JPH02128698A - 座位特異的組換えによる生体内でのキメラ抗体産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ キメラ抗体の有用性は、広く認識されている。

最近では、キメラ抗体は、生体外法により構築される遺
伝子から調製されている。これらの方法は、例えば、Ｎ
ａｔｕｒｅ　３１２．６０４〜６０８ページ（１９８４
）に報告さられたノイバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）
　　らの仕事に例示されている。これらの方法は、一般
に、次の１）抗体Ｈ鎖を得るために選ばれる遺伝子を含
む転移プラスミドの調製、 ２）抗体り鎖を得るために選ばれる遺伝子を含む転移プ
ラスミドの調製、 ３）選ばれたハイブリドーマから可変Ｈ遺伝子（Ｖ□）
セグメントの単離、 ４）前記３）の可変Ｉ］遺伝子（ＶＨ）単離の確５）選
ばれたハイプリドーマから可変り遺伝子（ＶＬ　）の単
離、 ６）前記５）の可変り遺伝子（ＶＬ　）単離の確認、 ７）前記１）の転移プラスミドへの■イセグメントの挿
入、 ８）前記２）の転移プラスミドへの■、上セグメント挿
入、 ９）適当な受容細胞への前記７）および８）の両プラス
ミドのトランスフェクション、ならびに１０）キメラ抗
体の安定な分泌物についてのスクリーニング、を含んで
なる。

［発明が解決しようとする課題］ 前述の方法は労力集約的である。これは、生体外での抗
体遺伝子が完全に構築されることにより区別される。新
規なキメラ抗体ごとにＶＨおよび■、の両方を単離する
ことが必要である。

■、および■、遺伝子セグメントの単離同定は、この方
法で最も困難で時間のかかる工程である。

具体的には、これらの工程は全く見通しのつかない作業
を数週間から数箇月間続ける必要がある。

この非予測性と費用の必要性は、キメラ抗体をもたらす
可変遺伝子（Ｖ）セグメントの単離が非常に費用がかか
ることに起因する。このような状況下では、広（使用さ
れるキメラ抗体がほんの少し調製されるにすぎないであ
ろう。

〔課題を解決するための手段］ 前述の従来技術に伴う時間、労力および費用に対する多
くの課題は、本発明、すなわち（ａ）ＤＮＡ調節領域お
よび選択可能なマーカーと連携して操作可能な状態で、
免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖の不変部に関する遺伝子
または遺伝子セグメントおよび他の機能に関する遺伝子
または遺伝子セグメントを含んでなる遺伝子セグメント
を含むトランスフェクションプラスミドの構築工程、 （ｂ）前記プラスミド中の免疫グロブリン遺伝子または
遺伝子セグメントと少なくとも７０％のＤＮＡ配列相同
性を有するような免疫グロブリンを分泌する受容哺乳類
抗体産生細胞への該プラスミドのトランスフェクション
工程、ならびに（ｃ）前記のようなキメラ抗体を分泌す
る安定にトランスフェクションされた抗体産生細胞のス
クリーニング工程、を含んでなるキメラ抗体の産生方法
により解決される。

前記受容細胞は、ミエローマ、ハイブリドーマおよびＢ
−細胞系を含む哺乳類抗体産生細胞である。本発明に特
に有用な態様によれば、受容抗体産生哺乳類細胞は、ト
ランスフェクションプラスミドにおける免疫グロブリン
遺伝子セグメントと同一のクラスに属する免疫グロブリ
ンを産生ずるハイブリドーマ、具体的にはマウスハイブ
リドーマである。

「他の機能」は、酵素的、リガンドハインデイング性、
終止コドン、直接的なグリコシル化または免疫原性の可
変性などの機能を付加するかまたは削除する遺伝子また
は遺伝子断片の付加および／あるいは削除によって達成
される。

適当なトランスフェクションされた細胞は、培養３０日
後も生存しているものである。

「遺伝子」または「遺伝子セグメント」の語は、免疫グ
ロブリンまたは新規な機能のすべてまたは一部がトラン
スフェクションプラスミド中に付加されまたは削除され
ている状態を含む。

この生体内方法は、 ）抗体ＨまたはＬの不変部遺伝子セグメントおよび他の
機能に関する遺伝子から成るトランスフェクションプラ
スミドキメラ遺伝子セグメントの構築、 １１）トランスフェクションプラス・ミドによる適当な
受容細胞のトランスフェクション、ならびに１１１）キ
メラ抗体を分泌する安定にトランスフェクションされた
哺乳類抗体産生細胞のスクリーニング、に関する３種の
基本的な工程を有する。

この方法は、■８または■、遺伝子セグメントの単離を
必要としない。本発明の方法によれば、キメラ抗体に関
する遺伝子が、受容抗体産生哺乳類細胞内に組み込まれ
る。従って、本発明の方法は、「生体内（ｉｎ　ｖｉｖ
ｏ）　」方法である。キメラ遺遺伝子またはＬ鎖遺伝子
中に、外因性遺伝要素がトランスフェクションプラスミ
ドの状態で直接挿入されることにより生体内で創製され
る。

