CN116348105A - 芳基吡咯衍生物的药用盐 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及(/？)‑4‑[5‑(4‑氯苯基)‑1‑[2‑(三氟甲基)‑苯基]吡咯‑2‑基]‑N‑[2‑(二甲基氨基)‑乙基]苯甲酰胺(+)‑L‑酒石酸盐、它的制备方法、包含它的药物组合物以及它治疗疾病诸如癌症的用途。

Description

芳基吡咯衍生物的药用盐
本发明涉及三芳基吡咯化合物的阻转异构体的药用盐、它的制备方法、包含它的药物组合物以及它治疗疾病诸如癌症的用途。
背景技术
正常KRAS基因表达的蛋白质在正常组织信号传导中起到重要作用。由于单个氨基酸置换，并且特别是单个核苷酸置换导致的KRAS基因突变是激活突变的原因，这是许多癌症发展中的必要步骤。产生的突变蛋白涉及各种恶性肿瘤，包括肺腺癌、粘液腺瘤、胰腺导管癌和大肠癌。与Ras家族的其他成员类似，KRAS蛋白是GTP酶并参与许多信号转导途径。
KRAS充当分子打开/关闭开关。一旦打开，它就会募集并激活生长因子和其他受体信号传播所必需的蛋白质，诸如c-Raf以及PI-3激酶。正常的KRAS在活性状态下与GTP结合并具有固有的酶活性，即切割核苷酸的末端磷酸，将其转化为GDP。在将GTP转化为GDP后，KRAS被关闭。转化率通常慢，但可以通过GTP酶活化蛋白(GAP)类的辅助蛋白，例如RasGAP来显著加速。反过来，KRAS可以结合鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)类的蛋白，例如SOS1，其迫使释放结合的核苷酸。随后，KRAS结合存在于胞质溶胶中的GTP，并且GEF从ras-GTP释放出来。在突变型KRAS中，其GTP酶活性被直接除去，使得KRAS组成性地处于活性状态。突变型KRAS通常特征在于：密码子12、13、61的突变或其混合的突变。
已知携带突变型KRAS的癌细胞的生存力依赖于Polo样激酶1(PLK1)，并且已经显示沉默PLK1导致包含突变型KRAS的细胞死亡(参见Luo et al.,Cell.2009May 29；137(5):835–848)。因此，抑制PLK1的化合物可用于治疗由KRAS突变引起的癌症，但与其他激酶相比，目前设计用于结合PLK1的保守ATP结合结构域的激酶抑制剂可能由于无选择性而无法进入这种作用模式(参见例如Elsayed et al.,Future Med.Chem.(2019)11(12),1383–1386)。
PLK1是丝氨酸/苏氨酸激酶，由603个氨基酸组成，并且具有的分子量为66kDa，并且是细胞周期的重要调节因子。特别地，PLK1对于有丝分裂是重要的并且参与在细胞周期的M期期间的有丝分裂纺锤体的形成和变化以及CDK/周期蛋白复合物的激活。
所有Polo样激酶均包含N末端丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域和包含一个或两个Polo盒的C末端区域(Lowery et al.,Oncogene,(2005),24,248-259)。对于Polo样激酶1、2和3，整个C-末端区域(包括两个Polo盒)起到单个模块化磷酸丝氨酸/苏氨酸结合结构域的作用，称为Polo盒结构域(PBD)。在不存在结合底物的情况下，PBD抑制激酶结构域的基础活性。PBD与其配体的磷酸化依赖性结合释放激酶结构域，而同时将Polo样激酶定位于特定的亚细胞结构。
已经显示(Reindl et al.,Chemistry&Biology,15,459–466,May 2008)，由于PLKL1通过其polo盒结构域定位于其细胞内锚定位点，PLK1的作用可被小分子抑制，该小分子通过抑制PBD的功能来干扰其细胞内定位。
肿瘤蛋白p53作为肿瘤抑制因子起作用，并在细胞凋亡、基因组稳定性和血管生成抑制中起作用。已知具有p53缺陷和高PLK1表达两者的肿瘤可能对PLK1抑制剂特别敏感(Yim et al.,Mutat Res Rev Mutat Res,(2014).761,31-39)。
因此，文献中的证据表明，结合并抑制PBD功能的小分子应该是PLK1激酶的有效抑制剂，并且因此也可用于治疗由KRAS和/或p53突变引起的癌症。特别地，由于PBD结构域仅存在于PLK中，因此针对该结构域设计的抑制剂具有比先前的ATP竞争性抑制剂更高的选择性的潜力，能够更有能力靶向KRAS突变型和p53缺陷型癌症。
已经证明，用于治疗原发性脑癌的药物的鉴定和开发特别具有挑战性。靶向癌症疗法，并且特别是使用蛋白激酶抑制剂的疗法，已成为制药和生物技术公司的主要关注点(Nature Reviews Clinical Oncology 2016,13,209--227)。然而，尽管已批准超过三十种激酶抑制剂用于肿瘤学，但这些激酶抑制剂均未用于治疗原发性脑癌。一个特别的问题是，大多数批准的激酶抑制剂肿瘤药物缺乏如果它们用于治疗脑癌以实现脑暴露所需的必要的药物品质[JMC 2016,59(22),10030-10066]。
烷基化剂替莫唑胺(temozolomide)
Figure BDA0004143454640000031
目前一线治疗脑癌多形性胶质母细胞瘤，并经常与放射疗法联用。然而，耐药性是胶质母细胞瘤管理中的主要问题，并且因此限制了替莫唑胺的有效性。因此，目前，恶性胶质母细胞瘤仍然是无法治愈的。
Polo样激酶1(PLK1)在多种肿瘤类型中过表达，包括多形性胶质母细胞瘤(Translational Oncology 2017,10,22-32)。此外，最近的研究表明PLK1在多形性胶质母细胞瘤中驱动检查点适应和对替莫唑胺的抗性[Oncotarget2017,8,15827-15837]。
室管膜瘤是脑和脊髓的肿瘤，其中护理的现行标准限于手术和辐射。PLK1已涉及室管膜瘤，并且PLK1的抑制剂对室管膜瘤细胞系具有活性[Gilbertson et.al.,CancerCell(2011)20,384-399]。
还研究了PLK1作为用于扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(Diffuse IntrinsicPontine Glioma)(DIPG)、高级侵袭性儿童脑肿瘤(a high grade,aggressive childhoodbrain tumour)的靶标[Amani et al.BMC Cancer(2016)16,647和Cancer Biology andTherapy(2018)19,12,1078-1087]。
更特别地，已经显示了对PLK1的抑制，以增强替莫唑胺对IDH1突变神经胶质瘤的功效[Oncotarget,(2017)8,9,15827-15837]，并且在MMR缺陷、耐替莫唑胺的胶质母细胞瘤异种移植模型中抑制肿瘤生长[Mol Cancer Ther；17(12)December 2018]。
在上述情况下，目前的抑制剂缺乏足够的脑暴露。
将预期抑制PLKL1但不诱导耐药性并且表现出良好脑暴露的化合物用于治疗多形性胶质母细胞瘤和其他脑癌。
PLK4是丝氨酸/苏氨酸激酶的polo样激酶家族成员，其在中心体复制中起关键作用，充当中心粒复制的中心调节因子(Bettencourt-Dias,Curr Biol.2005 15(24)；2199-207)。中心体的PLK4依赖性改变能够导致有丝分裂时的不对称染色体分离，这能够在染色体错误分离和有丝分裂缺陷之后触发细胞死亡。
PLK4在人类癌症中异常地表达，并且涉及肿瘤发生和转移。因此，PLK4已经被强调为癌症治疗的有希望的靶标(Zhao,J Canc Res Clin Oncol.,2019)。
PLK4在许多癌症中过表达，这些癌症包括横纹肌样瘤(rhabdoid tumours)、髓母细胞瘤和其他脑胚胎性肿瘤(Pediatr Blood Cancer.2017)，以及乳腺癌、肺癌、黑素瘤癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和卵巢癌。升高或过度激活的PLK4与癌症(包括卵巢癌、乳腺癌和肺癌)患者的低存活率相关(Zhao,J Canc Res Clin Oncol.,2019)。
已经研究了PLK4抑制用于治疗多形性胶质母细胞瘤，并且已经证明了PLK4在调节替莫唑胺化学敏感性上起关键作用。与单独的替莫唑胺相比，已经示出了胶质母细胞瘤PDX模型中替莫唑胺与PLK4抑制的组合以增强抗肿瘤作用(Cancer Letters,Vol 443,2019,91-107)。
据报道在癌症发展中PLK4与p53失活协作，并且预测具有PLK4过表达和p53缺陷的癌症易于形成肿瘤(Sercin,2016；Nat Cell Biol 18:100-110)。因此，抑制PLK4活性的化合物将预期在p53突变型癌症的治疗中有用。
PLK4的抑制导致肺癌中的抗肿瘤活性，其中活性见于携带野生型和突变型KRAS的癌症中(Kawakami,PNAS 2018,115(8)1913-18)。因此，抑制PLK4活性的化合物将预期在KRAS突变型癌症的治疗中有用。
目前的PLK4抑制剂在激酶活性位点起作用，并且对于脑渗透不是最佳的(Int.J.Mol.Sci.2019,20,2112)。因此，将预期抑制PLK4 PBD但也表现出良好脑暴露的化合物用于治疗多形性胶质母细胞瘤和其他脑癌。
我们更早的国际专利申请WO2018/197714公开了以下式的化合物：
Figure BDA0004143454640000051
其中环X是苯或吡啶环，环Y是苯、吡啶、噻吩或呋喃环，Ar1是任选取代的苯、吡啶、噻吩或呋喃环，并且R1至R4、R6、R7是氢或各种取代基。将这些化合物描述为具有抗癌活性并在口服给药后具有良好脑暴露，使其成为用于治疗脑癌的良好候选物。这些化合物对胶质母细胞瘤细胞系具有活性，并且据信充当PLK1激酶的Polo盒结构域的抑制剂。还公开了这些化合物对突变体-RAS癌细胞系(诸如HCT116)具有活性，并且还可用于治疗由KRAS突变引起的癌症。
发明内容
现已发现在WO2018/197714中实施例33的化合物，即4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2-(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺及其类似物形成阻转异构体。阻转异构体是由围绕单键轴线的旋转受阻引起的立体异构体，其中旋转势垒的能量势垒足够高以允许分离单个旋转异构体；参见LaPlante et al.,J.Med.Chem.,54:7005-7022(2011)。
基于对于手性轴线通过旋转发生外消旋化所需的能量的量和外消旋化发生所需的时间长度，阻转异构体可以划分成三个类别。第1类阻转异构体具有围绕手性轴线<84kJ/mol(20kcal/mol)的旋转势垒并且在室温下以数分钟或更短测量的时间段内发生外消旋化；第2类阻转异构体具有84与117kJ/mol(20–28kcal/mol)之间的旋转势垒并且在室温下以数小时至数月测量的时间段内发生外消旋化；和第3类阻转异构体具有>117kJ/mol(28kcal/mol)的旋转势垒并且在室温以数年测量的时间段内发生外消旋化。
可以使用图1中所示的Cahn-Ingold-Prelog R与S系统对阻转异构体的立体化学结构确定，该系统由(S)-6,6'-二硝基联苯基-2,2'-二甲酸说明。
在这个系统中，芳基-芳基键的任何一侧的最近取代基按顺序a-b-c-d指定优先。由于取代基a、b和c处于逆时针排列，所以阻转异构体是S异构体。在相应R异构体中，取代基a、b和c处于顺时针排列。
4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺和它的类似物的阻转异构体足够稳定以便被分离及表征并且已经发现不发生任何显著程度的外消旋化，甚至当加热到最高达80℃的温度持续10天的时间段也不发生任何显著程度的外消旋化。因此，阻转异构体可以被分类为第3类阻转异构体。据信阻转异构因为2-三氟甲基取代基和连接到吡咯环的2-位和5-位的芳香环之间的空间相互作用阻止了围绕在2-三氟甲基取代的环和吡咯环的氮原子之间的键旋转而产生。
已经发现4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的两种单独的阻转异构体具有显著不同的生物学特性。因此，通常，一对的两种阻转异构体中的一种比该对的另一种阻转异构体具有显著更多的针对某些癌症靶标的活性。通过对单晶的X射线分析表明，对目标生物靶标具有更好的生物学活性的阻转异构体具有R构型，即化学结构(1)：
Figure BDA0004143454640000061
进一步已经发现，4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的(+)-L-酒石酸盐相对于4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的游离碱形式和该化合物的其他盐具有优点，其中存在大约1:1的酸和碱之间的摩尔比。
(+)-L-酒石酸是特别有利的，在于它是仅吸收表面水分(在90％RH时<1％)的高度结晶且稳定的固体，具有超过游离碱的改善的水溶解度。这些特性使其特别适于药物开发。
因此，在第一实施方式(实施方式1.1)中，本发明提供了(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2-(二甲基氨基)-乙基]苯甲酰胺(+)-L-酒石酸盐，具有大约1:1的酸和碱之间的摩尔比。
在另外实施方式中，本发明提供了：
1.2具有式(2)的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的(+)-L-酒石酸盐：
Figure BDA0004143454640000071
1.3 4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的(+)-L-酒石酸盐，其中存在大约1:1的酸和碱之间的摩尔比并且其中所述4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]-苯甲酰胺呈单一阻转异构体形式。
1.4根据实施方式1.3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述单一阻转异构体是式(1)的阻转异构体。
1.5根据实施方式1.3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述单一阻转异构体是4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的R阻转异构体。
1.6根据实施方式1.3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述单一阻转异构体通过以下参数中的任一个或多个表征：
(i)基本上如本文实施例3中描述的X射线晶体学数据；
(ii)当通过本文手性HPLC方法1确定时，大约20分钟(例如大约20.5分钟)的保留时间；和
(iii)当使用本文实施例2中描述的方法测量时，大约-11.76°的比旋光度。
1.7根据实施方式1.3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述单一阻转异构体是本文实例中所述的阻转异构体A-2。
1.8根据实施方式1.3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述(+)-L-酒石酸盐是本文实例中所述的。
1.9根据实施方式1.1至1.8中任一项所述的(+)-L-酒石酸盐，其呈结晶形式。
1.10根据实施方式1.9所述的(+)-L-酒石酸盐，其是无水物。
1.11根据实施方式1.10所述的(+)-L-酒石酸盐，其是本文作为图案B鉴定的无水物。
1.12根据实施方式1.9所述的(+)-L-酒石酸盐，其是溶剂化物。
1.13根据实施方式1.12所述的(+)-L-酒石酸盐，其是本文作为图案A鉴定的溶剂化物。
1.14一种物质组合物，包括根据实施方式1.3至1.13中任一项所述的(+)-L-酒石酸盐，其中(a)所述单一阻转异构体是存在于所述组合物中的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的唯一阻转异构体或(b)相对于所述单一阻转异构体，存在按摩尔量计小于10％的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的任何其他阻转异构体。
