JP2024511479A - メイタンシン抗体コンジュゲートおよびそれを使用する方法 - Google Patents

メイタンシン抗体コンジュゲートおよびそれを使用する方法 Download PDF

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Abstract

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、その抗原結合フラグメント、リンカーおよび薬物を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が記載される。薬物は、チューブリン重合の阻害剤である。ＡＤＣの使用方法も記載される。【選択図】図１０

Description

１．相互参照
[0001]本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０２１年３月２６日に出願された米国仮出願第６３／１６６７９３号の利益を主張する。
２．背景技術
[0002]がん治療薬、特に原発性腫瘍ならびに浸潤性腫瘍細胞および転移を退縮させることができる、治療余地が改善した治療薬の必要性が未だある。
[0003]腫瘍血管を破壊するように計画したがん治療は、毒性により過去に臨床試験が失敗している。例としては、血管破壊剤、例えばコンブレタスタチン（ＣＡ４Ｐ）が挙げられる。例えば、Ｇｒｉｓｈａｍら Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ＣＡ４Ｐ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ，ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ，ａｎｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ．２０１８；５：１を参照されたい。フェーズＩＩのＦＡＬＣＯＮ試験では、ＣＡ４Ｐは、全生存を１６．２～１３．６カ月減少させ、ＣＡ４Ｐにより処置している間に７人の患者が心臓発作を経験した。同文献。冠動脈心疾患および脳卒中が主な死因であり、いずれの血管標的化毒治療も致死毒性のリスクをもたらし得る。
[0004]ＴＭ４ＳＦ１は、血管新生に機能的役割を有する内皮細胞マーカーである。例えば、Ｓｈｉｈら Ｔｈｅ Ｌ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＭ４ＳＦ１ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；６９（８）：３２７２～７を参照されたい。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、固形腫瘍のための治療としてそれらの有望性を満たすように、ＴＭ４ＳＦ１を標的化する抗体薬物コンジュゲートが以前に検討されたが（例えば、Ｖｉｓｉｎｔｉｎら Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉ－ＴＭ４ＳＦ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１５（１４）（８）１８６８～１８７６を参照されたい）、正常血管、特に動脈への毒性を低減したＴＭ４ＳＦ１標的化ＡＤＣが必要である。
３．発明の概要
[0005]メイタンシン、ベンゾアンサマクロリドは、ナノモルまたはナノモル以下の濃度で有糸分裂停止を誘導し、腫瘍細胞を死滅させる、非常に強力な微小管標的化化合物である。しかしながら、メイタンシンは、臨床環境で腫瘍特異性を示さず、容認できない全身毒性を示す。メイタンシンの強力な細胞死滅能は、多発性骨髄腫の処置で使用され得る。血管毒性を最小にしたメイタンシンを使用する標的化ＡＤＣ治療が必要とされる。
[0006]本開示の一態様は：ｉ）抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント；およびｉｉ）チューブリン重合阻害剤を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。一部の実施形態において、チューブリン重合の阻害剤は、メイタンシンまたはその誘導体である。一部の実施形態において、チューブリン重合の阻害剤はメイタンシンである。
[0007]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびチューブリン重合の阻害剤は、一段階または多段階プロトコールにおいてリンカーによってコンジュゲートされている。一部の実施形態において、リンカーは、切断可能リンカー、切断不能リンカー、親水性リンカー、プロ荷電リンカー、またはジカルボン酸ベースのリンカーを含む。一部の実施形態において、切断可能リンカーは、切断可能な共有結合性または非共有結合性リンカーを含む。他の実施形態において、リンカーは、切断不能な共有結合性または非共有結合性リンカーを含む。一部の実施形態において、切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、またはジスルフィド含有リンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、システインリンカーまたは非システインリンカーを含む。特定の実施形態において、非システインリンカーは、リジンリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、ＭＣ（６－マレイミドカプロイル）、ＭＣＣ（マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ－ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、ｖａｌ－ａｌａ（バリン－アラニン）、ａｌａ－ｐｈｅ（アラニン－フェニルアラニン）、ＰＡＢ（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘキサノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－メチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘキサノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－メチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘプタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－エチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘプタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロプロピル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロブチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロペンチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロヘキシル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、ＳＭＣＣ（Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１ カルボキシレート）、またはＳＩＡＢ（Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート）を含む。一部の実施形態において、リンカーは、架橋試薬に由来し、架橋試薬は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ３－シクロプロピル－３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ３－シクロブチル－３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエート、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロプロピル－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロブチル－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタノエート、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロプロピル－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロブチル－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタノエート、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）－２－スルホ－ブタノエート（スルホ－ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル ヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）、または２，５－ジオキソピロリジン－１－イル １７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－５，８，１１，１４－テトラオキソ－４，７，１０，１３－テトラアザヘプタデカン－１－オエート（ＣＸ１－１）を含む。
[0008]一部の実施形態において、リンカーは、切断不能な共有結合性リンカーを含む。一部の実施形態において、切断不能な共有結合性リンカーは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントのＮ末端、Ｃ末端または内部アミノ酸位置に接着されている。一部の実施形態において、切断不能な共有結合性リンカーは、チューブリン重合の阻害剤に共有結合性に接着されている。一部の実施形態において、切断不能な共有結合性リンカーは、Ｎ、Ｏ、またはＳを含むヘテロ原子またはチューブリン重合の阻害剤の炭素原子に共有結合性に接着されている。
[0009]一部の実施形態において、切断不能な共有結合性リンカーは、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、アルケニレン、３～７員環を有するシクロアルキレン、アルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、Ｎ、ＯまたはＳの１～３原子を含む５～１２員環を有するヘテロシクレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｃ１～６アルキル）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、またはこれらの組合せを含み、Ｃ１～Ｃ６アルキレン、アルケニレン、３～７員環を有するシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびＮ、ＯまたはＳの１～３原子を含む５～１２員環を有するヘテロシクレンは、非置換であるかまたはハライド、アミノ、－ＣＦ３、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ３アルコキシ、Ｃ１～Ｃ３アルコキシ、またはＣ１～Ｃ３アルキルチオによって置換されている。一部の実施形態において、切断不能リンカーは、
（式中、整数ｍは０～３であり、整数ｑは０～１２であり、整数ｒは１～３である）
を含む。
[0010]一部の実施形態において、切断不能リンカーは、
（式中、各Ｙ１およびＹ２は、独立して結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１００であり；Ｒ１００は、独立してＨ、重水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり；Ｃ６～Ｃ１２アリール、５～１２員ヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル、または３～１２員複素脂環式基、またはＲ１００が結合される窒素と共にＲ１００および切断不能リンカーの別の原子、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント、またはチューブリン重合の阻害剤が組み合わされ、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１～３個のさらなるヘテロ原子を含有してもよい３～１２員複素脂環式または５～１２員ヘテロアリール基を形成し；整数ｍは０～３であり、整数ｑは０～１２であり、整数ｒは１～３である）
を含む。
[0011]一部の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、式（Ｉ）、その立体異性体または薬学的に許容される塩：
（式中：
Ｒ１は、－ＬＬ－ＡＡであり；
ＬＬは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントとチューブリン重合の阻害剤との間のリンカーであり；
ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
を有する。
[0012]一部の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、式（ＩＩ）またはその薬学的に許容される塩：
（式中：
Ｒ１は、－ＬＬ－ＡＡであり；
ＬＬは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントとチューブリン重合の阻害剤との間のリンカーであり；
ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
を有する。
[0013]一部の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、式（ＩＩＩ）またはその薬学的に許容される塩：
（式中：
整数ｎは、１～１２であり；
Ｙは、ＭＣ（６－マレイミドカプロイル）、ＭＣＣ（マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ－ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、ｖａｌ－ａｌａ（バリン－アラニン）、ａｌａ－ｐｈｅ（アラニン－フェニルアラニン）、ＰＡＢ（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘキサノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－メチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘキサノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－メチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘプタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－エチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘプタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロプロピル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロブチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロペンチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロヘキシル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、ＳＭＣＣ（Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１ カルボキシレート）、またはＳＩＡＢ（Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート）であり；
ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
を有する。
[0014]一部の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、式（ＩＶ）またはその薬学的に許容される塩：
（式中：
整数ｎは、１～７であり；
ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
を有する。
[0015]一部の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、式（Ｖ）またはその薬学的に許容される塩：
（式中：
ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
を有する。
[0016]一部の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントの操作されたアミノ酸残基とチューブリン重合の阻害剤に接着したリンカーとの間に共有結合を含む。
[0017]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、改変されたＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、改変されたＩｇＧ Ｆｃ領域は野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数の置換を含む。一部の実施形態において、野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域は、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態において、野生型Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるようにＥＵインデックスにより番号付けられた場合、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５０、Ｔ２５６、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｐ３３１、Ｍ４２８、Ｎ４３４からなる群から選択される１つまたは複数の位置における突然変異を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｎ２９７位に突然変異をさらに含む。一部の実施形態において、Ｎ２９７位の突然変異はシステインである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＥ２３３位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｅ２３３位の突然変異はプロリンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＬ２３４位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｌ２３４位の突然変異はアラニンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＬ２３５位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｌ２３５位の突然変異はアラニンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＧ２３７位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｇ２３７位の突然変異はアラニンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＭ２５２位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｍ２５２位の突然変異はチロシンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＳ２５４位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｓ２５４位の突然変異はスレオニンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＴ２５６位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｔ２５６位の突然変異はグルタミン酸である。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＭ４２８位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｍ４２８位の突然変異はロイシンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＮ４３４位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｎ４３４位の突然変異はセリンまたはアラニンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＴ２５０位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｔ２５０位の突然変異はグルタミンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＤ２６５位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｄ２６５位の突然変異はアラニンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＫ３２２位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｋ３２２位の突然変異はアラニンである。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＰ３３１位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｐ３３１位の突然変異はグリシンである。
[0018]一部の実施形態において、野生型Ｆｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるようにＥＵインデックスにより番号付けられた場合、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｆ２４３、Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｅ２５８、Ｄ２５９、Ｖ２６４、Ｄ２６５、Ｋ２８８、Ｔ２９９、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｑ３１１、Ｋ３２２、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｔ３５６、Ｋ３７０、Ａ３７８、Ｒ４０９、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５からなる群から選択される１つまたは複数の位置における突然変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。
[0019]一部の実施形態において、Ｋ４４７位の後の１つまたは複数のアミノ酸残基は、独立して、リジン、プロリン、アルギニン、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
[0020]一部の実施形態において、Ｋ４４７位の後の１つまたは複数のアミノ酸残基は、独立して、リジンおよびプロリンからなる群から選択される。
[0021]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８位に突然変異を含む。一部の実施形態において、Ｓ２２８位の突然変異は、Ｓ２２８Ｐを含む。
[0022]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｆ２３４位に突然変異を含む。
[0023]一部の実施形態において、Ｆ２３４位の突然変異は、Ｆ２３４Ａを含む。
[0024]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｌ２３５位に突然変異を含む。
[0025]一部の実施形態において、Ｌ２３５位の突然変異は、Ｌ２３５Ｅを含む。
[0026]一部の実施形態において、Ｌ２３５位の突然変異は、Ｌ２３５Ｅを含む。
[0027]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、およびＮ２９７Ｃを含む。
[0028]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＮ２９７Ｃを含む。
[0029]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む。
[0030]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｌ２３５およびＦ２３４に突然変異を含む。
[0031]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｌ３２８、Ａ３３０、およびＴ２９９位に突然変異を含む。
[0032]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、およびＰ２３８Ｓを含む。
[0033]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域はＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ａを含む。
[0034]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｍ２５２ＹおよびＭ４２８Ｌ；Ｄ２５９ＩおよびＶ３０８Ｆ；またはＮ４３４Ｓを含む。
[0035]一部の実施形態において、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｔ３０７ＱおよびＮ４３４Ｓ；Ｍ４２８ＬおよびＶ３０８Ｆ；Ｑ３１１ＶおよびＮ４３４Ｓ；Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ；Ｅ２５８ＦおよびＶ４２７Ｔ；またはＴ２５６Ｄ、Ｑ３１１Ｖ、およびＡ３７８Ｖを含む。
[0036]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは：（ｉ）配列番号８、２０、３２、４４、５６、６８、８０、９６、１１８、１１９、１２０、または１２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；配列番号７、１９、３１、４３、５５、６７、７９、９５、１１６、または１１７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；および配列番号６、１８、３０、４２、５４、６６、７８、９４、または１１５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖；ならびに（ｉｉ）配列番号１４、２６、３８、５０、６２、７４、８６、１１０、または１２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；配列番号１３、２５、３７、４９、６１、７３、８５、１０９、または１２８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；および配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、または８４、１０７、１０８、１２４、１２５、１２６、または１２７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含む軽鎖
を含む。
[0037]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、９０、９２、１１２、１１４、１３０、または１３２に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９７、９９、１０１、１２２、１３１、または１３３に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
[0038]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、９０、９２、１１２、１１４、１３０、または１３２に記載の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９７、９９、１０１、１２２、１３１、または１３３に記載の配列を含む。
[0039]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0040]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0041]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0042]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0043]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0044]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号６７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0045]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号８０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0046]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号１１１または配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０７または配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0047]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0048]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0049]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号１１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0050]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号１１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0051]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１２４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0052]一部の実施形態において、重鎖は、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、または配列番号１２１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１６または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み；軽鎖は、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、または配列番号１２７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。
[0053]一部の実施形態において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨＨ、またはｓｃＦｖを含む。
[0054]一部の実施形態において、チューブリン重合の阻害剤またはその誘導体は、リソソーム内移行によって無力であるように構成されている。
[0055]一部の実施形態において、チューブリン重合の阻害剤またはその誘導体は、核内移行後に効力があるように構成されている。
[0056]一部の実施形態において、チューブリン重合の阻害剤またはその誘導体は、リソソーム内で分解されるように構成されている。
[0057]一部の実施形態において、チューブリン重合の阻害剤またはその誘導体は、リソソーム内に閉じ込められるように構成されている。
[0058]本開示の別の態様は、本開示の抗体－薬物コンジュゲート、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
[0059]本開示の別の態様は、対象における疾患または障害を処置または予防する方法に関し、疾患は、異常な内皮細胞（ＥＣ）相互作用を特徴とし、方法は、本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
[0060]一部の実施形態において、ＥＣ細胞相互作用は、ＥＣ－間葉幹細胞、ＥＣ－線維芽細胞、ＥＣ－平滑筋、ＥＣ－腫瘍細胞、ＥＣ－白血球、ＥＣ－脂肪細胞、およびＥＣ－神経細胞相互作用の１つまたは複数を含む。
[0061]一部の実施形態において、疾患または障害は、炎症性疾患またはがんを含む。
[0062]本開示の別の態様は、対象における炎症を処置または予防する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法に関する。
[0063]本開示の別の態様は、対象における転移を処置または予防する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態において、対象は、がんからの部分または完全寛解にある。
[0064]本開示の別の態様は、高い転移リスクを伴うがんを有する対象を処置する方法であって、本開示の医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態において、がんを有する対象は高い転移リスクを伴う。
[0065]本開示の別の態様は、がんを有する対象における転移を処置または予防する方法であって、本開示の医薬組成物を、がんを有する対象に投与するステップを含む方法に関する。
[0066]本開示のさらに別の態様は、対象における転移を処置または予防する方法であって、高い転移リスクを伴うがんを有する対象を処置する、およびがんを有する対象における転移を処置または予防する方法に関する。一部の実施形態において、対象は、転移を誘発する可能性がある処置を受けている。一部の実施形態において、処置は、外科手術、放射線処置または化学療法を含む。
[0067]一部の実施形態において、対象は哺乳動物である。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。一部の実施形態において、がんは、癌腫または肉腫である。一部の実施形態において、癌腫は、乳がん、肺がん、結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、または卵巣がんである。一部の実施形態において、肉腫は、血管肉腫、骨肉腫または軟部組織肉腫を含む。一部の実施形態において、がんは、膠芽腫である。
[0068]本開示の別の態様は、本開示による医薬組成物をヒト対象に投与するステップを含む、ヒト対象においてリンパまたは血行性転移を処置または予防する方法に関する。
４．参照による組み込み
[0069]本明細書に記載される全ての公報、特許、および特許出願は、それぞれ個々の公報、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
[0070]図１は、ペイロード（メイタンシン）をリンカーにより抗ＴＭ４ＳＦ１抗体（Ａ０７－ＹＴＥＣ）に接着することによって抗ＴＭ４ＳＦ１抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成し、ＡＤＣ（Ａ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲート）を生じる図解例を示す図である。 [0071]図２Ａは、突然変異を有するか、または突然変異がないＡ０７抗体のキャピラリー電気泳動ＳＤＳ（ＣＥ－ＳＤＳ）の安定性試験結果を示す図である。 図２Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィー－ＨＰＬＣ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）解析でのＡ０７－ＹＴＥＣ抗体の安定性試験結果を示す図である。 [0072]図３は、Ａ０７－ＹＴＥＣおよびＡ０７－ＹＴＥＣ－ＭコンジュゲートのＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 [0073]図４は、Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体およびＡ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートの疎水性相互作用クトマトグラフィー－ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）クロマトグラムを示す図である。 [0074]図５は、非還元Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体および非還元Ａ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートの逆相ＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。 [0075]図６は、還元Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体および還元Ａ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートの逆相ＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。 [0076]図７は、Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体およびＡ０７－ＹＴＥＣ－ＭコンジュゲートのデコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。フルマス範囲のデコンボリューションが実施された。 [0077]図８Ａは、Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体の７０ｋＤａのデコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。 図８Ｂは、Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体の１５０ｋＤａのデコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。 図８Ｃは、Ａ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートの７０ｋＤａのデコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。 図８Ｄは、Ａ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートの１５０ｋＤａのデコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。 [0078]図９は、Ａ０７－ＹＴＥＣ－ＭコンジュゲートのＤＡＲ値を推定する場合、デコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを提供する図である。 [0079]図１０は、膵臓がん（ＭｉａＰａｃａ２）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）を標的化する、Ａ０７ ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲート（６または１２ｍｇ／ｋｇ、１回の注射中）実験の腫瘍退縮解析を示す図である。 [0080]図１１Ａおよび図１１Ｂは、サルにおけるＡＤＣのインビボ薬物動態プロファイルを提供する。図１１Ａは、総抗体およびＡＤＣの血漿濃度－時間プロファイルを示す図である。 図１１Ｂは、血漿－時間プロファイルにおける総抗体にわたる％ＡＤＣを示す図である。 [0081]図１２は、ペイロードがインビボでどのようにリンカー－ペイロード複合体から分離され得るかの概略を提供する図である。 [0082]図１３Ａは、カニクイザルへの注射後４日目に、血漿中のＡ０７－ＹＴＥＣ－ＭコンジュゲートのデコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。 図１３Ｂは、カニクイザルへの注射後８日目に、血漿中のＡ０７－ＹＴＥＣ－ＭコンジュゲートのデコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。 図１３Ｃは、カニクイザルへの注射後１２日目に、血漿中のＡ０７－ＹＴＥＣ－ＭコンジュゲートのデコンボリュートしたＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。ピークパーセンテージは、総ピーク高に基づいて算出した。 [0083]図１４Ａは、試験対象の個体心拍数および個体ＱＲＳ時間の心電図（ＥＣＧ）のダイアグラムを示す図である。 図１４Ｂは、試験対象の個体ＱＴ間隔および個体補正ＱＴ間隔の心電図（ＥＣＧ）のダイアグラムを示す図である。 図１４Ｃは、試験対象の個体ＲＲ間隔および個体ＰＲ間隔の心電図（ＥＣＧ）のダイアグラムを示す図である。
６．発明を実施するための形態
[0084]膜貫通－４Ｌ６ファミリーメンバー－１（ＴＭ４ＳＦ１）は、多くのヒト上皮腫瘍細胞上および内皮細胞、特に血管新生血管または過形成の新しい血管の内皮細胞において高度に発現されるテトラスパニンの形態を有する小さい膜糖タンパク質である。
[0085]一実施形態において、例えば、腫瘍血管の内皮細胞を致死させることにより、原発性腫瘍を退縮させることができる、血管標的化治療のための抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が本明細書で提供される。この治療は、様々な魅力的特徴を含み得る。特に、（１）血管新生は、がんの特徴であり、血管新生血管を破壊する治療は固形腫瘍の一般的な処置であり得る；（２）血管内皮は未変異の宿主システムであり、治療耐性に進化することができないであろう。したがって、血管標的化治療は、標的組織が治療耐性に進化するおよび治療耐性になる、腫瘍細胞標的化治療に伴う共通問題を克服することができ；（３）腫瘍の血管内皮は、静脈内に注入された薬物に直接曝露され、したがって、腫瘍細胞に到達することができない薬物に接近可能にすることができる。腫瘍細胞に接近可能でないことは、がん、例えば腫瘍細胞への薬物の接近を制限する高密度の線維性の間質を有する膵臓がんにおいて重大な問題であり得る。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含むＡＤＣを使用する、血管標的化治療は、腫瘍の血管内皮に有利に到達することができる。
[0086]一実施形態において、本開示は、ＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質、例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびその抗原結合フラグメントを含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。本開示は、一部の例において、がんを処置または予防するためにＡＤＣを使用する方法を含む。本開示は、一部の実施形態において、抗体にコンジュゲートした薬物ペイロードがメイタンシンを含むＡＤＣを含む。
６．１ 定義
[0087]本明細書において別段の定義がない限り、本発明の開示と関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。用語の意味および範囲は明確であるべきであるが、何らかの潜在的なあいまいさがある場合、本明細書で提供される定義が、いずれの辞書または非本質的な定義よりも優先される。さらに、文脈上別段の要求がなされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本出願において、「または」の使用は、別段の指定がない限り「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、加えて他の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、非限定的である。
[0088]一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用される学術名、およびその技術は、周知であり、当技術分野において一般的に使用されるものである。本発明の開示の方法および技術は、一般的に、別段の指定がない限り、当技術分野において周知の従来の方法に従って、さらに、本明細書中で引用および考察される様々な一般的な参考文献やより詳細な参考文献に記載されるように実行される。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に達成される通り、または本明細書に記載される通り、製造元の詳細な説明に従って実行される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬および製薬化学と関連して使用される学術名、ならびにそれらの実験手順および技術は、周知であり、当技術分野において一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、配合、および送達、ならびに患者の処置に関して、標準的な技術が使用される。
[0089]本発明の開示がより容易に理解できるように、選択される用語は、以下で定義される。用語「膜貫通－４Ｌ６ファミリーメンバー－１」または「ＴＭ４ＳＦ１」は、本明細書で使用される場合、腫瘍血管系内皮細胞（ＥＣ）、腫瘍細胞（ＴＣ）、網膜血管系および血管新生の血管を発達させるＥＣ上で高度に発現される膜貫通４スーパーファミリー／テトラスパニンファミリーのポリペプチドを指す。ＴＭ４ＳＦ１は、４つの膜貫通ドメイン（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４）によって分離される２つの細胞外ループ（ＥＣＬ１およびＥＣＬ２）、ＮおよびＣ末端、ならびに細胞内ループ（ＩＣＬ）を有する。ＥＣＬ２は、２つのＮ－グリコシル化部位を含有する。ヒトＴＭ４ＳＦ１（ｈＴＭ４ＳＦ１）のアミノ酸配列は、配列番号９０に記載される（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５０３５．１も参照）。
[0090]用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、特定の抗原（例えば、ＴＭ４ＳＦ１）に特異的に結合するかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むあらゆる抗原結合分子を意味する。用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、加えて、それらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変性を有する領域にさらに細かく分類でき、この領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより高度に保存された領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列される。本開示の異なる実施形態において、抗ＴＭＳ４Ｆ１抗体（またはその抗原結合部位）のＦＲは、ヒト生殖細胞系配列に同一であってもよいし、または天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つまたはそれより多くのＣＤＲの並行分析に基づき定義することができる。
[0091]用語「ＹＴＥＣ」は、本明細書で使用される場合、一般に、Ｆｃ領域に改変を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体（例えば、Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体）を指す。
[0092]用語「無傷の抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互連結した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む抗体を指す。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、無傷の抗体である。一実施形態において、無傷の抗体は、無傷のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである。ある特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプである。
[0093]抗体の「抗原結合部位」、抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、あらゆる天然に存在する、酵素によって入手可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質分解消化、または抗体の可変ドメインおよび任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子工学技術などのあらゆる好適な標準的技術を使用して、無傷の抗体分子から得ることができる。このようなＤＮＡは公知であり、および／または例えば、商業的な供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリーなど）から容易に入手可能であり、または合成することができる。ＤＮＡは、シーケンシングし、化学的に、または分子生物学的技術を使用することによって操作して、例えば、１つまたは複数の可変および／または定常ドメインを好適な配置に配列する、またはコドンを導入する、システイン残基を作り出す、アミノ酸の改変、付加もしくは欠失などをもたらすことができる。
[0094]抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の高度可変領域（例えば、単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）、または拘束性ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模擬するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。