プラスミド内の免疫グロブリン遺伝子の免疫グロブリン
部と受容細胞内の活性抗体遺伝子との相同性に起因して
、該プラスミドは、細胞自体のＦ遺伝機構」に沿って細
胞のＨ鎖遺伝子またはＬ鎖遺伝子中に直接挿入され、 ｉ）キメラ抗体を産生ずる活性Ｈ鎖遺伝子または活性り
鎖遺伝子、ならびに １１）理想的には、プラスミド特有の挿入部が、５′末
にＨ鎖遺伝子またはＬ鎖遺（公子を、３′末に不変領域
遺伝子を有し、そしてその間に他のトランスフェクショ
ンプラスミド要素を有する（第４図を参照）ものをもた
らすであろう。

】、　　−ンスフェクションプラスミ　の−　　な殻 適当なトランスフェクションプラスミドは、第１図に一
部示されるような５つの部分を必ず含む。

第一の部分はイ・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）における選択
可能な培養のための遺伝マーカーから成る。第二の部分
は、哺乳類細胞のための選択マーカーである。かかるプ
ラスミドの幾つかは、既に開発され広く使用されており
、例えばｐＳＶ２ｎｅｏおよびｐＳＶ２ｇｐ　ｔが挙げ
られる。第三の部分は、座位特異的組換えを可能にする
のに十分大きな免疫グロブリン■］鎖遺伝子またはＬ鎖
遺伝子の不変部に関するセグメントである。第四の部分
は、挿入が望まれる新規な機能のものに関する遺伝子セ
グメントである。かかる機能の例としては、ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵
素、アビジンまたはメタロチオネインのようなパインデ
ィング蛋白質および免疫グロブリンの遺伝子セグメント
が挙げられる。全体がそろった遺伝子は必要とされない
であろう。第五の部分（図示していない）は、削除また
は付加されてもよい調節要素、転写またはポリアデニル
化部位の終止点、スプライス部位あるいはリンカ−をコ
ードする遺伝子セグメントを含んでなる。この構築物で
は、小さなりＮＡ上セグメント付加するかまたは削除し
て翻訳フレーム中に組み込まれた遺伝子を保持すること
ができる。これらの必須の要素は、一般に第１図に示さ
れるように構成される。

適当なＨ鎖遺伝子またはＬ鎖遺伝子を生体内で形成する
には、プラスミドが受容ハイブリドーマ細胞にトランス
フェクションされねばならない。

トランスフェクションは、浸透シヨ・ンク、リン酸カル
シウム沈澱、リポソームまたはプロトプラスト融合ある
いはエレクトロボレーション（ｅｌｅｃｔｒ。

ｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む多くの方法のいずれかにより
実施することができる。トランスフェクションされたハ
イプリドーマ細胞は、選択可能なマーカーにより指摘さ
れるようなプラスミドをそれらのゲノム中に取り込んだ
細胞である。これらは、トランスフェクションされてい
ない細胞にグして選択的な毒性を示す培地中でそれらの
細胞を増殖することにより同定することができる。典型
的には、エレクトロボレーション実験により約１０，０
００中の１細胞が安定にトランスフェクションされる。

安定にトランスフェクションされた集団は、２種の亜集
団を含む。すなわち、１）それらのゲノムの不適切な部
位にプラスミドを組み込んでいて、今だ正常な抗体を産
生ずるもの、ならびに２）それらの活性Ｈ鎖遺伝子中に
プラスミドを組み込んでいて、キメラ抗体を産生ずるも
のである。次に、これらの細胞は、キメラ抗体を分泌す
る貴重な細胞に対する標準的なエンザイムーリンクドイ
ムノア・ンセイ法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニング
することができる。基本的には次の３つの別個の性質に
ついてスクリーニングすることができる。

ｉ）新規なタンパク質の機能的な活性、１１）新規なタ
ンパク質の抗原活性、または山）Ｈ鎖またはＬ鎖の削除
されたタンパク質における通常検出可能なエピトープの
欠失。

次に、細胞分泌性キメラ抗体をクローン化し、さらなる
精製、特性決定または使用の目的で相当量のキメラ抗体
を得るために標準的な方法により培養する。

２、トランスフェクションブースミド（ＫＨ９４）選択
されたハイブリドーマをトランスフェクションし、本発
明の詳細な説明するために本明細書で使用される具体的
なプラスミドを、第２図に図示する。このものは、選択
されたハイブリドーマによりキメラ抗体産生を誘発する
ために使用された。このべ°フタ−は、次の操作可能に
連結された遺伝構成要素を有する。各要素に続く頭字語
または丸括弧内の名称は、第１図〜第４図の各要素につ
いて使用される記号である。

Ａ、抗体と一緒に存在するいずれかの新規な機能に関す
る遺伝子または遺伝子セグメントを組み込むことにより
キメラ抗体を調製する。かかる新規な機能の例は、前述
されている。本発明を具体的に説明する目的で、シトク
ロムＣペルオキシダーゼ（ＣＣＰ）に関する遺伝子４が
ｐＫＨ９４中で使用された。

