KR20230074784A - 아릴피롤 유도체의 약학적 염 - Google Patents

아릴피롤 유도체의 약학적 염 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (R)-4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]벤즈아미드 (+)-L-타르트레이트 염, 그의 제조 방법, 그 염을 함유하는 약학 조성물 및 암과 같은 질환의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

아릴피롤 유도체의 약학적 염
본 발명은 트리-아릴 피롤 화합물의 회전장애 이성질체의 약학적 염, 그의 제조 방법, 그것을 함유하는 약학 조성물 및 암과 같은 질환의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
정상 KRAS 유전자에 의하여 발현되는 단백질은 정상 조직 신호전달에서 필수적인 기능을 수행한다. 단일 아미노산 치환, 특히 단일 뉴클레오티드 치환에 의한 KRAS 유전자의 돌연변이는 다수의 암의 발생에서 필수 단계인 활성화 돌연변이의 원인이 된다. 결과로 초래되는 돌연변이된 단백질은 폐 선암종, 점액 선종, 췌장의 도관 암종 및 결장직장 암종을 포함한 각종 악성종양에 연루되어 있다. Ras 패밀리의 기타 구성원과 같이, KRAS 단백질은 GTPase이며, 다수의 신호 형질도입 경로에 관련되어 있다.
KRAS는 분자 온/오프 스위치로서 작용한다. 일단 온 상태로 되면, 그것은 c-Raf 및 PI-3 키나제와 같이 성장 인자 및 기타 수용체의 신호의 전파에 필요한 단백질을 동원 및 활성화시킨다. 정상 KRAS는 활성 상태로 GTP에 결합되며, 뉴클레오티드의 말단 포스페이트를 분할하여 이를 GDP로 전환시키는 고유 효소 활성을 갖는다. GTP의 GDP로의 전환시 KRAS는 오프 상태가 된다. 전환율은 일반적으로 느리지만, GTPase-활성화 단백질(GAP) 부류, 예를 들면 RasGAP의 부속 단백질에 의하여 크게 가속될 수 있다. 다시 KRAS는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF) 부류, 예를 들면 SOS1의 단백질에 결합될 수 있으며, 이는 결합된 뉴클레오티드의 방출을 강제하게 된다. 그 후, KRAS는 시토솔 중에 존재하는 GTP를 결합시키며, GEF는 ras-GTP로부터 방출된다. 돌연변이 KRAS에서, 그의 GTPase 활성은 직접 제거되어 KRAS가 구성적으로 활성 상태가 되게 한다. 돌연변이 KRAS는 종종 코돈 12, 13, 61 또는 이들의 혼합에서의 돌연변이를 특징으로 한다.
돌연변이 KRAS를 지니는 암 세포의 생존율은 폴로-유사 키나제 1(PLK1)에 의존하는 것으로 공지되어 있으며, 이는 침묵 PLK1이 돌연변이 KRAS를 함유하는 세포사를 초래하는 것으로 밝혀졌다(Luo et al., Cell. 2009 May 29; 137(5): 835-848 참조). 그러므로, PLK1을 억제시키는 화합물은 KRAS 돌연변이로부터 야기되는 암의 치료에 유용하여야 하지만, PLK1의 보존된 ATP 결합 도메인에 결합되도록 설계된 통상의 키나제 억제제는 기타 키나제에 대하여 비선택성이 커서 상기 유형의 작용에 접근할 수 없게 한다(예를 들면, Elsayed et al., Future Med . Chem. (2019) 11(12), 1383-1386 참조).
PLK1은 603개의 아미노산으로 이루어지며, 66 kDa의 분자량을 갖는 세린/트레오닌 키나제이며, 세포 주기의 중요한 조절자이다. 특히, PLK1은 유사분열에 중요하며, 유사분열 방추에서의 형성 및 변화에 관련되고 세포 주기의 M 단계 중에 CDK/사이클린 복합체의 활성화에 관련된다.
모든 폴로-유사 키나제는 N 말단 세린/트레오닌 키나제 촉매 도메인, 및 1 또는 2개의 폴로-박스를 함유하는 C 말단 영역을 함유한다(Lowery et al., Oncogene, (2005), 24, 248-259). 폴로-유사 키나제 1, 2 및 3의 경우, 폴로-박스 둘다를 포함한 전체 C 말단 영역은 폴로-박스 도메인(PBD)으로서 공지된 단일 모듈 포스포세린/트레오닌 결합 도메인으로서 작용한다. 결합된 기질의 부재하에서, PBD는 키나제 도메인의 기초 활성을 억제한다. PBD의 그의 리간드로의 인산화 의존성 결합은 키나제 도메인을 방출하고, 동시적으로 폴로-유사 키나제를 특정 세포하 구조에 국소화시킨다.
PLKL1이 그의 폴로-박스 도메인을 경유하여 그의 세포내 고정 부위로 국소화하므로, PLK1의 작용은 PBD의 기능을 억제하여 그의 세포내 국소화를 간섭하는 소분자에 의하여 억제될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Reindl et al., Chemistry & Biology, 15, 459-466, May 2008).
종양 단백질 p53은 종양 억제자로서 기능을 하며, 아폽토시스, 게놈 안정성 및 혈관신생의 억제에 역할을 한다. p53 결핍 및 높은 PLK1 발현 둘다를 갖는 종양은 PLK1 억제제에 대하여 매우 민감성일 수 있는 것으로 공지되어 있다(Yim et al., Mutat Res Rev Mutat Res, (2014). 761, 31-39).
그래서, 그 문헌에서의 증거는 PBD에 결합되어 그의 기능을 억제하는 소분자가 PLK1 키나제의 효과적인 억제제이어야 하며, 그러므로 또한 KRAS 및/또는 p53 돌연변이로부터 야기되는 암의 치료에 유용하여야 한다는 것을 시사한다. 특히, PBD 도메인이 오직 PLK에만 존재하므로, 상기 도메인에 설계된 억제제가 종래의 ATP 경쟁적 억제제에 비하여 더 큰 선택성을 가질 가능성은 KRAS 돌연변이 및 p53 결핍 암을 표적화하는 더 큰 능력을 가능케 할 수 있다.
원발성 뇌암의 치료를 위한 약물의 식별 및 개발은 매우 도전적인 것으로 입증되었다. 표적화된 암 요법, 특히 단백질 키나제 억제제를 사용하는 요법은 약학 및 생명공학 회사의 주된 관심사가 되고 있다(Nature Reviews Clinical Oncology 2016, 13, 209-227). 그러나, 30여종의 키나제 억제제가 종양학에서의 사용이 승인되기는 하였으나, 이들 중 어느 것도 원발성 뇌암의 치료를 위한 것은 아니었다. 특정한 문제는 승인된 키나제 억제제 종양학 약물의 대부분이 뇌암의 치료에 사용되는 경우 요구되는 뇌 노출을 달성하는데 필요한 약물 물질 품질을 결여하고 있다는 점이다[JMC 2016, 59(22), 10030-10066].
알킬화제 테모졸로미드(테모다르(Temodar)®, 테모달(Temodal)®)는 현재 뇌암 다형성 아교모세포종에 대한 1차 치료이며, 종종 방사선 요법과의 병용으로 사용된다. 그러나, 약물 내성은 교모세포종의 관리에서 주요한 문제가 되며, 그러므로 테모졸로미드의 유용성을 제한한다. 그러므로, 현재, 악성 교모세포종은 여전히 치료 불가하다.
폴로-유사 키나제 1(PLK1)은 다형성 아교모세포종을 포함한 일련의 종양 유형에서 과발현된다(Translational Oncology 2017, 10, 22-32). 더욱이, 최근 연구에 의하면, PLK1이 다형성 아교모세포종에서 테모졸로미드에 대한 내성 및 체크포인트 적응을 유도하는 것으로 밝혀 졌다[Oncotarget 2017, 8, 15827-15837].
뇌실막세포종은 수술 및 방사선으로 제한된 현재의 진료 표준을 사용한 뇌 및 척수의 종양이다. PLK1은 뇌실막세포종과 연관되어 있으며, PLK1의 억제제는 뇌실막세포종 세포주에 대하여 활성이다[Gilbertson et al., Cancer Cell (2011) 20, 384-399].
PLK1은 또한 산재적 내재성 뇌교종(DIPG), 고 등급 공격성 소아 뇌 종양에 대한 표적으로서 연구되어 왔다[Amani et al., BMC Cancer (2016) 16, 647 and Cancer Biology and Therapy (2018) 19, 12, 1078-1087].
보다 구체적으로, PLK1의 억제는 IDH1 돌연변이 신경교종에서의 테모졸로미드 효능을 향상시는 것으로 밝혀 졌고[Oncotarget, (2017) 8, 9, 15827-15837], MMR 결핍, 테모졸로미드 내성 교모세포종 이종이식 모델에서의 종양 성장을 억제시키는 것으로 밝혀 졌다[Mol Cancer Ther; 17(12) December 2018].
상기 경우에서는, 통상의 억제제가 충분한 뇌 노출이 부족하다.
약물 내성을 유도하지 않으면서 PLKL1을 억제하며, 우수한 뇌 노출을 나타내는 화합물은 다형성 아교모세포종 및 기타 뇌 암의 치료에서 유용할 것으로 예상된다.
PLK4는 중심체 복제에서 결정적인 역할을 하여 중심소체 복제의 중심 조절자로서 작용하는 세린/트레오닌 키나제의 폴로-유사 키나제 패밀리 구성원이다(Bettencourt-Dias, Curr Biol. 2005 15(24);2199-207). 중심체에서 PLK4 의존성 변성은 유사분열에서의 비대칭 염색체 분리를 초래할 수 있는데, 이는 염색체 오분리후 세포사 및 유사분열 결함을 촉발시킬 수 있다.
PLK4는 사람 암에서 이상 발현되며, 종양발생 및 전이에 연루되어 있다. 그 결과, PLK4는 암 요법을 위한 유망한 표적으로서 강조되어 왔다(Zhao, J Canc Res Clin Oncol., 2019).
PLK4는 뇌의 간상 종양, 수모세포종 및 기타 배아성 종양(Pediatr Blood Cancer. 217)뿐 아니라, 유방암, 폐암, 흑색종, 위암, 결장직장암, 췌장암 및 난소암을 포함한 다수의 암에서 과발현된다. 증가되거나 또는 과활성화된 PLK4는 난소암, 유방암 및 폐암을 포함한 암 환자에서의 불량한 생존율과 관련되어 있다(Zhao, J Canc Res Clin Oncol ., 2019).
PLK4 억제는 다형성 아교모세포종의 치료를 위하여 연구되어 왔으며, PLK4는 테모졸로미드 화학민감성의 조절에서 결정적인 역할을 하는 것으로 입증되었다. 교모세포종 PDX 모델에서 PLK4의 억제와 테모졸로미드의 조합은 테모졸로미드 단독에 비하여 항종양 효과를 향상시키는 것으로 밝혀 졌다(Cancer Letters, Vol 443, 2019, 91-107).
PLK4는 암 발생에서 p53 불활성화와 협력하는 것으로 보고되며, PLK4 과발현 및 p53 결핍을 갖는 암은 종양을 형성하기 쉬운 것으로 예상된다(Sercin, 2016; Nat Cell Biol 18:100-110). 그러므로, PLK4 활성을 억제하는 화합물은 p53 돌연변이 암의 치료에서 유용할 것으로 예상된다.
PLK4의 억제는 폐암에서 항종양 활성을 결과로 유도하며, 활성은 야생형 및 돌연변이 KRAS를 지닌 암에서 나타난다(Kawakami, PNAS 2018, 115(8) 1913-18). 그러므로, PLK4 활성을 억제하는 화합물은 KRAS 돌연변이 암의 치료에서 유용할 것으로 예상된다.
통상의 PLK4 억제제는 키나제 활성 부위에서 작용하며, 뇌 침투에 최적이지는 않다(Int . J. Mol . Sci. 2019, 20, 2112). 그러므로, PLK4 PBD를 억제하지만, 또한 우수한 뇌 노출을 나타내는 화합물은 다형성 아교모세포종 및 기타 뇌암의 치료에서 유용할 것으로 예상된다.
본 출원인의 이전의 국제 특허 출원 WO2018/197714에서는 하기 화학식의 화합물을 개시하고 있다:
Figure pct00001
상기 식에서, 고리 X는 벤젠 또는 피리딘 고리이며, 고리 Y는 벤젠, 피리딘, 티오펜 또는 푸란 고리이며, Ar1은 임의로 치환된 벤젠, 피리딘, 티오펜 또는 푸란 고리이며, R1 내지 R4, R6, R7은 수소 또는 다양한 치환기이다. 상기 화합물은 항암 활성을 가지며, 경구 투여후 우수한 뇌 노출을 가져서 뇌암의 치료에 대한 우수한 후보물질이 되는 것으로 기재되어 있다. 상기 화합물은 교모세포종 세포주에 대하여 활성이며, PLK1 키나제의 폴로-박스 도메인의 억제제로서 작용하는 것으로 여겨진다. 또한, 상기 화합물은 돌연변이 RAS 암 세포주(예컨대, HCT116)에 대하여 활성이며, 또한 KRAS 돌연변이로부터 야기되는 암의 치료에 유용할 것이라는 점도 개시되어 있다.
본 발명
현재 WO 2018/197714의 실시예 33의 화합물, 이른바 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드 및 그의 유사체는 회전장애 이성질체를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 회전장애 이성질체는 단일 결합 축 주위에서의 방해된 회전으로부터 결과로 얻어지는 입체이성질체이며, 여기서 회전 장애에 대한 에너지 장애는 개개의 회전 이성질체의 단리를 허용하기에 충분히 높다. 문헌[LaPlante et al., J. Med . Chem., 54:7005-7022 (2011)]을 참조할 수 있다.
회전장애 이성질체는 키랄 축에 있어서 회전에 의하여 라세미화되는데 필요한 에너지의 양 및 라세미화를 발생시키는데 요구되는 시간의 길이에 기초하여 3가지 카테고리로 분류될 수 있다. 부류 1 회전장애 이성질체는 < 84 kJ/mol(20 kcal/mol)의 키랄 축 주위에서 회전에 대한 장애를 지니며, 실온에서 수분 이하로 측정되는 시간 기간에 걸쳐 라세미화되며; 부류 2 회전장애 이성질체는 84 내지 117 kJ/mol(20-28 kcal/mol)의 회전에 대한 장애를 지니며, 실온에서 수 시간 내지 수 개월 내로 측정된 시간 기간에 걸쳐 라세미화되며; 부류 3 회전장애 이성질체는 > 117 kJ/mol(28 kcal/mol)의 회전에 대한 장애를 지니며, 실온에서 수 년 내로 측정된 시간 시간에 걸쳐 라세미화된다.
회전장애 이성질체의 입체화학 구조는 (S)-6,6'-디니트로비페닐-2,2'-디카르복실산에 의하여 예시된 칸-인골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog) R 및 S 시스템을 이용하여 할당될 수 있다.
상기 시스템에서, 아릴-아릴 결합의 둘 중 하나의 측에서 가장 근접한 치환기는 a-b-c-d의 순서로 우선 순위로 할당된다. 치환기 a, b 및 c가 시계반대방향으로 배열되어 있으므로, 회전장애 이성질체는 S 이성질체이다. 해당 R 이성질체에서는, 치환기 a, b 및 c가 시계방향으로 배열된다.
4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 회전장애 이성질체 및 그의 유사체는 단리 및 특성화하기에 충분히 안정하며, 80℃ 이하의 온도로 10 일의 기간 동안 가열할 때에도 임의의 상당한 정도로 라세미화되지 않는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 본 발명의 회전장애 이성질체는 부류 3 회전장애 이성질체로서 분류될 수 있다. 2-트리플루오로메틸 치환기 및 피롤 고리의 2- 및 5-위치에 부착된 방향족 고리 사이의 입체적 상호작용이 2-트리플루오로메틸-치환된 고리와 피롤 고리의 질소 원자 사이의 결합 주위에서의 회전을 방지하기 때문에, 회전장애 이성질체화가 발생하는 것으로 여겨진다.
4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 2개의 개별적인 회전장애 이성질체는 상당히 상이한 생물학적 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그래서, 통상적으로 쌍으로 된 2종의 회전장애 이성질체 중 하나는 해당 쌍의 다른 회전장애 이성질체보다 특정 암 표적에 대하여 훨씬 더 큰 활성을 갖는다. 관심의 생물학적 표적에 대하여 더 우수한 생물학적 활성을 갖는 회전장애 이성질체는 단일 결정의 X선 분석에 의하여 R 배열, 즉 하기 화학식 (1)을 갖는 것으로 밝혀졌다:
Figure pct00002
산과 염기 사이의 약 1:1 몰비를 갖는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 (+)-L-타르타르산 염은 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 유리 염기 형태 및 그의 화합물의 기타 염에 비하여 이점을 갖는 것으로 추가로 밝혀졌다.
(+)-L-타르타르산은 결정성이 크고, 유리 염기에 비하여 개선된 수용해도와 함께 표면 수분(90% RH에서 < 1%)만을 흡수하는 안정한 고체다는 점에서 매우 유리하다. 이러한 특성들은 약학적 개발에 매우 적합하게 된다.
따라서, 제1의 실시양태(실시양태 1.1)에서 본 발명은 산과 염기 간의 대략 1:1 몰비를 갖는 (R)-4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]벤즈아미드 (+)-L-타르타르산 염을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 하기를 제공한다:
1.2. 하기 화학식 (2)를 갖는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 (+)-L-타르타르산 염:
Figure pct00003
1.3. 산과 염기 사이의 대략 1:1 몰비가 존재하고, 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-벤즈아미드가 단일 회전장애 이성질체의 형태로 존재하는 것인 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 (+)-L-타르타르산 염.
1.4. 실시양태 1.3에 있어서, 단일 회전장애 이성질체가 화학식 (1)의 회전장애 이성질체인 (+)-L-타르타르산 염.
1.5. 실시양태 1.3에 있어서, 단일 회전장애 이성질체가 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 R 회전장애 이성질체인 (+)-L-타르타르산 염.
1.6. 실시양태 1.3에 있어서, 단일 회전장애 이성질체가 하기 파라미터 중 임의의 하나 이상을 특징으로 하는 것인 (+)-L-타르타르산 염:
(i) 실질적으로 본원의 실시예 3에 기재된 바와 같은 X선 결정학 데이타;
(ii) 본원의 키랄 HPLC 방법 1에 의한 측정시 대략 20 분(예, 대략 20.5 분)의 체류 시간; 및
(iii) 본원의 실시예 2에 기재된 방법을 이용한 측정시 대략 -11.76°의 비선광도.
1.7. 실시양태 1.3에 있어서, 단일 회전장애 이성질체가 본원의 실시예에서 기재된 바와 같은 회전장애 이성질체 A-2인 (+)-L-타르타르산 염.
1.8. 실시양태 1.3에 있어서, (+)-L-타르타르산 염이 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 것인 (+)-L-타르타르산 염.
1.9. 실시양태 1.1 내지 1.8 중 어느 하나에 있어서, 결정질 형태로 존재하는 (+)-L-타르타르산 염.
1.10. 실시양태 1.9에 있어서, 무수화물인 (+)-L-타르타르산 염.
1.11. 실시양태 1.10에 있어서, 패턴 B로서 본원에서 확인된 무수화물인 (+)-L-타르타르산 염.
1.12. 실시양태 1.9에 있어서, 용매화물인 (+)-L-타르타르산 염.
1.13. 실시양태 1.12에 있어서, 패턴 A로서 본원에서 확인된 용매화물인 (+)-L-타르타르산 염.
1.14. 실시양태 1.3 내지 1.13 중 어느 하나의 (+)-L-타르타르산 염을 포함하는 물질의 조성물로서, (a) 단일 회전장애 이성질체가 조성물 중에 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 단 하나의 회전장애 이성질체이거나, 또는 (b) 상기 단일 회전장애 이성질체에 대하여 10 몰% 미만의 양의 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 임의의 기타 회전장애 이성질체가 존재하는 것인 물질의 조성물.
