CN113862326A

CN113862326A - KREMEN1和/或ASGR1作为药物靶点在治疗SARS-CoV-2感染中的应用

Info

Publication number: CN113862326A
Application number: CN202111033444.1A
Authority: CN
Inventors: 罗敏; 卢智刚; 赵允; 高海; 谢幼华
Original assignee: Fudan University; Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Fudan University; Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-09-03
Also published as: CN113862326B; CN118717980A

Abstract

本发明公开了KREMEN1和/或ASGR1作为药物靶点在治疗SARS‑CoV‑2感染中的应用。研究发现ASGR1和/或KREMEN1的瞬时表达可导致SARS‑CoV‑2入侵，通过抑制SARS‑CoV‑2的S蛋白与ASGR1和/或KREMEN1的结合可以有效的预防或者治疗SARS‑CoV‑2感染，因此本发明为SARS‑CoV‑2感染的治疗提供新的思路。

Description

KREMEN1和/或ASGR1作为药物靶点在治疗SARS-CoV-2感染中的应用

技术领域

本发明涉及一种生物医药领域，特别是涉及一种以KREMEN1和/或ASGR1作为药物靶点在治疗SARS-CoV-2感染中的应用。

背景技术

SARS-CoV-2是一种高度传染性的人类病原体，可引起发烧，咳嗽，严重的呼吸道疾病和致命的器官衰竭。SARS-CoV-2是β冠状病毒属的成员，与严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和几种蝙蝠冠状病毒密切相关。

宿主细胞受体是病毒嗜性和发病机制的关键决定因素。病毒(如HIV，HBV和冠状病毒等)能够通过多个受体来介导该病毒与宿主进行相互作用，从而导致病毒附着、入侵细胞或引起特定宿主反应。冠状病毒表面的刺突蛋白(S)在与宿主受体结合中起核心作用。SARS-CoV和SARS-CoV-2都利用ACE2作为主要入侵受体(3-5)，而目前被广泛认可的SARS-CoV-2受体仅有ACE2一个。然而，ACE2的组织表达特异性难以解释SARS-CoV-2的多器官嗜性，同时ACE2自身也不能解释SARS-CoV和SARS-CoV-2之间的临床表现差异；这些都提示存在其他受体来介导SARS-CoV-2的入侵过程。此外，即使受体不参与病毒入侵过程，其介导的病毒宿主相互作用也可以其他宿主反应，如诱导细胞因子的分泌，细胞凋亡和免疫应答的刺激，或者改变病毒的萌芽和释放，从而促进病毒的致病进程。因此，系统性分析SARS-CoV-2的宿主细胞受体谱系对于新冠的基础与临床研究非常重要。

从病毒易感细胞系中筛选获得的受体受限于该细胞所特定表达的膜蛋白。我们之前利用一种基于流式细胞术的方法来研究配体-受体相互作用；其原理为将表达受体的细胞与带标签的配体进行孵育，然后利用抗标签的抗体进行标记和检测。该方法更加真实的模拟了生理条件下的配体-受体相互作用，但由于耗时耗力，故常用于确认新发现的配体-受体相互作用，或者小规模的相互作用筛选。我们基于该方法，开发了一个全基因组水平的分泌组学相互作用筛选平台，涵盖了几乎所有人源膜蛋白(共5054种，占所有人源膜蛋白的91.6％)。该系统能够无视病毒嗜性对病毒相关蛋白进行筛选，从而获得几乎所有的相关受体。

我们利用该平台对SARS-CoV-2S蛋白进行系统性筛选，并对所获得受体进行功能分析，以获得针对SARS-CoV-2感染的治疗新靶点。

发明内容

鉴于以上背景所述的现有缺点，本发明的目的在于提供一种靶向KREMEN1和ASGR1在治疗SARS-CoV-2感染中的应用，为解决现有技术治疗SARS-CoV-2感染提供新思路。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供KREMEN1作为药物作用靶点在体外筛选SARS-CoV-2治疗药物中的用途。

所述体外筛选SARS-CoV-2治疗药物的方法，可选地包括：对候选药物进行体外病毒感染实验、从而筛选出能够增强细胞抵抗病毒感染的药物。

所述治疗药物能够抑制或阻断KREMEN1与SARS-CoV-2的S蛋白结合。

本发明另一方面提供了KREMEN1抑制剂在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2药物中的用途。

所述药物以KREMEN1作为药物靶点。

所述药物能够抑制或阻断KREMEN1与SARS-CoV-2的S蛋白结合。

所述KREMEN1抑制剂是指针对KREMEN1具有抑制效果的物质，其能够降低细胞内KREMEN1的含量。所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂或KREMEN1抗体。

优选地，当所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂时，其为Suramin Sodium(CAS129-46-4)，分子式为C₅₁H₃₄N₆Na₆O₂₃S₆，结构式如式(I)所示：

优选地，当所述KREMEN1抑制剂为KREMEN1抗体时，所述KREMEN1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:1～3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:4～6所示。

对于KREMEN1的抑制效果包括但是不限于：抑制KREMEN1的活性或者抑制KREMEN1的基因转录或者表达。例如，与对照组相比，在不影响细胞其他功能的情况下KREMEN1抑制剂可以降低细胞中KREMEN1含量的50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％。所述KREMEN1抑制剂可以是抗体或者小分子化合物。所述抗体是指能够与KREMEN1结合的肽或者蛋白质。KREMEN1抑制剂也可以是通过降低或者抑制KREMEN1基因的表达或者转录的化合物，包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。

判断药物是否可抑制KREMEN1活性，可以采用现有技术进行，包括：同位素标记测定法。

判断药物是否可抑制KREMEN1基因转录或者表达亦可以采用现有技术。例如提供正常表达KREMEN1的细胞，在待检测药物或携带待检测药物的载体存在情况下培养所述细胞，检测KREMEN1转录或者表达水平是否发生变化。

KREMEN1抑制剂在制备用于预防或者治疗SARS-CoV-2药物中的用途具体是指：将KREMEN1抑制剂作为药物的主要有效成分用于制备用于预防或者治疗SARS-CoV-2药物。

本发明的另一方面提供了用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物，所述药物包括治疗有效量的KREMEN1抑制剂。

所述KREMEN1抑制剂是指针对KREMEN1具有抑制效果的化合物。优选地，所述KREMEN1抑制剂为Suramin Sodium(CAS 129-46-4)，分子式为C₅₁H₃₄N₆Na₆O₂₃S₆，结构式如式(I)所示。对于KREMEN1的抑制效果包括但是不限于：抑制KREMEN1的活性或者抑制KREMEN1的基因转录或者表达。所述KREMEN1抑制剂可以是抗体或者小分子化合物。当所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂时，其结构如式(I)所示。当所述KREMEN1抑制剂为KREMEN1抗体时，所述KREMEN1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:1～3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:4～6所示。

KREMEN1抗体K33：

重链：CDR1:GYTFTGYG(SEQ ID NO:1)；CDR2:IYPRSGNT(SEQ ID NO:2)；CDR3:SRYYGPKGFDY(SEQ ID NO:3)；

轻链：CDR1:ESVDNYGISF(SEQ ID NO:4)；CDR2:AAS(SEQ ID NO:5)；CDR3:QQSKEVPYT(SEQ ID NO:6)。

本发明的另一方面提供了一种用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法，包括向对象施加KREMEN1抑制剂。

所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的病毒感染后的细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。病毒感染后的细胞可以为离体感染后的细胞。

所述对象可以是感染SARS-CoV-2的患者或者期待治疗的感染SARS-CoV-2的个体。或者所述对象为感染SARS-CoV-2的患者或者期待治疗的感染SARS-CoV-2的个体的感染病毒细胞。

