JP2010520910A - 癌の治療のためのモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
好ましくは、ADCCを介した細胞の溶解はエフェクター細胞の存在下で起こり、エフェクター細胞は、特定実施形態では、単球、単核細胞、NK細胞及びPMNから成る群より選択され、また貪食作用はマクロファージによるものである。
好ましい実施形態では、本発明の抗体は以下の性質:
a)GT468に対する特異性;
b)約100nM又はそれ以下、好ましくは約5〜10nM又はそれ以下、より好ましくは約1〜3nM又はそれ以下の、GT468に対する結合親和性;
c)CD55/59陰性細胞上又はCD55/59陽性細胞上のいずれかで高レベルのCDCを媒介する能力;
d)GT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害する能力;
e)GT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞のアポトーシスを誘導する能力;
f)GT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞の同型接着を誘導する能力;
g)エフェクター細胞の存在下でGT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞のADCCを誘導する能力;
h)GT468を発現する腫瘍細胞及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる腫瘍細胞を有する被験者の生存を延長させる能力;
i)GT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞を枯渇させる能力;
j)低レベルのGT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞を枯渇させる能力;及び/又は
k)生細胞の表面でGT468を集合させる能力
の1又はそれ以上によって特徴づけることができる。
a.4E9−1H9、アクセッション番号DSM ACC2822、2007年3月13日寄託
b.9B6−2A9、アクセッション番号DSM ACC2826、2007年3月13日寄託
c.59D6−2F2、アクセッション番号DSM ACC2824、2007年3月13日寄託
d.61C11−2B5、アクセッション番号DSM ACC2825、2007年3月13日寄託
e.78H11−1H6、アクセッション番号DSM ACC2823、2007年3月13日寄託
f.22−1A−I、アクセッション番号DSM ACCXXXX、2008年3月11日寄託
g.22−2A−1、アクセッション番号DSM ACCXXXX、2008年3月11日寄託
h.22−9B−1、アクセッション番号DSM ACCXXXX、2008年3月11日寄託
i.23−33A−1、アクセッション番号DSM ACCXXXX、2008年3月11日寄託
j.23−19A−1、アクセッション番号DSM ACCXXXX、2008年3月11日寄託
k.F11#33F7D12、アクセッション番号DSM ACCXXXX、2008年3月11日寄託
1.4A12 2D4 1A10、アクセッション番号DSM ACCXXXX3、2008年3月11日寄託
m.4E9 1D12 2D4、アクセッション番号DSM ACCXXXX、2008年3月11日寄託
「GT468」という用語は、好ましくはヒトGT468に関し、特に(i)配列番号1の核酸配列を含む核酸などの、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸、又は(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質に関し、細胞によって天然に発現される又はGT468遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現されるその任意の変異体、立体配座、アイソフォーム及び種ホモログを包含する。1つの実施形態では、「GT468」という用語は、細胞外ドメインに対応するGT468の部分に関し、好ましくはN末端疎水性ドメインを含まないGT468のアミノ酸配列に関する。「GT468」という用語は、配列番号2のアミノ酸29〜119、好ましくはアミノ酸29〜212、より好ましくはアミノ酸23〜212を含むタンパク質を包含する。
以下は、本発明の抗体の治療効果の基礎となる機序についての考察を提供するが、いかなる意味においても本発明に対する限定とみなされるべきではない。
ADCCは、本明細書に記載されるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表し、好ましくは抗体によって印が付けられた標的細胞を必要とするものをいう。
CDCは、抗体によって指令され得る別の細胞死滅法である。IgMは補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。IgG1及びIgG3も、古典的補体活性化経路を通してCDCを指令する上でどちらも非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体の形成は、IgG分子などの関与する抗体分子のCH2ドメイン上のごく近接する多数のC1q結合部位の露出を生じさせる(C1qは補体C1の3つのサブ成分の1つである)。好ましくはこれらの露出されたC1q結合部位は、それまでは低親和性のC1q−IgG相互作用を高いアビディティのものに変換し、それが、一連の他の補体タンパク質が関与する事象のカスケードを惹起し、エフェクター細胞走化性/活性化物質、C3a及びC5aのタンパク質分解放出を導く。好ましくは、補体カスケードは膜攻撃複合体の形成で終了し、膜攻撃複合体は、細胞の内外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の細孔を作製する。
本発明の抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばKohler and Milstein,Nature 256:495(1975)の標準体細胞ハイブリダイゼーション手法を含む、様々な手法によって作製できる。体細胞ハイブリダイゼーション手順は、原則として、好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の手法、例えばBリンパ球のウイルス若しくは発癌性形質転換又は抗体遺伝子のライブラリーを使用したファージディスプレイ手法も使用できる。
GT468に対する抗体を作製するため、前述したように、組換え発現されたGT468抗原又はそのフラグメント及び/又はGT468を発現する細胞の冨化製剤である、GT468配列に由来する担体結合ペプチドでマウスを免疫することができる。代替的には、完全長ヒトGT468(例えば配列番号1)をコードするDNA又はそのフラグメント、特に配列番号3〜10及び35〜79をコードするものでマウスを免疫することができる。GT468抗原の精製又は冨化製剤を用いた免疫が抗体を生じない場合は、免疫応答を促進するために、GT468を発現する細胞、例えば細胞系でマウスを同様に免疫することができる。
