CN114616031A - 对靶标密度高的细胞的选择性增强的多聚体抗体 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种多聚体结合分子，例如IgM、IgM样、IgA或IgA样结合分子，例如对以高密度表达靶标的细胞例如肿瘤细胞的选择性增强的抗体。选择性增强可以例如通过调节对所述靶抗原的结合亲和力和/或通过经由多聚体抗原结合调节亲合力来实现。

Description

对靶标密度高的细胞的选择性增强的多聚体抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月19日提交的美国临时专利申请序列号62/902,915的权益，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，其以ASCII格式以电子方式提交且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2020年9月17日，命名为023WO1-Sequence-Listing，并且大小为82,283字节。

背景技术

直接靶向癌细胞和其他患病细胞的单克隆抗体通常与靶抗原结合，靶抗原在患病细胞上过表达，但是还在正常的健康细胞上以降低的水平表达。因此，虽然用这种抗体进行治疗可以杀伤肿瘤细胞，但是抗体还可能对正常细胞产生不良影响。例如，抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)可以有效杀伤B细胞淋巴瘤，但是还可能消耗患者的正常B细胞。Kosmas,C.等人,Leukemia 16:2004-2015(2002)。最近，Slaga等人.ScienceTrans.Med.doi:10.1126/scitranslmed.aat5775(2018)证明了与HER2二价结合但亲和力降低的双特异性抗HER2/CD3抗体显示，相对于杀伤表达较低密度HER2的非肿瘤细胞，选择性杀伤HER2过表达肿瘤细胞。

可以多聚化的抗体和抗体样分子，诸如IgA和IgM抗体，已成为例如免疫肿瘤学和感染性疾病领域中实现特异性和亲合力改善并且还实现与多种结合靶标结合的能力的有前景的候选药物。参见例如美国专利号9,951,134、9,938,347和10,618,978；美国专利申请公开号US 2019-0100597和US 2019-0185570；以及PCT公开号WO 2016/154593、WO 2016/168758、WO 2018/017888、WO 2018/017763、WO 2018/017889、WO 2018/017761和WO 2019/169314，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。

仍然需要可以更有选择性地靶向肿瘤或其他过表达靶抗原的患病细胞，同时避免与以降低的密度表达抗原的健康细胞相互作用的治疗性单克隆抗体。

发明内容

本公开提供了一种多聚体结合分子，其包含两个、五个或六个二价结合单元，所述二价结合单元分别共同地包含四个、十个或十二个结合单元缔合的抗原结合结构域。如本文所提供，每个结合单元包含两条抗体重链，其各自具有IgA、IgA样、IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体以及结合单元缔合的抗原结合结构域或其亚基，其中结合分子的结合单元缔合的抗原结合结构域中的至少三个与细胞表面上相同的预定靶标特异性结合，并且其中结合分子优先与相对于以较低密度表达预定靶标的细胞，以较高密度表达预定靶标的细胞结合。

在某些实施方案中，每条抗体重链包含结合单元缔合的抗原结合结构域的重链可变区(VH)部分。在某些实施方案中，与细胞表面上相同的预定靶标结合的至少三个结合单元缔合的抗原结合结构域各自包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在某些实施方案中，至少三个抗原结合结构域各自与预定靶标上的相同表位结合。在某些实施方案中，与细胞表面上相同的预定靶标结合的至少三个结合单元缔合的抗原结合结构域是相同的。

在某些实施方案中，至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个结合单元缔合的抗原结合结构域与细胞表面上相同的预定靶标结合并且是相同的。在某些实施方案中，所提供的结合分子相对于参考二价IgG抗体，优先与以较高密度表达预定靶标的细胞结合，参考二价IgG抗体仅具有与细胞表面上的预定靶标特异性结合的相同的结合单元缔合的抗原结合结构域中的两个。在某些实施方案中，所提供的结合分子可与以较高密度表达靶抗原的细胞结合，其中参考二价IgG抗体不可与以较高密度表达靶抗原的细胞结合，参考二价IgG抗体仅具有与细胞表面上的预定靶标特异性结合的相同的结合单元缔合的抗原结合结构域中的两个。在某些实施方案中，所提供的结合分子不与以较低密度表达预定靶标的细胞可检测地结合。在某些实施方案中，以高密度表达预定靶标的细胞是癌细胞，并且以低密度表达预定靶标的细胞是正常的健康细胞。

在某些实施方案中，多聚体结合分子是五聚体或六聚体，并且分别包含五个或六个二价IgM或IgM样结合单元，其中每个结合单元包含两个IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体，它们各自与结合单元缔合的抗原结合结构域或其亚基缔合。在某些实施方案中，IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体各自包含Cμ4结构域和IgM尾片(tailpiece；tp)结构域，并且可还包含Cμ1结构域、Cμ2结构域、Cμ3结构域或其任何组合。在某些实施方案中，IgM或IgM样重链恒定区是人IgM恒定区或人源性IgM样恒定区。在某些实施方案中，每个结合单元包含：两条IgM或IgM样重链，其各自包含位于IgM或IgM样恒定区或其多聚化片段或变体的氨基末端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，其各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。在多聚体结合分子是五聚体的那些实施方案中，它可以还包含J链或其功能片段或变体。

在某些实施方案中，多聚体结合分子是二聚体，并且包含两个二价IgA或IgA样结合单元以及J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体，它们各自与结合单元缔合的抗原结合结构域或其亚基缔合。在某些实施方案中，二聚体结合分子可还包含分泌组分或其功能片段或变体。在某些实施方案中，IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体各自包含Cα3结构域和IgA尾片(tp)结构域，并且可还包含Cα1结构域、Cα2结构域、IgA铰链区或其任何组合。在某些实施方案中，IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体是人IgA重链恒定区或人源性IgA样重链恒定区。在某些实施方案中，每个结合单元包含：两条IgA或IgA样重链，其各自包含位于IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体的氨基末端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，其各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。

本文提供的某些多聚体结合分子包含J链或其片段或变体。在某些实施方案中，J链或其片段或变体是包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的人或人源性J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，J链或其功能片段或变体是相对于野生型J链包含一个或多个单氨基酸取代、缺失或插入的变体J链，从而可影响结合分子的血清半衰期。根据这些实施方案，相对于除一个或多个单氨基酸取代、缺失或插入之外均相同并且以相同方式向同一动物物种施用的参考结合分子，包含变体J链的结合分子在向动物施用后表现出血清半衰期增加。更具体地，在某些实施方案中，J链或其功能片段或变体在对应于野生型人J链(SEQ ID NO:42)的氨基酸Y102的氨基酸位置处包含氨基酸取代。SEQ ID NO:42的Y102可以被丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或精氨酸(R)取代。更具体地，对应于SEQ ID NO:42的Y102的氨基酸可以被丙氨酸(A)取代。在某些具体的实施方案中，变体J链是变体人J链并且包含氨基酸序列SEQID NO:43(J*)。

在某些实施方案中，所提供的多聚体结合分子的J链或其片段或变体是修饰的J链并且还包含异源部分，其中异源部分与J链或其片段或变体化学缀合或融合。在某些实施方案中，异源部分是异源多肽。异源多肽可以经由肽接头与J链或其片段或变体融合。例如，肽接头可由氨基酸序列SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60或SEQ IDNO:61组成。在某些实施方案中，异源多肽与J链或其片段或变体的N末端融合，与J链或其片段或变体的C末端融合，或者异源多肽可与J链或其片段或变体的N末端和C末端融合。在某些实施方案中，至少两种异源多肽可与J链或其片段或变体融合，并且至少两种异源多肽可以是相同或不同的。在某些实施方案中，至少一种异源多肽包含J链缔合的抗原结合结构域。在某些实施方案中，J链缔合的抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)片段或其任何组合。在某些实施方案中，J链缔合的抗原结合结构域是scFv片段。在某些实施方案中，J链缔合的抗原结合结构域与免疫效应细胞(例如，T细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)或NK细胞)特异性结合。

当免疫效应细胞是T细胞时，J链缔合的抗原结合结构域可以是例如与CD3ε特异性结合的scFv片段。在某些实施方案中，抗CD3εscFv片段可包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含VH互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51或者包含在VHCDR中的一个或多个中具有一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，并且其中VL包含VL互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:53、SEQID NO:54和SEQ ID NO:55或者包含在VLCDR中的一个或多个中具有一个、两个或三个氨基酸取代的SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55。例如，scFv片段可包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:48和VL氨基重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在某些具体的实施方案中，修饰的J链可包含SEQ IDNO:46(V15J)的氨基酸20至412、SEQ ID NO:47(V15J*)的氨基酸20至412或SEQ ID NO:56(SJ*)的氨基酸20至420。当免疫效应细胞是NK细胞时，J链缔合的抗原结合结构域可以是例如与CD16特异性结合的scFv片段。

在某些实施方案中，所提供的多聚体结合分子的修饰的J链可包含与J链或其片段或变体融合或化学缀合的免疫刺激剂(“ISA”)。在某些实施方案中，ISA可包括细胞因子或其受体结合片段或变体。例如，IS可以包含：(a)白介素-15(IL-15)蛋白或其受体结合片段或变体(“I”)；以及(b)能够与I缔合的包含寿司(sushi)结构域的白介素-15受体α(IL-15Rα)片段或其变体(“R”)，其中J链或其片段或变体以及I和R中的至少一个缔合为融合蛋白，并且其中I和R可以缔合以起ISA的作用。在某些实施方案中，ISA可以经由肽接头与J链融合。

在某些实施方案中，所提供的多聚体结合分子的预定靶标是B细胞成熟抗原(BCMA)、CD19、CD20、EGFR、HER2(ErbB2)、ErbB3、ErbB4、CTLA4、PD-1、PD-L1、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、CD52、CD30、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD38、GD2、SLAMF7、血小板源性生长因子受体A(PDGFRA)、CD22、FLT3(CD135)、CD123、MUC-16、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、间皮素、肿瘤相关钙信号转导蛋白2(Trop-2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)、人血型H类型1三糖(Globo-H)、唾液酸Tn抗原(STn抗原)或CD33。在某些实施方案中，对预定靶标具有特异性的至少三个相同的结合单元缔合的抗原结合结构域是已知与预定靶标结合的现有抗体的抗原结合结构域的亲和力降低的变体，其中现有抗体的抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在某些实施方案中，现有抗体是阿仑单抗(alemtuzumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗(avelumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、卡罗单抗(capromab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达雷木单抗、地诺单抗(denosumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊匹单抗(ipilimumab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、奈昔妥珠单抗(necitumumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)、纳武利尤单抗、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗、曲妥珠单抗(trastuzumab)或曲美木单抗(tremelimumab)。在某些实施方案中，所提供的结合分子与预定靶标结合，其对预定靶标的结合亲和力比现有抗体低至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。在某些实施方案中，现有抗体的抗原结合结构域的VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25、SEQID NO:26和SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41。

更具体地，现有抗体的抗原结合结构域与CD20特异性结合，并且包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:7和VL氨基酸序列SEQ ID NO:8，并且亲和力降低的变体在VL SEQ ID NO:8中的位置N93处包含氨基酸取代。例如，SEQ ID NO:8的N93可以包含N93D或N93E氨基酸取代。在某些具体实施方案中，对预定靶标具有特异性的至少三个相同的结合单元缔合的抗原结合结构域包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:7和VL氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在某些实施方案中，所提供的结合分子可以引导以高密度表达CD20的B细胞的补体引导的细胞毒性(complement-directed cytotoxicity；CDC)，其EC50浓度比针对以低密度表达CD20的B细胞的EC50浓度低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。在某些实施方案中，所提供的结合分子可以指导以高密度表达CD20的B细胞而不是以低密度表达CD20的B细胞的CDC。在某些实施方案中，所提供的抗CD20结合分子是五聚体IgM或IgM样结合分子或二聚体IgA或IgA样结合分子，并且还包含修饰的J链，其包含与CD3ε特异性结合的scFv。例如，修饰的J链可包含SEQ ID NO:46(V15J)的氨基酸20至412、SEQ ID NO:47(V15J*)的氨基酸20至412或SEQ ID NO:56(SJ*)的氨基酸20至420。在某些实施方案中，所提供的抗CD20结合分子可以引导以高密度表达CD20的B细胞的T细胞定向细胞毒性(TDCC)或TDCC和CDC两者，其EC50浓度比针对以低密度表达CD20的B细胞系或正常B细胞的EC50浓度低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。在某些实施方案中，所提供的抗CD20结合分子可以指导以高密度表达CD20的B细胞而不是以低密度表达CD20的B细胞的TDCC或TDCC和CDC两者。在某些实施方案中，以高密度和低密度CD20表达B细胞是淋巴瘤细胞系。例如，以高密度表达CD20的淋巴瘤细胞系是Ramos细胞系、Raji细胞系、DoHH-2细胞系、JeKo-1细胞系、Z-138细胞系、Daudi细胞系、Granta细胞系或DoHH2细胞系，并且以低密度表达CD20的淋巴瘤细胞系是CA46细胞系、Nalm-1细胞系、Toledo细胞系、BJAB细胞系、Kasumi-2细胞系、RPMI 8226细胞系、HT细胞系、SU-DHL-8细胞系、JM1细胞系、Namalwa细胞系、Nalm-6细胞系或Z138细胞系。在某些实施方案中，所提供的抗CD20结合分子可以指导Ramos细胞的CDC，其中等效量的包含与结合分子相同的抗原结合结构域的单特异性二价IgG1抗体不显示可检测的对Ramos细胞的补体介导的杀伤。在某些实施方案中，以高密度表达CD20的B细胞是患有癌症的受试者的CD20阳性恶性B细胞，并且以低密度表达CD20的B细胞是患有癌症的受试者的正常B细胞。在某些实施方案中，癌症是CD20阳性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些实施方案中，受试者是人。

本公开进一步提供了一种组合物，其包含本公开所提供的结合分子。

本公开进一步提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码所提供的结合分子、所提供的结合分子的抗原结合和多聚化片段或其亚基的核酸分子。在某些实施方案中，亚基是抗体重链或其多聚化片段或变体、抗体轻链或其片段、J链或其片段或变体或者其任何组合。本公开进一步提供了一种包含所提供的多核苷酸的载体，以及一种包含所提供的多核苷酸或所提供的载体的宿主细胞。在一相关的实施方案中，本公开提供了一种用于产生所提供的结合分子的方法，其中所述方法包括培养所提供的宿主细胞以及回收结合分子。

此外，本公开提供了一种IgM或IgM样抗体，其包含五个二价结合单元和修饰的J链，其中每个结合单元包含两个人IgM或人源性IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体，其各自与结合单元缔合的抗原结合结构域缔合，其中抗体的每个结合单元缔合的抗原结合结构域包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:7和VL氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10，其中修饰的J链包含J链缔合的结合结构域，其包含与CD3ε特异性结合的scFv，并且其中IgM抗体可以指导以高密度表达CD20的B细胞的TDCC、CDC或TDCC和CDC两者，其EC50浓度比针对以低密度表达CD20的B细胞系或正常B细胞的EC50浓度低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。在某些实施方案中，IgM或IgM样抗体可以指导以高密度表达CD20的B细胞而不是以低密度表达CD20的B细胞的CDC、TDCC或TDCC和CDC两者。在某些实施方案中，修饰的J链包含SEQ ID NO:46(V15J)的氨基酸20至412、SEQ ID NO:47(V15J*)的氨基酸20至412或SEQ ID NO:56(SJ*)的氨基酸20至420。在某些方面，高密度和低密度CD20表达细胞是淋巴瘤细胞系，例如，以高密度表达CD20的细胞可以是Ramos细胞系，并且以低密度表达CD20的细胞可以是CA46细胞系。在某些实施方案中，所提供的IgM或IgM样抗体可以引导对Ramos细胞的补体介导的杀伤，其中等效量的包含相同的抗原结合结构域的单特异性二价IgG1抗体不显示可检测的对Ramos细胞的补体介导的杀伤。在某些实施方案中，以高密度表达CD20的细胞是患有癌症的受试者的恶性B细胞，并且其中以低密度表达CD20的细胞是患有癌症的受试者的正常B细胞。癌症可以是例如CD20阳性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些实施方案中，受试者是人。

本公开进一步提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的所提供的结合分子、所提供的组合物或所提供的IgM或IgM样抗体。

本公开进一步提供了有效量的所提供的结合分子、所提供的组合物或所提供的IgM或IgM样抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

本公开进一步提供了所提供的结合分子、所提供的组合物或所提供的IgM或IgM样抗体，其在治疗癌症中使用。

附图说明

图1A至图1D：结合亲和力改变的抗CD20 IgG和IgM的生成。图1A.非还原型凝胶显示组装的IgG。图1B.还原型凝胶显示IgG重链和轻链。对于图1A和图1B：泳道1：RTX-IgG野生型，泳道2：RTX IgG N93A，泳道3：RTX IgG N93D，泳道4：RTX IgG N93E，泳道5：RTX IgGN93K，泳道6：RTX IgG N93R。图1C.非还原型凝胶显示组装的IgM。图1D.还原型凝胶显示IgM重链和轻链。图1C和图1D：泳道1：RTX-IgM+J野生型，泳道2：RTX IgM+J N93A，泳道3：RTXIgM+J N93D，泳道4：RTX IgM+J N93E，泳道5：RTXIgM+J N93K，泳道6：RTX IgM+J N93R。

图2A至图2B：呈IgG(图2A)以及呈IgM+J(图2B)的利妥昔单抗的各种亲和力改变的突变体对Ramos细胞的结合活性。

图3A至图3D：利妥昔单抗的各种亲和力改变的突变体在Ramos和CA46 B细胞系上的CDC活性。图3A：IgG抗体在Ramos细胞上的CDC活性；图3B：IgM抗体在Ramos细胞上的CDC活性；图3C：IgG抗体在CA46细胞上的CDC活性；图3D：IgM抗体在CA46细胞上的CDC活性。

图4A至图4C：利妥昔单抗的两种亲和力改变的突变体在CA46细胞(图4A)、正常B细胞(图4B)和Ramos细胞(图4C)上的TDCC活性。空心(open)圆圈：RTX-IGM V15J；空心菱形：RTX-IgM N93EV15J；空心三角形：RTX-IgM N93D V15J。

具体实施方式

定义

术语“一个”或“一种”实体是指一个(种)或多个(种)所述实体；例如，“结合分子”表示一个或多个结合分子。因此，诸如“一个”(或“一种”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”的术语在本文中可以互换使用。

此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个具有或不具有另一者的具体公开内容。因此，如在本文中诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非另外定义，否则本文所用的技术和科学术语均具有与本公开相关的领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology,修订版,2000,Oxford University Press为本领域的技术人员提供本公开中所用的许多术语的一般解释。

单位、前缀和符号均以其国际单位制(Système International de Unites；SI)接受的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基取向自左至右书写。本文提供的标题不是对本公开的各种实施方案的限制，所述实施方案可以通过参考整个说明书来获得。因此，通过参考说明书全文，可以更充分地定义下文即将定义的术语。

如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数个“多肽”以及复数个“多肽”，并且是指由酰胺键(又称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链并且不指代特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语均包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于替代这些术语中的任一个或可与其互换使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酰化、酰胺化、以及通过已知保护/阻断基团而衍生化、蛋白水解裂解或者通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以来源于生物来源或通过重组技术产生，但不必从指定核酸序列翻译。其可以任何方式生成，包括通过化学合成来生成。