1.15根据实施方式1.14所述的物质组合物，其中(a)所述单一阻转异构体是存在于所述组合物中的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的唯一阻转异构体或(b)相对于所述单一阻转异构体，存在按摩尔量计小于5％的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的任何其他阻转异构体。
1.16根据实施方式1.14所述的物质组合物，其中(a)所述单一阻转异构体是存在于所述组合物中的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的唯一阻转异构体或(b)相对于所述单一阻转异构体，存在按摩尔量计小于2％的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的任何其他阻转异构体。
1.17根据实施方式1.14所述的物质组合物，其中(a)所述单一阻转异构体是存在于所述组合物中的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的唯一阻转异构体或(b)相对于所述单一阻转异构体，存在按摩尔量计小于1.5％的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的任何其他阻转异构体。
1.18根据实施方式1.14所述的物质组合物，其中(a)所述单一阻转异构体是存在于所述组合物中的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的唯一阻转异构体或(b)相对于所述单一阻转异构体，存在按摩尔量计小于1％的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的任何其他阻转异构体。
1.19根据实施方式1.14所述的物质组合物，其中(a)所述单一阻转异构体是存在于所述组合物中的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的唯一阻转异构体或(b)相对于所述单一阻转异构体，存在按摩尔量计小于0.1％的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的任何其他阻转异构体。
定义
所述(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2-(二甲基氨基)-乙基]苯甲酰胺(+)-L-酒石酸盐、式(2)的化合物和实施方式1.1至1.19中任一项所限定的物质组合物可以共同地或一般地称为“本发明的酒石酸盐”。因此，对“本发明的酒石酸盐”的提及可以被视为对实施方式1.1至1.19中任一项的提及，除非上下文相反指示。
同位素
根据实施方式1.1至1.19中任一项所限定的物质组合物或化合物或盐可以包含一个或多个同位素置换，并且对具体元素的提及包括其范围内该元素的所有同位素。例如，对氢的提及包括在其范围内的1H、2H(D)和3H(T)。类似地，对碳和氧的提及分别包括其范围内的12C、13C和14C及16O以及18O。
同位素可以是放射性的或非放射性的。在本发明的一种实施方式中，物质组合物或阻转异构体不含放射性同位素。这样的化合物优选用于治疗用途。在另一种实施方式中，然而，物质组合物或阻转异构体可以包含一种或多种放射性同位素。包含这样的放射性同位素的化合物可在诊断背景下有用。
溶剂化物和无水物
根据实施方式1.1至1.19中任一项所限定的物质组合物、化合物或盐可以形成溶剂化物和无水物。
具体的溶剂化物是通过将无毒的药学上可接受的溶剂(下文称为溶剂化溶剂)的分子掺入本发明的物质组合物或阻转异构体的固态结构(例如晶体结构)而形成的溶剂化物。溶剂化物可以通过用包含溶剂化溶剂的溶剂或溶剂混合物使本发明的物质组合物或阻转异构体重结晶来制备。在任何给定情况下，溶剂化物是否已形成可以通过使用众所周知且标准的技术诸如热重分析(TGE)、差示扫描量热法(DSC)和X射线粉末衍射法(XRPD)使物质组合物或阻转异构体的晶体经受分析来确定。
溶剂化物可以是化学计量的或非化学计量的溶剂化物。
溶剂化物的实例是与任何选自水、醇(例如甲醇、乙醇和异丙醇)、烷基-烷酸酯(例如乙酸乙酯和乙酸异丙酯)、醚(特别是环醚，诸如1-4-二噁烷和四氢呋喃)和单环内酰胺(例如N-甲基吡咯烷酮)中的多种溶剂中的一种形成的那些。
对于溶剂化物以及用于制造和表征它们的方法的更详细的讨论，参见Bryn etal.,Solid-State Chemistry of Drugs,Second Edition,published by SSCI,Inc ofWest Lafayette,IN,USA,1999,ISBN 0-967-06710-3。
除形成溶剂化物之外，根据实施方式1.1至1.19中任一项所限定的物质组合物、化合物或盐还可以呈无水物形式提供。如本文所用的术语“无水物”是指在其三维结构内部不包含水(和优选地不包含任何其他溶剂)的固体微粒形式(例如结晶形式)，虽然盐或化合物的颗粒可以具有附到其外表面上的水分子。
制备本发明的化合物的方法
可以通过与酒石酸在溶剂或溶剂混合物中反应并且然后从溶剂或溶剂混合物中分离酒石酸盐，从式(1)的阻转异构体制备本发明的(+)-L-酒石酸盐。
在一种实施方式中，可以将式(1)的阻转异构体溶解或悬浮于一种溶剂中，以形成第一混合物，并将(+)-L-酒石酸溶解或悬浮于相同或另一种溶剂中，以形成第二混合物，并且然后将第一和第二混合物合并且搁置(例如伴以搅拌)一段时间，以允许成盐发生，随后分离(+)-L-酒石酸盐。
当第一和第二混合物合并时，优选式(1)的阻转异构体的摩尔量和(+)-L-酒石酸的摩尔量大约相等；即优选地存在1:1的式(1)的阻转异构体和(+)-L-酒石酸之间的摩尔比。
可以通过过滤(当沉淀物形成时)或通过蒸发溶剂从合并的混合物中分离(+)-L-酒石酸盐。
因此，当合并的混合物中存在多于一种溶剂时，可以选择不同溶剂，从而充当共溶剂或充当反溶剂。
可以选择溶剂或溶剂混合物，使得当加热时，它们使(+)-L-酒石酸盐至少部分地保留在溶液中，但然后在冷却溶剂或溶剂混合物时，使盐作为沉淀物沉积。
用来形成第一混合物(包含式(1)的阻转异构体的混合物)的溶剂可以例如选自脂族酮、脂族酸的脂族酯、非芳香族环醚和脂族醇。
脂族酮的具体实例是丙酮。
脂族酸的脂族酯的实例包括乙酸的C2-4烷基酯，具体实例是乙酸异丙酯。
非芳香族环醚的实例包括二噁烷、2-甲基四氢呋喃和四氢呋喃，具体实例是2-甲基四氢呋喃。
脂族醇的实例是C2-4脂族醇，并且更特别地是C3-4烷醇诸如异丙醇和丁醇。
用来形成第二混合物(包含(+)-L-酒石酸的混合物)的溶剂可以例如选自水、非芳香族环醚和脂族醇。
用于第二混合物的脂族醇溶剂的具体实例是乙醇。
用于第二混合物的非芳香族环醚溶剂的具体实例是四氢呋喃(THF)。
用于形成第二混合物的溶剂的另一种具体实例是水。
式(1)的阻转异构体的(+)-L-酒石酸盐可以呈数种结晶形式、尤其图案A(其为溶剂化物)和图案B(其为无水物)存在。本文别处提供不同结晶形式的表征性细节。可以通过改变形成盐时所用的溶剂和加热条件制备不同结晶形式。
在一种用于制造具有图案A的式(1)的阻转异构体的(+)-L-酒石酸盐的方法中，将阻转异构体在丙酮中的溶液与(+)-L-酒石酸在乙醇中的溶液在20℃至30℃范围内的温度(例如大约25℃)下混合，将所产生的混合物搅拌或另外搅动足以允许成盐发生的时间长度(例如12-24小时)，并且然后通过过滤分离盐。
在另一种用于制造具有图案A的式(1)的阻转异构体的(+)-L-酒石酸盐的方法中，将阻转异构体在异丙醇中的溶液与(+)-L-酒石酸在乙醇中的溶液在35℃至45℃范围内的温度(例如大约40℃)下混合，将所产生的混合物在大约1-3小时的时间段内冷却至20℃至30℃范围内的温度(例如大约25℃)，并且然后通过过滤分离盐。
在另一种用于制造具有图案A的式(1)的阻转异构体的(+)-L-酒石酸盐的方法中，将阻转异构体在2-甲基四氢呋喃中的溶液与(+)-L-酒石酸在乙醇中的溶液在20℃至30℃范围内的温度(例如大约25℃)下混合，将所产生的混合物搅拌或另外搅动足以允许成盐发生的时间长度(例如12-24小时)，并且然后通过过滤分离盐。
在一种用于制造具有图案B的式(1)的阻转异构体的(+)-L-酒石酸盐的方法中，将阻转异构体在乙酸异丙酯中的溶液与(+)-L-酒石酸在乙醇中的溶液在35℃至45℃范围内的温度(例如大约40℃)下混合，将所产生的混合物在大约1-3小时的时间段内冷却至20℃至30℃范围内的温度(例如大约25℃)，并且然后通过过滤分离盐。
在另一种用于制造具有图案B的式(1)的阻转异构体的(+)-L-酒石酸盐的方法中，将阻转异构体在乙酸异丙酯中的溶液与(+)-L-酒石酸在THF中的溶液在35℃至45℃范围内的温度(例如大约40℃)下混合(分批或一次单一进料)并且加入图案B的盐的一个或多个晶种以产生沉淀物，将混合物冷却至20℃至30℃范围内的温度(例如大约25℃)并且搅拌或搅动一段时间(例如12至24小时，特别地大约20小时)，该时间足以允许沉淀物成熟至其中可以通过过滤来分离沉淀物的状态。
在另一种用于具有图案B的式(1)的阻转异构体的(+)-L-酒石酸盐的方法中，将阻转异构体在丁醇中的溶液在70℃至85℃范围内的高温(例如大约80℃)下与(+)-L-酒石酸在水中的溶液混合(分批或一次单一进料)，将所产生的混合物冷却至65℃至70℃范围内的中间温度，之后加入图案B的盐的一个或多个晶种并且将混合物在8至15小时的时间段内冷却至3-10℃范围内的低温，并且此后将所产生的混合物在低温或低温附近搅拌或另外搅动2至8小时的另一段时间段(例如大约6小时)，并且然后过滤出如此形成的图案B的盐。
式(1)的阻转异构体可以通过以下制备：
(a)分离4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)-乙基]苯甲酰胺的阻转异构体的混合物(例如，外消旋混合物)；或者
(b)使式(3)的阻转异构体:
Figure BDA0004143454640000141
与式H2N-(CH2)-N(CH3)2的胺在形成酰胺的的条件下反应。
式(1)、(2)和(3)的化合物可以通过以下在方案1中所示的路线制备。
Figure BDA0004143454640000151
方案1
方案1所示的合成路线的起始材料是4-氰基-苯乙酮(4)和4-氯代苯甲酰甲基溴(5)，二者均可商购。
在步骤1中，使4-氰基-苯乙酮(4)和4-氯代苯甲酰甲基溴(5)在一起反应，以产生4-[4-(4-氯苯基)-4-氧亚基-丁酰基]苯甲腈(6)。该反应通常在合适的溶剂例如非极性(例如烃)溶剂(诸如苯或甲苯)和叔醇(例如，叔丁醇)的混合物中，在叔胺诸如三乙胺存在下，在锌(II)盐(例如，氯化锌)存在下进行。该反应可以在室温或接近室温进行，例如12至60小时的时间段。
在步骤2中，使4-[4-(4-氯苯基)-4-氧亚基-丁酰基]苯甲腈(6)与2-三氟甲基苯胺反应，以产生4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲腈(7)。该反应通常在酸催化剂(诸如对甲苯磺酸)存在下，在合适的高沸点溶剂(例如二噁烷)中，在升高的温度(例如在130℃和170℃之间)下和/或用微波照射进行。该反应可进行1与12小时之间，例如1与6小时之间。
在步骤3中，使4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲腈(7)经历碱性水解，以产生4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲酸(8)。水解反应通常在水性溶剂(其可以包含醇诸如甲醇)中，在碱金属氢氧化物诸如氢氧化钠(通常呈过量的量)存在下进行，并且通常伴以加热，例如加热至60-80℃范围内的温度或时间段最长达约20小时或更多。一旦水解完成，则通常通过冷却和酸化反应混合物来分离酸(8)。
在步骤3后，可以遵循阻转异构体(1)的两个可能路线之一。在一个由步骤4b和5b和6组成的变体中，使4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲酸(8)与N,N-二甲基乙二胺在形成酰胺的条件下反应，以产生4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)苯甲酰胺(9)的阻转异构体的外消旋混合物，该外消旋混合物然后通过手性分离拆分成其单独的阻转异构体，以产生阻转异构体(1)。
在另一变体中，使外消旋6(4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲酸(8))经历手性分离以产生阻转异构体(3)，将其然后与N,N-二甲基乙二胺在形成酰胺的条件下反应，以产生阻转异构体(1)。
使羧酸(3)和(8)与N,N-二甲基乙二胺在形成酰胺的条件下在酰胺偶联试剂存在下反应。这样的酰胺偶联试剂的实例包括碳二亚胺类偶联试剂，诸如1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)(Sheehan et al,J.Amer.Chem Soc.1955,77,1067)和1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(本文称为EDC或EDCI)(Sheehan et al,J.Org.Chem.,1961,26,2525)，其通常与1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)(L.A.Carpino,J.Amer.Chem.Soc.,1993,115,4397)或1-羟基苯并三唑(HOBt)(Konig et al,Chem.Ber.,103,708,2024-2034)联用，脲鎓类偶联试剂，诸如O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和丙烷膦酸酐(T3P)(参见A.Garcia,Synlett,2007,No.8,pp1328-1329)。方法步骤5a和5b中所用的具体酰胺偶联试剂是HATU和T3P。
酰胺偶联反应通常在非水性、极性、非质子溶剂诸如四氢呋喃或二甲基甲酰胺或其混合物中，在室温或附近(例如18-30℃)在非干扰碱(例如叔胺诸如三乙胺或N,N-二异丙基乙胺)存在下进行。
羧酸(8)和酰胺(9)的阻转异构体的混合物的手性分离可以使用多种技术进行。例如，手性色谱法可以用来分离单独的阻转异构体。阻转异构体在手性色谱程序中的保留时间提供了在其NMR和MS特性通常相同的单独的阻转异构体之间区分并且表征它们的手段。
可以用来分离单独的阻转异构体的手性色谱柱包括可以例如基于官能化直链淀粉或纤维素的固定化手性固定相(CSF)。这样的CSF的实例是已经用氯和/或甲基取代的苯基氨基甲酸酯官能化的直链淀粉和纤维素。可以用来分离本发明的单独的阻转异构体的手性柱的具体实例是从Daicel公司可获得的“Chiralpak IG”柱。
通常可以结合以上手性柱一起使用的流动相包括以下的混合物：(A)包含少量(例如最多达1％(v/v)和更多通常地约0.1％(v/v))的烷基胺碱诸如二乙胺的液体烷烃诸如正庚烷；和(B)醇及其混合物诸如异丙醇和甲醇(例如70:30IPA:MeOH)的混合物。例如，流动相可以包括在80:20至95:5(例如大约85:15至大约90:10)比率范围内的A:B混合物。流动相可以用于等度或梯度洗脱方法中，但是在本发明的一种实施方式中，用于等度洗脱方法中。
本发明的阻转异构体也可以在超临界流体色谱(SFC)条件下通过手性HPLC拆分。在超临界流体色谱法中，流动相包括超临界流体诸如二氧化碳，经常伴有共溶剂诸如醇或醇混合物，例如甲醇、乙醇和异丙醇。
上文所提及的Chiralpak IG柱可以用于使用二氧化碳/甲醇/异丙醇混合物作为流动相的SFC色谱程序中。
用于SFC中的其他手性柱/共溶剂组合包括：
Lux纤维素4(MeOH、EtOH)；
Lux纤维素2(MeOH)；
Lux直链淀粉1(MeOH、EtOH)；和
YMC直链淀粉-SA(MeOH、EtOH)
