KR20180129872A - 글리코실화된 pd-l1에 특이적인 이중 기능 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

글리코실화된 pd-l1에 특이적인 이중 기능 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하고, PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하며, PD-L1의 내부화 및 분해를 촉진하는 항체가 제공된다. 글리코실화된 PD-L1 단백질 상의 특정 에피토프를 인식하고, PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하며, 세포 상의 PD-L1의 내부화를 가능하게 하는 둘 다의 이중 기능을 발휘하는 항체가 제공된다. 일부 양태에서, PD-L1 세포외 도메인의 아미노 및 카복시 말단에 글리코실화된 아미노산 잔기를 포함하는 PD-L1 폴리펩티드가 제공된다. 암, 특히 PD-L1 양성 암의 치료를 위한 상기 항체의 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

글리코실화된 PD-L1에 특이적인 이중 기능 항체 및 이의 사용 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 형태로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전체는 본원에 참고로 포함된다. 2017년 3월 23일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 24258_105007_SL.txt이고, 40,452 바이트의 크기이다.
관련 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학, 의약 및 종양학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 새로운 항체 및 암을 치료하기 위한 이의 용도가 제공된다.
배경
T 세포 활성화의 영구화는 광범위한 스펙트럼의 악성 암의 치료를 대폭 변경시켜 왔다. 예를 들어, T 세포 반응을 표적화하는 최초로 FDA 승인된 체크포인트 차단제인 이필리무맙의 개발은 전이성 흑색종 치료를 가능하게 하였다(Hodi, F.S. et al., 2010, NEJM, 363:711-723; Robert, C. et al., 2013, Clin . Cancer Res., 19:2232-2239; 및 Robert, C. et al., 2011, NEJM, 364:2517-2526). 항-세포독성 T 림프구 항원-4(anti-cytotoxic T lymphocyte antigen-4)(CTLA-4) 단클론 항체가 흑색종 환자를 치료하는데 유망한 결과를 나타낸 한편, PD-1 및 PD-L1 둘 다를 표적화하는 2 세대 체크포인트 억제제는 III 상 임상 시험에서 더 우수한 임상 활성 및 안전성을 입증하여왔다(Topalian, S.L. et al., 2012, NEJM, 366:2443-54; 및 Brahmer, J.R. et al., 2012, NEJM, 366:2455-2465). PD-L1은 또한 종양발생 가능성을 포함하기 때문에, 암 세포 진행을 유도한다(Topalian, S.L. et al., Id.; Page, D.B. et al., 2014, Ann. Rev. Med ., 65:185-202). 이의 면역억제 활성과 함께, PD-1/PD-L1 상호작용을 표적화하는 것은 PD-1을 통한 면역억제를 차단하는 한편, PD-L1을 통한 세포 진행을 감소시키는 이중 효능을 제공하며, 더욱 민감한 결과를 가질 것으로 예상된다(Topalian, S.L. et al., Id.; Brahmer, J.R. et al., Id.; 및 Hamid, O., 2013, NEJM, 369:134-144). 2014년에는, 단일 약제 또는 조합으로서 항-PD-L1 및/또는 항-PD-1 항체의 효능을 시험하는 10 개를 초과하는 임상 시험이 미국에서 진행중이었다(Page, D.B. et al., Id.). 미국 FDA는 특정 암의 치료를 위한 2 개의 항-PD-1 치료 항체인 KEYTRUDA®(펨브롤리주맙) 및 OPDIVO®(니볼루맙)를 승인하였다. 그러나, PD-L1의 병리생리학적 기능 및 조절 메커니즘은 불완전하게 정의된 채로 남아있다.
침묵된 면역 반응, 특히 이펙터 T 세포를 되살리는 것은 최근에 수술적 제거, 화학요법, 방사선요법, 및 표적화 요법을 포함하는 치료 옵션의 레퍼토리에 추가되어왔다. 항-CTLA-4 단클론 항체의 사용(Dunn, G.P., et al., 2002, Nat. Immunol., 3:991-998; 및 Leach, D.R., et al., 1996, Science, 271:1734-1736)은 최초로 전이성 흑색종을 치료하는데 있어서 성공을 입증한 한편, 이는 또한 자가면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 면역 세포에만 영향을 미치는 항-CTLA-4 항체와 달리, 항-PD-L1 항체 및 항-PD-1 항체는 세포 수준에서 작용하며, 종양 부위에서 PD-1-발현 이펙터 T 세포와 PD-L1-발현 종양 세포 사이의 상호작용을 차단한다. 이는 종양 세포와 T 세포 둘 다로부터 이중 영향을 생성하므로, 유해 효과를 제한하고, 더 우수한 치료 효능을 제공한다(Okazaki, T., et al., 2013, Nature immunology, 14:1212-1218). 이 경로를 표적화하는 더욱 견고한 치료제를 개발하기 위해 종양 세포에 대한 PD-L1 매개된 면역 억제 및 선종양유발 효과의 기본이 되는 병리생리학적 메커니즘의 우수한 이해가 필요하다. PD-1/PD-L1 경로를 성공적으로 표적화하고 면역계의 이펙터 세포를 활성화하여 표적 세포를 공격하고 암을 치료하는 새롭고 더욱 효과적인 치료제 및 방법론이 필요한 채로 남아있다.
요약
본 발명자들은 종양 세포 상에 발현된 PD-L1(CD274, PDCD1L1, 또는 B7-H1으로도 알려짐)의 글리코실화가 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포 상에 발현된 PD-1에 대한 결합을 촉진하거나 향상시키므로, 종양 세포에 대한 T 세포 활성의 억제를 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 PD-L1의 글리코실화가 세포 표면 상의 PD-L1 발현을 안정화시킬 수 있으므로, PD-L1의 내부화 및 세포내 분해를 감소시킬 수 있음을 추가로 발견하였다. 본 발명자들은 비글리코실화된 인간 PD-L1 폴리펩티드에 비해 글리코실화된 인간 PD-L1 폴리펩티드에 우선적으로 결합하는 항체를 확인하였다. 본원에 사용된 바와 같이, 글리코실화된 인간 PD-L1에 우선적으로 결합하는 상기 항체는 "항-glycPD-L1 항체"로 지칭된다. 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체는 또한 이들이 PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하고 PD-L1-발현 세포 상에서 PD-L1의 내부화 및 세포내 분해를 또한 촉진하는 이중 기능을 가지므로; 이들 항체는 "이중 기능" 항체로 지칭된다. 따라서, 상기 PD-1/PD-L1 결합을 억제하고 PD-L1 내부화 및 분해를 촉진하는 이중 기능을 나타내는 항-glycPD-L1 항체가 제공된다.
또한, 1 이상의 항-glycPD-L1 항체를 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체에서 암, 특히 세포가 PD-L1을 발현하거나 과잉발현하는 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 억제하거나 차단하며, 또한 종양 세포 상의 PD-L1의 수준을 감소시켜, PD-1/PD-L1 상호작용으로부터 야기된 면역억제를 억제하고 PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 PD-1-발현 이펙터 T 세포의 세포독성 활성의 영구화를 촉진한다. PD-1/PD-L1 상호작용을 억제하고 종양 세포 표면 상의 글리코실화된 PD-L1 수준을 감소시킴으로써, 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체는 이펙터 T 세포 반응을 향상시키고 항-종양 활성을 매개할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 종양 및 암은 상호교환적으로 사용된다. 달리 나타내지 않는 경우, 본원에 사용된 바와 같은 "PD-L1"은 PD-L1 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드, 특히 인간 PD-L1(서열번호 1의 아미노산 서열)을 지칭하며; "PD-1"은 PD-1 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드, 특히 인간 PD-1을 지칭한다.
본 발명자들은 인간 PD-L1이 서열번호 1에 기재된 바와 같은 인간 PD-L1 단백질의 아미노산 위치 N35, N192, N200 및/또는 N219의 세포외 도메인의 4 개 부위에서 글리코실화된다는 점을 추가로 발견하였다. 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체는 이들 부위 중 1 이상에 결합할 수 있으며, 예를 들어 이들 글리코실화 부위 중 1 이상에 돌연변이(예를 들어, 글리코실화 콘센서스 서열(consensus sequence) 내의 아스파라긴에 대한 글루타민의 치환)를 갖는 PD-L1에 결합하지 않을 수 있으므로, 상기 1 이상의 부위에서는 글리코실화되지 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1 글리코폴리펩티드 또는 이의 펩티드에서의 1 이상의 글리코실화 모티프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화 모티프 및 인접 펩티드를 포함하는 PD-L1 글리코펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 3 차원으로 1 이상의 글리코실화 모티프에 인접하여 위치한 펩티드 서열에 결합한다. 따라서, 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1의 입체구조 에피토프를 인식하고 이에 선택적으로 결합한다. 예로서, 특정 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만이지만, 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 이하의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합하나, 여전히 이중 항-글리코실화된 PD-L1 기능을 나타낸다. 상술한 Kd 값 사이뿐 아니라, 이와 동등한 값이 포함된다는 점을 이해해야 한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 2분의 1 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합하나, 여전히 이중 항-글리코실화된 PD-L1 기능을 나타낸다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 5 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1 단백질에 관해 나타난 Kd 보다 적어도 10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는, 예를 들어 WT PD-L1 및 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포가 혼합되고 상이하게 표지된 다음에, 예를 들어 실시예 6에 기재된 바와 같이, 예를 들어 항체가 형광 마커로 표지되었을 때 2 개의 세포 집단에 대한 측정 형광 강도(measured fluorescence intensity)(MFI)에 의해 측정되는 측정 가능한 마커로 표지된 에세이될 항체와 접촉되는 유세포분석 에세이에서 에세이된 바와 같이 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 비해 적어도 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 큰 빈도로 WT 글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 우선적으로 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 5-20 nM, 5-10 nM, 또는 10-20 nM의 친화도로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 선택적으로 결합한다. 실시양태에서, 항체는 단클론 항체이고, 더욱 바람직하게는 키메라 또는 인간화 또는 인간 항체이다. 용어 "특이적으로 결합하다" 및 "선택적으로 결합하다"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하고; PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 감소, 차단, 또는 억제하며; PD-L1의 내부화 및 세포내 분해를 촉진한다. 특정 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 비선형, 입체구조 에피토프인 PD-L1 에피토프에 결합한다. 또한, 이론에 구애됨 없이, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 아미노산을 함유하거나 PD-L1의 3 차원 구조에서 글리코실화된 아미노산에 근접한 PD-L1 에피토프에 결합하고; PD-L1의 상기 글리코실화된 영역은 특히 PD-L1/PD-1 상호작용에 관여하는 것으로 여겨진다. 글리코실화되는 PD-L1의 영역에서 에피토프 아미노산을 결합함으로써 효과적으로 작용하여, 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1/PD-1 상호작용 및/또는 종양 세포 표면 상의 PD-L1 발현의 안정화에 관여하는 글리코실화된 PD-L1 단백질의 결합 부위 또는 영역을 마스킹(mask)하거나 중화할 수 있다.
기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 이들의 결합으로 인해 이중 기능을 가하므로, 본원에서 '이중 기능' 항체로 지칭된다. 이론에 구애되지 않더라도, ECD(N35)의 N-말단 글리코실화 부위는 주로 PD-L1/PD-1 결합에 관여하는 한편, ECD의 추가 C-말단 글리코실화 부위(N192, N200 및 N219)는 주로 세포막 상의 PD-L1의 안정화에 관여하나, 이들 영역 각각은 PD-L1/PD-1 결합 및 막 상의 PD-L1의 안정화 둘 다에 기여할 수 있다. 따라서, N35에 결합하고/하거나, N35의 글리코실화를 차단하고/하거나 마스킹하는 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1/PD-1 결합을 억제할 수 있으며, N192, N200 및/또는 N219에 결합하고/하거나, N192, N200 및/또는 N219의 글리코실화를 차단하고/하거나 마스킹하는 항체는 PD-L1 내부화 및 분해를 촉진한다. 본원에 제공된 항체는 양측의 기능을 갖는다.
특별한 양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 대해 특이적인 이중 기능 항-glycPD-L1 단클론 항체 STM073(하기 표 3에도 제공되는 바와 같은 서열번호 3의 VH 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 11의 VL 도메인 아미노산 서열을 가짐) 및 STM108(하기 표 3에도 제공되는 서열번호 19의 VH 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 27의 VL 도메인 아미노산 서열을 가짐), 및 이의 결합 단편뿐 아니라 이의 키메라 및 인간화 형태가 제공된다. 일 실시양태에서, STM073은 본원의 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 H69, Y112, R113 및 K124를 포함하는 아미노산 잔기에 상응하는 PD-L1 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이 STM073 에피토프는 아미노산 서열 내에서 비연속적이며, 입체구조 에피토프이다. 일 실시양태에서, STM073 MAb 에피토프를 포함하는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 부분은 서열 VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 85)를 갖고, MAb STM073에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기 H69, Y112, R113 및 K124는 밑줄쳐 있으며, 위치 78의 아미노산 잔기 히스티딘(H)과 위치 108의 아미노산 잔기 아스파르트산(D) 사이의 파선은 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 79-107의 아미노산을 나타낸다. STM073 에피토프에 결합하는 항체 및 PD-L1에 결합하기 위해 STM073과 경쟁하는 항체가 제공된다.
다른 실시양태에서, STM108 MAb는 본원의 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 S80, Y81, K162 및 S169를 포함하는 아미노산 잔기에 상응하는 PD-L1 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이 STM108 에피토프는 아미노산 서열 내에서 비연속적이며, 입체구조 에피토프이다. 일 실시양태에서, STM073 MAb 에피토프를 포함하는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 부분은 서열 LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ(서열번호 1의 잔기 74-173)를 갖고, MAb STM108에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기 S80, Y81, K162 및 S169는 밑줄쳐 있으며, 위치 84의 아미노산 잔기 아르기닌(R)과 위치 158의 아미노산 잔기 글루탐산(E) 사이의 파선은 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 85-157의 아미노산, 즉 서열번호 1의 아미노산 19-290으로부터의 성숙 PD-L1 단백질을 나타낸다. STM108 에피토프에 결합하는 항체 및 PD-L1에 결합하기 위해 STM108과 경쟁하는 항체가 제공된다.
STM073 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 상응하는 아미노산 서열을 하기 표 3에 나타낸다. 표 3은 STM073의 성숙(즉, 단일 펩티드를 함유하지 않음) VH 및 VL 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(각각 서열번호 2, 3, 10, 및 11) 및 단일 펩티드를 함유하는 VH 및 VL 도메인 서열(각각 서열번호 87, 88, 89, 및 90) 둘 다를 제공한다. 표 3에 나타낸 중쇄 및 경쇄 도메인을 함유하는 시그널 서열의 중쇄 DNA 및 단백질 V 도메인 서열에서, 아미노 말단 시그널 서열(각각 VH 도메인의 뉴클레오티드 1-58 및 아미노산 1-19 및 VL 도메인의 뉴클레오티드 1-66 및 아미노산 1-22)은 이탤릭체로 나타낸다. 또한, 표 3에는 카밧(Kabat) 및 코티아(Chothia) 넘버링 정의 둘 다를 사용하여 STM073 MAb 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR을 나타낸다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 3의 VH 도메인 및 서열번호 11의 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하기 위해 항체와 경쟁하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 3의 VH 도메인 및 서열번호 11의 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 도메인 및/또는 서열번호 11의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VL 도메인을 포함하고, PD-1에 대한 글리코실화된 PD-L1의 결합을 억제하거나 차단한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 PD-1에 대한 글리코실화된 PD-L1의 결합을 차단한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 항체는 PD-1에 대한 글리코실화된 PD-L1의 결합을 차단한다. 바람직하게는, 이들 항체는 인간 프레임워크 영역을 갖고, 즉 STM073의 인간화 형태이며, 선택적으로 인간 불변 도메인을 갖는다. 또한, 인간 프레임 워크 영역 및, 선택적으로 인간 불변 영역에 대해 AbM, 콘택트(Contact) 또는 IMGT 정의된 CDR을 사용한 STM073의 인간화 형태가 제공된다. 1 이상의 아미노산 치환이 인간화 항체의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 내에서 이루어져, 결합 친화도를 개선할 수 있다는 점이 당업자에게 이해될 것이다.
실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 2분의 1 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 5 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1 단백질에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 6에 기재된 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 결합하기 위한 MFI에 비해 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 큰 WT PD-L1을 발현하는 세포에 대한 MFI 만큼 발현된 결합을 나타낸다. 실시양태에서, STM073 항체, 또는 이의 인간화 또는 키메라 형태, 또는 결합을 위해 상술한 것과 경쟁하는 항체의 글리코실화된 PD-L1에 대한 결합 친화도는 상한값 및 하한값을 포함하는 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하고, 이펙터 T 세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1의 상호작용을 특히 억제하며, 특히 PD-L1의 내부화 및 세포내 분해를 증가시킴으로써 종양 세포의 표면 상의 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1의 수준을 또한 감소시킨다. 본원에 제공된 항-글리코실화된 PD-L1 항체에 의해 결합한 다음에, 종양 세포 상에서 발현되는 PD-L1의 내부화는 항-glycPD-L1 항체의 유익한 특징이며, 이는 덜 글리코실화된 PD-L1이 T 세포 상의 PD-1과의 상호작용을 위해 종양 세포 상에서 이용 가능하여, 종양 세포에 대한 T 세포 세포독성 이펙터 기능을 증가시키고, PD-L1/PD-1 상호작용으로부터 야기된 T 세포 아네르기(anergy)를 감소시키기 때문이다.
다른 특별한 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합하는, 항-glycPD-L1 단클론 항체 STM108인 항체, 또는 이의 결합 단편이 제공된다. STM108 MAb의 성숙 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 상응하는 아미노산 서열(서열번호 18, 19, 26 및 27)을 하기 표 3에 나타낸다. 미처리된 중쇄 V 도메인 서열(즉, N-말단에 시그널 서열을 함유함)의 DNA 및 아미노산 서열을 또한 표 3(서열번호 91 및 92)에 나타내며, 아미노 말단 시그널 서열은 이탤릭체로 나타낸다(VH 도메인의 뉴클레오티드 1-57 및 아미노산 1-19). 또한, 표 3에는 카밧 및 코티아 정의에 따라, STM108 MAb 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR을 나타낸다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열의 VH 도메인 및 서열번호 27의 아미노산 서열의 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 서열번호 19의 아미노산 서열의 VH 도메인 및 서열번호 27의 아미노산 서열의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 도메인 및 서열번호 27의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25, 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열에 대하여, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25, 또는 이의 조합의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인, 및/또는 (b) 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또한, 인간 프레임 워크 영역 및, 선택적으로 인간 불변 영역에 대해 AbM, 콘택트 또는 IMGT 정의된 CDR을 사용한 STM108의 인간화 형태가 제공된다. 바람직하게는, 이들 항체는 인간 프레임워크 영역을 갖고, 즉 STM108의 인간화 형태이며, 선택적으로 인간 불변 도메인을 갖는다.
실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. STM108의 인간화 형태는 CDR 및/또는 프레임워크 영역에서 1 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가져, 항원 친화도와 같은 항체의 1 이상의 특성을 개선할 수 있다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 2분의 1 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 5 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1 단백질에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 6에 기재된 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 결합하기 위한 MFI에 비해 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 큰 WT PD-L1을 발현하는 세포에 대한 MFI 만큼 발현된 결합을 나타낸다. 실시양태에서, STM108 MAb, 또는 이의 키메라 또는 인간화 형태의 글리코실화된 PD-L1에 대한 결합 친화도는 상한값 및 하한값을 포함하는 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하고, 이펙터 T 세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1의 상호작용을 특히 억제한다. 항체는 바람직하게는 인간 프레임워크 영역 및 특정 실시양태에서 인간 불변 도메인을 갖는다.
또한, 서열번호 1의 인간 PD-L1 서열의 펩티드 부분인 인간 PD-L1 아미노산 서열 DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 86) 내의 에피토프에 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 단클론 항체가 본 실시양태에 의해 포함된다. 실시양태에서, 항체에 의해 결합된 에피토프는 비연속 아미노산을 포함하고, 상기 에피토프는 입체구조 에피토프이다. 실시양태에서, 항체는 다음 사열에서 밑줄친 아미노산 잔기로 나타낸 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 Y112, R113 및 S117을 포함하는 비연속 아미노산 잔기에 상응하는 인간 PD-L1 에피토프에 특이적으로 결합한다: DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 86).
다른 양태에서, 서열이 서열번호 1의 성숙 인간 PD-L1 폴리펩티드 서열 내에 위치한 VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 85), 또는 DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 86)로부터 선택되는 아미노산 서열 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 또는 이의 결합 단편, 특히 인간화 또는 인간 항체가 제공된다. 항체는 바람직하게는 인간 프레임워크 영역 및 특정 실시양태에서 인간 불변 도메인을 갖는다. 다른 양태에서, 서열번호 1의 아미노산 74 내지 84 및 158 내지 173인 아미노산 서열 LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 또는 이의 결합 단편, 특히 인간화 또는 인간 항체가 제공된다. 항체는 바람직하게는 인간 프레임워크 영역 및 특정 실시양태에서 인간 불변 도메인을 갖는다.
특정 실시양태에서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 H69, Y112, R113 및 K124를 포함하는 에피토프에 결합하는 단리된 항-glycPD-L1 항체, 특히 단클론, 인간화, 또는 인간 항체가 제공된다. 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 때, 항체가 다음 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하도록, 글리코실화된 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 항-glycPD-L1 항체가 제공된다: 서열번호 1의 H69, Y112, R113 및 K124. 다른 실시양태에서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 S80, Y81, K162 및 S169를 포함하는 에피토프에 결합하는 단리된 항-glycPD-L1 항체, 특히 단클론, 인간화, 또는 인간 항체가 제공된다. 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 때, 항체가 다음 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하도록, 글리코실화된 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 항-glycPD-L1 항체가 제공된다: 서열번호 1의 S80, Y81, K162 및 S169.
다른 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 때, 항체가 다음 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하도록, 글리코실화된 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 특히 단클론, 인간화, 또는 인간 항체가 제공된다: 서열번호 1의 Y112, R113 및 S117.
다른 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 때, 항체가 서열번호 1의 V68 내지 V128의 아미노산 영역 내 또는 서열번호 1의 D108 내지 V128의 아미노산 영역 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합하도록, 글리코실화된 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 특히 단클론, 인간화, 또는 인간 항체가 제공된다. 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 때, 단클론 항체가 다음 그룹의 아미노산 잔기에 결합하도록, 글리코실화된 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 제공된다: 서열번호 1의 V68 내지 V128의 아미노산 영역 내의 H69, Y112, R113 및 K124. 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 때, 단클론 항체가 다음 그룹의 아미노산 잔기에 결합하도록, 글리코실화된 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 제공된다: 서열번호 1의 D108 내지 V128의 아미노산 영역 내의 Y112, R113, S117.
양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 1의 L74 내지 R84 및/또는 E158 내지 Q173의 영역 내, 및 바람직하게는 서열번호 1의 잔기 S80, Y81, K162 및 S169 중 1 이상에 결합한다.
다른 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 때, 항체가 PD-L1 단백질(서열번호 1)의 적어도 아미노산 영역 V68-V128 또는 적어도 아미노산 영역 D108-V128, 또는 이의 조합에 결합하도록, 비글리코실화 된 것에 비해 글리코실화된 인간 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 또는 이의 결합 단편, 특히 단클론, 인간화, 또는 인간 항체가 제공된다. 항체는 바람직하게는 인간 프레임워크 영역 및 특정 실시양태에서 인간 불변 도메인을 갖는다.
다른 양태에서, (a) 서열번호 5, 서열번호 21, 서열번호 4 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 7, 서열번호 23, 서열번호 6 또는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 9, 서열번호 25, 서열번호 8 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열번호 12 또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 14 또는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 16 또는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 실시양태에서, 항체는 인간 프레임워크 영역, 및 선택적으로 인간 항체 불변 도메인을 갖는 인간화 항체이다.
다른 양태에서, VH 도메인을 코딩하는 서열번호 2 또는 18로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 및/또는 VH 도메인을 코딩하는 서열번호 10 또는 26으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 실시양태는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 VH 도메인을 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공하되, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90-98% 동일하다. 다른 실시양태는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 VL 도메인을 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공하되, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19 또는 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90-98% 동일하다. 실시양태에서, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 2 또는 18, 또는 서열번호 10 또는 26과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상 동일하다.
특정 양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 IgG, IgM, IgA, 이의 이소형(isotype), 예컨대 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG4, 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 Fab', F(ab')2, F(ab')3, 1가 scFv, 2가 scFv, 이중특이적 항체, 이중특이적 scFv, 또는 단일 도메인 항체이다. 일부 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 재조합적으로 생성된다. 추가 양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 이미징제, 화학치료제, 세포독성제, 독소, 또는 방사성핵종에 콘쥬게이트된다.
양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 배지 내에 이중 기능 항-glycPD-L1 항체(예를 들어, 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 선택적으로 및 우선적으로 결합하고 본원에 기재된 바와 같은 PD-L1의 내부화 및/또는 분해를 유발하는 항체)가 제공된다.
추가 양태에서, 인간 PD-L1의 세포외 도메인(ECD) 내의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7 개(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상)의 연속 아미노산의 펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드가 제공된다. 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 인간 PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 인간 PD-L1의 적어도 7 개(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상)의 펩티드를 포함하고, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 아미노산 중 적어도 하나는 글리코실화된다. 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 면역원성 폴리펩티드(예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), KLH)에 융합되거나 콘쥬게이트된다. 특정 양태에서, 폴리펩티드는 이의 아미노(N)- 또는 카복시(C)- 말단에서 시스테인(Cys) 잔기를 추가로 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 Cys 잔기에서 다이설파이드 연결에 의해 면역원성 폴리펩티드에 콘쥬게이트될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 인간 PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 위치에서 글리코실화된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 PD-L1 펩티드는 항-glycPD-L1 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용된된다.
추가 양태에서, 인간 PD-L1의 ECD 내의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7 개(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상)의 연속 아미노산의 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 상기 아미노산 중 적어도 하나가 글리코실화되며, 상기 폴리펩티드가 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 비히클 내에 제형화되는 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 인간 PD-L1 폴리펩티드의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7 개의 연속 아미노산의 펩티드 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, PD-L1 폴리펩티드의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 아미노산 중 적어도 하나가 글리코실화되며, 상기 폴리펩티드가 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 비히클 내에 제형화되는 면역원성 조성물이 제공된다. 일부 양태에서, 면역원성 조성물은 백반 또는 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant)와 같은 아쥬반트를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본원에 기재된 바오 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체와 같은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 구체적 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 MAb STM073 또는 STM108 중 하나의 인간화 또는 키메라 형태이다. 다른 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 결합을 위해 MAb STM073 또는 MAb STM108과 경쟁하는 항체이다. 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 암 세포는 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1에 대해 양성이다. 암 세포는 또한, 비제한적으로, EGFR과 같은 1 이상의 다른 암 세포 마커에 대해 양성이다. 비제한적 실시양태에서, 대상체에세 치료될 암, 질환 또는 병리학은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암, 피부암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암이다. 특정 실시양태에서, 치료될 암은 부신암, 항문암, 담도암, 골암, 성인에서의 뇌/CNS 종양, 소아에서의 뇌/CNS 종양, 남성에서의 유방암, 청소년에서의 암, 소아에서의 암, 젊은 성인에서의 암, 원발부위 불명암, 캐슬맨병(Castleman disease), 자궁경부암, 자궁내막암, 유잉 패밀리 종양(Ewing family tumor), 안구암, 담낭암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor)(GIST), 임신 영양막 질환, 호지킨병(Hodgkin's disease), 카포시육종, 신장암, 후두 또는 하인두암, 백혈병(예를 들어, 성인 급성 림프성(adult acute lymphocytic)(ALL), 급성 골수성(acute myeloid)(AML), 만성 림프성(chronic lymphocytic)(CLL), 만성 골수성(chronic myeloid)(CML), 만성 골수단핵구성(chronic myelomonocytic)(CMML), 소아 백혈병), 폐암(예를 들어, 비소세포, 소세포), 폐 카르시노이드 종양, 림프종, 피부의 림프종, 악성 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 비강암, 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 소아에서의 비-호지킨 림프종, 구강암, 구인두암, 골육종, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종(예를 들어, 성인 연조직암), 피부암(예를 들어, 기저 및 편평 세포, 흑색종, 메르켈 세포(merkel cell)), 소장암, 위암, 고환암, 흉선암, 갑상선암, 자궁육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 또는 빌름스 종양(Wilms tumor)이다.
특정 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 약학적으로 허용 가능한 조성물로 제형화된다. 추가 양태에서, 항체는 전신으로 또는 비경구적으로 투여된다. 특별한 양태에서, 항체는 전신으로, 정맥내로, 피내로, 종양내로, 근육내로, 복강내로, 피하로, 척추강내로 또는 국소로 투여된다. 다른 양태에서, 1 이상의 유형의 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 치료를 필요로 하는 환자에게 공동-투여될 수 있다. 항체의 공동-투여는 다른 항체의 이전, 그 이후, 또는 그와 동시에 하나의 항체의 투여를 포함할 수 있다.
양태에서, 암 또는 종양, 특히 암 또는 종양 세포 표면 상에 PD-L1을 발현하는 암 또는 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, PD-L1과 PD-1의 상호작용을 억제하거나 차단하고, 면역억제를 예방하며, 대상체의 이펙터 T 림프구에 의한 암 또는 종양 세포의 사멸을 촉진하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 STM073 또는 STM108의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 글리코실화된 PD-L1에 선택적으로 결합하기 위해 이들 항체 중 하나 또는 둘 다와 경쟁하는 항체이다.
일부 양태에서, 방법은 적어도 제2 항암 요법 또는 약물을 항-glycPD-L1 항체로 치료받고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 제2 항암 요법은, 비제한적으로, 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 냉동요법, 호르몬 요법, 면역요법 또는 사이토카인 요법으로 구성될 수 있다. 제2 항암 약물은 또한 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 당업계의 숙달된 임상의, 전문 의료진(예를 들어, 종양학자)에 의해 사실상 경험적으로 결정될 수 있을 것이다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 적어도 제2 항암 요법 또는 약물의 투여는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 투여 이전, 그 이후, 또는 그와 동시에 발생할 수 있다.
다른 양태에서, 암을 갖는 환자가 PD-L1과 PD-1의 결합을 차단하는 약제를 이용한 치료로부터 이득을 얻을 수 있는지(즉, 치료에 대한 후보인지)를 결정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 사용하여 환자의 암 세포의 샘플로부터 유래된 세포 상의 글리코실화된 PD-L1의 존재에 대해 시험하는 단계를 포함하고, 환자의 암 세포에 대한 항체의 결합을 검출하는 것은 환자가 요법에 대한 후보임을 나타낸다. 방법은 환자의 암 세포가 글리코실화된 PD-L1 단백질의 발현에 대해 양성인 것으로 밝혀진 경우에, PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 예방하는 약제의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 예방하는 약제는 항-glycPD-L1 항체, 바람직하게는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 또는 이의 조합이다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체 및/또는 항-PD-1 항체는 다른 항암 약물 또는 치료제와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 본원에 기재된 바와 같은 다른 항-glycPD-L1 항체와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 방법은 환자로부터 암 세포 샘플을 얻는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 생물학적 샘플에서 PD-L1 단백질의 글리코실화, N-연결된 글리코실화, 또는 N-글리코실화를 평가하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 PD-L1-함유 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 방법은 시험관내(in vitro) 방법 또는 에세이이다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 세포 샘플, 조직 샘플, 체액(예를 들어, 혈장, 혈청, 혈액, 소변, 가래, 림프, 복수액, 복강내 유체, 뇌 또는 척수액 등)이다. 특별한 실시양태에서, 샘플은 세포 샘플 또는 암 또는 종양을 갖는 대상체로부터 얻어진 종양 또는 암으로부터의 세포 샘플이다. 상기 암 또는 종양 세포 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체를 사용하여 암 또는 종양 세포 표면 상의 글리코실화된 PD-L1에 대해, 특히 글리코실화된 PD-L1이 대상체의 암 또는 종양 세포 상에 존재하는지, 상기 세포가 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체를 이용한 치료를 위한 적절한 표적일 수 있는지를 결정하기 위해 에세이될 수 있다.
다른 양태에서, 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 실시양태에 따른 폴리펩티드(예를 들어, 인간 PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7 개의 연속 아미노산의 단편을 포함하고, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 상기 아미노산 중 적어도 하나가 글리코실화되는 폴리펩티드)를 대상체(예를 들어, 동물)에게 투여하는 단계 및 대상체로부터 항체를 단리시키는 단계를 포함한다. 예로서, 상기 동물은 비인간 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 또는 인간일 수 있다. 특정 양태에서, 방법은 당업계에 알려진 방법 및 절차를 사용하여 항체의 CDR을 확인하는 단계 및 CDR 주변의 서열(즉, 프레임워크 서열)을 인간화하여 인간화 항체를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 또 추가적인 양태에서, 방법은 인간화 항체를 재조합적으로 발현하는 단계를 포함한다. 따라서, 추가 실시양태에서, 상술한 방법에 의해 생성된 단리된 항체가 제공된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드(예를 들어, 인간 PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7 개의 연속 아미노산의 단편을 포함하고, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 상응하는 상기 아미노산 중 적어도 하나가 글리코실화되는 폴리펩티드)의 에피토프, 예컨대 입체구조 에피토프에 선택적으로 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 다른 양태는 면역원성 항원으로서 실시양태의 폴리펩티드(예를 들어, 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드)의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응, 예를 들어 항원을 향한 항체 반응을 생성하도록 대상체를 면역시키는 방법을 제공한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 각각 글리코실화된 PD-L1의 다른 항원 결합 도메인의 에피토프와 중첩되지 않는 에피토프에 결합하고, 적어도 하나의 결합 도메인(및 특정 실시양태에서, 결합 도메인 둘 다)이, 예를 들어 본원에 열거된 글리코실화 부위 중 1 이상을 함유한 에피토프에 결합함으로써 PD-L1의 글리코실화된 형태에 우선적으로 결합하는 2 개의 상이한 항원 결합 도메인을 갖는 비파라토프(biparatopic) 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 이들 항체는 내부화, 리소좀 수송 및 분해를 촉진하는 세포 표면 단백질을 교차결합시킬 수 있다. 상기 비파라토프 항체는 당업계에 알려지고 공동-계류중인 미국 가특허 출원 제62/361,298호에 기재된 바와 같은 스크리닝 방법을 사용하여 PD-L1의 비글리코실화된 형태에 비해 글리코실화된 PD-L1 단백질에 우선적으로 결합하는 항체에 대해 스크리닝하고, 글리코실화된 PD-L1의 비중첩 에피토프에 결합하고, 바람직하게는 하나 또는 둘 다 비글리코실화된 형태와 비교하여 PD-L1의 글리코실화된 형태에 우선적으로 결합하는 2 개의 항체를 확인함으로써 생성될 수 있다. 글리코실화 함유 에피토프 또는 항체가 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 결합하는 본원에 기재된 에피토프 중 임의의 것에 대한 항체가 사용될 수 있다. 2 개의 항원 결합 도메인은, 예를 들어 Dimasi et al., J. Mol . Biol ., 393:672-692 (2009)에 기재된 바와 같이 항체 분자 내에 배열될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항원 결합 도메인 중 하나는 단일쇄 Fv의 형식이 된 다음에, 예를 들어 펩티드 링커를 통해 다른 항원 결합 도메인을 갖는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N 말단 또는 CH3 도메인의 C-말단에 연결되도록 조작된다.
다른 양태에서, 본원에 기재된, 특히 글리코실화된 PD-L1에 결합한 다음에, 효과적인 내부화 활성을 나타내는 항-glycPD-L1 항체가 항신생물 약물 및 약제에 화학적으로 연결되어 본원에 기재되고 예시된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체-약물 콘쥬게이트(antibody-drug conjugate)를 생성하는 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-glycPD-L1 MAb ADC는 종양 또는 암 세포를 사멸시키고 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 항신생물 요법에 매우 효과적이다. 실시양태에서, ADC의 항-glycPD-L1 항체 성분은 이중특이적, 다중특이적, 비파라토프, 또는 멀티파라토프 항체, 또는 이의 항원 결합 부분이다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 항유사분열제, 예컨대 마이탄신(maytansine) 유도체, 예를 들어 DM1 또는 DM4와 같은 마이탄시노이드, 또는 튜불린-중합성 아우리스타틴, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같은 모노메틸 아우리스타틴(monomethyl auristatin) E(MMAE) 또는 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)에 화학적으로 연결된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체에 대한 링커는 세포외 유체에서는 안정적이지만, ADC가 종양 또는 암 세포로 들어가면 카텝신에 의해 절단되어, MMAE 또는 다른 독성 약물의 항유사분열 메커니즘을 활성화시킨다. 실시양태에서, ADC의 항체 성분은 본원에 기재된 바와 같은 STM073 MAb 또는 STM108 MAb이다. 실시양태에서, STM108 MAb-함유 ADC(STM108-ADC)는 절단성 링커를 통해 MMAE에 화학적으로 연결된다. 특별한 실시양태에서, STM108-ADC는 STM108 MAb가 이의 C-영역 내의 시스테인 잔기를 통해 말레이미드 및 카프로산(maleimide and caproic acid)(MC) 부착기에 화학적으로 연결되고, 이는 발린(Val) 및 시트룰린(Cit)으로 구성된 "vc"와 같은 카텝신 절단성 링커에 화학적으로 연결되며, 이는 스페이서 "PAB", 즉 파라아미노벤조산(paraminobenzoic acid)에 화학적으로 부착되고, 이는 MMAE 세포독소에 화학적으로 연결되어, 성분 구조에 의해 STM108-MC-vc-PAB-MMAE로 표시되는 ADC를 생성한다.