1.15. 실시양태 1.14에 있어서, (a) 단일 회전장애 이성질체가 조성물 중에 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 단 하나의 회전장애 이성질체이거나, 또는 (b) 상기 단일 회전장애 이성질체에 대하여 5 몰% 미만의 양의 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 임의의 기타 회전장애 이성질체가 존재하는 것인 물질의 조성물.
1.16. 실시양태 1.14에 있어서, (a) 단일 회전장애 이성질체가 조성물 중에 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 단 하나의 회전장애 이성질체이거나, 또는 (b) 상기 단일 회전장애 이성질체에 대하여 2 몰% 미만의 양의 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 임의의 기타 회전장애 이성질체가 존재하는 것인 물질의 조성물.
1.17. 실시양태 1.14에 있어서, (a) 단일 회전장애 이성질체가 조성물 중에 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 단 하나의 회전장애 이성질체이거나, 또는 (b) 상기 단일 회전장애 이성질체에 대하여 1.5 몰% 미만의 양의 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 임의의 기타 회전장애 이성질체가 존재하는 것인 물질의 조성물.
1.18. 실시양태 1.14에 있어서, (a) 단일 회전장애 이성질체가 조성물 중에 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 단 하나의 회전장애 이성질체이거나, 또는 (b) 상기 단일 회전장애 이성질체에 대하여 1 몰% 미만의 양의 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 임의의 기타 회전장애 이성질체가 존재하는 것인 물질의 조성물.
1.19. 실시양태 1.14에 있어서, (a) 단일 회전장애 이성질체가 조성물 중에 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 단 하나의 회전장애 이성질체이거나, 또는 (b) 상기 단일 회전장애 이성질체에 대하여 0.1 몰% 미만의 양의 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 임의의 기타 회전장애 이성질체가 존재하는 것인 물질의 조성물.
정의
실시양태 1.1 내지 1.19 중 임의의 하나에서 정의된 바와 같은 (R)-4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]벤즈아미드 (+)-L-타르타르산 염, 및 화학식 (2)의 화합물은 "본 발명의 타르트레이트 염"으로서 총괄적으로 또는 총칭적으로 지칭될 수 있다. 그러므로, "본 발명의 타르트레이트 염"의 지칭은, 문맥이 달리 지시하고 있지 않는 한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 임의의 하나의 지칭으로 할 수 있다.
동위원소
실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 물질의 조성물, 화합물 또는 염은 하나 이상의 동위원소 치환을 함유할 수 있으며, 특정한 원소에 대한 언급은 그의 범주 내에서 원소의 모든 동위원소를 포함한다. 예를 들면, 수소에 대한 언급은 그의 범주 내에서 1H, 2H(D) 및 3H(T)를 포함한다. 유사하게, 탄소 및 산소에 대한 언급은 그의 범주 내에서 각각 12C, 13C 및 14C 및 16O 및 18O를 포함한다.
동위원소는 방사성 또는 비방사성일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 물질의 조성물 또는 회전장애 이성질체는 방사성 동위원소를 함유하지 않는다. 상기 화합물은 치료적 용도에 바람직하다. 그러나, 또 다른 실시양태에서, 물질의 조성물 또는 회전장애 이성질체는 하나 이상의 방사성 동위원소를 함유할 수 있다. 상기 방사성 동위원소를 함유하는 화합물은 진단적 문맥에서 유용할 수 있다.
용매화물 및 무수화물
실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 물질의 조성물, 화합물 또는 염은 용매화물 및 무수화물을 형성할 수 있다.
특정한 용매화물은 본 발명의 물질의 조성물 또는 회전장애 이성질체의 고체 상태 구조(예, 결정 구조) 내로 비독성 약학적으로 허용되는 용매(하기에서 용매화 용매로서 지칭됨)의 분자를 혼입함으로써 형성된 용매화물이다. 용매화물은 용매 또는 용매화 용매를 함유하는 용매의 혼합물로 본 발명의 물질의 조성물 또는 회전장애 이성질체를 재결정화시킴으로써 제조될 수 있다. 용매화물이 임의의 제시된 예로 형성되는지의 여부는 물질의 조성물 또는 회전장애 이성질체의 결정을 널리 공지된 표준 기술, 예컨대 열중량 분석(TGE), 시차 주사 열량법(DSC) 및 X선 분말 회절(XRPD)을 사용하는 분석으로 처리함으로써 결정될 수 있다.
용매화물은 화학량론적 또는 비화학량론적 용매화물일 수 있다.
용매화물의 예는 물, 알콜(예, 메탄올, 에탄올 및 이소프로필 알콜), 알킬-알카노에이트 에스테르(예, 에틸 아세테이트 및 이소프로필 아세테이트), 에테르(특히 시클릭 에테르, 예컨대 1-4-디옥산 및 테트라히드로푸란) 및 모노시클릭 락탐(예, N-메틸피롤리돈)으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 용매에 의해 형성된 것이다.
용매화물, 및 그를 제조 및 특성화하는데 이용되는 방법의 보다 상세한 논의에 관해서는, 문헌[Bryn et al., Solid-State Chemistry of Drugs, Second Edition, published by SSCI, Inc of West Lafayette, IN, USA, 1999, ISBN 0-967-06710-3]을 참조할 수 있다.
용매화물의 형성 이외에, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 물질의 조성물, 화합물 또는 염은 무수화물의 형태로 제공될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "무수화물"은, 염 또는 화합물의 입자가 그의 외부 표면에 결합된 물 분자를 가질 수 있긴 하지만, 그의 3차원 구조(예, 결정질 형태) 내에 물을 함유하지 않는 (바람직하게는 임의의 기타 용매를 함유하지 않는) 고체 미립자 형태를 지칭한다.
본 발명의 화합물의 제조 방법
본 발명의 (+)-L-타르타르산 염은 타르타르산을 용매 또는 용매의 혼합물 중에서 반응시킨 후, 용매 또는 용매의 혼합물로부터 타르트레이트 염을 단리시킴으로써 화학식 (1)의 회전장애 이성질체로부터 제조될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 화학식 (1)의 회전장애 이성질체를 1종의 용매 중에 용해 또는 현탁시켜 제1 혼합물을 형성하고, (+)-L-타르타르산을 동일 또는 또 다른 용매 중에 용해 또는 현탁시켜 제2 혼합물을 형성한 후, 제1 혼합물 과 제2 혼합물을 합하고, 일정 시간 기간 동안 방치(예, 교반하면서)하여 염이 형성되도록 한 후에 (+)-L-타르타르산 염을 단리시킬 수 있다.
제1 혼합물과 제2 혼합물을 합할 때, 화학식 (1)의 회전장애 이성질체 및 (+)-L-타르타르산의 몰량은 대략 동량인 것이 바람직하며, 즉 화학식 (1)의 회전장애 이성질체 및 (+)-L-타르타르산 사이에서 1:1 몰비가 바람직하다.
(+)-L-타르타르산 염은 합한 혼합물로부터 여과에 의하여(침전물 형성시) 또는 용매의 증발에 의하여 단리될 수 있다.
그래서, 1종 초과의 용매가 합한 혼합물 중에 존재하는 경우에는, 공용매로서 또는 역용매로서 작용하도록 상이한 용매가 선택될 수 있다.
용매 또는 용매의 혼합물은, 이것이 (+)-L-타르타르산 염을 가열시 용액 중에서 적어도 부분적으로 보유하지만, 용매 또는 용매의 혼합물의 냉각시 침전물로서 염을 침전시키도록, 선택될 수 있다.
제1 혼합물(화학식 (1)의 회전장애 이성질체를 함유하는 혼합물)을 형성하는데 사용된 용매는, 예를 들면 지방족 케톤, 지방족 산의 지방족 에스테르, 비방향족 시클릭 에테르 및 지방족 알콜로부터 선택될 수 있다.
지방족 케톤의 특정한 예는 아세톤이다.
지방족 산의 지방족 에스테르의 예는 아세트산의 C2-4 알킬 에스테르를 포함하며, 그의 특정한 예는 이소프로필아세테이트이다.
비방향족 시클릭 에테르의 예는 디옥산, 2-메틸테트라히드로푸란 및 테트라히드로푸란을 포함하며, 그의 특정한 예는 2-메틸테트라히드로푸란이다.
지방족 알콜의 예는 C2-4 지방족 알콜이며, 보다 구체적으로 C3-4 알칸올, 예컨대 이소프로필 알콜 및 부탄올이다.
제2 혼합물((+)-L-타르타르산을 함유하는 혼합물)을 형성하는데 사용된 용매는, 예를 들면 물, 비방향족 시클릭 에테르 및 지방족 알콜로부터 선택될 수 있다.
제2 혼합물에 대한 지방족 알콜 용매의 특정한 예는 에탄올이다.
제2 혼합물에 대한 비방향족 시클릭 에테르 용매의 특정한 예는 테트라히드로푸란(THF)이다.
제2 혼합물을 형성하는데 사용하기 위한 용매의 또 다른 특정한 예는 물이다.
화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 (+)-L-타르타르산 염은 수개의 결정질 형태로, 특히 패턴 A(용매화물인 것) 및 패턴 B(무수화물인 것)로 존재할 수 있다. 상이한 결정질 형태에 대한 특징적인 세부사항은 본원에 제공된다. 상이한 결정질 형태는 염의 형성에 사용되는 용매 및 가열 조건을 변경킴으로써 제조될 수 있다.
패턴 A를 갖는 화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 (+)-L-타르타르산 염을 생성하기 위한 한 방법에서는, 아세톤 중의 회전장애 이성질체의 용액을 에탄올 중의 (+)-L-타르타르산의 용액과 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도(예를 들면, 대략 25℃)에서 혼합하고, 결과로 생성된 혼합물을 염 형성이 발생하기에 충분한 길이의 시간(예, 12-24 시간) 동안 교반하거나 또는 달리 진탕시킨 후, 염을 여과에 의하여 단리시킨다.
패턴 A를 갖는 화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 (+)-L-타르타르산 염의 제조를 위한 또 다른 방법에서는, 이소프로필 알콜 중의 회전장애 이성질체의 용액을 에탄올 중의 (+)-L-타르타르산의 용액과 35℃ 내지 45℃ 범위의 온도(예를 들면, 대략 40℃)에서 혼합하고, 결과로 생성된 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도(예를 들면, 대략 25℃)에서 대략 1-3 시간의 기간 동안 냉각시킨 후, 염을 여과에 의하여 단리시킨다.
패턴 A를 갖는 화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 (+)-L-타르타르산 염의 제조를 위한 또 다른 방법에서는, 2-메틸테트라히드로푸란 중의 회전장애 이성질체의 용액을 에탄올 중의 (+)-L-타르타르산의 용액과 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도(예를 들면, 대략 25℃)에서 혼합하고, 결과로 생성된 혼합물을 염 형성이 발생하기에 충분한 길이의 시간(예를 들면, 12-24 시간) 동안 교반하거나 또는 달리 진탕시킨 후, 염을 여과에 의하여 단리시킨다.
패턴 B를 갖는 화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 (+)-L-타르타르산 염의 제조를 위한 또 다른 방법에서는, 이소프로필 아세테이트 중의 회전장애 이성질체의 용액을 에탄올 중의 (+)-L-타르타르산의 용액과 35℃ 내지 45℃ 범위의 온도(예를 들면, 대략 40℃)에서 혼합하고, 결과로 생성된 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도(예를 들면, 대략 25℃)에서 대략 1-3 시간의 기간 동안 냉각시킨 후, 염을 여과에 의하여 단리시킨다.
패턴 B를 갖는 화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 (+)-L-타르타르산 염의 제조를 위한 또 다른 방법에서는, 35℃ 내지 45℃ 범위의 온도(예를 들면, 대략 40℃)에서 이소프로필 아세테이트 중의 회전장애 이성질체의 용액을 THF 중의 (+)-L-타르타르산의 용액과 혼합하고(일부씩 또는 한번의 단일 충전으로), 염 패턴 B의 하나 이상의 씨드 결정을 첨가하여 침전물을 생성하고, 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도(예를 들면, 대략 25℃)에서 냉각시키고, 침전물을 여과에 의하여 단리시킬 수 있는 상태로 숙성시키기에 충분한 시간 기간(예, 12 내지 24 시간, 특히 대략 20 시간) 동안 교반하거나 또는 진탕시킨다.
패턴 B를 갖는 화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 (+)-L-타르타르산 염의 제조를 위한 또 다른 방법에서는, 70℃ 내지 85℃ 범위의 고온(예를 들면, 대략 80℃)에서 부탄올 중의 회전장애 이성질체의 용액을 수 중의 (+)-L-타르타르산의 용액과 혼합하고(일부씩 또는 한번의 단일 충전으로), 결과로 생성된 혼합물을 65℃ 내지 70℃ 범위의 중간 온도로 냉각시킨 후, 패턴 B 염의 하나 이상의 씨드 결정을 첨가하고, 혼합물을 3-10℃ 범위의 저온으로 8 내지 15 시간의 기간 동안 냉각시키고, 결과로 생성된 혼합물을 저온에서 또는 저온 부근에서 2 내지 8 시간(예, 대략 6 시간)의 추가 기간 동안 교반하거나 또는 달리 진탕시킨 후, 형성된 패턴 B 염을 여과 제거하여 회수한다.
화학식 (1)의 회전장애 이성질체는
(a) 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]벤즈아미드의 회전장애 이성질체의 혼합물(예, 라세미 혼합물)을 분리함으로써; 또는
(b) 하기 화학식 (3)의 회전장애 이성질체를 아미드 형성 조건 하에서 화학식 H2N-(CH2)-N(CH3)2의 아민과 반응시킴으로써
제조될 수 있다:
Figure pct00004
화학식 (1), (2) 및 (3)의 화합물은 하기 반응식 1에 제시된 경로에 의하여 제조될 수 있다.
Figure pct00005
반응식 1에 제시된 합성 경로에 대한 출발 물질은 4-시아노-아세토페논(4) 및 4-클로로펜아실브로마이드(5)이며, 이 둘은 상업적으로 입수 가능하다.
단계 1에서, 4-시아노-아세토페논(4) 및 4-클로로펜아실브로마이드(5)는 함께 반응하여 4-[4-(4-클로로페닐)-4-옥소-부타노일]벤조니트릴(6)을 생성한다. 반응은 통상적으로 아연(II) 염(예를 들면. 염화아연)의 존재하에서 적절한 용매, 예를 들면 비극성(예, 탄화수소) 용매, 예컨대 벤젠과 3급 알콜(예를 들면, t-부탄올)의 혼합물 중에서, 3급 아민, 예컨대 트리에틸아민의 존재 하에서 실시된다. 반응은 실온 또는 실온 부근에서, 예를 들면 12 내지 60 시간의 기간에 걸쳐 실시될 수 있다.
단계 2에서, 4-[4-(4-클로로페닐)-4-옥소-부타노일]벤조니트릴(6)은 2-트리플루오로메틸 아닐린과 반응하여 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조니트릴(7)을 생성한다. 반응은 통상적으로 산 촉매, 예컨대 p-톨루엔술폰산의 존재하에서 적절한 고 비점 용매(예를 들면, 디옥산) 중에서 고온(예를 들면, 130 내지 170℃)에서 및/또는 마이크로파 조사로 실시된다. 반응은 1 내지 12 시간, 예를 들면 1 내지 6 시간 동안 실시될 수 있다.
단계 3에서, 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조니트릴(7)은 알칼리 가수분해로 처리되어 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(8)을 생성한다. 가수분해 반응은 통상적으로 알콜, 예컨대 메탄올을 함유할 수 있는 수성 용매 중에서 알칼리 금속 수산화물, 예컨대 수산화나트륨의 존재 하에서(통상적으로 과잉의 양으로) 및 일반적으로 예를 들면 60-80℃ 범위의 온도 또는 약 20 시간까지 또는 그 이상의 기간 동안 가열하여 실시된다. 가수분해가 완료된 후, 산(8)은 통상적으로 반응 혼합물을 냉각 및 산성화시킴으로써 단리된다.
단계 3에 이어서, 회전장애 이성질체(1)로의 2가지 가능한 경로 중 하나가 수행될 수 있다. 단계 4b 및 5b 및 6으로 이루어진 하나의 변형예에서, 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(8)은 아미드 형성조건 하에서 N,N-디메틸에틸렌디아민과 반응하여 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)-N-(2-(디메틸아미노)에틸)벤즈아미드(9)의 회전장애 이성질체의 라세미 혼합물을 생성하며, 이어서 그 혼합물은 그의 개개의 회전장애 이성질체로 키랄 분리에 의하여 분해되어 회전장애 이성질체(1)를 생성하게 된다.
기타 변형예에서, 라세미 6, 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(8)은 키랄 분리로 처리되어 회전장애 이성질체(3)를 생성하고, 이어서 그 생성물은 아미드 형성 조건 하에서 N,N-디메틸에틸렌디아민과 반응하여 회전장애 이성질체(1)를 생성하게 된다.
카르복실산 (3) 및 (8)은 아미드 형성 조건 하에서 아미드 커플링 시약의 존재 하에서 N,N-디메틸에틸렌디아민과 반응한다. 상기 아미드 커플링 시약의 예는 카르보디이미드계 커플링 시약, 예컨대 1,3-디시클로헥실카르보디이미드(DCC) (Sheehan et al., J. Amer . Chem Soc . 1955, 77, 1067) 및 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(본원에서 EDC 또는 EDCI로 지칭함)(Sheehan et al., J. Org . Chem ., 1961, 26, 2525)를 포함하며, 이는 통상적으로 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)(L. A. Carpino, J. Amer . Chem . Soc ., 1993, 115, 4397) 또는 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)(Konig et al., Chem . Ber ., 103, 708, 2024-2034), 우로늄계 커플링 시약, 예컨대 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU) 및 프로판포스폰산 무수물(T3P)(A. Garcia, Synlett, 2007, No. 8, pp 1328-1329 참조)과 조합하여 사용된다. 공정 단계 5a 및 5b에 사용하기 위한 특정한 아미드 커플링 시약은 HATU 및 T3P이다.
아미드 커플링 반응은 통상적으로 비수성, 극성, 비양성자성 용매, 예컨대 테트라히드로푸란 또는 디메틸포름아미드 또는 이들의 혼합물 중에서 실온 또는 그 부근(예, 18-30℃)에서 비간섭성 염기, 예를 들면 3급 아민, 예컨대 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에서 실시된다.
카르복실산(8) 및 아미드(9)의 회전장애 이성질체의 혼합물의 키랄 분리는 각종 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들면, 키랄 크로마토그래피는 개별적인 회전장애 이성질체를 분리하는데 사용될 수 있다. 키랄 크로마토그래피 절차에서 회전장애 이성질체의 체류 시간은 통상적으로 동일한 NMR 및 MS 특성을 갖는 개별적인 회전장애 이성질체 사이에서의 구별하여 특성화하는 수단을 제공한다.
개별적인 회전장애 이성질체를 분리하는데 사용될 수 있는 키랄 크로마토그래피 컬럼은, 예를 들면 작용화된 아밀로스 또는 셀룰로스에 기초할 수 있는 고정된 키랄 정지상(CSF)을 포함한다. 상기 CSF의 예는 클로로- 및/또는 메틸-치환된 페닐 카르바메이트로 작용화된 아밀로스 및 셀룰로스이다. 본 발명의 개별적인 회전장애 이성질체를 단리시키는데 사용될 수 있는 키랄 컬럼의 특정예는 다이아셀 코포레이션(Daicel Corporation)으로부터 입수 가능한 "키랄팩(Chiralpak) IG" 컬럼이다.
