JP2019500405A - 癌の成長を抑制する結合分子 - Google Patents
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Abstract
Description
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR4に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5777のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5777のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR4に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5781のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5781のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5790のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5790のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5803のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5803のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5814のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5814のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5816のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5816のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5817のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5817のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5818のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5818のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
RNF43に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5832のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5832のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
RNF43に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5836のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5836のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5850のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5850のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5853のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5853のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5855のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5855のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5884のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5884のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5888のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5888のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR4に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5777のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5777のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR4に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5781のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5781のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5790のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5790のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5803のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5803のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5814のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5814のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5816のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5816のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5817のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5817のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5818のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5818のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
RNF43に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5836のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5836のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5850のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5850のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5853のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5853のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5855のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5855のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5884のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5884のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3178のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ZNRF3に結合する可変ドメインのVH鎖が、
図1に示したVH鎖MF5888のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5888のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
a)EGFRファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合し、かつ第1のCH3ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第1の核酸分子と、b)WNTシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分に結合し、かつ第2のCH3ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第2の核酸分子と、を有する細胞を提供することを含み、上記の核酸分子には、上記の第1及び第2のCH3ドメインの優先的な対形成のための手段が提供されており、
上記の方法が、上記の細胞を培養し、上記の2つの核酸分子によってコードされるタンパク質を発現させ、かつ上記の二重特異性IgG抗体を培養物から採取する工程を更に含む、方法を提供する。特に好ましい実施形態においては、上記の細胞はまた、共通軽鎖をコードする第3の核酸分子を有する。上記の第1、第2及び第3の核酸分子は、同一の核酸分子、ベクター又は遺伝子送達ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同一部位に組み込まれていてもよい。あるいは、上記の第1、第2及び第3の核酸分子は、上記の細胞に別々にもたらされる。好ましい共通軽鎖はO12に基づき、好ましくは、好ましい共通軽鎖は、上記の再配列生殖系列ヒトκ軽鎖IgVκ1 39*01/IGJκ1*01である。上記の第1及び第2のCH3ドメインの優先的な対形成のための手段は、好ましくは重鎖コード領域のCH3ドメインにおける対応する変異である。本質的に二重特異性抗体のみを産生する好ましい変異は、第1のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351K及びT366K(EUナンバリングによるナンバリング)、並びに第2のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351D及びL368E、又はこの逆の場合である。そのため、二重特異性抗体を作製する、本発明による方法であって、上記の第1のCH3ドメインがアミノ酸置換L351K及びT366K(EUナンバリングによるナンバリング)を含み、上記の第2のCH3ドメインがアミノ酸置換L351D及びL368Eを含み、上記の方法が、上記の細胞を培養し、上記の核酸分子によってコードされるタンパク質を発現させ、かつ上記の二重特異性抗体を培養物から採取する工程を更に含む、方法が更に提供される。二重特異性抗体を作製する、本発明による方法であって、上記の第1のCH3ドメインがアミノ酸置換L351D及びL368E(EUナンバリングによるナンバリング)を含み、上記の第2のCH3ドメインがアミノ酸置換L351K及びT366Kを含み、上記の方法が、上記の細胞を培養し、上記の核酸分子を発現させ、かつ上記の二重特異性抗体を培養物から採取する工程を更に含む、方法もまた提供される。これらの方法によって作製可能な抗体もまた、本発明の一部である。CH3ヘテロ二量体形成ドメインは、好ましくはIgG1ヘテロ二量体形成ドメインである。CH3ヘテロ二量体形成ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくはIgG1定常領域である。
図1に示したVH鎖MF5777のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5777のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5781のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5781のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5790のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5790のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5803のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5803のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5814のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5814のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5816のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5816のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5817のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5817のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5818のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5818のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5832のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5832のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5836のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5836のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5850のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5850のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5853のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5853のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5855のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5855のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5884のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5884のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF5888のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF5888のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は
図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、上記のVHに関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
方法、材料及び抗体のスクリーニング
細胞株:
Freestyle 293F細胞(カタログ番号p/n51−0029)はInvitrogenより入手し、293 FreeStyle培地で定常的に維持した。HEK293T(ATCC−CRL−11268)及びCHO−K1(DSMZ ACC110)細胞株はATCCより購入し、L−グルタミン(Gibco)及びFBS(Lonza)を添加したDMEM/F12(Gibco)で定常的に維持した。