所述KREMEN1抑制剂可以在接受病毒感染治疗前、中、后向对象施用。所述KREMEN1抑制剂可以是抗体或者小分子化合物。优选地，所述KREMEN1抑制剂为Suramin Sodium(CAS129-46-4)，分子式为C₅₁H₃₄N₆Na₆O₂₃S₆，结构式如式(I)所示。当所述KREMEN1抑制剂为KREMEN1抗体时，所述KREMEN1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:1～3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:4～6所示。

本发明另一方面提供ASGR1作为药物作用靶点在体外筛选SARS-CoV-2治疗药物中的用途。

所述体外筛选SARS-CoV-2治疗药物的方法，可选地包括：对候选药物进行体外病毒感染实验筛选出能够增强细胞存活能力的药物。

所述治疗药物能够抑制或阻断ASGR1与SARS-CoV-2的S蛋白结合。

本发明另一方面提供了ASGR1抑制剂在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2药物中的用途。

所述药物以ASGR1作为药物靶点。

所述药物能够抑制或阻断ASGR1与SARS-CoV-2的S蛋白结合。

所述ASGR1抑制剂是指针对ASGR1具有抑制效果的物质，其能够降低细胞内ASGR1的含量。所述ASGR1抑制剂为小分子抑制剂或ASGR1抗体。

优选地，当所述ASGR1抑制剂为ASGR1抗体时，所述ASGR1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:7～9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:10～12所示。

ASGR1抗体S23:

重链：CDR1:RYTFTDYN(SEQ ID NO:7)；CDR2:ITPNNGGT(SEQ ID NO:8)；CDR3:ARKGGYFDV(SEQ ID NO:9)；

轻链：CDR1:SSVSY(SEQ ID NO:10)；CDR2:RTSN(SEQ ID NO:11)；CDR3:QQYHSYPLT(SEQ ID NO:12)。

对于ASGR1的抑制效果包括但是不限于：抑制ASGR1的活性或者抑制ASGR1的基因转录或者表达。例如，与对照组相比，在不影响细胞其他功能的情况下ASGR1抑制剂可以降低细胞中ASGR1含量的50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％。所述ASGR1抑制剂可以是抗体或者小分子化合物。所述抗体是指能够与ASGR1结合的肽或者蛋白质。ASGR1抑制剂也可以是通过降低或者抑制ASGR1基因的表达或者转录的化合物，包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。

判断药物是否可抑制ASGR1活性，可以采用现有技术进行，包括：同位素标记测定法。

判断药物是否可抑制ASGR1基因转录或者表达亦可以采用现有技术。例如提供正常表达ASGR1的细胞，在待检测药物或携带待检测药物的载体存在情况下培养所述细胞，检测ASGR1转录或者表达水平是否发生变化。

ASGR1抑制剂在制备用于预防或者治疗SARS-CoV-2药物中的用途具体是指：将ASGR1抑制剂作为药物的主要有效成分用于制备用于预防或者治疗SARS-CoV-2药物。

本发明的另一方面提供了用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染药物，所述药物包括治疗有效量的ASGR1抑制剂。

所述ASGR1抑制剂是指针对ASGR1具有抑制效果的化合物。所述ASGR1抑制剂为小分子抑制剂或ASGR1抗体。优选地，当所述ASGR1抑制剂为ASGR1抗体时，所述ASGR1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:7～9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQID NO:10～12所示。

对于ASGR1的抑制效果包括但是不限于：抑制ASGR1的活性或者抑制ASGR1的基因转录或者表达。

本发明的另一方面提供了一种用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法，包括向对象施加ASGR1抑制剂。

所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的病毒感染后的细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述病毒感染后的细胞可以为离体感染后的细胞。

所述ASGR1抑制剂可以在接受病毒感染治疗前、中、后向对象施用。所述ASGR1抑制剂为小分子抑制剂或ASGR1抗体。优选地，当所述ASGR1抑制剂为ASGR1抗体时，所述ASGR1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:7～9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:10～12所示。

本发明的另一方面提供了本发明提供KREMEN1和ASGR1联合作为药物作用靶点在体外筛选SARS-CoV-2治疗药物中的用途。

所述治疗药物能够抑制或阻断KREMEN1以及ASGR1与SARS-CoV-2的S蛋白结合。

本发明另一方面是提供一种预防和/治疗SARS-CoV-2的靶点抗体，所述靶点抗体为KREMEN1抗体，和/或，所述靶点抗体为ASGR1抗体。

所述KREMEN1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:1～3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:4～6所示；

所述ASGR1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:7～9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:10～12所示。

本发明另一方面是提供如上所述的SARS-CoV-2的靶点抗体在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2药物中的用途。

本发明另一方面提供了KREMEN1抑制剂和ASGR1抑制剂联合在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2药物中的用途。

所述KREMEN1抑制剂是指针对KREMEN1具有抑制效果的物质，包括小分子抑制剂或KREMEN1抗体。优选地，当所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂时，其为Suramin Sodium(CAS129-46-4)，分子式为C₅₁H₃₄N₆Na₆O₂₃S₆，结构式如式(I)所示。优选地，当所述KREMEN1抑制剂为KREMEN1抗体时，所述KREMEN1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:1～3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:4～6所示。

对于KREMEN1的抑制效果包括但是不限于：抑制KREMEN1的活性或者抑制KREMEN1的基因转录或者表达。所述KREMEN1抑制剂可以是抗体或者小分子化合物。

所述ASGR1抑制剂是指针对ASGR1具有抑制效果的物质，所述ASGR1抑制剂为小分子抑制剂或ASGR1抗体。优选地，当所述ASGR1抑制剂为ASGR1抗体时，所述ASGR1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:7～9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ IDNO:10～12所示。

对于ASGR1的抑制效果包括但是不限于：抑制ASGR1的活性或者抑制ASGR1的基因转录或者表达。所述ASGR1抑制剂可以是抗体或者小分子化合物。

本发明中，所述KREMEN1抑制剂、ASGR1抑制剂还可以与ACE2抑制剂联合使用。所述联合使用包括所述KREMEN1抑制剂与ACE2抑制剂联合使用；或，所述ASGR1抑制剂与ACE2抑制剂联合使用；或，所述KREMEN1抑制剂和ASGR1抑制剂与ACE2抑制剂三者联合使用。其中，所述ACE2抑制剂为小分子抑制剂或ACE2抗体；当所述ACE2抑制剂ACE2抗体时，所述ACE2抑制剂为Ab-414。

本发明的另一方面提供了用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染药物，所述药物包括治疗有效量的KREMEN1抑制剂和/或ASGR1抑制剂，并且所述药物包括或不包括ACE2抑制剂。

所述ASGR1抑制剂是指针对ASGR1具有抑制效果的物质。所述ASGR1抑制剂为小分子抑制剂或ASGR1抗体。优选地，当所述ASGR1抑制剂为ASGR1抗体时，所述ASGR1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:7～9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ IDNO:10～12所示。

所述ACE2抑制剂是指针对ACE2具有抑制效果的物质。所述ACE2抑制剂为小分子抑制剂或ASGR1抗体。优选地，当所述ACE2抑制剂为ACE2抗体时，所述ASGR1抗体为Ab-414。

对于ACE2的抑制效果包括但是不限于：抑制ACE2的活性或者抑制ACE2的基因转录或者表达。

本发明的另一方面提供了一种用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法，包括向对象施加KREMEN1抑制剂和/或ASGR1抑制剂，并且施加或不施加ACE2抑制剂。

