TW201914616A - 抗gd3抗體及抗體-藥物結合物 - Google Patents

抗gd3抗體及抗體-藥物結合物 Download PDF

Info

Publication number
TW201914616A
TW201914616A TW107125168A TW107125168A TW201914616A TW 201914616 A TW201914616 A TW 201914616A TW 107125168 A TW107125168 A TW 107125168A TW 107125168 A TW107125168 A TW 107125168A TW 201914616 A TW201914616 A TW 201914616A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
adc
days
seq
antigen
Prior art date
Application number
TW107125168A
Other languages
English (en)
Inventor
費柯 米亞拉
達恩文斯里 Ｓ 迪維
利烏米拉 奇斯蒂亞科芙
米歇爾 麥德
軼潔 郜
保羅 恰曼
戈文德 拉古帕契
Original Assignee
美商輝瑞大藥廠
紀念斯隆凱特林癌症中心
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商輝瑞大藥廠, 紀念斯隆凱特林癌症中心 filed Critical 美商輝瑞大藥廠
Publication of TW201914616A publication Critical patent/TW201914616A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明提供抗GD3抗體及ADC以及其製備與使用方法。

Description

抗GD3抗體及抗體-藥物結合物
本發明係關於神經節苷脂GD3 (GD3)抗體及抗體-藥物結合物(ADC)。本發明另外係關於使用此類抗體及ADC治療癌症之方法。
鞘醣脂促成包圍所有真核細胞之糖蛋白-多糖(糖萼)覆蓋(連同其他糖蛋白及葡糖胺聚糖) 鞘醣脂為含有鞘胺基醇受質及一或多種糖殘餘物的脂。神經節苷脂(諸如GD3)由鞘醣脂(腦醯胺及寡醣)構成，其中一或多種唾液酸呈存在於糖鏈於上(Kolter，2012，ISRN Biochem:506160)。GD3由以下化學結構定義：Neu5Acα2、8NeuAcα2、3Galβ1、4Glcβ1Cer (Haji-Ghassemi等人，2015, 25(9):920-952)。此等化學結構在進化過程中跨物種保存(Irvine及Seyfried, 1994, Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 109(4):603-612; Variki, 2011, Cold Spring Harb Perspect Biol 3(6):a005462)。
GD3發現於跨物種多個組織中，包括小鼠、大鼠、狗、猴、人及其他哺乳動物((Helfand等人，1999, Cancer Res 59(13):3119-3127；Kasahara等人，1997, J Biol Chem 272(47):29947-29953)。細胞表面GD3以及其他神經節苷脂在脊椎動物之胚胎發生期間表現於神經脊譜系之細胞上，且最終經歷表現量在整個發育期間的根本變化(Kasahara 等人，1997)。當神經元細胞主動激增時，GD3在早期發育階段內高度表現於中樞神經系統內(Popa等人，2007, Glycobiology 17(4):367-373; Nagai & Iwamori, 1995, Biology of the sialic acids, 197-241)。在較遲的發育階段，GD3表現減少且其他神經節苷脂成為顯示於細胞上之主要物質(Seyfried及Yu, 1985, Mol Cell Biochem 68:3-10)。GD3以較低量表現於正常成人組織中，包括黑色素細胞、腎上腺髓質、胰腺胰島細胞、星形膠質細胞及角質細胞與T淋巴細胞之亞群(Graus等人，1984, Brain Research 324:190-194；Real等人，1985, Cancer Research 45:4401；Garin-Chesa等人，1989, American Journal of Pathology 134:2)。
與正常成人組織相對比，GD3高度表現於某些腫瘤細胞上(Hakomori & Kannagi, 1983, Natl Cancer Inst 71(2):231-251；Portoukalian等人，1991, Int J Cancer 2:49(6):893-899)，且其增加之表現可透過對細胞遷移、黏附、增殖及分化之效應而促成腫瘤發生(Daniotti等人，2002, Neurochem Res 27(11):1421-1429；Birkle等人，2003, Biochimie 85:455-463)。報導61個人類黑色素瘤腫瘤中有58個GD3表現，包括8個肝轉移性病變中的7個(Real等人，1985, Cancer Research 45:4401)。來自原發性腫瘤之人類黑色素瘤細胞GD3表現較高量，而不考慮其BRAF突變狀態(Tringali等人，2014, BMC Cancer 14:560)。GD3亦過度表現於神經外胚層腫瘤(例如神經母細胞瘤及神經膠質瘤)中(Campanella, 1992, J Neurosurg Sci 36(1):11-25；Hedberg等人，2000, Glycoconj J 17(10):717-726；Hedberg等人，2001, Neuropathol Appl Neurobiol 27(6):451-64)、軟組織肉瘤(Chang等人，1992, Cancer 70(3):633-638)及癌瘤，包括小細胞肺癌(Spitalnik等人，1986, Cancer Res 46(9):4751-4755；Brezicka等人，2000, Lung Cancer 28(1):29-36)、肺癌(Marquina等人，1996, Cancer Res 56(22):5165-5171)、結腸肺癌、胰臟肺癌(Fredman等人，1983, 61(1):45-48)、前列腺肺癌(Fabbri 等人，2011, J Cell Physiol 226(11):3035-3042)及卵巢肺癌(Lo等人，2010, Clin Cancer Res 16(10):2769-2680)。此外，GD3表現經證明係存在於T細胞急性淋巴母細胞白血病上，而不存在於其他非T細胞淋巴細胞惡性病上(Reaman等人，1990, Cancer Res 50(1):202-205)。
仍存在對於癌症之其他治療選項之大量需求。為此目的，本發明提供目標為GD3表現癌症的新穎抗體及ADC。
本發明提供特異性結合於GD3之抗體(及其抗原結合片段)及抗體-藥物結合物，以及其用途及相關聯方法。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明之具體實施例的許多等效物。此類等效物意欲由以下實施例(E)涵蓋。 E1. 一種抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於GD3。 E2. 如E1之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO: 1之重鏈可變區互補決定區1 (CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3序列。 E3. 如E1或E2之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區(VH)包含： (a)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的VH CDR-H1, (b)包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的VH CDR-H2，及 (c)包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之VH CDR-H3。 E4. 如E1至E3之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區(VH)包含： (a)包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的VH CDR-H1， (b)包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的VH CDR-H2，及 (c)包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之VH CDR-H3。 E5. 如E1至E4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH生殖系共同構架序列。 E6. 如E1至E5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含衍生自選自由以下組成之群之人類生殖系VH序列的VH構架序列：DP54、DP-50、IGHV3-30*09、IGHV3-30*15、IGHV3-48*01、DP-77、DP-51、IGHV3-66*01、DP-53、DP-48、IGHV3-53*01、IGHV3-30*02及DP-49。 E7. 如E1至E6中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該VH構架序列與其所衍生自之人類生殖系構架序列有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。 E8. 如E1至E7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含衍生自人類生殖系DP54序列之VH構架序列。 E9. 如E1至E8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH構架序列，其中根據SEQ ID NO: 1之編號，VH結構域之位置74處之殘基為脯胺酸胺基酸殘基。 E10. 如實施例E1至E9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH，該VH包含與SEQ ID NO: 1至少90%一致的胺基酸序列。 E11. 如實施例E1至E10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH，該VH包含與SEQ ID NO: 1至少90%一致的胺基酸序列，其中，根據SEQ ID NO: 1之編號，位置1處之胺基酸殘基為麩胺酸，位置11處之胺基酸殘基為白胺酸，位置16處之胺基酸殘基為甘胺酸，位置74處之胺基酸殘基為脯胺酸，位置77處之胺基酸殘基為絲胺酸，位置93處之胺基酸殘基為丙胺酸，且位置108處之胺基酸殘基為白胺酸。 E12. 如實施例E1至E11中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含構架序列與SEQ ID NO: 1之構架序列有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的VH。 E13. 如實施例E1至E12中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含構架序列與SEQ ID NO: 1之構架序列有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的VH，且其中，根據SEQ ID NO: 1之編號，位置1處之胺基酸殘基為麩胺酸，位置11處之胺基酸殘基為白胺酸，位置16處之胺基酸殘基為甘胺酸，位置74處之胺基酸殘基為脯胺酸，位置77處之胺基酸殘基為絲胺酸，位置93處之胺基酸殘基為丙胺酸，且位置108處之胺基酸殘基為白胺酸。 E14. 如實施例E1至E13中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH，該VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。 E15. 如E1至E14中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO: 9之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。 E16. 如E1至E15中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區(VL)包含： (a)包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之VL互補決定區1 (CDR-L1)， (b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的VL CDR-L2，及 (c)包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的VL CDR-L3。 E17. 如E1至E16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區(VL)包含： (a)包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的VL CDR-L1，及 (b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的VL CDR-L2，及 (c)包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的VL CDR-L3。 E18. 如E1至E17中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL生殖系共同構架序列。 E19. 如E1至E18中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中VL構架序列與其所衍生自之人類生殖系構架序列有至少98%、至少99%或100%一致。 E20. 如E1至E19中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之VL構架序列：DPK9、 DPK5、DPK4、DPK1、IGKV1-5*01、DPK24、DPK21、DPK15、IGKV1-13*02、IGKV1-17*01、DPK8、IGKV3-11*01及DPK22。 E21. 如E1至E20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之VL構架序列：DPK9、DPK5、DPK4、DPK1及IGKV1-5*01。 E22. 如E1至E21中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含衍生自人類生殖系DPK9序列之VL構架序列。 E23. 如E1至E22中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL構架序列，其中根據SEQ ID NO: 9之編號，VL結構域之位置65處之殘基為色胺酸胺基酸殘基。 E24. 如E1至E23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL，該VL包含與SEQ ID NO: 9至少90%一致的胺基酸序列。 E25. 如實施例E1至E24中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL，該VL包含與SEQ ID NO: 9至少90%一致的胺基酸序列，其中根據SEQ ID NO: 9之編號，位置65處之胺基酸殘基為色胺酸，且位置71處之胺基酸殘基為苯丙胺酸。 E26. 如實施例E1至E25中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含構架序列與SEQ ID NO: 9之構架序列有至少66%、74%、76%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之VL。 E27. 如實施例E1至E26中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含構架序列與SEQ ID NO: 9之構架序列有至少66%、74%、76%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的VH，且其中根據SEQ ID NO: 9之編號，位置65處之胺基酸殘基為色胺酸，且位置71處之胺基酸殘基為苯丙胺酸。 E28. 如實施例E1至E27中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含構架序列與SEQ ID NO: 9之構架序列有至少96%、97%、98%或99%一致的VL。 E29. 如實施例E1至E28中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL，該VL包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。 E30. 一種特異性結合GD3之分離抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO: 1之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列，及SEQ ID NO: 9之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。 E31. 一種特異性結合GD3之分離抗體或其抗原結合片段，其包含： (i) VH，其包含： (a)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之CDR-H1， (b)包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之CDR-H2，及 (c)包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之CDR-H3； 及(ii) VL，其包含： (a)包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之CDR-L1， (b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之CDR-L2，及 (c)包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之CDR-L3。 E32. 一種特異性結合GD3之分離抗體或其抗原結合片段，其包含： (i) VH，其包含： (a)包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之CDR-H1， (b)包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之CDR-H2，及 (c)包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之CDR-H3； 及(ii) VL，其包含： (a)包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之CDR-L1， (b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之CDR-L2，及 (c)包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之CDR-L3。 E33. 如E1至E32中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。 E34. 如E33之抗體或其抗原結合片段，其中Fc結構域為IgA、IgD、IgE、IgM或IgG之Fc結構域。 E35. 如E34之抗體或其抗原結合片段，其中Fc結構域為IgG之Fc結構域。 E36. 如E35之抗體或其抗原結合片段，其中IgG係選自由以下組成之群：IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 。 E37. 如E36之抗體或其抗原結合片段，其中IgG為IgG1 。 E38. 如實施例E33至E37中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含HC，該HC包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。 E39. 如實施例E33至E38中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含LC，該LC包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。 E40. 如E1至E39中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含藉由寄存在ATCC處且ATCC寄存編號為PTA-124057之質體編碼VH胺基酸序列。 E41. 如E1至E39中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含藉由寄存在ATCC處且ATCC寄存編號為PTA-124058之質體編碼之VL胺基酸序列。 E42. 如E1至E41中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段為Fc融合蛋白、單功能抗體、最大抗體、雙功能抗體、scFab、scFv或肽體。 E43. 如E1至E42中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段與溶酶體標記物之類似性得分為大致0.8。 E44. 一種抗體或其抗原結合片段，其與如E1至E43中任一項之抗體或其抗原結合片段為結合於GD3而進行競爭。 E45. 一種經分離核酸分子，其編碼如E1至E44中任一項之抗體或其抗原結合片段。 E46. 一種經分離核酸分子，其包含如SEQ ID NO: 8所闡述或與其至少95%一致的核酸序列。 E47. 一種經分離核酸分子，其包含如SEQ ID NO: 15所闡述或與其至少95%一致的核酸序列。 E48. 一種經分離核酸分子，其包含以ATCC寄存且寄存編號為PTA-124057的質體之核酸插入物的編碼序列。 E49. 一種經分離核酸分子，其包含以ATCC寄存且寄存編號為PTA-124058的質體之核酸插入物的編碼序列。 E50. 一種載體，其包含如E45至E49中任一項之核酸分子。 E51. 一種宿主細胞，其包含如E45至E50中任一項之核酸分子或如E50之載體。 E52. 如E51之宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。 E53. 如E52之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞、HEK-293細胞或Sp2.0細胞。 E54. 一種製造抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在其中該抗體或抗原結合片段由該宿主細胞表現之條件下培養如E51至E53之宿主細胞。 E55. 如E54之方法，其進一步包含分離該抗體或其抗原結合片段。 E56. 如E1至E44中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中小鼠中之晚期血漿半衰期為以下中之至少一者或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天、約8.5天、約9天、約9.5天、約10天、約10.5天及約10.9天。 E57. 如E1至E44及E56中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中小鼠中之晚期血漿半衰期為至少10.6天或10.9天。 E58. 如E1至E44及E56至E57中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中大鼠中之晚期血漿半衰期為以下中之至少一者或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天、約8.5天、約9天、約9.5天、約10天、約10.5天、約11天、約11.5天、約12天、約12.5天、約13天、約13.5天及約13.7天。 E59. 如E1至E44及E56至E58中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中大鼠中之晚期血漿半衰期為至少12.3天或13.7天。 E60. 如E1至E44及E56至E59中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中食蟹猴中之晚期血漿半衰期為以下中之至少一者或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天、約8.5天、約9天、約9.5天、約10天、約10.5天、約11天、約11.5天、約12天、約12.5天、約13天、約13.5天、約14天、約14.5天、約15天、約15.5天及約16天。 E61. 如E1至E44及E56至E60中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中食蟹猴中之晚期血漿半衰期為至少10.8天、13天或16天。 E62. 如E1至E44及E56至E61中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中人類中之晚期血漿半衰期為以下中之至少一者或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天及約7天。 E63. 如E1至E44及E56至E62中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中人類中之晚期血漿半衰期為至少7天。 E64. 一種醫藥組合物，其包含如E1至E63中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 E65. 一種治療與GD3細胞表面表現相關之疾病或病症或與GD3經升高活性水平相關之病症的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如實施例E1至E63中任一項之抗體或其抗原結合片段或如E64之醫藥組合物。 E66. 如E65之方法，其包含向有需要之個體投與0.5 mg/kg之如實施例E1至E63中任一項之抗體或其抗原結合片段或如E64之醫藥組合物。 E67. 如E65或E66之方法，其中該疾病或病症為黑色素瘤、乳癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤或肺癌。 E68. 如E65至E67中任一項之方法，其包含經靜脈內投與該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物。 E69. 如E65至E68中任一項之方法，其中約一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、每月兩次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次或每四個月一次投與該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物。 E70. 如E1至E63中任一項之抗體或其抗原結合片段或如E64之醫藥組合物，其適用作藥劑。 E71. 一種式Ab-(L-D)p 之抗體-藥物結合物(ADC)，其中： (a) Ab為特異性結合GD3之抗體或其抗原結合片段； (b) L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物； (c)p 為約1至12之整數。 E72. 如E71之ADC，其中p為1。 E73. 如E71之ADC，其中p為2。 E74. 如E71之ADC，其中p為3。 E75. 如E71之ADC，其中p為4。 E76. 如E71之ADC，其中p為5。 E77. 如E71之ADC，其中p為6。 E78. 如E71之ADC，其中p為7。 E79. 如E71之ADC，其中p為8。 E80. 如E71之ADC，其中p為9。 E81. 如E71之ADC，其中p為10。 E82. 如E71之ADC，其中p為11。 E83. 如E71之ADC，其中p為12。 E84. 如E71至E83中任一項之ADC，其中抗體或其抗原結合片段為如E1至E52或E70中任一項之抗體或其抗原結合片段。 E85. 如E71至E84中任一項之ADC，其中該連接子係穩定或可水解的。 