ヒトLGR4完全長ヒト(h)LGR4は、2つのFLAGタグ及び2つのHAタグを含むベクターpEF1_Myc/His(Invitrogen)(pEF1_hLGR4−FLAG−HA)中に存在し、pVax1(Invitrogen)にクローニングし、pVax1_hLGR4−FLAG−HAを得た。挿入配列は、NCBI参照配列NM_018490との比較によって確認した。配列は、アミノ酸レベルの以下の逸脱、すなわちシグナルペプチドにおけるP2Aを含んでいた。構造体pEF1_hLGR4−FLAG−HAからの挿入を、pVax1に再クローニングした。別途、pVax1中の完全長hLGR4を、hLGR4の短縮型、hLGR4(ECD)−GPA33(TM)−FLAGで置換し、pVax1_hLGR4(ECD)−GPA33(TM)−FLAGを得た。
MAGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGAAPPLCAAPCSCDGDRRVDCSGKGLTAVPEGLSAFTQALDISMNNITQLPEDAFKNFPFLEELQLAGNDLSFIHPKALSGLKELKVLTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQSLRLDANHITSVPEDSFEGLVQLRHLWLDDNSLTEVPVHPLSNLPTLQALTLALNKISSIPDFAFTNLSSLVVLHLHNNKIRSLSQHCFDGLDNLETLDLNYNNLGEFPQAIKALPSLKELGFHSNSISVIPDGAFDGNPLLRTIHLYDNPLSFVGNSAFHNLSDLHSLVIRGASMVQQFPNLTGTVHLESLTLTGTKISSIPNNLCQEQKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEEISLQRNQIYQIKEGTFQGLISLRILDLSRNLIHEIHSRAFATLGPITNLDVSFNELTSFPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEALAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIRLTVWFIFLVALFFNLLVILTTFASCTSLPSSKLFIGLISVSNLFMGIYTGILTFLDAVSWGRFAEFGIWWETGSGCKVAGFLAVFSSESAIFLLMLATVERSLSAKDIMKNGKSNHLKQFRVAALLAFLGATVAGCFPLFHRGEYSASPLCLPFPTGETPSLGFTVTLVLLNSLAFLLMAVIYTKLYCNLEKEDLSENSQSSMIKHVAWLIFTNCIFFCPVAFFSFAPLITAISISPEIMKSVTLIFFPLPACLNPVLYVFFNPKFKEDWKLLKRRVTKKSGSVSVSISSQGGCLEQDFYYDCGMYSHLQGNLTVCDCCESFLLTKPVSCKHLIKSHSCPALAVASCQRPEGYWSDCGTQSAHSDYADEEDSFVSDSSDQVQACGRACFYQSRGFPLVRYAYNLPRVKDSRDYKDDDDKAGADYKDDDDKLDGGYPYDVPDYAAGAYPYDVPDYA
配列中、
MAGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGA:シグナルペプチド
APPLCAAPCSCDGDRRVDCSGKGLTAVPEGLSAFTQALDISMNNITQLPEDAFKNFPFLEELQLAGNDLSFIHPKALSGLKELKVLTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQSLRLDANHITSVPEDSFEGLVQLRHLWLDDNSLTEVPVHPLSNLPTLQALTLALNKISSIPDFAFTNLSSLVVLHLHNNKIRSLSQHCFDGLDNLETLDLNYNNLGEFPQAIKALPSLKELGFHSNSISVIPDGAFDGNPLLRTIHLYDNPLSFVGNSAFHNLSDLHSLVIRGASMVQQFPNLTGTVHLESLTLTGTKISSIPNNLCQEQKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEEISLQRNQIYQIKEGTFQGLISLRILDLSRNLIHEIHSRAFATLGPITNLDVSFNELTSFPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEALAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIRLTVWFIFLVALFFNLLVILTTFASCTSLPSSKLFIGLISVSNLFMGIYTGILTFLDAVSWGRFAEFGIWWETGSGCKVAGFLAVFSSESAIFLLMLATVERSLSAKDIMKNGKSNHLKQFRVAALLAFLGATVAGCFPLFHRGEYSASPLCLPFPTGETPSLGFTVTLVLLNSLAFLLMAVIYTKLYCNLEKEDLSENSQSSMIKHVAWLIFTNCIFFCPVAFFSFAPLITAISISPEIMKSVTLIFFPLPACLNPVLYVFFNPKFKEDWKLLKRRVTKKSGSVSVSISSQGGCLEQDFYYDCGMYSHLQGNLTVCDCCESFLLTKPVSCKHLIKSHSCPALAVASCQRPEGYWSDCGTQSAHSDYADEEDSFVSDSSDQVQACGRACFYQSRGFPLVRYAYNLPRVKD:hLGR4(FL)
SR:リンカー領域
DYKDDDDK:FLAGタグ
AGA:リンカー領域
DYKDDDDK:FLAGタグ
LDGG:リンカー領域
YPYDVPDYA:HAタグ
AGA:リンカー領域
YPYDVPDYA:HAタグ
MPGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGAAPPLCAAPCSCDGDRRVDCSGKGLTAVPEGLSAFTQALDISMNNITQLPEDAFKNFPFLEELQLAGNDLSFIHPKALSGLKELKVLTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQSLRLDANHITSVPEDSFEGLVQLRHLWLDDNSLTEVPVHPLSNLPTLQALTLALNKISSIPDFAFTNLSSLVVLHLHNNKIRSLSQHCFDGLDNLETLDLNYNNLGEFPQAIKALPSLKELGFHSNSISVIPDGAFDGNPLLRTIHLYDNPLSFVGNSAFHNLSDLHSLVIRGASMVQQFPNLTGTVHLESLTLTGTKISSIPNNLCQEQKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEEISLQRNQIYQIKEGTFQGLISLRILDLSRNLIHEIHSRAFATLGPITNLDVSFNELTSFPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEALAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIRVALYVGIAVGVVAALIIIGIIIYCCCCRGKDDNTEDKEDARPNREAYEEPPEQLRELSREREEEDDYRQEEQRSTGRESPDHLDQDYKDDDDK
配列中、
MPGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGA:シグナルペプチド
APPLCAAPCSCDGDRRVDCSGKGLTAVPEGLSAFTQALDISMNNITQLPEDAFKNFPFLEELQLAGNDLSFIHPKALSGLKELKVLTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQSLRLDANHITSVPEDSFEGLVQLRHLWLDDNSLTEVPVHPLSNLPTLQALTLALNKISSIPDFAFTNLSSLVVLHLHNNKIRSLSQHCFDGLDNLETLDLNYNNLGEFPQAIKALPSLKELGFHSNSISVIPDGAFDGNPLLRTIHLYDNPLSFVGNSAFHNLSDLHSLVIRGASMVQQFPNLTGTVHLESLTLTGTKISSIPNNLCQEQKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEEISLQRNQIYQIKEGTFQGLISLRILDLSRNLIHEIHSRAFATLGPITNLDVSFNELTSFPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEALAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIR:hLGR4(ECD)