所述KREMEN1抑制剂包括小分子抑制剂或KREMEN1抗体。优选地，当所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂时，所述KREMEN1抑制剂为Suramin Sodium(CAS 129-46-4)，分子式为C₅₁H₃₄N₆Na₆O₂₃S₆，结构式如式(I)所示。优选地，当所述KREMEN1抑制剂为KREMEN1抗体时，所述KREMEN1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:1～3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:4～6所示。

所述对象可以是感染SARS-CoV-2的患者或者期待治疗的感SARS-CoV-2的个体。或者所述对象为感染SARS-CoV-2的患者或者期待治疗的感SARS-CoV-2的个体的感染病毒细胞。

所述KREMEN1抑制剂和ASGR1抑制剂可以在接受病毒感染治疗前、中、后向对象施用。

本发明的另一方面提供了一种筛选SARS-CoV-2治疗药物的方法，所述方法包括：以KREMEN1和/或ASGR1为药物靶点，寻找能够抑制或阻断KREMEN1和/或ASGR1与SARS-CoV-2的S蛋白结合的物质作为候选药物。

进一步地，所述方法包括：在体外向细胞中施加待选药物，共培养后检测细胞中KREMEN1和/或ASGR1的含量。

所述细胞为可以正常表达KREMEN1和/或ASGR1的细胞。所述细胞可以来自哺乳动物。试验者可以通过检测共培养后KREMEN1和/或ASGR1的含量判定药物是否是具有治疗意义的药物。通常来说，与对照组相比，可以使得ASGR1和/或ASGR1的含量分别降低了50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％的药物，可以判定为具有治疗意义的药物。

本发明中，所述预防和/或治疗SARS-CoV-2的药物是指所述药物既可以是只能用于预防SARS-CoV-2，或只能用于治疗SARS-CoV-2，或能够用于预防和治疗SARS-CoV-2。

如上所述，本发明的KREMEN1和ASGR1在治疗SARS-CoV-2感染中的应用，具有以下有益效果：

通过研究发现ASGR1或KREMEN1的瞬时表达可导致SARS-CoV-2入侵，但对于SARS-CoV和MERS-CoV无此效果。分析了ASGR1和KREMEN1，以及ACE2的表达谱系，并与从细胞到组织水平的SARS-CoV-2敏感性进行了关联分析，系统性模拟宿主与SARS-CoV-2相互作用，为COVID-19疾病关联症状提供了可能的解释，为研究SARS-CoV-2的嗜性和发病机理，以及开发针对COVID-19的药物和抗体的新靶点提供了有用的资源。

附图说明

图1中A显示为针对SARS-CoV-2S蛋白的分泌组学相互作用筛选(SIP)示意图；B显示为SIP筛选获得的S蛋白结合受体；C显示流式细胞分析显示所获得的受体与S-ECD结合情况。

图2显示为不同受体与SARS-CoV-2S-ECD相互作用的解离常数的测定。

图3显示为表达不同受体的293e与NTD-hFc,RBD-hFc,S2-hFc或者对照hFc蛋白孵育、anti-hFc抗体标记后，通过流式细胞仪检测受体与不同S蛋白结构域的结合情况；右上图显示实验中S各结构域蛋白浓度较为均一，具有可比性(anti-hFc抗体Western blot检测)。

图4显示为SIP鉴定的S结合受体分别在ACE2-KO 293T细胞中瞬时转染表达，然后分别用假型SARS-CoV-2，SARS-CoV和MERS-CoV病毒感染，感染后60小时测量相对于空载体转染的细胞的荧光素酶活性。

图5显示为免疫共沉淀检测S-ECD与全长KREMEN1或ASGR1的相互作用。

图6显示KREMEN1，ASGR1或ACE2转染的ACE2-KO 293T细胞均被病人来源的SARS-CoV-2活病毒感染。图为SARS-CoV-2感染后72小时后，利用抗SARS-CoV-2N蛋白抗体标记细胞，进行免疫荧光观察(A)和流式检测(B)；并利用SARS-CoV-2N蛋白引物对上清中的病毒滴度进行qPCR定量分析(C)。

图7中A显示ACE2，ASGR1，KREMEN1和SARS-CoV-2在COVID-19病人上呼吸道不同细胞群中的分布。B显示在其中不同细胞群体的ASK表达水平和病毒感染模式重叠图。C显示其中SARS-CoV-2阳性细胞的ASK表达水平。D显示在COVID-19病人上呼吸道总细胞群体、上皮细胞群体和免疫细胞群体中，病毒敏感性与ASK受体单独或组合的相关性分析。

图8中A显示在COVID-19病人上呼吸道的ASK表达细胞中，各受体单独或组合表达的细胞比例。B显示在COVID-19病人上呼吸道上皮细胞亚群体(纤毛细胞和分泌细胞)、和免疫细胞亚群体(巨噬细胞)中，病毒敏感性与ASK受体单独或组合的相关性分析。

图9中A显示在人体不同组织中ASK受体的可比性表达水平(数据来源于公开数据库，可比性表达水平＝mRNA水平/该受体与S蛋白相互作用Kd)。B显示在SARS-CoV-2阳性组织中，病毒敏感性与ASK受体可比性表达水平的聚类相关性分析。

图10显示HTB-182和Li7细胞中的SARS-CoV-2入侵不依赖ACE2受体。A显示利用SARS-CoV-2假病毒对不同的人源肺和肝细胞系进行感染，发生显著感染的细胞系被标记为红色(包括NCI-H1944、NCI-H23、Calu1、NCI-H661、NCI-H1650、HTB182、Calu3、Li7、HepG2、Hep 3B2.1-7、Huh-7)。B显示在SARS-CoV-2假病毒感染过程中，加入ACE2中和抗体，检测病毒的入侵是否依赖ACE2受体。

图11显示在HTB-182细胞中，干涉KREMEN1显著抑制假型SARS-CoV-2病毒(SARS-CoV-2假病毒)感染；在Li-7细胞中，干涉ASGR1显著抑制假型SARS-CoV-2病毒感染。A显示针对ACE2、KREMEN1和ASGR1的shRNA干涉效果。B显示在Calu-3细胞中干涉ACE2、KREMEN1和ASGR1基因表达后，对假型SARS-CoV-2病毒感染的影响。C显示在HTB-182细胞中干涉ACE2、KREMEN1和ASGR1基因表达后，对假型SARS-CoV-2病毒感染的影响。D显示在Li-7细胞中干涉ACE2、KREMEN1和ASGR1基因表达后，对假型SARS-CoV-2病毒感染的影响。

图12显示在HTB-182细胞中，干涉KREMEN1显著抑制SARS-CoV-2活病毒感染(A)；在Li-7细胞中，干涉ASGR1显著抑制SARS-CoV-2活病毒感染(B)。

图13显示ASGR1单克隆抗体S23和KREMEN1单克隆抗体K33，能够分别特异性阻断受体与S蛋白的结合、并抑制相关受体介导的假型SARS-CoV-2病毒入侵。A显示Elisa检测S23和K33抗体分别与ASGR1和KREMEN1抗原的Kd。B显示S23和K33分别特异性阻断ASGR1、KREMEN1与S蛋白的结合。C显示S23特异性抑制假型SARS-CoV-2病毒入侵293T-ASGR1细胞，K33特异性抑制假型SARS-CoV-2病毒入侵293T-KREMEN1细胞。D显示ASGR1抗体S23特异性抑制假型SARS-CoV-2病毒入侵Li7细胞(IC50＝4.254ug/ml)。E显示KREMEN1抗体K33特异性抑制假型SARS-CoV-2病毒入侵HTB-182细胞(IC50＝2.439ug/ml)。

