CN117986383A - 融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及融合蛋白，其包含抗T细胞表面分子抗体，白介素2和免疫球蛋白Fc。所述融合蛋白为异源二聚体或同源二聚体。本发明还涉及所述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。具体地，本发明涉及一种T细胞抗体与白介素2组成的融合蛋白及其应用。
背景技术
细胞因子在癌症免疫疗法中发挥着重要作用。然而，由于半衰期极短、肿瘤靶向性有限且副作用较大，天然细胞因子在癌症治疗中的作用通常有限[1]。IL-2目前被批准用于肾癌和黑色素瘤患者的治疗，也是第一个被批准用于肿瘤治疗的细胞因子[2-4]。超过三分之一的肾细胞癌(RCC)患者被诊断为晚期，预估5年生存率约为12％[5]。虽然在过去十年中已批准多种靶向疗法用于延迟癌症进展的转移性RCC(mRCC)，但目前的治疗仍无法在大多数患者中诱导完全反应(CR)[6]。由于众所周知的RCC免疫原性，已知唯一能在mRCC中诱导CR并具有持久疗效的治疗方法是IL-2免疫疗法[7]。然而，CR只能在7-9％的患者中实现[4]。已知IL-2会引起显著的短期毒性，所有接受IL-2治疗的患者都需要住院观察[8,9]。因此，如何提高IL-2的治疗功能是癌症治疗中的一大难题。目前的IL-2疗法存在几个主要问题：1)靶向肿瘤组织有限，特别是肿瘤特异性的T细胞；2)淋巴组织和内皮靶向引起的严重副作用；3)优先激活Treg，限制CTL介导的抗肿瘤作用；4)由于其体积小和淋巴组织靶向，半衰期短(<30分钟)。
免疫原性较强的肿瘤组织通常具有大量T细胞，但它们的功能失调限制了它们控制肿瘤的能力。PD1+和TIM3+TIL被认为是终末分化和功能失调的TIL[10]。抗PD1/PDL1治疗可以解除对T细胞反应的制动并部分恢复其功能，但只有少数患者有完全反应[11]。我们观察到在PD1抗体治疗中细胞因子起了重要作用[12]。这增加了用细胞因子靶向TIL可能克服PD1耐药性的可能性。大多数研究侧重于将细胞因子靶向肿瘤细胞[13-15]。这将增加肿瘤组织中细胞因子的保留，但效应T细胞对这些细胞因子的可及性可能仍然有限。目前尚不清楚肿瘤细胞或基质细胞是否是T细胞相关细胞因子最理想的靶标，因为大部分肿瘤细胞是不与T细胞接触的，并且肿瘤细胞对细胞因子的内吞可能会降低TIL对细胞因子的可及性。然而，由于Treg细胞上高表达细胞因子受体，这就很难在避免全身毒性的同时向肿瘤中的CD8+T细胞输送足够的细胞因子。
发明内容
通过将细胞因子(优选低亲和力的细胞因子)连接到抗体(如抗TIM3抗体/抗LAG3抗体等)设计了新的融合蛋白，以靶向肿瘤内肿瘤特异性的CD8+T细胞而不是Treg。新的融合蛋白与外周CD8+T细胞和Treg细胞的结合较低，这大大减少外周消耗和毒副作用。新的融合蛋白治疗将主要作用于肿瘤中的CD8+T细胞而不是Treg细胞。例如，所述CD8+T细胞是PD1/TIM3高表达的，新的融合蛋白可以重新激活肿瘤特异性的PD1+TIM3+CD8+TIL，并产生长期记忆反应以防止复发。
具体地，本发明首先涉及一种融合蛋白，所述的融合蛋白为异源二聚体，其特征在于，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，
自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-F，F-I，A-I-F，A-F-I，I-A-F，I-F-A，F-I-A或F-A-I；
(2)第二单体，
自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-F，F-A，A-I-F，A-F-I，I-A-F，I-F-A，F-I-A或F-A-I；
其中所述第一单体和所述第二单体不同；
其中I表示白介素2(IL2)，F表示免疫球蛋白Fc，A表示抗T细胞表面分子的抗体，
所述抗T细胞表面分子的抗体为Fab形式或scFv形式；
所述第一单体与所述第二单体通过Fc单链的二聚化连接，构成所述的异源二聚体。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含以下第一单体和第二单体的组合：
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-F；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-F；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-F；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-I-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-F；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为I-A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-F；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-I-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-F；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A-I。