源、抗生素、微量元素。还可以包含本领域技术人员已知的合适浓度的任何其他必需补充剂。

术语“可药用盐”是指如上所述的肽的生理学上可接受的和可药用的盐；即保留肽的期望生物活性并且不会对其产生不期望的毒理作用的盐。这样的可药用盐的实例包括但不限于：(a)与例如钠、钾、铵、镁、钙、多胺(例如精胺和亚精胺)等阳离子形成的盐；(b)与无机酸形成的酸加成盐、所述无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸等；(c)与有机酸形成的盐，所有有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；以及(d)由例如但不限于氯、溴和碘的元素阴离子形成的盐。

本文限定的“治疗性”化合物是这样的化合物(或药剂或分子或组合物)，其能够预防性地起作用以预防发生弱化和/或不健康状态；和/或向对象提供足够量的其复合物或药物组合物或药物以减轻或消除疾病状态和/或疾病状态的症状以及弱化和/或不健康状态。因此，在一个实例中，用所要求保护的化合物治疗对象的方法可包括以治疗有效量施用所述化合物。

术语“治疗”是指以任何方式补救疾病状态或症状、预防疾病建立或者另外预防、阻碍、延缓或逆转疾病进展或其他不期望症状的任何用途和所有用途。

本文使用的术语“治疗”旨在提供药物有效量的肽或其相应的药物组合物或药物，其足以预防性地起作用以预防发生弱化和/或不健康状态；和/或向对象提供足够量的其复合物或药物组合物或药物以减轻或消除疾病状态和/或疾病状态的症状以及弱化和/或不健康状态。

在本发明的上下文中，术语“治疗有效量”和“诊断有效量”在其含义内包括足够但无毒量的化合物或组合物以提供期望的治疗或诊断效果。所需的确切量将根据例如以下因素而因对象而异：所治疗对象的物种、对象的年龄和一般状况、所治疗病症的严重程度、施用的具体药剂、施用模式等等。因此，不能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定情况，本领域普通技术人员仅使用常规实验就可确定合适的“有效量”。

本文使用的术语“低表达”表示包含p53的复合物中蛋白质的表达水平低于从未患疾病或健康患者分离或培养的细胞中发现的水平。例如，与患者的非癌细胞中或从健康患者分离的细胞中的p53表达水平相比，从癌症患者分离的癌细胞中可发现p53的抑制，其中细胞属于具有相同的组织学、形态学、物理学和生物学特征的同一组群，例如但不限于肝细胞、角质形成细胞和肺细胞。

本文使用的术语“抑制”表示在包含p53的复合物中蛋白质的酶促、生物、动力学或任何可测量活性的水平低于从未患疾病、病症或任何疾患的健康患者分离或培养的细胞中发现的水平。例如，与患者的非癌细胞中或从健康患者分离的细胞中p53蛋白的活性水平相比，从癌症患者分离的癌细胞中可发现p53的抑制，其中细胞属于具有相同的组织学、形态学、物理学和生物学特征的同一组群。

在本公开内容的上下文中，术语“施用”及该术语的变化形式包括通过任何合适的方式向生物体或表面接触、施加、递送或提供化合物或组合物。

发明详述

p53:Mdm2相互作用的抑制是有吸引力的治疗靶标。能够阻断所述相互作用的分子可以通过阻断Mdm2的两种抑制活性来激活p53应答，所述两种抑制活性即其封闭N-末端p53反式激活结构域和其靶向p53进行泛素化和蛋白酶体降解。这样的分子可用于重新激活p53野生型肿瘤细胞中的p53功能。肿瘤抑制蛋白p53是一种通过诱导细胞周期阻滞、凋亡或衰老而在协调针对多种应激信号的细胞应答中起重要作用的转录因子。p53的活性由E3-泛素连接酶Mdm2调节。Mdm2通过阻止p53与一般转录机制相互作用和靶向p53进行泛素介导的降解来抑制p53。Mdm2通过至少两个区域与p53相互作用：p53的N-末端与Mdm2的N-末端结构域相互作用，以及p53的DNA结合结构域与Mdm2的酸性结构域相互作用。Mdm2在许多癌症中过表达，并且被认为是p53野生型(WT)肿瘤中p53网络失活的主要原因之一。

肽模拟物代表靶向eIF4E:eIF4G相互作用的一种替代方法。处于其天然状态的蛋白质被折叠成二级结构的区域，例如螺旋、折叠和转角。α-螺旋是蛋白质中发现的最常见结构基序之一，并且很多生物学上重要的蛋白质相互作用由一种蛋白质与另一种蛋白质的α-螺旋区域的相互作用介导。然而，α-螺旋具有解开和形成无规卷曲的倾向，其在大多数情况下在生物学上活性较低或甚至无活性、对其靶标具有较低的亲和力、具有降低的细胞摄取并且高度易于进行蛋白水解降解。因此，与由p53野生型序列衍生的化合物相比，本文所述的肽在p53活化和蛋白质-蛋白质相互作用测定中表现出更大的效力。本文提供了用于与Mdm2/Mdm4结合并激活p53应答的肽和交联肽的示例性非限制性实施方案。

因此，p53:Mdm2相互作用的抑制是有吸引力的治疗靶标。这种相互作用的拮抗剂可以通过阻断Mdm2的两种p53抑制活性来激活p53应答，所述两种抑制活性即其封闭N-末端p53反式激活结构域和其靶向p53进行泛素化和蛋白酶体降解。已经显示这种活化进而稳定并激活p53的转录活性，导致细胞死亡或G1/G2细胞周期停滞。p53:Mdm2相互作用拮抗剂的第二潜在治疗应用是循环治疗(cyclotherapy)，其中它们在正常增殖中细胞中诱导可逆细胞周期阻滞的能力可以选择性地保护这些组织免受细胞毒性化学治疗剂和电离辐射，从而能够使p53无效肿瘤或p53突变肿瘤的治疗具有较少副作用。因此，在一个实例中，本公开内容描述了本文所述的肽的施用，其中所述肽的施用在非癌性增殖中细胞中诱导可逆的细胞周期停滞。

已经开发了抑制p53与Mdm2之间的这种相互作用的几类分子。这些分子模拟来自p53 N-末端中序列部分、与Mdm2的N-末端p53结合结构域相互作用所必需的保守残基。该短序列在结合之后形成α-螺旋，其允许Mdm2结合基序(FXXXWXXL)的三个保守残基最佳地嵌入位于Mdm2和同源Mdm4蛋白表面上的疏水性结合槽中。因此，在一个实例中，本公开内容描述了一种肽，其长度为至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个或更多个氨基酸、4至15个氨基酸、5至10个氨基酸、10至15个氨基酸、约4个氨基酸、约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸或约15个氨基酸。在另一个实例中，肽不具有任选的接头，即其不包含任选的接头或是不含接头肽。在另一个实例中，肽包含任选的接头。在一个实例中，肽(无任选的接头)的长度为4至15个氨基酸。在另一个实例中，不含接头肽的长度为4至15个氨基酸。

据报道，由野生型p53序列衍生的装订肽与Mdm2和Mdm4结合并激活细胞中的p53应答。然而，据报道野生型p53肽(E1TFSDLWKLLP¹¹E；SEQ ID NO:26)对Mdm2/Mdm4的亲和力低(分别为452±11nM和646±26nM)，并且来自p53的已知与很多其他蛋白质相互作用的区域。广泛的研究已经使用噬菌体展示来选择以高亲和力结合Mdm2的线性肽。然而，在Mdm2:肽复合物的晶体结构中的电子密度图中没有观察到第P12位的脯氨酸，并且其对于与Mdm2的结合不是关键的。因此，进行野生型p53肽的修饰。因此，在一个实例中，本公开内容描述了包含TSFXaa₁EYWXaa₃LLXaa₂的氨基酸序列或由以其组成的肽。在另一个实例中，所述肽可以包含TSFXaa₁EYWXaa₃LLXaa₂的氨基酸序列或由以其组成。在一个实例中，Xaa₁是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或其衍生物。在另一个实例中，Xaa₁可以是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或其衍生物；以及Xaa₂和Xaa₃可以独立地是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸。在一个实例中，Xaa₃可以是但不限于A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。在另一个实例中，Xaa₂可以是但不限于S或P或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。在另一个实例中，Xaa₃可以是N或A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。在另一个实例中，Xaa₃可以是但不限于N或A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物；以及其中如果Xaa₃是N，则Xaa₁不是A和/或Xaa₂不是S。在另一个实例中，Xaa₃可以是A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。在另一个实例中，本文公开的肽还可包含含有与其C-末端(即例如Xaa₂)结合的氨基酸-ENXaa₅的序列，产生：TSFXaa₁EYW Xaa₃LLXaa₂ENXaa₅。在另一个实例中，Xaa₅可以是F或Y。在另一个实例中，Xaa₅是F。在另一个实例中，Xaa₅是Y。在另一个实例中，所述肽可以包含TSFXaa₁EYWXaa₃LLXaa₂的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁、Xaa₂和Xaa₃独立地选自任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸；以及其中所述肽的N-末端(例如T)与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。

在另一个实例中，所述肽可以包含根据式I或式II的序列：

其中取代基如下限定。这种限定也理解为还包括本文所述取代基的组合。在一个实例中，R₁是-C(OH)CH₃[T]。在另一个实例中，R₂是-CH₂OH[S]。在另一个实例中，R₃是苄基[F]。在另一个实例中，R₄和R₁₁独立地选自但不限于H或C₁至C₁₀烷基、或烯基、或炔基、或芳基烷基、或环烷基烷基、或杂芳基烷基、或杂环基烷基。在一个实例中，R₅是-(CH₂)₂C(O)OH[E]。在另一个实例中，R₆是-CH₂-苯基-OH[Y]。在另一个实例中，R₇是Trp(色氨酸)的侧链。在另一个实例中，R₇是Trp(色氨酸)的侧链，其中Trp(色氨酸)的C₆被氢或卤素取代。在另一个实例中，Trp可以独立地是L或D光学异构体。在另一个实例中，R₈是任意氨基酸的侧链。在一个实例中，R₉和R₁₀是-CH₂CH(CH₃)₂[L]。在另一个实例中，R是烷基、烯基、炔基；[R’–B–R”]_n；其各自可以被0至6个R₁₂取代。因此，在一个实例中，R’和R”可以独立地是但不限于亚烷基、亚烯基或亚炔基。在另一个实例中，每个R₁₂可以独立地为但不限于卤代、烷基、OR₁₃、N(R₁₃)₂、SR₁₃、SOR₁₃、SO₂R₁₃、CO₂R₁₃、R₁₃、荧光部分或放射性同位素。在另一个实例中，B独立地选自但不限于O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₁₃。在另一个实例中，每个R₁₃可以独立地为H、烷基或治疗剂。在另一个实例中，n是1至4的整数(例如1、2、3或4)。在另一个实例中，R₄和R₁₁独立地为H或C₁至C₆烷基。在另一个实例中，R可以是直链烷基、烯基或炔基。在另一个实例中，R可以是C₈烷基或C₁₁烷基。在另一个实例中，R是烯基。在另一个实例中，R可以是C₈烯基或C₁₁烯基。在另一个实例中，R₁、R₂、R₃、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀如前限定，其中R₄和R₁₁是H，以及其中R是C₁₁烯基。

