KR20120059553A - Ｖｅｇｆ 길항제에 대한 환자 반응을 모니터링하기 위한 생물학적 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 VEGF 길항제로의 치료의 유효성을 모니터링하기 위해 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 VEGF 길항제 요법에 대해 반응성일 가능성이 있는 환자를 확인 및 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 방법에 사용하기 위한 키트 및 제조품을 제공한다.

Description

ＶＥＧＦ 길항제에 대한 환자 반응을 모니터링하기 위한 생물학적 마커{BIOLOGICAL MARKERS FOR MONITORING PATIENT RESPONSE TO VEGF ANTAGONISTS}

<관련 출원>

본 출원은 각각의 개시문 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함되는, 2009년 8월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/234,197 및 2009년 8월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/234,201을 우선권으로 주장한다.

<발명의 분야>

본 발명은 VEGF 길항제 요법으로의 치료로부터 가장 이익을 얻을 환자를 확인하는 방법 및 환자를 이들의 VEGF 길항제 요법으로의 치료에 대한 감수성 및 반응성에 대해 모니터링하는 방법에 관한 것이다.

바이오마커 (예를 들어, 혈장에 분비된 단백질)의 발현 수준을 측정하는 것은 예를 들어 VEGF 길항제로의 치료를 비롯하여 특정한 요법에 반응할 환자 및 환자 집단을 확인하기 위한 효과적인 수단일 수 있다. 그러나, 현재까지, 이러한 환자 및 환자 집단을 확인하기에 유용한 바이오마커의 어떠한 포괄적인 패널도 확인되지 않았다.

따라서, 환자가 어떤 치료에 대해 반응할 것인지를 결정하고, 이러한 결정을 VEGF 길항제 요법을 사용한 환자에 대한 보다 효과적인 치료 방식에 도입하여 단일 작용제로 사용할지 또는 다른 작용제와 조합할지의 여부를 결정하는 보다 효과적인 수단이 요구된다.

<발명의 개요>

본 발명은 VEGF 길항제로의 치료에 반응할 환자를 확인하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. VEGF 길항제 요법에 반응성인 환자는 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 유전자의 발현 수준에 근거하여 확인된다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태는 (a) 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여한 후에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하는 것; 및 (b) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할 환자를 확인하는 것인, 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할지 여부를 모니터링하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 mRNA를 측정하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 혈장 단백질 수준을 측정하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58 또는 제59 유전자의 발현을 검출하는 것, 및 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 상기 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58 또는 제59 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 더 포함하고, 여기서 상기 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58 또는 제59 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할 환자를 확인한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자는 ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주맙 포함)이다. 일부 실시양태에서, 환자는 혈관신생 장애를 갖는다. 일부 실시양태에서, 혈관신생 장애는 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종, 및 이들의 조합의 군으로부터 선택된 암이다.

본 발명의 추가의 실시양태는 (a) 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여한 후에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하는 것; 및 (b) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제로부터 이익을 얻을 가능성이 증가한 환자를 확인하는 것인, 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할지 여부를 모니터링하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 mRNA를 측정하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 혈장 단백질 수준을 측정하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58 또는 제59 유전자의 발현을 검출하는 것, 및 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 상기 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58 또는 제59 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 더 포함하고, 여기서 상기 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58 또는 제59 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할 환자를 확인한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자는 ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주맙 포함)이다. 일부 실시양태에서, 환자는 혈관신생 장애를 갖는다. 일부 실시양태에서, 혈관신생 장애는 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종, 및 이들의 조합으로부터 선택된 암이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) VEGF 길항제를 투여한 후에 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하는 것; (b) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하는 것; 및 (c) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서 검출된다면 VEGF 길항제를 요법으로 선택하는 것; 또는 (d) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서 검출되지 않는다면 VEGF 길항제가 아닌 요법을 선택하는 것을 포함하는, 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자 (예를 들어, 결장직장암, 유방암, 폐암, 또는 교모세포종 등을 비롯한 혈관신생 장애를 갖는 것으로 진단된 환자)를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, (c)의 요법은 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 및 이들의 조합으로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, (d)의 요법은 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 및 이들의 조합으로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자는 ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58 또는 제59 유전자의 발현을 검출하는 것을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (e) 상기 하나 이상의 유전자의 발현의 감소가 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서 검출된다면 유효량의 VEGF 길항제를 환자에게 투여하는 것을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주맙)이다. 일부 실시양태에서, 방법은 (f) 적어도 제2 작용제 (예를 들어, 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 및 이들의 조합으로부터 선택된 작용제 포함)의 유효량을 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 (a) 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 후보 바이오마커의 발현을 검출하는 것; 및 (b) 후보 바이오마커의 발현 수준을 참조 샘플에서의 후보 바이오마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 생물학적 샘플에서 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 1.95배, 1.99배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 이상 더 낮은 수준으로 발현된 후보 바이오마커가 VEGF 길항제에 대한 반응성을 모니터링하기에 유용한 바이오마커로 확인되는 것인, VEGF 길항제에 대한 반응성을 모니터링하기 위한 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플은 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주맙 포함)이다.

도 1은 특정 유전자가 VEGF 길항제로의 치료 후 제7일에 하향조절된다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타낸다. 개방 및 해치 원형은 VEGF 길항제로의 치료 후 제7일에 하향조절된 유전자를 나타낸다. 개방 원형은 LOD 스코어 > 0을 갖는 유전자를 나타낸다. 해치 원형은 LOD 스코어 > 2를 갖는 유전자를 나타낸다.
도 2는 특정 유전자가 VEGF 길항제로의 치료 후 제14일에 하향조절된다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타낸다. 개방 및 해치 원형은 VEGF 길항제로의 치료 후 제14일에 하향조절된 유전자를 나타낸다. 개방 원형은 LOD 스코어 > 0을 갖는 유전자를 나타낸다. 해치 원형은 LOD 스코어 > 2를 갖는 유전자를 나타낸다.
도 3은 VEGF 길항제로의 치료 후 제7일 및 제14일에 하향조절된 유전자 사이의 오버랩을 보여준다. 도 3a: 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 0을 갖는 제7일에 하향조절된 유전자를 나타내고; 플러스 기호는 LOD 스코어 > 0을 갖는 제14일에 하향조절된 유전자를 나타내고; 해치 원형은 LOD 스코어 > 0을 갖는 제7일 및 제14일에 하향조절된 유전자를 나타낸다. 도 3b: 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 0을 갖는 제7일에 하향조절된 유전자를 나타내고; 플러스 기호는 LOD 스코어 > 0을 갖는 제14일에 하향조절된 유전자를 나타내고; 해치 원형은 LOD 스코어 > 0을 갖는 제7일 및 제14일에 하향조절된 유전자를 나타낸다.
도 4는 하기 실시예 1 및 2에 기재된 유전자 시그너쳐의 유전자가 결장직장 선암종 종양 이종이식 모델의 기질에서 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)에 반응하여 하향조절된다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. 4a: 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 2 (p-값 5.3e-82)를 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 4b: 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 0 (p-값 4.8e-74)을 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다.
도 5는 하기 실시예 1 및 2에 기재된 유전자 시그너쳐의 유전자가 전이성 유방암 이종이식 모델의 기질에서 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)에 반응하여 하향조절된다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. 5a: 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 2 (p-값 1.6e-159)를 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 5b: 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 0 (p-값 7.0e-266)을 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다.
도 6은 하기 실시예 1 및 2에 기재된 유전자 시그너쳐의 유전자가 결장 선암종 이종이식 모델의 기질에서 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)에 반응하여 하향조절된다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. 6a: 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 2 (p-값 5.6e-18)를 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 6b: 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 0 (p-값 3.4e-43)을 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다.

<바람직한 실시양태의 상세한 설명>

I. 도입

본 발명은 VEGF 길항제로의 치료에 대해 감수성 또는 반응성인 환자를 모니터링 및/또는 확인하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 VEGF 길항제로의 하나 이상의 치료 이전 및 이후에 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 이상의 유전자(들)의 발현 수준이 VEGF 길항제로의 치료에 대한 환자의 반응성 또는 감수성을 모니터링하고, VEGF 길항제로의 치료에 대해 감수성 또는 반응성인 환자를 확인하기에 유용하다는 발견에 기초한다.

II. 정의

용어 "바이오마커" 및 "마커"는 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물 또는 당지질-기재 분자 마커를 나타내기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 대상체 또는 환자에서의 그의 발현 또는 존재는 표준 방법 (또는 본원에 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있고, VEGF 길항제에 대한 포유동물 대상체의 반응성 또는 감수성을 모니터링하기에 유용하다. 이러한 바이오마커는 표 1 내지 3에 열거된 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 바이오마커의 발현은 대조군 샘플 (예를 들어, VEGF 길항제로 치료하기 전에 동일한 환자로부터 수득한 샘플, VEGF 길항제로 치료하지 않은 하나 이상의 관련되지 않은 개체(들)로부터 수득한 샘플 포함)에서 보다 환자가 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 후에 VEGF 길항제에 대해 감수성 또는 반응성인 환자로부터 수득한 샘플에서 더 낮아질 것으로 결정될 수 있다. 보다 낮은 발현은 전형적으로 대조군 샘플에서의 발현보다 예를 들어 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 1.95배, 1.99배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 이상 더 낮은 발현 수준을 나타낸다. 보다 낮은 발현은 또한 측정된 모든 유전자의 평균 발현 수준으로부터 약 -2, -3, -4, -5, 또는 -6 이상의 표준 편차의 평균 log 비의 감소를 나타낸다.

용어 "샘플" 및 "생물학적 샘플"은 체액, 신체 조직, 세포 또는 다른 공급원을 포함하여 개체로부터 수득한 임의의 생물학적 샘플을 나타내는데 상호교환가능하게 사용된다. 체액은 예를 들어 림프, 혈청, 신선한 전혈, 말초혈 단핵 세포, 동결된 전혈, 혈장 (예를 들어, 신선하거나 동결된 것), 소변, 타액, 정액, 활액 및 척수액이다. 샘플은 또한 유방 조직, 신장 조직, 결장 조직, 뇌 조직, 근육 조직, 활막 조직, 피부, 모낭, 골수 및 종양 조직을 포함한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 얻기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다.

VEGF 길항제로의 치료에 대한 환자의 "유효 반응" 또는 그에 대한 환자의 "반응성" 또는 "감수성"은 VEGF 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체로의 치료로부터 또는 그의 결과로서 혈관신생 장애의 위험이 있거나 혈관신생 장애를 앓고 있는 환자에게 부여된 임상적 또는 치료적 이점을 나타낸다. 이러한 이점은 길항제 치료로 인해 또는 길항제 치료의 결과로서의 세포 또는 생물학적 반응, 완전 반응, 부분 반응, 안정적인 질환 (진행이나 재발이 없음), 또는 환자의 재발이 지연된 반응을 포함한다. 예를 들어, 유효 반응은 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 바이오마커를 발현하지 않는 환자와 비교하여 상기 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 것으로 진단된 환자에서 감소된 종양 크기 또는 무진행 생존일 수 있다. 유전자 바이오마커(들)의 발현은 이러한 유효 반응을 효과적으로 예측하거나 또는 높은 감수성으로 예측한다.

본원에 사용된 "길항제"는 이들이 결합하는 분자의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 화합물 또는 작용제를 나타낸다. 길항제는 VEGF에 결합하는 항체, 합성 또는 천연-서열 펩티드, 이뮤노어드헤신, 및 소분자 길항제를 포함한다 (임의로 또 다른 분자와 접합되거나 이에 융합됨). "차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다.

본원에 사용된 바와 같이, "효능제 항체"는 관심 폴리펩티드의 하나 이상의 기능적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 항체이다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2개 이상의 무손상 항체로 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 이것의 천연 환경의 오염물 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 여기에는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 95 중량％ 초과의 항체로, 일부 실시양태에서는 99 중량％ 초과로, (2) 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제하였다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에서의 가변 도메인 (V_L) 및 다른쪽 말단에서의 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에서 경계를 형성한다고 여겨진다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 나타낸다. 중쇄의 가변 도메인은 "V_H"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "V_L"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 나타내고, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이것은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역 (HVR)이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 베타-시트 배위를 취하며 3개의 HVR에 의해 연결되어 있는 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이것은 베타-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 상기 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 HVR들은 FR 영역에 의해 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데는 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포 독성에서의 항체 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

임의의 척추동물 종의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불리는 2개의 분명하게 상이한 유형 중 하나로 배정될 수 있다.

중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 다양한 클래스로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂로 추가로 나뉠 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체형상은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체 및 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.

용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "온전한 항체"는 본원에서 구별없이 사용되며, 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아니라 실질적으로 무손상 형태의 항체를 나타낸다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.

본원의 목적상, "네이키드(naked) 항체"는 세포독성 잔기 또는 방사선표지와 접합되지 않은 항체이다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부를 포함하고, 바람직하게는 무손상 항체의 항원-결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-연결될 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유 결합에 의해 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합에 의해 연결될 수 있다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 V_H-V_L 이량체 표면의 항원 결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR 만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체-힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 C_H1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄로 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있도록 V_H 도메인 및 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv를 검토하기 위해서는 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Mono-clonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. (Springer-Verlag, New York: 1994), pp 269-315]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 동일 폴리펩티드 쇄 내에서 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H) (V_H-V_L)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타낸다. 동일 쇄상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody) 역시 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물이 아니라는 것으로 나타낸다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 과정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선별 과정은 복수개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열을 추가로 변경시켜서 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고 표적 결합 서열을 인간화하고 세포 배양물 중에서의 그의 생성을 개선시키며 생체내 그의 면역원성을 저하시키고 다중특이적 항체를 생성할 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해해야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대한 것이다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 이외에도 다른 이뮤노글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.

수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 예를 들어 하이브리도마 방법 (문헌 [Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)] 참조), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조)을 포함한 각종 기술, 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성시키는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., PNAS USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995)] 참조)에 의해 만들 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 상기 항체의 단편이 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., PNAS USA 81:6851-6855 (1984)]). 키메라 항체는 항체의 항원 결합 영역이 예를 들어 마카쿠 원숭이를 관심 항원으로 면역화하여 생성된 항체로부터 유래된 프리마티즈드^® 항체를 포함한다.

비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 HVR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조를 위한 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다. 또한 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 시험접종에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화시킨 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스에게 항원을 투여하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)^TM 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체에 관해서는 문헌 [Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참고할 수 있다.

용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"가 본원에 사용되는 경우, 이것은 서열에서 초가변이고/이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; V_H 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 V_L 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al. Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 카멜리드(camelid) 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)] 및 [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.

많은 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)인 HVR은 서열 가변성을 기초로 하며 가장 흔히 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 코티아는 구조적 루프의 위치를 대신 나타낸다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 CDR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어로 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이들 각각의 HVR로부터의 잔기를 하기 나타낸다.

HVR은 다음과 같이 "확장된 HVR"을 포함할 수 있다: V_L에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2), 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 V_H에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2), 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 연장된 HVR 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

표현 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 변형 형태는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서 항체 편집(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 나타낸다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이들로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.

"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 V_H 및 V_L 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 예를 들어 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.

"성장 억제" 항체는 이러한 항체와 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방지 또는 저하시키는 것이다.

"아폽토시스를 유도하는" 항체는 표준 아폽토시스 검정, 예컨대 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포 (아폽토시스체로 불림)의 형성에 의해 판단되는 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 항체이다.

항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 이소형에 따라서 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC), 식작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화를 포함한다.

본원에서의 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역을 정의하기 위하여 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 이것의 카르복실 말단까지의 스트레치인 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작으로 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.