VALYVGIAVGVVAALIIIGIIIYCCCCRGKDDNTEDKEDARPNREAYEEPPEQLRELSREREEEDDYRQEEQRSTGRESPDHLDQ:TM領域を含むGPA33配列
DYKDDDDK:FLAG
完全長ヒト(h)LGR5は、2つのFLAGタグ及び2つのHAタグを含むベクターpEF1_Myc/His(pEF1_hLGR5−FLAG−HA)中に存在し、pVax1(Invitrogen)にクローニングし、pVax1_hLGR5−FLAG−HAを得た。配列は、NCBI参照配列NM_003667.3との比較によって確認した。構造体pEF1_hLGR5−FLAG−HAからの挿入を、pVax1に再クローニングし、pVax1_hLGR5−FLAG−HAを得た。別途、pVax1中の完全長hLGR5を、hLGR5の短縮型、hLGR5(ECD)−GPA33(TM)−FLAGで置換し、pVax1_hLGR5(ECD)−GPA33(TM)−FLAGを得た。
MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIGVIAAVNMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCHVIGFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSAKYSAKFETKAPFSSLKVIILLCALLALTMAAVPLLGGSKYGASPLCLPLPFGEPSTMGYMVALILLNSLCFLMMTIAYTKLYCNLDKGDLENIWDCSMVKHIALLLFTNCILNCPVAFLSFSSLINLTFISPEVIKFILLVVVPLPACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLRKQTYVWTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSITYDLPPSSVPSPAYPVTESCHLSSVAFVPCLARDYKDDDDKAGADYKDDDDKLDGGYPYDVPDYAAGAYPYDVPDYA
配列中、
MDTSRLGVLLSLPVLLQLATG:シグナルペプチド
GSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIGVIAAVNMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCHVIGFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSAKYSAKFETKAPFSSLKVIILLCALLALTMAAVPLLGGSKYGASPLCLPLPFGEPSTMGYMVALILLNSLCFLMMTIAYTKLYCNLDKGDLENIWDCSMVKHIALLLFTNCILNCPVAFLSFSSLINLTFISPEVIKFILLVVVPLPACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLRKQTYVWTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSITYDLPPSSVPSPAYPVTESCHLSSVAFVPCL:hLGR5
AR:リンカー領域
DYKDDDDK:FLAGタグ
AGA:リンカー領域
DYKDDDDK:FLAGタグ
LDGG:リンカー領域
YPYDVPDYA:HAタグ
AGA:リンカー領域
YPYDVPDYA:HAタグ
MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRVALYVGIAVGVVAALIIIGIIIYCCCCRGKDDNTEDKEDARPNREAYEEPPEQLRELSREREEEDDYRQEEQRSTGRESPDHLDQDYKDDDDK
配列中、
MDTSRLGVLLSLPVLLQLATG:シグナルペプチド
GSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIR:hLGR5(ECD)
VALYVGIAVGVVAALIIIGIIIYCCCCRGKDDNTEDKEDARPNREAYEEPPEQLRELSREREEEDDYRQEEQRSTGRESPDHLDQ:TM領域を含むGPA33配列
DYKDDDDK:FLAG
完全長(FL)マウス(m)LGR5をコードするcDNAは、cMyc及びHISタグを含むpEF1_Myc/His(Invitrogen)(pEF1_mLgr5−Myc−HIS)中に存在していた。mLgr5 cDNA配列は、配列決定及び参照配列NM_010195.2との比較によって確認した。
MDTSCVHMLLSLLALLQLVAAGSSPGPDAIPRGCPSHCHCELDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLPASLLHRLCFLEELRLAGNALTHIPKGAFTGLHSLKVLMLQNNQLRQVPEEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTDVPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIADYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIKTLSNLKELGFHSNNIRSIPERAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGVSAFQHLPELRTLTLNGASHITEFPHLTGTATLESLTLTGAKISSLPQAVCDQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSLSGCQKLQKIDLRHNEIYEIKGSTFQQLFNLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPVTGLHGLTHLKLTGNRALQSLIPSANFPELKIIEMPSAYQCCAFGGCENVYKISNQWNKDDGNSVDDLHKKDAGLFQVQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLFGSWLIRIGVWTTAVLALSCNALVALTVFRTPLYISSIKLLIGVIAVVDILMGVSSAVLAAVDAFTFGRFAQHGAWWEDGIGCQIVGFLSIFASESSIFLLTLAALERGFSVKCSSKFEVKAPLFSLRAIVLLCVLLALTIATIPLLGGSKYNASPLCLPLPFGEPSTTGYMVALVLLNSLCFLIMTIAYTKLYCSLEKGELENLWDCSMVKHIALLLFANCILYCPVAFLSFSSLLNLTFISPDVIKFILLVIVPLPSCLNPLLYIVFNPHFKEDMGSLGKHTRFWMRSKHASLLSINSDDVEKRSCESTQALVSFTHASIAYDLPSTSGASPAYPMTESCHLSSVAFVPCLAAARGHPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH
配列中、
MDTSCVHMLLSLLALLQLVAA:シグナルペプチド
GSSPGPDAIPRGCPSHCHCELDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLPASLLHRLCFLEELRLAGNALTHIPKGAFTGLHSLKVLMLQNNQLRQVPEEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTDVPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIADYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIKTLSNLKELGFHSNNIRSIPERAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGVSAFQHLPELRTLTLNGASHITEFPHLTGTATLESLTLTGAKISSLPQAVCDQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSLSGCQKLQKIDLRHNEIYEIKGSTFQQLFNLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPVTGLHGLTHLKLTGNRALQSLIPSANFPELKIIEMPSAYQCCAFGGCENVYKISNQWNKDDGNSVDDLHKKDAGLFQVQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLFGSWLIRIGVWTTAVLALSCNALVALTVFRTPLYISSIKLLIGVIAVVDILMGVSSAVLAAVDAFTFGRFAQHGAWWEDGIGCQIVGFLSIFASESSIFLLTLAALERGFSVKCSSKFEVKAPLFSLRAIVLLCVLLALTIATIPLLGGSKYNASPLCLPLPFGEPSTTGYMVALVLLNSLCFLIMTIAYTKLYCSLEKGELENLWDCSMVKHIALLLFANCILYCPVAFLSFSSLLNLTFISPDVIKFILLVIVPLPSCLNPLLYIVFNPHFKEDMGSLGKHTRFWMRSKHASLLSINSDDVEKRSCESTQALVSFTHASIAYDLPSTSGASPAYPMTESCHLSSVAFVPCL:mLGR5(FL)
AAARGHPF:リンカー
EQKLISEEDL:cMyc由来エピトープタグ
NMHTG:リンカー
HHHHHH:ヘキサHisタグ
ヒト(h)ZNRF3(Genbank NM_001206998.1)をコードするcDNAを鋳型として用い、cDNAの特定部分(細胞外ドメイン(ECD):アミノ酸1〜219、又はECD−TM部分(短縮変異体):アミノ酸1〜256)を増幅した。標的タンパク質を抗原陰性細胞の表面に発現可能とするため、かつ安定な細胞クローンを作製可能とするため、hZNRF3のECDをコードするcDNAをpDisplay(pDisplay_hZNRF3(ECD)−cMyc−PDGFR(TM))にクローニングし、短縮変異体(自己TM領域を有するECD)をpcDNA3.1(pcDNA3.1_hZNRF3(ECD−TM))にクローニングした。pDisplay構造体により、細胞外cMyc由来エピトープタグを介したタンパク質表面発現の確認が可能となる。特異的プライマーを設計して合成し、hZNRF3の特定部分の増幅に用いた。次いでこれらをpDisplay(ECDのみ)にクローニングし、pDisplay_hZNRF3(ECD)−cMyc−PDGFR(TM)及びpcDNA3.1(TM領域を有するECD)を得、(抗原陰性)細胞中で発現するpcDNA3.1_hZNRF3(ECD−TM)を得た。
マウス(m)ZNRF3(Genbank NM_001080924.2、アミノ酸53〜205、用いたシグナルペプチドはシスタチン由来であった)のECD及びヒトRNF43(GenBank NM_017763、アミノ酸24〜109、シスタチンリーダー配列を含む)のECDをコードするcDNAを用い、ベクターpUPE(U−Protein Express BV)において、標的のECDからなる、組み換えの、精製した、hisタグを付加したタンパク質を作製した。要約すると、構造体(Peng et al.2013 Plos ONE 8:2−10)をHek293E細胞(293 c18 ATCC,CRL−10852)にトランスフェクションし、産生の1週間後に、タンパク質を含む上清を採取した。ヘキサHISタグを付加したタンパク質を、IMAC(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)及びゲル濾過の手段によって精製した。マウスZNRF3の(コドン最適化)ECDをコードする別のcDNAを合成的に作製し、cMyc由来エピトープタグ及び血小板由来成長因子受容体(PDGFR)の膜貫通領域とフレームを揃え、細胞表面に発現するpDisplayにクローニングした(pDisplay_mZnrf3−cMyc−PDGFR(TM))。
ヒト(h)RNF43(Genbank NM_NM_017763)をコードするcDNAを鋳型として用い、cDNAの特定部分(細胞外ドメイン(ECD):アミノ酸1〜199、又はECD−TM部分(短縮変異体):アミノ酸1〜222)を増幅した。標的タンパク質を抗原陰性細胞の表面に発現可能とするため、かつ安定な細胞クローンを作製可能とするため、hRNF43のECDをコードするcDNAをpDisplayにクローニングし(pDisplay_hRNF43(ECD)−cMyc−PDGFR(TM))、hRNF43の短縮変異体(自己TM領域を有するECD)をpcDNA3.1にクローニングした(pcDNA3.1_hRNF43(ECD−TM))。pDisplay構造体により、細胞外cMyc由来エピトープタグを介したタンパク質表面発現の確認が可能となる。特異的プライマーを設計して合成し、hZNRF3の特定部分の増幅に用いた。次いで、(抗原陰性)細胞での発現及び標的を安定的に発現する細胞クローンの作製のため、これらをpDisplay(免疫化のためECDのみ)及びpCDNA3.1(TM領域を有するECD)にクローニングした。
マウス(m)RNF43(Genbank NM_172448.3、アミノ酸1〜199)のECDをコードするcDNAを合成遺伝子として発注し、cMyc由来エピトープタグ及び血小板由来成長因子受容体(PDGFR)の膜貫通領域とフレームを揃え、細胞表面にpDisplay_mRnf43−cMyc−PDGFR(TM)を発現するpDisplayにクローニングした。
MRPRSGGRPGATGRRRRRLRRRPRGLRCSRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAARAKETAFVEVVLFESSPSGDYTTYTTGLTGRFSRAGATLSAEGEIVQMHPLGLCNNNDEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENPEAIDQLNQGSEDPLKRPVVYVKGADAIKLMNIVNKQKVARARIQHRPPRQPTEYFDMVDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR
配列中、
MRPRSGGRPGATGRRRRRLRRRPRGLRCSRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAARA:シグナルペプチドKETAFVEVVLFESSPSGDYTTYTTGLTGRFSRAGATLSAEGEIVQMHPLGLCNNNDEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENPEAIDQLNQGSEDPLKRPVVYVKGADAIKLMNIVNKQKVARARIQHRPPRQPTEYFDM:
ヒトZNRF3 VDのECD:クローニング部位によってコードされるアミノ酸
EQKLISEEDL:cMyc由来エピトープタグ
NAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR:TM領域を含むPDGFR配列
MRPRSGGRPGATGRRRRRLRRRPRGLRCSRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAARAKETAFVEVVLFESSPSGDYTTYTTGLTGRFSRAGATLSAEGEIVQMHPLGLCNNNDEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENPEAIDQLNQGSEDPLKRPVVYVKGADAIKLMNIVNKQKVARARIQHRPPRQPTEYFDMGIFLAFFVVVSLVCLILLVKIKLKQRRSQNSMNRPAV
配列中、
MRPRSGGRPGATGRRRRRLRRRPRGLRCSRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAARA:シグナルペプチド
KETAFVEVVLFESSPSGDYTTYTTGLTGRFSRAGATLSAEGEIVQMHPLGLCNNNDEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENPEAIDQLNQGSEDPLKRPVVYVKGADAIKLMNIVNKQKVARARIQHRPPRQPTEYFD:ヒトZNRF3のECD
MGIFLAFFVVVSLV:予測されるTM領域
CLILLVKIKLKQRRSQNSMNRPAV:細胞内テール