在另一个实例中，本公开内容描述了包含如式III或式IV所示的序列的肽：

其中取代基如下限定。这种限定理解为还包括所述取代基的组合。在一个实例中，R₁至R₁₁如本文所述。在另一个实例中，每个R₁₃独立地选自但不限于卤代、烷基、OR₁₄、N(R₁₄)₂、SR₁₄、SOR₁₄、SO₂R₁₄、CO₂R₁₄、R₁₄、荧光部分或放射性同位素。在另一个实例中，B独立地选自但不限于O、S、SO、SO₂、CO、CO₂、CONR₁₄。在另一个实例中，每个R₁₄独立地为H、烷基或治疗剂。在另一个实例中，n是1至4的整数。在另一个实例中，R₁₂是-(CH₂)₂C(O)OH[E]。在另一个实例中，R₁₅是-CH₂C(O)NH₂[N]。在另一个实例中，R₁₆独立地是苄基[F]或-CH₂-苯基-OH[Y]。在另一个实例中，所述肽包含选自但不限于以下的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10。

在另一个实例中，本公开内容描述了包含式V或式VI的序列的肽：

其中取代基如下限定。这种限定理解为还包括所述取代基的组合，在此取代基如本文所述。

在一个实例中，本文公开的肽可以包含至少1个、至少2个或更多个卤素。在另一个实例中，所述肽包含约1、约2、约3、约4、或约5个卤素。在一个实例中，本文公开的肽的W可以通过添加独立地选自但不限于F或Cl或Br或I的一个或更多个卤素来修饰。在另一个实例中，卤素是Cl。在另一个实例中，W在如本文所限定的肽的第7位。在另一个实例中，通过添加例如卤素来修饰本文所述的肽的第7位的W。在另一个实例中，本文所述的肽的第7位的W通过在W的C₆位添加例如卤素来修饰。在另一个实例中，W可以独立地为L或D旋光异构体。

本公开内容还描述了长度为例如14个氨基酸的肽。在一个实例中，所述肽包含TSFXaa₁EYW Xaa₃LLXaa₂ENXaa₅的氨基酸序列或由其组成。在一个实例中，Xaa₁和Xaa₃为任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸。在另一个实例中，Xaa₂选自但不限于S或P或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。在另一个实例中，Xaa₅可以是F或Y。在一个实例中，所述肽包含TSFXaa₁EYW Xaa₃LLXaa₂ENXaa₅的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa₁和Xaa₃为任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸，Xaa₂选自但不限于S或P或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物，以及Xaa₅是F或Y。在一个实例中，Xaa₃选自但不限于N或A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。在另一个实例中，如果Xaa₃是N，则Xaa₁不是A和/或Xaa₂不是S。在另一个实例中，Xaa₃是N或A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物；以及其中如果Xaa₃是N，则Xaa₁不是A和/或Xaa₂不是S。在一个实例中，Xaa₁是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或其衍生物。在另一个实例中，Xaa₃是A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。

已经开发了Mdm2:p53相互作用的至少四种小分子拮抗剂以实现应用于临床试验：RG-7388、MI-888、AMG 232和SAR。这些小分子拮抗剂中各自都模拟来自p53 N-末端区域、与Mdm2的N-末端p53结合结构域相互作用所必需的保守残基。该N-末端区域在结合之后形成α-螺旋，使得Mdm2结合表位(F₁₉SDLW₂₃KLL₂₆；SEQ ID NO:24)的三个保守残基能够最佳地嵌入位于Mdm2和同源Mdm4蛋白上的同源疏水性结合槽。

开发蛋白质:蛋白质相互作用的小分子拮抗剂的一种替代方法是合成对应于连续表位的短线性肽，其可以竞争性地结合受体上的同源位点。这样的短线性肽还能够容易地通过标准化学修饰以实现亲和力。还有证据表明，借助于其与靶标的大量接触，其可以本来地不太容易发生结合位点的抗性突变，例如使得靶标中任何一个氨基酸的突变不可能对亲和力及其固有柔性具有大影响，这允许肽通过位姿和构象的微妙变化来补偿结合位点突变。

然而，与小分子不同，线性肽对蛋白水解切割敏感、在靶标接合之前缺乏限定的构象，并且细胞可渗透性差。当肽在其生物活性构象中为α-螺旋时，这些缺点可以通过称为化学装订的方法来克服，其中通过引入合适的共价键来使α-螺旋肽在特定表面上暴露的残基的侧链连接。已经将多种装订肽与Mdm2共结晶，揭示疏水性钉还与靶标的表面相互作用，增强由Mdm2结合表位的三个保守残基介导的相互作用。

很多蛋白质-蛋白质相互作用涉及在结合时形成界面α-螺旋的连续蛋白质部分。有利地，这种构象可以通过称为装订的化学方法进一步稳定，其由全烃大环桥连接螺旋的相邻圈组成。装订肽可以通过降低结合的熵成本来提高其亲和力、通过提高其蛋白水解稳定性来延长其体内半衰期，以及最显著地允许其有效的细胞摄取和细胞内活性。因此，本公开内容有利地选择了上述对Mdm2/Mdm4具有高亲和力的肽以例如通过装订进一步提高其稳定性、防止蛋白水解切割及其细胞摄取。

因此，在一个实例中，本公开内容描述了本文所述的肽，其中所述肽可以是具有使第一氨基酸Xaa₁与第二氨基酸Xaa₂连接的交联接头的交联肽；或者所述肽是具有使第一氨基酸Xaa₁与第二氨基酸Xaa₃连接的交联接头的交联肽。在一个实例中，所述肽是具有使第一氨基酸Xaa₁与第二氨基酸Xaa₂连接的交联接头的交联肽。在另一个实例中，所述肽是具有使第一氨基酸Xaa₁与第二氨基酸Xaa₃连接的交联接头的交联肽。

结构研究还显示Mdm2的肽结合口袋是构象上高度塑性的。以其未结合形式，Mdm2的结合口袋比当其与肽或小分子拮抗剂复合时浅得多。以其结合形式，当与短肽或小分子抑制剂复合时，Mdm2结合口袋被盖的螺旋“铰链”区(第20至24位残基，从起始甲硫氨酸作为1号残基开始计数)包围。然而，较大且体积较大的分子在立体上阻挡“铰链”螺旋采取这种构象。这导致Mdm2表面上的肽结合槽的打开和延伸。装订肽(例如M06，Mdm2的有效细胞可渗透性抑制剂)与Mdm2形成复合物，其中“铰链”螺旋不被置换。相比之下，野生型(WT)p53肽具有更长的Mdm2结合序列，由此结合的肽的C-末端形成延伸的链结构。因此，铰链区对结合口袋的包围在立体上防止闭合。

利用计算机技术，在结合的M06:Mdm2复合物的C-末端附近鉴定到两个相互作用口袋，其中铰链螺旋未包围结合口袋。然后，合理地延伸野生型p53肽和称为sMTide-02的M06肽变体以利用这些推定的口袋来提高M06对Mdm2的亲和力。然后，在生物物理和结构上表征这些设计策略以验证计算机建模和模拟。此外，然后测试称为sMTIDE的新肽变体的细胞活性。这是为了评估针对与Mdm2结合而优化装订肽是否改善其细胞内活性。然后，如下进一步改进这些肽变体：通过添加带正电荷的N-末端来扰乱其生理化学特征，然后仔细评价其改善的生物活性以及在血清存在或不存在下产生的任何毒性副作用。

本公开内容基于通过噬菌体展示文库鉴定的药理学特性改善的肽。有利地，本文公开的肽作为初始肽从噬菌体展示文库获得，提供了当与其他抑制剂如由p53野生型序列衍生的抑制剂相比时为针对Mdm2/Mdm4的强效结合剂的肽的实验证据。本文公开的观察结果可用于设计用于治疗应用，例如用于治疗癌症的新Mdm2/Mdm4抑制剂。

装订肽是氨基酸的短线性序列，其二级结构已经通过序列中两个点之间的共价连接而稳定。如本文所公开的，已经设计了在不扰乱细胞的膜完整性下仍有效地激活p53的肽。这些肽的毒性要小得多，并且因此更加适合于治疗开发。此外，本文公开的肽当以不同浓度在多种细胞系中使用时不诱导乳酸脱氢酶(LDH)的可测量释放，同时维持其通过Mdm2介导的抑制活化p53的能力。由于乳酸脱氢酶通常在组织损伤期间被释放，因此乳酸脱氢酶的缺乏意味着细胞膜保持完整且未受损伤。

因此，在一个实例中，肽如本文所述，其中肽的N-末端(例如T)或C-末端(例如Xaa₂)与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。在另一个实例中，肽的N-末端(例如T)或C-末端(例如Xaa₅)与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。在另一个实例中，肽的N-末端(例如T)与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。在另一个实例中，肽的C-末端(例如Xaa₂)与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。在另一个实例中，肽的C-末端(例如Xaa₅)与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。

肽交联接头在结合之前主要提高肽在溶液中的螺旋度，但是这可以由于肽:蛋白质界面处的非最佳相互作用而折衷。在经合理设计的肽中，已经通过优化界面处的填充效应、稳定结合的复合物和在溶液中的更大螺旋稳定性克服或至少改善了这些限制。例如，在本文公开的一些肽中，交联接头可能仅诱导45％螺旋度。然而，这可以用两个氨基酸之间(氢)H键的形成和通过肽的另一氨基酸的最佳填充相互作用来补偿。相比之下，另一种示例性肽可以在结合之后失去两个氨基酸之间的氢键，但通过在溶液中的较大螺旋度(63％)和通过另一氨基酸稳定螺旋结合形式来进行补偿。这反映在对这两种肽得到的结合焓值和熵值，其中第一示例性肽具有更有利的焓组分，第二示例性肽具有更有利的熵成分。因此，在一个实例中，接头是共价接头。在另一个实例中，共价接头可以包含但不限于烃接头。在另一个实例中，接头是己离子接头(hexionic linker)。在另一个实例中，接头是氨基己酸接头。在另一个实例中，接头是疏水性的。在另一个实例中，烃接头是疏水性的。在另一个实例中，烃接头包含Ahx(氨基己酸)。在另一个实例中，烃接头包含Ac-RRR-Ahx(乙酰化-Arg-Arg-Arg-氨基己酸)的序列。

本公开内容还描述了肽，其中如本文所述的任选接头的任一端或两端可以被修饰。因此，在一个实例中，肽如本文所述，其中序列Z_n与如本文限定的接头的未结合端连接。在另一个实例中，Z_n中的n限定为长度为至少1个、至少2个、至少3个或更多个氨基酸，或者长度为1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10个氨基酸。在一个实例中，Z_n为1或2或3。在另一个实例中，Z可以是具有单个局部正电荷的分子。在一个实例中，Z可以是但不限于丁胺、精氨酸[R]或赖氨酸[K]。在一个实例中，Z是丁胺。在另一个实例中，Z是赖氨酸[K]。在另一个实例中，Z是精氨酸[R]。

