CN116003611A - 抗tmprss2抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗TMPRSS2抗体及其用途，所述抗体为单克隆抗体，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，或重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。该抗体能有效中和TMPRSS2的切割作用，进而抑制基于新冠病毒S蛋白与其受体ACE2介导的细胞融合，有望用于预防和治疗因新冠病毒感染引起的肺炎重症病人，对于疫情的防控和治疗起到积极的作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，具体地，涉及一种抗TMPRSS2抗体及其用途。
背景技术
根据研究分析，新冠病毒主要通过衣壳表面的S蛋白与细胞表面的ACE2受体结合来进入靶细胞。S蛋白包含两个亚单位S1和S2，其中S1包含受体结合结构域RBD，用于与ACE2受体结合，S2则含有参与膜融合的功能元素，用于驱动病毒与细胞膜融合。新冠病毒S蛋白的一个显著特征是它可以包含多个蛋白酶切割位点，其中第一个确定的切割位点位于S1/S2边界，另一个在假定融合肽的上游S2内，称为S2'。
跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serines 2，TMPRSS2)基因位于人类21号染色体上，是一种可切割ACE2和S蛋白的细胞表面蛋白酶，利用TMPRSS2在S1/S2和S2'位点进行蛋白质切割，可以促进病毒附着到靶细胞表面。
德国哥廷根大学Stefan Phlmann、Markus Hoffmann等研究人员在Cell上联合发表了题为“SARS-CoV-2Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by aClinically Proven Protease Inhibitor”的研究论文，证明TMPRSS2在新冠病毒的入侵过程中确实发挥了“助攻”作用：TMPRSS2通过激活病毒的S蛋白，为SARS-CoV-2进入人体细胞提供便利，在ACE2受体和TMPRSS2的联合作用下，SARS-CoV-2更容易入侵宿主。据此可以推断，TMPRSS2作为抗新冠病毒干预的潜在靶标具有重要意义。
现阶段，业内暂未见到以TMPRSS2为靶点的抗体类药物，而已上市的TMPRSS2抑制剂均为小分子药物，主要适应症为抗病毒且二者的作用机理也完全不同。本发明申请人希望能基于TMPRSS2开发出一种广谱性的治疗药物，将成为遏制COVID-19大流行的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗TMPRSS2的单克隆抗体及其制备方法和相关用途，并提供编码该单克隆抗体的核苷酸、载体、宿主细胞及相关用途。由本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子，作为药物用于临床上发挥预防和治疗由冠状病毒感染引起的疾病的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种抗TMPRSS2抗体，所述抗体为单克隆抗体且用于结合人TMPRSS2；
所述人TMPRSS2的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，编码人TMPRSS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
11)所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；或
12)所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；或
13)11)或12)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与11)或12)所述氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
所述功能为中和TMPRSS2对冠状病毒S蛋白的切割作用或抑制冠状病毒与靶细胞融合。所述多个为两个、三个、四个或更多。
或
14)与11)、12)或13)所示氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体的重链为IgG1型；所述抗体的轻链为λ型。
本发明还提供了编码所述抗TMPRSS2抗体的核苷酸。
在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸包括
41)如SEQ ID NO:5所示的重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区的核苷酸序列；或
42)如SEQ ID NO:9所示的重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区的核苷酸序列；或