E86. 如E71至E85中任一項之ADC，其中該連接子包含腙連接子、二硫化物連接子或基於肽之連接子。 E87. 如E71至E86中任一項之ADC，其中連接子包含具有式(CO-Alk1 -Sp1 -Ar-Sp2 -Alk2 -C(Z1 )=Q-Sp)之連接子，其中： (a) Alk1 及Alk2 獨立地為鍵或分支鏈或未分支(C1 -C10 )伸烷基鏈； (b) Sp1 為鍵、—S—、—O—、—CONH—、—NHCO—、—NR'—、—N(CH2 CH2 )2 N—或—X—Ar'—Y—(CH2 )n —Z，其中X、Y及Z獨立地為鍵、—NR'—、—S—或—O—，其限制條件為當n=0時，則Y及Z中之至少一者必須為鍵，且Ar'為視情況經(C1 -C5 )烷基、(C1 -C4 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或=S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之1,2-、1,3-或1,4-伸苯基，其限制條件為當Alk'為鍵時，Sp1 為鍵；n為0至5之整數；R'為視情況由—OH、(C1 -C4 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、(C1 -C3 )二烷胺基或(C1 -C3 )三烷基銨-A− 中之一或兩個基團取代之分支鏈或未分支(C1 -C5 )鏈，其中A− 為與鹽競爭之醫藥學上可接受之陰離子； (c) Ar為視情況經(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之1,2-、1,3-或1,4-伸苯基，其中n及R'係如上文所定義或1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-、或2,7-伸萘基或其中每一伸萘基或吩噻嗪視情況經(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個、三個或四個基團取代，其中n及R'係如上文所定義，其限制條件為當Ar為吩噻嗪時，Sp1 為僅連接至氮之鍵； (d) Sp2 為鍵、—S—或—O—，其限制條件為當Alk2 為鍵時，Sp2 為鍵， (e) Z1 為H、(C1 -C5 )烷基或視情況經(C1 -C5 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—ONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之苯基，其中n及R'係如上文所定義； (f) Sp為直鏈或分支鏈二價或三價(C1 -C18 )基團、二價或三價芳基或雜芳基、二價或三價(C3 -C18 )環烷基或雜環烷基、二價或三價芳基-或雜芳基-芳基(C1 -C18 )基團、二價或三價環烷基-或雜環烷基-烷基(C1 -C18 )基團或二價或三價(C2 -C18 )不飽和烷基，其中雜芳基較佳為呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、N-甲基咔唑基、胺基香豆素基或吩嗪基，且其中若Sp為三價基團，則Sp可另外經以下取代：低碳(C1 -C5 )二烷胺基、低碳(C1 -C5 )烷氧基、羥基或低碳(C1 -C5 )烷硫基；及 (g) Q為NHNCO—、=NHNCS—、=NHNCONH—、=NHNCSNH—或=NHO—。 E88. 如E71至E87中任一項之ADC，其中： (a) Alk1 為分支鏈或未分支(C1 -C10 )伸烷基鏈；Sp'為鍵、—S—、—O—、—CONH—、—NHCO—或—NR'，其中R'係如上文所定義，其限制條件為當Alk'為鍵時，Sp1 為鍵； (b) Ar為視情況經(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之1,2-、1,3-或1,4-伸苯基，其中n及 R'係如上文所定義，或Ar為1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-伸萘基，其各自視情況經(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個、三個或四個基團取代。 (c) Z1 為(C1 -C5 )烷基或視情況經(C1 -C5 )烷基、(C1 -C4 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之苯基；及 (d)Alk2 及Sp2 共同為鍵。 E89. 如E71至E88中任一項之ADC，其中連接子包含馬來醯亞胺己酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基連接子(mcValCitPABC)、4-(4-乙醯基苯氧基)丁酸、(3-乙醯基苯基)乙酸、4-巰基-4-甲基-戊酸、纈胺酸-瓜胺酸、苯丙胺酸-離胺酸連接子、磺酸基丁二醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸酯、順丁烯二醯亞胺基己醯基、二伸乙基三胺五乙酸酯-異硫氰酸酯、6-肼鎓菸鹼酸丁二醯亞胺酯鹽酸鹽或六甲基丙二胺肟。 E90. 如E71至E89中任一項之ADC，其中連接子包含mcValCitPABC。 E91. 如E71至E90中任一項之ADC，其中藥物包含治療劑、可偵測標記或結合劑。 E92. 如E71至E91中任一項之ADC，其中藥物對癌細胞或經活化免疫細胞起細胞毒性、細胞生長抑制及/或免疫調節作用。 E93. 如E71至E92中任一項之ADC，其中藥物係選自由以下組成之群：細胞毒性劑、化學治療劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、抗增殖劑、促凋亡劑及免疫調節劑。 E94. 如E71至E93中任一項之ADC，其中藥物為選自由以下組成之群的藥物：蒽環黴素(anthracycline)、奧瑞他汀(auristatin)、CC-1065、海兔毒素(dolastatin)、倍癌黴素(duocarmycin)、烯二炔、格爾德黴素(geldanamycin)、美登素(maytansine)、嘌呤黴素(puromycin)、紫杉烷(taxane)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、SN-38、特吡萊辛(tubulysin)、哈米特林(hemiasterlin)及其立體異構體、電子等排物、類似物或衍生物。 E95. 如E71至E94中任一項之ADC，其中奧瑞他汀係選自由以下組成之群：奧瑞他汀0101、奧瑞他汀D、奧瑞他汀E、奧瑞他汀EB、奧瑞他汀EFP、單甲基奧瑞他汀D、單甲基奧瑞他汀F及5-苯甲醯基戊酸-奧瑞他汀E。 E96. 如E71至E95中任一項之ADC，其中藥物為奧瑞他汀0101。 E97. 如E71至E96中任一項之ADC，其中連接子為mcValCitPABC且藥物為奧瑞他汀0101。 E98. 如E71至E97中任一項之ADC，其中抗體或其抗原結合片段為如E1至E47中任一項之抗體或其抗原結合片段，連接子為mcValCitPABC，且藥物為奧瑞他汀0101。 E99. 如E71至E98中任一項之ADC，其中抗體或其抗原結合片段包含VH，其包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，及VL，其包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，連接子為mcValCitPABC，且藥物為奧瑞他汀0101。 E100. 如E71至E99中任一項之ADC，其中抗體或其抗原結合片段包含重鏈(HC)，其包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，及輕鏈(LC)，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，連接子為mcValCitPABC，且藥物為奧瑞他汀0101。 E101. 如E71至E100中任一項之ADC，其中ADC與溶酶體標記物之類似性得分為約0.9至1.1。 E102. 如E71至E101中任一項之ADC，其中以10 mg/kg體重每隔4天向小鼠投與ADC達16天的小鼠SK-MEL-19轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第1天低於約196 mm3 、在第5天低於約234 mm3 、在第8天低於約207 mm3 、在第12天低於約249 mm3 、在第15天低於約337 mm3 、在第19天低於約337 mm3 、在第22天低於約333 mm3 、在第26天低於約359 mm3 、在第29天低於約374 mm3 或在第33天低於約366 mm3 。 E103. 如E71至E102中任一項之ADC，其中以10 mg/kg體重每隔4天向小鼠投與ADC達16天的小鼠SK-MEL-19轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第1天低於約196 mm3 、在第5天低於約234 mm3 、在第8天低於約207 mm3 、在第12天低於約249 mm3 、在第15天低於約337 mm3 、在第19天低於約337 mm3 、在第22天低於約333 mm3 、在第26天低於約359 mm3 、在第29天低於約374 mm3 或在第33天低於約366 mm3 ，且另外其中，並未投與ADC之小鼠模型之平均腫瘤體積在第1天低於約599 mm3 、在第5天低於約642 mm3 、在第8天低於約693 mm3 、在第12天低於約654 mm3 、在第15天低於約663 mm3 、在第19天低於約689 mm3 、在第22天低於約838 mm3 、在第26天低於約869 mm3 、在第29天低於約969 mm3 或在第33天低於約1,126 mm3 。 E104. 如E71至E103中任一項之ADC，其中以10 mg/kg體重每隔4天投與ADC達16天的小鼠SK-MEL-19轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第1天為約144 mm3 至約196 mm3 、在第5天為約176 mm3 至約234 mm3 、在第8天為約139 mm3 至約207 mm3 、在第12天為約165 mm3 至約249 mm3 、在第15天為約235 mm3 至約337 mm3 、在第19天為約235 mm3 至約337 mm3 、在第22天為約211 mm3 至約333 mm3 、在第26天為約191 mm3 至約359 mm3 、在第29天為約200 mm3 至約374 mm3 或在第33天為約190 mm3 至約366 mm3 。 E105. 如E71至E104中任一項之ADC，其中以10 mg/kg體重每隔4天投與ADC達16天的小鼠SK-MEL-19轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第1天為約144 mm3 至約196 mm3 、在第5天為約176 mm3 至約234 mm3 、在第8天為約139 mm3 至約207 mm3 、在第12天為約165 mm3 至約249 mm3 、在第15天為約235 mm3 至約337 mm3 、在第19天為約235 mm3 至約337 mm3 、在第22天為約211 mm3 至約333 mm3 、在第26天為約191 mm3 至約359 mm3 、在第29天為約200 mm3 至約374 mm3 或在第33天為約190 mm3 至約366 mm3 ，且另外其中，並未投與ADC之在其他方面一致的小鼠之平均腫瘤體積在第1天為約363 mm3 至約599 mm3 ，在第5天為約410 mm3 至約642 mm3 、在第8天為約465 mm3 至約693 mm3 ，在第12天為約444 mm3 至約654 mm3 、在第15天為約437 mm3 至約663 mm3 、在第19天為約463 mm3 至約689 mm3 、在第22天為約608 mm3 至約838 mm3 、在第26天為約637 mm3 至約869 mm3 、在第29天為約753 mm3 至約969 mm3 或在第33天為約838 mm3 至約1,126 mm3 。 E106. 如E73至E105中任一項之ADC，其中在以10 mg/kg體重每隔4天投與抗體-藥物結合物達16天之後，小鼠SK-MEL-19轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第33天為190 mm3 至366 mm3 。 E107. 如E71至E106中任一項之ADC，其中以10 mg/kg體重每隔4天投與ADC達16天的小鼠SK-129862F (PDX)轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第1天低於約254 mm3 ，在第5天低於約247 mm3 ，在第8天低於約198 mm3 ，在第13天低於約113 mm3 ，在第15天低於約105 mm3 ，在第19天低於約79 mm3 ，在第22天低於約72 mm3 ，在第26天低於約74 mm3 ，在第29天低於約35 mm3 或在第32天低於約26 mm3 。 E108. 如E71至E107中任一項之ADC，其中以10 mg/kg體重每隔4天投與ADC達16天的小鼠SK-129862F (PDX)轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第1天低於約254 mm3 ，在第5天低於約247 mm3 ，在第8天低於約198 mm3 ，在第13天低於約113 mm3 ，在第15天低於約105 mm3 ，在第19天低於約79 mm3 ，在第22天低於約72 mm3 ，在第26天低於約74 mm3 ，在第29天低於約35 mm3 或在第32天低於約26 mm3 ，且另外其中，並未投與ADC之在其他方面一致的小鼠之平均腫瘤體積在第1天低於約234 mm3 ，在第5天低於約239 mm3 ，在第8天低於約237 mm3 ，在第13天低於約206 mm3 ，在第15天低於約220 mm3 ，在第19天低於約211 mm3 ，在第22天低於約195 mm3 ，在第26天低於約233 mm3 ，在第29天低於約253 mm3 或在第32天低於約271 mm3 。 E109. 如E71至E108任一項之ADC，其中以10 mg/kg體重每隔4天投與ADC達16天的小鼠SK-129862F (PDX)轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第1天為約162 mm3 至約254 mm3 ，在第5天為約143 mm3 至約247 mm3 ，在第8天為約98 mm3 至約198 mm3 ，在第13天為約69 mm3 至約113 mm3 ，在第15天為約57 mm3 至約105 mm3 ，在第19天為約39 mm3 至約79 mm3 ，在第22天為約24 mm3 至約72 mm3 ，在第26天為約30 mm3 至約74 mm3 ，在第29天為約11 mm3 至約35 mm3 ，在第32天為約0 mm3 至約26 mm3 。 E110. 如E71至E109任一項之ADC，其中以10 mg/kg體重每隔4天投與ADC達16天的小鼠SK-129862F (PDX)轉移性黑色素瘤異種移植模型之平均腫瘤體積在第1天為約162 mm3 至約254 mm3 ，在第5天為約143 mm3 至約247 mm3 ，在第8天為約98 mm3 至約198 mm3 ，在第13天為約69 mm3 至約113 mm3 ，在第15天為約57 mm3 至約105 mm3 ，在第19天為約39 mm3 至約79 mm3 ，在第22天為約24 mm3 至約72 mm3 ，在第26天為約30 mm3 至約74 mm3 ，在第29天為約11 mm3 至約35 mm3 ，在第32天為約0 mm3 至約26 mm3 ，且另外其中，並未投與ADC之在其他方面一致的小鼠之平均腫瘤體積在第1天為約178 mm3 至約234 mm3 ，在第5天為約189 mm3 至約239 mm3 ，在第8天為約159 mm3 至約237 mm3 ，在第13天為約166 mm3 至約206 mm3 ，在第15天為約184 mm3 至約220 mm3 ，在第19天為約169 mm3 至約211 mm3 ，在第22天為約165 mm3 至約195 mm3 ，在第26天為約199 mm3 至約233 mm3 ，在第29天為約213 mm3 至約253 mm3 ，在第32天為約233 mm3 至約271 mm3 。 E111. 如E71至E110中任一項之ADC，其中小鼠之晚期血漿半衰期為以下中之至少一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天及約5.9天。 E112. 如E71至E111中任一項之ADC，其中小鼠之晚期血漿半衰期為至少5.6天或5.9天。 E113. 如E71至E112中任一項之ADC，其中大鼠之晚期血漿半衰期為以下中之至少一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天及約8.5天。 E114. 如E71至E113中任一項之ADC，其中大鼠之晚期血漿半衰期為至少8.1天或8.5天。 E115. 如E71至E114中任一項之ADC，其中食蟹獼猴之晚期血漿半衰期為以下中之至少一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天及約7.7天。 E116. 如E71至E115中任一項之ADC，其中食蟹獼猴之晚期血漿半衰期為至少7天、7.6天或7.7天。 E117. 如E71至E116中任一項之ADC，其中人類之晚期血漿半衰期為以下中之至少一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天及約7.7天。 E118. 如E71至E117中任一項之ADC，其中人類之晚期血漿半衰期為至少7天、7.6天或7.7天。 E119. 一種用於產生如E71至E118中任一項之ADC之製程，其包含(a)將連接子與藥物連接；(b)將連接子-藥物與抗體結合；及(c)純化ADC。 E120. 一種醫藥組合物，其包含如E71至E118中任一項之ADC及醫藥學上可接受之載劑。 E121. 一種治療與相較於在其他方面一致之正常細胞中之GD3細胞表面表現的GD3細胞表面表現相關之疾病或病症的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如實施例E71至E118中任一項之ADC或如E120之醫藥組合物。 E122. 如E121之方法，其中與GD3細胞表面表現相關之疾病或病症為黑色素瘤、乳癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤或肺癌。 E123. 一種治療與細胞中GD3經升高活性水平相關之疾病或病症的方法，其包含向具有GD3經升高活性水平之細胞投與治療有效量之如實施例E71至E118中任一項之ADC或如E120之醫藥組合物。 E124. 一種治療個體中與GD3經升高活性水平相關之疾病或病症的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如實施例E71至E118中任一項之ADC或如E120之醫藥組合物。 E125. 如E123或E124之方法，其中GD3活性係選自由以下組成之群：增加之細胞生長、增加之細胞分裂、接觸抑制缺失、增加之細胞侵入、增加之細胞黏附及增加之細胞凋亡。 E126. 如E123至E125中任一項之方法，其中與GD3經升高活性水平相關之疾病或病症為黑色素瘤、乳癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤或肺癌。 E127. 如E121至E126中任一項之方法，其包含向有需要之個體投與0.5 mg/kg之如實施例E71至E118中任一項之ADC或如E120之醫藥組合物。 E128. 如E121至E127中任一項之方法，其包含經靜脈內投與該ADC或醫藥組合物。 E129. 如E121至E128中任一項之方法，其中約一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、每月兩次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次或每四個月一次投與該ADC或醫藥組合物。 E130. 如E71至E118中任一項之AD或如E120之醫藥組合物，其適用作藥劑。
聯合研究協議之各方
當前所主張之發明係由達成聯合研究協議之下列各方完成或以其為名義完成。聯合研究協議在所主張發明完成之日或該日期之前生效，且所主張發明係作為在聯合研究協議之範疇內進行的活動之結果而完成。達成聯合研究協議之各方為MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER及PFIZER INC。
本發明提供結合於GD3之ADC。本發明亦提供用於使用GD3抗體、連接子及藥物製備結合物之製程。本發明之ADC適用於製備及製造組合物，諸如可用於由GD3表現表徵之過度增殖性病症之診斷、預防及/或治療的藥劑。
抗體 「抗體」或「Ab」為能夠經由位於免疫球蛋白分子之可變區中之至少一個抗原識別位點識別及結合於特異性靶標或抗原(諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等)之免疫球蛋白分子。如本文所使用，術語「抗體」可涵蓋任何類型的抗體，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、保留特異性結合於既定抗原(例如GD3)之能力的完整抗體的抗原結合片段(或部分)。
抗體之「抗原結合片段 」係指保留特異性結合於抗原之能力(較佳具有實質上相同之結合親和力)之全長抗體的片段。抗原結合片段之實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，即包含藉由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fv片段；(iv)由抗體之單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v) dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341:544-546)，其由VH結構域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)、二硫鍵連接的Fvs (dsFv)及抗個體基因型(抗Id)抗體及胞內抗體。此外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)藉由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由使其能夠製成為單一蛋白鏈之合成連接子接合，其中VL及VH區成對形成單價分子(被稱為單鏈Fv (scFv))；參見例如Bird等人，Science 242:423-426 (1988)及Huston等人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH及VL結構域表現於單個多肽鏈上，但使用過短而不允許相同鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，由此迫使該等結構域與其他鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)；Poljak等人，1994, Structure 2:1121-1123)。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如最大抗體、微型抗體、胞內抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及bis-scFv (參見例如Hollinger及Hudson，2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136)。
抗體「可變結構域」係指單獨或組合形式之抗體輕鏈(VL)之可變區或抗體重鏈(VH)之可變區。如此項技術中已知，重鏈及輕鏈之可變區各自由藉由三個互補決定區(CDR)連接之四個構架區(FR)組成，且促成抗體之抗原結合位點之形成。
「互補決定區」(CDR)可根據Kabat、Chothia之定義、Kabat及Chothia、AbM、contact、North之累積及/或構形定義或此項技術中熟知之任何CDR判定方法鑑別。參見例如Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版(高變區)；Chothia等人，1989, Nature 342:877-883 (結構環結構)。特定抗體中構成CDR之胺基酸殘基之一致性可使用此項技術中熟知之方法判定。CDR之AbM定義係Kabat與Chothia之間的折衷方案且使用Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體(Accelrys®)。CDR之「接觸」定義係基於MacCallum等人, 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745中所闡述之所觀測抗原接觸。CDR之「構形」定義係基於對抗原結合作出熱焓貢獻之殘基(參見例如Makabe等人，2008，J. Biol. Chem.，283:1156-1166)。North已使用CDR定義之不同較佳集合鑑別典型CDR構形(North等人，2011, J. Mol. Biol. 406: 228-256)。在本文中被稱作CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可經鑑別為對抗原結合作出熱焓貢獻之殘基(Makabe等人，2008, J Biol. Chem. 283:1156-1166)。雖然其他CDR邊界定義可不嚴格遵循以上方法中之一者，但仍然將與Kabat CDR之至少一部分重疊，但其可根據以下預測或實驗結果而縮短或延長：特定殘基或殘基組或甚至全部CDR不顯著影響抗原結合。如本文所用，CDR可指由此項技術中已知之任何方法(包括方法之組合)所定義之CDR。本文所用之方法可利用根據此等方法中之任一者定義之CDR。對於含有超過一個CDR之任何既定實施例，CDR (或抗體之其他殘基)可根據Kabat、Chothia、North、延伸、AbM、接觸及/或構形定義中之任一者定義。
可變結構域中之殘基係根據Kabat編號，Kabat係用於抗體之編譯之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域之編號系統。參見Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service,美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變結構域之FR或CDR之縮短或向其中之插入的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可包括在H2之殘基52之後的單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來判定殘基之Kabat編號。用於指派Kabat編號之各種演算法係可用的。以Abysis之版本2.3.3版(www.abysis.org)實施之演算法在本文中用於將Kabat編號指派至可變區CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H2及CDR-H3。AbM定義係用於CDR-H1。
「構架」(FR)殘基為除了CDR殘基之外的抗體可變結構域殘基。VH或VL結構域構架包含四個構架子區FR1、FR2、FR3及FR4，穿插有呈以下結構之CDR： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4。
在某些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域。Fc結構域可衍生自IgA (例如IgA1 或IgA2 )、IgD、IgE、IgM或IgG (例如IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 )。
「Fc融合」蛋白為其中一或多個多肽可操作地連接於Fc多肽之蛋白。Fc融合將免疫球蛋白之Fc區與融合搭配物相組合。
「抗原決定基」係指抗體與其特異性結合之抗原之區域或區，例如包含與抗體相互作用之殘基的區域或區。抗原決定基可為線性的或構形的。