본원에서 달리 나타내지 않는 한, 이뮤노글로불린 중쇄 내 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 EU 지수의 넘버링이다. "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG₁ EU 항체의 잔기 넘버링을 나타낸다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합, CDC, Fc 수용체 결합, ADCC, 식작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체, BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능에는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되고, 이는 예를 들어 본원의 정의에서 개시된 바와 같은 각종 검정을 이용하여 평가할 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG₁ Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형), 천연 서열 인간 IgG₂ Fc 영역, 천연 서열 인간 IgG₃ Fc 영역 및 천연 서열 인간 IgG₄ Fc 영역 뿐만 아니라 이들의 자연 발생 변이체를 포함한다.

"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 바람직하게는 약 80％ 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 이것과 약 90％ 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 이것과 약 95％ 이상의 상동성을 가질 것이다.

용어 "Fc-영역-포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 나타낸다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작으로 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447 잔기가 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체를 포함하며, 이들은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward, Immunology Today, 18 (12):592-8 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 (7):637-40 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem., 279(8):6213-6 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조).

인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 인간 FcRn에 대한 생체내 결합 및 혈청 반감기는 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2000/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 또한 예를 들어 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조한다.

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.

"항체 의존적 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포)상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)와 결합된 분비형 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 이후에 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 나타낸다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.

"보체-의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재하의 표적 세포의 용해를 나타낸다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가되거나 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 나타낸다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적이고 예시적인 실시양태를 아래에 기재한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 검정에서 기재되는 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행되는 방사선표지된 항원 결합 검정 (RIA)으로 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재하에 (¹²⁵I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참조). 검정 조건을 수립하기 위해, 마이크로타이터 플레이트 (다이넥스 테크놀로지스, 인크.(DYNEX Technologies, Inc.))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 ㎍/㎖의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후에 PBS 중 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 2시간 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단한다. 비흡착 플레이트 (넌크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만, 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서의 인큐베이션 (예를 들어, 1시간 동안)을 위해 포획 플레이트로 보유한다. 이후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1％ 트윈(TWEEN)-20^TM 계면활성제로 8회 세척하였다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 ㎕/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20^TM; 패커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)^TM 감마 계수기 (패커드)에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에 사용한다.

또 다른 실시양태에 따라, Kd 또는 Kd 값은 25℃에서 약 10 반응 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩으로 비아코어(BIACORE)^®-2000 또는 비아코어^®-3000 기기 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정한다. 간략하게 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/㎖ (약 0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05％ 트윈 20^TM 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 중에 주입한다. 간단한 일-대-일 랑뮈르 결합 모델 (비아코어^® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 10⁶ M^-1s^{- 1}를 초과하는 경우, 온-레이트는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(AMINCO)^TM 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 "온-레이트", "회합의 속도", "회합 속도" 또는 "k_on"은 또한 비아코어^®-2000 또는 비아코어^®-3000 시스템 (비아코어, 인크., 미국 뉴욕주 피스카타웨이)을 사용하여 상기한 바와 같이 측정할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 본 발명의 항체와 관련이 있고, 다른 하나는 참조/비교 항체와 관련이 있음) (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서 예를 들어 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만 및/또는 약 10％ 미만이다.

본원에 사용되는 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 2개의 수치값 (일반적으로, 하나는 분자와 관련이 있고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 관련이 있음) (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과 및/또는 약 50％ 초과이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 유용한 인간화 항체는 IgG Fc에 아미노산 변경을 추가로 포함하고, 야생형 IgG Fc를 갖는 항체에 비해 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 더욱 바람직하게는 100배 이상, 바람직하게는 125배 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 150배 이상 내지 약 170배 증가된다.

"장애" 또는 "질환"은 본 발명의 물질/분자 또는 방법을 이용한 치료로부터 이득을 얻을 수 있는 모든 질환이다. 여기에는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉬운 병리 상태 포함)이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적 예는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프계 악성 종양; 뉴런, 신경교, 성상 세포, 시상 하부 및 다른 과립상, 대식 세포성, 표피성, 간질성 및 포배강 장애; 및 염증성, 면역학적 및 다른 혈관신생 장애를 포함한다.

용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련이 있는 장애를 나타낸다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 한 실시양태에서는, 세포 증식성 장애가 혈관신생이다.

본원에 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성 또는 양성 여부와 상관 없음), 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 나타낸다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 상호 배타적인 것이 아니다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 포유동물에게서의 생리적 질환을 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막암, 간세포성 암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수모구성 백혈병; 및 이식 후 림프구증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증과 연관된 비정상적 혈관 증식, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종), 및 메이그스 증후군이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

용어 "항종양 조성물" 또는 "항암 조성물" 또는 "항암제"는 하나 이상의 활성 치료제, 예를 들어 "항암제"를 포함하는, 암을 치료하는 데에 유용한 조성물을 나타낸다. 치료제 (항암제)의 예에는, 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용된 작용제, 항혈관신생제, 세포소멸제, 항투불린제, 및 암을 치료하기 위한 기타 작용제, 예를 들어 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)^TM)), 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec)^TM (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 시토카인, 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA VEGF 또는 VEGF 수용체(들), TRAIL/ Apo2, 및 기타 생물활성 및 유기 화학적 작용제 등 중의 하나 이상과 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체)가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이들의 조합 역시 본 발명에 포함된다.

"혈관신생 인자 또는 작용제"는 혈관의 발달을 자극하는, 예를 들어 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성 및/또는 혈관형성 등을 촉진하는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관신생 인자에는 VEGF 및 VEGF 부류 구성원, PlGF, PDGF 부류, 섬유아세포 성장 인자 부류 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴: Angiopoietin), 에프린, Del-1, 섬유아세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), 폴리스타틴 (Follistatin), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 간세포 성장 인자 (HGF)/스캐터 인자 (SF), 인터루킨-8 (IL-8), 렙틴 (Leptin), 미드카인 (Midkine), 태반 성장 인자, 혈소판 유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판 유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (Pleiotrophin) (PTN), 프로그라눌린, 프로리페린, 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)/혈관 침투성 인자 (VPF) 등이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이것은 또한 창상 치유를 가속화하는 인자, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 이것의 부류의 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타도 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)]; [Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)] (예를 들어, 공지된 혈관신생 인자를 열거한 표 1 참조); 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)]을 참조한다.

본원에 사용된 용어 "VEGF"는 문헌 [Leung et al. Science, 246:1306 (1989)], 및 [Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)]에 기재된 바와 같이, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 189-, 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자를 그의 자연 발생 대립유전자 및 프로세싱된 형태와 함께 나타낸다. 용어 "VEGF"는 또한 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 나타낸다. 때때로, 특정 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF의 경우에는 hVEGF, 뮤린 VEGF의 경우에는 mVEGF 등과 같은 용어로 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 절단된 형태를 지칭하기 위해 사용된다. VEGF의 임의의 상기 형태들에 대한 언급은 본 출원에서 예를 들어 "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"에 의해 확인될 수 있다. "말단절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 표시된 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 말단절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단된 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대해 천연 VEGF와 대등한 결합 친화도를 갖는다. 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF는 인간 VEGF이다.

"VEGF 길항제"는 VEGF 활성 (그의 VEGF 또는 하나 이상의 VEGF 수용체 또는 이를 코딩하는 핵산에 대한 결합성 포함)을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 분자를 나타낸다. 바람직하게, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합한다. VEGF 길항제는 항-VEGF 항체 및 그의 항원-결합 단편; VEGF 및 VEGF 수용체에 결합하고 리간드-수용체 상호작용을 차단하는 폴리펩티드 (예를 들어, 이뮤노어드헤신, 펩티바디); 항-VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어 VEGFR 티로신 키나제의 소분자 억제제; VEGF에 결합하는 앱타머; 및 엄격한 조건하에 VEGF 또는 VEGF 수용체를 코딩하는 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 (예를 들어, RNAi)을 포함한다. 한 가지 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF와 결합하고, 시험관 내에서 VEGF-유도된 내피 세포 증식을 억제시킨다. 한 가지 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체와 비-VEGF 또는 비-VEGF 수용체 보다 큰 친화도로 결합한다. 한 가지 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체와 1 μM 내지 1 pM의 Kd로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체와 500 nM 내지 1 pM으로 결합한다.

바람직한 실시양태에 따르면, VEGF 길항제는 폴리펩티드, 예컨대 항체, 펩티바디, 이뮤노어드헤신, 소분자 또는 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 항-VEGF 항체, 예컨대 아바스틴(AVASTIN)^® 항체 또는 항-VEGF 수용체 항체, 예컨대 항-VEGFR2 또는 항-VEGFR3 항체이다. VEGF 길항제의 다른 예는 VEGF-트랩, 무카젠, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (소라페닙), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 및 KRN-633을 포함한다.

"항-VEGF 항체"는 VEGF에 충분한 친화도 및 특이성으로 결합하는 항체이다. 바람직하게, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적화하고 간섭하는 치료제로서 사용될 수 있다. 항-VEGF 항체는 통상적으로 다른 VEGF 상동체, 예컨대 VEGF-B 또는 VEGF-C에도 결합하지 않을 것이고, 다른 성장 인자, 예컨대 PlGF, PDGF 또는 bFGF에도 결합하지 않을 것이다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생성되는 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직하게는, 항-VEGF 항체는 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체인데, 이는 베바시주맙 (BV; 아바스틴^®)으로서 공지된 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에 따라, 사용될 수 있는 항-VEGF 항체는 WO 2005/012359에 개시된 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에 따라, 항-VEGF 항체는 WO 2005/012359의 도 24, 25, 26, 27 및 29에 개시된 항체 중 어느 하나의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 포함한다 (예를 들어, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 및 B20.4.1). 또 다른 바람직한 실시양태에서, 라니비주맙으로 공지된 항-VEGF 항체는 안과 질병, 예를 들어 당뇨병성 망막병증 및 AMD을 위해 투여된 VEGF 길항제이다.

"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴^®"으로서 공지되기도 한 항-VEGF 항체 "베바시주맙 (BV)"은 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이것은 돌연변이된 인간 IgG₁ 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93％ (대부분의 프레임워크 영역 포함)는 인간 IgG₁로부터 유래되고, 서열의 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맙은 분자량이 약 149,000 달톤이고 글리코실화된다. 기타 항-VEGF 항체에는 미국 특허 번호 6884879 및 WO 2005/044853에 기재된 항체가 포함된다.

항-VEGF 항체 라니비주맙 또는 루센티스(LUCENTIS)^® 항체 또는 rhuFab V2는 인간화, 친화도-성숙 항-인간 VEGF Fab 단편이다. 라니비주맙은 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 발현 벡터 및 세균성 발효에 있어서의 표준 재조합 기술 방법에 의해 생성된다. 라니비주맙은 글리코실화되지 않고 분자량이 약 48,000 달톤이다. WO98/45331 및 US20030190317을 참조한다.

혈관신생의 조절이상은 비정상적인 혈관신생을 유발시킬 수 있는데, 즉 새로운 혈관이 질병 상태에서 과도하게, 불충분하게 또는 달리 부적절하게 (예를 들어, 혈관신생 부위, 시기 또는 발병이 의학적 관점에서 볼 때 바람직하지 못함) 성장하는 경우, 또는 이로 인해 질병 상태, 즉 혈관신생 장애가 유발되는 경우에 일어난다. 과도한, 부적절한 또는 제어되지 않은 혈관신생은 병든 상태를 유발시키거나 병든 상태를 악화시키는 데에 일조하는 새로운 혈관 성장이 있는 경우에 일어난다. 새로운 혈관은 병든 조직에 양분을 공급하고, 정상 조직을 파괴하고, 암의 경우, 새로운 혈관은 종양 세포가 순환계 내로 벗어나서 다른 기관에 머무르게 할 수 있다 (종양 전이). 비정상적인 혈관신생과 관련된 질병 상태 (즉, 혈관신생 장애)에는 비신생물성 및 신생물성 상태, 예를 들어 암, 특히 혈관화 고형 종양 및 전이성 종양 [결장암, 유방암, 폐암 (특히, 소세포 폐암), 뇌암 (특히, 교모세포종) 또는 전립선암 포함], 바람직하지 못하거나 이상한 비대증, 관절염, 류마티스 관절염 (RA), 염증성 장 질환 또는 IBD [크론병 (Crohn's disease) 및 궤양성 결장염], 건선, 건선성 반점, 사르코이드증, 아테롬성 경화증, 아테롬성 경화성 반점, 당뇨병성 및 기타 증식성 망막병증, 예를 들어 미숙아 망막병증, 후수정체 섬유증식증, 신생혈관성 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식편 신생혈관형성, 각막 이식편 거부, 망막/융모막 신생혈관형성, 전방각 신생혈관형성 (피부홍조), 안과 신생혈관 질환, 혈관성 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과형성 [그레이브스병 (Grave's disease) 포함], 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예를 들어, 급성 발작/폐쇄성 두부 손상/외상과 연관된 부종), 활막 염증, 골화성 근육염, 비대성 뼈 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 제3 유체 공간형성 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 근종, 조산, 만성 염증, 예를 들어 IBD, 신 동종이식편 거부, 염증성 장 질환, 신 증후군, 바람직하지 못하거나 이상한 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비대성 흉터, 모발 성장 억제, 오슬러-웨버 (Osler-Weber) 증후군, 화농성 육아종, 후수정체 섬유증식증, 피부 경화증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예를 들어, 심막염과 연관된 삼출), 및 흉막 삼출이 포함된다.

본원에 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 나타내고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 도중에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질병 또는 질환의 발생을 지연시키기 위해 사용된다.

"유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 용량에서 이러한 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다.

본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 목적하는 반응을 유도시킬 수 있는 본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력과 같은 요인들에 따라서 다양할 수 있다. 또한 치료 유효량은 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 치료적으로 이로운 효과가 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. 용어 "치료 유효량"은 특정 포유동물 (환자)에게서 질환 또는 장애를 "치료"하는 데에 유효한 본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 길항제의 양을 나타낸다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기 또는 중량을 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킴)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킴)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나; 암과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 암세포 성장을 억제하고/하거나 존재하는 암세포를 사멸시킬 정도로, 상기 약물은 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 한 실시양태에서, 치료 유효량은 성장 억제량이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 환자의 생존율을 연장시키는 양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 환자병 진행이 없는 생존율을 개선시켜 주는 양이다.

"예방 유효량"은 원하는 예방 결과 달성에 필요한 용량 및 이러한 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 반드시 그런 것은 아니지만 전형적으로, 예방적 용량은 질병이 발생하기에 앞서 또는 질병의 초기 단계에서 대상체에게 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 보다 적다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 저해하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 뉴클레오용해성(nucleolytic) 효소, 항생제, 및 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함) 또는 소분자 독소와 같은 독소, 및 하기에 개시되는 다양한 항종양 또는 항암 작용제를 포함하도록 의도된다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양치사제는 종양 세포의 파괴를 야기한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)^® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸렌라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)^®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)^®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)^®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신^® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK^® 다당류 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 미국 오리곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)^®, 필데신(FILDESIN)^®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)^® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 미국 뉴저지주 프린스톤), 아브락산(ABRAXANE)^TM 크레모포르-프리(Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 미국 일리노이주 샤움버그), 및 TAXOTERE^® 독세탁셀 (론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니); 클로란부실; 젬시타빈 (겜자르(GEMZAR)^®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)^®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)^®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)^®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)^®); 임의의 상기 물질들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 2가지 이상의 상기 물질들의 배합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약자인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 배합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)^TM)으로의 치료 요법에 대한 약자인 FOLFOX가 포함된다. 부가의 화학요법제에는 항체-약물 접합체로서 유용한 세포독성제, 예를 들어 마이탄시노이드 (예를 들어, DM1) 및 아우리스타틴, 예를 들어 MMAE 및 MMAF가 포함된다.