当组合时，如本文所述的接头序列和如本文所述的Z序列可以包含但不限于Ac-KK-Ahx(乙酰化-Lys-Lys-氨基己酸)或Ac-RRR-Ahx(乙酰化-Arg-Arg-Arg-氨基己酸)的序列。在一个实例中，接头和序列Z可以包含Ac-KK-Ahx(乙酰化-Lys-Lys-氨基己酸)的序列。在另一个实例中，接头和序列Z可以包含Ac-RRR-Ahx(乙酰化-Arg-Arg-Arg-氨基己酸)的序列。

肽可以包含在两个非天然(例如不是天然的或合成的)氨基酸之间的至少一个肽交联接头(也称为钉或系链)，其显著增强肽的α螺旋结构。通常，交联接头延伸横跨一个或两个螺旋圈(即约3.4个或约7个氨基酸)的长度。因此，在一个实例中，接头的长度为但不限于1至5、5至10、10至15、15至20、6至12、8至16、20至25、12至22、17至24、20至23、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少13、至少15、至少18或至少20个氨基酸的长度。因此，位于i和i+3(即相隔3个氨基酸)的氨基酸；以及i和i+4(即相隔4个氨基酸)的氨基酸；或i和i+7(即相隔7个氨基酸)的氨基酸可以是化学修饰和交联的理想候选物。

如本文所述的蛋白质还可以被翻译后修饰。因此，在一个实例中，肽如本文所述，其中肽已经历翻译后修饰，例如添加一个或更多个磷酰基。在另一个实例中，肽被修饰为包含选自但不限于以下的一个或更多个配体：羟基、磷酸酯、胺、酰胺、硫酸酯、硫化物、生物素部分、碳水化合物部分、脂肪酸衍生酸基团、荧光部分、生色团部分、放射性同位素、聚乙二醇(PEG)接头、亲和标记、靶向部分、抗体、细胞穿透肽或上述配体的组合。

如在此和上文所述的肽、分离的核酸分子或载体可以被配制成用于施用的合适组合物，例如药物组合物。如果适用，肽可以与可药用载体一起施用。“载体”可以包括任何可药用载体，只要载体可以与制剂的其他成分相容并且不对患者有害即可。因此，使用的药物组合物可以使用一种或更多种有利于将活性化合物加工成药学上可使用的制剂的生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅料)以常规方式配制。合适的配方取决于所选择的施用途径。因此，在一个实例中，本公开内容描述了药物组合物，其包含但不限于本文所述的肽、本文所述的分离的核酸分子或本文所述的载体。在另一个实例中，本公开内容描述了编码如本文所述的肽的分离的核酸分子。在另一个实例中，本公开内容描述了包含如本文所述的分离的核酸分子的载体。在一个实例中，药物组合物包含本文所述的肽。在另一个实例中，药物组合物还包含一种或更多种可药用赋形剂、载剂或载体。

如上所述的肽或者其药物组合物或药物可以以多种方式施用，这取决于是否期望局部或全身使用以及取决于待治疗的区域。例如，肽或其各自的药物组合物可以经口、或经直肠、或经粘膜、或经肠、或肌内、或皮下、或髓内、或鞘内、或直接室内、或静脉内、或玻璃体内、或腹膜内、或鼻内、或眼内施用于患者。

肽自身可以以任意广泛而多样形式存在于组合物中。例如，两种、三种、四种或更多种肽可以混合在一起，或者可以通过复合、结晶或者离子或共价结合更紧密地缔合。肽还可以包括在施用于动物(包括人)之后能够提供其生物活性代谢物或残基的任何可药用盐、酯、或这样的酯的盐、或任何其他化合物。因此，本文还描述了前药和这样的前药的可药用盐、以及其他生物等同物。

本公开内容还描述了联合治疗和组合物，也就是说，如本文所述的肽可以与另外的治疗性化合物同时、顺序或分开施用。这种治疗性化合物可以包括但不限于小分子、生物制剂或生物技术来源产品。在一个实例中，另外的治疗性化合物是促进凋亡化合物。这种促进凋亡化合物可以包括但不限于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂、BCL(B细胞淋巴瘤)家族BH3(Bcl-2同源结构域3)-模拟物抑制剂和毛细血管扩张性共济失调突变(ATM)抑制剂。在一个实例中，促进凋亡化合物是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。在另一个实例中，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂可以是但不限于2-(R)-(1-乙基-2-羟乙基氨基)-6-苄基氨基-9-异丙基嘌呤(CYC202；Roscovitine；Seliciclib)；4-[[5-氨基-1-(2,6-二氟苯甲酰基)-1H-1,2,4-三唑-3-基]氨基]苯磺酰胺(JNJ-7706621)；N-(4-哌啶基)-4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)-1H-吡唑-3-甲酰胺(AT-7519)；N-(5-(((5-(1,1-二甲基乙基)-2-噁唑基)甲基)硫基)-2-噻唑基)-4-哌啶甲酰胺(SNS-032)；8,12-环氧-1H,8H-2,7b,12a-三氮杂二苯并(a,g)环壬(cde)三茚-1-酮、2,3,9,10,11,12-六氢-3-羟基-9-甲氧基-8-甲基-10-(甲基氨基)-(UCN-01；7-羟基星形孢菌素；KRX-0601)；N,1,4,4-四甲基-8-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4,5-二氢-1H-吡唑并[4,3-H]喹唑啉-3-甲酰胺(PHA-848125；milciclib)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基哌啶-4-基]色烯-4-酮盐酸盐(夫拉平度(flavopiridol)；alvocidib)；6-(乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮盐酸盐(PD 0332991)；4-(1-异丙基-2-甲基-1H-咪唑-5-基)-N-(4-(甲基磺酰基)苯基)嘧啶-2-胺(AZD5438)；(S)-3-(((3-乙基-5-(2-(2-羟乙基)哌啶-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)甲基)吡啶1-氧化物(Dinaciclib；SCH 727965)；N-(4-哌啶基)-4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)-1H-吡唑-3-甲酰胺盐酸盐(AT-7519)；及其可药用盐。

在另一个实例中，促进凋亡化合物是受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂。在另一个实例中，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂可以是但不限于N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲基磺酰基乙基氨基]甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺(拉帕替尼)；N1’-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-(3-吗啉代丙氧基)-4-喹啉基]氧基]苯基]-N1-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(foretinib)；N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(卡博替尼(XL184))；N-(4-((6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(卡博替尼(XL184))；3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼(crizotinib)(Xalkori))；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-5-磺酰胺(SU11274)；(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺酰基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯烷基甲基)-1-吡咯烷基]羰基]-1H-吡咯-2-基]亚甲基]-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮水合物(PHA-665752)；6-[[6-(1-甲基吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]硫烷基]喹啉(SGX-523)；4-[1-(6-喹啉基甲基)-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡唑-1-乙醇甲磺酸酯(1:1)(PF-04217903)；2-氟-N-甲基-4-[7-[(喹啉-6-基)甲基]咪唑并[1,2-b]-[1,2,4]三嗪-2-基]苯甲酰胺(INCB28060)；N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(阿法替尼(afatinib))；3-(5,6-二氢-4H-吡咯并[3,2,1-ij]喹啉-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-吡咯烷-2,5-二酮(ARQ-197(Tivantinib))；N-[(2R)-1,4-二噁烷-2-基甲基]-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧代-5H-苯并[4,5]环庚[1,2-b]吡啶-7-基]硫酸二酰胺(MK-2461)；N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲(Linifanib(ABT 869))；4-[[(3S)-3-二甲基氨基吡咯烷-1-基]甲基]-N-[4-甲基-3-[(4-嘧啶-5-基嘧啶-2-基)氨基]苯基]-3-(三氟甲基)苯甲酰胺(巴氟替尼(Bafetinib)(INNO-406))；及其药用盐。

在另一个实例中，促进凋亡化合物是BCL(B细胞淋巴瘤)家族BH3(Bcl-2同源结构域3)-模拟物抑制剂。在另一个实例中，BCL(B细胞淋巴瘤)家族BH3(Bcl-2同源结构域3)-模拟物抑制剂可以是但不限于4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯基硫基)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基]磺酰基]苯甲酰胺(ABT 263；Navitoclax)；2-[2-[(3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-3-甲氧基-2H-吡咯-5-基]-1H-吲哚甲磺酸酯盐(Obatoclax甲磺酸盐(GX15-070))；4-[4-[(4'-氯[1,1'-联苯]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲基氨基)-1-[(苯基硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基]-苯甲酰胺(ABT-737)；及其可药用盐。

在另一个实例中，促进凋亡化合物是毛细血管扩张性共济失调突变(ATM)抑制剂。在另一个实例中，毛细血管扩张性共济失调突变(ATM)抑制剂可以是但不限于2-吗啉-4-基-6-噻蒽-1-基-吡喃-4-酮(KU-55933)；(2R,6S)-2,6-二甲基-N-[5-[6-(4-吗啉基)-4-氧代-4H-吡喃-2-基]-9H-噻吨-2-基]-4-吗啉乙酰胺(KU-60019)；1-(6,7-二甲氧基-4-喹唑啉基)-3-(2-吡啶基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺(CP466722)；α-苯基-N-[2,2,2-三氯-1-[[[(4-氟-3-硝基苯基)氨基]硫代甲基]氨基]乙基]苯乙酰胺(CGK 733)；及其可药用盐。

Mdm2在很多癌症中过表达，并且被认为是p53野生型(WT)肿瘤中p53网络失活的主要原因之一。因此，p53:Mdm2相互作用的抑制是有吸引力的治疗靶标。因此，在一个实例中，本公开内容描述了本文所述的肽在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。在另一个实例中，本文所述的肽可以用作药物。在另一个实例中，本公开内容描述了在患者中治疗或预防癌症的方法，其包括施用药物有效量的本文所述的肽、或本文所述的分离的核酸分子、或本文所述的载体。在一个实例中，癌症包括包含非突变p53序列的肿瘤。在另一个实例中，癌症包括包含突变p53序列的肿瘤。在另一个实例中，癌症可以是但不限于胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、黑素瘤和白血病。在另一个实例中，患者患有或怀疑患有癌症，其包含具有p53缺陷型肿瘤细胞或包含含有引起癌症的突变的p53基因的肿瘤。

使用配体映射分子动力学(MD)模拟来映射和鉴定Mdm2表面上的新结合位点，其紧密地位于肽结合缝隙。这些隐蔽位点被称为Nutlin次要位点和P27近端位点。一个位点通过生物物理测定和X射线晶体学证实为合理结合位点，由此证明配体映射技术的预测能力。设计了两个与任一位点相互作用的肽家族。有趣的是，设计用于与nutlin次要位点相互作用的家族在晶体学上被鉴定为与P27近端位点相互作用。尽管缺乏结构证据，但是由于非常可能的是,由大环连接施加的几何限制，i,i+7钉也利用相同的P27近端。这项研究是最先使用配体映射方法来预测以前未知的结合位点，随后通过实验对其进行验证。

