CN104507504A - 白介素-2融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及免疫球蛋白和白介素-2(IL-2)的融合蛋白。另外，本发明涉及编码这类融合蛋白的多核苷酸，和包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明融合蛋白的方法，以及在疾病治疗中使用它们的方法。

Description

白介素-2融合蛋白及其用途
发明领域
本发明一般涉及免疫球蛋白和白介素-2(IL-2)的融合蛋白。另外，本发明涉及编码这类融合蛋白的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明融合蛋白的方法，以及在疾病治疗中使用它们的方法。
发明背景
调节性T细胞(Treg)代表对维持自体耐受至关重要的特定T淋巴细胞子集。这些具有阻抑剂功能的CD4+CD25高细胞可以通过转录因子FOXP3的胞内表达，以及其它细胞标志物诸如CD127低、CTLA-4+、LAP、CD39+、PD-1+、GARP、等与效应T细胞区分开。FOXP3对于Treg分化和功能是至关重要的，而且FOXP3基因缺陷和突变在有皮屑的(scurfy)小鼠和具有免疫失调多内分泌腺病、肠病、X染色体连锁综合征(IPEX)的患者中均导致自体耐受故障和自身免疫疾病形成，原因是Treg缺陷或功能缺乏。
1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、和许多其它中的自身免疫应答与Treg中的缺陷有关。来自动物模型的数据支持下述假设，即自身免疫应答受Treg控制针对自身的破坏性免疫应答失败推动。1型糖尿病是胰中生成胰岛素的β细胞大多遭到破坏后发生的一种自身免疫疾病。1型糖尿病在美国人群中的频率为约0.3％，而且它的发病率在美国、欧洲、特别是斯堪的纳维亚(几乎1％)继续升高，预期在下面的20年内翻倍。
细胞因子IL-2在Treg以及效应T细胞(Teff)二者的激活和功能中发挥主要作用。IL-2生成缺陷或响应性缺乏优先导致Treg功能丧失和自身免疫性概率升高。因为Treg以比Teff高的水平组成性表达高亲和力IL-2受体，所以低剂量的IL-2与Teff细胞相比优先支持Treg维持。
凭借IL-2在体外和在体内优先激活Treg的效果，低剂量、长效IL-2疗法的潜力似乎会具有在自身免疫疾病中获得成功的较高预期。用IL-2()进行的一项200名患者、双盲、安慰剂对照的1型糖尿病临床试验设定为在2013年晚期开始。用每日低剂量进行的最近临床试验改善慢性移植物抗宿主病(GVHD)和丙型肝炎病毒诱导的血管炎的一些体征和症状(Koreth et al.,New Engl J Med 365,2055-2066(2011)；Saadoun etal.,New Engl J Med 365,2067-2077(2011))。在两项研究中，低剂量均诱导Treg且提高Treg:Teff比。然而，较差的PK特性使之对于在人中维持低、一致水平的IL-2是亚最佳的。在临床试验中测试的其它方法有Treg离体个性化扩充，继以再灌注，但是这种办法不够理想且代表有挑战性的一组质量对照问题。
如此，再建立天然调节性T细胞(Treg)介导的支配性免疫耐受的新治疗办法会大大增强治疗具有自身免疫疾病诸如1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病以及其它自身免疫疾病和基于免疫的促炎性疾病诸如慢性移植物抗宿主病、哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、心血管病诸如动脉粥样硬化、和移植排斥(实体器官和骨髓二者)的患者的能力。
本发明的IL-2融合蛋白优先激活Treg，倾斜平衡朝向更高的Treg:Teff比并降低自身免疫应答。它们是长效的，容许方便的给药时刻表，而且没有效应器功能，降低潜在副作用和功效损害。
发明概述
一方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含：
(i)包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力，和
(ii)两个白介素-2(IL-2)分子。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为人免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子能够特异性结合抗原。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为单克隆抗体。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够特异性结合抗原。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：9的重链可变区序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQ IDNO：11的轻链可变区序列。在一个甚至更加具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：9的重链可变区序列和SEQ ID NO：11的轻链可变区序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够特异性结合抗原，且包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列和基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，所述Fc受体为Fcγ受体，特别是人Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体为激活性Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体选自下组：FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。在一个具体实施方案中，所述Fc受体为FcγRIIIa，特别是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，所述修饰降低免疫球蛋白分子的效应器功能。在一个具体实施方案中，所述效应器功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，所述修饰在所述免疫球蛋白分子的Fc区中，特别是在CH2区中。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第329位(EU编号方式)处包含氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述氨基酸替代为P329G。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第234位和第235位(EU编号方式)处包含氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第234位、第235位和第329位(EU编号方式)处包含氨基酸替代。在一个特定实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式)。
在一个实施方案中，所述IL-2分子为野生型IL-2分子。在一个实施方案中，所述IL-2分子包含与天然存在、天然IL-2相比不改变所述IL-2分子对IL-2受体的结合亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述IL-2分子在与人IL-2残基125对应的位置处包含氨基酸突变。在一个更加特定实施方案中，所述氨基酸突变为氨基酸替代C125A。在一个实施方案中，所述IL-2分子为人IL-2分子。在一个具体实施方案中，所述IL-2分子包含SEQ ID NO：1或SEQID NO：3的序列，特别是SEQ ID NO：3的序列。在一个实施方案中，所述IL-2分子具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列，特别是SEQ ID NO：3的序列。在一个实施方案中，所述IL-2分子各自在它们的N末端氨基酸融合至所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链之一的C末端氨基酸，任选经由肽接头。
在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：19的多肽序列。在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：19的免疫球蛋白轻链和SEQ ID NO：17的免疫球蛋白重链-IL-2融合多肽。在一个实施方案中，所述融合蛋白基本上由包含修饰的免疫球蛋白分子、两个白介素-2(IL-2)分子、和任选的一个或多个肽接头组成，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述融合蛋白基本上由两个SEQ ID NO：19的免疫球蛋白轻链和两个SEQ ID NO：17的免疫球蛋白重链-IL-2融合多肽组成。
本发明进一步提供一种多核苷酸，其编码本发明的融合蛋白。进一步提供一种包含本发明的多核苷酸的载体，特别是表达载体。另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或载体。本发明还提供一种用于生成本发明的融合蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)在适合于表达该融合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，并(ii)回收该融合蛋白。还提供一种融合蛋白，其包含：(i)包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力；和(ii)两个白介素-2(IL-2)分子，该融合蛋白是通过所述方法生成的。
一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白和药学可接受载剂。还提供本发明的融合蛋白或药物组合物，其用作药物及用于治疗或预防自身免疫疾病，具体是1型糖尿病、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)或克罗恩(Crohn)氏病，最具体是1型糖尿病，或移植物抗宿主病或移植排斥。进一步提供本发明的融合蛋白在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途及治疗个体中疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，所述疾病为自身免疫疾病。在一个更加特定实施方案中，所述自身免疫疾病为1型糖尿病、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)或克罗恩氏病。在一个甚至更加具体实施方案中，所述自身免疫疾病为1型糖尿病。在另一个实施方案中，所述疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。在一个实施方案中，所述个体为哺乳动物，特别是人。
进一步提供本发明的融合蛋白，其用于在体外或在体内选择性激活调节性T细胞。在一个实施方案中，所述激活包含诱导调节性T细胞增殖和/或在调节性T细胞中诱导IL-2受体信号传导，特别是STAT5磷酸化。在一个实施方案中，所述使用在体外且以约1ng/mL或更少、特别是约0.1ng/mL或更少的浓度使用所述融合蛋白。在另一个实施方案中，所述使用在体内且以约20μg/kg体重或更少、特别是约12μg/kg体重或更少、更特别是约6μg/kg体重或更少的剂量使用所述融合蛋白。
本发明还提供一种用于在体外或在体内选择性激活调节性T细胞的方法，其包括使所述调节性T细胞与本发明的融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述激活包含诱导调节性T细胞增殖和/或在调节性T细胞中诱导IL-2受体信号传导，特别是STAT5磷酸化。在一个实施方案中，所述方法在体外且以约1ng/mL或更少、特别是约0.1ng/mL或更少的浓度使用所述融合蛋白。在另一个实施方案中，所述方法在体内且以约20μg/kg体重或更少、特别是约12μg/kg体重或更少、更特别是约6μg/kg体重或更少的剂量使用所述融合蛋白。
附图简述
图1。DP47GS IgG-IL-2融合蛋白(见SEQ ID NO 13、15、19)的纯化。(A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱图谱。(B)大小排阻层析步骤的洗脱图谱。产率4mg/L。(C)终产物的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。观察到下述条带：非还原的–7.5％面积在111kDa，92.5％面积在174kDa；还原的–23.6％面积在29kDa，23.5％面积在67kDa，52.9％面积在82kDa。产物含有约7.5％“半IgG”。(D)终产物在TSKgel G3000SW XL柱上的分析性大小排阻层析(91％单体含量)。
图2。DP47GS IgG-(IL-2)2融合蛋白(见SEQ ID NO 17、19)的纯化。(A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱图谱。(B)大小排阻层析步骤的洗脱图谱。产率13mg/L。(C)终产物的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。观察到下述条带：非还原的–2.3％面积在172.5kDa，97.7％面积在185kDa；还原的–18.3％面积在27.3kDa，0.6％面积在29.2kDa，81.1％面积在78.3kDa。(D)终产物在Superdex 200柱上的分析性大小排阻层析(100％单体含量)。
图3。CD4+Treg子集、NK细胞子集和NKT细胞上的CD25(IL-2RA)和CD122(IL-2RB)表达。使用细胞表面标志物来定义CD4+Treg子集、NKT细胞和NK细胞。为了优化对CD25和CD122的染色，未实施胞内FOXP3染色。(A，B)三种调节性CD4+T细胞(Treg)群体：幼稚(CD45RA+，CD25+；点线)，记忆(CD45RA-，CD25+；实线)和激活的(CD45RA-，CD25高；短划线)。(C，D)NKT(点线)、CD56亮NK细胞(短划线)、CD56中等NK细胞(实线)。灰色：同等型对照。
图4。CD4+和CD8+常规T细胞子集上的CD25(IL-2RA)和CD122(IL-2RB)表达。使用细胞表面标志物来定义幼稚(CD45RA+；点线)和记忆(CD45RA-；实线)常规CD4+T细胞(A，B)、记忆常规CD8+T细胞(CD45RA-；实线)和CD45RA+CD8T细胞(幼稚和TEMRA子集的组合；TEMRA指恢复成表达CD45RA的效应记忆细胞；点线)(C，D)。灰色：同等型对照。
图5。人外周血细胞子集中响应DP47GS IgG-IL-2的pSTAT5a诱导。在分开的时间对三名不同人供体(C4至C6)评估多种剂量的DP47GS IgG-IL-2对STAT5a磷酸化诱导的影响。显示CD4+Treg子集的结果：激活的、记忆和幼稚Treg；常规CD4+记忆T效应细胞；CD56亮NK细胞；CD8+记忆T效应细胞；CD4+幼稚T效应细胞；NK细胞；NKT细胞；和CD8+幼稚T效应+CD45RA+记忆细胞。
图6。人外周血细胞子集中响应DP47GS IgG-(IL-2)2的pSTAT5a诱导。在分开的时间对五名不同人供体(N1、N2、C4-C6)评估多种剂量的DP47GSIgG-(IL-2)2免疫缀合物对STAT5a磷酸化诱导的影响。显示CD4+Treg子集的结果：激活的、记忆和幼稚Treg；常规CD4+记忆T效应细胞；CD56亮NK细胞；CD8+记忆T效应细胞；CD4+幼稚T效应细胞；NK细胞；NKT细胞；和CD8+幼稚T效应+CD45RA+记忆细胞。
图7。人外周血细胞子集中的pSTAT5a诱导：DP47GS IgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2的比较。将每一种细胞子集的结果相对于来自每一个子集的最大观察效果标准化，并将Treg的近似EC50呈现于表2。(A)DP47GS IgG-IL-2的标准化结果，(B)DP47GS IgG-(IL-2)2的标准化结果。
图8。三名供体中Treg子集敏感性的详细检查，比较DP47GS IgG-IL-2和DP47GS IgG-(IL-2)2。图代表三名供体的pSTAT5a MFI的均值±SD。(A)总CD3+，CD4+，FoxP3+Treg。(B)激活的Treg。(C)记忆Treg。(D)幼稚Treg。
图9。DP47GS IgG-IL2在猕猴中具有提高调节性T细胞的剂量依赖性效果。以(A)每mm3全血Treg的绝对细胞数和(B)Treg的倍数变化显示处理后第7天全血CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(Treg)的变化。以均值±SD呈现所有数据。空心柱：DP47GS IgG-IL-2(n＝6)；阴影柱：媒介(n＝3)。
图10。DP47GS IgG-IL-2对猕猴中Treg的时间和低剂量效果。(A)2或6μg/kg DP47GS IgG-IL-2(分别为n＝4和6)剂量给药后Treg倍数升高的时间依赖性变化。(B)2或6μg/kg DP47GS IgG-IL-2(分别为n＝4和6)剂量给药后血液中Treg绝对数的时间依赖性变化。以均值±SD呈现所有数据。
图11。单剂在猕猴中刺激瞬时剂量依赖性Treg响应。(A)3x104至3x105IU/kg单剂处理后外周血Treg数目的变化。(B)3x104至3x105IU/kg单剂处理后Treg pSTAT5a的变化。以均值±SD呈现所有数据。
图12。低剂量DP47GS IgG-IL-2在猕猴中的Treg诱导方面比高剂量更加有效。用低剂量DP47GS IgG-IL-2或高剂量处理正常健康猕猴(各组n＝5)，并在第10天测试调节性T细胞的变化。在第0天和第7天，以16,800IU/kg(12μg/kg)的剂量SC给予DP47GS IgG-IL-2。每周3次SC给予处理(200,000IU/kg)(MWF)，总共5剂。对于(A)总Treg每mm3血液的变化、(B)Treg的倍数升高、和(C)Treg与常规CD4+FOXP3-细胞的比率的变化，以均值±SD显示结果。空心柱描绘IL-2处理，而阴影柱描绘媒介对照。
图13。离体全血磷酸化STAT5作为DP47GS IgG-IL-2Treg体内激活的灵敏生物标志物。在给健康猕猴(n＝5)体内施用单次低剂量DP47GS IgG-IL-2(12μg/kg)后1和3天，收集全血并在没有刺激磷酸化STAT5(pSTAT5a)的情况下立即测试。在第0天在处理前对每一只猴采血，测量pSTAT5a的量(阴影柱)，并个别地用于评估处理后倍数变化(空心柱)。显示(A)第1天和第3天Treg pSTAT5a的倍数变化，(B)常规CD4+CD45-记忆T细胞中pSTAT5a的倍数变化，和(C)幼稚T细胞pSTAT5a的倍数变化。以均值±SD显示数据。
图14。离体全血pSTAT5a作为低剂量DP47GS IgG-IL-2Treg体内激活的灵敏生物标志物。在给健康猕猴体内施用单次低剂量DP47GS IgG-IL-2后1至7天，收集全血并在没有刺激pSTAT5a的情况下立即测试。在第0天在处理前对每一只猴采血用于测量未刺激pSTAT5a水平，并与处理后的pSTAT5a变化比较。(A)用2μg/kg DP47GS IgG-IL-2处理之前和之后的Treg pSTAT5a(n＝4)。(B)用6μg/kg DP47GS IgG-IL-2处理之前和之后的Treg pSTAT5a(n＝6)。以均值±SD显示数据。