"화학요법제"에는 또한, 암의 성장을 증진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 저하, 차단 또는 억제시키는 작용을 하는 "항호르몬제"가 포함되고, 종종, 전신성 치료 형태이다. 이들은 그 자체가 호르몬일 수 있다. 이것의 예는, 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)^® 타목시펜), 에비스타(EVISTA)^® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)^® 토레미펜; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 저해하거나 또는 그의 기능을 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 루프론(LUPRON)^® 및 엘리가드(ELIGARD)^® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 다른 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가스(MEGASE)^® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)^® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)^® 보로졸, 페마라(FEMARA)^® 레트로졸 및 아리미덱스(ARIMIDEX)^® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)^® 또는 오스탁(OSTAC)^®), 디드로칼(DIDROCAL)^® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)^® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사막스(FOSAMAX)^® 알렌드로네이트, 아레디아(AREDIA)^® 파미드로네이트, 스켈리드(SKELID)^® 틸루드로네이트 또는 악토넬(ACTONEL)^® 리세드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로 중의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)^® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)^® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)^® 백신 및 박시드(VAXID)^® 백신; 루르토테칸(LURTOTECAN)^® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)^® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016이라고도 공지되어 있는, ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

본원에 사용된 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 통상적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 안트라시클린 항생제 독소루비신 ((8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온), 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지로까지 이어질 수도 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)] (특히, p. 13)에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 모두 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목에서 유래된 도세탁셀 (탁소테레^®, 론-프랑 로러)은 파클리탁셀 (탁솔^®, 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세소관 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시켜서 세포에서의 유사분열 억제를 야기한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "환자"는 치료가 요망되는 모든 단일 동물, 보다 바람직하게는 포유동물 (이에는 비-인간 동물, 예를 들어 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 암소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류가 포함됨)를 나타낸다. 가장 바람직하게, 본원의 환자는 인간이다.

본원에서 "대상체"는 하나 이상의 징후, 증상 또는 혈관신생 장애의 다른 지표를 경험하고 있거나 경험한 적이 있는 치료에 적격인 환자를 비롯한 임의의 단일 인간 대상체이다. 대상체는 질환의 임의의 임상적 징후를 나타내지 않는 임상 연구 시험에 포함된 임의의 대상체, 역학 연구에 포함된 대상체, 또는 대조군으로 이용된 대상체를 포함한다. 대상체는 이전에 VEGF 길항제로 치료된 적이 있을 수 있거나 또는 그렇게 치료되지 않았을 수 있다. 대상체는 본원의 치료를 시작한 경우에 사용되는 제2 의약을 투여받은 적이 없을 수 있는데(naive), 즉 대상체는 "기저수준" (즉, 본원의 치료 방법에서 제1 용량의 길항제를 투여하기 전의 설정 시점, 예컨대 치료 시작 전에 대상체를 스크리닝하는 날)에서 예를 들어 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제로 이전에 치료된 적이 없을 수 있다. 이러한 "투여받은 적이 없는" 대상체는 일반적으로 상기 제2 약물을 사용한 치료에 대한 후보인 것으로 간주된다.

표현 "유효량"은 혈관신생 장애의 치료에 효과적인 약물의 양을 나타낸다.

용어 "제약 제제"는 약물의 생물학적 활성이 유효하도록 해줄 수 있는 형태로 존재하고, 해당 제제가 투여되는 대상체에 대해 허용 가능하지 않은 수준으로 독성인 부가의 성분을 전혀 함유하지 않는 멸균성 제제를 나타낸다.

"멸균" 제제는 무균 상태이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 존재하지 않는다.

"포장 삽입물"은 치료 제품 또는 의약의 시판되는 포장물 내에 통상적으로 포함되어 있으며 적응증, 사용법, 용량, 투여, 금기 사항, 이러한 포장 제품과 조합될 기타 치료 제품 및/또는 이러한 치료 제품 또는 의약의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 지침서를 나타낸다.

"키트"는 혈관신생 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 시약, 예를 들어 의약 또는 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 포장물 또는 용기)이다. 제조품은 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 단위로서 판촉되거나 배급되거나 또는 판매된다.

의약(들)에 대한 비-반응의 목적을 위해, 이전의 또는 현재 하나 이상의 의약으로의 치료로부터 "임상적으로 허용되지 않는 높은 수준의 독성"을 경험한 대상체는 숙련된 임상의가 중요하다고 여기는 하나 이상의 부정적인 부작용 또는 이와 관련된 유해 사례, 예컨대, 예를 들어 심각한 감염, 울혈성 심부전, 탈수초 (다발성 경화증을 초래함), 유의한 과민증, 신경병리학적 사례, 높은 정도의 자가면역성, 암, 예컨대 자궁내막암, 비-호지킨 림프종, 유방암, 전립선암, 폐암, 난소암, 또는 흑색종, 결핵 (TB) 등을 경험한다.

"음성 부작용의 위험 감소"는, 본원의 길항제 치료로 인한 부작용의 위험이 이전에 투여된 의약을 동일 환자 또는 또 다른 환자에게 치료하여 관찰되는 위험보다 낮은 정도로 감소된 것을 의미한다. 이러한 부작용은 독성에 관하여 상기한 것들을 포함하고, 바람직하게는 감염, 암, 심부전 또는 탈수초이다.

"상관관계가 있다" 또는 "상관관계가 있는"은, 제1 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 임의의 방식으로 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 본원에서의 다양한 실시양태와 관련하여, 분석 검정의 결과를 사용하여 VEGF 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체를 사용한 특정 치료 방식이 수행되어야 하는지 여부를 결정할 수 있다.

용어 "표지"가 본원에 사용되는 경우, 이것은 시약, 예컨대 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합된 화합물 또는 조성물을 지칭하고, 그와 접합되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 한다. 표지는 그 자체가 검출가능할 수도 있고 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 기질 화합물 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변경을 촉매할 수도 있다. 상기 용어는 검출가능한 물질을 상기 프로브 또는 항체와 커플링 (즉, 물리적 연결)시킴으로써 프로브 또는 항체를 직접 표지하는 것 뿐만이 아니라 직접 표지되는 또 다른 시약과의 반응성에 의해 프로브 또는 항체를 간접적으로 표지하는 것도 포함한다. 간접 표지의 예는 형광 표지된 2차 항체를 사용하고 DNA 프로브를 비오틴으로 말단-표지하여 1차 항체가 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있게 하여 1차 항체를 검출하는 것을 포함한다.

용어 "발현의 수준" 또는 "발현 수준"은 상호교환가능하게 사용되고, 일반적으로 생물학적 샘플 중 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 생성물 또는 단백질의 양을 나타낸다. 일반적으로, "발현"은 유전자-코딩된 정보가 존재하는 구조로 전환되어 세포 내에서 작동하는 과정을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따라, 유전자의 "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 단백질로의 번역, 또는 심지어는 단백질의 번역후 변형을 나타낼 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 단백질, 또는 번역후 변형된 단백질의 단편 또한 이들이 대안적인 스플라이싱에 의해 생성된 전사체 또는 분해된 전사체 또는 단백질의 번역후 프로세싱, 예를 들어 단백질 분해로 생성된 것인지를 표현하는 것으로 간주된다. "발현된 유전자"는 mRNA로서의 폴리뉴클레오티드로 전사된 후에 단백질로 번역된 것 뿐만 아니라 RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않은 것 (예를 들어, 운반 및 리보솜 RNA)을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "공변량"은 환자와 관련이 있는 특정 변수 또는 정보를 나타낸다. 임상적 종점은 종종 회귀 모델에서 고려되며, 여기서 종점은 종속 변수를 나타내고 바이오마커는 주요 또는 표적 독립 변수 (리그레서(regressor))를 나타낸다. 임상 데이터 풀로부터의 추가의 변수가 고려된다면, 이들은 (임상적) 공변량으로 기재된다.

용어 "임상적 공변량"은 본원에서 일반적으로 기저수준에서 이용가능한, 환자에 관한 모든 임상적 정보를 기재하는데 사용된다. 이러한 임상적 공변량은 성별, 연령 등과 같은 통계학적 정보, 기타 기억 정보, 수반되는 질환, 동시 요법, 신체 검사의 결과, 수득된 통상의 실험 파라미터, 혈관신생 장애의 공지된 특성, 임상적 질환 병기분류, 사전치료의 시기 및 결과, 질환 병력, 뿐만 아니라 치료에 대한 임상 반응과 관련이 있을 수 있는 모든 유사한 정보를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "원시 분석(raw analysis)" 또는 "미조정 분석(unadjusted analysis)"은 고려되는 바이오마커 이외의 추가의 임상적 공변량이 독립적 인자로든 층별 공변량(stratifying covariate)이든 간에 회귀 모델에서 사용되지 않는 회귀 분석을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "공변량에 의해 조절된"은 고려되는 바이오마커 이외의 추가의 임상적 공변량이 독립적 인자로든 층별 공변량이든 간에 회귀 모델에서 사용되는 회귀 분석을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "단일변량"은 독립 변수로서 오직 1개의 표적 바이오마커만이 모델의 일부인 회귀 모델 또는 그래프식 접근법을 나타낸다. 이러한 단일변량 모델은 추가의 임상적 공변량과 함께 또는 이것 없이 고려될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "다변량"은 독립 변수로서 1종 초과의 표적 바이오마커가 모델의 일부인 회귀 모델 또는 그래프식 접근법을 나타낸다. 이러한 다변량 모델은 추가의 임상적 공변량과 함께 또는 이것 없이 고려될 수 있다.

III. VEGF 길항제에 반응성인 환자를 확인하기 위한 방법

본 발명은 VEGF 길항제 요법에 반응성일 가능성이 있는 환자를 확인 및/또는 모니터링하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 특히 VEGF 길항제를 환자에게 투여하는 것이 효과적일 가능성을 증가시키기에 유용하다. 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자 바이오마커의 발현을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 하나 이상의 이러한 바이오마커의 발현은 환자가 VEGF 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체에 반응성일지 여부의 지표이다. 보다 특히, 환자로부터의 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 이상의 유전자의 발현은 환자가 VEGF 길항제에 반응성 또는 감수성일지 여부를 모니터링하기에 유용하다. 일부 실시양태에서, 하기 군: ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현은 환자가 VEGF 길항제에 대해 반응성 또는 감수성일지 여부를 모니터링하기에 유용하다.

개시된 방법 및 검정은 환자를 치료하기에 적절하거나 또는 효과적인 요법을 평가하기에 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한, 편리하고, 효율적이며 잠재적으로 비용-효과적인 수단을 제공한다. 예를 들어, 환자는 VEGF 길항제로의 치료 이전 및 이후에 혈액 샘플을 제공할 수 있고, 샘플은 환자의 세포가 VEGF 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체인 치료제에 감수성일지 여부를 결정하기 위한 다양한 시험관내 검정의 방식에 의해 조사될 수 있다.

본 발명은 VEGF 길항제에 대한 환자의 감수성 또는 반응성을 모니터링하는 방법을 제공한다. 방법은 유전자 또는 단백질 발현을 검출하는 검정 (예컨대, PCR 및 효소 면역검정) 및 적절한 활성을 검출하는 생화학적 검정을 포함하는, 다양한 검정 포맷으로 수행될 수 있다. 샘플에서 이러한 바이오마커의 발현 또는 존재의 결정은 샘플을 제공한 환자가 VEGF 길항제의 생물학적 효과에 감수성이라는 것을 예측한다. 본원에서 출원인의 발명은 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 이상의 유전자(들)의 발현의 감소가 VEGF 길항제에 대한 이러한 환자의 관찰된 치료 효능과 관련이 있다는 것이다. 전형적으로, 대조군 샘플 (예를 들어, VEGF 길항제로의 치료 이전에 동일한 환자로부터 수득한 샘플, VEGF 길항제로 치료하지 않은 하나 이상의 관련되지 않은 개체(들)로부터 수득한 샘플 또는 모은 샘플)에서의 발현과 비교하여 유전자 중 하나 이상에서 발현의 약 1.5배, 1.6배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 이상의 감소 또는 측정된 모든 유전자의 평균 발현 수준으로부터 약 -2, -3, -4, -5, 또는 -6 이상의 표준 편차의 평균 log 비의 감소는 환자가 VEGF 길항제로의 치료에 대해 반응하거나 또는 이에 감수성일 것이라는 것을 나타낸다.

한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 혈관신생 장애를 갖는 환자에게 투여하기 이전 또는 이후에 수득한 환자로부터 수득한 샘플에서, 바이오마커로서, 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자 (예를 들어, ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18 중 하나 이상)의 발현을 평가하는 것을 포함하는, 혈관신생 장애를 갖는 환자가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할지 여부를 모니터링하는 방법을 제공한다. 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여한 후에 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현의 감소는 환자가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할 것이라는 것을 나타낸다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 VEGF 길항제에 대한 환자의 감수성 또는 반응성을 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자 샘플로부터의 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 이상의 유전자(들)의 유전자 발현을 평가하는 것, 및 VEGF 길항제에 대한 환자의 감수성 또는 반응성을 예측하는 것을 포함하고, 여기서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 이상의 유전자(들)의 발현의 감소가 VEGF 길항제로의 효과적인 치료에 대한 환자의 감수성 또는 반응성과 관련된다. 이 방법에 따라, 생물학적 샘플은 임의의 VEGF 길항제를 투여하기 전 및 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여한 후에 환자로부터 수득하고, 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 이상의 유전자(들)의 발현 생성물이 샘플에 존재하는지 평가하기 위한 검정을 수행한다. 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여한 후에 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 이상의 유전자(들)의 발현이 감소한다면, 환자는 VEGF 길항제로의 치료에 감수성 또는 반응성인 것으로 결정된다.

특히 진단 시험 및 치료제 처치의 적용에 관한 의학 분야의 숙련가는 생물학적 시스템이 다소 가변적이고 언제나 전체적으로 예측가능한 것이 아니기 때문에 여러가지 우수한 진단 시험 또는 치료제도 가끔 효과가 없다는 것을 알 것이다. 따라서, 시험 결과, 환자 상태 및 병력, 환자 고유의 경험을 기초로 하여 개개의 환자에게 가장 적절한 치료 과정을 결정하는 것은 궁극적으로 담당의의 판단에 달려 있다. 예를 들어, 심지어는 진단 시험 또는 다른 기준으로부터의 데이터를 기초로 하여 환자가 VEGF 길항제에 특히 감수성이 있는 것으로 예측되지 않는 경우라 할지라도, 특히 모든 또는 대부분의 다른 명백한 치료 옵션이 실패했다면, 또는 또 다른 처치가 행해지는 경우에 약간의 상승작용이 예측되는 경우에는 전문의가 환자에게 VEGF 길항제를 처치하는 것을 선택하는 경우가 있을 수 있다.