[0095]抗体またはそのフラグメントの「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２、およびＣＤＲ－３）、およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。本開示で使用される方法によれば、ＣＤＲおよびＦＲに割り振られたアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７および１９９１））に従って定義することができる。抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸の番号付けも、Ｋａｂａｔの番号付けに従う。
[0096]用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれの３つのＣＤＲがあり、これらは、可変領域のそれぞれにつきＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と指定される。用語「ＣＤＲセット」は、本明細書で使用される場合、抗原に結合が可能な単一の可変領域中に生じる３つのＣＤＲのグループを指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔによって説明されるシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ． （１９８７）および（１９９１）））は、抗体のあらゆる可変領域に適用可能な疑いのない残基の番号付けシステムを提供することに加えて、３つのＣＤＲを定義する正確な残基の境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称する場合もある。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８８３（１９８９））は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の特定の下位部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチドバックボーンコンフォメーションをとることを見出した。これらの下位部分を、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と指定した。ここで「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ軽鎖および重鎖領域を指示する。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと称する場合もあり、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップする境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３～１３９（１９９５））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２（５）：７３２～４５（１９９６））によって説明されている。さらに他のＣＤＲの境界の定義は、上記のシステムのどちらかに厳密に従っていない場合があるが、それでもＫａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップすると予想され、それにもかかわらず、それらは、特定の残基もしくは残基の群が、またはＣＤＲ全体も、抗原結合に顕著な影響を与えないという予測または実験的発見の観点で、短くしたりまたは長くしたりすることができる。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用することができるが、好ましい実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用する。
[0097]用語「フレームワーク領域」（以下ＦＲ）は、本明細書で使用される場合、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として同定された４つのＦＲを有する。抗体またはその機能的なフラグメントの可変領域のうち共通の構造的特徴は当技術分野において周知である。特定の抗体をコードするＤＮＡ配列は、一般的に、周知の方法、例えば、参考文献として本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、１９８７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤに記載される方法に従って見出すことができる。加えて、抗体から機能的な可変領域をクローニングするための一般的な方法は、参考文献として本明細書に組み込まれるＣｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．ら、１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６に見出すことができる。
[0098]本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用され、例えば、天然配列のＦｃ領域、組換えＦｃ領域、およびバリアントＦｃ領域が含まれる。抗体重鎖のＦｃ領域の境界は変わる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端への伸長部分と定義されることが多い。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｋａｂａｔらに記載されるＥＵ番号付けシステムに従って残基４４７）は、例えば、抗体の産生または精製中に除去してもよいし、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって除去してもよい。したがって、無傷の抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基を有するおよび有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでいてもよい。さらに、本開示の無傷の抗体の組成物は、Ｃ末端のリジン、Ｋ４４７の後に残基の伸長を有する抗体集団を含み得る。
[0099]用語「ヒト化抗体」は、本明細書で使用される場合、目的の抗原（例えば、ヒトＴＭ４ＳＦ１）に免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体またはそのバリアント、誘導体、類似体もしくはフラグメントを指す。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むと予想される。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦｃの少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体ヒト化方法は、当技術分野において公知である。例えば、全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～７；Ｑｕｅｅｎらの、米国特許第５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，６９３，７６１号；５，６９３，７６２号；および６，１８０，３７０号；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９～４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５～８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９～９７３；ならびに米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。
[0100]用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能性のある突然変異、例えば少量で存在する可能性がある天然に存在する突然変異を除いて、同一である。したがって、修飾句「モノクローナル」は、分離した抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。特定の実施形態において、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的と結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローンからの、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールからの固有なクローンの選択であってもよい。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して向けられる。
[0101]用語「キメラ抗体」は、本明細書で使用される場合、所望の生物学的活性を示す限り、特定の種由来の、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同な重鎖および／または軽鎖の部分を有し、それと同時に、鎖の残部が、別の種由来の、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、加えてこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一または相同である抗体（免疫グロブリン）を指す（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１～６８５５（１９８４））。
[0102]用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域中の特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が、１つより多くのエピトープを有する場合もある。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合する場合もあるし、異なる生物学的作用を有する場合もある。エピトープは、構造的または機能的と定義される場合もある。機能的エピトープは、一般的に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に寄与する残基を有する。またエピトープは、配座エピトープであってもよく、すなわち非線形アミノ酸で構成されていてもよい。特定の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面の分子群である決定基を含む場合もあり、特定の実施形態において、特定の３次元構造特徴、および／または特定の電荷の特徴を有していてもよい。
[0103]用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、疾患の処置に関して、所望の結果を達成するのに必要な投与量、および時間での有効な量を指す。例えば、ドライアイ疾患の処置において、がんの任意の症状を低減、予防、遅延または抑制または停止させる薬剤（すなわち、化合物、医薬組成物、抗体薬物コンジュゲート）が有効である。有効量の薬剤は、疾患または状態の治療に必要ではないが、疾患または状態の発症が遅延される、妨げられる、もしくは予防されるか、または疾患もしくは状態の症状が緩和されるような、疾患または状態の処置を提供するであろう。有効量は、好適な形態で１、２、またはそれ以上の用量に分けられ、指定した時間にわたり１回、２回またはそれ以上投与されてもよい。
[0104]用語「ペイロード」、「薬物ペイロード」、「治療分子」、「治療ペイロード」、「治療剤」、「治療成分」は、本明細書では置き換え可能に使用され、抗ＴＭＳＦ１抗体または抗原結合フラグメント（例えば、本明細書に開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメント）にコンジュゲートされている、化学成分または生物成分を指し、メイタンシンおよびその誘導体を含み得る。
[0105]用語「ポリペプチド」または「ペプチド」は、共有結合（例えば、アミド結合）によって接続された２つまたはそれ以上の自然または非自然発生のアミノ酸を指し得る。ポリペプチドまたはペプチドは、本明細書に記載される場合、全長タンパク質（例えば、完全にプロセシングされたタンパク質）ならびに短いアミノ酸配列（例えば、自然発生のタンパク質のフラグメントまたは合成ポリペプチドフラグメント）を含む。テトラペプチドは、共有結合によって共有結合性に接続された４つのアミノ酸を有する。
[0106]用語「置換基」は、任意の分子、化合物または部分上の水素原子などの第２の原子または基を置き換える基を指し得る。好適な置換基は、限定はされないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、およびシアノ基を含み得る。
[0107]用語「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」は、本明細書に開示のＡＤＣの、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントに接着した、薬物（本明細書では、治療分子、治療剤、または治療成分とも称される）の数を指し得る。ＡＤＣのＤＡＲは、典型的には、１～１２の範囲であるが、より高い負荷、例えば１６も、抗体上の結合部位の数または複数の薬剤ペイロードが１つの結合部位に接着されている多価結合の使用に応じて可能である。用語、ＤＡＲは、個々の抗体上に負荷された薬物分子の数を参照して使用され得る、または加えて、平均薬物負荷を反映するＡＤＣの群の平均または中間ＤＡＲを参照して使用され得る。組成物、バッチ、および／または複数のＡＤＣの製剤は、平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。ＤＡＲおよび平均ＤＡＲは、様々な従来の手段、例えばＵＶ分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射測定法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣによって決定され得る。
[0108]用語「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体などの結合タンパク質）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合による相互作用の総計の強度を指す。結合分子Ｘ（例えば、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体）のその結合パートナーＹ（例えば、ヒトＴＭ４ＳＦ１）に対する親和性は、一般的に、解離定数（ＫＤ）によって表することができる。親和性は、本明細書に記載されるものなどの当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般的に、ゆっくり抗原と結合し、容易に解離する傾向があり、それに対して高親和性抗体は、一般的に、より速く抗原と結合し、より長く結合したままの状態である傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野において公知であり、それらのいずれかは、本発明の開示の目的のために使用することができる。特定の例示的な実施形態は、以下を含む。一実施形態において、「ＫＤ」または「ＫＤ値」は、当技術分野において公知のアッセイによって、例えば結合アッセイによって測定することができる。ＫＤは、ＲＩＡで測定することができ、これは例えば、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて実行される（Ｃｈｅｎら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５～８１）。ＫＤはまた、ＦＡＣＳ、またはＢＩＡＣＯＲＥによる、例えばＢＩＡＣＯＲＥ２０００もしくはＢＩＡＣＯＲＥ３０００を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって、または例えばＯＣＴＥＴ ＱＫ３８４システムを使用するバイオレイヤー干渉法によっても測定できる。特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体のＫＤは、ＨＵＶＥＣ細胞を用いる標準的なフローサイトメトリーアッセイを使用して決定される。また、「オンレート」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」および「オフレート」または「解離の速度」または「解離速度」または「ｋｏｆｆ」も、例えばＢＩＡＣＯＲＥ２０００もしくはＢＩＡＣＯＲＥ３０００、またはＯＣＴＥＴ ＱＫ３８４システムを使用する、上述した同じ表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法技術で決定することができる。
[0109]用語「ｋｏｎ」は、本明細書で用いられる場合、当技術分野において公知のように、抗体／抗原複合体を形成するための抗体の抗原への会合に関するオンレート定数を指すことが意図される。
[0110]用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書で用いられる場合、当技術分野において公知のように、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関するオフレート定数を指すことが意図される。
[0111]用語「阻害」または「阻害する」は、本明細書で使用される場合、部分的な（例えば、１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％の）または完全な（すなわち、１００％の）阻害を指す。
[0112]用語「がん」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物における典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする生理学的状態を指すかまたは記載する。
[0113]用語「高い転移リスクを伴うがん」は、本明細書で使用される場合、がんを有する対象が転移がんを発症させるリスクを増加させることがわかっている少なくとも１つの因子に関連するがんを指す。転移リスクの増加に関連する因子の例としては、これらに限定されないが、対象が最初のがん診断時に有するがん性のリンパ節の数、腫瘍のサイズ、組織学的な格付け、および最初の診断時のがんの段階が挙げられる。
[0114]用語「血行性転移」は、本明細書で使用される場合、がん細胞が血管壁に侵入し、その後、血流（循環腫瘍細胞）を介して体内の他の部位および組織に循環できる能力を指す。
[0115]用語「リンパ転移」は、本明細書で使用される場合、がん細胞がリンパ管に侵入し、血管に排出する能力を指す。
[0116]本開示に関して、用語「処置する」または「処置」は、本明細書で使用される場合、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の１つまたは複数の症状を、回復させること、軽減すること、その進行を阻害すること、または予防することを意味する。用語「がんを処置する」は、本明細書で使用される場合、がん細胞の増殖および／または増殖の阻害を意味する。一実施形態において、本明細書に記載される組成物および方法は、転移がんを有する対象における転移を処置するのに使用される。
[0117]用語「がんを予防する」または「がんの予防」は、発癌または腫瘍形成の発生が証明されていないが、例えば遺伝学的スクリーニングによって決定したかまたはそれ以外の方法によるかにかかわらず、がんの素因が同定されている哺乳動物におけるがんの発病を、遅らせること、阻害すること、または予防することを指す。この用語はまた、悪性になる前の状態を有する哺乳動物を処置して、悪性になる前の状態から悪性状態への進行を止める、またはそのような進行を逆行させることも包含する。悪性になる前の状態の例としては、過形成、形成異常、および異形成が挙げられる。一部の実施形態において、がんの予防は、がんからの寛解にある対象に関して使用される。
[0118]悪性もしくは良性のおよび／または原発性もしくは続発性などの様々ながんが、本開示による方法で処置または予防することができる。このようながんの例は、当業者に公知であり、Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｍｅｒｃｋにより出版）などの標準的な教本に列挙される。
[0119]用語「対象」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。
[0120]用語「投与する」は、本明細書で使用される場合、抗体またはそのフラグメント、または組成物（例えば、医薬組成物）の投薬量を対象に与える方法を指す。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される結合タンパク質または医薬組成物、および処置される状態、疾患、または障害の重症度）に応じて変更することができる。
[0121]用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、所望の転帰をもたらすのに十分な、本明細書で提供される抗体または医薬組成物の量を指す。
[0122]用語「約」および「およそ」は、所与の値または範囲の、２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ未満を意味する。
[0123]用語「同一性」、または「相同性」は、本明細書では置き換え可能に使用され、最適な比較目的で配列をアライメントすること（例えば、第１の配列の配列中にギャップを導入してもよい）によって決定できる２つまたはそれより多くのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の「同一性」、「相同性」、または「パーセント相同性」の計算値であり得る。次いで対応する位置のヌクレオチドを比較することができ、２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共通する同一の位置の数の関数であり得る（すなわち、％相同性＝同一の位置の数／位置の合計数×１００）。例えば、第１の配列における位置は、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドで占められていてもよく、その場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント相同性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列が共通する同一の位置の数の関数であり得る。一部の実施形態において、比較目的でアライメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９５％であり得る。ＢＬＡＳＴ（登録商標）検索は、２つの配列間の相同性を決定することができる。２つの配列は、遺伝子、ヌクレオチド配列、タンパク質配列、ペプチド配列、アミノ酸配列、またはそのフラグメントであり得る。２つの配列の実際の比較は、周知の方法によって、例えば数学的なアルゴリズムを使用して達成することができる。このような数学的なアルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０－５８７３－５８７７（１９９３）に記載され得る。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９～３４０２（１９９７）に記載されるように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている場合もある。ＢＬＡＳＴおよびギャップ有りＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のあらゆる関連パラメーターを使用することができる。例えば、配列比較に関するパラメーターは、スコア＝１００、ワード長さ＝１２に設定してもよいし、または変更してもよい（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。他の例としては、Ｍｙｅｒｓおよびミラー、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズム、ＡＤＶＡＮＣＥ、ＡＤＡＭ、ＢＬＡＴ、およびＦＡＳＴＡが挙げられる。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）中のＧＡＰプログラムを使用して達成することができる。
[0124]用語「製造性」は、本明細書で使用される場合、特定のタンパク質の組換え発現および精製中におけるそのタンパク質の安定性を指す。製造性は、発現および精製の条件下における分子の固有の特性によると考えられる。改善された製造性の特徴の例としては、タンパク質の均一なグリコシル化、増加した細胞力価、タンパク質の組換え産生中の増殖およびタンパク質発現、改善された精製特性、凝集する傾向が低いことまたは凝集しないこと、ならびにこれらに限定されないが、低いｐＨでの熱安定性および安定性などの改善された安定性が挙げられる。一部の実施形態において、他のＴＭ４ＳＦ１抗体と比較して、インビトロおよびインビボでの活性の保持と共に製造性を示すＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質が提供される。一部の実施形態において、ＣＤＲまたはフレームワーク領域中にアミノ酸置換をもたらすことによる親ＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質のヒト化は、追加の製造性の利益を付与することができる。
[0125]一部の実施形態において、これらに限定されないが、例えばプロテインＡ精製またはサイズ排除クロマトグラフィー後の改善された精製収量、精製後の改善された均一性、改善された熱安定性などの改善された発展性の特徴を示すＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質が提供される。一部の場合において、改善は、ＨＬＡ分子結合によって決定した場合、ハイブリドーママウス細胞株８Ｇ４－５－１３－１３Ｆ（ＰＴＡ－１２０５２３）によって産生された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体に関する改善である。
[0126]一部の例において、結合親和性は、スキャッチャード分析によって決定され、この分析は、未結合リガンドに結合したリガンドの濃度と結合したリガンドの濃度との比率のプロットであるスキャッチャードプロットを作成することを含む。
[0127]用語「血管毒性」は、抗原担持細胞に作用する抗体または治療分子により直接、または免疫系の活性化または生じる炎症により間接的に血管傷害をもたらす、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体－治療分子コンジュゲート（本明細書では、抗ＴＭ４ＳＦ１ ＡＤＣまたはＴＭ４ＳＦ１標的化ＡＤＣとも称される）の任意の効果を指す。そのような血管傷害は、これらに限定されないが、血管内皮細胞または下にある平滑筋細胞または周皮細胞、または心内膜（心臓の内膜）を含む、任意の血管の基底膜に影響する損傷または炎症を含み得る。そのような血管傷害は、主幹動脈、例えば大動脈、弾性動脈（大動脈など）、サイズが多様な筋動脈、例えば冠動脈、肺動脈、頸動脈、細動脈、毛細血管、脳または腎臓の動脈を含む動脈；細静脈（ｖｅｎｕｅｓ）、静脈に影響し得る；または毛嚢、消化管、および骨髄に供給する血管を含む、血管新生血管に影響し得る。そのような血管傷害は、心臓、肺、腎臓、網膜、脳、皮膚、肝臓、消化管、骨髄、内分泌腺、精巣または卵巣、子宮内膜、および他の標的器官における微小血管の機能障害または損傷を含み得る、ならびに腎臓、網膜または脳血管循環の機能障害を含み得る。
[0128]用語「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」は、本明細書で使用される場合、細胞傷害性顆粒の内容物の放出を特徴とする非食細胞プロセスを介した細胞傷害性エフェクター細胞によって、または細胞死誘導分子の発現によって、抗体被覆標的細胞を致死させることを指す。ＡＤＣＣは、標的結合抗体（ＩｇＧまたはＩｇＡまたはＩｇＥクラスに属する）と、特定のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、すなわち免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ領域に結合するエフェクター細胞表面上に存在する糖タンパク質との相互作用を介して開始される。ＡＤＣＣを媒介するエフェクター細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球および樹状細胞が挙げられる。ＡＤＣＣは、迅速なエフェクターメカニズムであり、その効能は、多数のパラメーター（標的細胞の表面上の抗原の密度および安定性；抗体親和性ならびにＦｃＲ結合親和性）に依存する。ＰＢＭＣベースのＡＤＣＣアッセイおよびナチュラルキラー細胞ベースのＡＤＣＣアッセイは、ＡＤＣＣを検出するのに使用することができる。これらのアッセイにおける読み出しは、終点駆動型（標的細胞溶解）である。
[0129]用語「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、相補物の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の要素（Ｃ１ｑ）が、その同族抗原に結合する抗体（適切なサブクラスに属するもの）に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３を参照）を実行してもよい。変更されたＦｃ領域アミノ酸配列（バリアントＦｃ領域を有するポリペプチド）および増加または減少したＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチドバリアントが記載されている（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号；ＷＯ１９９９／５１６４２；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８～８４を参照）。ＣＤＣ活性をほとんど有さない抗体（またはフラグメント）も使用のために選択され得る。
[0130]用語「エフェクター機能」は、本明細書で使用される場合、ＩｇＧのＦｃエフェクタードメイン（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域）が寄与する機能を指す。このような機能は、例えば、Ｆｃエフェクタードメインが、食細胞または溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体に結合することによって、またはＦｃエフェクタードメインが補体系の要素に結合することによって達成することができる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食（ＡＤＣＰ）；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方調節；およびＢ細胞活性化が挙げられる。
[0131]用語「低減する」または「消失させる」は、本明細書で使用される場合、全体で、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれより多くの減少を引き起こす能力を指す。低減または消失は、２つの分子の結合親和性、例えば、Ｃ１ｑまたはＦｃ受容体への免疫グロブリンへの結合を指す場合があり；または処置される障害（例えば、がん）の症状、例えば転移の存在もしくはサイズまたは原発性腫瘍のサイズを指す場合もある。
[0132]用語「低減したＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能」は、本明細書で使用される場合、対照（例えば突然変異を含まないＦｃ領域を有する抗体）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれより多くの、特異的なエフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの低減を指す。
[0133]用語「細胞毒素」は、本明細書で使用される場合、がん細胞内で放出される場合に、その細胞に毒性である分子を指す。本発明で特に注目した細胞毒素は、チューブリシン（例えば、天然のチューブリシンまたはそれらの誘導体）、オーリスタチン（例えば、モノメチルオーリスタチンＥおよびモノメチルオーリスタチンＦ）、メイタンシノイド（例えばメルタンシン）、カリケアミシン（cahcheamicins）（例えば、カリケアミシンγ）である。
[0134]本発明の開示で考察される全てのアミノ酸位置に関して、抗体またはその抗原結合フラグメントの文脈において、番号付けはＥＵインデックスに従う。「ＥＵインデックス」または「Ｋａｂａｔらに記載されるＥＵインデックス」または「ＥＵ番号付けスキーム」は、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９；Ｋａｂａｔら、１９９１を参照）。
６．２ 改変されたＦｃ領域および／またはＣＤＲ領域を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する抗体薬物コンジュゲート
[0135]本開示の一実施形態は、治療分子に連結された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、改変されたＦｃ領域、例えば１つまたは複数の突然変異を含む、改変されたＩｇＧ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）を含む、抗体薬物コンジュゲートを提供する。一部の場合において、Ｆｃ領域における１つまたは複数の突然変異は、１）エフェクター機能の低減、２）半減期調節、３）安定性、および４）下流プロセスなどの改善の領域において、そのような改変されたＦｃ領域を含む薬物の改善をもたらす。一部の場合において、改変されたＦｃ領域は、抗体と免疫系の間の相互作用を低減または消失する１つまたは複数の突然変異を含み得る。重要な相互作用は、抗体Ｆｃと白血球および血小板上のＦｃγ受容体、および補体依存性細胞傷害をもたらす補体系のＣ１ｑとの相互作用を含み得る。
[0136]本発明の開示は、一部の場合において、例えば、Ｆｃ領域、そのような場合では改変されたＦｃ領域、例えば、改変されたＩｇＧ Ｆｃ領域において免疫消失突然変異を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＡＤＣを提供する。一部の実施形態において、改変されたＦｃ領域は、Ｎ２９７位に改変を含む。一部の実施形態において、改変されたＦｃ領域は、Ｅ２３３、Ｌ２３４またはＦ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｆ２４３、Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｅ２５８、Ｄ２５９、Ｖ２６４、Ｄ２６５、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ２９９、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｑ３１１、Ｋ３２２、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｔ３５６、Ｋ３７０、Ａ３７８、Ｒ４０９、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、およびＨ４３５位、またはこれらの任意の組合せに、１つまたは複数の突然変異を含む、改変されたＩｇＧ Ｆｃ領域（例えば、改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含む。一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、正電荷がＣ末端で維持されるように、そのＣ末端に残基の伸長を含む（例えば、一部の場合において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントが２つの重鎖を含む場合、少なくとも１つの重鎖がＣ末端に残基の伸長を含む）。残基のそのような伸長は、１つまたは複数のアミノ酸、例えばアルギニン、リジン、プロリン、またはこれらの任意の組合せの付加を含み得る。一部の例において、Ｆｃ領域の伸長したＣ末端は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＡＤＣのＣＤＣ機能の低減をもたらす。そのような効果は、一部の場合において、単独または他の突然変異との組合せで、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４におけるＦｃのＫ４４７の後のＫＰ残基の付加によって見られる（例えば、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３３１Ｇ－ＩｇＧ１）。
[0137]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１つまたは複数の置換を含む、エフェクター機能が低減した抗体を含み得る（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号参照）。一部の場合において、Ｆｃ領域におけるそのような突然変異は、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７の２つまたはそれ以上における置換、例えば、残基２６５および２９７のアラニンへの置換（ＤＡＮＡ突然変異、すなわちＤ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ）を含み得る（例えば、米国特許第７，３３２，５８１号参照）。一部の場合において、Ｆｃ領域における突然変異は、アミノ酸位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、およびＰ３３１の１つまたは複数において置換を含み得る。一部の場合において、Ｆｃ領域における突然変異は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｋ３２２Ａ、およびＰ３３１Ｇの少なくとも１つ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。例えば、Ｆｃ領域における突然変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ（ＩｇＧ１）、またはＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ（ＩｇＧ４）を含んでよく、そのような突然変異を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントは、変更されたＦｃｇＲＩ相互作用を示し得る。
[0138]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の突然変異：Ｍ４２８位およびＮ４３４位におけるアミノ酸置換（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）を含むＦｃバリアントを含み得る（例えば、ＵＳ９８０３０２３を参照）。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の突然変異：Ｔ２５０位およびＭ４２８位におけるアミノ酸置換（Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ）を含むＦｃバリアントを含み得る（例えば、ＵＳ９８０３０２３を参照）。
[0139]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、突然変異Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａを含み得る。一部の場合において、野生型ヒトＦｃ領域の３２９位のプロリン（Ｐ３２９）は、グリシンまたはアルギニン、またはＦｃのＰ３２９とＦｃｇＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｗ８７およびＷＨＯの間に形成される、Ｆｃ／Ｆｃｙ受容体界面内のプロリンサンドイッチを破壊するのに十分な大きさのアミノ酸残基と置換され得る（例えば、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４０６、２６７～２７３（２０ Ｊｕｌｙ ２０００）を参照）。さらなる実施形態において、Ｆｃ領域における突然変異は、Ｓ２２８Ｐ（ＩｇＧ４）、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓなどの１つまたは複数のアミノ酸置換、さらに他の実施形態において、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＦ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、またはＬ２３５Ｅを含み得る。
[0140]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＰ３２９がグリシンによって置換された野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃバリアントであり、Ｆｃバリアントが、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅにおいて少なくとも２つのさらなるアミノ酸置換を含み、残基がＥＵ番号付けに従って番号付けされる、改変されたＦｃ領域を含み得る（例えば、ＵＳ８９６９５２６を参照）。Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ置換を含むポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％までＡＤＣＣの下方調節、および／またはＡＤＣＰの下方調節のために、ヒトＦｃｙＲＩＩＩＡおよびＦｃｙＲＩＩＡへの親和性の低減を示し得る（例えば、ＵＳ８９６９５２６を参照）。
[0141]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、三重突然変異：Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異（Ｐ３２９／ＬＡＬＡ）を含むＦｃバリアントを含み得る（例えば、ＵＳ８９６９５２６を参照）。
[0142]本開示の特定の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントは、一部の実施形態において、ＦｃＲへの、改善または減退された結合を示す突然変異を含み得る（例えば、ＵＳ６７３７０５６、ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１～６６０４（２００１）を参照）。
[0143]一部の例において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントは、ＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、および／または３３４位における置換を有するＦｃ領域を含み得る。例えば、ＵＳ６１９４５５１、ＷＯ９９／５１６４２号、およびＩｄｕｓｏｇｉｅら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８～４１８４に記載されるように、変更された（すなわち、改善または減退された）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる変更が、Ｆｃ領域に行われ得る。
[0144]増加した半減期および新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体。母親のＩｇＧの胎児への移行のためのその機能にちなんで名付けられたＦｃＲｎはまた、それらをエンドソームにおいて捕捉し、それらを循環に戻すことにより、リソソームにおける分解から抗体を保護することに寄与する。（例えば、Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）を参照）、ＵＳ２００５／００１４９３４に記載される。いずれの特定の理論にも縛られることなく、ＦｃＲｎへの結合が改善した抗体は、ＴＭ４ＳＦ１から離れ、ＦｃＲｎに結合し、次いでＡＤＣをリサイクルして循環に戻し、したがって血管毒性を低減させると考えられる。一部の実施形態において、本明細書では、ＦｃＲｎリサイクルを強化する１つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを提供する。一部の実施形態において、本明細書では、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つまたは複数の置換、例えば、位置：２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２８、４２４、４３４、および４３５の１つまたは複数における置換、例えば、ＥＵ番号付けに従ってＦｃ領域残基４３４の置換（ＵＳ７３７１８２６）を有するＦｃ領域を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｕｎｃａｎ＆ａｍｐ；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８～４０（１９８８）；ＵＳ５６４８２６０；ＵＳ５６２４８２１；ＵＳ２００５／００１４９３４およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
[0145]一部の実施形態において、本明細書では、ｐＨ依存的ＦｃＲｎ結合親和性を有する、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いずれの特定の理論にも縛られることなく、ｐＨ依存的ＦｃＲｎ結合親和性を有するＡＤＣ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｐＨ＞７でＦｃＲｎから離れ、ｐＨ６でＦｃＲｎに結合すると考えられる。したがって、酸性ｐＨの細胞内小器官、例えばエンドソームにおけるＦｃＲｎは、そのような抗体を結合し、抗体を細胞膜へと運び戻し、ｐＨ＞７で血漿へと抗体を放出し、抗体をリサイクルし、ＡＤＣペイロードのリソソーム放出を避ける。
[0146]特定の実施形態において、本明細書では、ＦｃＲｎリサイクルを調節する１つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一部の実施形態において、本明細書は、酸性ｐＨ、例えばｐＨ６でのＦｃＲｎ結合を強化し、中性または塩基性ｐＨ、例えばｐＨ７でのＦｃＲｎ結合に影響しない、１つまたは複数の置換を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＥＵ番号付けに従って、２５０位、２５２位、２５４位、２５６位、４２８位、および４３４位の１つまたは複数に置換を含み得る。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、置換Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ｓの１つまたは複数を含むＦｃバリアントを含み得る。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、置換Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ（「ＱＬ突然変異」）を含むＩｇＧ１ Ｆｃバリアントを含み得る。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、置換Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ（「ＱＬ突然変異」）を含むＩｇＧ４ Ｆｃバリアントを含み得る。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ突然変異」）を含むＩｇＧ１ Ｆｃバリアントを含み得る。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ突然変異」）を含むＩｇＧ１ Ｆｃバリアントを含み得る。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ突然変異」）を含むＩｇＧ４ Ｆｃバリアントを含み得る。ＦｃＲｎリサイクルを調節するＦｃ領域におけるアミノ酸置換の効果は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｍｂｌｅｔｔら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１３（７）：２３８７～９６（２０１６）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３３）：２３５１４～２４（２００６），Ｈｉｎｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３～６（２００３），Ｈｉｎｔｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７６（１）：３４６～５６（２００６）、ＵＳ２００８０１８１８８７、ＵＳ７３６１７４０、およびＥＰ２２３５０５９に記載される。
[0147]特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、置換Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ含むＦｃバリアントを含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ含むＦｃバリアントを含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含むＦｃバリアントを含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ含むＦｃバリアントを含む。
[0148]特定の実施形態において、本明細書に開示のＡＤＣは、低減された血管毒性、低減されたリソソーム毒性、改善された有効性、および／または改善された治療限界を示す。一部の実施形態において、本明細書に開示のＡＤＣは、増加したＦｃＲｎ結合親和性および増加した血清半減期を有する突然変異したＦｃ領域を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態において、突然変異したＦｃ領域を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも５０日、少なくとも６０日、少なくとも７０日、少なくとも８０日、少なくとも９０日、少なくとも１００日またはそれ以上の血清半減期を有する。一部の実施形態において、
[0149]特定の実施形態において、本開示のＡＤＣは、低減された血管毒性、改善された治療限界、または両方を示す。特定の実施形態において、本開示のＡＤＣは、本開示の抗体と同じアミノ酸配列を有するがＦｃ領域への少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含まない抗体（本明細書では、「改変されていない抗体」とも称される）と比較して、エフェクター機能を促進することに関与するＦｃリガンドへの親和性が低減または消失している突然変異したＦｃ領域を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