Lux族手性柱从Phenomenex,Inc.可获得。
YMC直链淀粉-SA柱从YMC America,Inc.可获得。
上述手性色谱法的方法可以特别地用于从外消旋混合物(9)中分离阻转异构体(1)。
作为手性色谱法的替代方案，手性酸(例如(+)-10-樟脑磺酸)可以与外消旋混合物(9)反应以形成手性盐，作为非对映异构体的混合物，该混合物可以通过结晶分离得到阻转异构体(1)的盐，该盐然后可以转化为阻转异构体(1)的游离碱。
羧酸(8)的阻转异构体的外消旋混合物可以通过与手性胺诸如(S)-1-(4-甲氧基苯基)-乙胺形成盐来拆分，以形成可以通过结晶分离的非对映异构体的混合物，例如在手性胺与阻转异构体(1)的盐的晶种的帮助下。
上文所述方法的某些方面表示本发明的另外实施方式(实施方式2.1至2.5)。因此，本发明提供：
2.1一种用于制备式(1)的化合物的方法，所述方法包括使式(3)的化合物与N,N-二甲基乙二胺在形成酰胺的条件下反应。
2.2根据实施方式2.1所述的方法，其中所述形成酰胺的条件包括存在酰胺偶联试剂，例如，如本文所述的酰胺偶联剂。
2.3根据实施方式2.2所述的方法，其中所述酰胺偶联试剂是丙烷膦酸酐(T3P)。
2.4一种用于制备式(3)的化合物的方法，所述方法包括从式(8)的阻转异构体的混合物手性分离式(3)的化合物，例如通过手性色谱法或与手性碱成盐并拆分所产生的手性盐。
2.5一种具有式(3)的阻转异构体化合物或其盐(例如金属盐诸如碱金属盐或碱土金属盐或具有氨或有机胺的盐)。
生物学特性及治疗用途
下文实施例中所述的证据表明，如本文限定的式(1)的阻转异构体和它的酒石酸盐是PLK1和PLK4激酶的polo盒结构域的抑制剂，而不抑制PLK1和PLK4激酶的催化结构域。由于PBD结构域仅存在于PLK中，因此式(1)的阻转异构体和它的酒石酸盐应当显示比作为ATP竞争性激酶抑制剂的化合物大得多的选择性(并且因此更少的不想要的副作用，由于脱靶激酶抑制)。从下文实施例7F中所述的研究获得的结果，其中式(1)的阻转异构体针对一组九十七种激酶进行测试并且示出对其他激酶可忽略的活性，证实相对于结构与功能相似的其他激酶，式(1)的阻转异构体对PLK1-PBD和PLK4-PBD具有高程度的选择性。
抑制PBD结构域而不抑制催化结构域的另外优点是，与抑制催化结构域的PLK1抑制剂相比，这可能导致诱导耐药性的趋势减小。
可以使用Narvaez et al.,Cell Chemical Biology,24,1017-1028,2017，参见1018页以及1026页(方法细节)中描述的荧光偏振(FP)测定证明式(1)的阻转异构体和它的酒石酸盐作为PLK1激酶的PBD结构域的抑制剂的活性。
据信，式(1)的阻转异构体和它的酒石酸盐可以有效地利用基于组成性激活KRAS突变体的细胞途径中的弱点，并且因此可以用于治疗由KRAS调节介导的疾病和病症。
由单个核苷酸置换引起的KRAS突变与各种形式的癌症有关。特别是，KRAS突变以高比率在白血病、结肠癌、胰腺癌和肺癌中存在。
此外，据信，式(1)的阻转异构体和它的酒石酸盐可以用于治疗以p53缺陷或TP53基因中突变为特征的癌症。据信PLK1在癌细胞中抑制p53。因此，在用PLK1抑制剂治疗后，肿瘤细胞中的p53应该被激活并因此应当诱导细胞凋亡。
据信，式(1)的阻转异构体对KRAS突变型和p53缺陷型癌症的活性至少部分地通过抑制如上文所述的PLK1激酶的C末端polo盒结构域(PBD)而产生。已知，KRAS依赖于与PLK1的相互作用。
式(1)的阻转异构体诱导有丝分裂停滞，具有非分裂染色体(non-congressedchromosomes)，据信这种特性由阻转异构体的PLK1-PBD与PLK4-PBD抑制活性引起的(参见下文实施例7C)。
阻转异构体诱导有丝分裂停滞，具有多极纺锤体表型，并且造成中心粒放大，一种充分描述的PLK4抑制表型(Lei 2018,Cell Death&Disease 9,1066；Kawakami,PNAS 2018,115(8)1913-18)。据信这些表型由式(1)的阻转异构体的PLK4-PBD抑制活性引起的。
下文实施例7A中描述了利用癌细胞系(U87MG，人脑(胶质母细胞瘤星形细胞瘤))的抗癌活性的初步筛查。获得的数据表明，式(1)的R-阻转异构体(阻转异构体A-2)(IC50为0.22μM)比相应的S-阻转异构体(A-1)活性高得多，S-阻转异构体具有的对U87MG细胞系的IC50为4.6μM。
两种阻转异构体(A-2和A-1)也都针对一组四十八种癌细胞系进行了测试，并且结果显示在下面的实施例7B中。在所测试的每种细胞系中，式(1)的阻转异构体(A-2)比阻转异构体(A-1)的活性更高，在大多数情况下为至少十倍。
实施例7B中的数据表明，式(1)的阻转异构体(A-2)对范围从实体瘤诸如胰腺癌、大肠癌和结直肠癌、肺癌、脑癌和神经癌，以及血癌诸如淋巴瘤和白血病的各种不同的癌细胞系具有活性。
式(1)的阻转异构体具有良好的口服生物利用度(参见下文实施例7G)，并且当口服给药时具有良好的脑暴露(实施例7G)。因此，本发明的物质组合物或阻转异构体应当用于治疗脑癌诸如神经胶质瘤和胶质母细胞瘤。
根据迄今为止获得的证据，据信式(1)的阻转异构体将用于治疗多种癌症(和它们的良性对应物)，例如以下实施方式中列出的癌症。
因此，在另外实施方式(实施方式3.1至3.25)中，本发明提供：
3.1.根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于作为PLK1-PBD的用途。
3.2根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于作为PLK4-PBD抑制剂的用途。
3.3根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于作为PLK1-PBD和PLK4-PBD抑制剂的用途。
3.4根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如，抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症选自上皮源性肿瘤(各种类型的腺瘤和癌，包括腺癌、鳞状细胞癌、移行细胞癌和其他癌)，诸如膀胱和泌尿道、乳腺、胃肠道(包括食道、胃(胃部)、小肠、结肠、直肠和肛门)、肝(肝细胞癌)、胆囊与胆系统、外分泌胰腺、肾、肺(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管癌和间皮瘤)、头颈部(例如舌、颊腔、喉、咽、鼻咽、扁桃体、唾液腺、鼻腔和鼻窦癌)、卵巢、输卵管、腹膜、阴道、外阴、阴茎、子宫颈、子宫肌层、子宫内膜、甲状腺(例如甲状腺滤泡癌)、肾上腺、前列腺、皮肤和附件(例如黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、增生性痣)的癌；血液系统恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和恶变前血液疾患和边缘恶性肿瘤疾患，包括淋巴系的血液系统恶性肿瘤和相关病症(例如急性淋巴细胞白血病[ALL]、慢性淋巴细胞白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴组织增生性疾患)，以及髓系谱系的血液系统恶性肿瘤及相关病症(例如急性骨髓性白血病[AML]、慢性骨髓性白血病[CML]、慢性骨髓单核细胞性白血病[CMML]、嗜酸细胞增多综合征、骨髓增生性疾患，诸如多发性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征，骨髓增生异常综合征以及前髓细胞性白血病)；间充质源性肿瘤，例如软组织、骨或软骨的肉瘤，诸如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、尤文氏(Ewing’s)肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性与恶性组织细胞瘤和隆突性皮肤纤维肉瘤；中枢或外周神经系统肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体瘤、肾上腺瘤、胰岛细胞瘤、甲状旁腺瘤、甲状腺的类癌和髓样癌)；眼和附件肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；和小儿与胚胎肿瘤(例如髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、维尔姆斯(Wilms)瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或者使患者易患恶性肿瘤的先天性或其他综合征(例如着色性干皮病)。
3.4A根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症选自胰腺癌、大肠癌和结直肠癌、肺癌、脑癌和神经癌、血癌(诸如淋巴瘤和白血病)、前列腺癌和乳腺癌。
3.5根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症选自胰腺癌、大肠癌和结直肠癌、肺癌、脑癌和神经癌及血癌诸如淋巴瘤和白血病。
3.6根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症选自神经胶质瘤和胶质母细胞瘤(例如多形性胶质母细胞瘤、室管膜瘤、扩散型内因性脑桥神经胶质瘤、IDH1突变神经胶质瘤)。
3.7根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症选自横纹肌样瘤；髓母细胞瘤和其他脑胚胎性肿瘤；乳腺癌、肺癌、黑素瘤、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和卵巢癌。
3.7A根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症选自：
(a)选自乳腺癌、胃肠道癌、外分泌胰腺癌、肺癌和前列腺癌的上皮源性肿瘤；
(b)选自B细胞淋巴瘤诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病[AML]、慢性骨髓性白血病[CML]和骨髓增生异常综合征的血液系统恶性肿瘤；
(c)选自骨肉瘤和横纹肌肉瘤的间充质源性肿瘤；
(d)选自神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和室管膜瘤的中枢或外周神经系统肿瘤；和
(e)选自髓母细胞瘤和神经母细胞瘤的小儿与胚胎肿瘤。
3.8根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症是其中涉及PLK1(例如其中PLK1过表达)的癌症。
3.9根据实施方式3.8所述用途的酒石酸盐或物质组合物，其中所述癌症根据实施方式3.4至3.7中任一项所限定。
3.10根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症是其中涉及PLK4(例如其中PLK4过表达)的癌症。
3.11根据实施方式3.10所述用途的酒石酸盐或物质组合物，其中所述癌症根据实施方式3.4至3.7中任一项所限定。
3.12根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用，其中所述癌症是以p53缺陷或TP53基因中突变为特征的癌症。
3.13根据实施方式3.12所述用途的酒石酸盐或物质组合物，其中所述癌症根据实施方式3.4至3.7中任一项所限定。
3.14根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗癌症的用途，其中所述癌症是以存在KRAS突变形式为特征的癌症。
3.15根据实施方式3.14所述用途的酒石酸盐或物质组合物，其中所述KRAS突变形式是在蛋白质中选自甘氨酸12、甘氨酸13、谷氨酰胺61及其组合的氨基酸处具有突变的突变形式。
3.16根据实施方式3.14或3.15所述用途的酒石酸盐或物质组合物，其中所述癌症根据实施方式3.4至3.7中任一项所限定。
3.17根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于药物或疗法的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用。
3.18根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于预防或治疗以KRAS蛋白异常表达为特征的疾病状态和病症的用途，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用。
3.19根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于作为抗癌剂的用途。
3.20一种治疗患有根据实施方式3.4至3.16中任一项所限定的癌症的受试者(例如哺乳动物受试者诸如人)的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，任选地与另一种治疗剂或疗法(例如抗癌剂或疗法)联用。
3.21根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物用于制造用于根据实施方式3.1至3.9中任一项所限定的用途的药物的用途。
3.22一种抑制PLK1-PBD的方法，所述方法包括使有效抑制量的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物与所述PLK1-PBD接触。
3.23一种抑制PLK4-PBD的方法，所述方法包括使有效抑制量的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物与所述PLK4-PBD接触。
3.24一种抑制PLK1-PBD和PLK4-PBD的方法，所述方法包括使有效抑制量的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物与所述PLK1-PBD和PLK4-PBD接触。
3.25根据实施方式3.22至3.24中任一项所述的方法，其中使所述有效抑制量的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物与所述PLK1-PBD和/或PLK4-PBD在体内例如在哺乳动物受试者诸如人类受试者中接触。
在给药根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物之前，可以筛查患者以确定该患者患有或可能患有的癌症是否是以升高的PLK1和/或PLK4激酶水平为特征并且因此将对用具有针对PLK1和/或PLK4激酶的活性的化合物治疗敏感的癌症。
例如，可以分析取自患者的生物样品以确定该患者是否患有或可能患有的癌症是以遗传异常或蛋白表达异常(导致PLK1和/或PLK4激酶上调)为特征的癌症。术语上调包括表达升高或过表达，包括基因扩增(即多个基因拷贝)和通过转录作用引起的表达增加，以及过度活跃和激活，包括突变激活。因此，可以对患者进行诊断测试以检测PLK1和/或PLK4激酶上调的标志物特征。术语诊断包括筛查。对于标志物，我们包括遗传标志物(例如包括测量DNA组成)以鉴定PLK1的突变。术语标志物还包括以PLK1和/或PLK4上调为特征的标志物，包括前述蛋白质的酶活性、酶水平、酶状态(例如磷酸化与否)和mRNA水平。
PLK1和/或PLK4激酶上调的肿瘤可以对PLK1抑制剂特别敏感。可以优选筛查PLK1和/或PLK4上调的肿瘤。因此，可以对患者进行诊断测试以检测PLK1和/或PLK4上调的标志物特征。诊断测试通常在选自肿瘤活检样品、血液样品(脱落的肿瘤细胞的分离和富集)、粪便活检、痰、染色体分析、胸膜液和腹膜液的生物样品上进行。
鉴定和分析蛋白质突变和上调的方法是本领域技术人员已知的。筛查方法可以包括，但不限于标准方法，诸如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或原位杂交。