GSKETAFVEVVLFESSPSGDYTTHTTGLTGRFSRAGAMLSAEGEIVQMHPLGLCNNNDEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENPEAIDQLNQGSEDPLKRPVVYVKGADAIKLMNIVNKQKVARARIQHLAAAHHHHHH
配列中、
GS:クローニング部位によってコードされたアミノ酸
KETAFVEVVLFESSPSGDYTTHTTGLTGRFSRAGAMLSAEGEIVQMHPLGLCNNNDEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENPEAIDQLNQGSEDPLKRPVVYVKGADAIKLMNIVNKQKVARARIQHL:マウスZNRF3のECD
AAA:クローニング部位によってコードされたアミノ酸
HHHHHH:ヘキサHisタグ
MRPRSGGRPGAPGRRRRRLRRGPRGRRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAARAKETAFVEVVLFESSPSGDYTTHTTGLTGRFSRAGAMLSAEGEIVQMHPLGLCNNNDEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENPEAIDQLNQGSEDPLKRPVVYVKGADAIKLMNIVNKQKVARARIQHLPPRQPTEYFDMVDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR
配列中、
MRPRSGGRPGAPGRRRRRLRRGPRGRRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAARA:シグナルペプチド
KETAFVEVVLFESSPSGDYTTHTTGLTGRFSRAGAMLSAEGEIVQMHPLGLCNNNDEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENPEAIDQLNQGSEDPLKRPVVYVKGADAIKLMNIVNKQKVARARIQHLPPRQPTEYFDM:ECD mZNRF3
VD:クローニング部位によってコードされるアミノ酸
EQKLISEEDL:cMyc由来エピトープタグ
NAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR:TM領域を含むPDGFR配列
MSGGHQLQLAALWPWLLMATLQAGFGRTGLVLAAAVESERSAEQKAIIRVIPLKMDPTGKLNLTLEGVFAGVAEITPAEGKLMQSHPLYLCNASDDDNLEPGFISIVKLESPRRAPRPCLSLASKARMAGERGASAVLFDITEDRAAAEQLQQPLGLTWPVVLIWGNDAEKLMEFVYKNQKAHVRIELKEPPAWPDYDVVDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR
配列中、
MSGGHQLQLAALWPWLLMATLQAGFGRTGLVLAAAVESERSA:シグナルペプチド
EQKAIIRVIPLKMDPTGKLNLTLEGVFAGVAEITPAEGKLMQSHPLYLCNASDDDNLEPGFISIVKLESPRRAPRPCLSLASKARMAGERGASAVLFDITEDRAAAEQLQQPLGLTWPVVLIWGNDAEKLMEFVYKNQKAHVRIELKEPPAWPDYDV:ヒトRNF43のECD
VD:クローニング部位によってコードされたアミノ酸
EQKLISEEDL:Myc由来エピトープタグ
NAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR:TM領域を含むPDGFR配列
MSGGHQLQLAVLWPWLLMATLHAGFGHTGRVLAAAVESERSAEQKAVIRVIPLKMDPTGKLNLTLEGVFAGVAEVTPAEGKLMQSHPLYLCNASDDDNLEPGFISIVKLESPRRAPRPCLSLASKARMAGERGANAVLFDITEDRSAAEQLQQPLGLTKPVVLIWGSDAAKLMEFVYKNRKAYVWIELKEPPAGANYDVVDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR
配列中、
MSGGHQLQLAVLWPWLLMATLHAGFGHTGRVLAAAVESERSA:シグナルペプチド
EQKAVIRVIPLKMDPTGKLNLTLEGVFAGVAEVTPAEGKLMQSHPLYLCNASDDDNLEPGFISIVKLESPRRAPRPCLSLASKARMAGERGANAVLFDITEDRSAAEQLQQPLGLTKPVVLIWGSDAAKLMEFVYKNRKAYVWIELKEPPAGANYDV:マウスRNF43のECD
VD:クローニング部位によってコードされたアミノ酸
EQKLISEEDL:Myc由来エピトープタグ
NAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR:TM領域を含むPDGFR配列
カニクイザルLGR5をコードするcDNAを、ヒト特異的プライマーを用い、カニクイザル結腸及び肝臓cDNAから増幅した(Cyno−LGR5−FOR:5’−CCAGCAGGATCCGCCGCCACCATGGACACCTCCCGGCTCGGTG−3’及びCyno−LGR5−REV:5’−CCAGCAGCGGCCGCTTAGAGACATGGGACAAATGCCAC−3’)。PCR反応の収率及び特異性を場合によっては向上させるため、DMSOを反応に加えた。肝臓及び結腸cDNAの両方により、予想された2.7kbのバンドが増幅され、次いで、結腸cDNAから得られたPCR生成物をクローニングに用いた。得られたcDNAを、pcDNA3.1(BamH1−Not1)にクローニングし、配列決定した。カニクイザルの細胞外ドメインから構成されるキメラEGF受容体をコードする配列(国際公開第2010/022736(A2)号にも記載されている)を、米国特許出願公開第2010/0183615(A1)号(79ページ)から得られたヒト膜貫通部分及び細胞内部分に結合させた。コードするcDNAは、ヒト細胞での発現にコドン最適化し、GeneArtに発注し、GeneArtによりクローニングした。次いで、このcDNAを、Nhe1及びNot1を用い、pcDNA3.1に再クローニングした。ラットEGFR及びラットLGR5をコードするcDNAはSino Biological(ラットEGFRコードcDNA:カタログ番号RG80100−UT;GenBank参照HM801041.1)及びOrigene(ラットLGR5コードcDNA:カタログ番号RN202738;GenBank参照NM_001106784)より入手可能である。両方のcDNAを、Kpn1及びNot1を用い、pcDNA3.1に再クローニングした。全てのcDNAを配列決定し、正しいことが示された。
MDTSRLGVLLSLPVLLQLAAGSSSPRSGALLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRQVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPVTGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKIIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQVQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIGVIAVVNMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCQVIGFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSVKCSAKFETKAPFSSLKVIILLCALLALTMAAVPLLGGSEYGASPLCLPLPFGEPSTTGYMVALILLNSLCFLMMTIAYTKLYCNLDKGDLENIWDCSMVKHIALLLFTNCILYCPVAFLSFSSLLNLTFISPEVIKFILLVIVPLPACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLGKQTYFWTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSIAYDLPPSSVPSPAYPVTESCHLSSVAFVPCL
