KR20120105423A - 항암제에 반응할 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제에 반응할 증가된 가능성을 갖는 환자 또는 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항암제에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 사용하기 위한 키트 및 제조품을 제공한다.

Description

항암제에 반응할 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하는 방법 {METHOD TO IDENTIFY A PATIENT WITH AN INCREASED LIKELIHOOD OF RESPONDING TO AN ANTI-CANCER AGENT}

관련 출원

본 출원은 2009년 9월 11일자로 출원된 미국 가 특허 출원 번호 61/241,769를 우선권 주장하며, 상기 출원의 개시내용은 전체 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 항암제로의 치료로부터 가장 이익을 얻을 환자를 확인하는 방법 및 항암제로의 치료에 대한 그의 감수성 및 반응성에 대해 환자를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서만 매년 1백 3십만명 정도의 새로운 암 환자가 발생하고, 이는 심혈관 질환 다음으로 두 번째 주요 사망 원인이며, 사망자 4명 중의 대략 1명이 암 환자인 것으로 추정된다. 이러한 사망의 대부분은 고형 종양으로 인한 것이다. 특정 암의 경우에는 의학적 치료에 유의한 진보가 있었지만, 모든 암에 대한 전반적인 5년 생존율은 지난 20년 동안 약 10％ 정도만 개선되었다. 암 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이 및 성장하기 때문에 제시간에 이를 검출하고 치료하는 것은 극도로 어려운 일이다.

암 유형에 따라, 환자는 전형적으로 화학요법, 방사선 및 항체-기재의 약물을 비롯하여 이들에게 이용가능한 여러가지 치료 옵션을 갖는다. 상이한 치료 요법으로 인한 임상 결과를 예측하는데 유용한 진단 방법은 이러한 환자들의 임상적 관리에 크게 이로울 것이다.

따라서, 환자가 어떤 치료에 대해 반응할 것인지를 결정하고, 이러한 결정을 단일 작용제로 사용하든 또는 다른 작용제와 조합하든 항암 요법에 의하는 환자의 보다 유효한 치료 요법에 포함시키는, 보다 유효한 수단이 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 항암제로의 치료에 반응할 환자를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 실시양태는 항암제에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계; (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및 (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계를 포함하며, 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소는 항암제에 반응할 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하여 준다. 일부 실시양태에서, 림프관은 서혜 림프절을 축 림프절에 연결한다. 일부 실시양태에서, 영상화제는 형광 염료 (예를 들어, 알렉사플루오르680(Alexafluor680))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 림프 맥동 주파수는 형광 현미경검사를 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종, 신암 및 그의 조합으로부터 선택된 암으로 진단받은 바 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소가 검출된 경우에 환자에게 유효량의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항암제는 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, NRP2 길항제는 항-NRP2 항체이다. 일부 실시양태에서, VEGF-C 길항제는 항-VEGF-C 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (e) 환자에게 유효량의 제2 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항암제는 VEGF 길항제이다. 일부 실시양태에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계; (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및 (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계를 포함하며, 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 증가는 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하여 준다. 일부 실시양태에서, 림프관은 서혜 림프절을 축 림프절에 연결한다. 일부 실시양태에서, 영상화제는 형광 염료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광 염료는 알렉사플루오르680이다. 일부 실시양태에서, 림프 맥동 주파수는 형광 현미경검사를 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종, 신암 및 그의 조합으로부터 선택된 암으로 진단받은 바 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 증가가 검출된 경우에 환자에게 유효량의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항암제는 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, NRP2 길항제는 항-NRP2 항체이다. 일부 실시양태에서, VEGF-C 길항제는 항-VEGF-C 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (e) 환자에게 유효량의 제2 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항암제는 VEGF 길항제이다. 일부 실시양태에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다.

본 발명의 추가 실시양태는 항암 요법의 유효성을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계; (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및 (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계를 포함하며, 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소는 유효한 항암제를 확인하여 준다. 일부 실시양태에서, 림프관은 서혜 림프절을 축 림프절에 연결한다. 일부 실시양태에서, 영상화제는 형광 염료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광 염료는 알렉사플루오르680이다. 일부 실시양태에서, 림프 맥동 주파수는 형광 현미경검사를 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종, 신암 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로 진단받은 바 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소가 검출된 경우에 환자에게 유효량의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항암제는 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이다. 일부 실시양태에서, NRP2 길항제는 항-NRP2 항체이다. 일부 실시양태에서, VEGF-C 길항제는 항-VEGF-C 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (e) 환자에게 유효량의 제2 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항암제는 VEGF 길항제이다. 일부 실시양태에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 항암제의 용량을 최적화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계; (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및 (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계를 포함하며, 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 변화는 그 용량을 최소 유효 용량으로 확인하여 주고, 림프 맥동 주파수에서의 무변화는 그 용량을 최대 유효 용량으로 확인하여 준다. 일부 실시양태에서, 항암제는 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로부터 선택된다.

이러한 실시양태 및 기타 실시양태를 이하의 상세한 설명에서 추가로 설명한다.

도 1은 림프 맥동 주파수를 측정한 림프 기능 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 1a는 15 ㎕ 볼루스의 염료를 주사한 후 관을 통한 펄스형 림프 운동의 대표적인 시간대별 영상을 나타낸다. 도 1b는 약 24 사례/5 min (n = 6 동물)의 기저수준 활동을 나타낸다.
도 2는 영상화 시작시 꼬리 기저부 근처에 5 ㎕/min으로 15분 염료를 주입한 후 서혜 림프절로의 대량 림프 운반을 측정한 림프 기능 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 2a는 서혜 림프절에 이은 축 림프절의 초기 로딩을 보여주는 대표적인 시간대별 영상을 나타낸다. 도 2b는 기저수준 로딩 속도 및 서혜 림프절의 최대 신호 강도까지의 시간을 나타낸다, n = 4 동물.
도 3은 대량 림프 운반이 종양 관련된 림프 그물에서 상향조절됨을 입증하는 림프 기능 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 3a는 종양 이식 마우스 (n = 6 동물/그룹)에서 림프 맥동 주파수가 약 ％50 상향조절됨을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 3b는 종양 이식 마우스 (n = 4 동물/그룹)에서 대량 림프 운반도 또한 상향조절됨을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 3c는 종양 이식 마우스 (n = 12 동물/그룹)에서 시간대별 림프 맥동 상향조절을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 4는 VEGF-C 신호전달 억제가 종양 관련된 그물에서 림프 운반을 감소시킴을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 4a는 종양 보유 마우스에서 항-NRP2, 항-VEGF-C 또는 항-VEGF-A의 만성 치료가 림프 맥동 주파수를 유의하게 감소시킴을 입증하는 데이터를 나타낸다 (n = 6 동물/그룹). 도 4b는 종양 보유 마우스에서 항-NRP2, 항-VEGF-C 또는 항-VEGF-A의 만성 치료가 대량 림프 운반을 유의하게 감소시킴을 입증하는 데이터를 나타낸다 (n = 6 동물/그룹).
도 5는 VEGF-C 경로의 억제가 비-종양 보유 마우스에서 림프 기능을 유의하게 변경시키지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 5a는 비-종양 보유 마우스에서의 항-VEGF-C의 만성 치료가 3주에 걸쳐 n = 6 동물/그룹에서 측정했을 때 림프 맥동 주파수를 유의하게 변화시키지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 5b는 비-종양 보유 마우스에서의 항-NRP2의 만성 치료가 3주에 걸쳐 n = 4 동물/그룹에서 측정했을 때 림프 맥동 주파수를 유의하게 변화시키지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 6은 항암제의 급성 주사가 림프 기능을 변화시키지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 6a는 종양 보유 마우스에서의 항-NRP2, 항-VEGF-C 또는 항-VEGF-A의 급성 주사가 림프 맥동 주파수에서 어떤 유의한 변화도 야기하지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다 (n = 6 동물/그룹). 도 6b는 비-종양 보유 마우스에서의 재조합 VEGF-C 단백질 또는 재조합 VEGF-A 단백질의 급성 주사가 림프 맥동 주파수에서 어떤 유의한 변화도 야기하지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다 (n = 6 동물/그룹).
도 7은 림프 맥동 주파수가 꼬리 및 등 종양 보유 마우스 둘 모두에서는 상향조절되지만, 귀 종양 보유 마우스에서는 상향조절되지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

I. 도입

본 발명은 항암제에 반응할 증가된 가능성을 갖거나 또는 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 항암제에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 방법을 제공한다. 본 발명은 종양 배액 림프관에서 림프 기능 (예를 들어, 맥동 주파수 또는 대량 림프 운반)을 측정하는 것을 이용하여 항암제로의 치료에 대해 감수성이거나 반응성인 환자를 확인할 수 있거나, 또는 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인할 수 있다는 발견에 기초한다.

II. 정의

용어 "림프 운반"은 림프관을 통한 림프액의 이동을 지칭한다. 림프관은 조직에서 시작되어 림프액을 국소 림프절 (예를 들어, 자궁경부 림프절, 액와 림프절, 쇄골상 림프절, 종격 림프절, 장간막 림프절, 서혜 림프절 및 대퇴 림프절)로 운반 또는 "배액"하고, 여기서 림프액은 여과 및 프로세싱되어 림프액이 혈류로 진입하는 흉관에 도달할 때까지 라인을 따라서 다음 림프절 (예를 들어, 자궁경부 림프절, 액와 림프절, 쇄골상 림프절, 종격 림프절, 장간막 림프절, 서혜 림프절 및 대퇴 림프절)로 보내진다. 임의의 림프절은 배액 림프절일 수 있다. "종양 배액 림프절"은 종양으로부터 림프액을 받는 임의의 림프절이다. 림프 운반은 예를 들어 "림프 맥동," 및 "대량 림프 운반"을 포함한다. "림프 맥동"은 림프관을 통해 펌핑된다는 점에서 림프 추진을 지칭한다.

특정 실시양태에서, 용어 "증가"는 항암제로 치료 전의 림프관에서의 림프 맥동 주파수와 비교하여, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 5％, 10％, 20％, 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 초과의 전반적인 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 증가는 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 증가가 항암제로 치료 전의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X임을 지칭한다.

특정 실시양태에서, 본원의 용어 "감소"는 항암제로 치료 전의 림프관에서의 림프 맥동 주파수와 비교하여, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 5％, 10％, 20％, 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 초과의 전반적인 감소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 감소는 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소가 참조 림프관과 비교하여 항암제로 치료 전의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 적어도 약 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X 또는 0.01X임을 지칭한다.

"영상화제"는 여기 광에 노출되었을 때 근적외선 파장에서 형광을 나타내는 임의의 화합물을 지칭한다. 영상화제의 예에는, 예를 들어 인돌-함유 염료, 카르보시아닌-함유 염료, 폴리메틴 염료, 아크리딘, 안트라퀴논, 벤즈이미다졸, 인돌레닌, 나프탈이미드, 옥사진, 옥소놀, 폴리엔, 포르핀, 스쿠아레인, 스티릴, 티아졸, 크산틴, 당업자에게 공지되어 있는 기타 NIR 염료, 또는 그의 조합이 포함된다. 영상화제는 전형적으로 근적외선 범위에서 여기 파장을 갖는다. 특히, 영상화제는 약 550 nm 내지 약 1000 nm, 약 600 nm 내지 약 950 nm, 약 700 nm 내지 약 900 nm, 또는 약 750 nm 내지 약 850 nm의 여기 파장을 가질 수 있다.

용어 "뉴로필린(Neuropilin) 2", "NRP2" 또는 "Nrp2"는 교환 가능하게 사용되며, 문헌 [Rossignol et al., (2000) Genomics 70:21 1-222]에 기재된 바와 같이 뉴로필린-2 (NRP2, Nrp2) 및 그의 이소형 및 변이체를 총칭한다. 뉴로필린은 120 내지 130 kDa 비-티로신 키나제 수용체이다. 다수의 NRP-2 스플라이스 변이체 및 가용성 이소형이 존재한다. 뉴로필린의 기본 구조는 5개 도메인을 포함한다: 3개의 세포외 도메인 (ala2, blb2 및 c), 막횡단 도메인 및 세포질 도메인. ala2 도메인은 2개의 디술피드 브릿지를 형성하는 4개의 시스테인 잔기를 일반적으로 함유하는 보체 성분 CIr 및 CIs (CUB)와 상동성이다. blb2 도메인은 응고 인자 V 및 VIII과 상동성이다. c 도메인의 중앙부는 메프린, A5 및 수용체 티로신 포스파타제 μ 단백질과의 상동성 때문에 MAM으로 명명된다. ala2 및 blb2 도메인은 리간드 결합을 담당하는 한편, c 도메인은 동종이량체화 또는 이종이량체화를 위해 중요하다. 문헌 [Gu et al., (2002) J. Biol Chem. 211; 18069-76]; [He and Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-51].

"뉴로필린 매개된 생물학적 활성"은 일반적으로, 뉴로필린-1 및/또는 뉴로필린-2가 실질적 역할을 하는 생리학적 또는 병리학적 사건을 지칭한다. 이러한 활성의 비제한적 예는 배아 신경계 발생 또는 뉴런 재생 동안의 축삭 안내, 혈관신생 (혈관 모델링 포함), 종양형성 및 종양 전이이다.

본원에서 사용된 "뉴로필린-2 매개된 생물학적 활성" 또는 "Nrp2 매개된 생물학적 활성"은 일반적으로 Nrp2가 실질적인 역할, 예를 들어 VEGF 수용체 활성화의 증대, 특히 림프 내피 세포 (EC) 이동을 조절하는 능력, 성숙한 림프관신생에서의 역할, 구체적으로 종양 림프관신생 및 종양 전이에서의 역할을 수행하는 생리학적 또는 병리학적 사건을 지칭한다.

용어 "혈관 내피 성장 인자-C", "VEGF-C", "VEGFC", "VEGF-관련 단백질", "VRP", "VEGF2" 및 "VEGF-2"는 교환가능하게 사용되고, VEGF 패밀리의 구성원을 지칭하며, 이는 적어도 2가지의 세포 표면 수용체 패밀리, 티로신 키나제 VEGF 수용체 및 뉴로필린 (Nrp) 수용체에 결합하는 것으로 알려져 있다. 3가지 VEGF 수용체 중에서, VEGF-C는 VEGFR2 (KDR 수용체) 및 VEGFR3 (Flt-4 수용체)에 결합하여 수용체 이량체화 (문헌 [Shinkai et al., J Biol Chem 273, 31283-31288 (1998)]), 키나제 활성화 및 자가인산화 (문헌 [Heldin, Cell 80, 213-223 (1995)]; [Waltenberger et al., J. Biol Chem 269, 26988-26995 (1994)])를 유발할 수 있다. 인산화 수용체는 다중 기질의 활성화를 유도하여 혈관신생 및 림프관신생을 유발한다 (문헌 [Ferrara et al., Nat Med 9, 669-676 (2003)]). 종양 세포에서 VEGF-C의 과다발현은 종양-관련 림프관신생을 촉진시켜 부위 림프절로의 전이를 증대시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Karpanen et al., Faseb J 20, 1462-1472 (2001)]; [Mandriota et al., EMBO J 20, 672-682 (2001)]; [Skobe et al., Nat Med 7, 192-198 (2001)]; [Stacker et al., Nat Rev Cancer 2, 573-583 (2002)]; [Stacker et al., Faseb J 16, 922-934 (2002)]). VEGF-C 발현은 또한 다수의 인간 암에서 종양-관련 림프관신생 및 림프절 전이와 서로 관련이 있다 (문헌 [Achen et al., 2006, 상기문헌]에서 검토됨). 또한, VEGF-C 매개된 신호전달의 차단은 마우스에서 종양 림프관신생 및 림프절 전이를 저해하는 것으로 나타났다 (문헌 [Chen et al., Cancer Res 65, 9004-9011 (2005)]; [He et al., J. Natl Cancer Inst 94, 8190825 (2002)]; [Krishnan et al., Cancer Res 63, 713-722 (2003)]; [Lin et al., Cancer Res 65, 6901-6909 (2005)]).