图14显示同时阻断S蛋白与ASK三种受体(ACE2、ASGR1、KREMEN1)结合的抗体鸡尾酒更为有效地抑制SARS-CoV-2活病毒感染人肺类器官。SARS-CoV-2感染人肺类器官的示意图(A)，及感染48小时后S蛋白，ACE2，ASGR1和KREMEN1的免疫荧光(B)。C显示单独或联合加入抗体Ab-414(阻断ACE2-S结合)、S23(阻断ASGR1-S结合)、K33(阻断KREMEN1-S结合)对SARS-CoV-2感染人肺类器官的影响(各抗体终浓度为4ug/ml)。其中，C中，第1幅图是利用来自病例1的肺类器官进行的实验统计，第2幅图是利用来自病例2的肺类器官进行的实验统计，第3幅图是将病例1和2的肺类器官实验数据进行综合的统计结果；柱状图从左至右依次为Ctrl Ab、Ab-414、S23、K33、ASK(Ab-414+S23+K33，即联合加入三种抗体)。

图15显示利用KREMEN1-S蛋白结合的筛选体系，筛选特异阻断KREMEN1-S蛋白结合的药物小分子。A显示获得的阳性小分子Suramin sodium特异性抑制KREMEN1-S蛋白结合。B显示Suramin sodium分子式及结构。C显示Suramin sodium阻断假型SARS-CoV-2病毒入侵HTB-182细胞(IC50＝18.02uM)。D显示Suramin sodium对Calu3细胞中的SARS-CoV-2病毒入侵无显著影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明中，氨基酸序列与SEQ ID No.1～12中任一序列具有90％以上序列同一性(具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性)且具有该序列限定的多肽片段的功能的多肽片段也在本发明的保护范围内。例如可以是，如SEQID No.1～12任一序列所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个氨基酸，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个氨基酸，得到的功能未改变的多肽片段。

本发明所使用的术语“同一性”是指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

SARS-CoV-2S(实验室自己表达、纯化，相关流程见实施例1和例2)

293e细胞(ThermoFisher)

pCMV-CFP质粒(将CFP序列构建到pCMV6(OriGene公司)质粒中)

293T细胞(ATCC)

4-3.Luc.R质粒(NIH，Cat：3418)

pCMV-receptor-flag(将受体序列构建到pCMV6(OriGene公司)质粒中)

pLentilox3.7(Addgene)

pCDNA3.1-S质粒(将S蛋白编码序列构建到pcDNA3.1(Thermofisher)质粒中)

Vero E6细胞(ATCC)

SARS-CoV-2/MT020880.1(复旦大学BSL-3实验室)

Calu-3(肺癌细胞系)(ATCC)

HTB-182(肺癌细胞系)(ATCC)

Li-7(肝癌细胞系)(RIKEN Cell Bank)

实施例1高通量筛选获得与SARS-CoV-2S蛋白胞外区(S-ECD)结合的12个人细胞表面受体

S蛋白作为SARS-CoV-2病毒表面最大的囊膜蛋白，是结合宿主细胞表面受体并介导病毒入侵细胞的重要蛋白。本发明以SARS-CoV-2S蛋白为靶点，利用建立的分泌组学相互作用筛选体系，在全基因组水平对几乎所有人类膜蛋白进行筛选鉴定，共发现12个膜蛋白能够特异结合SARS-CoV-2S蛋白。

材料与方法：

1-1)表达各膜蛋白的293e细胞：人类膜蛋白表达文库包括5054个基因(pCMV载体)，该文库通过购买和自行构建的方式获得。将每个膜蛋白的表达质粒和pCMV-CFP质粒(5：1质量比)，通过PEI转染方法转入293e细胞(质粒：PEI比例为1：3)。48小时后，收集细胞用于结合实验(见1-4)；

1-2)SARS-CoV-2S蛋白胞外结构域(CoV2 S-ECD)的制备：构建C端融合表达hFc的CoV2 S-ECD表达载体(pCMV-S-ECD-hFc)；将pCMV-S-ECD-hFc载体利用PEI转染方法转入293e细胞(质粒：PEI比例为1：3)。96小时后，收集细胞上清，0.45um滤器过滤，用于结合实验(见1-4)；

1-3)对照hFc的制备：构建分泌型hFc表达载体(pCMV-hFc)；将pCMV-hFc载体利用PEI转染方法转入293e细胞(质粒：PEI比例为1：3)。96小时后，收集细胞上清，0.45um滤器过滤，用于结合实验(见1-4)；

1-4)蛋白结合实验：取200ul CoV2 S-ECD蛋白上清(1-2)，或200ul对照hFc蛋白上清(1-3)，分别与10⁴表达相应膜蛋白的293e细胞混合(1-1)，冰上孵育1hr；500g离心5min；细胞利用200ul PBS/2％FBS洗涤一次，500g离心5min；将细胞悬在50ul抗体染色液中(anti-hFc-AF647，Jackson Lab产品，1ug/ml，稀释液为PBS/2％FBS)，冰上30min，PBS/2％FBS洗涤一次，将细胞悬在100ul PBS/2％FBS，进行流式分析。

结果：

文库筛选示意图见图1中A，结果见图1中B和图1中C。结果显示，对照组293e细胞不结合S-ECD-hFc；表达ACE2(已知SARS-CoV-2受体)的293e细胞与S-ECD-hFc有特异性的高强度结合；表明该筛选体系能够用于新冠受体的筛选。在针对5054个膜蛋白(占人类基因组中所有预测为膜蛋白的91.6％)的筛选中，共发现十二个受体能够特异性结合S-ECD。

实施例2细胞表面受体与SARS-CoV-2S蛋白相互作用Kd测量

为评估本发明所发现的这些细胞表面受体与S蛋白之间的亲和能力，本发明进一步测量了这些受体与S蛋白相互作用的解离常数(Kd)。

材料与方法：

2-1)表达受体的293e细胞：将受体表达质粒(pCMV-receptor)与pCMV-CFP质粒(5：1质量比)，通过PEI转染方法转入293e细胞(质粒：PEI比例为1：3)。48小时后，收集细胞用于Kd测量；

2-2)S-ECD蛋白的纯化：将pCMV-S-ECD-hFc载体利用PEI转染方法转入293e细胞，96小时后，收集细胞上清，0.45um滤器过滤；利用protein A亲和层析纯化蛋白，利用PD-10脱盐柱(GE)置换缓冲液为PBS，最后利用蛋白浓缩柱(AMICON)将蛋白浓缩至1mg/ml，用于Kd测量；

2-3)Kd测量：利用2-2)纯化的蛋白、配置2倍梯度浓度的S-ECD蛋白各200ul(缓冲液为PBS/2％FBS，S-ECD最高浓度为300nM)，将不同浓度的S-ECD分别与10⁴receptor-293e细胞混合(2-1)，进行蛋白结合(步骤同1-4)；将不同浓度下CFP+细胞结合S-ECD的量(即APC平均荧光强度，MFI)做曲线，利用Prism软件计算Kd。

结果：

以ACE-2作为对照，结果显示，ACE2与S-ECD-Fc的Kd为12.4nM，与之前报道一致，证明此Kd测量体系的有效性；所有受体与S-ECD的Kd测量曲线和数值见图2及表1。

表1：细胞表面受体与S蛋白的相互作用Kd总结

实施例3确定各受体与S蛋白三个主要结构域的特异性结合能力试验

SARS-CoV-2S蛋白胞外结构域(S-ECD)分为几个主要的区域：受体结合结构域(RBD)，N末端结构域(NTD)和S2结构域，为了进一步研究这些人细胞表面受体具体和S蛋白上哪一个功能结构域结合，本发明进行以下实验：