如本文所公开的多肽的大小可为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，但是它们不一定具有这种结构。三维结构确定的多肽被称为折叠的，而不具有确定的三维结构的多肽可以采用大量不同构象。如本文所用，术语糖蛋白是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白质，碳水化合物部分经由氨基酸(例如，丝氨酸或天冬酰胺)的含氧或含氮侧链连接至蛋白质。

“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物旨在为不在它的天然周围环境中的多肽。不要求特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从它的原生或天然环境去除。如本文所公开，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，通过任何适合的技术分开、分级或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。

如本文所用，术语“非天然存在的多肽”或其任何语法变体是明确排除但仅排除由或可能由评判员或行政或评判部分确定或解释为“天然存在的”那些形式的多肽。

本文公开的其他多肽是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体以及其任何组合。如本文公开的术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留对应的天然抗体或多肽的至少一些特性(例如，与抗原特异性结合)的任何多肽。除本文别处讨论的特异性抗体片段之外，多肽的片段还包括例如蛋白水解片段以及缺失片段。例如多肽的变体包括如上文所述的片段以及由于氨基酸取代、缺失或插入而氨基酸序列改变的多肽。在某些实施方案中，变体可以是非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已经被改变以表现出在初始多肽上未发现的另外的特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可以称为“多肽类似物”。如本文所用，多肽的“衍生物”还可以指代具有一个或多个通过官能侧基的反应来化学衍生的氨基酸的主题多肽。“衍生物”还包括含有二十种标准氨基酸的一种或多种衍生物的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且/或者鸟氨酸可以取代赖氨酸。

“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸被另一个具有类似侧链的氨基酸置换的取代。具有类似侧链的氨基酸的家族已经在本领域中进行了定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些实施方案中，本公开的多肽和抗体的序列中的保守取代不会消除含有氨基酸序列的多肽或抗体与结合分子(例如，抗体)所结合的抗原的结合。鉴别不会消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。

术语“多核苷酸”旨在涵盖单数个核酸以及复数个核酸，并且指代分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、cDNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸”或“核酸序列”是指多核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。

“分离的”核酸或多核苷酸旨在为从其天然环境分开的任何形式的核酸或多核苷酸。例如，凝胶纯化的多核苷酸或编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸将被认为是“分离的”。另外，被工程化成具有克隆限制位点的多核苷酸片段，例如PCR产物，被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在非天然溶液(诸如缓冲液或盐水)中的纯化(部分或基本上)的多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录物，其中转录物不是在自然界中发现的转录物。分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。

如本文所用，术语“非天然存在的多核苷酸”或其任何语法变体是明确排除但仅排除由或可能由评判员或行政或评判部分确定或解释为“天然存在的”那些形式的核酸或多核苷酸。

如本文所使用，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可以被认为是编码区的一部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于例如单个载体上的单个多核苷酸构建体中，或存在于例如独立(不同)载体上的独立多核苷酸构建体中。此外，任何载体可以含有单个编码区，或者可以包含两个或更多个编码区，例如，单个载体可以分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可以包含异源编码区，其与另一编码区融合或不融合。异源编码区包含但不限于编码指定元件或基序的那些，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。

在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。就DNA而言，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包含与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。可操作的缔合是基因产物(例如，多肽)的编码区与一个或多个调控序列缔合成使得基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下的情形。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键联的本质不干扰表达调控序列指导基因产物的表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，那么两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其缔合的启动子)是“可操作地缔合”的。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，那么启动子区将与所述核酸可操作地缔合。启动子可以是指导DNA在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。除启动子之外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。

多种转录控制区是本领域的技术人员已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒(即刻早期启动子，与内含子-A缀合)、猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因的那些，诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够在真核细胞中控制基因表达的其他序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子可诱导的启动子(例如，可由干扰素或白介素诱导的启动子)。

类似地，多种翻译控制元件是本领域的普通技术人员已知的。它们包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及来源于小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。

在其他实施方案中，多核苷酸可以是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)、转移RNA或核糖体RNA的形式。

多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码区缔合，所述另外的编码区编码分泌或信号肽，所述分泌或信号肽指导由如本文所公开的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长中的蛋白质链跨过粗面内质网输出被起始，那么所述序列就从成熟蛋白质裂解。本领域的普通技术人员应意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽可具有与多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽从完整或“全长”多肽裂解，以产生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号序列，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者使用所述序列的功能性衍生物，其保留了指导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力。替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖苷酸酶的前导序列取代。

如本文所用，术语“结合分子”在其更广泛的意义上是指与结合靶标(例如，表位或抗原决定簇)特异性结合的分子。如本文进一步所述，结合分子可包含本文所述的多个“抗原结合结构域”中的一个。结合分子的非限制性实例是如本文详细描述的保留抗原特异性结合的抗体或抗体样分子。在某些实施方案中，“结合分子”包括如本文详细描述的抗体或抗体样分子。

如本文所用，术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”(可互换使用)是指结合分子(例如，抗体或抗体样分子)的区，其是与结合靶标(例如，表位)特异性结合所必需的且足以与结合靶标特异性结合。例如，“Fv”，例如抗体的重链可变区和轻链可变区，呈两个独立的多肽亚基或呈单链，被认为是“结合结构域”。其他抗原结合结构域包括但不限于来源于骆驼物种的抗体的重链可变区(VHH)、来自鲨鱼的V_NAR抗原受体或在异源支架(例如，纤连蛋白支架)中表达的六个免疫球蛋白互补决定区(CDR)。如本文所述的“结合分子”或“抗体”可包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或甚至更多个“抗原结合结构域”。如本文所用，“结合单元缔合的抗原结合结构域”是指作为抗体重链和/或抗体轻链的一部分的抗原结合结构域。术语“J链缔合的抗原结合结构域”是指与如本文所述的修饰的J链缔合的抗原结合结构域，例如与野生型人J链或其功能片段或变体融合的ScFv。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”可在本文中互换使用。抗体(或其如本文所公开的片段、变体或衍生物)包括至少(骆驼物种的)重链可变区或至少重链和轻链可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对好理解的。参见例如Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)。除非另外说明，否则术语“抗体”涵盖范围从抗体的小抗原结合片段到全尺寸抗体的任何抗体，例如包含两条完整重链和两条完整轻链的IgG抗体、包含四条完整重链和四条完整轻链以及J链或其功能片段或变体和/或分泌组分的IgA抗体或者包含十条或十二条完整重链和十条或十二条完整轻链并且任选地包含J链或其功能片段或变体的IgM抗体。

如下文将更详细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可被生物化学区别的各种广泛类别的多肽。本领域的技术人员将会知道重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，在它们之中有一些亚类(例如，γ1-γ4或α1-α2)。所述链的本质是将抗体的“同种型”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(亚型)(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂等)被很好地表征并且已知赋予功能特异化。这些免疫球蛋白中每一种的修饰的版本对于熟练的技术人员来说易于鉴于本公开来辨别，并且因此在本公开的范围内。

轻链被分类为κ或λ。可以用κ或λ轻链缔合每种重链类别。通常，轻链和重链彼此共价键合，并且当例如通过杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞来表达免疫球蛋白时，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键联或非共价键联彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉状端处的N末端到每条链底部处的C末端。某些抗体(例如，IgG抗体)的基本结构包含两个重链亚基和两个轻链亚基，其经由二硫键共价连接以形成“Y”结构(在本文中还称为“H2L2”结构)或“结合单元。”

术语“结合单元”在本文中用于指代结合分子(例如，抗体、抗体样分子、其抗原结合片段或其多聚化片段)的一部分，其对应于标准“H2L2”免疫球蛋白结构，例如，两条重链或其片段和两条轻链或其片段。在某些实施方案中，结合单元可以对应于例如骆驼抗体中的两条重链。在某些实施方案中，例如，当结合分子是二价IgG抗体或其抗原结合片段时，术语“结合分子”和“结合单元”是等效的。在其他实施方案中，例如，当结合分子是多聚体(例如，二聚体IgA抗体或IgA样抗体、五聚体IgM抗体或IgM样抗体或者六聚体IgM抗体或IgM样抗体)时，结合分子包含两个或多个“结合单元”。就IgA二聚体而言，为两个，或者就IgM五聚体或六聚体而言，分别为五个或六个。结合单元不需要包含全长抗体重链和轻链，但通常是二价的，即，包含两个“结合单元缔合的抗原结合结构域”，如上文所定义。如本文所用，本公开中提供的某些结合分子是“二聚体”，并且包含两个包含IgA恒定区或其多聚化片段的二价结合单元。本公开中提供的某些结合分子是“五聚体”或“六聚体”，并且包含五个或六个包含IgM恒定区或其多聚化片段的二价结合单元。包含两个或更多个(例如，两个、五个或六个)结合单元的结合分子(例如，抗体或抗体样分子)在本文中称为“多聚体”。“多聚化片段”意指足以形成五聚体或六聚体(就IgM而言)或二聚体(就IgA而言)的IgM或IgA恒定区的一部分。本文别处描述了足以多聚化的IgM和IgA恒定区片段。

如本文所用的术语“J链”是指任何动物物种的天然序列IgM或IgA抗体的J链、其任何功能片段、其衍生物和/或其变体，包括成熟的人J链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:42所呈现。本文公开了各种J链变体和修饰的J链衍生物。如本文所用，“功能片段”或“功能变体”包括可与IgM重链恒定区缔合以形成五聚体IgM抗体(或替代地，可与IgA重链恒定区缔合以形成二聚体IgA抗体)的那些片段和变体。

术语“修饰的J链”在本文中用于指代包含异源部分(例如，异源多肽，例如，引入到天然J链序列或变体J链序列中的外来抗原结合结构域)的天然序列J链多肽的衍生物。可以通过任何方式实现引入，包括异源多肽或其他部分的融合或通过肽或化学接头的连接。术语“修饰的人J链”涵盖但不限于通过引入异源部分(例如，异源多肽，例如，J链缔合的抗原结合结构域)来修饰的包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的天然序列人J链、或其功能片段、或其功能变体。在某些实施方案中，异源部分不干扰IgM单体有效聚合成五聚体以及五聚体IgM与靶标结合。示例性修饰的J链可见于例如美国专利号9,951,134和10,618,978以及美国专利申请公布号US-2019-0185570，其各自以引用的方式整体并入本文。

如本文所用，术语“IgM衍生的结合分子”、“IgM样抗体”、“IgM样结合单元”或“IgM样重链恒定区”是指变体抗体衍生的结合分子、抗体、结合单元或重链恒定区，其仍保留了IgM重链中赋予形成多聚体(即，六聚体)或与J链缔合形成五聚体的能力所必需的结构部分。IgM样抗体或IgM衍生的结合分子通常包含至少IgM恒定区的Cμ4和尾片(tp)结构域，但可以包含来自相同物种或来自不同物种的其他抗体同种型(例如，IgG)的重链恒定区结构域。IgM样抗体或IgM衍生的结合分子同样可以是其中一个或多个恒定区结构域缺失的抗体片段，只要IgM样抗体能够形成六聚体和/或五聚体即可。因此，IgM样抗体或IgM衍生的结合分子可以是例如杂交IgM/IgG抗体，或者可以是IgM抗体的“多聚化片段”。

如本文所用，术语“IgA衍生的结合分子”、“IgA样抗体”、“IgA样结合单元”或“IgA样重链恒定区”是指变体抗体衍生的结合分子、抗体、结合单元或重链恒定区，其仍保留了IgA重链中赋予与J链缔合形成多聚体(即，二聚体)的能力所必需的结构部分。IgA样抗体或IgA衍生的结合分子通常包含至少IgA恒定区的Cα3和尾片(tp)结构域，但可以包含来自相同物种或来自不同物种的其他抗体同种型(例如，IgG)的重链恒定区结构域。IgA样抗体或IgA衍生的结合分子同样可以是其中一个或多个恒定区缺失的抗体片段，只要IgA样抗体能够与J链缔合形成二聚体即可。因此，IgA样抗体或IgA衍生的结合分子可以是例如杂交IgA/IgG抗体，或者可以是IgA抗体的“多聚化片段”。

术语“化合价”、“二价”、“多价”和语法等效形式是指给定结合分子(例如，抗体或抗体样分子)或给定结合单元中抗原结合结构域的数目。因此，关于给定结合分子(例如，IgM抗体、IgM样抗体或其多聚化片段)的术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示存在两个抗原结合结构域、四个抗原结合结构域和六个抗原结合结构域。每个结合单元是二价的典型的IgM抗体、或IgM样抗体、或IgM衍生的结合分子可具有化合价10或12，或者当五聚体IgM包含有包含单一J链缔合的抗原结合结构域的修饰的J链时可具有化合价十一。二价或多价结合分子(例如，抗体或抗体样分子)可以是单特异性的，即所有抗原结合结构域都是相同的；或者可以是双特异性或多特异性的，例如，当两个或更多个抗原结合结构域不同时，例如，与相同抗原上的不同表位结合，或与完全不同的抗原结合。

术语“表位”包括能够与抗体或抗体样分子的抗原结合结构域特异性结合的任何分子决定簇。在某些实施方案中，表位可包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方案中，可具有三维结构特征和/或具体的电荷特征。表位是靶标中被抗体的抗原结合结构域结合的区。

术语“靶标”以最广泛的意义用于包括可以被结合分子(例如，抗体或抗体样分子)结合的物质。靶标可以是例如多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其他分子。此外，“靶标”可以例如是细胞、器官或生物体，其包含可以被结合分子(例如，抗体或抗体样分子)结合的表位。如本文所用，“靶抗原”是靶分子，例如多肽、核酸、碳水化合物、脂质或可以被如本文所提供的结合分子(例如，抗体或抗体样分子)结合的其他分子。在某些实施方案中，靶抗原可以出现在细胞(例如，肿瘤细胞)的表面上。如本文所用，“肿瘤特异性抗原”是至少在生物体发育的后期阶段，肿瘤细胞特有的蛋白质或其他细胞表面靶抗原。如本文所用，“肿瘤相关抗原”是不一定是肿瘤细胞特有的，但通常在肿瘤细胞上比在正常的健康细胞上更加丰富和/或以更高密度表达的蛋白质或其他细胞表面靶抗原。

轻链和重链均被分成结构和功能同源性的区。就其功能使用术语“恒定的”和“可变的”。轻链(VL)可变区和重链(VH)可变区决定抗原识别和特异性。相反，轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(例如，CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4)赋予生物特性，诸如分子柔性，分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号在它们变得离抗体重链亚基的抗原结合位点或氨基末端更远时增加。N末端部分是可变区(VH)，并且C末端部分是恒定区；例如，就IgA而言的CH3和尾片或就IgM而言的CH4和尾片以及CL结构域分别构成重链和轻链的羧基末端。

“全长IgM抗体重链”是以N末端至C末端方向包含抗体重链可变区(VH)、抗体重链恒定结构域1(CM1或Cμ1)、抗体重链恒定结构域2(CM2或Cμ2)、抗体重链恒定结构域3(CM3或Cμ3)和抗体重链恒定结构域4(CM4或Cμ4)并且还可以包含尾片的多肽。

“全长IgA抗体重链”是以N末端至C末端方向包含抗体重链可变区(VH)、抗体重链恒定结构域1(CA1或Cα1)、IgA铰链区、抗体重链恒定结构域2(CA2或Cα2)和抗体重链恒定结构域3(CA3或Cα3)并且还可以包含尾片的多肽。

如上文所指明，可变区允许结合分子(例如，抗体或抗体样分子)选择性识别抗原上的表位并与其特异性结合。即，结合分子(例如，抗体或抗体样分子)的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集组合以形成抗原结合结构域。更具体地，抗原结合结构域可以由VH和VL链中每一个上的三个CDR定义。某些抗体形成较大结构。例如，IgA可以形成包含经由二硫键共价连接两个H2L2结合单元和J链(它们可以进一步与分泌组分缔合)的分子，并且IgM可以形成包含经由二硫键共价连接的五个或六个H2L2结合单元和任选地J链的五聚体或六聚体分子。

存在于抗体抗原结合结构域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的非邻接氨基酸序列，当抗体在水性环境中呈现其三维构型时，所述氨基酸序列特异性地放置以形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸(称为“框架”区)显示出较小的分子间可变性。框架区大部分采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成其一部分的环。因此，框架区起到形成支架的作用，所述支架提供通过链间非共价相互作用将CDR以正确取向放置。通过所放置的CDR形成的抗原结合结构域限定了与靶抗原上的表位互补的表面。这个互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域的普通技术人员可以容易地鉴别出分别构成CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经以各种不同的方式进行定义(参见“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”Kabat,E.等人.,U.S.Department of Health and HumanServices,(1983)；以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)，其以引用的方式整体并入本文)。

除非明确地相反说明，否则在本领域中使用和/或接受的术语有两种或更多种定义的情况下，如本文所用的术语的定义旨在包括所有此类意义。一具体实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链多肽和轻链多肽的可变区内存在的非邻接抗原组合位点。这些特定区已通过例如Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)以及Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)进行了描述，其以引用的方式并入本文。当彼此进行比较时，Kabat和Chothia定义包括氨基酸的重叠或子集。然而，除非另外指明，否则应用任一定义(或本领域的普通技术人员已知的其他定义)来指代抗体或其变体的CDR旨在处于如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖如通过上文引用的参考文献中每一个所定义的CDR的适当氨基酸残基呈比较示于以下表1中。涵盖特定CDR的准确氨基酸编号将根据CDR的序列和大小而改变。本领域的技术人员通常可以确定哪些氨基酸构成给定抗体的可变区氨基酸序列的特定CDR。

表1 CDR定义^*

	Kabat	Chothia
			VH CDR1	31-35	26-32
VH CDR2	50-65	52-58
			VH CDR3	95-102	95-102
VL CDR1	24-34	26-32
			VL CDR2	50-56	50-52
VL CDR3	89-97	91-96

^*表1中所有CDR定义的编号根据Kabat等人示出的编号惯例(参见以下)。

还可以例如使用IMGT信息系统(imgt_dot_cines_dot_fr/)

分析抗体可变区以鉴别可变区区段，包括CDR。(参见例如，Brochet等人,Nucl.Acids Res.,36:W503-508,2008)。

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的用于可变区和恒定区序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以明确地对任何可变区序列指定这种“Kabat编号”系统，而不依赖于超过序列本身的任何实验数据。如本文所使用，“Kabat编号”是指由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest”(1983)所列举的编号系统。然而，除非明确说明使用Kabat编号系统，否则本公开中的所有氨基酸序列均使用按序编号。

人IgM恒定结构域的Kabat编号系统可见于Kabat等人,“Tabulation andAnalysis of Amino acid and nucleic acid Sequences of Precursors,V-Regions,C-Regions,J-Chain,T-Cell Receptors for Antigen,T-Cell Surface Antigens,β-2Microglobulins,Major Histocompatibility Antigens,Thy-1,Complement,C-ReactiveProtein,Thymopoietin,Integrins,Post-gamma Globulin,α-2 Macroglobulins,andOther Related Proteins,”U.S.Dept.of Health and Human Services(1991)。IgM恒定区可以依序编号(即，氨基酸#1从恒定区的第一个氨基酸开始)或使用Kabat编号方案。依序(本文呈现为SEQ ID NO:1(等位基因IGHM*03)和SEQ ID NO:2(等位基因IGHM*04))与通过Kabat系统对人IgM恒定区的两个等位基因进行编号的比较示于下文。Kabat系统中不考虑加下划线的氨基酸残基(下面加双下划线的