「優先結合」或「特異性結合」 (在本文中可互換使用)至抗原決定基之抗體為此項技術中已清楚理解之術語，且用以測定該等特異性或優先結合之方法亦為此項技術中所熟知。若分子與特定細胞或物質之反應或締合比其與替代性細胞或物質更頻繁、更快速，持續時間更長及/或親和力更大，則稱其呈現「特異性結合」或「優先結合」。若抗體與靶標結合比其與其他物質結合親和力/結合力(avidity)更大、更容易及/或持續時間更久，則該抗體「特異性結合」或「優先結合」至靶標。舉例而言，特異性或優先結合於GD3抗原決定基之抗體為：結合此抗原決定基比其結合至其他GD3抗原決定基或非GD3抗原決定基具有更大親和力、結合力、更容易及/或具有更長持續時間的抗體。藉由閱讀此定義亦應理解，例如特異性或優先結合至第一靶標之抗體(或部分或抗原決定基)可能或可能不特異性或優先結合至第二靶標。由此，「特異性結合」或「優先結合」未必需要(儘管其可包括)獨佔式結合。提及結合一般但不一定意謂優先結合。「特異性結合」或「優先結合」包括化合物，例如蛋白質、核酸、抗體及類似者，其識別並結合至特異性分子，但並未實質上識別或結合樣品中之其他分子。舉例而言，識別及結合至樣品中之同源配體或結合搭配物之抗體或肽受體(例如，結合腫瘤抗原之抗人類腫瘤抗原抗體)，但並未實質上識別或結合樣品中之其他分子，特異性結合至該同源配體或結合搭配物。因此，在經指示分析條件下，經指定結合部分(例如，抗體或其抗原結合部分或受體或其配體結合部分)優先結合至特定目標分子且並未大量結合至存在於測試樣品中之其他組分。
多種分析型式可用以選擇特異性結合所關注分子之抗體或肽。舉例而言，固相ELISA免疫分析、免疫沈澱、BIAcore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)、螢光活化細胞分選(FACS)、Octet™ (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA)及西方墨點分析等許多分析法可用以鑑別與抗原特異性反應之抗體或與同源配體或結合搭配物特異性結合之受體或其配體結合部分。通常，特異性或選擇性反應將為背景信號或雜訊之至少兩倍，且更通常地，超過背景10倍，甚至更具體而言，當平衡解離常數(KD )≤1 µM，較佳≤100 nM，更佳≤10 nM，甚至更佳≤100 pM，又更佳地≤10 pM及甚至更佳≤1 pM時，抗體被稱為「特異性結合」抗原。
本發明之抗體或其抗原結合片段可使用此項技術中熟知的標準技術而「親和力成熟」。舉例而言舉例來說，親和力成熟抗體可藉由此項技術中已知之程序產生(Marks等人，1992, Bio/Technology, 10:779-783；Barbas等人，1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813；Schier 等人，1995, Gene, 169:147-155；Yelton等人，1995, J. Immunol., 155:1994-2004；Jackson等人，1995, J. Immunol., 154(7):3310-9；Hawkins等人，1992, J. Mol. Biol., 226:889-896；及WO2004/058184)。
如本文所使用之關於抗體之術語「競爭」意謂將第一抗體或其抗原結合部分結合至抗原減少同一抗原藉由第二抗體或其抗原結合部分之後續結合。大體而言，結合第一抗體產生位阻、構形變化或結合至共同抗原決定基(或其部分)，使得第二抗體與同一抗原之結合減少。標準競爭分析可用於判定兩個抗體是否與彼此競爭。一種適合用於抗體競爭之分析涉及使用Biacore技術之基於ELISA之方法，其可使用表面電漿子共振(SPR)技術，通常使用生物感測器系統(諸如BIACORE®系統)量測相互作用之程度。舉例而言，SPR可用於活體外競爭性結合抑制分析，以判定一個抗體抑制第二抗體之結合的能力。另一用於量測抗體競爭之分析使用Biacore技術，其可使用表面電漿子共振(SPR)技術，通常使用生物感測器系統(諸如BIACORE®系統)量測相互作用之程度。舉例而言，SPR可用於活體外競爭性結合抑制分析，以判定一個抗體抑制第二抗體之結合的能力。
此外，基於抗體之競爭將其「分組」之高通量方法描述於國際專利申請案第WO 2003/48731號中。若一個抗體(或片段)減少另一抗體(或片段)結合至GD3，則存在競爭。舉例而言，可使用依序結合競爭分析，其中不同抗體經依序添加。可添加第一抗體以達成接近飽和之結合。隨後，添加第二抗體。若第二抗體至GD3之結合並未被偵測到或相較於平行分析在不存在第一抗體(其值可經設定為100%)的情況下顯著減少(例如，至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少約90%減少)，則認為兩個抗體與彼此競爭。
在稱為「生殖系化」之過程中，VH及VL序列中之某些胺基酸可突變以匹配在生殖系VH及VL序列中天然存在之胺基酸。特定言之，可使VH及VL序列中之構架區之胺基酸序列突變以匹配生殖系序列，以便降低投與抗體時免疫原性之風險。如本文所使用，術語「生殖系」係指抗體基因及基因片段在其經由胚細胞自父代傳遞至後代時的核苷酸序列及胺基酸序列。此生殖系序列與編碼抗體之核苷酸序列的區別在於成熟B細胞，其在B細胞成熟過程期間已經重組及超突變事件。「利用」特定生殖系之抗體具有大部分與該生殖系核苷酸序列或與其所指定之胺基酸序列緊密比對的核苷酸或胺基酸序列。與生殖系序列相比較，該等抗體頻繁突變。人類VH及VL基因之生殖系DNA序列係此項技術中已知的(參見例如「Vbase」人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat, E. A等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號；Tomlinson等人，J. Mol. Biol. 227:776-798, 1992；及Cox等人，Eur. J. Immunol. 24:827-836, 1994)。
術語「治療」包括預防性及/或治療性治療。若在病況之臨床表現之前投與，則治療視為預防性的。治療性治療包括例如改善或降低疾病之嚴重程度或縮短疾病時長。
結合親和力 抗體之結合親和力可表示為KD 值，其係指特定抗原-抗體相互作用之解離速率。KD 為解離速率(rate of dissociation) (亦稱為「解離速率(off-rate) (koff )」)與締合速率(association rate) (或「締合速率(on-rate) (kon )」)之比率。因此，KD 等於k off /k on 且表示為莫耳濃度(M)，且KD 愈小，結合親和力愈強。抗體之KD 值可使用此項技術中充分確立之方法測定。一種用於量測KD 之例示性方法為通常使用生物感測器系統(諸如BIACORE®系統)之表面電漿子共振(SPR)。BIAcore動力學分析包含分析抗原與在表面上具有固定分子(例如包含抗原決定基結合結構域之分子)之晶片的結合及解離。另一種用於測定抗體之KD 之方法係藉由使用生物層干擾量測法，通常使用OCTET®技術(Octet QKe system, ForteBio)。替代地或另外，亦可使用KinExA® (動力排除分析)分析，其購自Sapidyne Instruments (Boise, Id.)。
人類化 雖然人類化抗體由於其在人類中之潛在低的免疫原性而係合乎需要的，則其產生係不可預測的。舉例而言，用以降低潛在免疫原性之序列修改可能對抗體功能(諸如結合、結合特異性、清除、PK、PD、穩定性、黏度、凝集、摺疊等等)之其他態樣有未預期及不可預測效應。此外，「人類化抗體」仍可呈現在人類中之免疫原性，而不考慮序列修改如何。
如本文所使用，「人類化」及「CDR移植」抗體係指作為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列之片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或抗體之其他抗原結合子序列)的非人類(例如鼠類)抗體之形式。較佳地，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受體抗體)，其中來自接受體之一或多個互補決定區(CDR)之殘基由來自諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠或兔的非人類物種(供體抗體)之一或多個CDR的殘基置換。
在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基由對應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包括以下殘基：既不存在於接受體抗體中亦不存在於所導入之CDR或構架序列中，但包括該等殘基以進一步改進且最佳化抗體效能。大體而言，人類化抗體將包括實質上所有至少一種及通常兩種可變結構域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白共同序列之FR區。人類化抗體最佳亦將包括至少一部分免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之恆定區或結構域。在本發明之一些態樣中，抗體具有如PCT國際公開案第WO 99/58572中所描述般修飾之Fc區。人類化抗體之其他形式具有一或多個相對於原始抗體改變之CDR (CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，亦稱為一或多個「來源於」來自原始抗體之一或多個CDR的CDR。
人類化可基本上遵循Winter及同事之方法(Jones等人 Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人 Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人 Science 239:1534-1536 (1988))，藉由用嚙齒動物或突變嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之對應序列來進行。亦參見美國專利第5,225,539號；第5,585,089號；第5,693,761號；第5,693,762號；第5,859,205號，以其全文引用之方式併入本文中。在一些情況下，人類免疫球蛋白之一或多個可變區之構架區內之殘基由對應非人類殘基置換(參見例如美國專利第5,585,089號；第5,693,761號；第5,693,762號；及第6,180,370號)。此外，人類化抗體可包括在接受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。作出此等修飾以進一步改進抗體效能(例如，以獲得所需親和力、特異性及其類似者)。大體而言，人類化抗體將包括實質上所有至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有高變區對應於非人類免疫球蛋白之高變區，且所有或實質上所有構架區皆為人類免疫球蛋白序列之構架區。人類化抗體亦將視情況包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，該恆定區通常為人類免疫球蛋白之恆定區。關於進一步細節，參見Jones等人Nature 331:522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；及Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)；其以全文引用的方式併入本文中。因此，該等「人類化」抗體可包括實質上少於完整人類可變結構域已經非人類物種之對應序列取代之抗體。實際上，人類化抗體通常為一些CDR殘基及可能一些構架殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。參見例如美國專利第5,225,539號；第5,585,089號；第5,693,761號；第5,693,762號；第5,859,205號。亦參見美國專利第6,180,370號及PCT國際公開案第WO 01/27160號，其中揭示人類化抗體及用於產生對預定抗原具有經改良親和力之人類化抗體之技術。
「重組人類抗體」或「完全人類抗體」係指胺基酸序列對應於由人類產生及/或已使用熟習此項技術者已知或本文所揭示之任何用於製備人類抗體之技術製得的抗體的胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義包括具有至少一個人類重鏈多肽或至少一個人類輕鏈多肽之抗體。一個此類實例係具有鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。可使用此項技術中已知之各種技術產生人類抗體。舉例而言，人類抗體選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人, Nature Biotechnology, 14:309-314, (1996)；Sheets等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, (1998)；Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol., 227:381, (1991)；Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581, (1991))。人類抗體亦可藉由將已藉由轉殖基因方法引入人類免疫球蛋白基因座代替內源性基因座的動物(例如內源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化之小鼠)免疫接種來製得。此方法描述於美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號及第5,661,016號中。或者，人類抗體可藉由使產生針對靶標抗原之抗體的人類B淋巴細胞(此類B淋巴細胞可自個體或自cDNA之單細胞選殖回收或可在活體外已進行免疫接種)永生化來製備。參見例如Cole等人 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77頁, (1985)；Boerner等人, J. Immunol., 147 (1):86-95, (1991)；及美國專利第5,750,373號。
大體而言，為了產生融合瘤細胞株，宿主動物之免疫接種的途徑及計劃表一般與用於抗體刺激及產生之經確立及習知技術一致。預期可操控包括人類之任何哺乳動物個體或自其產生細胞之抗體來充當產生包括人類之哺乳動物、融合瘤細胞株的基礎。通常，宿主動物經腹膜內、經肌肉內、經口、經皮下、經足底內及/或經皮內接種一定量之包括如本文中所描述之免疫原。
融合瘤可自淋巴細胞及永生化骨髓瘤細胞，使用Kohler, B.及Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975之通用體細胞雜交技術或如藉由Buck, D. W.，等人，In Vitro, 18:377-381, 1982修改來製備。包括(但不限於) X63-Ag8.653及來自Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA之彼等者之可獲得的骨髓瘤株可用於雜交中。大體而言，技術涉及使用諸如聚乙二醇之促融劑或藉由熟習此項技術者熟知之電學方式使骨髓瘤細胞與淋巴細胞融合。可用作抗體來源之融合瘤包涵產生對GD3具有特異性之單株抗體或其部分之母融合瘤的所有衍生物、子代細胞。
可使用已知程序使產生該等抗體之融合瘤在活體外或活體內生長。若需要，可藉由諸如硫酸銨沈澱、凝膠電泳、透析、層析及超過濾之習知免疫球蛋白純化程序，自培養基或體液分離單株抗體。
替代地，編碼抗體之多核苷酸序列可用於基因操控以「人類化」抗體或改良抗體之親和力或其他特性。舉例而言，若抗體用於人類之臨床試驗及治療，則可將恆定區工程改造成更類似於人類恆定區以避免免疫反應。可能需要對抗體序列進行基因操縱以獲得更大的對GD3之親和力及/或更大的抑制GD3之功效。
人類化抗體可使用各種方法中之任一者製備，該等方法包括鑲飾、互補決定區(CDR)之移植、簡短CDR之移植、特異性測定區(SDR)之移植及Frankenstein組合，如下文所描述。人類化抗體亦包括超人類化抗體，其中一或多個變化已引入CDR中。舉例而言，人類殘基可取代CDR中之非人類殘基。此等一般方法可與標準突變誘發及合成技術組合以產生具有所需序列之抗GD3抗體。
鑲飾係基於藉由用人類胺基酸序列表面再塑抗體之溶劑可達外部來潛在地減少嚙齒動物或其他非人類抗體中之免疫原性胺基酸序列之概念。因此，經鑲飾抗體相比未經修飾之非人類抗體對人類細胞較不陌生。參見Padlan (1991)Mol . Immunol . 28:489-98。非人類抗體係藉由鑑別非人類抗體中之經暴露外部構架區殘基及通常發生在人類抗體中之該等相同位置的用胺基酸置換經鑑別殘基來鑲飾，該等外部構架區殘基不同於人類抗體之構架區中之相同位置處之彼等殘基。
藉由用供體抗體(例如非人類抗體)之CDR置換接受體抗體(例如人類抗體或具有所需構架殘基之其他抗體)之一或多個CDR來執行CDR之移植。可基於候選接受體抗體與供體抗體之間的構架殘基之類似性來選擇接受體抗體。舉例而言，人類構架區經鑑別為具有與相關非人類抗體之每一構架區之實質性序列同源性，且非人類抗體之CDR經移植至不同人類構架區之複合物上。亦有助於製備本發明之抗體之相關方法描述於美國專利申請公開案第2003/0040606號中。
簡短CDR之移植為相關方法。簡短CDR包括特異性測定殘基及鄰接胺基酸，包括處於輕鏈中之位置27d-34、50-55及89-96及處於重鏈中之位置31-35b、50-58及95-101的彼等者((Kabat等人(1987)之編號定則)。參見(Padlan等人，1995,FASEB J . 9: 133-139)， 特異性測定殘基(SDR))之移植係以對以下理解為前提：藉由在互補決定區(CDR)中之每一者內之大部分高度可變殘基測定抗體合併部位之結合特異性及親和力。對抗體-抗原錯合物之三維結構之分析結合對可用胺基酸序列資料之分析可用於基於出現在CDR內之每一位置處之胺基酸殘基的結構不類似性而對序列變化性建模。SDR經鑑別為由接觸殘基組成之最低限度地免疫原性多肽序列。參見Padlan等人，1995。
大體而言，在人類接受體構架實質上類似於供體抗體之構架區或最類似於可變區子族之共同序列的基礎上選擇該等人類接受體構架。在移植後，可對供體及/或接受體序列作出額外改變，以使抗體結合、功能性、密碼子使用、表現量等最佳，包括引入非人類殘基至構架區中。參見例如PCT國際公開案第WO 91/09967號。
在一些態樣中，VL構架為DPK9。亦預測其他類似構架區遞送本發明之有利抗體，其包含SEQ ID NO: 9之CDR，包括DPK5、DPK4、DPK1、IGKV1-5*01、DPK24、DPK21、DPK15、IGKV1-13*02、IGKV1-17*01、DPK8、IGKV3-11*01及DPK22，其包含分別與DPK-9之FW區之99、97、97、96、80、76、66、97、97、96、76及74%一致性及共同結構特徵中之一個或較少胺基酸差異(Kabat編號)：(A)剛好在CDR (游標區)下方之殘基：L2、L4、L35、L36、L46、L47、L48、L49、L64、L66、L68、L69、L71 ；(B) VH/VL鏈填充殘基：L36、L38、L44、L46、L87；及(C)典型CDR結構支撐物殘基L2、L48、L64、L71 (參見Lo，「Antibody Humanization by CDR Grafting」(2004) Antibody Engineering，第248卷，Methods in Molecular Biology 第135-159頁及O'Brien 及 Jones，「Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR Grafting」，(2003) Recombinant Antibodies for Cancer Therapy，第207卷，Methods in Molecular Biology 第81-100頁)。在一些態樣中，構架為分別與DPK9共有99、97、97、96、80、76、66%一致性之DPK5、DPK4、DPK1、IGKV1- 5*01、DPK24、DPK21、DPK15之構架區，且沒有在此等共同結構特徵中之胺基酸差異。在其他態樣中，一致性%係基於與不包括在本文中定義為CDR之彼等部分之VL的類似性。在一些態樣中，類似於DPK9之VL構架包含使用Kabat編號在輕鏈(S_L65_W)之可變區之位置65處之絲胺酸至色胺酸突變。
在一些態樣中，VH構架為DP-54。亦預測其他類似構架區遞送本發明之有利抗體，其包含SEQ ID NO: 1之CDR，包括DP-50、IGHV3-30*09、IGHV3-30*15、IGHV3-48*01、DP-77、DP-51、IGHV3-66*01、DP-53、DP-48、IGHV3-53*01、IGHV3-30*02及DP-49，其包含分別與DP-54之FW區具有93、92、92、99、97、97、96、96、94、94、93、92%一致性及共同結構特徵中之一個或較少胺基酸差異(Kabat編號)：(A)剛好在CDR (游標區)下方之殘基：H2、H47、H48及H49、H67、H69、H71、H73、H93、H94；(B) VH/VL鏈填充殘基：H37、H39、H45、H47、H91、H93；及(C)典型CDR結構支撐物殘基H24、H71、H94 (參見Lo 2004，同上文，及O'Brien and Jones 2003，同上文)。在一些態樣中，構架為分別與DP-54共有93、92及92%一致性之DP-50、IGHV3-30*09、IGHV3-30*15之構架區，且在此等共同結構特徵中沒有胺基酸差異。在其他態樣中，一致性%係基於與不包含本文中所定義為CDR之彼等部分之VH的類似性。在一些態樣中，類似於DP-54之VH構架包含使用Kabat編號於重鏈可變區之位置74處之丙胺酸突變成脯胺酸(A_H74_P)。
抗原結合片段或抗體片段可藉由抗體之蛋白分解或其他降解或藉由如上文所描述之重組方法(亦即單一或融合多肽)或藉由化學合成產生。抗體之多肽(尤其至多約50個胺基酸之較短多肽)宜藉由化學合成來製造。化學合成之方法為此項技術中已知的且為市售的。舉例而言，抗體或抗體片段可藉由自動多肽合成器採用固相方法產生。亦參見美國專利第5,807,715號；第4,816,567號；及第6,331,415號。
對 GD3 之抗體 在一些態樣中，本發明提供拮抗性GD3抗體。GD3路徑之高親和力拮抗劑抗體在多種細胞類型及多個組織隔室會發揮有效性，其中GD3被認為會作用在其靶細胞上。本發明抗體有可能修改驅動包括(但不限於)惡性黑色素瘤之癌症的發展及惡化之重要路徑，因為當與未表現GD3或表現減少GD3之在其他方面一致的正常細胞相比時，經細胞之GD3表現已經證明係與異常細胞生長及/或分裂相關或參與異常細胞生長及/或分裂。
作為在本文可互換使用之術語，「中和」或「阻斷」或「拮抗劑」GD3抗體係指結合至GD3之抗體，從而進行：(i)干擾、限制、減少或抑制GD3與GD3受體組件(例如c-MET信號傳導路徑)之間的相互作用；及/或(ii)導致抑制GD3之至少一種生物功能。
GD3之「生物功能」或「生物活性」意謂包括增加之細胞生長、增加之細胞分裂及接觸抑制缺失、增加之細胞侵入、增加之細胞黏附及增加之細胞凋亡。
如本文所使用，術語「GD3」包括人類神經節苷脂GD3 (例如圖12中所示之結構)之變體、同功異構物、同系物、直系同源物及旁系同源物。在本發明之一些態樣中，抗體與來自除人類以外之物種之GD3 (諸如小鼠、大鼠或非人類靈長動物之GD3)以及不同形式之GD3交叉反應。在其他態樣中，抗體可對人類GD3有完全特異性且可不展現物種或其他類型之交叉反應。如本文所使用，術語GD3係指天然產生之人類GD3，除非上下文另有規定。因此，「GD3抗體」、「抗GD3抗體」或其他類似標稱意謂與GD3類型配體或同功異構物或其片段或衍生物特異性締合、結合或反應之任何抗體(如本文所定義」。
在一些態樣中，GD3為人類GD3。在一些態樣中，GD3為大鼠GD3。在一些態樣中，GD3為小鼠GD3。在一些態樣中，GD3為靈長類動物GD3。在一些態樣中，GD3為猿GD3。在一些態樣中，GD3為猴GD3。在一些態樣中，GD3為食蟹獼猴GD3。在一些態樣中，GD3由以下化學結構定義：Neu5Acα2、8NeuAcα2、3Galβ1、4Glcβ1Cer (Haji-Ghassemi等人，2015, 25(9):920-952)。在一些態樣中，GD3具有圖12中所示之結構。
在本發明之一個態樣中，本發明之GD3抗體涵蓋為結合至具有同一抗原決定基之人類GD3進行競爭及/或作為抗體或其抗原結合片段結合同一抗原決定基的抗體，其具有如SEQ ID NO: 1中所闡述之重鏈可變區之胺基酸序列及如SEQ ID NO: 9所闡述之輕鏈可變區之胺基酸序列。
在本發明之一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包括IgG1重鏈恆定區，例如，如SEQ ID NO: 1中所闡述之huR24重鏈。在其他態樣中，抗體或其抗原結合片段包括κ輕鏈恆定區，例如，如SEQ ID NO: 9所闡述之huR24輕鏈。
在本文中亦被稱作「huR24vh1.1/vk1.2」之「huR24」為特異性結合於GD3之抗體，該抗體包含：重鏈，其包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。
表1提供本發明之人類化抗GD3抗體之胺基酸(蛋白質)序列及相關聯核酸(DNA)序列。如由Kabat及由Chothia定義之huR24 VH及huR24 VL之CDR係闡述為獨立序列。
表 1 .人類化抗GD3抗體之序列。
核酸 本發明亦提供編碼本發明抗體中之任一者之聚核苷酸，包括本文所描述之抗體部分及經修飾抗體。本發明亦提供製造本文所描述之聚核苷酸中之任一者的方法。聚核苷酸可藉由此項技術中已知之程序製造及表現。
所需抗體或其抗原結合片段及編碼此類抗體或其抗原結合片段之核酸之序列可使用標準定序技術測定。編碼所需抗體或其抗原結合片段之核酸序列可插入至各種載體(諸如選殖及表現載體)中，以用於重組產生及表徵。編碼重鏈或重鏈之抗原結合片段之核酸及編碼輕鏈或輕鏈之抗原結合片段之核酸可經選殖至同一載體或不同載體中。
在一個態樣中，本發明提供編碼GD3-結合抗體huR24之胺基酸序列之聚核苷酸。
本發明提供編碼一或多個蛋白質之聚核苷酸，其包含選自由(i) SEQ ID NO: 1-7及9-14之群之胺基酸序列。
本發明提供包含如SEQ ID NO: 7及14中之一或多者所闡述之核酸序列的聚核苷酸。本發明提供包含如SEQ ID NO: 7所闡述之核酸序列的聚核苷酸。本發明提供包含如SEQ ID NO: 14所闡述之核酸序列的聚核苷酸。
本發明提供聚核苷酸，其包含：以ATCC寄存且寄存編號為PTA-124057的核酸分子之DNA插入物的核酸編碼序列，其編碼huR24之VH結構域；及以ATCC寄存且寄存編號為PTA-124058的核酸分子之DNA插入物的編碼序列，其編碼huR24之VL結構域。本發明提供包含以ATCC寄存及寄存編號為PTA-124057之核酸分子的聚核苷酸。發明提供包含以ATCC寄存及寄存編號為PTA-124058之核酸分子的聚核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供編碼抗GD3抗體之聚核苷酸及其變體，其中此類變型聚核苷酸與本文所揭示或提及之特異性核酸序列中之任一者共用至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%。至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%核酸序列一致性。此等量並不意謂為限制性的，且所述百分比之間的增量特定地設想為本發明之部分。
本發明提供藉由本文所描述之核酸分子編碼之多肽。
在一個實施例中，VH及VL結構域或其抗原結合部分或全長HC或LC由獨立聚核苷酸編碼。替代地，VH及VL兩者或其抗原結合部分或HC及LC由單一聚核苷酸編碼。
本發明亦涵蓋與任何該等序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA (基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子；及mRNA分子，其不含內含子。額外編碼或非編碼序列可(但未必)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但未必)連接於其他分子及/或支撐材料。
聚核苷酸可包含編碼抗體或其部分之核酸序列或可包含此類序列之變體。聚核苷酸變體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，以使得經編碼多肽之結合特徵相對於天然抗體分子不會降低。可如本文所描述大體上評定對藉由變型核酸序列編碼之多肽之結合特徵的效應。在一些實施例中，聚核苷酸變體展現與編碼不包含任何取代、添加、缺失及/或插入之原始(親本)抗體或其部分的聚核苷酸序列至少約70%一致性，在一些實施例中，至少約80%一致性，在一些實施例中，至少約90%一致性，及在一些實施例中，至少約95%一致性。此等一致性百分比並不意謂為限制性的，且所述百分比之間的增量特定地設想為本發明之部分。
在如下文所描述之最大對應比對時，若兩個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則兩個聚核苷酸或多肽序列稱為「一致」。兩個序列之間的比較通常藉由在比較窗口比較序列以鑑別且比較具有序列類似性之局部區來進行。如本文所用之「比較窗口」係指至少約20個連續位置，通常30至約75個，或40至約50個連續位置的區段，其中在最佳比對兩個序列之後，序列可與相同數目之連續位置的參考序列相比較。