生物物理测定表明C-末端延伸确实提高基于配体映射模拟结果设计的初始装订肽(YS-01至04)的体外活性。用i,i+7连接修饰的YS-03和YS-04肽比经i,i+4修饰的肽在诱导细胞中p53活性方面更有效。这表明装订肽可能与细胞膜的表面相互作用。然后，通过引入P27S替换(YS-05和06)在T22 p53激活测定(YS-01和02)中对i,i+4装订肽进行增量改善，这改善装订肽在溶液中的螺旋度但没有显著改善其对Mdm2的结合亲和力。提高的螺旋度可以通过沿着螺旋的一个面定向肽中更具亲脂性的残基(LX、WX、FX和FX)并提高与细胞膜的推定相互作用且因此有助于细胞进入而增加效力。不受理论的束缚，这种现象受到C-末端苯丙氨酸与亲脂性较小的酪氨酸交换的支持，这破坏了装订肽激活p53的能力。这些结果表明，在订制生物活性分子的探索中，对装订肽剂型设计变化以仅提高其结合亲和力是不够的。

通过添加带多电荷的N-末端扰乱其生理化学特征并通过使用延长的己离子酸接头避免其结合亲和力减弱来基于活性更高的i,i+7装订肽(I,i+7)设计更有效的肽。必须仔细监测这些效果以开发对细胞无毒且在其作用模式中真正作用于靶标的肽。对于YS肽家族肽，使装订肽易于使细胞膜去稳定并诱导乳酸脱氢酶泄漏的因素是N-末端正电荷的性质、C-末端残基的亲脂性和所使用烃装订连接的类型。在大多数情况下，这些因素影响肽如何与细胞膜的相互作用，并且是进一步详细研究的主题。例如，与极性较大的YXX形成对比，与(X₅,S₈)i,i+7钉(例如YS-03)而不是较短的(X₅,X₅)i,i+4钉连接的C-末端亲脂性FXX少量增强从T22细胞的乳酸脱氢酶泄漏，并且这在ARN8细胞中更为显著。这延伸到N-末端多聚精氨酸相对于二赖氨酸修饰(YS-07相对于YS-09)的作用，其中公知与赖氨酸相比，形成精氨酸侧链的双齿氢键与脂质双层更高效地相互作用。结果表明，p53激活装订肽与细胞膜相互作用，但只有在高于其诱导p53的浓度下，其才会破坏细胞膜并诱导乳酸脱氢酶渗漏。同样地，装订肽破坏细胞膜的能力由血清中存在的因子调节，这可影响溶液中游离装订肽的量。

使用计算技术，开发了替代的p53激活肽家族，随后使用测定评估经由乳酸脱氢酶泄露的细胞毒性和p53的靶标激活通过进一步的化学合成改变其生物活性。通过调节亲脂特性和正电荷特性，开发了相对于亲本肽sMTIDE-02(SEQ ID NO:22)效力提高并且在不存在血清下破坏细胞膜的能力可忽略的YS肽化合物，例如YS-07。

本文说明性地描述的发明可以适当地在不存在本文未具体公开的任何要素、限制下实施，这里没有具体公开。因此，例如，术语包含”、“包括”、“含有”等应广泛且不受限制地阅读。此外，本文使用的术语和表述已经被用作描述而不是限制的术语，并且不旨在使用排除所示和所述特征的任何等同物或其部分这样的术语和表述，但是应认识到在所要求保护发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文所体现的本发明的修改方案和变化方案，并且这样的修改方案和变化方案被认为在本发明的范围内。

已经在本文中广泛且一般性地描述本发明。落在上位公开内容内的每个较窄类型和下位组群也形成本发明的一部分。这包括对本发明的上位描述，其中限制性条件或否定限制将任何主题从该类属中除去而不管所删除材料在本文是否被具体记载。

另一些实施方案在所附权利要求书和非限制性实施例中。此外，当根据根据马库什组对本发明的特征或方面进行描述时，本领域技术人员将认识到，本发明因此还根据马库什组的任何单独成员或成员亚组来描述。

实施例

使用配体映射分子动力学(MD)模拟的结合位点检测

配体映射是基于分子动力学(MD)的技术，其利用在水性溶剂中的疏水性探针(例如苯和氯苯分子)来检测蛋白质表面上的配体结合位点。已经显示其在揭示构象敏感性(隐蔽)配体结合位点方面特别有用，并且之前用于成功地设计选择性地靶向已知隐蔽口袋的配体。将这种方法应用于Mdm2以鉴定蛋白质表面上尚未被其他已知配体利用的新辅助性口袋以增强抑制性肽与Mdm2的结合。然而，作为替代，可以使用本领域已知的其他方法来鉴定这样的辅助性口袋。

使用与野生型p53反式激活结构域肽(p53 WT-1:¹⁶QETFSDLWKLLPEN²⁹；SEQ ID NO:13)复合的人Mdm2的晶体结构(PDB:1YCR)作为用于配体映射模拟的初始结构。由于隐蔽结合位点天然往往是疏水性的，因此选择苯作为映射配体。Apo Mdm2(前缀“apo”是指处于其未结合状态的Mdm2)通过从复合物结构中移除肽产生，并用于具有不同起始苯分布的十个独立5纳秒配体映射模拟的初始组。通过使用相对较低的苯浓度(0.2M)来避免通过配体竞争性饱和(SILCS)方法在相关位点鉴定中引入非天然配体间排斥力。这还有助于防止相分离和蛋白质上的配体聚集，其可能已引起变性。还对p53结合的Mdm2(holo，即Mdm2的结合形式)进行第二组配体映射模拟以确定与p53结合裂口离散的结合位点是否可以在肽存在下重现。然后，基于p53野生型肽(SEQ ID NO:12)的结构，将经鉴定结合位点的这一亚组用于设计新的抑制性肽和肽模拟物。

然后，进行与蛋白质结构数据库(PDB)中其他已发表Mdm2:配体结构的定性比较以鉴定来自apo(未结合)或holo(结合)模拟的任何分离结合位点是否已被用于以前报道的抑制剂研究。比较揭示两个新的且以前未被鉴定的结合位点(图1)。第一结合位点对应于1RV1晶体结构中Nutlin-2的第二观察到的相互作用位点。第一Nutlin-2结合位点位于p53肽结合槽中，其中其模拟保守的相互作用基序，而第二位于Tyr100和Tyr104之间。在此，Nutlin-2分子通过相同的溴苯基部分再次利用浅腔，所述部分代替p53野生型肽中保守色氨酸残基的相互作用。在apo和holo配体映射模拟中通过苯探针映射两个Nutlin-2结合位点，指示第二位点可潜在地用于肽配体的进一步迭代药物设计。竞争性滴定实验表明，Y104G突变折衷nutlin-3从Mdm2的p53肽置换，表明在晶体结构和配体映射模拟中观察到的第二nutlin相互作用位点可能在结合中具有功能作用。在apo配体映射模拟中紧邻Pro27结合位点鉴定到第二潜在结合位点。这被称为近端Pro27位点(图1b)并且在holo模拟中未被鉴定到，因为其被结合的肽封闭。设计了两个延伸烃装订肽家族来靶向这两个位点。

设计利用Mdm2上新鉴定的隐蔽结合位点的装订肽

通过对具有Mdm2结合的晶体结构的肽的C-末端进行简单苯丙氨酸延伸可以容易地接近两个推定的结合位点。苯丙氨酸侧链可以附加到p53野生型肽((ETFSDLWKLLPEN：SEQID NO:12)的C-末端延伸链以占据第二nutlin-2结合位点(图2a)，或者附加到装订肽SAH-p53-8(QTFX₈NLWRLLS₅QN；SEQ ID NO:11；YS-11)，其中C-末端以螺旋构象稳定以与近端Pro27位点相互作用(图2b)。这两种模式用于合理地设计Mdm2的新的、新颖的肽抑制剂。

设计用于利用对应于第二nutlin结合位点的隐窝口袋的第一肽家族(YS-01和YS-02)基于p53野生型肽结构。从两组配体映射模拟(apo和holo)中选择其中存在鉴定的隐蔽口袋的合适轨迹结构。在将两个蛋白质结构叠加之后，通过从1YCR晶体结构提取将p53肽建模到所选择的未结合Mdm2结构上。然后，使用PyMOL将苯丙氨酸或酪氨酸残基附加到肽的C-末端，使得苯基与第二nutlin相互作用位点处的苯密度最佳重叠。还以相同方式将C-末端苯丙氨酸/酪氨酸添加到所选p53结合Mdm2结构中的肽。

随后，修饰延伸的p53肽(ETFSDLWKLLPENF/Y；SEQ ID NO:15/16)以包含sMTIDE-02序列(TSFSEYWKLLPENF/Y；SEQ ID NO:17/18)的已知特征。然后，将由在肽序列的第21和25位上放置2(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸残基形成的i,i+4钉建模到sMTIDE-02修饰序列中。这些特征用于试图保留sMTIDE-02所报告的期望生物特性。使用i,i+4(X₅,X₅)钉代替更常用的i,i+4(S₅,S₅)钉以最大化钉与由甘氨酸架构成的Mdm2表面之间的配合互补性。另外，使用较短的i,i+4钉代替较长的i,i+7钉以防止C-端延伸链结构作为替代采用螺旋圈。这些新型肽分别称为YS-01(TSFX₅EYWX₅LLPENF；SEQ ID NO:01)和YS-02(TSFX₅EYWX₅LLPENF；SEQ IDNO:02)。

设计第二肽家族YS-03(SEQ ID NO:03)和YS-04(SEQ ID NO:04))以利用近端Pro27隐蔽位点。为了对这些肽建模，仅使用来自apo配体映射模拟的轨迹结构，因为参与形成近端Pro27位点的残基也构成肽:蛋白质界面的一部分，并且因此在配体映射模拟中未观察到近端隐蔽位点。为了靶向具有苯丙氨酸或酪氨酸侧链的近端Pro27位点，在p53野生型肽末端需要螺旋圈，而不是肽在Mdm2:p53野生型肽晶体结构中采用的延伸链。为了实现在p53野生型肽的C-末端采用螺旋圈，使用i,i+7烃钉代替较短的i,i+4钉。在p53野生型序列的第20和27位引入残基：2(R)-2-(4'-辛烯基)丙氨酸和2(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸以形成i,i+7钉。该钉与先前公开的装订肽SAH-p53-8(SEQ ID NO:11)和sMTIDE-02(SEQ ID NO:23)中使用的烃限制相同。

在将结合结构与来自轨迹的框架叠加之后，通过从与SAH-p53-8(PDB3V3B)结合的Mdm2的晶体结构中提取来建模装订肽SAH-p53-8(SEQ ID NO:11)。然后将残基突变以产生sMTIDE-02分子的支架。然后，使用PyMOL将苯丙氨酸或酪氨酸连接到装订肽的C-末端，分别产生YS-03(TSFX₈EYWALLS₅ENF；SEQ ID NO:03)和YS-04(TSFX₈EYWALLS₅ENY；SEQ ID NO:04)肽，使得与在近端Pro27位点的苯密度最佳重叠。