GT468に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するため、免疫マウスからの脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系などの適切な不死化細胞系に融合することができる。生じたハイブリドーマを、次に、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることができる。個々のウエルを、その後、抗体分泌ハイブリドーマに関してELISAによってスクリーニングすることができる。GT468発現細胞を用いた免疫蛍光及びFACS分析により、GT468に対して特異性を有する抗体が同定できる。抗体分泌ハイブリドーマを再びプレートに植え付け、スクリーニングして、抗GT468モノクローナル抗体に対して依然として陽性である場合は、限界希釈法によってサブクローニングすることができる。安定なサブクローンを、その後、特性付けのために組織培養培地において抗体を作製するためにインビトロで培養することができる。
本発明の抗体はまた、例えば当該技術分野において周知である組換えDNA手法と遺伝子トランスフェクション法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて作製することができる(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
a)キメラ化
マウスモノクローナル抗体は、毒素又は放射性同位体で標識したとき、ヒトにおける治療抗体として使用できる。非標識マウス抗体は、繰り返し適用したときヒトにおいて高度に免疫原性であり、治療効果の低下を導く。主たる免疫原性は重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体をキメラ化又はヒト化した場合、低減するか又は完全に回避することができる。キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種に由来する抗体、例えばマウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。抗体のキメラ化は、マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をヒト重鎖及び軽鎖の定常領域と連結する(例えばKraus et al.,in Methods in Molecular Biology series,Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN−0−89603−918−8に記載されているように)ことによって達成される。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同様に好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、IgG1、IgG3及びIgG4である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、IgG2、IgA、IgD及びIgMである。
抗体は、主として6つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域(CDR)に位置するアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。この理由から、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外側の配列よりも個々の抗体間で多様である。CDR配列は大半の抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる性質を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特定の天然に生じる抗体からのCDR配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に生じる抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現することが可能である(例えばRiechmann,L.et al.(1998)Nature 332:323−327;Jones,P.et al.(1986)Nature 321:522−525;及びQueen,C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029−10033参照)。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公的なDNAデータベースから入手できる。これらの生殖細胞系配列は、B細胞成熟の間にV(D)J結合によって形成される、完全に構築された可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖細胞系遺伝子配列はまた、高親和性の二次レパートリー抗体の配列とも、可変領域全体にわたって個々に均一に異なる。例えば体細胞突然変異は、フレームワーク領域1のアミノ末端部分及びフレームワーク領域4のカルボキシ末端部分では比較的まれである。さらに、多くの体細胞突然変異は抗体の結合特性を有意に変化させない。この理由から、もとの抗体と類似の結合特性を有する無傷組換え抗体を再創製するために特定抗体のDNA配列全体を得る必要はない(国際公開第99/45962号参照)。CDR領域にわたる部分重鎖及び軽鎖配列が、典型的にはこの目的のために十分である。部分配列を使用して、いずれの生殖細胞系可変(V)及び連結(J)遺伝子セグメントが組み換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次に、生殖細胞系配列を用いて可変領域の欠けている部分を充填する。重鎖及び軽鎖リーダー配列はタンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の性質には寄与しない。欠けている配列を加えるために、クローン化されたcDNA配列を連結又はPCR増幅によって合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。代替的には、可変領域全体を一組の短い重複するオリゴヌクレオチドとして合成し、完全な合成可変領域クローンを創製するためにPCR増幅によって結合することができる。この工程は、特定制限部位の除去若しくは包含、又は特定コドンの最適化などのいくつかの利点を有する。
GT468に結合する抗体の能力は、実施例に記載されるもの(例えばELISA、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析)のような、標準的結合アッセイを用いて決定することができる。
抗GT468抗体を精製するため、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の2リットルスピナーフラスコで増殖させることができる。代替的には、抗GT468抗体は、透析膜に基づくバイオリアクターにおいて生産することができる。上清をろ過し、必要に応じて濃縮した後、プロテインG−セファロース又はプロテインA−セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーにかけることができる。溶出されたIgGは、純度を保証するためにゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーによって検査することができる。緩衝液をPBSに交換し、1.43の吸光係数を用いてOD280によって濃度を決定することができる。モノクローナル抗体を等分(アリコート)に分け、−80℃で保存することができる。