"혈관 내피 성장 인자-C", "VEGF-C", "VEGFC", "VEGF-관련 단백질", "VRP", "VEGF2" 및 "VEGF-2"는 전장 폴리펩티드 및/또는 전장 폴리펩티드의 활성 단편을 지칭한다. 한 실시양태에서, 활성 단편은 미국 특허 번호 6,451,764 (그의 전체 개시 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함됨)의 서열 3에 나타낸 전장 아미노산 서열의 전체 419개 미만의 아미노산을 갖는 전장 아미노산 서열의 임의의 부분을 포함한다. 이러한 활성 단편은 VEGF-C 생물학적 활성을 함유하고, 성숙한 VEGF-C를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한 실시양태에서, 전장 VEGF-C 폴리펩티드는 단백질분해적으로 프로세싱되어 VEGF-C 폴리펩티드의 성숙한 형태 (또한 성숙한 VEGF-C로 지칭됨)를 생성한다. 이러한 프로세싱은 완전하게-프로세싱된 성숙한 형태를 생성하는 신호 펩티드의 절단 및 아미노-말단 펩티드의 절단 및 카르복실-말단 펩티드의 절단을 포함한다. 실험적 증거는 전장 VEGF-C, VEGF-C의 부분적으로-프로세싱된 형태 및 VEGF-C의 완전하게 프로세싱된 성숙한 형태가 VEGFR3 (Flt-4 수용체)에 결합할 수 있다는 것을 입증한다. 그러나, VEGFR2에 대한 고친화도 결합은 단지 VEGF-C의 완전하게 프로세싱된 성숙한 형태에서 일어난다.

VEGF-C 폴리펩티드에 관한 용어 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성인"은 전장 및/또는 성숙한 VEGF-C와 관련된 물리적/화학적 특성 및 생물학적 기능을 지칭한다. 일부 실시양태에서, VEGF-C "생물학적 활성"은 Flt-4 수용체 (VEGFR3)에 결합하고 그의 인산화를 자극하는 능력을 갖는다는 것을 의미한다. 일반적으로, VEGF-C는 Flt-4 수용체의 세포외 도메인에 결합하여 그의 세포내 티로신 키나제 도메인을 활성화 또는 억제할 것이다. 결과적으로, 수용체에 대한 VEGF-C의 결합은 생체내 또는 시험관내에서 VEGF-C에 대한 Flt-4 수용체를 갖는 세포의 증식 및/또는 분화 및/또는 활성화를 증대 또는 억제할 수 있다. Flt-4 수용체에 대한 VEGF-C의 결합은 경쟁 결합 방법, 예컨대 RIA, ELISA, 및 다른 경쟁적 결합 검정을 비롯한 통상의 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 리간드/수용체 복합체는 여과, 원심분리, 유동 세포측정 (예를 들어, 문헌 [Lyman et al., Cell, 75:1157-1167 [1993]]; [Urdal et al., J. Biol. Chem., 263:2870-2877 [1988]]; 및 [Gearing et al., EMBO J., 8:3667-3676 [1989]] 참조) 등과 같은 분리 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 결합 연구로부터의 결과는 결합 데이터의 임의의 통상적인 그래프 표현, 예컨대 스캐차드 분석 (문헌 [Scatchard, Ann. NY Acad. Sci.,51:660-672 [1949]]; [Goodwin et al., Cell, 73:447-456 [1993]]) 등을 이용하여 분석할 수 있다. VEGF-C가 Flt-4 수용체의 인산화를 유도하므로, 통상적인 티로신 인산화 검정은 또한 Flt-4 수용체/VEGF-C 복합체의 형성의 지표로 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, VEGF-C "생물학적 활성"은 KDR 수용체 (VEGFR2)에 결합하는 능력, 혈관 투과성 뿐만 아니라 내피 세포의 이동 및 증식을 갖는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, KDR 수용체에 대한 VEGF-C의 결합은 생체내 또는 시험관내에서 VEGF-C에 대한 KDR 수용체를 갖는 내피 세포의 혈관 투과성 뿐만 아니라 이동 및/또는 증식 및/또는 분화 및/또는 활성화를 증대 또는 억제할 수 있다.

용어 "VEGF-C 길항제"는 VEGF-C 활성을 중화, 차단, 억제, 제거, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 특정 실시양태에서, VEGF-C 길항제는 혈관신생, 림프 내피 세포 (EC) 이동, 증식 또는 성숙한 림프관신생, 특히 종양 림프관신생 및 종양 전이를 조절하는 VEGF-C의 능력을 중화, 차단, 억제, 제거, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. VEGF-C 길항제는 VEGF-C에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체, 항-VEGF-C 수용체 항체 및 VEGF-C 수용체 길항제, 예컨대 VEGFR2 및 VEGFR3의 소분자 억제제에 대한 그의 결합을 격리시키는, 항-VEGF-C 항체 및 그의 항원-결합 단편, 수용체 분자 및 유도체를 비제한적으로 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "VEGF-C 길항제"는 특히 VEGF-C에 결합하고 VEGF-C 활성을 중화, 차단, 억제, 제거, 감소 또는 방해할 수 있는 분자, 예컨대 항체, 항체 단편, 다른 결합 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드 소분자를 포함한다. 따라서, 용어 "VEGF-C 활성"은 특히 VEGF-C의 VEGF-C 매개된 생물학적 활성 (본원에서 상기 정의된 바와 같음)을 포함한다.

용어 "항-VEGF-C 항체" 또는 "VEGF-C에 결합하는 항체"는 항체가 VEGF-C를 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 VEGF-C와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 항-VEGF-C 항체는 예를 들어 대리인 문서 PR4391에 기재되어 있고, 이 특허 출원의 전체 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다. 한 실시양태에서, 관련없는 비-VEGF-C 단백질에 항-VEGF-C 항체가 결합하는 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정시, VEGF-C에 대한 항체의 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, VEGF-C에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.1 nM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-VEGF-C 항체는 상이한 종으로부터의 VEGF-C 사이에 보존된 VEGF-C의 에피토프에 결합한다.

본원에서 사용된 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 문헌 [Leung et al., (1989) Science 246:1306] 및 [Houck et al., (1991) Mol. Endocrin., 5:1806]에 기재된 바와 같은 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 189- 및 206- 아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자와 함께, 그의 자연 발생 대립유전자 형태 및 프로세싱된 형태를 지칭한다. 용어 "VEGF"는 또한 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 지칭한다. 때때로, 특정 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF의 경우에는 hVEGF, 뮤린 VEGF의 경우에는 mVEGF 등과 같은 용어로 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 아미노산 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 말단절단된 형태를 지칭하는데 사용된다. VEGF의 임의의 상기 형태들에 대한 언급은 본 출원에서 예를 들어 "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"에 의해 확인될 수 있다. "말단절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 표시된 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 말단절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단된 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대해 천연 VEGF와 대등한 결합 친화도를 갖는다.

"VEGF 생물학적 활성"은 임의의 VEGF 수용체에 대한 결합 또는 임의의 VEGF 신호전달 활성, 예컨대 정상적 및 비정상적 혈관신생 및 혈관형성 둘 모두의 조절 (문헌 [Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25]; [Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543]); 배아 혈관형성 및 혈관신생의 촉진 (문헌 [Carmeliet et al., (1996) Nature 380:435-439]; [Ferrara et al., (1996) Nature 380:439-442]); 및 여성 생식기에서의 순환적 혈관 증식 및 골 성장 및 연골 형성 조절 (문헌 [Ferrara et al., (1998) Nature Med. 4:336-340]; [Gerber et al., (1999) Nature Med. 5:623-628])을 포함한다. 혈관신생 및 혈관형성에 있어서 혈관신생 인자인 것에 더하여, 다면발현 성장 인자로서 VEGF는 다른 생리학적 과정에서 다양한 생물학적 효과, 예컨대 내피 세포 생존, 혈관 투과성 및 혈관확장, 단핵구 화학주성 및 칼슘 유입을 나타낸다 (문헌 [Ferrara and Davis-Smyth (1997), 상기 문헌] 및 [Cebe-Suarez et al., Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)]). 추가로, 몇몇 비-내피 세포 유형, 예컨대 망막 색소 상피 세포, 췌장관 세포 및 슈반 세포에 대한 VEGF의 분열촉진 효과가 최근 연구에서 보고되었다. 문헌 [Guerrin et al., (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394]; [Oberg-Welsh et al., (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132]; [Sondell et al., (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740].

"VEGF 길항제" 또는 "VEGF-특이적 길항제"는 VEGF에 결합하거나, VEGF 발현 수준을 감소시키거나, 또는 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 VEGF 결합 및 VEGF 매개된 혈관신생 및 내피 세포 생존 또는 증식을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 VEGF 생물학적 활성을 중화, 차단, 억제, 제거, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. VEGF에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 항-VEGF 항체 및 그의 항원-결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체, 융합 단백질 (예를 들어, VEGF-트랩 (레게네론(Regeneron)) 및 VEGF₁₂₁-겔로닌 (페레그린(Peregrine))이 본 발명의 방법에 유용한 VEGF-특이적 길항제로서 포함된다. VEGF-특이적 길항제는 또한 VEGF 폴리펩티드의 길항제 변이체, VEGF에 대한 안티센스 핵염기 올리고머, VEGF에 대한 소형 RNA 분자, RNA 압타머, 펩티바디, 및 VEGF에 대한 리보자임을 포함한다. VEGF-특이적 길항제는 또한 VEGF에 결합하는 비펩티드 소분자를 포함하고, 이는 VEGF 생물학적 활성을 차단, 억제, 제거, 감소 또는 방해할 수 있다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 구체적으로 VEGF의 VEGF 매개된 생물학적 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, VEGF 길항제는 VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 그 초과만큼 감소 또는 억제한다.

"항-VEGF 항체"는 VEGF에 충분한 친화성 및 특이성으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 선택된 항체는 정상적으로, VEGF에 대해 충분히 결합 친화도를 가질 것이고, 예를 들어 항체는 100 nM 내지 1 pM의 K_d 값으로 hVEGF와 결합할 수 있다. 항체 친화도는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 기반 검정 (예컨대 PCT 출원 공보 번호 WO2005/012359에 기재된 바와 같은 비아코어(BIAcore) 검정); 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA); 및 경쟁 검정 (예를 들어, RIA)으로 결정할 수 있다.

특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적화하고 이를 간섭하는데 있어서의 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체를 대상으로 하여 다른 생물학적 활성 검정을 수행하여, 예를 들어 그의 치료제로서의 유효성을 평가할 수 있다. 이러한 검정은 당업계에 공지되어 있고, 표적 항원 및 항체의 의도된 용도에 따라 달라진다. 이것의 예는 HUVEC 억제 검정, 종양 세포 성장 억제 검정 (예를 들어, WO 89/06692에 기재된 바와 같음), 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개 세포독성 (CDC) 검정 (미국 특허 5,500,362), 및 효능작용 활성 또는 조혈 검정 (WO 95/27062 참조)을 포함한다. 항-VEGF 항체는 통상적으로 다른 VEGF 상동체, 예컨대 VEGF-B 또는 VEGF-C에도 결합하지 않을 것이고, 다른 성장 인자, 예컨대 PlGF, PDGF 또는 bFGF에도 결합하지 않을 것이다. 한 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생성되는 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙 (BV; 아바스틴(AVASTIN)^®)으로 공지된 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌, 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성되는 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다.

"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴^®"으로 공지되기도 한 항-VEGF 항체 "베바시주맙 (BV)"은 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이것은 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93％ (대부분의 프레임워크 영역 포함)는 인간 IgG1로부터 유래되고, 서열의 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맙은 분자량이 약 149,000 달톤이고 글리코실화된다. 베바시주맙 및 다른 인간화 항-VEGF 항체는 2005년 2월 26일자로 허여된 미국 특허 번호 6,884,879 (전체 개시 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함됨)에 추가로 기재되어 있다.

가장 잘 특징규명된 2종의 VEGF 수용체는 VEGFR1 (또한, Flt-1이라고도 공지됨) 및 VEGFR2 (또한, KDR 및 FLK-1 (뮤린 상동체)이라고도 공지됨)이다. 각 VEGF 패밀리 구성원에 대한 각 수용체의 특이성은 다양하지만, VEGF-A는 Flt-1 및 KDR 둘 모두에 결합한다. 전장 Flt-1 수용체는 7개의 Ig 도메인을 갖는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 티로신 키나제 활성을 지닌 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 VEGF의 결합에 관여하고, 세포내 도메인은 신호 전달에 관여한다.

VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF 수용체 분자 또는 그의 단편이, VEGF 단백질에 결합하여 그를 격리시킴으로써 VEGF 단백질이 신호전달을 하지 못하도록 하는 VEGF 억제제로서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, VEGF 수용체 분자 또는 그의 VEGF 결합 단편은 가용성 형태, 예컨대 sFlt-1이다. 가용성 형태의 수용체는 VEGF와 결합함으로써 VEGF 단백질의 생물학적 활성에 대한 억제 효과를 발휘하여 VEGF 단백질이 표적 세포 표면상에 존재하는 그의 천연 수용체와 결합하는 것을 방해한다. 또한, VEGF 수용체 융합 단백질이 포함되는데, 이것의 예는 아래에 기재되어 있다.

키메라 VEGF 수용체 단백질은 적어도 2종의 상이한 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 수용체 분자로서, 이중 적어도 1종은 VEGF와 결합하여 그의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 VEGF 수용체 단백질 (예를 들어, flt-1 또는 KDR 수용체)이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 키메라 VEGF 수용체 단백질은 단지 2개의 상이한 VEGF 수용체 분자로부터 유래된 아미노산 서열로 이루어지지만, flt-1 및/또는 KDR 수용체의 세포외 리간드-결합 영역으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 모든 7개의 Ig-유사 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 다른 관련되지 않은 단백질로부터의 아미노산 서열, 예를 들어 이뮤노글로불린 서열에 연결될 수 있다. Ig-유사 도메인과 조합되는 다른 아미노산 서열은 당업자에게 매우 명백할 것이다. 키메라 VEGF 수용체 단백질의 예에는, 가용성 Flt-1/Fc, KDR/Fc 또는 Flt-1/KDR/Fc (VEGF 트랩으로서 공지되기도 함)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. (예를 들어 PCT 출원 공보 번호 WO97/44453 참조).