Ｂ、Ｅ・コリー複製起源（示してない）。この中間体お
よび最終的なプラスミド（ｐＫＨ９４）は、Ｅ・コリー
中で複製可能である。

Ｃ０β−ラククマーゼ遺伝子（ＡＭＰ）。このものは、
Ｅ・コリーにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマ
ーゼをコードする遺伝子である。当該技術分野で既知の
すべての薬剤耐性Ｅ・コリーを使用することもできる。

薬剤耐性は、薬剤耐性を有するプラスミドを含む細胞の
増殖について選択することにより供給する。

Ｄ、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
遺伝子（ｎｅｏ）。ｎｅｏは、哺乳類細胞で抗生物質Ｃ
４１８に耐性を付与する遺伝子である。このものは、成
功裏にｐＫＨ９４でトランスフェクションされたハイブ
リドーマ細胞を選択するのに利用可能である。適当なプ
ロモーターおよびターミネータ−を伴う操作可能な他の
選択し得る遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
およびＥ・コリグアノシンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼに関するものも同様に利用可能である。

Ｅ、免疫グロブリンＨ鎖に関する遺伝子または遺伝子セ
グメント。本発明の態様では、この遺伝子は、選択され
たハイブリドーマから普通に分泌されるＨ鎖に調和する
ように選ばれる。この場合、免疫グロブリンγ２ｂ不変
遺伝子領域セグメントが本発明の具体例に使用された。

このセグメントは、ＣＨＩエキソンの１．３ｋｂ５’か
ら始まる２、１ｋｂのマウスｒ２ｂＨ鎖遺伝子であって
、ｐＳＶ−Ｖｎｐ　γ５Ｎａｓｅと称されるプラスミド
としてマイケルーノイバーガー（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｎｅ
ｕｂｅｒｇｅｒ）博士（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈＣｏｕｎｃｉｌ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）より入手した
。この遺伝子は、ＣＣＰ遺伝子を有する翻訳フレームに
存在する。

３、ＫＨ９４ｇ、′の−法 トランスフェクション　ベクターｐＫＨ９４は、標準的
な組換えＤＮＡ法を使用して調製した。ｐＫＨ９４は、
ｂｌａおよびｎｅｏ遺伝子を含むｐＳＶ２ｎｅｏ　；　
ｒ　２ｂ遺伝子セグメントを含むｐＳＶ−Ｖｎｐ　７５
Ｎａｓｅ　；複数クローニング部位を含むｐＵｃ　１８
ならびにＣＣＰ遺転子を含むｐＫｏ　７４の４種の既存
のプラスミドから横築された。ＤＮＡ遺伝子発現の制御
要素もまた、ｐＳＶ２ｎｅｏに含まれていた。

ｐＫ）！　９４の調製方法の各工程を、第３図に図示す
る。一般に、この方法は、 Ａ、　ｐＵＣ１８から複数クローニング部位を採取する
工程； Ｂ、その複数クローニング部位をｐＳＶ２ｎｅｏに挿入
し中間的なプラスミド（ｐＫＨ５７）を調製する工程： Ｃ，ｐＫＨ５７の複数クローニング部位からＸｂａｌ制
限部位を除去してｐＫＨ５８を調製する工程；Ｄ、　ｐ
、ＫＨ７４からｃｃｐ遺伝子を採取する工程；Ｅ、　ｐ
ＫＩＩ　５８の複数クローニング部位にそのＣＣＰ遺伝
子を挿入して中間的なプラスミドｐＫＨ７６を調製する
工程； Ｆ　、　ｐＳＶ−Ｖｎｐ　７５Ｎａｓｅからｒ２ｂ遺伝
子セグメントを採取する工程、ならびに Ｇ、　ｐＫＨ７６のＣＣＰ遺伝子を有するフレーム中に
ｐＫＨ７６のγ２ｂを挿入してｐＫＨ９４をもたらす工
程、を含む。

４、■狙痰バ影月仄１１方法 バＬ匠■構築（第３図、工程１） Ａ、■ すべての制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ断片（フレノウ
）　、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびＴ４　ＤＮＡポリメ
ラーゼは、ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）由来のものであり
、使用説明書に従って使用した。Ｋｐｎｌリンカ−は、
ニュー・イングランド・バイオラボから購入した。