도면의 간단한 설명
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 비제한적으로, 본원에 기재된 실시양태의 특정 양태를 추가로 나타내기 위해 포함된다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 도시된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 이 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요 수수료의 지불시 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1a-1h. PD-L1은 암 세포에서 글리코실화된다 . 1a. 원발성 유방암 환자 샘플에서 PD-L1 단백질의 발현. 대표적인 유방암 환자 샘플의 웨스턴 블롯 분석. 1b. 4 개의 대표적인 유방암 세포주, 4 개의 흑색종 세포주, 3 개의 폐암 세포주 및 3 개의 결장암 세포주에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. 1c. A431 세포의 shCTRL 및 2 개의 독립 shPD-L1 안정 클론에서 PD-L1 발현의 웨스턴 블롯 분석. PD-L1을 shPD-L1#5 클론으로 일시적으로 형질주입하였다. d. PNGase F 처치를 이용하거나 이용하지 않은 정제된 PD-L1 단백질의 당단백질 염색. 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색된 패널은 PD-L1 단백질의 총량을 나타낸다. 레인(lane) 4 및 5를 나타내는 상부 밴드는 PNGase F의 로딩으로 인한 것이다. (-) Ctrl, 비-당단백질에 대한 대조군; (+) Ctrl, 당단백질에 대한 대조군. e. PD-L1-GFP, HA-PD-L1, 및 PD-L1-Flag 단백질의 글리코실화 패턴. 세포 용해액을 PNGase F 및 Endo H로 처치하고, 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. f. GFP- 태그된 PD-L1 전장(WT), 세포외 도메인(ECD), 또는 세포내 도메인(intracellular domain)(ICD)을 293T 세포에서 일시적으로 발현하였다. 이어서, 세포를 5 ㎍/mL 튜니카마이신(tunicamycin)(TM)을 이용하거나 이용하지 않고 밤새 처치하였다. PD-L1의 단백질 발현을 웨스턴 블롯을 사용하여 시험하였다. g. 전장 PD-L1 단백질을 나타내는, 본원에 기재된 실험 연구에서 사용된 바와 같은 대표적인 PD-L1 단백질 발현 구축물 및 이의 성분 세포외 도메인(ECD), 세포내 도메인(ICD), 시그널 펩티드(signal peptide)(SP), 막관통 도메인(transmembrane domain)(TM)의 도식적 도표. 도표에서, PD-L1의 ECD 도메인의 4 개의 N-글리코실화 부위(NXT 모티프)를 적색으로 나타낸다. 숫자는 PD-L1 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다. h. PD-L1 WT 및 PD-L1의 글리코실화 돌연변이(NQ 돌연변이)의 단백질 발현 패턴의 웨스턴 블롯 분석. 레인 14는 튜니카마이신(TM)으로 밤새 처치된 비글리코실화된, 야생형(WT) PD-L1을 나타낸다. 도면에서, 흑색 원은 글리코실화된 PD-L1을 나타내고, 흑색 화살표는 비글리코실화된 PD-L1을 나타낸다.
도 2a-2g. 글리코실화는 PD-L1 발현을 안정화시키고 암 세포 -연관된 면역억제를 위해 필요하다. a 및 b: PD-L1-Flag 발현 293T 세포에서 PD-L1 단백질의 웨스턴 블롯 분석의 결과. 세포를 표시된 간격에서 20 mM 사이클로 헥시미드(cycloheximide)(CHX)(A) 및 5 μM MG132, 프로테오좀(proteosome) 억제제(B)로 처치하고 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 농도계를 사용하여 PD-L1 단백질의 강도를 정량화하였다. c. (a)에 기재된 바와 같이 결정된 PD-L1WT, 및 PD-L1 글리코실화 돌연변이 N35Q, N192Q, N200Q, N219Q, 및 4NQ의 단백질 안정성의 웨스턴 블롯 분석. 아래의 웨스턴 블롯 분석 결과: 농도계를 통한 PD-L1 WT 및 4 개의 NQ 돌연변이의 반감기의 정량화. d. TM 또는 항-PD-L1 항체 치료를 이용하거나 이용하지 않은 PD-1과 PD-L1의 상호작용. 공초점 영상은 PD-L1 WT 발현 293T 세포의 막 상의 결합된 PD-1/Fc 융합 단백질을 나타낸다(좌측의 염색 패널). PD-L1/PD-1 상호작용 에세이에서 결합된 PD-1 단백질의 정량화(우측 플롯). e. PD-1과 PD-L1 WT 또는 4NQ 단백질의 결합 친화도. PD-L1 WT 또는 4NQ 발현 293T 세포의 용해액을 PD-1/Fc 융합 단백질이 있거나 없이 항온처리하였다. 이어서, PD-L1 단백질을 항-Flag 항체로 면역침강시키고 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. f. PD-L1 WT 또는 4NQ 발현 293T 세포에서 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 측정하는 공동-면역침강법. g. 저캇(Jurkat) T 세포 및 PD-L1 WT 또는 4NQ 발현 세포의 공동-배양액에서 가용성 IL-2 발현의 수준. (d), (e) 및 (g)에 나타낸 실험 전에 세포를 MG132로 미리 처치하였다. 도면에서, 흑색 원은 글리코실화된 PD-L1을 나타내고; 화살표는 비글리코실화된 PD-L1을 나타낸다; TM: 튜니카마이신; *은 스튜던트 t 테스트(Student's t test)에 의해 통계적으로 유의미함을 나타낸다. 모든 오차 막대는 3 개의 독립 실험의 평균±SD로 표현한다.
도 3a-3d. 암 세포에서 PD-L1 단백질의 발현. a. 폐암 세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. b. 결장암 세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. c. 유방암 세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. d. 난소암 세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. 흑색 원=글리코실화된 PD-L1; 화살표=비글리코실화된 PD-L1.
도 4a-4d. PD-L1은 암 세포에서 글리코실화 된다. a. 상이한 항-PD-L1 항체를 사용한 암 세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. 상이한 항체를 사용하여 PD-L1의 발현을 분석하기 위해 4 개의 BLBC 세포주, HCC1937, SUM149, MB-231 및 BT20, 및 2 개의 비-BLBC 세포주, MB-483 및 MB-474를 선택하였다. b. MDA-MB-231 및 A431 세포의 shCTRL 및 2 개의 독립 shPD-L1 안정 클론에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. c. Flag-PD-L1 및 PD-L1의 shRNA에 대한 이중-발현 구축물의 도식적 도표. d. MDA-MB-231 및 A431 세포에서 PD-L1 단백질의 글리코실화 패턴. 세포 용해액을 PNGase F로 처치하고 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 흑색 원=글리코실화된 PD-L1; 화살표=비글리코실화된 PD-L1.
도 5a-5e. 글리코실화된 PD-L1 단백질 및 비글리코실화된 PD-L1 단백질의 발현. a. 튜니카마이신(TM) 처치된 세포에서 PD-L1-Myc, PD-L1-Flag, 및 HA-PD-L1 단백질의 웨스턴 블롯 분석. b. 튜니카마이신(TM) 처치되거나 미처치된 세포에서 PD-L1-GFP-WT, PD-L1-GFP-ECD 및 PD-L1-GFP-ICD 단백질의 웨스턴 블롯 분석. c. 튜니카마이신(TM) 처치된 세포에서 PD-L1-Myc, PD-L1-Flag, HA-PD-L1, PD-L1-GFP-WT, PD-L1-GFP-ECD 및 PD-L1-GFP-ICD 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 글리코실화된 PD-L1 단백질(흑색 막대) 또는 비글리코실화된 PD-L1 단백질(적색 막대)의 강도를 농도계 정량화에 의해 결정하였다(웨스턴 블롯 분석 아래의 막대 그래프에서). d. 상기 (c)에서 나타낸 막대 그래프로부터 얻어진 글리코실화된 PD-L1 단백질(흑색 막대) 또는 비글리코실화된 PD-L1 단백질(적색 막대)의 강도의 평균. 오차 막대는 표준 편차(standard deviation)(SD)를 나타낸다. e. PD-L1 발현 HEK 293T 세포에서 PD-L1 단백질의 글리코실화 패턴. 세포 용해액을 PNGase F 또는 O-글리코시다아제를 이용하거나 이용하지 않고 처치하였으며, 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 흑색 원=글리코실화된 PD-L1; 화살표=비글리코실화된 PD-L1. 튜니카마이신은 단백질의 N-연결된 글리코실화를 억제하는 뉴클레오티드 항생제이다.
도 6a 및 6b. PD-L1 단백질의 N- 글리코실화 부위. 상이한 종으로부터의 PD-L1 아미노산 서열의 서열 정렬. 4 개의 NXT 모티프, N35, N192, N200, 및 N219를 상자로 표시하고 적색으로 나타내었으며, 2 개의 비-NXT 모티프, N63 및 N204를 녹색으로 나타내었다. 적색 상자=보존적 NXT 모티프. 도 6a. 콘센서스 서열(서열번호 74); Q9NZQ7_인간(서열번호 75); Q9EP73_마우스(서열번호 76); D4AE25_래트(서열번호 77); C5NU11_소(서열번호 78); Q4QTK1_돼지(서열번호 79); 및 F7DZ76_말(서열번호 80). 도 6b: 콘센서스 서열(서열번호 94); Q9NZQ7_인간(서열번호 95); Q9EP73_마우스(서열번호 96); D4AE25_래트(서열번호 97); C5NU11_소(서열번호 98); Q4QTK1_돼지(서열번호 99); 및 F7DZ76_말(서열번호 100).
도 7a-7h. N - 글리코펩티드의 LC-MS/MS-이용 확인. HEK 293 세포로부터의 PD-L1의 4 개의 N-글리코실화 부위, N35(a 및 e), N192(b 및 f), N200(c 및 g), 및 N219(d 및 h) 각각에 상응하는 N-글리코펩티드의 LC-MS/MS-이용 확인. 글리코폼의 대표적인 서브세트가 검출되었을 때, 용출 기간(도면에 표지된 바와 같음)에 걸쳐 평균화된 스펙트럼으로서 LC-MS 프로파일(a-d)을 나타낸다. 각각의 N-글리코실화 부위에 대해, 하나의 대표적인 HCD MS2 스펙트럼(e-h)은 펩티드 서열을 정의하는 b 및 y 이온과 함께, y1 이온(N-글리코실화된 Asn에 부착된 GlcNAc를 수반하는 트립신 펩티드 백본(backbone))의 검출을 기본으로 하는 이의 확인을 예시하도록 나타낸다. 글리칸에 사용된 만화 기호(삽도 참고)는 기능적 글리코믹스 컨소시엄(Consortium for Functional Glycomics)에 의해 권장된 표준 표현을 따른다: 추가 Hex 및 HexNAc는 시험적으로 코어 푸코실화되거나(core fucosylated) 되지 않을 수 있는 트리만노실 코어(trimannosyl core)(Man3-GlcNAc2)로부터의 lacNAc(Gal-GlcNAc) 또는 lacdiNAc(GalNAc-GlcNAc) 확장으로서 지정하였다. 도 7e-7h에 도시된 서열은 각각 서열번호 81-84에 기재된다.
도 8a-8h. PD-L1 글리코실화는 PD-L1의 단백질 안정성 및 면역억제 기능을 변경시킨다. a-b. PD-L1-Flag 발현 HEK 293T 세포에서 PD-L1 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 표시된 간격(시) 동안 튜니카마이신을 이용하거나 이용하지 않고 처치된 세포를 20 mM 사이클로 헥시미드(CHX)(A) 및 5 μM MG132(B)로 처치하고 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. c. 표시된 시간 동안 튜니카마이신을 이용하여 처치되거나 처치되지 않았으며, 20 mM 사이클로 헥시미드(CHX)로 처치된 A431 세포 내의 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. 하부 패널은 글리코실화 대 비글리코실화된 PD-L1 단백질의 농도계 정량화를 나타낸다. d. PD-L1/PD-1 상호작용 에세이의 도식적 도표. e. A431 세포 내의 막 위치된 PD-L1 WT 또는 4NQ 돌연변이를 나타내는 공초점 영상. f. PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 단백질의 막 위치. 막 위치된 PD-L1 WT 또는 4NQ 단백질의 비오틴화 후에, 비오틴화된 단백질을 스트렙타비딘 아가로스에 의해 풀-다운시켰다(pull-downed). 막 위치된 PD-L1 WT 또는 4NQ 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다. 샘플의 농도계 정량화로부터 얻어진 막 결합된 PD-L1 WT 또는 4NQ 단백질의 비가 블롯 아래에 나타난다. g. PD-L1 WT-, N35Q-, N192Q-, N200Q-, N219Q-, 또는 4NQ-발현 세포에서 PD-1과 PD-L1 단백질의 상호작용. 모든 오차 막대는 3 개의 독립 실험의 평균±SD로 표현한다. h. 각각 PD-1/PD-L1을 통한 T 세포/종양 세포 상호작용 이후, IL-2 생성을 검출하도록 설계된 ELISA의 도식적 도표. PD-L1-발현 종양 클론을 PD-1을 과잉발현한 저캇 T 세포와 함께 공동-배양하였다. 저캇 세포로부터의 IL-2 생성을, 예를 들어 하기 실시예 1, 4, 및 5에 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 측정하였다. a-c에서, 흑색 원=글리코실화된 PD-L1; 화살표=비글리코실화된 PD-L1.
도 9a-9e. PD-L1의 글리코실화는 암 세포 연관된 면역억제를 위해 필요하다. a. 막 결합된 PD-1과 BT549 세포 상에 발현된 PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 돌연변이 단백질의 상호작용을 측정하는 유세포분석. 실험 전에 세포를 MG132로 미리 처치하였다. b. 최종 시점에서 PD-L1과 PD-1 사이의 동적 상호작용을 나타내는 타임 랩스(Time lapse) 현미경 영상. PD-L1 WT 또는 4NQ 발현 세포의 적색 형광(핵 제한된 RFP) 및 녹색 형광(녹색 형광 표지된 PD-1/Fc 단백질) 병합된 영상(20x). (b)의 우측의 운동 그래프는 매 시점에서 BT549 세포 상에 발현된 PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 단백질에 대한 PD-1/Fc 단백질의 정량적 결합을 나타낸다. c. BT549 세포 상에 발현된 PD-L1 WT 또는 4NQ PD-L1 단백질을 포함하는 T 세포 매개된 종양 세포 사멸(T cell-meditated tumor cell killing)(TTK) 에세이. 96 시간에 카스파제 3/7 기재의 존재 하의 PD-L1 WT 또는 4NQ 발현 세포, 및 PD-1-발현 T 세포 공동-배양액의 대표적인 상, 적색 형광(핵 제한된 RFP), 및/또는 녹색 형광(NucViewTM 488 Caspase 3/7 기재) 병합된 영상(10x). T 세포를 항-CD3 항체(100 ng/mL) 및 IL-2(10 ng/mL)로 활성화시켰다. 녹색 형광 세포를 사멸된 세포로서 계수하였다. 사멸된 세포 대 PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 단백질과 결합된 총 세포의 정량적 비는 영상의 우측의 막대 그래로 나타낸다. d. PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 돌연변이 단백질을 발현하는 주사된 4T1 세포로부터 유래된 종양을 보유한 BALB/c 마우스에서의 종양 성장. 4T1-luc 세포의 종양 성장을 IVIS100을 사용한 생물발광에 의해 생체내에서(in vivo) 나타내었다(d의 좌측). d의 우측: 4T1 세포 발현 PD-L1 WT 대 PD-L1 4NQ 단백질로부터 유래된 종양을 보유한 마우스에서 종양 부피를 나타내는 상자 플롯 및 종양 크기를 나타내는 사진. 종양을 측정하고 종료시에 해부하였다. n = 그룹 당 8 마리 마우스(우측). e. CD8+ CD3+ T 세포 집단에서 IFNγ의 세포내 사이토카인 염색. 2 가지 방식의 ANOVA에 의해 *p < 0.05 및 **p < 0.001을 갖는 유의성을 결정하였으며; n = 그룹 당 7 마리 마우스. *은 스튜던트 t 테스트에 의해 통계적으로 유의미함을 나타낸다. 모든 오차 막대는 3 개의 독립 실험의 평균±SD로 표현한다. f. STM073 MAb("73"), 100 ㎍, 또는 IgG 대조군, 100 ㎍으로 처치된 4T1 세포 발현 PD-L1 WT(글리코실화된) 단백질로부터 유래된 종양을 보유한 마우스에서 종양 부피를 나타내는 상자 플롯. 종양을 측정하고 종료시에 해부하였다. n = 그룹 당 7 마리 마우스. STM073을 이용한 처치는 종양 부피 감소를 야기하였다.
도 10a-10c. PD-L1 단백질의 글리코실화된 형태 및 비글리코실화된 형태의 도식적 도표 및 웨스턴 블롯 분석. a. 각각 PD-L1 단백질의 4 개의 N-글리코실화 부위(N35/3NQ; N192/3NQ; N200/3NQ; 및 N219/3NQ) 중 하나의 글리코실화된 아미노산 잔기 및 3 개의 비글리코실화된 아미노산 잔기를 갖는 야생형 글리코실화된 PD-L1 단백질(PD-L1 WT) 및 4 개의 PD-L1 단백질 변이체의 도식적 도표. 흑색으로 표시된 아미노산은 글리코실화된 잔기를 나타내고; 적색으로 나타낸 아미노산 부위는 변이체 PD-L1 단백질의 비글리코실화된 것을 나타낸다. b. PD-L1 단백질의 BT 549 발현 N35/3NQ, N192/3NQ, N200/3NQ 및 N219/3NQ 형태의 안정 클론을 생성하였다. 항-glycPD-L1 항체 중 일부는 웨스턴 블롯에 의해 결정된 바와 같이, 다른 것에 비해 PD-L1 글리코실화 변이체의 일부에 대하여 높은 결합 수준을 나타내었으며, 이는 상기 MAb가 부위 특이적임을 증명하였다. b에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, MAb STM073이 N35/3NQ, N192/3NQ 및 N200/3NQ PD-L1 변이체를 인식하고 이에 결합한다는 것은 이 단클론 항체가 글리코실화된 PD-L1의 N35, N192 및 N200 영역에 결합하였다는 것을 나타내었다. c.는 간암 세포주의 용해액에 결합하는 STM073 MAb의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
도 11. 항- glycPD -L1 항체는 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 향상시킨다. 실시예 10에 기재된 바와 같이 세포 세포독성 에세이에서 상이한 양의 STM073 MAb를 사용하여, 종양 세포(BT549)에 대한 PBMC-유래된 T 세포의 세포독성을 평가하였다. 도 11은 MAb STM073으로 처치된 BT549(RFP PD-L1(WT)) 세포의 세포 사멸을 실시간으로 나타낸다. 도 11에서, 하부 플롯팅된 선(순 오렌지색 다이아몬드)은 대조군(PBMC로부터의 대조군 없음)을 나타내고; 순자색 반전된 삼각형은 항체 대조군이 없음을 나타내며; 순녹색 삼각형은 에세이에서 사용된 10 ㎍/mL의 STM073 MAb를 나타내고; 순적색 사각형은 에세이에서 사용된 20 ㎍/mL의 STM073 MAb를 나타내며; 순청색 원은 에세이에서 사용된 40 ㎍/mL의 STM073 MAb를 나타낸다. 도 11로부터 관찰된 바와 같이, 시간에 걸친 PD-L1 보유 종양 세포의 용량 비례 사멸이 입증된다.
도 12a-12c. 결합 에세이. 12a-12c는 실시예 10에 기재된 바와 같은 결합 에세이의 결과를 나타내며, STM073 MAb(a) 및 STM108 MAb(b)는 에세이 대조군, 즉 PD-1/Fc 없음; Ab 없음; mIgG Ab 대조군(c)에 비교하여 WT PD-L1을 발현하는 BT549 표적 세포에 대한 PD-1의 결합을 용량 의존 방식으로 차단하는 것으로 보인다.
도 13. 항- glycPD -L1 항체에 의한 PD-L1의 내부화. 도 13은 무혈청 배지에서 밤새 배양되고 2 일 동안 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체(10 ㎍)로 처치된 A431 세포로부터의 PD-L1 단백질의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 블롯의 짧고 긴 노출을 나타낸다. 튜불린이 대조군으로서 제시된다. "73"으로 표시된 레인은 STM073 MAb을 이용한 A431 세포의 처치를 나타내고, 대조군을 이용한 처치(IgG 레인)에 비해 STM073-처치된 세포에서 PD-L1의 감소된 수준을 나타낸다. 상기 결과는 본원에 기재된 STM073과 같은 항-glycPD-L1 항체에 의한 PD-L1의 내부화 및 분해의 촉진 또는 향상을 지지한다.
도 14a-14e. 항- glycPD -L1 항체의 세포 내부화의 시각화. STM073 및 STM108 MAb를 표지하고 상이한 암 세포 유형과 함께 배양하였으며, 실시예 11에 기재된 바와 같이 IncuCyte ZOOM® 기구를 사용하여 내부화를 시각화하였다. 도 14a: STM073과 함께 배양된 야생형 BT 549 세포(인간 유관암, 유방암 세포주); 도 14b: STM073과 함께 배양된 PD-L1 WT(글리코실화됨)을 발현하도록 분자 조작된 BT 549 세포; 도 14c: STM073과 함께 배양된 NCI-H226 세포(인간 폐암 세포주, 편평세포 중피종); 도 14d: STM073과 함께 배양된 MCF-7 세포(인간 유방암 세포주, 선암); 및 도 14e: STM108과 함께 배양된 PD-L1 WT(글리코실화됨)를 발현하는 BT 549 세포.
도 15a-15c. 항- glycPD -L1 항체에 의한 결합 후의 PD-L1의 내부화 및 분해. 도 15a-15c는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체와 함께 항온처리된 PD-L1-발현 세포의 생세포 영상화의 결과를 나타낸다. 도 15a-15c에서, 항-PD-L1 항체는 적색 형광 염료 pHrodoTM Red(석신이미딜에스터(pHrodoTM Red, SE), (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 콘쥬게이트된 STM108 MAb이다. pHrodoTM Red 염료 콘쥬게이트는 세포 외부에서는 비-형광성이지만, 식포 내에서는 밝은 적색으로 형광을 내며, 이는 이들이 바이오입자의 식세포작용 내지 수용체 내부화 범위의 연구에 유용한 시약이 되게 한다. 녹색 염색은 생세포 영상화를 통해 영상화된 생세포에서 산성 구획(리소좀)을 염색하는 세포 침투성 녹색 염료인 LysoTracker® Green DND-26으로 염색된 세포를 나타낸다. 도 15a는 제1 시점(0 시)에, 화살표로 나타낸 세포의 강한 적색 세포내 염색으로 도시된 바와 같이 STM108이 세포 내로 내부화된다는 것을 나타낸다. 도 15b는 도 15a의 시점의 2 분 후에 도 15a에 도시된 동일한 세포에서 약화된 세포내 적색 염색을 나타낸다. 도 15c는 도 15a의 시점의 4 분 후에 적색 세포내 염색의 결여를 나타내며, 이는 세포 내부의 STM108 항체 및/또는 항체-항원 복합체의 분해를 나타낸다.
도 16a-16l. 총 T 세포에 비해 종양 세포에서 항-PD-L1 항체에 의해 결합된 PD-L1의 내부화. 16a-16l은 PD-L1 양성 종양 세포 내로는 내부화하지만, 활성화된 또는 비활성화된 T 세포 내로는 그렇지 않은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 능력을 나타내는 세포의 영상을 나타낸다. 도 16a-16d는 다음 항체와 함께 항온처리된 후에 말초 혈액으로부터의 비활성화된 총 T 세포의 영상을 나타낸다: 마우스 IgG 항체 대조군(도 16a); 비-내부화 항-glycPD-L1 MAb STM004(도 16b); 이중 기능 항-glycPD-L1 MAb STM073(도 16c); 및 이중 기능 항-glycPD-L1 항체 STM108(도 16d). 도 16a-16d는 시험된 항체 중 어느것도 비활성화된 총 T 세포 내로 내부화되지 않았다는 것을 나타낸다. 도 16e-16h는 다음 항체와 함께 항온처리된 후에 말초 혈액으로부터의 활성화된 총 T 세포의 영상을 나타낸다: 마우스 IgG 항체 대조군(도 16e); 비-내부화 STM004(도 16f); 이중 기능 STM073(도 16g); 및 이중 기능 STM108(도 16h). T 세포 활성화를 위해 총 T 세포를 비드, 예를 들어 1:1의 비의 항-CD3 및 항-CD28 항체와 공유 결합된 불활성 초상자성 비드(예를 들어, ThermoFisher Scientific, Rochester, NY)와 혼합하였다. 도 16e-16h는 시험된 임의의 항체에 관하여 활성화된 총 T 세포 내로의 내부화가 사실상 관찰되지 않았다는 것을 나타낸다. 도 16i-16l은 다음 항체와 함께 항온처리 후의 NCI-H226 세포(인간 폐암 세포주, 편평세포 중피종)의 영상을 나타낸다: 마우스 IgG 항체 대조군(도 16i); 비-내부화 항-glycPD-L1 항체 STM004(도 16j); 이중 기능 항-glycPD-L1 MAb STM073(도 16k); 및 이중 기능 항-glycPD-L1 MAb STM108(도 16l). 도 16i-16l은 적색 세포내 염색에 의해 입증된 바와 같이 대조군 항체 mIgG(도 16i) 및 비-내부화 STM004 MAb와 비교하여 이중 기능 내부화 STM073 및 STM108이 이들 세포와의 항온처리 후에 NCI-H226 세포 내로 내부화되었다는 것을 나타낸다.
도 17a-17d. 항- glycPD -L1 항체- ADC의 항-종양 효능. 도 17a-17d는 대조군(IgG 및 STM108 MAb 단독)으로 주사된 종양화된 동물과 비교해, STM108 ADC로 종양화된 동물의 주사 후에 종양-이식된 마우스에서 PD-L1-발현 및 비-PD-L1-발현 종양 세포를 살해하고, 종양의 부피를 감소시키는데 있어서, MMAE에 결합되어, 본원에 기재된 바와 같은 항체-약물 콘쥬게이트(STM108-ADC)를 생성하는 이중 기능 항-glycPD-L1 MAb STM108을 포함하는 ADC의 효능을 평가하는 실험의 결과를 나타낸다. 도 17a는 상이한 농도의 STM108-ADC, 즉 "ADC108"에 노출된 후에 PD-L1의 발현("MB231 PDL1 KO")을 녹아웃(knock out)시키도록 분자 조작된 MB231 세포의 % 생존도(채워진 흑색 사각형)와 비교하여, 상이한 농도(nM)의 STM108-ADC에 노출된 후의 PD-L1-발현 MDA-MB231(인간 유방암종 세포주) 종양 세포("MB231")의 % 생존도(채워진 흑색 원)를 나타낸다. 도 17b에서, 도 17b의 그래프 상에 나타낸 바와 같이, MB231 세포로부터 유래된 종양이 이식된 동물을 IgG-MMAE 대조군(100 ㎍); 또는 50 ㎍, 100 ㎍, 또는 150 ㎍의 STM108 ADC("ADC"); 또는 100 ㎍의 STM108 MAb로 처치한 유방암의 MDA-MB231 마우스 모델을 사용하였다. 100 ㎍ STM108-ADC가 투여된 5 마리 마우스 중 3 마리 및 150 ㎍ STM108-ADC가 투여된 5 마리 마우스 중 4 마리에서 완전 반응(Complete response)("CR")이 관찰되었다. 도 17c는 상이한 농도의 STM108-ADC, 즉 "ADC108"에 노출된 후에 PD-L1을 자연적으로 발현하지 않는 4T1 세포("4T1")의 % 생존도(채워지지 않은 적색 사각형)와 비교하여, 상이한 농도(nM)의 STM108-ADC에 노출된 후에 세포 표면 상에 인간 PD-L1을 발현하도록 분자 조작된 4T1 유방 암종 세포("4T1 hPDL1")의 % 생존도(채워지지 않은 적색 원)를 나타낸다. 도 17d에서, 세포 표면에서 PD-L1을 발현하도록 분자 조작된 4T1 유방 암종 세포로부터의 종양이 동물(Balb/c 마우스)에 이식되거나("4T1 hPD-L1"), 세포 표면 상에 PD-L1을 자연적으로 발현하지 않는 비형질감염된 4T1 유방 암종 세포로부터 유래된 종양이 Balb/c 마우스에 이식된("4T1") 유방암의 4T1 동계(syngeneic) 마우스 모델을 사용하였다. 2 개 유형의 4T1 세포로부터 유래된 종양 보유 동물을 도 17d의 그래프 상에 나타낸 바와 같이, IgG-MMAE 대조군(100 ㎍); 또는 STM108 MAb(100 ㎍), 또는 STM108 ADC(100 ㎍)로 처치하였다. 실시예 14를 참고한다.
기재된 실시양태의 다른 양태, 특징 및 이점은 다음 상세한 설명 및 예시적 실시예로부터 명확해질 것이다.
실시양태의 상세한 설명
종양 세포 상에 발현된 프로그래밍된 사멸 리간드-1 단백질(programmed death ligand-1 protein)(PD-L1)과 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 상에 발현된 프로그래밍된 사멸-1 단백질(PD-1) 사이의 세포외 상호작용은 종양-관련 면역 회피에 대해 명확한 영향을 갖는다. 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체를 사용한 면역 체크포인트 차단의 임상 성공에도 불구하고, PD-L1 및 PD-1 상호작용의 기본이 되는 조절 메커니즘 및 구조적 특징은 많이 알려지지 않은 채로 남아있다. 본원에 기재된 조사결과에 따르면, PD-L1의 N-연결된 글리코실화가 종양 세포 상에 존재하는 PD-L1 단백질 리간드를 안정화시키며, 또한 PD-1에 대한 이의 결합을 가능하게 하고 향상시키며, 이는 T 세포-매개된 면역 반응의 억제를 촉진한다는 점이 입증되었다. 반대로, 예컨대 종양 세포 상에 발현된 PD-L1 폴리펩티드의 부분적이거나 완전한 탈글리코실화로부터의 N-연결된 글리코실화의 이상 또는 결손은 불리하게 영향을 미쳐, 예를 들어 PD-L1/PD-1 상호작용을 약화시키거나 방해하며, 종양 세포 상의 PD-L1의 내부화 및 분해를 촉진하고, 이는 결국 면역억제를 억제하고, 이펙터 T 세포 세포독성 활성 및 종양 세포의 사멸을 촉진한다. 또한, 종양이 매우 글리코실화된 PD-L1을 발현하는 환자의 생존이 좋지 않기 때문에, 글리코실화된 PD-L1은 본원의 조사결과를 기본으로 하여 암 치료를 위한 효과적인 치료 표적으로서 인식된다. 본원은 암 치료제, 예컨대 글리코실화된 PD-L1과 특이적으로 및 우선적으로 결합하고 상호작용하여, 글리코실화된 PD-L1/PD-1 상호작용을 방해하며, 종양 세포 표면 상에 발현된 PD-L1을 불안정화시켜, 면역억제를 억제하고 종양 세포에 대한 T 세포 이펙터 기능을 촉진하여, 암을 치료하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체를 제공하고 기재한다. 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체를 이용한 종양 치료는 PD-L1의 글리코실화된 형태에 대해 특이적이지 않은 항-PD-L1 항체에 비해 향상된 면역억제 억제 효과를 제공한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 본원에서 "MAb"로 표시되는 단클론 항체이다.
본원은 글리코실화된 부위에 상응하는 PD-L1의 세포외 도메인(ECD), 특히 PD-L1 ECD의 N-말단 및 C-말단 부분의 에피토프에 결합하거나, 대안적으로 상기 글리코실화 부위를 차단하거나 마스킹하도록 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. PD-L1 단백질에서 글리코실화되는 아미노산은 본원의 서열번호 1에 넘버링된 바와 같은 PD-L1의 위치 35, 192, 200 및 219에서, 도 1에 나타낸 바와 같은 이의 세포외 도메인 내에 있다. 본 조사결과에 따르면, 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체는 이들이 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 감소, 차단, 또는 억제하고, 또한 PD-L1 내부화 및 분해를 촉진하여, 종양 세포 상에 발현된 PD-L1의 수준을 감소시키는 이중 기능성이다. 실시양태에서, 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 비선형, 입체구조 에피토프에 결합한다. 또한, 이론에 구애됨 없이, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 아미노산을 함유하는 에피토프에 결합하고, 3 차원 공간에서 글리코실화된 아미노산에 근접해 있으며; 상기 글리코실화된 아미노산은 특히 PD-L1/PD-1 상호작용에 관여하고 또한 종양 세포의 표면 상의 PD-L1의 유지에 관여하는 것으로 여겨진다. 이론에 구애됨 없이, 글리코실화된 PD-L1의 ECD N-말단 내의 N35와 연관된 글리칸 구조는 PD-1 단백질에 의해 인식되고 결합되며 PD-1/PD-L1 상호작용에서 상당한 역할을 하는 글리코실화된 PD-L1 단백질의 기능성 구조 또는 구성을 포함하거나 이에 기여한다. PD-L1 ECD의 N-말단 영역 내의 위치 35의 아미노산을 포함하는 에피토프, 또는 위치 35에 근접한 에피토프에 결합함으로써, 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1/PD-1 상호작용에 특히 관여할 수 있는 글리코실화된 PD-L1 단백질의 결합 부위 또는 영역을 마스킹한다. 글리코실화된 아미노산 잔기(N192, N200 및 N219)를 포함하는 PD-L1 ECD의 C-말단 영역 내의 아미노산에 결합함으로써, 또는 이에 대한 결합, 마스킹을 통해, 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 종양 세포의 표면 상의 PD-L1의 안정화에 특히 관여할 수 있는 글리코실화된 PD-L1 단백질의 결합 부위 또는 영역을 효과적으로 마스킹하여, PD-L1 내부화 및 분해를 촉진하고, 종양 세포 상의 PD-L1의 수준을 감소시킨다.
본원에 기재된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1 ECD의 N- 및 C-말단 영역 둘 다의 아미노산, 특히 비선형, 입체구조 에피토프 내의 아미노산을 포함하거나 마스킹하는 에피토프에 결합하여, PD-L1/PD-1 상호작용 및 종양 세포 표면 상의 PD-L1의 안정화에 관여하는 상기 글리칸-함유 잔기 또는 PD-L1 단백질의 영역의 항-glycPD-L1 항체에 의한 마스킹 또는 은닉을 야기할 수 있다. 상기 항-glycPD-L1 항체는 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제하거나 차단하고, 또한 종양 세포 표면 상의 PD-L1의 수준을 감소시켜, 더 적은 PD-L1 분자가 PD-1 결합에 이용 가능하도록 한다. 항-glycPD-L1 항체는 이펙터 T 세포 및 PD-1-보유 종양 또는 암 세포와의 혼합물에 제공될 때, PD-1/PD-L1 상호작용에 의해 면역억제되지 않는 T 세포에 의한 상기 종양 또는 암 세포의 사멸을 촉진한다. (예를 들어, 도 11 및 실시예 9 참고).
본원에 기재된 실시예는 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체에 의하여 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1의 결합에서 상당한 차이, 예를 들어 2-3 배를 나타내는 실험 결과를 제공한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 대해 나노몰농도 범위, 예를 들어 약 5-20 nM 또는 약 10-20 nM의 결합 친화도를 나타낸다. 실시예는 항-glycPD-L1 항체가 PD-L1 발현 종양 세포에 의해 내부화되지만 T 세포(활성화되거나 비활성화됨)에 의해서는 그렇지 않으며(도 16a-16l); 항-glycPD-L1 항체는 또한 종양 세포주로부터 유래된 종양을 보유한 마우스 모델에서 PD-L1 발현 종양 세포의 생존도 및 종양 부피를 감소시킨다는 점을 추가로 나타낸다(도 17a-17d).
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "하나" 또는 "한"은 하나 이상을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 본 발명이 대체물 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 지지하더라도, 대체물만을 지칭하는 것으로 명확하게 나타내지지 않거나, 대체물이 서로 배제하지 않는 경우, "및/또는"을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다른"은 적어도 제2 이상을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 값이 상기 값을 결정하기 위해 사용되는 장치, 방법에 대한 오차의 고유 변동, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변동을 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로그래밍된 사멸 리간드-1" 또는 "PD-L1"은 달리 나타내지 않는 경우, 영장류(예를 들어, 인간, 시노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey)(cyno)), 개, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 폴리펩티드(용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용됨) 또는 임의의 천연 PD-L1을 지칭하며, 특정 실시양태에서, 다양한 PD-L1 이소형, 관련 PD-L1 폴리펩티드, 및 이의 SNP 변이체를 포함한다.
인간 PD-L1의 예시적 아미노산 서열(UniProtKB/Swiss-Prot: Q9NZQ7.1; GI:83287884)이 하기에 제공된다:
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서열번호 1에서, 아미노 말단 아미노산 1-18은 인간 PD-L1 단백질의 시그널 서열을 구성한다. 따라서, 성숙 인간 PD-L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 19-290으로 구성된다.
본원에 기재된 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하는 아미노산 잔기, 및 이들 아미노산 잔기에 대한 보존적 치환에 대한 약자를 하기 표 1에 나타내었다. 본원에 기재된 폴리펩티드의 1 이상의 보존적 아미노산 치환 또는 보존적으로 변형된 변이체를 함유한 폴리펩티드는 원래의 또는 천연적으로 발생하는 아미노산이 유사한 특징, 예를 들어 유사한 전하, 소수성/친수성, 측쇄 크기, 백본(backbone) 입체구조, 구조 및 강도 등을 갖는 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 이들 아미노산 변경은 전형적으로 폴리펩티드의 생물학적 활성, 기능, 또는 다른 소망하는 특성, 예컨대 항원에 대한 이의 친화도 또는 이의 특이성이 변화되지 않으면서 이루어질 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드의 비본질적 영역에서의 단일 아미노산 치환은 실질적으로 생물학적 활성을 변화시키지 않는다. 또한, 구조 또는 기능이 유사한 아미노산의 치환은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 덜 방해할 수 있다.
Figure pct00002
용어 "항체", "면역글로불린", 및 "Ig"는 본원에서 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되며, 구체적으로 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은 개별 항-PD-L1 항체, 예컨대 본원에 기재된 단클론 항체(항원 결합 활성을 유지하는 항체의 작용제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 온전한(intact) 단클론 항체, 펩티드 단편을 포함함), 항-비글리코실화된 PD-L1 항체 및 항-글리코실화된 PD-L1 항체; 폴리에피토프 또는 모노에피토프 특이성을 갖는 항-PD-L1 항체 조성물, 다클론 또는 1가 항체, 다가 항체, 적어도 2 개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체 또는 비파라토프 항체), 단일쇄 항-PD-L1 항체, 및 항-PD-L1 항체의 단편을 포괄한다. 항체는 인간, 인간화, 키메라, 및/또는 친화도 성숙일 수 있다. 항체는 다른 종, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 등으로부터의 것일 수 있다. 용어 "항체"는 특정 분자 항원에 결합할 수 있는 폴리펩티드의 면역글로불린 클래스 내의 B 세포의 폴리펩티드 생성물을 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 전형적으로 2 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 중쇄(약 50-70 kDa) 및 하나의 경쇄(약 25 kDa)를 갖고; 중쇄 및 경쇄의 아미노-말단 부분은 약 100 내지 약 130 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하며, 각각의 사슬의 카복시-말단 부분은 불변 영역을 포함한다(Antibody Engineering, Borrebaeck (ed.), 1995, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby, 1997, Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New York 참고). 구체적 실시양태에서, 본원에 제공된 항체에 의해 결합된 특정 분자 항원은 PD-L1 폴리펩티드, PD-L1 펩티드 단편, 또는 PD-L1 에피토프를 포함한다. PD-L1 폴리펩티드, PD-L1 펩티드 단편, 또는 PD-L1 에피토프는 비글리코실화되거나 글리코실화될 수 있다. 특별한 실시양태에서, PD-L1 폴리펩티드, PD-L1 펩티드 단편, 또는 PD-L1 에피토프는 글리코실화된다. PD-L1 항원에 결합하는 항체 또는 이의 펩티드 단편은 예를 들어, 면역에세이, Biacore, 또는 당업자에게 알려진 다른 기법에 의해 확인될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 방사면역에세이(radioimmunoassay)(RIA) 및 효소 연결 면역흡착 에세이(enzyme linked immunosorbent assay)(ELISA)와 같은 실험 기법을 사용하여 결정된 바와 같이, 그것이 임의의 교차-반응성 항원에 비해 높은 친화도로 PD-L1 항원에 결합할 때, PD-L1 항원에 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 적어도 2 배 백그라운드 신호 또는 노이즈(noise), 및 더욱 전형적으로 5-10 배 이상의 백그라운드 신호 또는 노이즈일 것이다. 예를 들어, 항체 특이성에 관한 논의에 대해 Fundamental Immunology Second Edition, Paul, ed., 1989, Raven Press, New York at pages 332-336을 참고한다.