가용성 VEGF 수용체 단백질 또는 키메라 VEGF 수용체 단백질은 막횡단 도메인을 통해 세포의 표면에 고정되지 않는 VEGF 수용체 단백질을 포함한다. 이와 같이 가용성 형태의 VEGF 수용체, 예를 들어 키메라 수용체 단백질은 VEGF와 결합하여 이것을 불활성화시키면서도 막횡단 도메인을 포함하지 않기 때문에 일반적으로는 해당 분자가 발현되는 세포의 세포막과 회합되지 않는다.

추가의 VEGF 억제제가, 예를 들어 WO 99/24440, PCT 국제 출원 PCT/IB99/00797, WO 95/21613, WO 99/61422, 미국 특허 번호 6,534,524, 미국 특허 번호 5,834,504, WO 98/50356, 미국 특허 번호 5,883,113, 미국 특허 번호 5,886,020, 미국 특허 번호 5,792,783, 미국 특허 번호 6,653,308, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755 및 WO 98/02437에 기재되어 있고, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "B20 시리즈 폴리펩티드"는 VEGF에 결합하는 항체를 비롯한 폴리펩티드를 지칭한다. B20 시리즈 폴리펩티드에는 미국 공보 번호 20060280747, 미국 공보 번호 20070141065 및/또는 미국 공보 번호 20070020267 (이들 특허 출원의 내용은 분명하게 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있는 B20 항체 또는 B20-유래 항체의 서열로부터 유래된 항체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한 실시양태에서, B20 시리즈 폴리펩티드는 미국 공보 번호 20060280747, 미국 공보 번호 20070141065 및/또는 미국 공보 번호 20070020267에 기재된 바와 같은 B20-4.1이다. 또 다른 실시양태에서, B20 시리즈 폴리펩티드는 그 전체 개시내용이 분명하게 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 60/991,302에 기재된 B20-4.1.1이다.

본원에서 사용된 용어 "G6 시리즈 폴리펩티드"는 VEGF에 결합하는 항체를 비롯한 폴리펩티드를 지칭한다. G6 시리즈 폴리펩티드에는 미국 공보 번호 20060280747, 미국 공보 번호 20070141065 및/또는 미국 공보 번호 20070020267에 기재된 G6 항체 또는 G6-유래 항체의 서열로부터 유래된 항체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 미국 공보 번호 20060280747, 미국 공보 번호 20070141065 및/또는 미국 공보 번호 20070020267에 기재되어 있는 G6 시리즈 폴리펩티드에는 G6-8, G6-23 및 G6-31이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

추가의 항체에 대해서는, 미국 특허 번호 7,060,269, 6,582,959, 6,703,020; 6,054,297; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 공보 번호 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 및 20050112126; 및 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 다른 항체는 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 및 C104를 포함하거나, 또는 다르게는 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 및 Q89를 포함하는 인간 VEGF 상의 기능적 에피토프에 결합하는 것을 포함한다.

다른 항-VEGF 항체가 또한 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)]에 기재되어 있다.

환자의 "유효한 반응" 또는 환자의 항암제 치료에 대한 "반응성" 또는 "감수성"은, 예를 들어 항-VEGF-A 항체, 항-VEGF-C 항체 또는 항-NRP2 항체와 같은 항암제로의 치료로부터 또는 그러한 치료의 결과로서 암에 걸릴 위험이 있거나 암을 앓고 있는 환자에게 부여되는 임상적 또는 치료상 이점을 지칭한다. 이러한 이점에는 길항제 치료로부터 또는 그러한 치료의 결과로서의 세포적 또는 생물학적 반응, 완전 반응, 부분 반응, 안정적 질환 (진행 또는 재발이 없음), 또는 환자의 후기 재발이 있는 반응이 포함된다. 예를 들어, 유효한 반응은 적어도 1회의 항암제로의 치료에 따라 종양 배액 림프절과 관련된 림프관 내의 림프 맥동 주파수가 감소된 것으로 진단된 환자에서 종양 크기 또는 무진행 생존을 감소시킬 수 있다. 림프 맥동 주파수의 감소는 이러한 유효한 반응을 효과적으로 예측하게 하거나, 또는 높은 감수성으로 예측하게 한다.

본원에서 사용된 "길항제"는 그것이 결합하는 분자의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 화합물 또는 작용제를 지칭한다. 길항제에는 VEGF에 결합하고, 임의로는 또 다른 분자에 접합되거나 융합된 항체, 합성 또는 천연 서열 펩티드, 이뮤노어드헤신 및 소분자 길항제가 포함된다. "차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 것이다.

본원에서 사용된 "효능제 항체"는 관심 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 항체이다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.

"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 확인되고, 분리 및/또는 회수된 항체이다. 천연 환경의 오염물 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 여기에는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 95 중량％의 항체를 초과하도록, 일부 실시양태에서는 99 중량％를 초과하도록, (2) 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 사슬내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L) 및 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에서 계면을 형성한다고 여겨진다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 지칭하고, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이것은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역 (HVR)이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 베타-시트 입체형태를 취하며 3개의 HVR에 의해 연결되어 있는 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이것은 베타-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 상기 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 HVR들은 FR 영역에 의해 함께 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데는 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포독성에서의 항체 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

임의의 척추동물 종의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불리는 2개의 분명하게 상이한 유형 중 하나로 배정될 수 있다.

중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 다양한 클래스로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇몇은 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 나뉠 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체형태는 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체 및 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.

용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "온전한 항체"는 본원에서 교환 가능하게 사용되며, 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아니라 실질적으로 무손상인 형태의 항체를 지칭한다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.

본원의 목적상, "네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지와 접합되지 않은 항체이다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부를 포함하고, 바람직하게는 무손상 항체의 항원-결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상에 항원 결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체-힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들은 단일 폴리펩티드 쇄로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 VH 도메인 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv를 검토하기 위해서는, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Mono-clonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. (Springer-Verlag, New York: 1994), pp 269-315]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 동일 폴리펩티드 쇄 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디 역시 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 이 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물이 아니라는 것으로 나타낸다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 과정에 의해 수득된다. 예를 들어, 선별 과정은 복수개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열을 추가로 변경시켜서 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고 표적 결합 서열을 인간화하고 세포 배양물 중에서의 그의 생성을 개선시키며 생체내 그의 면역원성을 저하시키고 다중특이적 항체 등을 생성할 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해해야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대한 것이다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 이외에도 다른 이뮤노글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.

수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조)을 비롯한 다양한 기술, 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자 자리의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성시키는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., PNAS USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995)] 참조)에 의해 제조될 수 있다.

본원의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편이 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 및 문헌 [Morrison et al., PNAS USA 81:6851-6855 (1984)]). 키메라 항체는 항체의 항원 결합 영역이 예를 들어 마카쿠 원숭이를 관심 항원으로 면역화하여 생성된 항체로부터 유래된 프리마티제드(PRIMATIZED)® 항체를 포함한다.

비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 HVR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 임의로, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조를 위한 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 시험접종에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스에게 항원을 투여하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체에 관해서는 문헌 [Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다.

용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"가 본원에서 사용되는 경우, 이것은 서열에서 초가변이고/이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)] 및 [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.

많은 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)인 HVR은 서열 가변성을 기초로 하며 가장 흔히 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이들 각각의 HVR로부터의 잔기를 이하에 나타낸다.

HVR은 다음과 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2), 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2), 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 연장된 HVR 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

표현 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이것의 변형 형태는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.

"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 1개 이상의 HVR에 1개 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화력을 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH- 및 VL-도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.

"성장 억제" 항체는 이러한 항체와 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방지 또는 저하시키는 것이다.

"아폽토시스를 유도하는" 항체는 표준 아폽토시스 검정, 예컨대 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포 (아폽토시스체로 불림)의 형성에 의해 판단되는 프로그램화된 세포 사멸을 유도하는 항체이다.

항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 이소형에 따라서 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 식세포작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절, 및 B-세포 활성화를 포함한다.

본원에서의 용어 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역을 비롯한 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위하여 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 이것의 카르복실 말단까지의 스트레치인 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작으로 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.

본원에서 달리 나타내지 않는 한, 이뮤노글로불린 중쇄 내 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 EU 지수의 넘버링이다. "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합, CDC, Fc 수용체 결합, ADCC, 식세포작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체, BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능에는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되고, 이는 예를 들어 본원의 정의에서 개시된 바와 같은 각종 검정을 이용하여 평가할 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형), 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역, 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 및 또한 이들의 자연 발생 변이체를 포함한다.

"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 바람직하게는 적어도 약 80％의 상동성, 가장 바람직하게는 이것과 적어도 약 90％의 상동성, 보다 바람직하게는 이것과 적어도 약 95％의 상동성을 가질 것이다.

용어 "Fc-영역-포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447 잔기가 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체를 포함하며, 여기에는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 달리 스플라이싱된 형태가 포함된다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (예를 들어, 문헌 [Daeeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward, Immunology Today,18 (12):592-8 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 (7):637-40 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem.,279(8):6213-6 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조).

인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 인간 FcRn에 대한 생체내 결합 및 혈청 반감기는 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2000/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 또한 예를 들어 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조한다.

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)와 결합된 분비형 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 이후에 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 별법적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.

"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체계의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위클래스의 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가되거나 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체가 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적이고 예시적인 실시양태를 아래에 기재한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 검정에서 기재되는 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행되는 방사선표지된 항원 결합 검정 (RIA)으로 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 (¹²⁵I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터 플레이트 (다이넥스 테크놀로지스, 인크.(DYNEX Technologies, Inc.))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 ㎍/mL의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후에 PBS 중 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 2시간 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (넌크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만, 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서의 인큐베이션 (예를 들어, 1시간 동안)을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1％ 트윈(TWEEN)-20™ 계면활성제로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.

또 다른 실시양태에 따라, Kd 또는 Kd 값은 25℃에서 약 10 반응 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩으로 비아코어(BIACORE)^®-2000 또는 비아코어^®-3000 기기 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정한다. 간략하게 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05％ 트윈 20™ 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 중에 주입한다. 간단한 일-대-일 랑뮈르 결합 모델 (비아코어^® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on의 비로 계산한다. 예를 들어 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트(on-rate)가 10⁶ M^-1s^-1를 초과하는 경우, 온-레이트는 분광측정계, 예컨대 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 "온-레이트", "회합의 속도", "회합 속도" 또는 "k_on"은 또한 비아코어^®-2000 또는 비아코어^®-3000 시스템 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하여 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 본 발명의 항체와 관련이 있고, 다른 하나는 참조/비교 항체와 관련이 있음) (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서 예를 들어 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만 및/또는 약 10％ 미만이다.

본원에서 사용된 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 2개의 수치값 (일반적으로, 하나는 분자와 관련이 있고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 관련이 있음) (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과 및/또는 약 50％ 초과이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 유용한 인간화 항체는 IgG Fc에 아미노산 변경을 추가로 포함하고, 야생형 IgG Fc를 갖는 항체에 비해 인간 FcRn에 대해 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 보다 바람직하게는 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 125배, 보다 더 바람직하게는 적어도 150배 내지 약 170배 만큼 증가된 결합 친화도를 나타낸다.

"장애" 또는 "질환"은 본 발명의 물질/분자 또는 방법을 이용한 치료로부터 이득을 얻을 수 있는 모든 질환이다. 여기에는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉬운 병적 상태 포함)이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비-제한적 예에는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프성 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 기타 선상, 대식세포, 상피, 기질 및 포배강 장애; 및 염증성, 면역학적 및 기타 혈관신생 관련 장애가 포함된다.

용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 나타낸다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 혈관신생이다.

본원에서 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성 또는 양성 여부와 상관 없음), 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 상호 배타적인 것이 아니다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 포유동물에게서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막암, 간세포성 암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암, 및 B-세포 림프종 (저등급/여포성 비호지킨 림프종 (NHL); 소림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소형 비-분할 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 림프모구성 백혈병; 및 이식 후 림프구증식성 장애 (PTLD) 및 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종 (예컨대, 뇌 종양과 관련된 부종), 및 메이그스 증후군이 포함된다.

용어 "항신생물성 조성물" 또는 "항암 조성물" 또는 "항암제"는 적어도 하나의 활성 치료제, 예를 들어 "항암제"를 포함하는, 암을 치료하는데 유용한 조성물을 지칭한다. 치료제 (항암제)의 예는 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 항림프관신생제, 아폽토시스성 작용제, 항튜불린제, 및 암 치료를 위한 기타 작용제, 예컨대 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)™), 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec)™ (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 시토카인, ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA VEGF 또는 VEGF 수용체(들) 표적 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성 및 유기 화학적 작용제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그의 조합 역시 본 발명에 포함된다.

"혈관신생 인자 또는 작용제"는 혈관의 발생을 자극하는데 관여하는, 예를 들어 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성 및/또는 혈관형성 등을 촉진하는 성장 인자 또는 그의 수용체이다. 예를 들어 혈관신생 인자는, 예를 들어 VEGF 및 VEGF 패밀리의 구성원 및 그의 수용체 (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3), PlGF, PDGF 패밀리, 섬유모세포 성장 인자 패밀리 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2), TIE1, TIE2, 에프린, Bv8, 델타-유사 리간드 4 (DLL4), Del-1, 섬유모세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), FGF4, FGF9, BMP9, BMP10, 폴리스타틴, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), GM-CSF, 간세포 성장 인자 (HGF)/산란 인자 (SF), 인터류킨-8 (IL-8), CXCL12, 렙틴, 미드카인, 뉴로필린, NRP1, NRP2, 태반 성장 인자, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판-유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB, PDGFR-알파 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (PTN), 프로그라눌린, 프로리페린, 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), Alk1, CXCR4, Notch1, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이것은 혈관신생을 촉진하는 인자, 예컨대 ESM1 및 페를레칸을 추가로 포함할 것이다. 이것은 또한 상처 치유를 가속화하는 인자, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), EGF-유사 도메인, 멀티플 7 (EGFL7), CTGF 및 그의 패밀리의 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타를 포함할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39]; [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179]; [Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364]; [Tonini et al., (2003) Oncogene 22:6549-6556 (예를 들어, 공지된 혈관신생 인자를 열거한 표 1); 및 [Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206]을 참조한다.