材料与方法：

3-1)表达受体的293e细胞：将受体表达质粒(pCMV-receptor)与pCMV-CFP质粒(5：1质量比)，通过PEI转染方法转入293e细胞(质粒：PEI比例为1：3)。48小时后，收集细胞用于Kd测试(见2-3)；

3-2)S蛋白三个结构域RBD-hFc,NTD-hFc,S2-hFc蛋白、及对照hFc蛋白的纯化：将pCMV-RBD-hFc,pCMV-NTD-hFc,pCMV-S2-hFc或者pCMV-hFc等载体质粒利用PEI转染方法分别转染293e细胞，96小时后，收集细胞上清，0.45um滤器过滤；利用protein A亲和层析纯化蛋白，利用PD-10脱盐柱(GE)置换缓冲液为PBS，最后利用蛋白浓缩柱(AMICON)将蛋白浓缩至1mg/ml；

3-3)蛋白结合实验：取200ul CoV2 S-ECD蛋白上清(1-2)，或200ul对照hFc蛋白上清(1-3)，分别与10⁴表达相应膜蛋白的293e细胞混合(1-1)，冰上孵育1hr；500g离心5min；细胞利用200ul PBS/2％FBS洗涤一次，500g离心5min；将细胞悬在50ul抗体染色液中(anti-hFc-AF647，Jackson Lab产品，1ug/ml，稀释液为PBS/2％FBS)，冰上30min，PBS/2％FBS洗涤一次，将细胞悬在100ul PBS/2％FBS，进行流式分析。

3-4)分析方法：为进行对比，本发明将结合能力进行数值化；即针对表达受体的细胞(CFP+细胞)，将其结构域蛋白的结合数值除以对照hFc结合数值，从而获得受体与不同结构域的结合倍数，低于2被视为不特异结合。

结果：

结果显示，ACE2确实仅和S蛋白的RBD区域结合，与其他区域没有相互作用；这与前人报道一致，也证明了这个实验体系的有效性。所有受体与S蛋白不同区域的结合图谱见图3，相关数值总结见表2。

表2：细胞表面受体与S蛋白不同结构域的结合能力总结

实施例4通过假病毒实验确定KREMEN1和ASGR-1直接介导病毒入侵细胞的能力

为证明这些结合受体是否能够直接介导病毒入侵，本发明在敲除ACE-2的293T细胞上表达12个受体，并测试新冠假病毒的感染。

材料与方法：

4-1)假病毒的制备：将新冠SARS-CoV-2或者SARS，MERS的S蛋白全长的表达载体pCDNA3.1-S与骨架质粒pNL4-3.Luc.R(1：1质量比)，通过PEI转染方法转入293T细胞(质粒：PEI比例为1：3)。48小时后，收集病毒上清分装保存于-80度，用于感染实验；

4-2)293T-ACE2 KO细胞系的建立：通过CRISPER-cas9技术建立ACE-2敲除的293-T细胞系，以排除痕量ACE-2对其他受体感染的背景和干扰；

4-3)病毒感染：在293T细胞中转染12个受体的pCMV-receptor质粒，24小时后传至96孔白板中，加入50ul 4-1)收集的假病毒上清，感染48小时后，利用荧光素酶底物反应试剂盒(Beyotime,RG051M)及多功能酶标仪，测量细胞中萤光素酶的活性。

结果：

结果见图4，在ACE2-KO_293T细胞表达ACE-2受体能够明显介导SARS-CoV-2及SARS假病毒入侵，但是不能介导MERS假病毒的入侵，这和之前报道非常符合，证明此体系的有效性；然后同理检测其他11个受体，发现KREMEN1和ASGR-1也能够介导SARS-CoV-2病毒入侵细胞，但是不能介导SARS或MERS假病毒的入侵；其他受体没有明显的介导病毒入侵的功能。

实施例5免疫共沉淀(Co-IP)证明KREMEN1和ASGR-1与SARS-CoV-2S蛋白的特异相互作用实验

免疫共沉淀是进一步佐证蛋白之间相互作用的经典方法，这里通过此方法佐证两个入侵受体(KREMEN1和ASGR1)与SARS-CoV-2的S蛋白的相互作用。

材料与方法：

5-1)表达受体的293T细胞：将带有Flag融合表达受体全长的质粒(pCMV-receptor-flag)通过PEI转染方法转入293T细胞(质粒：PEI比例为1：3)。48小时后，收集细胞并用RIPA缓冲液裂解，4度15000rpm离心15分钟，收集上清；

5-2)S-ECD蛋白的纯化：将pCMV-S-ECD-hFc载体利用PEI转染方法转入293e细胞，96小时后，收集细胞上清，0.45um滤器过滤；利用protein A亲和层析纯化蛋白，利用PD-10脱盐柱(GE)置换缓冲液为PBS，最后利用蛋白浓缩柱(AMICON)将蛋白浓缩至1mg/ml；

5-3)Co-IP：将S-ECD蛋白(终浓度10ug/ml)与anti-FLAG beads、细胞裂解上清混合，4度摇晃孵育过夜，RIPA缓冲液洗涤3次，将beads结合的蛋白制备样品进行western-Blot检测。

结果：

免疫沉淀之前的混合物(Input)中可以检测到细胞表达的两个受体蛋白和S-ECD-Fc或者hFC蛋白，通过Flag beads共沉淀并多次洗涤后(IP)，两个受体蛋白明显富集，同时S-ECD-Fc蛋白也明显存在于IP产物中，而对照组hFC存在量甚微，证明通过beads共沉淀富集两个受体蛋白的同时可以特异富集到S蛋白，受体与S蛋白存在特异结合(图5)。

实施例6通过患者来源的SARS-CoV2活毒感染实验确定KREMEN1和ASGR-1介导病毒入侵细胞的能力

为进一步证明KREMEN1和ASGR-1能够直接介导病毒入侵，在ACE2-KO_293T细胞上表达这两个受体，并测试新冠病毒的感染。

材料与方法：

6-1)活病毒的制备：病人来源的SARS-CoV-2/MT020880.1在Vero E6细胞上扩增，感染后50小时三次冻融，2500g离心10分钟收取病毒上清，分装保存在-80度。病毒滴度在Vero E6细胞上空斑实验测定；

6-2)293T-ACE KO细胞系的建立：通过CRISPER-cas9技术建立ACE-2敲除的293-T细胞系，以排除痕量ACE-2对其他受体感染的背景和干扰(同4-2)；

6-3)病毒感染：在293T-ACE KO细胞中转染pCMV-KREMEN1或者pCMV-ASGR-1质粒，24小时后传至24孔板中，加入MOI＝1的病毒量，感染48小时后，利用anti SARS-CoV-2Nprotein抗体免疫荧光标记，通过荧光显微镜和流式细胞技术分析阳性细胞比例；

同时在感染48小时后，收集细胞上清；利用SARS-CoV-2N蛋白引物通过qPCR检测上清中病毒mRNA水平(引物：SARS-CoV-2-N-F 5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'(SEQ ID NO:13)，SARS-CoV-2-N-R 5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'(SEQ ID NO:14))对上清中的病毒滴度进行qPCR定量分析。

结果：

免疫荧光(图6A)和流式分析结果(图6B)表明，未转染任何受体的ACE2-KO 293T细胞基本不支持活病毒感染，而瞬时转染ACE2的ACE2-KO 293T细胞，病毒感染比例高，证明此体系的有效性；同样，本发明在转染KREMEN1和ASGR-1的293T-ACE2 KO细胞中，都明显检测到活病毒感染细胞(图6A、图6B)。本发明对细胞上清中病毒粒子的释放也进行了qPCR检测，结果表明转染ACE2、KREMEN1和ASGR-1的细胞上清中，病毒粒子显著高于未转染任何受体的对照组(图6C)。