アンピシリンおよびジエネテシン（Ｇ４１８）は、ギブ
コ（Ｇｉｂｃｏ）から購入した。

Ｂ、バクテ１ア　およびブースミド Ｅ・コリー）ＩＢＩＯＩ（Ｆ−１ｅｕＢ６．　ｐｒｏＡ
２．　ｒｅｃＡ１３゜ｔｈｉ−１ａｒａ−１４，１ａｃ
Ｙ１．　ｇａｌＫ２．　ｘｙｌ−５，ｍｔｌ−Ｌｒｐｓ
Ｌ２（ｌ　　λ−＋　５ｕｐＥ４４．　ｈｓｄｓ２０ｒ
−ａｍ−ｇ）株をプラスミドの増殖およびトランスフェ
クション宿主として使用した。ＡＴＣＣから入手できる
プラス−ミドｐＳＶ２ｎｅｏは、Ｅ・コリー選択用のア
ンピシリン耐性をコードする遺伝子を含み、ｎｅｏ遺伝
子は、哺乳類細胞で選択するためのＧ４１８耐性をコー
ドする遺伝子と必要なりＮＡ遺伝子発現要素のすべてを
含む。プラスミドｐＫＨ７４は、シトクロームＣペルオ
キシダーゼ遺伝子源として使用された。それらの調製方
法は、Ｃ１ｃｃａｒｅｌ　ｌｉらの名で１９８７年１０
月１６日付で出願された米国特許出願番号第１０９，７
９６号明細書に記載されており、引用することにより本
明細書の内容となる。免疫グロブリン７２ｂ不変領域セ
グメントは、マイケル・ノイバーガー博士から入手した
ｐＳＶ−Ｖｎｐ　７５Ｎａｓｅからサブクローニングさ
れ、Ｎａｔｕｒｅ　３１２，６０４〜６０８ページ（１
９８４）に記載されている。

Ｃ０方法 すべての標準的な組換えプラスミド操作、例えば、連結
反応、付着ＤＮＡ端のファイリング、制限酵素による消
化、ＤＮＡ配列決定、制限マツピングおよび大量調製は
、マニエチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　
　Ｍａｎｕａｌ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９
８２、に従って実施した。

Ｄ、プラノ、Ｓ口λｌ策 マウスハイブリドーマをトランスフェクションするのに
使用されるプラスミド（ｐＫＨ９４）は、酵母ＣＣＰ遺
伝子についての翻訳フし・−ム中に融合される免疫グロ
ブリンＴ２ｂ不変遺伝子領域フラグメントを含む。ｐＫ
ＩＩ　９４は、第３図に示されるように構築された。

ｐＵＣ１８の複数クローニング部位（ＭＣ３）が、　ｐ
ＳＶ２ｎｅ。

にサブクローニングされて有用な制限部位を提供した。

複数制限部位（ＭＣＳ）を採集するには、ｐＵＣ１８を
旧ｎｄｌ［［で消化し、得られる付着端をフレノウ断片
およびｄＮＴＰｓを使用してファイルし、次いでＥｃｏ
ＲＩで消化した。

ｐＳＶ２ｎｅｏは、Ａａｔ　Ｕで消化した。その付着端
を、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓを使用
してファイルし、次いでＥｃｏＲＩで消化した。

ｐＳＶ２ｎｅｏおよびｐｕｃ　１８に由来するこれらの
調製物を一緒に混合して連結し、次いでこのものを使用
してアンピシリン耐性Ｅ・コリー８８１０１株をトラン
スフェクションした。選ばれたプラスミドを、制限解析
にかけた。ｐｓＶ２ｎｅｏおよびｐＵＣ１８ＭＣ５が組
み合わされたｐＫＩＩ　５７は、唯一のＸｂａＩ部位、
唯一のＫｐｎ１部位、２つのＢａｍＨ１部位、唯一のＨ
ｉｎｄｌＩ［部位および適当な５ａ１１部位を含有する
ことで識別された。

ｐＫＨ５７の複数クローニング部位（ＭＣ３）は、一つ
のＸｂａ　Ｉ　（Ｘ）制限部位を含む。γ２ｂもまた、
本発明者らの構築戦略において、ｐＫＨ９４におけるＴ
２ｂの存否を確認するために使用されたＸｂａ１部位を
含む。従って、複数クローニング部位からＸｂａｌを除
去する必要があった。ｐＫＨ５７におけるＸｂａｌを欠
失させるために、プラスミドをＸｂａｌで消化した。こ
うして得られる付着端は、前述のようなプラントを形成
する。このプラスミドは、連結により再環化された。連
結後、ｐＫＨ５７を含む溶液は、なおＸｂａ１部位を含
むようなすべてのプラスミドを除去する目的で、再度Ｘ
ｂａｌ消化された。Ｘｂａｌで切断されないプラスミド
をｐＫＨ５８とした。

ｐＫＩＩ　７４に由来するシトクロムＣペルオキシダー
ゼ（ＣＣＰ）遺伝子を、ＥｃｏＲＩでｐＫＨ７４を切断
することにより調製し、その遺伝子をｐＫＩＩ　５８中
に連結した。切り出された遺伝子の付着端は、フレノウ
断片を使用してファイルされた。ｐＫＩＩ　７４中のシ
トクロムＣペルオキシダーゼ遺伝子は、１　）　ｐｒｅ
−ＣＣＰのリーダーペプチドをコードするＣＣＧ遺伝子
セグメントの欠失、２）翻訳開始点へのＸｈｏ１部位５
ｂｐ５’の挿入、および３）このＸｈｏ１部位とＣＣＰ
翻訳開始点との間への追加のアデニン残基の挿入、によ
って明らかに変性されていた。挿入されたＤＮＡは第１
図を参照のこと。追加のアデニン残基は、ｐＫＩＩ　７
６におけるＸｈｏｌスプライス部位におけるγ２ｂを有
する翻訳フレーム中にＣＣＰ遺伝子を入れるために付加
された。ｐＫＨ５８は、ＥｃｏＲｒにより切断され、そ
の端が前述のようにファイルされた。次に、第１図に示
すようにｐＫ）Ｉ　５８にＣＣＰ遺伝子を連結して中間
的なプラスミドｐＫＨ７６を調製した。連結後Ｅ・コリ
ーでクローニングし、クローンをＣＣＰ遺伝子セグメン
トの存否について分析した。ｐＫＨ７６と命名された一
つのプラスミドは、前記遺伝子を含み次の操作に役立つ
ことが確認された。