在通过RT-PCR的筛查中，通过产生mRNA的cDNA拷贝，然后通过PCR扩增cDNA来评估肿瘤中mRNA的水平。本领域技术人员已知PCR扩增的方法、引物的选择和扩增条件。核酸操作和PCR是通过标准方法进行的，如例如在Ausubel,F.M.et al.,eds.Current Protocolsin Molecular Biology,2004,John Wiley&Sons Inc.,或Innis,M.A.et-al.,eds.PCRProtocols:a guide to methods and applications,1990,Academic Press,San Diego中描述的。涉及核酸技术的反应和操作也在Sambrook et al.,2001,3rd Ed,MolecularCloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press中描绘。可替代地，可以使用RT-PCR的可商购试剂盒(例如Roche Molecular Biochemicals)或如美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659、5,272,057、5,882,864和6,218,529中所列的方法并且通过援引并入本文。
用于评估mRNA表达的原位杂交技术的实例将是荧光原位杂交(FISH)(参见Angerer,1987Meth.Enzymol.,152:649)。
通常，原位杂交包括以下主要步骤：(1)固定待分析的组织；(2)对样品进行预杂交处理，以增加靶核酸的可及性，并减少非特异性结合；(3)使核酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后洗涤以除去未结合在杂交中的核酸片段，和(5)检测杂交的核酸片段。在这样的应用中使用的探针通常用例如放射性同位素或荧光报道分子标记。优选的探针足够长，例如，约50、100或200个核苷酸至约1000或更多的核苷酸，以使得能够在严格条件下与一个或多个靶核酸特异性杂交。进行FISH的标准方法描述于Ausubel,F.M.etal.,eds.Current Protocols in Molecular Biology,2004,John Wiley&Sons Inc andFluorescence In Situ Hybridization:Technical Overview by John M.S.Bartlett inMolecular Diagnosis of Cancer,Methods and Protocols,2nd ed.；ISBN:1-59259-760-2；March 2004,pps.077-088；Series:Methods in Molecular Medicine中。
可替代地，可以通过肿瘤样品的免疫组织化学，用微量滴定板的固相免疫测定、蛋白质印迹法、2维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、ELISA、流式细胞术和本领域已知的检测特异性蛋白的其他方法来测定从mRNA表达的蛋白质产物。检测方法将包括使用位点特异性抗体。技术人员将认识到，用于检测PLK1和/或PLK4激酶上调的所有这样的众所周知的技术可以在当前情况下适用。
可替代地或额外地，在给药根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物之前，可以筛查患者以确定该患者患有或可能患有的癌症是否是以突变型KRAS为特征并且因此将对用具有针对携带突变型KRAS的癌症细胞的活性的化合物治疗敏感的癌症。
例如，可以分析取自患者的生物样品以确定该患者患有或可能患有的癌症是否是以突变型KRAS的存在为特征的癌症。因此，例如，可以对患者进行诊断测试以检测KRAS蛋白中第12、13、61位密码子的突变或其混合。用于突变型KRAS的可商购诊断测试包括来自Roche Molecular Systems,Inc的
Figure BDA0004143454640000271
KRAS突变测试和来自Qiagen Manchester,Ltd的therascreen KRAS RGQ PCR试剂盒。
具有突变型KRAS的肿瘤可能对PLK1和/或PLK4抑制剂特别敏感。鉴定和分析蛋白质突变和上调的方法是本领域技术人员已知的。筛查方法可以包括，但不限于标准方法，诸如如上所述的逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或原位杂交。
因此，在另外实施方式(实施方式3.26至3.34)中，本发明提供：
3.26根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗受试者(例如人类受试者)中的癌症的用途，所述受试者已经被筛查并确定为患有以升高的PLK1激酶水平(例如PLK1过表达)为特征的癌症。
3.27根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗受试者(例如人类受试者)中的癌症的用途，所述受试者已经被筛查并确定为患有以升高的PLK4激酶水平(例如PLK4过表达)为特征的癌症。
3.28根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗受试者(例如人类受试者)中的癌症的用途，所述受试者已经被筛查并确定为患有以升高的PLK1激酶和PLK4激酶水平(例如PLK1和PLK4过表达)为特征的癌症。
3.29根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗受试者(例如人类受试者)中的癌症的用途，所述受试者已经被筛查并确定为患有疾病或病症或者处于患有疾病或病症的风险，所述疾病或病症将对用具有针对KRAS的活性的化合物治疗敏感。
3.30根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，用于治疗受试者(例如人类受试者)的用途，所述受试者已经被筛查并确定为患有癌症，所述癌症是以突变型KRAS为特征且将对用具有针对携带突变型KRAS的癌症细胞的活性的化合物治疗敏感的癌症。
3.31根据实施方式3.26至3.30中任一项所述用途的酒石酸盐或物质组合物，其中所述癌症是根据实施方式3.4至3.16中任一项所限定的癌症。
3.32根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物用于制造用于根据实施方式3.26至3.31中任一项所限定的用途的药物的用途。
3.33一种用于诊断和治疗以存在KRAS突变形式为特征的疾病状态或病症(例如癌症，例如，根据实施方式3.4至3.16中任一项所限定的癌症)的方法，所述方法包括(i)筛查受试者(例如人类受试者)以确定所述受试者患有或可能患有的疾病或病症是否是将对用具有针对KRAS的活性的化合物治疗敏感的疾病或病症；和(ii)在表明所述受试者患有的疾病或病症因此是敏感的情况下，此后向所述受试者给药治疗有效量的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物。
3.34一种用于治疗以存在KRAS突变形式为特征的疾病状态或病症(例如癌症，例如，根据实施方式3.4至3.16中任一项所限定的癌症)的方法，所述方法包括向受试者(例如人类受试者)给药治疗有效量的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，所述受试者已经被筛查并确定为患有疾病或病症或者处于患有疾病或病症的风险，所述疾病或病症将对用具有针对KRAS的活性的化合物治疗敏感。
药物制剂
根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物通常以药物组合物的形式向患者给药。因此，在本发明的另一种实施方式(实施方式4.1)中，本发明提供了一种药物组合物，其包括根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，以及药学上可接受的赋形剂。
在另外实施方式中，提供了：
4.2根据实施方式4.1所述的药物组合物，其包括大约1％(w/w)至大约95％(w/w)的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物和99％(w/w)至5％(w/w)的药学上可接受的赋形剂或赋形剂组合和任选地一种或多种另外治疗性活性成分。
4.3根据实施方式4.2所述的药物组合物，其包括大约5％(w/w)至大约90％(w/w)的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐组合物或物质组合物和95％(w/w)至10％的药物赋形剂或赋形剂组合和任选地一种或多种另外治疗性活性成分。
4.4根据实施方式3.3所述的药物组合物，其包括大约10％(w/w)至大约90％(w/w)的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物和90％(w/w)至10％的药物赋形剂或赋形剂组合。
4.5根据实施方式4.4所述的药物组合物，其包括大约20％(w/w)至大约90％(w/w)的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物和80％(w/w)至10％的药物赋形剂或赋形剂组合。
4.6根据实施方式3.5所述的药物组合物，其包括大约25％(w/w)至大约80％(w/w)的根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物和75％(w/w)至20％的药物赋形剂或赋形剂组合。
本发明的药物组合物可以呈适于口服、肠胃外、外用、鼻内、支气管内、眼内、耳道、直肠、阴道内或经皮给药的任何形式。当组合物旨在用于肠胃外给药时，可以将它们配制成用于静脉内、肌内、腹膜内、皮下给药或通过注射、输注或其他递送方式直接递送到靶器官或组织中。
适于口服给药的药物剂型包括片剂、胶囊、囊片、丸剂、锭剂、糖浆剂、溶液、喷雾剂、散剂、颗粒剂、酏剂和混悬剂、舌下片剂、喷雾剂、薄片剂或贴剂和颊贴剂。
因此，在另外实施方式中，本发明提供：
4.7根据实施方式4.1至4.6中任一项所述的药物组合物，其适于口服给药。
4.8根据实施方式4.7所述的药物组合物，其选自片剂、胶囊、囊片、丸剂、锭剂、糖浆剂、溶液、喷雾剂、散剂、颗粒剂、酏剂和混悬剂、舌下片剂、喷雾剂、薄片剂或贴剂和颊贴剂。
4.9根据实施方式4.8所述的药物组合物，其选自片剂和胶囊。
4.10根据实施方式4.1至4.6中任一项所述的药物组合物，其适于肠胃外给药。
4.11根据实施方式4.10所述的药物组合物，其被配制成用于静脉内、肌内、腹膜内、皮下给药或通过注射、输注或其他递送方式直接递送到靶器官或组织中。
4.12根据实施方式4.11所述的药物组合物，其是用于注射或输注的溶液或混悬剂。
可以根据已知技术配制包含根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物的药物组合物(例如，根据实施方式4.1至4.12中任一项所限定的)，参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA,USA。
因此，片剂组合物(根据实施方式4.9中的)可包含单位剂量的活性化合物连同惰性稀释剂或载体，诸如糖或糖醇，例如；乳糖、蔗糖、山梨糖醇或甘露糖醇；和/或非糖衍生的稀释剂，诸如碳酸钠、磷酸钙、滑石、碳酸钙，或纤维素或其衍生物，诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，以及淀粉，诸如玉米淀粉。片剂还可以包含标准成分，诸如粘结剂和制粒剂(诸如聚乙烯吡咯烷酮)，崩解剂(例如可溶胀的交联聚合物，诸如交联的羧甲基纤维素)，润滑剂(例如硬脂酸酯)，防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)，抗氧化剂(例如BHT)，缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)和泡腾剂(诸如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物)。这样的赋形剂众所周知，并且无需在此详细讨论。
胶囊制剂(根据实施方式4.9中的)可以是硬明胶或软明胶种类，并且可以包含固体、半固体或液体形式的活性组分。明胶胶囊可由动物明胶或其合成或植物来源的等同物形成。
固体剂型(例如片剂、胶囊等)可以是包衣的或未包衣的、但是通常具有包衣，例如保护膜包衣(例如蜡或清漆)或控释包衣。可以将包衣(例如EudragitTM型聚合物)设计成在胃肠道内的期望位置释放活性组分。因此，可以选择包衣，以便在胃肠道内某些pH条件下降解，从而选择性地在胃或回肠或十二指肠中释放物质组合物或阻转异构体。
代替包衣或除包衣外，药物可以在包括控释剂(例如释放延迟剂)的固体基质中呈现，其可适于选择性地在胃肠道中酸度或碱度变化的条件下释放物质组合物或阻转异构体。可替代地，基质材料或延迟释放包衣可以采取可蚀性聚合物(例如马来酸酐聚合物)的形式，其在剂型通过胃肠道时基本上连续地被蚀解。
外用的组合物包括软膏、乳膏、喷雾剂、贴剂、凝胶剂、液滴剂和插剂(例如眼内插剂)。这样的组合物可以根据已知方法配制。
肠胃外给药的组合物(根据实施方式4.10至4.12中的)通常作为无菌的水性或油性溶液或细悬浮液呈现，或者可以以细分的无菌粉末形式提供，用无菌水临时配制用于注射。
用于直肠或阴道内给药的制剂的实例包括子宫托和栓剂，其可以例如由包含活性化合物的成型的可模制或蜡质材料形成。
通过吸入给药的组合物可以采取可吸入粉末组合物或液体或粉末喷雾剂的形式，并且可以使用粉末吸入器装置或气雾剂分配装置以标准形式给药。这样的装置是众所周知的。为了通过吸入给药，粉状制剂通常包括活性化合物连同惰性固体粉状稀释剂，诸如乳糖。
药物组合物通常将以单位剂型呈现，且就其本身而言，通常将包含足以提供所需水平生物活性的化合物。例如，根据实施方式4.1至4.9中任一项，旨在用于口服给药的组合物可以包含2毫克至200毫克的活性成分，更通常地为10毫克至100毫克，例如12.5毫克、25毫克和50毫克。
剂量学
活性化合物(根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物)将以足以实现所需治疗效果(例如，上文实施方式3.1至3.34中所述的效果)的量向有此需要的患者(例如人或动物患者)给药。
通常将根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物给药至需要这样的给药的受试者，例如人或动物患者，优选地人。
通常将根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物以治疗或预防上有用且通常无毒的量给药。然而，在某些情况下，给药本发明的化合物的益处可能超过任何毒性作用或副作用的缺点，在这种情况下，可以认为期望以与毒性程度相关的量给药化合物。
在一种实施方式中，根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物的典型日剂量可以在每千克体重0.025毫克至5毫克的范围内，例如，每千克体重最高达3毫克，并且更通常为每千克体重0.15毫克至5毫克，但是如果需要，可以给药更高或更低的剂量。
在另外的实施方式中，根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物的典型日剂量可以在每千克体重0.025毫克至50毫克的范围内，例如，每千克体重最高达30毫克，并且更通常为每千克体重0.15毫克至50毫克(例如，每千克体重0.5毫克至30毫克)，但是如果需要，可以给药更高或更低的剂量。
以举例方式，在本发明的一种实施方式中，可以将初始起始剂量12.5mg一天给药2至3次。剂量可以每3至5天按一天12.5mg增加，直到达到如医师确定的个体最大耐受和有效剂量。
在本发明的另外实施方式中，每周一次的给药方案可以包括在第一周中的初始起始剂量为0.5-1.5mg/kg(例如1mg/kg)，随后在第二周和随后的数周中通过递增剂量(例如，对于最高达三次、四次或五次剂量递增，为先前剂量的两倍或三倍)直至与受试者的治疗效果和耐受性一致的最大剂量。例如，在第一周，可以给药1mg/kg的起始剂量，然后是增加的剂量，在第二周为3mg/kg，在第三周为9mg/kg以及第四周为27mg/kg。