43)与41)或42)所述核苷酸序列编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的核苷酸序列；或
44)与41)、42)或43)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；或
45)41)、42)、43)或44)所述核苷酸序列的互补序列。
本发明提供一种表达载体，包括编码所述抗TMPRSS2抗体的核苷酸。
在此基础上，本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。
本发明提供了一种抗原，包括如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中至少一项所示的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗原包括如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中所示的全部氨基酸序列。
本发明还提供了所述抗TMPRSS2抗体的制备方法，包括：培养所述宿主细胞，诱导抗TMPRSS2抗体的表达。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1、用所述抗原免疫小鼠后，获得小鼠的B细胞；
步骤2、融合所述B细胞和骨髓瘤细胞，筛选能够与人TMPRSS2结合的杂交瘤细胞株，经体外培养，制得抗TMPRSS2抗体。
在此基础上，本发明还提供产生所述抗TMPRSS2抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还提供了所述抗TMPRSS2抗体经化学标记或生物标记制得的结合物。
所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
本发明还提供了所述抗TMPRSS2抗体或其结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。
所述固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。
本发明还提供了所述抗TMPRSS2抗体或其结合物或其偶联物在制备预防和/或治疗因新冠病毒感染引起的肺炎药物中的应用。
进一步地，本发明还提供了药物，包括所述抗TMPRSS2抗体或所述结合物或所述偶联物以及药学上可接受的辅料。
本发明还提供了所述抗TMPRSS2抗体或其结合物或其偶联物在制备检测TMPRSS2表达的产品中的应用。
进一步地，本发明还提供了试剂盒，包括所述抗TMPRSS2抗体或所述结合物或所述偶联物以及可接受的助剂。所述助剂包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液和显色液中的至少一种。
本发明还提供了所述抗TMPRSS2抗体或其结合物或其偶联物在制备阻断TMPRSS2结合的产品中的应用。
本发明还提供了所述抗TMPRSS2抗体或其结合物或其偶联物在制备抑制因新冠病毒S蛋白感染引起的细胞融合的产品中的应用。
需注意的是，除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。如：
“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。
抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。
“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。
“鼠源抗体”为根据本领域知识和技能制备的结合人TMPRSS2的单克隆抗体，制备时用人TMPRSS2多肽注射试验对象，然后分离具有所需序列或功能性的抗体的杂交瘤。在本公开一个实例方案中，所述的鼠源TMPRSS2抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或变体的轻链恒定区，和/或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
“载体”是指能够运输已与其链接的另一个核酸分子。在一个具体的实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段链接至其中的环状双链DNA环。在另一个具体的实施方案中，载体是病毒载体，其将另外的DNA区段链接至病毒基因组中。本发明中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如非附加型哺乳动物载体)。
“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和毕赤酵母(Pichiapastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