图15。离体猕猴全血Ki-67充当DP47GS IgG-IL-2在体内诱导的T细胞增殖的标志物。还对如图14所述用2和6μg/kg DP47GS IgG-IL-2处理的猕猴离体监测胞内标志物Ki-67的变化以评估体内增殖的程度。在第0天在处理前量化处于细胞周期中的细胞(Ki-67+)的正常稳态百分比，然后下面的7至11天每天监测。显示(A)用于Treg的％Ki-67+，(B)用于常规CD4+CD45-记忆/效应T细胞的％Ki-67+，和(C)用于幼稚CD4+CD45RA+T细胞的％Ki-67+。以均值±SD显示数据。
图16。DP47GS IgG-(IL-2)2对幼稚健康猕猴中的Treg的时间和低剂量效果。(A)6μg/kg DP47IgG-(IL-2)2后Treg绝对数的时间依赖性变化，(B)处理后Treg pSTAT5a的时间依赖性变化，(C)Treg的倍数升高的时间依赖性变化，和(D)来自DP47Gs IgG-IL-2处理的猴(空心柱，2至36μg/kg)与DP47GSIgG-(IL-2)2处理的猴(阴影柱，6μg/kg)的Treg的倍数变化的比较。以均值±SD显示所有数据(n＝4至6)。
图17。很低剂量DP47GS IgG-(IL-2)2对幼稚健康猕猴中的Treg的时间和剂量依赖性效果。(A)施用0.7和2μg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2后Treg倍数升高的时间依赖性变化，(B)在第0天在治疗之前和第1-4天在治疗之后测量的Treg pSTAT5a的依赖性变化，(C)T效应/记忆细胞pSTAT5a的时间依赖性变化。以均值±SD显示所有数据(0.7μg/kg时n＝3，2μg/kg时n＝8)。
图18。DP47GS IgG-IL-2与DP47GS IgG-(IL-2)2的剂量依赖性比较及其提高全血猕猴Treg的能力。以均值±SD呈现所有数据(n＝3至6)。
图19。高剂量IL-2在猕猴中诱导嗜曙红细胞增多。在用或IL-2的免疫缀合物进行的所有测试中监测血液嗜曙红细胞计数的变化。在用高剂量(2x105IU/kg，每周3次，持续2周)或更高剂量DP47GS IgG-IL-2处理后7至14天检测到嗜曙红细胞增多。基线嗜曙红细胞计数为左边的阴影柱，而6μg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2后的嗜曙红细胞计数为右边的阴影柱。(A)来自每一个剂量组的每一种动物的嗜曙红细胞计数和(B)仅来自在处理后嗜曙红细胞升高的动物的嗜曙红细胞计数。以均值±SD显示数据。
图20。DP47GS IgG-IL-2具有与相比增强的PK特性。给NOD小鼠腹膜内(IP)(左边小图)或皮下(SC)(右边小图)注射所示剂量的DP47GS IgG-IL-2或在所示时间通过基于单抗的捕捉测定法在血清样品中评估人IL-2，并以穿过每一幅图的水平线显示每一项测定法的检测限。
图21。用DP47GS IgG-IL-2、和DP47GS IgG-(IL-2)2处理后鼠Treg中CD25和FOXP3均升高。用(20,000和100,000IU/小鼠，n＝3)、DP47GS IgG-IL-2、或DP47GS IgG-(IL-2)2(60、300、或1,500IU/小鼠，n＝3)处理BALB/c小鼠，包括用媒介处理的小鼠作为未刺激对照(n＝4)。处理后24小时，对脾Treg评估CD25和FOXP3水平。对三种IL2分子均观察到(A)细胞表面CD25的剂量依赖性变化和(B)胞内FOXP3的剂量依赖性变化。对于CD25和FOXP3，媒介小鼠的均值MFI分别为4,900和1,566。以均值±SD呈现数据(n＝3)。
图22。体内DP47GS IgG-IL-2处理阻抑鼠绵羊红血球迟发型超敏感性(DTH)。显示用媒介(100％响应)、IgG-IL-2(4,000IU/小鼠)、或作为阳性对照的小鼠CTLA-4-Ig(200μg/小鼠)处理的小鼠个体的所有数据。来自(A)NOD小鼠和(B)C57BL/6小鼠的结果。以爪重量与未免疫小鼠相比的变化(Δ爪重量)显示第4天DTH响应的程度。以均值±SD呈现数据。
图23。体内DP47GS IgG-IL-2(4,000IU/小鼠)处理阻抑针对KLH的鼠IgG抗体应答，(A)C57BL/6小鼠，免疫后21天和(B)NOD小鼠，免疫后7天。以均值±SD显示数据。
发明详述
定义
除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。
如本文中使用的，术语“融合蛋白”指包含免疫球蛋白分子和IL-2分子的融合多肽分子，其中融合蛋白的组件通过肽键彼此连接，或是直接地或是经由肽接头。为清楚起见，融合蛋白的免疫球蛋白构件的各个肽链可以是非共价连接的，例如通过二硫键。
“融合”意指各组分直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。免疫球蛋白结合特定抗原的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000))，以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，免疫球蛋白对无关蛋白的结合程度是该免疫球蛋白对抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的免疫球蛋白具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
“降低的结合”，例如降低的对Fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。
如本文中使用的，术语“抗原性决定簇”与“抗原”同义，并且指多肽大分子上与抗体结合，从而形成抗体-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以例如在细胞表面上、游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。
如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和单域抗体。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有可变区(VH)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
如本文中使用的，“Fab片段”指包含轻链的VL域和恒定域(CL)及重链的VH域和第一恒定域(CH1)的免疫球蛋白片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“可变区”或“可变域”指免疫球蛋白或抗体重或轻链中一般牵涉免疫球蛋白或抗体结合抗原的域。然而，本发明的融合蛋白中包含的免疫球蛋白可包含不赋予抗原结合特异性的可变区。免疫球蛋白或抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。
如本文中所使用的，术语“高变区”或“HVR”指免疫球蛋白或抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区域。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196,901-917(1987))。例示性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区域内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13,1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号(称作“Kabat编号”)。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因而，HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人免疫球蛋白”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人免疫球蛋白全集或其它人免疫球蛋白编码序列自非人来源衍生的免疫球蛋白的氨基酸序列对应的氨基酸序列的免疫球蛋白。人免疫球蛋白的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化免疫球蛋白。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自大约位置231处的氨基酸残基延伸至大约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链附着至CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中CH2域C端的一段残基(即IgG中自大约位置341处的氨基酸残基至大约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333，通过述及明确收入本文)。此类变体CH3域可以用于促进两条不相同免疫球蛋白重链的异二聚化，如本文中描述的。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
术语“效应器功能”指那些可归于免疫球蛋白Fc区且随免疫球蛋白同种型而变化的生物学活性。免疫球蛋白效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
“激活性Fc受体”是一种在免疫球蛋白的Fc区衔接后，引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。激活性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。一种具体的激活性Fc受体为人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637(版本141))。
如本文中使用的，术语“白介素-2”或“IL-2”指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-2，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语涵盖未加工的IL-2以及源自细胞中加工的任何形式的IL-2。该术语还涵盖IL-2的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人IL-2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1。未加工的人IL-2另外包含N末端20个氨基酸的信号肽，其在成熟IL-2分子中缺失。
“天然IL-2”，也称作“野生型IL-2”，意指天然存在IL-2。天然人IL-2分子的序列显示于SEQ ID NO：1。为了本发明的目的，术语野生型还涵盖下述形式的IL-2，其包含一处或多处与天然存在、天然IL-2相比不改变IL-2受体结合的氨基酸突变，诸如例如与人IL-2残基125对应的位置处半胱氨酸变成丙氨酸的替代。在一些实施方案中，本发明目的的野生型IL-2包含氨基酸替代C125A(参见SEQ ID NO：3)。
如本文中使用的，术语“CD25”或“IL-2受体α”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD25，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工的CD25以及源自细胞中加工的任何形式的CD25。该术语还涵盖CD25的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。在某些实施方案中，CD25为人CD25。一种例示性人CD25的氨基酸序列(带信号序列、Avi标签和His标签)显示于SEQID NO：25。
如本文中使用的，术语“高亲和力IL-2受体”指由受体γ亚基(也称作共同细胞因子受体γ亚基、γc、或CD132)、受体β亚基(也称作CD122或p70)和受体α亚基(也称作CD25或p55)组成的IL-2受体异三聚体形式。比较而言，术语“中等亲和力L-2受体”或“IL-2受体βγ”指只包括γ亚基和β亚基，没有α亚基的IL-2受体(综述参见例如Olejniczak and Kasprzak,Med Sci Monit 14,RA179-189(2008))。例示性人CD122和CD132的氨基酸序列(融合至Fc区，带His标签)分别显示于SEQ ID NO 21和23。
“调节性T细胞”或“Treg细胞”意指专门化类型的CD4+T细胞，其能阻抑其它T细胞的应答。Treg细胞特征在于表达CD4、IL-2受体的α亚基(CD25)、和转录因子forkhead box P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))且在诱导和维持针对包括由肿瘤表达的抗原在内的抗原的外周自体耐受中发挥至关重要作用。
“选择性激活Treg细胞”意指在基本上没有伴随激活其它T细胞子集(诸如CD4+T辅助细胞、CD8+细胞毒性T细胞、NK T细胞)或天然杀伤(NK)细胞的情况下激活Treg细胞。实施例中描述了用于鉴定和区分这些细胞类型的方法。激活可包括诱导IL-2受体信号传导(以例如通过检测磷酸化STAT5a测量)、诱导增殖(以例如通过检测Ki-67来测量)和/或上调激活标志物(诸如例如CD25)表达。
术语“肽接头”为包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或本文中记载的。合适的、非免疫原性的接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头。“n”一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。
术语“修饰”指对肽主链(例如氨基酸序列)的任何操作或对多肽的翻译后修饰(例如糖基化)。
“节入穴修饰”指CH3域中两条免疫球蛋白重链之间的界面内的修饰，其中i)在一条重链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条重链的CH3域中的界面内生成隆起(“节”)，其可放置在另一条重链的CH3域中的界面内的空腔(“穴”)中，和ii)在另一条重链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3域的界面内生成空腔(“穴”)，其中可放置第一CH3域中的界面内的隆起(“节”)。在一个实施方案中，“节入穴修饰”包含抗体重链之一中的氨基酸替代T366W和任选的氨基酸替代S354C，及抗体重链另一中的氨基酸替代T366S、L368A、Y407V和任选的Y349C。节入穴技术记载于例如US5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng 9,617-621(1996)及Carter,JImmunol Meth 248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉引入第一多肽的界面处的隆起(“节”)和第二多肽的界面中的相应空腔(“穴”)，使得隆起可位于空腔中，从而促进异二聚化和阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用更小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换在第二多肽的界面中创建与隆起大小相同或相似的互补空腔。分别在位置S354和Y349处引入两个半胱氨酸残基导致在Fc区中的两条抗体重链之间形成二硫桥，进一步使二聚体稳定化(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
氨基酸“替代”指多肽中一个氨基酸用另一种氨基酸替换。在一个实施方案中，氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。“保守”氨基酸替代可以在所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；而带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。非保守替代会需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的成员。例如，氨基酸替代还可导致将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换，例如将来自一个组(例如极性)的氨基酸用来自一个不同组(例如碱性)的另一种氨基酸替换。可以使用本领域公知的遗传或化学方法来生成氨基酸替代。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等等。涵盖的是，通过除遗传工程以外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也可能是有用的。本文中可能使用了多种命名来指示同一氨基酸替代。例如，免疫球蛋白重链第329位自脯氨酸变成甘氨酸的替代可以以329G、G329、G329、P329G、或Pro329Gly来指示。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y的100倍
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，而且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或能由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何物质。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸构件中断。多核苷酸可包含合成后进行的修饰，诸如缀合至标记物。
与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95％“相同的”核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只不过按照参照核苷酸序列的每100个核苷酸，该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一种核苷酸取代参照序列中高达5％的核苷酸，或者可以将参照序列中占总核苷酸的高达5％的数目的核苷酸插入到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任意地方，个别分散在参照序列中的残基中或分散在参照序列内的一或多个连续组中。作为一个实际问题，可以使用已知的计算机程序，如上文针对多肽论述的程序(例如ALIGN-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文中所使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的融合蛋白的任意类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良作用。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、及消退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
“自身免疫疾病”指源自或针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。自身免疫疾病或病症的例子包括但不限于炎症应答诸如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎(例如特应性皮炎)；与炎性肠病有关的应答(诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)；皮炎；变应性疾患，诸如湿疹和哮喘；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)(包括但不限于狼疮肾炎、皮肤狼疮)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症和青少年型糖尿病。
本发明的融合蛋白