用於比較之最佳序列比對可使用生物資訊軟體之Lasergene® 套件中之Megalign程式(DNASTAR® , Inc., Madison, WI)使用預設參數來進行。此程序體現以下參考文獻中描述之若干比對方案：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships。在Dayhoff, M.O. (編) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC 第5卷, 第3增刊, 第345-358頁；Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes 第626-645頁 Methods in Enzymology 第183卷, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins, D.G.及Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153；Myers, E.W.及Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17；Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105；Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A.及Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J.及Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730中。
在一些實施例中，「序列一致性之百分比」係藉由在至少20個位置之比較窗口比較兩個最佳比對序列測定，其中，如與用於最佳比對兩個序列之參考序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗口中之聚核苷酸或多肽序列之部分可包含20%或更低之添加或缺失(亦即，間隔)，通常5至15%，或10至12%。藉由判定相同核酸基底或胺基酸殘基出現在兩個序列中之位置之數目以得到匹配位置數目，將匹配位置數目除以參考序列中之位置之總數目(亦即，窗口大小)及將結果乘以100以得到序列一致性之百分比，來計算百分比。
聚核苷酸變體亦可或者實質上與基因或其部分或互補序列同源。此類聚核苷酸變體在適當嚴格條件下能夠與編碼抗體(或互補序列)之天然產生DNA序列雜交。
合適的「適當嚴格條件」包括在5×SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液中預洗滌；在約50℃至65℃下使5×SSC (0.75 M NaCl，0.075 M檸檬酸鈉)雜交隔夜；隨後在65℃下用含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC中之每一者洗滌兩次，持續20分鐘。
如本文中所使用，「高度嚴格條件」或「較高嚴格度條件」如下：(1)使用低離子強度及高溫用於洗滌，例如在50℃下0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間使用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下具有0.1%牛血清白蛋白之50% (v/v)甲醯胺/0.1%菲科爾(Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/具有750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之pH 6.5的50 mM磷酸鈉緩衝液；或(3)在42℃下使用50%甲醯胺、5 × SSC、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 × Denhardt氏溶液、音波處理鮭魚精子DNA (50 µg/mL)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，其中在42℃下在0.2 × SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中及在55℃下在50%甲醯胺中洗液，隨後在55℃下用由含EDTA之0.1 × SSC組成的較高嚴格度洗液洗滌。熟習此項技術者將認識到如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似者之因素。
一般熟習此項技術者將瞭解，由於基因密碼之簡併，存在許多編碼如本文所描述之多肽之核苷酸序列。一些此等聚核苷酸與任何天然基因之核苷酸序列攜帶最小同源性。儘管如此，本發明尤其預期因密碼子使用差異而改變之聚核苷酸。此外，包含本文所提供之聚核苷酸序列之基因的對偶基因在本發明範疇內。對偶基因為由於核苷酸之一或多個突變(諸如缺失、添加及/或取代)而變化的內源基因。所得mRNA及蛋白質可(但不必須)具有變化的結構或功能。對偶基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來識別。
本發明之聚核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學聚核苷酸合成方法在此項技術中熟知且無需詳細描述於本文中。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商用DNA合成器以產生所需DNA序列。
為使用重組方法製備聚核苷酸，包含所需序列之聚核苷酸可插入適合載體中，且載體又可引入適合宿主細胞中進行複製及擴增，如本文中進一步論述。聚核苷酸可藉由此項技術中已知之任何方法插入宿主細胞中。細胞藉由利用直接吸收、內吞作用、轉染、F-配對或電穿孔將外源性聚核苷酸引入來轉型。一旦引入，外源性聚核苷酸可作為非一體化載體(諸如質體)維持在細胞內或一體化至宿主細胞基因組中。如此擴增之聚核苷酸可藉由此項技術中熟知之方法自宿主細胞分離。參看例如Sambrook等人, 1989。
或者，PCR允許DNA序列複製。PCR技術在此項技術中熟知且描述於美國專利第4,683,195、4,800,159、4,754,065及4,683,202號以及PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis等人編, Birkauswer Press, Boston, 1994。
RNA可藉由使用適當載體中之經分離DNA且將其插入適合宿主細胞內獲得。當細胞複製且DNA轉錄至RNA時，可隨後使用熟習此項技術者熟知之方法分離RNA，例如，如Sambrook等人, 1989中所闡述。
合適的選殖及表現載體可包括多種組分，諸如啟動子、強化子及其他轉錄調節序列。載體亦可經構築以允許抗體可變結構域後續選殖至不同載體中。適合選殖載體可根據標準技術構築，或可選自大量在此項技術中可供使用之選殖載體。雖然所選選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞變化，但適用選殖載體將一般能夠自我複製，可具有特定限制核酸內切酶之單一靶標，及/或可載有可用於選擇含有載體之純系的標記物之基因。合適的實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體，諸如pSA3及pAT28。此等及許多其他選殖載體可購自諸如BioRad、Strategene及Invitrogen之商業供應商。進一步提供表現載體。表現載體通常為含有根據本發明之聚核苷酸的可複製聚核苷酸構築體。暗示表現載體作為游離基因體或作為染色體DNA之整體部分在宿主細胞中必須為可複製的。合適的表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分可一般包括(但不限於)以下一或多者：信號序列；複製起點；一或多種標記物基因；合適的轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(亦即轉譯)，亦通常需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯啟動位點及中止密碼子。
含有所關注聚核苷酸及/或聚核苷酸本身之載體可藉由多種適當方法中之任一者引入宿主細胞中，包括電穿孔、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(例如其中載體為諸如痘苗病毒之感染物)。引入載體或聚核苷酸之選擇將常常視宿主細胞之特徵而定。
抗體或其抗原結合片段可使用合適的宿主細胞以重組方式製得。編碼抗體或其抗原結合片段之核酸可選殖至表現載體中，該表現載體接著可經引入至宿主細胞中，諸如大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，其中該細胞並不會另外產生免疫球蛋白，以獲得重組宿主細胞中之抗體之合成。較佳宿主細胞包括CHO細胞、人類胎腎(HEK) 293細胞或Sp2.0細胞以及此項技術中熟知的其他多種細胞。抗體片段可藉由全長抗體之蛋白分解或其他降解、藉由重組方法或藉由化學合成而產生。抗體之多肽片段(尤其至多約50個胺基酸之較短多肽)可宜藉由化學合成來製造。用於蛋白質及肽之化學合成方法係此項技術中已知的且可商購的。
抗體藥結合物 本發明之抗GD3 ADC可使用將藥物與抗GD3抗體連接或結合之連接子來製備。此類結合物允許將細胞毒性藥物選擇性遞送至腫瘤細胞。
「抗體-藥物結合物」或「ADC」係指抗體或其抗原結合片段，包括鍵結至GD3及結合至藥物(諸如細胞毒性、細胞生長抑制及/或治療劑)之抗體衍生物，如本文中進一步描述。舉例而言，細胞毒性劑可連接或結合於如本文所描述之抗GD3抗體，以用於細胞毒性劑至腫瘤(例如GD3表現腫瘤)的靶向局部遞送。
為了製備本發明之GD3 ADC，抗體或其抗原結合片段可為本文所描述之抗GD3抗體或其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段可經分離、純化或衍生，以用於製備GD3 ADC。
為了用於製備ADC，本文所描述之GD3抗體可為實質上純的，亦即，至少50%純(亦即，不含污染物)，更佳地，至少90%純，更佳地，至少95%純，又更佳地，至少98%純，且最佳地至少99%純。
本發明提供式Ab-(L-D)p 之ADC，其中(a) Ab為結合至GD3之抗體或其抗原結合片段，(b) L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物，及(c)p 表示藥物與抗體比(DAR)或平均藥物負載，其指示每抗體結合之藥物分子之數目。亦提供製備及製造此類ADC之方法及ADC在臨床應用中之使用。
在本發明之特定態樣中，式Ab-(L-D)p 之GD3 ADC包括：(a)抗體(Ab)或其抗原結合片段，包括如SEQ ID NO: 1所闡述之重鏈可變區及如SEQ ID NO: 9所闡述之輕鏈可變區；(b)連接子-藥物部分(L-D)，其中L為連接子，且D為藥物，其中連接子為mcValCitPABC，且其中藥物為奧瑞他汀0101，即(2-甲基丙胺醯基-N -[(3R , 4S , 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R ,2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺)；及(c)p 為約1至約12之整數，其中p 亦被稱作「藥物與抗體比」(DAR)。
在本發明之另一態樣中，式Ab-(L-D)p 之GD3 ADC包括：(a)抗體(Ab)或其抗原結合片段，包括如SEQ ID NO: 1所闡述之重鏈可變區及如SEQ ID NO: 9所闡述之輕鏈可變區；(b)連接子-藥物部分(L-D)，其中L為連接子，且D為藥物，其中連接子為mcValCitPABC，且其中藥物為奧瑞他汀0101，即(2-甲基丙胺醯基-N -[(3R , 4S , 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R ,2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺)；及(c)p 為4 (亦即，DAR為4)。
在本發明之另一態樣中，式Ab-(L-D)p 之GD3 ADC包括：(a)抗體(Ab)或其抗原結合片段，包括如SEQ ID NO: 7所闡述之重鏈及如SEQ ID NO: 14所闡述之輕鏈；(b)連接子-藥物部分(L-D)，其中L為連接子，且D為藥物，其中連接子為mcValCitPABC，且其中藥物為奧瑞他汀0101，即(2-甲基丙胺醯基-N -[(3R , 4S , 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R ,2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺)；及(c)p 為4 (DAR)。
「huR24-ADC」為式Ab-(L-D)p 之ADC，其中：(a) Ab為抗體huR24 vh1.1/vk1.2，(b) L為連接子mcValCitPABC，及(c) D為藥物奧瑞他汀0101 (Aur101)，及(d)p 為4。
連接子 美國專利第8,828,401號揭示可與抗GD3抗體一起使用之連接子，該美國專利以全文引用的方式併入本文中。
在一個態樣中，引入連接子單元之第二部分，其具有第二反應性部位，例如與存在於抗體單元(例如抗體)上之親核性基團具有反應性之親電子基團。抗體上之適用親核性基團包括(但不限於)硫氫基、羥基及胺基。抗體之親核性基團之雜原子對連接子單元上之親電子基團具有反應性且與連接子單元形成共價鍵。適用親電子基團包括(但不限於)順丁烯二醯亞胺及鹵乙醯胺基團。親電子基團提供宜用於抗體連接之位點。
在另一實施例中，連接子單元具有親核性基團對存在於抗體上之親電子基團具有反應性之反應性位點。抗體上之適用親電子基團包括(但不限於)醛及酮羰基。連接子單元之親核性基團之雜原子可與抗體上之親電子基團反應且與抗體形成共價鍵。連接子單元上之適用親核性基團包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫縮胺基脲(thiosemicarbazone)、肼甲酸酯及芳基醯肼。抗體上之親電子基團提供宜用於連接至連接子單元之位點。
胺基官能基亦係適用於連接子單元之反應性位點，因為其可與甲酸或化合物之活化酯反應，以形成醯胺鍵聯。通常，本發明之基於肽之化合物可藉由在兩個或更多個胺基酸及/或肽片段與之間形成肽鍵來製備。此類肽鍵可例如根據肽化學領域中熟知之液相合成方法(參見例如Schroder及Lubke, 「The Peptides」, 第1卷, 第76-136頁, 1965, Academic Press)製備。
如下文更詳細地描述，結合物可使用一段具有反應性位點之連接子單元來製備，以結合至本發明化合物且引入另一段具有抗體之反應性位點之連接子單元。在一個態樣中，連接子單元具有親電子基團對存在於抗體單元(諸如抗體)上之親核性基團具有反應性之反應性位點。親電子基團提供宜用於抗體連接之位點。抗體上之適用親核性基團包括(但不限於)硫氫基、羥基及胺基。抗體之親核性基團之雜原子對連接子單元上之親電子基團具有反應性且與連接子單元形成共價鍵。適用親電子基團包括(但不限於)順丁烯二醯亞胺及鹵乙醯胺基團。
在另一實施例中，連接子單元具有親核性基團對存在於抗體單元上之親電子基團具有反應性之反應性位點。抗體上之親電子基團提供宜用於連接至連接子單元之位點。抗體上之適用親電子基團包括(但不限於)醛及酮羰基。連接子單元之親核性基團之雜原子可與抗體上之親電子基團反應且與抗體形成共價鍵。連接子單元上之適用親核性基團包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫縮胺基脲、肼甲酸酯及芳基醯肼。
如本文所使用，亦被稱作「MalCValCitPABC-」之「mcValCitPABC-」係指
連接分子可為穩定(不可裂解)或可水解(可裂解)的，由此其係在ADC之細胞進入後自抗體釋放。連接子-藥物自抗體裂解之主要機制包括可裂解連接體在溶酶體(例如腙、縮醛及順烏頭酸酯類醯胺及其他)之酸性pH下的水解、藉由溶酶體酶(包括但不限於組織蛋白酶及其他溶酶體酶)之肽裂解，及二硫鍵之還原。由於此等變化的用於裂解之機制，用於將藥物連接至抗體之機制亦有極大變化，且可如此項技術中所理解來選擇任何合適的連接子。
適合結合程序之一個實例依賴於醯肼及其他親核試劑與藉由抗體上天然存在之碳水化合物氧化所產生之醛的結合。含有腙之結合物可藉由引入之提供所要藥物釋放特性的羰基製得。結合物亦可用在一端具有二硫化物、在中間具有烷基鏈且在另一末端具有肼衍生物的連接子製得。蒽環黴素為可使用此技術結合於抗體之細胞毒素之一個實例。
含有除腙以外之官能基的連接子有可能在溶酶體之酸性環境下裂解。舉例而言，結合物可自含有除腙以外之位點的硫醇反應性連接子製得，該位點可胞內裂解，諸如酯、醯胺及縮醛/縮酮。喜樹鹼為一種可使用此等連接子結合之細胞毒性劑。亦可使用由5員至7員環酮製成且使一個氧連接至細胞毒性劑並且使另一氧連接至連接子以用於抗體連接的縮酮蒽環黴素亦為與此等連接子一起使用之合適的細胞毒素的實例。
一類pH敏感連接子之另一實例為順烏頭酸酯，其使甲酸與醯胺鍵並置。甲酸加速在酸性溶酶體中之醯胺水解。亦可使用利用若干其他類型之結構達成相似類型之水解速率加速之連接子。類美登素為可與在C-9處連接之連接子結合之細胞毒素的實例。
用於藥物結合物之另一潛在釋放方法為藉由溶酶體酶對肽之酶水解。在一個實例中，經由醯胺鍵將肽連接至對胺基苯甲醇且接著在苯甲醇與細胞毒性劑之間製成胺基甲酸酯或碳酸酯。肽之裂解導致胺基甲酸胺基苯甲酯或碳酸酯之壓縮或自我分解。以此策略例示之細胞毒性劑包括蒽環黴素、紫杉烷、絲裂黴素C及奧瑞他汀。在一個實例中，酚亦可藉由壓縮連接子而非胺基甲酸酯來釋放。在另一變化形式中，使用二硫化物還原來引發胺基甲酸或碳酸對巰基苯甲酯之壓縮。
與抗體結合之許多細胞毒性劑(若存在)具有極低水溶性且其可由於結合物之凝集而限制在結合物上之藥物負載。一種克服此情況之方法係向連接子添加增溶基團。可使用利用由PEG及二肽組成之連接子製成之結合物，包括具有連接至抗體之PEG二酸、硫醇酸或順丁烯二醯亞胺酸、二肽間隔基及至蒽環黴素或倍癌黴素類似物之胺的醯胺鍵的結合物。另一實例為使用鍵結至細胞毒性劑之包含PEG之連接子二硫化物及鍵結至抗體之醯胺製備的結合物。併入PEG基團之方法可在克服凝集方面有益且限制藥物負載。
在本發明之一些態樣中，用於製備本發明之ADC之連接子包括具有下式之連接子： (CO-Alk1 -Sp1 -Ar-Sp2 -Alk2 -C(Z1 )=Q-Sp)其中 Alk1 及Alk2 獨立地為鍵或分支鏈或未分支(C1 -C10 )伸烷基鏈； Sp1 為鍵、—S—、—O—、—CONH—、—NHCO—、—NR'—、—N(CH2 CH2 )2 N—或—X-Ar'—Y—(CH2 )n —Z，其中X、Y及Z獨立地為鍵、—NR'—、—S—或—O—，其限制條件為當n=0時，則Y及Z中之至少一者必須為鍵，且Ar'為視情況經(C1 -C5 )烷基、(C1 -C4 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中一個、兩個或三個基團取代之1,2-、1,3-或1,4-伸苯基，其限制條件為當Alk'為鍵時，Sp1 為鍵； n為自0至5之整數； R'為視情況由—OH、(C1 -C4 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、(C1 -C3 )二烷胺基或(C1 -C3 )三烷基銨-A− 中之一或兩個基團取代之分支鏈或未分支(C1 -C5 )鏈，其中A− 為與鹽競爭之醫藥學上可接受之陰離子； Ar為視情況經(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之1,2-、1,3-或1,4-伸苯基，其中n及R'係如上文所定義，或1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-、或2,7-伸萘基或其中每一伸萘基或吩噻嗪視情況經(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個、三個或四個基團取代，其中n及R'係如上文所定義，其限制條件為當Ar為吩噻嗪時，Sp1 為僅連接至氮之鍵； Sp2 為鍵、—S—或—O—，其限制條件為當Alk2 為鍵時，Sp2 為鍵， Z1 為H、(C1 -C5 )烷基或視情況經(C1 -C5 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—ONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之苯基，其中n及R'係如上文所定義； Sp為直鏈或分支鏈二價或三價(C1 -C18 )基團、二價或三價芳基或雜芳基、二價或三價(C3 -C18 )環烷基或雜環烷基、二價或三價芳基-或雜芳基-芳基(C1 -C18 )基團、二價或三價環烷基-或雜環烷基-烷基(C1 -C18 )基團或二價或三價(C2 -C18 )不飽和烷基，其中雜芳基較佳為呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、N-甲基咔唑基、胺基香豆素基或吩嗪基，且其中若Sp為三價基團，則Sp可另外經以下取代：低碳(C1 -C5 )二烷胺基、低碳(C1 -C5 )烷氧基、羥基或低碳(C1 -C5 )烷硫基；及 Q為NHNCO—、=NHNCS—、=NHNCONH—、=NHNCSNH—或=NHO—。
較佳地，Alk1 為分支鏈或未分支(C1 -C10 )伸烷基鏈；Sp'為鍵、—S—、—O—、—CONH—、—NHCO—或—NR'，其中R'係如上文所定義，其限制條件為當Alk'為鍵時，Sp1 為鍵； Ar為視情況經(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之1,2-、1,3-或1,4-伸苯基，其中n及 R'係如上文所定義，或Ar為1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-伸萘基，其各自視情況經(C1 -C6 )烷基、(C1 -C5 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個、三個或四個基團取代。 Z1 為(C1 -C5 )烷基或視情況經(C1 -C5 )烷基、(C1 -C4 )烷氧基、(C1 -C4 )硫代烷氧基、鹵素、硝基、—COOR'、—CONHR'、—O(CH2 )n COOR'、—S(CH2 )n COOR'、—O(CH2 )n CONHR'或—S(CH2 )n CONHR'中之一個、兩個或三個基團取代之苯基；Alk2 及Sp2 共同為鍵；且Sp及Q係如上文直接定義。
美國專利第5,773,001號揭示可與由卡奇黴素製備之親核藥物，尤其醯肼及相關親核試劑一起使用的連接子，該專利以全文引用的方式併入本文中。此等連接子尤其適用於在藥物與連接子之間形成之鍵可水解時獲得較好活性的彼等情況。此等連接子含有兩個官能基，包括(1)用於與抗體(例如甲酸)反應之基團；及(2)用於與藥物反應之羰基(例如醛或酮)。羰基可與藥物上之醯肼基團反應，以形成腙鍵。此鍵為可裂解可水解的，從而允許在結合至靶細胞後自結合物釋放治療劑。在本發明之一些態樣中，所使用之可水解連接子為4-(4-乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)。在本發明之其他態樣中，可使用(3-乙醯基苯基)乙酸(AcPAc)或4-巰基-4-甲基-戊酸(醯胺)作為連接分子來製備ADC。
N-羥基丁二醯亞胺(OSu)酯或其他可相當地活化之酯可用於產生經活化可水解連接子-藥物部分。其他合適的活化酯之實例包括NHS (N-羥基丁二醯亞胺)、磺基-NHS (磺化的NHS)、PFP (五氟苯基)、TFP (四氟苯基)及DNP (二硝基苯基)。
在本發明之一些態樣中，藉由使卡奇黴素或其衍生物、4-(4-乙醯基苯基)丁酸連接子及本發明之抗GD3抗體反應來製備ADC。參見例如美國專利第5,773,001號。4-(4-乙醯基苯基)丁酸連接子產生實質上穩定循環之結合物，從而在37℃下在人類血漿中於活體外分析時，每天釋放經估計之2%的卡奇黴素。結合物在酸性溶酶體中釋放卡奇黴素。
在本發明之一些態樣中，4-(4-乙醯基苯基)丁酸-卡奇黴素部分可使用此項技術(諸如PCT國際公開案第WO 08/147765號及美國專利第8,273,862號)中所描述之方法及製程產生，該等專利以全文引用之方式併入本文中。
在本發明之一些態樣中，4-(4-乙醯基苯基)丁酸-卡奇黴素部分可使用如美國申請公開案第2016/0251389號中所描述之經改良合成製程產生，該公開案以全文引用之方式併入本文中。
本發明包括其中連接子可為二肽連接子,諸如纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、苯丙胺酸-離胺酸(phe-lys)連接子或順丁烯二醯亞胺基己酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(vc)連接子的連接子。在另一態樣中，連接子可為磺基丁二醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸酯(smcc)。磺基-smcc結合經由與硫氫基反應之順丁烯二醯亞胺基發生(硫醇，-SH)，而其磺基-NHS酯對一級胺有反應性(如在離胺酸及蛋白質或肽N端中發現)。此外，連接子可為順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。
適用於結合放射性同位素之代表性連接子包括二伸乙基三胺五乙酸酯(DTPA)-異硫氰酸酯、6-肼鎓菸鹼酸丁二醯亞胺酯鹽酸鹽(SHNH)或六甲基丙二胺肟(HMPAO) (Bakker等人 (1990)J . Nucl . Med . 31: 1501-1509, Chattopadhyay等人 (2001)Nucl . Med . Biol . 28: 741-744, Dewanjee等人 (1994)J . Nucl . Med . 35: 1054-63, Krenning等人 (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi等人 (2001)Ann . Nucl . Med . 15: 267-270)；美國專利第6,024,938號)。可替代地，靶向分子可經衍生化，使得放射性同位素可與其直接結合(Yoo等人(1997)J . Nucl . Med . 38: 294-300)。亦在此項技術中已知碘化方法，且可在例如Krenning等人 (1989)Lancet 1:242-4中及Bakker 等人 (1990)J . Nucl . Med . 31:1501-9中找到代表性方案。
在本發明之特定態樣中，本發明之GD3 ADC之連接子包括(但不限於) mcValCitPABC。
藥物 適用於製備所揭示GD3 ADC之藥物包括具有生物活性之任何物質，例如治療劑、可偵測標記、結合劑等及在活體內經代謝至活性劑之前藥。藥物亦可為藥物衍生物，其中藥物已經功能化以實現與本發明抗體之結合。根據所揭示之方法，使用藥物來製備式Ab-(L-D)p 之ADC，其中(a) Ab為結合至GD3之抗體或其抗原結合片段，(b) L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物，及(c)p 為指定亦被稱作平均藥物負載之藥物與抗體比(DAR)之整數，該平均藥物負載指示每抗體結合之藥物分子之數目。平均藥物負載指示在異質ADC群體中每抗體之藥物部分之總體平均數目。亦即，為4之平均藥物負載指示一些抗體分子可具有每抗體分子少於4個藥物部分，且其他抗體分子可具有每抗體分子超過4個藥物部分，但對於該群體，每抗體分子之藥物部分之總體平均數目為每抗體分子約4個藥物部分。如先前所述，「p 」為在1至約12之範圍內之整數且指定ADC之DAR。因此，在本發明之態樣中，GD3 ADC具有為1之DAR、為2之DAR、為3之DAR、為4之DAR、為5之DAR、為6之DAR、為7之DAR、為8之DAR、為9之DAR、為10之DAR、為11之DAR、為12之DAR或大於12之DAR。在本發明之態樣中，GD3 ADC可具有根據每一抗體分子結合之一個藥物分子、或2個藥物分子、或3個藥物分子、或4個藥物分子、或5個藥物分子、或6個藥物分子、或7個藥物分子、或8個藥物分子、或9個藥物分子、或10個藥物分子、或11個藥物分子、或12個藥物分子或超過12個分子。
術語「藥物與抗體比」或「DAR」係指連接至ADC之抗體的藥物(例如奧瑞他汀)之數目。ADC之DAR可在1至12之範圍中，但較高負載(例如16)亦為可能的，其視抗體上之鍵聯位點之數目而定。術語DAR可參考裝載至個別抗體上之藥物分子之數目使用，或替代地可參考ADC之群組之平均或均值DAR使用以反映平均藥物負載。
複數個ADC之組成、批次及/或調配的特徵可在於平均DAR。DAR及平均DAR可藉由諸如UV光譜法、質譜、ELISA分析、輻射量測方法、疏水性相互作用層析(HIC)、電泳及HPLC之各種習知手段測定。
在一個實施例，治療劑(例如藥物分子或部分)為對細胞起細胞毒性、細胞生長抑制及/或免疫調節效應之試劑，該細胞包括癌細胞或相較於在其他方面一致但並非異常的細胞呈現異常生長特徵的細胞。異常生長特徵可包括(但不限於)減少之細胞循環生長或分裂時間、較大生長規模及接觸抑制缺失，使得該細胞可相較於在其他方面一致但正常的細胞生長至較大密度。可與本發明抗體結合之治療劑之實例包括細胞毒性劑、化學治療劑、細胞生長抑制劑及免疫調節劑以及其他。此等試劑適用於治療癌症。