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-I-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为I-A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-I-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A-I。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为A-I-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为A-I-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为A-I-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为I-A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为A-I-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-I-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为A-I-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A-I。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-A-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-A-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-A-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-I-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-A-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-I-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为I-A-F；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A-I。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I-A；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I-A；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I-A；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-I-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I-A；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为I-A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-I-A；(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A-I。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-A-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-A-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-A。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-A-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为A-I-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-A-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为I-A-F。
在一些实施方案中，所述的异源二聚体包含：
(1)第一单体，自N端向C端方向，所述第一单体表示为F-A-I；
(2)第二单体，自N端向C端方向，所述第二单体表示为F-I-A。
优选地，所述免疫球蛋白Fc为天然免疫球蛋白Fc或通过基因突变敲除ADCC效应的免疫球蛋白Fc；更优选地，所述免疫球蛋白Fc为人IgG(优选人IgG1，人IgG2，人IgG3或人IgG4)的Fc单链，优选地，通过基因突变敲除ADCC效应的免疫球蛋白Fc的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
在一些实施方案中，当所述抗T细胞表面分子的抗体为scFv形式时，所述白介素2连接于scFv的N端；或当所述抗T细胞表面分子的抗体为Fab形式时，所述白介素2连接于Fab中CH1或CL的N端，或所述白介素2连接于Fab中CL的C端。
本发明还涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白为同源二聚体，其特征在于，自N端向C端方向，所述同源二聚体的单体包括I-F-A，A-F-I，I-A-F，A-I-F，F-I-A，F-A-I，其中I表示白介素2，F表示免疫球蛋白Fc，A表示抗T细胞表面分子，其中所述抗T细胞表面分子抗体为Fab形式或scFv形式，所述单体通过Fc单链的二聚化连接，构成所述的同源二聚体。