本发明提供新颖的免疫球蛋白-IL-2融合蛋白，其具有特别有利的特性可用于本文所述治疗方法。
在第一个方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含：
(i)包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力，和
(ii)两个白介素-2(IL-2)分子。
在一个实施方案中，所述融合蛋白基本上由包含修饰的免疫球蛋白分子、两个白介素-2(IL-2)分子、和任选的一个或多个肽接头组成，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力。
如实施例中显示的，包含两个IL-2分子的融合蛋白令人惊讶地提供与包含单个IL-2分子的相应融合蛋白相比大大改善的功效和激活调节性T细胞方面的选择性。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为人免疫球蛋白分子，即它包含完全人的可变和恒定区。一种例示性人IgG1恒定区的序列显示于SEQ ID NO：8。IgG类免疫球蛋白分子包含(i)两条免疫球蛋白轻链，每一条自N至C末端包含轻链可变域(VL)和轻链恒定域(CL)，和(ii)两条免疫球蛋白重链，每一条自N末端至C末端包含重链可变域(VH)、重链恒定域(CH)1、免疫球蛋白铰链区、CH2域和CH3域。后两个域形成免疫球蛋白分子的Fc区的一部分。两条重链在Fc区中二聚化。
在依照本发明的融合蛋白的一个实施方案中，所述两个IL-2分子各自在它们的N末端氨基酸融合至所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链之一的C末端氨基酸，任选经由肽接头。两个(相同的)IL-2分子与免疫球蛋白重链的融合容许简单生成融合蛋白，避免形成不想要的副产物及规避对促进不相同重链异二聚化的修饰，诸如节入穴修饰的需要。
IL-2分子与免疫球蛋白分子的融合提供与游离(未融合)IL-2相比有利的药动学特性，包括长血清半衰期(由于经由结合FcRn的再循环、和分子大小充分超出肾过滤的阈)。而且，免疫球蛋白分子的存在还能够通过例如蛋白A亲和层析来简单纯化融合蛋白。然而，免疫球蛋白分子(具体是免疫球蛋白分子的Fc区)的存在同时可引起不想要的将融合蛋白靶向表达Fc受体的细胞，而非优选的携带IL-2受体的细胞。此外，Fc受体的参与可引起(促炎症)细胞因子的释放和除调节性T细胞以外的多种免疫细胞不想要的激活。因此，本发明的融合蛋白中包含的所述免疫球蛋白分子包含修饰，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力。在一个具体实施方案中，所述Fc受体为Fcγ受体，特别是人Fcγ受体。对Fc受体的结合亲和力可容易地测定，例如通过ELISA或通过表面等离振子共振(SPR)，使用标准仪器设备，诸如BIAcore设备(GE Healthcare)和Fc受体，诸如可通过重组表达获得。下面描述了一种用于测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。依照一个实施方案，于25℃用在CM5芯片上固定化的配体(Fc受体)使用T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振测量对Fc受体的结合亲和力。简言之，用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依照供应商的用法说明书活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，GEHealthcare)。用10mM乙酸钠pH 5.5将重组配体稀释至0.5-30μg/ml，之后以10μl/min流速注射以实现大约100-5000个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，于25℃以大约30-50μl/min的流速注射抗体在HBS-EP+(GE Healthcare，10mMHEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中的3至5倍连续稀释液(范围介于约0.01nM至300nM之间)。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型( T100Evaluation Software version 1.1.1)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。参见例如Chen et al.,J MolBiol 293,865-881(1999)。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系，诸如表达FcγIIIa受体的NK细胞来评估抗体对Fc受体的结合亲和力。
在一个实施方案中，修饰包含一处或多处降低免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中，氨基酸突变为氨基酸替代。典型的，两条免疫球蛋白重链每一条中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在存在多于一处降低免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可将免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一个实施方案中，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，所述免疫球蛋白分子展现少于20％、特别是少于10％、更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。
在一个实施方案中，所述Fc受体为激活性Fc受体。在一个具体实施方案中，所述Fc受体选自下组：FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。在一个具体实施方案中，Fc受体为Fcγ受体，更具体是FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa受体。优选地，对这些受体每一种的结合亲和力是降低的。在一个甚至更加具体实施方案中，所述Fc受体为FcγIIIa，特别是人FcγIIIa。在一些实施方案中，对补体构件的结合亲和力，具体是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当免疫球蛋白分子展现未修饰形式的免疫球蛋白分子对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现实质性相似的对FcRn的结合，即保留免疫球蛋白分子对所述受体的结合亲和力。本发明的融合蛋白中包含的免疫球蛋白分子可展现大于约80％和甚至大于约90％的此类亲和力。
在一个实施方案中，所述降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力的修饰在免疫球蛋白分子的Fc区中，特别是CH2区。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第329位(EU编号方式)包含氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，所述氨基酸替代为P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第234位和第235位(EU编号方式)包含氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含抗体重链第329位(EU编号方式)处的氨基酸替代和选自免疫球蛋白重链位置228，233，234，235，297和331的位置处的别的氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，别的氨基酸替代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一个特定实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含免疫球蛋白重链第P329位、第L234位和第L235位(EU编号方式)处的氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含免疫球蛋白重链中的氨基酸替代L234A、L235A和P329G(LALAP329G)。这种氨基酸替代组合特别有效地消除人IgG类免疫球蛋白的Fcγ受体结合，如记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831，通过述及完整收入本文。PCT公开文本No.WO 2012/130831还记载了制备此类经修饰免疫球蛋白的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。
在免疫球蛋白重链中包含修饰的免疫球蛋白可以使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除、替代、插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的定点诱变、PCR、基因合成、等等。可通过例如测序来验证正确核苷酸变化。
包含降低Fc受体结合的修饰的免疫球蛋白或抗体一般具有与相应未修饰免疫球蛋白或抗体相比降低的效应器功能，特别是降低的ADCC。因而，在一个实施方案中，所述降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力的修饰降低免疫球蛋白分子的效应器功能。在一个具体实施方案中，所述效应器功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，ADCC降低至由没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子诱导的ADCC的少于20％。免疫球蛋白或抗体的效应器功能可通过本领域已知方法来测量。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定法方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.，Mountain View，CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clyneset al.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子对补体构件(具体是C1q)的结合也是降低的。因而，补体依赖性细胞毒性(CDC)也可以是降低的。可进行C1q结合测定法以测定免疫球蛋白是否能够结合C1q并因而具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
在本文上文和PCT公开文本No.WO 2012/130831所述免疫球蛋白分子之外，Fc受体结合和/或效应器功能降低的免疫球蛋白还包括那些替代Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸第265位、第269位、第270位、第297位和第327位中两个或更多个处具有替代的Fc突变体，包括具有残基265和297变成丙氨酸的替代的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
IgG4亚类免疫球蛋白展现与IgG1免疫球蛋白相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因而，在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中包含的所述免疫球蛋白分子为IgG4亚类免疫球蛋白，特别是人IgG4亚类免疫球蛋白。在一个实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在Fc区中在位置S228处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P。为了进一步降低它对Fc受体的结合亲和力和/或它的效应器功能，在一个实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在位置L235处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E。在另一个实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在位置P329处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代P329G。在一个特定实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在第S228位、第L235位和第P329位处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P、L235E和P329G。此类经修饰IgG4亚类免疫球蛋白及其Fcγ受体结合特性记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831，通过述及完整收入本文。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子能够特异性结合抗原。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够特异性结合抗原，特别是不能够特异性结合人抗原。此类免疫球蛋白分子对抗原的特异性结合的缺失(即能与非特异性相互作用区分开的任何结合的缺失)可例如通过ELISA或表面等离振子共振来测定，如本文中描述的。此类免疫球蛋白分子例如对于延长融合蛋白的血清半衰期是特别有用的，其中不想要靶向特定组织。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含与SEQID NO：9的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含与SEQ ID NO：11的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。在一个甚至更加具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含重链可变区序列SEQ ID NO：9和轻链可变区序列SEQ ID NO：11。包含这些可变区序列的免疫球蛋白分子不能够特异性结合抗原，特别是人抗原。它们缺乏对正常组织以及PBMC的结合，没有多反应性且通过成像不显示非特异性体内积累(数据未显示)。可变区序列完全基于人种系序列，重链CDR 3除外，其中引入GSG序列以生成非结合性免疫球蛋白。
在一个实施方案中，所述IL-2分子为野生型IL-2分子。在一个实施方案中，所述IL-2分子为人IL-2分子。在一个具体实施方案中，所述IL-2分子包含序列SEQ ID NO：1(天然人IL-2)。
在一个实施方案中，所述IL-2分子在与人IL-2残基125对应的位置处包含氨基酸替代。在一个实施方案中，所述氨基酸替代为C125A。在一个具体实施方案中，所述IL-2分子包含序列SEQ ID NO：3(具有氨基酸替代C125A的人IL-2)。或者，位置125处的半胱氨酸可以用另一种中性氨基酸替换，诸如丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，分别生成C125S IL-2、C125T IL-2或C125V IL-2，如记载于美国专利No.4,518,584。如其中记载的，还可以删除IL-2的N末端丙氨酸残基，生成诸如des-A1C125S或des-A1C125A等突变体。或者/另外，IL-2分子可包括野生型人IL-2位置104处正常存在的甲硫氨酸用中性氨基酸诸如丙氨酸替换的突变(参见美国专利No.5,206,344)。人IL-2中的此类修饰可提供别的优点，诸如表达或稳定性升高。
本发明的融合蛋白中包含的IL-2分子也可以是未糖基化的IL-2分子。例如，在哺乳动物细胞诸如CHO或HEK细胞中表达融合蛋白时，消除IL-2分子的O糖基化位点导致更加均质的产物。如此，在某些实施方案中，IL-2分子包含消除IL-2中在与人IL-2残基3对应的位置处的O糖基化位点的修饰。在一个实施方案中，所述消除IL-2中在与人IL-2残基3对应的位置处的O糖基化位点的修饰为氨基酸替代。例示性氨基酸替代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K、和T3P。在一个具体实施方案中，所述修饰为氨基酸替代T3A。
在一个实施方案中，于25℃通过SPR测量时，融合蛋白能够以小于10nM、特别是小于3nM的亲和常数(KD)结合IL-2βγ受体。在一个具体实施方案中，所述IL-2βγ受体为人IL-2βγ受体。在一个实施方案中，于25℃通过SPR测量时，融合蛋白能够以小于100nM、特别是小于20nM的亲和常数(KD)结合IL-2α受体。在一个具体实施方案中，所述IL-2α受体为人IL-2α受体。本文中描述了一种通过SPR测量对IL-2βγ或IL-2α受体的结合亲和力的方法。依照一个实施方案，于25℃用在CM5芯片上固定化的IL-2受体使用T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振测量结合亲和力(KD)。简言之，用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依照供应商的用法说明书活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，GE Healthcare)。用10mM乙酸钠pH 5.5将重组IL-2受体稀释至0.5-30μg/ml，之后以10μl/min流速注射以实现大约200-1000(对于IL-2Rα)或500-3000(对于IL-2Rβγ异二聚体)个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注射IL-2受体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，于25℃以大约30μl/min的流速注射融合蛋白在HBS-EP+(GEHealthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中的3倍连续稀释液(范围介于约3nM至300nM之间)。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(T100Evaluation Software version 1.1.1)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。参见例如Chen etal.,J Mol Biol 293,865-881(1999)。
在一个特定方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含(i)在免疫球蛋白重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式)的IgG1亚类免疫球蛋白分子，和(ii)两个白介素-2(IL-2)分子，每一个在它的N末端氨基酸处经由肽接头融合至免疫球蛋白重链之一的C末端氨基酸。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子和所述IL-2分子是人的。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含重链可变区序列SEQ ID NO：9和轻链可变区序列SEQ ID NO：11。在又一个特定实施方案中，所述IL-2分子每一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：3。在一个甚至更加具体实施方案中，所述融合蛋白包含与序列SEQ ID NO：17至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，和与序列SEQ ID NO：19至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