[0150]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を低減または消失する少なくとも２つの突然変異を含むＦｃ領域を含む。さらなる実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を低減するまたは消失させる、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０個またはそれより多くの突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0151]特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６デルタ（欠失）、Ｇ２３７Ａ、Ｖ２６３Ｌ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｋ３２２Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｇ、およびＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0152]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｇ２３７Ａ突然変異と共に、またはＧ２３７Ａ突然変異なしで、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含むＦｃ領域を含む。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0153]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0154]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｎ Ｚら、Ｍａｂｓ ２００９ Ｎｏｖ－Ｅｃ；１（６）：５７２～９で記載されるように、ＦｃγＲＩ（本明細書ではＦｃｇＲＩとも称される）、ＦｃγＲＩＩＡ（本明細書ではＦｃｇＲＩＩＡとも称される）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（本明細書ではＦｃｇＲＩＩＩＡＩとも称される）への低減した結合、および低減したＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を提供するＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／デルタＧ２３６（欠失）突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0155]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｎ２９７ｘ突然変異（式中、ｘ＝Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｑ）を含むＦｃ領域を含む。
[0156]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0157]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣａｎｆｉｅｌｄ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（１９９１）１７３（６）：１４８３～９１．１０．１０８４で記載されるように、Ｃ１ｑへの低減した結合を提供するＫ３２２Ａ、Ｐ３２９Ａ、およびＰ３３１Ａの１つまたは複数に突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0158]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｅｚａｒｅｈら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１ Ｄｅｃ；７５（２４）：１２１６１～８に記載されるように、ＦｃγＲＩＩＢ（本明細書ではＦｃｇＲＩＩＢとも称される）への強化された結合および強化されたＡＤＣＣを提供するＶ２６３Ｌ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0159]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡまたはＬ２３５Ｅ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0160]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥまたはＰ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0161]特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２アイソタイプであり、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８ＡまたはＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0162]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２アイソタイプであり、Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0163]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２アイソタイプであり、Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１ＳまたはＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0164]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６デルタ（欠失）、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｒからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0165]特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｈａｐｐｅｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９１）８８（２０）：９０３６～４０に記載されるように、低減したＦａｂ－アーム交換および低減した凝集を提供するＳ２２８Ｐ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0166]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0167]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ／Ｅ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／デルタＧ２３６（欠失）突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0168]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｎ２９７ｘ突然変異（式中、ｘ＝Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｑ）を含むＦｃ領域を含む。
[0169]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0170]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、例えば、Ｓａｘｅｎａら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ｄｅｃ １２；７：５８０に記載されるように、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの低減した結合および低減したＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター活性を提供するＬ２３５Ｅ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0171]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡまたはＥ２３３Ｐ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６デルタ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0172]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、少なくともＳ２２８Ｐ突然変異を含むＦｃ領域を含む。Ａｎｇａｌら（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３ Ｊａｎ；３０（１）：１０５～８）は、残基２４１におけるセリンの存在（ＥＵ番号付けシステムに従って、ここではＫａｂａｔ番号付けにおける残基２２８に対応する）が、分泌されたヒトＩｇＧ４の所定の割合において、ヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋の不均質性の原因であることを決定するための、ヒトＩｇＧ４重鎖のヒンジ配列の分析を記載する。Ｓｉｌｖａら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｆｅｂ ２７；２９０（９）：５４６２～９）は、インビボおよびインビトロにおけるＩｇＧ４ Ｆａｂ－アーム交換を防止するヒトＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ突然変異を記載する。
[0173]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｌ２３５ＥまたはＳ２２８Ｐ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0174]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＮ２９７Ｇ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0175]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｒ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0176]例示的な実施形態の一つにおいて、いずれかのＩｇＧアイソタイプの突然変異したＦｃ領域が、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２９７位、３１８位、３２０位、３２２位（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ１９８８００７０８９に記載される通り）に１つまたは複数の突然変異を含む。また置換、欠失および付加などのＦｃ領域における他の可能性のある突然変異は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４０１７０１４０、ＷＯ２００９１００３０９、ＵＳ２００９０１３６４９４およびＵＳ８９６９５２６にも記載される。
[0177]インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害性アッセイは、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減または消失を確認するのに実行することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を喪失しているが（したがってＡＤＣＣ活性を喪失している可能性がある）、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、それに対して単球は、ＦｃγＲＩ、ＲＩＩおよびＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えばＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６）７０５９～７０６３を参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（１９８５）１４９９～１５０２；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１～１３６１を参照）に記載される。代替として、非放射性アッセイ方法が採用される場合がある（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を参照されたい。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替として、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、例えばＣｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１９９８）６５２～６５６で開示された動物モデルで、評価することができる。またＣ１ｑ結合アッセイを行って、抗体が、Ｃ１ｑに結合できないこと、したがってＣＤＣ活性を喪失していることを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２に記載のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実行することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２（１９９６）１６３；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０１（２００３）１０４５～１０５２；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．、およびＧｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．、Ｂｌｏｏｄ １０３（２００４）２７３８～２７４３を参照）。またＦｃＲｎ結合およびインビボにおけるクリアランス／半減期の決定も、当技術分野において公知の方法を使用して実行することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）（２００６）１７５９～１７６９を参照）。
[0178]一部の実施形態において、いずれかのＩｇＧアイソタイプの突然変異したＦｃ領域が、Ｌ３２８位に突然変異、例えばＬ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａを含む（例えば、ＵＳ２００５００５４８３２を参照）。
[0179]一実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、改変されていない抗体と比較して、低減または消失したＡＤＣＣエフェクター機能を示す。別の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、改変されていない抗体のＡＤＣＣエフェクター機能の、２分の１以下、または３分の１以下、または５分の１以下、または１０分の１以下、または５０分の１以下、または１００分の１以下に低減したＡＤＣＣエフェクター機能を示す。さらに別の実施形態において、本開示の抗体は、改変されていない抗体と比べて、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％低減したＡＤＣＣエフェクター機能を示す。本開示のさらなる態様において、本発明の開示の抗体またはその抗原結合フラグメントにより誘発されたＡＤＣＣエフェクター機能の低減または下方調節は、改変されていない抗体によるＡＤＣＣの誘発について観察された値の０、２．５、５、１０、２０、５０または７５％の低減である。特定の実施形態において、ＡＤＣＣ活性の低減および／または消失は、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントのＦｃリガンドおよび／または受容体に対する低減した親和性に起因する可能性がある。
[0180]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントのｐＨ依存的ＴＭ４ＳＦ１結合を調節するＣＤＲ置換
[0181]本開示の一実施形態は、治療分子またはペイロードに連結された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＡＤＣであって、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントがＴＭ４ＳＦ１へのｐＨ依存的な結合親和性を示す、ＡＤＣを提供する。一部の例において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、他のｐＨ範囲と比較して、特定のｐＨ範囲において高い親和性でＴＭ４ＳＦ１に結合する。例えば、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨとは異なる親和性でＴＭ４ＳＦ１に結合し得る。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨよりも高い親和性でＴＭ４ＳＦ１に結合する。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨよりも低い親和性でＴＭ４ＳＦ１に結合する。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、酸性ｐＨにおいてＴＭ４ＳＦ１に結合し、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨにおいてＴＭ４ＳＦ１から解離する。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｐＨ７またはそれ以上でＴＭ４ＳＦ１に結合し、ｐＨ６またはそれ以下でＴＭ４ＳＦ１から離れる。血漿、サイトゾル、および核などの細胞内区画では、ｐＨは中性または塩基性である。リソソームまたはエンドソームでは、ｐＨは酸性である。いずれの特定の理論にも縛られることなく、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは抗原に結合し、続いてエンドソームの膜において内部移行する。ｐＨ依存的抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、エンドソームにおいてＴＭ４ＳＦ１から離れ、エンドソーム内のＦｃＲｎ受容体に結合することができ、ＦｃＲｎ受容体によってリサイクルされ、エンドソームが進行するリソソームにおいて分解されるよりも循環に戻され得る。したがって、ｐＨ依存的抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、複数回ＴＭ４ＳＦ１抗原に結合することができる。したがって、ｐＨ依存的抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびそれと会合される治療分子またはペイロードは、リソソームにおいてペイロードを放出することなく、ＦｃＲｎ受容体によってリサイクルされ得る。
[0182]標的介在性の薬物消失（Ｔａｒｇｅｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、またはＴＭＤＤは、抗原が、結合した抗体および／または任意の会合したＡＤＣペイロードをリソソームに運ぶ場合に起こり、ＡＤＣは分解され、ペイロードは放出される。ＴＭＤＤに関連するリソソーム毒性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｉｍｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．３６（５）：４０７～２０（２００９）に記載される。一部の実施形態において、本明細書では、低減された血管毒性、増加された血清半減期、および／または改善された治療限界を示す、治療分子に連結された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＡＤＣが提供される。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ残基において１つまたは複数のヒスチジンアミノ酸残基置換を含む。いずれの特定の理論にも縛られることなく、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の好適な位置におけるヒスチジン残基の導入は、ＴＭ４ＳＦ１へのｐＨ調節性の結合親和性を可能にし得る。例えば、ｐＨ依存的抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を有するＡＤＣは、酸性リソソームまたはエンドソーム環境においてＴＭ４ＳＦ１から解離し、続いてＦｃＲｎ結合を介して循環へとリサイクルされ得る。他の匹敵する野生型抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較すると、ｐＨ依存的抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、増加した血清半減期および低減された分解速度またはリソソームにおけるペイロード放出速度を示し得る。一部の場合において、ｐＨ依存的抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＡＤＣは、増加された血清半減期、低減された血管毒性、改善された治療限界、および／または改善されたまたは少なくともおよそ等価なインビボ効力を示し得る。
[0183]本明細書では、抗体－ＴＭ４ＳＦ１結合が、少なくとも２、３、４、８、１０、１６もしくはそれ以上、または２、３、４、８、１０、１６もしくはそれ以上の間の範囲である、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４でのＫｄ比および／またはＫｏｆｆ比を有するように、抗体のｐＫａに影響する微小環境を最適化する抗体ＣＤＲヒスチジン残基または他の残基を選択するステップを含む、ｐＨ依存的な方法で抗体－ＴＭ４ＳＦ１結合親和性を調節するステップにより増加された半減期および／または薬力学的効果を有する、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＡＤＣを作製する方法を開示する。一部の実施形態において、方法は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにアミノ酸置換を導入し、２５℃で測定した場合に少なくとも１００ｎＭのｐＨ７．４でのＫＤを有するＴＭ４ＳＦ１親和性を達成するステップを含む。特定の実施形態において、方法は、ｐＫａに影響する微小環境を最適化するＣＤＲ残基または他の残基においてヒスチジンが濃縮された抗体ライブラリーを生成するステップを含む。一部の実施形態において、抗体ライブラリーは、ＣＤＲ位置に導入されたヒスチジン残基を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態において、抗体ライブラリーは、一連の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、抗体ライブラリーの各抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、異なるＣＤＲ位置に単一のヒスチジン置換を含む。一部の実施形態において、抗体ライブラリーは、それぞれヒスチジン残基に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の突然変異を含む、一連の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態において、抗体ライブラリーのＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原フラグメントの少なくとも１つにおいて、全てのＣＤＲ位置がヒスチジンに突然変異される。
[0184]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ領域において１、２、３、４、５またはそれ以上のヒスチジン置換を含む。ヒスチジン残基は、ｐＨ依存的な結合親和性のため、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体軽鎖（ＬＣ）または重鎖（ＨＣ）の異なる位置に操作され得る。したがって、一部の実施形態において、本明細書では、ヒスチジン操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを有するＡＤＣが提供される。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１に１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ２に１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３に１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３に１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１に１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ２に１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３に１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。したがって、一部の実施形態において、本開示のＡＤＣは、ヒスチジン操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
[0185]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３、例えば配列番号１０１または配列番号１３１の３０位（Ｓ３０Ｈ）、９２位（Ｓ９２Ｈ）、および９３位（Ｎ９３Ｈ）の１つまたは複数に、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３、例えば配列番号９２または配列番号１３０の２８位（Ｔ２８Ｈ）、３１位（Ｎ３１Ｈ）、３２位（Ｙ３２Ｈ）、５２位（Ｎ５２Ｈ）、５４位（Ｙ５４Ｈ）、５７位（Ｎ５７Ｈ）、１００位（Ｑ１００Ｈ）、および１０１位（Ｙ１０１Ｈ）の１つまたは複数に、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む。
[0186]Ｎ２９７位（Ａｓｎ２９７）における置換および抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントへの１つまたは複数の治療分子のコンジュゲーション
[0187]ヒトＩｇＧ分子は、ＣＨ２ドメインの各Ｎ２９７残基に保存されたグリコシル化部位を有し、これらのペンダントＮ－グリカンを部位特異的コンジュゲーションのための便利な標的にする。このグリコシル化部位は、可変領域から十分遠く、薬物部分の接着したグリカンへのコンジュゲーションは抗原結合に影響しない。本開示の一部の実施形態において、過ヨウ素酸塩によるこれらのグリカンに含有される隣接ジオール部分の酸化的切断を含み、還元的にアミノ化され、ヒドラジドおよびアミノオキシ化合物にコンジュゲートされ得るアルデヒドを生成する例示的な方法を使用して、治療分子はグリカンに連結される。（例えば、Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら（１９８４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８：２７３～７７を参照）。
[0188]別の方法は、これらのグリカンにおけるＮ－アセチルグルコサミン残基のフコシル化を増加するステップを含み得る。これらのフコース残基の酸化は、抗体のこれらの特定の部位に薬物および蛍光を連結させるために使用され得るカルボン酸およびアルデヒド部分を産生し得る（例えば、Ｚｕｂｅｒｂｕｈｌｅｒら（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：７１００～０２を参照）。別の方法は、これらのグリカンのシアル酸を改変するステップ（ならびにこれらのグリカンにおけるシアル酸含量を増加するステップ）、続いてシアル酸の酸化およびオキシム連結コンジュゲートを形成するアミノオキシ薬とのコンジュゲーションを含み得る（例えば、Ｚｈｏｕら（２０１４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２５：５１０～２０を参照）。
[0189]あるいは、シアリルトランスフェラーゼは、これらのグリカンへと成体直交型の官能基を含有する改変されたシアル酸残基を組み込むために使用され得る。成体直交型の官能基は、次いで、グリカンの部位へと治療分子を接着するように改変され得る（例えば、Ｌｉら（２０１４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．５３：７１７９～８２を参照）。これらのグリカン部位を改変する別のアプローチは、ガラクトース、またはケトンもしくはアジドを含有するガラクトース類似物を、これらのグリカンのＮ－アセチルグルコサミンへと連結する、グリコシルトランスフェラーゼの使用であり、薬物または放射性ヌクレオチドをガラクトース分子に連結することである（例えば、Ｋｈｉｄｅｋｅｌら（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１６１６２～６３；Ｃｌａｒｋら，（２００８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０：１１５７６～７７；Ｂｏｅｇｇｅｍａｎら（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１８：８０６～１４を参照）。別のアプローチは、代謝性オリゴ糖工学による抗体の発現時の、これらのグリカンへの改変された糖の導入による（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（２００７）Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔ．３：１８７～９４；Ａｇａｒｄら，（２００９）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４２：７８８～９７を参照）。
[0190]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、部位特異的コンジュゲーションによって、治療分子にコンジュゲートされている。システインおよびグルタミンを含む、いくつかの天然または工学的に操作されたアミノ酸は、コンジュゲーションの部位として選択され得る。
[0191]一部の例において、システイン残基は、例えばＮ２９７位、すなわちＮ２９７Ｃなど、連結のために抗体重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）の異なる位置に工学的に操作され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示のＡＤＣは、システイン操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
[0192]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の好適な位置におけるシステイン残基の導入は、コンジュゲーションの部位の制御を可能にすることができ、得られた部位特異的コンジュゲートは、野生型コンジュゲーション、すなわち還元された鎖間のシステインを介するコンジュゲーション、を介して得られたコンジュゲートよりもより均一であり得る。一部の場合において、システインを介する少なくとも１つのコンジュゲーションを含むＡＤＣは、野生型コンジュゲートと比較して、少なくとも等価なインビボ効力、改善された薬物動態（ＰＫ）、および拡大された治療濃度域を示し得る。一部の実施形態において、ＡＤＣは、切断可能なジペプチドリンカー（すなわち、バリン－アラニン）および抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦｃ部分の重鎖Ｎ２９７Ｃ位においてシステインに連結される薬物としてＤＮＡ架橋ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体を含む。一部の場合において、ＡＤＣは、１以上の平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）、例えば約２、６、１０等のＤＡＲを有する。
[0193]いずれの特定の理論にも縛られることなく、非対合のシステインを介する部位特異的コンジュゲーションは、比較的簡単およびスケーラブルであり得ると考えられる。例えば、治療分子の連結は、特別な試薬を必要とせずに行われ得る。一部の場合において、部位特異的システインを介して調製されたＡＤＣは、強いインビボ抗腫瘍活性を示し、従来のコンジュゲートよりもより耐性であり得る。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントのＮ２９７位は、システイン、すなわちＮ２９７Ｃに突然変異されてよく、システイン残基は治療分子にコンジュゲートされ得る。一部の例において、Ｎ２９７Ｃ突然変異は、近くの残基のさらなる突然変異と組み合わされ、安定化する残基（例えば、アルギニン、リジン）を付加および／またはグルタミン酸を除去する。一部の場合では、Ｎ２９７Ｃに加えて、残基２９２～３０３から１つまたは複数の位置が改変される。２９２～３０３位の配列は、ＲＥＥＱＹＣＳＴＹＲＶＶ（ＩｇＧ１）、およびＲＥＥＱＦＣＳＴＹＲＶＶ（ＩｇＧ４）であり得る。
[0194]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、グルタミン残基を介する部位特異的コンジュゲーションにより、治療分子にコンジュゲートされている。一部の場合において、微生物のトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）が、ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、脱グルコシル化抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖のＱ２９５残基へと、薬物－リンカーまたは反応性スペーサーを含有するアミンを移行するために使用され得る。コンジュゲーションは、２段階の化学酵素アプローチを使用して最適化され、それにより、成体直交型のアジドまたはチオール機能性リンカーを含有する反応性スペーサーがｍＴＧにより抗体に接着され、続いてジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）またはＭＭＡＥを含有するマレイミドと反応した。歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）またはチオール－マレイミド化学を使用することにより、ＡＤＣは、例えば、約２のＤＡＲで生成され得る。
[0195]一部の例において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、グルタミン残基（例えばＱ２９５）ならびに２９７位におけるシステイン、Ｎ２９７Ｃを介して、部位特異的コンジュゲーションによって、治療分子にコンジュゲートされている。突然変異のこの組合せは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにおける２つのコンジュゲーションハンドルを開き、より高いＤＡＲのＡＤＣを得ることができる。したがって、本開示の一部の実施形態において、１つより多くの治療分子（例えば２つの治療分子）がＮ２９７ＣおよびＱ２９５における部位特異的コンジュゲーションを介して抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされている、ＡＤＣが提供される。例えば、システインコンジュゲーションは、マレイミド、ハロアセトアミド、または別のパートナーであり得る。
[0196]増加されたＤＡＲは有効なＡＤＣ構築、抗体構造の最低限の不安定化、および強化されたＡＤＣ有効性をもたらし得る。モジュラーペイロード導入を可能にするシステインコンジュゲーションベースの２重負荷リンカーが近年開発された（Ｌｅｖｅｎｇｏｏｄら，２０１７）。したがって、複数のペイロードを送達することができるＡＤＣの必要性が未だある。
[0197]加えて、ＡＤＣリンカー構造および抗体－ペイロードコンジュゲーション様式は、ＡＤＣ均一性、細胞傷害性能、耐性、および薬物動態（ＰＫ）に影響する。これらの重要なパラメーターは、全体的なインビボ治療有効性に非常に貢献し得る（例えば、Ｌｕら，２０１６、Ｈａｍｂｌｅｔｔら，２００４、Ｊｕｎｕｔｕｌａら，２００８、およびＢｅｈｒｅｎｓら，２０１５を参照）。したがって、リンカーおよびコンジュゲーション化学を精製することは、ＡＤＣの治療能および安全性プロファイルを最大にするために極めて重要である。
[0198]バイオコンジュゲーション様式および方法は、改善されたＡＤＣ安定性および有効性のために最適化され得る。一部の実施形態において、１つまたは複数の治療剤および／または診断剤は、マレイミド、例えばシステイン－マレイミドコンジュゲーションを介して抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされている。マレイミド以外の他の官能基は、一部の例において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、例えばシステイン操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体のチオール基と反応性であり、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートを含む。一部の実施形態において、治療剤および／または診断剤は、アセトアミドを介して、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされている。例えば、治療剤は、ブロモアセトアミドコンジュゲーションを介して抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされ得る。一部の場合において、ブロモアセトアミドコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＡＤＣは、増加された安定性、増加された半減期、低減された毒性、および／または改善された治療限界を示す。例示的なＡＤＣ構造は、図１～６に提供する。
６．３ 抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント
[0199]ＴＭ４ＳＦ１は、テトラスパニン形態を有するが相同性を有さない小さい原形質膜糖タンパク質である（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５０３５．１）（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：１５９４～１６００、２０００）。これは、原形質膜上にＴＭ４ＳＦ１濃縮ドメイン（ＴＭＥＤ）を形成し、この場合、真のテトラスパニンのように、機能的に関連する膜およびサイトゾル分子を補充する分子促進剤として役立ち（Ｓｈｉｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９：３２７２～３２７７、２００９；Ｚｕｋａｕｓｋａｓら、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．１４：３４５～３５４、２０１１）、がん細胞増殖（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：３９１７～３９２３、１９８６）、運動性（Ｃｈａｎｇら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１１６：２４３～２５２、２００５）、および転移（Ｒｉｃｈｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９１６ｓ～５９２０ｓ、１９９５）において重要な役割を果たす。ヒトＴＭ４ＳＦ１タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５０３５．１）は、以下に配列番号１３４として示される。
[0200]ＭＣＹＧＫＣＡＲＣＩ ＧＨＳＬＶＧＬＡＬＬ ＣＩＡＡＮＩＬＬＹＦ ＰＮＧＥＴＫＹＡＳＥ ＮＨＬＳＲＦＶＷＦＦ ＳＧＩＶＧＧＧＬＬＭ ＬＬＰＡＦＶＦＩＧＬ ＥＱＤＤＣＣＧＣＣＧ ＨＥＮＣＧＫＲＣＡＭ ＬＳＳＶＬＡＡＬＩＧ ＩＡＧＳＧＹＣＶＩＶ
ＡＡＬＧＬＡＥＧＰＬＣＬＤＳＬＧＱＷＮＹＴＦＡＳＴＥＧＱＹＬＬＤＴＳＴＷＳＥＣＴＥＰＫＨＩＶＥＷＮＶＳＬＦＳＩＬＬＡＬＧ ＧＩＥＦＩＬＣＬＩＱＶＩＮＧＶＬＧＧＩＣ ＧＦＣＣＳＨＱＱＱＹ ＤＣ（配列番号９１）
[0201]一部の実施形態において、本開示の、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ドメインに特異的である。ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ドメインのアミノ酸配列は、ＥＧＰＬＣＬＤＳＬＧＱＷＮＹＴＦＡＳＴＥＧＱＹＬＬＤＴＳＴＷＳＥＣＴＥＰＫＨＩＶＥＷＮＶＳＬＦＳ（配列番号９２）である。
[0202]以下の表５に記載されるように、ＴＭ４ＳＦ１に特異的な新規の抗体が本開示に含まれる。表５に記載される抗体は、モノクローナルマウス抗体ＡＧＸ－Ａ０３、ＡＧＸ－Ａ０４、ＡＧＸ－Ａ０５、ＡＧＸ－Ａ０７、ＡＧＸ－Ａ０８、ＡＧＸ－Ａ０９、およびＡＧＸ－Ａ１１であり、これらのそれぞれは実施例に記載されるスクリーニングで同定されたものであり、ＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２領域と結合する。さらに以下の表５に、ヒト化抗体ｈＡＧＸ－Ａ０７およびｈＡＧＸ－Ａ０１が提供される。
[0203]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８７または８８に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号７３または７４に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むＩｇＧ重鎖定常領域を含む。
[0204]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号８９に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む軽鎖定常領域を含む。
[0205]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、または７５に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、または７５に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
[0206]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号９０または９２に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号９０または９２に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む重鎖を含む。
[0207]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号１１２または１１４に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１１２または１１４に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む重鎖を含む。
[0208]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、または８１に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、または８１に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
[0209]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号９７、９９、１０１、１０３、または１０５に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号９７、９９、１０１、１０３または１０５に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号９７、９９、または１０１に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号９７、９９、または１０１に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
[0210]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号１２２に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２２に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
[0211]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６、１８、３０、４２、５４、６６、または７８に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７、１９、３１、４３、５５、６７、または７９に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８、２０、３２、４４、５６、６８、または８０に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
[0212]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、または８４に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３、２５、３７、４９、６１、７３、または８５に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１４、２６、３８、５０、６２、７４、または８６に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
[0213]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号９４または配列番号１１５に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号９５、配列番号１１６、または配列番号１１７に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号９６、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、または配列番号１２１に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
[0214]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、または配列番号１２７に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号１０９、または配列番号１２８に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号１１０、配列番号１１１、または配列番号１２９に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されており、配列番号１１０または配列番号１２９に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
[0215]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ－Ａ０３のアミノ酸配列は、表５に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号６、７、および８（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号１２、１３、および１４（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号６、７、および８のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む重鎖可変領域、および／または配列番号１２、１３、および１４のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。ＡＧＸ－Ａ０３のＣＤＲを含むヒト化抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ－Ａ０３の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および９に記載される。
[0216]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ－Ａ０４のアミノ酸配列は、表５に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号１８、１９、および２０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号２４、２５、および２６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号１８、１９、および２０のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む重鎖可変領域、および／または配列番号２４、２５、および２６のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。ＡＧＸ－Ａ０４のＣＤＲを含むヒト化抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ－Ａ０４の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５および２１に記載される。