配列中、
MDTSRLGVLLSLPVLLQLAAG:シグナルペプチド
SSSPRSGALLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRQVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPVTGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKIIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQVQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIGVIAVVNMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCQVIGFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSVKCSAKFETKAPFSSLKVIILLCALLALTMAAVPLLGGSEYGASPLCLPLPFGEPSTTGYMVALILLNSLCFLMMTIAYTKLYCNLDKGDLENIWDCSMVKHIALLLFTNCILYCPVAFLSFSSLLNLTFISPEVIKFILLVIVPLPACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLGKQTYFWTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSIAYDLPPSSVPSPAYPVTESCHLSSVAFVPCL:カニクイザルLGR5
hLGR4(pEF1_hLGR4−FLAG−HA)、hLGR5(pEF1_hLGR5−FLAG−HA)、hZRNF3(ECD)(pcDNA3.1_hZNRF3(ECD)及びpDisplay_hZNRF3(ECD)−Myc−PDGFR(TM))及びhRNF43(ECD)(pDisplay_hRNF43−(ECD)−Myc−PDGFR(TM))を発現する構造体を用い、それぞれのタンパク質を安定的に発現するFreestyle 293Fクローン及びCHO−K1クローンを作製した。構造体を、Freestyle 293F細胞及びCHO−K1細胞中でPEI(Freestyle 293F細胞)又はリポフェクタミン(CHO細胞)トランスフェクションを用い、一過性トランスフェクションし、それぞれの標的と反応する抗体を用い、FACSによってスクリーニングした。良好にトランスフェクションした後、Freestyle 293F細胞及びCHO−K1細胞の両方を、限界希釈法により、0.5mg/mL G418の選択圧下で接種し、安定な細胞クローンを得た。選定の2〜3週間後、クローンをFACSによってスクリーニングした。選定したクローンを連続継代により拡大培養し、FACSで再試験し、−150℃で凍結した。
LGR4、LGR5、ZNRF3及びRNF43に結合するヒト抗体を作製するため、ヒトVK1−39軽鎖(共通軽鎖マウス、国際公開第2009/157771号を参照)及びヒト重鎖(HC)小遺伝子座(minilocus)(ヒトV遺伝子断片、全てのヒトDs及びヒトJsの選定を含む)の遺伝子導入マウスを、タンパク質をコードするDNA又は下記に簡単に説明する組み換えDNAのいずれかで免疫した。これらのマウスは、「MeMo(登録商標)」マウスと呼ばれる。
hLGR4/hLGR5 DNA免疫化
18匹のマウスを、それぞれ完全長hLGR4及びhLGR5を発現するプラスミドDNA(pVax1_hLGR4−FLAG−HA及びpVax1_hLGR5−FLAG−HA)20μgで免疫した。更に、12匹のマウスを、GPA33の膜貫通ドメイン及びFlagタグに融合したhLGR4及びhLGR5の細胞外ドメインのプラスミドDNA(pVax1_hLGR4(ECD)−GPA33−FLAG及びpVax1_hLGR5(ECD)−GPA33−FLAG)20μgで免疫した。マウスに、0、3、6、14、17、28、31、49、63、70、84及び91日目にワクチン接種した。
6匹のマウスを、PBSに溶解した組み換えヒト(rh)LGR4−Fc(RND systemsカタログ番号7750−GP)、rhLGR5−Fc(RND systemsカタログ番号8078−GP)、rhZNRF3−Fc(RND systemsカタログ番号7994−RF)又はrhRNF43−Fc(RND systemsカタログ番号7964−RN)タンパク質40μgで免疫し、GerbuアジュバントMM(Gerbu Biotechnik)40μLを添加した。続いて、マウスを組み換えタンパク質20μg(+GerbuアジュバントMM 20μL)で14及び28日目に追加免疫し、その後、血清力価が確認されるまで、又は免疫期間が3箇月を超えるまで、組み換えタンパク質20μgで更に追加免疫した。
免疫したマウスの血清中の抗hLGR4、抗hLGR5、抗hZNRF3又は抗hRNF43力価を、FACSによって、それぞれの標的を過剰発現するFreestyle 293F細胞について測定した。
脾臓及び流入領域リンパ節を、良好に免疫された全てのマウス(表1を参照)から取り出した。単一細胞懸濁液を脾臓及び鼠径リンパ節の両方から調製した後、これらの組織をトリゾール試薬中に溶解し、使用まで−80℃で保存した。
良好に免疫されたマウスの鼠径リンパ節を、「免疫」ファージ抗体レパートリーの構築に用いた。トリゾールを用いてRNAをリンパ組織から抽出し、全RNA 1μgを、IgG−CH1特異的プライマーを用いたRT反応に用いた。次いで、得られたcDNAを用い、自社開発のVH特異的プライマーを用い、本質的にMarks et al.(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581〜97)に記載のように、VHをコードするcDNAのポリクローナルプールを増幅した。次いで、Fabフラグメントをファージ上に呈するため、得られたPCR生成物を、Haard et al.(J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218〜30)に記載のように、ファージミドベクターにクローニングした。ただし、軽鎖は各抗体に同一のものであり、ベクターによってコードされた。ライゲーション後、ファージミドを用いて大腸菌TG1を形質転換し、形質転換した細菌を、アンピシリン及びグルコースを含むLB寒天平板培地に接種した。全てのファージライブラリーは106超の形質転換体を含んでおり、挿入頻度は80%超であった。終夜培養した後細菌を採取し、確立した手順(de Haard et al.,J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218〜30)に従い、ファージを調製するのに用いた。
ファージライブラリーは、標準化された手順(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581〜97;J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218〜30)に従って回収し、自社で作製した合成レパートリーの場合は2回の選定、免疫ファージ抗体レパートリーの場合は1回で、ファージを選定した。1回目は、組み換えタンパク質をMAXISORP(登録商標)ELISAプレートの壁又はNUNC免疫チューブにコーティングし、一方、2回目は、標的を過剰発現する組み換えタンパク質又は細胞のいずれかを用いた。MAXISORP(登録商標)ELISAプレート又は免疫チューブは、4%ELKで阻害した。ファージ抗体ライブラリーも4%ELK及び過剰のヒトIgGで阻害し、ファージライブラリーをコーティングした抗原に付加する前に、Fc領域の結合体を枯渇させた。
それぞれの標識を安定的に過剰発現するFreestyle 293F細胞クローンを、自家作製した。これらの細胞を、標準化された手順を用い、培養し、採取した。次いで、細胞培地1mL中約2000万の抗原発現細胞を、DiD(Invitrogen、カタログ番号V22889)1μLにより、37℃で20分間標識した。DiD標識を細胞の少量のアリコートについてFACSで確認し、一貫して90%超であることが分かった。次いで、細胞を細胞培地20mLで2回洗浄した後、FACS染色に用いた。この目的のために、抗原陰性(親)Freestyle 293F細胞とDiD標識抗原陽性細胞との1:1混合物を調製し、丸底の96ウェルFACSマイクロタイタープレートに、1ウェル当たり200,000細胞のアリコートに分割した。モノクローナルファージを用いた染色を、下記のように実施した。