最终，给药化合物的量应与治疗的疾病或生理状况的性质和由给定剂量方案产生的治疗益处及副作用存在与否相称，并且应由医师决定。
联合疗法
可以设想，根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物可用作单独的化学治疗剂，或更通常地，与化学治疗剂或放射疗法一起以联合疗法用于预防或治疗一系列增生性疾病状态或病症。上文列出了这样的疾病状态和病症的实例。
可以与根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物共同给药的化学治疗剂或其他疗法的具体实例包括：
·拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康(irinotecan))
·抗代谢物：(例如，阿糖胞苷或吉西他滨(gemcitabine))
·微管蛋白靶向剂(例如，紫杉醇)
·DNA结合剂和拓扑异构酶II抑制剂
·EGFR抑制剂(例如，吉非替尼(gefitinib)或阿法替尼(afatinib))
·mTOR抑制剂(例如依维莫司(everolimus))
·PI3K通路抑制剂(例如PI3K、PDK1)
·Akt抑制剂
·烷基化剂(例如替莫唑胺)
·单克隆抗体。
·抗激素
·信号转导抑制剂
·蛋白酶体抑制剂
·DNA甲基转移酶抑制剂
·细胞因子和类视黄醇
·缺氧引发的DNA破坏剂(例如替拉扎明(tirapazamine))
·芳香化酶抑制剂
·抗Her2抗体(参见，例如http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp？wo＝2007056118)
·抗cd20抗体(例如利妥昔单抗(rituximab))
·血管生成抑制剂
·HDAC抑制剂
·MEK抑制剂
·B-Raf抑制剂
·ERK抑制剂
·HER2小分子抑制剂(例如拉帕替尼(lapatinib)或阿法替尼)
·Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂(例如，伊马替尼(imatinib))
·CDK4/6抑制剂(例如，哌柏西利(palbociclib))
·Mps1/TTK抑制剂
·Aurora B抑制剂
·FLT3激酶抑制剂
·IDH1或IDH2抑制剂
·BRD4抑制剂
·替莫唑胺
·免疫检查点阻断信号传导组分的抑制剂，包括PD1、PDL-1和CTLA4；
·KRAS阻断药物，包括针对特异性突变诸如G12C的那些(例如索托拉西布(sotorasib))；
·Bcl2抑制剂(例如维奈托克(venetoclax)、沙布托克(sabutoclax)或奥巴克拉(obatoclax))；以及
·放射疗法。
可以与根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物共同给药的化学治疗剂或其他疗法的优选实例可以选自：
·拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康)
·抗代谢物：(例如，阿糖胞苷或吉西他滨)
·微管蛋白靶向剂(例如，紫杉醇)
·EGFR抑制剂(例如，吉非替尼或阿法替尼)
·mTOR抑制剂(例如依维莫司)
·烷基化剂(例如替莫唑胺)
·抗cd20抗体(例如利妥昔单抗)
·免疫检查点阻断信号传导组分的抑制剂，包括PD1、PDL-1和CTLA4；
·KRAS阻断药物，包括针对特异性突变诸如G12C的那些(例如索托拉西布)；
·Bcl2抑制剂(例如维奈托克、沙布托克或奥巴克拉)；以及
·放射疗法。
因此，在另外实施方式中，本发明提供：
5.1一种药物组合，包括根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，以及另一种治疗性活性剂。
5.2根据实施方式5.1所述的药物组合，其中所述另一种治疗剂选自上文所列的具体的和优选的化学治疗剂。
5.3根据实施方式5.1所述的药物组合，其中所述另一种治疗剂是抗癌剂。
5.4根据实施方式5.1至5.3中任一项所述的药物组合，其中根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物和所述另一种治疗性活性剂呈现于单一药物组合物或患者包中。
5.5一种药物组合物，包括根据实施方式1.1至1.19中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，另一种治疗性活性剂和至少一种药学上可接受的赋形剂。
5.6一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的根据实施方式5.1至5.5中任一项所述的药物组合。
附图说明
图1是说明阻转异构体的R/S分类系统的示意图。
图2是如通过单晶X射线晶体学研究确定的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2-(二甲基氨基)-乙基]苯甲酰胺阻转异构体A-2的三维结构的描述。
图3是两种阻转异构体A-1(S)和A-2(R)的示意性立体化学图示及使用Cahn–Ingold–Prelog(CIP)顺序规则指定其立体化学结构的基础。
图4是阻转异构体A-2游离碱的X射线粉末衍射光谱。
图5是阻转异构体A-2酒石酸盐图案A盐(底部线)和图案B盐(顶部线和中部线)的X射线粉末衍射光谱
图6说明了阻转异构体A-2游离碱的热分布曲线(thermal profile)并且示出差示扫描量热法图(线6A)和热重分析图(线6B)。
图7说明了阻转异构体A-2酒石酸盐图案A盐的热分布曲线并且示出差示扫描量热法图(线7A)和热重分析图(线7B)。
图8说明了阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐的热分布曲线并且示出差示扫描量热法图(线8A)和热重分析图(线8B)。
图9是在阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐上进行的重量蒸气吸附研究中的重量变化相对于相对湿度的图。
图10是条形图，示出了用0.03μM浓度的阻转异构体A-1或阻转异构体A-2中的任一种处理U87MG细胞后，观察到的不同有丝分裂表型(非分裂染色体、多极纺锤体/异常胞质分裂、单极纺锤体、正常前中期、之后产生的正常中期)的比例。
图11是条形图，示出了用0.02μM浓度的阻转异构体A-1或阻转异构体A-2中的任一种处理后，HeLa细胞中存在的中心粒数。
图12是向小鼠口服和i.v.给药阻转异构体A-2后血浆浓度与时间的图。延伸至24小时的下部线是2mg/kg i.v.给药的线。另一条线是10mg/kg p.o.给药的线。
图13是向小鼠口服给药(10mg/kg)阻转异构体A-2后血浆与脑浓度与时间的图。上部线显示出脑浓度而下部线显示出血浆浓度。
图14是给药阻转异构体A-2后，U87MG皮下异种移植模型中雄性无胸腺裸鼠的肿瘤体积与时间的图。
图15是与给药阻转异构体A-2后，U87-Luc原位异种移植模型中雄性无胸腺裸鼠的肿瘤生长相关的生物发光信号的图形化比较。
图16是给药阻转异构体A-2后，HCT116皮下异种移植模型中雄性无胸腺裸鼠的肿瘤体积与时间的图。
实施例
现在将通过参照以下实施例中所描述的特定实施方式说明而非限制本发明。
除非另有说明，否则在27℃的二甲亚砜-d6(DMSO-d6)或甲醇-d4(MeOH-d4)(如所示)中，在400MHz下运行的Bruker 400仪器上记录质子磁共振(1H NMR)光谱，并报告如下：化学位移δ/ppm(多重性，其中s＝单峰，d＝双峰，dd＝双双重峰，dt–双三重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，br＝宽，质子数)。残留的质子溶剂用作内部参考。
使用下文列出的系统和操作条件进行液相色谱和质谱分析。如果存在具有不同同位素的原子且引用单一质量，则该化合物所引用的质量为单同位素质量(即35Cl；79Br等)。
LCMS条件
使用下文所述的方法之一获得以下实施例中给出的LCMS数据。
LCMS方法1
在具有PDA光电二极管阵列检测器和QDa质量检测器的UPLC AQUITY上进行LCMS。所用的柱是C18，2.1x50mm，1.9μm。柱流量是1.2mL/min并且所用的流动相是：(A)MilliQ水中的0.1％甲酸(pH＝2.70)(B)水:乙腈(10:90)中的0.1％甲酸，注射体积在4和7μL之间。在甲醇:乙腈中制备样品，以实现250ppm的近似浓度。
以下梯度用于洗脱：
Figure BDA0004143454640000381
质量参数
探针：ESI毛细管
源温度：120℃
探针温度：600℃
毛细管电压：0.8KV(+Ve和–Ve)
锥孔电压：10和30V
电离模式：正和负
HPLC分析
使用以下方法获得报告的HPLC数据。
HPLC方法1
在Agilent Technologies 1100/1200系列HPLC系统上进行HPLC分析。所用的柱为ACE 3C18；150x4.6mm，3.0μm粒度(Ex：Hichrom，零件号：ACE-111-1546)。流量为1.0mL/min。流动相A是水:三氟乙酸(100:0.1％)并且流动相B是乙腈:三氟乙酸(100:0.1％)。注射体积是5μL并且使用以下梯度：
时间(min) ％A ％B
0 80 20
35 5 95
39.5 5 95
40 80 20
手性HPLC分析
使用下文所述的方法之一获得报告的手性HPLC数据。
手性HPLC方法1
在Agilent Technologies 1200系列HPLC系统上进行手性HPLC分析。所用的柱为CHIRAL PAK IG，250x4.6mm，5μm。柱流量是1.0mL/min并且流动相是：(A)正庚烷中的0.1％v/v DEA和(B)IPA:MeOH(70:30)。注射体积是25μL。将样品在IPA:MeOH中制备以实现250ppm的近似浓度，并且用以下等度方法：
时间 流量 ％A ％B
0.01 1.0mL/min 90 10
45 1.0mL/min 90 10
手性HPLC方法3
在Agilent Technologies 1200系列HPLC系统上进行手性HPLC。所用的柱为CHIRAL PAK IG，250x4.6mm，5μm。柱流量是1.0mL/min并且流动相是：(A)正庚烷中的0.1％v/v DEA和(B)IPA:MEOH(70:30)。注射体积是10μL。将样品在IPA:MeCN中制备以实现250ppm的近似浓度，并且用以下等度方法：
时间 流量 ％A ％B
0.01 1.0mL/min 85 15
25 1.0mL/min 85 15
手性HPLC方法4
条件与手性方法3相同，例外是使用以下等度方法：
时间 流量 ％A ％B
0.01 1.0mL/min 70 30
25 1.0mL/min 70 30
手性HPLC方法5
条件与手性方法3相同，例外是使用以下等度方法：
时间 流量 ％A ％B
0.01 1.0mL/min 90 10
25 1.0mL/min 90 10
手性HPLC方法6
在Agilent Technologies 1100/1200系列HPLC系统上进行手性HPLC分析。所用的柱为CHIRALPAK AD-H；250x4.6mm，5.0μm。柱流量是1.0mL/min并且流动相是：己烷:EtOH:TFA(90:10:0.1％)。注射体积是5μL。在100％ EtOH中制备样品，以实现0.5mg/mL的近似浓度。
手性HPLC方法7
在Agilent Technologies 1100/1200系列HPLC系统上进行手性HPLC分析。所用的柱为CHIRALPAK IA；250x4.6mm，5.0μm。柱流量是1.0mL/min并且流动相是：己烷:EtOH:乙醇胺(90:10:0.1％)。注射体积是5μL。在100％EtOH中制备样品，以实现0.5mg/mL的近似浓度。
制备型手性HPLC方法：
使用以下制备型手性HPLC方法之一分离阻转异构体。
制备型手性HPLC方法1
用(A)庚烷中的0.1％ DEA和(B)IPA作为流动相洗脱，用流量30mL/min和以下等度体系，使用CHIRALPAK IG SFC,21x250mm,5μm柱进行制备型手性HPLC：
时间(min) ％A ％B
0.01 94 6
50.00 94 6
制备型手性HPLC方法2
用(A)庚烷中的0.1％ DEA和(B)IPA:MeOH(90:10)作为流动相洗脱，以及流量22mL/min和以下等度体系用于洗脱，使用CHIRALPAK IG SFC柱,21x250mm,5μm进行制备型手性HPLC：
时间(min) ％A ％B
0.01 93 7
35.00 93 7
实施例1
(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2-(二甲基氨基) 乙基]苯甲酰胺
Figure BDA0004143454640000411
通过上文方案1中所示的合成路线的以下步骤1、2、3、4b和5b制备标题化合物。
步骤1：4-[4-(4-氯苯基)-4-氧亚基-丁酰基]苯甲腈(6)
Figure BDA0004143454640000421
将氯化锌(30.5g，223mmol)在真空下加热至熔融，然后冷却至室温。将甲苯(100mL)、叔丁醇(16.5mL，172mmol)和三乙胺(24mL，172mmol)加入，并将混合物在氮气氛下在室温下搅拌2小时，在此时氯化锌已完全溶解。加入4-氰基苯乙酮(25g，172mmol)和4-氯代苯甲酰甲基溴(40.2g，172mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌48小时。然后将反应混合物用乙酸乙酯(300mL)稀释并且用水(5x100mL)洗涤。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)并且在减压下蒸发。通过使用甲基叔丁基醚(400mL)研磨来纯化所得到的残余物，以提供标题化合物(30g，101mmol，59％)。
步骤2：4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲腈(7)
Figure BDA0004143454640000422
将4-(4-(4-氯苯基)-4-氧亚基丁酰基)苯甲腈(30g，101mmol)、2-三氟甲基苯胺(48.79g，303mmol)和对甲苯磺酸(1.92g，10.099mmol)在二噁烷中(300mL)的搅拌溶液在150℃下加热16小时。将反应混合物在减压下浓缩并且将所得到的残余物通过以下进行纯化：在硅胶(60-120目)的柱色谱法，使用8％乙酸乙酯/己烷作为洗脱液，以提供标题化合物(30g，71mmol，70％)。
步骤3：4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲酸(8)
Figure BDA0004143454640000423
向甲醇(20mL)中的4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲腈(2g，4.739mmol)的溶液中加入水(10mL)中的氢氧化钠(1.89g，47mmol)，并且将所得到的混合物在90℃下搅拌24小时。将混合物在减压下浓缩并且将所得到的残余物通过使用二乙醚(10mL)通过研磨进行纯化，以提供标题化合物(1.8g，4.1mmol，86％)。
步骤4b：4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)-N-(2-(二甲 基氨基)乙基)苯甲酰胺(9)
Figure BDA0004143454640000431