精製抗体のアイソタイプを決定するため、様々な市販のキット(例えばZymed,Roche Diagnostics)によるアイソタイプELISAが実施できる。マイクロタイタープレートのウエルを抗マウスIgで被覆することができる。ブロックした後、プレートをモノクローナル抗体又は精製アイソタイプ対照と周囲温度で2時間反応させる。次にウエルをマウスIgG1、IgG2a、IgG2b若しくはIgG3、IgA又はマウスIgM特異的ペルオキシダーゼ結合プローブと反応させることができる。洗浄後、プレートをABTS基質(1mg/ml)で展開し、405〜650のODで分析することができる。代替的には、IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche、カタログ番号1493027)を製造者によって説明されているように使用し得る。
免疫したマウスの血清中の抗GT468抗体の存在又はGT468を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、フローサイトメトリーが使用できる。天然に又はトランスフェクション後にGT468を発現する細胞系とGT468発現を欠く陰性対照(標準的増殖条件下で増殖させた)を、ハイブリドーマ上清中又は1%FBSを含むPBS中で様々な濃度のモノクローナル抗体と混合し、4℃で30分間インキュベートすることができる。洗浄後、APC又はAlexa647で標識した抗IgG抗体を、一次抗体染色と同じ条件下でGT468結合モノクローナル抗体に結合させることができる。単一生細胞に対してゲートする光散乱及び側方散乱特性を用いるFACS装置でのフローサイトメトリーによって試料を分析することができる。単一測定においてGT468特異的モノクローナル抗体を非特異的結合抗体から区別するために、コトランスフェクションの方法が使用できる。GT468と蛍光マーカーをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞を上述したように染色することができる。トランスフェクトした細胞は、抗体染色細胞とは異なる蛍光チャネルで検出できる。トランスフェクト細胞の大部分は両方の導入遺伝子を発現するので、GT468特異的モノクローナル抗体は蛍光マーカー発現細胞に選択的に結合するが、非特異的抗体は非トランスフェクト細胞に同等の割合で結合する。蛍光顕微鏡検査を用いた代替的アッセイを、フローサイトメトリーアッセイに加えて又はその代わりに使用し得る。細胞を上述したように正確に染色し、蛍光顕微鏡によって検査することができる。
免疫したマウスの血清中の抗GT468抗体の存在又はGT468を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、免疫蛍光顕微鏡検査分析が使用できる。例えば自然に又はトランスフェクション後にGT468を発現する細胞系とGT468発現を欠く陰性対照を、10%ウシ胎仔血清(FCS)、2mM L−グルタミン、100IU/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM/F12培地中、標準的増殖条件下にてチェンバースライドで増殖させる。次に細胞をメタノール若しくはパラホルムアルデヒドで固定するか又は処理しないままにしておくことができる。その後、細胞をGT468に対するモノクローナル抗体と25℃で30分間反応させることができる。洗浄後、細胞を同じ条件下でAlexa555標識抗マウスIgG二次抗体(Molecular Probes)と反応させることができる。その後、蛍光顕微鏡によって細胞を検査することができる。
抗GT468 IgGを、ウエスタンブロット法によってGT468抗原との反応性に関してさらに試験することができる。簡単に述べると、GT468を発現する細胞と適切な陰性対照からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に転写し、ブロックして、試験するモノクローナル抗体でプローブする。抗マウスIgGペルオキシダーゼを用いてIgG結合を検出し、ECL基質で展開することができる。
抗GT468マウスIgGは、当業者に周知の方法で、例えば常套的な手術手順の間に患者から得た又は自然に若しくはトランスフェクション後にGT468を発現する細胞系を接種した異種移植腫瘍を担持するマウスから得た、非癌組織又は癌組織試料からのパラホルムアルデヒド若しくはアセトン固定した凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋組織切片を用いて、免疫組織化学によってGT468抗原との反応性に関してさらに試験することができる。免疫染色のために、GT468に対して反応性の抗体をインキュベートし、続いて販売元の指示書に従ってホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体又はヤギ抗ウサギ抗体(DAKO)と共にインキュベートすることができる。
GT468に特異的に結合することに加えて、抗GT468抗体は、GT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞の貪食作用及び死滅を媒介するそれらの能力に関して試験することができる。インビトロでのモノクローナル抗体活性の試験は、インビボモデルでの試験に先立つ初期スクリーニングを提供する。
簡単に述べると、健常ドナーからの多形核細胞(PMN)、NK細胞、単球、単核細胞又は他のエフェクター細胞を、Ficoll Hypaque密度遠心分離とそれに続く汚染赤血球の溶解によって精製することができる。洗浄したエフェクター細胞を、10%熱不活化ウシ胎仔血清か、代替的には5%熱不活化ヒト血清を添加したRPMIに懸濁し、GT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる51Cr標識標的細胞と、エフェクター細胞対標的細胞の様々な比率で、混合することができる。代替的には、標的細胞を蛍光増強リガンド(BATDA)で標識してもよい。死細胞から放出される増強リガンドとユウロピウムの高度蛍光キレートを蛍光光度計によって測定することができる。別の代替的手法は、ルシフェラーゼによる標的細胞のトランスフェクションを利用し得る。添加したルシファーイエローは、生細胞によってのみ酸化され得る。次に、精製抗GT468 IgGを様々な濃度で添加することができる。無関係なヒトIgGが陰性対照として使用できる。アッセイは、使用するエフェクター細胞型に依存して37℃で4〜20時間実施できる。培養上清中の51Crの放出又はEuTDAキレートの存在を測定することによって試料を細胞溶解に関して検定することができる。代替的には、ルシファーイエローの酸化から生じる発光が生細胞の測定であり得る。