在一些实施方案中，当所述抗T细胞表面分子的抗体为scFv形式时，所述白介素2连接于scFv的N端或C端；或当所述抗T细胞表面分子的抗体为Fab形式时，所述白介素2连接于Fab中CH1或CL的N端，或所述白介素2连接于Fab中CL的C端。
在一些实施方案中，所述白介素2、所述抗T细胞表面分子的抗体或所述免疫球蛋白Fc彼此之间直接连接或通过接头连接。优选地，所述接头选自(G4S)n，n＝0，1或2。
在一些实施方案中，所述T细胞表面分子包括但不限于：TIM3、LAG3、PD1、ICOS、GITR、CD27、CD137、2B4、OX40、4-1BB、TIGIT、CTLA-4、VISTA、CD8；优选地，所述T细胞表面分子为TIM3或LAG3，所述抗T细胞表面分子的抗体为抗TIM3的抗体(aTIM3)或抗LAG3的抗体(aLAG3)。
在一些实施方案中，所述抗T细胞表面分子的抗体为人源化抗体或全人化抗体。
在一些实施方案中，所述白介素2的序列如SEQ ID NO:1所示，或SEQ ID NO:1所示序列的突变体，优选的，所述突变体包含如下任一或任意组合的突变位点；R38L、F42A、H16K、D20K、R38A、F42K和K43E。
在一些实施方案中，所述异源二聚体包括：
(1)第一单体，所述的第一单体自N端开始依次包含：
i)序列如SEQ ID NO.1所示的野生型IL-2蛋白、或所述的野生型IL-2蛋白的突变体，优选的，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；R38L、F42A、H16K、D20K、R38A、F42K和K43E；
ii)必要的连接结构(如(G4S)n连接序列)，优选的，所述的连接序列如SEQ IDNO.6所示；和
iii)序列如SEQ ID NO.2所示的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.3所示的No-ADCC突变型的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.4所示的knob突变型Fc、或如SEQ ID NO.5所示的hole突变型Fc；
(2)第二单体，所述的第二单体选自以下各项组成的组：
i)第二单体，其包含：
a)序列如SEQ ID NO.7所示的多肽(抗TIM3抗体VL-CL)和序列如SEQ ID NO.8所示的多肽(抗TIM3抗体VH-CH1)组成的抗TIM3抗体Fab区；或：序列如SEQ ID NO.9所示的抗TIM3单链抗体(ScFv)：
和：b)序列如SEQ ID NO.2所示的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.3所示的No-ADCC突变型的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.4所示的knob突变型Fc、或如SEQ ID NO.5所示的hole突变型Fc；
ii)第二单体，其包含：
a)序列如SEQ ID NO.13所示的多肽(抗LAG3抗体VL-CL)与序列如SEQ ID NO.14所示的多肽(抗LAG3抗体VH-CH1)组成的抗体Fab区；或：序列如SEQ ID NO.15所示的多肽(抗LAG3 scFv)；和：
b)序列如SEQ ID NO.2所示的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.3所示的No-ADCC突变型的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.4所示的knob突变型Fc、或如SEQ ID NO.5所示的hole突变型Fc；或
iii)第二单体，其包含：
a)序列如SEQ ID NO.16所示的多肽(aLAG3 VH-CH1-Fc(knob))和序列如SEQ IDNO.13所示的多肽(aLAG3 VL-CL)组成的抗LAG3抗体的Fab构建体；或
b)序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.22所示的多肽(a LAG3ScFv-Fc(knob))。
在一些实施方案中，所述异源二聚体包括：
第一单体：其为序列如SEQ ID NO.10所示的多肽(laIL2-Fc)；
第二单体：其为：
(1)序列如SEQ ID NO.11所示的多肽(抗TIM3抗体VH-CH1-Fc)和序列如SEQ IDNO.7所示的多肽(抗TIM3抗体轻链VL-CL)组成的第二单体；
或(2)序列如SEQ ID NO.12或22所示的多肽(aTIM3 ScFv-Fc)。
在一些实施方案中，所述同源二聚体的单体自N端开始依次包含：(1)序列如SEQID NO.1所示的野生型IL-2蛋白、或所述的野生型IL-2蛋白的突变体，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；R38L、F42A、H16K，D20K、R38A、F42K和K43E；
(2)必要的连接结构(如(G4S)n连接序列)，优选的，所述的连接序列如SEQ IDNO.6所示；
(3)抗TIM3抗体的Fab或ScFv；所述抗TIM3抗体为人源化抗体或全人化抗体；
(4)抗体的Fc；所述的抗体Fc为全人野生型Fc或No-ADCC突变型Fc。
在一些实施方案中，所述同源二聚体的单体为：
(1)SEQ ID NO.18(TIM3-InFc-laIL2：aTIM3(ScFv)-InFc-laIL2)所示的多肽，或
(2)SEQ ID NO.19(laIL2-InFc-TIM3：laIL2-Fc-aTIM3(ScFv))所示的多肽，或