통상적으로 상기 키랄 컬럼과 함께 사용될 수 있는 이동상은 (A) 소량(예, 1% (v/v) 이하, 보다 일반적으로 약 0.1% (v/v))의 알킬아민 염기, 예컨대 디에틸아민을 함유하는 액체 알칸, 예컨대 n-헵탄; 및 (B) 알콜 및 그의 혼합물, 예컨대 이소프로필 알콜과 메탄올의 혼합물(예, 70:30 IPA:MeOH)의 혼합물을 포함한다. 예를 들면 이동상은 A:B의 혼합물을 80:20 내지 95:5, 예를 들면 대략 85:15 내지 대략 90:10 비의 범위로 포함할 수 있다. 이동상은 등용매 또는 구배 용출 방법에 사용될 수 있으나, 본 발명의 한 실시양태에서 등용매 용출 방법에 사용된다.
본 발명의 회전장애 이성질체는 또한 키랄 HPLC에 의하여 초임계 유체 크로마토그래피(SFC) 조건 하에서 분해될 수 있다. 초임계 유체 크로마토그래피에서 이동상은 종종 공용매, 예컨대 알콜 또는 알콜의 혼합물, 예를 들면 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올과 함께 초임계 유체, 예컨대 이산화탄소를 포함한다.
상기에 지칭된 키랄팩 IG 컬럼은 이산화탄소/메탄올/이소프로판올 혼합물을 이동상으로서 사용하여 SFC 크로마토그래피 절차에서 사용될 수 있다.
SFC에 사용하기 위한 기타 키랄 컬럼/공용매 조합은 하기를 포함한다:
룩스(Lux) 셀룰로스 4(MeOH, EtOH);
룩스 셀룰로스 2(MeOH);
룩스 아밀로스 1(MeOH, EtOH); 및
YMC 아밀로스-SA(MeOH, EtOH)
키랄 컬럼의 룩스 패밀리는 페노메넥스, 인코포레이티드(Phenomenex, Inc.)로부터 입수 가능하다.
YMC 아밀로스-SA 컬럼은 와이엠씨 아메리카, 인코포레이티드(YMC America, Inc.)로부터 입수 가능하다.
상기 키랄 크로마토그래피 방법은 특히 라세미 혼합물(9)로부터 회전장애 이성질체(1)의 분리에 사용될 수 있다.
키랄 크로마토그래피에 대한 대체예로서, 키랄 산(예, (+)-10-캄포르술폰산)은 라세미 혼합물(9)과 반응하여 결정화에 의하여 분리될 수 있는 부분입체이성질체의 혼합물로서 키랄 염을 형성하여 회전장애 이성질체(1)의 염을 생성하고, 이어서 그 염은 회전장애 이성질체(1)의 유리 염기로 전환될 수 있다.
카르복실산(8)의 회전장애 이성질체의 라세미 혼합물은 키랄 아민, 예컨대 (S)-1-(4-메톡시페닐)-에틸아민으로 염을 형성하여 부분입체이성질체의 혼합물을 형성함으로써 분해될 수 있으며, 그 혼합물은 결정화에 의하여, 예를 들면 회전장애 이성질체(1)와 키랄 아민의 염의 씨드 결정의 도움으로 분리될 수 있다.
상기 기재된 공정의 특정한 양태는 본 발명의 추가의 실시양태(실시양태 2.1 내지 2.5)를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 하기를 제공한다:
2.1. 화학식 (1)의 화합물의 제조 방법으로서, 아미드 형성 조건 하에서 화학식 (3)의 화합물과 N,N-디메틸에틸렌디아민의 반응을 포함하는 제조 방법.
2.2. 실시양태 2.1에 있어서, 아미드 형성 조건이 아미드 커플링 시약, 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 아미드 커플링 시약의 존재를 포함하는 것인 제조 방법.
2.3. 실시양태 2.2에 있어서, 아미드 커플링 시약이 프로판포스폰산 무수물(T3P)인 제조 방법.
2.4. 화학식 (3)의 화합물의 제조 방법으로서, 예를 들면 키랄 크로마토그래피 또는 키랄 염기를 사용한 염 형성 및 생성된 키랄 염의 분해에 의하여, 화학식 (8)의 회전장애 이성질체의 혼합물로부터 화학식 (3)의 화합물의 키랄 분리를 포함하는 제조 방법.
2.5. 화학식 (3)을 갖는 회전장애 이성질체 화합물 또는 그의 염(예를 들면, 금속 염, 예컨대 알칼리 또는 알칼리 토금속 염, 또는 암모니아 또는 유기 아민과의 염).
생물학적 성질 및 치료적 용도
하기 실시예에서 명시된 증거는 본원에서 정의된 바와 같은 화학식 (1)의 회전장애 이성질체 및 그의 타르트레이트 염이 PLK1 및 PLK4 키나제의 폴로-박스 도메인의 억제제이지만, PLK1 및 PLK4 키나제의 촉매 도메인을 억제하지는 않는다는 것을 보여준다. PBD 도메인만이 PLK에 존재하므로, 화학식 (1)의 회전장애 이성질체 및 그의 타르트레이트 염은 ATP 경쟁적 키나제 억제제인 화합물보다 훨씬 더 큰 선택성(및 이에 따라 오프타겟 키나제 억제제로 인한 원치 않는 부작용이 더 적은 것)을 나타내야 한다. 화학식 (1)의 회전장애 이성질체가 97종의 키나제의 패널에 대하여 테스트되었고, 기타 키나제에 대하여 무시할 정도의 활성을 나타내는 하기 실시예 7F에 기재된 연구로부터 얻은 결과는 화학식 (1)의 회전장애 이성질체가 기타 구조적으로 및 작용적으로 유사한 키나제에 비하여 PLK1-PBD 및 PLK4-PBD에 대하여 높은 정도의 선택성을 갖는다는 것을 확인하여 보여주었다.
촉매 도메인보다는 PBD 도메인을 억제하는 추가의 잇점은 촉매 도메인을 억제하는 PLK1 억제제에 비하여 약물 내성을 유발하는 경향이 결과로 감소될 수 있다는 점이다.
PLK1 키나제의 PBD 도메인의 억제제로서 화학식 (1)의 회전장애 이성질체 및 그의 타르트레이트 염의 활성은 문헌[Narvaez et al., Cell Chemical Biology, 24, 1017-1028, 2017, see page 1018 and page 1026 (Method Details)]에 기재된 형광 편광(FP) 검정을 이용하여 입증될 수 있다.
화학식 (1)의 회전장애 이성질체 및 그의 타르트레이트 염은 KRAS 돌연변이를 구성적으로 활성화시키는 결과로서 세포 경로에서의 약함을 이용하는데 효과적일 수 있으므로, KRAS의 조정에 의하여 중재되는 질환 및 병태의 치료에 유용할 수 있는 것으로 여겨진다.
단일 뉴클레오티드 치환으로부터 결과로 초래되는 KRAS의 돌연변이는 다양한 형태의 암과 관련되어 있다. 특히, KRAS 돌연변이는 백혈병, 결장암, 췌장암 및 폐암에서 높은 비율로 발견된다.
게다가, 화학식 (1)의 회전장애 이성질체 및 그의 타르트레이트 염은 TP53 유전자에서 p53 결핍 또는 돌연변이를 특징으로 하는 암의 치료에 유용할 수 있는 것으로 여겨진다. PLK1은 암 세포에서 p53을 억제하는 것으로 여겨진다. 그러므로, PLK1 억제제에 의한 처치시 종양 세포에서의 p53은 활성화되어야 하며, 그리하여 아폽토시스를 유도하여야 한다.
KRAS 돌연변이 및 p53 결핍 암에 대한 화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 활성은 상기 기재된 바와 같이 PLK1 키나제의 C 말단 폴로-박스 도메인(PBD)의 억제에 의하여 적어도 부분적으로 유발되는 것으로 여겨진다. KRAS는 PLK1과의 상호작용에 의존하는 것으로 공지되어 있다.
화학식 (1)의 회전장애 이성질체는 비회합 염색체로 유사분열 정지를 유도하며, 이는 회전장애 이성질체의 활성을 억제하는 PLK1-PBD 및 PLK4-PBD로부터 유발되는 것으로 여겨지는 특성이다(하기 실시예 7C 참조).
회전장애 이성질체는 다극성 방추체 표현형으로 유사분열 정지를 유도하며, 그리고 PLK4 억제의 잘 기재된 표현형인 중심소체의 증폭을 유발한다(Lei 2018, Cell Death & Disease 9, 1066; Kawakami, PNAS 2018, 115(8) 1913-18). 그러한 표현형은 화학식 (1)의 회전장애 이성질체의 활성을 억제하는 PLK4-PBD로부터 발생되는 것으로 여겨진다.
암 세포주(U87MG, 사람 뇌(교아종 성상세포종))를 사용하는 항암 활성에 대한 1차 스크린은 하기 실시예 7A에 기재되어 있다. 얻은 데이타는 화학식 (1)의 R-회전장애 이성질체(회전장애 이성질체 A-2)가 U87MG 세포주에 대한 4.6 μM의 IC50을 갖는 해당 S-회전장애 이성질체(A-1)보다 더 큰 활성(0.22 μM의 IC50)을 갖는 것을 입증해 보여 주었다.
2종의 회전장애 이성질체(A-2 및 A-1)는 또한 48종의 암 세포주의 패널에 대해서도 둘다 테스트하였으며, 결과를 하기 실시예 7B에 제시한다. 테스트한 모든 세포주에서, 화학식 (1)의 회전장애 이성질체(A-2)는 회전장애 이성질체(A-1)보다 활성이 더 컸으며, 대부분의 경우에서는 적어도 10배이다.
실시예 7B에서의 데이타는 화학식 (1)의 회전장애 이성질체(A-2)가 고체 종양, 예컨대 췌장암, 대장 및 결장직장의 암, 폐암, 뇌 및 신경의 암 및 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병 범위의 다양한 각종 암 세포주에 대하여 활성이다는 것을 입증해 보여준다.
화학식 (1)의 회전장애 이성질체는 우수한 경구 생체이용률을 가지며(하기 실시예 7G 참조), 경구 투여시 우수한 뇌 노출을 갖는다(하기 실시예 7G 참조). 따라서, 본 발명의 물질의 조성물 또는 회전장애 이성질체는 뇌암, 예컨대 신경아교종 및 교모세포종의 치료에 유용하여야 한다.
현재까지 얻어진 증거에 기초하여, 화학식 (1)의 회전장애 이성질체는 다양한 암(및 그의 양성 대응부), 예를 들면 하기 실시양태에 명시된 암의 치료에 유용할 것으로 여겨진다.
따라서, 추가의 실시양태(실시양태 3.1 내지 3.25)에서, 본 발명은 하기를 제공한다:
3.1. PLK1-PBD 억제제로서 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.2. PLK4-PBD 억제제로서 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.3. PLK1-PBD 및 PLK4-PBD 억제제로서 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.4. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 상피성 기원의 종양(선암종, 편평 암종, 이행 세포 암종을 포함한 각종 유형의 선종 및 암종 및 기타 암종), 예컨대 방광 및 요도, 유방, 위장관의 암종(식도, 위, 소장, 결장, 직장 및 항문 포함), 간(간세포 암종), 담낭 및 담도계, 외분비 췌장, 신장, 폐(예를 들면. 선암종, 소세포 폐 암종, 비소세포 폐 암종, 기관지폐포 암종 및 중피종), 두경부(예를 들면. 혀, 협강, 후두, 인두, 비강인두, 편도, 타액선, 비강 및 부비동의 암), 난소, 자궁관, 복막, 질, 외음, 음경, 자궁경부, 자궁근층, 자궁내막, 갑상선(예를 들면. 갑상선 소포 암종), 부신, 전립선, 피부 및 부속기관의 암종(예를 들면. 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 각질극세포종, 이형성 모반); 혈액학적 악성종양(즉 백혈병, 림프종) 및 림프계의 혈액학적 악성종양 및 관련 병태를 포함한 경계성 악성종양의 전암성 혈액학적 질병 및 질환(예를 들면. 급성 림프구성 백혈병[ALL], 만성 림프구성 백혈병[CLL], B-세포 림프종, 예컨대 미만성 거대 B-세포 림프종[DLBCL], 소포 림프종, 버킷 림프종, 외투 세포 림프종, T-세포 림프종 및 백혈병, 자연 살해[NK] 세포 림프종, 호지킨 림프종, 모발상 세포 백혈병, 불확실한 유의성을 갖는 단클론성 감마병증, 형질세포종, 다발성 골수종 및 이식 후 림프증식성 질환) 및 혈액학적 악성종양 및 골수의 관련 병태(예를 들면. 급성 골수성 백혈병[AML], 만성 골수성 백혈병[CML], 만성 골수단구성 백혈병[CMML], 과다호산구 증후군, 골수증식 질환, 예컨대 진성 적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증 및 일차 골수섬유증, 골수증식성 증후군, 골수이형성 증후군 및 전골수세포 백혈병); 중간엽 기원의 종양, 예를 들면 연조직, 뼈 또는 연골의 육종, 예컨대 골육종, 섬유육종, 연골육종, 횡문근육종, 평활근육종, 지방육종, 혈관육종, 카포시 육종, 유잉 육종, 윤활막 육종, 상피모양 육종, 위장관 기질 종양, 양성 및 악성 조직구종 및 융기 피부섬유육종; 중추 또는 말초 신경계의 종양(예를 들면. 성상세포종, 신경아교종 및 교모세포종, 수막종, 뇌실막세포종, 송과체 종양 및 슈반세포종); 내분비 종양(예를 들면. 뇌하수체 종양, 부신 종양, 도세포 종양, 부갑상선 종양, 카르시노이드 종양 및 갑상선의 수질성 암종); 안구 및 부속기 종양(예를 들면. 망막모세포종); 생식 세포 및 영양막 종양(예를 들면. 기형종, 고환종, 난소생식세포종, 포상기태 및 융모막암종); 및 소아과 및 배아성 종양(예를 들면. 수모세포종, 신경모세포종, 윌름 종양 및 원시 신경외배엽 종양); 또는 환자를 악성종양에 영향받기 쉽게 하는 증후군, 선천적 또는 기타(예를 들면. 색소성 피부건조증)로부터 선택되는 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.4A. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)과 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 췌장암, 대장 및 결장직장의 암, 폐암, 뇌 및 신경의 암, 혈액암(예컨대 림프종 및 백혈병), 전립선암 및 유방암으로부터 선택되는 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.5. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 췌장암, 대장 및 결장직장의 암, 폐암, 뇌 및 신경의 암 및 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병으로부터 선택되는 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.6. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 신경아교종 및 교모세포종(예를 들면. 다형성 아교모세포종, 뇌실막세포종, 산재적 내재성 뇌교종, IDH1 돌연변이 신경교종)으로부터 선택되는 것인타 르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.7. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 간상 종양; 수모세포종 및 뇌의 기타 배아성 종양; 유방암, 폐암, 흑색종, 위암, 결장직장암, 췌장암 및 난소암으로부터 선택되는 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.7A. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은
(a) 유방암, 위장관암, 외분비 췌장암, 폐암 및 전립선암으로부터 선택된 상피 기원의 종양;
(b) B세포 림프종, 예컨대 미만성 거대 B세포 림프종[DLBCL], 버킷 림프종, 외투막 세포 림프종, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병[AML], 만성 골수성 백혈병[CML] 및 골수형성이상 증후군으로부터 선택된 혈액 악성종양;
(c) 골육종 및 횡문근육종으로부터 선택된 중간엽 기원의 종양;
(d) 신경아교종, 교아종 및 뇌실막세포종으로부터 선택된 중추 또는 말초 신경계의 종양; 및
(e) 속질모세포종 및 신경모세포종으로부터 선택된 소아 및 배아 종양
으로부터 선택되는 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.8. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 PLK1이 연관된 것(예, PLK1이 과발현된 것)인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.9. 실시양태 3.8에 있어서, 암은 실시양태 3.4 내지 3.7 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.10. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)과 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 PLK4가 연관된 것(예, PLK4가 과발현된 것)인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.11. 실시양태 3.10에 있어서, 암은 실시양태 3.4 내지 3.7 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.12. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 TP53 유전자에서의 p53 결핍 또는 돌연변이를 특징으로 하는 것인 타르타레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.13. 실시양태 3.12에 있어서, 암은 실시양태 3.4 내지 3.7 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.14. 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물로서, 암은 KRAS의 돌연변이된 형태의 존재를 특징으로 하는 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.15. 실시양태 3.14에 있어서, KRAS의 돌연변이된 형태는 글리신 12, 글리신 13, 글루타민 61 및 이들의 조합으로부터 선택된 단백질에서 아미노산에서의 돌연변이를 갖는 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.16. 실시양태 3.14 또는 3.15에 있어서, 암은 실시양태 3.4 내지 3.7 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 것인 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.17. 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 의약 또는 요법에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.18. KRAS 단백질의 비정상 발현을 특징으로 하는 질환 상태 및 병태의 예방 또는 치료에서, 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.19. 항암제로서 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물.
3.20. 실시양태 3.4 내지 3.16 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 암을 앓고 있는 대상체(예, 포유동물 대상체, 예컨대 사람)를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게, 임의로 또 다른 치료제 또는 치료(예, 항암제 또는 요법)와 조합하여, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
3.21. 실시양태 3.1 내지 3.9 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르트레이트 염 또는 물질의 조성물의 용도.
3.22. PLK1-PBD를 억제하는 방법으로서, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 유효 억제량을 PLK1-PBD와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
3.23. PLK4-PBD를 억제하는 방법으로서, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 유효 억제량을 PLK4-PBD와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
3.24. PLK1-PBD 및 PLK4-PBD를 억제하는 방법으로서, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 유효 억제량을 PLK1-PBD 및 PLK4-PBD와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
3.25. 실시양태 3.22 내지 3.24 중 어느 하나에 있어서, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 유효 억제량은 생체내에서, 예를 들면 포유동물 대상체, 예컨대 사람 대상체에서 PLK1-PBD 및/또는 PLK4-PBD와 접촉되는 것인 방법.
실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 투여 전에, 환자가 앓고 있거나 또는 앓을 수 있는 암이 상승된 수준의 PLK1 및/또는 PLK4 키나제를 특징으로 하고 이에 따라 PLK1 및/또는 PLK4 키나제에 대하여 활성을 갖는 화합물을 사용한 치료에 민감한 것인지의 여부를 결정하기 위하여 환자를 스크리닝할 수 있다.
예를 들면, 환자로부터 취한 생물학적 샘플은 환자가 앓고 있거나 또는 앓을 수 있는 암이 PLK1 및/또는 PLK4 키나제의 상향조절을 초래하는 유전적 이상 또는 비정상적인 단백질 발현을 특징으로 하는 것인지의 여부를 결정하기 위하여 분석할 수 있다. 용어 상향조절은 유전자 증폭(즉 복수의 유전자 복제) 및 전사 효과에 의한 증가된 발현을 포함한 상승된 발현 또는 과발현, 및 돌연변이에 의한 활성화를 포함한 과활성 및 활성화를 포함한다. 그래서, 환자는 PLK1 및/또는 PLK4 키나제의 상향조절의 마커 특징을 검출하기 위한 진단 테스트로 처리할 수 있다. 용어 진단은 스크리닝을 포함한다. 마커는, 예를 들면 PLK1의 돌연변이를 식별하기 위한 DNA 조성의 측정을 포함한, 유전 마커를 포함한다. 용어 마커는 또한 전술한 단백질의 효소 활성, 효소 수준, 효소 상태(예, 인산화되거나 또는 되지 않음) 및 mRNA 수준을 포함한 PLK1 및/또는 PLK4의 상향조절의 특징인 마커를 포함한다.
PLK1 및/또는 PLK4 키나제의 상향조절을 갖는 종양은 PLK1 억제제에 특히 민감할 수 있다. 종양은 PLK1 및/또는 PLK4의 상향조절에 대하여 우선적으로 스크리닝될 수 있다. 그래서, 환자는 PLK1 및/또는 PLK4의 상향조절의 마커 특징을 검출하는 진단 테스트로 처리할 수 있다. 진단 테스트는 통상적으로 종양 생검 샘플, 혈액 샘플(세드(shed) 종양 세포의 단리 및 농축), 대변 생검, 가래, 염색체 분석, 흉수 및 복수로부터 선택된 생물학적 샘플 상에서 실시된다.