モノクローナル抗体抗GT468抗体は、様々な公知の手法を用いてCDCを媒介するそれらの能力に関して試験することができる。例えば補体用の血清は、当業者に公知の方法で血液から入手できる。mAbのCDC活性を測定するために、種々の方法が使用できる。例えば51Cr放出を測定するか又はヨウ化プロピジウム(PI)排除アッセイを用いて膜透過性上昇を評価することができる。簡単に述べると、標的細胞を洗浄し、5×105/mlを様々な濃度のmAbと共に室温で又は37℃で10〜30分間インキュベートすることができる。次に血清又は血漿を添加して20%(v/v)の最終濃度にし、細胞を37℃で20〜30分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をFACSチューブ中のPI溶液に添加することができる。その後直ちに、FACSArrayを用いたフローサイトメトリー分析によって混合物を分析することができる。
アポトーシスを開始させる能力を試験するため、モノクローナル抗GT468抗体を、例えば、GT468陽性腫瘍細胞又はGT468でトランスフェクトした腫瘍細胞と共に37℃で約20時間インキュベートすることができる。細胞を採取し、アネキシンV結合緩衝液(BD biosciences)で洗浄して、FITC又はAPC(BD biosciences)と結合したアネキシンVと共に暗所にて15分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をFACSチューブ中のPI溶液(PBS中10μg/ml)に添加し、直ちにフローサイトメトリーによって(上記のように)評価することができる。
GT468に結合するモノクローナル抗体はまた、GT468を発現する腫瘍細胞の増殖を制御するうえでのそれらの効果を測定するため、インビボモデルにおいて(例えば、場合によりトランスフェクション後に、GT468を発現する細胞系を接種した異種移植腫瘍を担持する免疫欠損マウスにおいて)試験することができる。
本発明の抗体によって認識されるエピトープのマッピングは、"Epitope Mapping Protocols"(Methods in Molecular Biology)by Glenn E.Morris ISBN−089603−375−9及び"Epitope Mapping:A Practical Approach"Practical Approach Series,248 by Olwyn M.R.Westwood,Frank C.Hayの中で詳細に記載されているように実施できる。
本発明のさらに別の実施形態では、GT468に対する抗体は、多数の結合部位又は標的エピトープに結合する二重特異性/多重特異性分子を作製するために、誘導体化する又は別の機能性分子、例えば別のペプチド又はタンパク質(例えばFab'フラグメント)に連結することができる。例えば本発明の抗体は、別の抗体、ペプチド又は結合模倣体などの、1又はそれ以上の他の結合分子に機能的に連結することができる(例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合又は他の方法によって)。
1つの実施形態では、Fc受容体に対する結合特異性は、その結合がヒト免疫グロブリンG(IgG)によってブロックされないモノクローナル抗体によって提供される。本明細書において使用される、「IgG受容体」という用語は、第1番染色体に位置する8つのγ鎖遺伝子のいずれかを指す。これらの遺伝子は、3つのFcγ受容体クラス:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)に分類される合計12の膜貫通型又は可溶性受容体アイソフォームをコードする。1つの好ましい実施形態では、Fcγ受容体はヒト高親和性FcγRIである。
FcαRI及びFcγRIは、それらが、(1)主として免疫エフェクター細胞、例えば単球、PMN、マクロファージ及び樹状細胞上で発現され;(2)高レベルで発現され(例えば細胞当たり5,000〜100,000);(3)細胞傷害活性(例えばADCC、貪食作用)の媒介物質であり;(4)それらを標的とする、自己抗原を含む抗原の抗原提示増強を媒介するので、本発明における使用のための好ましいトリガー受容体である。
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬剤(例えば免疫抑制剤)又は放射性同位体などの治療用の成分又は物質に結合した抗GT468抗体を特徴とする。そのような複合体を本明細書では「免疫複合体」と称する。1又はそれ以上の細胞毒を含む免疫複合体を「イムノトキシン」と称する。細胞毒又は細胞傷害性物質は、細胞に対して有害であり、特に細胞を死滅させる任意の物質を含む。例は、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又はホモログを含む。
別の態様では、本発明は、本発明の抗体の1つ又は本発明の抗体の組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。医薬組成物は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th Edition,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995に開示されているような従来の手法に従って、医薬的に許容される担体又は希釈剤並びに他の任意の公知のアジュバント及び賦形剤と共に製剤し得る。1つの実施形態では、組成物は、異なる機序によって作用する本発明の複数の(例えば2又はそれ以上)単離抗体の組合せ、例えば主としてCDCを誘導することによって働く1つの抗体と主としてアポトーシスを誘導することによって働く別の抗体との組合せを含む。
本発明の抗体(本明細書の中に記載される免疫複合体、二重特異性/多重特異性分子、組成物及び他の誘導体を含む)は、GT468を発現する及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞が関与する疾患の治療を含む、数多くの治療上の有用性を有する。例えば抗体は、本明細書に記載されるような様々な疾患を治療する又は予防するために、例えばインビトロ又はエクスビボで培養下の細胞に、又は例えばインビボでヒト被験者に投与することができる。本明細書において使用される、「被験者」という用語は、GT468に対する抗体に応答するヒト及び非ヒト動物を包含することが意図されている。好ましい被験者は、疾患細胞、特に正常細胞と比較してGT468の変化した発現パターン及び/又はそれらの細胞表面とGT468の結合の変化したパターンによって特徴づけられる細胞を死滅させることによって矯正できる又は改善できる疾患を有するヒト患者を含む。
本明細書において言及する手法及び方法は、それ自体公知である方法で及び、例えばSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.に記載されているように、又は以下に記載されるように実施される。キット及び試薬の使用を含むすべての方法は製造者の情報に従って実施される。
組換えDNA作業を、公式の許可を得て、Rheinland−Pfalz州政府の規則に従って実施した。組織は、常套的な診断又は治療手順の間のヒトの余剰材料として入手し、使用時まで−80℃で保存した。乳癌細胞系MCF−7及びBT549をDMEM/10%FCSにおいて培養した。