本发明中提到的序列“同源性”或“同一性”或“一致性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个序列中的位置具备相同残基的氨基酸单位亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是指两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数再乘以100的函数。例如，在序列最佳比时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配数或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源，或者说两序列具有95％同一性，或具有95％一致性。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本发明提供的技术方案至少具有如下有益效果：
SARS-CoV-2入侵细胞分为两个阶段：①病毒表面S蛋白结合细胞膜表面ACE2蛋白；②TMPRSS2切割S蛋白并促进病毒融入细胞。本发明提供的单克隆抗体能够结合人TMPRSS2，减少TMPRSS2对新冠病毒的S蛋白的切割作用，进而有效抑制细胞融合，发挥抗病毒的作用。通过应用本发明提供的抗TMPRSS2抗体，可有望预防中重度感染及治疗重症病人，对于疫情的防控和治疗起到积极的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定。
图1为阳性抗体SDS-PAGE图；泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：阳性抗体非还原性条带；泳道2：阳性抗体还原性条带；
图2(a)为免疫肽段TM1-1亲水指数分析图；
图2(b)为免疫肽段TM2-1亲水指数分析图；
图2(c)为免疫肽段TM3-1亲水指数分析图；
图3为融合第一次筛选OD450值与样品个数分布图；
图4为抗体抑制HEK 293-Spike细胞和HEK 293-ACE2-TMPRSS2细胞融合的结果图，从左往右各柱形分别代表阴性细胞组、阴性对照组、hIgG、阳性对照ACE2-FC、抗体1.152.37和抗体1.333.25；柱子上方的数字为抑制率，计算公式为(1-样品组融合率/不加抗体组融合率)×100％；
图5为抗体1.152.37和1.333.25与重组TMPRSS2蛋白亲和力曲线图；
图6为总RNA琼脂糖凝胶电泳检测；泳道M：DL2000分子量标记；泳道1：P085-1.333.25总RNA电泳条带；泳道2：P085-1.152.37总RNA电泳条带；
图7为P085-1.333.25PCR扩增候选抗体重链可变区和轻链可变区琼脂糖凝胶电泳检测；泳道M：DL2000分子量标记；泳道1：P085-1.333.25重链可变区PCR产物电泳条带；泳道2：P085-1.333.25轻链可变区PCR产物电泳条带；
图8为P085-1.152.37PCR扩增候选抗体重链可变区和轻链可变区琼脂糖凝胶电泳检测；泳道M：DL2000分子量标记；泳道1：P085-1.152.37重链可变区PCR产物电泳条带；泳道2：P085-1.152.37轻链可变区PCR产物电泳条带。
具体实施方式
本发明公开抗TMPRSS2抗体及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了抗TMPRSS2抗体的可变区的氨基酸序列，可经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得新的氨基酸序列，且具有与本发明提供的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。或者与公开序列至少有80％同源性的氨基酸序列可作为替代方案。
本发明提供了抗TMPRSS2抗体的可变区的核苷酸序列，其互补序列或因遗传密码的简并性而与本发明公开核苷酸序列不同，但编码相同蛋白的序列，或与本发明公开序列至少有80％同源性的序列可作为替代方案。
本发明提供了抗TMPRSS2抗体的可变区的核苷酸序列，经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与本发明公开核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列可作为替代方案。
本发明提供了抗TMPRSS2抗体的可变区的氨基酸序列及核苷酸序列，在此基础上可以产生基因工程抗体，其所含的重链和轻链可变区序列与本发明公开的可变区序列是一致的。该基因工程抗体包括但不限于：抗体的功能性片段Fab，或者是单链抗体，或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH-L，或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段，或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。
本发明提供的抗TMPRSS2抗体及其制备方法和应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1抗原蛋白及阳性对照抗体的制备
1、阳性抗体瞬时转染表达载体的构建