治療劑為可用於治療或預防有需要之個體之病況的組合物。適用於本發明之治療劑包括抗癌劑，亦即，對諸如來自癌症之癌細胞之細胞有抗癌活性的試劑，該等癌症包括(但不限於)黑色素瘤、乳癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤及肺癌，其中癌細胞表現GD3。
代表性治療劑包括細胞毒素、細胞毒性劑及細胞生長抑制劑。「細胞毒性效果」係指減少、消除及/或殺滅靶細胞。細胞毒性劑係指對細胞具有細胞毒性及/或細胞生長抑制效果之試劑。「細胞生長抑制效果」係指對細胞生長及/或增殖之抑制。因此，細胞生長抑制劑係指對細胞具有細胞生長抑制效果，由此抑制細胞之生長及/或擴增的試劑。
額外代表性治療劑包括放射性同位素、抗血管生成劑、抗增殖劑、促凋亡劑及溶胞酶(例如RNAses)。試劑亦可包括治療性核酸，諸如編碼基因之免疫調節劑、抗血管生成劑、抗增殖劑或促凋亡劑。此等藥物描述詞不相互排斥，且因此可使用一或多個上述術語描述治療劑。舉例而言，所選放射性同位素亦為細胞毒素。治療劑可製備為上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。一般而言，具有放射性同位素作為藥物之結合物稱為放射免疫結合物，且具有化學治療劑作為藥物之結合物稱為化學免疫結合物。
細胞毒性劑之實例包括(但不限於)蒽環黴素、奧瑞他汀、CC-1065、海兔毒素、倍癌黴素、烯二炔、格爾德黴素、美登素、嘌呤黴素、紫杉烷、長春花生物鹼、SN-38、特吡萊辛、哈米特林及其立體異構體、電子等排物、類似物或衍生物。亦可使用植物毒素、其他生物活性蛋白質、酶(亦即ADEPT)、放射性同位素、光敏劑(亦即用於光動力學療法)。
蒽環黴素源自細菌鏈黴菌(Streptomyces )且已用於治療大範圍之癌症，諸如白血病、淋巴瘤、乳癌、子宮癌、卵巢癌及肺癌。例示性蒽環黴素包括(但不限於)道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin) (亦即阿德力黴素(adriamycin))、表柔比星(epirubicin)、艾達黴素(idarubicin)、伐柔比星(valrubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone)。
海兔毒素及其肽類似物及衍生物奧瑞他汀為高度有效的抗有絲分裂劑，其已展示具有抗癌及抗真菌活性。參見例如美國專利第5,663,149號及Pettit等人，Antimicrob . Agents Chemother . 42:2961-2965, (1998)。例示性海兔毒素及奧瑞他汀包括(但不限於)海兔毒素10、奧瑞斯他汀E、奧瑞他汀EB (AEB)、奧瑞他汀EFP (AEFP)、MMAD (單甲基奧瑞他汀D或單甲基海兔毒素10)、MMAF (單甲基奧瑞他汀F或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-多拉索因-多拉普因-苯丙胺酸)、MMAE (單甲基奧瑞他汀E或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-多拉索因-多拉普因-降麻黃鹼)、5-苯甲醯基戊酸-AE酯(AEVB)。
在本發明之一些態樣中，在本文中使用PCT國際公開案第WO 2013/072813號中所描述之奧瑞他汀及產生彼等奧瑞他汀之方法，該PCT國際公開案以全文引用的方式併入本文中。
舉例而言，奧瑞他汀0101，即(2-甲基丙胺醯基-N -[(3R , 4S , 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R ,2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺)具有以下結構：
另外，奧瑞他汀8261，即2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺具有以下結構：
倍癌黴素及CC-1065為具有細胞毒性效能之DNA烷基化劑。參見Boger及Johnson，PNAS 92:3642-3649, 1995。例示性海兔毒素及奧瑞他汀包括(但不限於)(+)-倍癌黴素A及(+)-倍癌黴素SA及(+)-CC-1065。
烯二炔為特徵在於九員及十員環或存在具有結合之參-雙-參鍵之環狀系統的一類抗腫瘤細菌產品。例示性烯二炔包括(但不限於)卡奇黴素(calicheamicin)、埃斯培拉黴素(esperamicin)及達米辛(dynemicin)。
在本發明之一些態樣中，細胞毒性劑為抗生素，諸如亦被稱作LL-E33288錯合物之卡奇黴素，例如β-卡奇黴素、γ-卡奇黴素、或N-乙醯基-γ-卡奇黴素(γ-卡奇黴素(γ1 ))。適合用於本發明之卡奇黴素之實例揭示於例如美國專利第4,671,958號、第4,970,198號、第5,053,394號、第5,037,651號、第5,079,233及第5,108,912號中，其以全文引用的方式併入本文中。此等化合物含有可與適當硫醇反應以形成二硫化物之甲基三硫化物，同時引入適用於將卡奇黴素結合於GD3抗體之官能基，諸如醯肼或其他官能基。亦可使用卡奇黴素之二硫化物類似物，例如描述於美國專利第5,606,040號及第5,770,710,號中之類似物，該等專利以全文引用的方式併入本文中。在本發明之一些態樣中，二硫化物類似物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(下文稱為「CM」)。
格爾德黴素為結合於Hsp90 (熱休克蛋白90)且已用作抗腫瘤藥物之苯醌安沙黴素抗生素。例示性格爾德黴素包括(但不限於) 17-AAG (17-N-烯丙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素)及17-DMAG (17-二甲基胺基乙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素)。
美登素或其衍生物類美登素係藉由抑制微管蛋白聚合，抑制有絲分裂期間微管形成，來抑制細胞增殖。參見Remillard等人，Science 189:1002-1005, 1975。例示性美登素及類美登素包括(但不限於)美登素 (DM1)及其衍生物以及安絲菌素(ansamitocin)。
紫杉烷為充當抗微管蛋白劑或有絲分裂抑制劑之二萜。例示性紫杉烷包括(但不限於)太平洋紫杉醇(paclitaxel)(例如TAXOL® )及多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE® )。
長春花生物鹼亦為抗微管蛋白劑。例示性長春花生物鹼包括(但不限於)長春新鹼、長春鹼、長春地辛(vindesine)及長春瑞賓(vinorelbine)。
在本發明之一些態樣中，藥物為免疫調節劑。免疫調節劑之實例包括(但不限於)更昔洛韋(ganciclovir)、依那西普(etanercept)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、伏環孢素(voclosporin)、環孢靈(cyclosporine)、雷帕黴素(rapamycin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸酯(mycophenolgate mofetil)、甲胺喋呤(methotrextrate)、糖皮質激素及其類似物、細胞因子、幹細胞生長因子、淋巴毒素(lymphotoxin)、腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子、介白素(例如介白素-1 (IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18及IL-21)、群落刺激因子(例如粒細胞群落刺激因子(G-CSF)及粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ)、稱為「S 1因子」之幹細胞生長因子、紅血球生成素及血小板生成素或其組合。
適用於本發明之免疫調節劑亦包括阻斷對腫瘤之荷爾蒙作用的抗激素及遏制細胞介素產生、下調自體抗原表現或遮擋MHC抗原之免疫抑制劑。代表性抗激素包括抗雌激素，包括例如他莫昔芬、拉洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑之芳香酶、4-羥基他莫昔芬、特洛西芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、那普斯酮(onapnstone)及托瑞米芬(toremifene)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及抗腎上腺劑。代表性免疫抑制劑包括2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧啶、硫唑嘌呤、環磷醯胺、溴隱定(bromocryptine)、達那唑(danazol)、氨苯碸(dapsone)、戊二醛、針對MHC抗原及MHC片段之抗個體基因型抗體、環孢素A (cyclosporin A)、類固醇(諸如糖皮質類固醇)、細胞介素或細胞介素受體拮抗劑(例如，抗干擾素抗體、抗IL10抗體、抗TNFa抗體、抗IL2抗體)、鏈激酶、TGFβ、雷帕黴素(rapamycin)、T細胞受體、T細胞受體片段及T細胞受體抗體。
在本發明之一些態樣中，藥物為治療性蛋白質，包括(但不限於)毒素、激素、酶及生長因子。
毒素蛋白質(或多肽)之實例包括(但不限於)白喉(例如白喉A鏈)、綠膿桿菌(Pseudomonas )外毒素及內毒素、蓖麻毒素(例如蓖麻毒素A鏈)、相思子毒素(例如相思子毒素A鏈)、莫迪素(例如莫迪素A鏈)、α-帚麴菌素、油桐蛋白質、康乃馨蛋白質、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌(Staphylococcal )腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白質、白樹素、白喉毒素、美洲商陸蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、黴菌毒素(tricothecene)、抑制劑胱胺酸結頭(ICK)肽(例如賽拉毒素(ceratotoxin))及芋螺毒素(conotoxin)(例如KIIIA或SmIIIa)。
激素之實例包括(但不限於)雌激素、雄激素、孕激素及皮質類固醇。
在本發明之一些態樣中，細胞毒性劑可使用脂質體或生物相容性聚合物製得。如本文所描述之抗GD3抗體可結合於生物相容的聚合物，以增加血清半衰期及生物活性及/或延長活體內半衰期。生物相容性聚合物之實例包括水溶性聚合物,諸如聚乙二醇(PEG)或其衍生物，及含有兩性離子之生物相容性聚合物(例如含有磷酸膽鹼之聚合物)。
在本發明之一些態樣中，藥物為寡核苷酸，諸如反義寡核苷酸。
適用於本發明之額外藥物包括抑制血管形成之抗血管生成劑，例如法尼基(famesyl)轉移酶抑制劑、COX-2抑制劑、VEGF抑制劑、bFGF抑制劑、類固醇硫酸酯酶抑制劑(例如，2-甲氧基雌二醇雙-胺基苯磺酸鹽(2-MeOE2bisMATE))、介白素-24、凝血栓蛋白、金屬蛋白酶蛋白、I類干擾素、介白素12、魚精蛋白、血管生長抑素、層黏連蛋白、內皮生長抑素及促乳素片段。
抗增殖劑及促凋亡劑包括PPAR-γ (例如，環戊烯酮、前列腺素(cyPGs))、類視黃素、三萜系化合物(例如，環阿烷、羽扇豆烷、α-香樹烷、齊燉果烷、木栓烷、大馬樹烷、葫蘆素及檸檬苦素三萜系化合物)之活化劑；EGF受體(例如，HER4)、雷帕黴素、CALCITRIOL® (1,25-二羥基膽鈣化醇(維生素D))之抑制劑；芳香酶抑制劑(FEMARA® (來曲唑(letrozone)))；端粒酶抑制劑；鐵螯合劑(例如，3-胺基吡啶-2-甲醛硫縮胺基脲(Triapine))；凋亡蛋白(來自雞貧血病毒之病毒蛋白3-VP3)；Bcl-2及Bcl-X(L)、TNF-α、FAS配體、TNF相關細胞凋亡誘導配體(TRAIL/Apo2L)之抑制劑；TNF-α/FAS配體/TNF相關細胞凋亡誘導配體(TRAIL/Apo2L)信號傳導之活化劑；及PI3K-Akt存活路徑信號傳導之抑制劑(例如，UCN-01及格爾德黴素(geldanamycin))。
代表性化學治療劑包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；阿奇定(aziidine)，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲基三聚氰胺；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、氮乙環磷醯胺(trofosfarnide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤、曲美沙特；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱、阿紮胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-EU；雄激素，諸如卡魯睾酮、丙酸屈他雄酮、環硫雄醇、美雄烷、睪內酯；抗腎上腺，諸如胺魯米特(arninoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸、醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙胺酸；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基尿素；磨菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2',2'-三氯三乙胺；尿烷；長春地辛；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉，例如太平洋紫杉醇(TAXOL®，Bristol-Myers Squibb Oncology of Princeton，N.J.)及多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE® ，Rhone-Poulenc Rorer of Antony，France)；苯丁酸氮芥(chiorambucil)；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞賓；溫諾平(navelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔紅黴素；胺喋呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波黴素；及卡培他濱。
可根據本發明使用之額外治療劑包括光增敏劑，諸如美國公開案第20020197262號及美國專利第5,952,329號，其以全文引用的方式併入本文中，其用於光動力學療法；用於溫熱療法之磁性粒子，諸如美國公開案第20030032995號，其以全文引用的方式併入本文中；結合劑，諸如肽、配體、細胞黏附配體等；及前藥，諸如含磷酸鹽之前藥、含硫代磷酸鹽之前藥、含硫酸鹽之前藥、含肽之前藥、含β-內醯胺之前藥、含經取代之苯氧基乙醯胺之前藥或含經取代之苯基乙醯胺之前藥；5-氟胞嘧啶及可轉化為更具活性之細胞毒性游離藥物的其他5-氟尿苷前藥。
診斷方法 對於使用抗GD3抗體之診斷方法，經結合藥物可包括用以偵測GD3表現細胞在活體外或活體內之存在的可偵測標記。可在活體內偵測之放射性同位素(諸如，可使用閃爍攝影術、磁共振成像或超音波偵測之彼等標記)可用於臨床診斷應用。有用之閃爍攝影標記包括正電子發射體及γ-發射體。磁源成像之代表性造影劑為順磁性或超順磁性離子(例如，鐵、銅、錳、鉻、鉺、銪、鏑、鈥及釓)、氧化鐵粒子及水溶性造影劑。對於超音波偵測，氣體或液體可截留於作為微泡造影劑釋放之多孔無機顆粒中。對於活體外偵測，有用之可偵測標記包括螢光團、可偵測抗原決定基或結合劑及放射性標記。
因此，在本發明之一些態樣中，藥物為顯影劑(例如螢光團或PET (正電子發射斷層攝影術)標記、SPECT (單光子發射電腦斷層攝影術)標記)或MRI (磁共振成像)標記。
活體內偵測及診斷 在另一態樣中，提供一種偵測、診斷及/或監測與GD3表現相關之病況之方法。舉例而言，如本文所描述之GD3抗體或ADC可用可偵測部分(諸如顯影劑及酵-受質標記)標記。如本文所描述之GD3抗體或ADC亦可用於活體內診斷分析，諸如活體內成像(例如PET或SPECT)或染色反應劑。
在向個體投與GD3抗體或ADC後，其中藥物為可偵測標記，且在足夠用於結合之時間後，可觀測由抗體或ADC結合之GD3表現細胞的生物分佈。所揭示之診斷方法可與治療方法組合使用。此外，可投與本發明之GD3抗體或ADC，以用於偵測及治療之雙重目的。
代表性非侵入偵測方法包括閃爍攝影術(例如SPECT (單光子發射電腦斷層攝影術)、PET (正電子發射斷層攝影術)、γ攝影機成像及直線掃描)、磁共振成像(例如常規磁共振成像、磁化傳遞成像(MTI)、質子磁共振光譜(MRS)、擴散加權成像(DWI)及功能性MR成像(fMRI))及超音波。
當在本文中使用時，術語「標記」係指直接或間接結合於抗體從而產生「經標記」抗體的可偵測化合物或組合物。標記自身可為可偵測的(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記之情況下，可催化受質化合物或組合物的化學改變，此改變為可偵測的。可充當可偵測標記之放射性核素包括(例如) I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212及Pd-109。該標記亦可能為不可偵測實體，諸如毒素。
螢光團之實例包括(但不限於)螢光異硫氰酸鹽(FITC) (例如5-FITC)、螢光素醯胺(FAM) (例如5-FAM)、曙紅、羧基螢光素、紅螢素、Alexa Fluor® (例如Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基若丹明(TAMRA) (例如5,-TAMRA)、四甲基若丹明(TMR)及磺醯羅丹明(SR) (例如SR101)。
治療性或診斷性放射性同位素或其他標記(例如PET或SPECT標記)可併入至試劑中，以用於結合於如本文所描述之抗GD3抗體。同位素可直接結合至抗體，例如在抗體中所存在之半胱胺酸殘基處，或可使用螯合劑來介導抗體與放射性同位素之結合。適合於放射線療法之放射性同位素包括(但不限於) α-發射體、β-發射體及歐傑(auger)電子。對於診斷應用，有用之放射性同位素包括正電子發射體及γ-發射體。本發明之抗GD3抗體可例如在抗體之酪胺酸殘基上進一步碘化，以促進抗體之偵測或治療作用。
放射性同位素或其他標記之實例包括(但不限於)3 H、11 C、13 N、14 C、15 N、15 O、35 S、18 F、32 P、33 P、47 Sc、51 Cr、57 Co、58 Co、59 Fe、62 Cu、64 Cu、67 Cu、67 Ga、68 Ga、75 Se、76 Br、77 Br、86 Y、89 Zr、90 Y、94 Tc、95 Ru、97 Ru、99 Tc、103 Ru、105 Rh、105 Ru、107 Hg、109 Pd、111 Ag、111 In、113 In、121 Te、122 Te、123 I、124 I、125 I、125 Te、126 I、131 I、131 In、133 I、142 Pr、143 Pr、153 Pb、153 Sm、161 Tb、165 Tm、166 Dy、166 H、167 Tm、168 Tm、169 Yb、177 Lu、186 Re、188 Re、189 Re、197 Pt、198 Au、199 Au、201 Tl、203 Hg、211 At、212 Bi、212 Pb、213 Bi、223 Ra、224 Ac及225 Ac。
製備 GD3 抗體 - 藥物結合物之方法 亦提供用於製備本發明之ADC之方法。舉例而言，一種用於產生如本文所揭示之GD3 ADC之製程可包括(a)將連接子連接於藥物部分；(b)將連接子-藥物部分結合於抗體；及(c)純化ADC。
在一些態樣中，GD3 ADC可使用連接子-酬載部分經由抗GD3或其抗原結合片段之一或多個半胱胺酸殘基之習知非特異性結合產生。
在另一態樣中，GD3 ADC可使用連接子-酬載部分經由經工程改造至抗GD3抗體恆定結構域中之一或多個反應性半胱胺酸殘基之位點特異性結合產生。製備抗體以用於經由經工程改造之半胱胺酸殘基之位點特異性結合之方法描述於PCT國際公開案第WO2013/093809中，其以全文引用的方式併入本文中。
用於形成結合物之最佳反應條件可憑經驗藉由反應變數(諸如溫度、pH、連接子-卡奇黴素部分輸入及添加劑濃度)之變化測定。適合於結合其他藥物之條件可藉由熟習此項技術者測定而無需過度實驗。用於結合及表徵GD3 ADC之代表性方法描述於實例6中。
在結合後，結合物可自未經結合反應物及/或凝集形式之結合物分離、純化，且藉由習知方法表徵。其包括諸如但不限於以下之方法：質譜、尺寸排外層析法(SEC)、超過濾/透濾作用、離子交換層析法(IEC)、層析聚焦(CF)、定點突變誘發、螢光標記、X射線結晶、高效液相層析(HPLC)、快速蛋白液相層析(FPLC)、丙烯葡聚糖凝膠S-200層析或疏水相互作用層析(HIC)。合適的HIC介質包括(但不限於)苯基瓊脂糖6快速流動層析介質、丁基瓊脂糖4快速流動層析介質、辛基瓊脂糖4快速流動層析介質、Toyopearl醚-650M層析介質、大型製備型甲基HIC介質或大型製備型第三丁基HIC介質。
用於表徵 GD3 抗體或抗體 - 藥物結合物之功能分析 本發明另外另外揭示用以表徵GD3抗體或ADC之活性(包括GD3結合活性)的活體外及活體內分析、在結合於細胞表面上所呈現之GD3抗原及靶向至組織或個體中之GD3表現細胞之後的細胞內化。在本發明之一些態樣中，GD3 ADC的特徵在於GD3抗體或其抗原結合片段之中和或耗乏態樣。在本發明之一些態樣中，如與缺乏替代藥物之功效相比，GD3 ADC的特徵在於特定藥物之未預期功效。在本發明之一些態樣中，GD3抗體或ADC經表徵為勝過具有與藥物相同之作用模式但並未結合於本發明抗體之標準保健治療劑。
功能分析包括用於評定GD3抗體或ADC之抗癌活性(例如除滅現有癌細胞或延遲或預防癌細胞之生長的能力)之方法。藉由本發明之ADC之靶向之癌症包括在個體中之任何組織之原發性及轉移性腫瘤及癌瘤，包括癌瘤及造血性惡性病，諸如白血病及淋巴瘤，其中腫瘤細胞表現GD3。
具有生長抑制活性之GD3抗體或ADC可消除GD3表現細胞或預防或減少GD3表現細胞之增殖。用於細胞生長抑制之快速活體外評定之代表性方法描述於Jones等人(2001) J. Immunol. Methods 254:85-98。
GD3抗體或ADC亦可包括誘導細胞死亡(例如漸進式細胞死亡)的能力，其特徵在於核DNA降解、核變性及縮合、膜完整性損失及噬菌作用。用以評定細胞死亡之代表性分析描述於Hoves等人(2003) Methods 31:127-34；Peng等人(2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21；Yasuhara 等人(2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885中。
舉例而言，為在活體外評定抗GD3裸抗體或GD3-ADC之細胞毒性，在GD3 ADC之存在下及分別在相同條件下但在GD3抗體或GD3-ADC不存在的情況下培養GD3表現癌細胞及在其他方面一致之亦GD3表現對照細胞。GD3抗體或GD3-ADC之細胞毒性經報導為ED50 (ng/ml)，其為既定為結合物或游離抗體或游離藥物的藥物的量，其引起細胞培養物相對於未經處理之對照之50%減少。在其他此項技術中公認的方法中，在藥物暴露後使用活體染色劑(MTS)測定培養物中之細胞之數目。
為在活體內評定GD3抗體或ADC之細胞毒性，藉由皮下注射各種癌細胞來製備免疫功能不全小鼠中之腫瘤。可例如藉由一週兩次腹膜內注射持續兩週而向負載腫瘤之小鼠投與GD3抗體或ADC及對照化合物(q4dx4)。可量測治療結果包括抑制腫瘤細胞生長。
應理解，本發明涵蓋抑制或殺滅GD3表現任何腫瘤或癌細胞。
使用及醫學療法 活體外應用 本發明提供使用GD3抗體或ADC之活體外方法。舉例而言，可單獨或結合細胞毒性劑或其他藥物結合使用所揭示之GD3抗體或ADC，以特異性結合GD3-陽性癌細胞以自細胞樣品耗盡此類細胞。亦提供用於經由使GD3表現細胞與GD3抗體或ADC接觸而誘導細胞凋亡及/或抑制細胞增殖的方法。在上文以「用於表徵GD3抗體-藥物結合物之功能分析」的標題來描述代表性活體外方法。
本發明之GD3抗體或ADC亦在基於其特異性結合GD3抗原之能力在活體外偵測GD3-陽性細胞中有效。一種用於偵測GD3表現細胞之方法可包括：(a)製備具有細胞之生物樣品；(b)使GD3抗體或ADC與活體外生物樣品接觸，其中藥物為可偵測標記；及(c)偵測GD3抗體或ADC之結合。
治療應用 GD3相關疾病或病況包括(但不限於)黑色素瘤、乳癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤及肺癌。亦即，GD3在正常成人細胞中通常並未以較高量表現，使得通常並不表現GD3之細胞類型中之GD3之較高表現量係以下指示：細胞與疾病、病症或病況相關或引起疾病、病症或病況，該疾病、病症或病況與GD3表現相關或由GD3表現介導。如本文先前所述，已知與GD3表現相關或由GD3表現介導之疾病、病症或病況包括(例如)黑色素瘤、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、乳癌及肺癌。然而，本發明涵蓋與一般不表現GD3之細胞對GD3之表現相關或由該GD3表現介導之任何疾病、病症或病況，且此類表現可易於使用本文所描述或此項技術中已知之任何方法來偵測，以評定GD3在細胞或組織中之表現。
片語「有效量」、「有效劑量」或如本文所使用，係指達成任何一或多種有益或所要治療結果必需之藥物、化合物或醫藥組合物的量。對於防治性用途，有益或所要結果包括消除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度或延緩疾病發生，包括疾病、其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理性表型之生物化學、組織及/或行為症狀。對於治療用途，有益或所要結果包括臨床結果，諸如減少發病率或改善與GD3表現相關或由GD3表現介導之各種疾病、病症或病況的一或多種症狀，包括減小治療疾病所需之其他藥劑的劑量，增強另一藥劑之效果，及/或延緩個體(包括患者)之疾病、病症或病況的惡化。
在一個態樣中，本發明提供一種用於治療有需要之個體中與細胞中之GD3表現相關或由該GD3表現介導之病況的方法。本發明亦提供如本文所描述之GD3抗體或ADC或醫藥組合物，其用於治療有需要之個體中與GD3表現相關或由GD3表現介導之疾病、病症或病況之方法。本發明進一步提供如本文所描述之ADC或醫藥組合物之用途，其用於製造治療與GD3表現相關或由GD3表現介導之病況的藥劑。
在本發明之一些態樣中，治療有需要之個體中與GD3表現相關或由GD3表現介導之病況之方法包括向個體投與有效量之組合物(例如醫藥組合物)，其包含本文所描述之GD3抗體或ADC。與GD3表現相關或由GD3表現介導之疾病、病症或病況包括(但不限於)增生性病症(例如癌症)，包括(但不限於)黑色素瘤、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、乳癌及肺癌。
適合於使用抗GD3抗體或ADC靶向之癌症包括GD3表現原發性及轉移性癌症，及與另外不表現GD3之細胞中之GD3表現相關或由該GD3表現介導之任何贅生性病症。
在本發明之一些態樣中，提供一種抑制患有GD3表現腫瘤之個體中之腫瘤生長或惡化的方法，包括向有需要之個體投與有效量的具有如本文所描述之GD3抗體或ADC之組合物。在其他態樣中，本發明提供一種抑制有需要之個體中之GD3表現癌細胞的癌轉移的方法，包括向該個體投與有效量的具有如本文所描述之GD3抗體或ADC之組合物。
在其他態樣中，本發明提供一種誘導有需要之個體中之GD3表現腫瘤的消退的方法，包括向該個體投與有效量的包含本發明之GD3抗體或ADC之組合物。
在其他態樣中，本發明提供如本文所描述之ADC或包含該ADC之醫藥組合物，其用於如上文所描述之方法中。在其他態樣中，本發明提供包含本發明之GD3抗體或ADC或相同之醫藥組合物的用途，其用於製造供上述方法中使用之藥劑。
因此，待用本發明之GD3抗體或ADC治療之個體可基於生物標記物表現(包括(但不限於)塊體腫瘤樣品之mRNA (qPCR))而選擇，以偵測較高GD3表現。此類篩選可產生針對富含靶標(亦即GD3)之表現而非腫瘤病因或組織學選擇的患者群體。可根據GD3細胞染色之數目結合GD3細胞染色之強度來量測GD3表現。舉例而言，較高GD3表現之分類包括其中大於30% (亦即40%、50%或60%)細胞由針對含量3+ (在1至4之規模上)的GD3染色陽性之免疫組織化學測試的彼等患者，而適度GD3表現可包括其中大於20%之細胞以約1+至2+之染色強度水平進行細胞染色的彼等患者。
癌症生長或異常增殖係指多個指標中之任一者，該等指標暗示在細胞內會發展成癌症形式或疾病病況的變化。抑制癌細胞或非贅生性增生性病症之細胞的生長(諸如經延緩或經減少之腫瘤生長(例如腫瘤體積)及抑制癌轉移)可藉由此項技術中已知之方法分析。用於量測癌症生長之抑制的其他指標包括癌細胞存活之減小、腫瘤細胞數目之減少、腫瘤體積或形態之減小(例如，如使用電腦斷層攝影術(CT)、超音波掃描或其他成像方法測定)、腫瘤脈管毀壞、遲發性過敏皮膚測試之經改善表現、溶胞T淋巴細胞之活性的增加及腫瘤特異性抗原含量之減低。