[0217]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ－Ａ０５のアミノ酸配列は、表５に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号３０、３１、および３２（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号３６、３７、および３８（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号３０、３１、および３２のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む重鎖可変領域、および／または配列番号３６、３７、および３８のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。ＡＧＸ－Ａ０５のＣＤＲを含むヒト化抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ－Ａ０５の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７および３３に記載される。マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ－Ａ０７のアミノ酸配列は、表５に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号４２、４３、および４４（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号４８、４９、および５０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号４２、４３、および４４のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む重鎖可変領域、および／または配列番号４８、４９、および５０のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。ＡＧＸ－Ａ０７のＣＤＲを含むヒト化抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ－Ａ０７の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３９および４５に記載される。
[0218]一実施形態において、配列番号９０のアミノ酸配列に記載の重鎖配列を含むヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７（ｈＡＧＸ－Ａ０７）抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９０のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７（ｈｍＡＧＸ－Ａ０７）抗体またはその抗原結合フラグメントである。表５に示されるように、配列番号９０に記載の重鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０７Ｈ２とも称される。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９０のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントであって、１つまたは複数の置換は、配列番号９０のアミノ酸位置１、４４、および８０にある、抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｅ１Ｑ（重鎖、配列番号９０の１位におけるグルタミン酸からグルタミンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｄ４４Ｇ（重鎖、配列番号９０の４４位におけるアスパラギン酸からグリシンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆ８０Ｙ（重鎖、配列番号９０の８０位におけるフェニルアラニンからチロシンへの置換）を含む。一部の実施形態において、配列番号９２のアミノ酸配列に記載の重鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体または抗原結合フラグメントが提供される。表５に示されるように、配列番号９２に記載の重鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０７Ｈ２ｖ１とも称される。一部の実施形態において、配列番号９７のアミノ酸配列に記載の軽鎖配列を含むヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体または抗原結合フラグメントが提供される。表５に示されるように、配列番号９７に記載の軽鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５とも称される。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９７のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９７のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここで１つまたは複数の置換は、配列番号９７のアミノ酸位置３、２６、６２、および９０にある。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｉ３Ｖ（軽鎖、配列番号９７の３位におけるイソロイシンからバリンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｎ２６Ｑ（軽鎖、配列番号９７の２６位におけるアスパラギンからグルタミンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｎ２６Ｓ（軽鎖、配列番号９７の２６位におけるアスパラギンからセリンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｇ６２Ｓ（軽鎖、配列番号９７の６２位におけるグリシンからセリンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｗ９０Ｙ（軽鎖、配列番号９７の９０位におけるトリプトファンからチロシンへの置換）を含む。一部の実施形態において、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、および配列番号１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列に記載の軽鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体または抗原結合フラグメントが提供される。表５に示されるように、配列番号９９に記載の軽鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ１とも称され、配列番号１０１に記載の軽鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ２とも称され、配列番号１０３に記載の軽鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ３とも称され、配列番号１０５に記載の軽鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ４とも称される。ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖に関する例示的なコード配列は、配列番号９１で提供される。ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖に関する例示的なコード配列は、配列番号９３で提供される。ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖に関する例示的なコード配列は、配列番号９８（ＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５）で提供される。ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖に関する例示的なコード配列は、配列番号１００（ＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ１）、配列番号１０２（ＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ２）、配列番号１０４（ＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ３）、および配列番号１０６（ＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ４）で提供される。
[0219]一実施形態において、配列番号１３０または配列番号１３２のアミノ酸配列に記載の重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３０または配列番号１３２のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントである。一実施形態において、配列番号１３１または配列番号１３３のアミノ酸配列に記載の軽鎖可変ドメイン配列を含むヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３１または配列番号１３３のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖可変ドメイン配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントである。
[0220]一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３１のアミノ酸配列に記載の配列を含む軽鎖可変ドメイン配列、および配列番号１３０のアミノ酸配列に記載の配列を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３１のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖可変ドメイン配列、および配列番号１３０のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３３のアミノ酸配列に記載の配列を含む軽鎖可変ドメイン配列、および配列番号１３２のアミノ酸配列に記載の配列を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３３のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖可変ドメイン配列、および配列番号１３２のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１５６のアミノ酸配列に記載の配列を含む重鎖配列、または配列番号１５６のアミノ酸配列中に１つまたは複数の置換を含む配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントである。
[0221]一部の場合において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９４、９５、および９６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の重鎖ＣＤＲ配列、または配列番号９４、９５、および９６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９４、９５、および９６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の重鎖ＣＤＲ配列、または配列番号９４、９５、および９６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。
[0222]一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９４に記載の重鎖ＣＤＲ１配列、または配列番号９４に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖ＣＤＲ１配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９５に記載の重鎖ＣＤＲ２配列、または配列番号９５に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖ＣＤＲ２配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９６に記載の重鎖ＣＤＲ３配列、または配列番号９６に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む。
[0223]一部の場合において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０７、１０９、および１１０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の軽鎖ＣＤＲ配列、または配列番号１０７、１０９、および１１０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。一部の場合において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０７、１０９、および１１１（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の軽鎖ＣＤＲ配列、または配列番号１０７、１０９、および１１１（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。一部の場合において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０８、１０９、および１１０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の軽鎖ＣＤＲ配列、または配列番号１０８、１０９、および１１０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。一部の場合において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０８、１０９、および１１１（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の軽鎖ＣＤＲ配列、または配列番号１０８、１０９、および１１１（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。
[0224]一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０７または１０８に記載の軽鎖ＣＤＲ１配列、または配列番号１０７または１０８に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０９に記載の軽鎖ＣＤＲ２配列、または配列番号１０９に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１０または１１１に記載の軽鎖ＣＤＲ３配列、または配列番号１１０または１１１に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１０に記載の軽鎖ＣＤＲ３配列、または配列番号１１０に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。
[0225]一部の実施形態において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７は、配列番号１３２中に以下のアミノ酸置換：Ｑ１Ｅ、Ｄ４４Ｇ、Ｆ８０Ｙを含む重鎖可変領域（本明細書ではＡＧＸ－Ａ０７Ｈ２とも称される）、および配列番号１３３中に以下のアミノ酸置換：Ｉ３Ｖ、Ｎ２６Ｑ、Ｇ６２Ｓを含む軽鎖可変領域（本明細書ではＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５とも称される）を含む。一部の実施形態において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７は、配列番号１３２中に以下のアミノ酸置換：Ｑ１Ｅ、Ｄ４４Ｇ、Ｆ８０Ｙを含む重鎖可変領域、および配列番号１３３中に以下のアミノ酸置換：Ｉ３Ｖ、Ｎ２６Ｑ、Ｇ６２Ｓを含む軽鎖可変領域を含み、この重鎖は、ＣＤＲ１（配列番号９４）、ＣＤＲ２（配列番号９５）、およびＣＤＲ３（配列番号９６）を含み、この軽鎖は、ＣＤＲ１（配列番号１０８）、ＣＤＲ２（配列番号１０９）、およびＣＤＲ３（配列番号１１０）を含む。一部の実施形態において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７は、ＡＧＸ－Ａ０７Ｈ２ｖ１Ｌ５ｖ２であり、配列番号１３０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖（本明細書ではＡＧＸ－Ａ０７Ｈ２ｖ１とも称される）、および配列番号１３１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖（本明細書ではＡＧＸ－Ａ０７Ｌ５ｖ２とも称される）を含む。一部の実施形態において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０７は、配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
[0226]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ－Ａ０８のアミノ酸配列は、表５に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号５４、５５、および５６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号６０、６１、および６２（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号５４、５５、および５６のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む重鎖可変領域、および／または配列番号６０、６１、および６２のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。ＡＧＸ－Ａ０８のＣＤＲを含むヒト化抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ－Ａ０８の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５１および５７に記載される。
[0227]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ－Ａ０９のアミノ酸配列は、表５に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号６６、６７、および６８（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号７２、７３、および７４（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号６６、６７、および６８のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む重鎖可変領域、および／または配列番号７２、７３、および７４のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。ＡＧＸ－Ａ０９のＣＤＲを含むヒト化抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ－Ａ０９の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６３および６９に記載される。
[0228]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ－Ａ１１のアミノ酸配列は、表５に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号７８、７９、および８０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号８４、８５、および８６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号７８、７９、および８０のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む重鎖可変領域、および／または配列番号８４、８５、および８６２のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。ＡＧＸ－Ａ１１のＣＤＲを含むヒト化抗体または抗原結合フラグメントが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ－Ａ１１の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７５および８１に記載される。
[0229]ヒト化抗体ＡＧＸ－Ａ０１（ｈＡＧＸ－Ａ０１）のアミノ酸配列は、表５に記載される。表５に示されるように、配列番号１１２に記載の重鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０１Ｈ１とも称される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号１１５、１１６、および１１８（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号１２４、１２８、および１２９（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。さらに、例示的なヒト化されたＡＧＸ－Ａ０１の重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１２および１２２に記載される。ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０１の重鎖および軽鎖の例示的なコード配列は、それぞれ配列番号１１３および１２３に記載される。
[0230]一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１２のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１（ｈｍＡＧＸ－Ａ０１）抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１２のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、１つまたは複数の置換は、配列番号１１２のアミノ酸位置６３および１０６にある。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｇ６３Ｓ（重鎖、配列番号１１２の６３位におけるグリシンからセリンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｄ１０６Ｅ（重鎖、配列番号１１２の１０６位におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｄ１０６Ｓ（重鎖、配列番号１１２の１０６位におけるアスパラギン酸からセリンへの置換）を含む。一部の実施形態において、配列番号１１４のアミノ酸配列に記載の重鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体または抗原結合フラグメントが提供される。表５に示されるように、配列番号１１４に記載の重鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０１Ｈ１ｖ１とも称される。
[0231]一部の実施形態において、配列番号１２２のアミノ酸配列に記載の軽鎖配列を含むヒト化されたＡＧＸ－Ａ０１抗体または抗原結合フラグメントが提供される。表５に示されるように、配列番号１２２に記載の軽鎖配列はまた、本明細書でＡＧＸ－Ａ０１Ｌ１０とも称される。一部の実施形態において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２２のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２２のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、１つまたは複数の置換は、配列番号１２２のアミノ酸位置１、３３、４２、５１、８６、および９０から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置にある。一部の実施形態において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２２のアミノ酸配列に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖配列を含むヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、１つまたは複数の置換は、配列番号１２２のアミノ酸位置１、３３、４２、５１、および８６から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置にある。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａ１Ｅ（軽鎖、配列番号１２２の１位におけるアラニンからグルタミン酸への置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｎ３３Ｓ（軽鎖、配列番号１２２の３３位におけるアスパラギンからセリンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｍ４２Ｑ（軽鎖、配列番号１２２の４２位におけるメチオニンからグルタミンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｖ５１Ｌ（軽鎖、配列番号１２２の５１位におけるバリンからロイシンへの置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｄ８６Ｅ（軽鎖、配列番号１２２の８６位におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換）を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｉ９０Ｖ（軽鎖、配列番号１２２の９０位におけるイソロイシンからバリンへの置換）を含む。
[0232]一部の場合において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１５（ＣＤＲ１）；１１６（ＣＤＲ２）；および１１８（ＣＤＲ３）に記載の重鎖ＣＤＲ配列、または配列番号１１５（ＣＤＲ１）；１１６（ＣＤＲ２）；および１１８（ＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１５（ＣＤＲ１）；１１６または１１７（ＣＤＲ２）；および１１８、１１９、１２０、または１２１（ＣＤＲ３）に記載の重鎖ＣＤＲ配列、または配列番号１１５（ＣＤＲ１）；１１６または１１７（ＣＤＲ２）；および１１８、１１９、１２０、または１２１（ＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。
[0233]一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１５に記載の重鎖ＣＤＲ１配列、または配列番号１１５に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖ＣＤＲ１配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１６に記載の重鎖ＣＤＲ２配列、または配列番号１１６に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖ＣＤＲ２配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１７に記載の重鎖ＣＤＲ２配列、または配列番号１１７に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖ＣＤＲ２配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１８、１１９、１２０および１２１から選択される配列に記載の重鎖ＣＤＲ３配列、または配列番号１１８、１１９、１２０、および１２１から選択される配列中に１つまたは複数の置換を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む。
[0234]一部の場合において、ヒト化されたＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２４（ＣＤＲ１）；１２８（ＣＤＲ２）；および１２９（ＣＤＲ３）に記載の軽鎖ＣＤＲ配列、または配列番号１２４（ＣＤＲ１）；１２８（ＣＤＲ２）；および１２９（ＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２４、１２５、１２６、もしくは１２７（ＣＤＲ１）；１２８（ＣＤＲ２）；および１２９（ＣＤＲ３）に記載の軽鎖ＣＤＲ配列、または配列番号１２４、１２５、１２６、もしくは１２７（ＣＤＲ１）；１２８（ＣＤＲ２）；および１２９（ＣＤＲ３）に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含むＣＤＲ配列を含む。
[0235]一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２５、１２６、１２７、もしくは１２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１配列、または配列番号１２５、１２６、１２７、もしくは１２８に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２配列、または配列番号１２９に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。一部の場合において、ヒト化突然変異ＡＧＸ－Ａ０１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３配列、または配列番号１３０に記載の配列中に１つまたは複数の置換を含む軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。
[0236]一実施形態において、本開示は、配列番号３に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号９に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１５に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号２１に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号２７に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号３３に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号３９に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号４５に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号５１に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号５７に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号６３に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号６９に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号７５に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号８１に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９０に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号９７に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９０に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号９９に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９０に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号１０１に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９０に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号１０３に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９０に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号１０５に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９２に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号９７に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９２に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号９９に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９２に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号１０１に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９２に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号１０３に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９２に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号１０５に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
[0237]一実施形態において、本発明の開示は、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、配列番号７５、配列番号９０、配列番号９２、配列番号１１２、または配列番号１１４から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％同一の、少なくとも９７％同一の、少なくとも９８％同一の、少なくとも９９％同一の、または１００％同一の重鎖可変ドメイン配列を有し；配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１２２から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％同一の、少なくとも９７％同一の、少なくとも９８％同一の、少なくとも９９％同一の、または１００％同一の軽鎖可変ドメイン配列を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本発明の開示は、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、配列番号７５、配列番号９０、配列番号９２、配列番号１１２、または配列番号１１４から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％同一の、少なくとも９７％同一の、少なくとも９８％同一の、少なくとも９９％同一の、または１００％同一の重鎖可変ドメイン配列を有し；配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１２２から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％同一の、少なくとも９７％同一の、少なくとも９８％同一の、少なくとも９９％同一の、または１００％同一の軽鎖可変ドメイン配列を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本発明の開示は、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、配列番号７５、配列番号９０、配列番号９２、配列番号１１２、または配列番号１１４から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％同一の、少なくとも９７％同一の、少なくとも９８％同一の、少なくとも９９％同一の、または１００％同一の重鎖可変ドメイン配列を有し；配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、または配列番号１２２から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％同一の、少なくとも９７％同一の、少なくとも９８％同一の、少なくとも９９％同一の、または１００％同一の軽鎖可変ドメイン配列を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
[0238]一実施形態において、本開示は、ＩｇＧであり、それぞれ重鎖可変ドメインならびに重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む２つの重鎖と、それぞれ軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む２つの軽鎖とを包含する４つのポリペプチド鎖を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含む。特定の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４である。特定の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１である。他の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２である。重鎖および軽鎖可変ドメイン配列は、表５に記載のＣＤＲを含有していてもよい。
[0239]相補性決定領域（ＣＤＲ）は、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において高度可変領域として公知である。それより高度に保存された可変ドメインの部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。所与の抗体のＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔら、上記；Ｌｅｆｒａｎｃら、上記および／またはＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、上記により説明されたシステムを使用して同定することができる。また、Ｋａｂａｔら（１９９１、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１～３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｖａ．）に記載される番号付けシステムも当業者によく知られている。これに関して、Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能なＣＤＲの同定を含む可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。
[0240]１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合または非共有結合のいずれかで分子に取り込むことで、それを抗原結合タンパク質にすることもできる。
[0241]抗原結合タンパク質は、ＣＤＲをより大きいポリペプチド鎖の一部として取り込んでいてもよいし、共有結合でＣＤＲが別のポリペプチド鎖に連結されていてもよいし、または非共有結合でＣＤＲを取り込んでいてもよい。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的の特定の抗原に特異的に結合することを許容する。特にＣＤＲ３は、抗体または抗体フラグメントの抗原結合において重要な役割を果たすことがわかっている。
[0242]一実施形態において、本開示は、配列番号８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号４４、配列番号５６、配列番号６８、または配列番号８０のいずれか１つに記載のＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含み、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、または配列番号７５のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１４、配列番号２６、配列番号３８、配列番号５０、配列番号６２、配列番号７４、または配列番号８６のいずれか１つに記載のＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖を含み、配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、または配列番号８１のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。したがって、特定の実施形態において、ＣＤＲ３ドメインは一定に保ちつつ、重鎖および／または軽鎖の残存するＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域に可変性が導入されてもよく、一方で抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１に結合する能力を保持し、親の機能的特徴、例えば結合親和性を保持するか、または親と比較して改善された機能的特徴、例えば結合親和性を有する。
[0243]一実施形態において、本開示は、配列番号７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４３、配列番号５５、配列番号６７、または配列番号７９のいずれか１つに記載のＣＤＲ２ドメインを含む重鎖を含み、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、または配列番号７５のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１３、配列番号２５、配列番号３７、配列番号４９、配列番号６１、配列番号７３、または配列番号８５のいずれか１つに記載のＣＤＲ２ドメインを含む軽鎖を含み、配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、または配列番号８１のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。したがって、特定の実施形態において、ＣＤＲ２ドメインは一定に保ちつつ、重鎖および／または軽鎖の残存するＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域に可変性が導入されてもよく、一方で抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１に結合する能力を保持し、親の機能的特徴、例えば結合親和性を保持するか、または親と比較して改善された機能的特徴、例えば結合親和性を有する。
[0244]一実施形態において、本開示は、配列番号６、配列番号１８、配列番号３０、配列番号４２、配列番号５４、配列番号６６、または配列番号７８のいずれか１つに記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖を含み、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号４５、配列番号６９、または配列番号８１のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１２、配列番号２４、配列番号３６、配列番号４８、配列番号６０、配列番号７２、または配列番号８４のいずれか１つに記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖を含み、配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、または配列番号８１のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。したがって、特定の実施形態において、ＣＤＲ１ドメインは一定に保ちつつ、重鎖および／または軽鎖の残存するＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域に可変性が導入されてもよく、一方で抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１に結合する能力を保持し、親の機能的特徴、例えば結合親和性を保持する。
[0245]一部の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖を含み、Ｆｃ領域は、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３からなる群から選択される配列を含み、またはＦｃ領域は、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３からなる群から選択される配列中に１つまたは複数の置換を含む配列を含む。例えば、一部の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体はＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域は、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３からなる群から選択される配列に、少なくとも約７０％から約１００％、例えば少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含む。
[0246]一部の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５４、配列番号１５５、および配列番号１５６からなる群から選択される配列を含む重鎖を含み、重鎖は、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５４、配列番号１５５、および配列番号１５６からなる群から選択される配列中に１つまたは複数の置換を含む配列を含む。例えば、一部の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５４、配列番号１５５、および配列番号１５６からなる群から選択される配列に、少なくとも約７０％から約１００％、例えば少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含む重鎖を含む。
[0247]また表５に記載される抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびフラグメントは、ヒト化されていてもよい。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当技術分野において公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト源からそれに導入される１つまたは複数のアミノ酸残基を有していてもよい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と称されることが多く、これは、典型的には「インポート」可変ドメインから得られる。ヒト化は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２～２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～２７；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４～３６の方法に従って、高度可変領域配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって実行することができる。
[0248]一部の場合において、ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティングによって構築され、この場合、親非ヒト抗体（例えば、げっ歯類）の６つのＣＤＲのアミノ酸配列が、ヒト抗体フレームワーク上にグラフト化される。例えば、Ｐａｄｌａｎらは、ＣＤＲ中の残基の約３分の１のみが実際に抗原と接触することを決定し、これらを「特異性決定残基」、またはＳＤＲと名付けた（Ｐａｄｌａｎら、１９９５、ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３～３９）。ＳＤＲグラフティングの技術において、ＳＤＲ残基のみが、ヒト抗体フレームワーク上にグラフト化される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５～３４を参照）。
[0249]ヒト化抗体の作製において使用される、ヒト可変ドメイン、軽鎖および重鎖の両方の選択は、抗原性を低減するのに重要であり得る。例えば、いわゆる「ベストフィット」方法に従って、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして選択され得る（Ｓｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６～３０８；およびＣｈｏｔｈｉａら、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～１７）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に使用される可能性がある（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５～８９；およびＰｒｅｓｔａら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３～３２）。一部の場合において、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスであるＶＬ６サブグループＩ（ＶＬ６Ｉ）およびＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のコンセンサス配列由来である。別の方法において、ヒト生殖細胞系遺伝子は、フレームワーク領域の源として使用される。