RNAの抽出、第一鎖cDNAの合成、RT−PCR及びリアルタイムRT−PCRを先に記載されているように(Koslowski,M.,Sahin,U.,Huber,C.& Tureci,O.(2006)Hum.Mol.Genet.15,2392−2399)実施した。エンドポイント解析のためにGT468特異的オリゴヌクレオチド(センス5'−AAA TTT GGC AGC TGC CTT CAC−3';アンチセンス5'−TGA TGC CAC ATT CAG TAA CAC−3'、60℃でアニーリング)を35サイクルのRT−PCRにおいて使用した。リアルタイムの定量的発現解析を40サイクルのRT−PCRにおいて三重に実施した。HPRT(センス5'−TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA−3';アンチセンス5'−GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT−3'、62℃でアニーリング)に正規化した後、△△CT法の計算を用いて、腫瘍試料中のGT468転写産物を正常組織と比較して定量化した。任意の選択試料からの増幅産物をクローニングし、配列決定することによってPCR反応の特異性を確認した。
栄養芽層特異的分子のインシリコでのクローニングのために、別の場所で詳述されているデータマイニング法を修正して適合させた(Koslowski,M.,Bell,C,Seitz,G.,Lehr,H.A.,Roemer,K.,Muntefering,H.,Huber,C,Sahin,U.& Tureci,O.(2004)Cancer Res.64,5988−5993;Koslowski,M.,Tureci,O.,Bell,C,Krause,P.,Lehr,H.A.,Brunner,J.,Seitz,G.,Nestle,F.O.,Huber,C.& Sahin,U.(2002)Cancer Res.62,6750−6755;Koslowski,M.,Sahin,U.,Huber,C.& Tureci,O.(2006)Hum.Mol.Genet.15,2392−2399)。簡単に述べると、GenBankの階層化キーワード検索をデジタルcDNA−サブトラクションと組み合わせた。
GT468のアミノ酸117−127に対して惹起したポリクローナル抗血清を、抗体受託生産サービス(Squarix,Marl,Germany)によって作製した。VECTOR NovaRED Substrate Kit(Vector,Burlingame,CA)を製造者の指示に従って使用して、組織凍結切片に関して免疫組織化学試験を実施した。ウエスタンブロット分析のために、Triton−Xで溶解した細胞から抽出した全タンパク質30μgを使用した。抽出物を還元試料緩衝液(Roth,Karlsruhe,Germany)に希釈し、SDS−PAGEに供して、その後PVDF膜(Pall,East Hills,NY)に電気転写した。pAKT(Cell Signaling,Danvers,MA)、AKT(Cell Signaling,Danvers,MA)、サイクリンD1(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)及びβアクチン(Abeam,Cambridge,UK)に対して反応性の抗体で免疫染色を実施し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギ二次抗体(Dako,Glostrup,Denmark)で一次抗体を検出した。
GT468 siRNA二本鎖(Qiagen,Hilden,Germany)(センス5'−r(CCA UGA GAG UAG CCA GCA)dTdT−3'、アンチセンス5'−r(UUG CUG GCU ACU CUC AUG G)dAdG−3')は、GT468 mRNA配列のヌクレオチド670〜690(NM_021796.3)を標的した。対照としてスクランブルsiRNA二本鎖(センス5'−r(UAA CUG UAU AAU CGA CUA G)dTdT−5'、アンチセンス5'−r(CUA GUC GAU UAU ACA GUU A)dGdA−3')を使用した。GT468サイレンシング試験のために、HiPerFectトランスフェクション試薬(Qiagen)を製造者の指示に従って使用して、細胞を10nM siRNA二本鎖でトランスフェクトした。すべての結果を、ヌクレオチド342〜362を標的するGT468 siRNA二本鎖の2番目のセット(センス5'−r(GGU UCA GGA CAA AGU CCA A)dTdT−3'、アンチセンス5'−r(UUG GAC UUU GUC CUG AAC C)dGdG−3')で再現した。
siRNA二本鎖によるトランスフェクションの24時間後、1×104細胞を、10%FCSを添加した培地で48時間培養した。Wallac Victor2マルチラベルカウンター(Perkin Elmer,Boston,MA)で、DELFIA細胞増殖キット(Perkin Elmer,Boston,MA)を製造者の指示に従って使用し、新たに合成されたDNA鎖へのBrdUの取り込みを測定することによって増殖を分析した。
細胞を、10%FCSを添加した培地において様々な濃度で培養した。siRNA二本鎖によるトランスフェクションの72時間後に細胞を採取し、EtOH固定して、ヨウ化プロピジウムで染色した後、フローサイトメトリーによるDNA含量分析に供した。細胞周期の異なる期にある細胞を、CellQuest(TM) Pro(BD,Franklin Lakes,NJ)及びFlowJo(TM)(Tree Star,Ashland,OR)フローサイトメトリー分析ソフトウエアを用いて定量した。siRNAトランスフェクションの48時間後と72時間後に、アポトーシス細胞をアネキシンV染色によって定量した。
細胞移動アッセイを、8.0μmの細孔膜(BD Biosciences,San Jose,CA)を有するトランスウエルチェンバーにおいて、実験前に無血清培地で12時間培養した細胞に関して実施した。siRNA実験のために、上述したようにsiRNA二本鎖によるトランスフェクションの24時間後に細胞を無血清条件に移した。無血清培養培地400μl中の4×104細胞を上部チェンバーに添加した。下部チェンバーは、化学誘引物質として5%FCSを添加した培養培地800μlを含んだ。24時間後、膜の底部側に移動していた細胞を氷冷メタノール中に固定した;膜を切り出し、顕微鏡のスライドガラスに載せて、蛍光顕微鏡検査のためにHoechst(Dako,Glostrup,Denmark)で封入した。5つのランダムな視野の細胞(倍率100×)を各々の膜について計数した。すべての実験を三重に実施した。化学誘引物質を上部と下部の両方のチェンバーに添加して、同じ実験設定を用いて細胞のケモキネシスへの作用を分析した。インビトロ浸潤アッセイのために、無血清培地中で1mg/mlに希釈したマトリゲル(BD Biosciences,San Jose,NJ)100μlを用いて上部チェンバーを準備した。ゲル化のためにチェンバーを37℃で5時間インキュベートした。
内因性にGT468を発現する癌細胞系BT−549、Caov−3、EFO−21、MCF−7及びMDA−MB−231を、DMEM細胞培養培地中で1:2に希釈したハイブリドーマ上清と共に72時間インキュベートした。Wallac Victor2マルチラベルカウンター(Perkin Elmer)で、DELFIA細胞増殖キット(Perkin Elmer)を製造者の指示に従って使用し、新たに合成されたDNA鎖へのBrdUの取り込みを測定することによって増殖を分析した。