Ｔ２ｂ遺伝子セグメントは、プラスミドｐＳＶ−Ｖｎｐ
Ｉ　５Ｎａｓｅから得られた。ｐＳＶ−Ｖｎｐ　ｒ　５
ＮａｓｅをＥｃｏＲ１で消化した。この末端をフレノウ
断片およびｄＮＴＰｓを使用してプラント化した。プラ
ント化した末端にＫｐｎｌリンカ−を付加した。次にこ
のプラスミドをＸｈｏＩで消化して、前記付加したＫｐ
ｎ　Ｉ　（Ｋ）部位とＸｈｏ　Ｉ　（Ｘ）部位との間の
約２．１ｋｂのＫｐｎｌ−ＸｈｏＩｙ２ｂ断片を生成し
た。ｐＫＩＩ　７６をＫｐｎＩおよびＸｈｏｌで切断し
た。前記Ｔ２ｂ断片をｐＫＨ７６に連結してｐＫＨ９４
を生成した。ｐＫ）ｌ　９４の構造は、制限マンピング
解析で確認した。ｐＫＨ９４は、第２図に示されるよう
な特異的な構造を有する。

５、座」υ降選１Ｂル換ｊ２（第４図）本発明で記載さ
れる生体内方法に準じて調製されるキメラ抗体をコード
する遺伝子は、座位特異的な組換えにより創製される。

受容ゲノムとトランスフェクションプラスミドとにかな
りの相同領域が存在する場合、受容ハイブリドーマゲノ
ムと外因性遺伝要素、例えば第２図のトランスフェクシ
ョンプラスミドとの間で座位特異的組換えが生じる。

哺乳類細胞における組換えは、総ＤＮＡ配列の相同性が
７０％以上であるＤＮＡセグメント間で生ずることが判
明している。本発明者らは、少な（とも７０％の総配列
相同性を有する他の不変領域遺伝子座に、不変領域遺伝
子セグメントを含むプラスミドが特異的に取り込まれ得
るものと信する。

相同領域は、第２および４図の破線により示される。こ
の相同領域（第２および４図）は、エキマンをコードす
るＣＨ１Ｔｉｌ域の約１．３ｋｂ５’からエキマンをコ
ードするＣｏＺＳｆｆ域中のｔｓｂｐに達するγ２ｂＨ
鎖遺伝子の２．１ｋｂセグメントである。

この組換え現象に特有の生成物は、第４図の最終行に図
示される。本質的に、このプラスミドは相同領域のいず
れかの受容ゲノム中に挿入され、相同領域の２種のコピ
ーを与える。この２種のコピーは、他のプラスミド要素
により分離される。

第４図では、相同領域は、エキマンをコードするｒ２ｂ
ｃＨ１に対するイントロン５′からエキソンをコードす
るｒ２ｂｃＨ２のほんの数個のヌクレオチドまで拡がる
。ＣＣＰは、相同領域・に隣接するプラスミドの３′に
組み込まれた。この組換え現象の結果として、ＣＣＰ遺
伝子は、取って代わられる正常な遺伝子Ｔ２ｂセグメン
トを置換する（第４図参照）。これは、以下の方法によ
り実施された。

ハイブリドーマ細胞系ｐｈｅ４．５を、本発明を具体的
に説明するための受容細胞として使用した。

ｐｈｅ４．５細胞系は、ＳＰ２１０−Ａｇ１４ミエロー
マ細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　２７６．２
６９〜２７０ページ、１９７８）とウシ血清アルブミン
に接合させたフエノバルビクールにより免疫感作された
Ｈａ　ｌ　ｂ／ｃマウス由来のリンパ球との間の融合生
成体である。ｐｈｅ４．５の免疫グロブリン生成物は、
フェノバルビクールに対してほんのわずかな特異性（Ｋ
ａ＜１０’）を有するにすぎず、フエノバルビクールの
接合したグルコースオキシダーゼ（ｐｈｅ−ＣＯＤ）に
容易にパインディングする。ｐｈｅ４．５は、イソタイ
プｒ２ｂ、にの抗体を有する。