参考US2019/0300625A1专利中抗TMPRSS2抗体HIH7017N序列，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。合成对应的DNA，构建表达载体，制备含有重链表达载体pGS003-HIH7017N VH-hIgG1CH的Top10F’菌种和含有轻链表达载体pGS003-HIH7017N VL-hIgKCL的Top10F’菌种。分别将轻、重链表达质粒菌种接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时。使用Zymo Research的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，获得纯度较高的质粒DNA。
2、在哺乳动物细胞293E中的转染、表达和检测
将上述重链表达载体和轻链表达载体进行300mL 293E体系的瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×106细胞/mL的293E细胞300mL，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μL的293fectin加入到5.7mL的OPtiMEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将重链和轻链表达质粒各150μg使用OPtiMEM稀释至6mL。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养7天。
3、抗体的纯化及检测
取2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，用Octet检测上清中抗体表达量，并进行SDS-PAGE检测。
将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后过MabSelect SuRe亲和层析柱(GE)，20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性。利用4～20％梯度胶(金斯瑞公司)对纯化抗体进行还原及非还原SDS-PAGE检测，结果见图1。
实施例2实验用细胞系构建
1、HEK293-Spike(D614G)细胞系构建
通过基因工程技术将2019-nCoV病毒S蛋白(NP No:YP_009724390.1)基因序列，氨基酸序列见SEQ ID NO:13，核苷酸序列见SEQ ID NO:14，基因合成核酸序列，并构建到含有Neo筛选标记的慢病毒包装载体pLVX上，通过病毒包装获得携带目的基因的重组慢病毒，并感染宿主细胞HEK293，利用HygB加压筛选，对恢复的HEK293-Spike抗性细胞库进行单克隆分选得到能够稳定表达目的蛋白的稳转细胞系HEK293-Spike。
2、HEK293-ACE2-hTMPRSS2细胞系构建
通过基因工程技术分别将人TMPRSS2蛋白(uniprot：O15393)基因序列，氨基酸序列见SEQ ID NO:15，核苷酸序列见SEQ ID NO:16，基因合成核酸序列，并构建到含有HygB筛选标记的慢病毒包装载体pLVX上，通过病毒包装获得携带目的基因的重组慢病毒，并感染购买的过表达人ACE2的HEK293-ACE2宿主细胞系，利用HygB加压筛选，对恢复的HEK293-ACE2-hTMPRSS2加压细胞库进行单克隆分选，得到能够持续表达目的蛋白的稳转细胞系HEK293-ACE2-hTMPRSS2。
3、N2a-hTMPRSS2稳转细胞系构建
通过基因工程技术将人TMPRSS2蛋白(uniprot：O15393)基因序列，氨基酸序列见SEQ ID NO:15，核苷酸序列见SEQ ID NO:16，基因合成核酸序列，并构建到含有HygB标签的慢病毒包装载体pLVX上，通过病毒包装获得携带目的基因的重组慢病毒，并感染宿主细胞N2a细胞系，利用HygB加压筛选，将恢复的N2a-hTMPRSS2抗性细胞库进行单克隆分选得到能够持续表达目的蛋白的稳转细胞系N2a-hTMPRSS2。
实施例3抗原多肽分析设计
根据MODELER软件构建TMPRSS2的ECD区域的三维结构，计算分析得到催化中心HDS的溶剂可及表面积暴露百分比，HDS催化中心的侧链暴露百分比分别为：HIS296＝45.4％、ASP345＝4.1％、SER441＝23.5％。将人的TMPRSS2和小鼠的TMPRSS2胞外区的序列进行比对，分析催化中心HDS附近的保守性，选择和小鼠的对应区域差异比较大氨基酸肽段，具有更好的免疫原性。
综合以上因素，选择三个肽段作为免疫肽段，分别为TM1-1：294-AAHCVEKPLNNPWH-307、TM2-1：343-NNDIALMKLQKPLT-356、TM3-1：438-QGDSGGPLVTSKNN-451，计算每个肽段的氨基酸的亲水指数即Kyte-Doolittle Hydropathy，该值描述其支链的亲水性或疏水性程度大小的值。亲水指数越大，这种氨基酸的疏水性就越强。
最后，选择三个水溶性较好的肽段作为最终的免疫肽段，分别为：TM1-1：294-AAHCVEKPLNNPWH-307(SEQ ID NO:17)、TM2-1：343-NNDIALMKLQKPLT-356(SEQ ID NO:18)、TM3-1：438-QGDSGGPLVTSKNN-451(SEQ ID NO 19)，图2(a)～(c)分别显示了这三个肽段整体偏向亲水性，其在水溶液中具有良好的稳定性。