단백질의 돌연변이 및 상향조절의 식별 및 분석 방법은 해당 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 스크리닝 방법은 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 동소 하이브리드화와 같은 표준 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
RT-PCR에 의한 스크리닝에서, 종양에서의 mRNA의 수준은 mRNA의 cDNA 복제의 생성에 이어서 PCR에 의한 cDNA의 증폭에 의하여 평가된다. PCR 증폭의 방법, 프라이머의 선택 및 증폭에 대한 조건은 해당 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 핵산 조작 및 PCR은, 예를 들면 문헌[Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2004, John Wiley & Sons Inc., or Innis, M.A. et-al., eds. PCR Protocols: a guide to methods and applications, 1990, Academic Press, San Diego]에 기재된 바와 같이, 표준 방법에 의하여 실시된다. 핵산 기술을 포함한 반응 및 조작은, 또한 문헌[Sambrook et al., 2001, 3rd Ed, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에도 기재되어 있다. 대안으로, RT-PCR에 대한 상업적 입수 가능한 키트(예를 들면, 로슈 몰레큘라 바이오케미칼즈(Roche Molecular Biochemicals))가 사용될 수 있거나 또는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659, 5,272,057, 5,882,864 및 6,218,529에 명시된 바와 같은 방법이 이용될 수 있다.
mRNA 발현을 평가하기 위한 동소 하이브리드화 기술의 예는 형광 동소 하이브리드화(FISH)가 될 수 있다(문헌[Angerer, 1987 Meth . Enzymol., 152: 649] 참조).
일반적으로, 동소 하이브리드화는 하기 주요 단계를 포함한다: (1) 분석하고자 하는 조직의 고정; (2) 표적 핵산의 접근성을 증가시키고, 비특이성 결합을 감소시키기 위한 샘플의 프리-하이브리드화 처리; (3) 생물학적 구조 또는 조직 중의 핵산으로의 핵산 혼합물의 하이브리드화; (4) 하이브리드화에서 결합되지 않는 핵산 분절을 제거하기 위한 포스트-하이브리드화 세정, 및 (5) 하이브리드화된 핵산 분절의 검출. 통상적으로, 상기 적용에 사용된 프로브는, 예를 들면 방사성동위원소 또는 형광 리포터를 사용하여, 표지화된다. 바람직한 프로브는 엄격한 조건 하에서 표적 핵산(들)을 사용한 특이성 하이브리드화를 가능케 하기에 충분히 긴, 예를 들면 약 50, 100 또는 200개의 뉴클레오티드 내지 약 1,000개 이상의 뉴클레오티드이다. FISH를 실시하기 위한 표준 방법은 문헌[Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2004, John Wiley & Sons Inc and Fluorescence In Situ Hybridization: Technical Overview by John M. S. Bartlett in Molecular Diagnosis of Cancer, Methods and Protocols, 2nd ed.; ISBN: 1-59259-760-2; March 2004, pps. 077-088; Series: Methods in Molecular Medicine]에 기재되어 있다.
대안으로, mRNA로부터 발현된 단백질 생성물은 특정 단백질의 검출을 위하여 종양 샘플의 면역조직화학, 미량역가 평판을 사용한 고체상 면역검정, 웨스턴 블롯팅, 2차원 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, ELISA, 흐름 세포측정 및 해당 기술분야에 공지된 기타 방법에 의하여 검정될 수 있다. 검출 방법은 부위 특이성 항체를 사용하는 것을 포함한다. 상기 기술자는 PLK1 및/또는 PLK4 키나제의 상향조절의 검출을 위한 상기 널리 공지된 기술이 본 사례에서 적용 가능하다는 것을 인지할 것이다.
대안적으로 또는 부가적으로, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 투여 전에, 환자가 암을 앓고 있거나 또는 앓을 수 있는 암이 돌연변이된 KRAS를 특징으로 하며, 그리하여 돌연변이 KRAS를 지니는 암 세포에 대한 활성을 갖는 화합물을 사용한 치료에 민감한 것인지의 여부를 결정하기 위하여 환자를 스크리닝할 수 있다.
예를 들면, 환자로부터 취한 생물학적 샘플은 환자가 앓고 있거나 또는 앓을 수 있는 암이 돌연변이 KRAS의 존재를 특징으로 하는 것인지의 여부를 결정하기 위하여 분석할 수 있다. 그래서, 예를 들면 환자는 KRAS 단백질에서의 코돈 12, 13, 61 또는 이들의 혼합에서 돌연변이를 검출하는 진단 테스트를 실시할 수 있다. 돌연변이 KRAS에 대한 시판 중인 진단 테스트는 로슈 몰레큘라 시스템즈, 인코포레이티드(Roche Molecular Systems, Inc)로부터의 코바스(cobas) ® KRAS 돌연변이 테스트 및 퀴아젠 맨체스터, 리미티드(Qiagen Manchester, Ltd.)로부터의 테라스크린(therascreen) KRAS RGQ PCR 키트를 포함한다.
돌연변이 KRAS를 갖는 종양은 PLK1 및/또는 PLK4 억제제에 특히 민감할 수 있다. 단백질의 돌연변이 및 상향조절의 식별 및 분석 방법은 해당 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 스크리닝 방법은 상기 기재된 바와 같은 표준 방법, 예컨대 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 동소 하이브리드화를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
따라서, 추가의 실시양태(실시양태 3.26 내지 3.34)에서 본 발명은 하기를 포함한다:
3.26. 상승된 수준의 PLK1 키나제(예, PLK1 과발현)를 특징으로 하는 암을 앓고 있는 것으로서 스크리닝되어 결정된 대상체(예, 사람 대상체)에서 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.27. 상승된 수준의 PLK4 키나제(예, PLK4 과발현)를 특징으로 하는 암을 앓고 있는 것으로서 스크리닝되어 결정된 대상체(예, 사람 대상체)에서 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.28. 상승된 수준의 PLK1 키나제 및 PLK4 키나제(예, PLK1 및 PLK4 과발현)를 특징으로 하는 암을 앓고 있는 것으로서 스크리닝되어 결정된 대상체(예, 사람 대상체)에서 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.29. KRAS에 대한 활성을 갖는 화합물을 사용한 치료에 민감한 질환 또는 병태를 앓고 있거나 또는 그 질환 또는 병태를 앓을 위험이 있는 것으로서 스크리닝되어 결정된 대상체(예, 사람 대상체)에서 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.30. 돌연변이된 KRAS를 특징으로 하고, 돌연변이 KRAS를 지니는 암 세포에 대한 활성을 갖는 화합물을 사용한 치료에 민감한 것인 암을 앓고 있는 것으로서 스크리닝되어 결정된 대상체(예, 사람 대상체)에서 암의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.31. 실시양태 3.26 내지 3.30 중 어느 하나에 있어서, 암은 실시양태 3.4 내지 3.16 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 암인 타르타르산 염 또는 물질의 조성물.
3.32. 실시양태 3.26 내지 3.31 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 용도.
3.33. KRAS의 돌연변이된 형태의 존재를 특징으로 하는 질환 상태 또는 병태(예, 암, 예를 들면 실시양태 3.4 내지 3.16 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 암)를 진단 및 치료하는 방법으로서, (i) 대상체가 앓고 있거나 또는 앓을 수 있는 질환 또는 병태가 KRAS에 대한 활성을 갖는 화합물을 사용한 치료에 민감한 것인지의 여부를 결정하기 위하여 대상체(예, 사람 대상체)를 스크리닝하는 것; 및 (ii) 그리하여 대상체가 민감한 질환 또는 병태를 나타내는 경우, 그후 대상체에게 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
3.34. KRAS의 돌연변이된 형태의 존재를 특징으로 하는 질환 상태 또는 병태(예, 암, 예를 들면 실시양태 3.4 내지 3.16 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 암)을 치료하는 방법으로서, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 치료적 유효량을 KRAS에 대한 활성을 갖는 화합물을 사용한 치료에 민감한 질환 또는 병태를 앓고 있거나 또는 앓을 위험이 있는 것으로서 스크리닝되어 결정된 대상체(예, 사람 대상체)에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
약학적 제제
실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물은 통상적으로 환자에게 약학 조성물의 형태로 투여된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태(실시양태 4.1)에서, 본 발명은 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 하기를 제공한다:
4.2. 실시양태 4.1에 있어서, 대략 1% (w/w) 내지 대략 95% (w/w)의 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 99% (w/w) 내지 5% (w/w)의 약학적으로 허용되는 부형제 또는 부형제의 조합, 및 임의로 하나 이상의 추가의 치료적 활성 성분을 포함하는 약학 조성물.
4.3. 실시양태 4.2에 있어서, 대략 5% (w/w) 내지 대략 90% (w/w)의 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 95% (w/w) 내지 10%의 약학적으로 부형제 또는 부형제의 조합, 및 임의로 하나 이상의 추가의 치료적 활성 성분을 포함하는 약학 조성물.
4.4. 실시양태 4.3에 있어서, 대략 10% (w/w) 내지 대략 90% (w/w)의 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 90% (w/w) 내지 10% (w/w)의 약학적으로 부형제 또는 부형제의 조합을 포함하는 약학 조성물.
4.5. 실시양태 4.4에 있어서, 대략 20% (w/w) 내지 대략 90% (w/w)의 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 따른 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 80% (w/w) 내지 10% (w/w)의 약학적으로 부형제 또는 부형제의 조합을 포함하는 약학 조성물.
4.6. 실시양태 4.5에 있어서, 대략 25% (w/w) 내지 대략 80% (w/w)의 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 75% (w/w) 내지 20% (w/w)의 약학적으로 부형제 또는 부형제의 조합을 포함하는 약학 조성물.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 비경구, 국소, 비강내, 기관지내, 눈, 귀, 직장, 질내 또는 경피 투여에 적절한 임의의 형태로 존재할 수 있다. 조성물을 비경구 투여하고자 할 경우, 그 조성물은 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 투여를 위하여 또는 표적 기관 또는 조직으로의 주사, 주입 또는 기타 전달 수단에 의한 직접 전달을 위하여 제제화될 수 있다.
경구 투여에 적절한 약학적 투여 형태는 정제, 캡슐제, 캐플릿제, 환제, 로젠지제, 시럽제, 액제, 스프레이제, 산제, 과립제, 엘릭시르제 및 현탁제, 설하 정제, 스프레이제, 웨이퍼제 또는 패취제 및 협측 패취제를 포함한다.
따라서, 추가의 실시양태에서 본 발명은 하기를 제공한다:
4.7. 경구 투여에 적절한, 실시양태 4.1 내지 4.6 중 어느 하나에 따른 약학 조성물.
4.8. 실시양태 4.7에 있어서, 정제, 캡슐제, 캐플릿제, 환제, 로젠지제, 시럽제, 액제, 스프레이제, 산제, 과립제, 엘릭시르제 및 현탁제, 설하 정제, 스프레이제, 웨이퍼제 또는 패취제 및 협측 패취제로부터 선택된 약학 조성물.
4.9. 실시양태 4.8에 있어서, 정제 및 캡슐제로부터 선택된 약학 조성물.
4.10. 실시양태 4.1 내지 4.6 중 어느 하나에 있어서, 비경구 투여에 적절한 약학 조성물.
4.11. 실시양태 4.10에 있어서, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 투여를 위하여 또는 표적 기관 또는 조직으로의 주사, 주입 또는 기타 전달 수단에 의한 직접 전달을 위하여 제제화되는 것인 약학 조성물.
4.12. 실시양태 4.11에 있어서, 주사 또는 주입을 위한 액제 또는 현탁제인 약학 조성물.
본 발명의 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물을 함유하는 약학 조성물(예, 실시양태 4.1 내지 4.12 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 것)은 공지된 기술에 의하여 제제화될 수 있으며, 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA]을 참조할 수 있다.
그래서, 정제 조성물(실시양태 4.9에서와 같은 것)은 불활성 희석제 또는 담체, 예컨대 당 또는 당 알콜, 예를 들면 락토스, 수크로스, 소르비톨 또는 만니톨; 및/또는 비당 유래 희석제, 예컨대 탄산나트륨, 인산칼슘, 탈크, 탄산칼슘 또는 셀룰로스 또는 그의 유도체, 예컨대 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 및 전분, 예컨대 옥수수 전분과 함께 활성 화합물의 단위 투여량을 함유할 수 있다. 정제는 또한 결합제 및 과립화제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 붕해제(예, 팽창성 가교 중합체, 예컨대 가교 카르복시메틸셀룰로스), 활택제(예, 스테아레이트), 보존제(예, 파라벤), 산화방지제(예, BHT), 완충제(예를 들면. 포스페이트 또는 시트레이트 완충제) 및 발포제, 예컨대 시트르산염/중탄산염 혼합물과 같은 표준 성분들을 함유할 수 있다. 상기 부형제는 널리 공지되어 있으므로, 여기서 상세하게 논의할 필요는 없다.
캡슐 제제(실시양태 4.9에서와 같음)는 경질 젤라틴 또는 연질 젤라틴 품종으로 이루어질 수 있으며, 활성 성분을 고체, 반고체 또는 액체 형태로 함유할 수 있다. 젤라틴 캡슐은 동물성 젤라틴 또는 그의 합성 또는 식물성 유래 등가물로부터 형성될 수 있다.
고체 투여 형태(예, 정제, 캡슐제 등)는 코팅되거나 또는 코팅되지 않을 수 있으나, 통상적으로 코팅, 예를 들면 보호막 코팅(예, 왁스 또는 바니쉬) 또는 방출 제어 코팅을 갖는다. 코팅(예, 유드라짓(Eudragit)™ 타입 중합체)은 활성 성분을 위장관 내의 원하는 위치에서 방출하도록 설계될 수 있다. 그래서, 코팅은 위장관 내의 특정한 pH 조건 하에서 분해되어 물질의 조성물 또는 회전장애 이성질체를 위에서 또는 회장 또는 십이지장에서 선택적으로 방출하도록 선택될 수 있다.
코팅 대신에 또는 그 외에, 약물은 방출 제어제, 예를 들면 물질의 조성물 또는 회전장애 이성질체를 위장관 내에서 다양한 산도 또는 알칼리도의 조건 하에서 선택적으로 방출시키기 위하여 변형될 수 있는 방출 지연제를 포함하는 고체 매트릭스 내에 제공될 수 있다. 대안으로, 매트릭스 물질 또는 방출 지연 코팅은 투여 형태가 위장관을 통과함에 따라 실질적으로 연속적으로 침식되는 침식 가능한 중합체(예, 말산 무수물 중합체)의 형태를 취할 수 있다.
국소 용도를 위한 조성물은 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 액상 드롭제 및 인서트제(예를 들면. 안내 인서트제)을 포함한다. 상기 조성물은 공지된 방법에 의하여 제제화될 수 있다.
비경구 투여용 조성물(실시양태 4.10 내지 4.12에서와 같은 것)은 통상적으로 멸균 수성 또는 유성 액제 또는 미세 현탁제로서 제공되거나 또는 멸균 주사용수로 즉석 제조하기 위한 미분 멸균 분말 형태로 제공될 수 있다.
직장 또는 질내 투여용 제제의 예는, 예를 들면 활성 화합물을 함유하는 성형성 또는 왁스상 물질로부터 형성될 수 있는 페사리제 및 좌제를 포함한다.
흡입에 의한 투여용 조성물은, 분말 조성물 또는 액상 또는 분말상 스프레이제의 형태를 취할 수 있으며, 분말 흡입기 장치 또는 에어로졸 분배 장치를 사용하는 표준 형태로 투여될 수 있다. 상기 장치는 널리 공지되어 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 분말 제제는 통상적으로 불활성 고체 분말 희석제, 예컨대 락토스와 함께 활성 화합물을 포함한다.
약학 조성물은 일반적으로 단위 투여 형태로 제공될 것이며, 그리하여 통상적으로 원하는 수준의 생물학적 활성을 제공하기에 충분한 화합물을 함유할 것이다. 예를 들면, 실시양태 4.1 내지 4.9 중 어느 하나에 따르면, 경구 투여용 조성물은 2 밀리그램 내지 200 밀리그램의 활성 성분, 보다 일반적으로 10 밀리그램 내지 100 밀리그램, 예를 들면 12.5 밀리그램, 25 밀리그램 및 50 밀리그램의 활성 성분을 함유할 수 있다.
약량학
활성 화합물(실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물)은 치료를 필요로 하는 환자(예를 들면. 사람 또는 동물 환자)에게 원하는 치료적 효과, 예를 들면 상기 실시양태 3.1 내지 3.34에 명시된 바와 같은 효과를 달성하기에 충분한 양으로 투여될 것이다.
실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물은 일반적으로 상기 투여를 필요로 하는 대상체, 예를 들면 사람 또는 동물 환자, 바람직하게는 사람에게 투여될 것이다.
실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물은 통상적으로 치료적으로 또는 예방적으로 유용하며, 일반적으로 비독성인 양으로 투여될 것이다. 그러나, 특정한 상황에서, 본 발명의 화합물 투여의 잇점은 임의의 독성 효과 또는 부작용의 단점을 능가할 수 있으며, 이러한 경우 화합물을 독성의 정도와 관련된 양으로 투여되는 것은 바람직한 것으로 간주될 수 있다.
한 실시양태에서, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 통상의 1일 투여량은, 필요한 경우 더 크거나 또는 더 작은 투여량이 투여될 수 있더라도, 체중 1 킬로그램당 0.025 밀리그램 내지 5 밀리그램 범위, 예를 들면 체중 1 킬로그램당 3 밀리그램 이하, 보다 통상적으로 체중 1 킬로그램당 0.15 밀리그램 내지 5 밀리그램일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물의 통상의 1일 투여량은, 필요할 경우 더 크거나 또는 더 적은 투여량이 투여될 수 있더라도, 체중 1 킬로그램당 0.025 밀리그램 내지 50 밀리그램 범위, 예를 들면 체중 1 킬로그램당 30 밀리그램 이하, 더욱 통상적으로 체중 1 킬로그램당 0.15 밀리그램 내지 50 밀리그램(예, 체중 1 킬로그램당 0.5 밀리그램 내지 30 밀리그램)일 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 한 실시양태에서, 12.5 ㎎의 초기 출발 투여량은 1일 2 내지 3회로 투여될 수 있다. 투여량은, 의사에 의해 결정되는 바와 같이 개체에 대하여 최대 허용되는 유효 투여량이 도달될 때까지, 3 내지 5 일마다 1일 12.5 ㎎씩 증가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 주 1회 투여 스케쥴은 1주차에 0.5-1.5 ㎎/㎏(예, 1 ㎎/㎏)의 초기 시작 투여량에 이어서 2주차 및 후속 주차에 대상체의 치료적 효과 및 내약성과 일치하는 최대 투여량까지 점증되는 투여량(예, 3, 4 또는 5회 투여 점증까지 이전의 투여량의 2 또는 3배)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 1주차에, 1 ㎎/㎏의 시작 투여량을 투여한 후, 2주차에 3 ㎎/㎏, 3주차에 9 ㎎/㎏ 및 4주차에 27 ㎎/㎏으로 증가된 투여량으로 투여될 수 있다.
궁극적으로, 투여된 화합물의 양은 치료되는 질환 또는 생리학적 병태의 성질 및 치료적 이득 및 제시된 투여량 섭생에 의하여 생성되는 부작용의 존재 또는 부재에 상응하며, 이는 의사의 재량에 따를 것이다.
병용 요법
실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물은 일련의 증식성 질환 상태 또는 병태의 예방 또는 치료에서 단일 화학요법제로서 또는 보다 일반적으로 화학요법제 또는 방사선 요법과의 조합 요법으로 유용할 것으로 고려된다. 상기 질환 상태 및 병태의 예는 상기에 명시되어 있다.