본원에 제공된 항체는, 비제한적으로, 합성 항체, 단클론 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체를 포함함), 인간 항체, 인간화 항체, 낙타화 항체, 키메라 항체, 인트라바디(intrabody), 항-유전자형(anti-idiotypic)(항-Id) 항체, 및 상기 중 임의의 것의 기능적 단편(예를 들어, 글리코실화된 PD-L1 결합 단편과 같은 항원-결합 단편)을 포함한다. 결합 단편은 단편이 유래되는 항체의 결합 활성의 일부 또는 전부를 보유하는 펩티드 부분과 같은 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 부분을 지칭한다. 기능적 단편(예를 들어, PD-L1 결합 단편과 같은 항원-결합 단편)의 비제한적인 예는 단일쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이적, 이중특이적, 비파라토프, 1가(예를 들어, 단일 VH 또는 VL 도메인을 가짐) 또는 2가 등을 포함함), Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-연결된 Fv(sdFv), Fd 단편, Fv 단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 및 미니바디(minibody)를 포함한다. 특히, 본원에 제공된 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 예를 들어 항원 결합 도메인 또는 PD-L1 항원, 특히 글리코실화된 PD-L1 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 분자(예를 들어, 항-글리코실화된 PD-L1 항체의 1 이상의 상보성 결정 영역(CDR))를 포함한다. 상기 항체 단편의 설명은, 예를 들어 Harlow and Lane, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Molec . Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, Myers (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., 1993, Cell Biophysics, 22:189-224; Pl
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ckthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol., 178:497-515 및 Day, E.D., 1990, Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY에서 찾아볼 수 있다. 본원에 제공된 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 완전 인간, 예컨대 완전 인간 단클론 항-PD-L1 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간화, 예컨대 인간화 단클론 항-PD-L1 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 IgG 항체, 또는 클래스(예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4) 또는 이의 서브클래스, 특히 IgG1 서브클래스 항체이다.
4-쇄 항체 단위는 2 개의 동일한 경(L)쇄 및 2 개의 동일한 중(H)쇄로 구성된 이종4량체 당단백질이다. IgG의 경우에, 4-쇄(비환원된) 항체 단위의 분자량은 일반적으로 약 150,000 달톤(dalton)이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 다이설파이드 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 한편, 2 개의 H 사슬은 H 사슬의 이소형에 따라 1 이상의 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한, 규칙적으로 이격된 사슬내 다이설파이드 가교를 갖는다. N-말단에서, 각각의 H 사슬은 가변 도메인(VH) 이후 각각의 α 및 γ 사슬에 대한 3 개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대한 4 개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에서 가변 도메인(VL) 이후 이의 카복시 말단에서 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL 도메인은 VH 도메인과 정렬되고, CL 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 도메인과 중쇄 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH 및 VL의 쌍 형성은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다(그렇다 하더라도, 특정 VH 및 VL 도메인은 각각 대응하는 VH 또는 VL과 독립적으로 항원에 결합할 수 있음). 면역글로불린 분자의 기본 구조는 당업자에 의해 이해된다. 예를 들어, 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성은 Stites, Daniel P. et al., 1994, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Appleton & Lange, Norwalk, CT, page 71 and Chapter 6에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "표적 항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있도록 예정된 분자이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐, 또는 천연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 실시양태에서, 표적 항원은 소분자이다. 특정 실시양태에서, 표적 항원은 폴리펩티드 또는 펩티드, 바람직하게는 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편", "항원 결합 도메인", "항원 결합 영역", 및 유사한 용어는 항원과 상호작용하고 항원에 대한 결합제로서 이의 특이성 및 친화도를 항체 상에 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 부분을 지칭한다(예를 들어, 항체의 CDR은 항원 결합 영역임). 항원 결합 영역은 설치류(예를 들어, 토끼, 래트, 또는 햄스터) 및 인간과 같은 임의의 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항원 결합 영역은 인간 기원의 것일 수 있다.
"단리된" 항체는 세포 물질 또는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 다른 오염 단백질 및/또는 항체가 유래되는 다른 오염 성분이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 표현 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 항체가 그것이 단리되거나 재조합적으로 생성되는 세포의 세포 성분으로부터 분리되는 항체의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량으로) 미만의 이종 단백질(본원에서는 "오염 단백질"로도 지칭됨)을 갖는 항체의 제제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체가 재조합적으로 생성될 때, 이는 배양 배지가 실질적으로 없으며, 예를 들어 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 항체가 화학적 합성에 의해 생성될 때, 이는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 예를 들어, 그것은 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 상기 항체의 제제는 관심 항체 외에 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량으로) 미만의 화학적 전구체 또는 화합물을 갖는다. 오염 성분은 또한, 비제한적으로, 항체에 대한 치료적 용도에 간섭할 물질을 포함할 수 있으며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리법(Lowry et al., 1951, J. Bio. Chem ., 193: 265-275)에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량% 이상, 예컨대 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량%까지, (2) 스피닝 컵 서열결정기(spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 개 잔기를 얻기 충분한 정도 까지, 또는 (3) 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 동종성까지 정제된다. 단리된 항체는 또한, 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원위치(in situ)에서의 항체를 포함한다. 단리된 항체는 전형적으로 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 단리된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합하다" 또는 "결합하는"은, 예를 들어 복합체를 형성하는 것을 포함하여 분자 사이의 상호작용을 지칭한다. 예시적으로, 상기 상호작용은 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용, 및/또는 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용을 포함한 비공유 상호작용을 포괄한다. 복합체는 또한, 공유 또는 비공유 결합, 상호작용, 또는 힘에 의해 함께 유지되는 2 이상의 분자의 결합을 포함한다. 항체의 단일 항원-결합 부위와 PD-L1과 같은 표적(항원) 분자 상의 이의 에피토프 사이의 총 비공유 상호작용의 강도는 상기 에피토프에 대한 항체 또는 기능적 단편의 친화도이다. 1가 항원에 대한 항체의 결합(kon) 대 해리(koff)의 비(kon / koff)는 친화도의 측정치인 결합 상수 Ka이다. Ka의 값은 항체와 항원의 상이한 복합체에 대해 달라지며, kon 및 koff 둘 다에 의존한다. 본원에 제공된 항체에 대한 결합 상수 Ka는 본원에 제공된 임의의 방법 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 결합 부위에서의 친화도는 항체와 항원 사이의 상호작용의 실제 강도를 항상 반영하지는 않는다. 글리코실화된 PD-L1과 같은 다중 항원성 결정인자를 함유한 복합체 항원이 다중 결합 부위를 함유한 항체와 접촉하게 될 때, 하나의 부위에서 항체와 항원의 상호작용은 제2 결합 부위에서의 상호작용 가능성을 증가시킬 것이다. 다가 항체와 항원 사이의 상기 다중 상호작용의 강도는 결합활성(avidity)으로 지칭된다. 항체의 결합활성은 이의 개별 결합 부위의 친화도에 비해 이의 결합 능력의 우수한 측정치일 수 있다. 예를 들어, 높은 결합활성은 때때로 IgG에 비해 낮은 친화도를 갖지만, 이의 다가로부터 야기된 IgM의 높은 결합활성이 이를 항원에 효과적으로 결합시킬 수 있는 5량체 IgM 항체에 대해 발견되는 바와 같이 낮은 친화도에 대해 보상할 수 있다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체와 같은 결합 단백질)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 경우, 본원에 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍(예를 들어, 항체와 항원 또는 수용체와 리간드)의 멤버 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 본질적인 결합 친화도를 지칭한다. 결합 파트너 Y에 대한 결합 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함하여, 당업계에 알려진 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고, 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면에, 고친화도 항체는 일반적으로 항원에 신속하게 결합하고, 항원에 오래 결합된 채로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태는 다음을 포함한다: 일 실시양태에서, "Kd" 또는 "Kd 값"은 당업계에 알려진 방법에 의해, 예를 들어 결합 에세이에 의해 측정된다. Kd는 예를 들어, 관심 항체의 Fab 부분과 이의 항원을 이용해 수행되는 방사성표지된 항원 결합 에세이(radiolabeled antigen binding assay)(RIA)에서 측정될 수 있다(Chen et al., 1999, J. Mol . Biol ., 293:865-881). Kd 또는 Kd 값은 또한, 예를 들어 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용한 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)(SPR) 에세이(Biacore에 의함)를 사용함으로써, 또는 예를 들어, OctetQK384 시스템(ForteBio, Menlo Park, CA)을 사용한 바이오레이어 간섭계법(biolayer interferometry)(BLI)에 의해, 또는 수정 진동자 저울(quartz crystal microbalance)(QCM) 기술에 의해 측정될 수 있다. "온-레이트(on-rate)" 또는 "결합의 비율" 또는 "결합 비율" 또는 "kon"은 또한, 예를 들어 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), 또는 OctetQK384 시스템(ForteBio, Menlo Park, CA)을 사용한 상기 기재된 동일한 표면 플라스몬 공명 또는 바이오레이어 간섭계법 기술로 결정될 수 있다.
용어 "항-PD-L1 항체", "PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체", 또는 "PD-L1에 대해 특이적인 항체", "PD-L1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체" "PD-L1에 선택적으로 결합하는 항체", "PD-L1 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체", "PD-L1에 우선적으로 결합하는 항체" 및 유사 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특히 비글리코실화된 PD-L1 또는 PD-L1의 글리코실화 돌연변이와 비교하여, 충분한 친화도 및 특이성으로 PD-L1, 즉 글리코실화된 또는 WT PD-L1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체의 "우선적 결합"은 비글리코실화된 PD-L1 또는 변이체 PD-L1(예를 들어, 4NQ PD-L1), 또는 PD-L1의 비글리코실화된 형태 또는 변이체 형태(예를 들어, 4NQ PD-L1)를 발현하는 세포, 예를 들어 본원, 예를 들어 본원의 실시예 6에 기재된 바와 같은 분자 조작된 세포, 세포주 또는 종양 세포 단리물에 대한 결합과 같이, 적절한 대조군에 비교하여 세포 상에 발현된 PD-L1, 즉 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드, 또는 PD-L1 WT, 또는 글리코실화된 PD-L1에 대한 항체 결합의 형광 강도의 정량화를 기본으로 하여 결정되거나 정의될 수 있다. 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드 또는 글리코실화된 PD-L1(PD-L1 WT)-발현 세포에 대해 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체의 우선적 결합은 비글리코실화된 또는 돌연변이 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드 또는 비글리코실화된 또는 돌연변이 글리코실화된 PD-L1-발현 세포에 대한 항체의 결합과 비교하여, 적어도 1.5 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 6 배, 적어도 7 배, 적어도 8 배, 적어도 10 배, 적어도 15 배, 적어도 20 배 또는 그 이상인 유세포분석에 의해 평가된 바와 같은 측정 형광 결합 강도(measured fluorescent binding intensity)(MFI) 값으로 나타내어지며, 에세이될 항체는 형광 표지 또는 마커에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 측정 가능하다. 실시양태에서, 항체는 FITC와 같은 형광 마커를 이용하여 직접적으로 표지된다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 또는 선택적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 비글리코실화된 PD-L1 또는 PD-L1 글리코실화 변이체, 예를 들어 글리코실화되지 않은 4NQ PD-L1에 결합하기 위한 동일한 항체의 MFI 값에 비해 1.5 배 내지 25 배, 또는 2 배 내지 20 배, 또는 3 배 내지 15 배, 또는 4 배 내지 8 배, 또는 2 배 내지 10 배, 또는 2 배 내지 5 배 이상 큰 MFI 값을 나타낸다. 상기 모두의 사이이며 동일한 배수-형광 강도 값이 포함되는 것으로 의도된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드, 예컨대 글리코실화된 PD-L1 항원, 펩티드 단편, 또는 에피토프(예를 들어, 인간 글리코실화된 PD-L1, 예컨대 인간 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드, 항원 또는 에피토프)에 특이적으로 및 우선적으로 결합한다. PD-L1(예를 들어, 글리코실화된 또는 야생형 인간 PD-L1)에 특이적으로 결합하는 항체는 PD-L1의 세포외 도메인(ECD) 또는 ECD로부터 유래된 펩티드에 결합할 수 있다. PD-L1 항원(예를 들어, 인간 PD-L1)에 특이적으로 결합하는 항체는 관련 항원(예를 들어, 시노몰거스(cyno) PD-L1)과 교차-반응성일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, PD-L1 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 항원과 교차-반응하지 않는다. PD-L1 항원에 특이적으로 결합하는 항체는, 예를 들어 면역형광 결합 에세이, 면역에세이 방법, 면역조직화학 에세이 방법, Biacore, 또는 당업자에게 알려진 다른 기법에 의해 확인될 수 있다.
특정 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 PD-L1에 결합하는 항체는 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 또는 0.1 nM 이하, 및/또는 0.1 nM 이상의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 상이한 종으로부터의 PD-L1 단백질 사이(예를 들어, 인간과 시노몰거스 PD-L1 사이)에 보존된 PD-L1의 에피토프에 결합한다. 항체는 방사면역에세이(RIA) 및 효소 연결 면역흡착 에세이(ELISA)와 같은 실험 기법을 사용하여 결정된 바와 같이, 그것이 임의의 교차 반응성 항원에 비해 높은 친화도로 PD-L1 항원에 결합할 때, PD-L1 항원에 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 적어도 2 회 백그라운드 신호 또는 노이즈일 것이며, 10 회를 초과하는 백그라운드일 수 있다. 예를 들어, 항체 특이성에 관한 논의에 대한 Fundamental Immunology Second Edition, Paul, ed., 1989, Raven Press, New York at pages 332 336을 참고한다. 상기 실시양태에서, "비-표적" 단백질에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들어 형광 활성화된 세포 분류(fluorescence activated cell sorting)(FACS) 분석 또는 방사면역침강법(radioimmunoprecipitation)(RIA)에 의해 결정된 바와 같이, 이의 특정 표적 단백질에 대한 항체 결합의 약 10% 미만일 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체는 항-글리코실화된 PD-L1 항체 또는 항-야생형 PD-L1 항체를 포함하되, 야생형 PD-L1 단백질은 글리코실화되고, 이들은 글리코실화된 PD-L1에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, 항-글리코실화된 PD-L1 항체는 PD-L1의 선형 글리코실화 모티프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-글리코실화된 PD-L1 항체는 3 차원으로 글리코실화 모티프 중 1 이상에 인접하여 위치한 펩티드 서열에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-글리코실화된 PD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 비해 PD-L1의 1 이상의 글리코실화 모티프 또는 PD-L1의 글리코실화 모티프를 갖는 PD-L1의 펩티드에 선택적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1 단백질의 아미노산을 포함하는 선형 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-글리코실화된 PD-L1 항체는 글리코실화 모티프가 서열번호 1의 PD-L1의 N35, N192 N200, 및/또는 N219를 포함하는, PD-L1의 1 이상의 글리코실화 모티프에 선택적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1 단백질의 아미노산을 포함하는 입체구조(비선형) 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 이의 결합 부분은 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 이의 결합 부분은 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 50% 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 이의 결합 부분은 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 추가 양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 이의 결합 부분은 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 5-10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 이의 결합 부분은 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 대한 결합에 의해 나타나는 Kd의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 또는 20% 이하의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 이의 결합 부분은 5-20 nM 또는 10-20 nM(하부값 및 상부값 포함)의 친화도와 같은 나노몰농도 친화도로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다.
실시양태에서, 실시예 6에 기재된 바와 같은 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 결합하기 위한 MFI에 비해 적어도 또는 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배거나 그보다 큰, 특정 실시양태에서, 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 결합하기 위한 MFI에 비해 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이하 큰, WT PD-L1을 발현하는 세포에 대한 MFI만큼 발현된 결합을 나타낸다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중(H)쇄"는 약 50-70 kDa의 폴리펩티드 사슬을 지칭하되, 아미노-말단 부분은 약 115 내지 130 이상의 아미노산의 가변(V) 영역(V 도메인으로도 지칭됨) 및 불변(C) 영역을 포함하는 카복시-말단 부분을 포함한다. 불변 영역(또는 불변 도메인)은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 기본으로 하여, 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 지칭되는 5 개의 별개 유형(예를 들어, 이소형) 중 하나일 수 있다. 별개의 중쇄는 크기가 상이하다: α, δ 및 γ는 대략 450 아미노산을 함유하는 한편, μ 및 ε은 대략 550 아미노산을 함유한다. 경쇄와 조합될 때, 이들 별개 유형의 중쇄는 잘 알려진 클래스(예를 들어, 이소형)의 항체, 4 개의 서브클래스의 IgG, 소위 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여, 소위 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 각각 발생시킨다. 항체 중쇄는 인간 항체 중쇄일 수 있다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "경(L)쇄"는 약 25 kDa의 폴리펩티드 사슬을 지칭하되, 아미노-말단 부분은 약 100 내지 약 110 이상의 아미노산의 가변 도메인 및 불변 영역을 포함하는 카복시-말단 부분을 포함한다. 경쇄(V 및 C 도메인 둘 다)의 대략적인 길이는 211 내지 217 아미노산이다. 불변 영역의 아미노산 서열을 기본으로 하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2 개의 별개 유형의 경쇄가 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체 경쇄는 인간 항체 경쇄일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가변(V) 영역" 또는 "가변(V) 도메인"은 일반적으로 L 또는 H 사슬의 아미노-말단에 위치한 항체 폴리펩티드의 경(L)쇄 또는 중(H)쇄의 부분을 지칭한다. H 사슬 V 도메인은 약 115 내지 130 아미노산 길이를 갖는 한편, L 사슬 V 도메인은 100 내지 110 아미노산 길이이다. H 및 L 사슬 V 도메인은 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. H 사슬의 V 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. L 사슬의 V 영역은 "VL"로 지칭될 수 있다. 용어 "가변"은 V 도메인의 특정 절편이 상이한 항체 사이의 서열에서 광범위하게 상이하다는 점을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의하는 한편, 가변성은 항체 V 도메인의 110-아미노산 구간에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않다. 대신에, V 도메인은 각각 약 9-12 아미노산 길이인 "초가변 영역" 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 지칭되는 큰 가변성(예를 들어, 극단적 가변성)의 짧은 영역에 의해 분리된 약 15-30 아미노산의 프레임워크 영역(framework region)(FR)으로 지칭되는 덜 가변적인(비교적 비가변성인) 구간으로 구성된다. 항체 H 및 L 사슬의 V 도메인은 각각, β 시트 구조의 일부를 형성하는 일부 경우에, 루프 연결을 형성하는, β 시트 구조로 지칭되는, 3 개의 초가변 영역에 의해 연결된 β 시트 구성을 광범위하게 채택하는 4 개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬에서 초가변 영역은 FR에 의해 함께 근접하여 유지되며, 다른 사슬로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(예를 들어, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 참고). C 도메인은 항원에 항체를 결합하는 데에 직접 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity)(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity)(CDC)과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. V 도메인은 상이한 항체 클래스 또는 유형 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다. 서열에서의 가변성은 항체와 항원의 상호작용의 주요 원인이 되는 CDR에 집중된다. 구체적 실시양태에서, 항체의 가변 도메인은 인간 또는 인간화 가변 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역", "CDR", "초가변 영역", "HVR", 및 "HV"는 상호교환적으로 사용된다. "CDR"은 항체 VH β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3 개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 하나, 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3 개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 하나를 지칭한다. 본원에 사용될 때, 상기 용어는 서열에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 V 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6 개의 초가변 영역을 포함한다: VH 도메인의 3 개(H1, H2, H3) 및 VL 도메인의 3 개(L1, L2, L3). 따라서, CDR은 전형적으로 V 도메인의 프레임워크 영역 서열 내에 배치된 매우 가변적인 서열이다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 CDR의 측면 배치된 가변 영역 잔기이다. FR 잔기는, 예를 들어 키메라, 인간화, 인간, 도메인 항체, 디아바디, 선형 항체, 이중특이적, 또는 비파라토프 항체 내에 존재한다.
다수의 초가변 영역 설명이 본원에 사용되고 포함된다. CDR 영역은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 카밧(Kabat)에 의해 항체 V 도메인 내의 대부분의 초가변성의 영역으로서 정의되어 왔다(Kabat et al., 1977, J. Biol . Chem ., 252:6609-6616; Kabat, 1978, Adv . Prot . Chem ., 32:1-75). 카밧 CDR은 서열 가변성을 기본으로 하며, 가장 일반적으로 사용된다(예를 들어, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 참고). CDR 영역 서열은 또한, 코티아(Chothia)에 의해 보존적 β-시트 프레임워크의 일부가 아니므로, 상이한 입체구조를 채택할 수 있는 잔기로서 구조적으로 정의되어 왔다(Chothia et al., 1987, J. Mol . Biol ., 196:901-917). 코티아는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다. 코티아 CDR-H1 루프의 말단은 카밧 CDR 넘버링 협약을 사용하여 넘버링될 때, 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다(이는 카밧 넘버링 계획이 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문이며; 35A 및 35B 둘 다 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 종결되고; 35A만 존재하는 경우, 루프는 33에서 종결되며; 35A 및 35B 둘 다 존재하는 경우, 루프는 34에서 종결됨). 양측 넘버링 시스템 및 용어는 당업계에 잘 인식되어 있다.
최근, 범용 넘버링 시스템인 ImMunoGeneTics (IMGT) Information System®(Lefranc et al., 2003, Dev . Comp. Immunol ., 27(1):55-77)이 개발되어 왔으며, 광범위하게 채택되어 왔다. IMGT는 인간 및 다른 척추동물의 면역글로불린(Ig), T 세포 수용체(TR) 및 주조직적합복합체(MHC)에 특화된 통합 정보 시스템이다. 본원에서, CDR은 경쇄 또는 중쇄 내의 아미노산 서열 및 위치 둘 다와 관련하여 지칭된다. 면역글로불린 V 도메인의 구조 내의 CDR의 "위치"는 종들 사이에서 보존되며, 루프로 지칭되는 구조 내에 존재하기 때문에, 구조적 특징, CDR 및 프레임워크 잔기에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용함으로써 용이하게 확인된다. 이 정보는 하나의 종의 면역글로불린으로부터의 CDR 잔기를 전형적으로, 인간 항체로부터의 억셉터(acceptor) 프레임워크 내로 이식하고 치환하는데 사용될 수 있다. 추가의 넘버링 시스템(AHon)이 Honegger et al., 2001, J. Mol . Biol. 309:657-670에 의해 개발되어 왔다. 예를 들어, 카밧 넘버링과 IMGT 고유 넘버링 시스템을 포함하여, 넘버링 시스템 사이의 상응은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Kabat, Id.; Chothia et al., 1987, J. Mol . Biol ., 196:901-917, supra; Martin, 2010, Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag; 및 Lefranc et al., 1999, Nuc . Acids Res., 27:209-212 참고).
CDR 영역 서열은 또한 AbM, 콘택트(Contact) 및 IMGT에 의해서도 정의되어 왔다. AbM 초가변 영역은 카밧 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다(예를 들어, Martin, Id. 참고). "콘택트" 초가변 영역은 이용 가능한 복합 결정 구조의 분석을 기본으로 한다. 이들 초가변 영역 또는 CDR 각각으로부터의 잔기를 하기에 기재하였다.
CDR 영역 서열의 예시적 설명을 하기 표 3에 나타내었다. 표준 항체 가변 영역 내의 CDR의 위치는 많은 구조의 비교에 의해 결정되어 왔다(Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol . Biol ., 273:927-948; Morea et al., 2000, Methods, 20:267-279). 초가변 영역 내의 잔기의 수는 상이한 항체에서 달라지기 때문에, 표준 위치에 관한 추가 잔기는 전통적으로 표준 가변 영역 넘버링 계획에서 잔기 번호 다음에 a, b, c 등으로 넘버링된다(Al-Lazikani et al., Id.). 이러한 명명법은 당업자에게 유사하게 잘 알려져 있다.
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"친화도 성숙" 항체는 이의 1 이상의 HVR 내에 1 이상의 변화(예를 들어, 변경, 추가 및/또는 결실을 포함한 아미노산 서열 변이)를 가져, 상기 변화(들)를 포함하지 않는 모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화도에서의 개선을 야기하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 글리코실화된 PD-L1과 같은 표적 항원에 대해 나노몰농도 또는 피코몰농도 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 알려진 절차에 의해 생성된다. 검토를 위해, Hudson and Souriau, 2003, Nature Medicine 9:129-134; Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnol., 23:1105-1116; Quiroz and Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51을 참고한다.
"키메라" 항체는 H 및/또는 L 사슬의 부분, 예를 들어, V 도메인이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 아미노산 서열과 동일하거나 상동성인 반면에, 사슬(들)의 나머지, 예를 들어 C 도메인은 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체뿐 아니라, 소망하는 생물학적 활성을 발휘하는 한, 상기 항체의 단편이다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., 1984, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 참고).
"인간화" 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체는 천연 CDR 잔기가 소망하는 특이성, 친화도, 및 항원 결합과 상호작용을 위한 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(예를 들어, 도너(donor) 항체)의 상응하는 CDR로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린 서열을 지칭하는 항체(예를 들어, 수용체 항체)의 키메라 형태이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 1 이상의 FR 영역 잔기는 또한 상응하는 비인간 잔기에 의해 치환될 수 있다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 도너 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 인간화 항체의 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어진다. CDR 영역에서 1 이상의 변형은 또한, 예를 들어 친화도 성숙 항체에서 인간화 항체의 성능을 향상시키고 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 인간화 항체 H 또는 L 사슬은 CDR의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 CDR에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 FR인, 적어도 1 이상의 가변 영역의 실질적으로 전부를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 전형적으로, 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 당업자에게 알려져 있는 한편, 소망하는 경우, 추가 상세내용은 예를 들어, Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-329; and Presta, 1992, Curr . Op. Struct . Biol ., 2:593-596; Carter et al., 1992, Proc . Natl . Acd . Sci . USA, 89:4285-4289; 및 미국 특허 제6,800,738호(2004년 10월 5일 등록), 제6,719,971호(2005년 9월 27일 등록), 제6,639,055호(2003년 10월 28일 등록), 제6,407,213호(2002년 6월 18일 등록), 및 제6,054,297호(2000년 4월 25일 등록)에서 찾아볼 수 있다.
용어 "인간 항체" 및 "완전 인간 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 당업자에 의해 실시되는 바와 같이 인간 항체를 제조하기 위한 기법 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체를 지칭한다. 인간 항체의 이 정의는 특히 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하여, 당업계에 알려진 다양한 기법(Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol ., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol . Biol ., 222:581) 및 효모 디스플레이 라이브러리(Chao et al., 2006, Nature Protocols, 1: 755-768)를 사용하여 생성될 수 있다. 또한, Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boerner et al., 1991, J. Immunol ., 147(1):86-95에 기재된 방법이 인간 단클론 항체의 제조를 위해 이용 가능하다. 또한, van Dijk and van de Winkel, 2001, Curr . Opin . Pharmacol ., 5:368-74를 참고한다. 인간 항체는 내인성 Ig 좌위가 불능이 된 유전자도입(transgenic) 동물, 예를 들어 마우스, 및 인간 항체가 항원성 도전에 반응하여 생성되도록, 인간 항체를 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자를 보유하도록 유전적으로 변형된 유전자도입 동물에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, XENOMOUSETM 기술에 관한 Jakobovits, A., 1995, Curr. Opin . Biotechnol ., 6(5):561-6;
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and Taussing, 1997, Curr . Opin. Biotechnol ., 8(4):455-8; 및 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참고). 또한, 예를 들어 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006)를 참고한다. 구체적 실시양태에서, 인간 항체는 인간 기원의 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, "완전 인간" 항-PD-L1 항체는 또한 PD-L1 폴리펩티드에 결합하고 인간 생식세포 면역글로불린 핵산 서열의 천연 산출 신체적 변이체인 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항체를 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체는 완전 인간 항체이다. 용어 "완전 인간 항체"는 Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고)에 의해 기재된 바와 같은 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 어구 "재조합 인간 항체"는 숙주 세포 내로 형질주입된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체; 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입되고/되거나 염색체도입(transchromosomal)된 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)로부터 단리된 항체(예를 들어, Taylor, L. D. et al., 1992, Nucl . Acids Res. 20:6287-6295 참고); 또는 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 인간 항체를 포함한다. 상기 재조합 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가질 수 있다(Kabat, E. A. et al., Id 참고). 그러나, 특정 실시양태에서, 상기 재조합 인간 항체는 시험관내(in vitro) 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대해 동물 유전자도입이 사용될 때, 생체내 신체적 돌연변이유발)을 거치므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 한편, 인간 항체 생식세포 레퍼토리 내의 생체내에서 천연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항원의 표면 상의 국소화된 영역과 같이, 단일 항체 분자가 결합하는 항원 분자, 예를 들어 항-PD-L1 또는 항-glycPD-L1 항체의 1 이상의 항원 결합 영역에 의해 결합될 수 있는 PD-L1 폴리펩티드 또는 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드의 표면 상의 부위(들) 또는 영역(들)이다. 에피토프는 면역원성일 수 있으며, 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 구성되며, 특정한 3 차원 구조 특징뿐 아니라, 특정한 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체구조 에피토프일 수 있다. 에피토프에 기여하는 폴리펩티드의 영역은 선형 에피토프를 형성하는 폴리펩티드의 연속 아미노산일 수 있거나, 전형적으로, 입체구조 에피토프로 지칭되는 에피토프는 폴리펩티드의 2 이상의 비연속 아미노산 또는 영역으로부터 형성될 수 있다. 에피토프는 항원의 3 차원 표면 구조이거나, 항원의 3 차원 표면 구조가 아닐 수 있다. 특정 실시양태에서, PD-L1 에피토프는 PD-L1 폴리펩티드의 3 차원 표면 구조이다. 다른 실시양태에서, PD-L1 에피토프는 PD-L1 폴리펩티드의 선형 구조이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 에피토프는 1 이상의 부위에서 글리코실화된다. 일반적으로, 항원은 몇몇의 또는 많은 상이한 에피토프를 가지며, 많은 상이한 항체와 반응할 수 있다. 특별한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1, 특히 입체구조 에피토프인 글리코실화된 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
항체는 2 개의 항체가 3 차원 공간에서 동일하거나, 중첩되거나, 또는 인접한 에피토프를 인식할 때, 기준 항체로서 "에피토프" 또는 "필수적으로 동일한 에피토프" 또는 "동일한 에피토프"에 결합한다. 2 개의 항체가 3 차원 공간에서 동일하거나, 중첩되거나, 또는 인접한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 가장 광범위하게 사용되고, 신속한 방법은 예를 들어, 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다수의 상이한 형식으로 구성될 수 있는 경쟁 에세이이다. 일부 에세이에서, 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정화되거나, 세포 표면 상에 발현되며, 항원에 대한 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력은 검출 가능한 신호, 예를 들어 방사성, 형광 또는 효소 표지를 사용하여 측정된다. 또한, 항체의 에피토프는 결정된 다음에, 당업자에게 알려진, 예를 들어 본원의 실시예 8에 기재된 방법을 사용하여 비교될 수 있다.
PD-L1 표적 단백질 또는 이의 펩티드 상의 동일한 에피토프 또는 결합 부위에 대해 경쟁하는 항-PD-L1 항체의 맥락에서 사용될 때, 용어 "경쟁하다"는 연구 중인 항체가 일반 항원(예를 들어, PD-L1 또는 이의 단편)에 대한 기준 분자(예를 들어, 기준 리간드, 또는 기준 항체와 같은 기준 항원 결합 단백질)의 특이적 결합을 예방, 차단, 또는 억제하는 에세이에 의해 결정되는 바와 같은 경쟁을 의미한다. 시험 항체가 PD-L1(예를 들어, 인간 PD-L1 또는 인간 글리코실화된 PD-L1)에 결합하기 위해 기준 항체와 경쟁하는지를 결정하기 위해 많은 유형의 경쟁적 결합 에세이가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 에세이의 예는 고상 직접 또는 간접 방사면역에세이(RIA); 고상 직접 또는 간접 효소 면역에세이(enzyme immunoassay)(EIA); 샌드위치 경쟁 에세이(예를 들어, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253 참고); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619 참고); 고상 직접 표지된 에세이; 고상 직접 표지된 샌드위치 에세이(예를 들어, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 참고); 표지된 아이오딘(1125 표지)을 사용하는 고상 직접 표지 RIA(예를 들어, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15 참고); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552 참고); 및 직접 표지된 RIA(Moldenhauer et al., 1990, Scand . J. Immunol. 32:77-82)를 포함한다. 전형적으로, 이러한 에세이는 비표지된 시험 항원 결합 단백질(예를 들어, 시험 항-PD-L1 항체) 또는 표지된 기준 항원 결합 단백질(예를 들어, 기준 항-PD-L1 항체)을 보유한 고체 표면, 또는 세포에 결합되는 정제된 항원(예를 들어, 인간 PD-L1 또는 글리코실화된 PD-L1과 같은 PD-L1)의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 알려진 양의 존재 하에, 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 보통, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 에세이에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및/또는 입체적 방해가 발생하도록 야기하는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 대해 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하기 위한 방법에 관한 추가 상세내용은 본원에 기재되어 있다. 보통, 경쟁 항체 단백질이 과량으로 존재할 때, 적어도 15%, 또는 적어도 23%, 예를 들어, 비제한적으로, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 이상뿐 아니라, 기재된 양들 사이의 퍼센트 양으로 일반 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제할 것이다. 일반 사례에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96% 또는 97%, 98%, 99% 이상 억제된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "차단성" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 또는 기능적 활성을 예방, 억제, 차단, 또는 감소시키는 항체를 지칭한다. 차단성 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성 또는 기능을 실질적으로 또는 완전히 예방, 억제, 차단, 또는 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 차단성 항-PD-L1 항체는 PD-L1과 PD-1 사이의 결합 상호작용을 예방, 억제, 차단, 또는 감소시킬 수 있으므로, PD-1/PD-L1 상호작용과 연관된 면역억제 기능을 예방, 차단, 억제, 또는 감소시킬 수 있다. 용어 차단, 억제, 및 중화는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, PD-L1/PD-1 상호작용을 예방하거나, 이와 달리 방해하거나 감소시키는 본원에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체의 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 연속 배열에서 3 이상의 아미노산의 아미노산 중합체를 지칭한다. "폴리펩티드"는 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체, 올리고펩티드 등일 수 있다. 폴리펩티드를 포함하는 아미노산은 자연적으로 유래되거나 합성일 수 있다. 폴리펩티드는 생물학적 샘플로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, PD-L1 폴리펩티드 또는 펩티드는 인간 PD-L1 또는 글리코실화된 PD-L1의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 PD-L1 또는 글리코실화된 PD-L1의 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 또는 285 개의 연속 아미노산을 갖는다. 특정 실시양태에서, PD-L1 폴리펩티드는 PD-L1 폴리펩티드 또는 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 5 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 10 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 15 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 20 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 25 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 40 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 50 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 60 개의 연속 아미노 잔기, 적어도 70 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 80 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 90 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 100 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 125 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 150 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 175 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 200 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 250 개의 연속 아미노산 잔기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유사체"는 기준 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 포함하지만, 기준 폴리펩티드의 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 반드시 포함하지는 않거나, 기준 폴리펩티드의 유사하거나 동일한 구조를 반드시 포함하지는 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 기준 폴리펩티드는 PD-L1 폴리펩티드, PD-L1 폴리펩티드의 단편, 항-PD-L1 항체, 또는 항-glycPD-L1 항체일 수 있다. 기준 폴리펩티드와 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 본원에 기재된 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체일 수 있는 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 기준 폴리펩티드와 유사한 구조를 갖는 폴리펩티드는 본원에 기재된 PD-L1 폴리펩티드 또는 PD-L1 항체일 수 있는 기준 폴리펩티드의 구조와 유사한 2 차, 3 차 또는 4 차 구조를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 구조는, 비제한적으로, X선 결정학, 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance), 및 결정학 전자 현미경을 포함하여, 당업자에게 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 유사체는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체로서 기능한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체와 관련하여 사용될 때, 천연 또는 비변형된 PD-L1 서열 또는 항-PD-L1 항체 서열과 비교하여, 1 이상(예컨대, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5)의 아미노산 서열 치환, 결실, 및/또는 추가를 갖는 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체를 지칭한다. 예를 들어, PD-L1 변이체는 천연 PD-L1의 아미노산 서열에 대한 1 이상(예컨대, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5)의 변경으로부터 야기될 수 있다. 또한, 예로서, 항-PD-L1 항체의 변이체는 천연 또는 이전에 비변형된 항-PD-L1 항체의 아미노산 서열에 대한 1 이상(예컨대, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5)의 변경으로부터 야기될 수 있다. 폴리펩티드 변이체는 변이체를 코딩하는 상응하는 핵산 분자로부터 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체는 1 이상의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 1 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 항-glycPD-L1 항체이고, 바람직하게는 유사체는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체와 같이 기능한다.
용어 "동일성"은 서열을 정렬시키고 비교함으로써 결정된 바와 같이, 2 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 지칭한다. "퍼센트 동일성"은 비교된 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하며, 비교되는 분자의 최소 크기를 기본으로 하여 계산된다. 이들 계산을 위해, 정렬(존재하는 경우) 내의 갭(gap)은 특별한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, "알고리즘")에 의해 처리되어야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 방법은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds., 1994 , New Jersey: Humana Press; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., 1987, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., Eds., 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073에 기재된 것들을 포함한다.
퍼센트 동일성을 계산하는데 있어서, 비교되는 서열은 서열들 사이에 최대 매칭을 제공하는 방식으로 정렬될 수 있다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 예는 2 개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬하여 이의 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 사용되는 컴퓨터 알고리즘인 GAP(Devereux et al., 1984, Nucl . Acid Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)을 포함하는 GCG 프로그램 패키지이다. 서열은 이들 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 최적 매칭(알고리즘에 의해 결정되는 바와 같은 "매칭된 구간")을 위해 정렬될 수 있다. 갭 개방 페널티(gap opening penalty)(평균 대각선의 3 배로서 계산되며, "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고, "대각선"은 특별한 비교 매트릭스에 의해 각각 완벽한 아미노산 매칭을 위해 할당된 스코어 또는 수임); 갭 확장 페널티(보통 갭 개방 페널티의 1/10 배 임)뿐 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 콘쥬게이트되어 사용된다. 특정 실시양태에서, 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스에 대한 Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352; BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대한 Henikoff et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:10915-10919)가 또한 알고리즘에 의해 사용된다. GAP 프로그램을 사용하는 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 퍼센트 동일성을 확인하기 위한 예시적 파라미터는 다음을 포함한다: (i) 알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol . Biol ., 48:443-453; (ii) 비교 매트릭스: Henikoff et al., Id로부터의 BLOSUM 62.; (iii) 갭 페널티: 12(그러나, 말단 갭에 대해서는 패널티 없음); (iv) 갭 길이 페널티: 4; 및 (v) 유사성의 임계치: 0.