プラスミドｐＫＨ９４でＥ・コリー８８１０１株を形質
転換した。これらの細胞培養物から、実質的にＭａｎｉ
ａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　：
　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋
　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８２に準じてプラスミドを数
ミリグラムの単位で調製した。ｐＫＨ９４を担うトラン
スフェクションした８８１０１株を、クロラムフェニコ
ールの存在下で培養してプラスミドを増大させた。次に
、トランスフェクションした８８１０１株を細胞溶解し
、ＲＮＡａｓｅＡで細胞溶解物を処理し、次いで細胞質
砕片を沈降させた後、プラスミドを抽出した。次に、塩
化セシウムグラージエントを用いる平衡沈降により抽出
物からプラスミドを精製した。

トランスフェクションの前日、タンパク質をコードする
配列から約０．８ｋｂ５’側でＴ２ｂ遺伝子セグメント
における唯一のＸｂａ１部位で開裂することにより環状
プラスミドｐＫＨ９４を鎖状にした。鎖状のプラスミド
を−２０’Ｃにて９５％ＥｔｏＨ中の沈澱物として貯蔵
し、トランスフェクションの日にＰＢＳ中に再溶解した
。

１１）支容彌帰副１１ ｐｈｅ４．５細胞を、標準的な細胞培養条件（空気中５
％ＣＯ□、１００％Ｒ１（，３７°Ｃ１暗所）下でｌＯ
％ＦＣ３が補足されたＤＭＥＭのＴ−１５０フラスコ中
に持続した。それらが新鮮な培地で１／２に分割して新
鮮なＴ−１５０フラスコ中に接種される場合には、トラ
ンスフェクション前２４時まで１日おきにそれは移され
た。この工程は、細胞がトランスフェクションの間中対
数増殖期にあることを保証する。

トランスフェクションの直前にｐｈｅ４．５細胞をＰＢ
Ｓで２度洗浄し、次いでＰＢＳ中に懸濁した。

ｉｊ　）エレク　ロポレーション ｐｈｅ４．５細胞（２，７Ｘ１０’細胞／ｄ）１００μ
７と精製したｐＫＨ９４（８０硝／成）ＬｏｏＩＪｌを
混合して５チヤンネルのエレクトロフュージョン　チェ
ンバー（Ｂｉｏｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｉｎｃ、、　Ｔ
ｒｏｙ、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）の２つのトラック間に置
いた。高圧細胞プロセッサー（Ｂ　ｉｏ　ｌｅｃ　ｔｒ
ｏｎ　１ｃｓ）からの２０００　Ｖパルス下、３０μ秒
後、細胞を２０％ＦＣ３を補足したＤＭＥＭ　２０　ｍ
ｌ中に懸濁して２つの９６ウエル微量培養プレート中に
分配した（２．７Ｘ１０’細胞／ウエル）。次に、これ
らの細胞を無差別に３日間増殖させた。

Ｃ１久又■二三ノ久 無差別に３日間培養した後、培地を２０％ＦＣ３および
０４１８（ギブコ）１■／戚を添加したＤＭＩＥＭで交
換した。Ｇ４１８は、ｐＫＨ９４に対する選択マーカー
であるＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラー
ゼ（ＮＥＯ）発現性細胞を選択する薬剤である。新鮮な
Ｇ４１８含有培地を３日毎に添加した。

３０日目土でに殆んどのウェル中で、１以上の肉眼視で
きるコロニーが観察できるようになった。

培養物の上澄をスクリーニング用に準備を整え、目的の
キメラ抗体を分泌するハイプリドーマを同定した。

）見返」暑ｉ粂 （ａ）シトクロムＣペルオキシダーゼに対する抗血清（
ａｎｔｉ−ＣＣＰ）は、次のように調製した。ニューシ
ーラント・アルピノ・ラットを、完全フロインドアジュ
バント中ＣＣＰ　１　ｍｇを使用して８箇所の皮下部で
免疫感作した。動物を４週間でブースト（ｂｏｏｓｔ）
　　シて血清を採集した。抗血清は、ＣＣＰ　１■／戒
に対する放射状（ｒａｄｉａｌ）免疫抗散法で１／１６
の力価を有し、天然のＣＣＰに対するＥＩＪＳＡ試験で
は１　／１００，０００を越える力価を有する。アフィ
ニティー精製抗ＣＣＰ抗体は、Ｃｕａ　ｔｒｅｃａｓａ
ｓ法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４５．３０５９
ページ（１９７９）　）により調製したＣＣＰ−セファ
ロースによる精製によって調製した。

（ｂ）　ＨＢ５８は、マウスＬ鎖に特異的なＩｇＧ　１
ラット抗体を分泌するラット−マウスハイブリドーマで
ある。これは、５ｃｈａｒｆｆ　らにより調製され（む
垣頂捲弘土、１〜５ページ（１９８ｔ））　、ＡＴＣＣ
より入手された。ミリグラム量のものは、本質的にＥＶ
ら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　１５．４２９〜
４３６ページ（１９７８）、の方法により振盪フラスコ
培養物から精製された。