실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물과 함께 동시 투여될 수 있는 화학요법제 또는 기타 치료의 특정예는 하기를 포함한다:
·토포이소머라제 I 억제제(예, 이리노테칸)
·항대사물질(예, 시타라빈 또는 겜시타빈)
·투불린 표적제(예, 파클리탁셀)
·DNA 결합제 및 토포이소머라제 II 억제제
·EGFR 억제제(예, 게피티닙 또는 아파티닙)
·mTOR 억제제(예, 에베롤리무스)
·PI3K 경로 억제제(예, PI3K, PDK1)
·Akt 억제제
·알킬화제(예, 테모졸로미드)
·모노클로날 항체
·항호르몬제
·신호 형질도입 억제제
·프로테아좀 억제제
·DNA 메틸 트랜스퍼라제 억제제
·시토킨 및 레티노이드
·저산소증 촉발된 DNA 손상제(예, 티라파자민)
·아로마타제 억제제
·항Her2 항체(예를 들면. http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?wo= 2007056118을 참조할 수 있다)
·항cd20 항체(예, 리툭시맙)
·혈관신생의 억제제
·HDAC 억제제
·MEK 억제제
·B-Raf 억제제
·ERK 억제제
·HER2 소분자 억제제(예, 라파티닙 또는 아파티닙)
·Bcr-Abl 티로신-키나제 억제제(예, 이마티닙)
·CDK4/6 억제제(예, 팔보시클립)
·Mps1/TTK 억제제
·오로라(Aurora) B 억제제
·FLT3 키나제 억제제
·IDH1 또는 IDH2 억제제
·BRD4 억제제
·테모졸로미드
·PD1, PDL-1 및 CTLA4를 포함한 면역 체크포인트 차단 신호전달 성분의 억제제;
·G12C와 같은 특정 돌연변이에 대한 것을 포함한 KRAS 차단 약물(예, 소토라십);
·Bcl2 억제제(예, 베네토클락스, 사부토클락스 또는 오바토클락스); 및
·방사선요법.
실시양태 1.1 내지 1.19 중 임의의 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물과 동시 투여될 수 있는 화학요법제 또는 기타 치료의 바람직한 예는 하기로부터 선택될 수 있다:
·토포이소머라제 I 억제제(예, 이리노테칸)
·항대사물질(예, 시타라빈 또는 겜시타빈)
·튜불린 표적제(예, 파클리탁셀)
·EGFR 억제제(예, 게피티닙 또는 아파티닙)
·mTOR 억제제(예, 에베롤리무스)
·알킬화제(예, 테모졸로미드)
·항cd20 항체(예, 리툭시맙)
·PD1, PDL-1 및 CTLA4를 포함한 면역 체크포인트 차단 신호전달 성분의 억제제;
·G12C와 같은 특정 돌연변이에 대한 것을 포함한 KRAS 차단 약물(예, 소토라십);
·Bcl2 억제제(예, 베네토클락스, 사부토클락스 또는 오바토클락스); 및
·방사선요법.
따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명은 하기를 제공한다:
5.1. 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 또 다른 치료적 활성제를 포함하는 약학 조합.
5.2. 실시양태 5.1에 있어서, 상기 또 다른 치료제는 상기 제시된 특정한 화학요법제 및 바람직한 화학요법제로부터 선택되는 것인 약학 조합.
5.3. 실시양태 5.1에 있어서, 상기 또 다른 치료제는 항암제인 약학 조합.
5.4. 실시양태 5.1 내지 실시양태 5.3 중 어느 하나에 있어서, 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 상기 또 다른 치료적 활성제는 단일 약학 조성물 또는 환자 팩으로 제공되는 것인 약학 조합.
5.5. 실시양태 1.1 내지 1.19 중 어느 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물, 또 다른 치료적 활성제, 및 적어도 1종의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
5.6. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 실시양태 5.1 내지 5.5 중 어느 하나에 의한 약학 조합의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
도면의 간단한설명
도 1은 회전장애 이성질체에 대한 R/S 분류계를 예시하는 개략도이다.
도 2는 단일 결정 X선 결정학상 연구에 의하여 측정시 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]벤즈아미드 회전장애 이성질체 A-2의 입체 구조를 도시한 것이다.
도 3은 2종의 회전장애 이성질체 A-1(S) 및 A-2(R)의 개략적 입체화학 예시 및 칸-인골드-프렐로그(CIP) 순위 규칙을 사용하여 그의 입체화학 구조를 할당하기 위한 기초를 나타낸 것이다.
도 4는 회전장애 이성질체 A-2 유리 염기에 대한 X선 분말 회절 스펙트럼이다.
도 5는 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 A 염(하부 선) 및 패턴 B 염(상부 및 중간 선)에 대한 X선 분말 회절 스펙트럼이다.
도 6은 회전장애 이성질체 A-2 유리 염기에 대한 열적 프로파일을 예시하고, 시차 주사 열량법 플롯(선 6A) 및 열중량 분석 플롯(선 6B)을 도시한 것이다.
도 7은 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 A 염에 대한 열적 프로파일을 예시하고, 시차 주사 열량법 플롯(선 7A) 및 열중량 분석 플롯(선 7B)을 도시한 것이다.
도 8은 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염에 대한 열적 프로파일을 예시하고, 시차 주사 열량법 플롯(선 8A) 및 열중량 분석 플롯(선 8B)을 도시한 것이다.
도 9는 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염에 실시한 중량 수분 수착 연구에서 상대 습도에 대한 중량 변화의 플롯이다.
도 10은 U87MG 세포를 0.03 μM 농도의 회전장애 이성질체 A-1 또는 회전장애 이성질체 A-2로 처리한 후 상이하게 관찰된 유사분열 표현형(비회합 염색체, 다극성 방추체/이상 세포질분열, 단극성 방추체, 정상 전중기, 그 후 생성된 정상 중기)의 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 11은 0.02 μM 농도의 회전장애 이성질체 A-1 또는 회전장애 이성질체 A-2를 사용한 치료 후 HeLa 세포에 존재하는 중심소체의 개수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 12는 마우스에게 회전장애 이성질체 A-2를 경구 및 정맥내 투여 후 시간에 대한 혈장 농도의 플롯이다. 24 시간까지 연장되어 있는 하부 선은 2 ㎎/㎏ 정맥내 투여에 대한 선이다. 나머지 선은 10 ㎎/㎏ 경구 투여에 대한 것이다.
도 13은 마우스에게 회전장애 이성질체 A-2의 경구 투여(10 ㎎/㎏) 후 시간에 대한 혈장 및 뇌 농도의 플롯이다. 상부 선은 뇌 농도를 나타내는 한편, 하부 선은 혈장 농도를 나타낸다.
도 14는 회전장애 이성질체 A-2의 투여 후 U87MG 피하 이종이식 모델에서 무흉 누드 마우스 수컷에서 시간에 대한 종양 부피의 플롯이다.
도 15는 회전장애 이성질체 A-2의 투여 후 U87-Luc 동소 이종이식 모델에서 무흉선 누드 마우스 수컷에서 종양 성장과 관련된 생물발광 신호의 그래프 비교이다.
도 16은 회전장애 이성질체 A-2의 투여 후 HCT116 피하 이종이식 모델에서 무흉선 누드 마우스 수컷에서 시간에 대한 종양 부피의 플롯이다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 기재된 구체적인 실시양태에 대한 언급을 예시하지만, 이에 제한되지 않는다.
양성자 자기 공명(1H NMR) 스펙트럼은, 달리 지시되어 있지 않는 한, 디메틸술폭시드-d6(DMSO-d6) 또는 메탄올-d4(MeOH-d4)(나타낸 바와 같음) 중에 27℃에서 400 MHz에서 작동하는 브루커(Bruker) 400 기기 상에서 기록하고, 하기와 같이 기록한다: 화학적 이동 δ/ppm (다중도, 여기서 s=단일항, d=이중항, dd=이중 이중항, dt-이중 삼중항, t=삼중항, q=사중항, m=다중항, br=넓음, 양성자의 개수). 잔류 양성자성 용매는 내부 표준으로서 사용하였다.
액체 크로마토그래피 및 질량 분광학 분석은 상기 시스템 및 하기 명시된 작동 조건을 사용하여 실시하였다. 상이한 동위원소를 갖는 원자가 존재하며, 단일 중량이 인용되는 경우, 화합물에 대하여 언급된 질량은 단일동위원소 질량(즉, 35Cl; 79Br 등)이다.
LCMS 조건
하기 실시예에 제시된 LCMS 데이타는 하기 기재된 방법 중 하나를 사용하여 얻었다.
LCMS 방법 1
LCMS는 PDA 포토다이오드 어레이 검출기 및 QDa 질량 검출기를 갖는 UPLC 애쿼티(AQUITY) 상에서 실시하였다. 사용한 컬럼은 C18, 2.1×50 ㎜, 1.9 ㎛이었다. 컬럼 유속은 1.2 ㎖/min이었으며, 사용한 이동상은 (A) 밀리큐(MilliQ) 수 중의 0.1% 포름산(pH=2.70) 및 (B) 물:아세토니트릴(10:90) 중의 0.1% 포름산이었으며, 주입 부피는 4 내지 7 ㎕이었다. 샘플은 메탄올:아세토니트릴 중에서 제조하여 250 ppm의 대략적인 농도를 달성하였다.
하기 구배는 용출에 대하여 사용하였다:
Figure pct00006
질량 파라미터
프로브: ESI 모세관
소스 온도: 120℃
프로브 온도: 600℃
모세관 전압: 0.8 KV (+Ve 및 -Ve)
콘 전압: 10 & 30 V
이온화 모드: 포지티브 및 네가티브
HPLC 분석
보고된 HPLC 데이타는 하기 방법을 사용하여 얻었다.
HPLC 방법 1
HPLC 분석은 아질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies) 1100/1200 시리즈 HPLC 시스템 상에서 실시하였다. 사용한 컬럼은 에이스(ACE) 3 C18; 150×4.6㎜, 3.0 ㎛ 입자 크기(Ex: 하이크롬(Hichrom), 파트 넘버: ACE-111-1546)이었다. 유속은 1.0 ㎖/min이었다. 이동상 A는 물:트리플루오로아세트산(100:0.1%)이었으며, 이동상 B는 아세토니트릴:트리플루오로아세트산(100:0.1%)이었다. 주입 부피는 5 ㎕이었으며, 하기 구배를 사용하였다:
Figure pct00007
키랄 HPLC 분석
보고된 키랄 HPLC 데이타는 하기 기재된 방법 중 하나를 사용하여 얻었다.
키랄 HPLC 방법 1
키랄 HPLC 분석은 아질런트 테크놀로지즈 1200 시리즈 HPLC 시스템 상에서 실시하였다. 사용한 컬럼은 키랄 PAK IG, 250×4.6 ㎜, 5 ㎛이었다. 컬럼 유속은 1.0 ㎖/min이었으며, 이동상은 (A) n-헵탄 중의 0.1% v/v DEA 및 (B) IPA:MeOH(70:30)이었다. 주입 부피는 25 ㎕이었다. 샘플은 IPA:MeOH 중에서 제조하여 하기 등용매 방법으로 250 ppm의 대략적인 농도를 달성하였다:
Figure pct00008
키랄 HPLC 방법 3
키랄 HPLC는 아질런트 테크놀로지즈 1200 시리즈 HPLC 시스템 상에서 실시하였다. 사용한 컬럼은 키랄 팩 IG, 250×4.6 ㎜, 5 ㎛이었다. 컬럼 유속은 1.0 ㎖/min이었으며, 이동상은 (A) n-헵탄 중의 0.1% v/v DEA 및 (B) IPA:MEOH(70:30)이었다. 주입 부피는 10 ㎕이었다. 샘플은 IPA:MeCN 중에서 제조하여 하기 등용매 방법으로 250 ppm의 대략적인 농도를 달성하였다:
Figure pct00009
키랄 HPLC 방법 4
하기 등용매 방법을 사용한 것을 제외하고는 키랄 방법 3과 동일한 조건을 사용하였다:
Figure pct00010
키랄 HPLC 방법 5
하기 등용매 방법을 사용한 것을 제외하고는 키랄 방법 3과 동일한 조건을 이용하였다:
Figure pct00011
키랄 HPLC 방법 6
키랄 HPLC는 아질런트 테크놀로지즈 1100/1200 시리즈 HPLC 시스템 상에서 실시하였다. 사용된 컬럼은 키랄팩(CHIRALPAK) AD-H; 250×4.6 ㎜, 5.0 ㎛이었다. 컬럼 유속은 1.0 ㎖/min이었으며, 유동상은 헥산:EtOH:TFA(90:10:0.1%)이었다. 주입 부피는 5 ㎕이었다. 샘플은 100% EtOH 중에서 제조하여 0.5 ㎎/㎖의 근사적 농도를 달성하였다.
키랄 HPLC 방법 7
키랄 HPLC 분석은 아질런트 테크놀로지즈 1100/1200 시리즈 HPLC 시스템 상에서 실시하였다. 사용한 컬럼은 키랄팩 IA; 250×4.6 ㎜, 5.0 ㎛이었다. 컬럼 유속은 1.0 ㎖/min이었으며, 이동상은 헥산:EtOH:에탄올아민(90:10:0.1%)이었다. 주입 부피는 5 ㎕이었다. 샘플은 100% EtOH 중에서 제조하여 0.5 ㎎/㎖의 대략적인 농도를 달성하였다.
정제용 키랄 HPLC 방법:
회전장애 이성질체는 하기 정제용 키랄 HPLC 방법 중 하나를 사용하여 단리시켰다.
정제용 키랄 HPLC 방법 1
정제용 키랄 HPLC는 키랄팩 IG SFC, 21×250 ㎜, 5 ㎛ 컬럼, 이동상으로서 (A) 헵탄 중의 0.1% DEA 및 (B) IPA로 용출시키며, 30 ㎖/min의 유속 및 하기 등용매 시스템으로 실시하였다:
Figure pct00012
정제용 키랄 HPLC 방법 2
정제용 키랄 HPLC는 키랄팩 IG SFC 컬럼, 21×250 ㎜, 5 ㎛, 이동상으로서 (A) 헵탄 중의 0.1% DEA 및 (B) IPA:MeOH(90:10)로 용출시키며, 22 ㎖/min의 유속을 사용하여 실시하였으며, 하기 등용매 시스템으로 용출에 사용하였다:
Figure pct00013
실시예 1
(R)-4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]벤즈아미드
Figure pct00014
표제 화합물은 상기 반응식 1에 제시된 합성 경로의 단계 1, 2, 3, 4b 및 5b를 수행하여 제조하였다.
단계 1: 4 -[4-(4- 클로로페닐 )-4-옥소- 부타노일 ]벤조니트릴(6)
Figure pct00015
염화아연(30.5 g, 223 mmol)을 진공 하에서 가열하여 용융시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 톨루엔(100 ㎖), tert-부탄올(16.5 ㎖, 172 mmol) 및 트리에틸아민(24 ㎖, 172 mmol)을 첨가하고, 염화아연이 완전 용해되는 시점에서 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 질소 대기 하에서 교반하였다. 4-시아노아세토페논(25 g, 172 mmol) 및 4-클로로펜아실브로마이드(40.2 g, 172 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(300 ㎖)로 희석하고, 물(5×100 ㎖)로 세정하였다. 합한 유기 추출물을 건조시키고(Na2SO4), 감압 하에서 증발시켰다. 메틸 tert-부틸 에테르(400 ㎖)를 사용한 마쇄에 의하여 생성된 잔류물을 정제하여 표제 화합물(30 g, 101 mmol, 59%)을 얻었다.
단계 2: 4 -(5-(4- 클로로페닐 )-1-(2-( 트리플루오로메틸 )페닐)-1H-피롤-2-일)벤조니트릴(7)
Figure pct00016
디옥산(300 ㎖) 중의 4-(4-(4-클로로페닐)-4-옥소부타노일)벤조니트릴(30 g, 101 mmol), 2-트리플루오로메틸 아닐린(48.79 g, 303 mmol) 및 p-톨루엔술폰산(1.92 g, 10.099 mmol)의 교반된 용액을 150℃에서 16 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 실리카 겔(60-120 메쉬) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의하여 용출제로서 8% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 정제하여 표제 화합물(30 g, 71 mmol, 70%)을 얻었다.
단계 3: 4 -(5-(4- 클로로페닐 )-1-(2-( 트리플루오로메틸 )페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(8)
Figure pct00017
메탄올(20 ㎖) 중의 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조니트릴(2 g, 4.739 mmol)의 용액에 수(10 ㎖) 중의 수산화나트륨(1.89 g, 47 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 90℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 디에틸 에테르(10 ㎖)를 사용하여 마쇄에 의하여 정제하여 표제 화합물(1.8 g, 4.1 mmol, 86%)을 얻었다.
단계 4b: 4-(5-(4- 클로로페닐 )-1-(2-( 트리플루오로메틸 )페닐)-1H-피롤-2-일)-N-(2-(디메틸아미노)에틸)벤즈아미드(9)
Figure pct00018
디메틸포름아미드(12 ㎖) 중의 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(1.8 g, 4.0 mmol)의 교반된 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민(2.13 ㎖, 22 mmol)에 이어서 (1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄-3-옥시드 헥사플루오로포스페이트)(HATU)(4.65 g, 12 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반한 후, N,N'-디메틸에틸렌디아민(1.08 g, 12 mmol)을 적가하고, 교반을 실온에서 4 시간 동안 지속하였다. 그 후, 혼합물을 빙냉수(150 ㎖)에 붓고, 에틸 아세테이트(3×100 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 6% 메탄올/디클로로메탄으로 용출시키는 중성 알루미나 상의 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 표제 화합물(1.2 g, 2.3 mmol, 57%)을 회전장애 이성질체의 혼합물로서 얻었다.
단계 5b: 회전장애 이성질체의 분리
4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 회전장애 이성질체를 키랄 HPLC에 의하여 정제용 키랄 HPLC 방법 1을 사용하여 분해하였다.
2개의 피크를 단리시켰다:
피크 1: 실시예 A-1, 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드 - 회전장애 이성질체 1(0.3 g, 0.58 mmol, 38%, > 99% ee), 및
피크 2: 실시예 A-2, 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드 - 회전장애 이성질체 2(0.31 g, 0.606 mmol, 39%, 98% ee).
화합물은 또한 그의 히드로클로라이드 염으로서 단리될 수 있다.
실시예 2
회전장애 이성질체의 추가의 정제 및 특성화
회전장애 이성질체 A-1: (S)-4-[5-(4- 클로로페닐 )-1-[2-( 트리플루오로메틸 )페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드 히드로클로라이드 염
실시예 1, 단계 5b로부터의 피크 1(0.31 g, 0.606 mmol)을 HPLC 등급수(30 ㎖) 중에서 교반한 후 10 분 동안 음파 처리하고, 에틸 아세테이트(3×30 ㎖)로 추출하여 추가로 정제하였다. 합한 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 감압 하에서 농축시킨 후, 동결건조시켜 무정형 고체(0.290 g, 0.567 mmol, 94%)를 얻고, 이를 디클로로메탄(7.12 ㎖) 중에 용해시켰다. 생성된 용액을 0℃로 냉각시키고, 디옥산 중의 4 N HCl(1.42 ㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 고 진공 하에서 건조시켰다. 디에틸 에테르(10 ㎖)를 사용한 마쇄 및 동결건조에 의하여 정제하여 표제 화합물(0.3 g, 0.56 mmol, 98%)을 회백색 고체로서 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6) δ 10.03, (brs, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.81-7.68 (m, 6H), 7.25 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.10-7.03 (m, 4H), 6.67-6.58 (m, 2H), 3.56-3.54 (m, 2H), 3.20-3.18 (m, 2H), 2.76 (s, 6H). LCMS (방법 1) - RT 2.54, MH+ 512.4.