肽段的重要性质参见下表1。
表1：免疫肽段主要参数
实施例4单克隆杂交瘤的制备
1、免疫
抗TMPRSS2的单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用Balb/c小白鼠，雌性，6-8周龄(辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号：SCXX(辽)2020-0001)。饲养环境：普通级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度为20-25℃；湿度在40-60％。将以适应环境的小鼠按以下方案免疫。
抗原与佐剂的体积为1:1的比例对免疫原人TM1-1、TM2-1和TM3-1(实施例3制得)进行乳化，首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化抗原，2天后，开始第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下2点注射，每只小鼠注射的抗原的量为10μg，每个注射点注射的体积为25μL。
在第二次免疫后3天，对小鼠进行眼眶采血，取少量血液样本进行血清效价检测，经间接ELISA方法检测血清效价滴度达到1:200000或者以上后，对小鼠进行加强免疫。
共进行2组免疫，每组为5只小鼠。
2、饲养细胞和骨髓瘤细胞的准备
骨髓瘤细胞准备，提前一周复苏P3X63Ag8.653，并用含1X 8-氮鸟嘌呤的完全培养基培养，融合前两天换用15％胎牛血清的DMEM培养，维持P3X63Ag8.653的密度为70％-80％至融合当天。
3、细胞融合及HAT筛选
脾细胞的获取和制备：取加强免疫后效价最高(TM2-1免疫)的小鼠2只，分别标记为L1和L2，采集L1、L2的免疫血清后处死并浸泡于75％酒精中。剪开免疫小鼠的腹部侧面的皮肤和腹膜，取小鼠双侧腹股沟淋巴结、颈部淋巴结以及脾脏。用剪尖剔除周围结缔组织，用研磨棒研磨后，经细胞筛网过滤后制备成单细胞悬液。
细胞融合前处理：收集培养瓶内的P3X63Ag8.653，1000rpm/5min离心后弃上清，重悬后进行活细胞计数。2000rpm/5min离心脾细胞悬液，弃上清后重悬并进行活细胞计数。记录P3X63Ag8.653活细胞数，脾细胞活细胞数。
细胞融合：按B细胞:P3X63Ag8.653＝1:1.2的比例混合细胞，2000rpm/5min离心后倒净上清，震散细胞沉淀，用400μL蛋白酶后，用10mL血清终止反应。将终止反应后的细胞悬液800rpm离心5min后弃去上清，定容到合适浓度，使用排队电压70V、穿孔电压3000V进行电融合。
1/2HA培养基筛选培养基重悬鼠杂交瘤细胞：按200μL/孔将细胞悬液加到96孔细胞培养板中，置于37℃细胞培养箱中培养。培养1周后，进行第一次换液，并置于37℃细胞培养箱中培养；培养3天后，进行第二次换液。
4、阳性杂交瘤细胞株的筛选
融合后2周，取细胞上清进行ELISA实验，检测细胞上清与人TM2-1蛋白的结合情况，筛选出ELISA结果为阳性的细胞后，进行第二次人TM2-1的复测以及市售hTMPRSS2蛋白Elisa结合实验，结果如图3。取复测结果为阳性的以及与蛋白结合的细胞上清进行FACS实验，获得56株双阳性的杂交瘤细胞株，选择信号最强的6株细胞株进行亚克隆(分别标记为P085-1.333、P085-1.152、P085-1.302、P085-1.72、P085-1.234和P085-1.178)，以便获得杂交瘤单克隆株。
5、扩大培养
将ELISA和FACS检测为双阳性的6株细胞株从96孔中转入24孔中培养，待长满后转入25cm2培养瓶中培养。
6、有限稀释法亚克隆
吹打混匀阳性细胞株，并吸取少量进行活细胞计数。吸取约100个细胞加入40mL完全培养基中混匀，铺板2块；另吸取约100个细胞加入20mL完全培养基中混匀，铺板1块；另吸取约1000个细胞加入20mL完全培养基中混匀，铺板1块；共以3个不同的细胞密度铺板4块，分别为0.5细胞/孔，1细胞/孔，10细胞/孔。将96孔板置37℃5％CO2培养箱中培养。
7、克隆检测和扩大培养
取单克隆细胞孔上清进行ELISA和FACS实验，分别检测细胞克隆抗体与TM1-2的结合及与lncap细胞表面TMPRSS2蛋白的结合情况。将ELISA和FACS检测为双阳性的细胞株(共16株，分别标记为P085-1.333.10、P085-1.333.25、P085-1.333.31、P085-1.152.3、P085-1.152.21、P085-1.152.37、P085-1.302.3、P085-1.302.7、P085-1.302.37、P085-1.72.4、P085-1.72.8、P085-1.72.12、P085-1.234.9、P085-1.234.13、P085-1.234.9和P085-1.178.29)从96孔中转入24孔中培养，待长满后转入25cm2培养瓶中培养。筛选获得最佳的两株杂交瘤单克隆株1.152.37和1.333.25。
8、亚类的鉴定