向4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲酸(1.8g，4.0mmol)在二甲基甲酰胺(12mL)中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(2.13mL,22mmol)，随后加入(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)(4.65g，12mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，随后逐滴加入N,N′-二甲基乙二胺(1.08g，12mmol)并且在室温下继续搅拌4小时。然后将混合物倒入冰冷的水(150mL)中并且用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并且在减压下浓缩。通过柱色谱法在中性氧化铝上用6％甲醇/二氯甲烷洗脱进行纯化所得到的残余物，以提供标题化合物(1.2g，2.3mmol，57％)作为阻转异构体的混合物。
步骤5b：分离阻转异构体
使用制备型手性HPLC方法1，通过手性HPLC拆分4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2-(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的阻转异构体。
分离出二个峰：
峰1：实例A-1，4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺-阻转异构体1(0.3g，0.58mmol，38％，>99％ee)，和：
峰2：实例A-2，4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺-阻转异构体2(0.31g，0.606mmol，39％，98％ee)。
也可以将化合物作为其盐酸盐分离。
实施例2
进一步纯化和表征阻转异构体
阻转异构体A-1：(S)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2 (二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺盐酸盐
通过以下进一步纯化来自实施例1，步骤5b的峰1(0.31g，0.606mmol)：在HPLC级水(30mL)中搅拌，随后超声处理10min并用乙酸乙酯(3x30mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤并且在减压下浓缩，随后冻干，以提供溶解于二氯甲烷(7.12mL)中的无定形固体(0.290g，0.567mmol，94％)。将所得到的溶液冷却至0℃并且加入二噁烷(1.42mL)中的4N HCl。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将混合物在高真空下浓缩和干燥。通过使用二乙醚(10mL)研磨的纯化及冻干提供了作为灰白色固体的标题化合物(0.3g，0.56mmol，98％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ10.03,(brs,1H),8.62(s,1H),7.81-7.68(m,6H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),7.10-7.03(m,4H),6.67-6.58(m,2H),3.56-3.54(m,2H),3.20-3.18(m,2H),2.76(s,6H)。LCMS(方法1)-RT 2.54,MH+512.4
阻转异构体A-2：(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2 (二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺盐酸盐
从峰2开始，使用与对于阻转异构体A-1使用的相同方法制备阻转异构体A-2的盐酸盐，以提供灰白色固体的标题化合物(0.31g，0.56mmol，99％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ9.91(brs,1H),8.69(s,1H),7.81-7.68(m,6H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),7.10-7.03(m,4H),6.67-6.58(m,2H),3.56-3.54(m,2H),3.20-3.18(m,2H),2.77(s,6H)。LCMS(方法1)-RT 2.56,MH+512.4
阻转异构体A-2的单晶X射线晶体学分析(参见下文实施例3)表明，阻转异构体A-2是R-异构体(化合物(1))并且因此阻转异构体A-1一定是S-异构体。
手性分析
通过以下进行对阻转异构体A-1和A-2的手性特性的分析：测量通过手性HPLC获得的其旋光度和其保留时间。
比旋光度方案：
仪器：Optical Activity AA-10自动旋光仪
波长：589nm
温度：23℃
池路径长度：1dm
溶剂：氯仿(Fisher，HPLC级)
浓度：1.0g/100mL
采样技术
将仪器开启并且允许稳定30min，之后使用Optical Activity石英控制板(S/N00049)检查校正。在34.16°测量在23℃下使用钠黄D线的角旋转(在无任何样品管下首次仪器调零后)。通过以下检查样品管品质：仪器调零，然后用氯仿填充样品并且检查仪器仍然读数为0.00(+/-0.02)。将仪器用氯仿空白调零就位。将样品溶解于CHCl3中(2mL中的2mg)，过滤，并且将2mL移取到池中以测量α。
从以下等式计算比旋光度：[α]Tλ＝(αx 100)/(cl)
Figure BDA0004143454640000451
阻转异构体分类
对分离的阻转异构体A-1和A-2进行稳定性研究。
为了评估阻转异构体A-1和阻转异构体A-2的互变，在40℃和80℃下监测手性稳定性。如通过下文所述的结果所示，在任一温度下加热10天时未观察到互变。
Figure BDA0004143454640000461
方案：
1.将2x1mg的纯阻转异构体溶解于密封打兰(dram)小瓶中的1mL的乙醇中。
2.将一组小瓶在40℃下加热并将另一组在80℃下加热
3.在指定的时间点，从每种储备溶液(1mL)取得20μL等分试样并且将其急冷入包含80μL己烷:乙醇80:20溶液的HPLC小瓶以提供200ppm的最终浓度，并且通过手性HPLC分析样品
4.在以下时间点：对于保持在40℃下的样品，0h、24h、48h、72h、96h和240h，以及对于保持在80℃下的样品，24h、96h和240h，使用手性HPLC方法5进行分析
分离的阻转异构体A-1和A-2的稳定性证实它们为第3类阻转异构体(LaPlante etal.,J.Med.Chem.,54:7005-7022(2011)))。
实施例3
阻转异构体A-2的X射线晶体学分析
制备阻转异构体A-2游离碱，并且单晶经受如下文所述的X射线晶体学研究。
实验：
通过从甲基异丁基酮(MIBK)中重结晶获得阻转异构体A-2的非确定形态单晶。选择合适的晶体0.19×0.13×0.04mm3，并且使用MiTiGen MicroMount，安装在配备有HyPix-6000HE检测器的Rigaku XtaLAB Syngery-S衍射仪上。在数据采集期间在稳定的T＝123(2)K下保存晶体。
使用CuKα辐射生成数据。实现的最大分辨率是
Figure BDA0004143454640000471
进行数据简化、换算和吸收校正。以Θ计74.263°时，最终数据完整度是100.00％。在波长
Figure BDA0004143454640000472
处确定的化合物的吸收系数μ为1.761mm-1。
使用CrysAlisPro软件采集及处理数据，并且使用Intrinsic Phasing解析方法以ShelXT(Sheldrick,2015)结构解析程序并且通过使用Olex2(Dolomanov et al.,2009)作为图形接口解析结构。使用最小二乘极小化，用2018/3版ShelXL-2018/3(Sheldrick,2018)修正模型。
发现晶体结构为单斜晶的并将其指定为空间群P21(#4)。
所有非氢原子均各向异性地修正。氢原子位置以几何方式计算并且使用导引(riding)模型修正。
参考文献：O.V.Dolomanov and L.J.Bourhis and R.J.Gildea andJ.A.K.Howard and H.Puschmann,Olex2:Acomplete structure solution,refinementand analysis program,J.Appl.Cryst.,(2009),42,339-341.
Sheldrick,G.M.,Crystal structure refinement with ShelXL,Acta Cryst.,(2015),C71,3-8.
Sheldrick,G.M.,ShelXT-Integrated space-group and crystal-structuredetermination,Acta Cryst.,(2015),A71,3-8。
下文表1-7中阐述研究结果。
Figure BDA0004143454640000473
Figure BDA0004143454640000481
Figure BDA0004143454640000491
Figure BDA0004143454640000501
Figure BDA0004143454640000511
Figure BDA0004143454640000521
Figure BDA0004143454640000531
Figure BDA0004143454640000532
Figure BDA0004143454640000541
Figure BDA0004143454640000551
Figure BDA0004143454640000552
Figure BDA0004143454640000561
基于下文所述的数据，认为阻转异构体A-2具有如图2和图3中所示的R构型并且可以因此命名为(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)-乙基]苯甲酰胺。
实施例4
制备和表征(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二 甲基氨基)乙基]苯甲酰胺酒石酸盐
方法1：小规模制备酒石酸盐
将阻转异构体A-2游离碱(904.2mg)悬浮于丙酮(9.042mL，10体积)中并且在25℃下搅拌40分钟。当溶液不含可见的微粒时，将它分成12个相等的等分试样(603μL)，产生每份样品60.3mg的近似活性含量。
将0.5M的酒石酸在乙醇中的溶液的247μL(1.05当量)的等分试样在25℃下加入至游离碱溶液的等分试样中。将混合物在25℃下搅拌18小时，在此时间后白色悬浮液形成，并且然后通过过滤(PTFE 10微米烧结筒)分离所得到的固体，并且在40℃下在真空中干燥约72小时。将所得到的盐标记为酒石酸盐图案A(溶剂化物)。
方法2：使用阻转异构体A-2的乙酸异丙酯溶液制备酒石酸盐
将阻转异构体A-2(749.8mg)悬浮于乙酸异丙酯(15mL，20体积)中并且将悬浮液在搅动下加热到40℃。当溶液不含可见的微粒时，将它分成12个相等的等分试样(1mL)，产生每份样品50mg的近似活性含量。将1M的阻转异构体A-2在乙醇中的溶液的195.3μL的等分试样在40℃下加入至游离碱溶液的等分试样中。将所得到的混合物按大约10℃/小时的冷却速率冷却至25℃。白色悬浮液形成，并且然后将所得到的固体通过过滤分离并在40℃下在真空中干燥约18小时。将所得到的盐标记为酒石酸盐图案B。
方法3：使用阻转异构体A-2的异丙醇溶液制备酒石酸盐
通过遵循方法2，制备酒石酸盐图案A盐，例外是阻转异构体A-2(750.1mg)最初悬浮于异丙醇(15mL，20体积)中。
方法4：使用阻转异构体A-2的2-甲基-四氢呋喃溶液制备酒石酸盐
重复方法1，例外是阻转异构体A-2(913.9mg)最初悬浮于2-甲基-四氢呋喃(15mL，20体积)，(9.139mL，10体积)中并且在25℃下搅拌约40分钟，并且然后将乙醇中的1M酒石酸的250μL(1.05当量)等分试样加入至A-2游离碱溶液的等分试样(609μL)中，以产生酒石酸盐图案A盐。
方法5：阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐的500mg规模制备
将阻转异构体A-2游离碱(521.5mg)称入玻璃小瓶并且装入乙酸异丙酯(20体积，10.430mL)。将混合物加热到40℃并且搅拌15分钟以产生澄清溶液。然后向溶液中装入溶解于3mL四氢呋喃中的酒石酸(1.05当量，162.5mg)。将所得到的混合物接种有阻转异构体A-2.酒石酸盐图案B，这造成盐在40℃下立即沉淀，形成流动悬浮液。将混合物冷却至25℃并且搅拌20小时。将所得到的固体通过过滤分离并且在40℃下在真空中干燥，以提供阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐，产率84％。
方法6：阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐(无水形式)的比例增大的制备
将阻转异构体A-2游离碱(10.0497g)称入Buchi烧瓶并且装入乙酸异丙酯(20体积，200ml)。将混合物加热到40℃以提供不含微粒的澄清溶液，并且搅拌30分钟。向溶液中装入溶解于四氢呋喃(50mL)中的酒石酸(3.1954g，1.08当量)，如下分批加入酸：40℃下15mL；接种有阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐并且搅拌30分钟；10mL并且搅拌1小时；10mL并且搅拌30分钟；15mL并且搅拌30分钟。然后将白色悬浮液按10℃/h的冷却速率冷却至室温并且搅拌18小时。将所得到的固体通过过滤在真空中分离并且用乙酸异丙酯(2x2体积)洗涤并且在40℃下在真空中干燥20小时，以提供A-2酒石酸盐图案B盐(无水)，产率97％；HPLC纯度99.74％(HPLC方法1)，手性纯度99.27％(手性HPLC方法7)。
方法7：通过从丁醇/水96:4中冷却结晶可替代地比例增加制备阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐(无水形式)
将阻转异构体A-2游离碱(36.79g)称入烧瓶并且装入丁醇(282.57ml，7.68体积)。将混合物加热到80℃(浅黄色，浑浊溶液)并且搅拌30分钟，之后澄清化入80℃预加热的Mya*容器中。然后向溶液中装入作为水中的溶液(11.77ml，初始API装入的0.32体积)的L-(+)-酒石酸(1.023当量，11.0806g)。在80℃下逐滴加入，使酸溶液澄清化。然后将混合物历经30分钟时间段冷却至68℃，接种有0.1％研磨的阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐晶种(32.6mg)并且保持1小时。然后将混合物按5℃/小时的冷却速率冷却至5℃并且在5℃下搅拌6小时，之后分离固体。将固体在真空中过滤，用丁醇洗涤两次并在过滤器上干燥15分钟，并且然后在40℃干燥20小时，以提供阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐(无水)，产率83％；HPLC纯度99.84％(HPLC方法1)，手性纯度99.66％(手性HPLC方法7)。
*注释：在要求温度控制和/或确定性加热/冷却分布曲线的前述平衡或结晶中，使用Radley’s Mya4反应站。Radley’s Mya4反应站是针对2至400mL规模混合物具有磁性搅拌能力与顶置式搅拌能力和-30至180℃的温度范围的4区反应站。通过Mya 4控制板程控所要求的反应条件。
表征阻转异构体A-2酒石酸盐
该盐作为1:1(摩尔比游离碱：酒石酸)化学计量盐的身份从其1H NMR谱确认，使用配备有自动进样器的JEOL ECX 400MHz光谱仪收集该谱。将样品溶解于合适的氘代溶剂中分析。使用Delta NMR处理和控制软件4.3版获得数据。
使用下文描述的技术，使用X射线粉末衍射(XRPD)、差示扫描量热法(DSC)、热重分析(TGA)、重量溶解度测试和重量蒸气吸附测试来表征酒石酸盐。
X射线粉末衍射(XRPD)