추가로 나타낸 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서 발현되는 본원에서 확인된 하나 이상의 유전자 바이오마커의 수준을 측정하는 것; 및 VEGF 길항제에 의한 억제에 대한 환자의 감수성을 예측하는 것을 포함하고, 여기서 하나 이상의 이들 유전자 바이오마커의 발현 수준은 VEGF 길항제로의 치료에 대해 효과적인 반응을 위한 환자의 높은 감수성과 관련되는 것인, VEGF 길항제로의 치료에 대한 환자의 감수성을 예측하거나, 또는 환자가 VEGF 길항제로의 치료에 대해 효과적으로 반응할지 예측하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 (a) VEGF 길항제에 대해 소정의 범위의 감수성을 나타내는 세포의 패널에서 후보 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 것, 및 (b) 세포에서 상기 후보 바이오마커의 발현 수준, 이에 대한 혈청 양성, 또는 이의 존재 및 VEGF 길항제에 대한 환자의 감수성 또는 반응성 사이의 관련성을 확인하는 것을 포함하고, 여기서 관련성은 상기 바이오마커의 발현 수준, 혈청 양성 또는 존재가 VEGF 길항제에 의한 치료에 대한 환자의 반응성을 예측한다는 것을 나타내는 것인, 발현 수준이 VEGF 길항제에 대한 특정 환자의 감수성 또는 반응성을 예측하는 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포의 패널은 환자 또는 실험 동물 모델로부터 유래된 샘플로부터 제조된 샘플의 패널이다. 추가의 실시양태에서, 세포의 패널은 마우스 이종이식에서 세포주의 패널이고, 여기서 반응성은 예를 들어 반응성의 분자 마커, 예를 들어 ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18 중 하나 이상을 모니터링하여 결정될 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 혈관신생 장애를 갖는 환자에게 투여하기 이전 및 이후에 수득한 환자로부터의 샘플에서 후보 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 후보 바이오마커의 발현의 감소는 바이오마커가 VEGF 길항제로의 혈관신생 장애의 보다 효과적인 치료에 대한 진단이라는 것을 나타내는 것인, VEGF 길항제에 대한 감수성 또는 반응성을 모니터링하기에 유용한 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 유전자이고, 그의 발현이 분석된다.

샘플은 혈관신생 장애를 갖는다고 의심되거나 혈관신생 장애를 갖는다고 진단되어 치료가 필요할 수 있는 환자로부터 또는 임의의 장애를 갖는 것으로 의심되지 않는 정상적인 개체로부터 수득할 수 있다. 마커 발현을 평가하기 위해서, 환자 샘플, 예컨대 세포, 또는 이들 세포에 의해 생성된 단백질 또는 핵산을 함유하는 샘플을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 바이오마커의 수준은 샘플 중 마커의 양 (예를 들어, 절대적인 양 또는 농도)을 평가하여 결정될 수 있고, 바람직하게는 검출가능한 수준의 바이오마커를 함유하는 체액 또는 배출물 중에서 평가한다. 본 발명에서 샘플로서 유용한 체액 또는 분비물은, 예를 들어 혈액, 소변, 타액, 대변, 흉수, 림프액, 가래, 복수, 전립선액, 뇌척수액 (CSF), 또는 임의의 다른 신체 분비물 또는 이들의 유도체를 포함한다. 단어 혈액은 전혈, 혈장, 혈청, 또는 혈액의 임의의 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 체액 또는 배출물 중 바이오마커의 평가는 침습적 샘플링 방법이 부적합하거나 불편한 상황에서 때때로 바람직할 수 있다. 그러나, 본원에서 시험할 샘플은 바람직하게는 혈액, 활막 조직, 또는 활액, 가장 바람직하게는 혈액이다.

샘플은 예컨대 동결되고/되거나 신선하고/하거나 고정 (예를 들어, 포르말린으로 고정시킴)되고/되거나 원심분리되고/되거나 매립 (예를 들어, 파라핀에 매립됨)될 수 있다. 물론, 세포 샘플은 샘플 중 마커의 양을 평가하기 전에 다양한 널리 공지된 수집후 정제 및 저장 기술 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 추출, 고정, 저장, 냉동, 한외여과, 농축, 증발, 원심분리 등)을 적용할 수 있다. 마찬가지로, 생검 역시 수집후 정제 및 저장 기술, 예를 들어 고정을 적용할 수 있다.

A. 유전자 발현의 검출

본원에 기재된 유전자 바이오마커는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 포유동물로부터의 조직 또는 세포 샘플은 노던, 도트-블롯팅 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석, 어레이 혼성화, RNase 보호 검정, 또는 DNA SNP 칩 마이크로어레이 (시판됨), 예컨대 DNA 마이크로어레이 스냅샷을 이용하여 예를 들어 관심 유전자 바이오마커로부터의 mRNA 또는 DNA에 대해 편리하게 검정될 수 있다. 예를 들어, 실시간 PCR (RT-PCR) 검정, 예컨대 정량적 PCR 검정은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 관심 유전자 바이오마커로부터 mRNA를 검출하는 방법은 하나 이상의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성하고; 이렇게 생산된 cDNA를 증폭시키고; 증폭된 cDNA의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 생물학적 샘플 중 mRNA의 수준을 결정할 수 있게 하는 (예를 들어, "하우스키핑(housekeeping)" 유전자, 예컨대 액틴 부류 구성원의 비교 대조군 mRNA 서열의 수준을 동시에 조사함) 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 증폭된 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.

1. 핵산의 검출

한 구체적 실시양태에서, 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 유전자의 발현은 RT-PCR 기술에 의해 수행될 수 있다. PCR에 사용되는 프로브는 검출가능한 마커, 예를 들어 방사선동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지될 수 있다. 이러한 프로브 및 프라이머는 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 발현된 유전자의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 매우 많은 상이한 프라이머 및 프로브를 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 제조할 수 있고, 클론의 증폭 및/또는 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 발현된 유전자의 존재 및/또는 수준을 결정하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다.

다른 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자로부터의 mRNA (예를 들어, ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18 mRNA)를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용함으로써, 시험 및 대조군 조직 샘플로부터의 시험 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, 프로브를 고체 지지체에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 상기 어레이를 이 어레이의 각 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있게 배열한다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현될 잠재력을 갖는 유전자의 선택물을 고체 지지체상에 배열할 수 있다. 특정 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는, 프로브가 유래된 샘플이 상기 유전자를 발현함을 나타낸다. 질환 조직의 차별적 유전자 발현 분석은 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술은 핵산 혼성화 기술 및 전산 기술을 이용하여 단일 실험 내에서 수천개의 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가한다 (예를 들어, WO 2001/75166 참조). 어레이 제작 논의를 위해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,700,637, 미국 특허 번호 5,445,934, 및 미국 특허 번호 5,807,522, 문헌 [Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)]; 및 [Cheung et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)]을 참조한다.

또한, EP 1753878에 기재된 마이크로어레이를 이용한 DNA 프로파일링 및 검출 방법을 이용할 수 있다. 이 방법은 짧은 병렬식 반복부 (STR) 분석 및 DNA 마이크로어레이를 사용하여 상이한 DNA 서열들 사이를 신속하게 확인하고 구별한다. 한 실시양태에서, 표지된 STR 표적 서열은 상보적 프로브를 보유하는 DNA 마이크로어레이에 혼성화된다. 이들 프로브는 소정 범위의 가능한 STR을 포함할 정도로 길이가 상이하다. DNA 하이브리드의 표지된 단일 가닥 영역은 혼성화후 효소 소화를 이용하여 마이크로어레이 표면으로부터 선택적으로 제거하였다. 미지의 표적 중 반복부의 수는 마이크로어레이에 혼성화된 채로 유지되는 표적 DNA의 패턴을 기초로 추정된다.

마이크로어레이 프로세서의 한 예는 애피메트릭스 진칩(Affymetrix GENECHIP)^® 시스템으로, 이것은 시판되며 유리 표면상에서 올리고뉴클레오티드를 직접 합성하여 제조된 어레이를 포함한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 다른 시스템이 이용될 수 있다.

RT-PCR 또는 또 다른 PCR-기재의 방법 이외에 바이오마커의 수준을 결정하는 다른 방법은 프로테오믹스 기술, 뿐만 아니라 분자 수준에서의 환자 반응을 기초로 하여 혈관신생 장애를 치료하는데 필요한 개별화된 유전자 프로파일을 포함한다. 본원에서의 특정 마이크로어레이, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 또는 cDNA 마이크로어레이는 하나 이상의 항-VEGF 항체에 대한 감수성 또는 내성과 상관관계가 있는 발현 프로파일을 갖는 하나 이상의 바이오마커를 포함할 수 있다.

상기 기술을 적용하는데 있어서의 지침을 제공하는 다수의 참조문헌이 입수가능하다 (문헌 [Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980)]; [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Inimunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)]; [Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984)]; [Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982)]; 및 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)]). 노덧 블롯 분석은 당업계에 주지된 통상적인 기술이고, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500]에 기재되어 있다. 유전자 및 유전자 생성물의 상태를 평가하기 위한 통상적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology] (유닛 2 (노덧 블롯팅), 4 (서던 블롯팅), 15 (이뮤노블롯팅) 및 18 (PCR 분석))에서 찾아볼 수 있다.

2. 단백질의 검출

단백질 바이오마커, 예컨대 ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18 중 하나 이상의 검출에 대해서와 같이, 예를 들어 다양한 단백질 검정이 이용가능하다. 예를 들어, 샘플을 항체-바이오마커 복합체의 형성에 충분한 조건하에 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후 상기 복합체를 검출할 수 있다. 단백질 바이오마커의 존재의 확인은 수많은 방법, 예컨대 웨스턴 블롯팅 (면역침전을 병용하거나 병용하지 않음), 2차원 SDS-PAGE, 면역침전, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 유동 세포계측, 및 혈장 또는 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플 검정을 위한 ELISA 절차로 수행될 수 있다. 이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,016,043, 4,424,279, 및 4,018,653을 참조한다. 이들은 비-경쟁 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 검정을 둘 모두 포함한다. 또한, 이러한 검정은 표적 바이오마커에 대한 표지된 항체의 직접 결합을 포함한다.

샌드위치 검정은 가장 유용하고 일반적으로 이용되는 검정 중 하나이다. 샌드위치 검정 기술의 수많은 변형이 존재하고, 모두가 본 발명에 포함된다. 간략하게, 전형적인 정방향 검정에서, 표지되지 않은 항체를 고체 기판에 고정시키고, 시험할 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 항체-항원 복합체 형성에 충분한 기간 동안의 적합한 인큐베이션 기간 후, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지되고 항원에 특이적인 2차 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 또 다른 복합체 형성에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척해 내고, 항원의 존재를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰하여 결정한다. 결과는 가시적인 신호의 단순 관찰에 의해 정성적일 수도 있고, 또는 공지된 양의 바이오마커를 함유하는 대조군 샘플과의 비교로 정량할 수도 있다.

정방향 검정의 변형은 결합된 항체에 샘플 및 표지된 항체 둘 모두를 동시에 첨가하는 동시 검정을 포함한다. 이들 기술은 쉽게 명백해질 임의의 근소한 변형을 포함하여 당업자에게 공지되어 있다. 전형적인 정방향 샌드위치 검정에서, 바이오마커에 특이성을 갖는 1차 항체는 고체 표면에 공유 또는 수동 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 일반적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크의 형태, 또는 면역검정 수행에 적합한 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 과정은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 가교 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척하였다. 이후, 시험할 샘플의 분취액을 고체 상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛이 결합할 수 있게 하는 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40℃, 예컨대 25℃ 내지 32℃ 포함)하에 충분한 기간 동안 (예를 들어, 2분 내지 40분 또는 보다 편리한 경우에는 밤새) 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 항체 서브유닛 고체 상을 세척하여 건조시키고, 바이오마커의 일부에 특이적인 2차 항체와 함께 인큐베이션한다. 2차 항체는 분자 마커에 대한 2차 항체의 결합을 표시하는데 사용되는 리포터 분자에 연결된다.

대안적인 방법은 샘플 중의 표적 바이오마커를 고정시킨 후, 상기 고정된 표적을 리포터 분자로 표지될 수도 있고 표지되지 않을 수도 있는 특이적 항체에 노출시키는 것을 포함한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 항체를 사용한 직접 표지에 의해 결합된 표적을 검출할 수 있다. 대안적으로, 1차 항체에 특이적인 제2 표지된 항체를 표적-1차 항체 복합체에 노출시켜 표적-1차 항체-2차 항체의 3원 복합체를 형성시킨다. 상기 복합체는 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용된 "리포터 분자"는 그의 화학적 성질에 의해 항원 결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 나타낸다. 이러한 유형의 검정에서 가장 일반적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사선핵종 함유 분자 (즉, 방사선동위원소) 및 화학발광 분자이다.

효소 면역검정의 경우에, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 퍼아이오데이트에 의해 2차 항체에 접합된다. 그러나, 쉽게 인지될 바와 같이, 당업자가 쉽게 이용가능한 다양한 여러가지 접합 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소는 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 특이적 효소와 함께 사용될 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의한 가수분해시에 검출가능한 색상 변화가 생성되는 것으로서 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼리성 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 상기한 발색 기질 보다는 형광 생성물을 생성하는 형광 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 모든 경우에서, 효소 표지된 항체를 1차 항체-분자 마커 복합체에 첨가하여 결합시킨 후에 잉여 시약을 세척해 낸다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 상기 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 신호를 생성할 것이고, 이는 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 표시하도록 일반적으로는 분광학적으로 추가로 정량될 수 있다. 대안적으로, 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 화합물이 이들의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 광을 사용한 조명으로 활성화될 때, 형광색소 표지 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학 현미경으로 가시적으로 검출가능한 특징적인 색상의 광을 방출한다. EIA에서와 같이, 형광 표지된 항체는 1차 항체-분자 마커 복합체에 결합하게 된다. 결합되지 않은 시약을 세척해 낸 후, 남아있는 3원 복합체를 적절한 파장의 광에 노출시키고, 관찰된 형광은 관심 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술 둘 모두 당업계에 널리 확립되어 있다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 화학발광 또는 생체발광 분자를 사용할 수도 있다.

B. 키트

바이오마커의 검출에 사용하기 위한 키트 또는 제조품도 본 발명에서 제공된다. 이러한 키트는 혈관신생 장애를 갖는 대상체가 VEGF 길항제에 대해 효과적으로 반응할 것인지 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 키트는 방법에 사용되는 별개의 요소 중 하나를 각각 포함하는 하나 이상의 용기 수단, 예컨대 바이알, 튜브 등을 가까이 모아 수용하도록 구획화된 운반 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 용기 수단 중 하나는 검출가능하게 표지된 것이거나 검출가능하게 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 각각 단백질 또는 메세지에 특이적인 항체 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 키트가 표적 핵산을 검출하기 위해 핵산 혼성화를 이용하는 경우에, 키트는 또한 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 뉴클레오티드(들)을 함유하는 용기, 및/또는 리포터 분자, 예컨대 효소, 형광 또는 방사성동위원소 표지에 결합된 리포터-수단, 예컨대 비오틴-결합 단백질, 예를 들어 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 용기를 가질 수 있다.

이러한 키트는 전형적으로 상기 기재된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용 지침서를 갖는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다. 조성물이 특정 용도로 사용된다는 것을 나타내는 라벨이 용기상에 존재할 수도 있고, 라벨이 생체내 또는 시험관내 사용, 예컨대 상기한 사용에 관한 지시 내용을 나타낼 수도 있다.

본 발명의 키트는 다수의 실시양태를 갖는다. 전형적인 실시양태는 용기, 상기 용기상의 라벨, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물을 포함하는 키트이고, 여기서 상기 조성물은 단백질 또는 자가항체 바이오마커에 결합하는 1차 항체를 포함하고, 상기 용기상의 라벨은 상기 조성물이 샘플 중 이러한 단백질 또는 항체의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내고, 상기 키트는 특정 샘플 유형 중 바이오마커 단백질의 존재를 평가하기 위해 항체를 사용하는 것에 관한 지침서를 포함한다. 키트는 샘플을 제조하고 항체를 샘플에 적용하기 위한 지침서 및 물질의 세트를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 1차 및 2차 항체 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 2차 항체는 표지, 예를 들어 효소 표지에 접합된다.