2 개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 계획은 2 개 서열의 짧은 영역만의 매칭을 야기할 수 있으며, 이 작은 정렬된 영역은 2 개의 전장 서열 사이에 상당한 관계가 없더라도, 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 대표적인 수의 아미노산, 예를 들어 표적 폴리펩티드의 적어도 50 개의 연속 아미노산에 걸친 정렬을 야기하기를 소망하는 경우, 선택된 정렬 방법(예를 들어, GAP 프로그램)은 조정될 수 있다.
기준 폴리펩티드 서열에 관한 퍼센트(%) 아미노산 동일성은 서열을 정렬하고 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입시킨 후에, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성 결정의 목적을 위한 정렬은 당업자의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸친 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유도체"는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 추가의 도입에 의해 변화된 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 기준 폴리펩티드는 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도체"는 또한, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 화학적으로 변형된 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체를 지칭한다. 예를 들어, PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체는, 예를 들어 알려진 보호/차단기, 단백분해 절단(proteolytic cleavage), 세포 리간드에 대한 연결, 펩티드 또는 단백질 태그 분자, 또는 다른 단백질 등에 대한 연결에 의한 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아마이드화, 유도체화에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 유도체는 부착된 분자의 유형 또는 위치에서 천연적으로 발생하거나 출발하는 펩티드 또는 폴리펩티드와 상이한 방식으로 변형된다. 유도체는 펩티드 또는 폴리펩티드 상에 천연적으로 존재하는 1 이상의 화학기의 결실을 추가로 포함한다. PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체의 유도체는, 비제한적으로, 튜니카마이신에 의한 특정 화학 절단, 아세틸화, 제형화, 대사 합성 등을 포함하여, 당업자에게 알려진 기법을 사용한 화학적 변형에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 또한, PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체의 유도체는 1 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드 유도체는 본원에 기재된 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체, 특히 이중 기능 항-glycPD-L1 단클론 항체일 수 있는 기준 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 적어도 2 개의 이종 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "융합"은 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체에 관하여 사용될 때 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체, 이의 변이체 및/또는 유도체와 이종 펩티드 또는 폴리펩티드의 연결, 융합, 또는 결합을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체의 생물학적 활성을 보유한다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 이종 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합, 융합, 또는 연결된 PD-L1 항체 VH 영역, VL 영역, VH CDR(1, 2 또는 3 개의 VH CDR), 및/또는 VL CDR(1, 2 또는 3 개의 VL CDR)을 포함하고, 융합 단백질은 PD-L1 단백질 또는 펩티드 상의 에피토프에 결합한다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인(바람직하게는, 인간 Fc 도메인)에 융합된 글리코실화된 PD-L1 펩티드가 제공된다. 융합 단백질은 당업계에서 실시되는 화학적 결합 반응을 통해, 또는 분자 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조성물"은, 선택적으로 특정 양 또는 유효량의 특정 구성요소 성분(예를 들어, 본원에 제공된 폴리펩티드 또는 항체)을 함유하는 생성물뿐 아니라, 선택적으로 특정 양 또는 유효량의 특정 구성요소 성분의 조합 또는 상호작용으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 야기되는 임의의 소망하는 생성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에게 비독성인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제, 비히클, 또는 안정제를 포함한다. 보통, 생리학적으로 허용 가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용 가능한 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트, 석시네이트, 및 다른 유기산과 같은 버퍼(buffer); 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량(예를 들어, 약 10 미만의 아미노산 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노오스, 수크로오스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 똔느 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 TWEENTM, 폴리에틸렌 글리코실(PEG), 및 PLURONICSTM과 같은 비이온 계면활성제를 포함한다. 용어 "담체"는 또한 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트(예를 들어, 프로인트 아쥬반트, 완전 또는 불완전), 부형제, 또는 비히클을 지칭할 수 있다. 약학 담체를 포함한 이러한 담체는 멸균액, 예컨대 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원의 것을 포함한 물 및 오일, 예컨대 땅콩 기름, 콩기름, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 물은 조성물(예를 들어, 약학 조성물)이 정맥내로 투여될 때의 예시적 담체이다. 또한, 생리식염수 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이, 특히 주사 가능한 용액에 대한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제(예를 들어, 약학 부형제)는, 비제한적으로, 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악(chalk), 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 또한, 소망하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 제형을 포함한 경구 조성물은 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카라이드, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA에 기재된다. 약학 화합물을 포함한 조성물은 치료적 유효량의 항-PD-L1 항체, 예컨대 항-glycPD-L1 항체를, 예를 들어 단리되거나 정제된 형태로, 적합한 양의 담체와 함께 함유하여, 대상체(예를 들어, 환자)에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공할 수 있다. 조성물 또는 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 희석제, 비히클, 보존제, 바인더, 또는 안정제로서 일반적으로 사용되는 불활성 물질을 지칭하며, 비제한적으로, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민 등), 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 등), 지방산 및 인지질(예를 들어, 알킬 설포네이트, 카프릴레이트 등), 계면활성제(예를 들어, SDS, 폴리소르베이트, 비이온 계면활성제 등), 사카라이드(예를 들어, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스 등) 및 폴리올(예를 들어, 만니톨, 소르비톨 등)을 포함한다. 또한, 참고를 위해 본원에 참고로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Id.를 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한" 또는 "약물학적으로 허용 가능한"은 사람과 같은 동물에게 적절하게 투여되었을 때, 불리한 반응, 알레르기 반응, 또는 다른 뜻밖의 또는 원치 않는 반응을 생성하지 않는 분자 독립체, 제형 및 조성물을 지칭한다. 항체 또는 추가 활성 성분을 포함한 약학 조성물의 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Id에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명의 측면에서 당업자에게 알려져 있다. 또한, 동물(예를 들어, 인간) 투여를 위해, FDA 생물학적 표준국과 같은 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 요구되거나, 미국 약전, 유럽 약전 또는 동물에서, 더욱 특별하게는 인간에서의 사용을 위한 일반적으로 인정된 다른 약전에 열거된 멸균성, 발열성, 일반적 안전성, 및 순도 표준을 충족해야 한다는 점이 이해될 것이다.
용어 "약학 제형"은 활성 성분(예를 들어, 항-PD-L1 항체 및 항-glycPD-L1 항체)의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태로 있으며, 제형이 투여될 대상체에 대해 허용 불가능한 독성일 수 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형은 멸균성, 즉 무균성이거나 모든 살아있는 미생물 및 이의 포자 등이 없을 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 생성물의 상용 패키지 내에 관례상 포함되는, 상기 치료 생성물의 용도에 관한 표시, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고를 함유하는 설명서를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", 또는 "치료하는"은 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 치료제의 투여 또는 적용, 또는 질환 또는 건강 관련 병태를 치료하는 것과 같은 적어도 하나의 양성적 치료 효과 또는 이득을 얻을 목적을 위한 대상체에 대한 절차 또는 양상의 수행을 지칭한다. 예를 들어, 치료는 다양한 유형의 암을 치료할 목적으로 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 조성물 또는 이의 제형의 약학적 유효량의 투여를 포함한다. 용어 "치료 계획", "투약 계획", 또는 "투약 프로토콜"은 상호교환적으로 사용되며, 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체와 같은 치료제의 시기 및 용량을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 암을 갖거나 암으로 진단받은 영장류, 포유동물, 및 척추동물과 같은 인간 또는 비인간 동물을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암 환자이다. 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 치료로부터 이득을 볼 것이거나 이득을 볼 것으로 예상된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적으로 유익한" 또는 "치료적으로 유효한"은, 특히 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 사용 및 기재된 방법의 수행의 결과로서 병태의 의료적 치료, 요법, 투여량 투여에 관하여 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 암을 갖거나 암으로 진단받은 대상체)의 웰-빙(well-being)의 촉진 또는 향상을 지칭한다. 이는, 비제한적으로, 질환의 신호 또는 증상의 빈도 또는 중증도에서의 감소를 포함한다. 예를 들어, 암의 치료는 예를 들어, 종양 크기에서의 감소, 종양의 침투성 또는 중증도에서의 감소, 말초 조직 또는 장기 내로의 암 세포 침투 감소; 종양 또는 암의 성장률에서의 감소, 또는 전이의 예방 또는 감소를 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 대상체에서 지속된 반응을 달성하는 것 또는 암을 갖는 대상체의 생존을 연장하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하다" 또는 "투여"는, 예를 들어 주사 또는 경구 경로를 통해, 예컨대 경구, 피하, 점막, 피내, 정맥내, 근육내 전달 및/또는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 물리적 전달의 다른 방법에 의해, 신체 외부에 존재하는 물질을 환자 내부로 물리적으로 전달하는 행동을 지칭한다. 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상이 치료적으로 치료될 때, 물질의 투여는 전형적으로 질환, 장애 또는 병태 또는 이의 증상의 개시 후에 발생한다. 예방적 치료는 상기 질환, 장애 또는 병태 또는 이의 증상의 개시 전의 시점의 물질의 투여를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 암 또는 이와 관련된 증상의 중증도 및/또는 기간을 감소, 약화, 완화, 및/또는 개선하기에 충분한 치료제(예를 들어, 본원에 제공된 항체 또는 약학 조성물)의 수량 또는 양을 지칭한다. 이 용어는 또한 암의 발전 또는 진행의 감소 또는 개선; 암의 재발, 발달, 또는 개시의 감소 또는 개선; 및/또는 다른 암 요법(예를 들어, 본원에 제공된 항-PD-L1 항체 또는 항-glycPD-L1 항체의 투여 이외의 요법)의 예방적 또는 치료적 효과(들)의 개선 또는 향상을 위해 필요한 양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 유효량은 약 또는 0.1 mg/kg(대상체의 체중 kg 당 항체의 mg) 내지 약 또는 100 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 유효량은 약 또는 0.1 mg/kg, 약 또는 0.5 mg/kg, 약 또는 1 mg/kg, 약 또는 3 mg/kg, 약 또는 5 mg/kg, 약 또는 10 mg/kg, 약 또는 15 mg/kg, 약 또는 20 mg/kg, 약 또는 25 mg/kg, 약 또는 30 mg/kg, 약 또는 35 mg/kg, 약 또는 40 mg/kg, 약 또는 45 mg/kg, 약 또는 50 mg/kg, 약 또는 60 mg/kg, 약 또는 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 또는 100 mg/kg이다. 이들 양은 그 안의 양 및 범위를 포함한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, "유효량"은 또한 특정 결과(예를 들어, 세포 표면 PD-L1에 대한 세포 표면 PD-1 결합 예방, 차단, 또는 억제; 또는 PD-1/PD-L1 매개된 면역억제 예방, 차단, 또는 억제)를 달성하기 위한 본원에 제공된 항체의 양을 지칭한다.
치료제(예를 들어, 다른 약제, 항암 약물, 항암 요법)의 투여의 맥락에서, 용어 "조합된"은 1 이상의 요법(예를 들어, 약물 요법 및/또는 항암 요법)의 사용을 포함한다. 1 이상의 추가 치료제와 "조합된" 투여는 동시(예를 들어, 공존) 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다. 용어 "조합된"의 사용은 요법이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 비제한적 예로서, 1 차 요법(예를 들어, 항-glycPD-L1 항체와 같은 약제)은 2 차 요법(예를 들어, 약제)의 투여 전에(예를 들어, 1 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 또는 12 주), 동시에, 또는 이후에(예를 들어, 1 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 또는 12 주 이상) 암을 갖거나 암으로 진단된 대상체에게 투여될 수 있다.
요법(예를 들어, 치료제를 포함한 약제의 사용)의 조합은 임의의 2 이상의 단일 요법(예를 들어, 상승 효과를 가짐)의 추가 효과에 비해 더욱 효과적일 수 있거나, 개선된 부작용 프로파일, 증가된 치료 효과의 효능 또는 기간, 상기 조합이 효과적인 광범위한 환자 집단 등과 같이 선험적으로 예측되지 않는 다른 이득을 가질 수 있다. 상기 효과는 전형적으로 예상되지 않으며, 예측될 수 없다. 예를 들어, 치료제의 조합의 상승 효과는 흔히 1 이상의 약제의 낮은 투여량의 사용 및/또는 암 환자에 대한 약제의 덜 빈번한 투여를 허용한다. 낮은 투여량의 치료제 및 암 요법을 이용하고/하거나 덜 빈반하게 요법을 투여하는 능력은 요법의 효과성을 감소시키지 않으면서 대상체에 대한 요법의 투여와 연관된 독성에 대한 가능성을 감소시킨다. 또한, 상승 효과는 암의 치료 또는 개선에서 요법의 효능 개선을 야기한다. 또한, 요법(예를 들어, 치료제)의 조합에 의해 입증된 상승 효과는 임의의 단일 요법의 사용과 연관된 불리하거나 원치 않는 부작용을 회피하거나 감소시킬 수 있다.
이중 기능 항- 글리코실화된 PD-L1 항체
본원은 글리코실화된 PD-L1 단백질(예를 들어, 특정 N-글리칸 구조; PD-L1의 특정 글리코펩티드를 갖는 PD-L1 단백질) 또는 글리코실화된 PD-L1 펩티드에 결합하고, 이들이 PD-L1/PD-1 상호작용을 감소시키거나 차단하는 이중 기능이며, 또한 종양 세포 상에서 PD-L1의 내부화 및 분해를 촉진하는 항체뿐 아니라, 질환, 특히 암의 치료에서 상기 항체의 용도를 제공한다. 항체는 비글리코실화된 PD-L1과 비교하여, 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 결합한다. 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE Ig 클래스뿐 아니라, 항원 결합 활성을 보유하는 항체 CDR 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 것일 수 있다. 예시적으로, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 키메라, 친화도 성숙, 인간화, 또는 인간 항체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 단클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 단클론 항-glycPD-L1 항체는 STM073 또는 STM108이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 인간화 항체 또는 키메라 항체, 특히 STM073 또는 STM108의 인간화 또는 키메라 형태이다. 본원에 기재된 바와 같이 알려진 수단에 의해, 글리코실화된 PD-L1 항원, 이의 각각의 에피토프 중 1 이상, 또는 상술한 것 중 임의의 것의 콘쥬게이트에 대해 특이적인 다클론 또는 단클론 항체, 항체 단편, 결합 도메인 및 CDR(상술한 것 중 임의의 것의 조작된 형태를 포함함)이 생성될 수 있으며, 상기 항원 또는 에피토프는 천연 공급원으로부터 단리되거나 천연 화합물의 합성 유도체 또는 변이체이다. 항체는 이중특이적이거나 비파라토프일 수 있다.
실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 예를 들어 이종 비인간, 인간 또는 인간화 서열(예를 들어, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)에 이식된 비인간 도너로부터의 항원 결합 서열(예를 들어, V 도메인 및/또는 CDR)을 포함하는 항체이다. 일 실시양태에서, 비인간 도너 서열은 마우스 또는 래트로부터의 것이다. 구체적 실시양태에서, VH 및 VL 도메인은 비인간, 예를 들어 뮤린이고, 불변 도메인은 인간이다. 일 실시양태에서, 항원 결합 서열은 예를 들어, 돌연변이유발(예를 들어, 인간 파지 라이브러리 등의 파지 디스플레이 스크리닝)에 의해 얻어진 합성이다. 일 실시양태에서, 키메라 항체는 뮤린 V 영역 및 인간 C 영역을 갖는다. 일 실시양태에서, 뮤린 경쇄 V 영역은 인간 카파 경쇄 C 영역에 융합된다. 일 실시양태에서, 뮤린 중쇄 V 영역은 인간 IgG1 C 영역에 융합된다.
실시양태에서, 항체는 낙타과 항체로부터, 바람직하게는 VHH 도메인 서열 또는 NanobodyTM로 알려진 경쇄가 없는 중쇄 낙타과 항체로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인이다. NanobodyTM(Nb)는 천연적으로 발생하는 단일쇄 항체의 최소 기능적 단편 또는 단일 가변 도메인(VHH)이며, 당업자에게 알려져 있다. 이들은 낙타과에서 나타나는 중쇄 유일 항체로부터 유래된다(Hamers-Casterman et al., 1993, Nature, 363:446-448; Desmyter et al., 1996, Nat. Struct . Biol ., p. 803-811). "낙타과"의 패밀리에서, 경쇄 폴리펩티드가 없는 면역글로불린이 발견된다. "낙타과"는 구세계 낙타과(카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius)) 및 신세계 낙타과(예를 들어, 라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama), 라마 가우니코에(Lama guanicoe) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))를 포함한다. 단일 가변 도메인 중쇄 항체는 본원에서 NanobodyTM 또는 VHH 항체로서 표시된다. Nb의 작은 크기 및 고유한 생물물리학적 특성은 드물거나 숨겨진 에피토프의 인식 및 단백질 표적의 구멍 또는 활성 부위로의 결합에 대해 종래의 항체 단편보다 뛰어나다. 또한, Nb는 리포터 분자에 부착되거나 인간화된 다중-특이적 및 다가 항체로서 설계될 수 있다. Nb는 안정적이고, 위장계에 생존하며 용이하게 제조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 상이한 특이성의 2 개의 항원 결합 부위를 단일 구축물로 결합함으로써, 이중특이적 항체는 예민한 특이성을 갖는 2 개의 신중한 항원을 결합시키는 능력을 가지므로, 치료제로서 큰 가능성을 갖는다. 이중특이적 항체는 본래 각각 상이한 면역글로불린을 생성할 수 있는 2 개의 하이브리도마를 융합함으로써 제조되었다. 이중특이적 항체는 또한 2 개의 scFv 항체 단편을 결합시키는 한편, 완전 면역글로불린에 존재하는 Fc 부분을 생략함으로써 생성된다. 상기 구축물에서 각각의 scFv 단위는 합성 폴리펩티드 링커를 통해 서로 결합된 중(VH) 및 경(VL) 항체 사슬 각각으로부터의 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있으며, 후자는 보통 유전적으로 조작되어 최소로 면역원성인 반면에, 단백분해에 대해 최대로 저항성인 채로 유지된다. 각각의 scFv 단위는 2 개의 scFv 단위를 가교하여 이중특이적 단일쇄 항체를 생성하는 짧은(보통 10 아미노산 미만) 폴리펩티드 스페이서의 결합을 포함하여, 다수의 알려진 기법에 의해 결합될 수 있다. 따라서, 얻어진 이중특이적 단일쇄 항체는 단일 폴리펩티드 사슬 상에 상이한 특이성의 2 개의 VH/VL 쌍을 함유하는 종이며, 각각의 scFv 단위에서 상기 VH 및 VL 도메인은 이들 2 개의 도메인 사이의 분자내 결합을 허용하여, 그렇게 형성된 scFv 단위가 예를 들어, 하나의 scFv 단위의 VH 도메인과 다른 scFv 단위의 VL 사이의 소망하지 않는 결합을 예방하도록 충분히 짧게 유지되는 폴리펩티드 스페이서를 통해 서로 연속하여 묶이기에 충분한 길이의 폴리펩티드에 의해 분리된다.
다른 실시양태에서, 항체는 비파라토프 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비파라토프 항체"는 동일한 단백질 표적, 예를 들어 종양 관련 PD-L1 표적 항원, 또는 본원에 기재된 바와 같은 글리코실화된 PD-L1 표적 항원 상의 2 개의 상이한 비중첩 에피토프, 항원성 결정인자, 또는 도메인을 인식하고 이에 결합하는 2 개의 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자를 지칭한다. 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 glycPD-L1 또는 이의 1 이상의 펩티드 부분에 대해 지향된 비파라토프 항체는 제1 면역글로불린 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 가변 도메인을 포함하되, 2 개의 결합 도메인은 동일한 표적 glycPD-L1 단백질의 2 개의 상이한 비중첩 에피토프에 결합한다. 제1 및 제2 면역글로불린 결합 도메인에 의해 인식된 에피토프 중 하나 또는 둘 다는 글리코실화되거나 글리코실화된 잔기를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 면역글로불린은 비글리코실화된 형태에 비해 glycPD-L1 단백질의 글리코실화된 형태에 우선적으로 결합한다.
다른 실시양태에서, 비파라토프 항체는 glycPD-L1 표적 분자 상의 에피토프에 결합하는 면역글로불린(바람직하게는, 3가 IgG) 및 동일한 glycPD-L1 표적 분자 상의 상이한 비중첩 에피토프에 결합하는 scFv를 포함하며, 상기 면역글로불린 및 scFv는 링커에 의해 연결되어, glycPD-L1 표적 분자 상의 상이한 비중첩 에피토프에 대한 면역글로불린 및 scFv의 결합을 허용한다. 따라서, 비파라토프 항체는 동일한 glycPD-L1 표적 상의 상이한 에피토프(또는 도메인)에 결합하는(즉, 비파라토프 결합) 2 개의 항-glycPD-L1 항체로부터 생성되어, 결합 친화도/결합활성을 향상시키고/시키거나; 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)과 같은 향상된 이펙터 기능을 위해 종양 세포 상의 항체 로드를 증가시키고/시키거나; 종양 체류 시간을 개선 또는 증가시킨다. 또한, 종양 관련 glycPD-L1 항원 상의 2 개의 비중첩 에피토프를 표적화하는 2가 비파라토프 항체는 세포막에서 glycPD-L1 표적 분자의 클러스터링(clustering)을 유도하여, 결국 내부화, 리소좀 수송 및 분해 증가를 촉진할 수 있는 가능성을 갖는다. 표적 단백질/항원 상의 2 개의 상이한 비중첩 에피토프에 대해 지향된 비파라토프 항체는 당업계에 알려진 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, B. Roberts et al., 1999, Int . J. Cancer, Vol. 81:285-291 (carcinoembryonic antigen, CEA); D. Lu et al., 1999, J. Immunol . Methods, Vol. 230:159-71 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGF2); 2009년 6월 4일 공개된 WO 2009/068627, Ablynx NV; 2010년 12월 16일 공개된 WO 2010/142534, 및 Ablynx NV를 참고한다.
실시양태에서, 2가 비파라토프 항체는 소정의 glycPD-L1 표적 단백질 상의 상이한 비중첩 에피토프를 인식하고 이에 결합하는 것으로 본원에 기재된 바와 같이 확인된 2 개의 상이한 항-glycPD-L1 항체로부터의 가변 도메인 서열을 사용함으로써 생성될 수 있으며, 상기 항체는 glycPD-L1 상의 상이한 비중첩 에피토프를 인식하는 제2 항-PD-L1 항체의 H 사슬 및/또는 L 사슬의 N-말단, 또는 대안적으로, CH3 도메인의 C-말단에 부착된 항-glycPD-L1 항체 중 하나의 단일쇄 가변 단편(scFv)을 함유한다. scFv는 예를 들어, scFv에서 결합 도메인을 연결하기 위해 사용되는 링커와 같은 펩티드 링커를 통해 제2 항-PD-L1 항체에 연결될 수 있다. 예를 들어, Dimasi et al., J. Mol . Biol ., 393:672-692 (2009)를 참고한다. 얻어진 결합 분자 생성물, 또는 비파라토프 항체는 glycPD-L1 상의 2 개의 상이한 에피토프와 상호작용하고 이에 결합할 수 있는, 4 개의 항-glycPD-L1 결합 단위, 또는 분자의 각각의 암(arm) 상의 2 개의 결합 단위를 함유한다. 이 실시양태에 따라, 종양 세포의 표면 상에 발현된 glycPD-L1 상의 2 개의 비중첩 에피토프를 표적화하는 2가 비파라토프 항체는 에피토프 결합을 통해 glycPD-L1를 효과적으로 교차결합하여, 세포 표면 상의 glycPD-L1의 클러스터링을 유도해, 향상된 내부화 및 리소좀 분해를 유도하고 촉진하는 큰 복합체의 형성을 야기할 수 있었다. 실시양태에서, 비파라토프 항체는 독소 또는 항암 약물에 연결되어, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)를 생성한다. 상기 항-PD-L1 비파라토프 항체의 향상된 내부화 및 내포작용 및 리소좀 수송은 궁극적으로 표적 세포 내로의 많은 양의 독소의 전달 및 큰 종양 세포 사멸 또는 퇴축을 야기한다. 상기 효과는 비파라토프 항-HER2 ADC에 대해 기재된 바와 같이 시험관내 및 생체내 둘 다에서 관찰되었다(J.Y. Li et al., 2016, Cancer Cell, Vol. 29:117-129). 예시적으로, 글리코실화된 막-결합된 PD-L1의 2 개의 비중첩 에피토프에 특이적으로 결합하여, 이의 PD-1 동족 결합 파트너와의 상호작용을 예방하거나 차단하고, 이의 내부화 및 분해뿐 아니라, 항-glycPD-L1 ADC가 사용되는 경우, 종양 세포의 사멸을 촉진하는 비파라토프 항-glycPD-L1 항체 또는 항-glycPD-L1 ADC가 생성될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 STM073, STM108, 또는 이의 ADC 형태이다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 의해 포함되는 항-glycPD-L1 결합 분자 또는 항체는 멀티파라토프일 수 있으며 즉, 동일한 glycPD-L1 표적 분자 상의 3 개, 4 개, 또는 그 이상의 상이한, 바람직하게는 비중첩 에피토프 또는 항원성 결정인자를 인식하고 이에 결합하는 항원 결합 도메인을 함유한다. 또 다른 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비파라토프 또는 멀티파라토프 및 다가 둘 다이며, 즉 상이한 표적 glycPD-L1 분자 상의 1 이상의 상이한 에피토프 또는 항원성 결정인자를 인식하고 이에 결합하는 항원 결합 부위 또는 "파라토프(paratope)"를 또한 포함한다.
사용에 적합한 항체 단편의 예는, 비제한적으로, (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 "Fd" 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 "Fv" 단편; (iv) VH 도메인으로 구성된 "dAb" 단편; (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2 개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인과 VL 도메인이 2 개의 도메인이 결합하여 결합 도메인을 형성하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv 분자("scFv"); (viii) 이중특이적 단일쇄 Fv 이량체(미국 특허 제5,091,513호 참고); 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축되는 디아바디, 다가, 또는 다중특이적 단편(미국 특허 출원 제20050214860호)을 포함한다. Fv, scFv, 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화물 다리의 결합에 의해 안정화될 수 있다. CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디(Hu et al., 1996, Cancer Res., 56:3055-3061)가 또한 유용할 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 펩티도미메틱(peptidomimetic)이 또한 실시양태에서 고려된다. 감소된(pared-down) 항체로서 작용하고 긴 혈청 반감기뿐 아니라, 덜 번거로운 합성 방법의 특정 이점을 갖는 펩티드인 "항체 유사 결합 펩티도미메틱"(ABiP)이 Liu et al., 2003, Cell Mol . Biol ., 49:209-216에 의해 보고되어 왔다.
동물은 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 항원으로 접종되어, 면역 반응을 생성하고 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 생성할 수 있다. 자주, 항원은 다른 분자에 결합되거나 콘쥬게이트되어, 면역 반응을 향상시킨다. 본원에 사용된 바와 같이, 콘쥬게이트는 동물에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용되는 항원에 결합되는 임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 비단백질성 물질이다. 항원 접종에 반응하여 동물에서 생성된 항체는 B 림프구를 생성하는 다양한 개별 항체로부터 제조된 다양한 비-동일성 분자(다클론 항체)를 포함한다. 다클론 항체는 항체 종들의 혼합된 집단이며, 이들 각각은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식할 수 있다. 동물에서 다클론 항체 생성을 위한 올바른 조건이 주어지면, 동물의 혈청에서 대부분의 항체는 동물이 면역화된 항원성 화합물 상의 집단 에피토프를 인식할 것이다. 이 특이성은 관심 항원 또는 에피토프를 인식하는 항체만을 선택하기 위해 친화도 정제에 의해 추가로 향상된다.
단클론 항체는 모든 항체 분자가 동일한 에피토프를 인식하는 단일, 클론 종의 항체이며, 이는 모든 항체 생성 세포가 단일, 항체-생성 B-림프구로부터 유래되기 때문이다. 단클론 항체(MAb)를 생성하기 위한 방법은 일반적으로 다클론 항체를 제조하기 위한 방법과 동일한 선을 따라 시작한다. 일부 실시양태에서, 마우스 및 래트와 같은 설치류가 단클론 항체를 생성하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 토끼, 양, 또는 개구리 세포가 단클론 항체를 생성하는데 사용된다. 래트의 사용은 잘 알려져 있으며, 특정 이점을 제공할 수 있다. 마우스(예를 들어, BALB/c 마우스)는 일상적으로 사용되고, 일반적으로 높은 비율의 안정된 융합을 제공한다. 단클론 항체 생성에서 사용되는 바와 같은 하이브리도마 기술은 글리코실화된 PD-L1 단백질 또는 펩티드와 고정화된 골수종 세포, 예를 들어 마우스 골수종 세포주를 이용하여 이전에 면역화된 마우스로부터 단리된 단일, 항체-생성 B 림프구의 융합을 포함한다. 이 기술은 무기한 세대 동안 단일 항체-생성 세포를 번식시켜, 동일한 항원 또는 에피토프 특이성을 갖는 비제한적 양의 구조적으로 동일한 항체, 즉 단클론 항체가 생성될 수 있는 방법을 제공한다.
조작된 항체는 단클론 항체 및 다른 항체 및 원래 항체의 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자(즉, 분자는 특이적 결합 도메인을 가짐)를 생성하기 위한 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 상기 기법은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 항체의 프레임워크 영역, 불변 영역, 또는 불변 영역 및 프레임워크 영역에 대한 유전자 물질 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,091,513호 및 제6,881,557호를 참고한다.
본원에 기재된 바와 같이 알려진 수단에 의해, 글리코실화된 PD-L1 단백질, 이의 각각의 에피토프 중 1 이상에 특이적으로 결합하고, PD-L1 대 PD-1 결합을 차단하고 종양 세포에서 PD-L1의 내부화를 촉진하는 이중 기능을 갖는, 결합 활성, 결합 도메인 및 CDR을 갖는 다클론 또는 단클론 항체, 항체 단편(상술한 것 중 임의의 것의 조작된 형태를 포함함), 또는 상술한 것 중 임의의 것의 콘쥬게이트가 생성될 수 있으며, 상기 항원 또는 에피토프는 천연 공급원으로부터 단리되거나 천연 화합물의 합성 유도체 또는 변이체이다.
항체는 새 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 공급원으로부터 생성될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 양, 뮤린(예를 들어, 마우스 및 래트), 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말, 또는 닭이다. 또한, 인간 항체는 인간 조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지 항체 발현 기술은 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,946,546호에 기재된 바와 같이, 특정 항체가 동물 면역화의 부재 하에서 생성되게 한다. 이들 기법은 Marks, 1992, Bio/Technol., 10:779-783; Stemmer, 1994, Nature, 370:389-391; Gram et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:3576-3580; Barbas et al., 1994, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 91:3809-3813; 및 Schier et al., 1996, Gene, 169(2):147-155에 추가로 기재되어 있다.
다양한 동물 종에서 다클론 항체를 생성할뿐 아니라, 인간화, 키메라, 및 완전 인간을 포함한 다양한 유형의 단클론 항체를 생성하기 위한 방법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 매우 재현 가능하다. 예를 들어, 다음 미국 특허들은 상기 방법의 설명을 제공하며, 본원에 참고로 포함된다: 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,196,265호; 제4,275,149호; 제4,277,437호; 제4,366,241호; 제4,469,797호; 제4,472,509호; 제4,606,855호; 제4,703,003호; 제4,742,159호; 제4,767,720호; 제4,816,567호; 제4,867,973호; 제4,938,948호; 제4,946,778호; 제5,021,236호; 제5,164,296호; 제5,196,066호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,420,253호; 제5,565,332호; 제5,571,698호; 제5,627,052호; 제5,656,434호; 제5,770,376호; 제5,789,208호; 제5,821,337호; 제5,844,091호; 제5,858,657호; 제5,861,155호; 제5,871,907호; 제5,969,108호; 제6,054,297호; 제6,165,464호; 제6,365,157호; 제6,406,867호; 제6,709,659호; 제6,709,873호; 제6,753,407호; 제6,814,965호; 제6,849,259호; 제6,861,572호; 제6,875,434호; 제6,891,024호; 제7,407,659호; 및 제8,178,098호.
본원에 제공된 글리코실화된 PD-L1으로 지향된 항체는 항체의 동물 종, 단클론 세포주 또는 다른 공급원과 관계 없이, 글리코실화된 PD-L1의 효과를 중화, 차단, 억제, 또는 대응하는 능력을 가질 것으로 예상된다. 특정 동물 종은 치료 항체를 생성하기에 덜 바람직할 수 있으며, 이는 이들이 항체의 "Fc" 부분을 통한 보체계의 활성화로 인해 면역 또는 알레르기 반응을 더욱 야기할 수 있기 때문이다. 그러나, 전체 항체는 "Fc"(보체 결합) 항체, 및 결합 도메인 또는 CDR을 갖는 펩티드 단편으로 효소로 분해될 수 있다. Fc 부분의 제거는 이 항체 단편이 소망하지 않는 면역학적 반응을 유도할 가능성을 감소시키므로, Fc 부분이 없는 항체는 예방적 또는 치료적 치료를 위해 바람직할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 항체는 또한 키메라, 인간화, 또는 부분적 또는 완전 인간이 되도록 구축되어, 다른 종에서 생성되거나 다른 종으로부터의 아미노산 서열을 갖는 항체를 동물에게 투여하는 것으로부터 야기되는 잠재적인 부정적 면역학적 효과를 감소시키거나 제거할 수 있다.
항체 단백질은 재조합체이거나, 시험관내 합성될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체-함유 조성물에서는, mL 당 약 0.001 mg 내지 약 10 mg의 총 항체 폴리펩티드가 있는 것으로 고려된다. 따라서, 조성물 중 항체 단백질의 농도는 약, 적어도 약 또는 최대 약 또는 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 mg/mL 이상(또는 이의 유도 가능한 임의의 범위)일 수 있다. 이 중, 약, 적어도 약, 최대 약, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 글리코실화된 PD-L1에 결합하는 항체일 수 있다.
결합 활성을 보유하는 항체 또는 항체의 면역학적 부분은 다른 단백질을 갖는 융합 단백질에 화학적으로 콘쥬게이트되거나, 다른 단백질을 갖는 융합 단백질로서 재조합적으로 발현될 수 있다. 본원에 기재된 목적을 위해, 모든 상기 융합된 단백질은 항체 또는 항체의 면역학적 부분의 정의에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체 콘쥬게이트 또는 페이로드(payload)를 형성하기 위해 적어도 하나의 약제에 연결되는 글리코실화된 PD-L1, 또는 폴리펩티드에 대해 생성되는 이중 기능 항체 및 항체-유사 분자가 포함된다. 진단제 또는 치료제로서 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 소망하는 분자 또는 모이어티를 항체에 연결시키거나 공유 결합시키거나 복합체화시킬 수 있다. 상기 연결된 분자 또는 모이어티는, 비제한적으로, 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있다. 이펙터 분자는 소망하는 활성, 예를 들어 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착될 수 있는 이펙터 분자의 비제한적인 예는 독소, 치료 효소, 항생제, 방사성-표지된 뉴클레오티드 등을 포함한다. 반대로, 리포터 분자는 에세이를 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체에 콘쥬게이트될 수 있는 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성표지, 합텐, 형광 표지, 인광성 분자, 화학발광성 분자, 발색단, 발광성 분자, 광친화성 분자, 유색 입자 또는 리간드, 예컨대 비오틴 등을 포함한다. 항체를 콘쥬게이트 분자 또는 모이어티에 부착하거나 콘쥬게이트시키기 위한 몇몇 방법이 당업계에 알려져 있다. 일부 부착 방법은 금속 킬레이트 복합체의 사용을 포함하며, 비제한적 예로서, 유기 킬레이트제, 예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(diethylenetriaminepentaacetic acid anhydride)(DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-툴루엔술폰아마이드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3-6α-디페닐글리코우릴-3을 사용한다. 항체, 특히 본원에 기재된 바와 같은 항체는 또한 글루타르알데하이드 또는 퍼아이오데이트(periodate)와 같은 커플링제의 존재 하에 효소와 반응할 수 있다. 형광 마커와의 콘쥬게이트는 전통적으로 이들 커플링제의 존재 하에서 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 화합물 또는 물질에 결합되거나 연결되어, 투여 후 혈장, 혈청, 또는 혈액에서 이의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다.
특별한 실시양태에서, 비글리코실화된 PD-L1 단백질에 비해 글리코실화된 PD-L1 단백질에 특이적으로 및 우선적으로 결합하고, PD-L1/PD-1 결합을 차단하며 PD-L1 내부화 및 분해를 촉진하는 이중 기능을 갖는 항체, 예컨대 단클론 항체, 및 이의 인간화 및 키메라 형태, 및 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 PD-L1 단백질의 아미노산 서열의 위치 35, 192, 200 및/또는 219에서 글리코실화되는 PD-L1 단백질에 특이적으로 및 우선적으로 결합한다. 예를 들어, 항-glycPD-L1 항체의 특이적 또는 선택적 결합은 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 2분의 1 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1 항원에 항체가 결합하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 5 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 6에 기재된 바와 같은 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 결합하기 위한 MFI에 비해 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 큰 WT PD-L1을 발현하는 세포에 대한 MFI 만큼 발현된 결합을 나타낸다.
실시양태에서, STM073에 의해 결합된 PD-L1 에피토프에 특이적으로 결합하는 글리코실화된 PD-L1에 대해 특이적이고 이에 우선적으로 결합하는 이중 기능 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 특정 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 H69, Y112, R113 및 K124를 포함하는 PD-L1 상의 에피토프에 결합한다. 실시양태에서, 에피토프의 아미노산은 비연속적이며, 에피토프는 입체구조 에피토프이다. STM073 MAb 에피토프를 포함하는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 영역은 서열 VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(즉, 서열번호 85 또는 서열번호 1의 V68-V128)를 갖고, MAb STM073에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기 H69, Y112, R113 및 K124는 밑줄쳐 있다. STM073 에피토프 서열에서, 위치 78의 아미노산 잔기 히스티딘(H)과 위치 108의 아미노산 잔기 아스파르트산(D) 사이의 파선은 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 79-107의 아미노산을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 단클론 항체 STM108, 또는 이의 인간화 또는 키메라 형태인 글리코실화된 PD-L1에 대해 특이적이고 이에 우선적으로 결합하는 이중 기능 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 구체적 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1은 본원의 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 S80, Y81, K162 및 S169를 포함하는 PD-L1 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. STM108 MAb 에피토프를 포함하는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 영역은 아미노산 서열 LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ(즉, 서열번호 1의 L74-Q173)를 갖고, MAb STM108에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기 S80, Y81, K162 및 S169는 밑줄쳐 있다. STM108 에피토프 영역에서, 위치 84의 아미노산 잔기 아르기닌(R)과 위치 158의 아미노산 잔기 글루탐산(E) 사이의 파선은 서열번호 1의 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 85-157의 아미노산을 나타낸다. 따라서, STM108 MAb 에피토프의 아미노산은 비연속적이며, 에피토프는 입체구조 에피토프이다.