[0250]さらに、一般的に、抗体が、その抗原に対する親和性や他の好都合な生物学的特性を保持しながらヒト化されることが望ましい。この目標を達成するために、１つの方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化された配列の３次元モデルを使用した親配列および様々な概念のヒト化生成物の分析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性がある３次元立体配座構造を例示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。そのようなものとしては、例えば、ＷＡＭ（ＷｈｉｔｅｌｅｇｇおよびＲｅｅｓ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：８１９～２４）、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（ＳａｌｉおよびＢｌｕｎｄｅｌｌ、１９９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：７７９～８１５）、およびＳｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ（ＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ、１９９７、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４～２３）が挙げられる。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の可能性がある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を許容する。この方法では、ＦＲ残基は、所望の抗体の特徴、例えば標的抗原への親和性の増加が達成されるように、レシピエントおよびインポート配列から選択し組み合わせることができる。一般的に、高度可変領域残基は、直接的に、ほぼ実質的に、抗原結合への影響に関与する。
[0251]ヒト化に使用可能なヒトフレームワーク領域としては、これらに限定されないが、「ベストフィット」方法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１９９３）２２９６を参照）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９（１９９２）４２８５；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１（１９９３）２６２３を参照）；ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ、およびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９～１６３３を参照）；およびＦＲライブラリーをスクリーニングすることによって得られたフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）１０６７８～１０６８４およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６）２２６１１～２２６１８を参照）が挙げられる。
[0252]ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ、およびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９～１６３３で総論され、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３～３２９；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）１００２９～１００３３；米国特許第５，８２１，３３７号、７，５２７，７９１号、６，９８２，３２１号、および７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）２５～３４（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングを説明する）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１９９１）４８９～４９８（「リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を説明する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）４３～６０（「ＦＲシャッフリング」を説明する）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）６１～６８およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３（２０００）２５２～２６０（ＦＲシャッフリングへの「ガイド選択」アプローチを説明する）で説明される。
[0253]一実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１×１０－６Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＴＭ４ＳＦ１に結合する。
[0254]特定の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定した場合、約５×１０－８Ｍ以下のＫＤで、ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループ上のエピトープに結合する。
[0255]特定の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約１×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。
[0256]特定の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１×１０－３Ｍから約１×１０－４Ｍ、約１ｘ１０－４Ｍから約１ｘ１０－５Ｍ、約１ｘ１０－５Ｍから約１ｘ１０－６Ｍ、約１ｘ１０－６から約１ｘ１０－７Ｍ、約１ｘ１０－７から約１ｘ１０－８Ｍ、約１ｘ１０－８Ｍから約１ｘ１０－９Ｍ、約１ｘ１０－９Ｍから約１ｘ１０－１０Ｍ、約１ｘ１０－１０Ｍから約１ｘ１０－１１Ｍ、約１ｘ１０－１１Ｍから約１ｘ１０－１２Ｍ、約２ｘ１０－３Ｍから約２ｘ１０－４Ｍ、約２ｘ１０－４Ｍから約２ｘ１０－５Ｍ、約２ｘ１０－５Ｍから約２ｘ１０－６Ｍ、約２ｘ１０－６から約２ｘ１０－７Ｍ、約２ｘ１０－７から約２ｘ１０－８Ｍ、約２ｘ１０－８Ｍから約２ｘ１０－９Ｍ、約２ｘ１０－９Ｍから約２ｘ１０－１０Ｍ、約２ｘ１０－１０Ｍから約２ｘ１０－１１Ｍ、約２ｘ１０－１１Ｍから約２ｘ１０－１２Ｍ、約３ｘ１０－３Ｍから約３ｘ１０－４Ｍ、約３ｘ１０－４Ｍから約３ｘ１０－５Ｍ、約３ｘ１０－５Ｍから約３ｘ１０－６Ｍ、約３ｘ１０－６から約３ｘ１０－７Ｍ、約３ｘ１０－７から約３ｘ１０－８Ｍ、約３ｘ１０－８Ｍから約３ｘ１０－９Ｍ、約３ｘ１０－９Ｍから約３ｘ１０－１０Ｍ、約３ｘ１０－１０Ｍから約３ｘ１０－１１Ｍ、約３ｘ１０－１１Ｍから約３ｘ１０－１２Ｍ、約４ｘ１０－３Ｍから約４ｘ１０－４Ｍ、約４ｘ１０－４Ｍから約４ｘ１０－５Ｍ、約４ｘ１０－５Ｍから約４ｘ１０－６Ｍ、約４ｘ１０－６から約４ｘ１０－７Ｍ、約４ｘ１０－７から約４ｘ１０－８Ｍ、約４ｘ１０－８Ｍから約４ｘ１０－９Ｍ、約４ｘ１０－９Ｍから約４ｘ１０－１０Ｍ、約４ｘ１０－１０Ｍから約４ｘ１０－１１Ｍ、約４ｘ１０－１１Ｍから約４ｘ１０－１２Ｍ、約５ｘ１０－３Ｍから約５ｘ１０－４Ｍ、約５ｘ１０－４Ｍから約５ｘ１０－５Ｍ、約５ｘ１０－５Ｍから約５ｘ１０－６Ｍ、約５ｘ１０－６から約５ｘ１０－７Ｍ、約５ｘ１０－７から約５ｘ１０－８Ｍ、約５ｘ１０－８Ｍから約５ｘ１０－９Ｍ、約５ｘ１０－９Ｍから約５ｘ１０－１０Ｍ、約５ｘ１０－１０Ｍから約５ｘ１０－１１Ｍ、約５ｘ１０－１１Ｍから約５ｘ１０－１２Ｍ、約５ｘ１０－７Ｍから約５ｘ１０－１１Ｍ、約５×１０－７Ｍ、約１×１０－７Ｍ、約５×１０－８Ｍ、約１×１０－８Ｍ、約５×１０－９Ｍ、約１×１０－９Ｍ、約５×１０－１０Ｍ、約１×１０－１０Ｍ、約５×１０－１１Ｍまたは約１×１０－１１ＭのＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。一部の実施形態において、ＫＤは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定される。
[0257]特定の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約５×１０－１０Ｍ以下のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。
[0258]特定の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＥＫ２９３過剰発現細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約１×１０－６Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＴＭ４ＳＦ１に結合する。一実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、カニクイザルＴＭ４ＳＦ１を発現するようにトランスフェクトされている。さらなる実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、１０６コピーの１８Ｓ ｒＲＮＡ当たり約６００のｍＲＮＡコピーで、カニクイザルＴＭ４ＳＦ１を発現する。
[0259]抗体または抗体フラグメントのＫＤを決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、表面プラズモン共鳴は、抗原に対する抗体のＫＤを決定するのに使用することができる（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を、約１０反応単位（ＲＵ）での固定化した抗原またはＦｃ受容体ＣＭ５チップと共に、２５℃で使用して）。特定の実施形態において、ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーは、ＫＤを決定するのに使用され、ＴＭ４ＳＦ１を発現する細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＨＵＶＥＣ細胞は、抗体またはフラグメントに結合させて、標準的な方法に従ってＫＤを測定するのに使用される。フローサイトメトリーを使用する抗体の親和性決定は、例えば、Ｇｅｕｉｊｅｎら（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０２（１～２）：６８～７７に記載される。特定の実施形態において、ＦＡＣＳは、抗体の親和性を決定するのに使用される。
[0260]一実施形態において、本開示は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、表５に記載のＣＤＲアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％同一の（または少なくとも９６％同一の、または少なくとも９７％同一の、または少なくとも９８％同一の、または少なくとも９９％同一の）ＣＤＲのアミノ酸配列を含むように、本明細書に記載される保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換される置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないものである。２つまたはそれより多くのアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質のために補正されるように上方調整される場合がある。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１を参照されたい。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；（３）アミドを含有する側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄を含有する側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。
[0261]本開示はさらに、一態様において、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定した場合、約５×１０－８Ｍ以下のＫＤで、ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループ上のエピトープに結合する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とし、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域を含み、ヒトＩｇＧフレームワーク領域を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、カニクイザルＴＭ４ＳＦ１と交差反応する。
[0262]本開示の別の態様において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定した場合、約５×１０－８Ｍ以下のＫＤで、ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループ上のエピトープに結合する、ヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＥＫ２９３過剰発現細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約１×１０－６Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＴＭ４ＳＦ１に結合する。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約１×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、１ｘ１０－３Ｍから約１ｘ１０－４Ｍ、約１ｘ１０－４Ｍから約１ｘ１０－５Ｍ、約１ｘ１０－５Ｍから約１ｘ１０－６Ｍ、約１ｘ１０－６から約１ｘ１０－７Ｍ、約１ｘ１０－７から約１ｘ１０－８Ｍ、約１ｘ１０－８Ｍから約１ｘ１０－９Ｍ、約１ｘ１０－９Ｍから約１ｘ１０－１０Ｍ、約１ｘ１０－１０Ｍから約１ｘ１０－１１Ｍ、約１ｘ１０－１１Ｍから約１ｘ１０－１２Ｍ、約２ｘ１０－３Ｍから約２ｘ１０－４Ｍ、約２ｘ１０－４Ｍから約２ｘ１０－５Ｍ、約２ｘ１０－５Ｍから約２ｘ１０－６Ｍ、約２ｘ１０－６から約２ｘ１０－７Ｍ、約２ｘ１０－７から約２ｘ１０－８Ｍ、約２ｘ１０－８Ｍから約２ｘ１０－９Ｍ、約２ｘ１０－９Ｍから約２ｘ１０－１０Ｍ、約２ｘ１０－１０Ｍから約２ｘ１０－１１Ｍ、約２ｘ１０－１１Ｍから約２ｘ１０－１２Ｍ、約３ｘ１０－３Ｍから約３ｘ１０－４Ｍ、約３ｘ１０－４Ｍから約３ｘ１０－５Ｍ、約３ｘ１０－５Ｍから約３ｘ１０－６Ｍ、約３ｘ１０－６から約３ｘ１０－７Ｍ、約３ｘ１０－７から約３ｘ１０－８Ｍ、約３ｘ１０－８Ｍから約３ｘ１０－９Ｍ、約３ｘ１０－９Ｍから約３ｘ１０－１０Ｍ、約３ｘ１０－１０Ｍから約３ｘ１０－１１Ｍ、約３ｘ１０－１１Ｍから約３ｘ１０－１２Ｍ、約４ｘ１０－３Ｍから約４ｘ１０－４Ｍ、約４ｘ１０－４Ｍから約４ｘ１０－５Ｍ、約４ｘ１０－５Ｍから約４ｘ１０－６Ｍ、約４ｘ１０－６から約４ｘ１０－７Ｍ、約４ｘ１０－７から約４ｘ１０－８Ｍ、約４ｘ１０－８Ｍから約４ｘ１０－９Ｍ、約４ｘ１０－９Ｍから約４ｘ１０－１０Ｍ、約４ｘ１０－１０Ｍから約４ｘ１０－１１Ｍ、約４ｘ１０－１１Ｍから約４ｘ１０－１２Ｍ、約５ｘ１０－３Ｍから約５ｘ１０－４Ｍ、約５ｘ１０－４Ｍから約５ｘ１０－５Ｍ、約５ｘ１０－５Ｍから約５ｘ１０－６Ｍ、約５ｘ１０－６から約５ｘ１０－７Ｍ、約５ｘ１０－７から約５ｘ１０－８Ｍ、約５ｘ１０－８Ｍから約５ｘ１０－９Ｍ、約５ｘ１０－９Ｍから約５ｘ１０－１０Ｍ、約５ｘ１０－１０Ｍから約５ｘ１０－１１Ｍ、約５ｘ１０－１１Ｍから約５ｘ１０－１２Ｍ、約５ｘ１０－７Ｍから約５ｘ１０－１１Ｍ、約５×１０－７Ｍ、約１×１０－７Ｍ、約５×１０－８Ｍ、約１×１０－８Ｍ、約５×１０－９Ｍ、約１×１０－９Ｍ、約５×１０－１０Ｍ、約１×１０－１０Ｍ、約５×１０－１１Ｍまたは約１×１０－１１ＭのＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。一部の実施形態において、ＫＤは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定される。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１を発現するＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約５×１０－１０Ｍ以下のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。
[0263]一実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントのヒトＴＭ４ＳＦ１への結合は、ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループのグリコシル化に依存的でなく、すなわち、抗体の結合は、ＥＣＬ２ループ（配列番号７７）内のＴＭ４ＳＦ１のグリコシル化から独立している。
[0264]本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、いずれかのアイソタイプ（例えば、これらに限定されないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）のいずれかであり得る。特定の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプである。具体的な実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプ由来である。特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４アイソタイプである。
[0265]ＩｇＧ２は、天然において、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が最も低い（Ａｎら、ＭＡｂｓ．２００９年１１月～１２月；１（６）：５７２～５７９）。したがって、特定の実施形態において、ＩｇＧ２は、有利に使用される。しかしながら、ＩｇＧ２は、２つの余分なシステイン（４つのヒンジ間ジスルフィド結合を生じる）を有し、それにより抗体間ジスルフィド結合の形成を介した凝集が起こりやすくなる。関連する実施形態において、凝集を減少させるために、ＩｇＧ２システインへの突然変異が作製される。
[0266]本発明の開示は、ＴＭ４ＳＦ１に結合する抗体フラグメントを提供する。特定の環境において、全抗体よりも抗体フラグメントを使用するほうが利点がある。フラグメントのサイズが小さいほど迅速なクリアランスが可能になり、それにより細胞、組織、または臓器への改善された接近をもたらすことができる。特定の抗体フラグメントの総論に関して、Ｈｕｄｓｏｎら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１２９～３４を参照されたい。
[0267]抗体フラグメントを産生するための様々な技術が開発されてきた。従来、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク質分解消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７～１７；およびＢｒｅｎｎａｎら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１～８３を参照）。しかしながら、現在これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ抗体フラグメントは全て、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母細胞で発現および分泌させることができ、したがって大量のこれらのフラグメントの容易な産生が可能である。抗体フラグメントは、上記で論じられた抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替として、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３～６７）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボでの半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体フラグメントを産生するための他の技術は、熟練した専門家には明らかであると予想される。特定の実施形態において、抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である（例えば、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号を参照）。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を欠く無傷の結合部位を有する。したがってそれらは、インビボでの使用中における非特異的な結合の低減に適している可能性がある。ｓｃＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにおけるエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、上記を参照）。抗体フラグメントはまた、「線状抗体」であってもよく、例えば、上記で引用された参考文献に記載されたものである。このような線状抗体は、単一特異性または多重特異性、例えば二重特異性であってもよい。
[0268]特定の実施形態において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される。
[0269]例えばヒトＴＭ４ＳＦ１に高親和性を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体（およびフラグメント）は、当技術分野において公知のスクリーニング技術を使用して同定することができる。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５～９７により最初に説明されたハイブリドーマ方法を使用して作製してもよいし、または組換えＤＮＡ方法によって作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。
[0270]ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターは、例えばヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループまたはＴＭ４ＳＦ１を発現する細胞を使用することにより免疫化されて（それによってＥＣＬ２ループが細胞表面上に発現される）、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合すると予想される抗体を産生するかまたは産生することが可能なリンパ球を惹起する。代替として、リンパ球は、インビトロで免疫化されてもよい。免疫化後、リンパ球を単離し、次いで好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを使用して骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ５９～１０３（１９８６））。
[0271]このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好適な培養培地中にシーディングされ、増殖させ、このような培養培地は、特定の実施形態において、融合していない親の骨髄腫細胞（融合パートナーとも称される）の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を喪失している場合、ハイブリドーマに選択的な培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むと予想され（ＨＡＴ培地）、これは、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止するものである。
[0272]例示的な融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定して高レベルの抗体産生を維持し、融合していない親細胞を選択する選択的な培地に感受性を有するものである。例示的な骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばＳＰ－２および誘導体、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）より入手可能なＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞、ならびにＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）より入手可能なＭＯＰＣ－２１およびＭＰＣ－１１マウス腫瘍由来のものである。またヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１～０５；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ５１～６３（１９８７））。
[0273]ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロでの結合アッセイ、例えばＲＩＡもしくはＥＬＩＳＡによって決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、１９８０、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０～３９に記載されるスキャッチャード分析によって決定することができる。
[0274]所望の特異性、親和性、および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させる（Ｇｏｄｉｎｇ、上記）。この目的のために好適な培養培地としては、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍として、例えばマウスへの細胞のｉ．ｐ．注射によって、インビボで増殖させることができる。
[0275]サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、好適には、培養培地、腹水、または血清から、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ－セファロースを使用するもの）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などの従来の抗体精製手順によって分離される。
[0276]モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離およびシーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの源として役立つ可能性がある。ＤＮＡは、単離されたら、発現ベクターに入れてもよく、次いで発現ベクターは、トランスフェクトされなければ抗体タンパク質を産生しない宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が達成される。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総論としては、Ｓｋｅｒｒａら、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６～６２およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１～８８が挙げられる。
[0277]さらなる実施形態において、モノクローナル抗体または抗体フラグメントは、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＡｉｔｋｅｎ編、２００２）に記載される技術を使用して生成した抗体ファージライブラリーから単離することができる。原則的に、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々なフラグメントを提示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対してスクリーニングされる。所望の抗原に結合することが可能なＦｖフラグメントを発現するクローンは抗原に吸着されるため、ライブラリー中の非結合クローンから分離される。次いで結合クローンは抗原から溶出され、さらに、抗原吸着／溶出の追加のサイクルによって濃縮することができる。
[0278]可変ドメインは、例えばＷｉｎｔｅｒら、１９９４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３～５５に記載されるように、ＶＨとＶＬとが短いフレキシブルなペプチドを介して共有結合で連結されている単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして、またはそれぞれ定常ドメインに融合しており、非共有結合によって相互作用するＦａｂフラグメントとしてのいずれかで、ファージ上に機能的に提示させることが可能である。
[0279]ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ＰＣＲによって別々にクローニングし、ファージライブラリー中でランダムに組み換えることができ、これは次いで、Ｗｉｎｔｅｒら、上記に記載されるように、抗原結合クローンに関して検索することができる。免疫化源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを必要とせずに、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。代替として、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５～３４で記載されるように、ナイーブレパートリーをクローニングして、免疫化をまったく行わなくても、多様な非自己に対する、さらには自己抗原にも対するヒト抗体の単一の源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１～８８によって記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ－遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することによって、合成的に作製することもできる。
[0280]ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野において公知の様々な技術によって達成することができる。例えば、ＴＭ４ＳＦ１（例えば、ＥＣＬ２ループまたはループを発現する細胞の可溶性形態）を使用して、吸着プレートのウェルをコーティングする、吸着プレートに付着させた宿主細胞上で発現させる、またはセルソーティングで使用する、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを捕獲するためにビオチンにコンジュゲートする、またはディスプレイライブラリーをパニングするための他のあらゆる方法で使用することができる。遅い解離速度論（例えば、優れた結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓら、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８：３０９～１４およびＷＯ９２／０９６９０に記載されるように、長い洗浄および１価ファージディスプレイの使用によって、さらに、Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９～８３に記載されるように抗原の低いコーティング密度の使用によって向上させることができる。
[0281]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、目的のファージクローンを選択するのに好適な抗原スクリーニング手順を設計し、それに続き、目的のファージクローンからの、ＶＨおよび／もしくはＶＬ配列（例えば、Ｆｖ配列）、またはＶＨおよびＶＬ配列からの様々なＣＤＲ配列、ならびにＫａｂａｔら、上記に記載される好適な定常領域（例えば、Ｆｃ）配列を使用して全長抗ＴＭ４ＳＦ１抗体クローンを構築することにより得ることができる。
[0282]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体のスクリーニングは、抗体がＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループに治療的な親和性を有するかどうかを決定するために、当技術分野において公知の、および本明細書に記載される結合アッセイを使用して実行することができる。転移性の細胞活性を阻害したりまたは減少させたりする抗体の能力は、当技術分野における標準的なアッセイや、本明細書に記載される標準的なアッセイを使用して測定することができる。前臨床アッセイは、一般的に以下の３つのタイプのうち１つの転移の動物モデルの使用を必要とする：（ｉ）転移性マウス腫瘍細胞、例えばＢ１６Ｆ１０黒色腫ＴＣを、一般的に、肺転移を生成するために尾静脈注射を介して、肝臓転移を生成するために門脈または脾臓内注射を介して、または骨および他の転移を生成するために心臓の左心室への注射を介してマウスに注射すること；（ｉｉ）転移性腫瘍細胞または無傷の腫瘍フラグメントを、マウスに同所移植することであり、この方法はしばしば、原発性腫瘍増殖に関連する罹患率を抑えるために後の原発性腫瘍の外科的切除を必要とするもの；および（ｉｉｉ）遺伝子操作された自然転移のマウスモデルであり、そのうち最も一般的なものは、ＭＭＴＶ－Ｐｙｔ（マウス乳がんウイルス－ポリオーマウイルス中型Ｔ抗原）マウス乳癌モデルであり、これは、ヒトがん転移の極めてリアルなマウスモデルを提供し、半接合ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ雌の８５％より多くが、８～１６週齢で肺に転移する触診可能な乳がんを自然に発症するもの。生きた動物を画像化するか、またはＴＭ４ＳＦ１免疫遮断（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｃｋａｄｅ）の程度の関数として致死させた動物の肺における転移性小結節を直接計数するかのいずれかによって肺における転移性の負荷量を定量化して、治療的なレベル、例えば肺転移の少なくとも５０％の低減が達成されることが、治療抗体が例えば本開示の方法で使用できることの指標となると予想される。さらに、異種間反応性アッセイは、当技術分野において公知である。使用できるアッセイの例は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＫｈａｎｎａおよびＨｕｎｔｅｒ（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００５年３月；２６（３）：５１３～２３）ならびにＳａｘｅｎａおよびＣｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ（Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１３年４月；７（２）：２８３～９６）に記載される。
[0283]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、例えばがんを処置または予防するために使用され得る。特定の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体および抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞の転移を予防するのに使用することができる。本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、一部の例において、腫瘍細胞と血管内皮細胞との相互作用を妨害することによって腫瘍細胞の転移を予防する。
６．４ メイタンシン
[0284]メイタンシノイドはメイタンシンの誘導体であり、チューブリン重合を阻害することによって作用する、細胞分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの低木メイテナス・セラタから初めて単離された（例えば、米国特許第３８９６１１１号を参照）。ある特定の微生物が、メイタンシノイド、例えばメイタンシノールおよびＣ－３メイタンシノールエステルを産生し得ることも発見された（例えば、米国特許第４１５１０４２号を参照）。合成メイタンシノイドは、例えば、米国特許第４１３７２３０号；同第４２４８８７０号；同第４２５６７４６号；同第４２６０６０８号；同第４２６５８１４号；同第４２９４７５７号；同第４３０７０１６号；同第４３０８２６８号；同第４３０８２６９号；同第４３０９４２８号；同第４３１３９４６号；同第４３１５９２９号；同第４３１７８２１号；同第４３２２３４８号；同第４３３１５９８号；同第４３６１６５０号；同第４３６４８６６号；同第４４２４２１９号；同第４４５０２５４号；同第４３６２６６３号；および同第４３７１５３３号に開示され、そのそれぞれはその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
[0285]メイタンシノイドは、それらが：（ｉ）発酵もしくは化学改変または発酵産物の誘導体化による調製に比較的利用しやすい、（ｉｉ）抗体への非ジスルフィドリンカーによるコンジュゲーションに好適な官能基による誘導体化に適している、（ｉｉｉ）血漿中で安定である、および（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体－薬物コンジュゲートの魅力的な薬物である。
[0286]特定のメイタンシノイドは、公知の方法によって天然原料から単離され得るか、または遺伝子工学技術を使用して産生され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕら（２００２）ＰＮＡＳ ９９：７９６８－７９７３を参照）。メイタンシノイドは、公知の方法により合成によっても調製され得る。
[0287]メイタンシノイドの例は、限定はされないが、改変された芳香族環を有するもの、例えば：Ｃ－１９デクロロ（米国特許第４２５６７４６号）（例えば、アンサミトシン（ansamytocin）Ｐ２の水素化アルミニウムリチウム還元によって調製される)；Ｃ－２０－ヒドロキシ（またはＣ－２０－デメチル）＋／－Ｃ－１９デクロロ（米国特許第４３６１６５０号および同第４３０７０１６号）（例えば、スプレプトミセス属（Streptomyces）またはアクチノミセス属（Actinomyces）を使用して脱メチル化によって、またはＬＡＨを使用して脱塩素によって調製される）；およびＣ－２０－デメトキシ、Ｃ－２０－アシルオキシ（－ＯＣＯＲ）、＋／－デクロロ（米国特許第４２９４７５７号）（例えば、塩化アシルを利用してアシル化によって調製される）、ならびに芳香族環のその他の位置に改変を有するものを含む。この段落で引用した各特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0288]メイタンシノイドの例は、改変、例えば：Ｃ－９－ＳＨ（米国特許第４４２４２１９号）（例えば、メイタンシノールのＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって調製される）；Ｃ－１４－アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号）；Ｃ－１４－ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル(ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ)（米国特許第４４５０２５４号）（例えば、ノカルジア属（Nocardia）から調製される)；Ｃ－１５－ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４３６４８６６号）（例えば、ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製される）；Ｃ－１５－メトキシ（米国特許第４３１３９４６号および同第４３１５９２９号）（例えば、トレウィア・ヌディフロラ（Trewia nudlflora）から単離される)；Ｃ－１８－Ｎ－デメチル（米国特許第４３６２６６３号および同第４３２２３４８号）（例えば、スプレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化によって調製される）；および４，５－デオキシ（米国特許第４３７１５３３号）（例えば、メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製される）を有するものも含む。この段落で引用した各特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0289]本発明に記載されるように、抗体へのメイタンシンの化学コンジュゲーションは、腫瘍血管および周辺細胞に細胞傷害性剤を選択的に送達すると期待される。
６．５ ＡＤＣ中のメイタンシン
[0290]一部の実施形態において、本開示のＡＤＣは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートした１つまたは複数の治療（本明細書では、治療分子または治療剤とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態において、ＡＤＣは、核に向けられ、ＮＤ－ＡＤＣとして公知である。一部の実施形態において、薬剤は、メイタンシンまたはその誘導体である。
[0291]理論に縛られることなく、メイタンシンにコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびその誘導体は、薬物による毒性を低減すると期待される。
６．６ リンカー
[0292]１つまたは複数の薬剤（例えば、治療剤および／または診断剤）は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントに間接的にコンジュゲートさせてもよい（例えば、直接的な共有結合または非共有結合による相互作用でリンカーを用いることによって）。リンカーは、化学的な連結剤、例えばホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤であってもよく、これらは、多くの商業的な供給源より入手可能である。架橋に利用可能な領域は、本開示の結合タンパク質（例えば、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体）上に見出すことができる。リンカーは、フレキシブルなアーム、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の炭素原子を含んでいてもよい。例示的なリンカーとしては、ＢＳ３（［ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩］；ＢＳ３は、接近可能な第一アミンを標的化するホモ二官能性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである）、ＮＨＳ／ＥＤＣ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ－エチル－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＮＨＳ／ＥＤＣは、第一アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする）、スルホ－ＥＭＣＳ（［Ｎ－ｅ－マレイミドカプロン酸］ヒドラジド；スルホ－ＥＭＣＳは、スルフヒドリルおよびアミノ基に反応性を有するヘテロ二官能性反応性基（マレイミドおよびＮＨＳ－エステル）である）、ヒドラジド（ほとんどのタンパク質は露出した炭水化物を含有し、ヒドラジドは、カルボキシル基を第一アミンに連結するのに有用な試薬である）、およびＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート；ＳＡＴＡは、アミンに反応性を有し、保護されたスルフヒドリル基を付加する）が挙げられる。共有結合を形成するために、化学的に反応性の基は、様々な活性カルボキシル基（例えば、エステル）であり、その場合、ヒドロキシル部分は、ペプチドを改変するのに必要なレベルで生理学的に許容される。特定の薬剤としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシ－スルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）、マレイミド－ベンゾイル－スクシンイミド（ＭＢＳ）、ガンマ－マレイミド－ブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）、マレイミドヘキサン酸（ＭＨＡ）、およびマレイミドウンデカン酸（ＭＵＡ）が挙げられる。第一アミンは、ＮＨＳエステルの主要な標的である。タンパク質のＮ末端に存在する接近可能なａ－アミノ基およびリジンのε－アミンは、ＮＨＳエステルと反応する。アミド結合は、ＮＨＳエステルのコンジュゲーション反応物が第一アミンと反応してＮ－ヒドロキシスクシンイミドを放出すると形成される。これらのスクシンイミドを含有する反応性基は、本明細書ではスクシンイミジル基と称される。本開示の特定の実施形態において、タンパク質上の官能基は、チオール基と予想され、化学的に反応性の基は、マレイミドを含有する基、例えばガンマ－マレイミド－ブチリルアミド（ＧＭＢＡまたはＭＰＡ）と予想される。このようなマレイミドを含有する基は、本明細書では、マレイミド基と称される。マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５～７．４である場合、ペプチド上のスルフヒドリル基にとって最も選択的である。ｐＨ７．０において、マレイミド基のスルフヒドリル（例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧなどのタンパク質上のチオール基）との反応速度は、アミンより１０００倍速い。したがって、マレイミド基とスルフヒドリルとの間の安定なチオエーテル結合を形成することができる。
[0293]他の実施形態において、リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸を含む（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、４０、または５０アミノ酸のペプチド）。特定の実施形態において、リンカーは、単一のアミノ酸（例えば、あらゆる天然に存在するアミノ酸、例えばＣｙｓ）である。他の実施形態において、グリシンリッチなペプチド、例えばペプチドが使用できる。一部の場合において、リンカーは、単一のアミノ酸（例えば、あらゆるアミノ酸、例えばＧｌｙまたはＣｙｓ）であってもよい。好適なリンカーの例は、コハク酸、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、およびＡｓｐであるか、またはＧｌｙ－Ｌｙｓなどのジペプチドである。リンカーがコハク酸である場合、その１つのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成することができ、その他のカルボキシル基は、例えば、ペプチドまたは置換基のアミノ基とアミド結合を形成することができる。リンカーがＬｙｓ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐである場合、それらのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成でき、それらのアミノ基は、例えば、置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成できる。Ｌｙｓがリンカーとして使用される場合、さらなるリンカーが、Ｌｙｓのε－アミノ基と置換基との間に挿入される場合もある。１つの特定の実施形態において、さらなるリンカーは、コハク酸であり、これは例えば、Ｌｙｓのε－アミノ基および置換基に存在するアミノ基とアミド結合を形成する。一実施形態において、さらなるリンカーは、ＧｌｕまたはＡｓｐであり（例えばこれは、Ｌｙｓのε－アミノ基とアミド結合を形成し、置換基に存在するカルボキシル基と別のアミド結合を形成する）、すなわち置換基は、ＮＥアシル化リジン残基である。
[0294]一部の実施形態において、本明細書に記載される抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子などの核酸分子）が、様々なアプローチ、例えば、遺伝的コンジュゲーション、酵素的コンジュゲーション、化学的コンジュゲーション、またはこれらの任意の組合せを使用してコンジュゲートされ得る。
[0295]一部の実施形態において、ＡＤＣ内のＲＮＡ分子は、哺乳動物または細菌トランスグルタミナーゼ酵素の使用を含む、酵素的な部位特異的コンジュゲーション法を使用して、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされ得る。微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）は、現代の研究およびバイオテクノロジーにおいて用途の広いツールである。大量の比較的純度の高い酵素の入手可能性、使用の容易さ、およびカルシウムおよびグアノシン－５’三リン酸（ＧＴＰ）による調節の欠如は、ｍＴＧを、食品産業とバイオテクノロジーの両方において使用される主要な架橋酵素に推進した。現在、ｍＴＧは、多くの適用に使用され、タンパク質およびペプチドを、小分子、ポリマー、表面、ＤＮＡ、ならびに他のタンパク質に接着させる。例えば、Ｐａｖｅｌ Ｓｔｒｐ，Ｖｅｒａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２５，５，８５５～８６２を参照）。
[0296]一部の実施形態において、コンジュゲート内のＲＮＡ分子は、直接的な共有結合または非共有結合による相互作用でリンカーを用いることによって、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートさせてもよい。リンカーは、アミノ酸またはペプチドベースのリンカー、または化学的な連結剤、例えばホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤であってもよく、これらは、多くの商業的な供給源より入手可能である。架橋に利用可能な領域は、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント上に見出すことができる。リンカーは、フレキシブルなアーム、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の炭素原子を含んでいてもよい。例示的なリンカーとしては、切断可能、切断不能、共有結合性、または非共有結合性リンカー、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態において、切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、またはジスルフィド含有リンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、システインリンカーまたはリジンリンカーなどの非システインリンカーを含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは非天然アミノ酸を含み、抗体または抗体フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、非天然アミノ酸を介して連結／コンジュゲートされている。