또 다른 실시양태는 용기, 상기 용기상의 라벨, 및 상기 용기내 함유되어 있는 조성물을 포함하는 키트이고, 여기서 조성물은 엄격한 조건하에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 바이오마커의 보체에 혼성화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및 조성물이 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 바이오마커의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내는 상기 용기상의 라벨을 포함하고, 키트는 특정 샘플 유형에서 바이오마커 RNA 또는 DNA의 존재를 평가하는데 폴리뉴클레오티드(들)을 사용하는 것에 대한 지침서를 포함한다.

키트의 다른 임의의 성분은 하나 이상의 완충제 (예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 기타 시약, 예컨대 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예를 들어, 색소원), 에피토프 복구 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다. 키트는 이 키트를 사용하여 얻은 결과를 해석하기 위한 지침서도 포함할 수 있다.

추가의 구체적인 실시양태에서, 항체-기재의 키트의 경우, 상기 키트는 예를 들어 (1) 바이오마커 단백질에 결합하는 제1 항체 (예를 들어, 고체 지지체에 부착됨), 및 임의로는 (2) 단백질 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능한 표지에 접합된 상이한 제2 항체를 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오티드-기재의 키트의 경우, 키트는 예를 들어 (1) 바이오마커 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 (2) 바이오마커 핵산 분자를 증폭시키는데 유용한 한 쌍의 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 예를 들어 완충제, 보존제 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출가능한 표지 (예를 들어, 효소 또는 기질)를 검출하는데 필요한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 검정되고 시험 샘플과 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 함유할 수 있다. 키트의 각 성분은 개개의 용기 내에 있을 수 있고, 모든 다양한 용기는 상기 키트를 사용하여 수행한 검정의 결과를 해석하는 것에 관한 지침서와 함께 단일 포장물 내에 있을 수 있다.

C. 통계

본원에 사용된 바와 같이, 일반적인 형태의 예측 규칙은 반응 또는 비-반응을 예측하거나, 또는 보다 일반적으로는 적합하게 규정된 임상적 종점과 관련하여 이점 또는 이점의 부재를 예측하는, 임상적 공변량을 잠재적으로 포함하는 1종 또는 여러 종의 바이오마커의 함수의 명세로 이루어진다.

가장 단순한 형태의 예측 규칙은 공변량이 없는 단일변량 모델로 이루어지며, 여기서 예측은 컷오프(cutoff) 또는 역치로 결정된다. 이것은 특정 컷오프 c 및 바이오마커 측정치 x에 대한 해비사이드(Heaviside) 함수와 관련하여 기재될 수 있고, 여기서 2원성 예측 A 또는 B가 생성되며, 이 때

H (x-c) = 0인 경우에는 예측 A이고,

H (x-c) = 1인 경우에는 예측 B이다.

이것이 단일변량 바이오마커 측정치를 예측 규칙에 이용하는 가장 단순한 방법이다. 이러한 단순한 규칙이 충분한 경우에는, 효과의 방향, 즉, 높거나 낮은 발현 수준이 환자에게 유익한지의 여부에 대한 단순 확인이 가능하다.

임상적 공변량이 고려될 필요가 있고/있거나 여러 바이오마커가 다변량 예측 규칙에 사용되는 경우에는 상황이 보다 복잡해질 수 있다. 하기하는 2가지 가설 예가 이와 관련된 문제를 예시한다:

공변량 조정 (가설 예):

바이오마커 X의 경우, 높은 발현 수준이 더 좋지 않은 임상 반응과 관련이 있다는 것이 임상 실험 집단에서 발견된다 (단일변량 분석). 보다 근접한 분석은 집단 내에 2가지 유형의 임상 반응이 있다는 것을 보여주고, 이 중 첫번째 군은 두번째 군보다 더 좋지 않은 반응을 갖고, 동시에 첫번째 군에 대한 바이오마커 발현은 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여한 후에 일반적으로 더 높다. 조정된 공변량 분석은 각각의 군에서 임상적 이점 및 임상 반응의 관련성이 역전된다는 것을 나타내고, 즉 군 내에서 보다 낮은 발현 수준이 보다 우수한 임상 반응과 관련이 있다는 것을 나타낸다. 전체적인 반대 효과는 예측 규칙의 일부가 방향을 역전시키기 때문에 공변량 유형 및 공변량 조정된 분석에 의해 가려진다.

다변량 예측 (가설 예):

바이오마커 X의 경우, 높은 발현 수준이 더 좋지 않은 임상 반응과 약간 관련이 있다는 것이 임상 실험 집단에서 발견된다 (단일변량 분석). 제2 바이오마커 Y의 경우, 유사한 관찰이 단일변량 분석으로 이루어진다. X 및 Y의 조합은 이들 바이오마커가 둘 모두 낮은 경우에는 우수한 임상 반응이 나타남을 보여준다. 이것은 이들 바이오마커가 둘 모두 약간의 컷오프 (및 해비사이드 예측 함수 관련) 미만인 경우에 규칙에 예측 이점을 부가한다. 조합 규칙의 경우, 단순한 규칙은 더 이상 단일변량 센스로 적용되지 않고; 예를 들어 X의 낮은 발현 수준을 갖는 것이 자동적으로 보다 우수한 임상적 반응을 예측하지 않을 것이다.

이러한 단순한 예는 공변량을 사용하거나 사용하지 않는 예측 규칙이 각 바이오마커의 단일변량 수준에 따라 판단될 수 없음을 보여준다. 다중 바이오마커의 조합 및 공변량에 의한 잠재적 조정은 단일 바이오마커에 단순한 관계를 부여하는 것을 허용하지 않는다. 특히 혈청 중의 마커 유전자는 다른 임상적 공변량을 잠재적으로 포함하는 다중 마커 예측 모델에서 사용될 수 있기 때문에, 이러한 모델 내에서 단일 마커 유전자의 유익한 효과의 방향은 단순한 방법으로는 결정될 수 없고, 단일변량 분석에서 발견되는 방향과 모순될 수 있다 - 즉, 단일 마커 유전자에 대해 기재된 바와 같은 상황이 일어날 수 있다.

임상의는 VEGF 길항제의 특정 투여 섭생의 유효성을 평가하는 것으로 당업계에 공지된 몇 가지 방법 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 예를 들어, 생체내 영상화 (예를 들어, MRI)는 종양 크기를 결정하고, 임의의 전이를 확인하여 요법에 대해 비교적 효과적인 반응성을 결정하는데 사용될 수 있다. 투여 방식은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 특정 용량을 투여할 수 있거나, 여러 회분으로 나눈 용량을 시간 경과에 따라 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 지시된 바에 따라서 용량을 감소시키거나 증가시킬 수 있다.

당업계 통상의 기술을 갖는 전문의는 특정 길항제의 유형과 같은 인자에 따라 필요한 제약 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 전문의는 바람직한 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 낮은 수준으로 제약 조성물에 사용되는 이러한 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체의 용량으로 시작하고, 바람직한 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 길항제의 주어진 용량 또는 치료 방식의 유효성은, 예를 들어 효능의 표준 측정치를 사용하여 환자에서 징후 및 증상을 평가하여 결정할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 대상체는 동일한 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체로 2회 이상 치료된다. 따라서, 초기 및 2차 길항제 노출은 바람직하게는 동일한 길항제로 수행되고, 더욱 바람직하게는 모든 길항제 노출이 동일한 길항제로 수행되는데, 즉 처음 2회의 노출, 바람직하게는 모든 노출에 대한 치료는 한 가지 유형의 VEGF 길항제, 예를 들어 VEGF에 결합하는 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체 (예를 들어, 모두 베바시주맙을 사용함)를 사용하여 수행된다.

본원에 열거된 본 발명의 모든 방법에서, 길항제 (예컨대, VEGF에 결합하는 항체)는 접합되지 않은 것, 예컨대 네이키드 항체일 수 있거나, 또는 예를 들어 반감기 개선과 같은 추가의 효과를 위해 또 다른 분자와 접합될 수도 있다.

본원에서 바람직한 길항제 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 보다 바람직하게는 항-VEGF 항체, 가장 바람직하게는 베바시주맙이다.

또 다른 실시양태에서, VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)는 대상체에게 투여되는 유일한 의약이다.

한 실시양태에서, 길항제는 매 1주, 2주, 3주 또는 4주마다 약 100 또는 400 mg의 용량으로 투여되거나 또는 매 1주, 2주, 3주 또는 4주마다 약 1, 3, 5, 10, 15 또는 20 mg/kg의 용량으로 투여되는 항-VEGF 항체이다. 용량은 주입과 같이 단일 용량으로 또는 다중 용량 (예를 들어, 2회 또는 3회 용량)으로 투여될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)를 첫번째로 투여한 후에 영상화 기술, 예컨대 방사선촬영 및/또는 MRI를 이용하여 종양 크기의 감소를 측정하는 것, 상기 길항제를 두번째로 투여한 후에 영상화 기술, 예컨대 방사선촬영 및/또는 MRI를 이용하여 혈관신생 장애를 갖는 대상체에서 종양 크기 감소를 측정하는 것, 첫번째와 두번째의 대상체에서의 영상화 소견을 비교하는 것, 및 스코어가 첫번째보다 두번째에서 더 낮은 경우에는 길항제를 계속 투여하는 것을 포함하는, 진단 단계 이후에 혈관신생 장애를 갖는 대상체에게 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)를 계속 투여할 것인지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.

다른 추가의 실시양태에서, 반응의 수준이 혈관신생 장애를 치료하는데 효과적인지 결정하기 위한 투여 단계 이후에 치료에 대한 대상체의 반응을 시험하는 단계가 치료 방법에 포함된다. 예를 들어, 투여후 영상화 (방사선촬영 및/또는 MRI) 스코어를 시험하고, 이것을 투여 이전에 수득된 기저수준 영상화 결과와 비교하여 이것이 변화되었는지 및 얼마나 변화되었는지를 측정함으로써 치료가 효과적인지의 여부를 결정하는 단계가 포함된다. 이러한 시험은 임의의 부분적 또는 완전한 차도의 유지를 결정하기 위해서 투여 이후에 다양한 예정되거나 예정되지 않은 시간 간격으로 반복될 수 있다. 대안적으로, 본원의 방법은 투여 이전에 상기 열거된 바와 같이 혈관신생 장애에 대한 하나 이상의 바이오마커 또는 증상이 존재하는지 여부를 알아보기 위해 대상체를 시험하는 단계를 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체 이외의 다른 의약이 혈관신생 장애를 치료하기 위해 대상체에게 투여되지 않는다.

본원의 임의의 방법에서, VEGF 길항제는 (VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)가 제1 의약인 경우에) 유효량의 제2 의약과 조합되어 투여될 수 있다. 적합한 제2 의약은 예를 들어 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제 또는 이들의 조합을 포함한다.

모든 이들 제2 의약은 서로 조합되어 사용할 수도 있거나, 또는 그 자체를 제1 의약과 함께 사용할 수도 있어, 본원에 사용된 바와 같은 "제2 의약"이라는 표현은 이것이 제1 약물에 추가되는 유일한 의약이라는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 제2 의약이 단일 의약일 필요는 없으나, 1종 초과의 이러한 약물로 구성되거나 이것을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 이들 제2 의약은 일반적으로 이전에 사용되던 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나 또는 지금까지 사용되던 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다. 이러한 제2 의약이 조금이라도 사용되는 경우, 바람직하게는 이들은 특히 제1 의약의 초기 투여 이후의 투여시에 제1 의약이 존재하지 않는 경우보다 더 적은 양으로 사용되어, 이에 의해 야기되는 부작용을 제거하거나 감소시킨다.

본원에 기재된 재처치 방법에서, 제2 의약이 길항제 노출과 함께 유효량으로 투여되는 경우, 이것은 임의의 노출, 예를 들어 오직 1회의 노출, 또는 1회 초과의 노출과 함께 투여된다. 한 실시양태에서, 제2 의약은 초기 노출과 함께 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 제2 의약은 초기 노출 및 제2 노출과 함께 투여된다. 추가의 실시양태에서, 제2 의약은 모든 노출과 함께 투여된다. 예컨대 스테로이드의 초기 노출 후 이러한 제2 의약의 양을 감소시키거나 없애서 부작용을 갖는 작용제, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 및 시클로포스파미드에 대한 대상체의 노출을 감소시키는 것이 바람직하다.

제2 의약의 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공동-투여 (동시 투여), 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 여기서 바람직하게는 둘 모두의 (또는 모든) 활성 작용제 (의약)가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는데에는 일정 기간이 있다.

본원의 길항제는 임의의 적합한 수단, 예컨대 비경구, 국소, 피하, 복강내, 폐내, 비내 및/또는 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내 (i.v.), 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 경막내 투여가 또한 고려된다. 또한, 길항제는 예를 들어 감소하는 용량의 길항제를 사용하는 펄스 주입에 의해 적합하게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 정맥내 또는 피하로, 보다 바람직하게는 정맥내 주입(들)에 의해 제공된다.

길항제의 다중 노출이 제공되는 경우, 각각의 노출은 동일한 또는 상이한 투여 수단을 사용하여 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 노출은 정맥내 투여에 의한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 노출은 피하 투여에 의해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 노출은 정맥내 및 피하 투여 둘 모두에 의해 제공된다.

한 실시양태에서, 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체는 정맥내 푸쉬 또는 볼루스 보다는 오히려 느린 정맥내 주입으로 투여된다. 예를 들어, 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론과 같은 스테로이드 (예를 들어, 약 80 내지 120 mg 정맥내, 보다 구체적으로 약 100 mg 정맥내)는 임의의 항-VEGF 항체 주입 약 30분 전에 투여된다. 항-VEGF 항체는, 예를 들어 전용 회선을 통하여 주입된다.

항-VEGF 항체에 대한 다중 용량 노출의 초기 용량에 대해, 또는 노출이 단지 1회분 용량 만을 포함하는 경우에는 단일 용량에 대해서는 이러한 주입을 약 50 mg/시의 속도로 시작하는 것이 바람직하다. 이는, 예를 들어 약 30분 마다 약 50 mg/시의 속도씩 단계적으로 상승시켜 최대 약 400 mg/시가 되도록 할 수 있다. 그러나, 대상체가 주입과 관련된 반응을 경험하게 되면, 주입 속도를, 예를 들어 현 속도의 절반으로, 예를 들어 100 mg/시에서 50 mg/시로 줄이는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 용량의 항-VEGF 항체 (예를 들어, 약 1000-mg 총 용량)의 주입은 약 255분 (4시간 15분)에 완료된다. 임의로, 주입을 시작하기 약 30분 내지 60분 전에 대상체에게 아세트아미노펜/파라세타몰 (예를 들어, 약 1 g) 및 디펜히드라민 HCl (예를 들어, 약 50 mg 또는 등가 용량의 유사 작용제)를 예방적으로 경구 처치한다.

총 노출을 달성하기 위해 항-VEGF 항체를 1회 초과 주입 (용량)으로 투여하는 경우에는, 이러한 주입 실시양태에서 제2 또는 후속 항-VEGF 항체 주입을 초기 주입 보다 고속으로, 예를 들어 약 100 mg/시로 시작하는 것이 바람직하다. 이러한 주입 속도는, 예를 들어 약 30분 마다 약 100 mg/시의 속도씩 단계적으로 상승시켜 최대 약 400 mg/시가 되도록 할 수 있다. 주입과 관련된 반응을 경험하는 대상체는 주입 속도를 현 속도의 절반으로, 예를 들어 100 mg/시에서 50 mg/시로 줄이는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 제2 또는 후속 용량의 항-VEGF 항체 (예를 들어, 약 1000-mg 총 용량)의 주입은 약 195분 (3시간 15분)에 완료된다.