STM073 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 상응하는 아미노산 서열을 하기 표 3에 나타낸다. 표 3은 STM073의 성숙(즉, 단일 펩티드를 함유하지 않음) VH 및 VL 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(각각 서열번호 2, 3, 10, 및 11) 및 단일 펩티드를 함유하는 VH 및 VL 도메인 서열(각각 서열번호 87, 88, 89, 및 90) 둘 다를 제공한다. 표 3에 나타낸 중쇄 DNA 및 단백질 V 도메인 서열에서, 아미노 말단 시그널 서열을 이탤릭체로 나타낸다. 또한, 표 3에는 카밧 및 코티아 넘버링 정의 둘 다에 의해 결정된 바와 같은 STM073 MAb 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR을 나타낸다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 3의 VH 도메인 및 서열번호 11의 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 서열번호 3의 VH 도메인 및 서열번호 11의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 도메인 및/또는 서열번호 11의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VL 도메인을 포함하고, PD-1에 대한 글리코실화된 PD-L1의 결합을 억제하거나 차단하고, 세포막 상의 PD-L1의 탈안정화를 촉진한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 항-glycPD-L1 항체는 PD-1에 대한 글리코실화된 PD-L1의 결합을 차단하며, 세포막 상의 PD-L1의 발현의 탈안정화를 촉진한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 각각 서열번호 5, 서열번호 7, 및 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) 각각 서열번호 12, 서열번호 14, 및 서열번호 16의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 항체는 PD-1에 대한 글리코실화된 PD-L1의 결합을 차단하며, 세포막 상의 PD-L1 발현의 탈안정화를 촉진한다.
상술한 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 2분의 1 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 5 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1 단백질에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 대한 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 결합 친화도는 상한값 및 하한값을 포함하는 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 실시예 6에 기재된 바와 같은 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 결합하기 위한 MFI에 비해 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 큰 WT PD-L1을 발현하는 세포에 대한 MFI 만큼 발현된 결합을 나타낸다.
실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하고, 이펙터 T 세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1의 상호작용을 특히 억제한다. 항체는 PD-L1의 내부화 및 PD-L1의 분해를 추가로 촉진하여, 세포 표면 상의 PD-L1의 수준을 감소시킨다.
다른 특별한 실시양태에서, 항-glycPD-L1 단클론 항체 STM108인 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항체, 또는 이의 결합 단편이 제공된다. STM108 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 상응하는 아미노산 서열(서열번호 18, 19, 26 및 27)을 하기 표 3에 나타낸다. 미처리된 중쇄 V 도메인 서열(즉, N-말단에 시그널 서열을 함유함)의 DNA 및 아미노산 서열을 또한 표 3(각각 서열번호 91 및 92)에 나타낸다. 또한, 표 3에는 카밧 및 코티아 정의에 따라, STM108 MAb 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR을 나타낸다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열의 VH 도메인 및 서열번호 27의 아미노산 서열의 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 서열번호 19의 아미노산 서열의 VH 도메인 및 서열번호 27의 아미노산 서열의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 이중 기능 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 도메인 및/또는 서열번호 27의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25, 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 및 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 24의 아미노산 서열에 대하여, 또는 각각 서열번호 21, 서열번호 23, 및 서열번호 25, 또는 이의 조합의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인, 및/또는 (b) 각각 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 갖는 적어도 1, 2, 또는 3 개 모두의 CDR을 갖는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또한, 인간 프레임 워크 영역 및, 선택적으로 인간 불변 영역에 대해 AbM, 콘택트 또는 IMGT 정의된 CDR을 사용한 STM108의 인간화 형태가 제공된다.
실시양태에서, 상술한 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd의 2분의 1 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 5 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비글리코실화된 PD-L1 단백질에 관해 나타난 Kd에 비해 적어도 10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 대한 STM108 MAb의 결합 친화도는 상한값 및 하한값을 포함하는 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 실시예 6에 기재된 바와 같은 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 결합하기 위한 MFI에 비해 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 큰 WT PD-L1을 발현하는 세포에 대한 MFI 만큼 발현된 결합을 나타낸다. 이들 항-glycPD-L1 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하고, 이펙터 T 세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1의 상호작용을 특히 억제한다.
또한, 인간 PD-L1 아미노산 서열 DAGVYRCMISYGGADYKRITV(즉, 서열번호 1의 D108-V128) 내의 에피토프에 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 실시양태에 포함된다. 실시양태에서, 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 비연속적이고 다음 서열 중 밑줄친 아미노산 잔기로 나타낸 인간 PD-L1 아미노산 서열 서열번호 1의 위치 Y112, R113 및 S117을 포함하는 인간 PD-L1 에피토프에 특이적으로 결합한다: DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 86).
실시양태에서, (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR H1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR H1; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR H2 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR H2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR H3 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR H3를 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 12의 아미노산을 갖는 CDR L1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR L2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR L3를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 제공된다. 또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같은 IMGT, AbM 또는 콘택트 정의에 따른 CDR을 갖는 STM073의 인간화 형태인 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 제공된다.
다른 실시양태에서, (a) 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR H1 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR H1; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR H2 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR H2; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 코티아 CDR H3 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR H3를 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 28의 아미노산을 갖는 CDR L1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 CDR L2; 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR L3를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 제공된다. 또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같은 IMGT, AbM 또는 콘택트 정의에 따른 CDR을 갖는 STM108의 인간화 형태인 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 제공된다.
다른 실시양태에서, VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 85), DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 86), 또는 LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ(각각 서열번호 1의 아미노산 74 내지 84 및 158 내지 173)로부터 선택된 아미노산 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공되고, 상기 서열은 서열번호 1의 인간 PD-L1 폴리펩티드, 즉 서열번호 1의 아미노산 19-290을 포함하는 성숙 PD-L1 단백질 내에 위치한다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하고, 이펙터 T 세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1의 상호작용을 특히 억제할뿐 아니라, 세포막으로부터 세포 내로의 PD-L1의 내부화 및 PD-L1의 세포내 분해를 가능하게 한다.
다른 실시양태에서, MAb STM073, 또는 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항-glycPD-L1 MAb와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공되고, 상기 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기 H69, Y112, R113 및 K124를 포함한다. 다른 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합될 때, 다음 아미노산 잔기: 서열번호 1의 H69, Y112, R113 및 K124 중 적어도 하나와 접촉하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1, 즉 글리코실화된 인간 PD-L1의 에피토프 영역(들)을 포함하는 아미노산 잔기 중 적어도 2, 적어도 3, 또는 4 개와 접촉한다.
다른 실시양태에서, MAb STM108, 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 S80, Y81, K162 및 S169를 포함하는 에피토프에 결합하는 단리된 항-glycPD-L1 MAb와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 다른 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합될 때, 다음 아미노산 잔기: 서열번호 1의 S80, Y81, K162 및 S169 중 적어도 하나와 접촉하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 제공된다.
다른 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합될 때, 다음 아미노산 잔기: 서열번호 1의 Y112, R113 및 S117 중 적어도 하나와 접촉하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
다른 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합될 때, 서열번호 1의 V68 내지 V128로부터의 아미노산 영역, 또는 서열번호 1의 D108 내지 V128로부터의 아미노산 영역, 또는 서열번호 1의 L74 내지 Q173로부터의 아미노산 영역, 또는 서열번호 1의 L74 내지 R84뿐 아니라, E158 내지 Q173으로부터의 아미노산 영역 내의 적어도 하나의 아미노산과 접촉하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 다른 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합될 때, 다음 그룹의 아미노산 잔기: 서열번호 1의 V68 내지 V128로부터의 아미노산 잔기 내의 H69, Y112, R113 및 K124 중 적어도 하나와 접촉하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 다른 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합될 때, 다음 그룹의 아미노산 잔기: 서열번호 1의 V68 내지 V173으로부터의 아미노산 영역 내의 H69, S80, Y81, Y112, R113, K124, K162, S169 중 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 또는 4 개와 접촉하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합될 때, 다음 그룹의 아미노산 잔기: 서열번호 1의 D108 내지 V128로부터의 아미노산 영역 내의 Y112, R113, S117과 접촉하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
다른 실시양태에서, 글리코실화된 PD-L1에 결합될 때, PD-L1 단백질(서열번호 1)의 적어도 아미노산 영역 V68-V128 또는 적어도 아미노산 영역 D108-V128, 또는 이의 조합에 결합하는 단리된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 단클론 항체, 이의 키메라 또는 인간화 형태, 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, VH 도메인을 코딩하는 서열번호 2 또는 18의 뉴클레오티드 서열 및 항체 VL 도메인을 코딩하는 서열번호 10 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 항-glycPD-L1 항체 VH 도메인을 코딩하는, 서열번호 2 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90-98% 동일한 단리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체 VL 도메인을 코딩하는, 서열번호 19 또는 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90-98% 동일한 단리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 실시양태에서, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 2 또는 18, 또는 서열번호 10 또는 26과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상 동일하다.
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질환 치료
특정 양태에서, 본원의 실시양태에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체)이 투여되어, 암을 앓고 있는 대상체에서의 암을 치료하거나, 암이 발달하는 성향(예컨대, 발암물질에 대한 노출 전, 암의 발생 전 등의 유전적 성향)을 갖는 대상체에서의 암을 예방하할 수 있다. 따라서, 본원은 암을 치료하기 위해 적어도 하나의 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 치료는 암 세포의 성장, 증식, 전이 등을 감소, 예방, 억제, 또는 차단하는 것을 포함하며, 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스(apoptosis)를 야기하는 단계를 포함한다. 치료는 또한 종양 세포의 전이를 예방하거나 퇴축을 야기할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 대상체, 특히, 예를 들어 T 세포, 특히 킬러 또는 세포독성 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포의 세포 표면 상에 발현된 PD-1 동족 리간드와 결합/상호작용 할 수 있는 글리코실화된 PD-L1 세포 표면 단백질을 발현하는 대상체의 종양 세포에 관하여 치료 중인 인간 환자에게 이점을 제공한다.
기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체 중 적어도 하나의 유효량을 이용한 이들 대상체의 치료는 종양 세포 상의 글리코실화된 PD-L1에 대한 항체(들)의 결합을 야기하고, PD-L1과 PD-1의 상호작용을 예방, 차단, 또는 억제하며, PD-L1의 내부화 및 분해를 촉진하여, PD-L1-발현 종양 세포와 PD-1-발현 T 세포의 상호작용을 예방, 차단 또는 억제하므로, T 세포 활성의 면역억제를 예방하거나 회피하고, T 세포가 PD-L1-보유 종양 세포를 사멸시키도록 활성화되게할 것으로 예상된다. 바람직한 실시양태에서, 이중 기능 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1에 결합하고, 대상체는 인간 대상체이다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 본 방법의 실시에 의해 달성되는 항암 결과가 필요하거나, 이로부터 이득을 얻을 수 있거나, 이의 이득을 얻기를 소망하는 대상체에게 유리하다. 적어도 하나의 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 치료적 유효량의 투여를 포함하는 방법의 치료적 이득 및 상기 치료 이득을 받는 것에 대한 대상체의 추구는 당업계에 이점을 제공한다. 또한, 본 방법은 부작용, 부정적 결과, 금기 등을 제거하거나 회피하거나, 다른 치료 및 치료 방법과 비교하여 발생할 상기 사례에 대한 위험 또는 가능성을 감소시키는 추가 이점을 제공한다.
구체적 실시양태에서, 암을 앓고 있거나 암에 걸리는 성형이 있는 대상체는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체인 STM073 또는 STM108의 인간화 또는 키메라 형태의 치료적 유효량을 투여받는다. 암의 치료를 위해 1 이상의 유형의 항-glycPD-L1 항체를 투여하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, STM073 및 STM108 둘 다의 키메라 또는 인간화 형태는 이를 필요로 하는 환자에게 공동-투여될 수 있다. 대안적으로, STM073의 키메라 또는 인간화 형태는 다른 항-glycPD-L1 항체와 함께 이를 필요로 하는 환자에게 공동-투여될 수 있거나, STM108의 키메라 또는 인간화 형태는 다른 항-glycPD-L1 항체와 함께 이를 필요로 하는 환자에게 공동-투여될 수 있다. 항-glycPD-L1 항체의 공동-투여는 항체 단독의 투여에 비해 더욱 치료적으로 또는 예방적으로 효과적일 수 있고/있거나 항체 단독에 비해 낮은 투여량 또는 낮은 빈도의 투여를 허용할 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 암은 임의의 악성 세포 유형, 예컨대 고형 종양 또는 혈액학적 종양, 특히 이들의 표면 상에 글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포를 갖는 종양에서 발견되는 것과 같은 악성 세포 유형을 포함한다. 일반적으로, 종양은 악성 또는 잠재적 악성 신생물 또는 임의의 크기의 조직 덩어리를 지칭하며, 원발성 종양 및 2 차 종양을 포함한다. 고형 종양은 보통 낭포 또는 액체를 함유하지 않는 비정상적 조직 덩어리 또는 성장이다. 예시적 고형 종양은, 비제한적으로, 췌장, 쓸개, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 고환, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 장기의 종양을 포함할 수 있다. 예시적 혈액학적 종양은 골수의 종양, 악성 T 또는 B 세포, 백혈병, 림프종, 아세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가적 예는, 비제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 편평세포암종, 폐암(소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암, 및 폐의 편평상피암을 포함함), 복막의 암, 간세포암, 위 또는 위선암(위장암 및 위장관기질암을 포함함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암, 흑색종, 표재 확산 흑색종, 흑색점 악성 흑색종, 말단 흑색점 흑색종, 결절성 흑색종뿐 아니라, B-세포 림프종(저급/난포 비-호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중급/난포 NHL; 중급 미만성 NHL; 고급 면역모세포 NHL; 고급 림프모구 NHL; 고급 소형 비-절개 세포 NHL; 대량 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함함), 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 모양 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 만성 골수모구 백혈병을 포함한다.
상기 암은 구체적으로 다음 조직학적 유형의 것일 수 있으나, 이들로 제한될 필요는 없다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 방추형 세포 암종; 소세포 암종; 유두상암; 편평세포 암종; 림프상피 암종; 기저세포암; 섬모기질암; 이행상피암; 유두상 이행상피암; 선암; 악성 가스트린종; 담관암; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암; 섬유주 선암; 샘낭 암종; 샘종성 폴립에서의 선암; 가족성 대장 폴립증 선암; 고형 암종; 악성 유암종; 세기관지-폐포 선암; 유두상 선암종; 색소혐성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암; 호염기성 암종; 투명세포 선암종; 과립세포 암종; 여포 선암종; 유두상 및 여포 선암종; 비피막 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부부속물 암종; 아포크린 선암종; 피지선암; 귀지선암; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암; 반지 세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질암종; 소엽암; 염증성 암종; 유방 파제트병(paget's disease); 선방세포 암종; 선편평세포 암종; 선암 w/편평상피화생; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포종; 악성 남성모세포종; 세르톨리세포 암종; 악성 간질세포종; 악성 지질세포종; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 갈색세포종; 글로만지오사르코마(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대색소 모반에서의 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 악성 청색모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 기질육종; 악성 혼합 종양; 뮐로(mullerian) 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종; 악성 브레너 종양(brenner tumor); 악성 엽상종; 활막육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 태생기암; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종(kaposi's sarcoma); 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 골막 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종(ewing's sarcoma); 악성 치성 종양; 사기질모세포 치육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 법랑모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상아세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절아세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 파라육아종; 소형 림프구성 악성 림프종; 광범위 큰 세포 악성 림프종; 난포 악성 림프종; 균상식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포성 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만세포성 백혈병; 거핵아구 백혈병(megakaryoblastic leukemia); 골수성 육종; 및 모양 세포 백혈병.
치료될 암은 바람직하게는 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1에 대해 양성이다. 특정 실시양태에서, 종양 세포는 또한 예를 들어, 유방암 세포 상에 발현되는 바와 같은 EGFR 또는 HER2/neu 발현과 같은 종양 세포 마커에 대해 양성이다. 이들 마커의 존재 또는 부재는 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체와 조합된 표적화된 치료제, 예컨대 티로신 키나아제 억제제, 예를 들어 EGFR-양성 암에 대한 제피티닙, 또는 HER2/neu-양성 암에 대한 헤르셉틴을 이용한 병용 요법이 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 치료 이득을 제공할 것이라는 점을 나타날 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 BLBC이다.
암을 특징지어 요법 또는 모니터링 요법의 선택을 안내하기 위해 사용될 수 있는 다른 마커는 비소세포 폐암 및 역형성 대세포 림프종에서 ALK 유전자 재배열 및 과잉발현; 간암 및 생식세포 종양에 대한 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein)(AFP); 다발성 골수종, 만성 림프성 백혈벙, 및 일부 림프종에 대한 베타-2-마이크로글로불린(beta-2-microglobulin)(B2M); 융모암 및 생식세포 종양에 대한 베타-인간 융모성 생식선 자극호르몬(beta-human chorionic gonadotropin)(Beta-hCG); 난소암 및 유방암에 대한 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이; 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 및 급성 골수성 백혈병에 대한 BCR-ABL 융합 유전자(필라델피아 염색체); 피부 흑색종 및 대장암에 대한 BRAF V600 돌연변이; 위장관 기질 종양 및 점막 흑색종에 대한 C-키트/CD117; 유방암에 대한 CA15-3/CA27.29; 췌장암, 담낭암, 담도암, 및 위암에 대한 CA19-9; 난소암에 대한 CA-125; 갑상선 수질암에 대한 칼시토닌; 대장암 및 일부 다른 암에 대한 암배아 항원(CEA); 비-호지킨 림프종에 대한 CD20; 신경내분비 종양에 대한 크로모그라닌(Chromogranin) A(CgA); 방광암에 대한 염색체 3, 7, 17, 및 9p21; 폐암에 대한 사이토케라틴 단편 21-1; 비소세포 폐암에 대한 EGFR 유전자 돌연변이 분석; 유방암에 대한 에스트로겐 수용체(estrogen receptor)(ER)/프로게스테론 수용체(progesterone receptor)(PR); 방광암에 대한 피브린/피브리노겐; 난소암에 대한 HE4; 유방암, 위암, 및 위식도접합부 선암종에 대한 HER2/neu 유전자 증폭 또는 단백질 과잉발현; 다발성 골수종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증에 대한 면역글로불린; 대장암 및 비소세포 폐암에 대한 KRAS 유전자 돌연변이 분석; 생식세포 종양, 림프종, 백혈병, 흑색종, 및 신경모세포종에 대한 락테이트 데하이드로게나아제; 소세포 폐암 및 신경모세포종에 대한 뉴런-특이 에놀라아제(neuron-specific enolase)(NSE); 방광암에 대한 핵기질 단백질 22; 전립선암에 대한 전립선-특이 항원(prostate-specific antigen)(PSA); 갑상선암에 대한 티로글로불린; 및 유방암에 대한 우로키나아제 플라스미노겐 활성제(urokinase plasminogen activator)(uPA) 및 플라스미노겐 활성제 억제제(plasminogen activator inhibitor)(PAI-1)를 포함한다.
이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 다양한 양식의 항종양제로서 사용될 수 있다. 특별한 실시양태는 항종양제로서 항체를 사용하는 방법에 관한 것이므로, 종양 세포 성장을 차단 또는 억제하거나 종양 세포포의 아폽토시스에 영향일 미치기에 충분한 기간 동안 종양 세포 집단을 치료적 유효량의 항체, 또는 항체를 함유하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 생체내에서 종양 세포를 접촉시키는 단계는 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체를 포함하는 생리학적 용인성 조성물의 치료적 유효량을 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 종양내 주사에 의해, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행된다. 항체는 주사에 의하거나 시간에 걸친 점진적 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 유용한 투여 및 전달 요법은 정맥내, 복강내, 경구, 근육내, 피하, 공동내, 척추강내, 경피, 피부, 연동 수단, 또는 종양 세포를 함유하는 조직 내로의 직접 주사를 포함한다.
항체를 포함하는 치료 조성물은 전통적으로, 예를 들어 단위 용량의 주사에 의한 바와 같이 정맥내로 투여된다. 용어 "단위 용량"은 치료 조성물에 관하여 사용될 때, 각각의 단위가 필요한 희석제, 즉 담체, 또는 비히클과 결합하여 소망하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정양의 활성 물질을 함유하는, 대상체에 대한 단일 투여량에 적합한 물리적 별개 단위를 지칭한다. 조성물을 함유하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 투약 제형과 양립 가능한 방식 및 치료적 유효량으로 투여된다. 투여될 양은 치료될 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체의 시스템의 능력, 및 소망하는 치료 효과의 정도에 의존한다. 투여에 요구되는 활성 성분의 정밀한 양은 의사의 판단에 의존하며 각각의 개체에 대해 고유하다. 그러나, 전신 적용을 위해 적합한 투여량 범위는 본원에 개시되어 있으며, 투여 경로에 의존한다. 초기 및 부스터 투여에 적합한 요법이 또한 고려되며, 전형적으로 초기 투여 이후 연속 주사 또는 다른 투여에 의한 1 이상의 간격(시간)으로 반복된 투약을 포함할 수 있다. 예시적 다중 투여는 항체의 연속적으로 높은 혈청 및 조직 수준을 유지하기에 적합하다. 대안적으로, 생체내 요법에 특화된 범위로 혈액내 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
항-glycPD-L1 항체는 질환을 치료하기 위해, 예컨대 국소 진행 또는 전이성 암을 앓는 암 환자에서 종양 세포 성장을 억제하거나 암 세포를 사멸시키기 위해 전신으로 또는 국소로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 항체는 단독으로 투여되거나 항-증식 약물 또는 항암 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 수술 또는 다른 절차 전에 환자에서 암 부담을 감소시키기 위해 투여된다. 대안적으로, 이들은 수술 후에 주기적 간격으로 투여되어, 임의의 나머지 암(예를 들어, 수술이 제거에 실패한 암)의 크기 또는 성장 능력이 감소되고/되거나 생존하지 않도록 보장할 수 있다. 상기 본원에 기재된 바와 같이, 항체의 치료적 유효량은 소망하는 효과를 달성하기 위해 계산된 소정의 양이다. 따라서, 항-glycPD-L1 항체의 투여를 위한 투여량 범위는 종양 세포 분열의 증상 및 세포 주기가 감소되는 소망하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 범위이다. 최적으로는, 투여량은 과점도 증후군, 폐부종, 울혈성 심부전, 신경학적 영향 등과 같은 부작용을 야기할 만큼 크면 안된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 병태, 크기 및 성별, 및 질환의 정도에 따라 달라질 것이며, 의사 또는 임상의와 같은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 물론, 투여량은 임의의 합병증 사례에서 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
치료 방법
특정 실시양태에서, 기재된 바와 같은 조성물 및 방법은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체 단독, 또는 제2 또는 부가 약물 또는 요법과의 조합으로의 투여를 포함한다. 상기 약물 또는 요법은 PD-L1 또는 글리코실화된 PD-L1, 바람직하게는 인간 PD-L1 또는 글리코실화된 인간 PD-L1과 인간 PD-1의 상호작용과 연관된 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 질환은 암일 수 있다. 글리코실화된 PD-L1 단백질에 우선적으로 결합하고, PD-L1 대 PD-1 결합을 둘 다 차단하거나 억제하며, PD-L1 내부화 및 분해를 촉진하는 적어도 하나의 항-PD-L1 항체, 또는 이의 결합 부분을 포함하는 조성물 및 방법은 PD-1/PD-L1 상호작용을 예방, 감소, 차단, 또는 억제시켜, 치료 효과 및 치료를 제공함으로써, 암 또는 다른 질환의 치료에서 치료 또는 예방 효과를 갖는다.
병용 요법을 포함한 조성물 및 방법은 치료 또는 예방 효과를 가지며, 치료 또는 예방 효과를 향상시키고/시키거나 다른 항암 또는 항-과증식성 요법의 치료 효과를 증가시킬 수 있다. 치료 및 예방 방법 및 조성물은 암 세포의 사멸 및/또는 세포 과증식성의 억제와 같은 소망하는 효과를 달성하기에 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이 과정은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체 또는 이의 결합 단편 및 제2 요법을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 제2 요법은 직접적인 세포독성 효과를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 제2 요법은 직접적인 세포독성 효과를 갖지 않으면서 면역계를 상향조절하는 약제일 수 있다. 조직, 종양, 및/또는 세포는 1 이상의 약제(예를 들어, 항체 또는 항암제)를 포함하는 1 이상의 조성물 또는 약학 제형(들)에 노출되거나, 하나의 조성물이, 예를 들어 1) 항체, 2) 항암제, 3) 항체 및 항암제 둘 다, 또는 4) 2 이상의 항체를 제공하는 2 이상의 별개의 조성물 또는 제형으로 조직, 종양, 및/또는 세포를 노출시킴으로써 노출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 요법은 또한 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 결합하는 항-PD-L1 항체, 바람직하게는 항-glycPD-L1, 다른 실시양태에서는 항-PD-1 항체이다. 또한, 상기 병용 요법은 화학요법, 방사선요법, 수술요법, 또는 면역요법과 콘쥬게이트되어 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
예로서, 용어 "접촉되다" 및 "노출되다"는 세포에 적용될 때, 본원에서 치료 폴리펩티드, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체가 표적 세포에게 전달되거나 표적 세포와 직접 병치되어, 특히 종양 또는 암 세포의 표면 상에 발현되거나 높게 발현된 표적 항원, 예를 들어 PD-L1, 특히 글리코실화된 PD-L1에 특이적으로 결합하는 과정을 기재하기 위해 사용된다. 치료적 항-glycPD-L1 항체 또는 이의 결합 단편에 의한 상기 결합은 종양 또는 암 세포-발현된 PD-L1과 이펙터 T 세포 상의 PD-1의 상호작용을 예방, 차단, 억제, 또는 감소시켜, PD-L1/PD-1 상호작용과 연관된 면역억제를 예방한다. 실시양태에서, 화학치료제 또는 방사선치료제가 또한 항-glycPD-L1 항체 또는 이의 결합 단편과 콘쥬게이트되어 대상체에게 투여되거나 전달된다. 예를 들어, 세포 사멸을 달성하기 위해, 1 이상의 약제가 세포를 사멸시키거나 이의 분열을 예방하기에 효과적인 조합된 양으로 세포에게 전달된다.
항-glycPD-L1 항체는 다른 항암 치료 전에, 그 동안에, 그 이후에, 또는 그에 비해 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 서로 동시 내지 수분 내지 수일 내지 수주 전 또는 후의 범위의 간격을 둘 수 있다. 항체가 항암제와 별도로 환자에게 제공되는 실시양태에서, 일반적으로 각각의 전달 시점 사이에 상당한 기간이 만료되지 않아, 투여된 화합물이 환자에 대해 유리하게 조합된 효과를 여전히 발휘할 수 있을 것이라는 점이 보장될 것이다. 예시적으로, 상기 사례에서, 당업자는 서로 약 12 내지 24 또는 72 시간 이내에, 더욱 상세하게는, 서로 약 6-12 시간 이내에 항체 및 항암 요법을 대상체에게 투여할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 치료 기간을 각각의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 주)가 경과하도록 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료의 과정 또는 치료 사이클은 1-90 일 이상(이 범위는 개입일 및 최종일을 포함함) 지속될 것이다. 하나의 약제는 1 일차 내지 90 일차(이러한 범위는 개입일 및 최종일을 포함함) 중 임의의 날짜 또는 이의 임의의 조합에 제공될 수 있으며, 다른 약제는 1 일차 내지 90 일차(이러한 범위는 개입일 및 최종일을 포함함) 중 임의의 날짜 또는 이의 임의의 조합에 제공되는 것으로 고려된다. 1 일(24 시간의 기간) 이내에, 환자는 약제(들)의 1 회 또는 다수 투여를 제공받을 수 있다. 또한, 치료 과정 후에, 항암 치료가 투여되지 않는 기간이 있을 수 있다는 점이 고려된다. 이 기간은, 예를 들어 예후, 강도, 건강 등과 같은 환자의 병태에 따라 1-7 일, 및/또는 1-5 주, 및/또는 1-12 개월 이상(이러한 범위는 개입일 및 최고 시점을 포함함) 지속될 수 있다. 치료 사이클은 필요시 반복될 것이다. 다양한 조합의 치료가 사용될 수 있다. 하기에 나타낸 조합 치료 요법의 대표적인 예에서, 항-glycPD-L1 항체 또는 이의 결합 단편과 같은 항체는 "A"로 표현되고, 항암 요법은 "B"로 표현된다:
Figure pct00011
환자에 대한 본 실시양태의 임의의 항체 또는 요법의 투여는, 존재하는 경우, 약제의 독성을 고려하여, 상기 화합물의 투여를 위한 일반 프로토콜에 따를 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 부작용 및 독성, 특히 병용 요법에 기인할 수 있는 부작용 및 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
실시양태에서, 치료를 필요로 하는 환자, 즉 암 또는 종양이 있는 환자에 대한 이중 기능 항-glycPD-L1 항체 단독 또는 다른 항암제와의 조합의 투여를 포함하는 방법이 제공된다. 항-glycPD-L1 항체의 투여 전에, 환자의 종양 또는 암의 샘플이 PD-L1의 존재에 대해 평가될 수 있다. 상기 평가의 결과가 환자의 종양 또는 암이 글리코실화된 PD-L1에 양성인 것으로 드러내는 경우, 환자는 환자의 glycPD-L1+ 종양 또는 암이 항-glycPD-L1 항체를 이용한 치료에 더욱 잘 들을 가능성을 기본으로 하여 치료가 선택될 것이며, 치료는 더욱 유익한 결과를 지속할 수 있다. 전문 의료진 또는 의사는 환자에게 항-glycPD-L1 항체 치료 방법을 지속할 것을 권고할 수 있으며, 환자는 전문 의료진 또는 의사의 권고를 기본으로 하여 치료를 지속할 것을 결정할 수 있다. 또한, 치료 과정 동안, 환자의 종양 또는 암 세포는 치료의 과정 또는 효과를 모니터링하기 위한 방식으로서, 글리코실화된 PD-L1의 존재에 대해 평가될 수 있다. 상기 에세이가 예를 들어, 환자의 종양 또는 암 세포 상의 글리코실화된 PD-L1에서의 변경, 손실, 또는 감소를 나타내는 경우, 환자와 함께 전문 의료진에 의해, 치료를 지속해야 하거나 일부 방식, 예를 들어 고 투여량, 다른 항암제 또는 요법의 추가 등으로 변경되어야 할지에 대한 결정이 이루어질 수 있다.
화학요법
매우 다양한 화학요법제가 본 실시양태의 치료 또는 치료 방법에 따라 사용될 수 있다. 용어 "화학요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 지칭한다. "화학요법제"는 암의 치료시 투여되는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 이러한 약제 또는 약물은 세포 내에서 이들의 활성화 방식에 의해, 예를 들어 어떠한 단계에서 이들이 세포 사이클 및 세포 성장 및 증식에 영향을 미치는지 여부에 의해 분류될 수 있다. 대안적으로, 화학요법제는 DNA를 직접 가교하거나, DNA 내로 삽입되거나, 세포에서 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 이의 능력을 기본으로 하여 특성화될 수 있다.
화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드(cyclosphosphamide); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아마이드, 트리에틸렌티오포스포아마이드, 및 트리메틸올로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(자신의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰기스타틴; 나이트로젠 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴(ranimnustine); 항생제, 예컨대 에네다인 항생제(예를 들어, 칼리키아미신, 특히 칼리키아미신 감마 1 및 칼리키아미신 오메가 1); 다이네미신 A를 포함한 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네다인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라나이신(authrarnycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르치노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라나이신(nogalarnycin), 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항-대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모퍼, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 및 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 미토테인 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피탄몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속잔트론(losoxantrone); 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스파마이드; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로니틴(difluorometlhylornithine)(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 젬시타빈, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 트랜스백금, 및 상기 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체를 포함한다.
방사선 요법
방사선요법은 DNA 손상을 야기하는 약제를 이용한 치료를 포함한다. 방사선요법은은 암 및 질환 치료에서 광범위하게 사용되어 왔으며, 방사선요법은 종양 세포에 대한 γ-선, X-선, 및/또는 방사성 동위원소의 직접 전달로서 일반적으로 알려진 것들을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태, 예컨대 마이크로파, 양성자 빔 조사(미국 특허 제5,760,395호 및 제4,870,287호), 및 UV-조사가 또한 고려된다. 이들 모든 인자가 DNA 자체, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 회복, 및 염색체의 조립 및 유지에 광범위한 손상을 미칠 가능성이 크다. X-선에 대한 예시적 투여량 범위는 연장된 기간(3 내지 4 주) 동안 50 내지 200 뢴트겐(roentgen)의 일일 선량에서 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량까지의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 투여량 범위는 광범위하게 달라지며, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 흡수, 및 치료 중인 대상체의 내성에 의존한다.
면역요법
본 방법의 일부 실시양태에서, 면역요법은 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 투여와 조합되거나 콘쥬게이트되어 사용될 수 있다. 암 치료의 맥락에서, 면역치료제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하는 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙(RITUXAN®)이 이러한 예이다. 이필리무맙을 포함하여 다른 체크포인트 억제제가 또한 조합되어 투여될 수 있다. 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 또한 다른 항-PD-1 또는 항- PD-L1 억제제, 예컨대 아테졸리주맙, 더발루맙, 또는 아벨루맙을 포함한 PD-L1에 대한 항체, 또는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 피딜리주맙을 포함한 PD-1에 대한 항체와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 실시양태의 이중 기능 항-glycPD-L1 항체 중 1 이상은 서로 조합되어 투여될 수 있다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 마커(세포 표면 단백질 또는 수용체)에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독은 요법의 이펙터로서 제공될 수 있거나 이는 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 모집할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학치료제, 방사성핵종, 리신(ricin) A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)와 콘쥬게이트될 수 있으며, 드물게는 표적화제로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 종양 세포 표적와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자, 예를 들어 종양 세포 상호작용시 T 세포/PD-L1에 대하여 PD-1을 수반하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 천연 킬러(natural killer)(NK) 세포를 포함한다.
면역요법의 일 양태에서, 종양 세포는 표적화에 잘 듣는 일부 마커(단백질/수용체)를 보유해야 한다. 최적으로는, 종양 마커 단백질/수용체는 비-암세포 또는 정상 세포와 같은 대부분의 다른 세포 상에 존재하지 않는다. 많은 종양 마커가 존재하며, 이들 중 임의의 것이 본 실시양태의 맥락에서 항-glycPD-L1 항체와 함께 투여되는 다른 약물 또는 요법에 의해 표적화하기 위해 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커는, 예를 들어 CD20, 암배아 항원(CEA), 티로시나아제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erbB, 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적 양태는 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 면역 자극 분자가 또한 존재하며, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN과 같은 사이토카인; MIP-1, MCP-1, IL-8과 같은 케모카인; 및 FLT3 리간드와 같은 성장 인자를 포함한다.
현재 조사 중이거나 사용 중인 면역요법의 예는 면역 아쥬반트, 예를 들어 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물(미국 특허 제5,801,005호 및 제5,739,169호; Hui and Hashimoto, 1998, Infection Immun ., 66(11):5329-5336; Christodoulides et al., 1998, Microbiology, 144(Pt 11):3027-3037); 사이토카인 요법, 예를 들어 α, β 및 γ 인터페론; IL-1, GM-CSF, 및 TNF(Bukowski et al., 1998, Clinical Cancer Res., 4(10):2337-2347; Davidson et al., 1998, J. Immunother., 21(5):389-398; Hellstrand et al., 1998, Acta Oncologica, 37(4):347-353); 유전자 요법, 예를 들어 TNF, IL-1, IL-2, 및 p53(Qin et al., 1998, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 95(24):14411-14416; Austin-Ward et al., 1998, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845; 미국 특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호); 및 단클론 항체, 예를 들어 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2, 및 항-p185(Hollander, 2012, Front. Immun ., 3:3; Hanibuchi et al., 1998, Int . J. Cancer, 78(4):480-485; 미국 특허 제5,824,311호)이다. 1 이상의 항암 요법이 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
수술
암에 걸린 사람 중 약 60 %가 예방, 진단 또는 스테이징(staging), 치유, 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 겪는다. 치유 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 절제, 및/또는 파괴되는 절제술을 포함하고, 다른 요법, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법, 및/또는 대안적 요법뿐 아니라, 이들의 조합과 콘쥬게이트되어 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제술과 함께, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경-제어 수술(모즈 수술(Mohs' surgery))을 포함한다. 암성 세포, 조직, 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제시, 신체 내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 추가 항암 요법을 이용한 상기 구역의 관류, 직접 주사, 또는 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5 주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 투여량을 이용한 치료일 수 있다.
단백질 정제
항체, 및 구체적으로, 항- glycPD-L1 항체를 포함한 단백질 정제 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 기법은 적어도 하나의 단계에서, 세포, 조직, 또는 장기를 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로 균질화 및 조제물 분별(crude fractionation)하는 것을 포함한다. 관심 단백질 또는 폴리펩티드는 달리 명시되지 않는 경우, 크로마토그래피 및 전기영동 기법을 사용하여 추가로 정제되어, 부분 또는 완전 정제(또는 균질성까지의 정제)를 달성할 수 있다. 순수 단백질 또는 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석적 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 및 등전점 전기영동이다. 펩티드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 고속 액체 크로마토그래피(fast-performance liquid chromatography)(FPLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography)(HPLC)이다. 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경되고/되거나, 특정 단계가 생략되어, 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 제조에 적합한 방법을 여전히 야기할 수 있다.
정제된 폴리펩티드, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 항체는 다른 성분으로부터 단리 가능하거나 단리되고, 이의 천연적으로 얻을 수 있는 상태와 비교하여 임의의 정도로 정제된 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 단리되거나 정제된 폴리펩티드는 또한 천연적으로 발생할 수 있는 환경, 예를 들어 세포, 조직, 장기, 생물학적 샘플 등으로부터 유리된 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된"은 분별을 거쳐 다양한 다른 성분이 제거된 폴리펩티드 조성물을 지칭할 것이며, 상기 조성물은 이의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. "실질적으로 정제된" 조성물은 폴리펩티드가 조성물 내의 단백질 성분의 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 %, 또는 그 이상을 구성하는 바와 같이, 조성물의 주요 성분을 형성하는 조성물을 지칭한다.