與對照或基線量測值相比，所揭示之治療方法之所要結果通常為可定量的度量。如本文所使用，諸如「改良」、「增加」或「減少」之相對術語指示相對於對照之值，諸如在開始本文所描述之治療之前相同個體之量測值，或在本文所描述之治療不存在的情況下對照個體(或多個對照個體)之量測值。代表性對照個體為所罹患過度增殖病症形式與所治療個體相同、年齡與所治療個體大約相同的個體(以確保所治療個體與對照個體之疾病階段類似)。
回應於療法的變化或改善通常具有統計顯著性。如本文所用，術語「顯著性」或「顯著」係指兩個或超過兩個實體之間存在非隨機關聯之機率的統計學分析。為判定關係是否係「顯著」或是否具有「顯著性」，資料之統計學操控可為「p值」。低於使用者定義之截止點的P值視為顯著。p值小於或等於0.1、小於0.05、小於0.01、小於0.005或小於0.001可視為顯著。
組合療法 在本發明之一些態樣中，本文所描述之方法進一步包括用其他治療形式治療個體之步驟。在一些態樣中，其他治療形式為其他抗癌療法，包括(但不限於)化學療法、放射、手術、激素療法及/或其他免疫療法。
可投與所揭示之GD3抗體或ADC作為初始治療，或用於治療對習知療法無反應的病況。此外，GD3抗體或ADC可與其他療法(例如外科切除術、放射、其他抗癌藥等)組合使用，由此引發額外或增強的治療作用及/或減少一些抗癌劑之肝細胞毒性。本發明之GD3抗體或ADC可與其他試劑共同投與或共同調配，或用其他試劑調配以按任何次序連續投與。
適用於組合療法之代表性試劑包括在上文描述為適用於製備子標題「藥物」下之GD3 ADC之藥物中之任一者。本發明之GD3抗體或ADC亦可結合其他治療性抗體及ADC使用，包括除所揭示之抗GD3抗體以外之抗GD3抗體以及靶向不同抗原之抗體及結合物。可單獨使用或用作ADC之代表性抗體包括抗5T4抗體(例如A1、A2及A3)、抗CD19抗體、抗CD20抗體(例如RITUXAN®、ZEVALIN®、BEXXAR®)、抗CD22抗體、抗CD33抗體(例如MYLOTARG®)、抗CD33 ADC、抗路易Y抗體(例如Hu3S193、Mthu3S193、AGmthu3S193)、抗HER-2抗體(例如HERCEPTIN® (曲妥珠單抗(trastuzumab))、MDX-210，OMNITARG.RTM. (帕妥珠單抗(pertuzumab)，rhuMAb 2C4))、抗CD52抗體(例如CAMPATH®)、抗EGFR抗體(例如ERBITUX® (西妥昔單抗(cetuximab))、ABX-EGF (帕尼單抗(panitumumab)))、抗VEGF抗體(例如AVASTIN® (貝伐單抗(bevacizumab)))、抗DNA/組蛋白錯合物抗體(例如ch-TNT-1/b)、抗CEA抗體(例如CEA-Cide、YMB-1003) hLM609、抗CD47抗體(例如6H9)、抗VEGFR2 (或含有激酶插入物結構域之受體，KDR)抗體(例如IMC-1C11)、抗Ep-CAM抗體(例如ING-1)、抗FAP抗體(例如西羅珠單抗(sibrotuzumab))、抗DR4抗體(例如TRAIL-R)、抗孕酮受體抗體(例如2C5)、抗CA19.9抗體(例如GIVAREX®)及抗纖維蛋白抗體(例如MH-1)。
作為治療方案之部分，所揭示之GD3抗體或ADC亦可與細胞毒性劑之一或多種組合一起投與。適用於此目的之細胞毒性製劑包括CHOPP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼、強的松及丙卡巴肼)；CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及強的松)；COP(環磷醯胺、長春新鹼、強的松)；CAP-BOP(環磷醯胺、小紅莓、丙卡巴肼、博萊黴素、長春新鹼及強的松)；m-BACOD(甲胺喋呤、博萊黴素、小紅莓、環磷醯胺、長春新鹼、地塞米松及甲醯四氫葉酸)；ProMACE-MOPP (強的松、甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、依託泊苷、亞葉酸(leukovorin)、二氯甲基二乙胺(mechloethamine)、長春新鹼、強的松及丙卡巴肼)；ProMACE-CytaBOM (強的松、甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、依託泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷(cytarabine)、博萊黴素及長春新鹼)；MACOP-B (甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、長春新鹼、強的松、博萊黴素及亞葉酸)；MOPP (二氯甲基二乙胺、長春新鹼、強的松及丙卡巴肼)；ABVD (阿德力黴素/小紅莓、博萊黴素、長春鹼及達卡巴嗪)；與ABV(阿德力黴素/小紅莓、博萊黴素、長春鹼)交替之MOPP (二氯甲基二乙胺、長春新鹼、強的松及丙卡巴肼)；與ABVD (阿德力黴素/小紅莓、博萊黴素、長春鹼及達卡巴嗪)交替之MOPP (二氯甲基二乙胺、長春新鹼、強的松及丙卡巴肼)；ChIVPP (苯丁酸氮芥、長春鹼、丙卡巴肼、強的松)；IMVP-16 (異環磷醯胺、甲胺喋呤、依託泊苷)；MIME (米托胍腙(methyl-gag)、異環磷醯胺、甲胺喋呤、依託泊苷)；DHAP (地塞米松、高劑量阿糖胞苷及順鉑)；ESHAP (依託泊苷、甲基強的松、HD阿糖胞苷及順鉑)；CEPP(B) (環磷醯胺、依託泊苷、丙卡巴肼、強的松及博萊黴素)；CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷及強的松)；及CVP-1 (環磷醯胺、長春新鹼及強的松)；DHAP(順鉑、高劑量阿糖胞苷及地塞米松)；CAP (環磷醯胺、小紅莓、順鉑)；PV (順鉑、長春鹼或長春地辛)；CE (卡鉑、依託泊苷)；EP (依託泊苷、順鉑)；MVP (絲裂黴素、長春鹼或長春地辛、順鉑)；PFL (順鉑、5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸(leucovorin))；IM (異環磷醯胺、絲裂黴素)；IE (異環磷醯胺、依託泊苷)；IP (異環磷醯胺、順鉑)；MIP (絲裂黴素、異環磷醯胺、順鉑)；ICE (異環磷醯胺、卡鉑、依託泊苷)；PIE (順鉑、異環磷醯胺、依託泊苷)；長春瑞賓及順鉑；卡鉑及太平洋紫杉醇；CAV (環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼)；CAE (環磷醯胺、小紅莓、依託泊苷)；CAVE (環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼、依託泊苷)；EP (依託泊苷、順鉑)；及CMCcV (環磷醯胺、甲胺喋呤、洛莫司汀、長春新鹼)。
GD3抗體或ADC可與全身性抗癌藥(諸如埃博黴素(BMS-247550，Epo-906))、紫杉烷之再調配物(阿布拉生，Xyotax)、微管蛋白抑制劑(MST-997，TTI-237)組合或與靶向細胞毒素(諸如CMD-193及SGN-15)組合使用。其他適用抗癌劑包括TAXOTERE®、TARCEVA®、GEMZAR® (吉西他濱)、5-FU、AVASTIN® ERBITUX®、TROVAX®、麻安莫單抗(anatumomab mafenatox)、來曲唑、多烯紫杉醇及蒽環黴素。
對於組合療法，在適合於進行所欲療法或診斷之任何時間範圍內投與GD3抗體或ADC及/或一或多個其他治療或診斷劑。因此，單一試劑可實質上同時(亦即，作為單一調配物或在數分鐘或小時內)或按任何次序連續投與。舉例而言，單一試劑治療可彼此在約1年內，諸如在約10、8、6、4或2個月內，或在約4、3、2或1週內，或在約5、4、3、2或1天內投與。相比GD3抗體或ADC單獨投與，GD3抗體或ADC結合第二治療劑之投與較佳地引發較大效果。
在本發明之一些態樣中，可存在超過一個GD3抗體或GD3 ADC。可存在至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個不同或更多GD3抗體或GD3 ADC。大體而言，彼等GD3抗體或GD3 ADC可具有不會不利地彼此影響的互補活性。舉例而言，可使用以下GD3抗體中之一或多者：導向至GD3上之一個抗原決定基之第一GD3抗體及導向至GD3上之不同抗原決定基之第二GD3抗體。
所揭示組合療法可引發協同治療作用，亦即，大於其個別效果或治療結果之總和的效果。本文描述可量測治療結果。舉例而言，協同治療作用可為比由單一試劑引發之治療作用大至少約兩倍，或為由既定組合之單一試劑引發之治療作用之總和，或大至少約五倍、或大至少約十倍、或大至少約二十倍、或大至少約五十倍或大至少約一百倍的效果。協同治療作用亦可經觀測為相比由單一試劑引發之治療作用的至少約10%的治療作用的提高，或由既定組合之單一試劑引發之治療效果之總和，或至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約100%或更大。協同作用亦為當其組合使用時允許治療劑之劑量降低的作用。
調配物 本發明之GD3抗體或ADC可經調配為醫藥組合物。醫藥組合物可進一步包含呈凍乾調配物或水溶液形式之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑(Remington: The Science and practice of Pharmacy 第21版, 2005, Lippincott Williams 及Wilkins, Ed. K. E. Hoover)。一定劑量及濃度之可接受載劑、賦形劑或穩定劑對接受體無毒，且可包含：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚；丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(低於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、雙糖及包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖之其他碳水化合物；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。本文中進一步描述醫藥學上可接受之賦形劑。
內化 可藉由隨時間觀測結合至GD3表現細胞之表面之抗體或結合物的量來分析GD3表現細胞對GD3抗體或ADC的內化。所選GD3配體或其同功異構物可以可溶形式存在，且至少一些GD3有可能保持與細胞表面相關，由此允許內化本文所揭示之抗體。因此，本發明之抗GD3抗體或ADC可藉由GD3表現細胞內化。
可使用其中將細胞用GD3抗體或ADC及結合至皂草素毒素之二級抗體Fab片段培育的功能分析來評定GD3抗體或ADC之內化。隨後藉由任何合適的方法量測細胞存活率，其中細胞毒性指示抗體內化。
替代地，內化GD3抗體或ADC可使用成像技術評定以定量地量測內化。量測在細胞之子區室內由抗體或ADC發射之螢光信號，如以下實例5中所描述。此技術允許量測GD3抗體或ADC至細胞之核內體及溶酶體區室之內化及共定位。為定量經內化GD3抗體或ADC與溶酶體之間的共定位，可將樣品用本文所描述之GD3抗體或ADC培育，用溶酶體標記物LAMP-1染色，且接著使用Amnis成像流式細胞儀獲取。可應用Amnis IDEAS軟體之「類似性」演算法以量測來自本文所描述之GD3抗體或ADC及抗LAMP-1 (溶酶體標記物)抗體之螢光信號的空間共定位程度。
表示為類似性得分之內化量測值為細胞內部之螢光強度與整個細胞之螢光強度的比率，且經定義為經對數轉換之皮爾森相關係數。此得分量測兩個影像在逐像素基礎在細胞區內呈線性相關的程度。在對數級上映射比率，以增大最小值與最大值之間的範圍。類似性得分為0指示無內化，係因為在細胞外部之螢光等於在細胞內部之螢光。類似性得分為1或更高指示完整內化。在一些態樣中，使用溶酶體標記物來量測類似性得分，以定量本文所描述之抗GD3抗體至細胞之溶酶體區室之共定位。在一些態樣中，溶酶體標記物為LAMP-1。在一些態樣中，利用抗LAMP-1抗體偵測溶酶體標記物。
對比而言，出人意料地，本發明之抗體及ADC表明內化至較高程度的能力。HuR24展示約0.8之高內化得分(實例5)。
甚至更出人意料地，huR24-ADC不斷地表明相比huR24在細胞中內化及保持至甚至更高程度的能力，如由其約0.9至1.1之類似性得分證明(參見實例5)。此高類似性得分指示當與未結合於LD之huR24相比時，huR24-ADC之提高的溶酶體轉運及更快速內化。鑒於ADC工程改造的目標在於最小化裸抗體與結合抗體之間的行為差異，此為尤其出人意料的。此出人意料的差異係有利的，係因為其導致huR24-ADC之內化改良，以及相較於僅基於huR24之行為將預期的，huR24-ADC之酬載遞送改良。
在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段與溶酶體標記物之類似性得分為大致0.6。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段與溶酶體標記物之類似性得分為大致0.7。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段與溶酶體標記物之類似性得分為大致0.8。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為大致0.6、0.7或0.8。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段具有在100、200、300或350分鐘量測之類似性得分。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為大致0.6。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為大致0.7。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為大致0.8。
在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段具有在100分鐘量測之類似性得分。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段具有在200分鐘量測之類似性得分。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段具有在300分鐘量測之類似性得分。在一些態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段具有在350分鐘量測之類似性得分。
在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分為約0.6。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分為約0.7。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分為約0.8。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分為約0.9。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分為約1.0。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分為約1.1。在一些態樣中，本文所描述之ADC具有在100、200、300或350分鐘量測之類似性得分。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為約0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或1.1。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為約0.6。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為約0.7。在一些態樣中，本文所描述之ADC的類似性得分在100、200、300或350分鐘為約0.8。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為約0.9。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為約1.0。在一些態樣中，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分在100、200、300或350分鐘為約1.1。在其他態樣中，當與huR24相比時，本文所描述之ADC與溶酶體標記物之類似性得分在100、200或300分鐘為約0.9至1.1。
在一些態樣中，本文所描述之ADC具有在100分鐘量測之類似性得分。在一些態樣中，本文所描述之ADC具有在200分鐘量測之類似性得分。在一些態樣中，本文所描述之ADC具有在300分鐘量測之類似性得分。在一些態樣中，本文所描述之ADC具有在350分鐘量測之類似性得分。
劑量 出於本發明之目的，適當劑量之GD3抗體或GD3 ADC將視所採用之GD3抗體或GD3 ADC(或其組合物)、待治療症狀之類型及嚴重程度、是否投與試劑以用於治療性目的、先前療法、患者之臨床病史及對試劑的反應、患者對所投與試劑的清除速率及主治醫師之判斷而定。臨床醫師可投與GD3抗體或GD3 ADC直至達到達成及超出所需結果之劑量。劑量及/或頻率可隨治療過程變化，但同樣可保持不變。
經驗考量(諸如抗體或Ab-ADC之半衰期)大體上將促成對劑量之判定。舉例而言，與人類免疫系統相容之抗體(諸如人類化抗體或全人類抗體)可用於延長抗體半衰期且預防抗體受宿主之免疫系統攻擊。
在一些態樣中，本文所描述之GD3-ADC之小鼠之晚期血漿半衰期為選自由以下組成之群的一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天及約5.9天。在一些態樣中，本文所描述之GD3-ADC之小鼠之晚期血漿半衰期為5.6天或5.9天。在一些態樣中，本文所描述之GD3-ADC之大鼠之晚期血漿半衰期為選自由以下組成之群的一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天及約8.5天。在一些態樣中，本文所描述之GD3-ADC之大鼠之晚期血漿半衰期為8.1天或8.5天。在一些態樣中，本文所描述之GD3-ADC之猴之晚期血漿半衰期為選自由以下組成之群的一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天及約7.7天。在一些態樣中，本文所描述之GD3-ADC之猴之晚期血漿半衰期為7天、7.6天或7.7天。在一些態樣中，本文所描述之ADC之人類之晚期血漿半衰期為選自由以下組成之群的一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天及約7天。在一些態樣中，本文所描述之ADC之人類之晚期血漿半衰期為7天。
在一些態樣中，本文所描述之GD3抗體或其抗原結合片段之小鼠之晚期血漿半衰期為選自由以下組成之群的一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天、約8.5天、約9天、約9.5天、約10天、約10.5天及約10.9天。在一些態樣中，本文所描述之GD3抗體或其抗原結合片段之小鼠之晚期血漿半衰期為10.6天或10.9天。在一些態樣中，本文所描述之GD3抗體或其抗原結合片段之大鼠之晚期血漿半衰期為選自由以下組成之群的一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天、約8.5天、約9天、約9.5天、約10天、約10.5天、約11天、約11.5天、約12天、約12.5天、約13天、約13.5天及及約13.7天。在一些態樣中，本文所描述之GD3抗體或其抗原結合片段之大鼠之晚期血漿半衰期為12.3天或13.7天。在一些態樣中，本文所描述之GD3抗體或其抗原結合片段之猴之晚期血漿半衰期為選自由以下組成之群的一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天、約8.5天、約9天、約9.5天、約10天、約10.5天、約11天、約11.5天、約12天、約12.5天、約13天、約13.5天、約14天、約14.5天、約15天、約15.5天及約16天。在一些態樣中，本文所描述之GD3抗體或其抗原結合片段之猴之晚期血漿半衰期為10.8天、13天或16天。在一些態樣中，本文所描述之GD3抗體或其抗原結合片段之人類之晚期血漿半衰期為選自由以下組成之群的一或多者：約1天、約1.5天、約2天、約2.5天、約3天、約3.5天、約4天、約4.5天、約5天、約5.5天、約6天、約6.5天、約7天、約7.5天、約8天、約8.5天、約9天、約9.5天、約10天、約10.5天、約11天、約11.5天、約12天、約12.5天、約13天、約13.5天、約14天、約14.5天、約15天、約15.5天及約16天。在一些態樣中，本文所描述之GD3抗體或其抗原結合片段之人類之晚期血漿半衰期為10.8天、13天或16天。
投與頻率可在治療過程內測定及調整，且其一般但未必係基於症狀之治療及/或遏止及/或改善及/或延緩，例如腫瘤生長抑制或延緩等。或者，持續連續釋放GD3抗體或GD3-ADC之調配物可為適當的。各種調配物及達成持續釋放之裝置為此項技術中已知。
本發明之GD3抗體或GD3-ADC可使用任何合適方法投與，包括藉由注射(例如，經腹膜內、經靜脈內、經皮下、經肌內等)。亦可經由吸入投與GD3抗體或GD3-ADC，如本文所描述。大體而言，對於GD3抗體或GD3 ADC之投與，劑量可為約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2.5 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg及約 25 mg/kg。典型每日劑量的範圍可能為約以下中之任一者：3 µg/kg至30 µg/kg、至300 µg/kg、至3 mg/kg、至30 mg/kg、至100 mg/kg或更大，其視上述因素而定。對於在幾天或更長時間內的反覆投與，根據病況，維持治療直至所要症狀遏止出現或直至達成足夠治療水平，例如以抑制或延緩腫瘤生長/惡化或癌細胞之癌轉移。例示性給藥方案包括投與約2 mg/kg之初始劑量，隨後投與約1 mg/kg GD3抗體或GD3 ADC之每週維持劑量，或隨後每隔一週投與約1 mg/kg的維持劑量。其他例示性給藥方案包括投與遞增劑量(例如1 mg/kg之初始劑量及每週或更長時段逐步升高至一或多種較高劑量)。其他劑量方案亦可適用，視行醫者希望實現之藥物動力學衰變模式而定。舉例而言，在本發明之一些態樣中，涵蓋一週一至四次的給藥。在其他態樣中，涵蓋每月一次或每隔一月或每三個月一次給藥，以及每週一次、每兩週一次及每三週一次給藥。此療法之進程可易於藉由習知技術及分析來監測。給藥方案(包括所用的GD3抗體或GD3-ADC)可隨時間推移而變化。
在本發明之一些態樣中，可在已向其給與GD3抗體或GD3-ADC之一或多種投與的個體中憑經驗判定GD3抗體或GD3-ADC之劑量。向個體給與遞增劑量之GD3抗體或GD3 ADC。為評定功效，可遵循疾病之指示物。
對於活體外及中活體內應用，以有效劑量提供或投與GD3抗體或GD3-ADC。在臨床上下文中，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療之量。有效劑量可以一或多種投與形式投與。藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可以或可以不結合另一藥物、化合物或醫藥組合物達成。因此，在投與一或多種治療劑之情形下可考慮「有效劑量」，且若結合一或多種其他試劑可達成或達成所要結果，則單一試劑可視為以有效量給予。為使用所揭示GD3抗體或ADC偵測GD3陽性細胞，向個體投與可偵測量之本發明之組合物物(亦即，一定劑量之結合物)，以使得可在活體外或活體內判定結合物之存在。
舉例而言，當投與給癌症患者時，有效量包括足以引發抗癌活性之量，包括癌細胞溶解、癌細胞增殖之抑制、癌細胞凋亡之誘發、癌細胞抗原之減少、經延緩腫瘤生長及/或癌轉移之抑制。減小之腫瘤尺寸被公認為功效之臨床代替標記物。功效之另一公認標記物為無惡化存活期。本發明之GD3抗體或GD3-ADC大體上表明關鍵功效參數之至少25%改良，諸如中值存活率、腫瘤惡化時間及總體反應速率的改良。
GD3抗體或GD3-ADC可經由任何合適途徑投與給個人。熟習此項技術者應瞭解，本文所描述之實例並不意欲限制性的，而是說明可供使用之技術。因此，在本發明之一些態樣中，GD3抗體或GD3抗體結合物根據已知方法(諸如靜脈內投與)例如以藥團形式，或藉由經一段時間連續輸液，藉由肌內、腹膜內、腦脊髓內、顱內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑膜內，經由吹入、鞘內、經口、吸入或局部途徑投與給個人。投與可為全身性的(例如，靜脈內投與)或局部的。包括噴嘴式噴霧器及超音波噴霧器之供液體調配物用之市售噴霧器適用於投與。液體調配物可直接霧化，且凍乾粉末可在復原後霧化。或者，GD3抗體或GD3 ADC可使用碳氟化合物調配物及定劑量吸入器霧化，或以凍乾且研磨之粉末形式吸入。
在本發明之一些態樣中，GD3抗體或GD3 ADC經由位點特異性或靶向局部遞送技術投與。位點特異性或靶向局部傳遞技術之實例包括GD3抗體或GD3 ADC之各種可植入貯存源；或局部傳遞導管，諸如輸注導管、留置導管或針導管；合成移植物；外膜包覆；分流器及血管支架或其他可植入裝置；位點特異性載體，直接注射或直接施用。參見例如PCT國際公開案第WO 2000/53211號及美國專利第5,981,568號。
根據本發明之方法投與GD3抗體或GD3 ADC可例如視接受體之生理病況、投與目的為治療性抑或預防性及熟練從業者已知之其他因素而定為連續或間斷的。GD3抗體或GD3 ADC之投與可為在預選時間段內基本上連續的或可呈一系列間隔劑量形式。
套組 本發明亦提供套組或包含本發明之抗體或其抗原結合片段之製品及使用說明書。因此，在一些實施例中，提供一種套組或製品，其包含容器、在該容器內包含GD3抗體或GD3 ADC之組合物及含有用以投與治療有效量之抗IL-33拮抗劑抗體以用於治療有需要之個體的說明的藥品說明書。
在某些實施例中，套組可含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有水性調配物之第二容器。在某些實施例中，包括含有單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及冷凍乾燥物注射器)之套組。
關於本發明之抗體或其抗原結合片段之使用的說明書大體上包括關於用於所預期治療之劑量、給藥時程及投與途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如，多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組中供應之說明書為通常在標籤或藥品說明書(例如套組中包括之紙片)上之書面說明書，但機器可讀說明書(例如磁性或光學儲存盤上載有的說明書)亦為可接受的。
本發明套組呈合適包裝形式。合適的包裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋用於與特定裝置，諸如吸入器、經鼻投與裝置(例如，霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵)組合之包裝。套組可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。容器亦可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。容器可進一步包含第二醫藥活性劑。
套組可視情況提供諸如緩衝劑之額外組分及說明性資訊。通常，套組包含容器及在容器上或與容器相聯之標籤或藥品說明書。
定義 除非本文中另有定義，否則「約」或「大致地」當與可量測數值變數結合使用時係指變數之指定值及在該指定值之實驗誤差內之所有變數值(例如，在平均值之95%信賴區間內)或在該指定值之10%內，無論哪一值更大。數值範圍包括界定該範圍之數字。
如本文所使用，「載體」意謂構築體，其能夠遞送及較佳地表現宿主細胞中所關注之一或多個基因或序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑結合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，及某些真核細胞，諸如生產細胞。
如此項技術中已知，術語「一致性」係指兩個或更多個多肽分子或兩個或更多個核酸分子之序列之間的關係，如藉由比較該等序列所判定。在此項技術中，「一致性」亦意謂多肽或核酸分子序列之間的序列相關性程度，視具體情況而定，如藉由核苷酸或胺基酸序列串之間的匹配所判定。「一致性」量測間隙比對藉由電腦程式之特定數學模型(亦即「演算法」)定址之兩個或更多個序列之間的一致匹配百分比。