(3)SEQ ID NO.20(TIM3-laIL2-InFc：aTIM3(ScFv)-Fc-laIL2)所示的多肽，或
(4)SEQ ID NO.21(laIL2-TIM3-InFc：laIL2-aTIM3(ScFv)-Fc)所示的多肽。
在一些实施方案中，本发明还涉及另一种融合蛋白，所述的融合蛋白为抗LAG3抗体与IL2的组合成的融合蛋白，所述的融合蛋白为异源二聚体；所述的异源二聚体包括：
(1)第一单体，所述的第一单体自N端开始依次包含：
1)序列如SEQ ID NO.1所示的野生型IL-2蛋白、或所述的野生型IL-2蛋白的突变体，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；R38L、F42A、D20K、R38A、F42K和K43E；
2)必要的连接结构(如(G4S)n连接序列)，优选的，所述的连接序列如SEQ ID NO.6所示；
3)如SEQ ID NO.2所示的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.3所示的No-ADCC突变型的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.4所示的knob突变型Fc、或如SEQ ID NO.5所示的hole突变型Fc；
(2)第二单体，所述的第二单体包含：
i)序列如SEQ ID NO.13所示的多肽(抗LAG3抗体轻链VL-CL)与序列如SEQ IDNO.14所示的多肽(抗LAG3抗体重链VH-CH1)组成的抗体Fab区；或序列如SEQ ID NO.15所示的多肽(抗LAG3 scFv)；和：
ii)序列如SEQ ID NO.2所示的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.3所示的No-ADCC突变型的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.4所示的knob突变型Fc、或如SEQ ID NO.5所示的hole突变型Fc；
在一些实施方案中，所述异源二聚体包括：
第一单体：其为序列如SEQ ID NO.10所示的多肽(laIL2-Fc)；
第二单体：其为：
(1)序列如SEQ ID NO.16所示的多肽(aLAG3 VH-CH1-Fc)和序列如SEQ ID NO.13所示的多肽(抗LAG3抗体轻链VL-CL)组成的第二单体；或
(2)序列如SEQ ID NO.17所示的多肽(aLAG3 scFv-Fc)。
本发明还涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白为同源二聚体，其特征在于，所述同源二聚体的单体为：
一分子白介素2(IL2)，一分子Fc单链与一分子抗TIM3抗体或抗LAG3抗体Fab直接或通过接头连接构成的单体；或，
一分子白介素2(IL2)，一分子Fc单链与一分子抗TIM3抗体或抗LAG3单链抗体(scFv)直接或通过接头连接构成的单体。
在一些实施方案中，所述同源二聚体的单体自N端开始依次包含：(1)序列如SEQID NO.1所示的野生型IL-2蛋白、或所述的野生型IL-2蛋白的突变体，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；R38L、F42A、H16K，D20K、R38A、F42K和K43E；
(2)必要的连接结构(如(G4S)n连接序列)，优选的，所述的连接序列如SEQ IDNO.6所示；
(3)抗LAG3抗体的Fab或scFv；所述抗LAG3抗体人源化抗体或全人化抗体；
(4)抗体的Fc；所述的抗体Fc为全人野生型Fc或No-ADCC突变型Fc。
在一些实施方案中，所述同源二聚体的单体为：
(1)SEQ ID NO.22(LAG3-InFc-laIL2：aLAG3(ScFv)-InFc-laIL2)所示的多肽，或
(2)SEQ ID NO.23(laIL2-InFc-LAG3：laIL2-Fc-aLAG3(ScFv))所示的多肽，或
(3)SEQ ID NO.24(LAG3-laIL2-InFc：aLAG3(ScFv)-Fc-laIL2)所示的多肽，或
(4)SEQ ID NO.25(laIL2-LAG3-InFc：laIL2-aLAG3(ScFv)-Fc)所示的多肽。
本发明还涉及所述融合蛋白的如下应用：
(1)制备抗肿瘤药物；
(2)制备抗肿瘤试剂盒，所述试剂盒还包含免疫检查点抑制剂或用于T细胞过继转移疗法的T细胞；
(3)制备克服免疫检查点抑制剂耐受的抗肿瘤药物；
(4)制备克服T细胞过继转移疗法不响应的抗肿瘤药物，
优选地，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1抗体，抗PD1抗体，抗CTLA4抗体；
优选地，所述T细胞为抗肿瘤T细胞；更优选地，所述的T细胞为抗肿瘤CAR T细胞或其结构类似物。
在本发明的另一个方面，还涉及试剂盒，其包含本发明如上所述的融合蛋白，优选还包含抗肿瘤药，所述抗肿瘤药选自以下的一种或多种：抗PD-L1抗体、抗PD1抗体、抗TIGIT抗体，和化疗药，优选地化疗药如酪氨酸激酶抑制剂，氮芥、阿霉素、铂类或紫杉醇。
在本发明的再一个方面，涉及mRNA或DNA，其编码所述融合蛋白的第一单体或第二单体，或其编码所述融合蛋白的单体。
在具体的实施方案中，所述肿瘤选自肺癌、结直肠癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、淋巴瘤如B细胞淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌或食道癌。