免疫マウスの血清中の抗GT468抗体の存在又はGT468を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするため、免疫蛍光顕微鏡分析を使用した。GT468−eGFPでトランスフェクトしたCHO細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)、2mM L−グルタミン、100IU/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM/F12培地中、標準的増殖条件下にてチェンバースライドで増殖させた。次に細胞をメタノール又はパラホルムアルデヒド/0.1%サポニンで固定した。細胞を、GT468に対する抗体と25℃で60分間インキュベートした。洗浄後、細胞を同じ条件下でAlexa555標識抗マウスIgG二次抗体(Molecular Probes)と共にインキュベートした。
マイクロウエルプレート(Nunc)を関連GT468ペプチド(5μg/ml)で37℃にて1時間被覆した。PBS 3%BSAによるブロッキングを4℃で一晩実施した。PBSで3回洗浄した後、プレートにハイブリドーマ上清(PBS 3%BSA中1:5又は1:10希釈、50μl/ウエル)を負荷し、室温で1時間インキュベートした(90rpmで軌道振とう)。PBSで3回洗浄した後、PBS 3%BSA中の二次抗体(HRPO結合ヤギ抗マウスIgG、Jackson Immunoresearch)を添加し、90rpmで軌道振とうしながら室温で1時間インキュベートした。最終洗浄工程(PBSで3回)後、100mM酢酸ナトリウム(pH5.2)中の1.5mM ABTSから成る基質溶液を添加した。使用の直前に、0.3μl/mlの30%H2O2を基質溶液に添加した。30〜60分後にTecan Safire Plate reader(Tecan)で405nmの吸収を測定した。
アクセッション番号DSM ACC2822(4E9−1H9)、DSM ACC2826(9B6−2A9)、DSM ACC2824(59D6−2F2)、DSM ACC2825(61C11−2B5)、DSM ACC2823(78H11−1H6)の下で寄託されたクローンの作製において、Balb/c又はC57/BL6をKLH結合ペプチドで免疫した。ペプチド50μg及びアジュバントとしてMontanide ISA 50V 50μlを1、15、45及び86日目に腹腔内(i.p.)注射した。マウスの血清中のGT468に対する抗体の存在を、24、57及び92日目にペプチド特異的ELISAによってモニターした。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出の3日前に追加免疫した。
マウス脾細胞を単離し、標準プロトコールに基づいてPEGによりマウス骨髄腫細胞系に融合した。生じたハイブリドーマを、次に、ペプチド特異的ELISA、GT468 CrELISA及びGT468−eGFPでトランスフェクトしたCHO細胞を用いて、GT468特異性を有する免疫グロブリンの産生をIFによってスクリーニングした。
ハイブリドーマ上清のアイソタイプ決定のために、IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche、カタログ番号1493027)を製造者によって記載されているように使用した。
・抗原の調製
大腸菌XLOLR細菌をGT468 pQEプラスミド又は挿入物を含まないpQE (「基準物質」と称する)のいずれかで形質転換し、LB培地でA600nm〜0.35Eに増殖させた。2mM IPTGでタンパク質発現を誘導し、細胞を37℃でさらに4時間増殖させた。タンパク質発現の適切な誘導とその反応速度をクマシーゲル分析によってモニターした。細菌を遠沈させ、0.2mMプロテアーゼ阻害剤AEBSF塩酸塩(AppliChem)を含有する少量のPBS pH7.2に再懸濁した。細胞を氷上に置き、超音波処理(Branson Sonic Power A Smithkline)によって破壊した。GT468及び標準的溶解産物を、0.2mM AEBSF及び20%(v/v)グリセロールを含有するPBS中で2mg/mlの総タンパク質濃度に希釈した。アリコートを窒素中で衝撃凍結し、使用時まで−70℃で保存した。
使用の前に、GT468並びに標準的溶解産物を被覆緩衝液(100mM HEPES、pH7.2)に希釈し、次に平底F96 Maxisorpマイクロウエルプレート(50μl/ウエル、Nunc)に移して、37℃で2時間吸着させた。
各々個々の血清試料を、GT468又は標準的溶解産物で被覆したウエルに関して並行して二重に試験した。プレートを再び上述したように洗浄し、3%(w/v)粉乳を含有する50mM HEPES(pH7.4)に1:5000希釈した二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG−AP、Dianova)50μl/ウエルと共に室温で1時間インキュベートした。プレートを100μl/ウエルの基質溶液[4−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物(Merck)2mg/ml ALP緩衝液(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)]により室温で30分間展開し、マイクロプレートリーダー(Victor2 Wallac,Perkin−Elmer,Turku,Finland)で、405nmでの吸光度値を直ちに読み取った。
GT468 pcDNA3.1プラスミド又は挿入物を含まないプラスミド(モック)でトランスフェクトしたHEK293細胞を採取し、氷冷メタノールで固定して、PBS/10%FCSで30分間ブロックした。細胞をハイブリドーマ上清と共に1時間インキュベートし、PBS/1FCSで10分間ずつ2回洗浄し、ヤギ抗マウスCy3二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)と共にインキュベートした。
GT468 pcDNA3.1プラスミド又は挿入物を含まないプラスミド(モック)トランスフェクトしたHEK293細胞の全細胞溶解産物を、Triton−Xに基づく溶解緩衝液(50mM HEPES(pH 7.4)、10%(v/v)グリセロール、1%(v/v)Triton X−100、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、 5mM EDTA、100mM NaF)を用いて調製した。抽出物を還元試料緩衝液(Roth)に希釈し、SDS−PAGEに供して、その後PVDF膜(Pall)に電気転写した。GT468に反応性のポリクローナル抗体(Koslowski et al.2007)で免疫染色を実施し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)で一次抗体を検出した。