进行Mdm2与YS-01/04肽(SEQ ID NO.1和4)以及sMTide-02(SEQ ID NO:24)和野生型p53(SEQ ID NO:12)的复合物的分子动力学(MD)模拟50纳秒以评价其稳定性。设计的四种装订肽的结构没有显著偏离其初始的最小化结构，其中低均方根差(RMSD)值小于

(图9)。在所有模拟结束时，Phe和Tyr延伸端保持在其所靶向结合位点处结合，表明预测的结合模式的稳定性。

不同Mdm2-肽复合物的结合自由能由通过模拟产生的结构推导，并用广义波恩表面积(MM/GBSA)方法使用分子力学计算。预测与野生型p53肽相比，sMTide-02肽对Mdm2具有更高结合亲和力，与先前的实验结果一致。值得注意的是，计算结果表明，所有的延伸装订肽均为比sMTide-02更有效的Mdm2结合剂。为了研究这些肽的结合特征，随后在生物物理学、生物学和X射线晶体学实验中进行表征。

C-末端延伸的sMTIDE-02变体肽(YS 01/04)的生物物理学表征

首先使用基于竞争的荧光各向异性测定来表征YS-01/04家族的装订肽和自然野生型p53肽(表1)。在该测定中，序列RFMDYWEGL(SEQ ID NO:22)的N-末端FAM标记的肽。通过用新sMTide衍生变体肽或野生型p5肽中的任一个滴定来从Mdm2的N-末端结构域置换序列RFMDYWEGL(SEQ ID NO:22)的N-末端FAM的标记肽。YS-01和YS-02针对Mdm2的解离常数(K_d)分别确定为9.9nM和7.4nM。装订肽的C-末端包含酪氨酸(YS-02)代替苯丙氨酸(YS-01)使得肽与Mdm2 N-末端结构域之间的结合亲和力差别可以忽略不计。然而，与原始sMTIDE-02(参考)相比，K_d值为约3倍强(表1)。还测定了肽YS-03和YS-04，其使用在肽序列第4和10位的替代(X₅,S₈)I,I+7连接进行装订。同样地，YS-03和YS-04肽分别仅在其最后残基的同一性方面不同，即苯丙氨酸与酪氨酸替换。如YS-01/02的情况，两种肽对Mdm2的亲和力差异是可忽略的。然而，两种肽的K_d值均比对相同序列(YS-01和YS-02)的(X₅,X₅)i,i+4类似物肽确定的K_d值弱约2倍，并且稍微强于sMTIDE-02(表1)。使用圆二色(CD)谱进一步表征这两组肽以确定其比较螺旋度。与YS-01和YS-02相比，YS-03和YS-04二者在溶液中具有显著更高的螺旋特征。这表明当肽在溶液中未结合时，(X₅,S₈)i,i+7大环连接是比较短的(Y₅,X₅)i,i+4钉更有效的螺旋诱导剂(图9)。

表1.装订肽的计算的结合自由能(ΔG_结合)、表观解离常数(K_d)(从竞争性荧光各向异性滴定获得)和生物活性(在不存在10％胎牛血清下和存在10％胎牛血清下通过T22 p53报道子测定而确定)。

YS-01/04装订肽类似物的细胞内活性的生物学表征

在具有胎牛血清下或不具有胎牛血清下在鼠T22衍生来源p53报道子测定中筛选YS-01/04肽，以评估其在完整细胞中诱导p53转录活性的能力(表1和图3)。当与在不存在血清下诱导p53活性的能力相比时，在血清存在下，所有四种肽在p53报道子测定中都显示出显著降低的活性(图3a和3b)。在两组条件下，YS-03和YS-04在T22测定中都显示出比YS-01和YS-02更强的效力，这表明与(X₅,X₅)i,i+4钉相比，(X₅,S₈)i,i+7钉在使得进入细胞内部方面更有效。然后，在p53转录活性测定中对YS-03和YS-04进行完全滴定，这确定其在不存在血清下的各自IC₅₀值分别为4.57μM和9.73μM(图4)。考虑到这些肽对Mdm2具有类似亲和力，其IC₅₀值的差异必须反映其进入细胞的能力的变化。对两组肽观察到这种差异(YS-01和YS-02，YS-03和YS-04，图3)，这暗示C-末端Y30的羟基导致细胞内摄取的效率降低。然后，使用western印迹分析直接探测p53和Mdm2蛋白水平。在存在胎牛血清下或不存在胎牛血清下用25μM和50μM的YS-03处理T22细胞(图4)。在存在或不存在血清下，在用YS-03处理后T22细胞中p53和Mdm2蛋白水平的诱导与在报道子测定中测量的β-半乳糖苷酶水平直接相关。

还针对扰乱T22和ARN8细胞的细胞膜壁以及释放细胞溶质乳酸脱氢酶(LDH)的能力筛选经装订的YS-01/04肽。这被认为是不期望的效果，因为这可表明肽对不同的细胞类型具有非特异性毒性。由于认为细胞膜的穿孔相对于细胞程序性死亡发生得更慢，因此对该测定使用短的2小时时间处理期。肽YS-01、YS-02和YS-04对T22或ARN8细胞测量的浓度下引起可忽略的乳酸脱氢酶释放(图3)。然而，在T22测定中为最强p53活性诱导剂的YS-03在无血清条件下在ARN8和T22细胞中均不同程度地导致乳酸脱氢酶的泄漏(图3C和3E)。与T22细胞相比，在ARN8细胞中测量的乳酸脱氢酶泄漏大得多，表明不同细胞在其对YS-03的膜破坏性敏感性方面有差异。这些结果表明，与更长且更具疏水性的(X₅,S₈)i,i+7钉串联的更具亲水性的C-末端苯丙氨酸的存在允许肽在高处理浓度下干扰细胞脂质双层的完整性。必须强调，当用较低浓度的YS-03(<25μM)处理T22细胞时，在无血清条件下释放出可忽略量的乳酸脱氢酶，同时仍然测量到显著水平的p53活化。然而，当血清存在时，在受试浓度下没有观察到膜破坏，但是YS-03仍诱导p53。这意味着，在不存在膜破坏下还由YS-04数据支持的p53活化确实发生，并且观察到的生物学活性不是细胞毒性的直接后果。

YS-01和YS-02装订肽的结构表征

解析与YS-01和YS-02复合的Mdm2的晶体结构以确定结合方式。这两种肽以相同的方式结合，其中对于一些溶剂暴露的残基具有仅微小的变化(图5和10)。装订肽采用具有结合在其典型的口袋中的Phe19、Trp23和Leu26α的螺旋结构。烃钉以与SAH-p53-8和M06的较长i,i+7钉大致相似的方式相对于所谓的螺旋α3的甘氨酸架折叠包装。肽的C-末端折叠包装进螺旋α3和α5之间的缝隙中(图5c)，置换铰链螺旋。尽管晶体结构中A和B链之间的链交换导致相邻分子的N-末端相对于α5折叠包装(图11)，但这并不显示是生物学上相关的。

令人惊讶的是，与野生型(WT)p53肽的第19至26位残基相比，YS-01/2的第19至30位残基呈螺旋(图6a)。在不存在YS-01/2的非装订形式的结构下，难以确定大于预期的螺旋度是否是由于i,i+4钉和/或经修饰的C-末端。虽然Pro27在野生型p53中用作螺旋破坏剂，尽管无法维持内部氢键网络，但仍将该残基并入YS-01/2的螺旋中。用能够维持该网络的残基替换Pro27将导致更高亲和力的肽似乎是合乎逻辑的。实际上研究表明，含有P27S突变的p53肽大致20倍更强地结合。然而，对于YS-03/4，由于Pro27被第二钉点代替，这样的修饰是不可行的。

YS-01/2的肽骨架的更紧凑排列导致在对YS-03/4肽鉴定的近端Pro27口袋中的Phe/Tyr30结合，而不是对YS-01/2预测的第二nutlin结合位点。相对于野生型p53结构，近端Pro27口袋由Met50、Leu54、Tyr100和Tyr104衬贴，其中两个酪氨酸残基都相对于肽转移，以衬贴该口袋(图5c)。Tyr104的这种旋转允许其与Tyr30的羟基形成氢键并使其封闭第二nutlin结合位点。Tyr100与Phe/Tyr30形成与面-边相互作用，并与Leu26的骨架羰基形成氢键。Tyr100采用的构象被称为“闭合”构象，并且在较高亲和力配体的结构中观察到。YS-01/2的N-末端(第17至23位残基)的结合与SAH-p53-8和M06的结合相似(图6b)。然而，不同的装订策略导致第24至28位残基以不同的方式结合。在YS-01/2的第24位残基引入第二装订点使得Leu25和Leu26沿螺旋轴进一步位移。这导致在Leu26的Cα位置具有

位移的更扩展螺旋结构(与SAH-p53-8相比)。这使得Leu26进入介于SAH-p53-8/M06和野生型p53之间的位置和构象。然而，第27至29位残基则采用比SAH-p53-8中更紧凑的螺旋构象，使SAH-p53的Asn29和YS-01/2的Gln29更靠近在一起(在Cα位置为

)。这意味着对SAH-p53-8结构建模的Tyr/Phe30的位置(图2b和2d)与近端Pro27位点中残基的实际位置非常相似。

实验结果与计算机预测的比较

在Mdm2-YS-01复合物的晶体结构中进行链交换单体的分子动力学模拟(3种具有不同初始条件的模拟)，以了解链交换结构的生物相关性和Phe/Tyr30在肽结合中的作用。在所有三个的100纳秒长模拟中，Mdm2 N-末端盖(第12至25位残基)向后在第二nutlin相互作用位点向结构域核心折叠，在Phe30上形成支架(图12)。这类似于在晶体结构中观察到的来自链B的N-末端盖相对于链A的α4的包装。通过在本晶体结构中观察到的在单体之间交换N-末端盖形成的Mdm2二聚体是晶体学的人工品，并且在生物学上不具有相关性。然而，模拟确实表明近端Pro27位点是功能且有效的配体结合位点，其由来自Mdm2 N-末端核心结构域和N-末端盖的残基限定。因此，YS肽相对于sMTide-02提高的结合亲和力可归因于Phe/Tyr30与近端Pro27位点的相互作用。这种相互作用还使得肽α-螺旋从M06中的9个残基(Phe19至S527)延伸至YS-01和YS-02中的12个残基(Phe19至Phe/Tyr30)。