使用Cu Kα辐射(45kV，40mA)、θ-θ测角仪、聚焦镜、发散狭缝(1/2”)、入射束与发散束两者处的索勒(soller)狭缝(4mm)和PIXcel检测器，在PANalytical衍射仪上采集X射线粉末衍射图案。用于数据采集的软件是X’Pert数据采集器2.2f版，并且使用X’Pert数据查看器1.2d版呈现数据。使用PANalytical X’Pert PRO在环境条件下借助传输箔样品台(聚酰亚胺-Kapton，12.7μm厚度的膜)获得XRPD图案。数据采集范围是采用0.202004°s-1连续扫描速度的2.994-35°2θ。
差示扫描量热法(DSC)
在配备有45位样品固持器的PerkinElmer Pyris 6000DSC上采集DSC数据。使用经过认证的铟，对仪器验证能量和温度校正。将预定量(0.5-3.0mg)的样品置于带针孔的铝盘中并且按20℃.min-从30℃加热至350℃或如实验决定变化。在样品上方按20ml min-1维持干燥氮气吹扫。用Pyris软件v11.1.1修订版H进行仪器控制、数据采集和分析。
热重分析(TGA)
在配备有20位自动进样器的PerkinElmer Pyris 1TGA上采集TGA数据。使用经过认证的砝码和经过认证的Alumel和Perkalloy对仪器校正温度。将预定量(1-5mg)的样品加载于预去了皮重的铝坩锅上并且按20℃.min-1从环境温度加热至400℃。在样品上方按20ml.min-1维持氮气吹扫。用Pyris软件v11.1.1修订版H进行仪器控制、数据采集和分析。
重量溶解度
使用重量溶解度方案测量盐的水中溶解度。
将1ml水装入结晶管中。将固体称入去了皮重的玻璃小瓶中，分批加入至溶液中并且将小瓶在每次加入后称重直至观察到浑浊溶液为止。然后计算以mg计的量以产生以mg/ml计的溶解度。
下表8中阐述了从表征研究获得的结果。
Figure BDA0004143454640000601
重量蒸气吸附(GVS)
使用下文所述的方案，对阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐进行GVS研究：
使用由IGAsorp系统软件V6.50.48控制的Hiden Isochema水分吸附分析仪(型号IGAsorp)，获得吸附等温线。通过仪器控制装置，将样品维持在恒定温度(25℃)。通过混合干氮气流与湿氮气流控制湿度，总流量为250ml.min-1。通过测量三种校正的Rotronic盐溶液(10-50-88％)，对仪器验证相对湿度含量。通过微量天平(精确度+/-0.005mg)监测随湿度变化的样品的重量变化。将确定量的样品在环境条件下置于去了皮重的网格不锈钢篮中。完整实验周期一般由恒定温度(25℃)和0–90％范围内10％ RH间隔(每个湿度水平60分钟)时的三个扫描(吸附、解吸和吸附)组成。这种类型的实验应当展示出所研究样品在一组充分确定的湿度范围内吸收(或不吸收)水分的能力。
GVS分析(参见图9)指示第一次解吸之前约0.3％的水分含量。在80％和90％ RH之间，存在略较高的水分增加，固体吸收约0.8％水分。第二次吸收/解吸周期显示多少水分吸收完全可逆的，在0％ RH下返回至0wt％。在0％ RH和90％ RH处保持最短3小时的GVS循环后的XRPD在两种RH值处提供无水图案B。
因此可以得出结论：阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐作为稳定固体存在，仅吸收表面水分，无形式变化。
实施例5
(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙 基]苯甲酰胺酒石酸盐的另外特征
溶解度
发现阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐在水性制剂中高度可溶，使得它适合于口服递送。在水中20％w/v的(2-羟丙基)-β-环糊精的溶液中，在连续搅拌并且温和升温至40℃后，浓度达到>100mg/mL。
粉末密度
通过向50mL玻璃烧杯中装入阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐来测量堆密度。在称重前使化合物沉降(占据大约40mL体积)，并且计算堆密度。
通过将6-8mL的阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐装入到10mL量筒中来确定振实密度，随后使用橡胶垫和木槌以竖直和水平方式手动振实材料并重复振动15分钟，或直到达到不再沉降的一致的床层(bed)。然后计算振实密度。
阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐具有0.55g/mL的粉末堆密度值和～0.659g/mL的振实密度。
药物粉末的流动性以及因此它的用于以胶囊形式配制的适用性可以通过其卡尔指数(Carr’s index)和豪斯纳比(Hausner ratio)来定义，其可以从它的堆密度和振实密度根据以下公式计算：
卡尔压缩指数＝100(ρT-ρB)/ρT
豪斯纳比＝ρT/ρB
然后，卡尔指数和豪斯纳比可以转换为下表中列出的流动性描述符(来源：https://www.researchgate.net/figure/Specifications-for-Carrs-index-and-Hausner-ratio_tbl1_325365029)。
Figure BDA0004143454640000621
对于阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐，卡尔指数计算为16.5％，并且豪斯纳比计算为1.19，表明“一般的”流动性。因此，这种盐形式适用于胶囊中的粉末给药。
稳定性
使用两组储存条件，即25℃±2℃/60％ RH和40℃±2℃/75％ RH评估阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐的稳定性。稳定性方案遵循ICH指南。
因此，在25℃/60％ RH和40℃/75％ RH下，将阻转异构体A-2酒石酸盐图案B盐(每个容器1g)放入ICH额定稳定性柜中，使用以下包装部件：
-双聚乙烯袋(供应商–Armagrip；零件号G01-PB-120)，
-带螺帽封闭件的宽口HDPE瓶(供应商–Curtec；零件号4303)，
-塑料扎带(供应商–Thomas&Betts；零件号TY125-40-100)。
储存后，将这些样品从稳定性柜中取出，并通过Karl Fischer滴定(KF)分析外观、水含量，以及纯度。在六个月内，通过HPLC观察到水含量或化学纯度没有变化。在六个月内，通过HPLC观察到水含量或化学纯度没有变化。
Figure BDA0004143454640000631
实施例6
制备(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨 基)乙基]苯甲酰胺(阻转异构体A-2)的替代方法
Figure BDA0004143454640000632
通过上文方案1中所示的合成路线的以下步骤1、2、3、4a和5a制备标题化合物。在这个路线中，在羧酸中间体(8)而不是在二甲基氨基-乙基酰胺(9)上进行手性拆分。
步骤1：4-[4-(4-氯苯基)-4-氧亚基-丁酰基]苯甲腈(6)
向烧瓶中装入四氢呋喃(4mL/g)并且分批加入氯化锌(1.222g/g，1.3当量)，以提供流动的白色悬浮液，将该悬浮液搅拌15min。加入叔丁醇(0.66mL/g，1当量)，随后分批加入三乙胺(0.96mL/g，1当量)，保持温度低于40℃。将反应搅拌2h。加入4-氰基苯乙酮(1g/g，1当量)和4-氯代苯甲酰甲基溴(1.61g/g，1当量)并且将反应混合物在20℃(±5)下搅拌48h或直至反应完成为止。通过用HCl水溶液和在HCl水溶液和甲醇中的浆料来沉淀而分离产物。所得到的固体在真空下干燥(45℃)，以提供作为浅黄色固体的标题化合物。
步骤2：4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲腈(7)
向烧瓶中装入4-(4-(4-氯苯基)-4-氧亚基丁酰基)苯甲腈(1g/g，1当量)并且加入二噁烷(10mL/g)，以提供黄色悬浮液。将2-三氟甲基苯胺(1.269mL/g，3当量)按单份加入，随后加入对甲苯磺酸(0.06399g/g，0.1当量)，并且将反应混合物在101℃下加热40-72h(如果要求，每8小时加入额外份的对甲苯磺酸(0.1当量)，以推动反应完成)。将反应混合物冷却至室温并且在真空下浓缩。通过在甲醇(10mL/g)中浆化，纯化所得到的油性残余物。将固体通过过滤分离并且在真空下干燥(45℃)，以提供作为黄色固体的标题化合物。
步骤3：4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲酸(8)
向甲醇(10.9mL/g)中的4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲腈(1g/g，1当量)历经15min逐滴加入水(5mL/g)中的氢氧化钠(0.948g/g，10当量)，并且将所得到的混合物在70-76℃下搅拌18小时或直至完成为止。将反应混合物冷却至室温，酸化并且将产物通过过滤分离，用水(5mL/g)和乙腈(3mL/g)洗涤。将产物在丙酮/水(20体积，75:25)中50-55℃下浆化并在真空下干燥(60℃)，以提供作为黄色固体的标题化合物。
步骤4a：通过手性拆分(8)所得的(R)4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)- 1H-吡咯-2-基)苯甲酸(3)
向烧瓶中加入4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲酸(1g/g，1当量)，随后加入四氢呋喃(2mL/g)和乙腈(0.75mL/g)。将(S)-1-(4-甲氧基苯基)-乙胺(0.335mL/g，1当量)历经5min逐滴加入并且将所得到的反应混合物在40-50℃下搅拌15min，然后冷却至室温。加入乙腈(7.25mL/g)并将反应接种(0.0001g/g，99％ee，所需阻转异构体的(S)-1-(4-甲氧基苯基)-乙胺盐)。将反应混合物搅拌16h并将所得到的固体通过过滤分离，用乙腈洗涤。乙腈中的热(75-80℃)浆料提供作为白色固体的手性盐(40％产率，98.16％ee)。使用1M HCl(2.2当量)，在THF/水(2/2体积)中实现盐分解，以提供通过水中的浆料进一步纯化的酸，提供标题化合物(90.52g，盐分解产率97％，总产率39％，98.06％ee)。1H NMR(DMSO-d6)δ12,83(brs,1H),7.77-7.67(m,6H),7.23-7.10(m,2H),7.08-7.01(m,4H),6.68(d,J＝4.0Hz,1H),6.59-6.58(d,J＝4.0Hz,1H)。采用手性HPLC方法6的手性HPLC显示单一阻转异构体，RT 6.083min,99.02％面积(少量阻转异构体RT 7.07min，0.98％面积)。
也可以使用(S)-(-)-1-苯基乙胺实现手性拆分。
步骤5a：(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基 氨基)乙基]苯甲酰胺(1)
将4-(5-(4-氯苯基)-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯-2-基)苯甲酸(单一阻转异构体，(3))(1g/g，1当量)溶解于THF(5mL/g)中，并且逐滴加入N,N-二甲基乙二胺(0.75mL/g，3当量)，随后DIPEA(1.58mL/g，4当量)。逐滴加入THF中50％ T3P(2.72mL/g，2当量)并且将反应混合物在20℃下搅拌15min。加入额外份的THF中50％ T3P直至反应完成为止。将反应混合物用10％盐水(2mL/g)和氢氧化钠溶液(2mL/g)稀释直至pH 8-10。分离各层，并将水层用乙酸乙酯(2x5mL/g)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并且浓缩，以提供作为白色摩擦发光固体的标题化合物(80g，156mmol，71％)。采用手性HPLC方法7的手性HPLC显示单一阻转异构体，RT 12.62min，99.32％面积(少量阻转异构体，RT 10.58min，0.67％面积)
实施例7
生物活性
A.测量阻转异构体A-1和A-2对U87MG人胶质母细胞瘤癌细胞生存力的影响的测定
以下方案用来测量阻转异构体A-1和A-2对U87MG细胞生存力的影响。
将U87MG细胞在为其推荐的生长培养基/补充物(ATCC)中生长。细胞以5000个细胞/孔的浓度接种入37℃，5％ CO2的96孔板过夜。将细胞用相关浓度的测试化合物处理72小时。72h温育后，使用磺基罗丹明B(SRB)比色测定确立生存力。相对于DMSO处理的对照样品的平均值，计算生存力百分比，并且使用GraphPad Prism软件通过非线性回归(4参数逻辑斯蒂方程(logistic equation))计算出抑制细胞生长的IC50值。
下表9中显示通过遵循上述方案的阻转异构体A-1和A-2获得的IC50值。
Figure BDA0004143454640000661
B.测量阻转异构体A-1和A-2对多样性癌细胞系组的癌细胞生存力影响的测定
进行针对多样性癌细胞系的筛查以鉴定对阻转异构体A-1和A-2展示敏感性的肿瘤类型。在高通量增殖测定中使用阻转异构体A-1/A-2的稀释物筛查一组48个癌症衍生细胞系。筛查过的细胞系包括表示胰腺癌、大肠/结直肠癌、肺癌、脑癌和神经癌和淋巴瘤和白血病细胞系的那些。将细胞系用化合物的半对数系列稀释物处理并且72小时后使用CellTiter-Glo测定(Promega)分析增殖。使用非线性回归模型，通过拟合剂量-反应数据计算IC50值。下表10中显示阻转异构体A-1和A-2以微摩尔计的IC50值。
Figure BDA0004143454640000662
Figure BDA0004143454640000671
如从数据可以看出，针对所有细胞系，阻转异构体A-2是比阻转异构体A-1显著更高活性的细胞生长抑制剂
C.测量阻转异构体A-2对有丝分裂中的细胞的影响的测定
已知抑制PLK1和PLK4通过其PBD与其伴侣结合的能力导致细胞停滞在有丝分裂中。实验上，通过免疫荧光检测磷酸化组蛋白H3(pH3)(仅存在于有丝分裂细胞中的一种标记)来评估用测试化合物处理后某时间点处于有丝分裂的细胞数，以此可以来进行测量。预期PLK1/4-PBD抑制剂引起pH3阳性细胞的剂量依赖性增加，据报道称为有丝分裂指数(MI)–在给定时间对该有丝分裂标记呈阳性的细胞百分比。
在细胞中抑制PLK1和PLK4后诱导不同的有丝分裂表型。已经证明PLK1的PBD结构域的破坏触发有丝分裂停滞，具有非分裂染色体，一种与由ATP竞争性PLK1抑制剂所诱导的单极纺锤体表型不同的表型(Hanisch et al.,2006Mol.Biol.Cell 17,448-459)。中心粒组装受PLK4控制，而抑制剂诱导因产生异常胞质分裂的中心体缺陷所致的多极纺锤体表型(Wong etal.,2015.Science 348(6239)；1155-1160)。
以下方案用来测量阻转异构体A-2对停滞处于有丝分裂中的细胞的影响并且分析表型。
有丝分裂指数和表型方案
细胞按10 000个/孔铺板在96孔板中并温育过夜。次日将DMSO中的阻转异构体A-2储液稀释于培养基中，然后以细胞上0.2％的DMSO最大最终浓度加入细胞中。将细胞与化合物一起温育24小时，然后在3.7％甲醛中固定。将细胞用0.1％ Triton X-100透化，然后与抗磷酸组蛋白H3(Ser10)抗体(Abcam ab5176)一起温育。将细胞用PBS洗涤，然后与AlexaFluor 488标记的山羊抗兔IgG(Invitrogen A11034)在4ug/ml Hoechst 33342(Invitrogen H3570)存在下一起温育。将细胞在PBS中洗涤，然后在Arrayscan VTi HCS仪器(Thermo Fisher)上使用Target Activation V4 Bioapplication成像。应用用户定义的阈值以基于磷酸-组蛋白H3染色的强度鉴定有丝分裂细胞。
使用对数[抑制剂]对比响应变量斜率，采用最小二乘拟合及无约束条件，GraphPad Prism用来绘制针对化合物浓度的％有丝分裂细胞。