[0297]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、天然アミノ酸を含み、抗体または抗体フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、天然アミノ酸を介して連結／コンジュゲートされている。非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントにおける２つの自然発生のアミノ酸の間に挿入され得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントにおける１つまたは複数の自然発生のアミノ酸を置き換えることができる。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントのＮ末端に組み込まれ得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントのＣ末端に組み込まれ得る。非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの結合領域から離れて組み込まれ得る。非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの結合領域近くに組み込まれ得る。非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの結合領域に組み込まれ得る。
[0298]１つまたは複数の非天然アミノ酸は、２０個のアミノ酸の１つをコードしないコドンによってコードされ得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、ナンセンスコドン（停止コドン）によってコードされ得る。停止コドンは、アンバーコドンであり得る。アンバーコドンは、ＵＡＧ配列を含み得る。停止コドンは、オーカーコドンであり得る。オーカーコドンは、ＵＡＡ配列を含み得る。停止コドンは、オパールまたはアンバーコドンであり得る。オパールまたはアンバーコドンは、ＵＧＡ配列を含み得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、４塩基コドンによってコードされ得る。
[0299]１つまたは複数の非天然アミノ酸は、ｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦまたはｐＡｃＰｈｅ）であり得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、セレノシステインであり得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、ｐ－フルオロフェニルアラニン（ｐＦＰｈｅ）であり得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、ｐ－アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、ｐ－アジドメチルフェニルアラニン（ｐＡｚＣＨ２Ｆ）、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＦ）、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｒＦ）、ｐ－ヨードフェニルアラニン（ｐＩＦ）、ｐ－シアノフェニルアラニン（ｐＣＮＦ）、ｐ－カルボキシメチルフェニルアラニン（ｐＣｍＦ）、３－（２－ナフチル）アラニン（ＮａｐＡ）、ｐ－ボロノフェニルアラニン（ｐＢｏＦ）、ｏ－ニトロフェニルアラニン（ｏＮｉＦ）、（８－ヒドロキシキノリン－３－イル）アラニン（ＨＱＡ）、セレノシステイン、および（２，２’－ビピリジン－５－イル）アラニン（ＢｉｐｙＡ）を含む群から選択され得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）アミノフェニルアラニンであり得る。
[0300]１つまたは複数の非天然アミノ酸は、βアミノ酸（β３およびβ２）、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３－置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、ジアミノ酸、Ｄ－アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、またはこれらの組合せであり得る。
[0301]非天然アミノ酸の追加の例は、限定はされないが、１）様々な置換チロシンおよびフェニルアラニン類似体、例えばＯ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－メトキシ－Ｌ－フェニルアラニンおよびｐ－イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン；２）光架橋され得るアリールアジドおよびベンゾフェノン基を有するアミノ酸；３）アセチル－Ｌ－フェニルアラニンおよびｍ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリール－Ｌ－チロシン、Ｏ－（２－プロピニル）－Ｌ－チロシン、ｐ－エチルチオカルボニル－Ｌ－フェニルアラニンおよびｐ－（３－オキソブタノイル）－Ｌ－フェニルアラニンを含むユニーク化学反応性を有するアミノ酸；４）ｐ－ヨードおよびｐ－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニンを含むＸ線結晶解析におけるフェージングのためのアミノ酸を含有する重原子；５）酸化還元活性のあるアミノ酸であるジヒドロキシ－Ｌ－フェニルアラニン；６）ｂ－Ｎ－アセチルグルコサミン－Ｏ－セリンおよびＮ－アセチルガラクトサミン－Ｏ－スレオニンを含むグリコシル化アミノ酸；７）ナフチル、ダンシル、および７－アミノクマリン側鎖を有する蛍光アミノ酸；８）アゾベンゼンおよびニトロベンジルＣｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒ側鎖を有する光切断可能および光異性化アミノ酸；９）ホスホチロシン模倣ｐ－カルボキシメチル－Ｌ－フェニルアラニン；１０）グルタミン相同ホモグルタミン；ならびに１１）２－アミノオクタン酸を含む。非天然アミノ酸は、化学基を組み込むように改変することができる。非天然アミノ酸は、ケトン基を組み込むように改変することができる。
[0302]１つまたは複数の非天然アミノ酸は、少なくとも１つのオキシム、カルボニル、ジカルボニル、ヒドロキシルアミン基またはこれらの組合せを含み得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、少なくとも１つのカルボニル、ジカルボニル、アルコキシ－アミン、ヒドラジン、非環式アルケン、非環式アルキン、シクロオクチン、アリール／アルキルアジド、ノルボルネン、シクロプロペン、トランス－シクロオクテン、またはテトラジン官能基またはこれらの組合せを含み得る。
[0303]１つまたは複数の非天然アミノ酸は、当技術分野で公知の方法によって、抗体または抗体フラグメントに組み込まれ得る。細胞ベースまたは細胞フリーシステムは、抗体または抗体フラグメントの遺伝子配列を変更し、それにより１つまたは複数の非天然アミノ酸を有する抗体または抗体フラグメントを産生することに使用され得る。栄養要求性菌株は、操作されたｔＲＮＡおよび合成酵素の代わりに使用され得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、１つまたは複数の天然アミノ酸の選択反応を介して産生され得る。選択反応は、１つまたは複数の酵素によって媒介され得る。非限定的な一例において、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）による１つまたは複数のシステインの選択反応は、Ｒａｂｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７：１０５２～１０６７（２０１２）に記載されるように１つまたは複数のホルミルグリシンを産生し得る。
[0304]１つまたは複数の非天然アミノ酸は、化学反応に参加し、リンカーを形成し得る。リンカーを形成する化学反応は、生体直交型の反応であり得る。リンカーを形成する化学反応は、クリックケミストリーであり得る。
[0305]追加の非天然アミノ酸は、Ｌｉｕら（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，７９：４１３～４４，２０１０）、Ｗａｎｇら（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，４４：３４～６６，２００５）およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３９４７２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３９４６８、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８００９、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５８６６８、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８９１４２、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８０１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１４８５、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９３９７、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７８２２およびＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４４６８２に開示され、その全てはその全体が参照により組み込まれる。
[0306]１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントにおいて１つまたは複数のアミノ酸を置き換えることができる。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントにおいて任意の天然アミノ酸を置き換えることができる。
[0307]１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの軽鎖に組み込まれ得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの重鎖に組み込まれ得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの重鎖および軽鎖に組み込まれ得る。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの軽鎖のアミノ酸を置き換えることができる。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの重鎖のアミノ酸を置き換えることができる。１つまたは複数の非天然アミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの重鎖および軽鎖のアミノ酸を置き換えることができる。
[0308]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント。一部の実施形態において、リンカーは、小分子フラグメント、スペーサー、非共有結合性リンカー、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態において、リンカーは、１つまたは複数の小分子フラグメントを含む。一部の実施形態において、リンカーはスペーサーを含む。
[0309]一部の実施形態において、リンカーは、１つまたは複数の反応性成分を含む。一部の実施形態において、リンカーは、マイケルアクセプター成分、脱離基成分、または抗体フラグメントおよび／または治療剤と共有結合を形成することができる成分から選択される反応性成分を含む。
[0310]一部の実施形態において、小さい抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、反応性成分を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、マイケルアクセプター成分、脱離基成分、またはシステイン残基のチオール基と共有結合を形成することができる成分から選択される反応性成分を含む。
[0311]一部の実施形態において、マイケルアクセプター成分は、アルケンまたはアルキン成分を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、化合物ライブラリーから得られる。一部の実施形態において、化合物ライブラリーは、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅフラグメントライブラリー、Ｐｙｒａｍｉｄ Ｐｌａｔｆｏｒｍフラグメントベースの創薬、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅフラグメントライブラリー、ＡｎａｌｙｔｉＣｏｎのＦＲＧｘ、ＡｎＣｏｒｅＸのＴＣＩ－Ｆｒａｇ、ＡＳＩＮＥＸのＢｉｏ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒのＢｉｏＦｏｃｕｓ ３Ｄ、Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏのＦｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｌｉｆｅ（ＦＯＬ）、Ｅｎａｍｉｎｅフラグメントライブラリー、ＩＯＴＡ Ｄｉｖｅｒｓｅ １５００、ＢＩＯＮＥＴフラグメントライブラリー、Ｌｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＯＴＡＶＡフラグメントライブラリー、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋフラグメントライブラリー、Ｓｅｌｃｉａフラグメントライブラリー、ＴｉｍＴｅｃフラグメントベースのライブラリー、Ｖｉｔａｓ－Ｍ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＡｌｌｉｕｍ、あるいはＺｅｎｏｂｉａフラグメントライブラリーを含む。
[0312]一部の実施形態において、小分子フラグメントは、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、ビニルスルホン、ヒドラジド、アルコキシアミン、アルキン、アジド、またはイソシアネート基を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、アルキンまたはアジド基を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、アルキン基を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、アジド基を含む。
[0313]一部の実施形態において、小分子フラグメントは、スペーサーと共有結合により相互作用する。一部の実施形態において、スペーサーは、アミド成分、エステル成分、エーテル成分、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６アルキレン成分、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６ハロアルキレン成分、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６ヘテロアルキレン成分、置換または非置換Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン成分、置換または非置換Ｃ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキレン成分、置換または非置換アリーレン成分、置換または非置換ヘテロアリーレン成分またはこれらの任意の組合せを含む。
[0314]一部の実施形態において、リンカーは、ＭＣ（６－マレイミドカプロイル）、ＭＣＣ（マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ－ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、ｖａｌ－ａｌａ（バリン－アラニン）、ａｌａ－ｐｈｅ（アラニン－フェニルアラニン）、ＰＡＢ（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート）、ＳＭＣＣ（Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート）、ＳＡＩＢ（Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエートを含む。リンカーのさらなる例としては：ＢＳ３（［ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩］；ＢＳ３は、接近可能な第一アミンを標的化するホモ二官能性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである）、ＮＨＳ／ＥＤＣ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ－エチル－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＮＨＳ／ＥＤＣは、第一アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする）、スルホ－ＥＭＣＳ（［Ｎ－ｅ－マレイミドカプロン酸］ヒドラジド；スルホ－ＥＭＣＳは、スルフヒドリルおよびアミノ基に反応性を有するヘテロ二官能性反応性基（マレイミドおよびＮＨＳ－エステル）である）、ヒドラジド（ほとんどのタンパク質は露出した炭水化物を含有し、ヒドラジドは、カルボキシル基を第一アミンに連結するのに有用な試薬である）、およびＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート；ＳＡＴＡは、アミンに反応性を有し、保護されたスルフヒドリル基を付加する）が挙げられる。共有結合を形成するために、化学的に反応性の基は、様々な活性カルボキシル基（例えば、エステル）であり、その場合、ヒドロキシル成分は、ペプチドを改変するのに必要なレベルで生理学的に許容される。特定の薬剤としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシ－スルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）、マレイミド－ベンゾイル－スクシンイミド（ＭＢＳ）、ガンマ－マレイミド－ブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）、マレイミドヘキサン酸（ＭＨＡ）、およびマレイミドウンデカン酸（ＭＵＡ）が挙げられる。第一アミンは、ＮＨＳエステルの主要な標的である。タンパク質のＮ末端に存在する接近可能なａ－アミノ基およびリジンのε－アミンは、ＮＨＳエステルと反応する。アミド結合は、ＮＨＳエステルのコンジュゲーション反応物が第一アミンと反応してＮ－ヒドロキシスクシンイミドを放出すると形成される。これらのスクシンイミドを含有する反応性基は、本明細書ではスクシンイミジル基と称される。本開示の特定の実施形態において、タンパク質上の官能基は、チオール基と予想され、化学的に反応性の基は、マレイミドを含有する基、例えばガンマ－マレイミド－ブチリルアミド（ＧＭＢＡまたはＭＰＡ）と予想される。このようなマレイミドを含有する基は、本明細書では、マレイミド基と称される。マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５～７．４である場合、ペプチド上のスルフヒドリル基にとって最も選択的である。ｐＨ７．０において、マレイミド基のスルフヒドリル（例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧなどのタンパク質上のチオール基）との反応速度は、アミンより１０００倍速い。したがって、マレイミド基とスルフヒドリルとの間の安定なチオエーテル結合を形成することができる。
[0315]他の実施形態において、リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸を含む（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、４０、または５０アミノ酸のペプチド）。特定の実施形態において、リンカーは、単一のアミノ酸（例えば、あらゆる天然に存在するアミノ酸、例えばＣｙｓまたはＬｙｓ）である。他の実施形態において、グリシンリッチなペプチド、例えばペプチドが使用できる。一部の場合において、リンカーは、単一のアミノ酸（例えば、あらゆるアミノ酸、例えばＧｌｙまたはＣｙｓまたはＬｙｓ）であってもよい。好適なリンカーの例は、コハク酸、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、およびＡｓｐであるか、またはＧｌｙ－Ｌｙｓなどのジペプチドである。リンカーがコハク酸である場合、その１つのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成することができ、その他のカルボキシル基は、例えば、ペプチドまたは置換基のアミノ基とアミド結合を形成することができる。リンカーがＬｙｓ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐである場合、それらのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成でき、それらのアミノ基は、例えば、置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成できる。Ｌｙｓがリンカーとして使用される場合、さらなるリンカーが、Ｌｙｓのε－アミノ基と置換基との間に挿入される場合もある。１つの特定の実施形態において、さらなるリンカーは、コハク酸であり、これは例えば、Ｌｙｓのε－アミノ基および置換基に存在するアミノ基とアミド結合を形成する。一実施形態において、さらなるリンカーは、ＧｌｕまたはＡｓｐであり（例えばこれは、Ｌｙｓのε－アミノ基とアミド結合を形成し、置換基に存在するカルボキシル基と別のアミド結合を形成する）、すなわち置換基は、ＮＥアシル化リジン残基である。一部の実施形態において、リンカーはリジンからなる単一アミノ酸ペプチドを含む。一部の実施形態において、リンカーはＬｙｓＬｙｓジペプチドを含む。一部の実施形態において、リンカーは＊Ｌｙｓおよび／またはＬｙｓ＊ジペプチドを含む。一部の実施形態において、リンカーはＬｙｓＬｙｓ＊および／または＊ＬｙｓＬｙｓ、Ｌｙｓ＊Ｌｙｓトリペプチドを含む。一部の実施形態において、リンカーはＬｙｓＬｙｓＬｙｓトリペプチドを含む。
[0316]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントとＲＮＡ分子のコンジュゲーションは、環に繋がれた分子を産生する方法で行われる。一部の実施形態において、スペーサーはさらに大環状分子を含む。一部の実施形態において、大環状分子は非共有結合性大環状分子を含む。一部の実施形態において、大環状分子は共有結合性大環状分子を含む。
[0317]一部の実施形態において、大環状分子は、ククルビット［Ｘ］ウリル（式中Ｘは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）を含む。一部の実施形態において、大環状分子は、ククルビット［Ｘ］ウリル（式中Ｘは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である）を含む。一部の実施形態において、大環状分子は、ククルビット［Ｘ］ウリル（式中Ｘは、５、６、７、または８である）を含む。一部の実施形態において、ククルビット［Ｘ］ウリルは、
（式中、ｘは５、６、７、または８である）
によって表される構造を有する。
[0318]一部の実施形態において、ｘは５である。一部の実施形態において、ｘは６である。一部の実施形態において、ｘは７である。一部の実施形態において、ｘは８である。
[0319]一部の実施形態において、大環状分子は、ククルビット［６］ウリルを含む（ＣＢ６）。一部の実施形態において、大環状分子は、ククルビット［７］ウリルを含む（ＣＢ７）。一部の実施形態において、ククルビット［７］ウリルは、
によって表される構造を有する。
[0320]一部の実施形態において、大環状分子は、シクロデキストリン（ＣＤ）を含む。一部の実施形態において、シクロデキストリンは、
（式中、ｎは５、６、７、または８である）
によって表される構造を有する。
[0321]一部の実施形態において、大環状分子は、ベータ－シクロデキストリン（ｎ＝７）を含む。一部の実施形態において、大環状分子は、ガンマ－シクロデキストリン（ｎ＝８）を含む。一部の実施形態において、ベータ－シクロデキストリンは、
によって表される構造を有する。
[0322]一部の実施形態において、大環状分子は、ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、
（式中、Ｒ１はＨ、Ｄ、Ｆ、－ＣＮ、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６フルオロアルキル、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換または非置換Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールであり；ｍは５、６、７、または８である）
によって表される構造を有する。
[0323]一部の実施形態において、大環状分子は、シクログリシンを含む。一部の実施形態において、大環状分子は、シクロ（グリシルグリシルグリシルグリシルグリシルグリシル）を含む。一部の実施形態において、大環状分子は、シクロ（グリシルグリシルグリシルグリシルグリシルグリシルグリシル）を含む。一部の実施形態において、シクロ（グリシルグリシルグリシルグリシルグリシルグリシルグリシル）は、
によって表される構造を有する。
[0324]一部の実施形態において、大環状分子は、クラウンエーテルを含む。一部の実施形態において、クラウンエーテルは、１５－クラウン－５、１８－クラウン－６、ジベンゾ－１８－クラウン－６、またはジアザ－１８－クラウン－６である。
[0325]一部の実施形態において、大環状分子は、シクロアルカンを含む。一部の実施形態において、シクロアルカンは、シクロペンタデカン、シクロヘキサデカン、シクロヘプタデカン、またはシクロオクタデカンである。
[0326]一部の実施形態において、大環状分子は、シクロビス（パラコート－ｐ－フェニレン）（ＣＢＰＱＴ４＋）を含む。一部の実施形態において、シクロビス（パラコート－ｐ－フェニレン）（ＣＢＰＱＴ４＋）は、
によって表される構造を有する。
[0327]一部の実施形態において、リンカーは、第４級窒素を含む。一部の実施形態において、リンカーは、
（式中、各Ｒは独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルである）
である。一部の実施形態において、リンカーは、
（式中、各Ｒは独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルである）
である。一部の実施形態において、リンカーは、
（式中、各Ｒは独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルである）
である。
[0328]一部の実施形態において、リンカーは、
である。
[0329]一部の実施形態において、コンジュゲートは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにリンカーの第１の部分、およびオリゴヌクレオチドにリンカーの第２の部分を連結することによって産生される。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントまたは治療分子にリンカーをコンジュゲートするステップは、リンカーと抗体、その抗原結合フラグメント、または治療剤の間にイオン結合、共有結合、非共有結合、またはこれらの組合せの産生を含み得る。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントまたはオリゴヌクレオチドにリンカーをコンジュゲートするステップは、一部の場合では、Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９～４７６（２００２）に記載されるように実施され得る。リンカーは、二官能性リンカー、切断可能リンカー、切断不能リンカー、エチレングリコールリンカー、二官能性エチレングリコールリンカー、フレキシブルなリンカー、またはフレキシブルではないリンカーから選択され得る。リンカーは、シクロオクチン、シクロプロペン、アリール／アルキルアジド、トランスシクロオクテン、ノルボレン、およびテトラジンから選択される化学基を含み得る。一部の実施形態において、リンカーの末端は、アルコキシアミンを含む。一部の実施形態において、リンカーの末端は、アジドまたはシクロオクチン基を含む。一部の実施形態において、抗体または抗体フラグメントまたは治療剤は、シクロオクチン、シクロプロペン、アリール／アルキルアジド、トランスシクロオクテン、ノルボレン、およびテトラジンから選択される化学基によってリンカーに結合され得る。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結するステップは、１つまたは複数の銅フリー反応を実施するステップを含み得る。抗体または抗体フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結するステップは、１つまたは複数の銅含有反応を実行することを含み得る。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結するステップは、１つまたは複数の環化付加を含み得る。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結するステップは、１つまたは複数のヒュスゲン環化付加を含み得る。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結するステップは、１つまたは複数のディールス・アルダー反応を含み得る。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結するステップは、１つまたは複数のヘテロ・ディールス・アルダー反応を含み得る。一部の実施形態において、リンカーの末端は脱離基を含む。
[0330]一部の実施形態において、本明細書に記載されるように、リンカーの第１の部分は、システインを含有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントと共有結合により相互作用する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるように、リンカーの第１の部分は、システインを含有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントと共有結合により相互作用する。一部の実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、リンカーの第２の部分と共有結合により相互作用する。一部の実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、リンカーの第２の部分と非共有結合により相互作用する。
[0331]一部の実施形態において、ウイルスタンパク質ｐ１９ベースのｓｉＲＮＡ担体が考えられ、そのタンパク質は、ｓｉＲＮＡに高い親和性を有することが示された。例えば、Ｙａｎｇら Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｂｙ ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｓＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１７ Ｊｕｌ ２７；４５（１３）：７６０２～７６１４を参照。一部の例において、ｐ１９－ｓｉＲＮＡ複合体が生成され、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントに融合される。さらなる実施形態において、統計的または無作為コンジュゲーション方法は、抗体またはその抗原結合フラグメント内のＣｙｓ、Ｌｙｓ、またはアルギニン残基を介する。
[0332]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント、およびｓｉＲＮＡを含むＡＤＣの合成
[0333]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートは、抗体または抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）の共有結合性コンジュゲーションによって開発される。そのような例示的なプロセスの第１のステップとして、システイン残基が重鎖内に導入された操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体が生成される（それにより、抗ＴＭ４ＳＦ１ ＨＣ ＴＨＩＯＭＡＢを産生する）。一部の例において、抗ＴＭ４ＳＦ１ ｔｈｉｏｍａｂは、ｓｉＲＮＡとなど、ＲＮＡ分子と結合するための少なくとも２つの別々の位置を提供する。例えば、１つのｓｉＲＮＡ分子は、抗ＴＭ４ＳＦ１ ｔｈｉｏｍａｂの各重鎖に結合され得る。コンジュゲーションプロセスの別々のまたは継続するステップにおいて、ペプチジルプロピルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ、シクロフィリンＢ）を標的化する配列を有するパッセンジャー鎖に結合するための３’－アミンによって改変された、化学的に安定なｓｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＳＴＡＢＬＥケミストリーを使用して合成される）が生成される。一部の実施形態において、コンジュゲーションは、還元性Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）または非還元性スクシンイミジル４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）リンカーをさらに含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１ ｔｈｉｏｍａｂを使用して、本開示に記載の例示的なコンジュゲート分子は、少なくとも２つの主なステップを含む多段階プロセスで生成される：（ｉ）チオール反応性ｓｉＲＮＡリンカー付加物を形成する、ＮＨＳリンカーとのアミンタグｓｉＲＮＡの反応、および（ｉｉ）チオール－エステル結合を介してｓｉＲＮＡを共有結合により連結するＴＨＩＯＭＡＢのチオール基と付加物を反応させるステップ。例示的なＡＤＣは、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製され、遊離のｓｉＲＮＡを除去され、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって未結合の抗体を除去される。さらなる技術、例えばゲル電気泳動およびエレクトロスプレーＴＯＦマススペクトロメトリーを次いで使用して、例示的なＡＤＣの収率、ならびに抗体当たり１つまたは２つの連結したｓｉＲＮＡとの単量体コンジュゲートなどの特徴を評価し得る。コンジュゲーションに用いることができるさらなる方法は、化学またはペプチドベースリンカー、化学または酵素的コンジュゲーション方法（例えば、哺乳動物または細菌トランスグルタミナーゼを使用する）、またはこれらの任意の組合せの使用を含む。上記の任意のリンカーおよび／または方法が、コンジュゲートの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびオリゴヌクレオチドを結合するために使用され得る。
[0334]適切な結合方法を使用して、例えば、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、もしくは１：１０またはそれ以上の比でオリゴヌクレオチドに対して抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、本開示のＡＤＣを生成することが可能である。一部の実施形態において、ＡＤＣは、１：１の比でオリゴヌクレオチドに対して抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。これは、例えば、抗体の抗原結合フラグメントまたは部分、例えばシステイン操作されたＴＨＩＯＭＡＢを含むハーフ抗体、Ｆａｂ、または他のフラグメントを使用することによって達成され得る。一部の例において、ＡＤＣは、多元金属タンパク質（例えば、ヘキサロジウムメタロペプチド）を利用して、分子認識に基づいて、タンパク質の改変を可能にするコンジュゲーション方法によってオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている全抗体を使用して、１：１比の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント対オリゴヌクレオチドを含むように設計され得る。例えば、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、多元金属タンパク質による抗体のＦｃドメイン定常領域の分子認識に基づき、部位特異的抗体機能化を使用してコンジュゲートされ得る。一部の実施形態において、多元金属タンパク質は、抗体のＦｃドメインに結合するタンパク質の特異的部位に接着する３つのロジウム複合体を含む。結合時、多元金属タンパク質は、抗体へのオリゴヌクレオチドの部位特異的コンジュゲーションを触媒し得る。多元金属タンパク質を使用することの利点は、コンジュゲーション中に抗体内の残基を操作されることを避けることによるなど、抗体の破壊が最小限であることであり得る。
[0335]切断不能リンカー
[0336]一部の実施形態において、切断不能リンカーは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントとメイタンシンまたはその誘導体の間である。一部の実施形態において、切断不能リンカーは共有結合性リンカーである。一部の実施形態において、切断不能リンカーは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントのＮ末端、Ｃ末端または内部アミノ酸位置に接着されている。一部の実施形態において、切断不能リンカーは、メイタンシンまたはその誘導体に共有結合性に接着されている。一部の実施形態において、切断不能リンカーは、メイタンシンまたはその誘導体のＮ、Ｏ、もしくはＳ、またはＣ１～Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ５～Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ８～Ｃ１６シクロアルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、５～１２員ヘテロアリール、または３～１２員複素脂環式基の炭素原子を含むヘテロ原子に共有結合性に接着されている。
[0337]一部の実施形態において、切断不能リンカーは、Ｃ１～Ｃ６アルキレン、アルケニレン、３～７員環を有するシクロアルキレン、アルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、Ｎ、ＯまたはＳの１～３原子を含む５～１２員環を有するヘテロシクレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｃ１～６アルキル）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、またはこれらの組合せを含み、Ｃ１～Ｃ６アルキレン、アルケニレン、３～７員環を有するシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびＮ、ＯまたはＳの１～３原子を含む５～１２員環を有するヘテロシクレンは、非置換であるかまたはハライド、アミノ、－ＣＦ３、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ３アルコキシ、Ｃ１～Ｃ３アルコキシ、またはＣ１～Ｃ３アルキルチオによって置換されている。
[0338]一部の実施形態において、切断不能リンカーは、
（式中、整数ｍは０～３であり、整数ｑは０～１２であり、整数ｒは１～３である）
を含む。
[0339]一部の実施形態において、切断不能リンカーは、
（式中、各Ｙ１およびＹ２は、独立して結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１００であり；
Ｒ１００は、独立してＨ、重水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり；Ｃ６～Ｃ１２アリール、５～１２員ヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル、または３～１２員複素脂環式基、またはＲ１が結合される窒素と共にＲ１および切断不能リンカーの別の原子、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント、またはメイタンシンが組み合わされ、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１～３個のさらなるヘテロ原子を含有してもよい３～１２員複素脂環式または５～１２員ヘテロアリール基を形成し；整数ｍは０～３であり、整数ｑは０～１２であり、整数ｒは１～３である）
を含む。
[0340]切断不能リンカーを含有する抗体薬物コンジュゲートの合成
[0341]切断不能リンカーを介する薬物への抗体の接着は、様々な方法で実施され得る。例えば、一方法は、抗体および薬物を別々に調製する。次いで、その末端に２つの異なる活性化／活性化可能基を有するリンカー試薬を調製する。２つの異なる活性化／活性化可能基は、それぞれ抗体および薬物と選択的に反応でき、それにより抗体薬物コンジュゲートの合成が完了する。例えば、１つの活性化／活性化可能基はＢｒＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－であってもよく、抗体のチオール基、特に表面チオール基と反応し、リンカーを抗体に接着することができる。別の活性化／活性化可能基は、活性化カルボニル、例えば塩化アシルまたは混合無水もしくは単にカルボン酸であってもよく、それは薬物のアミノ基と反応し得る。共有結合形成反応を使用して、リンカーを抗体または薬物に接着することができる。
[0342]別の方法は、薬物の合成中にリンカー基またはそのフラグメントを組み込む。薬物の合成が完了した後、組み込まれたリンカー基またはそのフラグメントの改変は、リンカーの遊離末端に活性化／活性化可能基の付加／アンマスクをもたらし得る。新規に明らかになったリンカーの活性化／活性化可能基は、抗体の表面反応基（例えば、チオール基）と反応し得る。
[0343]図１は、メイタンシン会合ＡＤＣの例およびその合成をもたらす経路の例を示す。
６．７ ポリヌクレオチド
[0344]また、一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドも提供される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡコンストラクトとして提供される。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。
[0345]一部の例において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号４、１６、２８、４０、５２、６４、または７６のいずれか１つに記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメインを含む。一部の例において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号１０、２２、３４、４６、５８、７０、または８２のいずれか１つに記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む。
[0346]一部の実施形態において、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、またはＣＨＯ細胞などの真核細胞での発現のためにコドンが最適化された核酸配列が提供される。一部の例において、核酸配列は、ＣＨＯ細胞での発現のためにコドンが最適化されている。一部の例において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号５、１７、２９、４１、５３、６５、または７７のいずれか１つに記載のコドンが最適化された核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメインを含む。一部の例において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号１１、２３、３５、４７、５９、７１、または８３のいずれか１つに記載のコドンが最適化された核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む。特定の場合において、配列番号５、１７、２９、４１、５３、６５、または７７のいずれか１つの核酸配列は、ＣＨＯ細胞での発現のためにコドンが最適化された核酸配列である。特定の場合において、配列番号１１、２３、３５、４７、５９、７１、または８３のいずれか１つの核酸配列は、ＣＨＯ細胞での発現のためにコドンが最適化された核酸配列である。
[0347]ポリヌクレオチド分子は、公知の方法によって、例えば、好適なプロモーターに、および任意選択で好適な転写ターミネーターに連結された遺伝学的コンストラクトに、結合タンパク質をコードする遺伝子を取り込ませ、それを細菌または他の適切な発現系、例えばＣＨＯ細胞などで発現することによって構築される。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含む様々な好適な転写および翻訳エレメントを使用することができる。プロモーターは、それがそれぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を駆動するように選択される。
[0348]一部の実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくは発現ベクターに挿入され、これは、さらなる実施形態の一つに相当する。この組換えベクターは、公知の方法に従って構築することができる。特に興味深いベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（ｖｉｒｉｉ）（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、およびコスミドが挙げられる。
[0349]様々な発現ベクター／宿主系が、記載されたＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有および発現するのに利用することができる。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のための発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（Ｌｅ Ｇａｌｌら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１～２７）であり、または哺乳類細胞での発現のためには、ｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
[0350]したがって、本明細書に記載されるＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質は、一部の実施形態において、上述したタンパク質をコードするベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を、タンパク質ドメインが発現される条件下で培養することによって産生され、これらは単離してもよいし、任意選択でさらに精製してもよい。
６．８ 処置の方法
[0351]本開示は、内皮細胞（ＥＣ）特異的であるが、例えば、ＥＣ－ＥＣ、ＥＣ－間葉幹細胞、ＥＣ－繊維芽細胞、ＥＣ－平滑筋細胞、ＥＣ－腫瘍細胞、ＥＣ－白血球、ＥＣ－脂肪細胞、およびＥＣ－神経細胞相互作用に限定されない細胞－細胞相互作用を阻害する方法をさらに提供する。特定の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびフラグメントを含有するＡＤＣは、異常なＥＣ－細胞相互作用によって特徴付けられる病理を有する任意のヒトの疾患または障害を処置するために使用され得る。特定の実施形態において、ＥＣ－細胞相互作用は、ＥＣ－白血球相互作用であり、ＥＣ－白血球相互作用の阻害は炎症を予防するために使用される。
[0352]他の実施形態において、本開示は、対象における疾患または障害を処置または予防する方法に注目し、疾患または障害は、異常な内皮細胞（ＥＣ）－細胞相互作用を特徴とし、方法は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与するステップを含む。特定の実施形態において、ＥＣ－細胞相互作用は、ＥＣ－間葉幹細胞、ＥＣ－繊維芽細胞、ＥＣ－平滑筋細胞、ＥＣ－腫瘍細胞、ＥＣ－白血球、ＥＣ－脂肪細胞、およびＥＣ－神経細胞相互作用の１つまたは複数を含む。例示的な実施形態において、疾患は、炎症性疾患または障害であり、本開示の抗体およびフラグメントは、ＥＣ－白血球相互作用を阻害するために使用される。別の例示的な実施形態において、疾患または障害は、炎症性疾患またはがんから選択される。白血球の血管内皮への付着は、炎症工程の顕著な特徴である。したがって、一実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含有するＡＤＣは炎症性疾患を処置するために使用され、白血球の内皮細胞への接着、または内皮を通る白血球遊出の阻害は処置に有用である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｙｃｈｌｙら、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００６；１２（２９）：３７９９～８０６参照）。例としては、限定はされないが、敗血症、炎症性腸疾患、乾癬、または多発性硬化症が挙げられる。
[0353]米国だけでも、毎年およそ５０万人の患者ががんにより死亡する。腫瘍転移は、これらの死の約９０％の原因である。転移を遮断する治療は公知ではない。本開示は、新規の標的、ＴＭ４ＳＦ１によって媒介される腫瘍細胞（ＴＣ）－内皮細胞（ＥＣ）相互作用の免疫遮断に基づいてがんを処置し、転移細胞を阻害することができる抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。