본원에서 사용된 용어 "VEGF"는 문헌 [Leung et al., Science, 246:1306 (1989)] 및 [Houck et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)]에 기재된 바와 같은 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 189- 및 206- 아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자와 함께, 그의 자연 발생 대립유전자 형태 및 프로세싱된 형태를 지칭한다. 용어 "VEGF"는 또한 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 지칭한다. 때때로, 특정 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF의 경우에는 hVEGF, 뮤린 VEGF의 경우에는 mVEGF 등과 같은 용어로 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 말단절단된 형태를 지칭하는데 사용된다. VEGF의 임의의 상기 형태들에 대한 언급은 본 출원에서 예를 들어 "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"에 의해 확인될 수 있다. "말단절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 표시된 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 말단절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단된 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대해 천연 VEGF와 대등한 결합 친화도를 갖는다. 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF는 인간 VEGF이다.

"VEGF 길항제"는 VEGF 활성 (그의 VEGF 또는 하나 이상의 VEGF 수용체 또는 이를 코딩하는 핵산에 대한 결합성 포함)을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 바람직하게는, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합한다. VEGF 길항제는 항-VEGF 항체 및 그의 항원-결합 단편, VEGF 및 VEGF 수용체에 결합하고 리간드-수용체 상호작용을 차단하는 폴리펩티드 (예를 들어, 이뮤노어드헤신, 펩티바디), 항-VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 길항제, 예컨대 VEGFR 티로신 키나제의 소분자 억제제, VEGF에 결합하는 압타머, 및 엄격한 조건하에 VEGF 또는 VEGF 수용체를 코딩하는 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 (예를 들어, RNAi)을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF에 결합하고, 시험관 내에서 VEGF-유도된 내피 세포 증식을 억제한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체와 비-VEGF 또는 비-VEGF 수용체 보다 큰 친화도로 결합한다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체와 1 uM 내지 1 pM의 Kd로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체와 500 nM 내지 1 pM으로 결합한다.

바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 폴리펩티드, 예컨대 항체, 펩티바디, 이뮤노어드헤신, 소분자 또는 압타머로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 항-VEGF 항체, 예컨대 아바스틴^® 항체 또는 항-VEGF 수용체 항체, 예컨대 항-VEGFR2 또는 항-VEGFR3 항체이다. VEGF 길항제의 다른 예에는 VEGF-트랩, 뮤카젠(Mucagen), PTK787, SU11248, AG-013736, 베이 439006 (소라페닙), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 및 KRN-633이 포함된다.

"항-VEGF 항체"는 VEGF에 충분한 친화성 및 특이성으로 결합하는 항체이다. 바람직하게, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적화하고 간섭하는 치료제로서 사용될 수 있다. 항-VEGF 항체는 통상적으로 다른 VEGF 상동체, 예컨대 VEGF-B 또는 VEGF-C에도 결합하지 않을 것이고, 다른 성장 인자, 예컨대 PlGF, PDGF 또는 bFGF에도 결합하지 않을 것이다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생성되는 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직하게는, 항-VEGF 항체는 베바시주맙 (BV; 아바스틴®)으로서 공지된 항체를 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 사용될 수 있는 항-VEGF 항체는 WO 2005/012359에 개시된 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한 실시양태에 따르면, 항-VEGF 항체는 WO 2005/012359의 도 24, 25, 26, 27 및 29에 개시된 항체 중 어느 하나의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 포함한다 (예를 들어, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 및 B20.4.1). 또 다른 바람직한 실시양태에서, 라니비주맙으로 공지된 항-VEGF 항체는 안구 질환, 예컨대 당뇨병성 신경병증 및 AMD에 대해 투여되는 VEGF 길항제이다.

"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴®"으로 공지되기도 한 항-VEGF 항체 "베바시주맙 (BV)"은 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이것은 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93％ (대부분의 프레임워크 영역 포함)는 인간 IgG1로부터 유래되고, 서열의 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맙은 분자량이 약 149,000 달톤이고 글리코실화된다. 다른 항-VEGF 항체에는 미국 특허 번호 6884879 및 WO 2005/044853에 기재된 항체가 포함된다.

항-VEGF 항체 라니비주맙 또는 루센티스(LUCENTIS)® 항체 또는 rhuFab V2는 인간화, 친화도-성숙 항-인간 VEGF Fab 단편이다. 라니비주맙은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 발현 벡터 및 박테리아 발효에 있어서의 표준 재조합 기술 방법에 의해 생성된다. 라니비주맙은 글리코실화되지 않고 분자량이 약 48,000 달톤이다. WO98/45331 및 US20030190317을 참조한다.

혈관신생의 조절이상, 즉 병든 상태에서 과도한, 불충분한, 또는 달리 부적절한 신규 혈관의 성장 (예를 들어, 혈관신생의 위치, 시기 또는 개시가 의학적 관점에서 바람직하지 않음)은 비정상적인 혈관신생으로 이어질 수 있거나, 또는 혈관신생의 조절 이상은 비정상적인 혈관신생으로 이어져 질환에 걸린 상태, 즉 혈관신생 장애를 야기할 수 있다. 과도한, 부적절한 또는 제어되지 않은 혈관신생은 병든 상태를 유발시키거나 병든 상태를 악화시키는데 일조하는 새로운 혈관 성장이 있는 경우에 일어난다. 새로운 혈관은 병든 조직에 양분을 공급하고, 정상 조직을 파괴하고, 암의 경우, 새로운 혈관은 종양 세포가 순환계로 벗어나서 다른 기관에 머무르게 할 수 있다 (종양 전이). 비정상적인 혈관신생과 관련된 질환 상태 (즉, 혈관신생 장애)에는 비-신생물성 및 신생물성 상태 둘 모두, 예를 들어 암, 특히 혈관성 고형 종양 및 전이성 종양 (결장암, 유방암, 폐암 (특히, 소세포 폐암), 뇌암 (특히 교모세포종) 또는 전립선암 포함), 바람직하지 못하거나 이상한 비대증, 관절염, 류마티스 관절염 (RA), 염증성 장 질환 또는 IBD (크론병 및 궤양성 결장염), 건선, 판상 건선, 사르코이드증, 아테롬성동맥경화증, 아테롬성동맥경화판, 당뇨병성 및 기타 증식성 망막병증, 예를 들어 미숙아 망막병증, 수정체후 섬유증식증, 신생혈관성 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식 신생혈관증식, 각막 이식편 거부, 망막/융모막 신생혈관형성, 전방각 신생혈관형성 (피부홍조), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 증식증 (그레이브스병 포함), 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐고혈압, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예를 들어, 급성 발작/폐쇄성 두부 손상/외상과 관련된 부종), 활막 염증, 골화성 근염, 비후성 골 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 제3 유체 공간형성 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 근종, 조기 분만, 만성 염증, 예컨대 IBD, 신장 동종이식편 거부, 염증성 장 질환, 신증후군, 바람직하지 못하거나 이상한 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장 억제, 오슬러-웨버(Osler-Weber) 증후군, 화농성 육아종, 수정체후 섬유증식증, 경피증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 전자간증, 복수, 심낭 삼출 (예컨대 심막염과 관련된 삼출), 및 흉막 삼출이 포함된다.

본원에서 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 도중에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발생을 지연시키기 위해 사용된다.

"유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.

본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 목적하는 반응을 도출할 수 있는 본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력과 같은 요인들에 따라서 다양할 수 있다. 또한 치료 유효량은 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 치료적으로 유익한 효과가 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. 용어 "치료 유효량"은 포유동물 (일명 환자)에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 유효한 본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 길항제의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기 또는 중량을 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나; 암과 관련된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 암세포 성장을 억제하고/하거나 존재하는 암세포를 사멸시킬 정도로, 상기 약물은 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 한 실시양태에서, 치료 유효량은 성장 억제량이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 환자의 생존을 연장시키는 양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 환자의 무진행 생존을 개선시켜 주는 양이다.

"예방 유효량"은 목적하는 예방 결과 달성에 필요한 투여량 및 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 반드시 그런 것은 아니지만 전형적으로, 예방적 용량은 질환이 발생하기에 앞서 또는 질병의 초기 단계에서 대상체에게 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 보다 적다.

본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 저해하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 뉴클레오티드분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체를 포함), 및 하기 개시한 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함한다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양치사제는 종양 세포의 파괴를 야기한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (예를 들어, 합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (예를 들어, 그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (예를 들어, 합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 또한 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (예를 들어, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (제이에이치에스 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스톤 소재), 크레모포르-무함유 아브락산(ABRAXANE)™, 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너즈(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샤움버그 소재) 및 탁소테레(TAXOTERE)® 독세탁셀 (론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로란부실; 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (크셀로다(XELODA)®); 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 또한 상기 중 2가지 이상의 조합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다. 부가적인 화학요법제에는 항체 약물 접합체로서 유용한 세포독성제, 예컨대 메이탄시노이드 (예를 들어 DM1) 및 아우리스타틴, 예를 들어 MMAE 및 MMAF가 포함된다.

"화학요법제"에는 또한, 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 저하, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬제"가 포함되고, 이는 종종 전신성 치료 형태이다. 이들은 그 자체가 호르몬일 수 있다. 이것의 예는, 항에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜), 에비스타(EVISTA)® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)® 토레미펜; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 저해하거나 또는 그의 기능을 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 다른 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 디드로칼(DIDROCAL)® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사막스(FOSAMAX)® 알렌드로네이트, 아레디아(AREDIA)® 파미드로네이트, 스켈리드(SKELID)® 틸루드로네이트 또는 악토넬(ACTONEL)® 리세드로네이트; 및 또한 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로 중의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016이라고도 공지되어 있는, ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

"성장 억제제"가 본원에서 사용되는 경우, 이것은 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 통상적인 M기 차단제에는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 안트라시클린 항생제 독소루비신 ((8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온), 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지로까지 이어질 수도 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995)] (특히, p. 13)에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 모두 주목 나무에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목 나무에서 유래된 도세탁셀 (탁소테레®, 론-프랑 로러)은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세소관 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시켜서 세포에서의 유사분열 억제를 야기한다.

본원에서 사용된 용어 "환자"는 치료가 요망되는 모든 단일 동물, 보다 바람직하게는 포유동물 (이에는 비-인간 동물, 예를 들어 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류가 포함됨)을 지칭한다. 가장 바람직하게, 본원의 환자는 인간이다.

본원의 "대상체"는 하나 이상의 혈관신생 장애의 징후, 증상 또는 다른 적응증을 겪고 있거나 겪은 바 있는, 치료에 적격인 임의의 단일 인간 대상체 (환자 포함)이다. 대상체는 질환의 임의의 임상적 징후를 나타내지 않는 임상 연구 시험에 포함된 임의의 대상체, 역학 연구에 포함된 대상체, 또는 대조군으로 이용된 대상체를 포함한다. 대상체는 이전에 항암제로 치료받았을 수 있거나, 또는 그러한 치료를 받지 못했을 수 있다. 대상체는 본원의 치료가 시작될 때 사용되는 제2 의약에 대한 경험이 없을 수 있는데, 즉 대상체는 예를 들어 항신생물제, 화학요법제, 성장억제제, 세포독성제에 의한 "기저수준" (즉, 본원의 치료 방법에서 제1 용량의 항암제를 투여하기 전의 설정 시점, 예컨대 치료 시작 전 대상체를 스크리닝하는 날)의 치료를 이전에 받았던 적이 없을 수 있다. 이와 같이 "경험이 없는" 대상체가 일반적으로, 상기 제2 의약을 이용한 치료에 대한 후보인 것으로 고려된다.

용어 "유효량"은, 예를 들어 암을 비롯한 혈관신생 장애 또는 림프관신생 장애를 치료하는데 유효한 의약의 양을 지칭한다.

용어 "제약 제제"는 의약의 생물학적 활성이 유효하도록 해줄 수 있는 형태로 존재하고, 해당 제제이 투여되는 대상체에 대해 허용 가능하지 않은 수준으로 독성인 추가의 성분을 전혀 함유하지 않는 멸균 제제를 지칭한다.

"멸균" 제제는 무균 상태이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 존재하지 않는다.

"포장 삽입물"은 치료 제품 또는 의약의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되어 있으며 적응증, 사용법, 용량, 투여, 금기 사항, 이러한 포장 제품과 조합될 기타 치료 제품 및/또는 이러한 치료 제품 또는 의약의 사용에 관한 경고 등에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭한다.

"키트"는 적어도 1종의 시약, 예를 들어 혈관신생 장애를 치료하기 위한 의약 또는 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 패키지 또는 용기)이다. 제조품은 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 단위로서 판촉되거나 배급되거나 또는 판매된다.

의약(들)에 대해 반응하지 않을 목적으로, 1종 이상의 의약을 이용한 이전의 또는 최근의 치료로부터 "임상적으로 허용되지 않는 높은 수준의 독성"을 경험한 대상체는 경험이 풍부한 임상의에 의해 유의한 것으로 고려되는, 예를 들어 심각한 감염, 울혈성 심부전, 탈수초 (다발성 경화증으로 이어짐), 심각한 과민증, 신경병리학적 사례, 고도의 자가면역, 암, 예컨대 자궁내막암, 비-호지킨 림프종, 유방암, 전립선암, 폐암, 난소암, 또는 흑색종, 결핵 (TB) 등과 같은 그와 관련된 하나 이상의 부정적인 부작용 또는 유해 사례를 경험하게 된다.

"부정적인 부작용의 위험 감소"는, 본원의 길항제 치료로 인한 부작용의 위험이 이전에 투여된 의약을 동일 환자 또는 또 다른 환자에게 처리하여 관찰되는 위험보다 낮은 정도로 감소된 것을 의미한다. 이러한 부작용은 독성에 관하여 상기한 것들을 포함하고, 바람직하게는 감염, 암, 심부전 또는 탈수초이다.

"상관관계가 있다" 또는 "상관관계가 있는"은, 제1분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 임의의 방식으로 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제1분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 본원의 다양한 실시양태와 관련하여, 분석 검정의 결과를 이용하여 항암제, 예컨대 항-VEGF 항체를 사용한 특정 치료 요법이 수행되어야 하는지 여부를 결정할 수 있다.

III. 방법

본 발명은 항암제에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하는 방법, 항암 요법의 유효성을 모니터링하는 방법, 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하는 방법, 및 항암제의 용량을 최적화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계; (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및 (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계를 포함한다. 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소는 항암제에 반응할 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하여 준다. 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 증가는 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하여 준다. 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 변화는 그 용량을 유효 용량으로 확인하여 준다. 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 무변화는 그 용량을 최대 유효 용량으로 확인하여 준다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 환자에게 유효량의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 환자에게 유효량의 제2, 제3 또는 제4의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

A. 영상화 방법

개시된 방법 및 검정은 림프 기능 (예를 들어, 림프 맥동 주파수 또는 대량 림프 운반)을 검출함으로써 환자를 치료하기 위한 적절하거나 유효한 요법을 평가하는데 유용한 데이터 및 정보를 수득하기 위한 편리하고, 효율적이며, 잠재적으로 비용 효과적인 수단을 제공한다. 상기 방법은 다양한 영상화제 및 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 적합한 검출 방법 및 장치는 예를 들어 문헌 [Sharma et al., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 292:H3109-3118 (2007)]; [Sharma et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1131:13-36 (2008)], [Rasmussen et al., Curr. Opin. Biotech. 20: 74-78 (2009)] 및 PCT 공보 번호 WO 2008//025005 및 WO 2008/02500에 기재되어 있다. 본원에 기재된 방법에 의해, 예를 들어 조직 또는 피부 표면 아래 적어도 약 1 cm, 2 cm 또는 3 cm 깊이에 위치한 림프관을 비롯하여, 조직 또는 피부 표면의 깊숙이 아래에 위치하는 림프관을 영상화할 수 있다.