P27到S27的突变以进一步稳定YS-01和YS02的螺旋结合结构

在揭示在结合Mdm2后P27被掺入到YS-01和YS-02的螺旋中的结构研究之后，代替如在p53野生型肽复合物结构中观察到的破坏结合的螺旋，用丝氨酸替代脯氨酸残基以提高相互作用的亲和力和增强细胞摄取。所得类似物称为YS-05和YS-06。其针对Mdm2的各自解离常数(K_d)值分别确定为11.61nM和8.8nM(表1)，并且显示相对于两种脯氨酸类似物肽(YS-01和YS-02)没有显著改善或减弱。此外，当在溶液中未结合时，YS-05和YS-06的圆二色(CD)谱为显著更加螺旋的结构(图9)。与YS-01和YS-02肽相比，这两种肽的螺旋度的这种增加与两种肽激活p53的提高成分相关(图13)。然而，较大的螺旋度不会导致较低的解离常数(K_d)值，如通过荧光各向异性完成测定确定的。此外，YS-05和YS-06在针对T22和ARN8细胞的乳酸脱氢酶释放测定中显示出可忽略的活性，进一步表明YS-03的膜破坏能力是较长烃钉和C-末端苯丙氨酸存在的结果，并且乳酸脱氢酶释放与T22测定中的p53活性不相关。YS-05和YS-06的结果进一步表明，与(X₅,S₈)i,i+7装订序列(YS-03和YS-04)相比，在杂合sMTIDE02序列背景下的(X₅,X₅)i,i+4钉仍具有较差的细胞活性。

在不存在膜破坏和细胞溶质乳酸脱氢酶释放下的高效p53活化

选择YS-03和YS-04肽用于进一步开发，因为其在T22 p53报道子测定中显示出最大活性。作为针对提高其与Mdm2相互作用的亲和力而对肽序列进行进一步的增量突变改变的替代，决定通过向N-末端添加正电荷来扰乱其生物特性。通过实施这一策略，解决了这些肽在血清存在下的差活性，并且改善了YS-05干扰细胞膜的能力，如在不存在血清下的乳酸脱氢酶释放测定所显示的。选择两种标签用于通过氨基己酸接头添加至YS-05和YS-06以避免对其对Mdm2的亲和力的任何减弱。这些是二赖氨酸标签(KK)或短聚精氨酸标签(RRR)。所得肽被称为YS-07、YS-08、YS-09和YS-10(表1)，并且其各自的解离常数(K_d)针对Mdm2(1-125)而确定。所有四种类似物均保持以低纳摩尔解离常数(K_d)与Mdm2结合。然而，相对于亲本肽(YS-5和YS-06，表1)，其解离常数略微减弱。

然后，根据在存在和不存在血清下在T22基因报道子测定中诱导p53活性的能力来筛选新类似物(图7)。所有4种肽都显示其在两种条件下激活p53的能力显著改善。进行进一步的滴定以确定每种肽的各自IC₅₀值(表1)，其揭示在存在和不存在血清下YS-07(KK-Ahx-TSFX8EYWALLX5ENF；SEQ ID NO:07)是最有效的，其中IC₅₀值分别为9.95μM和约0.78μM。相比之下，在四种肽中对应的二赖氨酸标记酪氨酸衍生物YS-08(SEQ ID NO:08)效力最低。然后，通过评估肽在短处理期(2小时，图7)之后是否诱导细胞溶质乳酸脱氢酶释放到细胞培养基中来测试其扰乱细胞膜的能力。乳酸脱氢酶释放测定对T22和ARN8细胞进行，其揭示多精氨酸标记的肽(YS-09和YS-10)在不存在血清下显著影响细胞膜的完整性，并且如对YS-05可见的，这些影响在ARN8细胞中远远更大(图7)。令人感兴趣的是，在两种条件下测量的任一细胞类型中都用二赖氨酸标记的YS-07和YS-08都未诱导任何乳酸脱氢酶泄漏。这些结果进一步支持：在不存在乳酸脱氢酶泄漏下可有效地诱导p53活性，这与本领域已知的其他报道相反。

然后，将装订肽YS-07和YS-09滴定到ARN8细胞中，并确定其激活p53的能力(图8a和8b)。ARN8细胞包含稳定转染入T22细胞中的在p53启动子控制下的相同β-半乳糖苷酶基因。在不存在血清下，YS-07在ARN8细胞中高效地诱导β-半乳糖苷酶活性，尽管IC₅₀值低于对T22细胞确定的IC₅₀值。然而，相比之下，YS-09在3.125μM下诱导p53转录活性的急剧突发，随后在较高浓度下急剧下降。再次重复YS-07和YS-09滴定，并作为替代测量来自ARN8细胞的乳酸脱氢酶泄漏(图8c和8d)。如之前所示，YS-07引起可忽略的乳酸脱氢酶泄漏，而YS-09在p53活性降低的浓度下开始诱导大量乳酸脱氢酶泄漏。在血清条件下，对两种肽都没有观察到乳酸脱氢酶渗漏，并且YS-09的活性略大于YS-07。然而，在高于50μM的浓度下YS-09的p53活性降低，这对YS-07并未观察到。这些结果表明肽抑制Mdm2和激活p53的能力独立于其膜破坏特性。

然后，比较sMTIDE-02和Nutlin与YS-07在T22和ARN8细胞中诱导乳酸脱氢酶泄漏和激活p53的能力。在所有测试条件下，Nutlin产生类似的钟形p53激活谱(图8e至8g)，其中在高浓度下p53水平显著降低，表明细胞死亡。sMTIDE-02当在存在或不存在血清下滴定到T22细胞中时产生与YS-07类似的S形曲线，诱导在处理浓度范围的界限处停滞的最大p53活性。在0％血清条件下，与YS-07不同，sMTIDE-02在T22细胞中确实诱导显著量的乳酸脱氢酶泄漏，并且程度远远大于YS-03(图8c)。然而，与YS-07在血清或无血清条件下诱导的p53激活相比时，p53活化的幅度并不改变，其中没有检测到乳酸脱氢酶泄漏，表明没有发生由于膜破坏的细胞死亡(图8E和8F)。当滴定到ARN8细胞中时，sMTIDE-02在血清条件下再次诱导与YS-07相似的p53活化谱，但当不再存在血清时，这发生显著变化，其中sMTIDE-02对p53活性的诱导差并且仅达到用Nutlin和YS-07进行滴定测量的最大活化的20％(图8D和8E)。然而，与YS-07和Nutlin形成对比，sMTIDE-02确实在与诱导p53活性所需范围重叠的浓度范围下确实引起大量的乳酸脱氢酶泄漏。这些结果表明sMTIDE02对ARN8细胞具有毒性，并且这与细胞膜的扰乱有关。令人感兴趣的是，不同于其中观察到p53活性在较低浓度下“突发”之后显著降低的在ARN8细胞中的YS-09滴定，sMTIDE-02仅诱导少量的p53活性。这推测YS-09与sMTIDE-02不同在这种条件下具有小窗口，其中其可以在ARN8细胞的细胞膜受损之前诱导p53活性。

结构的制备

使用与p53反式激活结构域肽结合的人Mdm2的晶体结构(PDB1YCR)作为分子动力学(MD)模拟的初始结构。如下将晶体结构中与Mdm2结合的p53肽突变成称为sMTide-02的装订肽(Ac-TSFX₈EYWALLS₅-NH₂；SEQ ID NO:22)：使其骨架保持固定并使用AMBER11(分子动力学力场和软件包)中的tleap模块添加突变残基的侧链且在X₈和S₅残基之间形成反式双键。X₈表示(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸残基，而S₅表示(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸残基。分别使用乙酰基和N-甲基封端Mdm2的N-和C-末端，而肽通过乙酰基和酰胺基团封端。PDB2PQR用于确定残基的质子化状态并添加缺失的氢原子。然后，使用AMBER 11包中的LEaP程序在周期性截角八面体盒中用TIP3P水分子溶剂化每个体系，使得其壁为距离蛋白质至少

并且用钠或氯离子中和电荷。

分子动力学(MD)模拟

使用用于伪随机数发生器的不同初始原子速度和种子对Mdm2/p53和Mdm2/sMTide-02复合物分别进行两种独立的显式溶剂分子动力学(MD)模拟。使用ff99SB-ILDN力场用AMBER 11的sander和PMEMD模块进行能量最小化和分子动力学(MD)模拟。X₈和S₅残基由ff99SB-ILDN和广义AMBER力场(GAFF)描述。X₈和S₅残基的原子电荷(表2和3)使用R.E.D.服务器通过将受限的静电电势(RESP)电荷拟合到由Gaussian 09程序在HF/6-31G*理论水平计算的分子静电电位(MEP)获得。涉及氢原子的所有键都受SHAKE算法约束，允许时间步长为2fs。非键合相互作用在

截断，并使用粒子网格Ewald方法考虑在周期边界条件下的长程静电相互作用。

在最小化和初始平衡步骤期间，将具有2.0kcal mol^-1

力常数的弱谐波位置约束放置在蛋白质非氢原子上。使用最陡下降算法进行500步的能量最小化，然后再进行共轭梯度算法500步。然后，将体系在恒定体积下在50皮秒内逐渐加热至300K，之后在1atm(101325Pa)的恒定压力下再平衡50皮秒。在1atm(101325Pa)和300K下在没有原子约束下进行最后一轮平衡(2纳秒)和最后一轮产生(50纳秒)。使用Langevin恒温器以2ps-1的碰撞频率使温度保持恒定，同时通过Berendsen恒压器以2皮秒的压力松弛时间维持压力。

配体映射分子动力学(MD)模拟

对未结合和p53结合的Mdm2二者进行配体映射分子动力学(MD)模拟。对于每组模拟，使用Packmol软件创建苯在蛋白质周围的十种不同分布。然后，使用AMBER 11包中的LEaP程序在周期性截角八面体盒中用TIP3P水分子溶剂化每个体系，使得其壁为距离蛋白质至少

并用钠或氯离子中和电荷，使得最终苯浓度为约0.2M。如上所述对Mdm2/p53复合物进行最小化、平衡和产生(5纳秒)分子动力学(MD)模拟持续50纳秒的累积采样时间。使用GAFF在模拟期间描述苯。苯的原子电荷(表4)使用R.E.D.服务器用与上文针对X₈(表2)和S₅(表3)残基所述的相同设置获得。

表2：(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸片段(X₈)的参数

表3：(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸片段(S5)的参数

部分电荷	GAFF/AMBER原子类型	原子名称
			0.4157-	N	N
0.2719	H	H
			0.5973	C	C
0.5679-	O	O
			0.0335	CT	CA
0.1254-	CT	CB1
			0.0371	HC	HB11,HB12
0.0414-	CT	CB2
			0.0351	HC	HB21,HB22,HB23
0.0092	CT	CG
			0.0310	HC	HG1,HG2
0.0559	CT	CD
			0.0190	HC	HD1,HD2
0.2280-	c2	CE
			0.1291	hc	HE

表4：苯的参数

部分电荷	GAFF原子类型	原子名称
			0.1259-	ca	C01,C02,C03,C04,C05,C06
0.1259	ha	H07,H08,H09,H10,H11,H12

轨迹分析

使用AMBER 11的ptraj模块生成苯占据栅格以将苯的碳原子放入1

栅格单元中。用于可视化苯占据的截止等量线值为阈值主体值的三倍，其定义为在主体溶剂中检测到苯的最高等值。这是用于滤除大多数假结合位点从而留下真正结合位点的任意标准。