회전장애 이성질체 A-2: (R)-4-[5-(4- 클로로페닐 )-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드 히드로클로라이드 염
회전장애 이성질체 A-2의 히드로클로라이드 염은 피크 2로부터 출발하여 회전장애 이성질체 A-1에 대하여 사용된 바와 동일한 방법을 사용하여 정제하여 표제 화합물(0.31 g, 0.56 mmol, 99%)을 회백색 고체로서 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6) δ 9.91 (brs, 1H), 8.69 (s, 1H), 7.81-7.68 (m, 6H), 7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.10-7.03 (m, 4H), 6.67-6.58 (m, 2H), 3.56-3.54 (m, 2H), 3.20-3.18 (m, 2H), 2.77 (s, 6H). LCMS (방법 1) - RT 2.56, MH+ 512.4.
회전장애 이성질체 A-2의 단일 결정 X선 결정학상 분석(하기 실시예 3 참조)은 회전장애 이성질체 A-2가 R-이성질체(화합물(1))이며, 그리하여 회전장애 이성질체 A-1은 S-이성질체이어야 한다는 것을 나타냈다.
키랄 분석
회전장애 이성질체 A-1 및 A-2의 키랄 성질의 분석은 상기 기재된 방법을 사용하여 키랄 HPLC에 의하여 얻은 그의 선광도 및 그의 체류 시간을 측정함으로써 실시하여 하기 표에 제시한 결과를 얻었다.
비선광도 프로토콜:
기기: 광학 활성 AA-10 자동 편광계
파장: 589 ㎚
온도: 23℃
셀의 경로길이: 1 dm
용매: 클로로포름(피셔, HPLC 등급)
농도: 1.0 g/100 ㎖
샘플링 기법:
기기를 켜고, 30 분 동안 안정화되도록 한 후 옵티칼 액티비티 쿼츠 콘트롤 플레이트(Optical Activity Quartz Control Plate)(S/N 00049)를 사용하여 보정을 체크하였다. 나트륨 옐로우 D 라인을 사용하는 23℃에서의 각회전은 34.16°에서 측정하였다(임의의 샘플 튜브 없이 우선 기기를 영점 조정한 후). 샘플 튜브 품질은 기기를 영점 조정한 후 샘플 튜브에 클로로포름을 채워 체크하고, 기기의 체크는 여전히 0.00(+/-0.02)로 판독되었다. 기기를 적소에서 클로로포름 공시험으로 영점 조정하였다. 샘플을 CHCl3(2 ㎖ 중 2 ㎎) 중에 용해시키고, 여과하고, 2 ㎖를 셀에 피펫팅하여 α를 측정하였다.
비선광도는 수학식 [α]Tλ = (α×100)/(cl)로부터 계산하였다.
Figure pct00019
회전장애 이성질체 분류
안정성 실험은 단리된 회전장애 이성질체 A-1 및 A-2에 실시하였다.
회전장애 이성질체 A-1 및 회전장애 이성질체 A-2의 상호전환을 평가하기 위하여 키랄 안정성을 40℃ 및 80℃에서 모니터링하였다. 하기 명시된 결과에 의하여 나타난 바와 같이, 10 일 동안 상기 온도에서 가열시 상호전환은 관찰되지 않았다.
Figure pct00020
프로토콜:
1. 2×1 ㎎의 순수한 회전장애 이성질체를 1 ㎖의 에탄올 중에서 밀봉된 드람 바이알 중에서 용해시켰다.
2. 바이알 1 세트를 40℃에서 및 또 다른 세트를 80℃에서 가열하였다.
3. 명시된 시점에서 각각의 스톡 용액(1 ㎖)으로부터의 20 ㎕ 분액을 취하고, 헥산:에탄올; 80:20의 용액 80 ㎕를 함유하는 HPLC 바이알에 켄칭시켜 200 ppm의 최종 농도를 얻고, 샘플을 키랄 HPLC에 의하여 분석하였다.
4. 분석은 40℃에서 유지된 샘플의 경우 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h 및 240 h 및 80℃에서 유지된 샘플의 경우 24 h, 96 h 및 240 h인 시점에서 키랄 HPLC 방법 5를 사용하여 실시하였다.
단리된 회전장애 이성질체 A-1 및 A-2의 안정성은 이들이 부류 3 회전장애 이성질체이라는 것을 확인하여 보여 주었다(LaPlante et al., J. Med . Chem ., 54:7005-7022 (2011)).
실시예 3
회전장애 이성질체 A-2의 X선 결정학상 분석
회전장애 이성질체 A-2 유리 염기를 생성하고, 단일 결정을 하기 기재된 바와 같이 X선 결정학상 연구로 처리하였다.
실험:
회전장애 이성질체 A-2의 단일의 정의되지 않은 모폴로지 결정은 메틸 이소부틸 케톤(MIBK)으로부터의 재결정화에 의하여 얻었다. 적절한 결정 0.19×0.13×0.04 ㎣을 선택하고, 미티겐 마이크로마운트(MiTiGen MicroMount)를 사용하여 HyPix-6000HE 검출기가 구비된 리가쿠(Rigaku) XtaLAB 신게리(Syngery)-S 회절계 상에 장착하였다. 결정은 데이타 수집 동안 안정한 T = 123(2) K에서 유지하였다.
데이타는 CuKα 방사를 사용하여 생성하였다. 달성된 최대 해상도는 θ = 74.263°(0.80 Å)이었다. 데이타 축소, 스케일링 및 흡수 보정을 수행하였다. 최종 완성도는 θ에서 74.263°까지 100.00%이었다. 화합물의 흡수 계수 μ는 파장(λ = 1.542 Å)에서 1.761 ㎜-1인 것으로 측정되었다.
데이타는 크리스알리스프로(CrysAlisPro) 소프트웨어를 사용하여 수집 및 처리하고, 구조는 고유 위상(Intrinsic Phasing) 솔루션 방법을 사용하는 셀엑스티(ShelXT)(Sheldrick, 2015) 구조 솔루션 프로그램으로 그리고 올렉스2(Olex2)(Dolomanov et al., 2009)를 그래픽 인터페이스로서 사용하여 분해하였다. 모델은 셀엑스엘(ShelXL)-2018/3(Sheldrick, 2018)의 버전 2018/3으로 최소 자승 최소화를 사용하여 정련(refine)하였다.
결정 구조는 단사정계인 것으로 밝혀졌으며, 공간군 P21(#4)로 할당하였다.
수소가 아닌 원자 모두는 이방성으로 정련하였다. 수소 원자 위치는 기하학적으로 계산하고, 라이딩(riding) 모델을 사용하여 정련하였다.
Figure pct00021
연구의 결과는 하기 표 1-7에 제시한다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
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Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
하기 제시된 데이타에 기초하여 회전장애 이성질체 A-2는 도 2 및 3에 도시된 바와 같이 R 배치를 갖는 것으로 여겨지므로, (R)-4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]벤즈아미드로 명명할 수 있다.
실시예 4
(R)-4-[5-(4- 클로로페닐 )-1-[2-( 트리플루오로메틸 )페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드 타르트레이트 염의 제조 및 특성화
방법 1: 타르트레이트 염의 소규모 제조
회전장애 이성질체 A-2 유리 염기(904.2 ㎎)를 아세톤(9.042 ㎖, 10 vol) 중에 현탁시키고, 25℃에서 40 분 동안 교반하였다. 용액에 눈에 보이는 미립자가 없을 때, 이를 12개의 동일한 분액(603 ㎕)으로 분할하여 샘플당 60.3 ㎎의 대략적인 활성 함유량을 얻었다.
에탄올 중의 타르타르산의 0.5 M 용액 247 ㎕(1.05 eq)의 분액을 유리 염기 용액의 분액에 25℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 18 시간 동안 교반한 후, 백색 현탁액이 형성되었으며, 생성된 고체를 여과(PTFE 10 미크론 프릿 처리된 카트리지)에 의하여 단리시키고, 생성된 고체를 단리시키고, 진공 하에서 40℃에서 약 72 시간 동안 건조시켰다. 생성된 염을 타르트레이트 패턴 A(용매화물)로서 표시하였다.
방법 2: 회전장애 이성질체 A-2의 이소프로필 아세테이트 용액을 사용한 타르 트레이트 염의 제조
회전장애 이성질체 A-2(749.8 ㎎)를 이소프로필 아세테이트(15 ㎖, 20 vol) 중에 현탁시키고, 현탁액을 40℃로 진탕시키면서 가열하였다. 용액에 눈에 보이는 미립자가 없을 때, 이를 12 개의 동일한 분액(1 ㎖)으로 분할하여 샘플당 50 ㎎의 대략적인 활성 함유량을 얻었다. 에탄올 중의 회전장애 이성질체 A-2의 1 M 용액 195.3 ㎕의 분액을 유리 염기 용액의 분액에 40℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 시간당 대략 10℃의 냉각 속도로 25℃로 냉각시켰다. 형성된 백색 현탁액 및 생성된 고체를 여과(PTFE 10 미크론 프릿 처리된 카트리지)에 의하여 단리시키고, 진공 하에서 40℃에서 약 18 시간 동안 건조시켰다. 생성된 염을 타르트레이트 패턴 B로서 표시하였다.
방법 3: 회전장애 이성질체 A-2의 이소프로필 알콜 용액을 사용한 타르트레이트 염의 제조
회전장애 이성질체 A-2(750.1 ㎎)를 이소프로필 알콜(15 ㎖, 20 vol) 중에 초기에 현탁시킨 것을 제외하고는 방법 2를 수행하여 타르트레이트 패턴 A 염을 제조하였다.
방법 4: 회전장애 이성질체 A-2의 2- 메틸 -테트라히드로푸란 용액을 사용한 타르트레이트 염의 제조
회전장애 이성질체 A-2(913.9 ㎎)를 2-메틸-테트라히드로푸란(15 ㎖, 20 vol), (9.139 ㎖, 10 vol) 중에 초기에 현탁시키고, 25℃에서 약 40 분 동안 교반한 후, 에탄올 중의 1 M 타르타르산의 250 ㎕(1.05 eq) 분액을 A-2 유리 염기 용액의 분액에 첨가하여 타르트레이트 패턴 A 염을 얻은 것을 제외하고는, 방법 1을 반복하였다.
방법 5: 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염의 500 ㎎ 규모의 제조
회전장애 이성질체 A-2 유리 염기(521.5 ㎎)를 유리 바이알로 계량하고, 이소프로필 아세테이트(20 vol, 10.430 ㎖)를 넣었다. 혼합물을 40℃로 가열하고, 15 분 동안 교반하여 맑은 용액을 얻었다. 그 후, 용액을 3 ㎖의 테트라히드로푸란 중에 용해된 타르타르산(1.05 eq, 162.5 ㎎)을 넣었다. 생성된 혼합물은 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B로 시딩하여 염이 40℃에서 즉시 침전되게 하여 유동성 현탁액을 형성하였다. 혼합물을 25℃로 냉각시키고, 20 시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의하여 단리시키고, 40℃에서 진공 하에 건조시켜 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염을 84% 수율로 얻었다.
방법 6: 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염(무수 형태)의 규모 확장된 생성
회전장애 이성질체 A-2 유리 염기(10.0497 g)를 부치(Buchi) 플라스크에 계량하고, 이소프로필 아세테이트(20 vol, 200 ㎖)를 넣었다. 혼합물을 40℃로 가열하여 침전물이 없는 맑은 용액을 얻고, 30 분 동안 교반하였다. 용액에 테트라히드로푸란(50 ㎖) 중에 용해된 타르타르산(3.1954 g, 1.08 eq.)을 넣고, 산을 하기와 같이 여러 부분으로 나누어 첨가하였다: 40℃에서 15 ㎖; 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염으로 시딩하고, 30 분 동안 교반하며; 10 ㎖ 및 1 시간 동안 교반하며; 10 ㎖ 및 30 분 동안 교반하고; 15 ㎖ 및 30 분 동안 교반하였다. 그 후, 백색 현탁액을 10℃/h의 냉각 속도로 실온으로 냉각시키고, 18 시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 진공 하에서의 여과에 의하여 단리시키고, 이소프로필 아세테이트(2×2 vol)로 세정하고, 진공 하에 40℃에서 20 시간 동안 건조시켜 A-2 타르트레이트 패턴 B 염(무수)을 97% 수율로 얻었다; HPLC 순도 99.74%(HPLC 방법 1), 키랄 순도 99.27%(키랄 HPLC 방법 7).
방법 7: 부탄올/물 96:4로부터의 냉각 결정화에 의하여 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염(무수 형태)의 대안의 규모 확장된 제조
회전장애 이성질체 A-2 유리 염기(36.79 g)를 플라스크에 계량하고, 부탄올(282.57 ㎖, 7.68 vol)을 넣었다. 혼합물을 80℃로 가열하고(담황색, 뿌연 용액), 30 분 동안 교반한 후, 미야(Mya)* 용기에 정화시키고, 80℃에서 예열시켰다. 그 후, 용액에 L-(+)-타르타르산(1.023 eq, 11.0806 g)에 수 중의 용액(11.77 ㎖, 0.32 vol의 초기 API 공급물)으로서 넣었다. 80℃에서 산 용액으로 정화시키면서 적가하였다. 그 후, 혼합물을 68℃로 30 분의 기간에 걸쳐 냉각시키고, 0.1%의 분쇄된 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염 씨드 결정(32.6 ㎎)으로 시딩하고, 1 시간 동안 유지하였다. 그 후, 혼합물을 5℃/h의 냉각 속도로 5℃로 냉각시키고, 5℃에서 6 시간 동안 교반한 후, 고체를 단리시켰다. 고체를 진공 하에서 여과하고, 부탄올로 2회 세정하고, 15 분 동안 필터 상에서 건조시킨 후, 40℃에서 20 시간 동안 건조시켜 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염(무수)을 83%의 수율로 얻었다; HPLC 순도 99.84%(HPLC 방법 1), 키랄 순도 99.66%(키랄 HPLC 방법 7).
*주: 온도 제어 및/또는 정의된 가열/냉각 프로파일을 필요로 하는 상기 평형화 또는 결정화에서, 래들리(Radley)의 미야4 반응 스테이션을 사용하였다. 래들리의 미야4 반응 스테이션은 자기 및 오버헤드 교반 능력 및 2 내지 400 ㎖ 규모의 혼합물에 대하여 -30 내지 180℃의 온도 범위를 갖는 4-구역 반응 스테이션이다. 반응 조건은 미야4 제어 패드를 경유하여 프로그래밍하였다.
회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 염의 특성화
1:1(유리 염기:타르타르산의 몰비) 화학량론적 염으로서 염의 정체는 그의 1H NMR 스펙트럼으로부터 확인하였으며, 이는 오토샘플러가 구비된 제올(JEOL) ECX 400 MHz 분광계를 사용하여 수집하였다. 분석을 위하여 샘플을 적절한 중수소화 용매 중에 용해시켰다. 데이타는 δ(델타) NMR 프로세싱 및 제어 소프트웨어 버전 4.3을 사용하여 얻었다.
타르트레이트 염은 하기 기재된 기술을 사용하여 X선 분말 회절(XRPD), 시차 주사 열량법(DSC), 열중량 분석(TGA), 중량 용해도 태스트 및 중량 증기 수착 테스트를 사용하여 특성화하였다.
X선 분말 회절( XRPD )
X선 분말 회절 패턴은 패날리티칼(PANalytical) 회절계 상에서 Cu Kα 방사(45 kV, 40 mA), θ-θ 고니오미터(goniometer), 집속 거울, 발산 슬릿(1/2"), 입사 및 발산 비임 둘다에서의 솔러(soller) 슬릿(4 ㎜) 및 PIXcel 검출기를 사용하여 수집하였다. 데이타 수집에 사용된 소프트웨어는 엑스퍼트(X'Pert) 데이타 수집기, 버전 2.2f이었으며, 데이타는 엑스퍼트 데이타 뷰어, 버전 1.2d를 사용하여 제시하였다. XRPD 패턴은 주위 조건 하에서 송신 호일 샘플 스테이지(transmission foil sample stage)(폴리이미드, 캡톤(Kapton), 12.7 ㎛ 두께 필름)에 의하여 패널리티칼 엑스퍼트 프로(PRO)를 사용하는 주위 조건 하에서 얻었다. 데이타 수집 범위는 2.994-35°2θ이었으며, 연속 스캔 속도는 0.202004°s-1이었다.
시차 주사 열량법 ( DSC )
DSC 데이타는 45-위치 샘플 홀더가 구비된 퍼킨엘머 파이리스(PerkinElmer Pyris) 6000 DSC 상에서 수집하였다. 기기는 에너지 및 온도 보정에 대하여 인증된 인듐을 사용하여 검증하였다. 사전정의된 양의 샘플 0.5-3.0 ㎎을 핀-홀이 있는 알루미늄 팬에 넣고, 20℃ min-1에서 30℃로부터 350℃로 가열하거나 또는 지시된 실험과 같이 변경하였다. 20 ㎖ min-1에서 건조 질소의 퍼지를 샘플 상에서 유지하였다. 기기 제어, 데이타 수집 및 분석은 파이리스 소프트웨어 v11.1.1 버전 H로 수행하였다.
열중량 분석( TGA )
TGA 데이타는 20-위치 오토샘플러가 구비된 퍼킨엘머 파이리스 1 TGA 상에서 수집하였다. 기기는 인증된 추 및 온도에 대하여 인증된 알루멜(Alumel) 및 퍼칼로이(Perkalloy)를 사용하여 보정하였다. 사전정의된 양의 샘플 1-5 ㎎을 미리 무게를 잰 알루미늄 도가니에 로딩하고, 20℃ min-1에서 주위 온도로부터 400℃로 가열하였다. 20 ㎖ min-1에서의 질소 퍼지를 샘플 상에서 유지하였다. 기기 제어, 데이타 수집 및 분석은 파이리스 소프트웨어 v11.1.1 버전 H로 수행하였다.
중량 용해도
염의 수용해도는 중량 용해도 프로토콜을 사용하여 측정하였다.
1 ㎖의 물을 결정화 시험관에 넣었다. 미리 무게를 잰 유리 바이알에 고체를 계량하고, 여러 부분으로 나누어 용액에 첨가하고, 뿌연 용액이 관찰될 때까지 각각의 첨가 후 바이알을 계량하였다. 그 후 양(㎎)을 계산하여 용해도(㎎/㎖)를 구하였다.
특성화 연구로부터 얻은 결과는 하기 표 8에 제시한다.
Figure pct00037
중량 증기 수착 ( GVS )
GVS 실험은 하기 제시된 프로토콜을 사용하여 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염 상에서 실시하였다.
수착 등온선은 IGAsorp 시스템 소프트웨어 V6.50.48에 의하여 제어되는 하이든 이소케마(Hiden Isochema) 수분 수착 분석기(모델 IGAsorp)를 사용하여 얻었다. 샘플은 일정한 온도(25℃)에서 기기 제어에 의하여 유지하였다. 습도는 건조 및 젖은 질소의 혼합 흐름에 의하여 250 ㎖ min-1의 총 유속으로 제어하였다. 기기는 3종의 보정된 로트로닉(Rotronic) 염 용액(10-50-88%)을 측정하여 상대 습도 함유량에 대하여 확인하였다. 샘플의 중량 변화는 미량저울(정확도 ±0.005 ㎎)에 의하여 습도의 함수로 모니터링하였다. 정의된 양의 샘플을 미리 중량을 잰 메쉬 스테인레스 스틸 바스켓에 주위 조건 하에서 넣었다. 전체 실험 사이클은 통상적으로 일정한 온도(25℃) 및 10% RH 간격으로 0-90% 범위(각각의 습도 수준에 대하여 60 분)에 걸쳐 3회 스캔(수착, 탈착 및 수착)으로 이루어진다. 상기 유형의 실험은 연구된 샘플이 잘 결정된 습도 범위에 걸쳐 수분을 흡수하는(또는 흡수하지 않는) 능력을 입증하여야 한다.