本发明示例性融合蛋白的结构如图15所示。
附图说明
图1.LAG3-laIL2比LAG3-IL2与外周Treg有更低的亲和力。
图2.TIM3-laIL2比TIM3-IL2与外周Treg有更低的亲和力。
图3.TIM3-laIL2可以结合肿瘤内CD8细胞。
图4.LAG3-laIL2可以结合肿瘤内CD8细胞。
图5.TIM3-laIL2能有效控制MC38肿瘤生长。
图6.LAG3-laIL2能有效控制MC38肿瘤生长。
图7.TIM3-laIL2抗肿瘤效果明显优于Anti-TIM3和laIL2的混合治疗。
图8.LAG3-laIL2抗肿瘤效果明显优于Anti-LAG3和laIL2的混合治疗。
图9.TIM3-laIL2抗肿瘤效果不依赖于CD4 T细胞。
图10.TIM3-laIL2抗肿瘤效果依赖于CD8 T细胞。
图11.TIM3-laIL2可以协同anti-PDL1控制肿瘤。
图12.LAG3-laIL2可以协同anti-PDL1控制肿瘤。
图13.LAG3-InFc-laIL2能有效控制MC38肿瘤生长。
图14.LAG3-InFc-laIL2能有效控制CFPAC1肿瘤生长。
图15.示例性融合蛋白的结构图。A为异源二聚体形式；B为同源二聚体形式。
具体实施方式
实验材料
1.菌种和质粒
菌种：Top10 E.coli、DH5αE.coli感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)
质粒：
pEE6.4-IgGκ-hIgG1(来自Lonza)，包含有小鼠IgGκ的信号肽和人IgG1的Fc序列，用于表达抗体。
pEE6.4-IgGκ-hIgG1-Fc-hole和pEE6.4-IgGκ-hIgG1-Fc-knob用于表达异二聚体蛋白。
pEE6.4-TIM3 VH-CH1-Fc-knob、pEE6.4-TIM3 VL-CL用于表达异二聚体蛋白的TIM3抗体部分；pEE6.4-laIL2-Fc-hole、用于表达异二聚体蛋白的laIL2部分。
2.实验动物
野生型C57BL/6和BALB/c小鼠购于中国北京维通利华实验动物心，NCG小鼠购于集萃药康生物科技股份有限公司。除特殊说明外，所有实验使用的均为8-10周龄的小鼠。小鼠均在无特定病原微生物(specific pathogen-free，SPF)的屏障环境中饲养。
3.细胞系
MC38(ATCC)为C57背景小鼠结直肠癌细胞系，在DMEM完全培养基(含10％灭活胎牛血清，2mmol/l L-谷氨酰胺，0.1mmol/l非必需氨基酸，100U青霉素和100μg/ml链霉素)中培养。
A20(ATCC)为BALB/c背景小鼠B细胞淋巴瘤细胞系，在RPMI1640完全培养基(含10％灭活胎牛血清，2mmol/L L-谷氨酰胺，0.1mmol/L非必需氨基酸，100U青霉素和100μg/ml链霉素)中培养。
FreeStyleTM 293F细胞系(Invitrogen)为悬浮细胞，源自于HEK293细胞株，在SMM293-TII或者CD OptiCHOTM培养基中，主要用于瞬时转染表达融合蛋白。
含有R38L和F42A突变的IL2基因序列如SEQ ID NO:32所示，以laIL2表示。
实验中所用蛋白通过SnapGene软件设计并由通用生物公司合成。以下为实施例使用的蛋白，其中抗TIM3抗体为Fab形式，抗LAG3抗体为scFv形式，具体的：
1.TIM3-laIL2是由如下第一单体和第二单体构成：
(1)含有R38L和F42A突变的IL2和Fc片段融合的多肽，其序列如SEQ ID NO.10所示，
(2)SEQ ID NO.26所示的aTIM3-VL-CL和SEQ ID NO.27所示的aTIM3-VH-CH1-InFc(hole)组成的第二单体；
2.TIM3-IL2是由如下第一单体和第二单体构成：
(1)含有野生的IL2和Fc片段融合的多肽，其序列如SEQ ID NO.31所示，
(2)SEQ ID NO.26所示的aTIM3-VL-CL和SEQ ID NO.27所示的aTIM3-VH-CH1-InFc(hole)组成的第二单体；
3.LAG3-laIL2是由如下第一单体和第二单体构成：
(1)含有R38L和F42A突变的IL2和Fc片段融合的多肽，其序列如SEQ ID NO.10所示，
(2)SEQ ID NO.17所示的aLAG3的第二单体；
4.LAG3-IL2是由如下第一单体和第二单体构成：
(1)含有野生的IL2和Fc片段融合的多肽，其序列如SEQ ID NO.31所示，
(2)SEQ ID NO.17所示的aLAG3的第二单体；
5.PD1-laIL2是由如下第一单体和第二单体构成：
(1)含有R38L和F42A突变的IL2和Fc片段融合的多肽，其序列如SEQ ID NO.10所示，
(2)SEQ ID NO.28所示的aPD1-ScFv-Fc(hole)的第二单体；6.hTIM3-laIL2是由如下第一单体和第二单体构成：
(1)含有R38L和F42A突变的IL2和Fc片段融合的多肽，其序列如SEQ ID NO.10所示，
(2)SEQ ID NO.12所示的aTIM3的第二单体；
7.hLAG3-laIL2是由如下第一单体和第二单体构成：
(1)含有R38L和F42A突变的IL2和Fc片段融合的多肽，其序列如SEQ ID NO.10所示，
(2)SEQ ID NO.17所示的aLAG3的第二单体；
8.hPD1-laIL2是由如下第一单体和第二单体构成：
(1)含有R38L和F42A突变的IL2和Fc片段融合的多肽，其序列如SEQ ID NO.10所示，
(2)SEQ ID NO.29所示的ahPD1-ScFv-Fc(hole)的第二单体；