如实施例中显示的，本发明的融合蛋白可以用于选择性激活调节性T细胞(即基本上没有伴随的其它T细胞子集和/或NK细胞激活)。如此，本发明特别提供融合蛋白，其用于在体外或在体内选择性激活调节性T细胞。在一个实施方案中，所述使用包括在体外或在体内将调节性T细胞与所述融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述使用进一步包括将其它(非调节性)T细胞与所述融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述使用在体外且所述融合蛋白以约1ng/mL或更少、特别是约0.1ng/mL或更少的浓度使用。在另一个实施方案中，所述使用在体内且所述融合蛋白以约20μg/kg体重或更少、特别是约12μg/kg体重或更少、更特别是约6μg/kg体重或更少的剂量使用(其中“体重”指接受融合蛋白施用的个体的体重)。
本发明还提供一种用于在体外或在体内选择性激活调节性T细胞的方法，其包括使所述调节性T细胞与本发明的融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述方法进一步包括使其它(非调节性)T细胞与所述融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述激活包含诱导增殖和/或诱导IL-2受体信号传导。在一个实施方案中，所述方法在体外且所述融合蛋白以约1ng/mL或更少、特别是约0.1ng/mL或更少的浓度使用。在另一个实施方案中，所述方法在体内且所述融合蛋白以约20μg/kg体重或更少、特别是约12μg/kg体重或更少、更特别是约6μg/kg体重或更少的剂量使用(其中“体重”指接受融合蛋白施用的个体的体重)。
依照在先段落中描述的用途或方法的某些实施方案，所述激活包含诱导调节性T细胞增殖和/或在调节性T细胞中诱导IL-2受体信号传导。诱导增殖可通过例如检测胞内增殖标志物Ki-67来测量，如实施例中描述的。在一个实施方案中，由本发明的融合蛋白激活的调节性T细胞增殖与非激活的调节性T细胞的增殖相比升高至少约1.5倍、至少约2倍、或至少约3倍。在一个实施方案中，与本发明的融合蛋白接触的其它(非调节性)T细胞和/或NK细胞的增殖与未与所述融合蛋白接触的相应细胞的增殖相比升高少于约1.5倍、少于约1.2倍、或少于约1.1倍。诱导IL-2受体信号传导可通过例如检测磷酸化STAT5来测量，如实施例中描述的。在一个实施方案中，由本发明的融合蛋白激活的调节性T细胞中IL-2受体信号传导与非激活的调节性T细胞中的IL-2受体信号传导相比升高至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、或至少约5倍。在一个实施方案中，与本发明的融合蛋白接触的其它(非调节性)T细胞和/或NK细胞中的IL-2受体信号传导与未与所述融合蛋白接触的相应细胞中的IL-2受体信号传导相比升高少于约1.5倍、或少于约1.2倍、或少于约1.1倍。
多核苷酸
本发明还提供多核苷酸，其编码如本文中描述的融合物或其片段。
本发明的多核苷酸包括那些与以下所列序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸：SEQ ID NO 2、4、5、6、7、10、12、18和20，包括其功能性片段或变体。
可以将编码本发明的融合蛋白的多核苷酸以编码完整融合蛋白的单一多核苷酸表达，或以共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性融合蛋白。例如，免疫球蛋白的轻链部分可与免疫球蛋白的重链部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 9或11所示的可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 17或19所示的多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO 2、4、5、6、7、10、12、18或20所示的核酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO 2、4、5、6、7、10、12、18或20所示的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO 9或11的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ IDNO 17或19的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列的序列。本发明涵盖编码免疫球蛋白和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO 9或11的可变区序列及保守氨基酸替代的序列。本发明还涵盖编码免疫球蛋白和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO 17或19的多肽序列及保守氨基酸替代的序列。
在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可以例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成来获得本发明的融合蛋白。对于重组生成，分离一种或多种编码所述融合蛋白(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序这类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有融合蛋白(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(1989)；及Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码融合蛋白(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的融合蛋白(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，与内含子-A联合)、猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔β球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述融合物，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明融合蛋白或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。例示性分泌性信号肽的氨基酸和核苷酸序列在SEQ ID NO39-47显示。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白序列的DNA纳入融合蛋白(片段)编码多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个这类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明融合蛋白(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的融合蛋白或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持融合蛋白表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的融合蛋白用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，和Li et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham et al.,J Gen Virol 36,59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)的)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、猕猴肾细胞(MDCK)，牛鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)的)、MRC 5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一免疫球蛋白链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的免疫球蛋白。
在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的融合蛋白的方法，其中所述方法包括在适合于所述融合蛋白表达的条件下培养包含编码融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述融合蛋白。
在本发明的融合蛋白中，各组分(免疫球蛋白分子和IL-2分子)彼此遗传融合。融合蛋白可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度，并可以测试功效。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合蛋白的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，本发明的融合蛋白至少包含能结合抗原的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow and Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring HarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建生成，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
可以将任何动物物种的免疫球蛋白用于本发明。可用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类或人起源的。如果融合蛋白意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的免疫球蛋白(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro and Fransson,FrontBiosci 13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann et al.,Nature 332,323-329(1988)；Queen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Jones et al.,Nature321,522-525(1986)；Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri et al.,Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；及Osbourn et al.,Methods 36,61-68(2005)及Klimka et al.,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。依照本发明的特定免疫球蛋白为人免疫球蛋白。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分和自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；及McCafferty et al.,Nature 348,552-554；Clackson et al.,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。
在某些实施方案中，将本发明的融合蛋白中包含的免疫球蛋白改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于PCT公开文本WO 2012/020006(参见涉及亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的融合蛋白结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(Liljeblad,et al.,Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体。在某些实施方案中，这类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象性表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,inMethods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一标记抗体和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体在与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manualch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的融合蛋白，所述技术如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷、疏水性、亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用融合蛋白结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的融合蛋白的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离融合蛋白，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定融合蛋白的纯度，包括凝胶电泳、高压液相层析等。例如，如实施例中所描述的那样表达的融合蛋白显示为完整且正确装配的，如通过还原性和非还原性SDS-PAGE证明的(见例如图2)。
组合物、配制剂和施用路径
在一个别的方面，本发明提供包含本文中提供的任何融合蛋白的药物组合物，例如用于下述任何治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任何融合蛋白以及药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任何融合蛋白及至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。
还提供以适于体内施用的形式生成本发明的融合蛋白的方法，所述方法包括(a)获得依照本发明的融合蛋白，并(b)将所述融合蛋白与至少一种药学可接受载体配制在一起，由此配制成用于体内施用的融合蛋白制剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的一种或多种融合蛋白。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性，即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利、变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种融合蛋白以及任选地另外的活性成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990例示的，其通过提述并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，会理解制剂应当满足FDA生物标准部门(FDA Office of BiologicalStandards)或其它国家的相应机构要求的无菌性、热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲剂、分散介质、涂料材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂(disintegration agent)、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染料、这类类似的材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.MackPrinting Company,1990,pp.1289-1329，通过提述并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，涵盖其在治疗或药物组合物中的使用。
所述组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其要以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及其对于这类施用路径如注射是否需要是无菌的。可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊泡内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、表面(topically)、局部(locally)、通过吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸洗靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、以乳剂、以液体组合物(例如脂质体)、或通过其它方法或前述项的任意组合施用本发明的融合蛋白(以及任何另外的治疗剂)，如本领域中普通技术人员会知晓的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990，通过提述并入本文)。胃肠外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子如本发明的融合蛋白。
胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用，例如皮下、皮内、损伤内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射，可以将本发明的融合蛋白在水性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制，所述生理学相容的缓冲液如汉克(Hanks)氏溶液、林格(Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，融合蛋白可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以需要的量掺入到具有下文列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌，例如通过过滤流过无菌过滤膜进行。一般地，通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液、悬液或乳剂的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冻冻干燥技术，其将活性成分以及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应当是适当缓冲的，并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会领会的是，应当将内毒素污染最少保持于安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethoniumchloride)；氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)；氯化苄乙铵(benzethoniumchloride)；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。另外，可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如乙基cleats或甘油三酯或脂质体。