肽设计

从对未结合和p53结合的Mdm2进行的两组配体映射模拟中的每一个中选择其中第二nutlin相互作用位点与苯分子结合的合适轨迹结构。选择苯埋藏最深的结构，并且这通过测量苯的质量中心与形成口袋基部的Leu107的Cγ原子之间的距离来确定。所选结构中Tyr100的侧链扭转角χ1也必须小于-170°以避免与肽骨架发生空间冲突。

在两个蛋白质结构叠加之后，通过从1YCR晶体结构提取来将p53肽(ETFSDLWKLLPEN；SEQ ID NO 12)建模到所选的未结合Mdm2结构上。使用PyMOL将苯丙氨酸残基附加到肽的C-末端，使得苯基与第二nutlin相互作用位点的苯密度最佳重叠。以相同的方式将C-末端苯丙氨酸添加到与选择的p53结合Mdm2结构中的肽。随后，如下将这些延伸的p53肽(ETFSDLWKLLPENF；SEQ ID NO:15)突变成噬菌体展示获得的装订肽(YS-01，TSFX₅EYWX₅LLSPENF；SEQ ID NO:1)：使其骨架保持固定并使用AMBER11中的tleap模块添加突变残基的侧链且在两个X₅残基之间形成反式双键。X₅表示(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸残基。使用tleap模块建模在C-末端具有酪氨酸替代苯丙氨酸的类似装订肽(YS-02，TSFX₅EYWX₅LLSPENY；SEQ ID NO:02)。

选择另外两种未结合Mdm2轨迹结构用于肽设计：一种在闭合构象中具有Tyr100，另一种在开放构象中具有Tyr100。这些结构具有最接近Met50的结合苯，其形成近端Pro27结合位点的基部。通过蛋白质结构叠加后从与SAH-p53-8结合的Mdm2的晶体结构(PDB3V3B)提取来将装订肽SAH-p53-8建模在其上。类似地，使用PyMOL将苯丙氨酸连接到装订肽的C-末端以产生YS-03肽(TSFX₈EYWALLS₅ENF；SEQ ID NO:3)，使得与近端Pro27位点的苯密度最佳重叠。使用tleap模块由YS-03建模类似YS-04肽(TSFX₈EYWALLS₅ENY；SEQ ID NO:4)的C-末端酪氨酸残基。

对八种建模的装订肽复合物(六种来自未结合的Mdm2，两种来自p53结合的Mdm2)各自进行显式溶剂分子动力学(MD)模拟50ns。在模拟期间，使用ff99SB-ILDN和GAFF(广义AMBER力场)力场来描述X₅残基。X₅的原子电荷(表5)使用R.E.D.服务器如较早针对X₈和S₅残基所述获得。所有的肽都通过乙酰基和酰胺基封端。

表5：(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸片段(X₅)的参数

分子力学/广义波恩表面积(MM/GBSA)

使用分子力学/广义波恩表面积(MM/GBSA)方法Mdm2复合物与野生型(WT)p53肽和两种设计的装订肽的结合自由能，其中复合物(G_复合物)、受体(G_受体)和配体(G_配体)的自由能单独计算并且结合自由能(ΔG_结合)如下获得：

ΔG_结合＝G_复合物-G_受体-G_配体

＝ΔE_MM+ΔG_sol-TΔS (等式1)

ΔG_结合被评价为分子机械能(ΔE_MM)(其包括范德华能、静电能和内能)、溶剂化自由能(ΔG_sol)(其包括极性和非极性贡献)和熵(-TΔS)的变化之和。

ΔE_MM＝ΔE_vdw+ΔE_ele+ΔE_int (等式2)

ΔG_sol＝ΔG_GB+ΔG_np (等式3)

G_np＝γ×SASA+β (等式4)

用于MM/GBSA计算的所有程序均来自AMBER 11。根据系统平衡何时发生(由其RMSD图的平稳指示)及其用sander模块计算的分子机械能，从每个轨迹的最后20至40纳秒提取200个等间隔的快照结构。使用Onufriev等描述的经改进广义波恩(GB)模型通过pbsa程序计算对溶剂化自由能的极性贡献(ΔG_GB)，同时使用molsurf程序用

和设置为零的β由溶剂可及表面积(SASA)估算非极性贡献(ΔG_np)。使用nmode程序通过正常模式分析估计熵。由于其计算费用，仅使用来自平衡轨迹部分的50个等间隔快照进行分析。

与YS-01结合的Mdm2的分子动力学(MD)模拟

使用YS-01结合Mdm2晶体结构的链A和F来起始模拟。保留在所选链的

内的所有结晶水，同时将双Mdm2突变E69A和K70A恢复到野生型状态。分别使用乙酰基和N-甲基封端Mdm2的N-和C-末端。使用与较早针对其他Mdm2复合物所述的相同设置和方案进行Mdm2/YS-01复合物的三次独立100纳秒分子动力学(MD)模拟。

基于T22 p53β-半乳糖苷酶的报道子测定

将用p53响应性β-半乳糖苷酶报道子稳定转染的T22细胞以8000个细胞/孔的细胞密度接种到96孔板中。还将细胞维持在包含10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的Dulbecco基本Eagle培养基(DMEM)中。将细胞孵育24小时，然后用化合物/肽在含有10％FBS的DMEM中处理18小时。使用FluoReporter LacZ/半乳糖苷酶量化试剂盒根据制造商的说明检测β-半乳糖苷酶活性。使用Safire II多板阅读器进行测量。实验单独进行两次。

基于ARN8β-半乳糖苷酶的报道子测定

将用p53响应性β-半乳糖苷酶报道子稳定转染的ARN8细胞以8000个细胞/孔的细胞密度接种到96孔板中。还将细胞维持在包含10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的Dulbecco基本Eagle培养基(DMEM)中。将细胞孵育24小时，然后用化合物/肽在含有10％FBS的DMEM中处理18小时。使用FluoReporter LacZ/半乳糖苷酶量化试剂盒根据制造商的说明检测β-半乳糖苷酶活性。使用Safire II多板阅读器进行测量。实验单独进行两次。

乳酸脱氢酶释放测定

将二者均用p53响应性β-半乳糖苷酶报道子稳定转染的T22细胞或ARN8细胞以5000个细胞/孔的细胞密度接种到96孔板中。还将细胞维持在包含10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的Dulbecco基本Eagle培养基(DMEM)中。将细胞孵育24小时，然后用化合物/肽在具有或不具有10％FBS的DMEM中处理2小时。使用非放射性细胞毒素测定试剂盒(Promega)根据制造商的说明检测细胞溶质乳酸脱氢酶释放。使用Envision多板阅读器进行测量。

T22 Western印迹分析

将T22鼠细胞以150 000个细胞/孔的细胞密度接种到12孔板中并孵育过夜。将细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的DMEM培养基中。在具有或不具有10％FBS的DMEM培养基中在指定时间点和浓度下用不同化合物/载剂对照处理细胞。用PBS清洗细胞，然后收获在50μl的1x NuPAGE LDS样品缓冲液(NP0008)中。然后，将样品声处理，加热至90℃5分钟，声处理10秒两次，并以13,000rpm离心5分钟。通过BCA测定测量蛋白质浓度。然后，使用针对肌动蛋白(AC-15)(作为上样对照)、p21(F-5小鼠；单克隆)、Mdm2(2A10小鼠单克隆)和p53(1C12；小鼠单克隆)的抗体进行Western印迹。

用于荧光极化竞争实验的Mdm2蛋白纯化

通过BAMH1和NDE1双重消化将Mdm2(1-125)连接到GST融合表达载体pGEX-6P-1中。然后，用GST标记(1-125)Mdm2构建体转化BL21 DE3感受态细菌。将表达Mdm2 GST融合构建体的细胞在37℃下在LB培养基中培养至OD600为约0.6，并在室温下用1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导。通过离心收获细胞，将细胞沉淀重悬于50mM Tris pH8.0,10％蔗糖中，然后声处理。将经声处理的样品在4℃下以17,000g离心60分钟。将上清液施加到5ml FF GST柱上，所述柱经在具有1mM二硫苏糖醇(DTT)的洗涤缓冲液(磷酸缓冲盐水，2.7mM KCL和137mM NaCl，pH 7.4)中预平衡。然后，用6体积的洗涤缓冲液进一步洗涤柱。然后，通过用PreScission蛋白酶切割从柱纯化Mdm2。向柱中注入在一个柱体积具有1mMDTT缓冲液的PBS中的10单位PreScission蛋白酶。使切割反应在4℃下进行过夜。然后，用洗涤缓冲液从柱洗脱切割的蛋白质。用SDS-PAGE分析蛋白质级分，并使用Centricon(3.5kDa分子量截留值(MWCO))浓缩器浓缩。

然后，将Mdm2蛋白样品透析到具有1mM DTT的含有20mM Bis-Tris(pH6.5)、0.05MNaCl的缓冲溶液中，并上样到经在缓冲液A(20mM Bis-Tris(pH 6.5)、1mM DTT)中预平衡的monoS column柱上。然后，将柱在6个柱体积的缓冲液A中洗涤，并在25个柱体积内用线性梯度的1M NaCl洗脱结合的蛋白质。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质级分，并使用Centricon(3.5kDa分子量截留值(MWCO))浓缩器浓缩。将切割的Mdm2(1-125)纯化至约90％纯度。使用A280测定以10430M^-1cm^-1的消光系数确定用于Mdm2(1-125)的蛋白质浓度。

荧光各向异性测定和解离常数(K_d)确定

将经纯化的Mdm2(1-125)针对50nM经羧基荧光素(FAM)标记的12-1肽(FAM-RFMDYWEGL-NH₂)进行滴定。通过将实验数据拟合为下示1:1结合模型方程来确定Mdm2和Mdm4针对FAM标记的12-1肽的滴定的解离常数：

[P]是蛋白质浓度(Mdm2/Mdm4)，[L]是经标记肽的浓度，r是所测量的各向异性，r0是游离肽的各向异性，r_b是Mdm2/4-经FAM标记肽复合物的各向异性，K_d是解离常数，[L]_t是总经FAM标记肽的浓度，[P]_t是总Mdm2/4浓度。将确定的表观K_d值(下表所示)用于在后续竞争测定中确定Mdm4和Mdm2针对各自竞争性配体的表观K_d值：

Mdm4 K<sub>d</sub>	Mdm2 K<sub>d</sub>	肽
			4.2nM	13.0nM	(FAM)-RFMDYWEGL-NH<sub>2</sub>

通过竞争性荧光各向异性实验确定不同分子的表观解离常数(K_d)值。进行滴定，在Mdm2和Mdm4的浓度分别在250nM和75nM保持恒定以及经标记肽在50nM保持恒定下进行滴定。然后，将竞争性分子针对经FAM标记肽和蛋白质的复合物进行滴定。通过将实验数据拟合到下示等式来确定表观解离常数(K_d)值：

d＝K_d1+K_d2+[L]_st+[L]_t-[P]_t

(等式6-2)

e＝([L]_t-[P]_t)K_d1+([L]_st-[P]_t)K_d2+K_d1K_d2 (等式6-3)

f＝-K_d1K_d2[P]_t (等式6-4)