9.aTIM3抗体是由SEQ ID NO.26所示的aTIM3-VL-CL和SEQ ID NO.30所示的aTIM3-VH-CH1-Fc组成的；
10.aPDL1抗体是商业化的atezolizumab；
11.LAG3-InFc-laIL2是由SEQ ID NO.22所示的序列组成。
小鼠肿瘤接种及治疗
(1)肿瘤接种及测量：
肿瘤模型的建立：1×106个MC38单细胞悬于100μl PBS中，皮下接种于C57BL/6小鼠背部皮下；1.5×106个A20单细胞悬于100μl PBS中，接种于BALB/c小鼠背部皮下；1×106个CFPAC1单细胞悬于100μl PBS中，皮下接种于NCG小鼠背部皮下。对肿瘤消退的小鼠进行同一种肿瘤细胞的re-challenge实验时，肿瘤细胞的接种数量为初始肿瘤造模时候的5倍，接种部位为小鼠背部另一侧皮下。
每周监测两次肿瘤大小，使用游标卡尺测量肿瘤长径(a)、短径(b)和高(c)，小鼠肿瘤体积＝a×b×c/2。
(2)治疗：
抗体或者融合蛋白采用腹腔注射方式，具体给药剂量在实施例中给出。
小鼠体内CD4+T细胞、CD8+T细胞删除
IL2或IL2融合蛋白治疗前一天分别腹腔注射200μg GK1.5或者TIB210抗体(BioXCell)用来删除CD4+T细胞、CD8+T细胞，之后每隔3天注射一次，依据治疗周期调整注射次数。通过流式检测删除效率。
实施例1.TIM3-laIL2、LAG3-laIL2具有极低的外周结合，从而避免外周的副作用
为了降低IL2的毒性，我们降低了IL2与IL2Rα以及IL2Rβ的结合能力。检测了不同抗体融合的低亲和力IL2(laIL2)对于外周T细胞和肿瘤内T细胞的结合能力。脾脏单细胞悬液加入1ug/ml不同的蛋白进行染色。如图1所示，LAG3-laIL2比LAG3-IL2对于外周脾脏Treg具有更低的亲和力。这就可以降低外周Treg细胞对于LAG3-laIL2的消耗。如图2所示，TIM3-laIL2比TIM3-IL2对于外周脾脏Treg具有更低的亲和力。这就可以降低外周Treg细胞对于TIM3-laIL2的消耗。
同时我们也检测了LAG3-laIL2和TIM3-laIL2与肿瘤内T细胞的结合，肿瘤单细胞悬液加入1ug/ml不同的蛋白进行染色。我们可以看到LAG3-laIL2和TIM3-laIL2可以有效的与肿瘤内T细胞结合(图3，4)。
实施例2.TIM3-laIL2融合蛋白和LAG3-laIL2融合蛋白具有更好的抗肿瘤活性
1.TIM3-laIL2融合蛋白可以有效的控制MC38肿瘤
在C57BL/6小鼠皮下接种1×106MC38肿瘤细胞，在接种肿瘤后D13开始治疗；通过腹腔注射30ug TIM3-laIL2抗体蛋白。每周两次测量肿瘤大小；结果显示TIM3-laIL2融合蛋白具有很好的治疗效果(图5)。
2.LAG3-laIL2融合蛋白可以有效的控制MC38肿瘤
在C57BL/6小鼠皮下接种1×106MC38肿瘤细胞，在接种肿瘤后D13开始治疗；通过腹腔注射30ug LAG3-laIL2抗体蛋白。每周两次测量肿瘤大小；结果显示LAG3-laIL2融合蛋白具有很好的治疗效果(图6)。
3.在A20 B细胞淋巴瘤中，TIM3-laIL2融合蛋白比混合治疗效果显著改善
在BALB/c小鼠皮下接种1.5×106A20肿瘤细胞，在接种肿瘤后D16开始治疗；分别通过腹腔注射15ug aTIM3抗体和30ug ahTIM3-laIL2或30ug TIM3-laIL2抗体蛋白。每周两次测量肿瘤大小；结果显示，与aTIM3抗体与laIL2混合治疗相比，TIM3-laIL2融合蛋白具有更好的治疗效果(图7)。
4.在MC38结直肠癌肿瘤中，LAG3-laIL2融合蛋白比单独治疗效果显著改善
在C57BL/6小鼠皮下接种1×106MC38肿瘤细胞，在接种肿瘤后D15开始治疗；分别通过腹腔注射15ug aLAG3抗体和30ug ahLAG3-laIL2或30ug LAG3-laIL2抗体蛋白。每周两次测量肿瘤大小；结果显示，与aLAG3抗体与laIL2混合治疗相比，LAG3-laIL2融合蛋白具有更好的治疗效果(图8)。
实施例3.TIM3-laIL2能够激活CD8 T细胞
1.TIM3-laIL2融合蛋白治疗效果不依赖于CD4细胞
为了确定TIM3-laIL2抗体的治疗主要依赖于哪一群免疫细胞，我们分别进行了不同细胞群的删除实验。
BALB/c小鼠皮下接种1.5×106A20肿瘤细胞，在15天腹腔注射30ug TIM3-laIL2融合蛋白。在治疗开始前一天腹腔注射200ug CD4 T细胞删除性抗体(克隆号：GK1.5，购于BioXCell)，每4天一次，共注射3次。
在小鼠肿瘤实验中，删除CD4细胞后，TIM3-laIL2抗体仍然具有治疗效果，说明CD4细胞不是抗体发挥治疗效果的主要效应细胞(图9)。
2.TIM3-laIL2抗体治疗效果依赖于CD8 T细胞
我们进一步验证CD8 T细胞在抗体治疗过程中发挥的作用。BALB/c小鼠皮下接种1.5×106A20肿瘤细胞后，第15天开始治疗，腹腔注射30ug TIM3-laIL2蛋白。在治疗开始前一天腹腔注射200ug CD8 T细胞删除性抗体(克隆号：TIB210，购于BioXCell)，每4天一次，共注射三次。
CD8 T细胞的删除实验表明，在删除CD8 T细胞后，治疗效果有明显的降低。说明TIM3-laIL2抗体的治疗效果主要依赖于CD8 T细胞(图10)。
实施例4.TIM3-laIL2、LAG3-laIL2能够克服抗PD-L1抗体治疗不响应
在MC38荷瘤小鼠肿瘤在150mm3以下时，单独的TIM3-laIL2或LAG3-laIL2抗体治疗具有很好的清除作用(图7，8)。但是当肿瘤更大时，单独的抗体治疗只能控制肿瘤生长而不能完全清除(图11)；为了更好的提高治疗效果，我们将融合蛋白和免疫检查点抑制性抗体联合使用观察能否提高治疗效果。