可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂，例如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊剂中，在胶体药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液(macroemulsion)中包载。这类技术披露于Remington'sPharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，来产生可注射组合物的延长吸收。
在先前描述的组合物外，融合蛋白还可以配制为贮存(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用这类长效配制剂。如此，例如所述融合蛋白可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。
可以通过常规的混合、溶解、乳化、包囊、包载或冻干过程来制备包含本发明的融合蛋白的药物组合物。可以以常规方式配制药物组合物，其使用一种或多种有助于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。合适的配制剂依赖于选择的施用路径。
可以将融合蛋白以游离酸或碱、中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acidaddition salt)，例如与蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸(如例如氢氯酸或磷酸)或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。
治疗方法和组合物
可以将本文中提供的任一种融合蛋白用在治疗方法中。
对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制、给药和施用本发明的融合蛋白。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的投递部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。
在一个方面，提供用作药物的本发明的融合蛋白。在别的方面，提供用于治疗疾病的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明提供如本文中描述的融合蛋白，用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供融合蛋白，用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是自身免疫疾病。例示性自身免疫疾病包括1型糖尿病、银屑病、哮喘、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症。在一个实施方案中，该疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。在一个特定实施方案中，该疾病选自下组：1型糖尿病，克罗恩氏病，SLE，和多发性硬化症。在一个更加特定实施方案中，该疾病为1型糖尿病。在另一个特定实施方案中，该疾病为多发性硬化症。在又一些实施方案中，该疾病为哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在还有又一些实施方案中，该疾病为心血管病，特别是动脉粥样硬化。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂(如果待治疗的疾病是自身免疫疾病的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供本发明的融合蛋白在制造或制备药物中的用途，所述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是自身免疫疾病。在一个实施方案中，该疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。在一个特定实施方案中，该疾病选自下组：1型糖尿病，克罗恩氏病，SLE，和多发性硬化症。在一个更加特定实施方案中，该疾病为1型糖尿病。在另一个特定实施方案中，该疾病为多发性硬化症。在又一些实施方案中，该疾病为哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在还有又一些实施方案中，该疾病为心血管病，特别是动脉粥样硬化。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂(如果待治疗的疾病是自身免疫疾病的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供用于在个体中治疗疾病的方法，包括对所述个体施用治疗有效量的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药学可接受的形式的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是自身免疫疾病。在一个实施方案中，该疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。在一个特定实施方案中，该疾病选自下组：1型糖尿病，克罗恩氏病，SLE，和多发性硬化症。在一个更加特定实施方案中，该疾病为1型糖尿病。在另一个特定实施方案中，该疾病为多发性硬化症。在又一些实施方案中，该疾病为哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在还有又一些实施方案中，该疾病为心血管病，特别是动脉粥样硬化。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂(如果待治疗的疾病是自身免疫疾病的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的融合蛋白。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明的融合蛋白以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的融合蛋白的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用路径、患者的体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和进程、施用融合蛋白是为了预防还是治疗目的、先前或同时的治疗干预、患者的临床史和对融合蛋白的响应、以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
所述融合蛋白适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的融合蛋白可以是用于对患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注进行。根据上文提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在数天或更长里的重复施用，根据状况，治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。融合蛋白的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中，剂量还可包括每次施用从约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数目，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重的范围等。如此，可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用这类剂量，例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20、或例如约6剂的融合蛋白)。可以施用起始较高的加载剂量，继之以一剂或多剂较低剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测该疗法的进行。
本发明的融合蛋白一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途，以治疗有效量施用或应用本发明的融合蛋白、或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内，尤其根据本文中提供的详细公开内容。
对于系统性施用，能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。
使用本领域中公知的技术，还能从体外数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的融合蛋白的血浆水平。通过注射施用的通常患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况中，融合蛋白的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文中描述的融合蛋白的治疗有效剂量一般将提供治疗益处，而不导致实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定融合蛋白的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，其可以表达为LD50/ED50比。优选展现出较大治疗指数的融合蛋白。在一个实施方案中，依照本发明的融合蛋白展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地，剂量处于具有很小或无毒性的循环浓度(包含ED50)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素，例如采用的剂量形式、利用的施用路径、受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况，各个内科医生可以选择确切的配制剂、施用路径和剂量(参见例如Fingl et al.,1975,in:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1，通过提述完整并入本文)。
用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止、中断或调整施用(由于毒性、器官功能障碍等)。相反，如果临床应答不适当(排除毒性)，主治内科医生还将知晓如何将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级将随待治疗状况的严重程度、施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外，剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其它药剂和治疗
本发明的融合蛋白可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如，本发明的融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的任何活性成分，优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中，另外的治疗剂是免疫抑制剂。
这类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。这类其它药剂的有效量取决于使用的融合蛋白的量、病症或治疗的类型以及上文所述其它因素。所述融合蛋白一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径、或以本文中描述的剂量的约1至99％、或通过凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。
上文记载的这类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分别的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用，在该情况中，本发明的融合蛋白的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后发生。
制品
在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。所述制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合物，其自身或与其它组合物组合对于治疗、预防和/或诊断状况是有效的，并且可以具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的融合蛋白。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的状况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的融合蛋白；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页，其指示该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中描述的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白的轻链和重链核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.etal.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIHPublication No 91-3242。
DNA测序
通过双链测序来测定DNA序列。
基因合成
在需要的情况下，期望的基因片段通过使用合适的模板进行PCR来生成或由Geneart AG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物合成。在确切基因序列不可得的情况下，基于来自最近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并通过RT-PCR从源自合适组织的RNA分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆到标准的克隆/测序载体中。从经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分光术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因片段设计为具有合适的限制性位点以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计为具有编码前导肽的5’端DNA序列，该前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。SEQ ID NO 39-47给出了例示性前导肽和其编码多核苷酸序列。
IL-2Rβγ亚基-Fc融合物和IL-2Rα亚基Fc融合物的制备
为了研究IL-2受体结合亲和力，生成了一种容许表达异二聚体IL-2受体的工具。将IL-2受体的β亚基融合至使用“节入穴”技术(Merchant et al.,NatBiotech.16,677-681(1998))工程化改造成异二聚化的Fc分子(Fc(穴))(见SEQ ID NO 21和22(人)，SEQ ID NO 27和28(小鼠)和SEQ ID NO 33和34(猕猴))。然后将IL-2受体的γ亚基融合至与Fc(穴)异二聚化的Fc(节)变体(参见SEQ ID NO 23和24(人)，SEQ ID NO 29和30(小鼠)和SEQ ID NO35和36(猕猴))。然后使用此异二聚体Fc-融合蛋白作为底物来分析IL-2/IL-2受体相互作用。与AcTev切割位点和Avi His标签一起作为单体链表达IL-2Rα亚基(SEQ ID NO 25和26(人)，SEQ ID NO 31和32(小鼠)和SEQ ID NO 37和38(猕猴))。在HEK EBNA 293细胞中瞬时表达各IL-2R亚基，IL-2Rβγ亚基构建体有血清，而α亚基构建体没有血清。在蛋白A(GE Healthcare)上纯化IL-2Rβγ亚基构建体，接着是大小排阻层析(GE Healthcare，Superdex200)。在NiNTA柱上经His标签纯化IL-2Rα亚基(Qiagen)，接着是大小排阻层析(GE Healthcare，Superdex 75)。各种受体构建体的氨基酸和相应核苷酸序列显示于SEQ ID NO 21-38。
融合蛋白的制备
通过基因合成和/或经典分子生物学技术生成DNA序列，并亚克隆入哺乳动物表达载体，在MPSV启动子控制下且在合成polyA位点上游，每一种载体均携带EBV OriP序列。使用磷酸钙转染用哺乳动物表达载体共转染指数式生长中的HEK293-EBNA细胞来生成下文实施例中应用的融合蛋白。或者，通过聚乙烯亚胺(PEI)用各表达载体转染悬浮生长中的HEK293细胞。或者，在无血清培养基中使用稳定转染的CHO细胞集合或CHO细胞克隆进行生成。随后，自上清液纯化融合蛋白。简言之，用在20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH 7.5中平衡的蛋白A(HiTrap ProtA，GE Healthcare)通过一个亲和步骤纯化融合蛋白。加载上清液后，首先用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH 7.5清洗柱，随后用13.3mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠pH 5.45清洗。用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸pH 3洗脱融合蛋白。中和并合并级分，并在最终配制缓冲液：20mM组氨酸、140mM NaCl pH 6.0中通过大小排阻层析(HiLoad 16/60Superdex 200，GEHealthcare)纯化。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来测定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和缺失下的SDS-PAGE并用考马斯蓝(SimpleBlueTMSafeStain，Invitrogen)染色，分析融合蛋白的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书(4-20％Tris-甘氨酸凝胶或3-12％Bis-Tris)使用预制凝胶系统(Invitrogen)。或者，依照制造商的用法说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper Lifescience)，在还原剂存在和缺失下通过CE-SDS分析分子的纯度和分子量。于25℃在2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％NaN3pH 7.3运行缓冲液中使用Superdex 20010/300GL分析性大小排阻柱(GE Healthcare)分析融合蛋白样品的聚集体含量。或者，于25℃在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸单氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3pH 6.7运行缓冲液中使用TSKgel G3000SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析抗体样品的聚集体含量。