영상화제는 그러한 작용제가 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에 도달하도록 환자에게 투여되고, 이는 당업계에 공지되어 있는 방법 및 장치에 의해 검출될 수 있다. 영상화제는, 예를 들어 시린지 또는 카테터를 비롯한 임의의 적합한 수단을 통해, 그리고 예를 들어 피내, 피하 또는 근육내를 비롯한 임의의 적합한 경로를 통해 개체에게 투여될 수 있다. 영상화제는 예를 들어 염수 용액과 같은 용액 중에 적합한 농도로 희석될 수 있다. 예를 들어, 용액 중에 개질된 영상화제의 농도는 약 1 μM 내지 약 400 μM, 약 10 μM 내지 약 200 μM, 또는 약 25 μM 내지 약 100 μM일 수 있다. 임의의 적합한 영상화제의 양을 투여할 수 있다. 예를 들어, 투여되는 양은 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 75 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 50 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 25 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 10 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 5 mg, 또는 약 1 ㎍ 내지 약 1 mg일 수 있다.

림프계에서 영상화제를 여기시키기 위해, 여기 광원을 이용하여 표적화된 관심 영역에 걸쳐 조직 표면 상에 여기 광을 비출 수 있다. 적합한 광원의 예에는, 예를 들어 레이저 다이오드, 반도체 레이저 다이오드, 기체 레이저, 발광 다이오드 (LED), 또는 그의 조합이 포함된다. 일부 실시양태에서, 여기 광원은 연속파 광원, 즉 연속적인 빛의 강도를 방출하는 광원이다. 광원은 약 550 nm 내지 약 1000 nm, 약 600 nm 내지 약 950 nm, 약 700 nm 내지 약 900 nm, 또는 약 750 nm 내지 약 850 nm의 파장을 갖는 광을 방출할 수 있다. 이와 달리, 여기 광원은 시변 광원, 즉 빛의 강도가 변경되어 방출되는 광원일 수 있다. 여기 광원의 강도 변조는 예를 들어 정현파, 사각파, 또는 램프파 변조일 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기 광원은 특정 주파수 및 반복률에서 펄스형일 수 있다. 주파수 및 반복률은 또한 시간에 따라 변경될 수 있다. 여기 광원의 시간 변이는 본원에 기재된 방법과 연계되어 사용되는 영상화제의 수명의 약 10 내지 약 1000 배일 수 있다.

여기 광으로 조직 표면을 비추면, 환자에 투여된 영상화제가 형광을 방출한다. 형광 영상화제로부터의 방출물을 검출하거나 감지하기 위해 센서를 사용할 수 있다. 센서는 바람직하게는 형광 표적으로부터 방출된 형광을 검출할 수 있고, 매체로부터 반사된 여기 광을 검출할 수 있다. 한 실시양태에서, 센서는 전하 결합 카메라 (CCD)를 포함할 수 있다. 적합한 센서의 다른 예에는 비제한적으로, 게이팅 또는 비-게이팅 전자 증배 (EM)-CCD 또는 강화된 (ICCD) 카메라가 포함된다. 센서는 형광 광학 단층촬영 및 영상화에 요구되는 적절한 빛의 파장을 측정하는데 필요한 임의의 적합한 필터 또는 편광기를 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 영상화제로부터의 형광 방출물은 영상화제로부터 방출되는 빛의 영상을 연속적으로 수집하거나 취득하는 것에 의해 연속적으로 검출되어, 림프 구조를 통한 림프 추진의 일련의 실시간 영상 (즉 영화 또는 비디오)이 생성될 수 있다. 영상은 예를 들어 약 100밀리초 내지 약 30분, 약 1분 내지 약 20분, 또는 약 5분 내지 약 15분의 시간 동안 수집될 수 있다. 또한, 영상은 예를 들어 약 1밀리초 내지 약 5초, 약 10밀리초 내지 약 1초, 또는 약 100밀리초 내지 약 800밀리초의 임의의 적합한 통합 시간에 수집되거나 기록될 수 있다. 따라서, 시간 및 프레임 속도에 따라 수집된 영상은 100개의 영상 내지는 1,000개를 초과한 영상일 수 있다. 영상화제가 림프 구조를 통해 펌핑됨에 따라 그것을 추적하는 것에 의해, 림프 추진 및 기능이 양적으로 그리고 정확하게 측정될 수 있다. 또한, 기록된 영상의 순서는 림프 구조 (예를 들어, 림프관)를 통해 추진되거나 수송되는 하나 이상의 영상화제의 패킷 또는 무리의 영구적 광기록을 제공하며, 여기서 추가의 분석을 수행하여 림프 기능 (예를 들어, 림프 맥동 주파수 또는 대량 림프 운반과 같은 림프 운반)을 평가할 수 있다. 림프 맥동 주파수를 측량하기 위해, 고정된 관심 표적 부위 또는 영역을 형광 림프관 상에서 확인할 수 있다. 관심 표적 부위 또는 영역은 림프관을 따른 지점이며, 여기서 구체적으로 측정이 이루어질 수 있다. 이어서, 구체화된 관심 표적 부위 또는 영역에서의 형광 강도는 주어진 시간 동안 연속적으로 측정될 수 있다. 영상화제 패킷이 림프관을 통과함에 따라, 형광 강도에서 상응하는 스파이크 또는 피크가 측정될 수 있다. 이어서 림프관의 림프 맥동 주파수는 측정된 펄스 수를 측정 시간으로 나누는 것에 의해 측량될 수 있다. 예를 들어, 8개의 강도 피크가 5분에 걸쳐 측정된 경우, 펄스 주파수는 약 1.6 펄스/min과 같을 것이다. 따라서, 상기 개시된 방법은 림프 맥동 주파수를 평가하기 위한 정량적이고 비-침습적인 방법이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 단층촬영 영상화와 함께 사용될 수 있다.

당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 영상화제를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 적합한 영상화제의 예에는, 예를 들어 트리카르보시아닌 염료, 비스(카르보시아닌) 염료, 디카르보시아닌 염료, 인돌-함유 염료, 폴리메틴 염료, 아크리딘, 안트라퀴논, 벤즈이미다졸, 인돌레닌, 나프탈이미드, 옥사진, 옥소놀, 폴리엔, 포르핀, 스쿠아레인, 스티릴, 티아졸, 크산틴 또는 그의 조합이 포함된다. 적합한 영상화제에는 또한, 예를 들어 인도시아닌 그린, 알렉사플루오르® 염료 (인비트로젠(Invitrogen)); 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 610, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 635, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700 및 알렉사 플루오르 750, y 염료 (GE); Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, IRdye (리-코르(Li-Cor)); IRdye700, IRdye800, 퀀텀 도트(Quantum dot) (인비트로젠); Qdot565, Qdot585, Qdot605, Qdot625, Qdot655, Qdot705, Qdot800, 안지오센스(AngioSense)680 및 750, 안지오스파크(AngioSpark)680 및 750, 비보태그(VivoTag) 680 및 750 (비스엔(VisEn)), IRdye (시그마(Sigma)); IRdye740, IRdye707, IRdye743, IRdye648, IRdye814, IRdye638, IRdye762, IRdye711, IRdye784, IRdye701, IRdye712, IRdye768, IRdye683, IRdye695, IRdye668, 디피콜릴시아닌 (DIPCY), 형광 단백질: mCherry, IFP1.4, DsRed, HcRed, mPlum, mRFP (문헌 [Wang et al., 2008]에서 검토됨), X-사이트(X-Sight) 염료 (카레스트림 헬스(Carestream Health)); X-사이트 640, X-사이트 670, X-사이트 549 나노스피어, X-사이트 650 나노스피어, X-사이트 691 나노스피어, X-사이트 761 나노스피어, 로다민, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 디라이트(DyLight) (써모피셔(ThermoFishcer)); 디라이트549, 디라이트594, 디라이트633, 디라이트649, 디라이트680, 디라이트750, 디라이트800, 나일 레드(Nile red), CF 염료 (비오튬(Biotium)); CF680, CF750, CF770, 제노라이트(XenoLight) (캘리퍼(Caliper)); 제노라이트CF680, 제노라이트CF750, 제노라이트CF770, 제노플루오르(XenoFluor)680, 제노플루오르750, 트랜스플루오스피어스 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)): 543/620, 633/720, 633/760, 플루오스피어스 (몰레큘라 프로브스): 오렌지, 레드-오렌지, 레드, 카르민, 크림슨, 스칼렛, 다크 레드가 포함된다.

일부 실시양태에서, 영상화제는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜), 덱스트란 또는 알부민을 비롯한 담체에 접합된다.

당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 검출 장치를 본원에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 검출 장치는 개개의 림프관을 최소 1 mm의 영상 영역 및 3) 프레임 속도 => 0.5 Hz로 가시화하는 해상도를 갖는다. 적합한 장치의 전형적인 부품은, 예를 들어 광원 (LED, 백색 광, 레이저 등), 필터, 렌즈(들), 검출기 (CCD, iCCD, EMCCD, PMT 등) 및 프레임 글래버가 장착된 컴퓨터를 포함한다. 적합한 검출 장치는, 예를 들어 형광 내시경, 에피형광 현미경, 공초점 및 2-광자 현미경, 매트로영상화 시스템 및 전체 동물 영상화 시스템을 포함한다.

다른 당업계에 공지되어 있는 비-형광-기재의 영상화 방법을 본원에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 작용제를 적합한 담체에 접합하거나 유리 작용제로서 사용하여 발광 영상화 장치를 통해 림프 맥동 및 운반을 가시화하고 측정한다. 적합한 발광 영상화제에는, 예를 들어 루시페라제 및 브렛-Qdot(BRET-Qdot) (문헌 [Kosaka et al., Contrast Media and Mol. Im. DOI:10.1002/cmmi.395 (2010])가 포함된다.

일부 실시양태에서, 광음향 영상화제를 적합한 담체에 접합하거나 유리 작용제로서 사용하여 광음향 영상화에 의해 림프 맥동 및 운반을 가시화하고 측정한다 (문헌 [Song et al., Med. Phys. 36:3724-9 (2009)], [Erpelding et al., Radiology 256:102-10 (2010)], [Kim et al., Radiology 255:442-50 (2010)]). 적합한 광음향 영상화제에는, 예를 들어 에반스 블루 (문헌 [Song et al., Med. Phys. 36:3724-9 (2009)]), 메틸렌 블루 (문헌 [Erpelding et al., Radiology 256:102-10 (2010)]) 및 인도시아닌 그린 (문헌 [Kim et al., Radiology 255:442-50 (2010)])이 포함된다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 빛 간섭 단층촬영 (문헌 [McLaughlin et al., Cancer Res. 70:2579-84 (2010)]) 및 광 주파수 도메인 영상화 (OFDI) (문헌 [Vakoc et al., Nat. Med. 15:1219-24 (2009)])를 비롯한 당업계 공지의 다른 영상화 방법을 이용하여 림프관을 직접 관찰할 수 있다. 검출 및 감도를 증가시키기 위해, 조영제를 본 방법과 함께 사용할 수 있다.

다른 당업계에 공지되어 있는 비-광학 기재의 검출 장치를 본원에 기재된 방법에 사용할 수 있다 (문헌 [Clement and Luciani Eur. Radiol. 14:1498-1507 (2004)], [Barrett et al., Contrast Media and Mol. Img. 1:230-245 (2006)]). 일부 실시양태에서, 자기 공명 영상화 (MRI) 작용제를 사용하여 MRI에 의해 림프 맥동 및 운반을 가시화하고 측정한다 (문헌 [Motoyama et al., Surgery 141:736-47 (2007)], [Ruddel et al., Neoplasia 10:706-13 (2008)] 및 [Notohamiprodjo et al., Eur. Radiol. 19:2771-8 (2009)]). 적합한 영상화제에는, 예를 들어 산화철 입자 (문헌 [Motoyama et al., Surgery 141:736-47 (2007)]), 나노튜브 (문헌 [Ananta et al., Nano Lett. 9:1023-27 (2009)]), 가돌리늄-디메글루민 (문헌 [Notohamiprodjo et al., Eur. Radiol. 19:2771-8 (2009)]) 및 가돌리늄-기재의 나노튜브 (문헌 [Sitharaman and Wilson J. Nanomed. 1:291-5 (2006)])가 포함된다. MRI 작용제는 적합한 담체에 접합될 수 있거나, 또는 유리 작용제로서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 초음파-영상화제를 사용하여 초음파 영상화에 의해 림프 맥동 및 운반을 가시화하고 측정한다 (문헌 [Curry et al., Ann. Otol Rhinol Laryngol. 118:645-50 (2009)]). 적합한 초음파-영상화제에는, 예를 들어 퍼플루부탄 마이크로버블 (소나조이드(Sonazoid), 아머샴(Amersham))이 포함된다. 초음파-영상화제는 적합한 담체에 접합될 수 있거나, 또는 유리 작용제로서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 방사성핵종을 사용하여 양전자-방출 단층촬영 (PET), 단일-광자 방출 전산화 단층촬영 (SPECT) 또는 시분해 방사선촬영 영상화에 의해 림프 맥동 및 운반을 가시화하고 측정한다 (문헌 [Weiss et al., Eur. J. Nuc. Med. Mol. Img. 30:202-6 (2003)], [Mar et al., J. Nuc. Med. Tech 35:10-16 (2007)]). 적합한 방사성핵종에는, 예를 들어 Tc-99, F-18, Cu-64, I-124, Br-76, Br-77, C-11, In-111, I-123, Y-86, Cu-60, Cu-61 및 Zr-89가 포함된다. 방사성핵종은 적합한 담체에 접합될 수 있거나, 또는 유리 작용제로서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 전산화 단층촬영 (CT) 영상화제를 사용하여 전산화된 단층촬영 영상화에 의해 림프 맥동 및 운반을 가시화하고 측정한다 (문헌 [Suga et al., Radiology 230:543-552 (2004)], [Suga et al., Radiology 237:952-60 (2005)]). 적합한 CT 영상화제에는, 예를 들어 이오파미돌 (문헌 [Suga et al., Radiology 230:543-552 (2004)])이 포함된다. CT 영상화제는 적합한 담체에 접합될 수 있거나, 또는 유리 작용제로서 사용될 수 있다.

B. 추가의 방법

영상화제를 이용하는 상기의 본원에 기재된 방법에 더하여, 임상의는 항암제의 특정 투여량 계획의 유효성을 측정하기 위해 당업계에 공지되어 있는 임의의 여러 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 생체내 영상화 (예를 들어, MRI)를 이용하여, 종양 크기를 결정하고 임의의 전이를 확인하여, 요법의 비교적 유효한 반응성을 결정할 수 있다. 투여 요법은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 한 용량을 투여할 수 있거나, 여러 회분으로 나뉘어진 용량을 시간 경과에 따라 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 지시된 바에 비례하여 용량을 감소시키거나 증가시킬 수 있다.