術語「類似性(similarity)」為相關概念，但相比於「一致性(identity)」，其指包括一致匹配與保守取代匹配之類似性度量。由於保守取代適用於多肽而非核酸分子，故類似性僅涉及多肽序列比較。若兩個多肽序列具有例如10/20個一致胺基酸，且剩餘物為所有非保守的取代，則一致性百分比及類似性兩者將均為50%。若在同一實例中，有5個更多存在保守取代的位置，則一致性百分比仍為50%，但類似性百分比將為75% (15/20)。因此，在存在保守取代之情況下，兩個多肽序列之間的類似性程度將高於此兩個多肽之間的一致性百分比。
儘管本發明支援涉及僅替代及「及/或」之定義，但除非明確指示為僅替代或替代相互排斥，否則術語「或」在申請專利範圍中之使用用於意謂「及/或」。除非另外清楚指示，否則如本說明書中所使用，「一(a)」或「一(an)」可意謂一或多個。如申請專利範圍中所使用，當與字組「包含」結合使用時，字組「一(a)」或「一(an)」可意謂一個或超過一個。如本文中所使用，「另一」可意謂至少第二個或更多個。除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。當參照本發明在本文中使用時，字組「包含(comprises/comprising)及字組「具有/包括」用於指明存在所陳述特徵、整數、步驟或組分但並不排除存在或添加一或多種其他特徵、整數、步驟、組分或其群。
生物寄存 本發明之代表性物質於2017年4月11日寄存於美國弗吉尼亞州20110-2209馬納薩斯10801大學大街之美國菌種保存中心。ATCC寄存編號為PTA-124057之載體huR24-VH包含編碼抗體huR24之重鏈可變區之DNA插入物，且ATCC寄存編號為PTA-124058之載體huR24-VL包含編碼抗體huR24之輕鏈可變區之DNA插入物。按照國際承認用於專利程序的微生物寄存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure) (布達佩斯條約(Budapest Treaty))及其下條例之規定進行寄存。此保證自寄存之日起維持30年之寄存物之活力培養。寄存將由ATCC在布達佩斯條約之條款下提供，且受制於Pfizer Inc.與ATCC之間的協議，其保證在相關美國專利發佈後或在任何美國或外國專利申請案對公眾公佈後(不分先後)，公眾可永久且無限制地利用寄存培養物之子代，且保證由美國專利及商標局委員根據35 U.S.C.第122節及依據其之委員規則(包括特定參考886 OG 638之37 C.F.R.第1.14節)經授權所確定者可利用子代。
本申請案之受讓人已同意，若處於保存之物質的培養物在適合條件下培養時死亡或損失或破壞，則將通知立即以另一相同物質置換該等物質。寄存物質之可供使用性不解釋為許可在違反由任何政府部門根據其專利法授予權利之情況下實踐本發明。
實例 提供以下實例僅為達成說明之目的，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實際上，除了本文所示及所述之修改之外，本發明之各種修改將由熟習此項技術者根據前文描述顯而易知，且屬於所附申請專利範圍之範疇內。
實例 1 鼠類抗 GD3 抗體之人類化 鼠類R24 (mR24)為結合GD3 (SEQ ID NO:17及19)之鼠類抗體。為將免疫原性之風險降至最低，作出人類化mR24以供進一步治療發展之嘗試。較早人類化mR24之嘗試揭示於WO2008/101234中。使用Kabat鑑別鼠類抗體mR24之CDR。使用半經驗構架混洗方法首次嘗試mR24之人類化。在此方法中，選擇與mR24序列、VL構架V1-12及V3-11及VH構架V3-7高度同源之人類生殖系構架。隨後，在構架區中無任何反突變的情況下，將所選構架用作mR24之受體構架。隨後將mR24之CDR插入至受體構架中，且產生抗體蛋白且評定其表現產率、純化特性及GD3標靶結合活性。在篩選後，評估具有高GD3結合活性、總體表現產率及穩定性之兩個高級人類化變體，即hAb 21 (SEQ ID NO: 30及31，VL構架V3-11及VH構架V3-7)及hAb3 (SEQ ID NO: 32及33，VL構架V1-12及VH構架V3-7)在純化後的凝集水平。如表3中所展示，hAb21及hAb3之親和力比chR24 (SEQ ID NO:28及29)低3倍至6倍。此外，如表4中所展示，表現產率不超過chR24之表現產率的一半。
表 2 . 基於 構架混洗之人類化版本之命名法
表 3 . 藉由八位組估計結合親和力
表 4 . 高級人類化引導體之表現產率。
實例 2 用於人類化鼠類抗 GD3 抗體之構架的選擇 在最大化人類化抗GD3抗體之表現、可製造性及生物物理特性之努力過程中，將mR24之CDR區移植至一組替代的人類構架上： VH構架VH3-DP54_JH4及VL構架VK3-DPK9_JK4。此CDR移植版本經指定為hR24VH1.0/VL1.0。hR24VH1.0之序列(SEQ ID NO:34)及hR24VL1.0之序列(SEQ ID NO:36)展示於圖1及圖2中。然而，hR24VH1.0/VL1.0之親和力、表現、可製造性及某些生物物理特性低於chR24。
進行更詳細調查以基於使用mR24之X射線結構之結構建模分析來探究是否可找到與作為小鼠-人類嵌合體(chR24)之小鼠親本抗體mR24相比參數較低的問題的解決方案，小鼠(PDB id:1R24)及嵌合(PDB id:1BZ7) mR24抗體之兩個晶體結構可供使用(Kaminski等人，1999，J Biol Chem 274(9):5597-5604)。觀測到，當在一對VH結構域之CDR-H2區(CDR-H2殘基H-56至H-58，根據Kabat編號)之間形成反平行β-薄片的情況下，同型界面保留在此等結構中之兩者中。此界面在結構上藉由Kaminski等人(Kaminski等人，1999, J Biol Chem 274(9):5597-5604)鑑別，且先前在結合研究中由Yan等人(Yan等人，1996, J Immunol 157(4):1582-1588)鑑別。二者展示，此同型界面起GD3結合之作用。如圖1中所展示之重鏈變體hR24VH1.6 (I58E))及hR24VH1.7 (S57E/N59E)經由電荷間排斥而移除同型界面。兩種變體展示出如下表5中所描述之活性的顯著損失。此等資料表明，具有所需活性之人類化抗體需要保留同型界面。
在VH構架VH3-DP54_JH4中存在三個位點H19、H74及H82a (根據Kabat編號)，其面向同型界面且不同於chR24構架中之相對應的位點。儘管此等殘基並未在同型界面處相互作用，H74有可能改變與CDR-H1及CDR-H2相互作用的環，如以下實例3中進一步描述。
實例 3 用於人類化鼠類抗 GD3 抗體之突變的選擇 為進一步探究表現、可製造性及生物物理特性，產生hR24VH1.0/VL1.0之同源模型以比較hR24VH1/VL1.0之晶體結構與chR24之晶體結構。基於表面暴露、(尤其在CDR區中)突變時的潛在結構變化、與抗原或與同型界面之潛在相互作用及位點處之殘基類型的罕見性來對所有不同的位點進行分類。參見表5，以實驗方式表明許多潛在突變中的兩者將活性顯著提高至嵌合體之水平。使用Kabat編號，其為在輕鏈(S_L65_W)之可變區的位置65處之絲胺酸至色胺酸突變及在重鏈(A_H74_P)之可變區之位置74處的丙胺酸至脯胺酸突變。此等位置中之兩者在表面上且增加表面疏水性。此等位點中無一者係在小鼠抗體之人類化中常見的典型突變(Lo, 2004, Methods in Molecular Biology 248:135-159；O'Brien 及 Jones, 2003, Methods in Molecular Biology 207:81-100)。
尤其考慮到脯胺酸側鏈傾向於實行有毒結構及關於丙胺酸之相對較小側鏈的構形更改，對位置74處之脯胺酸的鑑別及選擇亦係不可預測及出人意料的。重鏈突變(亦即，在重鏈(A_H74_P)之胺基酸殘基74處之丙胺酸至脯胺酸)藉由其與同型界面之近接及其與已經描述為對CDRH1及CDRH2環之恰當構形結構重要的殘基的兩個在結構上重要的位點(重鏈位點H71及H73)的近接來鑑別(Foote 及 Winter, 1992)。假定重鏈H74位置處之突變可更改構架3之該部分的局部結構且更改重鏈H71及/或H73位點之構形(圖4)。然而，未預期到且出人意料的係，將允許最大構形自由的丙胺酸取代為在蛋白質之構形中引入典型「扭接」的脯胺酸將導致在huR24中觀測到的結合特徵改良。然而，含有此A_H74_P突變之人類化mR24變型hR24 VH1.1 (SEQ ID NO: 1) (圖1)出乎意料地展示為親和力及活性相比包含在此位置之丙胺酸的親本抗體增加。
對位置65處之色胺酸之鑑別及選擇尤其出人意料。S_L65_W突變之分佈使用Abysis資料庫v2.3.3 (Abhinandan及Martin，2008)中之序列展示於圖3中。自此資料清楚，該位點作為絲胺酸而極好保留。對於所有抗體，絲胺酸在人類及鼠類抗體中出現＞96%的時間及＞97%的時間。除在mR24抗體中以外，色胺酸僅出現在來自大致25,000個總序列之4個其他抗體中。人類化R24變型hR24 VL1.2 (SEQ ID NO: 9)亦含有此S_L65_W突變(參見圖2)且相較於包含L65處之絲胺酸的親本抗體，以實驗方式展示此突變以增加親和力及活性。
合成表5中描述之人類化mR24變體之cDNA且接著與哺乳動物表現載體內之重鏈之人類IgG1恆定區及輕鏈之人類κ框內稠合。評定包括hR24vh1.1/vl1.2 (huR24，SEQ ID NO: 1及9)之此等變體的結合、CDC、ADCC、ADC可行性、PACS、與經板結合GD3之結合活性，及與GD3表現細胞表面的結合活性。
如下表5中所展示，相比其他mR24 VH變體，huR24vh1.1展示結合、ADC可行性、PACS及GD3 ELISA活性之組合增加。當與其他mR24 VL變體相比時，hR24vl1.2亦展示結合、CDC、ADCC、ADC可行性及PACS活性之組合增加。
表 5 . 使用 構架 ( VH 構架 VH3 - DP54 _ JH4 及 VL 框架 VK3 - DPK9 _ JK4) 之 mR24 的 人類化變體 對小規模抗體生產，pSMED2中之每一huR24變型重鏈及pSMEN3中之每一相對應的huR24變型輕鏈根據製造商之方案共轉染至HEK-293F細胞中(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，且在稍後第5天至第7天採集改良性培養基(CM)以供抗體純化。對於大規模抗體生產，重鏈及輕鏈表現構築體經共轉染至中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中，且兩種構築體之可選標記物(pSMED2之二氫葉酸還原酶及pSMEN3之新黴素抗性)用於對具有穩定併入至其基因組中之表現構築體的細胞進行選擇。隨後擴增穩定具有所關注抗體基因之細胞且採集大型改良性培養基。使用5 μm及0.2深度過濾澄清所收集之CM，隨後經由切向流過濾進行5倍濃縮。HuR24表明在HEK293細胞(大約40 mg/L)中之暫時轉染或CHO細胞(大約600 mg/L)中之穩定轉染後的良好表現產率。
在蛋白質或蛋質結構域的熱穩定性與蛋白質或蛋質結構域的整體穩定性之間存在正相關。蛋白質或蛋白質結構域之較高熔融溫度常提供經改良可製造性及更長存放期。差示掃描熱量測定(DSC)用於評定huR24之熱穩定性。以如下所列之體積為250 μL之經指定緩衝液將抗體樣品稀釋至0.3 mg/mL。將相對應的調配物緩衝液坯料用於參考樣品。使用MicroCal ThermoVac樣品除氣及設定成8℃之恆溫器(Microcal, Inc, Northampton, MA)對兩個樣品進行徹底脫氣。將樣品施配至MicroCal VP-DSC毛細管細胞微型蒸氣乾度計(Microcal, Inc, Northampton, MA)之適當細胞中。在15℃下將樣品平衡4分鐘，且接著以每小時100℃之速率掃描直至100℃。選擇20秒之過濾期。將原始資料經基線校正且將蛋白質濃度歸一化。Origin軟體(OriginLab Corporation, Northampton, MA)係用於利用適當轉譯數目將資料擬合至MN2-狀態模型。如表6中所展示，huR24在所有經測試緩衝液中具有良好熱穩定性，其中Fab區之熔融溫度高於80℃。此等結果表明，在人類化期間保持鼠類R24之所需特徵，且該huR24為用於GD-3表現腫瘤之潛在療法。
表6.人類化抗GD3抗體huR24之熱穩定性(DSC)分析
實例 4 抗 GD3 抗體之結合特性 藉由 ELISA 之細胞結合特性 一天之前，以50,000細胞/孔將內源性GD3表現細胞(SK-MEL黑色素瘤細胞株或G361)鍍敷於96孔細胞培養板(BD Biosciences)中之100 μL適當培養基(描述如下)中。在ELISA之日，自孔移除培養基，且細胞藉由添加50微升/孔的固著溶液(Cytofix, BD Biosciences, Cat編號554655)固定且在冰上培育30分鐘。在培育後，用PBS將培養板洗滌兩次並留在補充有1%牛血清白蛋白(BSA)之PBS中。隨後在PBS加鈣/鎂(PBS-Ca2 + /Mg2 + )中以1:3連續稀釋mR24之人類化變體，且將1%BSA施用至培養板。隨後將培養板在冰上培育1小時且接著用PBS-Ca2 + /Mg2 + 洗滌4次。隨後施用以1:5000稀釋於具有1% BSA之PBS-Ca2 + /Mg2 + 中的辣根過氧化酶(HRP)結合之二級抗體(羊抗人IgG片段結晶穩定區(Fc)，Jackson ImmunoResearch, Cat編號109-035-098)以供在冰上培育1小時。再次如上文所描述洗滌培養板，且添加TMB受質溶液(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)；BioFX Labs, Owing Mills, MD)，持續10分鐘，隨後添加0.18 M H2 SO4 。隨後量測OD450 nM處之吸收率且用Microsoft Excel及Graphpad-Prism軟體標繪及分析資料。
用於SK-MEL028之細胞生長培養基為補充有10% FBS、非必需胺基酸及青黴素-鏈黴素-麩胺酸(Invitrogen, Carlsbad, CA)之DMEM。用於G361之細胞生長培養基為補充有10% FBS、非必需胺基酸及青黴素-鏈黴素-麩胺酸(Invitrogen, Carlsbad, CA)之McCoy 5a。
經純化重組抗體係用於在基於培養板及基於細胞之ELISA中評估huR24的GD3結合特性。如(圖5)中所展示，huR24展現比嵌合抗體chR24 (SEQ ID NO:29及30)好的結合力。HuR24展示在對G361及SK-MEL028腫瘤細胞株兩者(分別為圖6A及圖6B)之內源性細胞表面表現之GD3分析中與chR24類似的結合力。此等資料表明，huR24超過其親本小鼠抗體mR24 (製成為人類-小鼠嵌合體chR24)之結合活性。因此，突變出人意料地產生相比其親本小鼠抗體具有較好結合特徵的人類化抗體。
以流式細胞測量術計之 hu24 之 細胞結合活性 藉由流式細胞測量術檢查HuR24與活細胞的細胞表面結合。為確認特異性，利用變化的GD3表現量來評定在標靶陰性人類結腸直腸腺癌細胞(COLO-205)及一組轉移性黑色素瘤細胞株上的huR24結合(表7)。huR24並未展示結合於COLO-205細胞。對比而言，hu24結合至具有可變相對螢光強度之轉移性黑色素瘤細胞株。
表 7 . hu24 在人類 轉移性黑色素瘤細胞株上之細胞表面結合的流式細胞測量。 在一組GD3陽性腫瘤細胞株(表7及圖7A至圖7E)上評定中值螢光強度比率(MFIR=未結合huR24之MFI與同型對照、結合於連接子酬載(b)之對照單株抗體或未結合對照單株抗體(a))中之一者之MFI的比率，其中MFI經計算為在每一所示曲線圖之曲線下的面積。同型對照抗體並未展現與細胞株中之任一者的可觀結合。此等結果表明，表現於黑色素瘤株上之細胞表面GD3由huR24特異性結合，且進一步表明，huR24係用於至少治療GD3表現腫瘤之潛在療法，係因為其結合至GD3表面表現細胞之表面。
實例 5 抗 GD3 抗體之內化 為判定huR24是否可用作潛在GD3-ADC，檢查GD3-ADC之內化。量測內化之基於成像流式細胞測量術之方法係用於測定ADC分子至黑色素瘤細胞中之內化。在兩個人類黑色素瘤細胞株(Malme-3M細胞(圖8A)及SK-MEL-28細胞(圖8B))中測試除huR24-ADC以外的HuR24裸抗體結合細胞表面GD3且內化至細胞中之能力。
將HuR24及huR24-ADC添加至細胞且在37℃下培育以開始內化時程。在每一時間點，使用細胞解離緩衝液(Gibco®目錄號13151014)採集樣品，將細胞樣品用冰冷PBS洗滌兩次，用50 μL 1%多聚甲醛/維爾烯再懸浮，以終止內化，並轉移至96孔板。始終將陰性對照內化樣品保持在4℃下以防止內化。藉由40×之Amnis成像流式細胞儀ImageStream MK II，使用INSPIRE軟體來分析樣品。集合單細胞，且自每一樣品採集3,000個GD3+細胞。使用Amnis IDEAS軟體測定每一樣品之膜及胞內螢光強度。為導出內吞速率常數(Ke )，將Opresko及Wiley (1987)之方法應用於來自每一樣品之膜及胞內強度資料。
計算每個時間點之膜強度且相對於時程之直線部分的胞內強度進行標繪。線性回歸之斜率提供內吞速率常數(Ke )。為定量經內化抗GD3與溶酶體之間的共定位，將樣品用huR24或huR24-ADC培育，用定位溶酶體標記物LAMP-1之經螢光標記之抗LAMP-1染色，且接著使用Amnis成像流式細胞儀獲取。應用Amnis IDEAS軟體之「類似性」演算法以量測來自抗GD3及抗LAMP-1 (溶酶體標記物)抗體之螢光信號的空間共定位程度。
GD3抗體及GD3-ADC與LAMP-1溶酶體標記物之共定位基於所計算的類似性得分繼續進行無法分辨的動力學(圖8A及圖8B)。經映射為經對數轉換之皮爾森相關係數的類似性得分為兩個影像在逐像素基礎上在細胞區內呈線性相關的程度的度量。類似性得分為0指示無內化，係因為在細胞外部之螢光等於在細胞內部之螢光。較高類似性得分表明當與比較抗體相比時提高的溶酶體轉運及快速內化。類似性得分為1或更高指示完整內化。
在3至4小時(圖8A及圖8B)後，huR24出現在離散區室中，與溶酶體之標記物(Lamp-1)共定位。HuR24-ADC在5至6個小時之時段內具有比huR24高的類似性得分(圖8A及圖8B)，其指示當與huR24相比時huR24-ADC之提高的溶酶體轉運及更快速內化。huR24之類似性得分在100、200、300及350分鐘之時間為約0.7至約0.8。huR24-ADC之類似性得分在100、200、300及350分鐘之時間為約0.9至約1.1。
此等資料表明，huR24結合細胞表面GD3且經內化並能夠將細胞毒性劑遞送至表現GD3之細胞，進一步指示huR24-ADC為用於治療GD3表現腫瘤之潛在療法。出人意料地，huR24-ADC之內化實質上比單獨的huR24抗體好。因此，單獨的抗體並非係huR24將被用作ADC療法之能力的精確預測子，且huR24-ADC為用於由細胞上之GD3表現介導或與該GD3表現相關之疾病、病症或病況的新穎的出人意料的潛在ADC療法。
實例 6 抗 GD3 抗體 - 藥物結合物之結合及純化 經由用參(2-羧基乙基)膦(TCEP)使mAb部分還原，隨後使經還原之半胱胺酸殘基與所要順丁烯二醯亞胺封端之連接子-酬載反應來製備抗GD3抗體藥結合物(ADC)。特定言之，在37℃下經由將2.4莫耳餘量之參(2-羧基乙基)膦(TCEP)添加於pH 7.0之100 mM HEPES(4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸緩衝液)及1 mM二伸乙三胺五乙酸(DTPA)中來使抗GD3 mAb部分還原達2小時。隨後將連接子-酬載馬來醯亞胺己酸-奧瑞他汀(mcValCitPABC-Aur101)添加至連接子-酬載/mAb莫耳比為7的反應混合物，且在25℃下在15% v/v二甲基乙醯胺(DMA)之存在下再反應1小時。在1小時培育期後，添加3倍餘量的N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)以使不反應之硫醇封端且允許其反應15分鐘，隨後添加6倍餘量的L-Cys以淬滅任何不反應之連接子-酬載。在4℃下將反應混合物在pH 7.4之酸鹽緩衝鹽水(PBS)中透析隔夜，且經由SEC (AKTA avant, Superdex 200)純化。經由純度尺寸排外層析法(SEC)、疏水相互作用層析(HIC)及液相層析電噴霧電離串疊型質譜(LC-ESI MS)來進一步表徵ADC以計算藥物-抗體比率(DAR)。經由UV分光光度計測定蛋白質濃度。
對照ADC含有以與huR24抗體相同之方式結合之非靶向對照TT-21人類IgG1。TT-21為抗破傷風類毒素之完全人類抗體並具有活體內正常mAb半衰期，且對於非特異性分類或猴組織交叉反應為陰性的。HuR24-ADC及對照ADC展現類似生物物理學圖譜。huR24-ADC及對照ADC之平均DAR為4。
實例 7 抗 GD3 ADC 之 活體外細胞毒性 評定huR24-ADC在多種人類轉移性黑色素瘤細胞株中之抗腫瘤效果。將細胞用huR24-mcValCitPABC-Aur101或對照ADC之連續稀釋液培育96小時，此時藉由量測總細胞ATP含量來測定細胞存活率。
表 8 . 一組人類黑色素瘤細胞株上之以 μ g/ mL 為單位的 活體外細胞毒性分析 EC50 值 COLO-205細胞並不表現GD3，且在此實驗中用作額外對照。除了COLO-205之外，相較於對照ADC，EC50對於GD3-ADC而言低得多。在所有經測試的表現表面GD3之細胞中，huR24-ADC為選擇性殺滅轉移性人類黑色素瘤細胞之高選擇性細胞毒素，指示其係用於該疾病之潛在新穎療法。
實例 8 ： huR24 - ADC 在原生及 商業 人類 及獼猴細胞株中之細胞毒性 評估huR24-mcValCitPABC-Aur101在原生食蟹獼猴黑色素細胞、食蟹獼猴真皮纖維母細胞及人類真皮纖維母細胞中相較於市售人類表皮黑色素細胞之活體外結合及細胞毒性圖譜。成人表皮黑色素細胞(HEMa-LP)及新生人類表皮黑色素細胞(HEMn-LP)的GD3表現量高於食蟹獼猴黑色素細胞及食蟹獼猴及人類纖維母細胞。所選對照ADC為陰性對照同型-匹配之Aur101 ADC。使用流式細胞測量術且與陰性對照ADC比較，較高數目之huR24-ADC分子結合至自食蟹獼猴及人類獲得之真皮纖維母細胞及黑色素細胞，其解釋為表示結合至GD3 (圖9)。在所評價之細胞類型中，huR24-ADC以最低含量結合至食蟹獼猴黑色素細胞(圖9)。此外，huR24-ADC分子結合至HEMa-LP及HEMn-LP的數目高於結合至獼猴纖維母細胞及黑色素細胞及人類纖維母細胞的數目(圖9)。其與在HEMa-LP及HEMn-LP細胞之表面上之較高GD3表現量一致。對照ADC展示出非常低的效能，且因此並未產生EC50 值。分子中無一者抑制GD3-陰性細胞株COLO-205之生長(表8)。
在真皮纖維母細胞中，huR24-ADC結合在食蟹獼猴細胞與人類細胞之間係類似的，且觀測回應於huR24-ADC之類似細胞毒性圖譜(圖10A及圖10B)。在人類表皮黑色素細胞中，huR24-ADC展示出顯著提高之細胞殺滅(圖10C及圖10D)。在食蟹獼猴黑色素細胞中，huR24-ADC亦展示出細胞殺滅(圖10E)。
huR24-ADC展示出以濃度依賴性方式之細胞殺滅。huR24-ADC細胞殺滅亦與在細胞表面上之GD3表現量相關。此等資料確認，huR24-ADC為選擇性殺滅表現表面GD3之細胞的高選擇性細胞毒素，指示其係用於該疾病之潛在新穎療法，如以上實例7中所表明。
實例 9 抗 GD3 抗體 - 藥物結合物之活體內功效 huR24-ADC之活體內藥理學係藉由評定兩個轉移性黑色素瘤人類腫瘤中之抗腫瘤活性來評估：細胞株衍生之異種移植模型(SK-MEL-19；圖11A)及患者衍生之異種移植(PDX) (129862F-PDX；圖11B)。基於以流式細胞測量術及免疫組織化學(IHC)計之GD3表現並基於在雌性無胸腺nu/nu小鼠或雌性NSG (無IL-2 γ受體之非嚴重肥胖性糖尿病併發免疫缺陷之小鼠)小鼠中形成腫瘤的能力選擇模型。對於本文中所描述之兩種模型，評估3、6及10 mg/kg劑量之huR24-ADC且直接與攜載相同細胞毒素酬載(Aur101)之陰性對照ADC的6 mg/Kg劑量進行比較。在每一研究中，將動物隨機分為研究組，使得在第一次給藥時求腫瘤體積群在200至300 mm3 之間的平均值。在隨機分組後，向動物IV給藥，劑量為Q4天×4。結果之概述呈現於表9中。SK-MEL-19及SK-129862F (PDX)之腫瘤生長抑制曲線分別描繪於圖11A及圖11B中。平均腫瘤體積展示於表10及表11中。
表 9 . 利用 huR24 - mcValCitPABC - Aur101 及對照 ADC 之 活體內功效研究的概述 在SK-MEL-19黑色素瘤模型中，huR24-ADC以10 mg/kg劑量抑制腫瘤生長，且展示出相較於投與生理食鹽水之群相比，在3及6 mg/kg下之更慢腫瘤生長傾向。以10 mg/kg投與之動物之平均腫瘤體積展示出在第33天相對於經投與生理食鹽水之動物的統計學上的顯著減小(在安樂死媒劑群之前的最後一天)。此時，相對於生理食鹽水媒劑投與huR24-mcValCitPABC-Aur101之群組的腫瘤體積在3、6及10 mg/kg下分別為42%、48%及15%。在10 mg/kg劑量下之huR24-mcValCitPABC-Aur101導致長期腫瘤消退，其中兩個小鼠並未在開始藥物投與後第56天展示出可觸的腫瘤。標繪群中之每一者的腫瘤生長曲線直至至少一個動物被發現死亡或基於病態或腫瘤負荷而安樂死之日。並未注意到任何給藥群中的顯著體重差異。
表 10 . SK - MEL - 19 異種移植模型中之平均腫瘤體積之概述 腫瘤體積係以mm3 來量測
表 11 . SK - 129862F ( PDX ) 異種移植模型中之平均腫瘤體積之概述 腫瘤體積係以mm3 量測 當以Q4d×4 IV方案中之3、6或10 mg/kg之劑量投與huR24-ADC時，HuR24-ADC顯著減少植入於雌性NSG小鼠中之SK-129862F PDX之生長。SK-129862F患者衍生之異種移植物係來自患者的真實黑色素瘤癌症樣品，該等異種移植物在注射至小鼠中之前在活體外具有最小塑性膨脹。所有投與huR24-mcValCitPABC-Aur101之群組展示出相較於媒劑對照群在統計學上更大之腫瘤體積減小。在第32天(在安樂死媒劑群之前的最後一天)，處理組腫瘤相對於媒劑之體積在3、6及10 mg/kg之huR24-ADC劑量下分別為35%、11%及4%。以6 mg/kg投與之同型對照ADC展示出類似於3 mg/kg之huR24-ADC之劑量的腫瘤體積減小，但並未將腫瘤生長減小至與huR24-ADC之等效劑量相同之程度，且10 mg/kg huR24-ADC展示出相較於對照ADC之腫瘤體積的更大較少，其表明腫瘤減小效果對於GD3表現腫瘤細胞具有選擇性。標繪群中之每一者的腫瘤生長曲線直至至少一個動物被發現死亡或基於病態或腫瘤負荷而安樂死之日。引起關注的係，雖然經對照處理之動物的體重隨著腫瘤生長而略有減低，但經減低6或10 mg/kg處理之動物的體重在腫瘤消退時有實質增加，表明小鼠體重增加與腫瘤負荷消退之間的相關性。
實例 10 小鼠、大鼠及食蟹獼猴中之抗 GD3 抗體藥物結合物之藥代動力學及毒物動態學 huR24及huR24-ADC之藥代動力學參數呈現於下表12及13中。在以6或10 mg/kg單次IV投與huR24-ADC之後，在雌性無胸腺nu/nu小鼠(4/時間點/劑量組)中測定huR24及huR24-ADC之藥代動力學。在向雌性小鼠IV投與huR24-ADC之後，如藉由最大血漿濃度(Cmax )及濃度-時間曲線下之面積(AUClast )評定，huR24-ADC之全身暴露隨著劑量自6至10 mg/kg之增加而增加。huR24 ADC展現兩個劑量組之低血漿清除率(CL；0.8 mL/hour/kg)及低穩態分佈體積(Vss ；0.13 L/kg)。huR24-ADC之表觀t½ 針對6及10 mg/kg劑量組分別為5.9天及5.6天。在向雌性小鼠IV投與huR24之後，如藉由Cmax 及AUClast 評定，huR24之全身暴露隨著huR24之劑量自6至10 mg/kg之增加而增加。huR24展現在各劑量及低Vss (0.14至0.15 L/kg)下之類似低的血漿CL (0.4毫升/小時/公斤)。在用huR24給藥後，huR24之表觀t½ 針對6及10 mg/kg劑量組分別為10.9天及10.6天。
在以6或30 mg/kg單次IV投與huR24或huR24-ADC之後，在雄性韋斯漢大鼠(4/時間點/劑量組)中測定huR24及huR24-ADC之藥代動力學。在向雄性大鼠IV投與huR24-ADC之後，如藉由在時間零處之經外插濃度(C0 )及AUClast 評定，huR24-ADC之全身暴露隨著劑量自6至30 mg/kg之增加而增加。huR24-ADC展現在各劑量及低Vss (0.10至0.094 L/kg)下之低血清血漿清除率(CL；0.5毫升/小時/公斤)。huR24-ADC之表觀t½ 針對6及30 mg/kg劑量組分別為8.5天及8.1天。在向雄性大鼠IV投與huR24之後，如藉由C0 及AUClast 評定，huR24之全身暴露亦隨著huR24-ADC劑量自6至30 mg/kg之增加而增加。huR24亦展現低血清CL (0.2毫升/小時/公斤)及低Vss (0.094至0.096 L/kg)。在用huR24給藥後，huR24之表觀t½ 分別針對6及30 mg/kg劑量組在13.7天及12.3天的劑量組之間係類似的。