DP47GS IgG-IL-2和DP47GS IgG-(IL-2)2构建体的纯化和表征结果显示于图1和2。
对IL-2受体的亲和力
在下述条件下通过表面等离振子共振(SPR)使用重组IL-2Rβγ异二聚体测定融合蛋白对人、鼠和猕猴IL-2Rβγ异二聚体的亲和力：配体：在CM5芯片上固定化的人、鼠和猕猴IL-2Rβ节γ穴异二聚体，分析物：DP47GSIgG-IL-2(见SEQ ID NO 13、15和19)或DP47GS IgG-(IL-2)2(见SEQ ID NO17和19)，温度：25℃，缓冲液：HBS-EP，分析物浓度：300nM降至3.7nM(1:3稀释)，流：30μl/min，结合：180s，解离：300s，再生：60s 3M MgCl2，拟合：1:1结合，RI≠0，R最大＝全局。还在下述条件下通过表面等离振子共振(SPR)使用重组单体IL-2Rα亚基测定融合蛋白对人、鼠和猕猴IL-2Rα亚基的亲和力：配体：在CM5芯片上固定化的人、鼠和猕猴IL-2Rα亚基，分析物：DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2，温度：25℃，缓冲液：HBS-EP，分析物浓度：100nM降至3.1nM(1:3稀释)，流：30μl/min，结合：60s，解离：180s，再生：无，拟合：1:1结合，RI＝0，R最大＝全局。
用IL-2Rβγ异二聚体或IL-2Rα亚基进行的动力学分析的结果显示于表1。
表1。融合蛋白对IL-2Rβγ和IL-2Rα的结合。
人IL-2对人IL 2Rβγ异二聚体的亲和力据描述为1nM左右，而两种融合蛋白均具有略微更低的亲和力，在2和3nM之间。对鼠IL-2R的亲和力比对人和猕猴IL-2R的亲和力弱数倍。
免疫细胞上的IL-2受体表达
高亲和力三聚体IL-2受体由α(IL-2RA，CD25)、β(IL-2RB，CD122)和γ(IL-2RG，CD132)链构成且具有约10pM的KD。单独的CD25对IL-2只具有低亲和力(KD约10nM)。在IL-2RA缺失下在一些细胞类型上表达的IL-2RB/IL-2RG二聚体也结合IL-2但亲和力中等(KD约1nM)。经IL-2受体的信号传导是由IL-2RB和IL-2RG链介导的。根据晶体结构分析，IL-2RA看来不接触IL-2RB或IL-2RG任一。已经提出三聚体受体协同的基础是CD25在细胞表面处捕捉IL-2以呈递给IL-2RB和IL-2RG时的熵降低，或者是发生CD25诱导的IL-2构象改变，由此稳定化复合物。在FOXP3+调节性CD4+T细胞中，有IL-2RA与受体的β和γ链相比化学计量大大过量，这支持α链的二聚体或甚至更大的复合物帮助IL-2结合的假说。还有一个细胞上的CD25能以高亲和力、细胞间相互作用将IL-2呈递给另一个细胞上的IL-2RB/IL-2RG二聚体的证据，这强调构成高亲和力IL-2受体的三条链之间的独特相关性。
通过FACS测定CD4+Treg子集，NK细胞子集和NKT细胞，以及CD4+和CD8+常规T细胞子集上的CD25(IL-2RA)和CD122(IL-2RB)表达(图3和4)。使用细胞表面标志物来定义CD4+Treg子集、NKT细胞和NK细胞(图3)。为了优化对CD25和CD122的染色，没有实施细胞内FoxP3染色。简言之，使用一名健康志愿者捐献的150μl血液，将荧光抗体在黑暗中于室温温育45分钟(在开始时及20分钟后漩涡震荡)。用BD裂解缓冲液(BD FACS LysingSolution，349202)将红细胞裂解9分钟，清洗(2ml PBS+0.1％BSA)并固定(1％PFA)剩余细胞。在LSRFortessa细胞分析仪(Becton Dickinson)上分析细胞，并使用FloJo软件(TreeStar)分析数据。使用对TCRαβ-FITC(IP26，BioLegend)、CD4-Alexa Fluor 700(RPA-T4，BioLegend)、CD127-PE/CY7(ebioRDR5，Ebioscience)、CD45RA-太平洋蓝(HI100，BioLegend)、CD25-APC(2A3，M-A251，BD Biosciences)和CD122-PE(TU27，BioLegend)特异性的抗体鉴定Treg子集。在另一个管中用对TCRαβ-FITC、CD4-AlexaFluor 700、CD8-PE/CY7(HTT8a，BioLegend)、CD56-太平洋蓝(HCD56，BioLegend)、CD25-APC和CD122-PE特异性的抗体对NK和NKT细胞染色。在基于FSC/SSC的淋巴细胞射门之后并排除重复，以TCRαβ+、CD4+、CD127-、CD25+、CD45RA+鉴定幼稚Treg，以TCRαβ+、CD4+、CD127-、CD25+、CD45RA-鉴定记忆Treg，并以TCRαβ+、CD4+、CD127-、CD25高、CD45RA-鉴定激活的Treg。以TCRαβ-、CD56+鉴定NK细胞，并以TCRαβ-，CD56亮鉴定激活的NK细胞。以TCRαβ+、CD56+鉴定NKT细胞。分别使用缀合至APC和PE的同种型对照来评估CD25和CD122的背景荧光。
类似地，使用细胞表面标志物来定义幼稚和记忆常规CD4+T细胞(图4A和4B)，记忆常规CD8+T细胞和CD45RA+CD8T细胞(幼稚和TEMRA子集的一种组合；TEMRA指恢复表达CD45RA的效应器记忆细胞)(图4C和4D)。如上所述实施染色和分析。使用上文所述同一管来表征CD4+Treg，以TCRαβ+、CD4+、CD127+、CD25-/+、CD45RA+鉴定CD4+常规幼稚T细胞，并以TCRαβ+、CD4+、CD127+、CD25-/+、CD45RA-鉴定CD4+常规记忆T细胞。使用TCRαβ-FITC、CD8-Alexa Fluor 700(HTT8a，BioLegend)、CD28-PE/CY7(CD28.2，BioLegend)、CD45RA-太平洋蓝、CD25-APC和CD122-PE定义CD8T细胞。以TCRαβ+、CD8+、CD45RA-鉴定CD8+记忆T细胞。以TCRαβ+、CD8+、CD45RA+鉴定CD8+幼稚和TEMRA(TEMRA指恢复表达CD45RA T细胞的效应器记忆细胞)。没有使用CD28来区分CD8+幼稚T细胞与CD8+TEMRA T细胞，因为下文所述pSTAT5a分析中没有包括CD28标志物(参见图5)。
在图3和4中，为人外周血中的T细胞、NK细胞和NK T细胞子集显示了IL-2RA和IL-2RB的细胞特异性表达(IL-2RG在造血细胞上具有实质性普遍的表达，因为它与多种细胞因子受体成配偶)。三种调节性CD4+T细胞(Treg)群上存在最高水平的IL-2RA：幼稚(CD45RA+、CD25+)，记忆(CD45RA-、CD25+)和激活的(CD45RA-、CD25高)(图3A)。平均而言，常规记忆CD4+T细胞表达比Treg少大约10倍的CD25(图4A)。幼稚CD4+T细胞上的CD25表达在供体间显著变化但始终比在记忆CD4+T细胞上观察到的低(图4A)。NK、NKT和CD8T细胞上的CD25表达很低或检测不到，CD56亮NK细胞除外(图3C和4C)。CD56亮NK和CD56+NK细胞表达最高水平的IL-2RB(图3D)，比包括NKT细胞在内的任何T细胞子集多大约10倍(图3B、3D、4B、4D)。
人外周血细胞子集中的pSTAT5a诱导
在IL-2诱导的三聚体IL-2R寡聚化之后，分别与IL-2RB和IL-2RG胞内域有关的JAK1和JAK3胞质蛋白质酪氨酸激酶变成活化的。这些激酶磷酸化某些IL-2RB酪氨酸残基，它们作为继而被磷酸化的STAT5a和STAT5b的停靠位点起作用。IL-2诱导的数种信号传导途径激活最终导致有助于多种与IL-2/IL-2R途径有关的功能的靶基因转录。由于多种细胞类型表达不同水平的IL-2受体IL-2RA和IL-2RB分子(图3和4)，为了了解由高和中等亲和力受体的各种组合介导的对IL-2的整合信号传导响应，我们通过多色(polychromatic)流式细胞术测量了各个细胞内的pSTAT5a水平。
在人CD4+Treg子集、幼稚和记忆常规CD4+T细胞、记忆常规CD8+T细胞、CD45RA+CD8T细胞、NKT细胞和NK细胞中评估了各种剂量的DP47GSIgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2对STAT5a磷酸化诱导的影响(图5和6)。对每一种剂量在一个管中表征所有子集。简言之，将来自一名健康志愿者的血液采集入肝素化管。将各种浓度的DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2添加至500μl血液并于37℃温育。30分钟之后，使用预温热的裂解/固定缓冲液(Becton Dickinson#558049)将血液于37℃裂解并固定10分钟，用含有0.2％BSA的PBS清洗2次，接着在冰上用-20℃预冷却的甲醇(Sigma，Biotech级#494437)透化20分钟。然后将细胞用含有0.2％BSA的PBS充分清洗4次，之后使用一组荧光抗体实施FACS染色以区分不同淋巴细胞和NK细胞亚群和pSTAT5a状态。所利用的抗体为抗CD4-Alexa Fluor 700(克隆RPA-T4)、CD3-PerCP/Cy5.5(UCHT1)、CD45RA-PE/Cy7(HI100)、CD8-亮紫605(RPA-T8)、CD56-亮紫421(HCD56)、FOXP3-PE(259D)(均来自BioLegend)、CD25-APC(克隆M-A251&2A3)和pSTAT5a-Alexa Fluor 488(pY694)(Becton Dickinson)。使用LSRFortessa细胞分析仪(BectonDickinson)获取样品，并使用FloJo软件(TreeStar)分析数据。在门选淋巴细胞及排除重复之后，以CD3+、CD4+、FOXP3+定义Treg，并以CD45-FOXP3高(激活的Treg)，CD3+、CD4+、CD45RA-、FOXP3+(记忆Treg)和CD3+、CD4+、CD45+、FOXP3+(幼稚Treg)细分。以CD3+、CD4+、CD45RA+(幼稚)和CD3+、CD4+、CD45RA-(记忆)定义常规CD4+T细胞。以CD3+、CD8+、CD45RA-(记忆)和CD3+、CD8+、CD45RA+定义CD8T细胞。以CD3+、CD56+定义NKT细胞且以CD3-、CD56亮(激活的NK细胞)或CD3-、CD56+(NK细胞)定义NK细胞。于所有剂量量化所有细胞子集中的胞内pSTAT5a水平。
图5显示DP47GS IgG-IL-2免疫缀合物对来自三名供体个体(在不同日子测试)的人外周血中的T细胞、NK细胞和NK T细胞的剂量响应。对DP47GSIgG-IL-2的响应性的分层在所有三名供体中是相同的，而且与使用重组人IL-2()时观察到的(数据未显示)相同。所有三个Treg群(激活的(CD45RA-、CD25高)、记忆(CD45RA-、CD25+)、和幼稚(CD45RA+、CD25+))在0.1ng/ml浓度的DP47GS IgG-IL-2提高pSTAT5a水平，而其它细胞群需要大于1ng/ml(CD56亮NK和记忆CD4+T细胞)或10-100ng/ml(记忆CD8+T细胞、CD56+NK细胞、幼稚CD4+T细胞、NKT细胞和CD45RA+CD8T细胞)的DP47IgG-IL-2来生成可检测的pSTAT5a升高。对于展示对DP47GSIgG-IL-2的高敏感性的Treg群，更加详细的剂量响应还可见图8。值得注意的是，与T细胞子集上的IL-2RB表达相比，具有中等CD56水平的NK细胞上的高IL-2RB表达(图3D)不足以容许Treg样IL-2敏感性。总之，激活的、记忆和幼稚Treg子集显示对DP47GS IgG-IL-2的最大敏感性，而CD56亮NK细胞和CD4+常规记忆T效应细胞的敏感性低20-50倍。在分析pSTAT5a升高的其它细胞子集中，CD8+记忆T效应细胞、CD4+幼稚T效应细胞、NKT细胞、“静息”NK细胞(CD56染色阳性，不亮)、和CD8+幼稚T效应+CD45RA+记忆细胞对IgG-IL-2免疫缀合物相对不敏感。
图6显示DP47GS IgG-(IL-2)2对来自五名供体个体(在不同日子测试)的人外周血中的T细胞、NK细胞和NK T细胞的剂量响应。正如对DP47GSIgG-IL-2观察到的(图5)，三种Treg子集是对DP47GS IgG-(IL-2)2诱导的pSTAT5a最敏感的细胞(图6和8)，而且在所有五名个体中对其它细胞子集看到相似的分层剂量响应。
为了更加容易地比较DP47GS IgG-IL-2和DP47GS IgG-(IL-2)2，将pSTAT5a值标准化(图7)。为了标准化MFI值，自每一种门选子集所有经过刺激的MFI值减去该细胞子集特异性的未经刺激的pSTAT5a MFI值。所得值除以由该子集在剂量响应中获得的最高pSTAT5a MFI值。基于实现对该子集观察到的最大pSTAT5a MFI的50％需要的IL-2融合蛋白量评估EC50。如图7所示，DP47GS IgG-(IL2)2免疫缀合物在组成性表达CD25的细胞中生成更加有力的pSTAT5a诱导，这可能是免疫缀合物对高亲和力IL-2受体的亲合力升高的后果。在直接比较DP47GS IgG-(IL-2)2与DP47GS IgG-IL-2时，Treg中pSTAT5a激活的EC50据观察低5-9倍。表2总结了不同细胞子集中DP47GSIgG-IL-2与DP47GS IgG-(IL-2)2的pSTAT5a激活的代表性EC50值和倍数差异。
表2。不同细胞子集中DP47GS IgG-IL-2与DP47GS IgG-(IL-2)2的pSTAT5a激活EC50值和倍数差异。
T细胞 IgG-IL-2 IgG-(IL-2)2 倍数变化
激活的Treg 0.10ng/mL 0.020ng/mL 5
记忆Treg 0.22ng/mL 0.033ng/mL 7
幼稚Treg 0.20ng/mL 0.023ng/mL 9
CD56亮NK 2.0ng/mL 0.63ng/mL 3
CD4T常规记忆 5ng/mL 0.7ng/mL 7
NK细胞 35ng/mL 10ng/mL 4
甚至在极端有限的浓度，DP47GS IgG-(IL-2)2生成与DP47GS IgG-IL-2相比更高水平的pSTAT5a(图8)。为了这项实验，在同一天在有限浓度的IL-2对来自三名健康志愿者的血液分别测试对DP47IgG-IL-2和DP47IgG-(IL-2)2的2倍滴定的响应。图8中的图呈现三名供体的pSTAT5a MFI均值±SD。在分别检验的三种Treg子集(图8B-D)之外，应用一个门来评估总CD3+、CD4+、FoxP3+Treg中的pSTAT5a(图8A)。结果清楚地指示Treg的DP47GS IgG-(IL-2)2激活效力升高5-10倍，尽管每IgG分子的IL-2只升高2倍。如上所述实施多色流式细胞术(参见图5)。
CD4+常规记忆T细胞还响应与DP47GS IgG-IL-2相比更低(7倍)浓度的DP47GS IgG-(IL-2)2。虽然在比较DP47GS IgG-(IL-2)2与DP47 IgG-IL-2时CD56亮NK细胞和CD56+NK细胞的EC50值更低，但是降低分别只有3倍和4倍。这有可能是由于这些细胞在IL-2介导的信号传导方面对中等亲和力IL-2受体的依赖性。Treg中与NK细胞相比ED50的这种差异位移将Treg激活偏爱提高数倍。
猕猴外周血细胞子集中的pSTAT5a诱导
正如在人外周血中观察到的，在用IL-2()刺激的猕猴外周血中的Treg子集中存在优先且相似的剂量依赖性pSTAT5a诱导(数据未显示)。在DP47GS IgG-(IL-2)2和DP47GS IgG-IL-2在三种Treg子集中诱导pSTAT5a的能力的直接比较中，达到最大pSTAT5a水平的50％需要的DP47GSIgG-(IL-2)2要少2-8倍。表3总结了DP47GS IgG-IL-2与DP47GS IgG-(IL-2)2相比在不同猕猴Treg子集中激活pSTAT5a的EC50值，结果与用人外周血看到的结果(表2)惊人相似。
与人全血相似，使用细胞表面和胞内标志物在来自正常健康猕猴的全血中鉴定调节性T细胞子集和常规T细胞。在同一天在肝素钠管中自三只健康猕猴收集血液样品，将多种浓度的DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2添加至500μl血液，并于37℃温育。于37℃ 10分钟后，用预温热的BD裂解/固定缓冲液(BD Biosciences)裂解并固定样品。清洗后，将细胞在冰上用1mL甲醇透化30分钟。将样品清洗3次，并用一组FOXP3-Alexa647(克隆：259D，BioLegend)、CD4-V500(克隆：L200，BD Biosciences)、CD45RA-V450(克隆：5H9，BD Biosciences)、CD25-PE(克隆：4E3，eBioscience)、pSTAT5a-Alexa488(克隆：47，BD Biosciences)、和Ki-67-PerCP-Cy5.5(克隆：B56，BD Biosciences)于4℃染色1小时。通过LSRFortessa细胞分析仪(Becton Dickinson)获取所有样品，然后用FlowJo软件(Tree star,Inc.，Ashland，USA)进行分析。
表3。猕猴外周血Treg子集中响应DP47GS IgG-IL-2和DP47GS IgG-(IL-2)2的pSTAT5a诱导。
T细胞 IgG-IL-2 IgG-(IL-2)2 倍数变化
激活的Treg 0.07ng/mL 0.02ng/mL 4
记忆Treg 0.21ng/mL 0.025ng/mL 8
幼稚Treg 0.040ng/mL 0.02ng/mL 2
猕猴中Treg数目的诱导
用DP47GS IgG-IL-2体内处理的猕猴动物在给药后7天具有Treg绝对数以及超出基线的倍数升高方面的剂量依赖性升高(分别见图9A和9B)。在所有测试中使用两种性别、年龄范围3至6岁的正常健康猕猴，而且无一动物使用多于一次。在麻醉下，在背侧上SC注射多种剂量的DP47GS IgG-IL-2(n＝4-6)或媒介(n＝3)。DP47GS IgG-IL-2的个体剂量基于体重，而且在媒介含有0.5％无菌正常猕猴血清的无菌PBS pH 7.2中配制用于注射。在处理后的多个时间收集血液样品，并用Advia自动化血液学分析仪以及上文详述的细胞表面和胞内标志物(表3的实验规程)测试血液学变化(CBC和差示)。处理后第7天全血CD4+、CD25+、FOXP3+、调节性T细胞的变化以每mm3全血的绝对细胞数(图9A)和Treg中的倍数变化(图9B)显示于图9；所有数据以均值±SD呈现。在更高剂量25μg/kg和36μg/kg DP47GS IgG-IL-2，观察到分别为几乎3倍(范围为111-255％，n＝6)和4倍(范围为110-470％，n＝6)的平均Treg升高。进一步降低DP47GS IgG-IL-2的SC剂量(12、6、和2μg/kg)继续相应引起Treg数目变化和倍数变化降低。不希望受限于理论，12μg/kgDP47GS IgG-IL2剂量的约2倍Treg升高(范围为67-133％，n＝6)代表期望的Treg升高。人中的Treg数目范围较大(每mm3血液20-90个Tregs；4至10％的CD4+T细胞)，而且个体内由IL-2诱导的Treg增多会导致功能性阻抑总体升高的假设是合理的。然而，可能想要在持久的时段里不增加Treg数目超出这种细胞群体的正常范围，但是主要增强这些细胞的功能。
在评估更低剂量的DP47GS IgG-IL-2(2-6μg/kg)时，更加频繁地收集血液样品以鉴定用于检测DP47GS IgG-IL-2施用之后Treg变化的最佳时间(图10)。虽然Treg的变化存在7天，但是最大刺激发生于第4天，比用更高剂量的DP47GS IgG-IL-2测量到的要早(第7天，图9)。