당업계 통상의 기술을 갖는 의사는 항암제의 특정 유형과 같은 인자에 따라 요구되는 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사는 제약 조성물에 사용되는 항-NRP2 항체, 항-VEGF-C 항체, 또는 항-VEGF-A 항체와 같은 항암제의 용량을 목적하는 치료 효과를 달성하는데 요구되는 것보다 낮은 수준으로 시작하여 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 길항제의 주어진 용량 또는 치료 요법의 유효성은, 예를 들어 표준 효능 측정치를 이용하여 환자에서 징후 및 증상을 평가하여 결정할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 대상체는 항-NRP2 항체, 항-VEGF-C 항체 또는 항-VEGF-A 항체와 같은 동일한 항암제로 적어도 2회 치료된다. 따라서, 초기 및 제2 길항제 노출은 바람직하게는 동일한 길항제로 수행되고, 보다 바람직하게는 모든 길항제 노출이 동일한 길항제로 수행되며, 즉, 처음 2회의 노출, 바람직하게는 모든 노출의 경우 치료가 1가지 유형의 항암제, 예를 들어, VEGF에 결합하는 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체, 예를 들어 모두 베바시주맙으로 수행된다.

본원에서 언급된 모든 본 발명의 방법에서, 항암제 (예컨대 VEGF에 결합하는 항체)는 접합되지 않은 것, 예컨대 네이키드 항체일 수 있거나, 또는 예를 들어 반감기 개선과 같은 추가의 유효성을 위해 또 다른 분자와 접합될 수 있다.

본원의 한 바람직한 항암제는 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 예를 들어 항-VEGF 항체, 바람직하게는 베바시주맙이다.

또 다른 실시양태에서, VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)는 대상체에 투여되는 유일한 의약이다.

한 실시양태에서, 길항제는 항-VEGF 항체로, 이는 매 1, 2, 3 또는 4주마다 약 100 또는 400 mg의 용량으로 투여되거나, 또는 매 1, 2, 3 또는 4주마다 약 1, 3, 5, 10, 15 또는 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 용량은 단일 용량으로서 또는 다중 용량 (예를 들어, 2 또는 3 용량)으로서 투여, 예컨대 주입될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 진단 단계 이후 방사선 촬영 및/또는 MRI와 같은 영상화 기술을 이용하여 종양 크기의 감소를 측정하는 단계, 첫번째 길항제를 투여한 후 방사선 촬영 및/또는 MRI와 같은 영상화 기술을 이용하여 대상체에서 종양 크기의 감소를 측정하는 단계, 두번째 길항제를 투여한 후 첫번째와 두번째에 대상체에서의 영상화 소견을 비교하는 단계, 및 두번째에서의 스코어가 첫번째에서보다 낮은 경우, 길항제의 투여를 계속하는 단계를 포함하는, 암 진단을 받은 대상체에 항암제 (예를 들어, 항-VEGF 항체) 투여를 계속할 것인지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.

추가 실시양태에서, 반응의 수준이 혈관신생 장애를 치료하는데 유효한지를 결정하기 위해 투여 단계 이후 대상체의 치료에 대한 반응을 시험하는 단계가 치료 방법에 포함된다. 예를 들어, 투여후 영상화 (방사선촬영 및/또는 MRI) 스코어를 시험하고, 이것을 투여 이전에 수득된 기저수준 영상화 결과와 비교하여 이것이 변화되었는지 및 얼마나 변화되었는지를 측정함으로써 치료가 유효한지의 여부를 결정하는 단계가 포함된다. 이러한 시험은 임의의 부분적 또는 완전한 차도의 유지를 결정하기 위해 투여 이후에 다양한 예정되거나 예정되지 않은 시간 간격으로 반복될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-VEGF 항체와 같은 VEGF 길항제가 아닌 다른 어떤 의약도 암 치료를 위해 대상체에게 투여하지 않는다.

본원의 임의의 방법에서, 항암제는 유효량의 제2 의약과 함께 투여될 수 있다. 적합한 제2 의약에는, 예를 들어 항림프관신생제, 항혈관신생제, 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제 또는 그의 조합이 포함된다.

모든 이들 제2 의약은 서로 조합되어 사용될 수 있거나 또는 그 자체가 제1 의약과 함께 사용될 수 있으므로, 본원에 사용된 바와 같은 표현 "제2 의약"은 이것이 제1 의약에 추가되는 유일한 의약이라는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 제2 의약은 단일 의약일 필요는 없고, 1종 초과의 이러한 약물로 이루어지거나 이것을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 이들 제2 의약은 일반적으로 이전에 사용되던 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나 또는 지금까지 사용되던 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다. 이러한 제2 의약이 조금이라도 사용되는 경우, 바람직하게는 이들은 특히 제1 의약의 초기 투여 이후의 투여시에 제1 의약이 존재하지 않는 경우보다 더 적은 양으로 사용되어, 이에 의해 야기되는 부작용을 제거하거나 감소시킨다.

본원에 기재된 재치료 방법에서, 제2 의약이 길항제 노출과 함께 유효량으로 투여되는 경우, 이것은 임의의 노출, 예를 들어 단지 1회의 노출, 또는 1회 초과의 노출과 함께 투여된다. 한 실시양태에서, 제2 의약은 초기 노출과 함께 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 제2 의약은 초기 노출 및 제2 노출과 함께 투여된다. 추가 실시양태에서, 제2 의약은 모든 노출과 함께 투여된다. 예컨대 스테로이드의 초기 노출 후 이러한 제2 의약의 양을 감소시키거나 없애서 부작용을 갖는 작용제, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 및 시클로포스파미드에 대한 대상체의 노출을 감소시키는 것이 바람직하다.

제2 의약의 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공동-투여 (동시 투여), 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 여기서 바람직하게는 둘 모두의 (또는 모든) 활성제 (의약)가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는데에는 일정 기간이 있다.

항암제는 비경구, 국소, 피하, 복강내, 폐내, 비내 및/또는 병변내 투여를 비롯하여, 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내 (i.v.), 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 경막내 투여가 또한 고려된다. 또한, 항암제는 펄스 주입에 의해, 예를 들어 감소되는 항암제 용량으로 적합하게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투약은 정맥내 또는 피하 및 보다 바람직하게는 정맥내 주입(들)에 의해 이루어진다.

항암제가 다중 노출에 의해 제공될 경우, 각 노출은 동일하거나 상이한 투여 수단에 의해 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 각 노출은 정맥내 투여에 의한다. 또 다른 실시양태에서, 각 노출은 피하 투여에 의해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 노출은 정맥내 및 피하 투여 둘 모두에 의해 제공된다.

한 실시양태에서, 항-VEGF 항체와 같은 항암제는 정맥내 투입 또는 볼루스 보다 오히려 느린 정맥내 주입으로서 투여된다. 예를 들어, 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론과 같은 스테로이드 (예를 들어, 약 80-120 mg i.v., 보다 구체적으로 약 100 mg i.v.)는 항-VEGF 항체의 임의의 주입 전 약 30분에 투여된다. 항-VEGF 항체는, 예를 들어 전용 경로를 통해 주입된다.

항-VEGF 항체에 대한 다중 용량 노출의 초기 용량에 대해, 또는 노출이 단지 1회분 용량만을 포함하는 경우 단일 용량에 대해서는 이러한 주입을 약 50 mg/시의 속도로 시작하는 것이 바람직하다. 이는, 예를 들어 약 30분마다 약 50 mg/시의 속도씩 단계적으로 상승시켜 최대 약 400 mg/시가 되도록 할 수 있다. 그러나, 대상체가 주입-관련 반응을 경험하게 되면, 주입 속도를 예를 들어 현 속도의 절반으로, 예를 들어 100 mg/시에서 50 mg/시로 줄이는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 용량의 항-VEGF 항체 (예를 들어, 약 1000-mg 총 용량)의 주입은 약 255분 (4시간 15분)에 완료된다. 임의로, 주입을 시작하기 약 30분 내지 60분 전에 대상체에게 아세트아미노펜/파라세타몰 (예를 들어 약 1 g) 및 디펜히드라민 HCl (예를 들어 약 50 mg 또는 등가 용량의 유사 작용제)을 예방적으로 경구 치료한다.

총 노출을 달성하기 위해 항-VEGF 항체를 1회 초과 주입 (용량)으로 투여하는 경우에는, 이러한 주입 실시양태에서 제2 또는 후속 항-VEGF 항체 주입을 초기 주입보다 고속으로, 예를 들어 약 100 mg/시로 시작하는 것이 바람직하다. 이러한 속도는, 예를 들어 약 30분마다 약 100 mg/시의 속도씩 단계적으로 상승시켜 최대 약 400 mg/시가 되도록 할 수 있다. 주입-관련 반응을 경험하는 대상체는 주입 속도를 현 속도의 절반으로, 예를 들어 100 mg/시에서 50 mg/시로 줄이는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 제2 또는 후속 용량의 항-VEGF 항체 (예를 들어, 약 1000-mg 총 용량)의 주입은 약 195분 (3시간 15분)에 완료된다.

바람직한 실시양태에서, 항암제는 항-VEGF 항체이고, 약 0.4 내지 4 그램의 용량으로 투여되며, 보다 바람직하게는 항체는 약 한 달의 기간 내에 1 내지 4 용량의 빈도로 약 0.4 내지 1.3 그램의 용량으로 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 용량은 약 500 mg 내지 1.2 그램이고, 다른 실시양태에서는 약 750 mg 내지 1.1 그램이다. 이러한 측면에서, 길항제는 바람직하게는 2 내지 3 용량으로 투여되고/거나 약 2 내지 3주의 기간 내에 투여된다.

한 실시양태에서, 대상체는 암 치료를 위해 이전에 결코 어떤 약물(들)도 투여받은 적이 없다. 또 다른 실시양태에서, 대상체 또는 환자는 암 치료를 위해 이전에 1종 이상의 의약(들)을 투여받은 적이 없다. 추가 실시양태에서, 대상체 또는 환자는 이전에 투여받았던 1종 이상의 의약에 대해 반응하지 않았다. 대상체가 반응하지 않을 수 있는 그러한 약물에는, 예를 들어 항신생물제, 화학요법제, 세포독성제 및/또는 성장 억제제가 포함된다. 보다 특히, 대상체가 반응하지 않을 수 있는 약물에는 VEGF 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체가 포함된다. 추가 측면에서, 그러한 항암제에는 항체 또는 이뮤노어드헤신이 포함되며, 이전에 반응하지 않았던 대상체에 대한 본 발명의 1종 이상의 항체 또는 이뮤노어드헤신을 이용한 재치료가 고려된다.

IV. 항암제로의 치료

길항제로의 치료에 대해 가장 반응성이거나 감수성인 환자 집단이 확인되면, 항암제를 단독으로 또는 다른 의약과 조합하여 치료하여 암을 개선시킨다. 예를 들어, 이러한 치료는 종양 크기 또는 무진행 생존을 감소시킬 수 있다. 또한, 항암제 및 적어도 1종의 제2 의약(들)의 조합 치료는 환자에게 바람직하게는 부가적인, 보다 바람직하게는 상승작용적인 (또는 부가적인 것보다 더 큰) 치료 이점을 가져다준다. 바람직하게는, 이러한 조합 방법에서 제2 의약의 적어도 1회의 투여 및 항암제의 적어도 1회의 투여 사이의 시간은 약 1개월 이하, 보다 바람직하게는 약 2주 이하이다.

의학계의 당업자는 항암제에 대한 환자의 반응 가능성을 진단한 후 치료 유효량의 항암제를 상기 환자에게 투여하는 것에 대한 정확한 방식은 담당의의 판단에 의할 것임을 인식할 것이다. 투여량, 다른 작용제와의 조합, 투여 시기 및 빈도 등을 비롯한 투여 방식은 이러한 항암제에 대한 환자의 반응 가능성의 진단 및 또한 환자의 상태 및 병력에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 항암제에 대해 상대적으로 감수성이지 않을 것으로 예상되는 장애 진단 환자라도 항암제에 대한 환자의 반응성을 변경시킬 수 있는 작용제를 비롯하여 그러한 치료, 특히 다른 작용제와의 조합 치료로부터 유익함을 얻을 수 있다.

항암제를 포함하는 조성물은 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제제화되고, 용량에 따라 분배되고, 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 인자는 치료할 장애의 특정 유형, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 혈관신생 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 가능한 부작용, 길항제의 유형, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 진료의에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 투여될 항암제의 유효량은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이다.

일반 명제로서, 비경구 투여되는 용량 당 항암제의 유효량은 약 20 mg 내지 약 5000 mg의 범위일 것이다 (1회 이상의 투여량에 의함). 항체, 예컨대 항-VEGF 항체의 경우 예시적인 투여 요법은 매 1, 2, 3 또는 4주마다 100 또는 400 mg을 포함하거나, 또는 매 1, 2, 3 또는 4주마다 약 1, 3, 5, 10, 15 또는 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 상기 용량은 단일 용량으로서 또는 다중 용량 (예를 들어, 2 또는 3 용량)으로서 투여, 예컨대 주입될 수 있다.

그러나, 상기 주지된 바와 같이, 이와 같이 제안된 항암제의 양은 수많은 치료적 판단의 대상이다. 적절한 용량을 선택하고 스캐줄을 작성하는데 있어서의 주요 인자는 상기 표시된 바와 같은 수득된 결과이다. 일부 실시양태에서, 항암제는 가능한 한 첫번째 징후, 진단, 외양 또는 장애의 발생에 가깝게 투여된다.

항암제는 비경구, 국소, 피하, 복강내, 폐내, 비내 및/또는 병변내 투여를 비롯하여, 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 경막내 투여가 또한 고려된다. 또한 길항제는 펄스 주입에 의해, 예를 들어 감소되는 길항제 용량으로 적합하게 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는, 투약은 정맥내 주사에 의해 이루어진다.

상기 주지된 바와 같이, 제2 의약을 본원의 항암제와 함께 투여할 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 동시 투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 이때 바람직하게는 둘 모두의 (또는 모든) 활성제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다.

항암제를 상기 주지된 바와 같은 종래의 경로에 의해 환자에게 투여하는 것 이외에도, 본 발명은 유전자 요법에 의한 투여를 포함한다. 항암제를 코딩하는 핵산을 이와 같이 투여하는 것은 "유효량의 항암제 투여"라는 표현에 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성시키기 위한 유전자 요법의 이용에 관한 WO 1996/07321을 참조한다.