可以是丝氨酸(S)(SEQ ID NO:1)或甘氨酸(G)(SEQ ID NO:2))：

IgM重链的依序(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)/KABAT编号索引

1/127 GSASAPTLFP LVSCENSPSD TSSVAVGCLA QDFLPDSITF SWKYKNNSDI

51/176 SSTRGFPSVL RGGKYAATSQ VLLPSKDVMQ GTDEHVVCKV QHPNGNKEKN

101/226 VPLPVIAELP PKVSVFVPPR DGFFGNPRKS KLICQATGFS PRQIQVSWLR

151/274 EGKQVGSGVT TDQVQAEAKE SGPTTYKVTS TLTIKESDWL

201/324 HRGLTFQQNA SSMCVPDQDT AIRVFAIPPS FASIFLTKST KLTCLVTDLT

251/374 TYDSVTISWT RQNGEAVKTH TNISESHPNA TFSAVGEASI CEDDWNSGER

301/424 FTCTVTHTDL PSPLKQTISR PKGVALHRPD VYLLPPAREQ LNLRESATIT

351/474 CLVTGFSPAD VFVQWMQRGQ PLSPEKYVTS APMPEPQAPG RYFAHSILTV

401/524 SEEEWNTGET YTCVVAHEAL PNRVTERTVD KSTGKPTLYN VSLVMSDTAG

451/574TCY

结合分子(例如，抗体、抗体样分子、其抗原结合片段、变体或衍生物和/或其多聚化片段)包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如Fab、Fab'和F(ab')₂)、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子是本领域中已知的并且描述于例如美国专利5,892,019中。

“特异性结合”通常意指结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)经由其抗原结合结构域与表位结合，并且所述结合需要在抗原结合结构域与表位之间的一定补充。根据这个定义，当与随机不相关的表位相比，结合分子(例如，抗体或抗体样分子)更易于经由抗原结合结构域与一表位结合时，称所述结合分子与所述表位“特异性结合”。本文使用术语“特异性”来限定某一结合分子与某一表位结合的相对亲和力。例如，结合分子“A”可以被认为具有比结合分子“B”更高的对给定表位的特异性，或者可以称结合分子“A”以比它对相关表位“D”更高的特异性与表位“C”结合。

可以称结合分子(例如，本文所公开的抗体或其片段、变体或衍生物)与靶抗原结合，其解离速率(k(off))小于或等于5X10^-2s^-1、10^-2s^-1、5X10^-3s^-1、10^-3s^-1、5X10^-4s^-1、10^-4s^-1、5X10^-5s^-1或10^-5s^-1 5X10^-6s^-1、10^-6s^-1、5X10^-7s^-1或10^-7s^-1。

可以称结合分子(例如，本文所公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)与靶抗原结合，其结合速率(k(on))大于或等于10³M^-1s^-1、5X10³M^-1s^-1、10⁴M^-1s^-1、5X10⁴M^-1s^-1、10⁵M^-1s^-1、5X10⁵M^-1s^-1、10⁶M^-1s^-1或5X10⁶M^-1s^-1或10⁷M^-1s^-1。

如果结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)优先与给定表位结合，其程度使得它在一定程度上阻断参考抗体或抗原结合片段与表位的结合，那么称所述结合分子竞争性抑制参考抗体或抗原结合片段与所述表位的结合。可以通过本领域已知的任何方法(例如，竞争ELISA测定)来确定竞争性抑制。可以称结合分子(例如，抗体)竞争性抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。

如本文所使用，术语“亲和力”是指单独表位与例如免疫球蛋白分子的一个或多个抗原结合结构域的结合强度的量度。参见例如，Harlow等人,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988),第27-28页。抗原结合结构域(例如，Fab片段)对抗原的亲和力可以描述或指定为解离常数或K_D。K_D是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即比率k_off/k_on。K_D和亲和力是逆相关的。K_D值越低，抗体的亲和力越高。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，抗体)的解离常数或K_D不大于5x10^-2M、10^-2M、5x10^-3M、10^-3M、5x10^-4M、10^-4M、5x10^-5M、10^-5M、5x10^-6M、10^-6M、5x10^-7M、10^-7M、5x10^-8M、10^-8M、5x10^-9M、10^-9M、5x10^-10M、10^-10M、5x10^-11M、10^-11M、5x10^-12M、10^-12M、5x10^-13M、10^-13M、5x10^-14M、10^-14M、5x10^-15M或10^-15M。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)对以较高密度表达靶抗原(例如，在肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原)的细胞的选择性增强。“选择性增强”意指与同样表达预选靶抗原的其他细胞相比，所提供的结合分子(例如，抗体)与以较高密度表达所述抗原的靶细胞结合。例如，肿瘤细胞或恶性细胞通常表达也在正常的健康细胞上表达的肿瘤相关抗原，但肿瘤细胞以比正常细胞更高的水平或更高的密度表达靶抗原。为了获得选择性增强，如本文所提供的结合分子(例如，抗体)可以被修饰成具有多于两个抗原结合结构域，例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个抗原结合结构域，与已知单体二价参考抗体的等效抗原结合结构域相比，其对预定靶抗原的亲和力较低，即K_D较高。例如，相对于正常的健康细胞，对肿瘤细胞的选择性增强的IgA或IgM抗体可以具有多于两个抗原结合结构域，例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个抗原结合结构域，其K_D比与预定靶抗原结合的已知单体二价抗体的抗原结合结构域的K_D大至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少5000倍或至少10,000倍或更多倍。

如本文所用，术语“亲合力”是指抗原结合结构域群体与抗原或抗原复合物之间的复合物的总体稳定性。参见例如Harlow的第29-34页。亲合力与具有特异性表位的群体中的单独抗原结合结构域的亲和力以及免疫球蛋白和抗原的化合价相关。例如，与结合亲和力等效的具有抗原结合结构域的二价IgG抗体相比，十价IgM抗体以较高亲合力与抗原结合。亲合力还可以受到抗原影响，例如，二价IgG抗体与具有高度重复的表位结构的抗原(诸如，聚合物)之间的相互作用将是高亲合力的相互作用。二价、四价或十价抗体与以高密度存在于细胞表面上的受体之间的相互作用也具有高亲合力。当抗体与存在于细胞表面上的靶抗原(例如，肿瘤细胞上的肿瘤特异性或肿瘤相关抗原)结合时，至少三种途径可影响亲合力：(a)抗体的化合价，例如，二价IgG抗体的亲合力与具有等效抗原结合结构域的十价IgM抗体不同；(b)抗体的单独抗原结合结构域的亲和力增加或减小，例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二抗原结合结构域；和/或(c)细胞表面的靶抗原的密度，例如，以高密度表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞与以较低密度表达靶抗原的正常的健康细胞之间的差异。本公开提供抗体，其中可以操纵途径(a)和(b)以提供对以高密度表达靶抗原的患病细胞相对于以较低密度表达靶抗原的正常细胞的选择性增强。

结合分子(例如，如本文所公开的抗体或抗体样分子)也可以根据它们的交叉反应性来描述或指定。如本文所使用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)与第二抗原反应的能力；为两种不同抗原物质之间的相关性的量度。因此，如果结合分子与除了诱导它形成的表位以外的表位结合，那么结合分子具有交叉反应性。交叉反应表位通常包含许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下可以实际上比初始物更好地适合。

“抗原结合抗体片段”，包括单链抗体或其他抗原结合结构域，可以单独存在或与以下中的一种或多种组合存在：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌组分。还包括可以包含可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌组分中的一种或多种的任何组合的抗原结合片段。结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)可以来自包括鸟和哺乳动物的任何动物来源。抗体可以是例如人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马、熊或鸡抗体。在另一个实施方案中，可变区可以来源于软骨鱼(condricthoid)(例如，来自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从针对一种或多种人免疫球蛋白转基因的并且在一些情况下可能不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如下文以及例如在Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中所述。根据本公开的实施方案，如本文所提供的IgM或IgM样抗体、IgA或IgA样抗体或者IgM或IgA衍生的结合分子可以包括抗体的抗原结合片段，例如ScFv片段，只要它能够形成多聚体(例如，二聚体、六聚体或五聚体)即可。

如本文所使用，术语“重链亚基”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。重链亚基可以包括以下中的至少一种：VH结构域、CH1结构域、铰链(例如，上铰链区、中铰链区和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、尾片(tp)或其变体或片段。此外，重链亚基可缺少某些恒定区部分，例如CH1结构域和/或CH2结构域的全部或部分。这些结构域(例如，重链亚基)可以被修饰，使得它们的氨基酸序列与初始重链亚基不同。根据本公开的实施方案，如本文所提供的包含IgM或IgM样重链或IgA或IgA样重链的多聚体结合分子包含IgM、IgM样、IgA或IgA样重链恒定区中足以使结合分子形成多聚体(例如，二聚体、六聚体或五聚体)的部分，例如，重链恒定区包括IgM、IgM样、IgA或IgA样重链恒定区的“多聚化片段”。

如本文所使用，术语“轻链亚基”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基至少包含VL，并且可以还包含CL(例如，Cκ或Cλ)结构域。

结合分子(例如，抗体、抗体样分子、其抗原结合片段、变体或衍生物、或其多聚化片段)可以根据它们识别或特异性结合的表位或部分来描述或指定。靶抗原中与抗体的抗原结合结构域特异性地相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶抗原可以包含单个表位或至少两个表位，并且可以根据抗原的大小、构象和类型包含任何数目的表位。

如本文所用，术语“铰链区”包括重链分子中使IgG、IgA和IgD重链中的CH1结构域与CH2结构域连接的部分。这个铰链区包含大约25个氨基酸并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。

如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以形成二硫键或与第二个巯基桥联的巯基。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫反应性区或位点获自或来源于第一物种并且恒定区(其可以是完整的、部分的或修饰的)获自第二物种的抗体。在一些实施方案中，靶结合区或位点可以来自非人来源(例如，小鼠或灵长类动物)并且恒定区是人的。

术语“多特异性抗体”或“双特异性抗体”是指在单个抗体分子内具有针对两个或更多个不同表位的抗原结合结构域的抗体或抗体样分子。除经典的抗体结构之外的其他结合分子可以被构建成具有两种结合特异性。

如本文所用，术语“工程化的抗体”是指其中重链和轻链或两者中的可变区通过至少部分地置换CDR或框架区中的一个或多个氨基酸来改变的抗体。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，抗体)可以工程化成与已知参考抗体(例如，批准的治疗性抗体或开发中的治疗性抗体)相比，对预定靶抗原的亲和力降低。在某些实施方案中，可以将来自已知特异性的抗体的整个CDR移植到异源抗体的框架区中。虽然替代的CDR可以衍生自与框架区所衍生的抗体的类别或甚至亚类相同的抗体，但是CDR也可以衍生自不同类别的抗体，例如来自不同物种的抗体。来自已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR被移植到人重链或轻链框架区中的工程化的抗体在本文中称为“人源化抗体”。在某些实施方案中，不是所有CDR都被来自供体可变区的完整CDR置换，但是供体的抗原结合能力仍然可以被转移到接受体可变区。鉴于例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中所示出的解释，通过进行常规实验或通过试误法测试来获得功能性工程化或人源化抗体将很好地在本领域的普通技术人员的能力范围内。

如本文所用，术语“工程化”包括通过合成手段(例如，通过重组技术、体外肽合成、通过肽、核酸或聚糖的酶促或化学偶联或者这些技术的一定组合)来操纵核酸或多肽分子。

如本文所用，术语“连接”、“融合(fused)”、“融合(fusion)”或其他语法等效形式可以互换使用。这些术语指代通过无论什么手段(包括化学缀合或重组手段)将两种或更多种元件或组分连接在一起。“框内融合”指代以维持原始ORF的翻译阅读框的方式连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)以形成连续更长ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或多个区段的单一蛋白质，所述区段对应于初始ORF编码的多肽(所述区段在自然界中通常不如此连接)。尽管因此使阅读框在整个融合区段中是连续的，但是区段可以通过例如框内接头序列在物理上或空间上分开。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以在框内融合，但被编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分共翻译即可。

在多肽的情形下，“直链序列”或“序列”是多肽中以氨基末端至羧基末端方向的一定顺序的氨基酸，其中在序列中彼此相邻的氨基酸在多肽的一级结构中是连续的。多肽中在多肽的另一部分的“氨基末端”或“N末端”的部分是在顺序多肽链中较早出现的那个部分。类似地，多肽中在多肽的另一部分的“羧基末端”或“C末端”的部分是在顺序多肽链中较晚出现的那个部分。例如，在典型的抗体中，可变区在恒定区的“N末端”，并且恒定区在可变区的“C末端”。

如本文所用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质(例如，多肽)的过程。所述过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除以及瞬间表达与稳定表达。它包括但不限于基因转录成RNA(例如，信使RNA(mRNA))以及所述mRNA翻译为多肽。如果最终期望产物是生物化学物质，那么表达包括产生所述生物化学物质和任何前体。基因表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸(例如，由基因转录产生的信使RNA)或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如，聚腺苷酸化)的核酸或具有转录后修饰(例如，甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚基缔合、蛋白水解裂解等)的多肽。

诸如“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”、或“治疗(to treat)”、或“缓和(alleviating)”、或“缓和(to alleviate)”的术语是指治愈、减缓现有诊断的疾病、病理病况或病症、减轻其症状和/或暂停或减慢其进展的治疗措施。诸如“预防(prevent)”、“预防(prevention)”、“避免(avoid)”、“阻止(deterrence)”等的术语是指预防未诊断的目标疾病、病理病况或病症的发展的防治或预防措施。因此，“需要治疗的受试者”可以包括已经患有所述病症的受试者、易患所述病症的受试者以及待预防所述病症的受试者。

如本文所用，术语“血清半衰期”或“血浆半衰期”是指在施用后蛋白质或药物(例如，结合分子，诸如，如本文所述的抗体或抗体样分子)的血清或血浆浓度减小50％所需要的时间(例如，以分钟、小时或天为单位)。可以描述两种半衰期：α半衰期(alpha half-life或αhalf-life)或t_1/2α，其为血浆浓度由于药物从中心室(例如，就静脉内递送而言，血液)向周边室(例如，组织或器官)重新分配的过程而降低的速率；和β半衰期(beta half-life或βhalf-life)或t_1/2β，其为由于排泄或代谢的过程而降低的速率。

如本文所用，术语“血浆药物浓度-时间曲线下面积”或“AUC”反映了在施用一定剂量的药物之后实际的身体对药物的暴露并且以mg*h/L为单位表述。这种曲线下面积是从时间0(t₀)至无穷大(∞)测量的并且取决于药物从身体的清除速率和施用的剂量。

如本文所用，术语“平均停留时间”或“MRT”是指药物在体内保留的平均时间长度。

“受试者”、或“个体”、或“动物”、或“患者”、或“哺乳动物”意指期望进行诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物以及动物园、体育竞技动物或宠物，诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、奶牛、熊等。

如本文所用，诸如“将受益于治疗的受试者”和“需要治疗的动物”的短语是指所有可能的受试者中将受益于包含一个或多个抗原结合结构域的给定治疗剂(例如，结合分子，诸如抗体或抗体样分子)的施用的受试者的子集。此类结合分子(例如，抗体或抗体样分子)可用于例如诊断程序和/或治疗或预防疾病。

IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子

IgM是由B细胞响应于抗原刺激所产生的第一免疫球蛋白，并且以约1.5mg/ml自然存在于血清中，半衰期为约5天。IgM是五聚体或六聚体分子，并且因此包含五个或六个结合单元。IgM结合单元通常包含两条轻链和两条重链。虽然IgG重链恒定区包含三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，但是IgM的重链(μ)恒定区另外包含第四恒定结构域(CH4)并且包含C末端“尾片”(tp)。虽然存在若干人等位基因，但是人IgM恒定区通常包含氨基酸序列SEQID NO:1(IMGT等位基因IGHM*03，与例如GenBank登录号pir||S37768相同)或SEQ ID NO:2(IMGT等位基因IGHM*04，与例如GenBank登录号sp|P01871.4相同)。人Cμ1区的范围是SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的约氨基酸5至约氨基酸102；人Cμ2区的范围是SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的约氨基酸114至约氨基酸205；人Cμ3区的范围是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的约氨基酸224至约氨基酸319；Cμ4区的范围是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的约氨基酸329至约氨基酸430；并且尾片的范围是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的约氨基酸431至约氨基酸453。

存在序列变异较小的其他形式的人IgM恒定区，包括但不限于GenBank登录号CAB37838.1和pir||MHHU。在对应于本公开别处描述和要求保护的SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的位置处的氨基酸取代、插入和/或缺失同样可以并入替代的人IgM序列以及其他物种的IgM恒定区氨基酸序列中。

每个IgM重链恒定区可以与抗原结合结构域(例如，ScFv或VHH)或抗原结合域的亚基(例如，VH区)缔合。

五个IgM结合单元可与另外的小多肽链(J链或其功能片段、变体或衍生物)形成复合物，以形成具有十个结合单元缔合的抗原结合结构域的五聚体IgM抗体或IgM样抗体。在人J链的前体形式中，信号肽(加下划线)从SEQ ID NO:6的氨基酸1延伸到约氨基酸22，并且成熟人J链从SEQ ID NO:6的约氨基酸23延伸到氨基酸159。成熟人J链具有氨基酸序列SEQID NO:42。

示例性变体和修饰的J链在本文别处提供。在没有J链的情况下，IgM抗体或IgM样抗体通常组装成六聚体，其包含六个结合单元和多达十二个结合单元缔合的抗原结合结构域。在有J链的情况下，IgM抗体或IgM样抗体通常组装成五聚体，其包含五个结合单元和多达十个结合单元缔合的抗原结合结构域，或者如果J链是包含可以是例如J链缔合的抗原结合结构域的一个或多个异源多肽的修饰的J链，则更多。将五个或六个IgM结合单元组装成五聚体或六聚体IgM抗体或IgM样抗体被认为涉及Cμ4与五个或六个结合单元的尾片结构域之间的相互作用。参见例如，Braathen,R.等人,J.Biol.Chem.277:42755-42762(2002)。因此，本公开中提供的五聚体或六聚体IgM抗体或抗体样分子的恒定区通常至少包含Cμ4和/或尾片结构域(在本文中还统称为Cμ4-tp)。因此，IgM重链恒定区的“多聚化片段”至少包含Cμ4-tp结构域。IgM重链恒定区可以另外包含Cμ3结构域或其片段、Cμ2结构域或其片段、Cμ1结构域或其片段。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，IgM抗体或IgM样抗体)可以包含完整的IgM重(μ)链恒定结构域(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)或其变体、衍生物或类似物，例如，如本文所提供的。

在某些实施方案中，本公开提供了包含五个二价结合单元的五聚体IgM或IgM样抗体，其中每个结合单元包含两个IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体，其各自与抗原结合结构域或抗原结合结构域的亚基缔合。在某些实施方案中，两个IgM重链恒定区是人重链恒定区。

在本文提供的IgM或IgM样抗体是五聚体的情况下，IgM或IgM样抗体通常还包含J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，J链可以是修饰的J链，其包含例如与靶标(例如，免疫效应细胞，例如，CD8+细胞毒性T细胞或NK细胞)特异性结合的J链缔合的抗原结合结构域。在某些实施方案中，修饰的J链可以还包含一个或多个与其连接的异源部分，例如，免疫刺激剂。在某些实施方案中，J链可以突变成影响(例如，延长)本文提供的IgM或IgM样抗体的血清半衰期，如本文别处所讨论。在某些实施方案中，J链可以突变成影响糖基化，如本公开别处所讨论。