[0354]上記のように、ＴＭ４ＳＦ１は、元々は、ＴＣ浸潤および転移における役割を有するＴＣ抗原として発見された小さい、テトラスパニン様、細胞表面糖タンパク質である。ＴＭ４ＳＦ１は、ＴＣおよびＥＣによって選択的に発現される。ＴＭ４ＳＦ１は、マウスとヒトの両方において正常組織に供給する血管ＥＣに低レベルで発現される。ＴＭ４ＳＦ１は、多くのヒトがんに供給する血管の内側にある血管ＥＣに約１０～２０倍の高レベルで発現され、培養ＥＣに同等の高レベルで発現されることが示されている。ＴＭ４ＳＦ１濃縮マイクロドメイン（ＴＭＥＤ）は細胞表面タンパク質様インテグリンを動員し、ナノポディア、細胞表面から伸びた薄膜チャネルの形成を補助し、細胞－細胞相互作用を媒介する。したがって、特定の例において、本明細書に記載の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびフラグメントを含有するＡＤＣは、ナノポディア媒介相互作用を干渉し、ＴＣ血管外遊出に必要であるＴＣのＥＣとの相互作用を阻害する。
[0355]本開示のＡＤＣは、病的血管新生（例えば、がん、例えば乳がん、卵巣がん、腎臓がん、結腸直腸がん、肝臓がん、胃がん、および肺がん；肥満；黄斑変性症；糖尿病性網膜症；乾癬；リウマチ性関節炎；細胞性免疫；および酒さと関連する障害を有する対象（例えばヒト）を処置するために製剤化され得る。
[0356]ＴＭ４ＳＦ１は、ほとんどの上皮ＴＣの表面に高度に発現され、腫瘍血管の内側にあるＥＣおよび培養ＥＣにおいても高度に発現される。それは、正常血管ＥＣの表面に約１０～２０分の１の低レベルで発現される。マウスモデルでは、肺への腫瘍転移は、ＥＣとＴＣの両方でのＴＭ４ＳＦ１発現と関連する。転移は、血管ＥＣへのＴＣの最初の接着、および肺または他の転移部位に侵入するＥＣを通るそれらのその後の遊走を必要とする。以下の例は、一部の例において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体が培養においてＴＣ－ＥＣ相互作用と干渉し、インビボで腫瘍転移も阻害し得ることを示す。
[0357]したがって、本開示のＡＤＣは、転移の初期段階、すなわち、血管ＥＣへのＴＣ接着および／またはＥＣを通るＴＣの遊出の１つまたは両方を遮断するために使用され、それによりリスクのあるがん患者における転移を予防するかまたは転移の数を実質的に低減することができる。
[0358]本開示は、転移を予防する方法をさらに提供する。ヒト腫瘍は、典型的には増殖の初期に血液およびリンパにＴＣを流す；それゆえに、原発性腫瘍の早期処置は転移がまだ起こっていないという保証を与えない。したがって、ＴＭ４ＳＦ１の免疫遮断は、血行性転移を処置もしくは予防するため、またはリンパ性転移を処置もしくは予防するために使用され得る。
[0359]本開示の方法は、一部の実施形態において、対象における転移細胞を阻害するステップに向けられる。一実施形態において、対象は、がん、例えば転移と関連するがんまたはすでに転移したがんを有する。他の実施形態において、対象はすでにがんを処置され、寛解または部分寛解であり、本明細書に記載の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはフラグメントを含有するＡＤＣを投与するステップの利点は、それらが転移を予防し、寛解または部分寛解を維持するために作用することである。
[0360]特定の実施形態において、本開示は、転移発生のリスクが高いヒトを処置する方法を提供し、本明細書に記載の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびフラグメントを含有するＡＤＣの投与は、転移の発生を阻害または遅延するために使用され得る。
[0361]本開示には、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を、それを必要とする対象に投与するステップにより、腫瘍転移、特に肺への転移を遮断する方法が含まれる。一部の例において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体はヒト抗ＴＭ４ＳＦ１抗体であり、本明細書において抗ｈＴＭ４ＳＦ１とも呼ばれる。特定の実施形態において、方法は、有効量の抗ｈＴＭ４ＳＦ１抗体を含有するＡＤＣのそれを必要とする対象への投与を含み、有効量の抗体は、血管内皮細胞（ＥＣ）への腫瘍細胞（ＴＣ）の接着および血管内皮細胞（ＥＣ）を通る遊走を防止する。
[0362]特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含有するＡＤＣは、投与量および頻度が長期のＴＭ４ＳＦ１免疫遮断を維持するように、がんを有する対象または転移を有するリスクのある対象に投与される。投与レジメンは、対象の正常血管ＥＣに発現するＴＭ４ＳＦ１を飽和するのに十分な量で対象に抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含有するＡＤＣを投与するステップによりＴＭ４ＳＦ１媒介転移を最大限に阻害する。
[0363]特定の実施形態において、投与される抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含有するＡＤＣ、またはその抗原結合フラグメントの有効量は、１週間で循環抗体濃度＞１μｇ／ｍｌを達成するのに十分な量である。
[0364]特定の実施形態において、投与される抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含有するＡＤＣ、またはその抗原結合フラグメントの有効量は、抗体の血清濃度を約１カ月間継続して１μｇ／ｍｌ以上に維持するのに十分な量である。
[0365]一実施形態において、本開示は、有効量の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含有するＡＤＣ、またはその抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含むヒト対象における転移を処置または予防する方法を提供し、抗体、またはその抗原結合フラグメントの有効量は、１～８０ｍｇ／ｋｇの量の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。
[0366]本開示のＡＤＣの治療用途のための投与の様式は、抗体を宿主に送達する任意の好適な経路、例えば錠剤、カプセル剤、溶液、粉末、ゲル、粒子の、およびシリンジ、移植装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに含有される製剤を使用する、非経口投与、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下、肺、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）、または当業者によって認められ、当技術分野で周知の他の手段であり得る。部位特異的投与は、例えば、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝臓内、心臓内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、腹膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、または経皮送達によって達成され得る。
[0367]一部の実施形態において、本開示のＡＤＣは、対象に、任意の好適な経路によって、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）注入またはボーラス注射により非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）、筋肉内または皮下または腹腔内に投与され得る。ｉ．ｖ．注入は、例えば１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、もしくは２４０分にわたって、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２時間から与えられ得る。一部の実施形態において、対象に与えられる用量は、約０．００５ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０５ｍｇ～約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、または約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇまたは約２４ｍｇ／ｋｇ、または例えば約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態において、対象に与えられる用量は、例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、静脈内投与を介して約０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇであり得る。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、皮下投与を介して約０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、静脈内投与を介して約０．１ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、皮下投与を介して約０．１ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、静脈内投与を介して約０．３ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、皮下投与を介して約０．３ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、静脈内投与を介して約１．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、皮下投与を介して約１．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、静脈内投与を介して約３．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、皮下投与を介して約３．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、静脈内投与を介して約１０．０ｍｇ／ｋｇであり得る。一部の例において、対象に与えられる本開示の抗体の用量は、皮下投与を介して約１０．０ｍｇ／ｋｇである。
[0368]特定の実施形態において、本開示の抗体の固定単位用量、例えば５０、１００、２００、５００または１０００ｍｇが与えられ、または用量は患者の表面積、例えば５００、４００、３００、２５０、２００、または１００ｍｇ／ｍ２に基づき得る。一部の例において、１～８の間の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８）が投与され、患者を処置するが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の用量が与えられる。
[0369]本明細書に記載の本開示のＡＤＣの投与は、一部の実施形態において、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１カ月、５週間、６週間、７週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれ以上の後に反復される。慢性投与として、処置の反復コースも可能である。反復投与は、同じ用量または異なる用量である。一部の例において、本明細書に記載の本開示のＡＤＣは、８週間の間１週間間隔で８ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇ、続いてさらに１６週間の間２週間毎に８ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇでの投与、続いて静脈内注入によって４週間毎に８ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇでの投与で投与される。代わりに、一部の実施形態において、本明細書に記載の本開示のＡＤＣは、１７週間の間１週間間隔で０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの間で投与される。例えば、一部の場合、本開示の抗体は１日投与量として、２４、１２、８、６、４、または２時間毎の単回または分割用量、または任意のそれらの組合せを使用して、処置の開始後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０日目の少なくとも１日、または代わりに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０週目の少なくとも１週、またはそれらの任意の組合せに、１日当たり、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇの量で提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載の本開示のＡＤＣは、炎症性疾患、例えばＲＡ、乾癬性関節炎または乾癬の発症のリスクを低減するため、炎症性疾患、例えばＲＡ、乾癬性関節炎または乾癬の進行における事象の出現の発病を遅らせるために予防的に投与される。一部の例において、本開示のＡＤＣは、貯蔵のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体で再構成される。一部の場合、本開示の抗体は、フリップオフキャップの栓およびアルミニウムシールを有するガラスバイアル中の滅菌された凍結液体として供給される。一部の例において、各バイアルは、ｐＨ５．８の１０ｍＭヒスチジン、８．５％（ｗ／ｖ）スクロース、および０．０４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の製剤中３．３ｍＬの抗体の５０ｍｇ／ｍＬ溶液（１０％過剰量を含む）を含有するＡＤＣを含有する場合がある。一部の例において、バイアルは保存剤を含有せず、単回使用用である。バイアルは凍結して保存され、光から保護される。ＩＶ投与のための調製をするため、ＡＤＣ製剤は、一部の例において、滅菌希釈剤に希釈される前に０．２２ミクロンフィルターによって濾過される。一部の例において、およそ１００ｍＬまで体積を合わせた希釈ＡＤＣは、インライン０．２２ミクロンフィルターを使用して少なくとも３０分の期間にわたってＩＶ注入によって投与される。代わりに、一部の実施形態において、ＡＤＣは、約３．３ｍＬ中約５０ｍｇ／ｍＬ抗体を含有する１または２回の皮下注射として投与される。皮下注射部位は、例えば、腹部領域内であってよい。
[0370]患者の処置
[0371]本開示の組成物または単位剤形は、がんの形態を有する患者に同時に投与され得る。一部の実施形態において、組成物が投与され、腫瘍増殖が阻害される。一部の実施形態において、組成物は、腫瘍の明確な証拠または診断がなくても、その保護効果のために投与される。高齢者は、歳を取ると一部の型の腫瘍を発症し得るため、本開示のＡＤＣを使用する予防処置は、この患者集団においてその抗腫瘍効果のために有益であり得る。
[0372]一部の実施形態において、本開示は、がんを有する患者の処置に向けられる。一部の実施形態において、がんは血管肉腫である。本明細書で使用される場合、用語「血管肉腫」（ＨＳＡ）は、血管内皮で生じるがんを指し得る。ＨＳＡは、心臓、血管、リンパ、および脾臓のいずれかの内側で生じ得る。しかしながら、ＨＳＡは、心臓、心膜および脾臓を好む。ヒトに加えて、本開示の方法は、本開示に記載のＡＤＣを使用して、任意の種において血管肉腫を処置し得る。
[0373]一部の実施形態において、ヒトで生じる他の型のがんも同様に処置の標的とされ得る。本開示のＡＤＣによって処置され得るヒトがんの型の例は、限定はされないが、肉腫、癌腫、および腺癌を含み得る。がんまたは悪性腫瘍は、それらが発症する組織の型によって分類され得る。がんの広範な分割は、上皮組織から生じる癌腫、腫瘍、および全ての他の組織から生じる肉腫を分ける。上皮は、身体の内部または外部表面を覆う組織である。したがって、例えば、皮膚、口の内側、胃、腸、および膀胱は全て上皮組織である。
[0374]癌腫のカテゴリー内で、それらが由来し得る異なる上皮の型に相当する多くの細分があり得る。したがって、扁平上皮と呼ばれる上皮の型からなる皮膚は、扁平上皮癌を生じ得る。皮膚には他の上皮細胞も存在し、基底細胞は基底細胞癌を生じ、メラノサイトはメラノーマを生じ得る。
[0375]腺癌は、腺細胞に生じるがんである。腺癌は、肺において、気管支の小さい腺から；胃において、その内側のいくつかの型の腺の１つから、結腸、乳、卵巣、精巣、前立腺、肺および他の位置において生じ得る。異なる器官から生じる腺癌は、それらが転移した異なる位置、例えば肝臓から取られた場合でさえも、病理学者によって顕微鏡で同定されることが多い。したがって、それは肝臓に転移した胃の腺癌を指すか、または肺に転移した結腸からのものを指し得る。
[0376]本発明の化合物、医薬組成物、または単位剤形は、いずれの潜在的な毒性も最小にしながら最適な活性を得るため、通常の試験によって既定された適切な投与量で単独で投与され得る。
[0377]処置の投与量
[0378]本開示のＡＤＣの一日投与量は、様々な因子、例えば基礎疾患状態、個々の型、種、および健康状態、体重、性別、年齢、処置される状態の重症度；投与の経路；ならびに用いられるその特定の化合物によって変わり得る。当業者の医師または獣医師は、状態の進行を予防、対抗、または停止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定および処方することができる。毒性をもたらさずに有効性を生じる範囲内の薬物の濃度を達成する最適な処方は、標的部位への薬物の利用可能性の動力学に基づくレジメンを必要とし得る。これは、容易に定量される、薬物の吸収、分配、代謝、および排泄の検討を含み得る。
[0379]医薬組成物または単位剤形は、単回の一日量で投与されるか、または総一日投与量が１日２、３、または４回の分配用量で投与されてもよい。一部の実施形態において、投与レジメンの投与は、毎日、１日置き、３日置き、毎週、隔週、毎月、隔月、半年に１回、または年１回であり得る。
[0380]さらに、他の活性剤の共投与または順投与が望ましいことがある。１つより多くの活性剤による組合せ処置のため、活性剤は別の投与製剤中であり、活性剤は同時に投与されてもよく、またはそれぞれ時差で別々に投与されてもよい。投与量は、上記のように他の活性剤と組み合わせる場合、所望の効果を達成するため調整され得る。一方、これらの様々な活性剤の単位剤形は、独立して最適化され、組み合わせて、それぞれの活性剤が単独で使用された場合よりも病変が減少される相乗的な結果を達成し得る。
[0381]本開示により、投与は、少なくとも所定の処置ウィンドウ中、製剤の抗転移効果を持続するように、継続および定期的でなければならない。一部の実施形態において、投与は無期限に延長する。
[0382]本開示の製剤は、腫瘍発生の予防薬として診断前の任意の時点で投与され、好ましくは脾臓摘出後に転移を阻害する。本開示において、患者の寿命は、平均生存期間が８０日より長く、好ましくは、４００日より長く、最も好ましくは５００日より長く延長する。
[0383]本明細書で使用される場合、「寿命の延長」は、がんのみの予後を指し得る。
[0384]臨床的利点および使用
[0385]本開示は、がん、特に血管肉腫の最初の処置レジメンを提供する。本レジメンは、転移を阻害することにより動物の寿命を延長するだけでなく、がんと関連する腫瘍の再発に対する製剤としても使用され得る。さらに、本発明は、腫瘍退縮および正常な血液学的プロファイルを促進する。本明細書に開示のＡＤＳを含む組成物の投与により、動物は体重減少を経験せず、外皮の手触りが改善し得る。また、本明細書に開示のＡＤＣの投与は、神経学的な症状を伴わない。
６．９ 医薬組成物
[0386]本開示のＡＤＣは、一部の実施形態において、組成物（例えば、医薬組成物）に含まれ得る。本開示の医薬組成物は、医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含み得る。
[0387]本明細書で使用する用語「医薬組成物」は、医薬的に許容される担体によって製剤化される本明細書に記載のＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質を含有する組成物を指し、哺乳動物における疾患の処置のための治療レジメンの一部として政府規制機関の認可により製造または販売される。医薬組成物は、例えば、単位剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット、ゲルカップ、またはシロップ）での経口投与のため、局所投与のため（例えば、クリーム、ゲル、ローション、または軟膏として）、静脈内投与のため（例えば、粒状塞栓のない滅菌溶液としておよび静脈内使用に適した溶媒系で）、または本明細書に記載の任意の他の製剤で製剤化され得る。
[0388]本明細書で使用する用語「医薬的に許容される担体」は、それにより投与されるタンパク質の治療特性を保持しながら処置される哺乳動物（例えば、ヒト）に生理的に許容される担体を指す。１つの例示的な医薬的に許容される担体は、生理食塩水である。他の生理的に許容される担体およびそれらの製剤は当業者に公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に記載される。
[0389]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含有するＡＤＣを含有する医薬組成物は、一部の実施形態において、吸入可能剤形として、鼻腔内剤形として、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せとして、溶液、グリセロール中分散液、液体ポリエチレングリコール、および油中、固体剤形中のそれらの任意の組合せとして調製される。
[0390]医薬的に許容される賦形剤は、一部の例において、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８６）に記載の賦形剤である。好適な賦形剤の非限定的な例としては、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、潤滑剤、キレート剤、分散強化剤、崩壊剤、風味剤、甘味料、着色料が挙げられる。
[0391]一部の実施形態において、賦形剤は緩衝剤である。好適な緩衝剤の非限定的な例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸カルシウム、および炭酸水素カルシウムが挙げられる。緩衝剤としては、一部の実施形態において、本開示の医薬組成物において、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｇｌｕｃｏｍａｔｅ）、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、および他のカルシウム塩またはそれらの組合せが使用される。
[0392]一部の実施形態において、賦形剤は保存剤を含む。好適な保存剤の非限定的な例としては、抗酸化剤、例えばαトコフェロールおよびアスコルビン酸塩、ならびに抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、およびフェノールが挙げられる。一部の例において、抗酸化剤としては、限定はされないが、ＥＤＴＡ、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、ｐ－アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノールおよびＮ－アセチルシステインがさらに挙げられる。一部の例において、保存剤としては、バリダマイシンＡ、ＴＬ－３、オルトバナジウム酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、Ｎ－ａ－トシル－Ｐｈｅ－クロロメチルケトン、Ｎ－ａ－トシル－Ｌｙｓ－クロロメチルケトン、アプロチニン、フッ化フェニルメチルスルホニル、ジイソプロピルフルオロリン酸、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、グランザイム阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞分裂阻害剤、細胞周期阻害剤、脂質シグナル伝達阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗菌剤、オキシダーゼ阻害剤、または他の阻害剤が挙げられる。
[0393]一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、賦形剤として結合剤を含む。好適な結合剤の非限定的な例としては、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキサゾリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｏｘｏａｚｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール、Ｃ１２～Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴサッカリド、およびこれらの組合せが挙げられる。医薬製剤に使用される結合剤は、一部の例において、デンプン、例えばジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、コムギデンプン；糖、例えばスクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、マルトデキストリン；天然および合成ゴム；ゼラチン；セルロース誘導体、例えば結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース；ポリビニルピロリドン（ポビドン）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ワックス；炭酸カルシウム；リン酸カルシウム；アルコール、例えばソルビトール、キシリトール、マンニトール、および水またはこれらの任意の組合せから選択される。
[0394]一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、賦形剤として潤滑剤を含む。好適な潤滑剤の非限定的な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水添植物油、ステロテックス、モノステアリン酸ポリオキシエチレン、滑石、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムおよび軽油が挙げられる。医薬製剤に使用される潤滑剤は、一部の実施形態において、ステアリン酸金属塩類（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム）、脂肪酸エステル（例えば、フマル酸ステアリルナトリウム）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、脂肪アルコール、ベヘン酸グリセリル、鉱油、パラフィン、水添植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ラウリル硫酸金属塩類（ｍｅｔａｌｌｉｃ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ）（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム）、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および滑石またはこれらの組合せから選択される。
[0395]一部の実施形態において、医薬製剤は賦形剤として分散強化剤を含む。好適な分散剤の非限定的な例としては、一部の例において、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーゴム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート、および高ＨＬＢ乳化剤界面活性剤としての結晶セルロースが挙げられる。
[0396]一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、賦形剤として崩壊剤を含む。一部の実施形態において、崩壊剤は非起泡性崩壊剤である。好適な非起泡性崩壊剤の非限定的な例としては、デンプン、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、これらのアルファ化および修飾デンプン、甘味料、粘土、例えばベントナイト、結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ゴム、例えばカンテン、ガウア、イナゴマメ、カラヤ、ペシチン（ｐｅｃｉｔｉｎ）、およびトラガカントが挙げられる。一部の実施形態において、崩壊剤は起泡性崩壊剤である。好適な起泡性崩壊剤の非限定的な例としては、クエン酸と組み合わせた炭酸水素ナトリウムおよび酒石酸と組み合わせた炭酸水素ナトリウムが挙げられる。
[0397]一部の実施形態において、賦形剤は風味剤を含む。外層に組み込まれる風味剤は、一部の例において、合成風味油および風味香料；天然油；植物、葉、花および果物からの抽出物ならびにこれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、風味剤は、ケイヒ油；ウインターグリーン油；ハッカ油；クローバー油；干し草油；アニス油；ユーカリ；バニラ；柑橘類の油、例えばレモン油、オレンジ油、ブドウおよびグレープフルーツ油；ならびにリンゴ、モモ、セイヨウナシ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップルおよびアプリコットを含む果実エキスからなる群から選択され得る。
[0398]一部の実施形態において、賦形剤は、甘味料を含む。好適な甘味料の非限定的な例としては、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトースおよびこれらの混合物（担体として使用されない場合）；サッカリンおよびその様々な塩、例えばナトリウム塩；ジペプチド甘味料、例えばアスパルテーム；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリジン；ステビア（Ｓｔｅｖｉａ Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）（ステビオシド）；スクロースのクロロ誘導体、例えばスクラロース；および糖アルコール、例えばソルビトール、マンニトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）などが挙げられる。
[0399]一部の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、着色料を含む。好適な着色料の非限定的な例としては、食品、医薬品および化粧品色素（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品および化粧品色素（Ｄ＆Ｃ）、ならびに外用医薬品および化粧品色素（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。着色料は、染料またはこれらの対応するレーキとして使用され得る。
[0400]一部の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、キレート剤を含む。一部の場合、キレート剤は殺真菌性キレート剤である。例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＤＴＡ）；ＥＤＴＡの二ナトリウム、三ナトリウム、四ナトリウム、二カリウム、三カリウム、二リチウムおよび二アンモニウム塩；ＥＤＴＡのバリウム、カルシウム、コバルト、銅、ジスプロシウム、ユーロピウム、鉄、インジウム、ランタン、マグネシウム、マンガン、ニッケル、サマリウム、ストロンチウム、または亜鉛キレート；トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸一水和物；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン；１，３－ジアミノ－２－ヒドロキシプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；１，３－ジアミノプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸；エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二プロピオン酸二塩酸塩；エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（メチレンホスホン酸）半水和物；Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－三酢酸；エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（メチレンホスホン酸）；Ｏ，Ｏ’－ビス（２－アミノエチル）エチレングリコール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ－二酢酸；１，６－ヘキサメチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸；イミノ二酢酸；１，２－ジアミノプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸；ニトリロ三酢酸；ニトリロ三プロピオン酸；ニトリロトリス（メチレンホスホン酸（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ））の三ナトリウム塩；７，１９，３０－トリオキサ－１，４，１０，１３，１６，２２，２７，３３－オクタアザビシクロ［１１，１１，１１］ペンタトリアコンタンヘキサヒドロブロミド；またはトリエチレンテトラミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’－六酢酸。
[0401]また、本明細書で開示される抗ＴＭ４ＳＦ１抗体および１つまたは複数の他の抗菌剤または抗真菌剤、例えば、ポリエン、例えば、アンホテリシンＢ、アンホテリシンＢ脂質複合体（ＡＢＣＤ）、リポソーム型アンホテリシンＢ（Ｌ－ＡＭＢ）およびリポソーム型ナイスタチン、アゾールおよびトリアゾール、例えばボリコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール（ｐｏｚａｃｏｎａｚｏｌｅ）など；グルカンシンターゼ阻害剤、例えば、カスポファンギン、ミカファンギン（ＦＫ４６３）、およびＶ－エキノカンジン（ＬＹ３０３３６６）；グリセオフルビン；アリルアミン、例えば、テルビナフィン；フルシトシンまたは本明細書に記載されるそれらを含む他の抗真菌剤を含む組合せ製品が考えられる。さらに、ペプチドは、局所抗真菌剤、例えば、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ウンデシレン酸塩、局所ナイスタチン（ｎｙｓａｔｉｎ）、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィンおよび他の局所薬剤と組み合わされ得ると考えられる。一部の例において、医薬組成物は、さらなる薬剤を含む。一部の場合、さらなる薬剤は医薬組成物に治療有効量で存在する。
[0402]貯蔵および使用の通常の条件下で、本明細書に記載の医薬組成物は、保存剤を含み、微生物の増殖を防止する。特定の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、保存剤を含まない。注射可能な使用に好適な医薬品形態は、滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。医薬組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および／または植物油、またはこれらの任意の組合せを含有する溶媒または分散培地である担体を含む。良好な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合必要な粒子サイズの維持によって、ならびに界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが含まれる。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物での使用によってもたらされ得る。
[0403]水溶液での非経口投与のため、例えば、液体剤形は必要であれば好適に緩衝され、液体希釈剤は十分な生理食塩水またはグルコースによって等張にされる。液体剤形は、特に静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、および腹腔内投与に好適である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性培地は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１回の投与量は、特定の場合、１ｍＬ～２０ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、１００ｍＬ～１０００ｍＬの液体、例えば炭酸水素ナトリウム緩衝生理食塩水に添加されるか、注入の提案された部位で注射された。
[0404]特定の実施形態において、滅菌注射可能溶液は、免疫療法剤を、必要な場合、上記に列挙した様々な他の成分と適切な溶媒に必要な量で組み入れ、滅菌濾過することによって調製される。通常、分散液は様々な滅菌活性成分を、基本分散培地および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。本明細書で開示される組成物は、一部の例において、中性または塩形態に製剤化される。医薬的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基によって形成される）が挙げられ、それらは無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸など、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などによって形成される。遊離カルボキシル基によって形成された塩は、一部の場合、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムなど、または水酸化第二鉄、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどに由来する。製剤時、医薬組成物は、一部の実施形態において、投与製剤に対応した方法および治療に有効であるような量で投与される。
[0405]特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、医薬的に許容される担体と組み合わせて本明細書で開示される有効量の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含む。本明細書で使用する「医薬的に許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しないおよび／または投与される患者に毒性ではない任意の担体を含む。好適な医薬担体の非限定的な例としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば、油／水型エマルジョン、様々な型の湿潤剤および滅菌溶液が挙げられる。医薬的に適合する担体のさらなる非限定的な例としては、ゲル、生体吸収性マトリックス材、免疫療法剤または任意の他の好適なビヒクルを含有する移植エレメント、送達または分配手段または材料が挙げられ得る。そのような担体は、例えば従来の方法によって製剤化され、有効量で対象に投与される。
６．１０ 組合せ療法
[0406]特定の実施形態において、本開示の方法は、１つまたは複数のさらなる治療に続く、先行されるまたは組み合わせる、本明細書で開示されるＡＤＣを投与するステップを含む。さらなる治療の例としては、限定はされないが、化学療法、放射線、抗がん剤、またはこれらの任意の組合せが挙げられ得る。さらなる治療は、免疫療法の投与と同時にまたは順に投与され得る。特定の実施形態において、本開示の方法は、１つまたは複数の抗がん剤またはがん治療に続く、先行される、または組み合わせる本明細書で開示される免疫療法を投与するステップを含む。抗がん剤としては、限定はされないが、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、抗がん抗体、および／または抗サイクリン依存性キナーゼ剤が挙げられる。特定の実施形態において、がん治療としては、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、寒冷療法、毒物療法、および／または外科手術またはこれらの組合せが挙げられる。特定の実施形態において、本開示の方法は、１つまたは複数のさらなる免疫調節剤に続く、先行される、または組み合わせる本明細書で開示される免疫療法を投与するステップを含む。免疫調節剤としては、一部の例において、腫瘍またはがんと関連する抗ウイルス免疫を抑制することができる任意の化合物、分子または物質が挙げられる。さらなる免疫調節剤の非限定的な例としては、抗ＣＤ３３抗体またはこれらの可変領域、抗ＣＤ１１ｂ抗体またはこれらの可変領域、ＣＯＸ２阻害剤、例えばセレコキシブ、サイトカイン、例えばＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＦＮ３およびＩＦＮγ、ならびにケモカイン、例えばＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、およびＩＬ－８が挙げられる。
[0407]特定の例において、さらなる治療は例示的な放射線量が５，０００Ｒａｄｓ（５０Ｇｙ）～１００，０００Ｒａｄｓ（１０００Ｇｙ）、または５０，０００Ｒａｄｓ（５００Ｇｙ）、または記載した範囲内の他の適切な線量である。代わりに、例えば上記の線量測定試験によって決定された線量により、放射線量は約３０～６０Ｇｙ、約４０～約５０Ｇｙ、約４０～４８Ｇｙ、または約４４Ｇｙ、または記載した範囲内の他の適切な線量である。本明細書で使用する「Ｇｙ」は、１００Ｒａｄｓに等しい放射線の特定の吸収線量の単位を指し得る。Ｇｙは、「グレイ（Ｇｒａｙ）」の省略形である。
[0408]特定の例において、さらなる治療は化学療法であり、例示的な化学療法剤としては、限定されないが、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード誘導体、エチレンイミン、スルホン酸アルキル、ヒドラジンおよびトリアジン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ならびに金属塩）、植物アルカロイド（例えば、ベンカアルカロイド、タキサン、ポドフィロトキシン、およびカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）類似体）、抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン、クロモマイシンなど）、代謝拮抗薬（例えば、葉酸拮抗薬、ピリミジン拮抗薬、プリン拮抗薬、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤）、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、および種々の抗悪性腫瘍薬（例えば、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、副腎皮質ステロイド阻害剤、酵素、微小管阻害剤、およびレチノイド）が挙げられる。例示的な化学療法剤としては、限定はされないが、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、ブレオマイシン硫酸塩（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射剤（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４－ペントキシカルボニル－５－デオキシ－５－フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメガン（ｃｏｓｍｅｇａｎ））、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５－フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン（ｔｅｚａｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ－アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６－メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキセート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ－ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラント含有ポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６－チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用の塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、イブルチニブ、イデラリシブ、およびブレンツキシマブベドチンが挙げられ得る。
[0409]例示的なアルキル化剤としては、限定はされないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアおよびトリアゼン）：ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イフォスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスフォルアミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））、およびダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））が挙げられる。さらなる例示的なアルキル化剤としては、限定はされないが、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤとしても公知、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；メルファラン（Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタードとしても公知、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵとしても公知、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（ＣＤＤＰとしても公知、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミドとしても公知、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；イフォスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドニマスチン（Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ）；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチンおよび塩酸メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｍｉｎｅ）としても公知、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスファミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ）、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても公知、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；およびベンダムスチンＨＣｌ（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられる。
[0410]例示的なアントラサイクリンとしては、限定はされないが、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（Ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（塩酸ダウノルビシン（ｄａｕｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ダウノマイシン、および塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンが挙げられ得る。
[0411]例示的なビンカアルカロイドとしては、限定はされないが、酒石酸ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）））；ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢとしても公知、Ａｌｋａｂａｎ－ＡＱ（登録商標）およびＶｅｌｂａｎ（登録商標））；およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
[0412]例示的なプロテオソーム阻害剤としては、限定はされないが、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ－１７１－００７、（Ｓ）－４－メチル－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－４－メチル－１－（（Ｒ）－２－メチルオキシラン－２－イル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－１－オキソ－３－フェニルプロパン－２－イル）－２－（（Ｓ）－２－（２－モルホリノアセトアミド）－４－フェニルブタンアミド）－ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＩ－００５２）；クエン酸イキサゾミブ（ＭＬＮ－９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）；およびＯ－メチル－Ｎ－［（２－メチル－５－チアゾリル）カルボニル］－Ｌ－セリル－Ｏ－メチル－Ｎ－［（１Ｓ）－２－［（２Ｒ）－２－メチル－２－オキシラニル］－２－オキソ－１－（フェニルメチル）エチル］－Ｌ－セリンアミド（ＯＮＸ－０９１２）が挙げられ得る。
[0413]本明細書で使用する「と組み合わせて」は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体とさらなる治療が、処置レジメンまたは計画の一部として対象に投与されることを意味する。特定の実施形態において、組合せで使用されるステップは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体とさらなる治療が投与前に物理的に組み合わされるまたは同じ時間枠にわたって投与される必要がない。例えば、限定としてではなく、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体と１つまたは複数の薬剤は、処置される対象に同時に投与される、または同時にもしくは任意の順序でもしくは異なる時点で順に投与される。