바람직한 실시양태에서, 길항제는 항-VEGF 항체이고, 약 0.4 내지 4 g의 용량으로 투여되고, 보다 바람직하게는 항체는 약 1 개월의 기간 내에 1회 내지 4회 투여 빈도로 약 0.4 내지 1.3 g의 용량으로 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 용량은 약 500 mg 내지 1.2 g이고, 다른 실시양태에서는 약 750 mg 내지 1.1 g이다. 이러한 측면에서, 길항제는 바람직하게는 2회 내지 3회 용량으로 투여되고/거나 약 2 내지 3주의 기간 내에 투여된다.

한 실시양태에서, 대상체는 이전에 혈관신생 장애를 치료하기 위한 어떠한 약물(들)도 투여받은 적이 없다. 또 다른 측면에서, 대상체 또는 환자는 혈관신생 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 의약(들)을 이전에 투여받은 적이 있다. 추가의 실시양태에서, 대상체 또는 환자는 이전에 투여된 적이 있는 하나 이상의 의약에 반응성이 아니었다. 대상체가 비-반응성일 수 있는 이러한 약물은 예를 들어 항신생물제, 화학요법제, 세포독성제 및/또는 성장 억제제를 포함한다. 보다 특히, 대상체가 비-반응성일 수 있는 약물은 VEGF 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체를 포함한다. 추가의 측면에서, 이러한 길항제는 항체 또는 이뮤노어드헤신을 포함하여, 대상체가 이전에 비-반응성이었던 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 이뮤노어드헤신을 사용한 재치료가 고려된다.

IV. 길항제로의 치료

길항제로의 치료에 대해 가장 반응성 또는 감수성인 환자 집단이 확인되면, 본원의 길항제를 단독으로 또는 다른 의약과 조합하여 사용한 치료는 혈관신생 장애를 개선시킨다. 예를 들어, 이러한 치료는 종양 크기 감소 또는 무진행 생존을 나타낼 수 있다. 추가로, 본원의 길항제 및 하나 이상의 제2 의약(들)의 조합물로의 치료는 바람직하게는 환자에게 부가적인, 더욱 바람직하게는 상승작용적인 (또는 부가적인 것보다 더 우수한) 치료 이점을 나타낸다. 바람직하게는, 이 조합 방법에서, 제2 의약의 1회 이상의 투여와 본원의 길항제의 1회 이상의 투여 사이의 시간 간격은 약 1개월 이하, 더욱 바람직하게 약 2주 이하이다.

의학 분야의 숙련가는, VEGF 길항제에 대한 환자의 가능한 반응성을 진단한 후에 상기 환자에게 치료 유효량의 VEGF 길항제를 투여하는 정확한 방식이 담당의의 판단에 따라 좌우될 것임을 알 것이다. 투여 방식, 예컨대 투여량, 다른 작용제와의 조합, 투여 시기 및 빈도 등은 이러한 길항제에 대한 환자의 가능한 반응성의 진단 뿐만 아니라 환자의 상태 및 병력에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 심지어 상대적으로 길항제에 대해 감수성이지 않을 것으로 예측된 혈관신생 장애로 진단된 환자는 여전히 길항제로의 치료로부터, 특히 다른 작용제 (길항제에 대한 환자의 반응성을 변경시킬 수 있는 작용제)와 조합된 길항제로의 치료로부터 이익을 얻을 수 있다.

길항제를 포함하는 조성물은 양호한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제제화되어 용량에 따라 분배되고 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 인자는 치료할 혈관신생 장애의 특정 유형, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 혈관신생 장애의 원인, 길항제의 전달 부위, 가능한 부작용, 길항제의 유형, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 전문인에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 투여할 길항제의 유효량은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이다.

일반적인 제안으로, 1회 이상의 투여량에 의해 용량 당 비경구 투여되는 길항제의 유효량은 약 20 mg 내지 약 5000 mg의 범위일 것이다. 항체, 예컨대 항-VEGF 항체를 위한 예시적 투여 방식은 매 1주, 2주, 3주 또는 4주마다 100 또는 400 mg을 포함하거나, 또는 매 1주, 2주, 3주 또는 4주마다 약 1, 3, 5, 10, 15 또는 20 mg/kg의 용량이 투여된다. 용량은 주입과 같이 단일 용량으로서 또는 다중 용량 (예를 들어, 2회 또는 3회 용량)으로서 투여될 수 있다.

그러나, 상기 언급된 바와 같이, 이들 제안된 길항제의 양은 수 많은 치료적 재량에 따라 결정된다. 적당한 용량을 선택하고 스캐줄을 작성하는 데에 있어서의 주요 요인은 상기 표시된 바와 같이 수득된 결과이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 가능한 혈관신생 장애의 첫번째 신호, 진단, 시작 또는 발생과 가까운 시점에 투여된다.

길항제는 임의의 적합한 수단, 예컨대 비경구, 국소, 피하, 복강내, 폐내, 비내, 및/또는 병변내 투여에 의해 투여한다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 경막내 투여가 또한 고려된다. 또한, 길항제는 적합하게는 예를 들어 길항제의 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는, 투여는 정맥내 주사에 의해 제공된다.

본원의 길항제와 함께, 상기에 언급한 바와 같이, 제2 의약을 투여할 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 동시 투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 이때, 바람직하게는 2종 (또는 모든) 활성제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다.

길항제를 상기 언급된 바와 같은 전통적인 경로에 의해 환자에게 투여하는 것 이외에도, 본 발명은 유전자 요법에 의한 투여를 포함한다. 길항제를 코딩하는 핵산을 이와 같이 투여하는 것은 "유효량의 길항제 투여"라는 표현에 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성시키기 위한 유전자 요법의 이용에 관한 WO 1996/07321을 참고한다.

핵산 (임의로 벡터에 함유된 것)을 생체내 및 생체외에서 환자의 세포에 도입하기 위한 2가지 주요 접근법이 있다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 통상적으로 길항제가 필요한 부위에서 환자에게 직접 주사된다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 제거하고, 핵산을 이들 단리된 세포에 도입하고, 변형된 세포를 직접 또는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화시켜 환자에게 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 살아있는 세포에 도입하는 다양한 기술이 이용가능하다. 이러한 기술은 핵산이 시험관내 배양된 세포 내로 전달되는지 또는 의도한 숙주의 세포로 생체내 전달되는지의 여부에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포로 시험관내 전달하는데 적합한 기술은 리포솜, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 이용을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 일반적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기재의 시스템 (유전자의 지질 매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 사용한 형질감염을 포함한다. 일부 상황에서는, 핵산 공급원에 표적 세포에 대해 특이적인 작용제, 예를 들어 표적 세포상의 세포 표면 막 단백질에 특이적인 항체, 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드 등을 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜을 사용하는 경우에는, 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포 유형에 대해 지향성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화되는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질을 표적화하고/하거나 이것의 흡수를 용이하게 하는데 이용할 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입 기술은, 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., PNAS USA 87:3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자-표식 및 유전자-요법 프로토콜은, 예를 들어 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)] 및 WO 1993/25673에 기재되어 있다.

VEGF 길항제는 조합 요법으로서의 투여 방식 또는 제약 조합 제제에서, 항암 특성을 지닌 하나 이상의 추가의 화합물과 조합될 수 있다. 제약 조합 제제 또는 투여 방식의 하나 이상의 추가의 화합물은 VEGF 길항제 조성물에 대한 상보적 활성을 지녀, 이들이 서로 불리한 영향을 미치지 않도록 하는 것이 바람직하다.

하나 이상의 추가의 화합물은 화학요법제, 세포독성제, 시토카인, 성장 억제제, 항호르몬제, 및 이들의 조합물일 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다. VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)를 함유하는 제약 조성물은 또한 치료 유효량의 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

한 측면에서, 제1 화합물은 항-VEGF 항체이고, 하나 이상의 추가의 화합물은 항-VEGF 항체가 아닌 다른 치료 항체이다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 화합물은 암 세포 표면 마커와 결합하는 항체이다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 화합물은 항-HER2 항체, 트라스투주맙 (예를 들어, 헤르셉틴^®, 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코)이다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 화합물은 항-HER2 항체, 퍼투주맙 (옴니타르그^TM), 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코, US6949245 참조)이다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 화합물은 항체 (네이키드 항체 또는 ADC)이고, 추가의 항체는 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 이상의 항체이므로, 이러한 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 이상의 항체 (네이키드 또는 ADC)의 조합물이 혈관신생 장애를 치료하는 데에 효능이 있다.

방사선 요법 및/또는 골수 및 말초 혈액 이식, 및/또는 세포독성제, 화학요법제, 또는 성장 억제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 본 발명에 따른 다른 치료 방식은 VEGF-길항제 항암제의 투여를 포함한다. 이러한 실시양태 중 하나에서, 화학요법제는, 예를 들어 시클로포스파미드, 히드록시다우노루비신, 아드리아마이신, 독소루비신, 빈크리스틴 (온코빈^TM), 프레드니솔론, CHOP, CVP, 또는 COP, 또는 면역요법제, 예컨대 항-PSCA, 항-HER2 (예를 들어, 헤르셉틴^®, 옴니타르그^TM)와 같은 작용제 또는 작용제 조합물이다. 조합 요법은 동시 또는 순차 요법으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합물은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 공동 투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 이때, 바람직하게는 둘 모두의 (또는 모든) 활성제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다.

한 실시양태에서, 항-VEGF 항체로의 치료가 본원에서 확인된 항암제와, 하나 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제의 조합 투여 (이에는 상이한 화학요법제의 칵테일을 동시 투여하는 것이 포함됨)를 포함한다. 화학요법제에는 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라시클린 항생제가 포함된다. 이러한 화학요법제를 위한 제제 및 투여 스케줄은 제조사의 지침에 따라 또는 숙련된 전문인에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용할 수 있다. 상기 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케줄은 또한 문헌 ["Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md]에 기재되어 있다.

상기한 공동 투여되는 작용제 중 임의의 것에 대한 적합한 투여량은 현재 이용되고 있는 것이며, 새로 확인된 작용제 및 기타 화학요법제 또는 치료제의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 저하될 수 있다.

조합 요법은 "상승작용 효과"를 제공할 수 있고, "상승작용 효과를 갖는다"는 것이 입증될 수 있고, 즉 활성 성분들이 함께 사용되는 경우에 달성되는 효과가 이러한 화합물을 별개로 사용할 때 달성되는 효과의 합보다 더 우수하다. 상승작용 효과는 활성 성분들이 (1) 공동-제제화되어 투여되거나 조합된 단위 투여 제제 중에서 동시에 전달되는 경우, (2) 별개의 제제로서 교대로 전달되거나 동시에 전달되는 경우, 또는 (3) 일부 다른 방식으로 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우의 상승작용 효과는 화합물들이 순차적으로 투여되거나 전달되는 경우, 예를 들어 별개의 주사기에서 상이한 주사로 순차적으로 투여되거나 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는 유효 투여량의 각 활성 성분이 순차적으로, 즉 연속적으로 투여되지만, 조합 요법에서는 유효 투여량의 2종 이상의 활성 성분들이 함께 투여된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 추가의 치료제의 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과 상태, 예방 또는 치료 목적으로 VEGF 길항제 및 추가의 작용제를 투여받고 있는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 병력 및 VEGF 길항제 및 추가의 작용제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. VEGF 길항제 및 추가의 작용제는 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료로서 투여된다. VEGF 길항제는 전형적으로 상기에 열거된 바와 같이 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 의존하여, 예를 들어 1회 이상의 별도의 투여에 의해 투여하든지 또는 연속 주입에 의해 투여하든지, 추가의 작용제의 약 20 mg/m² 내지 600 mg/m²이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 한 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라 약 또는 약 20 mg/m², 85 mg/m², 90 mg/m², 125 mg/m², 200 mg/m², 400 mg/m², 500 mg/m² 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그보다 오랜 기간에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라서 치료는 질환 증상이 원하는 수준으로 저해될 때까지 지속된다. 따라서, 약 20 mg/m², 85 mg/m², 90 mg/m², 125 mg/m², 200 mg/m², 400 mg/m², 500 mg/m², 600 mg/m² (또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주, 또는 매 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 추가의 작용제의 약 2회 내지 약 20회, 예를 들어 약 6회 용량이 환자에게 제공되도록 함). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.

V. 제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 길항제의 치료 제제는, 원하는 정도의 순도를 갖는 길항제를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 동결건조된 제제 또는 수용액제 형태로 저장하도록 제조된다. 제제화와 관련된 일반적인 정보의 경우, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press]; [A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990)], [Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania.]; [Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York]; [Lieberman et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York]; 및 [Lieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker]을 참조한다.

허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈^TM, 플루로닉스^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

예시적 항-VEGF 항체 제제는 미국 특허 번호 6,884,879에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 단일 사용 바이알에서 25 mg/㎖로 제제화된다. 특정 실시양태에서, 100 mg의 항-VEGF 항체는 240 mg α,α-트레할로스 2수화물, 23.2 mg 인산나트륨 (일염기성, 1수화물), 4.8 mg 인산나트륨 (이염기성 무수물), 1.6 mg 폴리소르베이트 20, 및 주사용수, USP로 제제화된다. 특정 실시양태에서, 400 mg의 항-VEGF 항체는 960 mg α,α-트레할로스 2수화물, 92.8 mg 인산나트륨 (일염기성, 1수화물), 19.2 mg 인산나트륨 (이염기성 무수물), 6.4 mg 폴리소르베이트 20, 및 주사용수, USP로 제제화된다.

피하 투여에 적합한 동결건조 제제는 예를 들어 미국 특허 번호 6,267,958 (Andya et al.)에 기재되어 있다. 이러한 동결건조 제제는 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제가 본원에서 치료될 포유동물에게 피하 투여될 수 있다.

길항제의 결정화된 형태도 고려된다. 예를 들어, US2002/0136719A1 (Shenoy et al.)을 참조한다.

본원에서의 제제는 또한 1종 초과의 활성 화합물 (상기 언급된 바와 같은 제2 의약), 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수도 있다. 이러한 의약의 유형 및 유효량은, 예를 들어 제제 중에 존재하는 VEGF 길항제의 양 및 유형, 및 대상체의 임상적 파라미터에 따라 달라진다. 바람직한 이러한 제2 의약은 상기 언급되어 있다.

활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지속 방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형 용품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)^TM (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

실시예

하기 실시예는 여기서 청구되는 본 발명을 설명하기 위해 제공되나, 이에 한정되지는 않는다.

통계적 방법

통계 작업은 다음 단계를 포함할 수 있다:

ㆍ 1. 후보 바이오마커의 사전 선택

ㆍ 2. 관련 임상적 효능 반응 예측 공변량의 사전 선택

ㆍ 3. 단일변량 수준에서 바이오마커 예측 함수의 선택

ㆍ 4. 단일변량 수준에서 임상적 공변량을 포함하는 바이오마커 예측 함수의 선택

ㆍ 5. 다변량 수준에서 바이오마커 예측 함수의 선택

ㆍ 6. 다변량 수준에서 임상적 공변량을 포함하는 바이오마커 예측 함수의 선택

다음 내용은 상기한 여러 단계를 상세하게 기재한다:

1: 후보 바이오마커의 사전 선택.