（ｃ）ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体、アフ
ィニティー精製したラビット抗ＣＣＰまたは精製したＨ
Ｂ５Ｂモノクロナル抗体を、ＮａｋａｎｅおよびＫａｗ
ａｓｉ、　Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｔｏｃｈｅｍ
　、　２２％　１０８４〜１０９１ページ（１９７４）
の方法でＨＲＰと接合させた。

（ｄ）ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスｒ　２
ａ／　ｒ　２ｂは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅ
ｓｅａｒｃｈから入手した。

（ｅ）フエノバルビタール吉草酸エステルグルコースオ
キシダーゼ（ｐｈｅ−ＣＯＤ）は、ＢｒＩａｎｇｅｒ、
　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

並堕８％Ｕ、１０９０ページ（１９５９）の方法により
調製した。

１ｉ）ＣＣＰ　　　’　　　についてのア・セイ分泌す
る場合には、キメラ抗体は、その抗体のＦｃ部にＣＣＰ
遺伝子を有するであろう。ｐｈｅ−ＣＯＤ（ＰＢＳ中２
　ｎ　／　ｍｌ　）を、平底ポリスチレンミクロプレー
ト　ウェル上に吸着させ、残りの表面をＢＳＡでブロッ
クした。培養物上澄試料Ｌｏｏｍを、対応するウェルに
添加した。室温で（ＲＴ）１時間インキュベーションし
た後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ接合ラビうト抗ＣＣＰ
抗体を添加し次いでＲＴで１時間インキュベーションし
た。洗浄後、残存ペルオキシダーゼ活性をアッセイした
。

Ｆｃを所持する分子を取り除くために、９６ウエルのミ
クロタイタープレート中で、培養物上澄試料をＰＢＳ中
のパンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）　（Ｃａｌｂｉ
ｏ−ｃ　ｈ　ｅ　＋ｎ　）の２０％懸濁液と１００μｌ
と共にインキュベーションした。遠心によりパルソルビ
ンをベレット化した後、上澄をＦａｂおよびＦｃに対す
る分離したＥＬＩＳＡアンセイに分離した。Ｆａｂにつ
いての試験では、ｐｈｅ−ＣＯＤを塗布したミクロタイ
タープレート上で培養物上澄をインキュベーションした
。

洗浄後、各試料を）ＩＲＰ−ＨＢ５８　（モノクロナル
　ラット抗マウスカッパーＭ）により評価した。Ｆｃに
ついての試験では、ｐｈｅ−Ｇｏ口を塗布したプレート
上で培養物上澄をインキュベーションし、次いで１１Ｒ
Ｐ−接合ヤギ抗マウスγ２ａ／ｂで評価した。Ｆ　ａｂ
”でかつＦｃ−を記録した試料を、軟寒天でクローン化
し、次いで次の特性決定用材料を調製するために培養し
た。

■ シアノゲンープロマイド活性化セファロースによるアフ
ィニティークロマトグラフィー用固定化相は、本質的に
Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
　２４５．３０５９ページ（１９７０）に従った。ＨＢ
５８を、いずれかのカッパ鎖を所持する分子に対するリ
ガンドとして固定化した。アフィニティー精製ラビット
抗ＣＣＰ抗体を、いずれかのＣＣＰを所持する分子に対
するリガンドとして固定化した。すべての分離物は、実
質的に同一の方法で調製した。

Ｂ、ｆｆｉ西１−ス詠髪 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ＰＤＳ−ＰＡＧＥは、木質
的にＬａｅｍｍｌｉ　の方法（Ｎａｔｕｒｅ　２２７．
６８０ページ、１９７０）によりスラブゲルにより実施
した。

Ｃイムノブロッティング 新たに流がす５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、トランファー（
ｔｒａｎｓｆｅｒ）　緩衝液で平衡化し、バイオランド
・トランスプロット（ＢｉｏＲａｄ　Ｔｒａｎｓｂｌｏ
ｔ）を使用してニトロセルロース上にニレクロプロット
（９０分、７０Ｖ）した。フ゛ロントを標識し、１％の
ＢＳＡを有するＰＢＳ中で一夜インキユベーションして
ブロックした。プロット試料を１％のＢＳＡを有するＨ
ＲＰ−接合抗体の適当な希釈物と２時間インキュベーシ
ョンした後、ＰＢＳでよく洗浄し、次いで４−クロロナ
フトールによりＨＲＰ活性について現像した。

８、　　　　　　　および 前述のスクリーニングおよび特性決定において、抗体は
ｐｈｅ−ＣＯＤにパインディングし、ＣＣＰ抗原活性を
有するがＦｃ抗原活性が欠失していることが同定された
。これらのキメラ分子のさらなる特性決定は、それらが
予期したキメラ抗体の数多くの特性を有することを示し
た。具体的には、これらの細胞によって分泌されるキメ
ラ抗体は、ｉ）γ２ｂ遺伝子から控除された質量とＣＣ
Ｐ遺伝子が付加したものから控除された質量との間の差
違から予測されるように親ＴｇＧ２ｂのＨ鎖より大きい
Ｈ鎖（約５５ｋｄに対して約６５ｋｄ）を有し、ｉｉ）
共有結合したカッパーＬ鎖を有し、固定化した抗カッパ
ー抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製することができ、ｉｉｉ　）イムノブロッティン
グと固定化した抗ＣＣＰ抗体を用いるアフィニティーク
ロマトグラフィーによる精製の両方で証明されるように
ＣＣＰ抗原決定基を有し、かつ ｉｖ）スタフィロコッカス・アウレウス（針胛ｂ１ｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）由来の■８プロテアーゼを
用いる限定加水分解によって断片化して、天然のＣＣＰ
から生ずる数種の質量と同一の抗ＣＣＰ反応性断片を与
えることができる。