包被羊抗鼠IgG(Fc)，2μg/ml，每孔50μL，4℃过夜，BSA封闭，加入1.152.37和1.333.25细胞上清，室温，2小时，加入酶标亚类二抗IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG2c，IgG3，κ，λ(abcam)，显色，450nm读数，判断所测细胞株的亚类为IgG1，λ。
在加液前每步用PBST洗涤3次。
9、细胞冻存
冻存液配制：90％胎牛血清，10％DMSO。
重悬培养瓶内细胞，细胞计数后，以1500rpm/min离心3min后弃去上清，用含10％DMSO的胎牛血清进行吹打悬浮，以每管1×107细胞数冻存于冻存盒内，-80℃过夜，次日转入液氮中。
10、单克隆杂交瘤基因保存
取阳性单克隆细胞株RNA抽提液提取RNA，并反转录成cDNA，于-80℃永久保存。
实施例5单克隆抗体制备及鉴定
1、采用体外培养法制备抗体
对实施例4制得的杂交瘤细胞株进行复苏，方法为将含有10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基复苏并使用小瓶培养，待细胞汇合度约90％后，进行传代扩培，扩培至细胞培养上清共约200mL。
2、抗体纯化
收集培养约7天左右的细胞上清，测量体积(约200mL)，加入NaCl使上清中NaCl为2.5M，经0.22μm混合纤维素微孔滤膜真空过滤后，4℃保存，ProteinA亲和层析进行抗体纯化。
上样：含2.5M NaCl的细胞培养上清经0.22μm虑膜过滤后浓缩至30mL后直接上样；
流洗：pH7.42.5M PBS流洗，冲至UV280基线为0；
洗脱：pH3.50.1M柠檬酸溶液，每段2mL收集洗脱液，每管加入100μL 1M Tris溶液；
浓缩收集液，使用PBS洗脱至初始成分比例小于0.1％。
实施例6单克隆抗体体外抑制细胞融合
复苏培养过表达SARS-COVID-2Spike(S)蛋白的细胞以及过表达人ACE2蛋白的细胞，收集对数生长的HEK 293、HEK 293-Spike和HEK 293-ACE2-TMPRSS2细胞，DPBS清洗后，用PKH26染料染色HEK 293-ACE2-TMPRSS2细胞(5μM、8min)，清洗后条件培养基(DMEM+80ng/mLTrypsin)重悬细胞，以1万细胞/孔、25μL/孔接种于96孔培养板中；1.152.37抗体、1.333.25抗体、ACE2-Fc融合蛋白、hIgG抗体用条件培养基稀释至100μg/ml(终浓度50μg/ml)，50μL/孔加入HEK 293-ACE2-TMPRSS2细胞板中共孵育30min。然后用Dio染料对HEK293、HEK 293-Spike进行染色(10μM、10min)，清洗后用条件培养基重悬细胞，以1万细胞/孔、25μL/孔接种于HEK 293-ACE2-TMPRSS2细胞板中。培养4小时后，高内涵进行细胞成像后，通过计算100个总细胞中，HEK 293-Spike与HEK 293-ACE2-TMPRSS2融合细胞占比，即细胞融合指数，来定量分析抗体抑制细胞融合的优劣，如图4所示。结果参见下表2。
表2：1.152.37、1.333.25抗体细胞融合抑制率
| 抗体名称 | 细胞融合抑制率 |
| 1.152.37 | 18.44％ |
| 1.333.25 | 22.79％ |
| 阳性对照(ACE2-Fc) | 48.69％ |
| 阴性对照 | 0 |
实施例7单克隆抗体亲和力测定ELISA检测
包被：TMPRSS2 Recombinant Protein用CBS稀释成0.4μg/mL，加至酶标板96孔中，每孔100μL，4℃下孵育过夜；
封闭：洗板三次后用2％Milk/1X PBS封闭，每孔200μL，室温条件下孵育1小时；
加候选抗体：洗板3次后，加入候选抗体或阳性对照或阴性对照。每孔100μL，室温条件下孵育2小时；
加二抗：洗板3次后，加入山羊抗小鼠IgG Fc，HRP(1:5000)，每孔100μL，室温条件下孵育1小时；
显色：洗板6次后，加TMB显色液，每孔100μL，室温下避光显色10分钟；
终止：直接加入100μL每孔的终止液终止反应；
检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，数据结果参见表3和图5。
表3：1.152.37、1.333.25抗体亲和力测定ELISA检测OD450值
本发明提供的单克隆抗体亲和力最低为2.234nmol/L。
实施例8单克隆抗体基因测序
经免疫、融合及单克隆化后，通过ELISA、FACS以及抑制细胞融合实验结果选取P085-1.333.25和P085-1.152.37单克隆抗体细胞株分别进行总RNA提取，并反转录成cDNA，然后以cDNA为模板PCR扩增抗体的重链可变区和轻链可变区。
首先采用Invitrogen公司的TRIzol reagent试剂盒(15596-026)，按照其说明书进行P085-1.333.25和P085-1.152.37单克隆抗体细胞株总RNA提取，结果见图6。