항체 단백질과 같은 폴리펩티드의 정제의 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법이 본 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있다. 이들은 예를 들어, 활성 분획의 특이적 활성을 결정하는 단계, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 바람직한 방법은 분획의 특이적 활성을 계산하고, 그것을 최초 추출물의 특이적 활성과 비교하여, "정제 배수"로 평가된 이의 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는, 물론 정제를 따르기 위해 선택된 특별한 에세이 기법, 및 발현된 폴리펩티드가 검출 가능한 활성을 나타내는지 여부에 의존할 것이다.
폴리펩티드가 항상 그것의 가장 정제된 상태로 제공될 일반적 필요성은 없다. 실제로, 특정 실시양태에서는 실질적으로 덜 정제된 생성물이 유용성을 가질 수 있는 것으로 고려된다. 부분적 정제는 조합적으로 더 적은 정제 단계를 사용하거나, 동일한 일반 정제 계획의 상이한 형태를 이용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, HPLC 기구를 이용하여 수행된 양이온-교환 칼럼 크로마토그래피는 일반적으로 저압 크로마토그래피 시스템을 이용한 동일한 기법에 비해 더 큰 "배수" 정제를 야기할 것으로 인식된다. 낮은 정도의 상대 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 총 회수에서, 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데 유리할 수 있다.
친화성 크로마토그래피는 단리될 물질(단백질)과 그것이 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특이적 친화성, 예를 들어 수용체-리간드 유형의 상호작용에 의지하는 크로마토그래피 절차이다. 칼럼 물질(수지)은 결합 파트너 중 하나를 불용성 매트릭스에 공유결합으로 결합함으로써 합성된다. 이어서, 칼럼 물질은 칼럼 수지에 걸쳐 통과하는 용액으로부터 상기 물질을 특이적으로 흡착할 수 있다. 용출은 결합이 방해되는/발생하지 않는 조건으로 조건을 변경(pH, 이온 강도, 온도 변경 등)시킴으로써 발생한다. 매트릭스는 분자를 임의의 상당한 정도로 흡착하지 않고, 넓은 범위의 화학적, 물리적, 및 열적 안정성을 갖는 물질이어야 한다. 리간드는 그것의 결합 특성에 영향을 미치지 않는 방식으로 결합되어야 한다. 리간드는 또한 비교적 단단한 결합을 제공해야 하지만; 결합된 물질의 용출이 소망하는 샘플 단백질 또는 리간드를 파괴하지 않으면서 발생해야 한다.
크기-배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 내의 분자가 그것들의 크기, 또는 보다 기술적 관점에서 그것들의 유체역학적 부피를 기본으로 하여 분리되는 크로마토그래피 방법이다. 이는 보통 큰 분자 또는 거대분자 복합체, 예컨대 단백질 또는 산업 중합체에 적용된다. 전형적으로, 상기 기법은 유기 용매가 이동상으로서 사용될 때 사용되는 명칭인 겔 투과 크로마토그래피에 비해, 수용액이 칼럼을 통해 샘플을 이동시키기 위해 사용될 때, 겔 여과 크로마토그래피로 알려져 있다. SEC의 근본적인 원리는 상이한 크기의 입자가 고정상을 통해 상이한 비율로 용출(여과)되어, 크기를 기본으로 한 입자 용액의 분리를 야기하는 것이다. 모든 입자가 동시에 또는 거의 동시에 로딩된다면, 동일한 크기의 입자는 함께 용출되어야 한다.
고성능(고압으로도 알려짐) 액체 크로마토그래피(HPLC)는 화합물을 분리, 확인, 및 정량화하기 위해 생화학 및 분석 화학에서 자주 사용되는 칼럼 크로마토그래피의 형태이다. HPLC는 크로마토그래피 충전재(고정상)를 유지하는 칼럼, 칼럼을 통해 이동상(들)을 이동시키는 펌프, 및 분자의 체류 시간을 나타내는 검출기를 이용한다. 체류 시간은 고정상, 분석되는 분자, 및 사용된 용매(들)에 따라 달라진다.
약학 제제
이중 기능 항-glycPD-L1 항체 또는 글리코실화된 PD-L1을 함유한 약학 조성물의 임상 적용이 착수되는 경우, 일반적으로 의도된 적용에 적합한 약학 또는 치료 조성물을 제조하는 것이 유익하다. 일반적으로, 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 용해되거나 분산된 1 이상의 폴리펩티드 또는 추가 약제의 유효량을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 폴리펩티드 또는 항체를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 상한값 및 하한값을 포함하여, 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 예를 들어 이들 사이에서 유래될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 각각의 치료적으로 유용한 조성물 내의 활성 화합물(들)의 양은 적합한 투여량이 소정 단위 용량으로 얻어지는 방식으로 제조될 수 있다. 인자, 예컨대 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명뿐 아니라 다른 약학적 고려사항이 상기 약학 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
또한, 특정 양태에 따르면, 불활성 희석제를 갖거나 갖지 않는 약학적으로 허용 가능한 담체로의 투여에 적합한 조성물이 제공될 수 있다. 담체는 동화 가능해야 하며, 액체, 반고체, 예를 들어 겔 또는 페이스트, 또는 고체 담체를 포함해야 한다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 생리식염수, 지질, 리포좀, 수지, 바인더, 필러 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 당업자에게 알려진 바와 같은 임의의 또는 모든 수성 용매(예를 들어, 물, 알코올성/수성 용액, 에탄올, 생리식염수, 비경구적 비히클, 예컨대 염화나트륨, 링거스 덱스트로오스(Ringer's dextrose) 등), 비-수성 용매(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사 가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸올리에이트), 분산매, 코팅제(예를 들어, 레시틴), 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항균제 또는 항진균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스, 파라벤(예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살), 등장제(예를 들어, 당류, 염화나트륨), 흡수 지연제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴), 염, 약물, 약물 안정화제(예를 들어, 완충제, 아미노산, 예컨대 글리신 및 라이신, 탄수화물, 예컨대 덱스트로오스, 만노오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 말토오스, 소르비톨, 만니톨 등), 겔, 바인더, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 유체 및 영양소 보충제, 이와 같은 물질 및 이의 조합을 포함한다. 임의의 통상적 매질, 약제, 희석제, 또는 담체가 수용자에게 또는 이들이 함유된 조성물의 치료 효능에 유해한 경우를 제외하고, 본 방법을 실시하는데 사용하기 위한 투여 가능한 조성물에서의 그것의 사용은 적절하다. 약학 조성물에서 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘 알려진 파라미터에 따라 조정된다. 특정 양태에 따르면, 조성물은 임의의 간편하고 타당한 방식으로, 즉 용액, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수, 분쇄 등으로 담체와 조합될 수 있다. 상기 절차는 당업자에게 일상적이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 이들이 고체, 액체, 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부, 및 그것이 주사와 같은 투여의 경로를 위해 살균될 필요가 있는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 가질 수 있다. 조성물은 정맥내로, 피부내로, 경피로, 척추강내로, 동맥내로, 복강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 점막으로, 구강으로, 국부로, 국소로, 흡입(예를 들어, 에어로졸 흡입)에 의한, 주사에 의한, 수액(infusion)에 의한, 연속적인 수액에 의한, 표적 세포를 직접 배싱(bathing)하는 국소적 관류에 의한, 카테터를 통한, 세척을 통한, 지질 조성물(예를 들어, 리포좀)로, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법 또는 상기의 임의의 조합에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990을 참고한다. 전형적으로, 상기 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있고; 주사 전에 액체 첨가시 용액 또는 현탁액을 제조하는데 사용하기에 적합한 고체 또는 재구성 가능한 형태가 또한 제조될 수 있으며; 상기 제제는 또한 유화될 수 있다.
항체는 유리 염기, 중성, 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산 첨가 염, 예를 들어 단백질 조성물의 유리 아미노기로 형성된 것, 또는 무기산, 예컨대 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타타르산, 또는 만델산으로 형성된 것을 포함한다. 유리 카복시기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화제2철; 또는 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다.
추가 실시양태에서, 폴리펩티드, 1 이상의 지질, 및 수성 용매를 포함하는 약학 지질 비히클 조성물이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지질"은 특징적으로 물에서 불용성이고 유기 용매로 추출 가능한 광범위한 물질 중 임의의 것을 지칭한다. 이 광범위한 클래스의 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 용어 "지질"이 본원에 사용되는 경우, 그것이 임의의 특별한 구조로 제한되는 것은 아니다. 예는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 천연적으로 발생하거나 합성(즉, 인간에 의해 설계 또는 생성)될 수 있다. 그러나, 지질은 일반적으로 생물학적 성분일 수 있다. 생물학적 지질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 중성 지방, 인지질, 포스포글리세리드, 스테로이드, 테르펜, 라이소지질, 글리코스핑고리피드, 당지질, 설파타이드, 에터- 및 에스터-결합형 지방산을 갖는 지질, 중합성 지질, 및 이의 조합을 포함한다. 물론, 지질로서 당업자에게 이해되는 본원에 구체적으로 기재된 것들 이외의 화합물이 또한 상기 조성물 및 방법에 의해 포함될 수 있다. 당업자는 지질 비히클에서 조성물을 분산시키기 위해 이용될 수 있는 기법의 범위에 익숙할 것이다. 예를 들어, 항체는 지질을 함유한 용액에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 공유결합으로 결합되거나, 지질에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀(micelle) 또는 리포좀으로 함유되거나 복합화되거나, 그 외에 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조체와 결합될 수 있다. 상기 분산은 리포좀의 형성을 야기하거나 야기하지 않을 수 있다.
용어 "단위 용량" 또는 "투여량"은 대상체에서 사용하기에 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 투여, 즉 적절한 경로 및 투여 요법에 관하여 상기 논의된 소망하는 반응을 생성하기 위해 계산된 치료 항체 또는 치료 항체를 함유하는 조성물의 소정의 양을 함유한다. 치료 및 단위 용량의 수 둘 다에 따라 투여될 양은 소망하는 효과에 의존한다. 환자 또는 대상체에게 투여되는 본 실시양태의 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리학적 인자, 예컨대 대상체의 체중, 연령, 건강, 및 성별, 치료되는 질환의 유형, 질환 침투의 정도, 이전의 또는 동시적인 치료 개입, 환자의 특발증, 투여 경로, 및 특정 치료 물질의 역가, 안정성, 및 독성에 의해 결정될 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 용량은 또한 투여 당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 밀리그램/kg/체중 이상, 및 이의 유래 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유래 가능한 범위의 비제한적인 예에서, 상기 기재된 수치를 기본으로 하여, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 상술한 용량은 상기 나타낸 사이의 양을 포함하고, 또한 범위의 상한값 및 하한값을 포함하는 것으로 의도된다. 투여를 맡은 의사는 임의의 사례에서, 개별 대상체에 대한 조성물에서의 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
치료 조성물 또는 제제의 특별한 특성은 제한되지 않는 것으로 의도된다. 예를 들어, 적합한 조성물은 생리학적으로 용인 가능한 액체, 겔, 또는 고체 담체, 희석제, 및 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 제제는 가축과 같은 수의과 사용, 및 인간에서의 임상 사용을 위해 다른 치료제와 유사한 방식으로 포유동물에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능을 위해 필요한 투여량은 상기 기재된 바와 같이, 사용 유형 및 투여 방식뿐 아니라, 개별 대상체의 특정화된 요구에 따라 달라질 것이다.
바이오마커로서의 글리코실화된 PD-L1
글리코실화된 PD-L1에 대한 에세이에서 바이오마커로서 적어도 하나의 이중 기능 항-glycPD-L1 항체의 사용을 포함하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 암 또는 종양을 갖는 환자로부터 얻은 종양 또는 암 세포의 바이오마커 평가에 유용할 수 있다. 암을 갖는 대상체가 또한 글리코실화된 PD-L1, 특히 상기 세포의 세포 표면 상의 검출 가능한 수준의 글리코실화된 PD-L1을 발현하는 암 또는 종양을 갖는지 여부를 결정하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 대상체의 암 또는 종양 세포가 시험되고, 세포 표면 상에 글리코실화된 PD-L1을 발현하는 것으로 결정되는 경우, 항-glycPD-L1 항체 단독, 또는 다른 항암제와의 조합으로 치료된 대상체는, 예를 들어 상기 치료로부터 이득을 얻을 가능성이 더 있다. 상기 방법은 암 또는 종양을 갖는 대상체로부터 샘플을 얻는 단계, 당업계에 알려지고 사용되거나 상기 기재된 바와 같은 결합 방법을 사용하여, 대상체의 암 또는 종양으로부터 유래된 세포 상의 글리코실화된 PD-L1의 존재에 대해 샘플을 시험하는 단계, 및 대상체의 암 또는 종양이 글리코실화된 PD-L1 단백질의 세포 표면 발현에 대해 양성인 것으로 밝혀진 경우, 유효량의 항-glycPD-L1 항체 단독, 또는 다른 항암제와의 조합을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상체가 치료 전에 글리코실화된 PD-L1을 발현하는 암 또는 종양을 갖는 것으로 진단하는 것은 대상체에게 더욱 효과적인 치료 및 이득을 허용하며, 이는 투여된 항-glycPD-L1 항체가 대상체의 글리코실화된 PD-L1-발현 암 또는 종양 세포와 대상체의 PD-1-발현 T 세포의 상호작용을 차단하거나 억제하여, T 세포 활성의 먼역억제를 예방하고 활성화된 T 세포 사멸에 의해 종양 또는 암세포의 사멸을 촉진할 가능성이 있기 때문이다. 실시양태에서, 상기 방법은 암 또는 종양이 발현된 글리코실화된 PD-L1 단백질의 존재에 대한 시험에 잘 들을 수 있는 대상체를 우선 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
시간에 걸친 항-glycPD-L1 항체, 및 다른 항암 약물 또는 치료와의 조합 치료를 포함한 암 치료 또는 요법의 과정 동안뿐 아니라, 치료가 중단된 후에, 환자의 종양 세포 상의 글리코실화된 PD-L1의 존재를 모니터링하기 위해 유사한 방법이 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 항암 치료 요법, 또는 조합 치료가 치료 전에 및 치료 과정, 예를 들어 모니터링 동안 환자의 종양 또는 암 샘플을 글리코실화된 PD-L1-발현 종양 또는 암 세포에 대하여 시험하거나 평가하여, 성공적 결과 또는 이의 가능성을 결정하는 단계를 포함하는 동반 진단 방법에서 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 생체내 영상화에 유용한 마커, 예를 들어 방사성핵종, 예컨대 PET 또는 SPECT를 위한 I124, 광학 영상화를 위한 형광색소, 또는 MRI를 위한 상자성 킬레이트에 콘쥬게이트될 수 잇다. 표지된 항-glycPD-L1 항체는 환자에게, 예를 들어 정맥내 또는 다른 비경구적 투여 방식으로 투여될 수 있으며, 적절한 양의 시간을 대기한 후에, 표지된 항체의 존재 및 위치를 검출하여 종양 세포의 위치를 알아내고 정량화할 수 있다.
다른 약제
치료의 치료 효능을 개선하기 위해 다른 약제가 본 실시양태의 특정 양태와 조합되어 사용될 수 있다는 점이 고려된다. 이들 추가 약제는 세포 표면 수용체와 갭 연결부(GAP junction)의 상향조절에 영향을 미치는 약제, 세포증식억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 세포사멸 유도물질에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 약제, 또는 다른 생물학적 약제를 포함한다. 갭 연결부의 수의 증가에 의한 세포내 시그널링의 증가는 인접한 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료의 항-과증식성 효능을 개선하기 위해 세포증식억제제 또는 분화제가 본 실시양태의 특정 양태와 조합되어 사용될 수 있다. 세포 부착 억제제는 본 실시양태의 효능을 개선하는 것으로 고려된다. 세포 부착 억제제의 예는 초점 접착 키나아제(focal adhesion kinase)(FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 항체 c225와 같이 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 다른 약제가 치료 효능을 개선하기 위해 본 실시양태의 특정 양태와 조합되어 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
키트 및 진단법
다른 실시양태에서, 치료제 및/또는 다른 치료제 및 전달제를 함유한 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체를 포함한 요법을 제조 및/또는 투여하기 위해 사용된다. 키트는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 함유한 1 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 키트는, 예를 들어 적어도 하나의 항-글리코실화된 PD-1 항체뿐 아니라, 1 이상의 항-glycPD-L1 항체를 성분을 제조, 제형화, 및/또는 투여하거나 본원에 기재된 방법의 1 이상의 단계를 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 또한 키트의 성분과 반응하지 않는 용기, 예컨대 에펜도르프 튜브(eppendorf tube), 에세이 플레이트, 시린지, 병, 또는 튜브인 적합한 용기 수단을 포함할 수 있다. 용기는 살균 가능한 물질, 예컨대 플라스틱 또는 유리로 이루어질 수 있다.
키트는 본원에 기재된 방법의 절차적 단계의 개요를 설명하고, 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 바와 실질적으로 동일한 절차를 따를 지시 시트를 추가로 포함할 수 있다. 지시 정보는 컴퓨터를 사용해 실행될 때, 치료제의 약학적 유효량을 전달하는 실제 또는 가상 절차의 디스플레이를 야기하는, 기계-판독 가능한 지시를 함유한 컴퓨터 판독 가능한 매체 내에 있을 수 있다.
융합 및 콘쥬게이트
본원에서 제공된 항-글리코실화된 PD-L1 항체 또는 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드는 또한 다른 단백질을 갖거나 다른 모이어티에 화학적으로 콘쥬게이트된 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 이소형 또는 서브클래스에 의해 달라질 수 있으며, 키메라 또는 하이브리드일 수 있고/있거나, 예를 들어 이펙터 기능을 개선하며, 반감기, 또는 조직 접근성을 조절하고, 안정성과 같은 생물물리학적 특징을 증가시키며, 비용 감소와 연관될 수 있는 생산 효율성을 개선하기 위해 변형될 수 있는 Fc 부위를 갖는다. 융합 단백질 및 이를 제조하기 위한 방법의 구축에 유용한 많은 변형이, 예를 들어 Mueller, J.P. et al., 1997, Mol . Immun . 34(6):441-452; Swann, P.G., 2008, Curr . Opin . Immunol., 20:493-499; 및 Presta, L.G., 2008, Curr . Opin . Immunol ., 20:460-470에 의해 보고된 바와 같이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 항체의 천연 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 하이브리드, 예를 들어 IgG2/IgG4 Fc 불변 영역을 함유하는 키메라이다. Fc 영역에 대한 변형은, 비제한적으로, Fc 감마 수용체 및 보체에 대한 결합을 예방하기 위해 변형된 IgG4; 1 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 개선하기 위해 변형된 IgG1; 이펙터 기능을 최소화하기 위해 변형(아미노산 변경)된 IgG1; 변화된 글리칸을 갖는/글리칸이 없는(전형적으로 발현 숙주를 변경시킴으로써) IgG1; 및 FcRn에 대한 변경된 pH-의존성 결합을 갖는 IgG1을 포함한다. Fc 영역은 항체의 전체 힌지 영역, 또는 전체 미만의 힌지 영역을 포함할 수 있다.
다른 실시양태는 반감기를 증가시키는 FcR에 대한 결합 감소를 갖는 IgG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이를 포함한다. 대표적인 IG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이체는 예를 들어, Angal et al., 1993, Molec . Immunol ., 30(1):105-108; Mueller et al., 1997, Mol . Immun ., 34(6):441-452; 및 미국 특허 제6,982,323호에 기재되어 있으며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, IgG1 및/또는 IgG2 도메인은 결실된다. 예를 들어, Angal et al., Id.는 IgG1 및 IgG2 도메인의 세린 241이 프롤린으로 치환된 단백질을 기재하고 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100 개의 아미노산을 갖는 융합 단백질 또는 폴리펩티드가 고려된다.
일부 실시양태에서, 항-글리코실화된 PD-L1 항체 또는 글리코실화된 PD-L1 폴리펩티드는 적어도 하나의 모이어티와 연결되거나, 모이어티와 공유결합되거나, 모이어티와 복합체를 형성한다. 상기 모이어티는, 비제한적으로, 진단제 또는 치료제로서 항체의 효능을 증가시키는 모이어티일 수 있다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 이미징제, 독소, 치료 효소, 항생제, 방사성-표지된 뉴클레오티드, 화학치료제 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체 또는 이의 글리코실화된 폴리펩티드 또는 부분에 콘쥬게이트되거나 융합되는 모이어티는 효소, 호르몬, 세포 표면 수용체, 독소, 예컨대, 비제한적으로, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소(즉, PE-40), 디프테리아 독소, 리신, 젤로닌, 또는 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질), 단백질(예컨대, 종양 괴사 인자, 인터페론(예를 들어, α-인터페론, β-인터페론), 신경 성장 인자(nerve growth factor)(NGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor)(PDGF), 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator)(TPA), 또는 세포사멸제(예를 들어, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β)), 생체 반응 조절인자(예컨대, 림포카인(예를 들어, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6")), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor)("GM-CSF"), 과립구 집락 자극 인자("G-CSF"), 또는 대식세포 집락 자극 인자("M-CSF")), 또는 성장 인자(예를 들어, 성장 호르몬(growth hormone)("GH")), 세포독소(예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 예컨대 파클리탁셀, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론, 미스라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 튜불리신계 미세소관 억제제, 예를 들어 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄시노이드 DM1(N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신; 사용된 링커에 따라 메르탄신(mertansine) 또는 엠탄신(emtansine); 및 마이탄시노이드 DM4(N2'-데아세틸-n2'-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-6-메틸마이탄신; 라브탄신(ravtansine)), ImmunoGen, Inc., Waltham, MA) 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체), 대사길항제(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, BiCNU®(카무스틴; BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조신, 미토마이신 C, 및 시스디클로로디아민 플라티늄 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미스라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 항유사분열제 및/또는 튜불린 억제제, 예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴, 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF), 모노메틸 아우리스타틴 E(또는, 데스메틸-아우라스타틴 E)(MMAE), 예를 들어, 베도틴; 또는 이의 조합일 수 있다.
항체-약물 콘쥬게이트 ( ADC )
항체 약물 콘쥬게이트(ADC)는 항체, 전형적으로 특정 표적 항원, 특히 종양 또는 암 세포의 표면 상에 발현되거나 과잉발현된 표적 항원에 지향된 단클론 항체에 강한 세포독성 약물이 화학적 링커 또는 커필링제를 통해 공유적으로 연결된 생물학적 치료제이다. 상기 "로딩된" 항체는 종양 또는 암 세포에게 치명적 세포독성 화물을 전달하도록 설계된다. ADC는 페이로드 약물을 신생물 세포에 표적화하는 한편, 부작용을 감소시키고 전신성 독성을 최소화하기 위한 수단을 제공한다. ADC는 ADC의 항체 성분과 이의 표적 항원의 특이적 상호작용 때문에 세포 표면-발현된 표적 항원에 결합한다. 표적 항원에 대한 결합 후에, ADC는 특히, 항체가 내부화 활성을 고조시켰을 경우, 본원에 기재된 실시양태의 항-glycPD-L1 항체, 예를 들어 STM108 및 STM073과 같이, 세포 내로 내부화될 수 있다. 따라서, 상기 ADC가 세포 내로 내부화될 때, 이들은 세포를 사멸시키거나 아폽토시스 또는 세포 사멸을 야기하는 세포 내부의 분자를 표적화하기 위해 직접적으로 작용한다. 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체, 특히 단클론, 인간화, 키메라, 또는 인간 항체를 포함하는 상기 ADC는 종양 및 암 세포 상의 글리코실화된 PD-L1에 대한 항체의 특이적 표적화를 세포독성 약물 또는 화합물의 암-사멸 능력과 조합하여, 항-glycPD-L1 항체를 이용한 치료 및 요법에 대한 추가 이점을 제공한다. ADC를 제조하고 사용하기 위한 기법은 당업계에 알려져 있으며, 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체에 대하여 제한되지 않는다. (예를 들어, Valliere Douglass, J.F., et al., 2015, Mol . Pharm ., 12(6):1774-1783; Leal, M. et al., 2014, Ann. N.Y . Acad . Sci., 1321:41-54; Panowski, S. et al., 2014, mAbs, 6(1):34-45; Beck, A. 2014, mAbs, 6(1):30-33; Behrens, C.R. et al., 2014, mAbs, 6(1):46-53; 및 Flygare, J.A. et al., 2013, Chem. Biol . Drug Des., 81(1):113-121 참고). 실시양태에서, 상기 기재된 모이어티, 특히 독소 및 세포독소의 일부 또는 전부는 항-glycPD-L1 항체에 콘쥬게이트되어 암을 치료하기 위해 효과적인 ADC를 생성할 수 있다. 실시양태에서, ADC의 항-glycPD-L1 항체 성분은 이중특이적, 다중특이적, 비파라토프, 또는 멀티파라토프 항체일 수 있다.
치료 또는 세포독성 모이어티를 항체에 콘쥬게이트시키기 위한 기법은 잘 알려져 있으며; 예를 들어 Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in CONTROLLED DRUG DELIVERY (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; Thorpe et al., Immunol . Rev. 62:119-158 (1982); Carter et al., Cancer J. 14(3):154-169 (2008); Alley et al., Curr . Opin . Chem . Biol. 14(4):529-537 (2010); Carter et al., Amer . Assoc. Cancer Res. Educ . Book. 2005(1):147-154 (2005); Carter et al., Cancer J. 14(3):154-169(2008); Chari, Acc . Chem Res. 41(1):98-107 (2008); Doronina et al., Nat. Biotechnol. 21(7):778-784(2003); Ducry et al., Bioconjug Chem . 21(1):5-13(2010); Senter, Curr . Opin . Chem . Biol . 13(3):235-244 (2009); 및 Teicher, Curr Cancer Drug Targets. 9(8):982-1004 (2009)를 참고한다. ADC 및 ADC 종양학 생성물의 검토는 Lambert, British J. Clin. Pharmacol., 76(2):248-262 (2013) 및 Bouchard et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 24:5357-5363 (2014)에서 발견된다.
구체적 실시양태에서, 종양 세포 내로 PD-L1의 내부화를 가능하게 하는 항-glycPD-L1 항체는 전형적으로 불안정한 결합을 갖는 화학적 링커에 의해 매우 강한 생물학적으로 활성인 약물 또는 약제, 예컨대 세포독소 및/또는 화학치료제, 상기 기재된 바와 같은 독소 또는 세포독소, 또는 방사성핵종에 콘쥬게이트되어, 본원에서 항-glycPD-L1 항체-ADC로 지칭되는 항-glycPD-L1 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)를 생성한다. 생물학적으로 활성인 약물 또는 세포독성제는 예를 들어, 세포, 특히 항-glycPD-L1 항체-ADC에 의해 결합되는 세포-표면 표적 수용체 또는 분자를 발현하는 종양 또는 암 세포 내로 전달되는 "세포독성 페이로드"로서 제공된다. 표적 분자에 결합된 상기 항-glycPD-L1 항체-ADC는 세포독성 약물 페이로드가 방출되는 세포 내로 내부화된다. 매우 강한 세포독성 페이로드에 대한 콘쥬게이트를 통해 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체를 내부화시키는 암 세포-사멸 활성의 강화는 높은 항-종양 활성 및 일반적으로 잘 용인되는 가벼운 부작용을 갖는 항암 ADC 생물의약품을 제공한다.
본원의 실시양태에 기재된 항-glycPD-L1 항체는 당업계에 알려지고 사용되는 바와 같은, 또는 아직 상용화되지 않은 다양한 유형의 세포독성 또는 DNA-작용 페이로드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 마이탄신은 에티오피아 관목 마이테누스 오바투스(Maytenus ovatus)의 수피로부터 첫번째로 단리되는 벤조안사마크롤라이드(benzoansamacrolide)이다. 이 세포독성제 및 이의 유도체(예를 들어, 마이탄시노이드)는 빈카 알칼로이드 결합 부위에 인접한 튜불린에 결합한다. 이들은 미세소관의 단부에 위치한 튜불린에 대해 강한 친화도를 갖고 미세소관에 걸쳐 분포된 부위에 대해 낮은 친화도를 갖는 것으로 여겨진다. 미세소관 동역학의 억제는 세포가 세포 주기의 G2/M 단계에서 정지되도록 야기하여, 궁극적으로 아폽토시스에 의한 세포 사멸을 야기한다. (Oroudjev et al., Mol . Cancer Ther., 10L2700-2713 (2010)). 2 종의 메이탄신 유도체(티올-함유 마이탄시노이드)는 비가역적 및 가역적 링커와 조합되어 광범위하게 사용되어온 DM1 및 DM4(ImmunoGen, Inc., Waltham, MA)를 포함한다. 특히, 티오에터 링커를 이용해 항체에 부착된 DM1은 "엠탄신"으로 지칭되고; SPP 링커를 이용해 항체에 부착된 DM1은 "메르탄신"으로 지칭된다. SPDB 링커를 이용해 부착된 DM4는 "라브탄신(ravtansine)"으로 지칭되고; sSPDB 링커를 이용해 부착된 DM4는 "소라브탄신(soravtansine)"으로 지칭된다. (ImmunoGen, Inc., Waltham, MA). 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체-ADC는 튜불린-작용 마이탄시노이드 페이로드 DM1을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체-ADC는 튜불린-작용 마이탄시노이드 페이로드 DM4를 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체-ADC는 DNA-작용 페이로드, 예를 들어 DGN462(ImmunoGen, Inc., Waltham, MA)를 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체-ADC의 항-glycPD-L1 항체 성분은 STM073, 또는 이의 결합 부분이다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체-ADC의 항-glycPD-L1 항체 성분은 STM108, 또는 이의 결합 부분이다.
특별한 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체에 콘쥬게이트된 세포독성제는 MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E(또는 데스메틸-아우리스타틴 E)), 항유사분열 활성이 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포 분열을 억제하는 것을 포함하는 높은 독성의 항신생물제이다. 국제 일반명 베도틴은 MMAE-항체 콘쥬게이트에서 MMAE와 항체에 대한 이의 연결 구조를 지칭한다. 더욱 특별한 실시양태에서, ADC는 STM073-MMAE 또는 STM108-MMAE이다.
다수의 화학적 링커가 알려져 있으며, 세포독성 또는 DNA-작용 약물 페이로드를 항체에 콘쥬게이트시켜 ADC를 생성하기 위해 사용된다. 항-glycPD-L1 항체를 포함하는 ADC, 특히 본원에 기재된 바와 같은 이들의 표적에 결합한 이후 내부화하는 ADC를 생성하기 위해, 단독으로 또는 조합적으로 사용하기 위해 수용되는 특정 링커는 SMCC(4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산카복시산 N-하이드록시석신이미드 에스터); SPDB(N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)부티레이트); SPP(N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트); 설포-SPDB 또는 sSPDB(N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)-2-설포부타노에이트); 티오에터 링커 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(MCC); 및 vc(발린-시트룰린 디펩티드 링커)를 포함한다. 예로서, 조작된 링커(예를 들어, SMCC, SPDB, S-SPDB), (Immunogen, Inc.)는 종양에 대한 ADC의 결합 이전에 안정되고, 이어서 ACD가 암 세포 내부로 내부화되면 페이로드 효능을 최적화하도록 설계되었다. 다른 링커, 예컨대 카텝신 절단성 링커인 디펩티드 vc 링커는 세포독성제, 예컨대 돌라스타틴 10으로부터 유래된 유사분열 억제제인 아우리스타틴, 예를 들어 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 예를 들어 베도틴에 항체를 콘쥬게이트시키기 위해 사용될 수 있다. 세포독소는 항체에 콘쥬게이트되어, 1 이상의 독소 분자가 각각의 항체 분자에 부착될 수 있으며, 예를 들어 항체 당 평균 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 독소 분자가 있을 수 있다.
특별한 실시양태에서, MMAE는 발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐-MMAE(MC-vc-PAB-MMAE)에 결합된 말레이미도카프로일(MC) 부착기에 의해 항체 시스테인에 간접적으로 연결된다. "MC-vc-PAB-MMAE" 선형 구조에서, "MC"는 말레이미드 및 카프로산으로 구성되며, 전형적으로 H 사슬 상의 시스테인기를 통해 항체에 부착되는 모이어티이다. 결국, "MC"는 발린(Val) 및 시트룰린(Cit)으로 구성되고, 종양 또는 암 세포 내부의 카텝신에 의해 절단되는 카텝신 절단성 링커인 "vc" 링커에 부착된다. "vc"는 스페이서 "PAB", 즉 MMAE 세포독소가 연결되는 파라미노벤조산에 부착된다. MC-vc-PAB-MMAE ADC는 카텝신 B와 같은 프로테아제에 의해 절단될 때, 유리, 막-투과성 MMAE를 방출한다. 실시양태에서, 항체에 대한 링커는 세포외액에서 안정적이지만, ADC가 종양 또는 암 세포로 유입되면 카텝신에 의해 절단되어, MMAE 또는 다른 독소 약물의 항유사분열 메커니즘을 활성화한다. 다른 실시양태에서, 모노메틸아우리스타틴 F, (MMAF)는 말레이미도카프로일에 의해 항체 시스테인에 연결된다(MC-MMAF). MC-vc-PAB-MMAE ADC와 반대로, MC-MMAF ADC는 MCC-DM1 ADC와 같이 절단 불가능하며, 세포 내로 내부화 및 분해되어, 세포 내의 활성 약물로서 시스테인-MC-MMAF를 방출해야 한다.
실시양태에서, 세포독성 페이로드는 ADC를 세포 내로 내부화한 다음, 리소좀 내로 방출된다. 리소좀에서, 리소좀 효소는 ADC의 항체 성분을 분해시킨다. 리소좀 분해 이후, 약물(및 약물-링커) 페이로드가 세포질 내로 방출되며, 약물은 세포내 표적에 결합하여, 궁극적으로 세포 사멸을 야기한다. 최적으로는, 방출된 페이로드는 링커가 여전히 부착된 완전 활성이다. ADC에 결합된 표적이 리소좀으로의 열악한 수송을 야기하는 다른 실시양태에서, 표적 세포 외부에서 안정적이나, 세포 내에서는 항체 성분으로부터 페이로드를 절단하는 링커는 세포 내에서 페이로드 방출을 위한 대안적 방식을 제공하지만, 리소좀 외부에서는 그렇지 않다. 다른 실시양태에서, 링커는 세포외액에서 안정적이지만, ADC가 종양 또는 암 세포로 유입되면 카텝신에 의해 절단되어, 독소 약물의 항유사분열 또는 다른 세포독성 메커니즘을 활성화한다. 다른 실시양태에서, 절단성 링커의 작용에 의해 방출된 페이로드는 이웃한 암 세포에 유입되고, 방관자 효과를 통해 이들을 사멸시켜, ADC의 표적화 및 종양 사멸 활성을 증가시킬 수 있다.
실시양태에서, 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체, 예컨대 이중 기능 STM073 또는 STM108 MAb는 링커 SMCC(석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트)를 통해 DM1에 결합된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체, 예컨대 STM073 또는 STM108는 링커 SPDB(N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 또는 sSPDB(N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)-2-설포부타노에이트)를 통해 DM4에 결합된다. 다른 실시양태에서, 아우리스타틴 모노메틸아우리스타틴 E는 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐(MC-vc-PAB-MMAE)에 의해 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체, 예컨대 STM073 또는 STM108의 시스테인 잔기에 연결된다. 특별한 실시양태에서, ADC는 STM108-MC-vc-PAB-MMAE이다. 다른 특별한 실시양태에서, ADC는 STM073-MC-vc-PAB-MMAE이다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체-ADC는 분자 당 다중 단위의 MMAE와 같은 약물, 예컨대 분자 당 1-10, 1-5, 2-5, 3-5, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 단위뿐 아니라, 이들 사이의 값의 MMAE와 같은 약물을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체-약물 비는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상뿐 아니라, 2-10의 범위 및 이들 사이의 값일 수 있다. 실시양태에서, STM108 또는 STM073 항체는 이중특이적, 다중특이적, 비파라토프, 또는 멀티파라토프 항체, 또는 이의 항원 결합 부분이다. 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 항-glycPD-L1 항체를 포함하는 상기 ADC, 예를 들어 상술한 STM108-MC-vc-PAB-MMAE는 암 치료를 위한 종양 및 암 세포의 사멸에서 강화되고 다면적인 항신생물 효과를 제공한다. 약간의 예시적 이점으로서, 항-인간 glycPD-L1 항체(예를 들어, MAb)-ADC, 예를 들어 STM108-ADC는 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하여, 종양 세포에 대한 T 세포 면역력 및 이펙터 기능을 향상시킬 수 있고; 이는 종양 및 암 세포 상에 발현된 글리코실화된 PD-L1을 선택적으로 표적화할 수 있으며; 이는 결합 후에 종양 또는 암 세포 상에 PD-L1을 내부화하여, 종양 또는 암 세포 상에 표면-발현된 PD-L1을 감소시키고 PD-L1의 종양발생 가능성을 추가로 감소시킬 수 있으며; 이는 항체가 내부화되고 독성 약물이 방출되는 종양 또는 암 세포의 아폽토시스를 야기하여, 세포를 손상시키고 궁극적으로 사멸시킬 수 있으며; 이는 세포사멸된(apoptosed) 종양 또는 세포로부터의 독성 약물 방출을 통해 인근의 또는 이웃한 종양 또는 암 세포를 사멸시킴으로써 방관자 효과를 용이하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체는 펩티드와 같은 마커에 콘쥬게이트 되어, 정제를 용이하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헥사-히스티딘 펩티드(서열번호 93), 즉 헤마글루티닌 "HA" 태그(Wilson, I. A. et al., Cell, 37:767-778 (1984)), 또는 "플래그(flag)" 태그(Knappik, A. et al., Biotechniques 17(4):754-761 (1994))이다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 폴리펩티드에 콘쥬게이트된 모이어티는 에세이에서 검출될 수 있는 이미징제일 수 있다. 상기 이미징제는 효소, 보결분자단, 방사성표지, 비방사성 상자성 금속 이온, 합텐, 형광 표지, 인광성 분자, 화학발광성 분자, 발색단, 발광성 분자, 생물발광성 분자, 광친화성 분자, 또는 유색 입자 또는 리간드, 예컨대 비오틴일수 있다. 실시양태에서, 적합한 효소는, 비제한적으로, 꽃양배추 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 보결분자단 복합체는, 비제한적으로, 스트렙타비틴/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며; 형광 물질은, 비제한적으로, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아진일아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질은, 비제한적으로, 루미놀을 포함하며; 생물발광 물질은, 비제한적으로, 루시페라아제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고; 방사성 물질은, 비제한적으로, 비스무트(213Bi), 탄소(14C), 크롬(51Cr), 코발트(57Co), 불소(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 갈륨(68Ga, 67Ga), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브덴(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루테뮴(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), 스트론튬(85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113Sn, 117Sn), 삼중수소(3H), 제논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y), 아연(65Zn)을 포함하며; 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용한 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다.