在一些实施方案中，多聚体结合分子是六聚体并且包含六个二价结合单元或其变体或片段。在一些实施方案中，多聚体结合分子是六聚体并且包含六个二价结合单元或其变体或片段，并且其中每个结合单元包含两个IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体。

IgM重链恒定区可以包含Cμ1结构域或其片段或变体、Cμ2结构域或其片段或变体、Cμ3结构域或其片段或变体、Cμ4结构域或其片段或变体和/或尾片(tp)或其片段或变体中的一种或多种，条件是恒定区可以在IgM或IgM样抗体中发挥所需功能，例如与第二IgM恒定区缔合以形成具有一个、两个或更多个抗原结合结构域的结合单元，和/或与其他结合单元(以及就五聚体而言，J链)缔合以形成六聚体或五聚体。在某些实施方案中，单独结合单元内的两个IgM重链恒定区或其片段或变体各自包含Cμ4结构域或其片段或变体、尾片(tp)或其片段或变体或者Cμ4结构域和tp或其片段或变体的组合。在某些实施方案中，单独结合单元内的两个IgM重链恒定区或其片段或变体各自还包含Cμ3结构域或其片段或变体、Cμ2结构域或其片段或变体、Cμ1结构域或其片段或变体或其任何组合。

在一些实施方案中，IgM或IgM样抗体的结合单元包含两条轻链。在一些实施方案中，IgM或IgM样抗体的结合单元包含两个轻链片段。在一些实施方案中，轻链是κ轻链。在一些实施方案中，轻链是λ轻链。在一些实施方案中，每个结合单元包含两条免疫球蛋白轻链，其各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。

血清半衰期延长的IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子

本文提供的某些IgM衍生的多聚体双特异性结合分子可以修饰成血清半衰期延长。可以延长IgM衍生的结合分子的血清半衰期的示例性IgM重链恒定区突变公开于PCT公开号WO 2019/169314，其以引用的方式整体并入本文。例如，如本文所提供的IgM衍生的结合分子的变体IgM重链恒定区可以在对应于野生型人IgM恒定区(例如，SEQ ID NO:1或SEQID NO:2)的氨基酸S401、E402、E403、R344和/或E345的氨基酸位置处包含氨基酸取代。“对应于野生型人IgM恒定区的氨基酸S401、E402、E403、R344和/或E345的氨基酸”意指任何物种的IgM恒定区的序列中与人IgM恒定区中的S401、E402、E403、R344和/或E345同源的氨基酸。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的S401、E402、E403、R344和/或E345的氨基酸可以被任何氨基酸(例如，丙氨酸)取代。

CDC活性降低的IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子

相对于除赋予补体依赖性细胞毒性(CDC)活性降低的突变之外，对应的参考人IgM恒定区相同的参考IgM抗体或IgM样抗体，，如本文所提供的某些IgM衍生的多聚体结合分子可以工程化成表现出在存在补体的情况下对细胞的CDC降低。这些CDC突变可以与任何突变组合，以赋予如本文所提供的血清半衰期增加。“对应的参考人IgM恒定区”意指除影响CDC活性的恒定区中的修饰之外与变体IgM恒定区相同的人IgM恒定区或其部分，例如，Cμ3结构域。在某些实施方案中，相对于如例如PCT公开号WO/2018/187702(其以引用的方式整体并入本文)中所述的野生型人IgM恒定区，变体人IgM恒定区在例如Cμ3结构域中包含一个或多个氨基酸取代。用于测量CDC的测定为本领域的普通技术人员熟知的，并且示例性测定描述于例如PCT公开号WO/2018/187702中。

在某些实施方案中，赋予CDC活性降低的变体人IgM恒定区包含对应于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1(人IgM恒定区等位基因IGHM*03)或SEQ ID NO:2(人IgM恒定区等位基因IGHM*04)的位置L310、P311、P313和/或K315处的氨基酸取代。在某些实施方案中，赋予CDC活性降低的变体人IgM恒定区包含对应于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的位置P311处的氨基酸取代。在其他实施方案中，如本文所提供的变体IgM恒定区包含对应于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P313处的氨基酸取代。在其他实施方案中，如本文所提供的变体IgM恒定区包含对应于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的位置P311和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P313处的取代的组合。这些脯氨酸残基可以独立地被任何氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸)取代。在某些实施方案中，赋予CDC活性降低的变体人IgM恒定区包含对应于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置K315处的氨基酸取代。赖氨酸残基可以独立地被任何氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸)取代。在某些实施方案中，赋予CDC活性降低的变体人IgM恒定区包含对应于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置K315处用天冬氨酸的氨基酸取代。在某些实施方案中，赋予CDC活性降低的变体人IgM恒定区包含对应于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置L310处的氨基酸取代。赖氨酸残基可以独立地被任何氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸)取代。在某些实施方案中，赋予CDC活性降低的变体人IgM恒定区包含对应于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置L310处用天冬氨酸的氨基酸取代。

人和某些非人灵长类动物IgM恒定区通常包含五(5)个天然存在的天冬酰胺(N)连接的糖基化基序或位点。如本文所用，“N-连接糖基化基序”包括氨基酸序列N-X₁-S/T或由其组成，其中N是天冬酰胺，X₁是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，并且S/T是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。聚糖连接至天冬酰胺残基的氮原子。参见例如，Drickamer K,Taylor ME(2006),Introduction to Glycobiology(第2版).Oxford University Press,USA。N-连接糖基化基序出现在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的人IgM重链恒定区中，从位置46(“N1”)、209(“N2”)、272(“N3”)、279(“N4”)和440(“N5”)开始。这五个基序在非人灵长类动物IgM重链恒定区中是保守的，并且五个中的四个在小鼠IgM重链恒定区中是保守的。因此，在一些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子的IgM重链恒定区包含5个N-连接糖基化基序：N1、N2、N3、N4和N5。在一些实施方案中，每个IgM重链恒定区上的至少三个N-连接糖基化基序(例如，N1、N2和N3)被复合聚糖占据。

在某些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个或至少四个N-X₁-S/T基序可以包含防止在基序处的糖基化的氨基酸插入、缺失或取代。在某些实施方案中，IgM衍生的多聚体结合分子可以在基序N1、基序N2、基序N3、基序N5或者基序N1、N2、N3或N5中的两个或更多个、三个或更多个或全部四个的任何组合处包含氨基酸插入、缺失或取代，其中氨基酸插入、缺失或取代防止在基序处的糖基化。在一些实施方案中，IgM恒定区包含相对于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:1(人IgM恒定区等位基因IGHM*03)或SEQ ID NO:2(人IgM恒定区等位基因IGHM*04)的位置46、209、272或440处的一个或多个取代。参见例如，美国临时申请号62/891,263，其以引用的方式整体并入本文。

IgA抗体、IgA样抗体和IgA衍生的结合分子

IgA在黏膜免疫中起关键作用，并且占产生的总免疫球蛋白的约15％。IgA可以是单体或多聚体，主要形成二聚体分子，但也可以组装成三聚体、四聚体和/或五聚体。参见例如，Sousa-Pereira,P.和J.M.Woof,Antibodies 8:57(2019)。

在一些实施方案中，多聚体结合分子是二聚体并且包含两个二价结合单元或其变体或片段。在一些实施方案中，多聚体结合分子是二聚体，包含两个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚体结合分子是二聚体，包含两个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。

在一些实施方案中，多聚体结合分子是四聚体并且包含四个二价结合单元或其变体或片段。在一些实施方案中，多聚体结合分子是四聚体的，包含四个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚体结合分子是四聚体，包含四个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。

在某些实施方案中，本公开所提供的多聚体结合分子是二聚体结合分子，其包含IgA重链恒定区或其多聚化片段，它们各自与结合单元缔合的抗原结合结构域缔合以实现总计四个结合单元缔合的抗原结合结构域。如本文所提供，IgA抗体、IgA衍生的结合分子或IgA样抗体包含两个结合单元和J链，例如，如本文别处所述的修饰的J链。所提供的每个结合单元包含两个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。在某些实施方案中，多聚体结合分子的至少三个或全部四个结合单元缔合的抗原结合结构域与同一靶抗原结合。在某些实施方案中，多聚体结合分子的至少三个或全部四个结合单元缔合的抗原结合结构域是相同的。

二价IgA衍生的结合单元包含两个IgA重链恒定区，并且二聚体IgA衍生的结合分子包含两个结合单元。IgA包含以下重链恒定结构域Cα1(或替代地，CA1或CH1)、铰链区、Cα2(或替代地，CA2或CH2)和Cα3(或替代地，CA3或CH3)和C末端“尾片”。人IgA具有两种亚型，IgA1和IgA2。人IgA1恒定区通常包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。人Cα1结构域从SEQ ID NO:3的约氨基酸6延伸至约氨基酸98，人IgA1铰链区从SEQ ID NO:3的约氨基酸102延伸至约氨基酸124，人Cα2结构域从SEQ ID NO:3的约氨基酸125延伸至约氨基酸219，人Cα3结构域从SEQ ID NO:3的约氨基酸228延伸至约氨基酸330，并且尾片从SEQ ID NO:3的约氨基酸331延伸至约氨基酸352。人IgA2恒定区通常包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。人Cα1结构域从SEQID NO:4的约氨基酸6延伸至约氨基酸98，人IgA2铰链区从SEQ ID NO:4的约氨基酸102延伸至约氨基酸111，人Cα2结构域从SEQ ID NO:4的约氨基酸113延伸至约氨基酸206，人Cα3结构域从SEQ ID NO:4的约氨基酸215延伸至约氨基酸317，并且尾片从SEQ ID NO:4的约氨基酸318延伸至约氨基酸340。

两个IgA结合单元可以与两条另外的多肽链J链(例如，SEQ ID NO:42)和分泌组分(前体，SEQ ID NO:5，成熟，SEQ ID NO:5的氨基酸19至603)形成复合物，以形成如本文所提供的二价分泌IgA(sIgA)衍生的结合分子。两个IgA结合单元组装成二聚体IgA衍生的结合分子被认为涉及Cα3和尾片结构域。参见例如，Braathen,R.等人,J.Biol.Chem.277:42755-42762(2002)。因此，本公开中提供的多聚化二聚体IgA衍生的结合分子通常包含IgA恒定区，其至少包含Cα3和尾片结构域。四个IgA结合单元同样可以与J链形成四聚体复合物。sIgA抗体也可以形成更高阶的多聚体，例如四聚体。

IgA重链恒定区可以另外包含Cα2结构域或其片段、IgA铰链区或其片段、Cα1结构域或其片段和/或其他IgA(或其他免疫球蛋白，例如，IgG)重链结构域，包括例如IgG铰链区。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子可以包含完整的IgA重(α)链恒定结构域(例如，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)或其变体、衍生物或类似物。在一些实施方案中，IgA重链恒定区或其多聚化片段是人IgA恒定区。

在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子的每个结合单元包含两个IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体，其各自至少包含IgA Cα3结构域和IgA尾片结构域。在某些实施方案中，IgA或IgA样重链恒定区可各自还包含位于IgA Cα3和IgA尾片结构域的N末端的IgA Cα2结构域。例如，IgA重链恒定区可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸125至353或SEQ ID NO:4的氨基酸113至340。在某些实施方案中，IgA或IgA样重链恒定区可以各自还包含位于IgA Cα2结构域的N末端的IgA或IgG铰链区。例如，IgA重链恒定区可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸102至353或SEQ ID NO:4的氨基酸102至340。在某些实施方案中，IgA或IgA样重链恒定区可各自还包含位于IgA铰链区的N末端的IgA Cα1结构域。

在一些实施方案中，IgA抗体、IgA样抗体或其他IgA衍生的结合分子的每个结合单元包含两条轻链。在一些实施方案中，IgA抗体、IgA样抗体或其他IgA衍生的结合分子的每个结合单元包含两条片段轻链。在一些实施方案中，轻链是κ轻链。在一些实施方案中，轻链是λ轻链。在一些实施方案中，轻链是嵌合的κ-λ轻链。在一些实施方案中，每个结合单元包含两条免疫球蛋白轻链，其各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。

修饰的和/或变体J链

在某些实施方案中，本文提供的多聚体结合分子包含J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，本文提供的多聚体结合分子是五聚体并且包含J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，本文提供的多聚体结合分子是二聚体IgA分子或五聚体IgM分子并且包含J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚体结合分子可以包含天然存在的J链序列，诸如成熟的人J链序列(例如，SEQ ID NO:42)。在一些实施方案中，多聚体结合分子可以包含天然存在的或变体J链的功能片段。

在某些实施方案中，如本文所提供的五聚体IgM或IgM样抗体或二聚体IgA或IgA样抗体的J链可以例如通过引入异源部分或者两个或更多个异源部分(例如，多肽)来修饰，而不干扰IgM或IgM样抗体或IgA或IgA样抗体组装并与其结合靶标结合的能力。参见美国专利号9,951,134和10,618,978以及美国专利申请公开号US-2019-0185570，其各自以引用的方式整体并入本文。因此，如本文所提供的IgM或IgM样抗体或IgA或IgA样抗体，包括双特异性或多特异性IgM或IgM样抗体或IgA或IgA样抗体，可包含修饰的J链或其功能片段或变体，其还包含引入到J链或其片段或变体中的异源部分，例如，异源多肽。在某些实施方案中，异源部分可以是但不限于框内融合的肽或多肽，或者与J链或其片段或变体化学缀合的肽、多肽或其他化学或生物部分。在某些实施方案中，异源多肽经由接头与J链或其功能片段或变体融合，例如由至少5个氨基酸(但通常不多于50个氨基酸，例如5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸)组成的肽接头。在某些实施方案中，肽接头由以下组成：GGGGS(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:59)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:61)。在某些实施方案中，异源部分可以是与J链缀合的化学或生物部分。待连接至J链的异源部分可包括但不限于：J链缔合的抗原结合结构域，例如抗体或抗原结合片段或亚基，例如单链Fv(ScFv)分子；可以增加IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体的半衰期的稳定态；或化学部分，诸如聚合物或细胞毒素。在一些实施方案中，异源部分包含可以增加结合分子(例如，人血清白蛋白(HSA)或HSA结合分子)的半衰期的稳定肽。

在一些实施方案中，修饰的J链包含J链缔合的抗原结合结构域，例如，能够与靶抗原特异性结合的多肽。在某些实施方案中，J链缔合的抗原结合结构域可以是抗体或其抗原结合片段，如本文别处所述。在某些实施方案中，J链缔合的抗原结合结构域可以是单链Fv(scFv)抗原结合结构域或衍生自例如骆驼或软骨鱼抗体的单链抗原结合结构域。J链缔合的抗原结合结构域可以在允许J链缔合的抗原结合结构域与其结合靶标结合的任何位置处引入到J链中，而不干扰J链功能或缔合的IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体的功能。插入位置包括但不限于在C末端或附近、在N末端或附近或在基于J链的三维结构可接近的内部位置。在某些实施方案中，可将J链缔合的抗原结合结构域引入到成熟的人J链SEQ ID NO:42或其变体中的对应于SEQ ID NO:42的氨基酸92和101的半胱氨酸残基之间。在另一实施方案中，可将J链缔合的抗原结合结构域引入到人J链SEQ ID NO:42或其变体中的糖基化位点处或附近。在另一实施方案中，可将J链缔合的抗原结合结构域引入到人J链SEQ ID NO:42或其变体中的离C末端10个氨基酸残基内和/或离N末端10个氨基酸内。在另一实施方案中，可将J链缔合的抗原结合结构域引入到人J链SEQ ID NO:42或其变体中的C末端和/或N末端。

在某些实施方案中，如本文所提供的IgM抗体、IgM样抗体、IgA抗体、IgA样抗体或IgM或IgA衍生的结合分子的J链是包含一个或多个氨基酸取代的变体J链，所述氨基酸取代可以改变(例如，增加)包含变体J链的本文提供的IgM抗体、IgM样抗体、IgA抗体、IgA样抗体或IgM或IgA衍生的结合分子的血清半衰期。例如，某些氨基酸取代、缺失或插入可以得到以下IgM衍生的结合分子，相对于除变体J链中的一个或多个单氨基酸取代、缺失或插入之外均相同并且使用与对于同一动物物种相同的方法施用的参考IgM衍生的结合分子，其在向受试者动物施用后表现出血清半衰期增加。在某些实施方案中，相对于参考J链，变体J链可以包含一个、两个、三个或四个单氨基酸取代、缺失或插入。

在一些实施方案中，多聚体结合分子可包含变体J链序列，诸如糖基化减少或与一种或多种聚合物Ig受体(例如，pIgR、Fcα-μ受体(FcαμR)或Fcμ受体(FcμR))的结合减少的本文所述的变体序列。参见例如，PCT公开号WO 2019/169314，其以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，变体J链可以在对应于成熟的野生型人J链(SEQ ID NO：42)的氨基酸Y102的氨基酸位置处包含氨基酸取代。“对应于成熟的野生型人J链的氨基酸Y102的氨基酸”意指任何物种的J链序列中与人J链中的Y102同源的氨基酸。参见PCT公开号WO/2019/169314，其以引用的方式整体并入本文。对应于SEQ ID NO:42中的Y102的位置在至少43种其他物种的J链氨基酸序列中是保守的。参见美国专利号9,951,134的图4，其以引用的方式整体并入本文。在对应于SEQ ID NO:42的Y102的位置处的某些突变可以抑制某些免疫球蛋白受体(例如，人或鼠Fcαμ受体、鼠Fcμ受体和/或人或鼠多聚体Ig受体(pIg受体))与包含变体J链的IgM五聚体的结合。与除取代之外均相同并且以相同方式向同一物种施用的对应的抗体、抗体样分子或结合分子相比，在对应于SEQ ID NO:42的Y102的氨基酸处包含取代的IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子当向动物施用时，血清半衰期改善。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:42的Y102的氨基酸可以被任何氨基酸取代。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:42的Y102的氨基酸可以被丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或精氨酸(R)取代。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:42的Y102的氨基酸可以被丙氨酸取代。在一特定实施方案中，J链或其功能片段或变体是变体人J链并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:43，即J链，在本文中称为“J*”。参见PCT公开号WO 2019/169314。

野生型J链通常包括一个N连接的糖基化位点。在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子的变体J链或其功能片段在天冬酰胺(N)连接的糖基化基序N-X₁-S/T(例如，从对应于成熟的人J链(SEQ ID NO:42)或J*(SEQ ID NO:43)的氨基酸49开始(基序N6))内包含突变，其中N是天冬酰胺，X₁是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且S/T是丝氨酸或苏氨酸，并且其中突变防止在基序处的糖基化。如PCT公开号WO 2019/169314中所说明，组织此位点处的糖基化的突变可得到如本文所提供的多聚体结合分子，相对于除防止变体J链中的糖基化的突变之外均相同并且以相同方式向同一动物物种施用的参考多聚体结合分子，其在向受试者动物施用后表现出血清半衰期增加。