GVS 분석(도 9 참조)은 제1의 탈착 전 약 0.3%의 수분 함유량을 나타냈다. 80 내지 90% RH에서 수분에서의 약간 더 큰 증가가 있으며, 고체는 약 0.8% 수분을 취한다. 제2의 수착/탈착 사이클은 수분 흡수가 완전하게 가역적인 방법을 나타내며, 0% RH에서 0 중량%로 복귀한다. 최소 3 시간 동안 0% RH 및 90% RH에서 유지된 XRPD 후GVS 사이클링은 RH 값 둘다에서 무수 패턴 B를 얻었다.
그러므로 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염은 안정한 고체로서 존재하며, 표면 수분만을 형태 변화 없이 흡수하는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 5
(R)-4-[5-(4- 클로로페닐 )-1-[2-( 트리플루오로메틸 )페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드 타르트레이트 염의 추가의 특징
용해도
회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염은 수성 제제 중에서 가용성이 매우 커서 경구 전달에 적절한 것으로 밝혀졌다. >100 ㎎/㎖의 농도는 연속 교반 및 40℃로의 온화한 가온에 이어서 수 중의 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 20% w/v의 용액 중에서 달성하였다.
분말 밀도
벌크 밀도는 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염을 50 ㎖ 유리 비이커에 넣어 측정하였다. 약 40 ㎖ 부피를 차지하여 계량하기 이전에 화합물이 침강되도록 하고, 벌크 밀도를 계산하였다.
탭 밀도는, 6-8 ㎖의 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염을 10 ㎖ 눈금 실린더에 넣은 후, 그 물질을, 15 분 동안 수동으로 수직 및 수평 방식으로 고무 매트 및 말렛을 사용하여 또는 더 이상 침강되지 않는 일정한 층이 달성될 때까지 반복하여 탭핑하여 진동시킴으로써 측정하였다. 그 후, 탭 밀도를 계산하였다.
회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염은 0.55 g/㎖의 분말 벌크 밀도 값 및 ~0.659 g/㎖의 탭 밀도를 갖는다.
약물 분말의 유동성 및 그에 따른 캡슐 형태로의 제제화에 대한 그의 적합성은 카르(Carr) 지수 및 하우스너 비율(Hausner ratio)에 의하여 정의될 수 있으며, 이는 하기 수학식에 의하여 그의 벌크 밀도 및 탭 밀도로부터 계산될 수 있다:
카르 압축 지수 = 100(ρT - ρB)/ρT
하우스너 비율 = ρT/ρB
그 후, 카르 지수 및 하우스너 비율은 하기 표에 명시된 바와 같이 유동성 기술자(descriptor)로 전환될 수 있다(출처: https://www.researchgate.net/figure/Specifications-for-Carrs-index-and-Hausner-ratio_tbl1_325365029).
Figure pct00038
회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염의 경우, 카르 지수는 16.5%로 계산되었으며, 하우스너 비율은 1.19로 계산되었으며, 이는 "적당" 유동성인 것으로 나타났다. 그러므로, 그러한 염 형태는 캡슐 투여에서 분말에 대하여 적절하다.
안정성
회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염의 안정성은 2종의 세트의 저장 조건을 사용하여 평가하였다: 이른바 25℃±2℃/60% RH 및 40℃±2℃/75% RH. 안정성 프로토콜은 ICH 지침을 따랐다.
그래서, 회전장애 이성질체 A-2 타르트레이트 패턴 B 염(용기당 1 g)을 ICH 등급 안정성 캐비넷에 25℃/60% RH 및 40℃/75% RH에서 하기 팩킹 성분과 함께 두었다:
- 이중 폴리텐 주머니(판매 회사 - 아마그립(Armagrip); 파트 번호 G01-PB-120),
- 스크류 캡 클로저를 갖는 광구 HDPE 병(판매 회사 - 커텍(Curtec); 파트 번호 4303),
- 플라스틱 타이 스트립(판매 회사 - 토마스 앤 베츠(Thomas & Betts); 파트 번호 TY125-40-100).
저장 후, 이들 샘플을 안정성 캐비넷으로부터 꺼내고, 외관, 칼 피셔(Karl Fischer) 적정(KF)에 의한 물 함유량 및 순도에 대하여 분석하였다. HPLC에 의한 물 함유량 또는 화학적 순도에서의 변화는 6 개월에 걸쳐 관찰되지 않았다. HPLC에 의한 물 함유량 또는 화학적 순도에서의 변화는 6 개월에 걸쳐 관찰되지 않았다.
Figure pct00039
실시예 6
(R)-4-[5-(4- 클로로페닐 )-1-[2-( 트리플루오로메틸 )페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드(회전장애 이성질체 A-2)의 대안의 제조 방법
Figure pct00040
표제 화합물은 상기 반응식 1에 제시된 합성 경로의 단계 1, 2, 3, 4a 및 5a를 실시하여 제조하였다. 그러한 경로에서, 키랄 분해는 디메틸아미노-에틸 아미드(9)에서보다는 카르복실산 중간체(8)에 실시한다.
단계 1: 4 -[4-(4- 클로로페닐 )-4-옥소- 부타노일 ]벤조니트릴(6)
플라스크에 테트라히드로푸란(4 ㎖/g)을 채우고, 염화아연(1.222 g/g, 1.3 eq)을 여러 부분으로 나누어 첨가하여 백색의 이동성 현탁액을 얻었으며, 이를 15 분 동안 교반하였다. tert-부탄올(0.66 ㎖/g, 1 eq)을 첨가한 후, 40℃ 미만으로 온도를 유지하면서 트리에틸아민(0.96 ㎖/g, 1 eq)을 여러 부분으로 나누어 첨가하였다. 반응을 2 시간 동안 교반하였다. 4-시아노아세토페논(1 g/g, 1 eq) 및 4-클로로펜아실 브로마이드(1.61 g/g, 1 eq)를 첨가하고, 반응 혼합물을 20℃(±5)에서 48 시간 동안 또는 반응이 완료될 때까지 교반하였다. 생성물을 수성 HCl를 사용한 침전 및 수성 HCl 및 메탄올 중의 슬러리에 의하여 단리시켰다. 생성된 고체를 진공 하에서(45℃) 건조시켜 표제 화합물을 담황색 고체로서 얻었다.
단계 2: 4 -(5-(4- 클로로페닐 )-1-(2-( 트리플루오로메틸 )페닐)-1H-피롤-2-일)벤조니트릴(7)
4-(4-(4-클로로페닐)-4-옥소부타노일)벤조니트릴(1 g/g, 1 eq)을 플라스크에 넣고, 디옥산(10 ㎖/g)을 첨가하여 황색 현탁액을 얻었다. 2-트리플루오로메틸 아닐린(1.269 ㎖/g, 3 eq)을 한번에 첨가한 후, p-톨루엔술폰산(0.06399 g/g, 0.1 eq)을 첨가하고, 반응 혼합물을 101℃에서 40-72 시간 동안 가열하였다(필요할 경우 추가적인 부분의 p-톨루엔술폰산(0.1 eq)을 8 시간마다 첨가하여 반응이 완료되게 하였다). 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 생성된 유성 잔류물을 메탄올(10 ㎖/g) 중에서 슬러리로 만들어 정제하였다. 고체를 여과에 의하여 단리시키고, 진공 하에서(45℃) 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
단계 3: 4 -(5-(4- 클로로페닐 )-1-(2-( 트리플루오로메틸 )페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(8)
메탄올(10.9 ㎖/g) 중의 4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조니트릴(1 g/g, 1 eq)에 수(5 ㎖/g) 중의 수산화나트륨(0.948 g/g, 10 eq)을 15 분에 걸쳐 적가하고, 생성된 혼합물을 70-76℃에서 18 시간 동안 또는 완료될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 산성화시키고, 생성물을 여과에 의하여 단리시키고, 물(5 ㎖/g) 및 아세토니트릴(3 ㎖/g)로 세정하였다. 생성물을 아세톤/물(20 vol, 75:25) 중에서 50-55℃에서 슬러리로 만들고, 진공 하에서(60℃) 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다.
단계 4a: ( 8)의 키랄 분해에 의한 (R) 4-(5-(4- 클로로페닐 )-1-(2-( 트리플루오로메틸 )페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(3)
4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(1 g/g, 1 eq)을 플라스크에 첨가한 후, 테트라히드로푸란(2 ㎖/g) 및 아세토니트릴(0.75 ㎖/g)을 첨가하였다. (S)-1-(4-메톡시페닐)-에틸아민(0.335 ㎖/g, 1 eq)을 5 분에 걸쳐 적가하고, 생성된 반응 혼합물을 40-50℃에서 15 분 동안 교반한 후, 실온으로 냉각시켰다. 아세토니트릴(7.25 ㎖/g)을 첨가하고, 반응을 시딩하였다(0.0001 g/g, 99% ee, 원하는 회전장애 이성질체의 (S)-1-(4-메톡시페닐)-에틸아민 염). 반응 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 생성된 고체를 여과에 의하여 단리시키고, 아세토니트릴로 세정하였다. 아세토니트릴 중의 고온(75-80℃) 슬러리는 키랄 염을 백색 고체로서 얻었다(40% 수율, 98.16% ee). 염 분해는 THF/물(2/2 vol) 중에서 1 M HCl(2.2 eq)을 사용하여 달성하여 산을 얻고, 이를 수 중에서 슬러리에 의하여 추가로 정제하여 표제 화합물(90.52 g, 염 분해 수율 97%, 총 수율 39%, 98.06% ee)을 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6) δ 12,83 (brs, 1H), 7.77-7.67 (m, 6H), 7.23-7.10 (m, 2H), 7.08-7.01 (m, 4H), 6.68 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.59-6.58 (d, J = 4.0 Hz, 1H). 키랄 HPLC 방법 6을 사용한 키랄 HPLC는 단일 회전장애 이성질체, RT 6.083 min, 99.02% 면적(소수의 회전장애 이성질체 RT 7.07 min, 0.98% 면적)을 나타냈다.
키랄 분해는 또한 (S)-(-)-1-페닐에틸아민을 사용하여 달성될 수 있다.
단계 5a: (R)-4-[5-(4- 클로로페닐 )-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]피롤-2- 일 ]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드(1)
4-(5-(4-클로로페닐)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2-일)벤조산(단일 회전장애 이성질체, (3))(1 g/g, 1 eq)을 THF(5 ㎖/g) 중에 용해시키고, N,N-디메틸에틸렌디아민(0.75 ㎖/g, 3 eq)에 이어서 DIPEA(1.58 ㎖/g, 4 eq)를 적가하였다. THF 중의 50% T3P(2.72 ㎖/g, 2 eq)를 적가하고, 반응 혼합물을 20℃에서 15 분 동안 교반하였다. THF 중의 50% T3P의 추가적인 부분은 반응이 완료될 때까지 첨가하였다. 반응 혼합물을 10% 염수(2 ㎖/g) 및 수산화나트륨 용액(2 ㎖/g)으로 pH 8-10이 될 때까지 희석하였다. 층이 분리되었으며, 수성 층을 에틸 아세테이트(2×5 ㎖/g)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세정하고, 건조시키고(MgSO4), 농축시켜 표제 화합물(80 g, 156 mmol, 71%)을 백색 마찰발광 고체로서 얻었다. 키랄 HPLC 방법 7을 사용한 키랄 HPLC는 단일 회전장애 이성질체, RT 12.62 min, 99.32% 면적(소수의 회전장애 이성질체, RT 10.58 min, 0.67% 면적)을 나타냈다.
실시예 7
생물학적 활성
A. U87MG 사람 교모세포종 암 세포 생존율에 대한 회전장애 이성질체 A-1 및 A-2의 효과를 측정하는 검정
하기 프로토콜을 사용하여 U87MG 세포 생존율에 대한 회전장애 이성질체 A-1 및 A-2의 효과를 측정하는데 사용하였다.
U87MG 세포를 그의 추천되는 성장 배지/보충물(ATCC) 중에서 성장시켰다. 세포를 웰당 5,000개의 세포의 농도로 96웰 평판에 밤새 37℃, 5% CO2에서 파종하였다. 세포를 관련 농도의 테스트 화합물로 72 시간 동안 처리하였다. 72 시간 인큐베이션 후, 생존율은 술포로다민 B(SRB) 비색 검정을 사용하여 설정하였다. 퍼센트 생존율은 DMSO 처리된 대조 샘플의 평균에 대하여 계산하고, 세포 성장의 억제에 대한 IC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀(4 파라미터 로지스틱 수학식)에 의하여 계산하였다.
상기 프로토콜을 수행하여 회전장애 이성질체 A-1 및 A-2에 대하여 얻은 IC50 값은 하기 표 9에 제시된 바와 같이 구하였다.
Figure pct00041
B. 각종 암 세포주 패널의 암 세포 생존율에 대한 회전장애 이성질체 A-1 및 A-2의 효과를 측정하는 검정
각종 암 세포주에 대한 스크리닝은 회전장애 이성질체 A-1 및 A-2에 대한 민감성을 나타내는 종양 유형을 확인하기 위하여 수행하였다. 48개의 암 유래 세포주의 패널은 고 처리량 증식 검정으로 회전장애 이성질체 A-1/A-2의 희석을 사용하여 스크리닝하였다. 스크리닝된 세포주는 췌장, 대장/결장직장, 폐, 뇌 및 신경의 암, 및 림프종 및 백혈병 세포주를 나타내는 것을 포함하였다. 세포주를 화합물의 연속 반로그 희석으로 처리하고, 증식에 대하여 72 시간 후 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 검정(프로메가(Promega))을 사용하여 검정하였다. IC50 값은 비선형 회귀 모델을 사용하여 투여량 반응 데이타를 핏팅함으로써 계산하였다. 회전장애 이성질체 A-1 및 A-2에 대한 IC50 값(마이크로몰)은 하기 표 10에 제시한다.
Figure pct00042
Figure pct00043
상기 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 회전장애 이성질체 A-2는 모든 세포주에 대하여 회전장애 이성질체 A-1보다 상당히 더 큰 활성 세포 성장 억제제이었다.
C. 유사분열에서 세포에 대한 회전장애 이성질체 A-2의 효과를 측정하는 검정
PLK1 및 PLK4가 그의 PBD를 통해 그의 파트너에 결합되는 능력을 억제하는 것은 세포가 유사분열에서 정지를 야기하는 것으로 공지되어 있다. 실험적으로, 이는 유사분열 세포에서만 존재하는 마커인 인산화 히스톤 H3(pH3)의 면역형광 검출에 의하여 테스트 화합물로 처리 후 일정한 시간에서 유사분열 중인 세포의 개수를 평가함으로써 측정될 수 있다. PLK1/4-PBD 억제제는 pH3-포지티브 세포에서 투여량 의존성 증가를 유발하는 것으로 예상되며, 이는 주어진 시간에서 상기 유사분열 마크에 대하여 포지티브인 세포의 비율인 유사분열 지수(MI)로서 보고한다.
뚜렷한 유사분열 표현형은 세포에서 PLK1 및 PLK4의 억제 후 유발된다. PLK1의 PBD 도메인의 붕괴는 ATP 경쟁적 PLK1 억제제에 의하여 유발되는 단극성 방추체 표현형으로부터 뚜렷한 표현형인 비회합 염색체를 사용한 유사분열 정지를 촉발시키는 것으로 입증되었다(Hanisch et al., 2006 Mol . Biol. Cell 17, 448-459). 중심소체 어셈블리는 PLK4에 의하여 제어되며, 억제제는 이상 세포질분열을 초래하는 중심체 결함으로 인하여 다극성 방추체 표현형을 유발한다(Wong et al., 2015. Science 348(6239); 1155-1160).
하기 프로토콜을 사용하여 유사분열에서의 세포 정지 및 표현형의 분석에 대한 회전장애 이성질체 A-2의 효과를 측정하였다.
유사분열 지수 및 표현형 프로토콜
세포를 10,000/웰로 96웰 평판에 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날 DMSO 중의 회전장애 이성질체 A-2 스톡을 배지 내에서 희석한 후, 0.2%의 세포에 대한 최대 최종 DMSO 농도로 세포에 첨가하였다. 세포를 화합물과 함께 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 3.7% 포름알데히드 중에 고정시켰다. 세포를 0.1% 트리톤(Triton) X-100으로 침투시킨 후, 항-포스포-히스톤 H3(Ser10) 항체(앱캠(Abcam) ab5176)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 세정한 후, 알렉사플루오르(AlexaFluor) 488 표지된 염소 항-토끼 IgG(인비트로겐(Invitrogen) A11034)와 함께 4 ㎍/㎖ 획스트(Hoechst) 33342(인비트로겐 H3570)의 존재하에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중에서 세정한 후, 어레이스캔(Arrayscan) VTi HCS 기기(써모 피셔(Thermo Fisher) 상에서 타겟 액티베이션 V4 바이오애플리케이션(Target Activation V4 Bioapplication)을 사용하여 영상화하였다. 사용자 정의된 한계치를 적용하여 포스포-히스톤 H3 염색의 강도에 기초한 유사분열 세포를 식별하였다.
그래프패드 프리즘은 log(억제제)를 사용한 화합물 농도에 대한 % 유사분열 세포 대 최소 자승 핏팅을 사용하고 제한 없는 반응 가변 기울기를 플롯팅하는데 사용하였다.
상기 프로토콜을 수행하여 얻은 결과로부터, EC50 값 및, HeLa 및 U87MG 세포주에 대한 유사분열에서의 세포의 비율을 회전장애 이성질체 A-2에 대하여 얻었다. EC50 값은 하기 표 11에 제시한다.
Figure pct00044
별도의 연구에서는, 각각의 회전장애 이성질체 A-1 및 회전장애 이성질체 A-2에 대하여 0.03 μM의 단일 화합물 농도를 사용한 것을 제외하고 상기 프로토콜을 수행하여 U87MG 세포에서 관찰된 유사분열 표현형의 빈도를 수동으로 평가하고, 다음의 표현형으로 분류하였다: 각각의 A-1 및 A-2에 대하여 비회합 염색체, 다극성 방추체/이상 세포질분열, 단극성 방추체, 정상 전중기, 정상 중기. 결과는 도 10에 도시한다.
도 10에 도시된 결과는 회전장애 이성질체 A-2가 회전장애 이성질체 A-1보다 정상의 유사분열을 방해하는데 있어서 훨씬 더 큰 효과를 갖는다는 것을 입증해 보여준다. 그래서, A-1을 사용하면, 세포의 76%가 DMSO 대조군으로 처리한 세포의 77%에 필적하는 정상 유사분열 표현형을 나타냈으며, DMSO 대조군으로 처리한 23%에 비하여 24%가 이상 세포질분열을 나타내었다. 비회합 염색체 표현형의 증거는 DMSO 대조군 또는 회전장애 이성질체 A-1 처리된 세포에서 나타나지 않았다. 대조적으로, 더 큰 활성의 회전장애 이성질체 A-2를 사용한 세포 처리는 정상 유사분열 표현형을 갖는 세포 17%만을 초래하며, 이상 세포질분열은 70% 및 비회합 염색체는 13%를 초래하였다. 상기 표현형은 유사분열 중에 PLK1 및 PLK4 활성을 방해하는 것과 일치한다.