핵산 (임의로 벡터에 함유된 것)을 생체내 및 생체외에서 환자의 세포에 도입하기 위한 2가지 주요 접근법이 존재한다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 통상적으로 길항제가 필요한 부위에서 환자에게 직접 주사된다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 떼어내고, 핵산을 이들 단리된 세포에 도입하고, 변형된 세포를 직접 또는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화시켜 환자에게 투여한다 (예를 들어 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 살아있는 세포에 도입하는 다양한 기술이 이용가능하다. 이러한 기술은 핵산이 시험관내 배양된 세포 내로 전달되는지 또는 의도한 숙주의 세포로 생체내 전달되는지의 여부에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포로 시험관내 전달하는데 적합한 기술은 리포솜, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 이용을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 일반적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예컨대 아데노바이러스, 제I형 단순 포진 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기재의 시스템 (유전자의 지질 매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 사용한 형질감염을 포함한다. 일부 상황에서는, 핵산 공급원에 표적 세포에 대해 특이적인 작용제, 예를 들어 표적 세포상의 세포 표면 막 단백질에 특이적인 항체, 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드 등을 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜을 사용하는 경우에는, 세포내 이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포 유형에 대해 지향성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화되는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질을 표적화하고/하거나 이것의 흡수를 용이하게 하는데 이용할 수 있다. 수용체-매개 세포내 이입의 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., PNAS USA 87:3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자-표식 및 유전자 요법 프로토콜은, 예를 들어 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)] 및 WO 1993/25673에 기재되어 있다.

항암제는 항암 특성을 갖는 적어도 1종의 추가의 화합물과 함께 제약 조합 제제 중에서 조합될 수 있거나, 또는 조합 요법으로서의 투약 요법으로 조합될 수 있다. 제약 조합 제제 또는 투여 요법의 적어도 1종의 추가의 화합물은 바람직하게는 VEGF 길항제 조성물에 대해 상보적 활성을 지녀, 서로 불리한 영향을 미치지 않는다.

적어도 1종의 추가의 화합물은 화학요법제, 세포독성제, 시토카인, 성장 억제제, 항호르몬제, 항혈관신생제, 항림프관신생제 및 그의 조합일 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다. VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)를 함유하는 제약 조성물은 또한 치료 유효량의 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

한 측면에서, 제1 화합물은 항-VEGF 항체이고, 적어도 1종의 추가의 화합물은 항-VEGF 항체 이외의 치료 항체이다. 한 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 화합물은 암 세포 표면 마커와 결합하는 항체이다. 한 실시양태에서, 적어도 1종 이상의 추가의 화합물은 항-HER2 항체, 트라스투주맙 (예를 들어, 헤르셉틴®, 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.), 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)이다. 한 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 화합물은 항-HER2 항체, 페르투주맙 (옴니타르그(Omnitarg)™, 제넨테크, 인크., 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재, US6949245 참조)이다. 한 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 화합물은 항체 (네이키드 항체 또는 ADC)이고, 추가의 항체는 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 그 초과의 항체로, 이러한 (네이키드 또는 ADC로서의) 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 그 초과의 항체의 조합은 혈관신생 장애를 치료하는데 유효하다.

본 발명에 따른 다른 치료 요법은, VEGF-길항제 항암제 (및 비제한적으로 방사선 요법 및/또는 골수 및 말초 혈액 이식을 포함) 및/또는 세포독성제, 화학요법제, 또는 성장 억제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태 중 하나에서, 화학요법제는 예를 들어 시클로포스파미드, 히드록시다우노루비신, 아드리아마이신, 독소루비신, 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)™), 프레드니솔론, CHOP, CVP 또는 COP, 또는 면역요법제, 예컨대 항-PSCA, 항-HER2 (예를 들어, 헤르셉틴®, 옴니타르그™)와 같은 작용제 또는 작용제의 조합이다. 조합 요법은 동시 또는 순차 요법으로서 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합물은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공동투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 이때 바람직하게는 둘 모두의 (또는 모든) 활성제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다.

한 실시양태에서, 항-VEGF 항체를 이용한 치료는 본원에서 확인된 항암제와, 1종 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제를 조합 투여 (이에는 상이한 화학요법제의 칵테일을 공동투여하는 것이 포함됨)하는 것을 포함한다. 화학요법제에는 탁산 (예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라시클린 항생제가 포함된다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 전문가에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용될 수 있다. 상기 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케줄은 또한 문헌 ["Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md]에 기재되어 있다.

상기한 공동투여되는 작용제 중 임의의 것에 대한 적합한 투여량은 현재 이용되고 있는 것이며, 새로 확인된 작용제 및 기타 화학요법제 또는 치료제의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 감량될 수 있다.

조합 요법은 "상승작용"을 제공할 수 있고, "상승작용적"이라는 것, 즉 활성 성분들이 함께 사용되는 경우에 달성되는 효과가 이러한 화합물을 개별적으로 사용할 때 달성되는 효과의 합보다 더 우수하다는 것이 입증될 수 있다. 상승작용적 효과는 활성 성분들이 (1) 공동-제제화되어 투여되거나 조합된 단위 투여 제제 중에서 동시에 전달되는 경우, (2) 별개의 제제로서 교대로 전달되거나 동시에 전달되는 경우, 또는 (3) 일부 대체 요법으로 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우의 상승작용적 효과는 화합물들이 순차적으로 투여되거나 전달되는 경우, 예를 들어 별개의 시린지에서 상이한 주사로 순차적으로 투여되거나 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는 유효 투여량의 각 활성 성분이 순차적으로, 즉 연속적으로 투여되지만, 조합 요법에서는 유효 투여량의 2종 이상의 활성 성분들이 함께 투여된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 추가의 치료제의 적절한 투여량은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, VEGF 길항제 및 추가의 작용제가 예방 목적으로 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 VEGF 길항제 및 추가의 작용제에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의존적일 것이다. VEGF 길항제 및 추가의 작용제는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. VEGF 길항제는 전형적으로 상기한 바와 같이 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 20 mg/㎡ 내지 600 mg/㎡의 추가의 작용제가, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의하거나 또는 연속 주입에 의하든지, 환자에의 투여를 위한 초기 후보 투여량이다. 한가지 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 인자에 따라, 약 20 mg/㎡, 85 mg/㎡, 90 mg/㎡, 125 mg/㎡, 200 mg/㎡, 400 mg/㎡, 500 mg/㎡ 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라 목적하는 질환 증상이 억제될 때까지 치료를 지속한다. 따라서, 약 20 mg/㎡, 85 mg/㎡, 90 mg/㎡, 125 mg/㎡, 200 mg/㎡, 400 mg/㎡, 500 mg/㎡, 600 mg/㎡ (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 2, 3, 4, 5 또는 6주마다 투여될 수 있다 (예를 들어 환자가 추가의 작용제를 약 2 내지 약 20, 예를 들어 약 6 용량으로 제공받을 수 있도록 함). 초기의 보다 높은 로딩 용량에 이어 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.

V. 제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 길항제의 치료 제제는, 목적하는 정도의 순도를 갖는 길항제를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 저장하도록 제조된다. 제제에 관한 일반적인 정보에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press]; [A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania.]; [Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York]; [Lieberman et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York]; 및 [Lieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York], [Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker]을 참조한다.

허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

예시적인 항-VEGF 항체 제제가 미국 특허 번호 6,884,879에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 1회용 바이알 내에 25 mg/mL로 제제화된다. 특정 실시양태에서, 100 mg의 항-VEGF 항체는 240 mg의 α,α-트레할로스 2수화물, 23.2 mg의 인산나트륨 (1염기성, 1수화물), 4.8 mg의 인산나트륨 (2염기성 무수), 1.6 mg의 폴리소르베이트 20, 및 주사용수, USP로 제제화된다. 특정 실시양태에서, 400 mg의 항-VEGF 항체는 960 mg의 α,α-트레할로스 2수화물, 92.8 mg의 인산나트륨 (1염기성, 1수화물), 19.2 mg의 인산나트륨 (2염기성 무수), 6.4 mg의 폴리소르베이트 20, 및 주사용수, USP로 제제화된다.

피하 투여에 적합한 동결건조된 제제는 예를 들어 미국 특허 번호 6,267,958 (Andya et al.)에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제제는 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제가 본원에서 치료될 포유동물에게 피하 투여될 수 있다.

길항제의 결정화된 형태도 고려된다. 예를 들어, US 2002/0136719A1 (Shenoy et al.)을 참조한다.

본원에서의 제제는 또한 1종 초과의 활성 화합물 (상기 언급된 바와 같은 제2 의약), 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수도 있다. 이러한 의약의 유형 및 유효량은, 예를 들어 제제 중에 존재하는 VEGF 길항제의 양 및 유형, 및 대상체의 임상적 파라미터에 따라 달라진다. 바람직한 이러한 제2 의약은 상기 언급되어 있다.

활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

VI. 키트

또한 본 발명은 림프 기능의 검출에 사용하기 위한 키트 또는 제조품을 제공한다. 이러한 키트는 암에 걸린 대상체가 항암제에 유효하게 반응할 것인지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 키트는 방법에 사용되는 별개의 요소 중 하나를 각각 포함하는 1개 이상의 용기 수단, 예컨대 바이알, 튜브 등을 가까이 모아 수용하도록 구획화된 운반 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 용기 수단 중 하나는 영상화제를 포함할 수 있다.

이러한 키트는 전형적으로 상기 기재된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용 지침서를 갖는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 1개 이상의 다른 용기를 포함할 것이다. 조성물이 특정 용도로 사용된다는 것을 나타내는 라벨이 용기상에 존재할 수도 있고, 라벨이 생체내 또는 시험관내 사용, 예컨대 상기한 사용에 관한 지시 내용을 나타낼 수도 있다.

본 발명의 키트는 수많은 양태를 갖는다. 전형적인 양태는 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 담긴 조성물을 포함하는 키트로, 조성물은 영상화제를 포함하며, 상기 용기 상의 라벨은 조성물이 림프 맥동 주파수에 사용될 수 있음을 나타내고, 키트는 림프 맥동 주파수 검출을 위해 영상화제를 사용하는 것에 대한 지침서를 포함한다. 키트는 영상화제의 제조 및 투여를 위한 한 세트의 지침서 및 물질을 추가로 포함할 수 있다.

키트의 다른 임의적인 성분으로는 1종 이상의 완충제 (예를 들어, 희석 완충제 등), 담체와 같은 기타 시약 (예를 들어, 덱스트란, 알부민)이 포함된다. 키트는 또한 키트를 이용하여 얻은 결과를 해석하기 위한 지침서를 포함할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 설명을 위해 제공되는 것이지, 청구하고 있는 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다.

실시예 1: 물질 및 방법

동물:

찰스 리버 래보러토리(Charles River Laboratory)의 암컷 Balb-c 누드 마우스를 6-8주령의 것으로 사용하였다. 기저수준 맥동 주파수 및 림프절 로딩 속도를 확립하기 위해, 본 발명자들은 비-종양 보유 마우스를 영상화하였다. 일부 경우에, 마우스에 대해 맥동을 추적 영상화, 즉, 동일한 마우스를 7일의 기간에 걸쳐 매일 영상화하였다. 마우스를 2％ 이소플루란으로 마취시키고, 실험 기간동안 37℃로 유지시켰다. 펄스오엑스(PulseOx) 프로브를 넓적다리 (주사 부위의 반대편)에 부착하여 맥동 검정 구동 전에 심박수를 모니터링하였다.

영상화제:

모든 실험을 위해 1 ml 멸균 PBS 중의 덱스트란 70 kd (몰레큘라프로브스)에 접합된 5 mg 알렉사플루오르680을 이용하여 형광 염료를 주사하였다.

림프 맥동 주파수 검정:

28 ½ 게이지 바늘이 포함된 3/10 cc 시린지 (벡톤 디킨슨(Beckton Dickinson))를 이용하여 염료를 전달하였다. 염료 15 ㎕ 볼루스를 꼬리 기저부 근처, 직장 5 mm 측부에 피내 주사하였다. 주사 부위가 약간 불룩해졌고, 이어서 5분 이내에 서혜 림프절로 이어지는 림프관을 통해 염료가 가시적으로 배액되었다.

Cy5.5 레드 필터 세트 (크로마(Chroma)), 할로겐 광원 (엑스포 익사이트 시리즈(ExFo Excite Series) 120), 4x 대물 렌즈 (올림푸스(Olympus)) 및 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 (S97827, 올림푸스)가 장착된 에피형광 현미경 (프레리 테크놀로지스(Prairie Technologies))을 이용하여 에피-형광 현미경검사 펄스형 흐름 활동을 관찰하였다. 마우스를 염료 주사 직후 대물 렌즈 아래의 가열된 플랫폼으로 옮겼다. 동물을 측면으로 눕혀 위치시켜, 서혜 림프절로부터 축 림프절로의 염료가 가득 찬 림프관이 노출되게 하였다. 관을 따라 약 5 mm의 구획을 펄스형 림프 흐름 (즉, 림프 맥동 주파수)을 영상화하기 위한 관심 영역으로 확인하였다. 이어서 이 구획을 포즈 변경이 가능한 유리 슬라이드로 가볍게 덮어 편평한 표면을 제공하고 공기가 찬 인위적 구조를 감소시켰다. 비디오 수집 이전에 안정을 위해 10분 동안 맥동 및 심박수를 모니터링하였다 (펄스오엑스). 마취 동안 단계를 헤아려보고, 동물의 체온을 37℃로 유지시키기 위해 열을 조절하였다.

픽쳐프레임(PictureFrame) 소프트웨어 (옵트로닉스(Optronics))를 이용하여 저속 촬영 설정 (282 ms 노출, 프레임간 지연 없음, 총 획득 시간 5분)으로 맥동의 디지털 비디오 (5분)를 수득하였다. 데이터를 기록된 저속 촬영 비디오로부터 오프 라인으로 분석하였다.

대량 림프 운반 검정:

염료를 꼬리 기저부 근처, 직장 5 mm 측부에 피내 주사 부위에 이식된 카테터에 부착된 주입 펌프로 전달하였다. 카테터는 3/10 cc, 28 ½ 게이지 (BD)로부터 바늘 끝을 잘라내고, 75 ㎕의 염료가 로딩되는 마이크로-레나탄 (브레인트리 사이언티픽(Braintree Scientific)) 배관에 위치시켜 준비하였다.

전체 동물의 근적외선 형광 (NIRF) 영상화된 서혜 림프절로의 대량 림프 운반을 코닥(Kodak) 4000FX 프로 NIRF 영상화 시스템을 이용하여 관찰하였다. 카테터를 이식한 후, 마우스를 코닥 영상화 플랫폼으로 옮기고, 카테터를 외부의 주입 펌프 쪽으로 경로화하였다.

영상 영역 (FOV) 내에 서혜 림프절 및 축 림프절로 이어지는 관이 포획되도록, 마우스를 영상화 표면 상에서 그의 측면 방향으로 위치시켰다.