例如，在某些实施方案中，如本文所提供的包含J链的结合分子的变体J链或其功能片段可以在对应于SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的氨基酸N49或氨基酸S51的氨基酸位置处包含氨基酸取代，前提是对应于S51的氨基酸未被苏氨酸(T)取代，或其中变体J链在对应于SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的氨基酸N49和S51的氨基酸位置处包含氨基酸取代。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的N49的位置被任何氨基酸取代，例如，丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)。在一特定实施方案中，对应于SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的N49的位置可以被丙氨酸(A)取代。在另一个特定实施方案中，对应于SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的N49的位置可以被天冬氨酸(D)取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的S51的位置被丙氨酸(A)或甘氨酸(G)取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的S51的位置被丙氨酸(A)取代。

在某些实施方案中，所提供的结合分子的J链缔合的抗原结合结构域包含抗体或其片段。在某些实施方案中，抗体片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)片段或其任何组合。在某些实施方案中，抗体片段是单链Fv(scFv)片段。scFv可以与J链或片段或变体(例如，J*)融合或化学缀合。在某些实施方案中，scFv片段经由肽接头(例如，SEQ ID NO:57-61)与J链融合。scFv片段可以任何方式与J链或其片段或变体融合，只要修饰的J链与IgM、IgM样、IgA或IgA样结合单元组装以形成二聚体或五聚体的能力不受影响即可。例如，scFv片段可以与J链或其片段或变体的N末端、J链或其片段或变体的C末端或J链或其片段或变体的N末端和C末端融合。

在某些实施方案中，修饰的J链的scFv与免疫效应细胞上的靶标结合。J链缔合的抗原结合结构域所结合的免疫效应细胞可以是当与结合单元缔合的抗原结合结构域缔合时，赋予有益效果的任何免疫效应细胞，所述结合单元缔合的抗原结合结构域例如靶向例如介导对肿瘤细胞的基于细胞的杀伤。在某些实施方案中，免疫效应细胞可以是但不限于T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞或γδT细胞)、B细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞或自然杀伤(NK)细胞。在某些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞，例如，CD4+或CD8+T细胞。在某些实施方案中，免疫效应细胞是CD8+细胞毒性T细胞。在某些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。

当免疫效应细胞是T细胞(例如，CD8+T细胞)时，J链缔合的scFv片段可以与T细胞表面抗原CD3(例如，CD3ε)特异性结合。在某些实施方案中，抗CD3εscFv片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含VH互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，或在一个或多个VHCDR中具有一个、两个或三个氨基酸取代的SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，并且其中VL包含VL互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54和SEQ ID NO:55，或在一个或多个VLCDR中具有一个、两个或三个氨基酸取代的SEQID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55。在某些实施方案中，ScFv片段包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:48和VL氨基酸序列SEQ ID NO:52。在其他实施方案中，抗CD3εscFv片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:44和SEQ IDNO:45。在特定实施方案中，修饰的J链包含有包含SEQ ID NO:46的氨基酸20至412、SEQ IDNO:47的氨基酸20至412或SEQ ID NO:56的氨基酸20至420的氨基酸序列。

在某些其他实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞，并且scFv片段可以与CD16或CD56特异性结合。

如本文所提供的多聚体结合分子的修饰的J链可以进一步修饰成包含连接至J链的另外的异源部分。示例性部分描述于例如美国专利号9,951,134和10,618,978、和美国专利申请公开号US 2019-0185570、和PCT申请号PCT/US2020/046379中，其全部以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子的修饰的J链可以还包含与J链或其片段或变体融合或化学缀合的免疫刺激剂(“ISA”)。例如，ISA可以包括细胞因子或受体结合片段或其变体。在一特定实施方案中，J链缔合的ISA可以包含：(a)白介素-15(IL-15)蛋白或其受体结合片段或变体(“I”)；以及(b)能够与I缔合的包含寿司结构域的白介素-15受体α(IL-15Rα)片段或其变体(“R”)，其中J链或其片段或变体以及I和R中的至少一个或I和R两者缔合为融合蛋白，并且其中I和R可以缔合以起ISA的作用。在某些实施方案中，ISA可以经由肽接头与J链融合。

对靶标密度高的细胞的选择性增强的多价抗体

本公开提供了一种多聚体结合分子，例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体，相对于正常的健康细胞，其与患病细胞(例如，癌细胞或肿瘤细胞)结合的选择性增强。所提供的结合分子可以包含两个二价结合单元(例如，对于二聚体sIgA抗体)或五个或六个二价结合单元(例如，对于五聚体或六聚体IgM抗体)。所提供的结合分子的每个结合单位通常包含两条抗体重链，其各自包含IgA、IgA样、IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体，其中片段至少包含IgA重链恒定区的CH3和tp结构域或IgM重链恒定区的CH4和tp结构域。当然，重链可以包括另外的IgA或IgA样重链恒定区结构域(CH1、铰链、CH2)或IgM或IgM样重链恒定区结构域(CH1、CH2、CH3)或其片段，并且还可以是杂交重链恒定区，其包含例如一个或多个IgG恒定区结构域(例如，CH1、铰链、CH2或CH3)或另一抗体同种型的恒定区结构域或来自另一物种的恒定区结构域。所提供的结合分子的每个重链恒定区可以与结合单元缔合的抗原结合结构域或其亚基缔合，例如，可以与轻链可变区(VL)缔合的重链可变区(VH)、scFv或单链可变区(例如，鲨鱼或骆驼来源)。

在如本文所提供的多聚体结合分子中，结合分子的至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个结合单元缔合的抗原结合结构域与细胞表面上的相同预定靶标(例如，在细胞上表达的相同靶抗原)或靶抗原上的相同表位特异性结合。在某些实施方案中，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个结合单元缔合的抗原结合结构域是相同的。在某些实施方案中，靶标是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。如本文所提供的多聚体结合分子优先或选择性地与相对于以较低密度表达预定靶标的细胞(诸如，正常的健康细胞)，以较高密度表达预定靶标的细胞(例如，患病细胞，例如，肿瘤或其他癌细胞)。

如本文所用，“相对于以较低密度表达预定靶标的细胞，以较高密度表达预定靶标的细胞”是指例如与参考细胞或在筏(raft)或簇中表达靶标(例如，靶抗原)，使得靶抗原比参考细胞上的相同靶抗原更紧密地聚集在一起的细胞相比，在细胞表面上表达数目更多的靶标(例如，靶抗原)拷贝的细胞。在某些实施方案中，“以较高密度表达预定靶标的细胞”是患病细胞，例如癌细胞或肿瘤细胞，并且“以较低密度表达预定靶标”的参考细胞是正常的健康细胞。在某些实施方案中，“预定靶标”是响应于细胞的疾病状态而过表达的抗原。在某些实施方案中，预定靶标是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。

在某些实施方案中，“预定靶标”可以是在某些免疫细胞(例如，活化的CD4+和CD8+T细胞或调节性T细胞(Treg))上过表达的TNF受体超家族(TNFrSF)靶标。在人体内，例如，TNFrSF成员OX40和GITR在活化的CD4+和CD8+T细胞和活化的Treg上表达，但在大多数静息初始或记忆T细胞上不表达。通过在CD4+和CD8+效应T细胞上表达的OX40或GITR的信号传导提供共刺激增殖、存活和效应功能增强(同前，Stüber E等人,Immunity 2:507-21(1995)；Tone M等人,Proc Natl Acad Sci USA.100:15059-15064(2003)；Ronchetti,S.等人,EurJ.Immunol.34:613-622(2004))。考虑到适当的细胞因子环境，OX40或GITR信号传导还可以阻断Treg的免疫抑制能力，从而增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能(Linch,SN等人,Front.Oncol.5:doi:10.3389/fonc.2015.00034(2015)；Shimizu,J.等人,Nature Immunol3:135-142(2002))。

在某些实施方案中，“预定靶标”可以是在免疫细胞上差异表达的免疫检查点分子，例如，CTLA4。

可以以各种方式测量和表述任何给定细胞的抗原密度。例如，可以用与荧光标签结合的抗体处理细胞，然后进行荧光活化细胞分选(或FACS)，并且在细胞上表达的靶抗原的相对水平可以报告为相对平均荧光强度或MFI。在某些实施方案中，以较高密度表达预定靶标的细胞的MFI比针对以较低密度表达靶抗原的参考细胞测量的MFI大至少0.5x、1x、5x、10x、50x、100x、500x、1000x、5000x、10,000x、50,000x或100,000x。细胞的相对靶标密度还可以通过流式细胞术，使用包括结合了预定量的一抗的校准株的试剂盒(例如，QIFIKit(DAKO))进行测量。使用校准珠提供的标准曲线，相对抗原密度可以表述为每个细胞的“特异性抗体结合能力”(sABC)。

在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)对以相对较高的密度表达预定靶标的细胞的选择性增强，这(至少部分地)由于相对于例如与相同靶标结合、结合单元缔合的抗原结合结构域等效和/或相同的对应的二价IgG治疗性单克隆抗体，所述结合分子对预定靶标的化合价增加。例如，与包含仅两个结合单元缔合的抗原结合结构域的对应的二价IgG抗体相比，包含10个结合单元缔合的抗原结合结构域的五聚体IgM抗体可以更容易地识别过表达肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的细胞并与其结合。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)可以被工程化，以使得其与以较低密度表达预定靶抗原的细胞(例如，正常的健康细胞)仅弱结合或不可检测地结合，但可以与以较高密度表达靶抗原的细胞可检测地结合。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)可以与以较高密度表达靶抗原的细胞结合，其中具有仅两个与细胞表面上的预定靶标特异性结合的等效或相同的结合单元缔合的抗原结合结构域的对应的二价IgG抗体不可以与以较高密度表达靶抗原的细胞结合或与以较低密度表达靶抗原的细胞结合。

在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)通过每个结合单元缔合的抗原结合结构域对预定靶抗原的化合价增加(例如，由于是IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)和亲和力降低的组合来以增强的选择性与以较高密度表达预定靶抗原的细胞结合。例如，结合分子(例如，包含10个结合单元缔合的结合结构域、对靶抗原的结合亲和力低的IgM抗体或IgM样抗体)可以选择性地仅靶向以高密度表达靶抗原的那些细胞，因为它们对靶标的亲合力增加。如以下实施例部分中所示，发明人已经对与B细胞标志物CD20结合的已知治疗性抗体的结合单元缔合的抗原结合结构域进行了工程化，使得结合单元缔合的抗原结合结构域对靶标的亲和力降低。当并入二价IgG背景中时，这些亲和力降低的结合单元缔合的抗原结合结构域不能与任何B细胞系结合并诱导其补体介导的细胞毒性(CDC)，但是当并入IgM背景中时，相同的亲和力降低的抗原结合结构域不能可检测地与以低密度表达CD20的B细胞系结合或诱导其CDC，但是诱导以高密度表达CD20的B细胞系的CDC。同样，当并入双特异性IgM背景(其中IgM抗体还包含有包含与CD3ε特异性结合的J链缔合的抗原结合结构域的修饰的J链)中时，这些亲和力降低的结合单元缔合的抗原结合结构域不诱导以低密度表达CD20的B细胞系的T细胞引导的细胞毒性(TDCC)，但是诱导以高密度表达CD20的B细胞系的TDCC。用于鉴别已知治疗性抗体的预测以降低的亲和力与靶标结合的变体的方法在本文别处呈现。制备此类变体的方法为本领域的技术人员所熟知。

在某些实施方案中，“以较高密度表达预定靶标的细胞”可以是癌细胞或肿瘤细胞。在某些实施方案中，靶标是肿瘤特异性抗原，即，仅在肿瘤或癌细胞上大量表达或者可能仅在正常的健康成人细胞中以不可检测的水平表达的靶抗原。在某些实施方案中，靶标是肿瘤相关抗原，即在健康细胞和癌性细胞上均表达，但在癌性细胞上以比在正常的健康细胞上高得多的密度表达的靶抗原。示例性肿瘤特异性和肿瘤相关抗原包括但不限于B细胞成熟抗原(BCMA)、CD19、CD20、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2，还称为ErbB2)、HER3(ErbB3)、受体酪氨酸蛋白质激酶ErbB4、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体1(VEGFR1)、VEGFR2、CD52、CD30、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD38、神经节苷脂GD2、信号传导淋巴细胞活化分子家族成员7(SLAMF7)的自我配体受体、血小板源性生长因子受体A(PDGFRA)、CD22、FLT3(CD135)、CD123、MUC-16、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、间皮素、肿瘤相关钙信号转导蛋白2(Trop-2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)、人血型H类型1三糖(Globo-H)、唾液酸Tn抗原(STn抗原)或CD33。本领域的技术人员将理解，这些靶抗原以许多不同的名称出现在文献中，但是这些熟知的治疗性靶标可以使用在线可用的数据库(例如，EXPASY.org)容易地鉴别。

其他肿瘤相关和/或肿瘤特异性抗原包括但不限于：DLL4、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、JAG1、JAG2、c-Met、IGF-1R、Patched、Hedgehog家族多肽、WNT家族多肽、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、LRP5、LRP6、IL-6、TNFalpha、IL-23、IL-17、CD80、CD86、CD3、CEA、Muc16、PSCA、CD44、c-Kit、DDR1、DDR2、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、BMP家族多肽、BMPR1a、BMPR1b、或TNF受体超家族蛋白诸如TNFR1(DR1)、TNFR2、TNFR1/2、CD40(p50)、Fas(CD95、Apo1、DR2)、CD30、4-1BB(CD137、ILA)、TRAILR1(DR4、Apo2)、DR5(TRAILR2)、TRAILR3(DcR1)、TRAILR4(DcR2)、OPG(OCIF)、TWEAKR(FN14)、LIGHTR(HVEM)、DcR3、DR3、EDAR或XEDAR。

在某些实施方案中，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个对预定靶标具有特异性的结合单元缔合的抗原结合结构域是已知与预定靶标结合的现有抗体(例如，批准的治疗性抗体或临床前或临床开发中的治疗性抗体)的抗原结合结构域的亲和力降低的变体。制备亲和力降低的变体的示范性已知治疗性抗体包括但不限于阿仑单抗(与CD52结合)、阿替利珠单抗(与PD-L1结合)、阿维鲁单抗(与PD-L1结合)、贝伐珠单抗(与VEGF结合)、博纳吐单抗(与CD19结合)、本妥昔单抗(与CD30结合)、卡罗单抗(与PSMA结合)、西妥昔单抗(与EGFR结合)、达雷木单抗(与CD38结合)、地诺单抗(与RANKL结合)、地努妥昔单抗(与GD2结合)、度伐利尤单抗(与PD-L1结合)、埃罗妥珠单抗(与SLAMF7结合)、吉妥珠单抗(与CD33结合)、替伊莫单抗(与CD20结合)、伊匹单抗(与CTLA4结合)、奥英妥珠单抗(与CD22结合)、奈昔妥珠单抗(与EGFR结合)、纳武利尤单抗(与PD-1结合)、奥滨尤妥珠单抗(与CD20结合)、奥瑞珠单抗(与CD20结合)、奥法木单抗(与CD20结合)、奥拉单抗(与PDGFRA结合)、奥马珠单抗(与IgE结合)、帕尼单抗(与EGFR结合)、帕博利珠单抗(与PD-1结合)、帕妥珠单抗(与HER2结合)、雷莫芦单抗(与VEGFR2结合)、雷珠单抗(与VEGFR1和VEGFR2结合)、利妥昔单抗(与CD20结合)、曲妥珠单抗(与HER2结合)或曲美木单抗(与CTLA4结合)。

在某些实施方案中，现有抗体(包括但不限于上文列出的那些)的抗原结合结构域的亲和力降低的变体与预定靶标结合，其对预定靶标的结合亲和力比现有抗体的抗原结合结构域的结合亲和力低至少1倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少5000倍、至少10,000倍、至少50,000倍或至少100,000倍或更多。换句话讲，亲和力降低的变体结合域包括解离常数(K_D)，其值高于现有抗体的抗原结合域的K_D。

在某些实施方案中，现有抗体的抗原结合结构域包含抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)，其分别包含利妥昔单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、抗CD20单克隆抗体1.5.3的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15、伊匹单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17、曲美木单抗的VH和VL氨基酸序列SEQID NO:18和SEQ ID NO:19、曲妥珠单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21、西妥昔单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23、奥瑞珠单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25、奥滨尤妥珠单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:27、帕妥珠单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29、奥马珠单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31、帕博利珠单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33、阿维鲁单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35、阿替利珠单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37、度伐利尤单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39或纳武利尤单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41。这些序列提供于表2中：

表2：抗体序列

在某些实施方案中，现有抗体的抗原结合结构域包含抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)，其分别包含利妥昔单抗的VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。发明人结合与CD20蛋白结合的利妥昔单抗Fab的已知晶体结构对利妥昔单抗的VH和VL氨基酸序列进行了计算机建模，以鉴别预测增加或降低抗原结合结构域对CD20上其表位的结合亲和力的各种氨基酸取代。可使用各种蛋白质建模和预测算法预测抗体结合特征，包括但不限于BioLuminate(Schrodinger)、Lasergene Structural Biology Suite(DNASTAR)、Immunoinformatics(OMIC Tools)、Biovia(Dassault Systems)和RosettaAntibody(Rosetta Software)。替代地，可以通过标准方法，使用例如丙氨酸扫描对已知抗体的VH和VL序列进行鸟枪法诱变，并且可以测试所得抗原结合结构域与感兴趣的预定靶抗原结合的亲和力降低。

使用BioLuminate工具，发明人鉴别并构建了利妥昔单抗抗原结合结构域的几种示例性变体，其中在妥昔单抗的VL(SEQ ID NO:8)的位置N93处有预测导致结合亲和力修改的氨基酸取代。根据对结合亲和力的影响，对利妥昔单抗轻链可变区的位置N93处的几种取代进行排序(N93D＜N93E＜N93A＜野生型＜N93K＜N93R)。如下文实施例中所述，合成了编码这些突变体轻链可变区RTX N93D(SEQ ID NO:9)、RTX N93E(SEQ ID NO:10)、RTX N93A(SEQ ID NO:11)、RTX N93K(SEQ ID NO:12)和RTX N93R(SEQ ID NO:13)的DNA片段。在这些中，如预测的那样，具有N93D和N93E取代的变体抗原结合结构域显示相对于野生型利妥昔单抗抗原结合结构域，对CD20的亲和力降低。包含变体结合单元缔合的抗原结合结构域的IgM抗体可引导对以高密度表达CD20的B细胞系的补体介导的(CDC)杀伤，但不引导对以低密度表达CD20的B细胞系的CDC。包含变体抗原结合结构域的IgG抗体无法与高密度CD20表达细胞系结合，并且无法在高密度或低密度CD20表达B细胞系中引发CDC。

在某些实施方案中，例如，在期望测试抗原结合结构域与以较高和较低密度表达感兴趣的预定靶标的细胞的结合特性时，可以使用各种细胞系。例如，如果CD20是感兴趣的预定靶点，那么可以使用高密度和低密度CD20表达细胞系，例如，B细胞淋巴瘤细胞系，并且可以通过各种方法对其CD20表达水平进行分级，其中一些方法提供于本文别处。以高密度表达CD20的细胞系包括但不限于Ramos细胞系、Raji细胞系、DoHH-2细胞系、JeKo-1细胞系、Z-138细胞系、Daudi细胞系、Granta细胞系或DoHH2细胞系。以较低密度表达CD20的细胞系包括但不限于CA46细胞系、Nalm-1细胞系、Toledo细胞系、BJAB细胞系、Kasumi-2细胞系、RPMI 8226细胞系、HT细胞系、SU-DHL-8细胞系、JM1细胞系、Namalwa细胞系、Nalm-6细胞系或Z138细胞系。