６．１１ キット
[0414]一部の実施形態において、本開示は、本開示の組成物（例えば医薬組成物）（例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含有するＡＤＣを含む組成物）を含むキットを提供する。キットは、臨床医（例えば医師または看護師）がそこに含有される組成物を対象に投与し、病的血管新生（例えばがん）と関連する障害を処置することを可能にする説明書を含む。
[0415]特定の実施形態において、キットは、有効量の本開示の抗体を含有する単回用量の医薬組成物のパッケージを含む。任意選択により、医薬組成物を投与するステップに必要な器具または装置がキットに含まれ得る。例えば、本開示のキットは、本開示の有効量のワクチン、ベクター、安定化三量体、または最適化ウイルスポリペプチドを含有する１つまたは複数のプレフィルドシリンジを提供し得る。さらに、キットはさらなる構成成分、例えば、病的血管新生（例えばがん）と関連する障害を有する対象の投与スケジュールに関する説明書も含み、本開示のＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質またはポリヌクレオチドを含有する医薬組成物を使用し得る。
７．実施例
[0416]ペイロードとのコンジュゲーションのためのＮ２９７Ｃ突然変異を有するかまたは有さないＡ０７－ＹＴＥＣ抗体の安定性試験
[0417]Ａ０７－ＹＴＥＣへの部位特異的リンカーを使用するペイロードコンジュゲーションのため、抗体を、Ｎ２９７突然変異によって改変した。Ｎ２９７突然変異を有するＡ０７－ＹＴＥＣ抗体の安定性は、ＣＥ－ＳＤＳおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析によって評価した。ＣＥ－ＳＤＳ実験は、非還元条件下で実施した。試料を混合し、遠心分離し、図２Ａに示すように５分間９５℃で加熱した。各試料は、ゲルへの注入の前に室温まで冷却した。ＣＥ－ＳＤＳ解析の結果は図２Ａに示し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果は図２Ｂに示す。結果は、約４０～５０％のＡ０７－ＹＴＥＣ抗体が、重鎖内ジスルフィド結合せずに単量体抗体として結ばれていることを示し得る。
[0418]Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体への薬物のコンジュゲーションの特徴付け
[0419]Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体へのメイタンシンのコンジュゲーションは、それぞれＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ３００ ｍｍ ＳＥＣカラム、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＭａｂＰａｃ ＨＩＣ－ｂｕｔｙｌカラム、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓ ３００Ａカラム（２．１ｘ５０ｍｍ）、およびＡｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓ ３００Ａカラム（２．１ｘ５０ｍｍ）を使用して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図３）、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ（図４）、非還元逆相ＨＰＬＣ（図５）および還元逆相ＨＰＬＣ（図６）によって評価した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムは、図３に示したように、ペイロードとのコンジュゲーション後に１つの主要な単量体ピークを示したが、ＨＩＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムは、ペイロードとのコンジュゲーション後にシフトを示し、薬物負荷を示している（図４）。非還元逆相ＨＰＬＣおよび還元逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムは、それぞれ図５および図６に示すように、Ａ０７－ＹＴＥＣ抗体がペイロードとコンジュゲートされたことを示す。
[0420]抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物対抗体比（ＤＡＲ）の推定
[0421]Ａ０７－ＹＴＥＣ－ＭコンジュゲートのＤＡＲ値は、ＵＶ－ＶＩＳ分光法実験（表１および表２）およびインタクトＬＣ－ＭＳ実験（図７、図８Ａ～８Ｄ、および図９）によって推定された。ＵＶ－ＶＩＳ分光法を使用して、表１に示したように、ＡＤＣの吸光度、抗体および薬物の吸光係数を測定することによって平均ＤＡＲ値を決定した。インタクトＬＣ－ＭＳ解析では、同様に、生データを７０ｋＤａと１５０ｋＤａの質量範囲でデコンボリュートした（それぞれ、図７および図８）。Ａ０７－ＹＴＥＣ－ＭコンジュゲートのＤＡＲ推定を図９にまとめる。
[0422]Ａ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートのインビトロでの死滅活性
[0423]細胞死滅アッセイ。内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ＨＰＡＥＣ、ＡＨＥＣ、およびＡＭＶＥＣ－１）および腫瘍細胞（ＭｉａＰａｃａ２、Ａ５４９、ＳＫＯＶ３、およびＣｏｌｏ２０５）を、９６ウェル平底黒色マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、パート＃３９０４）に、アッセイ培地（ＨＵＶＥＣはＥＧＭ２完全培地；ＭｉａＰａｃａ２およびＡ５４９はＲＰＭＩ／１０％ ＦＢＳ）１００μｌ／ウェル中１００００個の細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞は、３７℃で終夜培養した。２日目に、Ａ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートを培養培地中で５倍に段階希釈し、１００μｌの希釈した化合物を細胞プレートに移した。細胞プレート中の試験Ａ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートの最終の最高濃度は３３３．３３５ｎＭであり、最低濃度は０．００４３ｎＭであった。細胞プレートは、５日間３７℃でインキュベートした。１０μｌのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ ＨＳ細胞生存試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｃａｔ＃Ｐ５０２０１）を各ウェルに添加し、プレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標） ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー）によって５７０ｍｍ／６００ｎｍ励起および発光での吸光度を読み取る前に、ＣＯ２インキュベーター内で１時間インキュベートした。結果は表３に示す。
[0424]*n.a. : 該当なし
[0425]インビボでの腫瘍退縮実験
[0426]簡潔に言うと、腫瘍細胞を８週齢のマウスの上脇腹に皮下注射し、ＭｉａＰａｃａ２腫瘍については、腫瘍容積が２００±５０ｍｍ３に達すると処置を開始した。マウス（群あたり５匹のマウス）に、６または１２ｍｇ／ｋｇの試験物質を１回注射により、腹腔内に投与し、腫瘍容積および体重を、腫瘍容積が１５００～２０００ｍｍ３に達するまで、週に２回測定した。腫瘍容積測定に使用した数学式は、（長さ×幅×高さ）／２である。結果は、両腫瘍について図１０に示す。
[0427]インビボ薬物動態実験
[0428]インビボでの抗体－薬物コンジュケートの薬物動態は、それぞれ図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、血漿濃度－時間プロファイル、および試験対象（サル）への抗体－薬物コンジュゲートの注射後の血漿中の総抗体量にわたるＡＤＣのパーセンテージを得ることによって評価した。最初の注射用量は４０ｍｐｋであった（体重のｋｇ当たりのＡＤＣのｍｇ）。
[0429]インビボでのカニクイザルにおけるＡ０７－ＹＴＥＣ－Ｍコンジュゲートの安定性試験
[0430]ＡＤＣのＬＣ－ＭＳ解析は、試験対象（カニクイザル）へのＡＤＣの注射後４日目、８日目、および１２日目に実施し、それぞれ図１４Ａ～１４Ｃに示すように、インビボでの抗体およびＡＤＣの安定性を評価した。結果は、メイシン分子がペイロードから欠失する図１３により、リンカー－ペイロードからのペイロード欠失のメカニズムを示唆する。メイシンは、メイタンシンの約１／１００００の効力を示した。
[0431]表４に記載する、例示的な抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。抗体は、化学コンジュゲーション法によって調製した。図１は、マレイミドコンジュゲーションハンドルを使用して、メイタンシンまたはその誘導体にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の構造を提供する。このメイタンシン－ＡＤＣは、表４の例示的な抗ＴＭ４ＳＦ１ ＡＧＸ－Ａ０７抗体を使用して生成され得る。メイタンシンまたはその誘導体にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の例は、マレイミドコンジュゲーションハンドル、２－ブロモアセトアミドコンジュゲーションハンドル、またはコンジュゲーションのためのＮＨＳエステルハンドルのいずれかを使用して合成され得る。
[0432]本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の組成物、方法、およびキットに様々な修正および変更がなされ得ることは当業者には明らかである。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内に入ることを条件に本開示の修正および変更をカバーすることを意図する。
[0433]本開示の好ましい実施形態が示され、本明細書に記載されるが、当業者にはそのような実施形態が例示のためだけに提供されることが明らかである。多くの変更、改変および置換が、ここで本開示から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。本明細書に記載の本開示の実施形態の様々な代替が本開示の実行に用いられ得ることが理解されるはずである。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによりカバーされることが意図される。

Claims (115)

  1. ｉ）抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント；および
    ｉｉ）チューブリン重合の阻害剤
    を含む、抗体薬物コンジュゲート。
  2. チューブリン重合の阻害剤がメイタンシンまたはその誘導体である、請求項０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  3. チューブリン重合の阻害剤がメイタンシンである、請求項０または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  4. 抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびチューブリン重合の阻害剤が、一段階または多段階プロトコールにおいてリンカーによってコンジュゲートされている、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  5. リンカーが、切断可能リンカー、切断不能リンカー、親水性リンカー、プロ荷電リンカー、またはジカルボン酸ベースのリンカーを含む、請求項４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  6. 切断可能リンカーが、切断可能な共有結合性または非共有結合性リンカーを含む、請求項５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  7. リンカーが、切断不能な共有結合性または非共有結合性リンカーを含む、請求項４から６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  8. 切断可能リンカーが、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、またはジスルフィド含有リンカーを含む、請求項５または６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  9. リンカーが、システインリンカーまたは非システインリンカーを含む、請求項４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  10. 非システインリンカーが、リジンリンカーを含む、請求項９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  11. リンカーが、ＭＣ（６－マレイミドカプロイル）、ＭＣＣ（マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ－ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、ｖａｌ－ａｌａ（バリン－アラニン）、ａｌａ－ｐｈｅ（アラニン－フェニルアラニン）、ＰＡＢ（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘキサノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－メチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘキサノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－メチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘプタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－エチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘプタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロプロピル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロブチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロペンチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロヘキシル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、ＳＭＣＣ（Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１ カルボキシレート）、またはＳＩＡＢ（Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート）を含む、請求項４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  12. リンカーが、架橋試薬に由来し、架橋試薬が、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ３－シクロプロピル－３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ３－シクロブチル－３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエート、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロプロピル－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロブチル－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタノエート、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロプロピル－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロブチル－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタノエート、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）－２－スルホ－ブタノエート（スルホ－ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル ヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）、または２，５－ジオキソピロリジン－１－イル １７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－５，８，１１，１４－テトラオキソ－４，７，１０，１３－テトラアザヘプタデカン－１－オエート（ＣＸ１－１）を含む、請求項４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  13. リンカーが、切断不能な共有結合性リンカーを含む、請求項４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  14. 切断不能な共有結合性リンカーが、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントのＮ末端、Ｃ末端または内部アミノ酸位置に接着されている、請求項１３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  15. 切断不能な共有結合性リンカーが、チューブリン重合の阻害剤に共有結合性に接着されている、請求項１３または１４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  16. 切断不能な共有結合性リンカーが、Ｎ、Ｏ、またはＳを含むヘテロ原子またはチューブリン重合の阻害剤の炭素原子に共有結合性に接着されている、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  17. 切断不能な共有結合性リンカーが、Ｃ１～Ｃ６アルキレン、アルケニレン、３～７員環を有するシクロアルキレン、アルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、Ｎ、ＯまたはＳの１～３原子を含む５～１２員環を有するヘテロシクレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｃ１～６アルキル）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、またはこれらの組合せを含み、Ｃ１～Ｃ６アルキレン、アルケニレン、３～７員環を有するシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびＮ、ＯまたはＳの１～３原子を含む５～１２員環を有するヘテロシクレンは、非置換であるかまたはハライド、アミノ、－ＣＦ３、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ３アルコキシ、Ｃ１～Ｃ３アルコキシ、またはＣ１～Ｃ３アルキルチオによって置換されている、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  18. 切断不能な共有結合性リンカーが、
    （式中、整数ｍは０～３であり、整数ｑは０～１２であり、整数ｒは１～３である）
    を含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  19. 切断不能な共有結合性リンカーが、
    （式中、各Ｙ１およびＹ２は、独立して結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１００であり；
    Ｒ１００は、独立してＨ、重水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり；Ｃ６～Ｃ１２アリール、５～１２員ヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル、または３～１２員複素脂環式基、またはＲ１００が結合される窒素と共にＲ１００および切断不能リンカーの別の原子、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント、またはチューブリン重合の阻害剤が組み合わされ、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１～３個のさらなるヘテロ原子を含有してもよい３～１２員複素脂環式または５～１２員ヘテロアリール基を形成し；
    整数ｍは０～３であり、整数ｑは０～１２であり、整数ｒは１～３である）
    を含む、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  20. 式（Ｉ）、その立体異性体または薬学的に許容される塩：
    （式中：
    Ｒ１は、－ＬＬ－ＡＡであり；
    ＬＬは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントとチューブリン重合の阻害剤との間のリンカーであり；
    ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
    を有する、請求項４から１９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  21. 式（ＩＩ）またはその薬学的に許容される塩：
    （式中：
    Ｒ１は、－ＬＬ－ＡＡであり；
    ＬＬは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントとチューブリン重合の阻害剤との間のリンカーであり；
    ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
    を有する、請求項２０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  22. 式（ＩＩＩ）またはその薬学的に許容される塩：
    （式中：
    整数ｎは、１～１２であり；
    Ｙは、ＭＣ（６－マレイミドカプロイル）、ＭＣＣ（マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ－ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、ｖａｌ－ａｌａ（バリン－アラニン）、ａｌａ－ｐｈｅ（アラニン－フェニルアラニン）、ＰＡＢ（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート）、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘキサノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－メチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘキサノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－メチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘプタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ５－エチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ヘプタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロプロピル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロブチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロペンチル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ４－シクロヘキシル－４－（ピリジン－２－イルチオ）ブタノエート、ＳＭＣＣ（Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１ カルボキシレート）、またはＳＩＡＢ（Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート）であり；
    ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
    を有する、請求項２０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  23. 式（ＩＶ）またはその薬学的に許容される塩：
    （式中：
    整数ｎは、１～７であり；
    ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
    を有する、請求項２０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  24. 式（Ｖ）またはその薬学的に許容される塩：
    （式中：
    ＡＡは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである）
    を有する、請求項２０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  25. 抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントの操作されたアミノ酸残基とチューブリン重合の阻害剤に接着したリンカーとの間に共有結合を含む、請求項２０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  26. 抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、改変されたＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、改変されたＩｇＧ Ｆｃ領域が野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数の置換を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  27. 野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域が、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項２６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  28. 野生型Ｆｃ領域がＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、Ｋａｂａｔに記載されるようにＥＵインデックスにより番号付けられた場合、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５０、Ｔ２５６、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｐ３３１、Ｍ４２８、Ｎ４３４からなる群から選択される１つまたは複数の位置における突然変異を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項２６または２７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  29. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＮ２９７位に突然変異をさらに含む、請求項２８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  30. Ｎ２９７位の突然変異がシステインである、請求項２９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  31. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＥ２３３位に突然変異を含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  32. Ｅ２３３位の突然変異がプロリンである、請求項３１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  33. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＬ２３４位に突然変異を含む、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  34. Ｌ２３４位の突然変異がアラニンである、請求項３３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  35. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＬ２３５位に突然変異を含む、請求項２８から３４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  36. Ｌ２３５位の突然変異がアラニンである、請求項３５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  37. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＧ２３７位に突然変異を含む、請求項２８から３６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  38. Ｇ２３７位の突然変異がアラニンである、請求項３７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  39. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＭ２５２位に突然変異を含む、請求項２８から３８のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  40. Ｍ２５２位の突然変異がチロシンである、請求項３９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  41. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＳ２５４位に突然変異を含む、請求項２８から４０のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  42. Ｓ２５４位の突然変異がスレオニンである、請求項４１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  43. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＴ２５６位に突然変異を含む、請求項２８から４２のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  44. Ｔ２５６位の突然変異がグルタミン酸である、請求項４３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  45. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＭ４２８位に突然変異を含む、請求項２８から４４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  46. Ｍ４２８位の突然変異がロイシンである、請求項４５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  47. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＮ４３４位に突然変異を含む、請求項２８から４６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  48. Ｎ４３４位の突然変異がセリンまたはアラニンである、請求項４７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  49. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＴ２５０位に突然変異を含む、請求項２８から４８のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  50. Ｔ２５０位の突然変異がグルタミンである、請求項４９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  51. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＤ２６５位に突然変異を含む、請求項２８から５０のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  52. Ｄ２６５位の突然変異がアラニンである、請求項５１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  53. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＫ３２２位に突然変異を含む、請求項２８から５２のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  54. Ｋ３２２位の突然変異がアラニンである、請求項５３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  55. 改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＰ３３１位に突然変異を含む、請求項２８から５４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  56. Ｐ３３１位の突然変異がグリシンである、請求項５５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  57. 野生型Ｆｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｋａｂａｔに記載されるようにＥＵインデックスにより番号付けられた場合、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｆ２４３、Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｅ２５８、Ｄ２５９、Ｖ２６４、Ｄ２６５、Ｋ２８８、Ｔ２９９、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｑ３１１、Ｋ３２２、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｔ３５６、Ｋ３７０、Ａ３７８、Ｒ４０９、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５からなる群から選択される１つまたは複数の位置における突然変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む、請求項２６または２７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  58. Ｋ４４７位の後の１つまたは複数のアミノ酸残基が、独立して、リジン、プロリン、アルギニン、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項０から２５、または５７のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  59. Ｋ４４７位の後の１つまたは複数のアミノ酸残基が、独立して、リジンおよびプロリンからなる群から選択される、請求項５８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  60. 改変されたＩｇＧ Ｆｃ領域が、Ｓ２２８位に突然変異を含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  61. Ｓ２２８位の突然変異がＳ２２８Ｐを含む、請求項６０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  62. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｆ２３４位に突然変異を含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  63. Ｆ２３４位の突然変異がＦ２３４Ａを含む、請求項６２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  64. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｌ２３５位に突然変異を含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  65. Ｌ２３５位の突然変異がＬ２３５Ｅを含む、請求項６４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  66. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  67. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、およびＮ２９７Ｃを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  68. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＮ２９７Ｃを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  69. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  70. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｌ２３５およびＦ２３４位に突然変異を含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  71. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｌ３２８、Ａ３３０、およびＴ２９９位に突然変異を含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  72. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、およびＰ２３８Ｓを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  73. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  74. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ａを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  75. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｍ２５２ＹおよびＭ４２８Ｌ；Ｄ２５９ＩおよびＶ３０８Ｆ；またはＮ４３４Ｓを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  76. 改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域が、Ｔ３０７ＱおよびＮ４３４Ｓ；Ｍ４２８ＬおよびＶ３０８Ｆ；Ｑ３１１ＶおよびＮ４３４Ｓ；Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ；Ｅ２５８ＦおよびＶ４２７Ｔ；またはＴ２５６Ｄ、Ｑ３１１Ｖ、およびＡ３７８Ｖを含む、請求項５７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  77. 抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    ａ．配列番号８、２０、３２、４４、５６、６８、８０、９６、１１８、１１９、１２０、または１２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；配列番号７、１９、３１、４３、５５、６７、７９、９５、１１６、または１１７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；および配列番号６、１８、３０、４２、５４、６６、７８、９４、または１１５からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖；ならびに
    ｂ．配列番号１４、２６、３８、５０、６２、７４、８６、１１０、または１２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン；配列番号１３、２５、３７、４９、６１、７３、８５、１０９、または１２８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン；および配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、または８４、１０７、１０８、１２４、１２５、１２６、または１２７からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖
    を含む、請求項０から７６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  78. 重鎖が、配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、９０、９２、１１２、１１４、１３０、または１３２に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９７、９９、１０１、１２２、１３１、または１３３に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  79. 重鎖が、配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、９０、９２、１１２、１１４、１３０、または１３２に記載の配列を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９７、９９、１０１、１２２、１３１、または１３３に記載の配列を含む、請求項７８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  80. 重鎖が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  81. 重鎖が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  82. 重鎖が、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  83. 重鎖が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  84. 重鎖が、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  85. 重鎖が、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号６７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  86. 重鎖が、配列番号８０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  87. 重鎖が、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号１１１または配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０７または配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  88. 重鎖が、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  89. 重鎖が、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  90. 重鎖が、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号１１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  91. 重鎖が、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号１１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  92. 重鎖が、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１２４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  93. 重鎖が、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、または配列番号１２１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１６または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、軽鎖が、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、または配列番号１２７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  94. 抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨＨ、またはｓｃＦｖを含む、請求項０から９３のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  95. チューブリン重合の阻害剤またはその誘導体が、リソソーム内移行によって無力であるように構成されている、請求項１から９４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  96. チューブリン重合の阻害剤またはその誘導体が、核内移行後に効力があるように構成されている、請求項９５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  97. チューブリン重合の阻害剤またはその誘導体が、リソソーム内で分解されるように構成されている、請求項９５または９６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  98. チューブリン重合の阻害剤またはその誘導体が、リソソーム内に閉じ込められるように構成されている、請求項９５または９６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  99. 請求項０から９８のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  100. 対象における疾患または障害を処置または予防する方法であって、疾患が、異常な内皮細胞（ＥＣ）相互作用を特徴とし、請求項９９に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
  101. ＥＣ細胞相互作用が、ＥＣ－間葉幹細胞、ＥＣ－線維芽細胞、ＥＣ－平滑筋細胞、ＥＣ－腫瘍細胞、ＥＣ－白血球、ＥＣ－脂肪細胞、およびＥＣ－神経細胞相互作用の１つまたは複数を含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 疾患または障害が、炎症性疾患またはがんを含む、請求項１００または１０１に記載の方法。
  103. 対象における炎症を処置または予防する方法であって、請求項９９に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
  104. 対象における転移を処置または予防する方法であって、請求項９９に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、対象が、がんからの部分または完全寛解にある、方法。
  105. 高い転移リスクを伴うがんを有する対象を処置する方法であって、請求項９９に記載の医薬組成物を、高い転移リスクを伴うがんを有する対象に投与するステップを含む、方法。
  106. がんを有する対象における転移を処置または予防する方法であって、請求項９９に記載の医薬組成物を、がんを有する対象に投与するステップを含む、方法。
  107. 対象が、転移を誘発する可能性がある処置を受けている、請求項１０４から１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 処置が、外科手術、放射線処置または化学療法を含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. 対象が哺乳動物である、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載の方法。
  110. 対象が、ヒトである、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載の方法。
  111. がんが、癌腫または肉腫である、請求項１０２および請求項１０４から１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 癌腫が、乳がん、肺がん、結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、または卵巣がんを含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 肉腫が、血管肉腫、骨肉腫または軟部組織肉腫を含む、請求項１１１に記載の方法。
  114. がんが、膠芽腫である、請求項１０２および請求項１０４から１１０のいずれか一項に記載の方法。
  115. ヒト対象におけるリンパまたは血行性転移を処置または予防する方法であって、請求項９９に記載の医薬組成物をヒト対象に投与するステップを含む、方法。
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