[L]_st和[L]_t分别表示经标记配体和总未标记配体的输入浓度。K_d2是未标记配体与蛋白质之间相互作用的解离常数。在所有的竞争类型实验中，假设[P]_t＞[L]_st，否则总是存在相当量的游离经标记配体并其干扰测量结果。K_d1是在各实验中使用的经标记肽的表观K_d，其已经如前段所述通过实验测定。将经FAM标记的肽以1mM溶解在二甲基亚砜(DMSO)中并稀释到实验缓冲液中。阅读是用Envision多标记阅读器进行读数。实验在PBS(2.7mMKCl、137mM NaCl、10mM Na₂HPO₄和2mM KH₂PO₄(pH 7.4))和0.1％Tween 20缓冲液中进行。所有滴定均以一式三份进行。使用Prism 4.0(GraphPad)进行曲线拟合。

为了验证1∶1结合模型的拟合，仔细分析了在Mdm2/Mdm4与经FAM标记肽之间直接滴定开始时的各向异性值与观察到的游离的经荧光标记肽观察到的各向异性值没有显著差异。还用经荧光标记的肽(不存在Mdm2/4)进行所研究配体的阴性对照滴定，以确保配体和经FAM标记肽之间不发生相互作用。此外，确保竞争性滴定中的最终基线不低于游离经荧光标记肽的各向异性值，否则这指示配体与经FAM标记肽之间的不期望相互作用而从Mdm2/4结合位点移离。

蛋白质纯化和结晶

将Mdm2 17-125 E69AK70A克隆到具有N末端谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合体的pGEX6P-1质粒中，并在BL21(DE3)pLysS大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。将细胞在37℃下在Luria-Bertani(LB)培养基中培养，直至在600nm下的光密度(OD600)为0.6，用0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导并在20℃孵育过夜。将细胞沉淀重悬于补充有250μg/ml溶菌酶、50μg/ml RNA酶A、10μg/ml DNA酶I和5mM MgCl₂的缓冲液A(20mM HEPESpH7.4、100mM NaCl、5mM二硫苏糖醇(DTT)中。通过声处理裂解细胞，并通过离心(50,000xg，4℃，1小时)使裂解物澄清。将上清液与谷胱甘肽珠孵育过夜，然后用缓冲液A洗涤，并用补充有20mM谷胱甘肽的缓冲液A洗脱。用PreScission 3C蛋白酶去除GST融合体，然后将样品上样到在缓冲液A中平衡的Superdex 75 26/60凝胶过滤柱上。将经纯化的Mdm2 17-125E69AK70A稀释至0.5mg/ml，并与YS01或YS02以1:1.1摩尔比在4℃下孵育过夜。将两种复合物浓缩至5mg/ml用于结晶。

将与YS-01复合的Mdm2的晶体在0.1M柠檬酸钠pH 4.2、0.2M NaCl和20％PEG8000的条件下生长。将这些晶体用于数据收集和用于接种到Mdm2-YS-02盘中。使用籽晶珠根据制造商的说明产生籽晶，然后与Mdm2 YS-02以及0.1M柠檬酸钠pH 4.0和15％PEG8000的沉淀剂以1:3:2的比例合并。将YS-01和YS-02晶体在补充有20％聚乙二醇400(PEG400)的储液溶液中冷冻保护，并在液氮中快速冷却。在金刚石光源下在束线I04(YS-01)或束线I04-1(YS-02)上在100K下对单晶收集衍射数据。将数据用xia2处理，然后在CCP4i中用Aimless和Pointless再处理。用Phaser进行分子置换，并利用用Refmac进行精化循环和在Coot中进行人工校正来精化模型。用MolProbity验证最终的模型。数据收集和精化统计量示于表6中。坐标储存在蛋白质数据库(PDB)中。

表6：数据收集和精化统计学。用于最高分辨壳的统计量包括在括号中。

表7：肽序列的表格

序列表

<110> 新加坡科技研究局

<120> 非膜破坏性p53活化装订肽

<130> 9869SG3615

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-01；封端，意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 1

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Xaa Leu Leu Pro Glu Asn Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-02；封端，意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 2

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Xaa Leu Leu Pro Glu Asn Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-03；封端,意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 3

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa Glu Asn Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-04；封端,意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 4

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa Glu Asn Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-05；封端,意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可以是任意天然存在氨基酸

<400> 5

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Xaa Leu Leu Xaa Glu Asn Phe

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-06；封端,意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可以是任意天然存在氨基酸

<400> 6

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Xaa Leu Leu Xaa Glu Asn Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-07；封端,意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是氨基己酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 7

Lys Lys Xaa Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa Glu Asn

1 5 10 15

Phe

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-08；封端,意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是氨基己酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 8

Lys Lys Xaa Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa Glu Asn

1 5 10 15

Tyr

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-08；封端,意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是氨基己酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 9

Arg Arg Arg Xaa Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa Glu

1 5 10 15

Asn Phe

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-10；封端,意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是氨基己酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 10

Arg Arg Arg Xaa Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa Glu

1 5 10 15

Asn Tyr

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-11 (SAH-p53-8)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或

(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 11

Gln Thr Phe Xaa Asn Leu Trp Arg Leu Leu Xaa Gln Asn

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> p53 WT

<400> 12

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn

1 5 10

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> p53 WT-1

<400> 13

Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn

1 5 10

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> p53-WT (封端; 意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端)

<400> 14

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 延伸的p53-a

<400> 15

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Phe

1 5 10

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 延伸的p53-b

<400> 16

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 延伸的p53-c

<400> 17

Thr Ser Phe Ser Glu Tyr Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Phe

1 5 10

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 延伸的p53-d

<400> 18

Thr Ser Phe Ser Glu Tyr Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-01 (未封端)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 19

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Xaa Leu Leu Pro Glu Asn Phe

1 5 10

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-02 (未封端)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或

(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 20

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Xaa Leu Leu Pro Glu Asn Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-03 (未封端)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或

(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 21

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa Glu Asn Phe

1 5 10

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> YS-04 (未封端)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或

(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 22

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa Glu Asn Tyr

1 5 10

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 12-1肽

<400> 23

Arg Phe Met Asp Tyr Trp Glu Gly Leu

1 5

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> sMTide-02 (封端;意指乙酰化N-末端, NH2在C-末端）

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或

(S)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸

<400> 24

Thr Ser Phe Xaa Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Xaa

1 5 10

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Mdm2结合表位

<400> 25

Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu

1 5

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> p53 WT-2

<400> 26

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu

1 5 10

Claims (26)

1.一种由以下氨基酸序列组成的肽：

TSFXaa₁EYWXaa₃LLXaa₂ENXaa₅

其中所述肽是具有使第一氨基酸Xaa₁与第二氨基酸Xaa₂连接的交联接头的交联肽；Xaa₁是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸，Xaa₂是(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，Xaa₃是A，Xaa₅是F或Y；或者

其中所述肽是具有使第一氨基酸Xaa₁与第二氨基酸Xaa₃连接的交联接头的交联肽，Xaa₁是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，Xaa₃是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸，并且Xaa₂是S或P，Xaa₅是F或Y。

2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽由下式组成：

或者

其中：

R₁是-C(OH)CH₃[T]；

R₂是-CH₂OH[S]；

R₃是苄基[F]；

R₄是-CH₃[(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸]；

R₅是-(CH₂)₂C(O)OH[E]；

R₆是-CH₂-苯基-OH[Y]；

R₇是Trp的侧链，其中Trp的C₆被氢或卤素取代，和/或其中Trp独立地是L或D光学异构体；

R₈是-CH₃[A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸]；

R₉和R₁₀是-CH₂CH(CH₃)₂[L]；

R₁₁是-CH₂OH[S]或-(CH₂)₃-[P]或-CH₃[(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸]；

R是C₈烯基或C₁₁烯基；

R₁₂是-(CH₂)₂C(O)OH[E]；

R₁₅是-CH₂C(O)NH₂[N]；

R₁₆是苄基[F]或-CH₂-苯基-OH[Y]。

3.根据权利要求2所述的肽，其中所述肽的N-末端或C-末端进一步与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。

4.根据权利要求3所述的肽，其中所述接头是共价接头。

5.根据权利要求3或4中所述的肽，其中所述接头的长度为1至20个氨基酸。

6.根据权利要求4所述的肽，其中所述共价接头选自由烃接头或疏水性烃接头组成的组。

7.根据权利要求6所述的肽，其中所述烃接头包含Ahx(氨基己酸)。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的肽，其中序列Z_n与如权利要求3至7中任一项限定的接头的未结合端连接，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，以及其中Z是具有单个局部正电荷的分子。

9.根据权利要求8所述的肽，其中n是1或2或3。

10.根据权利要求8或9所述的肽，其中Z选自由丁胺、精氨酸[R]或赖氨酸[K]组成的组。

11.根据权利要求3至10中任一项所述的肽，其中所述接头和权利要求8至10中任一项所述的序列Z由以下组成：序列Ac-KK-Ahx(乙酰化-Lys-Lys-氨基己酸)或Ac-RRR-Ahx(乙酰化-Arg-Arg-Arg-氨基己酸)。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的肽，其中所述肽由选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列组成。

13.根据权利要求3至11中任一项所述的肽，其中所述肽由选自由SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的组的序列组成。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的肽，其中所述肽已经历选自由添加一个或更多个磷酰基组成的组的翻译后修饰。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的肽，其中所述肽被修饰以包含选自由以下组成的组的一种或更多种配体：羟基、磷酸酯、胺、酰胺、硫酸酯、硫化物、生物素部分、碳水化合物部分、脂肪酸衍生酸基团、荧光部分、生色团部分、放射性同位素、PEG接头、亲和标记、靶向部分、抗体、细胞穿透性肽以及上述配体的组合。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的肽，其中通过添加独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组的一个或更多个卤素来修饰所述肽的第7位的W。

17.根据权利要求16所述的肽，其中所述肽包含1、2、3、4或5个卤素。

18.根据权利要求16所述的肽，其中通过在W的C₆位添加卤素来修饰第7位的W和/或其中W独立地是L或D光学异构体。

19.根据权利要求17至18中任一项所述的肽，其中所述卤素为Cl。

20.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的肽。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含另外的治疗性化合物。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述另外的治疗性化合物是促进凋亡化合物。

23.根据权利要求1至19中任一项所述的肽在制备用于在患者中治疗或预防癌症的药物中的用途。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述用途包括一种或更多种另外的治疗剂是要被同时地、顺序地或单独地施用至所述患者。

25.根据权利要求23或24所述的用途，其中所述癌症选自胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、黑素瘤和白血病。

26.根据权利要求24至25中任一项所述的用途，其中患有或怀疑患有癌症的所述患者包含肿瘤，所述肿瘤具有p53缺陷型肿瘤细胞或具有含有引起所述癌症的突变的p53基因。

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