在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体抗CD20结合分子(例如，包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10的VL的结合单元缔合的抗原结合结构域的IgA抗体、IgA样抗体、IgM抗体或IgM样抗体)可以引导对Ramos细胞的补体介导的杀伤，其中等效量的包含两个相同的抗原结合结构域的单特异性二价IgG1抗体不显示可检测的对Ramos细胞的补体介导的杀伤。此外，在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体抗CD20结合分子(例如，包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的VL的结合单元缔合的抗原结合结构域的IgA抗体、IgA样抗体、IgM抗体或IgM样抗体)可以引导对患有癌症的受试者的CD20阳性恶性B细胞的补体介导的(CDC)、T细胞介导的(如果结合分子是双特异性的并且包含例如与CD3ε结合的修饰的J链，如本文别处所述)或补体介导和T细胞介导的杀伤，但是对患有癌症的受试者的正常B细胞的影响很小或没有影响。在某些实施方案中，癌症是高表达CD20阳性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些实施方案中，受试者是人受试者。

其他已知治疗性抗体的亲和力降低的变体，包括但不限于本文所述的那些，同样可以通过本文所述的方法进行预测、构建和测试。例如，使用BioLuminate软件，结合伊匹单抗和曲美木单抗的抗原结合结构域的Fab的已知晶体结构对两种CTLA4抗体伊匹单抗(VH：SEQ ID NO:16和VL：SEQ ID NO:17)和曲美木单抗(VH：SEQ ID NO:18和VL：SEQ ID NO:19)进行了类似的建模。建模预测以下替换可能降低这些抗原结合结构域对其靶标CTLA4的结合亲和力。

对于伊匹单抗，预测降低抗原结合结构域对CTLA4的结合亲和力的氨基酸取代包括但不限于：在SEQ ID NO:16的F50处的重链取代，例如F50D、F50N、F50H或F50E；在SEQ IDNO:16的S52处的重链取代，例如S52H、S52D、S52K、S52I、S52T、S52F、S52N、S52W或S52Y；在SEQ ID NO:16的Y53处的重链取代，例如Y53S、Y53Q、Y52K、Y53T、Y53F、Y53N、Y53H、Y53W、Y53V、Y53E或Y53L；在SEQ ID NO:16的N56处的重链取代，例如N56D；在SEQ ID NO:16的N57处的重链取代，例如N57D、N57S、N57G或N57E；在SEQ ID NO:16的Y59处的重链取代，例如Y59H、Y59K、Y59I、Y59F、Y59R、Y59W或Y59L；在SEQ ID NO:17的G93处的轻链取代，例如G93E；在SEQ ID NO:17的S95处的轻链取代，例如S95H、S95K、S95N、S95G或S95A；或在SEQ ID NO:17的W97处的轻链取代，例如W97D或W97E。

对于曲美木单抗，预测降低抗原结合结构域对CTLA4的结合亲和力的氨基酸取代包括但不限于：在SEQ ID NO:18的W52处的重链取代，例如W52Q、W52G、W52E、W52C、W52D、W52S、W52P、W52H、W52N、W52V、W52T或W52A；在SEQ ID NO:18的N57处的重链取代，例如N57D；在SEQ ID NO:18的R101处的任何重链取代；在SEQ ID NO:18的G102处的重链取代，例如G102Q、G102D或G102F；在SEQ ID NO:18的Y106处的重链取代，例如Y106G、Y106E或Y106D；在SEQ ID NO:18的Y107处的重链取代，例如Y107Q、Y107C、Y107K、Y107P、Y107H、Y107N、Y107V、Y107T、Y107A或Y107L；在SEQ ID NO:18的Y110处的重链取代，例如Y110I、Y110Q、Y110G、Y110E、Y110C、Y110D、Y110S、Y110K、Y110P、Y110N、Y110H、Y110V、Y110T、Y110W或Y110A；在SEQ ID NO:19的S28处的轻链取代，例如S28H或S28R；在SEQ ID NO:19的I29处的轻链取代，例如I29W；在SEQ ID NO:19的N30处的轻链取代，例如N30I、N30G、N30E、N30C、N30D、N30S、N30K、N30H、N30V、N30T、N30F、N30A或N30L；或在SEQ ID NO:19的Y32处的轻链取代，例如Y32I、Y32Q、Y32C、Y32K、Y32P、Y32H、Y32N、Y32V、Y32T或Y32L。

在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，抗体)的至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个抗原结合结构域是相同的并且与细胞表面上的预定靶标特异性结合。

在某些实施方案中，结合分子是二聚体抗体，例如四价IgA或IgA样抗体，其包含两个二价IgA结合单元和J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段，其至少包含Cα3结构域和尾片(tp)结构域，例如，包含Cα3结构域和tp结构域以及Cα1结构域、IgA铰链区和/或Cα2结构域，其各自与如本文所提供的结合单元缔合的抗原结合结构域(例如，亲和力降低的抗原结合结构域)缔合。抗体可以还包含分泌组分或其片段或变体。

在某些实施方案中，结合分子是分别包含五个或六个二价IgM结合单元的五聚体或六聚体IgM或IgM样抗体，其中每个结合单元包含两个IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段，其至少包含Cμ4结构域和tp结构域，例如包含Cμ4结构域和tp结构域以及Cμ2结构域、Cμ1结构域和/或Cμ3结构域，其各自与如本文所提供的结合单元缔合的抗原结合结构域(例如，亲和力降低的抗原结合结构域)缔合。在某些实施方案中，IgM或IgM样抗体是五聚体，并且还包含J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，可以对IgM或IgM样重链恒定区进行修饰，以调节(例如，降低或阻断)结合分子促进补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。在一些实施方案中，可以对IgM或IgM样重链恒定区进行修饰，以增加结合分子的血清半衰期。

在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)包含J链或其功能片段或变体，例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的人J链或其功能片段或其功能变体，例如，在位置102处具有氨基酸取代(Y102A)的SEQ ID NO:42的变体，其增加包含变体J链(例如，SEQ ID NO:43)的IgM五聚体抗体的血清半衰期。在某些实施方案中，J链或其片段是还包含一种或多种异源多肽的修饰的J链，其中异源多肽例如经由肽接头与J链或其片段直接或间接融合。在某些实施方案中，修饰的J链是与CD3ε特异性结合的修饰的人J链，例如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:56。

多核苷酸、载体和宿主细胞

本公开进一步提供了一种多核苷酸，例如，分离、重组和/或非天然存在的多核苷酸，其包含编码如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)的多肽亚基的核酸序列。“多肽亚基”意指可以独立地翻译的抗体、结合分子、结合单元或结合域的一部分。实例包括但不限于抗体VH、抗体VL、单链Fv、抗体重链、抗体轻链、抗体重链恒定区、抗体轻链恒定区、J链、分泌组分和/或其任何功能(例如，抗原结合和/或多聚化)片段。

本公开进一步提供了一种包含两种或更多种多核苷酸的组合物，其中两种或更多种多核苷酸可以共同编码如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)。在某些实施方案中，组合物可以包含：编码IgM、IgM样、IgA或IgA样重链或其片段(例如，如上文所述的人IgM、IgM样、IgA或IgA样重链)的多核苷酸，其中IgM、IgM样、IgA或IgA样重链至少包含与预定靶标(例如，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)结合的结合单元缔合的抗原结合结构域的VH，其中与以较低密度表达预定靶标的参考细胞(例如，正常的健康细胞)相比，结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)选择性地与以较高密度表达预定靶标的细胞结合；和编码轻链或其片段的多核苷酸，例如至少包含与预定靶标(例如，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)结合的结合单元缔合的抗原结合结构域的VL的人κ或λ轻链，其中与以较低密度表达预定靶标的参考细胞(例如，正常的健康细胞)相比，结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)选择性地与以较高密度表达预定靶标的细胞结合。所提供的多核苷酸组合物还可以包含编码J链(例如，人J链)或其片段或其变体的多核苷酸。在某些实施方案中，构成如本文所提供的组合物的多核苷酸可以位于两个或三个单独的载体(例如，表达载体)上。本公开提供了此类载体。在某些实施方案中，构成如本文所提供的组合物的两种或更多种多核苷酸可以位于单个载体(例如，表达载体)上。本公开提供了这种载体。

本公开进一步提供了一种宿主细胞，例如原核或真核宿主细胞，其包含：一种多核苷酸或者两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码结合分子(例如，如本文所提供的IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)或其亚基；如本文所提供的多核苷酸组合物；或一种载体或者两种、三种或更多种载体，所述载体共同编码如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)或其任何亚基。在某些实施方案中，本公开提供的宿主细胞可以表达如本文是提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)或其亚基。

在相关实施方案中，本公开提供了一种产生如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)的方法，其中所述方法包括培养如上文所述的宿主细胞以及回收结合分子，例如IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体。

使用方法

本公开提供了用于使用如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)治疗基于细胞的疾病(例如，癌症)的方法，其中与以较低密度表达表抗原的参考细胞(例如，正常的健康细胞)相比，结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)选择性地与以较高密度表达感兴趣的预定靶抗原的细胞结合。本公开进一步提供了如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)在制备用于治疗基于细胞的疾病(例如，癌症)的药物中的用途，其中与以较低密度表达表抗原的参考细胞(例如，正常的健康细胞)相比，结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)选择性地与以较高密度表达感兴趣的预定靶抗原的细胞结合。本公开进一步提供了一种如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)，其用于治疗基于细胞的疾病(例如，癌症)，其中与以较低密度表达表抗原的参考细胞(例如，正常的健康细胞)相比，结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)选择性地与以较高密度表达感兴趣的预定靶抗原的细胞结合。下文所述的方法同样适用于所提供的组合物在制备用于治疗疾病的药物中使用以及所提供的用于治疗疾病的组合物。

本文所提供的治疗方法利用结合分子，例如IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体，其包含三个或更多个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或十二个抗原结合结构域，例如衍生自现有治疗性抗体的亲和力降低的抗原结合结构域，所述治疗性抗体诸如但不限于本文所述的那些，包括但不限于包含表2中提供的VH和VL氨基酸序列的抗体的亲和力降低的变体，或其抗原结合变体、衍生物或类似物。在某些实施方案中，多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)可以为以较高密度表达预定靶抗原的细胞(例如，癌细胞)提供增强的选择性。基于本公开，对以较高密度表达预定靶抗原的细胞的选择性增强的多聚体基于IgA或IgM的结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)的构建完全在本领域的普通技术人员的能力内。例如，相对于现有疗法，选择性改善可以提高安全性并预防副作用，因为可以留下正常的健康细胞。

在又一个实施方案中，当呈有效剂量向需要癌症治疗的受试者施用时，如本文所提供的对癌细胞的选择性增强的多聚体分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)可以例如通过减缓肿瘤生长、拖延肿瘤生长或减小现有肿瘤的大小来促进癌症治疗。本公开提供了一种治疗癌症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效剂量的如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)。

术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性”和“恶性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病。

在所提供方法的某些实施方案中，待治疗的癌症可以是实体瘤、血液学恶性肿瘤、其任何转移或其任何组合。在某些实施方案中，实体瘤可以是例如肉瘤、癌、黑素瘤、淋巴瘤、其任何转移或其任何组合。更具体地，实体瘤可以是例如鳞状细胞癌、腺癌、基底细胞癌、肾细胞癌、乳腺导管癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胃癌、胰腺癌、神经内分泌癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、脑癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、食道癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌、其任何转移或其任何组合。

在所提供方法的某些实施方案中，待治疗的癌症可以是血液学恶性肿瘤或其转移。在某些实施方案中，血液学恶性肿瘤可以是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、其任何转移或其任何组合。

在某些实施方案中，本文所提供的方法可以还包括施用另外的癌症疗法，例如外科手术、化学疗法、放射疗法、癌症疫苗或其任何组合。

本公开进一步提供了一种预防或治疗有需要的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)、包含结合分子(例如，抗体)或多核苷酸组合物或制剂、载体或宿主细胞，如本文所述。

“治疗有效剂量或量”或“有效量”是指多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)当施用时相对于癌症患者的治疗，引起阳性免疫治疗反应的量。在某些实施方案中，治疗有效剂量或量杀伤癌细胞但仅最小地影响或不影响正常细胞。在某些实施方案中，治疗有效量提供最小的副作用。

用于治疗癌症的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用手段、目标部位、患者的生理状态、患者为人还是动物、所施用的其他药物和治疗为预防性还是治疗性。通常，患者为人，然而也可治疗包括转基因哺乳动物的非人哺乳动物。治疗剂量可使用本领域者已知的常规方法滴定以优化安全性和效力。

在其最简单的形式中，向受试者施用的制备剂是以常规剂型施用的如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)，其可以与如本文别处所述的药物赋形剂、载剂或稀释剂组合。

药物组合物和施用方法

制备如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)并向有需要的受试者施用的方法是本领域的技术人员熟知或容易根据本公开确定的。结合分子(例如，抗体)的施用途径可以是例如肿瘤内、口服、肠胃外、通过吸入或局部。如本文所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、经直肠或经阴道施用。虽然这些施用形式被认为合适的形式，但是施用形式的另一个实例将是用于注射的溶液，尤其是用于肿瘤内、静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)可以局部引入到肿瘤中或在肿瘤细胞附近，例如在肿瘤微环境(TME)中。合适的药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如，人白蛋白)等等。

如本文所讨论，如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)可以药学有效量施用，以用于癌症的体内免疫治疗性治疗。可以配制所公开的结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)以有助于施用并促进活性剂的稳定性。因此，药物组合物可包含药学上可接受的、无毒的、无菌载剂，诸如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。如本文所提供的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)的药学有效量意指足以实现与靶标的有效结合并实现治疗益处的量。在某些方面，药学有效量引起最小的副作用。合适的制剂描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy(PharmaceuticalPress)第22版(2012)。

可以与载剂材料组合以产生单一剂型的多聚体结合分子(例如，IgM、IgM样、IgA或IgA样抗体)的量将取决于例如所治疗的受试者和特定的施用方式。组合物可被施用为单一剂量、多剂量或以输注的形式经过建立的时间段。还可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗性反应或预防性反应)。

除非另外指明，否则本公开采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，所述技术处于本领域的技能之内。此类技术在文献中被充分地解释。参见例如，Green和Sambrook编,(2012)Molecular CloningALaboratory Manual(第4版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编,(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover和B.D.Hames编,(1995)DNA Cloning第2版(IRL Press),第1-4卷；Gait编,(1990)Oligonucleotide Synthesis(IRL Press)；Mullis等人,美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编,(1985)Nucleic Acid Hybridization(IRL Press)；Hames和Higgins编,(1984)Transcription And Translation(IRL Press)；Freshney(2016)Culture OfAnimal Cells,第7版(Wiley-Blackwell)；Woodward,J.,Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1985)；Perbal(1988)A Practical Guide To Molecular Cloning；第2版(Wiley-Interscience)；Miller和Calos编,(1987)Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；S.C.Makrides(2003)GeneTransfer and Expression in Mammalian Cells(Elsevier Science)；Methods inEnzymology,第151-155卷(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Mayer和Walker编,(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell编；以及Ausubel等人,(1995)Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley and Sons)。

抗体工程化的一般原理示于例如Strohl,W.R.和L.M.Strohl(2012),TherapeuticAntibody Engineering(Woodhead Publishing)。蛋白质工程化的一般原理示于例如Park和Cochran编,(2009),Protein Engineering and Design(CDC Press)。免疫学的一般原理示于例如Abbas和Lichtman(2017)Cellular and Molecular Immunology第9版(Elsevier)。另外，本领域中已知的免疫学的标准方法可根据Current Protocols inImmunology(Wiley Online Library)；Wild,D.(2013),The Immunoassay Handbook第4版(Elsevier Science)；Greenfield编,(2013),Antibodies,a Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press)；以及Ossipow和Fischer编,(2014),MonoclonalAntibodies:Methods and Protocols(Humana Press)。

上文引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。

以下实施例以说明而非不限制的方式提供。

实施例

实施例1：对恶性B细胞的选择性增强的亲和力改变的抗CD20 IgM抗体的建模、构建和表达

抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)广泛用于B细胞恶性肿瘤(例如，淋巴瘤)的治疗。遗憾的是，CD20也在正常B细胞上广泛表达，在抗CD20癌症治疗期间导致不期望的B细胞耗竭。恶性B细胞上的抗原表达通常比正常B细胞上的密度高得多。此实施例显示了亲和力降低的具有抗CD20结合结构域的IgM抗体的构建和表征。IgM的亲和力增加导致抗体选择性地靶向那些以较高密度表达CD20的细胞。

相对于利妥昔单抗，可以以降低的亲和力与CD20特异性结合的五聚体或六聚体IgM抗体通过以下方法制备。使用BioLuminate(Shrodinger)以及利妥昔单抗Fab和CD20的可用晶体结构对利妥昔单抗的VH(SEQ ID NO:7)和VL(SEQ ID NO:8)氨基酸序列进行计算机建模以预测将导致结合亲和力降低的氨基酸取代。根据对结合亲和力的影响，对利妥昔单抗轻链可变区的位置N93处的几种取代进行排序(N93D＜N93E＜N93A＜野生型＜N93K＜N93R)。通过商业供应商合成了编码这些突变体轻链可变区RTX N93D(SEQ ID NO:9)、RTXN93E(SEQ ID NO:10)、RTX N93A(SEQ ID NO:11)、RTX N93K(SEQ ID NO:12)和RTX N93R(SEQ ID NO:13)的DNA片段以及编码野生型利妥昔单抗VH的构建体作为IgG和IgM抗体。

如下文所述使这些抗体构建体表达并进行纯化。如下在还原型和非还原型凝胶上拆分IgG和IgM分子。在还原和非还原条件下，在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的抗CD20 IgG和IgM+野生型J链抗体。图1A描绘了拆分组装的IgG的非还原型凝胶，图1B描绘了显示IgG重链和轻链的还原型凝胶，图1C描绘了拆分组装的IgM的非还原型凝胶，图1B描绘了显示IgM重链和轻链的还原型凝胶。将非还原型IgM凝胶样品与NuPage LDS样品缓冲液(LifeTechnologies编号NP0007)混合并上样到NativePage Novex 3-12％Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies编号BN1003)上。将Novex Tris-乙酸盐SDS运行缓冲液(Life Technologies编号LA0041)用于凝胶电泳，并且用胶体蓝染色剂(Life Technologies编号LC6025)将凝胶染色。将非还原型IgG样品与样品缓冲液混合，加热至80℃持续10分钟并上样在NuPageNovex 4-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies编号NP0322)上。将NuPage MES SDS运行缓冲液用于凝胶电泳，并且用胶体蓝将凝胶染色。对于还原型凝胶，将样品与样品缓冲液和NuPage还原剂(Life Technologies编号NP0004)混合并加热至80℃持续10分钟，并且上样在NuPage Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies编号NP0322)上。将NuPage MESSDS运行缓冲液(Life Technologies编号NP0002)用于凝胶电泳，并且用胶体蓝将凝胶染色。

蛋白质表达、纯化和表征

转染。将IgG或IgM重链、轻链和J链DNA(对于IgM五聚体构建体)转染到例如Expi293细胞中。将表达载体的DNA与Expifectamine混合，然后添加到细胞中。根据制造商的建议，用Expi293细胞进行瞬时转染。