前述の詳細な構成およびＥＬＩＳＡスクリーニング試験
は、本発明の生体内法がキメラ抗体産生に有用であるこ
とを示す。多種類のタンパク質セグメントのいずれかを
有するキメラ抗体の生成が可能である。

ＣＨ遺伝子セグメントの代わりに新規なタンパク質に関
する「遺伝子」を挿入するだけでなく、特に設計された
合成オリゴヌクレオチドを挿入することもできた。かか
るオリゴヌクレオチドは、選択的共有結合修飾（例えば
、グリコシル化）に関する部位または終止コドンをコー
ドしてもよい。

〔発明の効果］ キメラ抗体を創製するための生体内法は、広〈実施され
ている生体外法を陵駕する次の３つの主要な利点を有す
る。

）可変領域遺伝子セグメントを単離することは全く不要
である。

ｉｉ）本明細書で特定したように、受容抗体産生細胞の
Ｈ鎖またはＬ鎖抗体クラスが、プラスミドに含まれるＨ
鎖またはＬ鎖免疫グロブリン遺伝子と十分相同である限
り、−度構築されたトランスフェクションプラスミドは
、いずれかの特異性を有する類似のキメラ抗体を創製す
るための変性をすることなく同一のプラスミドを使用す
ることができる。

ｉｉｉ　）本発明のプラスミドのための受容細胞は、目
的の特異性を有する抗体を分泌する細胞である。

これらの実施上の利点は、キメラ抗体の調製方法を簡潔
、迅速、かつ低価格なものに変える。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法で使用される一般的なトランス
フェクションプラスミドの略図であり、第２図は、本発
明の方法を具体的に説明するために使用したトランスフ
ェクションプラスミドｐＫＨ９４の略図であり、 第３図は、本発明の方法で使用されるトランスフェクシ
ョンプラスミド調製方法の代表的な工程図であり、そし
て 第４図は、座位特異的組換えの代表的な略図である。 ＦＩＧ、　３ 座位特異的組換λ後の受容体ゲノム ＦＩＧ、　４ 手 続 補 正 書 （方式） 補正の対象 図 面 平成１年９月 日 ７゜ 補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ＤＮＡ調節領域および選択可能なマーカーと
   連携して操作可能な状態で、免疫グロブリンＨ鎖または
   Ｌ鎖の不変部に関する遺伝子または遺伝子セグメントお
   よび他の機能に関する遺伝子または遺伝子セグメントを
   含んでなる遺伝子セグメントを含むトランスフェクショ
   ンプラスミドの構築工程、 （ｂ）前記プラスミド中の免疫グロブリン遺伝子または
   遺伝子セグメントと少なくとも７０％のＤＮＡ配列相同
   性を有するような免疫グロブリンを分泌する受容哺乳類
   抗体産生細胞への該プラスミドのトランスフェクション
   工程、ならびに（ｃ）前記のようなキメラ抗体を分泌す
   る安定にトランスフェクションされた抗体産生細胞のス
   クリーニング工程、を含んでなるキメラ抗体産生方法。 ２、前記受容抗体産生細胞が、プラスミドに含まれる免
   疫グロブリン遺伝子または遺伝子セグメントと同一の鎖
   クラスに属する免疫グロブリンを分泌するハイブリドー
   マである請求項１記載の方法。 ３、前記抗体の遺伝子セグメントが、免疫グロブリンＨ
   鎖（Ｃ＿Ｈ）の不変部に関する遺伝子または遺伝子セグ
   メントを含む請求項１または２記載の方法。 ４、前記キメラの遺伝子セグメントが、免疫グロブリン
   Ｌ鎖（Ｃ＿Ｌ）の不変部に関する遺伝子または遺伝子セ
   グメントを含む請求項１または２記載の方法。 ５、前記他の機能が、酵素的機能、リガンドバインディ
   ング機能、終止コドン機能、直接的なグリコシル化機能
   および免疫原性の可変機能から選ばれる請求項１、２、
   ３または４記載の方法。 ６、前記トランスフェクションが、浸透ショック、リン
   酸カルシウム沈澱、リポソームまたはプロトプラスト融
   合あるいはエレクトロボレーションによって実施される
   請求項１または２記載の方法。 ７、前記鎖クラスが、いずれかの哺乳類抗体産生細胞の
   ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤから成る
   群より選ばれる請求項２記載の方法。 ８、前記受容抗体産生細胞が、ミエローマ細胞系または
   Ｂ−細胞系である請求項１記載の方法。