实施例7ACE2，ASGR1和KREMEN1受体与临床SARS-CoV-2的细胞与组织嗜性高度相关

为了研究这些入侵受体与SARS-CoV-2临床敏感性的相关性，本发明分析了最近发表的19例COVID-19患者上呼吸道单细胞测序(scRNA-seq)的结果，并与受体谱进行关联分析。该数据集来自病人的鼻咽拭子，包含了每个细胞的基因表达和病毒感染状态；这些细胞主要由上皮和免疫细胞组成。

ACE2主要在上皮细胞群中表达，与先前报道一致；而ASGR1和KREMEN1在这两种细胞中都有表达(图7中A)。大多数受体阳性细胞仅表达其中一种进入受体(88.5％)，而表达KREMEN1的细胞数量最多，比表达ACE2或ASGR1的细胞多5倍(图7中B和图8中A)。SARS-CoV-2主要感染上皮纤毛和分泌细胞以及免疫非驻留巨噬细胞(nrMa)，这也是表达ASK受体的主要群体。在SARS-CoV-2阳性细胞(V⁺细胞)中，只有10.3％的ACE-2表达，这表明很可能存在其他受体介导入侵(图7中C)。

进一步想分析确定ACE2，ASGR1和KREMEN1三受体(联称ASK)与SARS-CoV-2敏感性的相关性。在全部细胞中，V+细胞中的受体阳性细胞百分比(R⁺％)明显高于V-细胞中的受体阳性细胞百分比(R⁺％)。在上皮细胞中，ACE2和KREMEN1都在V⁺细胞中大量富集，而在免疫细胞中(图7中D)，只有ASGR1与病毒易感性相关，特别是在巨噬细胞中(图7中D和图8中B)。上皮纤毛细胞和分泌细胞是SARS-CoV-2的已知靶细胞；在纤毛细胞中，ACE2与KREMEN1与病毒易感性相关，其中ACE2相关性更为显著；而在分泌细胞中，仅有KREMEN1与病毒易感性显著相关(图8中B)。无论是在所有细胞群体、还是细胞亚群当中，从与病毒感染的相关性角度来看，ASK的组合比单个受体在相关性上通常更为显著(图7中D和图8中B)。上述结果从单细胞水平反应了ASK的表达与病毒的临床感染密切相关，且ASK的综合表达水平更为贴近新冠病毒的细胞嗜性。

SARS-CoV-2在COVID-19患者中显示出多器官嗜性。但是，ACE2在脑，肝，外周血(PB)甚至在肺中都罕见表达，所以仅ACE2自身难以解释SARS-CoV-2的多器官嗜性。因此，本发明基于开源数据库中各ASK受体在人体各组织中的表达水平，对宿主-SARS-CoV-2的系统性相互作用进行建模，并评估ASK是否能够更为准确地预测SARS-CoV-2的组织嗜性。为更为客观的从受体介导病毒结合的能力角度进行分析，本发明将受体mRNA转录水平除以该受体与S蛋白结合的解离常数(Kd)，从而能够对同一组织中的不同受体进行对比，并可以将其叠加后在不同组织间进行对比。结果显示，ACE2和ASGR1分别在胃肠道和肝脏中高表达，而KREMEN1则在人体中广泛表达。在能被新冠病毒感染的组织中，至少有一种ASK受体在表达(图9中A)。本发明将这些受体与各组织的病毒感染率进行关联分析，结果显示在相关性上，KREMEN1>ACE2>ASGR1，且ASK的综合表达水平比单个受体的更为贴近组织感染的实际情况(图9中B)。上述结果从器官水平进一步反应了ASK的表达与病毒临床感染相关，且ASK的综合表达水平更为贴近新冠病毒的组织嗜性。

实施例8通过RNAi基因干扰实验确定靶向KREMEN1和ASGR-1能够有效阻断SARS-CoV-2入侵细胞

为验证是否通过靶向KREMEN1和ASGR-1能够有效阻断SARS-CoV-2入侵细胞，本发明在细胞水平对内源性KREMEN1和ASGR1进行RNAi基因干扰实验，并测试其对SARS-CoV-2感染的影响。

材料与方法：

8-1)RNAi基因干扰：构建针对KREMEN1、ASGR1或ACE2的shRNA质粒(靶向序列：ASGR1 shRNA-1，GTCCTGGGAGGAGCAGAAATT(SEQ ID NO:15)；ASGR1 shRNA-2，GAAGGTGAGGAGCTTGAAACC(SEQ ID NO:16)；KREMEN1 shRNA-1，GCACAACTATTGCAGAAATCC(SEQID NO:17)，KREMEN1 shRNA-2:GGACCTTAGGGATTGTCATCA(SEQ ID NO:18)；ACE2 shRNA-1：GCAAACGGTTGAACACAATTC(SEQ ID NO:19)，ACE2 shRNA-2：GCTGTTCAGGGATAATCTAAA(SEQ IDNO:20))构建在pLentilox3.7载体中。每个基因构建两个shRNA载体。将这些质粒载体与psPAX2和MD2G两种质粒按4：3：1的比例通过PEI转染方法转染293T细胞，48hr后收集表达shRNA的慢病毒上清，0.45um过滤后加入终浓度4ug/ml的polybrene对靶细胞进行感染及qPCR鉴定，从而获得相关基因被干涉的细胞。

8-2)SARS-CoV-2假病毒的制备：步骤同4-1)；将新冠SARS-CoV-2S蛋白全长的表达载体pCDNA3.1-S与骨架质粒pNL4-3.Luc.R(1：1质量比)，通过PEI转染方法转入293T细胞(质粒：PEI比例为1：3)。48小时后，收集病毒上清分装保存于-80度，用于感染实验；

8-3)SARS-CoV-2假病毒感染：利用8-1)中的细胞，进行新冠假病毒感染，验证相关基因干涉后对新冠病毒感染的作用，相关流程同4-3)。为验证病毒感染是否依赖ACE2受体，本发明在感染过程中加入终浓度4ug/ml的ACE2中和抗体(Sino Biological,Cat#10108-MM37)。

8-4)活病毒的制备和感染：病人来源的SARS-CoV-2/MT020880.1在Vero E6细胞上扩增，反复冻融后2500g离心10分钟，收取病毒上清并测滴度。

将病毒按MOI＝1的病毒量加到细胞的培养基中，2小时后去除上清，PBS洗涤两次，继续培养48小时后，收集细胞上清；利用qPCR检测上清中病毒mRNA水平(N蛋白引物：SARS-CoV-2-N-F 5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'(SEQ ID NO:13)，SARS-CoV-2-N-R 5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'(SEQ ID NO:14))。

结果：

本发明首先筛选能被SARS-CoV-2感染的细胞系。在来源于人肺和肝的39种细胞系中，有11种细胞(包括NCI-H1944、NCI-H23、Calu1、NCI-H661、NCI-H1650、HTB182、Calu3、Li7、HepG2、Hep 3B2.1-7、Huh-7)能够明显被SARS-CoV-2假病毒感染(图10A)。

由于ACE2、ASGR1和KREMEN1均能独立介导SARS-CoV-2新冠病毒感染，本发明利用ACE2的中和抗体对这些细胞进行处理。结果显示在HTB-182(肺癌细胞系)和Li-7(肝癌细胞系)中，SARS-CoV-2感染不受ACE2受体的调控(图10B)。