이미징제는 당업계에 알려진 기법을 사용하여 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩티드에 직접적으로 또는 중간물(예컨대, 당업계에 알려진 링커)을 통해 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 진단제로서 사용하기 위해 본원에 기재된 항체 및 다른 분자에 콘쥬게이트 될 수 있는 금속 이온에 대하여 보고된 미국 특허 제4,741,900호를 참고한다. 일부 콘쥬게이션 방법은, 예를 들어 항체에 부착되는 유기 킬레이트제, 예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔술폰아마이드; 및/또는 테트라클로로-3-6α-디페닐글리코우릴-3을 이용하는 금속 킬레이트 복합체의 사용을 포함한다. 단클론 항체는 또한 글루타르알데하이드 또는 과요오드산염과 같은 커플링제의 존재 하에 효소와 반응할 수 있다. 형광 마커와의 콘쥬게이트는 이들 커플링제의 존재 하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-glycPD-L1 항체 또는 glycPD-L1 폴리펩티드는 2 차 항체에 콘쥬게이트되어, 예를 들어 미국 특허 제4,676,980호에 기재된 바와 같은 항체 이종콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 상기 이종콘쥬게이트 항체는 합텐(예를 들어, 플루오레세인), 또는 세포 마커(예를 들어, 비제한적으로, 4-1-BB, B7-H4, CD4, CD8, CD14, CD25, CD27, CD40, CD68, CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT, ICOS, B7-H3, B7-H7, B7-H7CR, CD70, CD47), 또는 사이토카인(예를 들어, IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-beta, IL-10, IL-17, IFNγ, Flt3, BLys), 또는 케모카인(예를 들어, CCL21)에 추가로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-글리코실화된 PD-L1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드는 또한 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이는 표적 항원, 또는 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 결합을 통해 지지체에 고정화된 표적 항원에 결합할 수 있는 다른 분자의 면역에세이 또는 정제를 수행하는데 유용할 수 있다. 상기 고체 지지체는, 비제한적으로, 유리, 셀루로오스, 폴리아크릴아마이드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함한다.
실시예
다음 실시예는 비글리코실화된 PD-L1 및/또는 PD-L1 글리코실화 돌연변이와 비교하여, 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 결합하는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체 및 본원에 기재된 사용 방법에 관한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 대표적인 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 예시된다. 개시된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체는 예이며, 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니라는 점이 당업자에 의해 인식되어야 한다.
실시예 1 물질 및 방법
세포 배양, 안정된 형질감염체 , 및 형질감염. 모든 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)으로부터 얻었다. 이들 세포를 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum)(FBS)이 보충된 DMEM/F12 또는 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다. 퓨로마이신(InvivoGen, San Diego, CA, USA)을 사용하여 MDA-MB-468, BT549 및 293T 세포 내의 PD-L1 안정된 형질감염체를 선택하였다. 일시적 형질감염을 위해, SN 리포좀(Hu, M. C. et al., 2004, Cell, 117:225-237) 및 lipofectamineTM 2000(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 DNA, 예컨대 PD-L1을 코딩하는 DNA로 세포를 일시적으로 형질감염시켰다.
렌티바이러스 감염을 사용한 안정된 세포의 생성. 세포에서 PD-L1의 녹다운(knockdown) 발현(Shen, J. et al., 2013, Nature, 497:383-387)에 사용된 렌티바이러스계 shRNA(pGIPZ 플라스미드)를 shRNA/ORF 코어 퍼실리티(Core Facility)(UT MD Anderson Cancer Center)로부터 구매하였다. MDA-MB-231 또는 A431 세포에서 PD-L1 단백질 발현의 녹-다운 효능을 기본으로 하여, 본 발명자들은 본 연구를 위해 2 개의 shPD-L1 클론을 선택하였다. 성숙 안티센스 서열은 다음과 같다: TCAATTGTCATATTGCTAC(shPD-L1 #1, 서열번호 34), TTGACTCCATCTTTCTTCA (shPD-L1 #5, 서열번호 35). 내인성 PD-L1을 녹다운시키고, 동시에 Flag-PD-L1을 재구성하기 위해 pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1 이중 발현 구축물을 사용하여, 본 발명자들은 내인성 PD-L1 녹-다운 및 Flag-PD-L1 WT 또는 4NQ 돌연변이 발현 세포주를 수립하였다. PD-L1 및 Flag-PD-L1에 대한 렌티바이러스-발현 shRNA를 생성하기 위해, 본 발명자들은 293T 세포를 FuGENE 6 형질감염 시약과 함께 pGIPZ-비-침묵(벡터 대조군 바이러스에 대해), pGIPZ-shPD-L1, 또는 pGIPZ-shPD-L1/ PD-L1 WT, 또는 pGIPZ-shPD-L1/ PD-L1 4NQ 돌연변이로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에 배지를 교환한 다음에, 상기 배지를 24 시간 간격으로 수집하였다. 렌티바이러스를 함유하는 수집된 배지를 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고, 0.45-μm 필터를 통해 여과하였다. 세포를 감염 12 시간 전에 50% 콘플루언스(confluence)로 접종하고, 배지를 렌티바이러스를 함유한 배지로 교체하였다. 24 시간 동안의 감염 후, 배지를 신선한 배지로 교체하였으며, 감염된 세포를 1 ㎍/mL 퓨로마이신(InvivoGen)으로 선택하였다.
플라스미드. shRNA/ORF 코어 퍼실리티(UT MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA)로부터 인간 PD-L1 클론을 얻었으며, 알려진 분자 생물학 기법을 사용하여 pCDH 렌티바이러스 발현 벡터 내로 클로닝하여, PD-L1-Flag 또는 PD-L1-Myc 발현 세포주를 수립하였다. 또한, 인간 PD-L1 핵산 또한 일시적 형질감염을 위해 pEGFP-N1 및 pCMV-HA 포유동물 세포 발현 벡터 내로 클로닝하였다. pCDH / PD-L1-Flag 발현 벡터를 주형으로 사용하여, 하기 표 4에 나타낸 프라이머를 사용하는 부위 지향된 돌연변이유발을 수행함으로써 PD-L1-Flag NQ 돌연변이 N35Q, N192Q, N200Q, N219Q, 및 4NQ(N35Q/N192Q/N200Q/N219Q)를 생성하였다. 내인성 PD-L1을 녹다운시키고, 동시에 Flag-PD-L1을 재구성하기 위한 pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1 이중 발현 구축물을 생성하기 위해, PD-L1 mRNA의 3'-UTR 영역을 표적화하는 shPD-L1 구축물(shPD-L1 #5)을 선택하였다. 내인성 PD-L1에 대해 특이적인 shRNA를 발현하는 pGIPZ-shPD-L1(Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA) 내로 Flag-PD-L1 야생형(WT) 또는 4NQ 돌연변이 DNA를 클로닝하였다. 효소 분해 및 DNA 서열결정을 사용하여 모든 구축물을 확인하였다.
Figure pct00012
qRT-PCR 에세이를 수행하여 mRNA의 발현을 측정하였다(Shen et al., 2013, Nature, 497:383-7; and Chang et al., 2011, Nature Cell Biology, 13:317-23)(하기 표 5 참고). 세포를 PBS로 2 회 세척하고 즉시 QIAzol에 용해시켰다. 상기 용해된 샘플은 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용한 총 RNA 추출을 거쳤다. mRNA의 발현을 측정하기 위해, 무작위 6량체(Life Technologies)를 사용하는 SuperScript III First-Strand cDNA 시스템에 의해 제조사의 지시에 따라 1 ㎍의 정제된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR 기구(iQ5, BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. 비교 ct 방법을 사용하여 모든 데이터 분석을 수행하였다. 결과를 우선 내부 대조군 β-액틴 mRNA에 대해 정규화하였다.
Figure pct00013
항체 및 화학물질. 실시예에 기재된 실험에서는 다음 항체를 사용하였다: (F3165; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); Myc(11667203001; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA); HA(11666606001; Roche Diagnostics); PD-L1(13684; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); PD-L1(329702; BioLegend, San Diego, CA, USA,); PD-L1(GTX117446; GeneTex, Irvine, CA, USA); PD-L1(AF156; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA); PD-1(ab52587; Abcam, Cambridge, MA, USA); B3GNT3(ab190458; Abcam); B3GNT3(18098-1-AP; Proteintech, Chicago, IL, USA); Granzyme B(ab4059; Abcam); EGFR(4267; Cell Signaling Technology); α-튜불린(B-5-1-2; Sigma-Aldrich); 및 β-액틴(A2228; Sigma-Aldrich). 실험에서 사용하기 위해, 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor)(EGF), 사이클로헥시미드, 및 튜니카마이신을 Sigma-Aldrich로부터 구매하였다. 제피티닙, 엘로티닙, 라파티닙, 세툭시맙, 및 AG1478을 Calbiochem Corp(Billerica, MA, USA)로부터 얻었다.
면역블롯 분석, 면역세포화학 및 면역침강. 면역블롯 분석을 이전에 기재된 바(Lim et al., 2008, Gastroenterology, 135:2128-40; 및 Lee et al., 2007, Cell, 130:440-455)와 같이 수행하였다. Odyssey® 적외선 영상화 시스템(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA)을 사용하여 이미지 획득 및 밴드 강도의 정량화를 수행하였다. 면역침강을 위해, 세포를 버퍼(50 mM Tris·HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)(EDTA) 및 0.5% Nonidet P-40(NP-40))에 용해시키고, 16, 000 x g에서 30 분 동안 원심분리하여, 잔해를 제거하였다. 깨끗해진 용해액은 항체와 함께 면역침강을 거쳤다. 면역세포화학을 위해, 세포를 실온에서 15 분 동안 4 % 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 5 % 트리톤(Triton) X-100에서 5 분 동안 투과시킨 다음에, 1 차 항체를 사용하여 염색하였다. 사용된 2 차 항체는 항-마우스 Alexa Fluor 488 또는 594 염료 콘쥬게이트 및/또는 항-토끼 Alexa Fluor 488 또는 594 염료 콘쥬게이트(Life Technologies)였다. 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI 블루)(Life Technologies)을 사용하여 핵을 염색하였다. 장착 후에, 다광자 공초점 레이저-주사 현미경(Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)을 사용하여 세포를 시각화하였다.
PD-L1 및 PD-1(PD-L1/PD-1) 상호작용 에세이. PD-1 단백질과 PD-L1 단백질의 상호작용을 측정하기 위해, 세포를 실온에서 15 분 동안 4 % 파라포름알데하이드에서 고정시킨 다음에, 재조합 인간 PD-1 Fc 키메라 단백질(R&D Systems)과 함께 1 시간 동안 항온처리하였다. 사용된 2 차 항체는 항-인간 Alexa Fluor 488 염료 콘쥬게이트(Life Technologies)였다. 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI 블루)(Life Technologies)을 사용하여 핵을 염색하였다. 이어서, 마이크로플레이트 판독기 Synergy Neo(BioTeK, Winooski, VT, USA)를 사용하여 Alexa Fluor 488 염료의 형광 강도를 측정하고, 총 단백질 양에 의한 강도로 정규화하였다. 영상을 얻기 위해, 장착 후에, 공초점 레이저-주사 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 세포를 시각화하였다.
공동-배양 실험 및 IL-2 발현 측정. 저캇 T 세포와 종양 세포의 공동-배양 및 IL-2 발현 측정을 이전에 기재된(Sheppard, K. A. et al., 2004, FEBS letters, 574:37-41) 바와 같이 수행하였다. T 세포 비활성화에 대한 종양 세포의 효과를 분석하기 위해, 종양 세포를 Dynabeads® 인간 T-활성제 CD3/CD28(Life Technologies)로 활성화되는 인간 PD-1을 발현하는 활성화된 저캇 T 세포와 함께 공동-배양하였다. 5:1(저캇:종양 세포) 비의 공동-배양액을 12 또는 24 시간 동안 항온처리하였다. 배지에서 분비된 IL-2 수준을 제조사(Human IL-2 ELISA Kits, Thermo Scientific)에 의해 기재된 바와 같이 측정하였다.
PD-L1의 글리코실화 분석. PD-L1 단백질의 글리코실화를 확인하기 위해, 세포 용해액을 제조사에 의해 기재된 바와 같이 효소 PNGase F, Endo H, O-글리코시다아제(New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)로 처치하였다. 글리코실화된 PD-L1 단백질을 염색하기 위해, 정제된 PD-L1 단백질을 제조사에 의해 기재된 바와 같이 당단백질 염색 키트(Peirce/Thermo Scientific)를 사용하여 염색하였다.
인간 유방암 조직 샘플의 면역조직화학 염색. 면역조직화학(IHC) 염색을 이전에 기재된(Lee et al., 2007, Cell, 130:440-455; Lo et al., 2007, Cancer Research, 67:9066-9076; Chang, C. J. et al., 2011, Cancer cell, 19:86-100) 바와 같이 수행하였다. 간략하게는, 조직 시료를 PD-L1, EGFR, B3GNT3, 또는 그란자임(Granzyme) B에 대한 항체 및 비오틴-콘쥬게이트된 2 차 항체와 함께 항온처리한 후에, 액티빈-비오틴-퍼옥시다아제 복합체와 함께 항온처리하였다. 아미노-에틸카바졸 발색단을 사용하여 시각화를 수행하였다. 통계적 분석을 위해, 피셔 정확 검정(Fisher's exact test) 및 스피어만(Spearman) 순위 상관 계수를 사용하였으며; 0.05 미만의 p-값을 통계적으로 유의미한 것으로 고려하였다. 조직학적 스코어에 따라, 염색 강도를 4 개의 그룹; 높음(스코어 3), 중간(스코어 2), 낮음(스코어 1) 및 음성(스코어 0)으로 순위화하였다.
N-글리코펩티드의 확인. 정제된 His 태그된 PD-L1 단백질을 10 mM 디티오트레이올(dithiothreitol)(DTT)로 37℃에서 1 시간 동안 환원시키고, 25 mM 암모늄 바이카보네이트 버퍼 중 50 mM 요오드아세트아마이드로 1 시간 동안 암실에서 실온으로 알킬화시킨 다음에, 37℃에서 1:50의 효소 대 기재의 비의 서열결정 등급 트립신으로 밤새 처치하였다. 이어서, 분해된 생성물을 0.1%의 최종 농도까지 포름산으로 희석하였으며, LC-MS/MS 분석 전에 ZipTip C18(Millipore)에 의해 세척하였다. IBC의 아카데미아 시니카 질량분석 시설(Academia Sinica Mass Spectrometry Facility)에서 수득하였다. 트랩 칼럼 Acclaim PepMap 100(2 cm x 100 μm 내경)(Dionex)을 구비한 UltiMate 3000 RSLCnano 시스템(Dionex)에 결합된 Orbitrap Fusion Tribrid(Thermo Scientific) 상의 나노스프레이 LC-MS/MS에 의해 펩티드 혼합물을 분석하였다. 펩티드 혼합물을 Acclaim PepMap RSLC 25 cm x 75 μm 내경 칼럼(Dionex) 상에 로딩시켰으며, 60 분 동안 5%에서 35% 용매 B (0.1% 포름산이 있는 100% 아세토니트릴)의 구배를 사용하여 500 nL/분의 유속으로 분리하였다. 용매 A는 0.1% 수중 포름산이었다. CID와 평행인 HCD 모드 하에서 MS 및 MS/MS 데이터 수득을 위해 사용된 파라미터는 다음이다: 3 초 사이클 시간을 갖는 최고 속도 모드; FTMS: 스캔 범위(m/z) = 400-2000; 해상도 = 120 K; AGC 표적 = 2 Х 105; 최대 분사 시간(ms) = 50; FTMSn(HCD): 단리 모드 = 4중극자; 단리 윈도우 = 1.6; 충돌 에너지(%) = 단계적 충돌 에너지 5%를 갖는 30; 해상도 = 30 K; AGC 표적 = 5 Х 104; 최대 분사 시간(ms) =60; ITMSn(CID): 단리 모드 = 4중극자; 단리 윈도우 = 1.6; 충돌 에너지(%) = 30; AGC 표적 = 1 Х 104. 원 데이터를 Proteome Discoverer 1.4에 의해 마스코트 일반 형태(Mascot generic format)(MGF)로 전환하였다. 글리코펩티드 확인을 위해, 다음 파라미터를 갖는 Byonic(버전 2.0-25)을 사용하여 HCD MS2 데이터를 검색하였다: 펩티드 내성 = 2 ppm; 단편 내성 = 6 ppm; 결손된 분열 = 1; 변형: 카바마이드메틸 시스테인(고정됨), 메티오닌 산화(일반 2), N에서 탈아마이드화(레어(rare) 1). Byonic에 의해 제시된 글리코펩티드 히트(hit)를 조합된 HCD 및 CID MS2 결과에 의해 수동으로 추가로 점검하였다.
통계 분석. 막대 그래프에서의 데이터는 3 개의 독립 실험의 표준 편차를 이용하여 미처치 그룹 또는 대조군 그룹에 비교한 평균 배수 변화를 나타낸다. SPSS(Ver. 20, SPSS, Chicago, IL)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 스피어만 상관관계(Spearman's correlation) 및 만-위트니 검정(Mann­Whitney test)을 사용하여 단백질 발현과 BLBC 서브세트(subset) 사이의 상관관계를 분석하였다. 실험 데이터에 대하여 스튜던트 t 테스트(Student's t test)를 수행하였다. P 값 < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 고려되었다.
실시예 2 PD -L1 단백질 발현 분석
PD-L1의 근본적인 메커니즘을 설명하기 위해, PD-L1의 단백질 발현을 인간 종양 조직 및 암 세포주에서 시험하였다. 도 1a 및 1b 및 도 3a-3d는 웨스턴 블롯 분석에 의해 폐, 유방, 결장 및 난소암 세포주에서의 단백질 발현을 도시하며; 도 4a는 상이한 PD-L1 항체에 의한 세포에서 PD-L1 단백질의 결합을 나타낸다. 대부분의 PD-L1 단백질이 ~45 kDa(흑색 원)에서 검출되었지만, 작은 분획 또한 33 kDa(흑색 원)에서 나타났다는 점이 관찰되었다. 코딩 서열(shPD-L1#1) 또는 3'UTR(shPD-L1#5)을 표적화하는 렌티바이러스 짧은-헤어핀(short-hairpin) RNA(shRNA)에 의한 PD-L1 녹다운은 PD-L1의 33- 및 45-kDa 형태 둘 다의 발현을 하향조절하였다(도 4b). PD-L1의 재구성은 shPD-L1#5 클론으로 양측 형태의 발현을 회복시켰다(도 1c; 도 4c는 벡터 설계를 나타냄). 이들 결과는 웨스턴 블롯 상의 양측 밴드가 PD-L1 단백질이고 PD-L1의 높은 분자량 형태는 번역후 변형을 나타낸다는 것을 나타낸다.
PD-L1의 높은 분자량(~45 kDa)에 대해 관찰된 바와 같이, 글리코실화된 단백질은 웨스턴 블롯에서 비균질 패턴을 자주 생성한다. PD-L1에 대하여 관찰된 글리코실화 패턴이 글리코실화된 형태에 대해 상응하는지 여부를 시험하기 위해, MDA-MB 231 및 HeLa 세포를 재조합 글리코시다아제(펩티드-N-글리코시다아제 F; PNGase F)로 처치하여 N-글리칸 구조체를 제거한 다음에, 웨스턴 블롯 분석을 거쳤다. 도 4d에 나타낸 바와 같이, 45-kDa PD-L1의 상당한 부분이 PNGase F 처치시 PD-L1의 33-kDa로 감소되었다. 일관되게, 글리칸 구조체의 양성 염색은 정제된 His-태그된 PD-L1에서 관찰되었으나, PNGase F의 존재 하에서는 그렇지 않았다(도 1d). 이들 결과는 높은 분자량은 PD-L1이 PD-L1 단백질의 실제 글리코실화된 형태라는 점을 입증한다.
세포에서 PD-L1 단백질의 발현을 재현하기 위해, 다양한 과잉발현 구축물을 생성하여, 단백질의 내인성 발현을 모방하였다. N-말단 시그널링 펩티드에서 가능한 분열을 회피하기 위해, 상이한 태그 서열을 N 또는 C-말단에 접합시켰다(도 5a 및 5b, 상기 블롯). 내인성 PD-L1 발현 분석으로부터의 결과와 유사하게, 모든 GFP-, HA-, Flag- 또는 Myc- 태그된 PD-L1의 일시적 형질감염은 웨스턴 블롯 상에서 이의 실제 크기로부터 ~15 kDa 분자량 변화를 가졌다(도 1e 및 5a 및 5b). PD-L1 단백질 상의 모든 N-글리칸 구조체를 제거하는 PNGase F 처치와 반대로, 재조합 글리코시다아제, 엔도글리코시다아제 H(Endo H)의 첨가는 PD-L1 글리코실화를 부분적으로만 감소시키며, 이는 N-연결된 글리칸 구조체의 복합 유형(높은 만노오스 및 하이브리드 유형을 함유함)이 PD-L1 상에 주로 존재한다는 것을 제시한다. 또한, PD-L1의 글리코실화는 세포를 N-연결된 글리코실화 억제제, 튜니카마이신(TM)으로 처치하였을 때 완전히 억제되지만(도 1f 및 5a-5d), O-글리코시다아제(도 5e)로는 그렇지 않았다. 이와 함께, 이들 결과는 PD-L1이 시험된 세포에서 광범위하게 N-연결 글리코실화된다는 것을 나타낸다(Heifetz, A., et al., 1979, Biochemistry, 18:2186-2192).
실시예 3 글리코실화 분석
2 개의 PD-L1-특이적 항체(항-PD-L1 및 항-hB7-H1)를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 PD-L1 글리코실화가 이의 세포외 도메인(ECD, 항-hB7-H1에 의해 인식됨) 상에서 발생하지만, 이의 세포내 도메인(ICD, 항-PD-L1에 의해 인식됨) 상에서는 그렇지 않음을 나타내었다(도 1f 및 5c). 글리코실화 부위를 정확히 나타내기 위해, 상이한 종으로부터의 PD-L1 아미노산 서열의 서열 정렬을 수행하여, 진화적으로 보존된 NXT 모티프, 콘센서스 N-글리코실화 인식 서열에 대해 검색하였다(Schwarz, F., et al., 2011, Current opinion in structural biology, 21:576-582). 초기 예측(Cheng et al., 2013, JBC, 288:11771-85; 및 Vigdorovich et al., 2013, Structure, 21:707-17)과 일치하여, 4 개의 NXT 모티프를 확인하였다(도 1g 및 도 6a 및 6b). 이들 서열이 실제로 글리코실화되었는지를 확인하기 위해, 정제된 인간 PD-L1의 트립신 펩티드를 나노 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. Endo H 처치에 대한 겉보기 내성(apparent resistance)과 일치하는(도 1e), 복합 유형 N-글리칸을 운반하는 글리코펩티드를 4 N-글리코실화 부위 각각에 대해 확인하였다(도 7a-7h). 아스파라긴(N)의 글루타민(Q)으로의 일련의 치환을 생성하여, PD-L1 단백질 상의 특이적 글리코실화 부위(들)를 결정하였다. 모든 4 개의 돌연변이 N35Q, N192Q, N200Q, 및 N219Q는 WT PD-L1과 비교하여 글리코실화의 특정 정도의 감소를 나타내었다(도 1h, 레인 2, 3, 4, 및 5). 글리코실화에서의 검출 가능한 차이가 3 개의 비-NXT NQ PD-L1 돌연변이에 대해 관찰되지 않았다(도 1h, 레인 11, 12, 및 13). 또한, PD-L1 글리코실화는 45 kDa의 글리코실화된 형태에 상응하는 신호의 부재에 의해 나타낸 바와 같이, 4 개의 아스파라긴 모두가 글루타민으로 돌연변이된 PD-L1 4NQ 변이체에서 완전히 제거되었다(도 1h, 레인 10(4NQ) 및 레인 14(WT)). PD-1/PD-L1 복합체의 결정 구조(Lin, D.Y., et al., 2008, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105:3011-3016)를 기본으로 하여, PD-L1의 이들 4 개의 글리코실화 부위(N35, N192, N200 및 N219)를 단백질의 표면 상에 노출시켰다. PD-L1 글리코실화 부위의 돌연변이(PD-L1 4NQ)는 예측을 기본을 하여 전체 구조에 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는 PD-L1이 N-글리코실화된 당단백질로서 배타적으로 존재하며, 4 개의 NXT 모티프 모두가 글리코실화된다는 것을 제시한다.
관찰된 글리코실화된 PD-L1의 수준은 PD-L1 단백질의 비글리코실화된 형태에 비해 상당히 높앗다(도 1a 및 1b 및 5c 및 5d). 이 조사결과를 기본으로 하여, 본 발명자들은 글리코실화가 PD-L1 단백질을 안정화시키는지 여부에 대해 조사하였다. 이를 위해, 단백질 대사회전율(turnover rate)을 단백질 합성 억제제인 사이클로 헥시미드(CHX)의 존재 하에 측정하여, PD-L1 단배질 안정성에 대한 글리코실화의 영향을 결정하였다. Flag-태그된 PD-L1의 대사회전율은 DMSO-처치된 HEK 293T 세포에서에 비해 튜니카마이신(TM)-처치된 HEK 293T 세포에서 더 신속하였다(도 2a; 8a 및 8b). A431 세포에서의 내인성 PD-L1에 대해 유사한 결과를 관찰하였다(도 8c). MG132에 의한 프로테아좀 억제 하에서, 비글리코실화된 PD-L1의 수준은 12 시간에 걸쳐 꾸준히 증가하였다(도 2b). 일관되게, 비글리코실화된 PD-L1 WT 의 것과 유사하게(도 2a), 비글리코실화된 PD-L1 4NQ는 4 시간만큼 짧은 반감기로 신속하게 분해되었으며(도 2c), 이는 손상된 글리코실화가 26S 프로테아좀을 통한 PD-L1의 분해를 야기한다는 것을 제시한다.
실시예 4 PD -L1의 결합 친화도
PD-L1은 암 진행 동안 PD-1과의 결합을 통한 핵심 면역 억제제이다(Okazaki, T., et al., 2013, Nature immunology, 14:1212-1218). 따라서, PD-1에 대한 WT PD-L1 및 글리코실화-결여된 돌연변이 PD-L1의 결합 친화도를 비교하였다. PD-L1 WT 및 4NQ 돌연변이 PD-L1을 MDA-MB-468 및 HEK-293T 세포에서 안정적으로 발현사키고, 유사한 양의 PD-L1 WT 및 4NQ 발현을 갖는 안정된 클론을 선택한 다음에, 재조합 PD-1/Fc 융합 단백질과 함께 항온처리한 후에, 신호 증폭을 위해 항-인간 IgG(Fc 특이적) 형광 콘쥬게이트를 첨가하였다(Cheng, X. et al., 2013, The Journal of biological chemistry, 288:11771-11785)(도 8d). 글리코실화된 PD-L1과 비글리코실화된 PD-L1 사이의 막 위치에서 상당한 변화가 없었던 반면에(도 8e(공초점 영상) 및 8f(비오티닐화 풀-다운)), TM을 이용하거나 이용하지 않고 처치된 안정된 형질감염체 사이의 세포막 상의 PD-1 결합에서 뚜렷한 차이가 관찰되었다(도 2d, 우측에 나타낸 정량화 그래프). 또한, TM 처치, 또는 4NQ 돌연변이의 발현에 의한 PD-L1 글리코실화의 삭제는 PD-L1과 PD-1의 결합을 감소시켰다(도 2e 및 도 8g). 시험관내 결합 실험은 또한 PD-L1 4NQ/PD-1/Fc 상호작용의 손실을 입증하였으며, 이는 PD-L1의 글리코실화가 PD-1과 이의 결합을 향상시킨다는 것을 제시하였다(도 2f). 면역억제 활성은 세포독성 T 세포를 포함하는 세포-세포 상호작용과 연관되기 때문에, 공동-배양 실험을 수행하여, PD-L1 안정 클론에 대한 노출 이후 저캇 T 세포에서 PD-L1과 PD-1 상호작용에 의해 억제되는 T 세포 면역 반응의 지표인 IL-2 발현 수준을 측정하였다 (Yang, W., et al., 2008, Investigative ophthalmology & visual science, 49:2518-2525)(도 8h). 일관되게, PD-L1 글리코실화의 손실은 PD-1과 이의 상호작용을 손상시켰으며, 가용성 IL-2의 방출을 향상시켰다(도 2g). 이들 결과는 PD-L1 글리코페노타입(PD-L1)의 강도가 이의 면역억제 기능을 위해 필요하다는 것을 드러낸다.
실시예 5 PD -L1 글리코페노타입의 기능성
PD-L1 WT 및 4NQ 돌연변이를 내인성 PD-L1-고갈된 MDA-MB-468 및 BT549 세포에서 안정적으로 발현시켰다. 이들 세포주를 사용하여, PD-1 및 PD-L1 결합 친화도를 분석하였다. 나타낸 바와 같이, 글리코실화된 변이체 PD-L1 4NQ와 PD-1 사이의 결합은 감소하였다(도 9a). 시험관내 결합 실험은 PD-L1과 PD-1 결합을 위해 글리코실화가 필요하다는 것을 추가로 입증하였다(도 9b). BT549 PD-L1 WT 및 PD-L1 4NQ 발현 안정 세포주와 인간 1 차 T 세포의 공동-배양에 의해 T 세포-매개된 종양 세포 사멸을 측정하였다(타임-랩스 현미경). PD-1 결합의 손실과 일치하여, PD-L1 4NQ 안정 세포주는 암 세포의 더욱 T 세포-매개된 사멸을 나타내었다(도 9c). 또한, PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 발현 4T1 세포를 투여받았던 BALB/c 마우스에서 종양 성장을 측정하는 동계 4T1 마우스 모델에서 PD-L1의 면역억제 기능을 생체내에서 측정하였다. PD-L1 WT를 발현하는 세포를 갖는 마우스와 비교하여, PD-L1 4NQ를 발현하는 세포를 갖는 마우스는 감소된 종양 크기 및 더욱 활성화된 세포독성 T 세포를 나타내었다(도 9d 및 9e). 이와 함께, 이들 데이터는 PD-L1 글리코실화가 PD-1과 이의 상호작용을 손상시키고, PD-1/PD-L1 상호작용의 능력을 손상시켜, 종양 세포가 T 세포에 의한 면역 감시를 회피하게 한다는 것을 입증한다. 따라서, PD-L1이 비글리코실화되거나 비정상적으로 글리코실화되는 종양 세포는 기능적 이펙터 T 세포에 의해 사멸되도록 처리할 수 있는 표적을 제공한다. 종양 세포가 이들의 막-발현된 PD-L1의 손상된 글리코실화에 의해 T 세포 면역 감시를 회피하는 것을 예방하거나 차단하는 이 메커니즘은 PD-L1 글리코페노타입의 강도가 이의 면역억제 기능을 위해 필요하다는 것을 추가로 확증한다.
또한, 상기와 같은 동계 4T1 BALB/c 마우스 모델을 사용하여 16 일 연구 기간 동안 동물에서 종양 성장에 대한 대표적인 이중 기능 항체, 소위 STM073의 효과(즉, 면역억제 기능)를 결정하였다. 간략하게는, 본 연구에서, 동물은 0 일차에 야생형(글리코실화된) PD-L1(1x105 4T1 세포)을 발현하는 4T1를 투여받았다. 그 후 3, 5, 7, 9, 11 및 13 일차에, 4T1-동물을 주사에 의해 STM073 MAb(100 ㎍) 또는 IgG 대조군 항체(100 ㎍)로 처치하였다. 처치 기간 동안, 동물에서 사망률 및 종양 부피를 평가하였다. 도 9f는 STM073("73") MAb로 처치된 마우스에서의 종양 부피가 대조군 동물에서의 종양 부피와 비교하여, 측정 가능하게 낮아졌음을 나타내는 상자 그래프를 나타낸다.
실시예 6 글리코실화된 PD-L1-결합 단클론 항체의 생성
표준화된 프로토콜에 따라, SP2/0 뮤린 골수종 세포와 인간 PD-L1-면역화된 BALB/c 마우스(n=6)(Antibody Solution, Inc.)로부터 단리된 비장 세포의 융합에 의해, 글리코실화된 인간 PD-L1에 대해 생성된 단클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 얻었다. 융합 전에, 면역화된 마우스로부터의 혈청은 FACS 분석을 이용하여 PD-L1 면역원에 대한 결합에 대하여 확인되었다. 단클론 항체(MAb)-생성 하이브리도마를 생성하였으며, 모든 MAb의 이소형은 IgG1이었다. 항체를 생성했던 하이브리도마를 특이성에 대해 다시 시험하였다.
비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1 항원에 특이적이고, 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1 항원에 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 MAb(즉, 글리코실화된 PD-L1 특이적 MAbs)를 확인하기 위해, 상이한 유형의 에세이를 수행하였다. 글리코실화된 PD-L1에 대한 MAb의 우선적 결합을 검출하기 위한 스크리닝 에세이에서, FACS 분석(막 결합된 단백질을 사용함)을 통해 형광 강도 측정을 기본으로 하여 항체 결합을 결정하였다. 예로서, 상기 에세이는 BT549 인간 유방암 세포주를 사용하여 수행하였다. 예시적으로, 종래 절차에 따라 PD-L1 WT(완전 글리코실화됨)를 과잉발현하는 BT549 세포를 비오틴으로 표지한 다음에, PD-L1 4NQ(완전 비글리코실화된 PD-L1 변이체)를 과잉발현하는 BT549 세포와 혼합하였다. 혼합된 세포를 항-PD-L1 항체, 예를 들어 항-glycPD-L1 항체와 함께 항온처리하고, 검출제로서 FITC와 콘쥬게이트된 2 차 항체와 함께 추가로 항온처리하였다. 세척 후에, FACS / 유세포분석을 통해 형광 강도(측정 형광 강도, MFI)를 측정하여, 막 결합된 PD-L1 WT(세포 상) 또는 4NQ PD-L1에 대한 항-PD-L1 항체의 상대적 결합을 평가하였다. 4NQ PD-L1에 비해 WT PD-L1에 대해 상당히 높은 MFI를 나타낸 항체를 추가 평가를 위해 선택하였다. STM073 및 STM108 이중 기능 MAb의 형광 결합 분석에 대한 결과를 하기 표 6에 나타내었며, 이는 변이체(비글리코실화된 4NQ) PD-L1을 발현하는 BT549 세포(BT549PD-L1 4NQ 세포)에 결합하는 항체와 비교하여 야생형(글리코실화된) PD-L1을 발현하는 BT549 세포(BT549PD-L1WT 세포)에 결합하는 항체에 대한 MFI 값을 나타낸다. 표 6의 실험 결과는 BT549PD-L1 4NQ 세포(비글리코실화된 PD-L1-발현 세포)와 비교하여 BT549PD-L1WT 세포(글리코실화된 PD-L1-발현 세포)에 대한 STM073 MAb 결합에 대하여 대략 5 배 높은 MFI 값을 나타낸다. 유사하게는 BT549PD-L1 4NQ 세포와 비교하여 BT549PD-L1WT 세포에 대한 STM108 결합에 대하여 대략 4 배 높은 MFI 값이 결정되었다.
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결합 분석을 기본으로 하여, 42 개의 후보 MAb-생성 하이브리도마를 선택하고, ADCF 배지에서 성장시켰으며, 단클론 항체를 함유한 이들의 상청액을 농축 및 정제하였다.
일부 경우에, 정제된 MAb를 생세포 영상화 에세이인 IncuCyteTM, (Essen Bioscience)를 사용하여 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용(PD-L1/PD-1 상호작용)을 중화하거나 억제하는 이들의 능력에 대해 추가로 시험하였다. 이 에세이를 위해, PD-L1을 발현하는 BT-549 세포를 항-인간 PD-L1 항체 및 형광-표지된 PD-1-Fc 융합 단백질과 함께 항온처리하였다. 리간드 및 수용체 결합을 IncuCyteTMZoom에 의해 매시간마다, 제조사의 지시에 따라 정량화하였다. 이 에세이를 기본으로 하여, 시험된 42 개의 MAb 중 15 개의 MAb가 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 완전히 차단하였음을 발견하였다. 강한 차단 효능을 나타낸 15 개의 MAb 중 일부는 또한 비글리코실화된 PD-L1에 어느정도 결합하였다.
다른 에세이에서, 글리코실화된 인간 PD-L1 단백질 및 비글리코실화된 PD-L1, 즉 PNGase F로 처치된 PD-L1 단백질 둘 다를 고상(solid phase)에 코팅하고, PD-L1 항원에 대한 MAb의 결합 친화도에 대해 시험하였다. "PD-L1 항원"은 "PD-L1 단백질"과 동의어임을 이해할 것이다. 12 개의 MAb가 비글리코실화된 PD-L1 단백질(PNGase F 처치된 단백질)과 비교하여 글리코실화된 PD-L1 단백질과 더 높은 친화도 상호작용을 나타내었다. 추가 특이성 분석을 위해, 선택된 MAb를 웨스턴 블롯 및 FACS 유세포분석에 의해 분석하였다. 다양한 분석으로부터, STM073 및 STM108과 같은 MAb가 PD-L1의 비글리코실화된 형태와 비교하여 PD-L1의 글리코실화된 형태에 특이적으로 결합하는 것이 발견되었으며, 이는 글리코실화된 PD-L1 항원에 대한 이들 MAb의 특이성을 추가로 입증하였다.
실시예 7 특이적 글리코실화된 PD-L1-결합 단클론 항체의 결합 영역의 확인
글리코실화된 PD-L1에 결합되는 단클론 항-glycPD-L1 항체의 영역을 확인하기 위해, 야생형(글리코실화된) PD-L1(PD-L1 WT) 및 글리코실화 변이체 단백질 N35/3NQ, N192/3NQ, N200/3NQ, 및 N219/3NQ(위치 35, 192, 200 또는 219의 글리코실화 부위 중 하나는 상기 위치에서 야생형 아스파라긴(N)이고, 나머지 3 개의 위치는 글루타민(Q)으로 돌연변이되어, 글리코실화되지 않음)(도 10a)를 PD-L1 녹다운 BT549 세포에서 과잉발현시켰다. 웨스턴 블롯에 의해 결정된 바와 같이, 일부 MAb는 다른 PD-L1 돌연변이와 비교하여 더 높은 수준의 결합을 갖는 특정 PD-L1 돌연변이를 인식하였으며, 이는 상기 MAb가 부위-특이적이라는 것을 입증하였다. 예를 들어, MAb STM073은 돌연변이 N35/3NQ, N192/3NQ 및 N200/3NQ에는 결합하였으나, 돌연변이 N219/3Q에는 결합하지 않았으며, 이는 이 항체가 PD-L1의 N35, N192 및 N200에는 결합하였지만, N219에는 그렇지 않았음을 입증하였다(도 10b). 또한, 간암 세포 용해액을 사용한 웨스턴 블롯 분석은 또한 대표적인 항-glycPD-L1 항체, 예컨대 STM073에 대한 상이한 패턴의 PD-L1 글리코실화를 밝혀내었다(도 10c).