具体试验方案：C57BL/6小鼠皮下接种1×106MC38肿瘤细胞，在接种肿瘤后D19开始治疗；分别通过腹腔注射100ug抗PD-L1抗体或/和30ug TIM3-laIL2抗体蛋白。每周两次测量肿瘤大小；结果显示，与单独的抗PD-L1抗体或TIM3-laIL2融合蛋白治疗相比，联合治疗具有更好的治疗效果(图11)。
C57BL/6小鼠皮下接种1×106MC38肿瘤细胞，在接种肿瘤后D19开始治疗；分别通过腹腔注射100ug抗PD-L1抗体或/和30ug LAG3-laIL2抗体蛋白。每周两次测量肿瘤大小；结果显示，与单独的抗PD-L1抗体或LAG3-laIL2融合蛋白治疗相比，联合治疗具有更好的治疗效果(图12)。
实施例4、LAG3-InFc-laIL2融合蛋白具有更好地抗肿瘤活性1.在MC38结直肠癌肿瘤中，LAG3-InFc-laIL2融合蛋白比混合治疗效果显著改善
在C57BL/6小鼠皮下接种1×106MC38肿瘤细胞，在接种肿瘤后D9和D12进行治疗；分别通过腹腔注射15ug aLAG3抗体和15ug laIL2-Fc或30ug LAG3-InFc-laIL2抗体蛋白。每周两次测量肿瘤大小；结果显示，与aLAG3抗体与laIL2混合治疗相比，LAG3-InFc-laIL2融合蛋白具有更好的治疗效果(图13)。
2.在人的CFPAC1肿瘤中，TIM3-InFc-laIL2融合蛋白比混合治疗效果显著改善
在NCG小鼠皮下接种1×106CFPAC1(ATCC)肿瘤细胞，在接种肿瘤后D13静脉注射1×106PBMC。在D17和D20进行治疗；分别通过腹腔注射15ug aLAG3抗体和15ug laIL2或30ugLAG3-InFc-laIL2抗体蛋白。每周两次测量肿瘤大小；结果显示，与联合抗体治疗相比，LAG3-InFc-laIL2融合蛋白具有更好的治疗效果(图14)。
以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限制本发明的保护范围。
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Claims (17)
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含以下每一种中的至少一种：
a)白介素2(IL2)多肽；
b)抗T细胞表面分子的抗体；
c)免疫球蛋白Fc。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的T细胞表面分子包括但不限于：TIM3、LAG3、PD1、ICOS、GITR、CD27、CD137、2B4、OX40、4-1BB、TIGIT、CTLA4、VISTA、CD8。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的免疫球蛋白Fc为天然免疫球蛋白Fc或通过基因突变敲除ADCC效应的免疫球蛋白Fc；优选的，所述的免疫球蛋白Fc为人IgG的Fc。
4.根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，
所述的T细胞表面分子为TIM3或LAG3，
所述的抗T细胞表面分子的抗体为抗TIM3的抗体或抗LAG3的抗体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为异源二聚体包括：
(1)第一单体，所述的第一单体自N端开始依次包含：
1)序列如SEQ ID NO.1所示的野生型IL-2蛋白；或所述的野生型IL-2蛋白的突变体，优选的，所述的野生型IL-2蛋白的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点：R38L、F42A、H16K，D20K、R38A、F42K和K43E；
2)必要的连接结构(G4S连接序列)，优选的，所述的连接序列如SEQ ID NO.6所示；
3)序列如SEQ ID NO.2所示的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.3所示的敲除ADCC效应的突变型的IgG的Fc(InFc)、或如SEQ ID NO.4所示的knob突变型Fc、或如SEQ ID NO.5所示的hole突变型Fc；
(2)第二单体，所述的第二单体包含：
1)序列如SEQ ID NO.7所示的抗TIM3抗体轻链VL-KCL和序列如SEQ ID NO.8所示的抗TIM3抗体重链VH&CH1组成的抗TIM3抗体Fab区；或，
序列如SEQ ID NO.9所示的抗TIM3单链抗体(ScFv)：
和，
2)序列如SEQ ID NO.2所示的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.3所示的敲除ADCC效应的突变型的IgG的Fc(InFc)、或如SEQ ID NO.4所示的knob突变型Fc、或如SEQ ID NO.5所示的hole突变型Fc。
6.根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，其特征在于，
所述的异源二聚体包括：
第一单体：其为序列如SEQ ID NO.10所示的多肽(laIL2-Fc(hole))；
第二单体：其为：
(1)由序列如SEQ ID NO.7所示的抗TIM3抗体轻链VL-KCL和序列如SEQ ID NO.11所示的抗TIM3抗体VH-CH1-Fc(knob)所组成的抗TIM3抗体的Fab构建体；
或(2)序列如SEQ ID NO.12、22所示的多肽(aTIM3-ScFv-Fc(knob))。
7.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，