후보 바이오마커의 통계적 사전 선택은 임상적 이점의 측정치와의 관련성의 강도에 따른다. 이러한 목적을 위해서, 여러가지 임상적 종점을 유도된 대용 스코어, 예를 들어 TTP에 관한 임상적 이점 스코어 정도에 관한 통상적 할당치 (관찰 중단을 피함)로 변환시킬 수 있다. 이러한 변환된 대용 측정치는 단순한 상관관계 분석을 위해, 예를 들어 비모수(非母數) 스피어만(Spearman) 랭크 상관관계 접근법을 통해 쉽게 사용될 수 있다. 대안책은 바이오마커 측정치를 시간-대-사건 회귀 모델, 예를 들어 콕스(Cox) 비례 위험 회귀에서의 계량 공변량으로 사용하는 것이다. 바이오마커 값의 통계적 분포에 따라, 이러한 단계는 일부 사전-프로세싱, 예를 들어 분산-안정화 변환 및 적합한 스케일의 사용 또는 대안적으로 표준화 단계, 예컨대 원시 측정치 대신 백분위수의 사용을 필요로 할 수 있다. 추가의 접근법은 예를 들어 단일 환자를 기초로 한 산란점 (x-축 = 바이오마커 값, y-축 = 임상적 이점의 측정치)을 나타내어 이변량 산포도를 조사하는 것이다. 예를 들어 스플라인을 부드럽게 하여 달성되는 바와 같은 일부 비모수 회귀선이 바이오마커 및 임상적 이점의 관계를 가시화하기에 유용할 수 있다.

이러한 여러가지 접근법의 목적은, 사용된 이점 측정치 중 적어도 하나에서 임상적 이점과의 일부 관련성을 보여주지만 다른 측정치에 대한 결과와 모순되지 않는 바이오마커 후보물질의 사전 선택이다. 이용가능한 대조군이 있는 경우, 상이한 측면에서 바이오마커와 임상적 이점의 관련성에서의 차이는 바이오마커(들)을 추가로 고려하기에 적절하게 하는 차별적 예측의 징후일 수 있다.

2: 적절한 임상 효능 반응 예측 공변량의 사전 선택.

본원에 정의된 바와 같은 임상적 공변량의 통계적 사전 선택은 바이오마커의 사전 선택을 위한 접근법과 유사하고, 또한 임상적 이점의 측정치와의 관련성의 강도와에 따른다. 따라서, 원칙적으로, 상기 1번에서 고려된 것과 동일한 방법이 적용된다. 통계적 기준에 추가하여, 임상적 경험 및 이론적 지식으로부터의 기준이 관련 임상적 공변량의 사전 선택에 적용될 수 있다.

임상적 공변량의 예측 값은 바이오마커의 예측 값과 상호작용할 수 있다. 이들은 필요한 경우에는 규정된 예측 규칙에 따라 고려될 것이다.

3: 단일변량 수준에서의 바이오마커 예측 함수의 선택.

용어 "예측 함수"는 일반적인 의미에서 표적 예측을 제공하도록 조절된 수를 생성하는 바이오마커 측정치의 수치적 함수를 의미하는데 사용될 것이다.

간단한 예는 특정 컷오프 c 및 바이오마커 측정치 x에 대한 해비사이드 함수의 선택이고, 여기서 2원성 예측 A 또는 B가 생성될 것이며, 이때

H (x-c) = 0인 경우에는 예측 A이고,

H (x-c) = 1인 경우에는 예측 B이다.

이것이 아마도 단일변량 바이오마커 측정치를 예측 규칙에 이용하는 가장 일반적인 방법일 것이다. 상기한 바와 같이 "예측 함수"의 정의는 예측 가능성을 조사하는데 사용될 수 있는 기존의 트레이닝 데이터 세트에 대한 언급을 포함한다. 상이한 경로를 이용하여 트레이닝 세트로부터 적합한 컷오프 c를 구할 수 있다. 우선, 1번에서 언급된 부드러운 스플라인을 갖는 산포도를 이용하여 컷오프를 정할 수 있다. 대안적으로, 분포의 몇가지 백분위수, 예를 들어 중앙값 또는 사분위수를 선택할 수 있다. 컷오프는 또한 임상적 이점의 측정치에 관한 예측 능력에 따라 모든 가능한 컷오프를 조사하여 체계적으로 추출될 수 있다. 이후, 이러한 결과를 플롯팅하여 매뉴얼을 선택하거나 최적성을 위한 일부 검색 알고리즘을 이용할 수 있다. 이것은 콕스 모델을 사용한 특정 임상적 종점을 기초로 실현될 수 있으며, 여기서의 각각의 시험 컷오프에서 바이오마커는 2원성 공변량으로 사용된다. 이후, 임상적 종점에 대한 결과를 함께 고려하여 종점 둘 모두와 유사한 예측을 보여주는 컷오프를 선택할 수 있다.

예측 함수를 선택하는 또 다른 비통상적인 접근법은 트레이닝 세트 및 바이오마커 값 (가능하게는 변환된 값)을 공변량으로 하여 수득된 고정된 파라미터 콕스 회귀 모델을 기초로 할 수 있다. 추가의 가능성은 약간의 우도비 (또는 그의 일률적 변환)에 대한 결정을 기초로 하는 것이며, 여기서 표적 확률 밀도는 예측 상태의 분리를 위해 트레이닝 세트에서 사전 결정된다. 이후, 바이오마커는 예측 기준의 일부 함수와 연결지어 진다.

4: 단일변량 수준에서의 임상적 공변량을 포함하는 바이오마커 예측 함수의 선택.

단일 변량은 오직 하나의 바이오마커를 사용하는 것을 나타낸다 -- 임상적 공변량에 관해서, 이것은 다변량 모델일 수 있다. 이 접근법은 임상적 공변량을 사용하지 않는 검색과 대등하지만, 상기 방법이 관련 공변량 정보의 혼입을 허용해야 한다는 점은 예외이다. 컷오프 선택의 산포도 방법은 오직 제한된 공변량 사용만을 허용하며, 예를 들어 2원성 공변량은 플롯 내에 코딩된 색상일 수 있다. 분석이 일부 회귀 접근법에 의존적인 경우, 공변량의 사용 (또한, 이들 중 많은 것들의 동시 사용)이 일반적으로 용이해진다. 상기 3번에 기재된 콕스 모델을 기초로 하는 컷오프 검색은 공변량의 용이한 혼입을 허용하여 공변량 조절된 단일변량 컷오프 검색을 유도한다. 공변량에 의한 조절은 상기 모델에서의 공변량으로서 또는 계층화된 분석 내에 포함시켜서 수행될 수 있다.

또한, 예측 함수의 다른 대안은 공변량의 혼입을 허용한다.

이것은 예측 함수로서 콕스 모델을 선택하게 한다. 이것은 예를 들어 다양한 연령 군의 경우에 상이한 예측 기준을 적용한다는 것을 의미하는, 상호 작용 수준에 대한 공변량의 영향을 추정하기 위한 옵션을 포함한다.

예측 함수의 우도비 유형의 경우, 예측 밀도는 공변량을 포함하여 추정되어야 한다. 이러한 목적상, 다변량 패턴 인식의 방법이 이용될 수도 있고, 또는 바이오마커 값이 공변량에 대한 다중 회귀에 의해 조절될 수도 있다 (밀도 추정 이전).

바이오마커 (원시 측정 수준) 및 임상적 공변량을 사용하고 반응으로서 임상적 이점 측정치를 사용하는 CART (Classification and Regression Trees) 기술 (문헌 [Breiman et al. (Wadsworth, Inc.: New York, 1984)])이 이러한 목적에 사용될 수 있다. 컷오프를 조사하고, 함수의 의사결정-트리 유형은 예측을 위한 공변량을 포함하는 것으로 확인될 것이다. CART에 의해 선택된 컷오프 및 알고리즘은 흔히 최적에 가깝고, 상이한 임상적 이점 측정치를 고려하여 조합되고 단일화될 수 있다.

5: 다변량 수준에서의 바이오마커 예측 함수의 선택.

상이한 단일변량 예측 함수 선택 내에 예측 잠재력을 유지하는 여러 바이오마커 후보물질이 존재하는 경우, 바이오마커를 조합하여, 즉 다변량 예측 함수를 고려하여 추가의 개선이 달성될 수 있다.

단순한 해비사이드 함수 모델을 기초로 하여, 예를 들어 최적의 컷오프가 표시된 바이오마커 값의 이변량 산포도를 고려하여 바이오마커의 조합을 평가할 수 있다. 이후, 논리적인 "AND" 및 "OR" 연산자에 의해 여러가지 해비사이드 함수를 조합하여 바이오마커의 조합을 달성함으로써 예측이 개선될 수 있다.

다양한 바이오마커 (원시 측정 수준) 및 반응으로서의 임상적 이점 측정치를 이용하는 CART 기술을 이러한 목적에 이용하여 바이오마커에 대한 컷오프 및 함수의 의사결정-트리 유형을 구하여 예측을 달성할 수 있다. CART에 의해 선택된 컷오프 및 알고리즘은 흔히 최적에 가깝고, 상이한 임상적 이점 측정치를 고려하여 조합되고 단일화될 수 있다.

콕스 회귀는 상이한 수준으로 이용될 수 있다. 첫번째 방법은 2원성 방법으로 다중 바이오마커를 혼입하는 것이다 (즉, 몇가지 컷오프를 사용한 해비사이드 함수를 기초로 함). 다른 옵션은 바이오마커를 계량적 방법 (적절한 변환 이후) 또는 2원성 및 계량적 접근법의 혼합 방식으로 이용하는 것이다. 개발되는 다변량 예측 함수는 상기 3번에 기재된 바와 같이 콕스 유형의 것이다.

다변량 우도비 접근법은 실시하기 어렵지만, 다변량 예측 함수에 대한 또 다른 옵션을 제공한다.

6: 다변량 수준에서의 임상적 공변량을 포함하는 바이오마커 예측 함수의 선택.

적절한 임상적 공변량이 존재하는 경우, 다중 바이오마커를 다중 임상적 공변량과 조합하여 추가의 개선을 달성할 수 있다. 상이한 예측 함수 선택은 임상적 공변량을 포함하기 위한 가능성과 관련하여 평가될 것이다.

바이오마커에 대한 해비사이드 함수의 단순한 논리적 조합을 기초로 하여, 추가의 공변량을 트레이닝 세트에서 구한 로지스틱 회귀 모델을 기초로 하는 예측 함수에 포함시킬 수 있다.

CART 기술 및 개발되는 의사결정-트리는 이들을 예측 알고리즘에 포함시키는 추가의 공변량과 함께 쉽게 사용될 수 있다.

콕스 회귀를 기초로 하는 모든 예측 함수는 추가의 임상적 공변량을 사용할 수 있다. 상호작용 수준에 대한 공변량의 영향을 추정하기 위한 옵션이 있으며, 이것은 예를 들어 상이한 연령 군에는 상이한 예측 기준이 적용된다는 것을 의미한다.

다변량 우도비 접근법은 추가의 공변량 사용으로 직접 확장될 수 없다.

실시예 1

본 실시예는 VEGF 길항제에 대한 환자의 반응성 또는 감수성을 예측하기에 유용한 바이오마커의 확인을 기재한다.

마우스 췌장암 모델로부터의 종양을 대조군 또는 항-VEGF 항체로 치료하고 7일 후에 단리하였다. 이 시점에서 혈관 표면 구역에 대한 예측된 큰 항-VEGF 효과가 관찰되었다. 본 발명자들은 특히 항-VEGF 치료에 의해 변경된 전사체를 확인하기 위해 마이크로어레이 분석을 수행하였다.

간략하게, 1 ㎍의 총 RNA를 T7 프로모터 프라이머 및 MMLV-RT (애질런트(Agilent), 낮은 RNA 투입 형광 선형 증폭 키트, 제품# 5184-3523)를 사용하여 이중-가닥 cDNA로 전환시켰다. cDNA 합성 후에, cRNA를 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 합성하고, 동시에 시아닌 3- 또는 시아닌 5-표지된 CTP를 혼입시켰다. 표지된 cRNA를 친화도 수지 컬럼 (RNeasy 미니 키트, 퀴아젠(Qiagen)) 상에서 정제하였다. 표지된 cRNA의 양을 260 nm에서의 흡광도를 측정하고, 260 nm에서의 1 OD가 40 ㎍/㎖의 RNA에 상응한다는 관례를 사용하여 결정하였다. 염료의 혼입은 시아닌 3- 및 시아닌 5-표지된 CTP의 흡광도를 측정하는 나노드롭(NanoDrop) ND-1000 분광광도계 (나노드롭 테크놀로지스(NanoDrop Technologies), 독일 윌밍톤)를 사용하여 샘플을 측정함으로써 결정하였다. 750 ng의 시아닌 3-표지된 유니버셜(Universal) 인간 참조 cRNA (스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라 졸라, 제품# 740000) 및 750 ng의 시아닌 5-표지된 cRNA를 단편화 완충제 (애질런트 계내 혼성화 키트-플러스, 제품# 5184-3568)에서 30분 동안 60℃에서 인큐베이션함으로써 단편화시켰다. LiCl 및 리튬 라우릴 술페이트를 함유하는 혼성화 완충제를 첨가하여 단편화를 종결시켰다. 로티세리(rotisserie) 오븐에서 18시간 동안 60℃에서 애질런트 마이크로어레이에 샘플을 혼성화시켰다. 어레이를 SSC 완충제를 사용하여 세척하고, 아세토니트릴을 사용하여 건조시켰다. 어레이를 애질런트 G2505B 모델 스캐너(Scanner)에서 스캐닝하였다. 발현 신호를 애질런트 특징 추출 소프트웨어 (버전 7.5 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 팔로 알토)를 사용하여 계산하였다.

마이크로어레이 혼성화는 40,009개 프로브 세트에 대한 데이터를 생성하였다 (이들 중 37,710개는 두 가지 치료의 모든 복제물에 존재함). 40,009개 프로브 세트는 21,200개 유전자의 전사 존재량의 측정값에 상응하고, 이들 중 20,503개는 두 가지 조건 중 각각에 대한 모든 5개 복제물에 존재한다. 각각의 프로브 세트에 대한 평균 값은 각각의 치료군에 대해 결정하였다. 이들 평균의 비교는 항-VEGF 항체로의 치료의 결과로서 발현이 상이한 전사체가 매우 적게 존재한다는 것을 나타내었다. 그러나, 실험적 치료에 반응하여 존재량이 유의하게 감소한 프로브의 소집단이 존재하였다.

항-VEGF 요법에 대해 가장 극단적인 반응을 나타내는 프로브 세트를 확인하기 위해, 본원 발명자들은 항-VEGF- 및 대조군-항체-치료된 종양 사이의 평균 배수-변화 차이를 분석하였다 (특히, 본원 발명자들은 각각의 군에 대해 log2의 평균을 사용함). 본원 발명자들은 가우시안(Gaussian) 혼합물로서 이들 차이의 분포를 모델링하였다. 혼합물에서의 각각의 성분 분포는 3가지 군 중 하나에 상응한다: (a) 항-VEGF 후에 감소된 발현을 갖는 프로브 세트, (b) 항-VEGF 요법 후에 변화가 없는 프로브 세트, 또는 (c) 항-VEGF 요법 후에 증가된 발현을 갖는 프로브 세트. 3가지 가우시안 성분에 상응하는 혼합물 분포의 파라미터에 대한 본원 발명자들의 최종 추정치는 (0.77230, 0.13221, 0.30198)의 표준 편차 및 상대적 비율 (0.02638, 0.59943, 0.37419)을 갖는 (-0.46117, 0.03042, -0.017276)에 집중되었다.

본원 발명자들의 시그너쳐는 혼합물 분포에서 최좌측 가우시안 성분을 따르는 프로브 세트에 의해 규정된다. 이 분포의 최좌측 말단부는 항-VEGF 요법 후에 최대 감소된 발현을 갖는 프로브 세트를 나타낸다.