接着采用Takara公司的5’RACE FULL试剂盒(D315)，以总RNA为模板，试剂盒中的随机引物进行反转录为第一链cDNA，然后重链以恒定区设计引物mIgGR(5’-CTCAGGGAARTARCCYTTGAC-3’)和试剂盒中的接头引物进行PCR扩增，轻链以恒定区设计引物mIgLR(5’-TTCAGAGGAAGGTGGAAACA-3’)和试剂盒中的接头引物进行PCR扩增，扩增结果见图7和图8。
琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段进行TA克隆后挑单克隆进行PCR鉴定，鉴定引物为pLB-F(5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGTC-3’)和pLB-R(5’-AAGAACATCGCTTTTCGATGGCAG-3’)，鉴定正确菌株中选取部分样品送至生工生物工程股份有限公司测序。最终确定P085-1.333.25重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:6；重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8；P085-1.152.37重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:10；重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:11，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本申请的权利要求和说明书的范围当中。尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本申请并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (10)
1.一种抗TMPRSS2抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体且用于结合人TMPRSS2；
11)所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；或
12)所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；或
13)11)或12)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与11)或12)所述氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
14)与11)、12)或13)所示氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗TMPRSS2抗体，其特征在于，所述抗体的重链为IgG1型；所述抗体的轻链为λ型。
3.编码如权利要求1～2任一项所述的抗TMPRSS2抗体的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的核苷酸，其特征在于，包括
41)如SEQ ID NO:5所示的重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区的核苷酸序列；或
42)如SEQ ID NO:9所示的重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区的核苷酸序列；或
43)与41)或42)所述核苷酸序列编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的核苷酸序列；或
44)与41)、42)或43)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；或
45)41)、42)、43)或44)所述核苷酸序列的互补序列。
5.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求3～4任一项所述的核苷酸。
6.转化或转染如权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。
7.一种抗原，其特征在于，包括如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中至少一项所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1～2任一项所述的抗TMPRSS2抗体的制备方法，其特征在于，包括：培养如权利要求6所述的宿主细胞，诱导抗TMPRSS2抗体的表达。
9.根据权利要求8所述的抗TMPRSS2抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、用如权利要求7所述的抗原免疫小鼠后，获得小鼠的B细胞；
步骤2、融合所述B细胞和骨髓瘤细胞，筛选能够与人TMPRSS2结合的杂交瘤细胞株，经体外培养，制得抗TMPRSS2抗体。
10.如权利要求1～2任一项所述的抗TMPRSS2抗体在制备治疗因新冠病毒感染引起的肺炎的产品中的应用。
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