在通过用于在Treg和其它IL-2响应性细胞中刺激pSTAT5a的IL-2活性单位直接比较时(数据未显示)，和DP47GS IgG-IL-2在体外在人和猕猴全血测定法中是相当的。在已知在人中半衰期较短的情况下，在猕猴中进行单剂研究以评估体内Treg诱导和激活。在Treg中生成剂量和时间依赖性变化，这是通过绝对数以及pSTAT5a激活的倍数变化测量的。虽然Treg数目的增多是有名无实的(图11A：10-40％)，但是Proleukin诱导的Treg pSTAT5a升高在处理后一天是实质性的且剂量依赖性的(图11B)。
DP47GS IgG-IL-2在体内在猕猴中诱导Treg增多的能力与的能力的比较显示于图12。用低剂量的DP47GS IgG-IL-2或高剂量的处理正常健康猕猴(多组n＝5)，并在第10天测试调节性T细胞的变化。在第0天和第7天，以16,800IU/kg的剂量(图9中所示12μg/kg剂量)SC给予DP47IgG-IL-2。基于已发表的工作(其中将给予1型糖尿病患者(4.5x106IU/人，3次/周)并显示出增加Treg)和图11中的单剂数据，每周3次(周一、周三、周五)SC给予总共5剂，每剂200,000IU/kg(猕猴当量4.5x106IU/人)。结果以每mm3血液总Treg的变化(图12A)、Treg数目的倍数增加(图12B)、和Treg与常规CD4+FOXP3-细胞的比率的变化(图12C)的均值±SD显示于图12。
虽然在10天时段里施用的DP47GS IgG-IL-2活性少几乎30倍，但是DP47GS IgG-IL-2诱导比更大的Treg数目增多(图12A，p＝0.06)。Treg数目超出基线的倍数增多(图12B)和Treg相对于常规CD4T细胞的增多(图12C)在服用DP47GS IgG-IL-2的猴中与相比也更大(分别为p＝0.0011和p＝0.016。在人中，常常将调节性CD4T细胞(通常以FoxP3+或通过表面标志物组合来定义)与非调节性CD4T细胞(称作常规或效应细胞)的比率用于定义患者中随时间的功能性Treg水平。
猕猴外周血细胞子集对低剂量DP47GS IgG-IL-2处理的体内响应
低剂量IL-2处理的体内细胞特异性是一项至关重要的参数。我们确定了通过在对猕猴或小鼠给药后多个时间采集的血液中离体测量pSTAT5a水平，能灵敏地监测DP47GS IgG-IL-2或诱导的体内细胞激活。能在体外监测的所有细胞群(图5-7)的体内响应也能离体检查。
在对健康猕猴(n＝5)体内施用单次低剂量DP47GS IgG-IL-2(12μg/kg)后1和3天，采集全血并如上所述测试STAT5a磷酸化(表3的实验规程)。在处理前第0天对每一只猴采血，测量STAT5a磷酸化的量，并个别地用于评估处理后的倍数变化。第1天和第3天Treg中的pSTAT5a倍数变化显示于图13A，常规CD4+CD45RA-记忆T细胞中的pSTAT5a倍数变化显示于图13B，而常规CD4+CD45RA+幼稚T细胞中的pSTAT5a倍数变化显示于图13C。结果清楚地显示单次低剂量(12μg/kg)DP47GS IgG-IL-2后1和3天获得的猕猴血液显示Treg细胞中与记忆和幼稚CD4+T细胞相比优先的pSTAT5a升高(图13A-C)。单次低剂量DP47GS IgG-IL-2在生成持久的体内Treg激活状态方面明显优于单次高剂量(图11B)。
使用STAT5a磷酸化作为Treg激活的体内生物标志物的初始研究看到最大pSTAT5a的时间在单剂的情况中只有1天(图11B)而在低剂量(12μg/kg)DP47GS IgG-IL-2的情况中有1和3天(图13A)。与另外的采样时间组合，DP47GS IgG-IL-2的进一步滴定显示体内pSTAT5a信号能维持4天，之后在7天时下降回到正常(图14A，14B)。2μg/kg(14A，n＝4)和6μg/kg(14B，n＝6)剂量二者的pSTAT5a信号的MFI(均值荧光强度)提示发生不及最大的pSTAT5a信号传导(见图16B)。即使这些很低剂量的DP47GSIgG-IL-2也提供持久的Treg体内信号传导，而且优于(图11B)。这些结果支持我们的假设，即很低水平的长效IL-2(即DP47GS IgG-IL-2，而非)能在体内刺激Treg持续延长的时段，由此降低再建立支配性的自体耐受和改善疾病结局需要的治疗频率。低剂量IL-2处理后外周血中的Treg细胞增多可能反映身体中细胞分布的变化，而非实际的细胞增多。为了证实体内Treg增多至少部分由于IL-2处理对细胞分裂的诱导，评估胞内增殖标志物Ki-67。Ki-67这种蛋白质能在G1、S、G2、和有丝分裂期间在核中检测到，但是在处于细胞周期的G0期的静息细胞中缺失。还如(表3的实验规程)所述对上文所述用2和6μg/kg DP47GS IgG-IL-2处理的猕猴(图14)监测胞内标志物Ki-67的离体变化以评估体内增殖程度。将第0天时处于细胞周期中(Ki-67+)的细胞的百分比与处理后1至11天时Ki-67+的细胞的百分比比较。Ki-67+Treg显示于图15A，常规CD4+CDRA45-记忆T细胞显示于图15B，而常规幼稚CD4+CD45RA+T细胞显示于图15C。单次低剂量DP47GS IgG-IL-2(6μg/kg)后1至7天获得的猕猴血液细胞显示在Treg中与幼稚常规CD4+T细胞相比优先的Ki-67增多(图15A与15C相比)。与幼稚T细胞不同，DP47GSIgG-IL-2(6μg/kg)能够刺激常规记忆CD4+T细胞增殖(图15B)。在最低剂量的DP47GS IgG-IL-2(2μg/kg)，存在与6μg/kg剂量相比最小限度进入细胞周期和增殖的激活。
在人和猕猴全血测定法中，在聚集体中，DP47GS IgG-(IL-2)2的体外活性对Treg的效力比DP47GS IgG-IL-2高大约6倍(表1和3)。因而，给猕猴的第一种剂量比DP47GS IgG-IL-2测试的最高剂量(36μg/kg)低6倍。以6μg/kg(n＝4)施用的DP47GS IgG-(IL-2)2引起循环Treg大大增多(图16A)、Treg中显著且延长的pSTAT5a(在1周时回到正常)(图16B)、和Treg数目增多几乎3倍(图16C)。DP47GS IgG-IL-2诱导的倍数变化(来自图9，空心柱)与6μg/kg剂量的DP47GS IgG-(IL-2)2(阴影柱)(图16D)比较。与人和猕猴全血测定法相似，DP47GS IgG-(IL-2)2展现增强的体内效力，超过其IL-2每分子IgG的2倍增多。
对猕猴给予别的剂量的DP47GS IgG-(IL-2)2以评估其在很低剂量(2和0.7μg/kg)的体内效果(图17)。虽然2μg/kg引起中等倍数变化(均值46％，范围为20至70％，n＝8)，但是0.7μg/kg剂量对T细胞数目影响较小(均值增多为16％，n＝3)(图17A)。两种低剂量均在Treg中刺激pSTAT5a升高(图17B，每一种n＝3)，但是对T效应/记忆细胞pSTAT5a影响较小(图17C，每一种n＝3)。
IL-2疗法的顶板效应(overarching effect)及其在猕猴中使Treg增多的能力呈现于图18。两种形式的长效IgG-IL-2均是有力的Treg诱导物，能在体内以pSTAT5a作为激活的生物标志物和在此图中以循环Treg的数目的倍数增多来跟踪。通过倍增IgG C末端处的IL-2分子来实现其效力增强的DP47GSIgG-(IL-2)2具有胜过DP47GS IgG-IL-2的剂量依赖性卓越性。
在以1x106至4.5x106IU/人的剂量每天给予时，在人中刺激嗜曙红细胞增多。在猕猴中，重复处理或单剂DP47GS IgG-IL-2后看到相似的嗜曙红细胞增多(图19)。图19A中的结果代表测试的每一只动物(n＝5-6)，不管嗜曙红细胞数目是正常的还是升高的。图19B中的数据只代表发生处理相关血液嗜曙红细胞升高的猴。以均值±SD显示数据。空心柱为DP47GS IgG-IL-2处理，而右边的阴影柱来自6μg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2处理的猴(来自图16)。结果汇总显示于下文表4。尽管25μg/kg DP47GS IgG-IL-2和6μg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2在Treg方面等同，但是它们对嗜曙红细胞的影响显著不同，分别为50％响应者与0％响应者。
表4。猕猴中IL-2的嗜曙红细胞的药理诱导。
DP47GS IgG-IL-2在小鼠中的药动学特性
在开始小鼠中的功能研究之前，将DP47GS IgG-IL-2的药动学(PK)特性与的药动学特性比较(图20)。
在含有0.5％小鼠血清的PBS中给NOD小鼠IP(图20A)或SC(图20B)注射所示剂量的DP47GS IgG-IL-2或并在注射后多个时间采血。DP47GS IgG-IL-2的剂量汇总于表4。在血清样品中评估人IL-2，使用小鼠抗人IL-2单抗，BD Pharmingen，产品目录#555051，克隆5344.111包被96孔板以捕捉IL-2。使用生物素化小鼠抗人IL-2单抗，BD Pharmingen，产品目录#555040，克隆B33-2检测IL-2。使用缀合有铕的链霉亲合素显现结合。
如先前所述，清除迅速。相反，DP47GS IgG-IL-2清除慢得多。来自比较DP47GS IgG-IL-2在正常小鼠和NOD-scid CD25KO小鼠中的PK的结果支持下述假设，即驱动DP47GS IgG-IL-2体内清除的主要成分是高亲和力IL-2受体(数据未显示)。
表4。图20所示PK研究的DP47GS IgG-IL-2剂量。
用IgG-IL-2处理后Treg中的FOXP3和CD25MFI升高
为了比较免疫缀合物DP47GS IgG-IL-2和DP47GS IgG-(IL-2)2、及重组人IL-2()在体内刺激FoxP3+Treg细胞的能力，给小鼠皮下注射DP47GS IgG-IL-2、或DP47GS IgG-(IL-2)2，并在先前确定的最佳时间24小时对Treg监测CD25和FOXP3表达的变化(图21)。
给年轻健康BALB/c小鼠(n＝3/处理组，n＝4/媒介对照分组)皮下注射(20,000或100,000IU)、DP47GS IgG-IL-2(60、300、或1,500IU)、或DP47GS IgG-(IL-2)2(60、300、或1,500IU)。在100μl含有0.5％无菌过滤小鼠血清的无菌PBS pH 7.2中投递剂量。24小时后，对小鼠处以安乐死并切出脾。在1ml L-15培养基中生成脾细胞的单细胞悬浮液并在冰上保存，直至进一步加工。将单细胞悬浮液经过过滤的等分试样40μl转移至FACS管，并用2ml FACS缓冲液清洗(600x g，5min)。然后将样品与缀合有荧光染料的针对细胞表面抗原的抗体一起温育：CD4(克隆RM4-5，荧光染料A700)，CD25(eBio7D4，Af488)，CD44(IM7，e605)，CD62L(MEL-14，PE)，ICOS(C398.4A，PE/Cy7)，CD103(2E7，APC)。在100μl FACS缓冲液(PBSpH 7.2+0.2％BSA)中于4℃实施染色30分钟。细胞表面染色后，用4ml FACS缓冲液清洗样品(600x g，5min)，之后进行胞内染色(依照eBioscience胞内染色方案)。简言之，将样品重悬浮于200μl固定/透化缓冲液(eBioscience#00-5521)并于4℃温育1小时。将1ml 1x透化缓冲液(eBioscience#00-8333)添加至样品，之后是3ml FACS缓冲液和清洗(600x g，5min)。在100μl 1x透化缓冲液于4℃对胞内抗原Ki-67(B56，PerCP Cy5.5)和FOXP3(FJK-16S，e450)染色1小时。用4ml FACS缓冲液清洗样品(600x g，5min，两次)，在BD Fortessa分析仪上获取数据，并使用FlowJo软件(Tree Star Inc.)进行分析。以来自淋巴细胞门内单峰的CD4+、FOXP3+定义Treg；对来自这个群体的所有样品计算CD25和FOXP3均值荧光强度(MFI)。
如图21所示，与100,000IU的相比，300IU的DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2诱导相似的CD25上调，而1,500IU甚至更加有力(图21A)。刺激胞内FOXP3的能力显示两种IL-2免疫缀合物相似的与相比的能力增强。在所有处理组中，以均值±SD显示数据。先前的研究显示了FOXP3和CD25水平在IL-2处理后72小时回到基线。
在小鼠中DP47GS IgG-IL-2体内处理阻抑免疫应答
在图21所示之前的初步研究中，我们观察到4,000IU DP47GS IgG-IL-2剂量在体内激活小鼠FOXP3+调节性T细胞；然后使用这种剂量来评估它在小鼠中阻抑经典T依赖性免疫应答的能力，即迟发型超敏感性(图22)和IgG抗KLH应答(图23)。
给NOD小鼠和C57BL/6小鼠(n＝7)IV免疫绵羊红血球(srbc)，并在3天后攻击，即单个后足中的srbc推注以诱导迟发型超敏感性(DTH)应答。攻击后1天，用CO2对小鼠处以安乐死，切下爪并称重。以爪重量与未免疫小鼠相比的变化显示DTH应答的程度(Δ爪重量)。在srbc免疫前3天和当天以4,000IU每只小鼠SC给予DP47GS IgG-IL-2，媒介为无菌PBS pH 7.2。在GraphPad Prism中自Mann Whitney检验推导统计学显著性。
绵羊红血球免疫前3天和当天的DP47GS IgG-IL-2剂量给药将随后针对绵羊血细胞攻击的迟发型超敏感性应答阻抑51％(在NOD小鼠中)(图22A；p＝0.0023)和38％(在C57BL/6小鼠)(图22B；p＝0.002)。作为阳性对照免疫阻抑剂，小鼠CTLA-4-Ig抑制DTH应答的水平与DP47GS IgG-IL-2相似。
DP47GS IgG-IL-2还能够在C57BL/6(78％抑制，p＝0.0007，图23A)和NOD(67％抑制，p＝0.004，图23B)小鼠中阻抑KLH特异性IgG应答。对于这项实验，如制造商(Stellar)推荐的，在没有佐剂的情况下给健康年轻C57BL/6小鼠(n＝7-10)和NOD小鼠(n＝13-14)IP免疫100μg人疫苗级KLH。DP47GS IgG-IL-2处理的组成为1(NOD)或2(C57BL/6)次每周处理，4,000IU每只小鼠，SC，在免疫当天启动。免疫后7天(NOD)和21天(C57BL/6)，收集血液，并通过ELISA测量血清KLH特异性IgG应答。
DP47GS IgG-IL-2在体内阻抑免疫应答的能力支持如下假设，即由低剂量IL-2诱导的调节性T细胞激活生成功能性调节性T细胞，其介导免疫应答降低。
                        *     *     *
尽管为了理解清楚已通过例示和实施例相当详细地描述了前述发明，但该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容均通过提述完整明确收录。

Claims (51)

1.一种融合蛋白，其包含：
(i)包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力，和
(ii)两个白介素-2(IL-2)分子。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子为人免疫球蛋白分子。
4.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子不能够特异性结合抗原。
5.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列。
6.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子包含SEQ IDNO：9的重链可变区序列。
7.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子包含基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。
8.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子包含SEQ IDNO：11的轻链可变区序列。
9.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体为Fcγ受体，特别是人Fcγ受体。
10.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体为激活性Fc受体。
11.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体选自下组：FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
12.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体为FcγRIIIa，特别是人FcγRIIIa。
13.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第329位(EU编号方式)处包含氨基酸替代
14.权利要求13的融合蛋白，其中所述氨基酸替代为P329G。
15.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第234位和第235位(EU编号方式)处包含氨基酸替代。
16.权利要求15的融合蛋白，其中所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。
17.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式)。
18.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IL-2分子为野生型IL-2分子。
19.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IL-2分子为人IL-2分子。
20.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IL-2分子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列，特别是SEQ ID NO：3的序列。
21.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IL-2分子各自在它们的N末端氨基酸融合至所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链之一的C末端氨基酸，任选经由肽接头。
22.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中该融合蛋白包含SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19的多肽序列。
23.一种多核苷酸，其编码前述权利要求任一项的融合蛋白。
24.一种包含权利要求23的多核苷酸的载体，特别是表达载体。
25.一种宿主细胞，其包含权利要求23的多核苷酸或权利要求24的载体。
26.一种生成权利要求1至22中任一项的融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(i)在适合于表达所述融合蛋白的条件下培养权利要求25的宿主细胞，并
(ii)回收所述融合蛋白。
27.一种融合蛋白，其包含：
(i)包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力；和
(ii)两个白介素-2(IL-2)分子，
该融合蛋白是通过权利要求38的方法生成的。
28.一种药物组合物，其包含权利要求1至22或27中任一项的融合蛋白和药学可接受载剂。
29.权利要求1至22或27中任一项的融合蛋白或权利要求28的药物组合物，其用作药物。
30.权利要求1至22或27中任一项的融合蛋白或权利要求28的药物组合物，其用于治疗或预防自身免疫疾病。
31.权利要求30的融合蛋白或药物组合物，其中所述自身免疫疾病选自下组：1型糖尿病，系统性红斑狼疮，克罗恩氏(Crohn)病和多发性硬化症。