이 항-VEGF 반응 시그너쳐에서 316개 프로브 세트 중에서, 284개를 260개 HUGO 유전자에 맵핑하였고, 28개는 마우스에서 공지된 유전자에 맵핑할 수 없었고, 32개는 아직 HUGO 부호에 명백하게 맵핑되지 않았다.

260개 HUGO 유전자의 세트는 혈관신생, 혈관 발생, 세포 부착, 세포 운동 및 분지화 구조의 형태발생과 관련된 GO 과정 온톨로지; 세포외 매트릭스 구조적 성분, 성장 인자 결합 및 막횡단 수용체 단백질 티로신 키나제와 관련된 기능 온톨로지; 세포외 매트릭스와 관련된 성분 온톨로지에서 매우 많이 풍부하였다. 이들 데이터는 항-VEGF 치료가 특정 혈관 유전자에서 평균 2.65배, 및 2.0배 이상의 특정 및 매우 일정한 전사 하향 이동을 유발한다는 것을 입증하였다. 또한, 종양-세포 특이적 유전자에 대해 유전자 발현의 변화가 관찰되지 않았고, 흥미롭게도 VEGF 차단에 반응하여 유전자의 검출가능한 상향조절이 관찰되지 않았다. 이 유전자는 하기 표 1에 열거하였다.

실시예 2

본 실시예는 VEGF 길항제에 대한 환자의 반응성 또는 감수성을 예측하기에 유용한 바이오마커의 확인을 기재한다.

마우스 췌장암 모델로부터의 종양을 대조군 또는 항-VEGF 항체로 치료하고 14일 후에 단리하였다. 이 시점에서 혈관 표면 구역에 대한 예측된 큰 항-VEGF 효과가 관찰되었다. 본 발명자들은 특히 항-VEGF 치료에 의해 변경된 전사체를 확인하기 위해 마이크로어레이 분석을 수행하였다.

cRNA의 제조 및 어레이의 혼성화/스캐닝 방법은 아피메트릭스(Affymetrix) (미국 캘리포니아주 산타 클라라)에 의해 제공된다. 간략하게, 3 ug의 총 RNA를 cDNA 합성 키트 및 T7-(dT)₂₄ 올리고머 프라이머를 사용하여 이중 가닥 cDNA로 전환시켰다. 이중 가닥 cDNA를 친화도 수지상에서 정제하였다. 제2 가닥 합성 후에, 표지된 cRNA를 시험관내 전사 (IVT) 반응에서 T7 RNA 폴리머라제 및 비오틴-표지된 뉴클레오티드를 사용하여 cDNA 샘플로부터 생성하였다. 표지된 cRNA를 친화도 수지상에서 정제하였다. 표지된 cRNA의 양을 260 nm에서의 흡광도를 측정하고, 260 nm에서의 1 OD가 40 ug/㎖의 RNA에 상응한다는 관례를 사용하여 결정하였다. 15 ㎍의 cRNA를 40 mM Tris-아세테이트 (pH 8.1), 100 mM 칼륨 아세테이트 및 30 mM 마그네슘 아세테이트에서 30분 동안 94℃에서 인큐베이션하여 단편화시켰다. 이어서, 샘플을 60 rpm으로 설정된 로티세리 오븐에서 19시간 동안 45℃에서 어레이에 혼성화시켰다. 어레이를 세척하고, 아피메트릭스 플루이딕스 스테이션 450(Affymetrix Fluidics Station 450)을 사용하여 염색하고, 아피메트릭스 진칩 코멘드 콘솔(Affymetrix Genechip Command Console) (AGCC) 소프트웨어 v.1.1로 실행되는 아피메트릭스 진칩 스캐너 3000(Affymetrix GeneChip Scanner 3000)을 사용하여 스캐닝하였다.

유전자 발현 데이터를 바이오컨덕터(Bioconductor) 패키지 '진필터(genefilter)' (Gentleman, R., Carey, V., Huber, W. and Hahne, F. "Genefilter: methods for filtering genes from microarray experiments. R package version 1.30.0.")로부터 'ns필터' 기능을 사용하여 분산에 의해 여과하였다. 이는 10,229개 유전자의 데이터세트를 생성하였다.

VEGF 길항제로의 치료에 대해 가장 극단적인 반응을 나타내는 유전자를 확인하기 위해, 본원 발명자들은 항-VEGF- 및 대조군-항체-치료된 종양 사이의 평균 배수-변화 차이를 분석하였다 (특히, 본원 발명자들은 각각의 군에 대한 log2의 평균을 사용함). 플롯에서 log2 배수 변화는 항-VEGF 항체 대 대조군 항체로의 치료에 유전자 발현을 관련시키는 선형 모델의 계수이다. log odd 스코어 (LOD 스코어) (문헌 [Gelman, A. et al. (2004). Bayesian Data Analysis (2nd. ed.). Chapman & Hall/CRC Press, Boca Raton, FL.]에 기재된 바와 같음)를 R 패키지 '림마(limma)' (문헌 [Smyth, G. K. (2004). Linear models and empirical Bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, No. 1, Article 3.])에서 시행된 바와 같이 경험적 베이즈(Bayes) 추정치를 사용하여 이 모델로부터 유도하였다. 확인된 유전자는 하기 표 2에 열거되어 있다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 표 1 및 2에 열거된 유전자는 이들의 LOD 스코어, 즉 VEGF 길항제로의 치료 후의 발현 감소의 측정치에 따라 분류될 수 있다. 표 3의 칼럼 1은 VEGF 길항제로의 치료 후에 LOD 스코어 > 0 또는 발현의 2배 감소를 갖는 표 1 및 2 모두에서의 358개 유전자 모두를 확인한다. 표 3의 칼럼 2는 VEGF 길항제로의 치료 후에 LOD 스코어 > 2를 갖는 표 1 및 2 중 어느 하나에서의 160개 유전자를 확인한다. 표 3의 칼럼 3은 VEGF 길항제로의 치료 후에 LOD 스코어 > 0을 갖고, 표 1 및 2 둘 모두에서 발견되는 98개 유전자를 확인한다. 표 3의 칼럼 4는 VEGF 길항제로의 치료 후에 LOD 스코어 > 2를 갖고, 표 1 및 2 둘 모두에서 발견되는 58개 유전자를 확인한다. 표 3의 칼럼 5는 VEGF 길항제로의 치료 후에 LOD 스코어 > 2를 갖는 표 2에서의 143개 유전자를 확인한다.

실시예 3

본 실시예는 상기 실시예 1 및 2에 기재된 유전자 시그너쳐의 유전자가 결장직장 선암종 종양 이종이식 모델의 기질에서 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)에 반응하여 하향조절된다는 것을 입증한다.

마우스를 HT29 세포로 접종하고,

a. 항-VEGF 항체 B20; 또는

b. 항-돼지풀 항체 대조군

으로 치료하였다.

종양 조직을 수집하고, 표 1 및 2에서의 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 표 1 및 2에서의 유전자의 발현은 항-VEGF에 반응하여 감소하였다. 도 4a에서, 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 2 (p-값 5.3e-82)를 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 도 4b에서, 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 0 (p-값 4.8e-74)을 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 관찰된 하향조절 패턴의 유의성을 문헌 [Jiang & Gentleman (2007). "Extensions to gene set enrichment", Bioinformatics 23(3):306-13]에서 논의된 T.Speed의 방법을 사용하여 평가하였다.

실시예 4

본 실시예는 상기 실시예 1 및 2에 기재된 유전자 시그너쳐의 유전자가 전이성 유방암 이종이식 모델의 기질에서 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)에 반응하여 하향조절된다는 것을 입증한다.

마우스를 MDA MB-231 세포로 접종하고,

a. 항-VEGF 항체 B20; 또는

b. 항-돼지풀 항체 대조군

으로 치료하였다.

종양 조직을 수집하고, 표 1 및 2에서의 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 표 1 및 2에서의 유전자의 발현은 VEGF 길항제에 반응하여 감소하였다. 도 5a에서, 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 2 (p-값 1.6e-159)를 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 도 5b에서, 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 0 (p-값 7.0e-266)을 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 관찰된 하향조절 패턴의 유의성을 문헌 [Jiang & Gentleman (2007). "Extensions to gene set enrichment", Bioinformatics 23(3):306-13]에서 논의된 T.Speed의 방법을 사용하여 평가하였다.

실시예 5

본 실시예는 상기 실시예 1 및 2에 기재된 유전자 시그너쳐의 유전자가 결장 선암종 이종이식 모델의 기질에서 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)에 반응하여 하향조절된다는 것을 입증한다.

마우스를 HCT-116 세포로 접종하고,

a. 항-VEGF 항체 B20.4.1.1; 또는

b. 항-돼지풀 항체 대조군

으로 치료하였다.

종양 조직을 수집하고, 표 1 및 2에서의 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 표 1 및 2에서의 유전자의 발현은 VEGF 길항제에 반응하여 감소하였다. 도 6a에서, 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 2 (p-값 5.6e-18)를 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 도 6b에서, 음영 표시 원형은 VEGF 길항제로의 치료 이전의 유전자 발현을 나타내고; 개방 원형은 LOD 스코어 > 0 (p-값 3.4e-43)을 갖는 하향조절된 유전자를 나타낸다. 관찰된 하향조절 패턴의 유의성을 문헌 [Jiang & Gentleman (2007). "Extensions to gene set enrichment", Bioinformatics 23(3):306-13]에서 논의된 T.Speed의 방법을 사용하여 평가하였다.

실시예 6

본 실시예는 환자가 VEGF 길항제에 대해 반응성 또는 감수성일지 여부를 모니터링하기 위한 검정을 기재한다. 샘플 (예를 들어, 혈액 또는 조직 생검)은 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)로의 치료 이전 및 이후에 하나 이상의 환자로부터 사전 동의를 받고 수득하였다. DNA 및 혈청/혈장을 주지의 절차에 따라 단리하였다. 샘플을 개별 샘플로 모으거나 또는 유지할 수 있었다.

표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현을 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA를 측정하거나 또는 ELISA를 사용하여 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질을 검출하여 평가하였다 (하기 치환을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행함: (1) 뮤린 유전자 (예를 들어, ESM1) 표준 대신 인간 유전자 (예를 들어, ESM1) 표준; (2) 비오티닐화 염소 항-마우스 유전자 (예를 들어, ESM1) 폴리클로날 Ab 대신 비오티닐화 염소 항-인간 유전자 (예를 들어, ESM1) 폴리클로날 항체; 및 (3) 0.5％ BSA 대신 10％ FBS). 그의 샘플이 하나 이상의 유전자의 발현의 2배 이상의 감소를 나타내는 환자를 VEGF 길항제로의 치료에 대해 반응성 또는 감수성인 환자로 확인하였다.

전술된 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 설명 및 실시예로서 약간 상세하게 기재되었지만, 상기 기재 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 과학 참고문헌, 및 진뱅크 승인 번호에 관한 설명은 각 특허, 특허 출원, 과학 참고문헌, 및 진뱅크 승인 번호가 구체적이고도 개별적으로 참고 문헌으로 도입된다고 언급한 것처럼 모든 목적을 위해 그의 전문이 본원에 참고로 명백히 도입된다.

Claims (31)

1. (a) 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여한 후에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하는 것; 및
   (b) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하는 것
   을 포함하고, 여기서 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할 환자를 확인하는 것인, 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자가 VEGF 길항제로의 치료에 반응할지 여부를 모니터링하는 방법.
2. (a) 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여한 후에 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하는 것; 및
   (b) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하는 것
   을 포함하고, 여기서 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제로의 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 증가한 환자를 확인하는 것인, VEGF 길항제의 치료 효능을 최적화하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자의 발현을 mRNA를 측정하여 검출하는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자의 발현을 혈장 단백질 수준을 측정하여 검출하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제2 유전자의 발현을 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제3 유전자의 발현을 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제4 유전자의 발현을 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 ABCC9; AFAP1L1; CD93; CTLA2A; CTLA2B; CNTNAP2; COL18A1; COL4A1; COL4A2; EGFL7; ELTD1; ESM1; FAM38B; FAM167B; GIMAP1; GIMAP5; GIMAP6; GNG11; GPR116; HBB; ICAM2; KCNE3; KDR; MCAM; MEST; MMRN2; MYCT1; MYL9; NID1; NID2; NOS3; NOTCH4; OLFML2A; PCDH17; PDE6D; PODXL; PRND; RAPGEF3; RASGRP3; RBP7; SPARCL1; SPRY4; TAGLN; TMEM88; 및 TSPAN18로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
10. 제9항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환자가 혈관신생 장애를 갖는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 환자가 결장직장암, 유방암, 폐암, 교모세포종 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 갖는 것인 방법.
13. (a) VEGF 길항제를 투여한 후에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하는 것;
    (b) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하는 것; 및
    (c) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서 검출된다면 VEGF 길항제를 요법으로 선택하는 것; 또는
    (d) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서 검출되지 않는다면 VEGF 길항제가 아닌 요법을 선택하는 것
    을 포함하는, 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자를 위한 요법을 선택하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제2 유전자의 발현을 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제3 유전자의 발현을 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 1 내지 3 중 어느 하나에 열거된 적어도 제4 유전자의 발현을 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
17. 제13항에 있어서, (c)의 요법이 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
18. 제13항에 있어서, (e) 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소가 VEGF 길항제를 투여한 후에 수득한 샘플에서 검출된다면 유효량의 VEGF 길항제를 환자에게 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
19. 제18항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
20. 제19항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
21. 제20항에 있어서, 적어도 제2 작용제의 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 제2 작용제가 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
23. 제13항에 있어서, (d)의 요법이 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
24. (a) 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 제공받은 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 후보 바이오마커의 발현을 검출하는 것;
    (b) 후보 바이오마커의 발현을 참조 샘플에서의 후보 바이오마커의 발현 수준과 비교하는 것
    을 포함하고, 여기서 참조 샘플과 비교하여 1.99배 이상 더 낮은 수준에서 발현된 후보 바이오마커가 VEGF 길항제에 대한 반응성을 모니터링하기에 유용한 바이오마커로 확인되는 것인, VEGF 길항제에 대한 반응성을 모니터링하기 위한 바이오마커를 확인하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 참조 샘플과 비교하여 생물학적 샘플에서 2.0배 이상 더 낮은 수준에서 발현된 후보 바이오마커가 VEGF 길항제에 대한 반응성을 모니터링하기에 유용한 바이오마커로 확인되는 것인 방법.
26. 제24항에 있어서, 참조 샘플과 비교하여 생물학적 샘플에서 2.7배 이상 더 낮은 수준에서 발현된 후보 바이오마커가 VEGF 길항제에 대한 반응성을 모니터링하기에 유용한 바이오마커로 확인되는 것인 방법.
27. 제24항에 있어서, 참조 샘플과 비교하여 생물학적 샘플에서 2.9배 이상 더 낮은 수준에서 발현된 후보 바이오마커가 VEGF 길항제에 대한 반응성을 모니터링하기에 유용한 바이오마커로 확인되는 것인 방법.
28. 제24항에 있어서, 참조 샘플과 비교하여 생물학적 샘플에서 3.1배 이상 더 낮은 수준에서 발현된 후보 바이오마커가 VEGF 길항제에 대한 반응성을 모니터링하기에 유용한 바이오마커로 확인되는 것인 방법.
29. 제24항에 있어서, 참조 샘플이 VEGF 길항제를 환자에게 투여하기 전에 환자로부터 수득한 생물학적 샘플인 방법.
30. 제24항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
31. 제30항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
    

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