所述的第二单体包含：
1)序列如SEQ ID NO.13所示的抗LAG3抗体轻链VL-CL与序列如SEQ ID NO.14所示的抗LAG3抗体重链VH-CH1组成的抗体Fab区；
或：2)序列如SEQ ID NO.15所示的抗LAG3单链抗体(ScFv)：
和：3)序列如SEQ ID NO.2所示的IgG的Fc、或如SEQ ID NO.3所示的No-ADCC突变型的IgG的Fc(InFc)、或如SEQ ID NO.4所示的knob突变型Fc、或如SEQ ID NO.5所示的hole突变型Fc。
8.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，
所述的第二单体为：
(1)序列如SEQ ID NO.16所示的多肽(aLAG3 VH-CH1-Fc(knob))和序列如SEQ IDNO.13所示的抗LAG3抗体轻链可变区组成的抗LAG3抗体的Fab构建体；或
(2)序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.22所示的多肽(aLAG3ScFv-Fc(knob))。
9.根据权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白为同源二聚体，其特征在于，
所述的同源二聚体的单体为：
一分子白介素2与一分子抗TIM3的抗体(aTIM3)或抗LAG3的抗体(aLAG3)的Fab通过任意方式连接构成的单体，或，
一分子白介素2与一分子抗LAG3的抗体(aLAG3)或抗LAG3的抗体(aLAG3)的(ScFv)通过任意方式连接构成的单体。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，
所述的同源二聚体的单体自N端开始依次包含：
(1)抗TIM3的抗体(aTIM3)或抗LAG3的抗体(aLAG3)的Fab/ScFv；所述的Fab为人源化抗体的Fab或全人化抗体的Fab，所述的ScFv为人源化抗体的ScFv或全人化抗体的ScFv；
(2)抗体的Fc；所述的抗体Fc为全人野生型Fc或No-ADCC突变型Fc(InFc)；
(3)必要的连接结构(如G4S连接序列)，优选的，所述的连接序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)如SEQ ID NO.1所示的野生型白介素2、或所述的野生型白介素2的突变体，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；R38L、F42A、H16K，D20K、R38A、F42K和K43E。
11.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，
所述的同源二聚体的单体为：
(1)SEQ ID NO.18(TIM3-InFc-laIL2：aTIM3(ScFv)-InFc-laIL2)所示的多肽，或
(2)SEQ ID NO.19(laIL2-InFc-TIM3：laIL2-Fc-aTIM3(ScFv))所示的多肽，或
(3)SEQ ID NO.20(TIM3-laIL2-InFc：aTIM3(ScFv)-Fc-laIL2)所示的多肽，或
(4)SEQ ID NO.21(laIL2-TIM3-InFc：laIL2-aTIM3(ScFv)-Fc)所示的多肽，或
(5)SEQ ID NO.22(LAG3-InFc-laIL2：aLAG3(ScFv)-InFc-laIL2)所示的多肽，或
(6)SEQ ID NO.23(laIL2-InFc-LAG3：laIL2-Fc-aLAG3(ScFv))所示的多肽，或
(7)SEQ ID NO.24(LAG3-laIL2-InFc：aLAG3(ScFv)-Fc-laIL2)所示的多肽，或
(8)SEQ ID NO.25(laIL2-LAG3-InFc：laIL2-aLAG3(ScFv)-Fc)所示的多肽。
12.权利要求1-11任一项所述的融合蛋白的如下应用：
(1)制备抗肿瘤药物；
(2)制备与免疫检查点抑制剂联用的抗肿瘤药物；
(3)制备克服免疫检查点抑制剂耐受的抗肿瘤药物；
(4)制备与T细胞过继转移联用的抗肿瘤药物；
(5)制备克服T细胞过继转移不响应的抗肿瘤药物，
优选地，所述肿瘤选自肺癌、结直肠癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、淋巴瘤如B细胞淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌或食道癌。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的免疫检查点抑制剂为抗PDL1的拮抗剂，优选的，所述的抗PDL1的拮抗剂为抗PDL1的抗体。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的T细胞为抗肿瘤T细胞；更优选的，所述的T细胞为抗肿瘤CAR T细胞或其结构类似物。
15.包含权利要求1-12任一项所述的融合蛋白的药物或药物组合物。
16.试剂盒，其包含权利要求1-12任一项所述的融合蛋白，优选还包含抗肿瘤药，所述抗肿瘤药选自以下的一种或多种：抗PD-L1抗体、抗PD1抗体、抗TIGIT抗体，和化疗药，优选地化疗药如酪氨酸激酶抑制剂，氮芥、阿霉素、铂类或紫杉醇。
17.mRNA或DNA，其编码权利要求5-8任一项所述融合蛋白的第一单体或第二单体，或其编码权利要求9-11任一项所述融合蛋白的单体。
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