32.权利要求1-22或27任一项的融合蛋白或权利要求28的药物组合物，其用于治疗或预防移植排斥或移植物抗宿主病。
33.权利要求1-22或27中任一项的融合蛋白在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途。
34.权利要求33的用途，其中所述疾病为自身免疫疾病。
35.权利要求34的用途，其中所述自身免疫疾病选自下组：1型糖尿病，系统性红斑狼疮，克罗恩氏病和多发性硬化症。
36.权利要求33的用途，其中所述疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。
37.权利要求33-36任一项的用途，其中所述个体为哺乳动物，特别是人。
38.一种治疗个体中疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的权利要求1至22或27中任一项的融合蛋白。
39.权利要求38的方法，其中所述疾病为自身免疫疾病。
40.权利要求39的方法，其中所述自身免疫疾病选自下组：1型糖尿病，系统性红斑狼疮，克罗恩氏病和多发性硬化症。
41.权利要求38的方法，其中所述疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。
42.权利要求38-41任一项的方法，其中所述个体为哺乳动物，特别是人。
43.权利要求1-22或27任一项的融合蛋白，其用于在体外或在体内选择性激活调节性T细胞。
44.权利要求43的融合蛋白，其中所述激活包括诱导调节性T细胞增殖和/或在调节性T细胞中诱导IL-2受体信号传导。
45.权利要求43或44的融合蛋白，其中在体外使用且以约1ng/mL或更少，特别是约0.1ng/mL或更少的浓度使用所述融合蛋白。
46.权利要求43或44的融合蛋白，其中在体内使用且以约20μg/kg体重或更少，特别是约12μg/kg体重或更少，更特别是约6μg/kg体重或更少的剂量使用所述融合蛋白。
47.一种在体外或在体内选择性激活调节性T细胞的方法，其包括使所述调节性T细胞与权利要求1-22或27任一项的融合蛋白接触。
48.权利要求47的方法，其中所述激活包括诱导调节性T细胞增殖和/或在调节性T细胞中诱导IL-2受体信号传导。
49.权利要求47或48的方法，其中所述方法在体外且以约1ng/mL或更少，特别是约0.1ng/mL或更少的浓度使用所述融合蛋白。
50.权利要求47或48的方法，其中所述方法在体内且以约20μg/kg体重或更少，特别是约12μg/kg体重或更少，更特别是约6μg/kg体重或更少的剂量使用所述融合蛋白。
51.如说明书所述的发明。
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TW (1) TW201420607A (zh)
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922496A (zh) * 2015-08-06 2018-04-17 新加坡科技研究局 IL2Rβ/通用γ链抗体
CN108623693A (zh) * 2017-03-20 2018-10-09 徐寒梅 一种融合蛋白及其制备方法和其在制备治疗眼科疾病、抗炎、抗肿瘤药物中的应用
CN112724259A (zh) * 2020-11-16 2021-04-30 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
CN113912734A (zh) * 2020-07-08 2022-01-11 南京师范大学 融合多肽及其用途
WO2024008126A1 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd. Il2 muteins and uses thereof

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
CA2894511C (en) 2012-12-11 2021-12-07 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Methods for high throughput receptor:ligand identification
WO2015118016A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
MA40721A (fr) * 2014-08-06 2017-06-13 The Univ Of Miami Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation
SI3482766T1 (sl) * 2014-08-11 2020-09-30 Delinia, Inc. Spremenjene variante IL-2, ki selektivno aktivirajo regulatorne T celice za zdravljenje avtoimunskih bolezni
BR112018010937A2 (pt) 2015-12-04 2018-12-04 Novartis Ag composições de anticorpos enxertados com citocina e métodos de uso para imunorregulação
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
CA3019005A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
IL262606B2 (en) 2016-05-18 2023-04-01 Albert Einstein College Medicine Inc pd-l1 variant polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of using them
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
KR20190083656A (ko) 2016-11-08 2019-07-12 데리니아, 인크. 자가면역 질환의 치료를 위한 il-2 변이체
CN116970059A (zh) 2016-12-22 2023-10-31 库尔生物制药有限公司 T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法
EP3565829A4 (en) 2017-01-09 2021-01-27 Cue Biopharma, Inc. MULTIMER POLYPEPTIDES T-LYMPHOCYTE MODULATORS AND THEIR METHODS OF USE
US20200010528A1 (en) 2017-03-15 2020-01-09 Cue Biopharma, Inc. Methods for modulating an immune response
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
PE20200303A1 (es) 2017-05-24 2020-02-06 Novartis Ag Proteinas de anticuerpo injertadas con citocina y metodos de uso en el tratamiento del cancer
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
WO2019139896A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Cue Biopharma, Inc. Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof
JP2021511348A (ja) * 2018-01-24 2021-05-06 ベイジン パーカンズ オンコロジー カンパニー リミテッド サイトカイン融合タンパク質
US11534479B2 (en) 2018-02-16 2022-12-27 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating Sjögren's syndrome
CA3094112A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
CN112955465A (zh) 2018-07-03 2021-06-11 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
EP3836954A1 (en) 2018-08-13 2021-06-23 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
EP4321530A3 (en) * 2018-09-27 2024-05-22 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
WO2020127277A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Robert Koch-Institut A peptide-loaded mhc-i presenting cell and an il-2 with extended half-life for amplifying a cellular cytotoxic immune response
EP4114440A1 (en) 2020-03-06 2023-01-11 Centre Hospitalier Universitaire de Nimes Low dose human interleukin-2 for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP4149534A2 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Cue Biopharma, Inc. Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof
CA3177843A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 John Thomas MULLIGAN Compositions of protein complexes and methods of use thereof
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
CN113248610B (zh) * 2021-05-14 2022-08-16 厦门柏慈生物科技有限公司 白细胞介素2结合分子、其衍生物、试剂盒及其生产方法和用途
CN117003852A (zh) * 2022-07-07 2023-11-07 北京大学 白细胞介素-2的拓扑改造及其作为自身免疫病药物的应用
WO2024056154A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder
KR20240055222A (ko) * 2022-10-19 2024-04-29 주식회사 에이프릴바이오 인터루킨-2 변이 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 이의 용도
WO2024094119A1 (zh) * 2022-11-02 2024-05-10 北京昌平实验室 融合蛋白及其应用
WO2024121173A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Centre Hospitalier Universitaire De Nimes Low dose human interleukin-2 for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis in a subgroup of patients

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1291995A (zh) * 1998-02-25 2001-04-18 利思进药品公司 提高以抗体为基础的融合蛋白的循环半衰期的方法

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2808353C2 (de) 1977-04-18 1984-01-19 Hitachi Metals, Ltd., Tokyo Ohrring
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
JPS60502136A (ja) * 1983-08-10 1985-12-12 アムジエン　インコーポレイテツド 微生物によるインタ−ル−キン２の形質発現
WO1985000817A1 (en) 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
US6955807B1 (en) 1998-05-15 2005-10-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation IL-2 selective agonists and antagonists
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2385347C (en) 1999-10-04 2009-12-15 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
ATE542137T1 (de) 2001-12-04 2012-02-15 Merck Patent Gmbh Immunocytokine mit modulierter selektivität
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
EP1723251A4 (en) 2004-03-05 2008-04-23 Novartis Vaccines & Diagnostic IN VITRO TESTING SYSTEM FOR PREDICTING THE TOLERABILITY OF THERAPEUTIC AGENTS IN PATIENTS
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
MX2007006234A (es) * 2004-11-24 2007-07-20 Schering Corp Dap10, y usos de la misma.
EP2038417A2 (en) * 2006-07-06 2009-03-25 Merck Patent GmbH Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses
AU2008278803A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binging agents directed to KDR and uses thereof - 035
WO2009061853A2 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
ES2564523T3 (es) 2007-12-19 2016-03-23 Janssen Biotech, Inc. Diseño y generación de bibliotecas de presentación en fago por pIX de novo humanas mediante fusión con pIX o pVII, vectores, anticuerpos y métodos
DE102008023820A1 (de) 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
CA2749539C (en) 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
MA34519B1 (fr) 2010-08-13 2013-09-02 Roche Glycart Ag Anticorps anti-fap et procédés d'utilisation
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
CN109432407A (zh) 2011-03-11 2019-03-08 公共事业救济局-巴黎医院 低剂量il-2用于治疗自身免疫相关病症或炎性病症的应用
CN103476795B (zh) 2011-03-29 2016-07-06 罗切格利卡特公司 抗体Fc变体
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
ES2758884T3 (es) 2011-06-24 2020-05-06 Stephen D Gillies Proteínas de fusión de inmunoglobulina a través de cadena ligera y métodos de uso de ellas
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
US9546203B2 (en) 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
WO2015118016A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
MA40721A (fr) 2014-08-06 2017-06-13 The Univ Of Miami Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1291995A (zh) * 1998-02-25 2001-04-18 利思进药品公司 提高以抗体为基础的融合蛋白的循环半衰期的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ROBERT L. SHIELDS ET AL.: ""High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR"", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922496A (zh) * 2015-08-06 2018-04-17 新加坡科技研究局 IL2Rβ/通用γ链抗体
CN108623693A (zh) * 2017-03-20 2018-10-09 徐寒梅 一种融合蛋白及其制备方法和其在制备治疗眼科疾病、抗炎、抗肿瘤药物中的应用
CN108623693B (zh) * 2017-03-20 2022-03-25 徐寒梅 一种融合蛋白及其制备方法和其在制备治疗眼科疾病、抗炎、抗肿瘤药物中的应用
CN113912734A (zh) * 2020-07-08 2022-01-11 南京师范大学 融合多肽及其用途
CN112724259A (zh) * 2020-11-16 2021-04-30 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
WO2024008126A1 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd. Il2 muteins and uses thereof

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