胎盤特異的栄養芽層遺伝子を同定するため、ゲノム全体のデータマイニング法を適合させた。この方法はもともと、生殖細胞特異的分子のインシリコでの同定のために我々が開発したものである(Koslowski,M.,Bell,C,Seitz,G.,Lehr,H.A.,Roemer,K.,Muntefering,H.,Huber,C,Sahin,U.& Tureci,O.(2004)Cancer Res.64,5988−5993;Koslowski,M.,Tureci,O.,Bell,C,Krause,P.,Lehr,H.A.,Brunner,J.,Seitz,G.,Nestle,F.O.,Huber,C.& Sahin,U.(2002)Cancer Res.62,6750−6755;Koslowski,M.,Sahin,U.,Huber,C.& Tureci,O.(2006)Hum.Mol.Genet.15,2392−2399)。原則的には、真正の胎盤特異的遺伝子の予測のためにGenBankの階層的キーワード検索をデジタルcDNAライブラリーサブトラクション法と組み合わせた。GT468はこのアプローチによって同定された。
GT468 mRNAを、正常組織標本と腫瘍組織標本の包括的なセットにおいてエンドポイントRT−PCR及び定量的リアルタイムRT−PCRによって調べた。GT468の発現は胎盤に限定されることが確認された。他のすべての正常組織標本では、転写産物の量は、かろうじて高感度RT−PCRの検出限界であるか又は検出限界未満である(図1、図2(Fig.1A、B、C)、表1)。唯一の例外が精巣であるが、転写産物のレベルは胎盤で認められるレベルより3〜4対数低い。
GT468特異的ペプチドエピトープ(配列番号2のアミノ酸117−127)に対するポリクローナルウサギ抗体(ウサギ抗GT468/C末端)を惹起した。低分子干渉RNA(siRNA)を使用したGT468の遺伝子サイレンシングによって抗体の特異性を確認した。siRNAを排除するため、二組のGT468特異的siRNA二本鎖、スクランブル非サイレンシングオリゴヌクレオチド及び非トランスフェクト細胞に関して標的活性試験を実施した。これらのsiRNA二本鎖で乳癌細胞系MCF−7及びBT−549をトランスフェクトすることにより、対照と比較して構成的GT468 mRNA発現の80〜90%の安定で再現可能な低下が達成された(図3(Fig.1D))。この所見と一致して、ウエスタンブロット法でのGT468の予測サイズに従って検出された26kDaのバンドは、両方の細胞系においてほぼ完全に消失し(図3(Fig.1E))、GT468タンパク質発現及び抗体の特異性の両方の強力なノックダウンを提供した。
腫瘍細胞におけるGT468の生物学的重要性を調べるため、そのsiRNA誘導の遺伝子サイレンシングの、基本的細胞機能への影響を試験した。
次に、DNAへのBrdUの取り込みによって測定した腫瘍細胞増殖は、GT468特異的siRNA二本鎖により両細胞系において80〜90%低減することが認められた(図6(Fig.4A))。細胞周期分析は、増殖ブロックの基礎となる原因として、GT468 siRNAでトランスフェクトした細胞における明確なG1/S停止を明らかにした(図6(Fig.4B))。細胞の生命力は影響を受けず、アネキシンVについての染色はアポトーシス細胞死の指標を示さなかった(図6(Fig.4C))。
我々は、ウサギ抗GT468/C末端及び非反応性対照抗体と共にインキュベートしたMCF−7及びBT−549細胞の増殖を測定した。GT468のターゲティングは、濃度依存的に両細胞系の増殖の効率的な阻害を生じさせた(図7(Fig.5))。
真核細胞における増殖及び細胞周期進行は、サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ(CDK)によって支配される。個々のサイクリンは、一連のCDKの活性を刺激することによって細胞周期の異なる時期で作用する。制限点の制御はサイクリンD及びE依存性キナーゼファミリーによって媒介される(Morgan,D.O.(1997)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.13,261−291;Sherr,C.J.(2000)Cancer Res.60,3689−3695)。GT468サイレンシングが、サイクリン発現の変化を通して認められた細胞周期調節不全を誘導するかどうかを調べるため、GT468 siRNAで処理したMCF−7及びBT−549乳癌細胞におけるサイクリンD1、D2、D3及びサイクリンEの発現を測定した。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製のために配列番号3〜10に示す配列を有するペプチドを使用した。例えば配列番号3のペプチドを用いた免疫はハイブリドーマ4E9−1H9及び9B6−2A9を生成し、配列番号4のペプチドを用いた免疫はハイブリドーマ59D6−2F2を生成し、配列番号6のペプチドを用いた免疫はハイブリドーマ61C11−2B5及び78H11−1H6を生成した。
GT468 DNAを用いた2回の筋肉内免疫及びそれに続く組換えGT468タンパク質の2回の皮下投与は、ハイブリドーマ22−1A−1、22−2A−1、22−9B−1、23−33A−1及び23−19A−1を生じさせた。GT468 DNAを用いた2回の筋肉内免疫及びそれに続く配列番号10に示すペプチドの2回の腹腔内投与は、ハイブリドーマF11#33F7D12を生じさせた。GT468 DNAを用いた2回の筋肉内免疫及びそれに続く配列番号3に示すペプチドの2回の腹腔内投与は、ハイブリドーマ4A12 2D4 1A10及び4E9 1D12 2D4を生じさせた。
Claims (35)
- GT468に結合し、GT468を発現する細胞の死滅及び/又は前記細胞の1又はそれ以上の活性の阻害を媒介する能力を有する抗体。
- 前記活性が、細胞運動、細胞移動、細胞の浸潤及び細胞増殖から成る群より選択される、請求項1に記載の抗体。
- 前記活性が細胞増殖である、請求項1に記載の抗体。
- 前記細胞の死滅及び/又は細胞の1又はそれ以上の活性の阻害が、前記細胞によって発現されるGT468への前記抗体の結合によって誘導される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記細胞の死滅及び/又は細胞の1又はそれ以上の活性の阻害が、前記細胞によって発現されるGT468の細胞外ドメインへの前記抗体の結合によって誘導される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体。
- 非癌性GT468を発現する細胞への前記抗体の結合により、前記の死滅及び/又は1又はそれ以上の活性の阻害が誘導されない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- GT468を発現する前記細胞が癌細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体。
- 癌細胞が、腫瘍形成性乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌及び肝細胞癌細胞から成る群より選択される、請求項7に記載の抗体。
- 補体依存性細胞傷害(CDC)を介した細胞溶解、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を介した細胞溶解、アポトーシス、同型接着、及び/又は貪食作用を誘導することによって細胞の前記死滅を媒介する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体。