D. 중심체에 대한 회전장애 이성질체 A-2의 효과를 측정하는 검정
상기 연구 C의 결과는 회전장애 이성질체 A-2가 조절곤란한 중심체 기능을 특징으로 하는 유사분열 효과를 유발한다는 것을 보여준다. 그러므로, 중심체 기능에 대한 A-2의 효과를 추가로 조사하였다. Centrin1-GFP 융합 단백질을 안정하게 발현시키는 HeLa 세포를 96웰 평판에 밤새 파종하였다. 세포를 회전장애 이성질체 A-2(DMSO 중의 0.02 μM의 농도) 또는 DMSO 대조군으로 72 시간 동안 처리한 후, 형광 현미경을 사용하여 영상화하였다. 복수의 세포 필드를 각각의 처리 조건에 대하여 캡쳐한 후, 화상을 수동으로 분석하였다. Centrin1-GFP는 중심소체를 별개의 초점으로서 구체적으로 마크하므로, 세포당 중심소체 개수를 정량화하는데 사용될 수 있다. 그래서, 각각의 처리 조건에 대하여 100개의 세포를 분석하고, 각각의 셀에 존재하는 중심소체의 개수를 기록하였다. 그 후, 데이타를 통에 분리시키고(중심소체 없음, 1개의 중심소체, 2개의 중심소체 및 2개 초과의 중심소체), 도 11에 도시한다.
상기 데이타로부터, 회전장애 이성질체 A-2는 HeLa 세포 상에서 PLK4 억제 표현형의 증거를 나타내는 것으로 결론낼 수 있다.
E. 야생형 대 KRAS HeLa 세포 생존율에 대한 회전장애 이성질체 A-2의 효과를 측정하기 위한 검정
검정은 야생형 HeLa 세포 및 KRAS 종양유전자를 품고 있는 HeLa 세포에 대한 회전장애 이성질체 A-2의 효과를 비교하기 위하여 실시하였다.
그리하여, FLP-in/T-Rex 시스템(인비트로겐)을 사용하여 야생형 또는 종양발생 KRasG12V 형질전환유전자를 유도 가능하게 발현시키도록 조작된 HeLa 세포 상에서 회전장애 이성질체 A-2를 테스트하였다. 세포를 파종한 후, 독시사이클린을 사용하거나 또는 사용하지 않고 처리하여 형질전환유전자 발현을 유발한 후, 연속 희석된 회전장애 이성질체 A-2로 처리하였다. 72 시간 인큐베이션 후, 세포 생존율을 셀 타이터 블루(Cell Titre Blue) 시약(프로메가) 및 BMG 페라스타(Pherastar) 평판 판독기를 사용하여 평가하였다. 야생형 또는 종양발생 G12V KRAS를 사용한 세포 생존율에 대한 PBD 억제의 효과는 그래프패드 프리즘을 사용하여 평가하였다.
상기 프로토콜을 수행하여 얻은 결과로부터, 야생형 및 KRAS G12V HeLa 세포주에 대한 회전장애 이성질체 A-2의 GI50 값은 하기 표 12에 제시한 바와 같이 구하였다.
Figure pct00045
F. 키나제 선택성 검정
본원에 제공된 증거는 회전장애 이성질체 A-2가 PLK1 및 PLK4의 촉매 도메인이 아니라 PLK1 및 PLK4의 PBD 도메인에 결합되며, 기타 키나제에 대한 우수한 선택성을 나타내야 한다는 것을 나타낸다. 이는 3 μM의 농도에서 디스커버엑스 키노메스크린(DiscoverX KinomeScreen) 검정을 사용하여 키노메 전체에 분포된 키나제 97개의 패널에 대한 오프 타겟 활성에 대하여 회전장애 이성질체 A-2를 테스트함으로써 조사되었다.
디스커버엑스 키노메스크린 검정은 용액 중 키나제를 결합 또는 캡쳐할 수 있는 고체 지지된 대조 화합물의 사용에 의하여 키나제로의 화합물의 결합 친화성을 측정하는 부위 지향된 경쟁적 결합 검정이다. 키나제-억제제 테스트 화합물의 부재하에서 모든 키나제는 고체 지지체에 결합될 것이다. 키나제-억제제 테스트 화합물이 검정 믹스에 첨가될 경우, 고체 지지체에 결합되는 키나제의 양은 감소될 것이며, 감소 정도는 키나제 억제제로서 테스트 화합물의 효력에 의존한다. 키나제에 대한 테스트 화합물의 효력은 테스트 화합물의 주어진 농도에서 고체 지지체에 결합하는 키나제의 비율(제어율)로서 나타낼 수 있으며, 비율이 낮을수록 테스트 화합물의 키나제 결합 능력의 효력은 더 크다. 그래서, 100%의 제어율 값은 테스트 화합물이 키나제에 전혀 결합되지 않는다는 것을 나타내는데, 이는 키나제 전부가 고체 지지체에 결합되기 때문이다. 반대로, 0%의 제어율 값은 테스트 화합물이 고체 지지체에 결합되지 않으므로 키나제 전부에 결합된다는 것을 나타낸다.
프로토콜:
대부분의 검정의 경우, 키나제 태그된 T7 파지 균주는 BL21 균주로부터 유도된 이. 콜리(E. coli) 숙주에서 24웰 블록에서 동시에 성장된다.
이. 콜리는 대수 증식기로 성장하며, T7 파지로 냉동된 스톡으로부터 감염시키고(감염 다중도=0.4), 32℃에서 용해될 때까지(90-150 분) 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 용해물을 원심분리하고(6,000×g), 여과하여(0.2 ㎛) 세포 부스러기를 제거하였다. 나머지 키나제는 HEK-293 세포 중에서 생성하였으며, 그 후 qPCR 검출을 위하여 DNA로 태그시켰다. 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드를 비오티닐화된 소분자 리간드로 30 분 동안 실온에서 처리하여 키나제 검정에 대한 친화성 수지를 생성하였다. 리간드 형성된 비드를 과잉의 비오틴으로 블로킹시키고, 차단 완충제(씨블록(SeaBlock)(피어스(Pierce)), 1% BSA, 0.05% 트윈(Tween) 20, 1 mM DTT)로 세정하여 미결합 리간드를 제거하고, 비특이성 파지 결합을 감소시켰다. 결합 반응은 키나제, 리간드 형성된 친화성 비드 및 테스트 화합물을 1x 결합 완충제(20% 씨블록, 0.17× PBS, 0.05% 트윈 20, 6 mM DTT) 중에서 조합하여 어셈블리하였다. 테스트 화합물은 100% DMSO 중의 40× 스톡으로 제조하고, 검정에 직접 희석하였다. 모든 반응은 폴리프로필렌 384웰 평판 중에서 0.02 ㎖의 최종 부피로 수행하였다. 검정 평판을 실온에서 1 시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션하고, 친화성 비드를 세정 완충액(1× PBS, 0.05% 트윈 20)으로 세정하였다. 그 후, 비드를 용출 완충액(1× PBS, 0.05% 트윈 20, 0.5 μM 비-비오티닐화된 천화성 비드) 중에 재현탁시키고, 실온에서 30 분 동안 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 용출액 중의 키나제 농도를 qPCR에 의하여 측정하였다.
키나제 활성 부위를 결합시키고, 고정된 리간드에 결합되는 키나제를 직접적(스테릭) 또는 간접적(알로스테릭)으로 방해하는 화합물은 고체 지지체 상에 캡쳐된 키나제의 양을 감소시킬 것이다. 반대로, 키나제를 결합시키지 않는 테스트 분자는 고체 지지체 상에서 캡쳐된 키나제의 양에 영향을 미치지 않는다.
테스트 분자를 키나제에 결합시키는 강도는 제어율(%Ctrl)로서 나타낼 수 있다.
제어율( %Ctrl )
화합물(들)을 3,000 nM 농도에서 스크리닝하고, 주요 스크린 결합 상호작용에 대한 결과를 '%Ctrl'로서 보고하고, 여기서 수치가 낮은 것은 그 다음 페이지(들)에서 매트릭스에서 더 강한 hit를 나타낸다.
%Ctrl 계산
Figure pct00046
음성 대조= DMSO(100%Ctrl)
양성 대조= 대조 화합물(0%Ctrl)
패널 키나제에 대한 회전장애 이성질체 A-2의 %Ctrl 값은 하기 표 13에 제시한다.
Figure pct00047
Figure pct00048
97종의 키나제에 대한 결과는 회전장애 이성질체 A-2가 광범위한 키나제에 대한 불량한 또는 존재하지 않는 결합 활성을 가지므로, 오프 타겟 키나제 억제와 관련된 문제를 겪지 않을 것으로 입증해 보여준다.
PLK1 및 PLK4의 경우, 회전장애 이성질체 A-2는 상기 키나제의 촉매 도메인에 대한 결합 친화성이 적거나 또는 없는 것으로 나타났다(각각 97% 및 100%의 % 제어값). 그러므로 상기 실시예에서 입증된 PLK1/PLK4 억제 활성을 나타내는 활성 프로파일은 PLK1 및 PLK4의 비촉매 폴로-박스 도메인의 결과인 것으로 결론내었다.
G. 마우스 PK에서 경구 생체이용률 및 뇌 노출의 결정
회전장애 이성질체 A-2는 경구 및 정맥내 투여 후 뇌 및 혈장 농도를 측정하기 위하여 생체내 마우스 모델에서 평가하였다.
하기 프로토콜을 수행하였다:
CD-1 마우스 수컷에게 회전장애 이성질체 A-2를 정맥내 투여(2 ㎎/㎏)에 의하여 또는 경구 투여(10 ㎎/㎏)에 의하여 투여하였다. 8개의 샘플을 정맥내 분석을 위하여 다리에서 2, 10, 30 분, 1, 2, 4, 8 및 24 시간에 채취하였으며(정맥내 경우), 9개의 샘플을 경구 분석에서 다리에서 15, 30 분, 1, 2, 4, 8, 24, 48 및 72 시간에 채취하였다.
회전장애 이성질체 A-2는 10% DMSO/90% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(수 중의 20% w/v) 중에서 정맥내 및 경구 투여를 위하여 제제화하였다. N = 시점당 마우스 3마리.
투여 후, 말단 혈액 샘플을 개개의 동물로부터 채취하고, 항응고제(EDTA)를 함유하는 라벨을 붙인 폴리프로필렌 시험관에 전달하였다. 코호트 중인 모든 동물의 샘플링이 완료되는 동안 샘플을 젖은 얼음 상에서 최대 30 분 동안 두었다. 혈액 샘플을 혈장의 경우 원심분리하고(4℃, 5 분 동안 21,100 g), 생성된 혈장을 해당 라벨을 붙인 시험관에 전달하였다. 각각의 경구 투여된 동물로부터의 말단 뇌를 절개하고, 염수로 헹구고, 미리 계량한 라벨을 붙인 폴리프로필렌 시험관에 넣고, 보관 전 샘플을 다시 계량하였다.
정량적 생분석은 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시하였으며, 질량 분광법을 수행하였다. 결과는 하기 표 14 및 15 및 도 12 및 13에 제시한다.
경구 생체이용률
Figure pct00049
Figure pct00050
상기 결과는 회전장애 이성질체 A-2가 마우스에서 경구 투여 후 크게 흡수된다는 것을 입증해 보여준다
뇌 노출
Figure pct00051
표 16에 제시된 뇌 노출 실험의 결과는 회전장애 이성질체 A-2가 마우스에서 경구 투여 후 3.3의 AUC B:P 비로 높은 뇌 노출을 갖는다는 것을 입증해 보여준다.
H. 생체내 효능
회전장애 이성질체 A-2는 하기 기재된 연구에 의하여 나타낸 바와 같이 종양을 피하 및 동소 이식할 때 교모세포종 마우스 모델에서의 효능을 나타낸다.
(i) U87MG 피하 이종이식 모델에서 생체내 항암 활성
U87MG 종양을 지닌 무흉선 누드 마우스 수컷에게 회전장애 이성질체 A-2의 경구 투여량 100 ㎎/㎏을 1, 4 및 7일차에 제공하고, 종양 부피를 20 일에 걸쳐 측정하였다. 동일한 시점에서 비히클만을 제공받은 종양을 지닌 마우스의 대조군에서의 종양 부피도 또한 측정하였다. 처치군은 도 16에 도시한 바와 같이 대조군에 비하여 크게 감소된 종양 부피(13일차에 3.85% T/C)를 나타냈다.
(ii) U87-Luc 동소 이종이식 모델에서 생체내 항암 활성
U87-Luc 세포를 무흉선 누드 마우스 수컷의 뇌에 대뇌내 이식하였으며, 종양 성장을 생물발광 신호에 의하여 모니터링하였다. 처치군에서는 동물에게 회전장애 이성질체 A-2의 경구 투여량 100 ㎎/㎏을 1, 4, 7, 10 및 13일차에 제공하였다. 대조군 동물에게는 비히클만을 제공하였다. 도 15에 도시된 결과는 15일차에 대조군에 비하여 처치군에 대한 종양 신호에서의 감소를 입증해 보여준다.
(iii) HCT116 종양을 지닌 마우스에서 생체내 항암 활성
회전장애 이성질체 A-2는 하기 기재된 바와 같이 KRAS 돌연변이된 결장직장암 모델에서 효능을 나타냈다.
HCT116 이종이식 종양을 지닌 무흉선 누드 마우스 수컷에게 회전장애 이성질체 A-2의 경구 투여량 100 ㎎/㎏을 1, 8 및 15일차에 제공하고, 종양 부피를 3 주에 걸쳐 측정하였다. 동일한 시점에서 비히클만을 제공받은 종양을 지닌 마우스의 대조군에서의 종양 부피도 또한 측정하였다.
도 16에 도시된 결과는 20일차에 종양 성장에서의 뚜렷한 효과를 입증해 보여준다(TGI 60%).
약학적 제제
(i) 정제 제제
실시양태 1.1 내지 1.19 또는 상기 실시예 중 임의의 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물을 함유하는 정제 조성물은 공지의 방식으로 50 ㎎의 화합물을 희석제로서 197 ㎎의 락토스(BP) 및 활택제로서 3 ㎎의 스테아르산마그네슘과 혼합하고, 압축시켜 정제를 형성함으로써 제조한다.
(ii) 캡슐 제제
캡슐 제제는 100 ㎎의 실시양태 1.1 내지 1.19 또는 상기 실시예 중 임의의 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물을 100 ㎎ 락토스와 혼합하고, 생성된 혼합물을 표준 불투명 경질 젤라틴 캡슐에 충전함으로써 제조한다.
(iii) 주사 제제 I
주사에 의한 투여용 비경구 조성물은 실시양태 1.1 내지 1.19 또는 상기 실시예 중 임의의 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물을 10% 프로필렌 글리콜을 함유하는 수 중에 용해시켜 1.5 중량% 농도의 활성 화합물을 생성함으로써 제조할 수 있다. 그 후, 용액은 여과에 의하여 멸균시키고, 앰풀에 채우고, 밀봉시킨다.
(iv) 주사 제제 II
주사용 비경구 조성물은 수 중에 실시양태 1.1 내지 1.19 또는 상기 실시예 중 임의의 하나에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물(2 ㎎/㎖) 및 만니톨(50 ㎎/㎖)을 용해시키고, 용액을 멸균 여과하고, 밀봉 가능한 1 ㎖ 바이알 또는 앰풀에 충전함으로써 제조한다.
(v) 주사 제제 III
주사 또는 주입에 의한 정맥내 전달을 위한 제제는 실시양태 1.1 내지 1.19 또는 상기 실시예 중 임의의 하나에 의한 물질의 조성물을 수 중에 20 ㎎/㎖로 용해킴으로써 제조할 수 있다. 그 후, 바이알을 밀봉시키고, 오토클레이브에 의하여 멸균시킨다.
(vi) 주사 제제 IV
주사 또는 주입에 의한 정맥내 전달을 위한 제제는 실시양태 1.1 내지 1.19 또는 상기 실시예 중 임의의 하나에 의한 물질의 조성물을 완충제를 함유하는 수(예, 0.2 M 아세테이트 pH 4.6) 중에 20 ㎎/㎖로 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 그 후, 바이알을 밀봉시키고, 오토클레이브에 의하여 멸균시킨다.
(vii) 피하 주사 제제
피하 투여용 조성물은 실시양태 1.1 내지 1.19 또는 상기 실시예 중 임의의 하나에 의한 물질의 조성물을 약학적 등급의 옥수수 오일과 혼합하여 5 ㎎/㎖의 농도를 생성함으로써 제조한다. 이어서, 조성물을 멸균시키고, 적절한 용기에 충전한다.
(viii) 동결건조 제제
제제화된 실시양태 1.1 내지 1.19 또는 상기 실시예 중 임의의 하나에 의한 물질의 조성물의 분액을 50 ㎖ 바이알에 넣고, 동결건조시킨다. 동결건조 중에 조성물을 1 단계 냉동 프로토콜을 사용하여 (-45℃)에서 냉동시킨다. 온도를 어닐링 동안 -10℃로 승온시킨 후, -45℃에서 냉동으로 감온시킨 후, +25℃에서 대략 3,400 분 동안 1차 건조시킨 후, 온도가 50℃가 될 경우 증가된 단계로 2차 건조를 실시한다. 1차 및 2차 건조 중 압력은 80 밀리토르로 설정한다.
균등물
상기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위하여 제시되며, 본 발명의 영역에 어떠한 제한을 가하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 다수의 변경예 및 변형예는 본 발명의 기본 원리로부터 벗어나는 일 없이 상기 기재되고 실시예에 예시된 본 발명의 구체적인 실시양태로 이루어질 수 있는 것으로 용이하게 이해될 수 있다. 상기 변경예 및 변형예 모두는 본원에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (16)

  1. 산과 염기 사이의 약 1:1 몰비를 갖는 (R)-4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]벤즈아미드 (+)-L-타르타르산 염.
  2. 하기 화학식 (2)를 갖는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 (+)-L-타르타르산 염:
    Figure pct00052
  3. 산과 염기 사이의 약 1:1 몰비를 가지며, 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-벤즈아미드가 단일 회전장애 이성질체의 형태로 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 (+)-L-타르타르산 염.
  4. 제3항에 있어서, 단일 회전장애 이성질체가 화학식 (1)의 회전장애 이성질체인 (+)-L-타르타르산 염.
  5. 제3항에 있어서, 단일 회전장애 이성질체가 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 R 회전장애 이성질체인 (+)-L-타르타르산 염.
  6. 제3항에 있어서, 단일 회전장애 이성질체가 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 회전장애 이성질체 A-2인 (+)-L-타르타르산 염.
  7. 제3항에 있어서, (+)-L-타르타르산 염이 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 (+)-L-타르타르산 염.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 결정질 형태로 존재하는 (+)-L-타르타르산 염.
  9. 제8항에 있어서, 무수화물인 (+)-L-타르타르산 염.
  10. 제9항에 있어서, 본원에서 패턴 B로 확인된 무수화물인 (+)-L-타르타르산 염.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 (+)-L-타르타르산 염을 포함하는 물질의 조성물로서,
    (a) 단일 회전장애 이성질체가 조성물 중에 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 유일한 회전장애 이성질체이거나, 또는 (b) 상기 단일 회전장애 이성질체에 대하여 10% 미만의 몰량의 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 임의의 기타 회전장애 이성질체가 존재하는 것인 물질의 조성물.
  12. 제11항에 있어서, (a) 단일 회전장애 이성질체가 조성물 중에 존재하는 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 유일한 회전장애 이성질체이거나, 또는 (b) 상기 단일 회전장애 이성질체에 대하여 0.1% 미만의 몰량의 4-[5-(4-클로로페닐)-1-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]피롤-2-일]-N-[2-(디메틸아미노)에틸]벤즈아미드의 임의의 기타 회전장애 이성질체가 존재하는 것인 물질의 조성물.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 (+)-L-타르타르산 염 또는 제11항 또는 제12항에 따른 물질의 조성물, 및 약학적으로 하용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  14. 암, 예를 들면 본원의 실시양태 3.4 내지 3.16 중 어느 하나에서 기재된 바와 같은 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 (+)-L-타르타르산 염 또는 제11항 또는 제12항에 따른 물질의 조성물.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의한 타르타르산 염 또는 물질의 조성물 및 또 다른 치료적 활성제를 포함하는 약학적 조합.
  16. 본원의 실시양태 1.1 내지 1.19, 2.1 내지 2.5, 3.1 내지 3.34, 4.1 내지 4.12 및 5.1 내지 5.6 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 발명.
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