이들 MAb의 병리조직학적 타당성을 면역조직화학(IHC) 염색에 의해 추가로 입증하였다. 사이토스핀 염색 분석에서, 항-glycPD-L1 단클론 항체는 PD-L1 단백질의 글리코실화된 부분을 지속적으로 인식하고 이에 결합하였으나, 비글리코실화된 PD-L1 단백질은 그렇지 않았다. 인간 삼중 음성 유방암 환자 샘플에서, 항-glycPD-L1 단클론 항체는 또한 1:30 비로 막 및 세포질 염색을 나타내었다. 이들 데이터는 항-glycPD-L1 단클론 항체가 글리코실화된 PD-L1의 검출을 위한 바이오마커 분석에서 바이오마커로서 사용될 수 있음을 입증하였다.
실시예 8 글리코실화된 PD-L1-결합 항체의 에피토프 맵핑 (mapping)
마우스 단클론 항-glycPD-L1 항체 STM073에 대한 에피토프 맵핑을 CovalX AG(Switzerland)에 의해 수행하였다. 항-glycPD PD-L1 항체, 특히 STM073 MAb에 의해 일반적으로 인식되는 에피토프의 특성, 예를 들어 선형 또는 입체구조를 결정하기 위해, 연구를 수행하여, PD-L1 항원 단백질과 항-PD-L1 항체 사이의 상호작용이 항원의 단백질분해에 의해 생성된 비정형 펩티드에 의해 억제될 수 있는지 여부를 평가하였다. PD-L1 항원의 완전 단백질분해에 의해 생성된 펩티드가 항체에 의한 항원의 결합을 억제할 수 있는 경우에, 상호작용은 입체구조를 기본으로 하지 않으며, 에피토프는 선형이다. 항원의 서열로부터 생성된 중첩 펩티드의 뱅크(bank)를 이용한 단순 경쟁 에세이는 에피토프의 서열을 결정하기에 충분히다. 대안적으로, PD-L1 항원의 완전 단백질분해에 의해 생성된 펩티드가 항체에 의한 항원의 결합을 억제할 수 없는 경우, 표적의 입체구조는 상호작용을 위해 필요한 것으로 결정되며, 에피토프는 입체구조, 예를 들어 연속적(루프와 같은 특별한 입체구조를 가짐) 또는 비연속적(3 차 구조에 기인함)이다. 입체구조 에피토프에 대한 결합을 추가로 설명하기 위해, 공유결합 표식, 펩티드 맵핑, 및 고해상도 질량분석법을 또한 사용하였다.
경쟁 에세이는 PD-L1 항원으로부터 생성된 펩티드가 PD-L1 항원에 대한 MAb STM073의 결합을 억제하지 않았음을 나타내었으며, 이는 STM073 MAb 에피토프가 선형이 아닌 입체구조라는 점을 입증하였다. 화학적 교차-결합, 고질량 MALDI 질량분석법 및 nLC-Orbitrap 질량분석법을 사용하여, PD-L1 단백질과 항체 사이의 상호작용 표면을 특성화하였다. PD-L1의 펩신 단백질분해, 생성된 펩신-생성된 PD-L1 펩티드와 항체 및 온전한 PD-L1 단백질의 혼합물을 사용하는 경쟁 에세이, 및 알려진 방법에 의한 항원/항체 상호작용의 분석은 PD-L1 펩티드에 의한 PD-L1 항원에 대한 STM073 단클론 항체 결합의 검출 가능한 억제를 나타내지 않았다. 따라서, 항-PD-L1 MAb STM073에 의해 인식된 PD-L1 상의 에피토프는 선형이 아닌 입체구조인 것으로 결정되었다. STM073의 에피토프는 V68로 시작하고 V128로 종결(파선으로서 표시된 위치 79 내지 107 내의 영역을 가짐)되는 서열 VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(서열번호 85)에서 밑줄친 아미노산 잔기 H69, Y112, R113 및 K124를 포함하는 것으로 결정되었다. STM108은 서열번호 1의 각각 아미노산 74 내지 84 및 158 내지 173인 서열 LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ 내의 에피토프에 결합하며, 서열번호 1의 잔기 74 내지 173 내의 서열번호 1의 잔기 S80, S81, K162 및 S169와 접촉한다는 것이 발견되었다.
실시예 9 T 세포 사멸 에세이
종양 세포에 대한 본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 단클론 항체의 세포독성 활성을 결정하기 위해 T 세포 사멸 에세이를 이용하였다. 따른 프로토콜은 다음과 같다: 0 일차에, 글리코실화된 야생형 PD-L1- (PD-L1 WT) 발현 BT549 RFP 표적 세포 배양액으로부터 혈청-함유 배지를 제거하고, PBS로 부드럽게 2 회 세정하였다. 세포를 수집하고 계수하였다. 세포 현탁액을 원심분리(1000 RPM, 4 분)하고, 세포 펠릿을 50,000 세포/mL로 배양 배지에서 재현탁하였다. 수동 멀티채널 피펫을 사용하여, 평평한 바닥 마이크로플레이트의 모든 웰에 세포를 접종(100 μL/웰, 즉 5000 세포/웰)하였다. 상기 플레이트를 주위 온도에서 30 분 동안 방치한 다음에, IncuCyte ZOOM® 생세포 영상기 내에 위치시켰으며, 이를 1 차 스캔이 예정되기 전에 20 분 동안 방치하여 평형화시켰다. 24 시간 반복 스캐닝(10x 대물렌즈)이 1 차 스캐닝 개시 직후 3 시간마다 예정되었다. 소망하는 콘플루언스(예를 들어, 20%)가 달성될 때까지 다음 18 시간 동안(밤새) 세포 콘플루언스를 모니터링하였다.
다음 아침, 에세이 당일(즉, 1 일차)에, IncuCyteTM 카스파아제 3/7 아폽토시스 녹색 형광 검출 시약(Essen BioScience 4440)의 10 μM 용액을 에세이 배지(4x 2.5 μM의 최종 에세이 농도)에서 제조하고, 항온처리기에서 37℃까지 승온하였다. 에세이 배지에서 4x 최종 에세이 농도의 항-CD3 항체(100 ng/mL) + IL-2(10 ng/mL) T 세포 활성제 치료제를 제조하고 37℃까지 승온하였다. 시험 MAb을 또한 제조하였다. 표적 세포 플레이트를 항온처리기에서 제거하고, 세포 층을 손상시키지 않도록 주의하면서, 배지를 흡입하였다. 멀티채널 피펫을 사용하여, 25 μL의 승온된 카스파아제 3/7 용액을 각각의 웰로 옮겼다. 그 후에, 25 μL의 승온된 항-CD3 항체 + IL-2, 및 항체를 세포 플레의트의 적절한 웰 내로 위치시켰다. 이펙터 세포(PBMC 또는 총 T 세포)를 함유한 추가의 50 μL의 배지를 첨가하여 100 μL의 총 에세이 부피를 형성하였다. 거품 제거된 세포 플레이트를 IncuCyte ZOOM® 기구 내에 위치시키고, 1 차 스캔 전에 20 분 동안 평형화시켰다. 24 시간 반복 스캐닝이 최대 5 일 동안 2-3 시간마다 예정되었다. (대물렌즈 10x; 용기 유형: Corning 3596; 스캔 방식: 표준; 스캔 패턴: 웰 당 2 개 영상; 채널: 위상 + "녹색"(NucLightTM Red 표적 세포가 사용된 경우, + "적색").
분석을 위해, 시간에 걸쳐 시야에서 "큰" 녹색-형광 물체(핵)의 총 수를 계수함으로써, IncuCyteTM 소프트웨어로 표적-세포 아폽토시스를 정량화하였다. 적색 세포 핵의 수에 상응하는 적색 물체 수로부터 표적 세포의 증식을 측정하였다. 데이터를 mm2 당 형광 물체의 수로서 나타내었다. 데이터는 본원에 기재된 바와 같은 항체, 특히 STM073의 첨가가 종양 세포 사멸을 향상시켰다는 것을 나타내었다(도 11).
실시예 10 결합 에세이
본원에 기재된 바와 같은 항-glycPD-L1 단클론 항체가 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 특이적으로 억제하는지 여부를 결정하기 위해, 다음 결합 에세이를 수행하였다. 에세이 0 일차에, PD-L1-발현 BT549 표적 세포 배양액으로부터 혈청-함유 배지를 제거하고, D-PBS로 부드럽게 2 회 세정(rinse)하였다. 세포를 수집하고 계수하였다. 세포 현탁액을 원심분리(1000 RPM, 5 분)하고, 세포 펠릿을 50,000 세포/mL로 배양 배지에서 재현탁하였다. 수동 멀티채널 피펫을 사용하여, 평평한 바닥 마이크로플레이트의 모든 웰에 세포를 접종(100 μL/웰, 즉 5000 세포/웰)하였다. 상기 플레이트를 주위 온도에서 30 분 동안 방치하였다. 그 후에, 세포를 함유한 상기 플레이트를 5% CO2 항온처리기에서 밤새 항온처리하였다.
에세이 1 일차(즉, 다음 아침)에, 1 ㎍/mL PD-1/Fc 및 1:400 희석액의 Alex Fluor 488-염소 항-인간 IgG를 함유한 배양 배지를 제조하고, 항온처리기에서 37℃까지 승온하였다. 세포 플레이트를 항온처리기에서 제거하고, 세포 층을 손상시키지 않도록 주의하면서, 배지를 흡입하였다. 50 μL의 시험 항체를 각각의 웰에 용량-의존 방식으로 첨가하였다. PD-1/Fc 및 Alex Fluor 488-염소 항-인간 IgG를 함유한 50 μL의 배양 배지를 모든 웰에 첨가하였다. 세포 플레이트를 IncuCyte ZOOM® 기구 내에 위치시키고, 1 차 스캔 전에 20 분 동안 평형화시켰다. 24 시간 자동 반복 스캐닝(10x)이 최대 24 시간 동안 1-2 시간마다 예정되었다. 대물렌즈: 10x; 용기 유형: Corning 3596; 스캔 방식: 표준; 스캔 패턴: 웰 당 4 개 영상; 채널: 위상(Phase) + "녹색".
도 12a 및 12b는 대표적인 MAb STM073 및 STM108이 PD-L1을 발현하는 세포에 대한 PD-1/Fc의 결합을 용량 의존 방식으로 억제하였음을 나타낸다. 대조군 에세이 결과를 도 12c에 나타낸다.
실시예 11 PD -L1 내부화 에세이
항-glycPD-L1 단클론 항체가 PD-L1 내부화 및 분해를 촉진하는지 여부를 결정하기 위해, A431 세포를 무혈청 배지에서 밤새 항온처리한 다음에, 10 ㎍의 항-glycPD-L1 항체와 함께 2 일 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 수집하고, 세포 내의 PD-L1을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 도 13은 STM073을 이용한 항온처리가 대조군(IgG)과 비교하여 세포에서 PD-L1의 수준 감소를 나타내었다는 것을 나타낸다.
pHrodoTM Red 마이크로스케일 표지 키트(ThermoFischer Scientific, Rochester, NY)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 pHrodoTM Red 염료로 항체를 표지함으로써 STM073 및 STM108 MAb의 세포 내부화를 시각화하였다. 간략하게는, 분석을 위해, 세포를 0 시에 접종하고; 접종 24 시간 후에, 세포를 표지된 STM073 또는 STM108 MAb(5 ㎍/mL)와 함께 항온처리하였다. 1 시간 후에, IncuCyte ZOOM® 기구를 사용하여 1 시간마다 예정된 24 시간 반복 스캐닝(10x)으로 세포의 영상 스캔을 시작하였다. 대물렌즈: 10x; 용기 유형: Corning 356407; 스캔 방식: 표준; 스캔 패턴; 웰 당 3 개 영상; 채널: 위상 + "적색". 도 14a: STM073과 함께 배양된 야생형 BT 549 세포(인간 유관암, 유방암 세포주); 도 14b: STM073과 함께 배양된 PD-L1 WT(글리코실화됨)을 과잉발현하는 BT 549 세포; 도 14c: STM073과 함께 배양된 NCI-H226 세포(인간 폐암 세포주, 편평세포 중피종); 도 14d: STM073과 함께 배양된 MCF-7 세포(인간 유방암 세포주, 선암); 및 도 14e: STM108과 함께 배양된 PD-L1 WT(글리코실화됨)를 과잉발현하는 BT 549 세포.
실시예 12 항 - glycPD -L1 항체에 의한 PD-L1의 결합은 PD-L1 내부화 및 분해를 촉진한다
도 15a-15c는 BT549-PD-L1 세포 상에 발현된 PD-L1에 대한 항-glycPD-L1 MAb STM108의 결합 후에 생세포 영상화 분석을 통한 PD-L1 내부화 및 분해의 예를 제공한다. 도 15a-15c에서, 항-PD-L1 항체는 실시예 11에서 상기 기재된 바와 같이 pHrodoTM Red 마이크로스케일 표지 키트(ThermoFisher Scientific, Rochester, NY)를 사용하여 적색 형광 염료인 pHrodoTM Red(석신이미딜 에스터(pHrodoTM Red, SE)에 콘쥬게이트 된 STM108이다. 녹색 염색은 생세포 영상화를 통해 영상화된 생세포에서 산성 구획(리소좀)을 염색시키는 세포 침투성 녹색 염료인 LysoTracker® Green DND-26으로 염색된 세포를 나타낸다. 도 15a는 제1 시점(0 시)에, 화살표로 나타낸 세포의 강한 적색 세포내 염색에 의해 관찰된 바와 같이 STM108 항체가 세포 내로 내부화된다는 것을 나타낸다. 도 15b는 도 15a의 0 시의 2 분 후 시점에 도 15a에 도시된 동일한 세포에서 약화된 세포내 적색 염색을 나타낸다. 도 15c는 도 15a의 0 시의 4 분 후에 적색 세포내 염색의 결여를 나타내며, 이는 세포 내부의 STM108 항체 및/또는 항체-항원 복합체의 분해를 나타낸다. 이들 영상은 항-glycPD-L1 항체, 예컨대 STM108 MAb가 세포 표면 상에 발현된 PD-L1에 대한 결합 후에 PD-L1의 내부화 및 분해를 유발하였다는 것을 나타낸다.
실시예 13 T 세포에 비교하여 종양 세포에서 항- glycPD -L1 항체에 의해 결합된 PD-L1의 내부화
항-glycPD-L1 항체를 활성화되거나 비활성화된 T 세포와 비교하여, 세포-표면 발현된 PD-L1 결합 후에 PD-L1 양성 종양 세포 내로 내부화하는 능력에 대해 시험하였다. 항-glycPD-L1 항체 STM004, STM073 및 STM108, 및 대조군으로서의 마우스 IgG를 PD-L1을 발현하는 말초 혈액으로부터의 비활성화된 총 T 세포, 말초 혈액으로부터의 활성화된 총 T 세포 및 NCI-H226 세포와 함께 항온처리하였다. T 세포 활성화를 위해, 총 T 세포를 비드, 예를 들어 항-CD3 및 항-CD28 항체(예를 들어, ThermoFisher Scientific, Rochester, NY)와 1:1 비로 공유 결합된 불활성 초상자성 비드와 혼합하여, 항원-제시 세포에 의한 자극(예를 들어, A. Trickett et al., 2003, J. Immunol . Methods, 275, Issues 1-2:251-255 참고)을 모방한 방식으로 T 세포를 자극하였다. 모든 항체를 pHrodoTM Red로 표지하고, 내부화를 실시예 11에서 상기 기재된 바와 같이 시각화하였다. 도 16a-16d 및 도 16e-16h는 시험된 어떠한 항체도 비활성화된 총 T 세포 또는 활성화된 총 T 세포 내로 내부화되지 않았음을 나타낸다. 도 16i-16l은 적색 세포내 염색을 나타내지 않는 표지된 대조군 항체인 mIgG(도 16i) 및 표지된 비-내부화 STM004 MAb(도 16j)와 비교하여, 적색 세포내 염색에 의해 입증된 바와 같이, 이중 기능 내부화 STM073 및 STM108 MAb가 이들 세포를 이용한 항온처리 후에 NCI-H226 세포 내로 내부화되었음을 나타낸다. 이 실시예는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체가 PD-L1-발현 종양 세포 내로 선택적으로 내부화되지만, 활성화되거나 비활성화된 T 세포 내로 내부화되지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 14 종양 세포 사멸 및 종양 부피의 감소에서 PD-L1 ADC의 효능
종양 사멸 및 종양 부피 감소에서 세포독성 MMAE에 결합된 항-인간 glycPD-L1 MAb, 즉 STM108 MAb를 포함하는 ADC의 효능을 평가하기 위해 시험관내 및 생체내 실험 둘 다를 수행하였다. STM108-ADC는 PD-L1-발현 종양 또는 암 세포에 대한 MMAE 세포독성 페이로드의 특이적 전달을 위해, 상기 본원에 기재된 바와 같이 시스테인을 통해 MC-vc-PAB-MMAE에 화학적으로 연결된 STM108 MAb를 포함한다. STM108-ADC(STM108-MC-vc-PAB-MMAE)의 측정된 물리적 특성은 다음과 같다:
Figure pct00015
이 실시예와 관련하여, 도 17a-17d는 대조군(IgG 및 STM108 MAb 단독)과 비교하여 종양-이식된 마우스에서 PD-L1-발현 및 비-PD-L1-발현 종양 세포 사멸 및 종양의 부피 감소에서 STM108-ADC의 효능을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 나타낸다. 도 17a는 상이한 농도의 STM108-ADC, 즉 "ADC108"에 노출된 후에 PD-L1의 MB231의 발현을 녹아웃시키도록 분자 조작된 MB231 세포("MB231 PDL1 KO")의 % 생존도(채워진 흑색 사각형)와 비교하여, 상이한 농도(nM)의 STM108-ADC에 노출된 후에 PD-L1-발현 MDA-MB231(인간 유방암종 세포주) 종양 세포("MB231")의 % 생존도(채워진 흑색 원)를 나타낸다. 관찰된 바와 같이, 표면 상에 PD-L1을 발현하지 않은 MB231 세포의 생존도는 최고 농도의 STM108-ADC에 의해 상당한 영향을 받지 않은 반면에, PD-L1-발현 MB231 세포의 생존도는, 특히 1 nM 내지 100 nM의 STM108-ADC 농도에서 상당히 감소되었다. 도 17b에서, MB231 세포로부터 유래된 종양이 이식된 동물을 IgG-MMAE 대조군(100 ㎍); 50 ㎍, 100 ㎍, 또는 150 ㎍의 STM108 ADC; 또는 STM108 MAb 단독(100 ㎍)으로 처치한 유방암의 MDA-MB231 마우스 모델을 사용하였다. 상기 결과는 IgG-MMAE 대조군으로 처치된 동물과 비교하여, 모든 농도 수준의 STM108-ADC뿐 아니라, 일부 정도의 STM108 MAb (100 ㎍)로 처치된 종양-보유 동물에서 종양 부피가 효과적으로 감소되었음을 입증하였다. 또한, 놀랍게도 약 18 일 차에 STM108-ADC(100 ㎍)로 처치된 5 마리 동물 중 3 마리(3/5) 및 STM108-ADC(150 ㎍)로 처치된 5 마리 동물 중 4 마리(4/5)에서 완전 완화(complete remission)("CR")가 발생한 것으로 밝혀졌다.
도 17c는 상이한 농도의 STM108-ADC, 즉 "ADC108"에 노출된 후에 PD-L1을 자연적으로 발현하지 않는 4T1 세포("4T1")의 % 생존도(채워지지 않은 적색 사각형)와 비교하여, 상이한 농도(nM)의 STM108-ADC에 노출된 후에 세포 표면 상에 인간 PD-L1을 발현하도록 분자 조작된 4T1 유방 암종 세포("4T1 hPDL1")의 % 생존도(채워지지 않은 적색 원)를 나타낸다. 관찰된 바와 같이, 표면 상에 PD-L1을 발현하지 않는 4T1 세포의 생존도는 최고 농도의 STM108-ADC에 의해 상당한 영향을 받지 않은 반면에, PD-L1-발현 4T1 세포의 생존도는 10 nM 내지 100 nM을 초과하는 STM108-ADC 농도에서 감소되었다.
동물(Balb/c 마우스)이 PD-L1 또는 세포 표면을 발현하도록 분자 조작된 4T1 유방 암종 세포로부터 유래된 종양을 이식받거나("4T1 hPD-L1"), Balb/c 마우스가 세포 표면 상에 PD-L1을 자연적으로 발현하지 않는 비형질감염된 4T1 유방 암종 세포로부터 유래된 종양을 이식받은("4T1") 유방암의 4T1 동계 마우스 모델을 사용하였다. BALB/c 마우스(6- 내지 8-주령 암컷; Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA)에 관한 모든 절차는 MD Anderson의 실험 동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 지침 하에서 수행하였다. 마우스를 평균 종양 부피에 따라 각각의 그룹으로 나누었다. 4T1 세포(25 μL의 매트릭스겔 베이스먼트 멤브레인 매트릭스(Matrixgel Basement Membrane Matrix)[BD Biosciences, San Jose, CA, USA]와 혼합된 25 μL의 배지 중 1 x 105 세포)를 유방 지방체(mammary fat pad) 내로 주사하였다. 마우스의 종양 세포 접종 3, 5, 7, 9, 11, 및 13 일 후에 IgG-MMAE 대조군(100 ㎍), STM108 MAb(100 ㎍), 또는 STM108-ADC(150 ㎍)를 복강내로 주사하였다. 종양을 3 일마다 캘리퍼로 측정하고, 다음 식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다: π/6 x 길이 x 폭2.
도 17d에서 관찰된 바와 같이, 세포-표면 PD-L1 발현을 거의 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는 4T1-유래 종양을 보유하는 동물(채워지지 않은 원/점선)에서는, 종양 부피가 모든 처치 유형, 즉 IgG-MMAE 대조군, STM108 MAb, 또는 STM108-ADC에 대해 시간에 걸쳐 증가하는 결과가 나타났다. PD-L1-발현 4T1 세포로부터 유래된 종양을 보유하고 IgG-MMAE 대조군으로 처치된 동물에서, 처치된 종물의 종양 부피가 또한 시간에 걸쳐 증가하였다(순흑색 원). 반대로, PD-L1-발현 4T1 세포로부터 유래된 종양을 보유하고 STM108 MAb(순청색 원) 또는 STM108-ADC(순적색 원)로 치료된 동물에서는, 종양 부피가 효과적으로 감소하였다. 또한, 놀랍게도 약 21 일 차에 STM108-ADC로 처치된 7 마리 동물 중 5 마리(5/7)에서 완전 완화("CR")가 발생한 것으로 밝혀졌다.
암, 예를 들어 2 개 유형의 유방암을 치료시, 상기 본원에 기재된 항-glycPD-L1 MAb, 예컨대 STM108을 포함하는 ADC의 사용과 관련된 유익하고 효과적인 항신생물 및 치료 양태는 처치 후 25 일 이내에, 예를 들어 약 15-23일에 항-glycPD-L1 MAb ADC로 처치된 동물에서 종양 부피의 상당한 감소 및 종양의 완전 완화를 나타내는 생체내 결과에 의해 강조된다.
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 발명의 측면에서 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 조성물 및 방법은 실시양태 및 바람직한 실시양태의 측면에서 기재된 한편, 다양한 변형이 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 기재된 것의 개념, 의의 및 범위를 벗어나지 않으면서, 상기 방법에 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명확할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적 및 생리학적 둘 다로 관련된 특정 약제는 본원에 기재된 약제로 치환될 수 있는 반면에, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 것이라는 점은 명확할 것이다. 당업자에게 명확한 모든 상기 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 기재된 실시양태의 의의, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 여겨진다.
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원, 및 다른 간행물은 본 출원에서 참고로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> STCUBE, INC. BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> DUAL FUNCTION ANTIBODIES SPECIFIC TO GLYCOSYLATED PD-L1 AND METHODS OF USE THEREOF <130> 24258.105007 <140> <141> <150> 62/361,312 <151> 2016-07-12 <150> 62/314,652 <151> 2016-03-29 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 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<210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 caagtgcaga ttttcagctt cctgctaatc agtgcctcag tcatactgtc cagaggacaa 60 actgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120 acctgcagtg ccagctcaag tgtagattac atgtactggt accagcagaa gccaggatcc 180 tcccccagac tcctgattta tgacacatcc aacctggctt ctggagtccc tgttcgcttc 240 agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat 300 gctgccactt attactgcca gcagtggagt agttccccac ccatcacgtt cggtactggg 360 accaaggtgg agctgaaa 378 <210> 27 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 35 40 45 Asp Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu 50 55 60 Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met 85 90 95 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser 100 105 110 Pro Pro Ile Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asp Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asp Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 tcaattgtca tattgctac 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 ttgactccat ctttcttca 19 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 gtggtagagt atggtagcca aatgacaatt gaatgcaaa 39 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 tttgcattca attgtcattt ggctaccata ctctaccac 39 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 gagaggagaa gcttttccag gtgaccagca cactgag 37 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 ctcagtgtgc tggtcacctg gaaaagcttc tcctctc 37 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 gaccagcaca ctgagaatcc agacaacaac taatgagat 39 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 atctcattag ttgttgtctg gattctcagt gtgctggtc 39 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 gagagaggag aagcttttcc aagtgaccag cacactgaga 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 tctcagtgtg ctggtcactt ggaaaagctt ctcctctctc 40 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 gcataacgaa cctaaccctc ag 22 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 gcccaatgtc cactgtgata 20 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 gtaacctcag tcacctgcc 19 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 attccgctcc acaatctctg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 tcttcaacct cacgctcaag 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 gtgtgcaaag acgtcatcat c 21 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 caccatcacc ctcctttcta ttc 23 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 gaacaacagg tctgggattt ct 22 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 gccttttgcc atcgacatg 19 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 agtcagattc ttgcatccct g 21 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 caaggagagc attaggacca ag 22 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 ccccattaaa cctcaggact g 21 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 tcgtcatggt gtggtattcc 20 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 caggaagatg ggctgatcc 19 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 gaccgcactc atcttacacc 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 ggaggttggc tgaaggaata c 21 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 tcccctgctt taaccatcg 19 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 ttgtcaccta tactggcgtt g 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 ctgagtgatg gaacgagtga g 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 tagagatgac cagatgcaac g 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 gagtccaact tcacggctta t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 agtggtccag gaagacatag a 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 tgtgagggaa agatcaagtg g 21 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 gctctccaag gtaaatgagg ac 22 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 ccactgagtt cgtcaagagg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 acttccttgc catctgtcac 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 tggctcgctg ataagttctg 20 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 gtgagtctgg tttgggagaa g 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 gcaaagacct gtacgccaac a 21 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 tgcatcctgt cggcaatg 18 <210> 74 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ile, Met or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Asp or Asn <400> 74 Ala Phe Thr Ile Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Xaa Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Xaa 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val Asn Gly 50 <210> 75 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val His Gly 50 <210> 76 <211> 53 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu Asp 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile 35 40 45 Gln Phe Val Ala Gly 50 <210> 77 <211> 53 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 77 Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Gln Lys Leu Asp 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Lys Glu Val Ile 35 40 45 Gln Phe Val Glu Gly 50 <210> 78 <211> 53 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 78 Ala Phe Thr Ile Thr Val Ser Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Arg Phe Pro Val Asp Lys Gln Leu Asn 20 25 30 Leu Leu Val Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val Asn Gly 50 <210> 79 <211> 53 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 79 Ala Phe Thr Ile Thr Val Pro Lys Asp Met Tyr Glu Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Arg Phe Pro Val Asp Lys Gln Leu Asn 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Lys Asp Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val Asn Gly 50 <210> 80 <211> 53 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 80 Ala Phe Thr Ile Thr Val Thr Lys Asp Leu Tyr Val Val Asp Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Glu Pro Leu Asn 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asn Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val Asn Gly 50 <210> 81 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys 1 5 10 15 Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln 20 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile 1 5 10 <210> 83 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg 1 5 10 15 <210> 84 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro 1 5 10 15 Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr 20 25 <210> 85 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln 1 5 10 15 Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu 20 25 30 Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met 35 40 45 Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 50 55 60 <210> 86 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Arg Ile Thr Val 20 <210> 87 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 87 atgaacttgt ggctcagctt ggttttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggagcctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtaac tctgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtgctg gtagttatac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccttgtatt actgtacaag acattatgat 360 tactactttg actactgggg ccaaggcgcc actctcacag tctcctca 408 <210> 88 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Met Asn Leu Trp Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Ser Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg His Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Ala Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 89 <211> 385 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 89 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt catactgtcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcaccttga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcattggta ccagcagaag 180 ccaggatcct cccccagact cgtgatttat gacacatcca acctggcttc tggagtccct 240 gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacagtcag ccgaatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagtg atcacccgct cacgttcggt 360 gctgggacca agctggagct gaaac 385 <210> 90 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 Pro Arg Leu Val Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val 85 90 95 Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Asp His Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 91 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 91 atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtccttattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgatgctgg tggagtctgg gggagcctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagctt ctggattcag tttgagtaac tatgtcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtaggtatat ctactataca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agggacaatg ccaggaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt attgtgcaag agacggtagt 360 accttgtact actttgacta ttggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414 <210> 92 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Ser Asn Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 93 His His His His His His 1 5 <210> 94 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ile or Val <220> <221> MOD_RES <222> (44)..(44) <223> Leu, Ala, Val or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> Ala, Thr, Pro, Leu, Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> His, Arg, Asp or Val <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> Pro or Ala <400> 94 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Xaa Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly Pro Glu Glu Asn 20 25 30 His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu Pro Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 35 40 45 Asn Lys Arg Thr His 50 <210> 95 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr 1 5 10 15 Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn 20 25 30 His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro 35 40 45 Asn Glu Arg Thr His 50 <210> 96 <211> 53 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 96 Gly Met Leu Leu Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Asn Asp Val Phe Tyr Cys Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn 20 25 30 His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro 35 40 45 Gln Asn Arg Thr His 50 <210> 97 <211> 53 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 97 Glu Lys Leu Leu Asn Val Thr Ser Val Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Asn Asp Val Phe His Cys Thr Phe Trp Arg Val His Ser Gly Glu Asn 20 25 30 His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro Glu Leu Pro Val Pro Arg Leu Pro 35 40 45 His Asn Arg Thr His 50 <210> 98 <211> 52 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 98 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala 1 5 10 15 Asp Lys Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly His Glu Glu Asn 20 25 30 Asn Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Pro Ala Lys 35 40 45 Lys Arg Asn His 50 <210> 99 <211> 52 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 99 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Val Asn Ala Thr Thr 1 5 10 15 Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly Pro Glu Glu Asn 20 25 30 Ser Thr Ala Val Leu Val Ile Pro Glu Pro Tyr Val Asp Pro Ala Arg 35 40 45 Lys Arg Thr His 50 <210> 100 <211> 52 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 100 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Ser Gly Leu Glu Glu Asn 20 25 30 Ser Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Pro Leu Ile Val Pro Ala Asn 35 40 45 Lys Arg Thr His 50

Claims (67)

  1. 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 선택적으로 결합하고, PD-L1에 대한 글리코실화된 PD-L1의 결합을 억제하며, 종양 세포 상의 PD-L1의 내부화 및 분해를 촉진하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    재조합적으로 조작되거나, 키메라이거나, 인간화된 단리된 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    비글리코실화된 PD-L1에 대한 항체 결합에 의해 나타나는 Kd의 2분의 1 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합하는 단리된 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    비글리코실화된 PD-L1에 대한 항체 결합에 의해 나타나는 Kd에 비해 적어도 10 배 작은 Kd로 글리코실화된 PD-L1에 결합하는 단리된 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    5-20 nM의 친화도로 글리코실화된 PD-L1에 결합하는 단리된 항체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 표지에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 항체가 유세포분석 에세이에서 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 대한 항체 결합에 의해 나타나는 측정 형광 강도(measured fluorescence intensity)(MFI) 값에 비해 2 배 내지 10 배 큰 MFI로 글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 우선적으로 결합하는 단리된 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    항체가 비글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 대한 항체 결합에 의해 나타나는 MFI 값에 비해 3 배 내지 5 배 큰 MFI로 글리코실화된 PD-L1을 발현하는 세포에 우선적으로 결합하는 단리된 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 H69, S80, Y81, Y112, R113, K162, K124 및 S169 중 적어도 하나를 포함하는 글리코실화된 PD-L1의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    에피토프가 서열번호 1의 영역 V68 내지 V128 이내 또는 영역 L74 내지 Q173 이내의 아미노산을 포함하는 단리된 항체.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 Y112, R113 및 S117 중 적어도 하나를 포함하는 글리코실화된 PD-L1의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  11. 제10항에 있어서,
    에피토프가 서열번호 1의 영역 D108 내지 V128 이내의 아미노산을 포함하는 단리된 항체.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    단클론 항체(MAb) STM073 또는 MAb STM108에 의해 인식된 PD-L1의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    글리코실화된 PD-L1에 대한 특이적 결합에 대해 MAb STM073 또는 MAb STM108과 경쟁하거나 교차 경쟁하는 단리된 항체.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    MAb STM073 또는 MAb STM108의 중쇄 가변(VH) 도메인 또는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 단리된 항체.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    MAb STM073 또는 MAb STM108로부터의 중쇄 CDR1-3 및/또는 경쇄 CDR1-3을 포함하는 단리된 항체.
  16. 제15항에 있어서,
    인간 항체 프레임워크 영역을 갖는 단리된 항체.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체.
  18. 제1항 내지 제7항 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    VL 도메인이 서열번호 11 또는 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체.
  19. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    VH 도메인이 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고 VL 도메인이 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    VH 도메인이 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖고 VL 도메인이 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 불변 도메인을 포함하는 단리된 항체.
  22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR H1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR H2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR H3을 포함하는 VH 도메인, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR H1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR H2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR H3을 포함하는 VH 도메인을 갖는 단리된 항체.
  23. 제1항 내지 제7항 또는 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR L1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR L2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR L3를 포함하는 VL 도메인을 갖는 단리된 항체.
  24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR H1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR H2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR H3을 포함하는 VH 도메인, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR H1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR H2, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR H3을 포함하는 VH 도메인을 갖는 단리된 항체.
  25. 제1항 내지 제7항 또는 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR L1, 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 CDR L2, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR L3를 포함하는 VL 도메인을 갖는 단리된 항체.
  26. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 2 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VH 도메인 및/또는 서열번호 19 또는 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VL 도메인을 포함하는 단리된 항체.
  27. 제26항에 있어서,
    VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각각 서열번호 2 또는 18, 또는 서열번호 10 또는 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 단리된 항체.
  28. 제27항에 있어서,
    VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각각 서열번호 2 또는 18, 또는 서열번호 10 또는 26의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 단리된 항체.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체 프레임워크 영역을 갖는 단리된 항체.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체 불변 도메인을 갖는 단리된 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 IgG, IgM, IgA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편인 단리된 항체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 Fab', F(ab')2, F(ab')3, 1가 scFv, 2가 scFv, 비파라토프(biparatopic), 또는 단일 도메인 항체인 단리된 항체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 또는 비파라토프 항체인 단리된 항체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 이미징제, 화학치료제, 세포독성제, 항신생물제, 또는 방사성핵종에 콘쥬게이트되는 단리된 항체.
  35. 서열번호 2 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  36. 서열번호 10 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  37. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항체의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  38. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항체를 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 비히클 내에 포함하는 조성물.
  39. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 유효량을 PD-L1 양성 암을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 PD-L1 양성 암을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    PD-L1 양성 암이 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암, 피부암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암인 방법.
  41. 제39항에 있어서,
    PD-L1 양성 암이 혈액암인 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 항체와 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 선택적으로 결합하는 제2 단리된 항체를 조합하여 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 약학적으로 허용 가능한 조성물로 투여되는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    항체가 전신으로, 정맥내로, 피내로, 종양내로, 근육내로, 복강내로, 피하로 또는 국소로 투여되는 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 항체와 적어도 제2 항암 요법을 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    제2 항암 요법이 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 냉동요법, 호르몬 요법, 면역요법 또는 사이토카인 요법인 방법.
  47. 제34항에 있어서,
    항체가 항신생물제에 콘쥬게이트되어 항체-약물 콘쥬게이트(antibody-drug conjugate)(ADC)를 생성하는 단리된 항체.
  48. 제47항에 있어서,
    항신생물제가 튜불린 중합반응을 억제하는 약제인 단리된 항체.
  49. 제48항에 있어서,
    약제가 마이탄시노이드 또는 아우리스타틴인 단리된 항체.
  50. 제49항에 있어서,
    마이탄시노이드가 DM1(N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신) 또는 DM4(N2'-데아세틸-n2'-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-6-메틸마이탄신)인 단리된 항체.
  51. 제49항에 있어서,
    아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E)(MMAE) 또는 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)인 단리된 항체.
  52. 제51항에 있어서,
    아우리스타틴이 MMAE인 단리된 항체.
  53. 제52항에 있어서,
    항체가 말레이미드 및 카프로산(maleimide and caproic acid)(MC) 부착기에 화학적으로 콘쥬게이트되고, 이는 카텝신 절단성 링커에 화학적으로 콘쥬게이트되며, 이는 파라아미노벤조산(paraminobenzoic acid)(PAB) 스페이서에 화학적으로 콘쥬게이트되고, 이는 MMAE에 화학적으로 콘쥬게이트되어, ADC를 형성하는 단리된 항체.
  54. 제53항에 있어서,
    카텝신 절단성 링커가 발린-시트룰린(valine-citruline)(vc)인 단리된 항체.
  55. 제54항에 있어서,
    항체가 STM073 또는 STM108인 단리된 항체.
  56. 제55항에 있어서,
    항체가 STM108인 단리된 항체.
  57. 세포독성 약물에 화학적으로 결합되는 이중 기능 항-glycPD-L1 항체를 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트(ADC).
  58. 제57항에 있어서,
    항체가 STM108 또는 STM073인 ADC.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서,
    세포독성 약물이 튜불린 중합반응을 억제하는 약제인 ADC.
  60. 제59항에 있어서,
    약제가 마이탄시노이드 또는 아우리스타틴인 ADC.
  61. 제60항에 있어서,
    마이탄시노이드가 DM1 또는 DM4인 ADC.
  62. 제60항에 있어서,
    아우리스타틴이 MMAE 또는 MMAF인 ADC.
  63. 제62항에 있어서,
    아우리스타틴이 MMAE인 ADC.
  64. 제63항에 있어서,
    항체가 MC 부착기에 화학적으로 콘쥬게이트되고, 이는 카텝신 절단성 링커에 화학적으로 콘쥬게이트되며, 이는 PAB 스페이서에 화학적으로 콘쥬게이트되고, 이는 MMAE에 화학적으로 콘쥬게이트되어, ADC를 형성하는 ADC.
  65. 제64항에 있어서,
    카텝신 절단성 링커가 발린-시트룰린(vc)인 ADC.
  66. 제65항에 있어서,
    항체가 STM108인 ADC.
  67. 절단성 링커를 통해 MMAE에 화학적으로 결합되는 항-glycPD-L1 항체 STM108을 포함하는 ADC.
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