주사 부위로부터 서혜 림프절에 이어 축 림프절로의 운반을 코닥 영상화 소프트웨어를 이용하여 수집하였다. 저속 촬영 설정은 2초 노출, 15초 간격, 21.5 mm FOV, ex 650 nm/em 700 nm, 총 획득 시간 30분으로 설정하였다. 운반 기록을 시작하고, 동시에 펌프 주입 (5 ㎕/min)을 개시하였다. 데이터를 기록된 저속 촬영 영상으로부터 오프 라인으로 분석하였다.

영상 분석/정량화:

코닥 시스템에 수집된 영상을 매트랩(MatLab)의 이용 관행을 이용하여 tiff 포맷으로 전환시켰다. 맥동 주파수 및 대량 림프 운반 둘 모두의 측정을 위해, NIH 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 분석에 사용하였다.

맥동 주파수를 결정하기 위해, 영상 영역을 통한 림프 운동을 분명하게 보여주는 관의 구획에 걸쳐 관심 영역 (ROI)을 끌어 두었다. ROI를 통해 림프가 안/팎으로 흐름에 따른 강도에서의 변화를 타임시리즈애널라이저(TimeSeriesAnalyzer) (NIH 이미지제이를 통해 이용가능한 플러그인)를 이용하여 전체 스택에 걸쳐 측정하였다. 생성된 평균 강도 값을 시간의 경과에 따라 엑셀로 송출하여 플롯팅하였다. 결과물인 맥동 자취를 5분의 영상 순서에 걸쳐 존재하는 피크의 수를 계수하여 정량화하였다.

염료의 대량 로딩 속도를 결정하기 위해, ROI를 직접적으로 서혜 림프절에 끌어 두었다. 림프가 절에 로딩됨에 따른 강도에서의 변화를 타임시리즈애널라이저 (NIH 이미지제이를 통해 이용가능한 플러그인)를 이용하여 전체 영상 스택에 걸쳐 측정하였다. 생성된 평균 강도 값을 시간의 경과에 따라 엑셀로 송출하여 플롯팅하였다. 피크까지의 시간, 최대 로딩 속도 및 dF/F를 평균 강도 값으로부터 계산하였다.

도 1은 림프 맥동 주파수를 측정한 림프 기능 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 1a는 15 ㎕ 볼루스의 염료를 주사한 후 관을 통한 펄스형 림프 운동의 대표적인 시간대별 영상을 나타낸다. 도 1b는 약 24 사례/5 min (n = 6 동물)의 기저수준 활동을 나타낸다.

도 2는 영상화 시작시 꼬리 기저부 근처에 5 ㎕/min으로 15분 염료를 주입한 후 서혜 림프절로의 대량 림프 운반을 측정한 림프 기능 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 2a는 서혜 림프절에 이은 축 림프절의 초기 로딩을 보여주는 대표적인 시간대별 영상을 나타낸다. 도 2b는 기저수준 로딩 속도 및 서혜 림프절의 최대 신호 강도까지의 시간을 나타낸다, n = 4 동물.

실시예 2: 항암제의 효능을 모니터링하기 위한 림프 기능의 측정

본 실시예는 림프 기능 (예를 들어, 림프 맥동 주파수 및 대량 림프 운반)을 측정하는 것에 의한 항암제 (예를 들어, 항-VEGF-C 또는 항-NRP2)의 효능의 모니터링을 보여준다.

암컷 Balb-c 누드 마우스를 다음과 같은 치료 그룹으로 무작위화하였다.

1) 대조군-종양 무

2) 대조군-종양

3) 항-VEGFC 40 mg/kg, IP, 100 ㎕, 1x/주

4) 항-VEGF 10 mg/kg IP, 100 ㎕, 1x/주

5) 항-NRP2 40 mg/kg, IP, 100 ㎕, 1x/주

C6 래트 교모세포종 세포 (200 ㎕ PBS 중 5.0 x 10⁵개 세포)를 마우스의 꼬리 기저부, 마우스의 우측 귀, 또는 꼬리 기저부의 주사 부위 위 대략 20 mm의 등의 가운데에 피하 이식하였다. 이어서 마우스를 비치료하거나, 또는 항-VEGF-C (10 mg/kg), 항-VEGF-A (10 mg/kg), 또는 항-Nrp2 (10 mg/kg)로 이식 후 3주 동안 주 1회 i.p. 치료하였다. 마우스를 영상화하기 전 거의 동일한 평균 종양 크기를 갖는 것으로 분류하고, 이식 후 7, 14 및/또는 21일째에 영상화하였다. 마우스를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 영상화하고, 데이터를 도 3, 4, 5, 6 및 7에 나타내었다.

도 3은 대량 림프 운반이 종양 관련된 림프 그물에서 상향조절됨을 입증하는, 마우스에서의 림프 기능 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 3a는 종양 이식 마우스 (n = 6 동물/그룹)에서 림프 맥동 주파수가 약 ％50 상향조절됨을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 3b는 종양 이식 마우스 (n = 4 동물/그룹)에서 대량 림프 운반도 또한 상향조절됨을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 3c는 종양 이식 마우스 (n = 12 동물/그룹)에서 시간대별 림프 맥동 상향조절을 입증하는 데이터를 나타낸다. 마우스는 종양 크기로 인해 21일 후에 안락사시켰다.

도 4는 VEGF-C 경로의 억제가 종양 관련된 그물에서 림프 운반을 감소시킴을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 4a는 종양 보유 마우스에서 항-NRP2, 항-VEGF-C 또는 항-VEGF-A의 만성 치료가 림프 맥동 주파수를 유의하게 감소시킴을 입증하는 데이터를 나타낸다 (n = 6 동물/그룹). 도 4b는 종양 보유 마우스에서 항-NRP2, 항-VEGF-C 또는 항-VEGF-A의 만성 치료가 대량 림프 운반을 유의하게 감소시킴을 입증하는 데이터를 나타낸다 (n = 6 동물/그룹).

도 5는 VEGF-C 경로의 억제가 비-종양 보유 마우스에서 림프 기능을 유의하게 변경시키지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 5a는 비-종양 보유 마우스에서의 항-VEGF-C의 만성 치료가 3주에 걸쳐 n = 6 동물/그룹에서 측정했을 때 림프 맥동 주파수를 유의하게 변화시키지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 5b는 비-종양 보유 마우스에서의 항-NRP2의 만성 치료가 3주에 걸쳐 n = 4 동물/그룹에서 측정했을 때 림프 맥동 주파수를 유의하게 변화시키지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다.

도 6은 항암제의 급성 주사가 림프 기능을 변화시키지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 6a는 종양 보유 마우스에서의 항-NRP2, 항-VEGF-C 또는 항-VEGF-A의 급성 주사가 림프 맥동 주파수에서 어떤 유의한 변화도 야기하지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다 (n = 6 동물/그룹). 도 6b는 비-종양 보유 마우스에서의 재조합 VEGF-C 단백질 또는 재조합 VEGF-A 단백질의 급성 주사가 림프 맥동 주파수에서 어떤 유의한 변화도 야기하지 않음을 입증하는 데이터를 나타낸다 (n = 6 동물/그룹).

도 7은 림프 맥동 주파수의 상향 조절의 특이성을 입증하는 데이터를 나타낸다. 상기 데이터는 림프 맥동 주파수가 꼬리 및 등 종양 보유 마우스 둘 모두에서는 상향조절되지만, 귀 종양 보유 마우스에서는 상향조절되지 않음을 입증한다.

실시예 3: 용량을 결정하기 위한 림프 맥동의 측정

본 실시예는, 예를 들어 전임상적으로 최소의 유효한 용량 (MiED) 또는 최대의 유효한 용량 (MxED)을 비롯한 치료제 (예를 들어, 항암제)의 용량을 결정하기 위한 림프 맥동의 측정을 기재한다. 종양 보유 마우스를 위약 및 잠재적인 치료제로 3주 동안 넓은 범위의 용량 (예를 들어, 1 mg/kg 내지 200 mg/kg - 1, 5, 10, 20, 40, 80, 150, 200 mg/kg)으로 치료하였다. 영상화제를 마우스에 투여하여 작용제가 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에 도달하게 하였다. 맥동 주파수를 측정하였다. 위약 치료 그룹에서의 맥동 주파수와 비교하여 맥동 주파수에서 통계적으로 유의한 변화가 있는 가장 낮은 용량을 MiED로 규정하였다. 위약 치료 그룹에서의 맥동 주파수와 비교하여 맥동 주파수에서 최대의 변화가 있는 가장 낮은 용량 (즉 추가의 증가가 맥동 주파수를 더 변화시키지 않는 용량)을 MxED로 규정하였다.

예를 들어 문헌 [Bagri et al., Clin Cancer Res. 16(15):3887-900 (2010)]에 기재되어 있는 것을 비롯한 당업계 공지의 방법을 이용하여 MiED 및 MxED에서의 잠재적 치료제의 약동학적 분석을 수행하여, 이들 용량 둘 모두에서의 곡선하 면적 (AUC), Cmax 및 C저점에 의해 규정되는 노출을 결정하였다. MiED에서 결정된 노출은 최소 노출이고, 및 MxED에서 결정된 노출은 표적 노출이다.

치료제를 제공받은 환자에서의 임상 연구 동안, 림프 맥동 속도를 본원에 기재된 바와 같이 측정하였다. 측정은 치료제 초기 투여 전 및 각각의 치료제 용량 이후 적합한 시간 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 그 초과의 날 또는 주)에 수행하였다. 평균 맥동 속도 및 맥동 속도에서의 평균 변화를 결정하였다. 동일한 환자에서 치료 전 주파수와 비교하여 "치료 시 및 치료 후" 맥동 주파수에서 통계적으로 유의한 변화가 있는 가장 낮은 용량을 MiED로 규정하였다. 치료 전 맥동 주파수와 비교하여 "치료 시 및 치료 후" 맥동 주파수에서 최대의 변화가 있는 가장 낮은 용량 (즉 추가의 증가가 맥동 주파수를 더 변화시키지 않는 용량)을 MxED로 규정하였다.

추가로, 작용제의 약동학적 분석을 수행하고, 각 용량 그룹에 대해 평균 AUC, Cmax 및 C저점을 결정하였다. 맥동 속도에서의 평균 변화는 전임상 실험에서 결정된 최소 및 표적 노출과 비슷한 노출에서 평가되어 전임상 분석을 유효하게 할 것이다.

전술된 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 설명 및 실시예로서 약간 상세하게 기재되었지만, 상기 기재 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 과학 참고문헌, 및 진뱅크 등록 번호의 개시내용은 각 특허, 특허 출원, 과학 참고문헌, 및 진뱅크 등록 번호가 구체적이고도 개별적으로 본원에 포함된 것과 같이 전체 목적상 그 전문이 본원에 명백하게 참고로 포함된다.

Claims (49)

1. (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계;
   (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및
   (c) 림프 맥동 주파수를 항암제 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계
   를 포함하며, 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소는 항암제에 반응할 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하여 주는 것인, 항암제에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 림프관이 서혜 림프절을 축 림프절에 연결하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 영상화제가 형광 염료를 포함하는 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 형광 염료가 알렉사플루오르680(Alexafluor680)인 방법.
5. 제3항에 있어서, 림프 맥동 주파수가 형광 현미경검사를 이용하여 검출되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
7. 제1항에 있어서, 환자가 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종, 신암 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로 진단받은 것인 방법.
8. 제1항에 있어서,
   (d) 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소가 검출된 경우에 환자에게 유효량의 항암제를 투여하는 단계
   를 추가로 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 항암제가 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인 방법.
10. 제9항에 있어서, NRP2 길항제가 항-NRP2 항체인 방법.
11. 제9항에 있어서, VEGF-C 길항제가 항-VEGF-C 항체인 방법.
12. 제8항에 있어서,
    (e) 환자에게 유효량의 제2 항암제를 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 제2 항암제가 VEGF 길항제인 방법.
14. 제13항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
15. 제14항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
16. (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계;
    (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및
    (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계
    를 포함하며, 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 증가는 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하여 주는 것인, 전이를 겪을 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 림프관이 서혜 림프절을 축 림프절에 연결하는 것인 방법.
18. 제16항에 있어서, 영상화제가 형광 염료를 포함하는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 형광 염료가 알렉사플루오르680인 방법.
20. 제18항에 있어서, 림프 맥동 주파수가 형광 현미경검사를 이용하여 검출되는 것인 방법.
21. 제16항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
22. 제16항에 있어서, 환자가 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종, 신암 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로 진단받은 것인 방법.
23. 제1항에 있어서,
    (d) 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 증가가 검출된 경우에 환자에게 유효량의 항암제를 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 항암제가 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인 방법.
25. 제24항에 있어서, NRP2 길항제가 항-NRP2 항체인 방법.
26. 제24항에 있어서, VEGF-C 길항제가 항-VEGF-C 항체인 방법.
27. 제23항에 있어서,
    (e) 환자에게 유효량의 제2 항암제를 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 제2 항암제가 VEGF 길항제인 방법.
29. 제28항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
30. 제29항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
31. (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계;
    (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및
    (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계
    를 포함하며, 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소는 유효한 항암제를 확인하여 주는 것인, 항암 요법의 유효성을 모니터링하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 림프관이 서혜 림프절을 축 림프절에 연결하는 것인 방법.
33. 제31항에 있어서, 영상화제가 형광 염료를 포함하는 것인 방법.
34. 제33항에 있어서, 형광 염료가 알렉사플루오르680인 방법.
35. 제33항에 있어서, 림프 맥동 주파수가 형광 현미경검사를 이용하여 검출되는 것인 방법.
36. 제31항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
37. 제31항에 있어서, 환자가 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종, 신암 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로 진단받은 것인 방법.
38. 제31항에 있어서,
    (d) 약 10％ 이상의 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 감소가 검출된 경우에 환자에게 유효량의 항암제를 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 항암제가 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인 방법.
40. 제39항에 있어서, NRP2 길항제가 항-NRP2 항체인 방법.
41. 제39항에 있어서, VEGF-C 길항제가 항-VEGF-C 항체인 방법.
42. 제38항에 있어서,
    (e) 환자에게 유효량의 제2 항암제를 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 제2 항암제가 VEGF 길항제인 방법.
44. 제43항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
45. 제44항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
46. (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계;
    (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및
    (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계
    를 포함하며, 림프관에서의 림프 맥동 주파수의 변화는 그 용량을 유효 용량으로 확인하여 주는 것인, 항암제의 용량을 최적화하는 방법.
47. 제46항에 있어서, 항암제가 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인 방법.
48. (a) 하나 이상의 용량의 항암제를 제공받은 환자에게 영상화제를 투여하는 단계;
    (b) 환자에서 종양 배액 림프절과 관련된 림프관에서의 림프 맥동 주파수를 검출하는 단계; 및
    (c) 림프 맥동 주파수를 항암제로 치료 전의 림프관에서의 맥동 주파수와 비교하는 단계
    를 포함하며, 림프 맥동 주파수에서의 무변화는 그 용량을 최대 유효 용량으로 확인하여 주는 것인, 항암제의 용량을 최적화하는 방법.
49. 제48항에 있어서, 항암제가 NRP2 길항제, VEGF-C 길항제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인 방법.
    

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