根据制造商的建议，例如使用MabSelectSuRe亲和基质(GE Life Sciences登录号17-5438-01)纯化IgG表达产物。

根据制造商的建议，例如使用Capture Select IgM亲和基质(BAC，Thermo Fisher登录号2890.05)纯化IgM表达产物(有或没有J链)。

实施例2：B细胞系上CD20密度的表征

使用QIFIKit(DAKO)测试了以下各种B细胞系的相对CD20表面密度：Raji(ATCC登录号CCL-86)、Ramos(ATCC登录号CRL-1596)、CA46(ATCC登录号CRL-1648)、DB(ATCC登录号CRL-2289)、DoHH-2(DSMZ登录号ACC-47)、JeKo-1(ATCC登录号CRL-3006)、Z-138(ATCC登录号CRL-3001)、Toledo(ATCC登录号CRL-2631)、BJAB(DSMZ登录号ACC-757)、Kasumi-2(DSMZ登录号ACC-526)、Nalm-1(ATCC登录号CRL-1567)、RPMI 8226(ATCC登录号CCL-155)、HT(ATCC登录号CRL-2260)、SU-DHL-8(ATCC登录号CRL-2961)和JM1(ATCC登录号CRL-10423)。以饱和点使用未缀合的小鼠CD20抗体(Biolegend)，作为以20μg/mL实现单价结合的一抗。将FITC缀合的F(ab')2抗体(Dako)以1:50用作二抗。将与一系列确定量的一抗Mab结合的五个校准珠(Dako)群体混合并以与细胞相同的方式染色，并且设置为标准曲线。利用使用标准操作程序的FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)测量细胞表面抗原。使用FlowJo(Treestar)计算每个样品的MFI(平均荧光强度)。使用Prism(GraphPad)为每个细胞系插入根据标准曲线的抗原密度。计算抗原密度，其表述为每个细胞的分子中的Ab结合能力(ABC)。最后，将表3中的“抗原密度”表述为特异性ABC(sABC)，其通过从ABC减去同种型对照的背景Ab等效值来确定。

通过以下方法，还通过FACS分析测试了细胞系的CD20密度。将细胞洗涤并且以0.48x10⁶个细胞/mL的密度重新悬浮于FACS染色缓冲液(FSB，BD登录号554656)中，并且向V形底96孔板中添加25μL/孔。对于每个孔，添加5μL CD20抗体(AlexaFluor488缀合，Biolegend登录号302316，浓度200μg/mL)和20μL CD19(PE缀合，BD登录号555413，浓度0.015μg/20μL)。对于同种型对照，添加5μL小鼠IgG2b抗体(AlexaFluor488缀合，Biolegend登录号400329)和20μL小鼠IgG1抗体(PE缀合，BD登录号555749)。将板在黑暗中并且在冰上孵育30min。用200μL FACS染色缓冲液洗涤板两次。用50μL固定缓冲液(BD登录号554655，1:8稀释于PBS中)将细胞固定过夜。在FACSCalibur细胞仪上采集数据，随后使用FlowJo(TreeStar)进行分析。

还通过以下方法测试了各种细胞系在10％正常人血清中经由补体依赖性细胞毒性被杀伤的能力。在37℃下，在5％CO₂培养箱中，将B细胞系在含有10-20％热灭活胎牛血清(HI-FBS)的RPMI完全培养基(RPMI-C；RPMI 1640培养基、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、1x MEM非必需氨基酸、1x GlutaMAX)(适用于每个细胞系)中维持培养。按需要使细胞每2-3天分裂一次，以维持细胞密度在0.2-2.0x10⁶个细胞/mL之间。通过离心回收约5.0x10⁶个细胞，并重新悬浮在5.0mL RPMI-C(1.0x10⁶个细胞/mL)中。将纯化的抗CD20 IgG抗体(利妥昔单抗)在RPMI-C、10％HI FBS中稀释至30μg/mL，然后在非组织培养处理的96孔板(Falcon 351177)中将其在RPMI-C、10％HI FBS中连续稀释3倍，并且将10μL细胞(10,000个细胞/孔)和10μL连续稀释的Ab在384孔板(Thermo 164610)中合并，并且在37℃下，在5％CO₂培养箱中孵育2h。将正常人血清补体(Quidel A113)在RPMI-C、10％HI FBS(1.5mL:3.5mL)中稀释至30％，然后添加(10μL/孔30％NHS或RPMI-C、10％HI FBS)到每个孔中，并在37℃下，在5％CO₂培养箱中孵育4h。将Cell Titer-Glo试剂(Promega G7572)(10μL/孔)添加到每个孔中并在板振荡器上混合两分钟，然后在室温下混合10分钟，并在PerkinElmer EnVision 2104上读取发光。

结果显示在表3中。细胞上的相对CD20抗原密度与MFI相关，并且与细胞被CDC杀伤的能力相关。

表3各种B细胞系上的CD20抗原密度

实施例3：Ramos细胞上IgG和IgM抗CD20突变体的结合活性

通过以下方法，通过流式细胞术测量实施例1中产生的各种IgG和IgM抗CD20突变体IgG和IgM抗体的结合亲和力。在37℃下，在5％CO₂培养箱中，将Ramos细胞在含有10％HI-胎牛血清的RPMI完全培养基(RPMI-C；RPMI 1640培养基、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、1x MEM非必需氨基酸、1x GlutaMAX)中维持培养。按需要使细胞每2-3天分裂一次，以维持细胞密度在0.2-2.0x10⁶个细胞/mL之间。通过离心回收约2x10⁶个细胞，并重悬于4.0mL FACS染色缓冲液(FSB，BD 554656；0.5x10⁶个细胞/mL)中。将如实施例1中所述制备的纯化的IgG或IgM抗体稀释至20μg/mL FBS，然后在未经TC处理的96孔板(Falcon 351177)中在FSB中连续稀释3倍。将细胞(25μL，12,500个细胞/孔)和连续稀释的抗体样品(25μL)在96孔V形底板(Sarstedt 82.1583.001)中合并，并且在37℃下，在5％CO₂培养箱中孵育2h。将细胞用200μL冷FSB洗涤两次，并且重悬浮于50μL以1μg/mL的小鼠抗人κ抗体AF647(BioLegend 316514，克隆MHK-49，50μg/mL；100μL抗体:5mL FSB)中。将抗体细胞混合物在黑暗中、在冰上孵育30分钟。再次洗涤细胞，然后重新悬浮于80μL FSB(未染色细胞)或80μL 1％7-氨基放线菌素D(7-AAD，BD51-88881E，1:100在FSB中)(染色细胞)中，并且将混合物转移到微型管(Nova32022)中。使用标准设置，在FACSCalibur上采集荧光染色数据，并用FloJo 10进行分析。将平均荧光强度(MFI)值导入GraphPad Prism，并根据所得曲线拟合计算EC50或K_D值。

结果示于图2A(IgG)和图2B(IgM+J)以及表4和表5中。N93D和N93E突变体作为IgG对Ramos没有可测量的亲和力并且作为IgM表现出与野生型利妥昔单抗(对于两个不同的批次，0.16nM或0.19nM)相比，高约10倍的EC50(分别地，2.8nM和1.9nM)。

表4：IgG抗体的EC50值

表5：IgM抗体的EC50值

与野生型利妥昔单抗相比，N93D和N93E突变体显示对Ramos细胞上的CD20的亲和力降低。事实上，N93D和N93E突变体作为IgG对Ramos没有可测量的亲和力。作为IgM，两种突变体的EC50比作为IgM的野生型利妥昔单抗高约10倍。

实施例4：IgG和IgM抗CD20突变体对Ramos和CA46细胞的CDC活性

通过以下方法，评估实施例1中产生的IgG和IgM亲和力改变的突变体促进对两种B细胞系的补体依赖性细胞毒性的能力。在37℃下，在5％CO₂培养箱中，将如实施例2中所述具有不同CD20密度的两种B细胞系Ramos(较高密度CD20)和CA46(中至低密度CD20)在含有10-20％热灭活胎牛血清(HI-FBS)的RPMI完全培养基(RPMI-C；RPMI 1640培养基、10mMHEPES、1mM丙酮酸钠、1xMEM非必需氨基酸、1x GlutaMAX)(适用于每个细胞系)中维持培养。按需要每2-3天分裂一次，以维持细胞密度在0.2-2.0x10⁶个细胞/mL之间。按需要使细胞每2-3天分裂一次，以维持细胞密度在0.2-2.0x10⁶个细胞/mL之间。通过离心回收约5.0x10⁶个细胞，并重新悬浮在5.0mL RPMI-C(1.0x10⁶个细胞/mL)中。如实施例1所述制备的纯化的抗CD20 IgM和IgG抗体在RPMI-C、10％HI FBS中稀释至30μg/mL(IgG)或3μg/mL(IgM)，然后在未经组织培养处理的96孔板(Falcon351177)中，在RPMI-C、10％HI FBS中连续稀释3倍。将细胞样品(10μL，约10,000个细胞/孔)与10μL连续稀释的抗体样品在384孔板(Thermo164610)中合并，并且在37℃下，在5％CO₂培养箱中孵育2h。将正常人血清补体(QuidelA113)在RPMI-C、10％HI FBS(1.5mL:3.5mL)中稀释至30％，然后将10μL 30％NHS或RPMI-C、10％HI FBS添加到每个孔中。在37℃下，在5％CO₂培养箱中，将板孵育4h，将Cell Titer-Glo试剂(10μL，Promega G7572)添加到每个孔中，在板振荡器上混合两分钟，然后在室温下孵育10分钟。在PerkinElmer EnVision 2104上读取发光。将原始数据导入Excel中的数据，并从所有值减去背景(培养基+Cell Titer-Glo的信号，无细胞)。将数据转移到GraphPadPrism。将Y值归一化，使得100％细胞活力定义为在不存在抗体的情况下孵育的细胞的平均最大值。使用X＝log(X)转换抗体浓度(nM)，然后使用可变斜率4参数逻辑拟合[激动剂对log(X)]将数据拟合到曲线。由所得曲线拟合计算EC50值。

结果示于图3A至图3D。在较高CD20密度的Ramos细胞中，N93D和N93E突变体显示作为IgG没有任何CDC活性(图3A)，但作为IgM得到亲合力增加，低亲和力。N93D和N93E突变体作为高亲合力IgM显示可测量的CDC活性(EC50约0.1至10nM)(图3B)。相比之下，在较低CD20密度的CA46细胞中，N93D和N93E突变体的IgG(图3C)和IgM形式(图3D)均未显示可测量的CDC活性。

实施例5：IgM抗CD20突变体对Ramos和CA46细胞的TDCC活性

通过以下方法，评估实施例1中产生的IgM亲和力改变的突变体促进对两种B细胞系以及另外对来自健康供体的正常B细胞的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)的能力。

在实验前一天，将CD8+T细胞(Precision for Medicine 84300)解冻并以约1.0-2.0x10⁶个细胞/mL的细胞密度重新悬浮于含有10％热灭活胎牛血清(HI-FBS)的RPMI完全培养基(RPMI-C；RPMI 1640培养基、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、1x MEM非必需氨基酸、1xGlutaMAX)，然后在37℃下，在5％CO₂培养箱中静置过夜。在实验当天，将T细胞在RPMI-C、10％HI-FBS中调整至密度约1.0x10⁶个细胞/mL。在37℃下，在5％CO₂培养箱中，将如实施例2中所述具有不同CD20密度的两种B细胞系Ramos(较高密度CD20)和CA46(中至低密度CD20)在含有10-20％HI-FBS的RPMI-C(适用于每个细胞系)中维持培养。按需要使细胞每2-3天分裂一次，以维持细胞密度在0.2-2.0x10⁶个细胞/mL之间。

通过离心，回收来自健康供体的约1.0x10⁶个B细胞，并重新悬浮于1.0mL RPMI-C、10％HI-FBS(1.0x106个细胞/mL)中。通过添加CellTrace Oregon Green 488(LifeTech34550)对细胞进行荧光标记，最终浓度为2-5μM，然后在在37℃下，在5％CO₂培养箱中孵育约30min。用10mL RPMI-C将标记的细胞洗涤两次，以去除过量的标记，并且以约1.0x10⁵个细胞/mL的最终密度重新悬浮于RPMI-C中。通过在荧光显微镜中检查细胞来确认荧光标记。

将如实施例1中所述的纯化的包含与CD3ε特异性结合的修饰的J链(J链氨基酸序列SEQ ID NO:46)的双特异性抗CD20 IgM抗体在RPMI-C、10％HI FBS中稀释至2μg/mL(野生型)或20μg/mL(变体)，然后在未经TC处理的96孔U形底板(Falcon 351177)中在RPMI-C、10％HI FBS中连续稀释3倍。将荧光标记的B细胞(50μL，约5,000个细胞/孔)与50μL连续稀释的抗体样品和CD8+T细胞(50μL，约50,000个细胞/孔)在96孔U形底板(Falcon 351177)中合并，并且在37℃下，在5％CO₂培养箱中孵育。约48h后，添加5μL/孔的CountBright绝对计数珠(Invitrogen C36950)，并且用200μL/孔的FACS缓冲液(FBS；BD 554656)洗涤细胞一次，然后重新悬浮于约60μL/孔含有1％7-AAD(BD 51-88881E)的FBS中。使用FACSCalibur流式细胞仪(BD)，通过流式细胞术分析细胞-珠混合物，并以列表模式保存数据。使用软件程序FlowJo，版本10(BD)分析数据。在FL1(绿色)通道中关于侧向散射(SSC)相对于荧光对B细胞进行门控，并且在FL4(红色)通道中关于FL1荧光相对于非荧光对活B细胞进行门控。关于SSC相对于FL1荧光对计数珠进行门控。使用计数珠，针对因洗涤所致的损失对活B细胞数/孔进行归一化。通过将处理的样品中的归一化的活细胞数/孔除以未处理的样品中的平均归一化的活细胞数/孔，从1减去所得比率并将结果乘以100来计算百分比裂解。使用软件程序Prism，版本7(GraphPad)进一步分析数据。使用X＝log(X)转换抗体浓度(pM)，并且使用可变斜率4参数逻辑拟合[激动剂对log(X)]将其拟合到曲线。由所得曲线拟合计算EC50值。

结果示于图4A至图4C和表6中。

表6：IgM抗CD20亲和力降低的突变体的TDCC活性

在较高CD20密度的Ramos细胞中，N93D和N93E IgM突变体作为高亲合力IgM显示可测量的TDCC活性(EC50约0.1至0.7nM)(图4C)。相比之下，在较低CD20密度的CA46细胞中，N93D和N93E IgM突变体没有显示可测量的TDCC活性(图4A)。N93E突变体杀伤高达27％的正常的健康B细胞，适度EC50为0.14nM，其中N93D突变体没有显示明显的TDCC活性(图4B)。

***

本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物定义。

表7：另外的序列

序列表

<110> IGM生物科学股份有限公司(IGM BIOSCIENCES, INC.)

<120> 对靶标密度高的细胞的选择性增强的多聚体抗体

<130> 004-023WO1

<140>

<141>

<150> 62/902,915

<151> 2019-09-19

<160> 61

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 453

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65 70 75 80

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

100 105 110

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

130 135 140

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

145 150 155 160

Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr

165 170 175

Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln

180 185 190

Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln

195 200 205

Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val

210 215 220

Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr

245 250 255

Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn

260 265 270

Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala

275 280 285

Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr

290 295 300

Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro

325 330 335

Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu

340 345 350

Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg

355 360 365

Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro

370 375 380

Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val

385 390 395 400

Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala

405 410 415

His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr

435 440 445

Ala Gly Thr Cys Tyr

450

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65 70 75 80

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

100 105 110

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

130 135 140

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

145 150 155 160

Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr

165 170 175

Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln

180 185 190

Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln

195 200 205

Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val

210 215 220

Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr

245 250 255

Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn

260 265 270

Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala

275 280 285

Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr

290 295 300

Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro

325 330 335

Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu

340 345 350

Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg

355 360 365

Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro

370 375 380

Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val

385 390 395 400

Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala

405 410 415

His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr

435 440 445

Ala Gly Thr Cys Tyr

450

<210> 3

<211> 353

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr

1 5 10 15

Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

20 25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val

35 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly

65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro

100 105 110

Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser

115 120 125

Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn

130 135 140

Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe

145 150 155 160

Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu

165 170 175

Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys

180 185 190

Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr

195 200 205

Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn

210 215 220

Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu

225 230 235 240

Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser

245 250 255

Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro

260 265 270

Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly

275 280 285

Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp

290 295 300

Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu

305 310 315 320

Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro

325 330 335

Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys

340 345 350

Tyr

<210> 4

<211> 340

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr

1 5 10 15

Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

20 25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val

35 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly

65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro

100 105 110

Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly

130 135 140

Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly

145 150 155 160

Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu

165 170 175

Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr

180 185 190

Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys

195 200 205

Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser

210 215 220

Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg

225 230 235 240

Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro

260 265 270

Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala

275 280 285

Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His

290 295 300

Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala

305 310 315 320

Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp

325 330 335

Gly Thr Cys Tyr

340

<210> 5

<211> 764

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile

1 5 10 15

Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu

20 25 30

Gly Asn Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn

35 40 45

Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys

50 55 60

Ile Thr Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn

85 90 95

Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu

100 105 110

Gly Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser

115 120 125

Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu

130 135 140

Gly Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln

145 150 155 160

Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val

165 170 175

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg

180 185 190

Leu Asp Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn

195 200 205

Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp

210 215 220

Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro

225 230 235 240

Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His

245 250 255

Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg

260 265 270

Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys

275 280 285

Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys

290 295 300

Asp Gly Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala

305 310 315 320

Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly

325 330 335

Ser Pro Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile

340 345 350

Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala

355 360 365

Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp

370 375 380

Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp

385 390 395 400

Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu

405 410 415

Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr

420 425 430

Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu

435 440 445

Trp Arg Thr Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu

450 455 460

Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val

465 470 475 480

Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys

485 490 495

Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly

500 505 510

Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser

515 520 525

Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys

530 535 540

Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val

545 550 555 560

Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala

565 570 575

Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg

580 585 590

Glu Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu

595 600 605

Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser

610 615 620

Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu

625 630 635 640

Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val

645 650 655

Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val

660 665 670

Ser Ile Arg Ser Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn

675 680 685

Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly Ala Ser Ser Ile Thr

690 695 700

Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Lys Glu Glu Phe Val Ala Thr Thr Glu

705 710 715 720

Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys

725 730 735

Glu Glu Ala Glu Met Ala Tyr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Ser Ser Thr

740 745 750

Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Gly Pro Gln Glu Ala

755 760

<210> 6

<211> 159

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys

1 5 10 15

Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp

20 25 30

Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser

35 40 45

Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val

50 55 60

Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg

65 70 75 80

Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro

85 90 95

Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn

100 105 110

Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg

115 120 125

Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr

130 135 140

Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

145 150 155

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 8

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 9

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asp Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 10

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Glu Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 11

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Ala Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 12

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 13

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Arg Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 15

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

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Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala

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Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 17

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

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Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

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100 105

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe

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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 22

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

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Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

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Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

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Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

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Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 23

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

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Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

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Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

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100 105

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 27

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

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Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

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Arg Thr Val

115

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

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Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 31

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His

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Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 32

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

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Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 33

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

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Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

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Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 34

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 34

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 35

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

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Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 36

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 39

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

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Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 41