- CDCを介した細胞溶解及び/又はADCCを介した細胞溶解を誘導することによって細胞の前記死滅を媒介する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記細胞のCDCを介した溶解を誘導しない、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記ADCCを介した細胞溶解が、単球、単核細胞、NK細胞及びPMNから成る群より選択されるエフェクター細胞の存在下で起こる、請求項9〜11のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記貪食作用がマクロファージによる、請求項9〜12のいずれか一項に記載の抗体。
- モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体のフラグメントである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体。
- IgG1、IgG2、好ましくはIgG2a及びIgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD、及びIgEから成る群より選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体。
- GT468が配列番号2によるアミノ酸配列を有する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗体がGT468に特異的に結合する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗体。
- 生細胞の表面上に存在するGT468の天然(ネイティブ)エピトープに結合する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗体。
- 癌細胞、好ましくは乳癌細胞に特異的である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記GT468が前記細胞の表面上で発現される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号2〜10及び35〜79から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体、又は前記タンパク質若しくはペプチドを発現する核酸若しくは宿主細胞、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体で動物を免疫する工程を含む方法によって入手できる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の抗体。
- アクセッション番号DSM ACC2822(4E9−1H9)、DSM ACC2826(9B6−2A9)、DSM ACC2824(59D6−2F2)、DSM ACC2825(61C11−2B5)、DSM ACC2823(78H11−1H6)、DSM ACCXXXX(22−1A−1)、DSM ACCXXXX(22−2A−1)、DSM ACCXXXX(22−9B−1)、DSM ACCXXXX(23−33A−1)、DSM ACCXXXX(23−19A−1)、DSM ACCXXXX(F11#33F7D12)、DSM ACCXXXX(4A12 2D4 1A10)、又はDSM ACCXXXX(4E9 1D12 2D4)の下で寄託されたクローンによって産生される抗体。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ。
- アクセッション番号DSM ACC2822(4E9−1H9)、DSM ACC2826(9B6−2A9)、DSM ACC2824(59D6−2F2)、DSM ACC2825(61C11−2B5)、DSM ACC2823(78H11−1H6)、DSM ACCXXXX(22−1A−1)、DSM ACCXXXX(22−2A−1)、DSM ACCXXXX(22−9B−1)、DSM ACCXXXX(23−33A−1)、DSM ACCXXXX(23−19A−1)、DSM ACCXXXX(F11#33F7D12)、DSM ACCXXXX(4A12 2D4 1A10)、又はDSM ACCXXXX(4E9 1D12 2D4)の下で寄託されたハイブリドーマ。
- 治療薬に結合された、請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体を含むコンジュゲート。
- 治療薬が、毒素、放射性同位体、薬剤又は細胞傷害性物質である、請求項25に記載のコンジュゲート。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体及び/又は請求項25若しくは26に記載のコンジュゲート、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 細胞を請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体及び/又は請求項25若しくは26に記載のコンジュゲートの有効量と接触させることを含む、GT468を発現する細胞及び/又はその細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害する方法。
- 細胞を請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体及び/又は請求項25若しくは26に記載のコンジュゲートの有効量と接触させることを含む、GT468を発現する細胞及び/又はその細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞を死滅させる方法。
- 細胞を請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体及び/又は請求項25若しくは26に記載のコンジュゲートの有効量と接触させることを含む、GT468を発現する細胞及び/又はその細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞の転移拡散を抑制する方法。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体、請求項25若しくは26に記載のコンジュゲート又は請求項27に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、GT468を発現する細胞及び/又はその細胞表面とGT468の結合によって特徴づけられる細胞が関与する疾患又は障害を治療する又は予防する方法。
- 疾患又は障害が腫瘍関連疾患である、請求項31に記載の方法。
- 腫瘍関連疾患が、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌及び肝細胞癌細胞から成る群より選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記GT468が配列番号2によるアミノ酸配列を有する、請求項28〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GT468が前記細胞の表面上で発現される、請求項28〜34のいずれか一項に記載の方法。
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