作為46天探測性毒性研究之部分，在以3、6或15毫克/公斤/劑之劑量將huR24或huR24-ADC反覆IV (以藥團形式)投與至雄性及雌性食蟹獼猴(1或2/性別/劑的組)(3個循環，每3週一次)之後第22天測定huR24及huR24-ADC之藥代動力學。基於Cmax及AUC之huR24-ADC之全身暴露隨劑量自3至6至15毫克/公斤/劑的增加而增加。huR24-ADC展現自7.0天至7.7天之低血清血漿清除率(CL；0.3至0.4毫升/小時/公斤)、低Vss (0.056至0.068 L/kg)及表觀t½ 。基於Cmax 及AUC之huR24之全身暴露隨著huR24劑量自3至6至15毫克/公斤/劑之增加而增加。huR24展現自10.8天至16天之類似地低的血清CL (大致為0.2毫升/小時/公斤)、低Vss (0.051至0.067 L/kg)及表觀t½ 。
表 12 . 在 huR24 - ADC 之 IV 投與後在小鼠、大鼠及 食蟹獼猴中之 huR24 - ADC 之平均 藥代動力學
表 13 . 在 huR24 之 IV 投與後在小鼠、大鼠及 食蟹獼猴中之 huR24 之平均 藥代動力學
實例 11 抗 GD3 抗體 - 藥物結合物之藥代動力學及給藥 作為6週關鍵毒性研究之部分，在以6、9或12毫克/公斤/劑之劑量將huR24-ADC反覆IV (以藥團形式)投與至雄性及雌性食蟹獼猴(3或5/性別/劑的組)(3個循環；第1天、第22天及第43天)之後第1天及第22天，測定huR24及huR24-ADC之血漿濃度。大體而言，對於劑量組之間的每一分析物，不存在性別相關的暴露差異，且血漿中之平均最大觀測到的藥物濃度(Cmax )及在給藥後0至504小時之濃度-時間曲線下之平均面積(AUC504 )值在第一天類似於在第22天之每一分析物的值，其中暴露隨著在第22天增加之huR24之劑量而增加。如藉由平均AUC504 值評定，huR24之暴露與huR24-ADC之暴露相比較高，其中平均比率(AUC504 ，huR24/huR24-ADC)在第1天及第22天跨越劑量組的範圍為1.6至2.3。藥代動力學參數提供於表14中。
使用針對清除率及針對體積為1.0之比例因子，根據6週關鍵毒性研究自食蟹獼猴藥代動力學按比例調整huR24-ADC之經人類預測PK參數。在本發明之臨床轉化方法中，假定血漿huR24-ADC濃度驅動功效且小鼠PK/PD參數直接轉化至人類。預期人類中之huR24-ADC之藥代動力學與0.375 mL/h/kg之經預計血漿清除率(CL)、大致為0.086 L/kg之穩態分佈體積(Vss )及7天之最終消除半衰期(t½ )成線性關係。在人類中在第7天之經預測最終消除半衰期(t½ )與如以上實例9及表12中所描述之猴中的最終消除半衰期度量一致。
為了計算安全界限，在所提出的huR24-ADC之0.5 mg/kg之起始劑量下，經預測平均濃度(Cav )為2.3 μg/mL且血漿中之經預測最大觀測藥物濃度(Cmax )為18.4 μg/mL。
表 14 . huR24 及 huR24 - ADC 之 藥代動力學資料之概述 放在一起考慮，實例10及11展示huR24-ADC在動物中之暴露被認為跨越所測試藥代動力學參數之範圍而大致呈劑量比例(參見以下表12及13)。此等資料表明，不存在不常見的藥力學效果，諸如藥物沈降或嚴重的抗藥物抗體清除huR24-ADC、使huR24-ADC起效。總之，此等資料表明，huR24-ADC可為安全且有效的潛在療法以治療表現GD3之腫瘤。
實例 12 抗 GD3 抗體 - 藥物結合物之 1 期劑量 升級研究 1期劑量升級、劑量擴增、安全性、藥代動力學研究登記已惡化或不耐受先前療法的具有不可切除的第III階段或第IV階段黑色素瘤的成人患者之循序群。在大致60分鐘內經靜脈內輸注以0.5 mg/kg起始之HuR24-ADC。給藥方案每21天重複。一期研究包括兩個部分。
第1部分，試驗之劑量升級包括至多20個患者，且將使用貝氏劑量升級時間表估計最大耐受劑量(MTD)/所建議2期劑量(RP2D)。試驗之第1部分正在進行中。到目前為止給藥之所有患者均耐受huR24 ADC。
第2部分將為至多20個患有以RP2D登記之不可切除的第III或IV階段黑色素瘤的患者之劑量擴增群。然而，在第1部分中最終將經判定為RP2D之患者將包括於此20個患者之群中。第2部分之目標係確認安全性及耐受性且探究huR24-ADC之抗腫瘤效果的基本跡象。
次要終點包括藥物動力學及免疫原性評定。繼續用huR24-ADC治療直至疾病惡化、患者拒絕或不可接受的毒性出現。將給予展現出關於可管理毒性之臨床益處且願意繼續接受huR24-ADC之患者仍進行研究的機會。
因此，本發明已廣泛揭示且參考上述代表性實施例說明。熟習此項技術者將認識到，在不背離本發明之精神及範疇下可進行各種修改。所有公開案、專利申請案及頒予專利以引用的方式併入本文中，其引用的程度如每個個別的公開案、專利申請案或頒予專利經特定及個別地指示以全文引用的方式併入本文中。在以引用的方式併入之正文中所含之定義若與在本發明中之定義矛盾，則將其排除在外。
應瞭解，本發明的為清楚起見在單獨實施例之上下文中描述的某些特徵亦可以組合形式提供於單一實施例中。相反，為簡潔起見而在單一實施例之上下文中所描述的本發明之各種特徵亦可分開地或以任何適合子組合形式提供。
特定預期關於本發明之一個實施例所論述的任何限制可適用於本發明之任何其他實施例。此外，本發明之任何組合物可用於本發明之任何方法，且本發明之任何方法可用於產生或利用本發明之任何組合物。詳言之，應瞭解單獨或與一或多個其他請求項及/或實施方式之態樣組合的申請專利範圍中所述之本發明之任何態樣可與申請專利範圍及/或實施方式及/或序列表及/或圖式中別處陳述之本發明之其他態樣組合。
雖然已參考不同申請案、方法及組合物描述所揭示教示，但將瞭解，在不背離本文中之教示及下文所主張之本發明情況下可進行不同變化及修改。提供實例以更好地說明所揭示之教示，且不意欲極限本文中呈現教示之範疇。雖然已根據此等例示性實施例描述本發明之教示內容，但在不進行過度實驗下可對此等例示性實施例進行大量變化及修改。所有該等變化及修改皆在本教示之範疇內。
當本發明之態樣或實施例根據馬庫西群組(Markush group)或其他替代群組進行描述時，本發明不僅涵蓋整體列出之全部群組，而且涵蓋獨立群組之各成員及主群組之所有可能子組，且亦涵蓋缺乏一或多個群組成員之主群組。本發明亦設想明確排除所主張之發明中之任何群組成員中之一或多者。
本文中所引用之全部參考文獻(包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似者)及其中引用的參考文獻就其尚未引用的程度而言係以全文引用之方式特此併入本文中。在所併入文獻及類似材料中之一或多者(包括(但不限於)定義之術語、術語用法、所描述之技術等)與本申請案不同或抵觸的情況下，以本申請案為準。
描述及實例詳述本發明之某些特定實施例，且描述本發明人預期之最佳模式。然而應瞭解，無論文中呈現之前述內容如何詳細，本發明仍可以許多方式實踐，且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何等效物來解釋。
圖1提供mR24之重鏈序列及抗體mR24之編號為1.0至1.8之若干人類化重鏈可變結構域(VH)變體的序列。為線性序列進行編號。為人類化變體1.0至1.8之序列與mR24之序列的差異加底線。此等差異係由存在於經選擇用於人類化之構架中之不同殘基而引起。以粗體形式展示引入至人類化變體1.0至1.8之序列中之突變。引入至VH變體1.6及1.7中之突變移除對於結合GD3重要之同型界面，且導致如以下實例2、實例3及表5中所描述之活性之顯著損失。當與其他mR24VH變體相比較時，引入至VH變體1.1之A_H74_P突變導致活性增加，如以下實例2、實例3及表5中所描述。圖1按出現次序分別揭示SEQ ID NO 16、30、1、38、39、35及40至42。 圖2提供mR24之輕鏈序列及抗體mR24之編號為1.0至1.8的若干輕鏈可變結構域(VL)變體之序列。為線性序列進行編號。為人類化變體1.0至1.8之序列與mR24的差異加底線。以粗體形式展示引入至人類化變體1.0至1.8之序列中之突變。當與其他mR24VH變體相比較時，引入至VL變體1.2之S_L65_W突變導致活性增加，如以下實例2、實例3及表5中所描述。圖2按出現次序分別揭示SEQ ID NO 18、36至37、9及43至48。 圖3展示輕鏈殘基65 (根據Kabat編號)之跨物種標識。展示Abysis資料庫中之人類、小鼠及所有其他物種(例如兔、豬、雞及大鼠)的在Kabat輕鏈位置65處之根據線性序列編號之每一天然胺基酸殘基(簡稱為單字母碼)的相對頻率。對於Kabat輕鏈位置65處之絲胺酸的選擇壓力係明顯的。 圖4展示嵌合mR24 Fab重鏈與huR24 VH1.0/VL1.0同源模型重鏈(以黑色展示)之結構比對。所有殘基係根據Kabat編號標記。結構比對展示位置H74處自丙胺酸至脯胺酸的突變可對含有在CDR-H1與CDR-H2之接面處相互作用的殘基H71及H73之環的位置及硬度有影響的突變。為了進一步論述，參見以下實例3。 圖5提供對基於培養板之ELISA結合分析的分析，該基於培養板之ELISA結合分析表明huR24 vh1.1/vk1.2及chR24與直接固定於ELISA板上之GD3的類似結合。 圖6A提供對細胞表面結合分析之分析，該細胞表面結合分析表明huR24 vh1.1/vk1.2及mR24 (使用嵌合chR24)與過度GD3表現G361腫瘤細胞的類似結合。G361細胞生長於ELISA板之孔中，且添加抗體至板，隨後使用辣根-過氧化酶(HRP)結合之羊抗人IgG抗體洗滌及偵測經結合抗體。 圖6B展示描繪對細胞表面結合分析之分析的曲線圖，該細胞表面結合分析表明huR24及mR24 (使用嵌合chR24)與過度GD3表現SK-MEL028腫瘤細胞的類似結合。SK-MEL028細胞生長於ELISA板之孔中，且添加抗體至板，隨後使用辣根-過氧化酶(HRP)結合之羊抗人IgG抗體洗滌及偵測經結合抗體。 圖7A至圖7F展示描繪流式細胞測量術結合分析之結果的曲線圖，該流式細胞測量術結合分析表明與GD3-陽性人類黑色素瘤細胞株之特異性細胞表面結合：SK-MEL-28 (圖7A)、G361 (圖7B)、SK-MEL-30 (圖7C)、MeWo (圖7D)、Malme-3M (圖7E)及COLO-205 (圖7F)。 圖8A展示對huR24及huR24-ADC結合於Malme-3M人類黑色素瘤細胞上之細胞表面GD3及後續內化之分析的曲線圖。量測內化之基於成像流式細胞測量術之方法係用於測定huR24及huR24-ADC分子至黑色素瘤細胞中之內化。為定量經內化抗GD3與溶酶體之間的共定位，將樣品用huR24或huR24-ADC培育，用定位溶酶體標記物LAMP-1之經螢光標記之抗LAMP-1染色。GD3抗體及GD3-ADC與LAMP-1溶酶體標記物之共定位基於所計算的類似性得分繼續進行無法分辨的動力學。出人意料地，huR24-ADC一貫表明內化及保持在細胞中達到甚至高於huR24之程度的能力，如由其約0.9至1.1之類似性得分所證明。 圖8B提供對huR24及huR24-ADC結合於SK-MEL-28人類黑色素瘤細胞上之細胞表面GD3及後續內化的分析。量測內化之基於成像流式細胞測量術之方法係用於測定huR24及huR24-ADC分子至黑色素瘤細胞中之內化。為定量經內化抗GD3與溶酶體之間的共定位，將樣品用huR24或huR24-ADC培育，用定位溶酶體標記物LAMP-1之經螢光標記之抗LAMP-1染色。GD3抗體及GD3-ADC與LAMP-1溶酶體標記物之共定位基於所計算的類似性得分繼續進行無法分辨的動力學。出人意料地，huR24-ADC一貫表明內化及保持在細胞中達到甚至高於huR24之程度的能力，如由其約0.9至1.1之類似性得分所證明。 圖9提供關於huR24-ADC細胞結合於人類及食蟹獼猴細胞之資料。所示出資料表明，相較於對照ADC，huR24-ADC與正常猴真皮纖維母細胞、人類真皮纖維母細胞及猴黑色素細胞結合更多。對比而言，相較於對照ADC在更大程度上，huR24-ADC結合相比表現較低含量之GD3的細胞表現含量增加之GD3的人類表皮黑色素細胞(亦即HEMa-LP黑色素細胞及HEMn-黑色素細胞)。此等資料表明，huR24選擇性地結合表現含量增加之GD3的黑色素細胞株的程度大於表現較低含量之GD3的細胞。參見以下實例8以供進一步論述。 圖10A至圖10E描繪相較於陰性對照ADC之huR24-ADC的人類及食蟹獼猴細胞毒性資料。huR24-ADC展示人類細胞及食蟹獼猴細胞中之類似細胞毒性特徵曲線(圖10A及10B)。在人類表皮黑色素細胞中，huR24-ADC展示明顯增加之細胞殺滅(圖10C及10D)。huR24-ADC亦展示食蟹獼猴黑色素細胞中之細胞殺滅(圖10E)。以圖9中呈現之資料考慮，此等資料指示呈濃度依賴性方式的與細胞表面GD3表現量相關的huR24-ADC細胞殺滅。此等資料確認huR24-ADC為選擇性地殺滅表現表面GD3之細胞的高選擇性細胞毒性劑，指示其為用於該疾病之潛在新穎療法，如以下實例8中所表明。 圖11A提供SK-MEL-19異種移植模型中之人類黑色素瘤異種移植生長曲線。向上箭頭(↑ )分別指示對照PBS、對照ADC以6 mg/kg給藥及huR24-ADC以3、6及10 mg/kg給藥。該資料表明在第0天、第4天、第8天及第12天給藥後SK-MEL-19腫瘤體積(表示為立方毫米mm3 )之減小。腫瘤體積經huR24-ADC以3或6 mg/kg之減小實質上不大於腫瘤體積經對照ADC以6 mg/kg之減小。然而，腫瘤體積經huR24-ADC以10 mg/kg之減小顯著增強。此等資料指示，huR24-ADC為此項技術中公認的活體內腫瘤模型中之腫瘤生長的選擇性抑制劑。 圖11B提供SK-129862F患者衍生之異種移植(PDX)模型中之人類黑色素瘤異種移植生長曲線。向上箭頭(↑)分別指示對照PBS、對照ADC以6 mg/kg給藥及huR24-ADC以3、6及10 mg/kg給藥。該資料表明在第0天、第4天、第8天及第12天給藥後SK-129862F (PDX)腫瘤體積(表示為立方毫米mm3 )之減小。腫瘤體積經huR24-ADC以3 mg/kg之減小實質上不大於腫瘤體積經對照ADC以6 mg/kg之減小。然而，腫瘤體積經huR24-ADC以6 mg/kg之減小相較於對照ADC顯著增強，且腫瘤細胞體積減小(作為腫瘤生長之度量)之甚至較大差異對於10 mg/kg之huR24-ADC為明顯的。此等資料指示，huR24-ADC為此項技術中公認的活體內腫瘤模型中之腫瘤生長的選擇性抑制劑。 圖12描繪人類GD3之結構。

Claims (24)

  1. 一種特異性結合GD3之抗體或其抗原結合片段，其包含： (i)重鏈可變區(VH)，其包含： (a)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之VH互補決定區1 (CDR-H1)， (b)包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之VH CDR-H2；及 (c)包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之VH CDR-H3；及 (ii)輕鏈可變區(VL)，其包含： (a)包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之VL CDR-L1， (b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL CDR-L2；及 (c)包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之VL CDR-L3， 其中該VH包含VL構架序列及VH構架序列，及(i)其中該VL構架序列與其所衍生自之DPK9人類生殖系構架序列有至少98%、99%或100%一致，及(ii)其中該VH構架序列與其所衍生自之DP54人類生殖系構架序列有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之VH；及(ii)包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之VL。
  3. 如請求項2之抗體或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列與SEQ ID NO: 1有90%一致之VH或胺基酸序列與SEQ ID NO: 9有至少90%一致之VL。
  4. 如請求項2之抗體或其抗原結合片段，其包含藉由寄存在ATCC處且ATCC寄存編號為PTA-124057之質體中之插入物之核酸序列所編碼之VH序列，及藉由寄存在ATCC處且ATCC寄存編號為PTA-124058之質體中之插入物之核酸序列所編碼之VL序列。
  5. 一種抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1之抗體或其抗原結合片段競爭與GD3之結合。
  6. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域，其中該Fc結構域為IgA1 、IgA2 、IgD、IgE、IgM、IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 之Fc結構域。
  7. 一種抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO: 7所闡述之重鏈及如SEQ ID NO: 14所闡述之輕鏈。
  8. 一種經分離核酸分子，其包含編碼如請求項1之抗體或其抗原結合片段之一或多個核苷酸序列。
  9. 一種載體，其包含如請求項8之核酸分子。
  10. 一種宿主細胞，其包含如請求項9之核酸分子。
  11. 一種下式之抗體-藥物結合物(ADC)： Ab-(L-D)p ， 其中： (a) Ab為特異性結合GD3之抗體或其抗原結合片段； (b) L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物； (c)p 為約1至12之整數。
  12. 如請求項11之ADC，其中該Ab包含： (i)重鏈可變區(VH)，其包含： (a)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之VH CDR-H1， (b)包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之VH CDR-H2；及 (c)包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之VH CDR-H3；及 (ii)輕鏈可變區(VL)，其包含： (a)包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之VL CDR-L1， (b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL CDR-L2；及 (c)包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之VL CDR-L3， 其中該VH包含VL構架序列及VH構架序列，及(i)其中該VL構架序列與其所衍生自之DPK9人類生殖系構架序列有至少98%、99%或100%一致，及(ii)其中該VH構架序列與其所衍生自之DP54人類生殖系構架序列有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。
  13. 如請求項12之ADC，其中該Ab包含：(i)包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之VH；及(ii)包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之VL。
  14. 如請求項11之抗體藥物結合物，其包含Fc結構域，其中該Fc結構域為IgA1 、IgA2 、IgD、IgE、IgM、IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 之Fc結構域。
  15. 如請求項11之ADC，其中該連接子包含mcValCitPABC。
  16. 如請求項11之ADC，其中該藥物為奧瑞他汀0101。
  17. 如請求項11之ADC： Ab-(L-D)p ，其中： (a) Ab為包含如SEQ ID NO: 7之重鏈及如SEQ ID NO: 14所闡述之輕鏈的抗體； (b) L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物，其中該連接子為mcValCitPABC，且其中該藥物為奧瑞他汀0101；及 (c)p 為4。
  18. 一種用於產生如請求項11之ADC的製程，其包含： (a) 將連接子連接於藥物部分； (b) 將該連接子-藥物部分結合於抗體；及 (c) 純化該ADC。
  19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項11之ADC及醫藥學上可接受之載劑。
  20. 一種治療有需要之個體中之與GD3細胞表面表現相關或由GD3細胞表面表現介導之疾病、病症或病況的方法，其包含向該個體投與治療有效量之包含如請求項11之ADC之組合物。
  21. 一種治療有需要之個體中與GD3經升高活性水平相關或由GD3經升高活性水平介導之疾病、病症或病況的方法，其包含向該個體投與治療有效量之包含如請求項11之ADC之組合物。
  22. 如請求項20或請求項21之方法，其中該疾病、病症或病況為黑色素瘤、乳癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤或肺癌。
  23. 一種如請求項11之ADC之用途，其用於治療具有與GD3細胞表面表現相關或由GD3細胞表面表現介導之疾病、病症或病況、或與GD3經升高活性水平相關或由GD3經升高活性水平介導之疾病、病症或病況的個體。
  24. 如請求項23之用途，其中該疾病、病症或病況為黑色素瘤、乳癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤或肺癌。
TW107125168A 2017-07-20 2018-07-20 抗gd3抗體及抗體-藥物結合物 TW201914616A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762535120P 2017-07-20 2017-07-20
US62/535,120 2017-07-20
US201862697485P 2018-07-13 2018-07-13
US62/697,485 2018-07-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201914616A true TW201914616A (zh) 2019-04-16

Family

ID=63244997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107125168A TW201914616A (zh) 2017-07-20 2018-07-20 抗gd3抗體及抗體-藥物結合物

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20190048073A1 (zh)
TW (1) TW201914616A (zh)
WO (1) WO2019018647A1 (zh)

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5037651A (en) 1987-01-30 1991-08-06 American Cyanamid Company Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US5108912A (en) 1987-01-30 1992-04-28 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5981568A (en) 1993-01-28 1999-11-09 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
ZA955642B (en) 1994-07-07 1997-05-06 Ortho Pharma Corp Lyophilized imaging agent formulation
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5952329A (en) 1996-01-23 1999-09-14 The General Hospital Corporation Benzophenothiazine and benzoporphyrin dye combination photodynamic therapy of tumors
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU3734900A (en) 1999-03-09 2000-09-28 University Of Southern California Method of promoting myocyte proliferation and myocardial tissue repair
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
WO2002100326A2 (en) 2001-05-01 2002-12-19 The General Hospital Corporation Photoimmunotherapies for cancer using photosensitizer immunoconjugates and combination therapies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
ATE395413T1 (de) 2001-12-03 2008-05-15 Amgen Fremont Inc Antikörperkategorisierung auf der grundlage von bindungseigenschaften
CA2921578C (en) 2002-12-24 2017-02-14 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using same
TW200806685A (en) 2006-02-21 2008-02-01 Wyeth Corp Processes for the convergent synthesis of calicheamicin derivatives
WO2008101234A2 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti ganglioside gd3 antibodies and uses thereof
CN101835494B (zh) 2007-05-22 2012-02-15 惠氏有限责任公司 制造酰肼的改良方法
PT3327027T (pt) 2011-11-17 2021-02-15 Pfizer Péptidos citotóxicos e seus conjugados de anticorpos e fármacos
CA3111357A1 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
WO2014083006A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Katinger Gmbh RECOMBINANT HUMAN IgM-ANTIBODY EFFECTIVE AGAINST CANCER CELLS

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019018647A1 (en) 2019-01-24
US20190048073A1 (en) 2019-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3137114B1 (en) Anti-ptk7 antibody-drug conjugates
JP7401126B2 (ja) 抗ｃｕｂドメイン含有タンパク質１（ｃｄｃｐ１）抗体、抗体薬物コンジュゲート、およびその使用方法
US20230331839A1 (en) Anti-sez6l2 antibodies and antibody drug conjugates
CN110087691B (zh) 抗-edb抗体和抗体-药物缀合物
US20180296691A1 (en) Anti-efna4 antibody-drug conjugates
EP3753952A1 (en) Egfrviii antibody and conjugate, and preparation method and use thereof
TW201914616A (zh) 抗gd3抗體及抗體-藥物結合物