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 41

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 137

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 42

Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp

20 25 30

Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu

35 40 45

Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His

50 55 60

Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp

65 70 75 80

Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser

85 90 95

Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala

100 105 110

Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala

115 120 125

Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

130 135

<210> 43

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 43

Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp

20 25 30

Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu

35 40 45

Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His

50 55 60

Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp

65 70 75 80

Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser

85 90 95

Ala Thr Glu Thr Cys Ala Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala

100 105 110

Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala

115 120 125

Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

130 135

<210> 44

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 45

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 46

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ile Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

180 185 190

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala

195 200 205

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

210 215 220

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

245 250 255

Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys

275 280 285

Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro

290 295 300

Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn

305 310 315 320

Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe

325 330 335

Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val

340 345 350

Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp

355 360 365

Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys

370 375 380

Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val

385 390 395 400

Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

405 410

<210> 47

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 47

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ile Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

180 185 190

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala

195 200 205

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

210 215 220

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

245 250 255

Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys

275 280 285

Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro

290 295 300

Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn

305 310 315 320

Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe

325 330 335

Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val

340 345 350

Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp

355 360 365

Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Ala Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys

370 375 380

Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val

385 390 395 400

Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

405 410

<210> 48

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 49

Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn

1 5 10

<210> 50

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 50

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Asp

20

<210> 51

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 51

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 52

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 52

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 53

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 53

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 54

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 54

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 55

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu

1 5

<210> 56

<211> 420

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 56

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95

Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val

115 120 125

Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

145 150 155 160

Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr

165 170 175

Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn

180 185 190

Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu

195 200 205

Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln

225 230 235 240

Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu

245 250 255

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Glu Asp Glu Arg

275 280 285

Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg

290 295 300

Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn

305 310 315 320

Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro

325 330 335

Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys

340 345 350

Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr

355 360 365

Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys

370 375 380

Ala Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val

385 390 395 400

Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala

405 410 415

Cys Tyr Pro Asp

420

<210> 57

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 57

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 58

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 59

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 59

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 60

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 60

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 61

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 61

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

Claims (89)

1.一种多聚体结合分子，其包含两个、五个或六个二价结合单元，所述二价结合单元分别共同地包含四个、十个或十二个结合单元缔合的抗原结合结构域；

其中每个结合单元包含两条抗体重链，其各自包含IgA、IgA样、IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体以及结合单元缔合的抗原结合结构域或其亚基，

其中所述结合分子的所述结合单元缔合的抗原结合结构域中的至少三个与细胞表面上相同的预定靶标特异性结合，并且

其中相对于以较低密度表达所述预定靶标的细胞，所述结合分子优先与以较高密度表达所述预定靶标的细胞结合。

2.如权利要求1所述的结合分子，其中每条抗体重链包含结合单元缔合的抗原结合结构域的重链可变区(VH)部分。

3.如权利要求1或权利要求2所述的结合分子，其中与细胞表面上相同的预定靶标结合的所述至少三个结合单元缔合的抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

4.如权利要求1至3中任一项所述的结合分子，其中所述至少三个抗原结合结构域各自与所述预定靶标上相同的表位结合。

5.如权利要求4所述的结合分子，其中与细胞表面上相同的预定靶标结合的所述至少三个结合单元缔合的抗原结合结构域是相同的。

6.如权利要求5所述的结合分子，其中至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个结合单元缔合的抗原结合结构域与细胞表面上相同的预定靶标结合并且是相同的。

7.如权利要求5或权利要求6所述的结合分子，其相对于参考二价IgG抗体，优先与以较高密度表达所述预定靶标的细胞结合，所述参考二价IgG抗体仅具有与所述细胞表面上的所述预定靶标特异性结合的相同的结合单元缔合的抗原结合结构域中的两个。

8.如权利要求7所述的结合分子，其可与以较高密度表达所述靶抗原的细胞结合，其中所述参考二价IgG抗体不可与以较高密度表达所述靶抗原的所述细胞结合，所述参考二价IgG抗体仅具有与所述细胞表面上的所述预定靶标特异性结合的相同的结合单元缔合的抗原结合结构域中的两个。

9.如权利要求1至8中任一项所述的结合分子，其与以较低密度表达所述预定靶标的细胞可不检测地结合。

10.如权利要求1至9中任一项所述的结合分子，其中以高密度表达所述预定靶标的所述细胞是癌细胞，并且以低密度表达所述预定靶标的所述细胞是正常的健康细胞。

11.如权利要求1至10中任一项所述的结合分子，其是五聚体或六聚体，分别包含五个或六个二价IgM或IgM样结合单元，其中每个结合单元包含两个IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体，其各自与结合单元缔合的抗原结合结构域或其亚基缔合。

12.如权利要求11所述的结合分子，其中所述IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体各自包含Cμ4结构域和IgM尾片(tp)结构域。

13.如权利要求11或权利要求12所述的结合分子，其中所述IgM或IgM样重链恒定区后其多聚化片段或变体各自还包含Cμ1结构域、Cμ2结构域、Cμ3结构域或其任何组合。

14.如权利要求11至13中任一项所述的结合分子，其中所述IgM或IgM样重链恒定区包含人IgM恒定区或人源性IgM样恒定区。

15.如权利要求11至14中任一项所述的结合分子，其中每个结合单元包含：两条IgM或IgM样重链，其各自包含位于所述IgM或IgM样恒定区或其多聚化片段或变体的氨基末端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，其各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。

16.如权利要求11至15中任一项所述的结合分子，其为五聚体，并且还包含J链或其功能片段或变体。

17.如权利要求1至10中任一项所述的结合分子，其为二聚体，并且包含两个二价IgA或IgA样结合单元以及J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体，其各自与结合单元缔合的抗原结合结构域或其亚基缔合。

18.如权利要求17所述的结合分子，其还包含分泌组分或其功能片段或变体。

19.如权利要求17或权利要求18所述的结合分子，其中所述IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体各自包含Cα3结构域和IgA尾片(tp)结构域。

20.如权利要求19所述的结合分子，其中所述IgA或IgA样重链恒定区后其多聚化片段或变体各自还包含Cα1结构域、Cα2结构域、IgA铰链区或其任何组合。

21.如权利要求17至20中任一项所述的结合分子，其中所述IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体是人IgA重链恒定区或人源性IgA样重链恒定区。

22.如权利要求17至21中任一项所述的结合分子，其中每个结合单元包含：两条IgA或IgA样重链，其各自包含位于所述IgA或IgA样重链恒定区或其多聚化片段或变体的氨基末端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，其各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。

23.如权利要求16至22中任一项所述的结合分子，其中所述J链或其片段或变体是包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的人J链或其功能片段或变体。

24.如权利要求16至23中任一项所述的结合分子，其中所述J链或其功能片段或变体是相对于野生型J链包含一个或多个单氨基酸取代、缺失或插入的变体J链，从而可影响所述结合分子的血清半衰期；并且其中相对于除所述一个或多个单氨基酸取代、缺失或插入之外均相同并且以相同方式向同一动物物种施用的参考结合分子，所述结合分子在向动物施用后表现出血清半衰期增加。

25.如权利要求24所述的结合分子，其中所述J链或其功能片段或变体在对应于野生型人J链(SEQ ID NO:42)的氨基酸Y102的氨基酸位置处包含氨基酸取代。

26.如权利要求25所述的结合分子，其中对应于SEQ ID NO:42的Y102的所述氨基酸被丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或精氨酸(R)取代。

27.如权利要求26所述的结合分子，其中对应于SEQ ID NO:42的Y102的所述氨基酸被丙氨酸(A)取代。

28.如权利要求27所述的结合分子，其中所述J链是变体人J链并且包含氨基酸序列SEQID NO:43(J*)。

29.如权利要求16至28中任一项所述的结合分子，其中所述J链或其片段或变体是还包含异源部分的修饰的J链，其中所述异源部分与所述J链或其片段或变体化学缀合或融合。

30.如权利要求29所述的结合分子，其中所述异源部分是异源多肽。

31.如权利要求30所述的结合分子，其中所述异源多肽经由肽接头与所述J链或其片段或变体融合。

32.如权利要求31所述的结合分子，其中所述肽接头由以下组成：SEQ ID NO:57、SEQID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61。

33.如权利要求30至32中任一项所述的结合分子，其中所述异源多肽与所述J链或其片段或变体的N末端融合，与所述J链或其片段或变体的C末端融合，或其中所述异源多肽与所述J链或其片段或变体的N末端和C末端融合。

34.如权利要求30至33中任一项所述的结合分子，其包含至少两个与所述J链或其片段或变体融合的异源多肽，其中所述至少两个异源多肽可以是相同或不同的。

35.如权利要求30至34中任一项所述的结合分子，其中至少一个异源多肽包含J链缔合的抗原结合结构域。

36.如权利要求35所述的结合分子，其中所述J链缔合的抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。

37.如权利要求36所述的结合分子，其中所述抗原结合片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)片段或其任何组合。

38.如权利要求37所述的结合分子，其中所述J链缔合的抗原结合结构域包含scFv片段。

39.如权利要求35至38中任一项所述的结合分子，其中所述J链缔合的抗原结合结构域与免疫效应细胞特异性结合。

40.如权利要求39所述的结合分子，其中所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。

41.如权利要求39或权利要求40所述的结合分子，其中所述免疫效应细胞是T细胞，并且其中所述J链缔合的抗原结合结构域包含与CD3ε特异性结合的scFv。

42.如权利要求41所述的结合分子，其中所述T细胞是CD8+细胞毒性T细胞。

43.如权利要求41或权利要求42所述的结合分子，其中所述scFv片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，或在一个或多个所述VHCDR中具有一个、两个或三个氨基酸取代的SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，并且其中所述VL包含VL互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55，或在一个或多个所述VLCDR中具有一个、两个或三个氨基酸取代的SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55。

44.如权利要求43所述的结合分子，其中所述scFv片段包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:48和VL氨基酸序列SEQ ID NO:52。

45.如权利要求41或权利要求42所述的结合分子，其中所述scFv片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。

46.如权利要求41或权利要求42所述的结合分子，其中所述修饰的J链包含SEQ ID NO:46(V15J)的氨基酸20至412、SEQ ID NO:47(V15J*)的氨基酸20至412或SEQ ID NO:56(SJ*)的氨基酸20至420。

47.如权利要求40所述的结合分子，其中所述免疫效应细胞是NK细胞，并且其中所述scFv片段与CD16特异性结合。

48.如权利要求29至47中任一项所述的结合分子，其中所述修饰的J链还包含与所述J链或其片段或变体融合或化学缀合的免疫刺激剂(“ISA”)。

49.如权利要求48所述的结合分子，其中所述ISA包含细胞因子或其受体结合片段或变体。

50.如权利要求49所述的结合分子，其中所述ISA包含：(a)白介素-15(IL-15)蛋白或其受体结合片段或变体(“I”)；以及(b)能够与I缔合的包含寿司结构域的白介素-15受体α(IL-15Rα)片段或其变体(“R”)，其中所述J链或其片段或变体以及I和R中的至少一个缔合为融合蛋白，并且其中I和R可以缔合以起所述ISA的作用。

51.如权利要求48至50中任一项所述的结合分子，其中所述ISA经由肽接头与所述J链融合。

52.如权利要求1至51中任一项所述的结合分子，其中所述预定靶标是B细胞成熟抗原(BCMA)、CD19、CD20、EGFR、HER2(ErbB2)、ErbB3、ErbB4、CTLA4、PD-1、PD-L1、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、CD52、CD30、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD38、GD2、SLAMF7、血小板源性生长因子受体A(PDGFRA)、CD22、FLT3(CD135)、CD123、MUC-16、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、间皮素、肿瘤相关钙信号转导蛋白2(Trop-2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)、人血型H类型1三糖(Globo-H)、唾液酸Tn抗原(STn抗原)或CD33。

53.如权利要求5至52中任一项所述的结合分子，其中对所述预定靶标具有特异性的所述至少三个相同的结合单元缔合的抗原结合结构域是已知与所述预定靶标结合的现有抗体的抗原结合结构域的亲和力降低的变体，其中现有抗体的抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

54.如权利要求53所述的结合分子，其中所述现有抗体是阿仑单抗、阿替利珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、贝伐珠单抗、博纳吐单抗、本妥昔单抗、卡罗单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、地诺单抗、地努妥昔单抗、度伐利尤单抗、埃罗妥珠单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、伊匹单抗、奥英妥珠单抗、奈昔妥珠单抗、纳武利尤单抗、纳武利尤单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥马珠单抗、帕尼单抗、帕博利珠单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗或曲美木单抗。

55.如权利要求53或权利要求54所述的结合分子，其与所述预定靶标结合，其对所述预定靶标的结合亲和力比所述现有抗体低至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。

56.如权利要求53至55中任一项所述的结合分子，其中所述现有抗体的所述抗原结合结构域的VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41。

57.如权利要求56所述的结合分子，其中所述现有抗体的所述抗原结合结构域包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:7和VL氨基酸序列SEQ ID NO:8，并且其中所述亲和力降低的变体在VL SEQ ID NO:8的位置N93处包含氨基酸取代。

58.如权利要求57所述的结合分子，其中所述氨基酸取代是N93D或N93E。

59.如权利要求58所述的结合分子，其中对所述预定靶标具有特异性的所述至少三个相同的结合单元缔合的抗原结合结构域包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:7和VL氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。

60.如权利要求57至59中任一项所述的结合分子，其可以引导以高密度表达CD20的B细胞的补体引导的细胞毒性(CDC)，其EC50浓度比针对以低密度表达CD20的B细胞的EC50浓度低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。

61.如权利要求57至60中任一项所述的结合分子，其可以引导以高密度表达CD20的B细胞而不是以低密度表达CD20的B细胞的CDC。

62.如权利要求57至61中任一项所述的结合分子，其是五聚体IgM或IgM样结合分子或二聚体IgA或IgA样结合分子，并且还包含修饰的J链，其包含与CD3ε特异性结合的scFv。

63.如权利要求62所述的结合分子，其中所述修饰的J链包含SEQ ID NO:46(V15J)的氨基酸20至412、SEQ ID NO:47(V15J*)的氨基酸20至412或SEQ ID NO:56(SJ*)的氨基酸20至420。

64.如权利要求62或权利要求63所述的结合分子，其可以引导以高密度表达CD20的B细胞的T细胞定向细胞毒性(TDCC)或TDCC和CDC两者，其EC50浓度比针对以低密度表达CD20的B细胞系或正常B细胞的EC50浓度低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。

65.如权利要求62至64中任一项所述的结合分子，其可以引导以高密度表达CD20的B细胞而不是以低密度表达CD20的B细胞的TDCC或TDCC和CDC两者。

66.如权利要求60至65中任一项所述的结合分子，其中以高密度和低密度表达CD20的所述B细胞是淋巴瘤细胞系。

67.如权利要求66所述的结合分子，其中以高密度表达CD20的所述淋巴瘤细胞系是Ramos细胞系、Raji细胞系、DoHH-2细胞系、JeKo-1细胞系、Z-138细胞系、Daudi细胞系、Granta细胞系或DoHH2细胞系，并且以低密度表达CD20的淋巴瘤细胞系是CA46细胞系、Nalm-1细胞系、Toledo细胞系、BJAB细胞系、Kasumi-2细胞系、RPMI 8226细胞系、HT细胞系、SU-DHL-8细胞系、JM1细胞系、Namalwa细胞系、Nalm-6细胞系或Z138细胞系。

68.如权利要求66或权利要求67中任一项所述的结合分子，其可以引导Ramos细胞的CDC，其中等效量的包含与所述结合分子相同的抗原结合结构域的单特异性二价IgG1抗体不显示可检测的对Ramos细胞的补体介导的杀伤。

69.如权利要求60至65中任一项所述的结合分子，其中以高密度表达CD20的所述B细胞是患有癌症的受试者的CD20阳性恶性B细胞，并且以低密度表达CD20的所述B细胞是患有癌症的所述受试者的正常B细胞。

70.如权利要求69所述的结合分子，其中所述癌症是CD20阳性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。

71.如权利要求69或权利要求70所述的结合分子，其中所述受试者是人。

72.一种组合物，其包含如权利要求1至71中任一项所述的结合分子和载剂。

73.一种分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求1至71中任一项所述的结合分子、或其抗原结合和多聚化片段、或其亚基的核酸分子。

74.如权利要求73所述的多核苷酸，其中所述亚基是抗体重链或其多聚化片段或变体、抗体轻链或其片段、J链或其片段或变体或者其任何组合。

75.一种载体，其包含如权利要求73或权利要求74所述的多核苷酸。

76.一种宿主细胞，其包含如权利要求75所述的载体。

77.一种用于产生如权利要求1至71中任一项所述的结合分子的方法，其包括培养如权利要求76所述的宿主细胞以及回收所述结合分子。

78.一种IgM或IgM样抗体，其包含五个二价结合单元和修饰的J链，

其中每个结合单元包含两个人IgM或人源性IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体，其各自与结合单元缔合的抗原结合结构域缔合，

其中所述抗体的每个结合单元缔合的抗原结合结构域包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:7和VL氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10，

其中所述修饰的J链包含有包含与CD3ε特异性结合的scFv的J链缔合的结合结构域，并且

其中所述IgM抗体可以引导以高密度表达CD20的B细胞的TDCC、CDC或TDCC和CDC两者，其EC50浓度比针对以低密度表达CD20的B细胞系或正常B细胞的EC50浓度低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。

79.如权利要求78所述的IgM或IgM样抗体，其可以引导以高密度表达CD20的B细胞而不是以低密度表达CD20的B细胞的CDC、TDCC或TDCC和CDC两者。

80.如权利要求78或权利要求79所述的IgM或IgM样抗体，其中所述修饰的J链包含SEQID NO:46(V15J)的氨基酸20至412、SEQ ID NO:47(V15J*)的氨基酸20至412或SEQ ID NO:56(SJ*)的氨基酸20至420。

81.如权利要求78至80中任一项所述的IgM或IgM样抗体，其中所述高密度和低密度CD20表达细胞是淋巴瘤细胞系。

82.如权利要求81所述的IgM或IgM样抗体，其中以高密度表达CD20的所述细胞是Ramos细胞系，并且以低密度表达CD20的所述细胞是CA46细胞系。

83.如权利要求78至82中任一项所述的IgM或IgM样抗体，其可以引导对Ramos细胞的补体介导的杀伤，其中等效量的包含相同的抗原结合结构域的单特异性二价IgG1抗体不显示可检测的对Ramos细胞的补体介导的杀伤。

84.如权利要求78至80中任一项所述的IgM或IgM样抗体，其中以高密度表达CD20的所述细胞是患有癌症的受试者的恶性B细胞，并且其中以低密度表达CD20的所述细胞是患有癌症的所述受试者的正常B细胞。

85.如权利要求84所述的IgM或IgM样抗体，其中所述癌症是CD20阳性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。

86.如权利要求84或权利要求85所述的IgM或IgM样抗体，其中所述受试者是人。

87.一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的如权利要求1至71中任一项所述的结合分子、如权利要求72所述的组合物或如权利要求78至86中任一项所述的IgM或IgM样抗体。

88.有效量的如权利要求1至71中任一项所述的结合分子、如权利要求72所述的组合物或如权利要求78至86中任一项所述的IgM或IgM样抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

89.如权利要求1至71中任一项所述的结合分子、如权利要求72所述的组合物或如权利要求78至86中任一项所述的IgM或IgM样抗体，其在治疗癌症中使用。

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