图11显示在HTB-182细胞中，干涉KREMEN1显著抑制假型SARS-CoV-2病毒(SARS-CoV-2假病毒)感染；在Li-7细胞中，干涉ASGR1显著抑制假型SARS-CoV-2病毒感染。A显示针对ACE2、KREMEN1和ASGR1的shRNA干涉效果。B显示在Calu-3细胞中干涉ACE2、KREMEN1和ASGR1基因表达后，对假型SARS-CoV-2病毒感染的影响。本发明进一步利用RNAi基因干扰实验，发现在HTB-182细胞中，KREMEN1基因干涉后能够有效阻断SARS-CoV-2假病毒感染(图11C)、以及SARS-CoV-2活病毒的感染(图12A)；在Li-7细胞中，ASGR1基因干涉后能够有效阻断SARS-CoV-2假病毒的感染(图11D)、以及SARS-CoV-2活病毒的感染(图12B)。上述结果表明SARS-CoV-2依赖不同的受体来感染不同类型的细胞，靶向KREMEN1和ASGR-1能够在该受体依赖型细胞中有效阻断SARS-CoV-2的入侵。

实施例9通过特异性抗体确定靶向KREMEN1和/或ASGR-1能够有效阻断SARS-CoV-2入侵细胞

为验证是否可以通过特异性抗体靶向KREMEN1和/或ASGR-1与S蛋白的结合，从而有效阻断SARS-CoV-2入侵细胞，本发明开发针对这两个受体的特异性抗体，筛选能够特异阻断KREMEN1-S和/或ASGR-1-S蛋白结合的抗体，测试其对SARS-CoV-2感染的影响。

材料与方法：

9-1)抗体的获得：利用小鼠免疫获得的针对KREMEN1或ASGR1的单克隆抗体、利用动物免疫获得的针对S蛋白的单克隆抗体、或病人体内分离的针对S蛋白的单克隆抗体。

9-2)抗体筛选：利用KREMEN1/ASGR1-S蛋白结合实验(具体步骤见实施例1)，测试抗体是否能够阻断S蛋白与受体KREMEN1/ASGR1的结合；对于阳性抗体，本发明测试不同浓度的抗体对S蛋白-KREMEN1/ASGR1相互作用的阻断效果，从而获得该抗体抑制相互作用的IC50；

9-3)抗体抑制SARS-CoV-2病毒入侵的实验：利用SARS-CoV-2病毒感染的实验(具体步骤见实施例4和例6)，测试9-2筛选后的抗体是否能够阻断SARS-CoV-2病毒入侵细胞；对于能够明显阻断病毒入侵的抗体，本发明测试不同浓度的抗体阻断病毒入侵的效果，从而获得该抗体抑制病毒入侵的IC50。

结果：

本发明获得的KREMEN1或ASGR1的小鼠单克隆抗体中，ASGR1抗体S23的亲和常数Kd为0.1236ug/ml，KREMEN1抗体K33的Kd为0.0199ug/ml(图13A)。S23抗体能够特异性阻断ASGR1与S蛋白的结合，而K33抗体能够特异性阻断KREMEN1与S蛋白的结合(图13B)。在过表达ACE2、ASGR1和KREMEN1等不同受体的293T细胞中，S23特异性抑制ASGR1介导的SARS-CoV-2病毒感染，K33特异性抑制KREMEN1介导的SARS-CoV-2病毒感染(图13C)。本发明进一步测试了这些抗体对内源性ASGR1、KREMEN1介导病毒感染的作用，结果显示，在依赖ASGR1的Li7细胞中，S23显著抑制SARS-CoV-2病毒的感染，IC50为4.254ug/ml；而在依赖KREMEN1的HTB-182细胞中，K33显著抑制SARS-CoV-2病毒感染，IC50为2.439ug/ml(图13D、图13E)。

ASGR1抗体S23:

KREMEN1抗体K33：

实施例10同时靶向ACE2/ASGR1/KREMEN1的抗体鸡尾酒能够更为有效的阻断SARS-CoV-2感染人肺类器官

本发明之前的数据表明在不同的细胞类型中，SARS-CoV-2的感染可以通过不同的ACE2、ASGR1、KREMEN1来介导。所以理论上，同时靶向这三个受体，将会在多细胞类型的器官水平上提供更好的抑制病毒感染的效果。因此，本发明测试这些不同受体的靶向抗体在单独、以及联合的情况下，对SARS-CoV-2感染人肺类器官的影响。

材料与方法：

10-1)人肺类器官的培养：从来源于手术病人的肺组织中分离出非肿瘤组织，利用胶原酶II消化成单细胞。细胞离心后重悬置于Matrigel(Corning公司)上，利用DF12培养基(含10mM HEPES(Gibco),2mM GlutaMAX-1(Gibco),500×Primocin(InvivoGen),1×B27(Gibco),1.56mM N-acetylcysteine(Sigma),10mM nicotinamide(Gibco),0.5μM A83-01(Tocris),10μM Y27632,50ng/mL EGF(Peprotech),10ng/mL FGF10(Peprotech),1ng/mLFGF2(Peprotech),10％in-house-prepared R-Spondin1,10％Noggin and 30％Wnt3a)在37℃、5％CO₂条件下培养。

10-2)SARS-CoV-2活病毒感染人肺类器官：病人来源的SARS-CoV-2/MT020880.1在Vero E6细胞上扩增，反复冻融后2500g离心10分钟收取病毒上清并测滴度。将病毒按MOI＝1的病毒量加到含步骤10-1)制备的肺类器官的培养基中，感染48小时后，收集细胞进行免疫荧光分析，并对细胞中的病毒载量进行qPCR鉴定。感染过程中使用的各种靶向抗体终浓度为4ug/ml，抗体包括：Ab-414阻断ACE2-S结合(相关文献Wan,J.,et al.Cell Rep 32,107918，2020)；S23阻断ASGR1-S结合；K33阻断KREMEN1-S结合。

结果：

本发明首先检测了SARS-CoV-2病毒对人肺类器官的感染。免疫荧光结果显示，ACE2/ASGR1/KREMEN1受体表达在不同的被感染的细胞中(图14A、图14B)，进一步支持了本发明的结论，即在不同的细胞中，SARS-CoV-2病毒依赖不同的入侵受体。

进一步地，本发明在这一感染体系中，利用ACE2靶向抗体(Ab-414)、ASGR1靶向抗体(S23)、和KREMEN1靶向抗体(K33)进行单独处理或联合处理。本发明使用了来自两个病人的肺类器官进行实验，结果显示，在单独靶向抗体处理的情况下，这些抗体均能显著抑制病毒的感染；其中Ab-414效果最强，其次是K33和S23；而上述三种抗体联合处理的抑制效果显著优于任一抗体的单独处理(图14C)。

以上结果表明，在SARS-CoV-2病毒感染人肺类器官的过程中，ASGR1和KREMEN1与ACE2一起发挥重要作用，同时靶向ACE2/ASGR1/KREMEN1的鸡尾酒抗体能够更为有效的阻断SARS-CoV-2感染。

实施例11靶向KREMEN1和/或ASGR-1的SARS-CoV-2药物筛选平台

为从KREMEN1/ASGR1的角度筛选特异靶向药物，从而有效阻断SARS-CoV-2入侵细胞，本发明的体系能够为相关药物筛选提供快速的筛选平台，并对阳性候选药物是否阻断SARS-CoV-2的感染进行有效评价。