从通过遵循上述方案所获得的结果，对于阻转异构体A-2，获得针对HeLa和U87MG细胞系的EC50值及有丝分裂中的细胞的百分比。下表11中显示EC50值。
Figure BDA0004143454640000691
在单独研究中，对于阻转异构体A-1和阻转异构体A-2中的每一种，遵循上述方案但是使用单一化合物浓度0.03μM，对于A-1和A-2中的每一种，手工评估U87MG细胞中观察到的有丝分裂表型的频率并且将其分类为以下表型：非分裂染色体、多极纺锤体/异常胞质分裂、单极纺锤体、正常前中期、正常中期。图10中显示结果。
图10中呈现的结果显示，阻转异构体A-2具有的扰乱正常有丝分裂的作用比阻转异构体A-1大得多。因此，用A-1，76％细胞显示正常的有丝分裂表型，与用DMSO对照处理的细胞的77％相当，并且与用DMSO对照处理的23％细胞相比，24％细胞显示异常胞质分裂。在DMSO对照或阻转异构体A-1处理的细胞中未见非分裂染色体表型的证据。相比之下，用更有活性的阻转异构体A-2处理细胞仅导致17％的细胞具有正常有丝分裂表型，70％的细胞具有异常胞质分裂并且13％的细胞具有非分裂染色体。这些表型与有丝分裂期间扰乱PLK1和PLK4活性一致。
D.测量阻转异构体A-2对中心体影响的测定
上文研究C的结果显示，阻转异构体A-2造成作为中心体功能失调特征的有丝分裂影响。因此进一步研究A-2对中心体功能的影响。将稳定表达中心体蛋白1-GFP融合蛋白的HeLa细胞接种在96孔板中过夜。将细胞用阻转异构体A-2(DMSO中浓度0.02μM)或DMSO对照处理72小时并且然后使用荧光显微镜成像。对每种处理条件捕获多个细胞视野，并且随后手工分析图像。中心体蛋白1-GFP将中心粒特异性标记为离散焦点，并且因此可以用来定量每个细胞的中心粒数目。因此，对于每种处理条件，分析100个细胞并且记录每个细胞中存在的中心粒的数目。然后将数据分成多个箱(无中心粒、1个中心粒、2个中心粒和大于2个中心粒)并且显示在图11中。
可以从数据得出结论：阻转异构体A-2对HeLa细胞显示出PLK4抑制表型的证据。
E.测量阻转异构体A-2对野生型与KRAS HeLa细胞生存力的影响的测定
进行了测定以比较阻转异构体A-2对野生型HeLa细胞和携带KRAS致癌基因的HeLa细胞的影响。
因此，使用FLP-in/T-Rex系统(Invitrogen)在设计成可诱导表达野生型或致癌性KRasG12V转基因的HeLa细胞上测试了阻转异构体A-2。将细胞铺板，并且然后用或不用多西环素(doxycycline)处理细胞以诱导转基因表达，并且然后用连续稀释的阻转异构体A-2处理。温育72小时后，使用细胞滴度蓝试剂(Promega)和BMG Pherastar酶标仪评估细胞生存力。使用GraphPad Prism评估了PBD对野生型或致癌性G12V KRAS细胞生存力的抑制影响。
从通过遵循上述方案获得的结果，确定阻转异构体A-2针对野生型和KRAS G12VHeLa细胞系的GI50值，并且显示在下表12中。
Figure BDA0004143454640000701
F.激酶选择性测定
本文提供的证据表明，阻转异构体A-2与PLK1和PLK4的PBD结构域结合，但不与PLK1和PLK4的催化结构域结合，并且应当显示出超过其他激酶的良好选择性。已经通过以下对此进行了研究：使用DiscoverX KinomeScreen测定，以3μM的浓度测试了阻转异构体A-2针对一组跨激酶组分布的九十七种激酶的脱靶活性。
DiscoverX KinomeScreen测定是一种定点竞争结合测定，其通过使用可以结合或捕获溶液中激酶的固体支持的对照化合物来测量化合物对激酶的结合亲和力。在不存在激酶-抑制剂测试化合物下，所有激酶将与固体支持物结合。如果将激酶-抑制剂测试化合物加入至测定混合物中，则与固体支持物结合的激酶的量将减少，减少程度依赖于测试化合物作为激酶抑制剂的效价。测试化合物针对激酶的效价可以表述为在给定浓度的测试化合物下与固体支持物结合的激酶的百分比(对照百分比)，百分比越低，测试化合物的激酶结合能力越强。因此，100％的对照值百分比将表明测试化合物根本不与激酶结合，因为所有激酶均与固体支持物结合。反过来，0％的对照值百分比将表明测试化合物已经结合所有激酶，因为没有激酶与固体支持物结合。
方案：
对于大部分测定，将激酶标记的T7噬菌体株在源自BL21菌株的大肠杆菌(E.coli)宿主中按24孔块平行生长。
大肠杆菌生长至对数期，并且将其用来自冷冻储液的T7噬菌体感染(感染复数＝0.4)，并且在32℃下振摇温育直到细胞裂解(90-150分钟)。将裂解物离心(6,000x g)和过滤(0.2μm)，以去除细胞碎片。剩余激酶在HEK-293细胞中产生，并且随后用DNA标记用于qPCR检测。将链霉亲和素-包衣的磁珠用生化素化的小分子配体在室温下处理30分钟，以产生用于激酶测定的亲和树脂。将配体处理的珠用过量的生物素封闭并用封闭缓冲液(SeaBlock(Pierce)，1％BSA，0.05％Tween 20，1mM DTT)洗涤，以去除未结合的配体并减少非特异性噬菌体结合。通过将激酶、配体处理的亲和珠以及测试化合物在1x结合缓冲液(20％SeaBlock，0.17x PBS，0.05％Tween 20，6mM DTT)中进行合并来组装结合反应。将测试化合物在100％DMSO中制备为40x储液并且直接稀释到测定中。所有反应均在聚丙烯384孔板中按最终体积0.02ml进行。将测定板在振摇下室温温育1小时，并且将亲和珠用洗涤缓冲液(1x PBS，0.05％ Tween 20)洗涤。然后将珠重新悬浮于洗脱缓冲液(1x PBS，0.05％Tween 20，0.5μM非生物素化的亲和配体)中并且在振摇下室温温育30分钟。通过qPCR测量洗脱物中的激酶浓度。
结合激酶活性位点并且直接(空间上)或间接(变构)阻止激酶与固定化配体结合的化合物将减少固体支持物上捕获的激酶的量。反过来，不结合激酶的测试分子不影响固体支持物上捕获的激酶的量。
测试分子与激酶结合的强度可以表述为对照百分比(％对照)
对照百分比(％对照)
以3000nM浓度筛查一种或多种化合物，并且将初步筛查结合相互作用的结果报告为‘％对照’，其中较小数值指示以下一个或多个页上基质中更强的命中。
％对照计算
Figure BDA0004143454640000721
阴性对照＝DMSO(100％对照)
阳性对照＝对照化合物(0％C对照)
下表13中阐述了阻转异构体A-2针对激酶组的％对照值。
Figure BDA0004143454640000722
Figure BDA0004143454640000731
针对九十七种激酶的结果显示，阻转异构体A-2对广泛的激酶具有差或不存在的结合活性并且因此不大可能遭遇与脱靶激酶抑制相关的问题。
在PLK1和PLK4的情况下，阻转异构体A-2对这些激酶的催化结构域显示少许结合亲和力或不显示结合亲和力(对照值％分别是97％和100％)。因此得出结论，指示上文实施例中展示的PLK1/PLK4抑制活性的活性特征是PLK1和PLK4的非催化性polo盒结构域的结果。
G.确定小鼠PK中的口服生物利用度和脑暴露
在体内小鼠模型中评估阻转异构体A-2，以确定p.o.和i.v.给药后的脑浓度和血浆浓度。
遵循以下方案：
将雄性CD-1小鼠用阻转异构体A-2，
通过i.v.给药(2mg/kg)或通过p.o.给药(10mg/kg)来给药。
在2、10、30min、1、2、4、8和24(对于i.v)在i.v.腿中取得八份样品用于分析，并且在15、30min、1、2、4、8、24、48和72h在p.o.腿中取得9份样品。
阻转异构体A-2在10％ DMSO/95％羟丙基-β-环糊精(水中20％w/v)中配制用于i.v.和p.o.给药。N＝3只小鼠/时间点。
给药后，末梢血样品取自各只动物并递送入包含抗凝剂(EDTA)的标记的聚丙烯管中。完成群组中所有动物采样的同时，将样品保留在湿冰上最长30min。将血液样品离心以取得血浆(4℃，21100g，5min)并且将所得到的血浆转移入标记的相应管中。将末端脑从每只PO给药的动物切下，用盐水冲洗并且置于预称重的标记聚丙烯管中，并且样品在储存之前再次称重。
使用液相色谱法–质谱法进行定量生物分析。下表14和15及图12和13中显示结果。
口服生物利用度
Figure BDA0004143454640000741
Figure BDA0004143454640000742
结果显示在小鼠中口服给药后，阻转异构体A-2被高度吸收。
脑暴露
Figure BDA0004143454640000751
表16中呈现的脑暴露研究的结果显示，在小鼠中口服给药后，阻转异构体A-2具有高的脑暴露，AUC B:P比率为3.3。
H.体内功效
当皮下和原位植入肿瘤时，阻转异构体A-2在胶质母细胞瘤小鼠模型中显出功效，如通过下文描述的研究所示。
(i)U87MG皮下异种移植模型中的体内抗癌活性
在第1、第4和第7天给予携带U87MG肿瘤的雄性无胸腺裸鼠100mg/kg口服剂量的阻转异构体A-2并且测量肿瘤体积20天。还测量了仅在相同时间点接受载体的荷瘤小鼠对照组的肿瘤体积。处理组显示与对照相比，肿瘤体积显著地减少(在第13天3.85％T/C)，如图14中所示。
(ii)U87-Luc原位异种移植模型中的体内抗癌活性
U87-Luc细胞按脑内方式植入雄性无胸腺裸鼠的脑中并且通过生物发光信号监测肿瘤生长。在处理组中，在第1、第4、第7、第10和第13天给予动物100mg/kg口服剂量的阻转异构体A-2。仅给予对照组动物载体。图15中显示的结果表明，在第15天，处理组的肿瘤信号对比对照组下降。
(iii)携带HCT116肿瘤的小鼠中的体内抗癌活性
阻转异构体A-2已经在KRAS突变的结直肠癌模型中显示功效，如下文描述。
在第1、第8和第15天给予携带HCT116异种移植肿瘤的雄性无胸腺裸鼠100mg/kg口服剂量的阻转异构体A-2并且测量肿瘤体积3周。还测量了仅在相同时间点接受载体的荷瘤小鼠对照组的肿瘤体积。
图16中所示的结果表明，在第20天显著影响肿瘤生长(TGI 60％)。
药物制剂
(i)片剂制剂
通过将50mg化合物与作为稀释剂的197mg乳糖(BP)和作为润滑剂的3mg硬脂酸镁混合并以已知方式压缩以形成片剂，制备了包含根据实施方式1.1至1.19中任一项或上述实施例所述的酒石酸盐或物质组合物的片剂组合物。
(ii)胶囊制剂
通过将100mg的根据实施方式1.1至1.19中任一项或上述实施例所述的酒石酸盐或物质组合物与100mg的乳糖混合并将所得到的混合物填充到标准的不透明的硬明胶胶囊中来制备胶囊制剂。
(iii)注射制剂I
可以通过将根据实施方式1.1至1.19中任一项或上述实施例所述的酒石酸盐或物质组合物溶解在包含10％丙二醇的水中以得到按重量计1.5％的活性化合物的浓度来制备用于注射给药的肠胃外组合物。然后将溶液通过过滤灭菌，装入安瓿瓶并密封。
(iv)注射制剂II
通过将根据实施方式1.1至1.19中任一项或上述实施例所述的酒石酸盐或物质组合物(2mg/ml)和甘露糖醇(50mg/ml)溶解在水中，无菌过滤该溶液并装入可密封的1ml小瓶或安瓿瓶来制备注射用肠胃外组合物。
(v)注射制剂III
可以通过将根据实施方式1.1至1.19中任一项或上述实施例所述的物质组合物以20mg/ml溶解在水中来制备通过注射或输注i.v.递送的制剂。然后将小瓶密封并通过高压灭菌来灭菌。
(vi)注射制剂IV
可以通过将根据实施方式1.1至1.19中任一项或上述实施例所述的物质组合物以20mg/ml溶解在包含缓冲剂(例如0.2M乙酸盐pH 4.6)的水中来制备通过注射或输注i.v.递送的制剂。然后将小瓶密封并通过高压灭菌来灭菌。
(vii)皮下注射制剂
通过将根据实施方式1.1至1.19中任一项或上述实施例所述的物质组合物与药用级玉米油混合以得到5mg/ml的浓度来制备用于皮下给药的组合物。将组合物灭菌并填充到合适的容器中。
(viii)冻干制剂
将配制的根据实施方式1.1至1.19中任一项或上述实施例所述的物质组合物的等分试样置入50ml小瓶中并冻干。在冻干期间，使用一步冷冻方案将组合物在(-45℃)下冷冻。将温度升高到–10℃进行退火，然后降低到–45℃冷冻，然后在+25℃下进行初级干燥约3400分钟，然后如果温度达到50℃，则增加步骤进行二级干燥。初级和二级干燥期间的压力设定为80毫托。
等同物
呈现前述实施例是为了说明本发明的目的，而不应解释为对本发明的范围施加任何限制。显而易见的是，在不脱离本发明基础原理的前提下，可以对上述本发明的特定实施方式进行许多修改和替代，并在实施例中进行说明。所有这样的修改和替代都旨在涵盖在本申请中。

Claims (16)

1.(R)-4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2-(二甲基氨基)-乙基]苯甲酰胺(+)-L-酒石酸盐，具有大约1:1的酸和碱之间的摩尔比。
2.具有式(2)的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的(+)-L-酒石酸盐：
Figure FDA0004143454630000011
3.4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的(+)-L-酒石酸盐，其中存在大约1:1的酸和碱之间的摩尔比并且其中所述4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]-苯甲酰胺呈单一阻转异构体形式。
4.根据权利要求3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述单一阻转异构体是式(1)的阻转异构体。
5.根据权利要求3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述单一阻转异构体是4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的R阻转异构体。
6.根据权利要求3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述单一阻转异构体是本文实例中所述的阻转异构体A-2。
7.根据权利要求3所述的(+)-L-酒石酸盐，其中所述(+)-L-酒石酸盐是本文实例中所述的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的(+)-L-酒石酸盐，其呈结晶形式。
9.根据权利要求8所述的(+)-L-酒石酸盐，其是无水物。
10.根据权利要求9所述的(+)-L-酒石酸盐，其是本文作为图案B鉴定的无水物。
11.一种物质组合物，包括根据权利要求1至10中任一项所述的(+)-L-酒石酸盐，其中(a)所述单一阻转异构体是存在于所述组合物中的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的唯一阻转异构体或(b)相对于所述单一阻转异构体，存在按摩尔量计小于10％的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的任何其他阻转异构体。
12.根据权利要求11所述的物质组合物，其中(a)所述单一阻转异构体是存在于所述组合物中的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的唯一阻转异构体或(b)相对于所述单一阻转异构体，存在按摩尔量计小于0.1％的4-[5-(4-氯苯基)-1-[2-(三氟甲基)-苯基]吡咯-2-基]-N-[2(二甲基氨基)乙基]苯甲酰胺的任何其他阻转异构体。
13.一种药物组合物，包括根据权利要求1至10中任一项所限定的(+)-L-酒石酸盐或根据权利要求11和12中任一项所述的物质组合物，以及药学上可接受的赋形剂。
14.根据权利要求1至10中任一项所限定的(+)-L-酒石酸盐或根据权利要求11和12中任一项所述的物质组合物，用于治疗癌症，例如在本文实施方式3.4至3.16中任一项所述的癌症的用途。
15.一种药物组合，包括根据权利要求1至12中任一项所述的酒石酸盐或物质组合物，以及另一种治疗性活性剂。
16.本文实施方式1.1至1.19、2.1至2.5、3.1至3.34、4.1至4.12和5.1至5.6中任一项所限定的发明。
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