材料与方法：

11-1)靶向KREMEN1和/或ASGR-1基因表达的药物筛选：

a，细胞系选择：利用依赖KREMEN1和/或ASGR1导致SARS-CoV2感染的细胞系，如HTB-182(依赖KREMEN1)和Li-7(依赖ASGR1)等细胞系，进行该药物筛选。

b，细胞培养在96孔板中，在细胞培养基中添加药物(一般选择药物终浓度1-10uMol/L)后继续培养；梯度时间取样(加药物后24、48、72小时等)，利用Trizol等试剂提取细胞RNA并反转录为cDNA；qPCR检测KREMEN1、ASGR1等基因的表达水平，将其与对照处理细胞的进行对比，能够将KREMEN1和/或ASGR1的mRNA水平显著降低30％以上(即药物组/对照组<0.7)作为候选药物；c，验证及IC50测定：对于上述候选药物，利用上述相同方法对其进行单独验证，对能重复验证的候选药物，本发明测试不同浓度候选药物对KREMEN1/ASGR1基因表达的抑制效果，从而获得该候选药物在抑制基因表达方面的IC50(50％有效抑制浓度)；这些候选药物本发明进行11-3)病毒测试。

11-2)靶向KREMEN1和/或ASGR-1与S蛋白结合的药物筛选：

(相关试剂制备详见实施例1和例2)

a：将受体KREMEN1或ASGR1的表达质粒(pCMV-KREMEN1或pCMV-ASGR1)与pCMV-CFP质粒(5：1质量比)，通过PEI转染方法转入293e细胞(质粒：PEI比例为1：3)。48小时后，500g离心5min收集细胞，重悬于PBS/2％FBS(浓度为2x10⁵/ml)，置于冰上用于以下筛选；

b：利用纯化的S-ECD-hFc蛋白，配置终浓度～10ug/ml的S-ECD-hFc蛋白溶液(缓冲液为PBS/2％FBS)，置于冰上用于以下筛选；

c：药物筛选：在96孔板(U型底)中，配置含药物的溶液，初始药物浓度设置为1-10uMol/L，50ul/孔(缓冲液为PBS/2％FBS)，置于冰上；加入100ul表达KREMEN1或ASGR1的细胞(来自步骤a)和50ul的S-ECD-hFc蛋白溶液(来自步骤b)，吹吸混匀冰上孵育1hr；500g离心5min；细胞利用200ul PBS/2％FBS洗涤一次，500g离心5min；将细胞悬在50ul抗体染色液中(anti-hFc-AF647，Jackson Lab产品，1ug/ml，稀释液为PBS/2％FBS)，冰上30min，PBS/2％FBS洗涤一次，将细胞悬在100ul PBS/2％FBS，进行流式分析；

d，结果分析：利用Flowjo软件分析流式结果，计算不同药物处理情况下受体表达细胞(CFP+细胞)结合S-ECD的量(即APC平均荧光强度，MFI)；将其与对照处理细胞的进行对比，能够将S-ECD结合水平降低30％以上(即药物组/对照组<0.7)作为候选药物；

11-3)测试以上获得的候选药物抑制SARS-CoV-2病毒入侵的效果：

病毒制备与感染具体步骤见实施例4；在细胞系上，本发明选用依赖KREMEN1被SARS-CoV-2感染的HTB-182、以及依赖ASGR1受体被SARS-CoV-2感染的Li-7细胞，以及分别稳定表达KREMEN1、ASGR1的293T细胞；将细胞传代至96孔白板中，第二天进行病毒感染，同时加入候选药物；感染48小时后，利用荧光素酶底物反应试剂盒(Beyotime,RG051M)及多功能酶标仪，测量细胞中萤光素酶的活性；对于能够明显抑制病毒入侵的药物(药物组/对照组<50％)，利用上述相同方法对其进行验证，对能重复验证的药物，测试不同浓度的药物阻断病毒入侵的效果，从而获得该候选药物抑制SARS-CoV-2病毒入侵的IC50(50％有效抑制浓度)。

结果：

利用11-2)平台，本发明对小分子药物库进行筛选，获得了一个阳性小分子Suramin Sodium，能够特异性抑制KREMEN1与S蛋白的结合(图15A)，其结构见图15B。利用11-3)抑制病毒感染的效果评价体系，本发明发现Suramin Sodium在依赖KREMEN1的HTB-182细胞中，特异性阻断SARS-CoV-2病毒入侵，IC50为18.02uM(图15C)；该小分子对依赖ACE2的Calu3细胞中的SARS-CoV-2病毒入侵没有作用(图15D)，表明Suramin Sodium特异性抑制KREMEN1介导的SARS-CoV-2病毒入侵。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心

<120> KREMEN1和/或ASGR1作为药物靶点在治疗SARS-CoV-2感染中的应用

<150> 2020109369695

<151> 2020-09-08

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Arg Tyr Tyr Gly Pro Lys Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Arg Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ile Thr Pro Asn Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Phe Asp Val

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Arg Thr Ser Asn

1

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtcctgggag gagcagaaat t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaaggtgagg agcttgaaac c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcacaactat tgcagaaatc c 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggaccttagg gattgtcatc a 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcaaacggtt gaacacaatt c 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctgttcagg gataatctaa a 21

Claims

1.KREMEN1和/或ASGR1作为药物作用靶点在体外筛选SARS-CoV-2预防和/或治疗药物中的用途。

2.KREMEN1抑制剂和/或ASGR1抑制剂在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述KREMEN1抑制剂能够抑制或阻断KREMEN1与SARS-CoV-2的S蛋白结合，所述ASGR1抑制剂能够抑制或阻断ASGR1与SARS-CoV-2的S蛋白结合；和/或，

所述KREMEN1抑制剂、ASGR1抑制剂与ACE2抑制剂联合使用；其中所述ACE2抑制剂能够抑制或阻断ACE2与SARS-CoV-2的S蛋白结合。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，包括以下特征中的任一项或多项：所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂或KREMEN1抗体；所述ASGR1抑制剂为小分子抑制剂或ASGR1抗体；所述ACE2抑制剂为小分子抑制剂或ACE2抗体；

当所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂时，其结构为：

当所述KREMEN1抑制剂为KREMEN1抗体时，所述KREMEN1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:1～3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:4～6所示；

当所述ASGR1抑制剂为ASGR1抗体时，所述ASGR1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:7～9所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3分别如序列SEQ ID NO:10～12所示；

当所述ACE2抑制剂ACE2抗体时，所述ACE2抗体为Ab-414。

5.一种预防和/治疗SARS-CoV-2的靶点抗体，其特征在于，所述靶点抗体为KREMEN1抗体，和/或，所述靶点抗体为ASGR1抗体；

6.一种用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染药物，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的KREMEN1抑制剂和/或ASGR1抑制剂，并且所述药物包括或不包括ACE2抑制剂。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述KREMEN1抑制剂能够抑制或阻断KREMEN1与SARS-CoV-2的S蛋白结合，所述ASGR1抑制剂能够抑制或阻断ASGR1与SARS-CoV-2的S蛋白结合；所述ACE2抑制剂能够抑制或阻断ACE2与SARS-CoV-2的S蛋白结合。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，包括以下特征中的任一项或多项：所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂或KREMEN1抗体；所述ASGR1抑制剂为小分子抑制剂或ASGR1抗体；所述ACE2抑制剂为小分子抑制剂或ACE2抗体；

当所述KREMEN1抑制剂为小分子抑制剂时，其结构为：

当所述ACE2抑制剂ACE2抗体时，所述ACE2抗体为Ab-414。

9.一种筛选SARS-CoV-2治疗药物的方法，所述方法包括：以KREMEN1和/或ASGR1为药物靶点，寻找能够抑制或阻断KREMEN1与SARS-CoV-2的S蛋白结合的物质作为候选药物。

10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括：在体外向细胞中施加待选药物，共培养后检测细胞中KREMEN1和/或ASGR1的含量。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述药物能够降低细胞中KREMEN1和/或ASGR1至少50％，则判定为具有治疗意义的药物。