それぞれの標的への結合について選定された単一クローンのモノクローナルファージを、記載(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581〜97;J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218〜30)のように調製した。これらを、4%の乳を含む全量100μLのFACS緩衝液(0.5%のBSA及び0.5mMのEDTAを含むPBS)中でファージ(30μL)とインキュベートすることにより、FACSで、(DiD標識)抗原陽性細胞株と(非標識)抗原陰性細胞株との混合物への結合について試験した。3回洗浄した後、ビオチン化抗M13抗体(Fitzgerald、カタログ番号61R−M101ABTB62−FEZ、FACS緩衝液中に1:125、氷上で30分間)及びPE標識ストレプトアビジン(Invitrogen、カタログ番号SA1004−4;FACS緩衝液中に1:400、氷上で15分間)で染色することにより、結合したファージを検出した。染色した細胞を、FACS Canto(Becton and Dickinson)を用いて解析した。
EGFR標的及びHER3標的cLC抗体を、前述の方法(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581〜97;J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218〜30)を用い、自社で作製した大型の合成ファージ抗体レパートリー(HER3)から、又は良好に標的免疫されたMeMoマウス(EGFR)から作製したファージ抗体レパートリーから得た。EGFR及びHER3に対する抗体、並びにEGFR抗体及びHER3抗体それぞれに対する抗体可変ドメインVH鎖を作製する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、係属中の出願、すなわち、国際公開第2015/130173(A1)号及び同第2015/130172(A1)号に記載されている。
全ての標的特異的クローンの、VHをコードするcDNAを配列決定した。次いで、配列同一性及びクラスター分析(図25)に基づく固有のクローンの選定を、標準化された分子生物学的手法に従い、Sfi1−BstEII消化又はSfiI/XhoI消化と、消化したcDNAのプールのIgG発現プラスミドへのライゲーションとを用い、異なるIgG発現ベクターに再クローニングした。
独占権下にあるCH3エンジニアリング技術を用い、異なるVHドメインを有するIgGをコードする2つのプラスミドの一過性コトランスフェクションにより、二重特異性抗体を作製し、効率的なヘテロ二量体形成及び二重特異性抗体の形成を確保した。共通軽鎖もまた、同一の細胞中で、同一のプラスミド上又は別のプラスミド上のいずれかで、コトランスフェクションした。本発明者らの同時係属中の出願(例えば、国際公開第2013/157954号及び同第2013/157953号;参照により本明細書に組み込まれる)において、本発明者らは、単一細胞から二重特異性抗体を作製する方法及び手段を開示しており、単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体の形成に好都合である手段が提供される。これらの方法はまた、本発明においても好適に用いることができる。具体的には、本質的に二重特異性完全長IgG分子のみを産生する好ましい変異は、第1のCH3ドメインにおける351位及び366位、例えばL351K及びT366K(EUナンバリングによるナンバリング)のアミノ酸置換(「KK変異」重鎖)、並びに第2のCH3ドメインにおける351位及び368位、例えばL351D及びL368E(「DE変異」重鎖)、又はこの逆の場合である。本発明者らの同時係属中の出願において、負に帯電したDE変異重鎖及び正に帯電したKK変異重鎖が優先的に対になり、ヘテロ二量体(いわゆる「DEKK」二重特異性分子)を形成することが、以前に実証されている。DE変異重鎖(DE−DEホモ二量体)又はKK変異重鎖(KK−KKホモ二量体)のホモ二量体形成は、同一の重鎖間のCH3−CH3境界面における帯電した残基間の強い反発力のため、ほとんど発生しない。
VH配列の選定もまた、単一特異性の二価のIgGをコードする、IgG1発現ベクターに再クローニングした。懸濁に適応させた293F Freestyle細胞を、振とう機上のT125フラスコ中で、密度3.0×106細胞/mLで定常状態となるまで培養した。細胞を、密度0.3〜0.5×106生細胞/mLで、24ディープウェルプレートの各ウェル中に接種した。細胞を、個々の滅菌したDNA、すなわち、標準化された手順によるPEl混合物で一過性トランスフェクションし、更に培養した。トランスフェクションの7日後に上清を採取し、0.22μM(Sartorius)フィルタで濾過した。滅菌した上清を、抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製するまで、4℃で保存した。
EGFR、FZD、RSPO3又はLGR5を特異的に認識する抗体は、当該技術分野において既知である。比較抗体を、公開情報に従って構築した。すなわち、VH及びVLをコードするcDNA配列は公開特許由来であり、完全長ヒトIgG1分子をコードする発現ベクターにクローニングした。続いて、標準的な手順に従い、抗体を一過性トランスフェクションにより293F Freestyle細胞中で発現させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用い、培養上清から精製した。hu8E11v2(抗LGR5)抗体を、米国特許出願公開第2013/0336885(A1)号(Genentech)から複製した。BNC101抗体(抗LGR5)の配列情報は、米国特許出願公開第2016/0031984(A1)号(Bionomics Inc.)から入手した。OMP18R5抗体(抗FZD)をコードする配列は、豪州特許出願公開第2014/212081(A1)号(Oncomed Pharmaceuticals Inc.)から複製した。OMP18R20及びOMP18R21抗体配列(抗LGR5)は米国特許第8,628,774(B2)号(Oncomed Pharmaceuticals Inc.)に見出され、この特許から複製した。OMP131R10(抗RSPO3)をコードする配列は、国際公開第2016/090024(A2)号(Oncomed Pharmaceuticals Inc.)から複製した。セツキシマブ(Erbitux(登録商標))の臨床バッチを用いた。複製した抗体及びこれらの複製抗体に付与した内部番号の一覧を表7に示す。
IgGの精製は、小規模(500μg未満)、中規模(10mg未満)及び大規模(10mg超)で、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施した。小規模精製は、無菌条件下で、24ウェルフィルタプレート中で濾過を用いて実施した。まず、培地のpHをpH8.0に調整した後、IgGを含む上清をプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(50%v/v)(Pierce)と、振とうプラットフォーム上600rpmで、25℃において2時間インキュベーションした。次に、ビーズを濾過によって採取した。ビーズをPBS pH7.4で2回洗浄した。次いで結合したIgGをpH3.0で0.1Mクエン酸緩衝液によって溶出させ、Tris pH8.0を用い、溶出液を直ちに中和した。マルチスクリーンUltracel 10マルチプレート(Millipore)を用いた遠心分離により、緩衝液交換を実施した。試料は、最終的にPBS pH7.4中に採取した。IgG濃度を、Octetを用いて測定した。タンパク質試料は、4℃で保存した。
精製したIgGの量を測定するため、抗体の濃度を、Octet分析によって、プロテインAバイオセンサー(Forte−Bio、供給業者の推奨に従った)を用い、全ヒトIgG(Sigma Aldrich、カタログ番号I4506)を標準物質として用い、測定した。
LGR4、LGR5、ZNRF3又はRNF43を標的とする抗体を、まず、非関連(対照)抗原:破傷風トキソイドを認識する第2のFabアームを有する二重特異性共通軽鎖抗体として発現させた。抗体を、hLGR4、hLGR5、hZNR3又はhRNF43を過剰発現するFreestyle 293F細胞への結合について、FACSで試験した。そのため、細胞を採取し、FACS緩衝液(PBS/0.5%BSA/0.5mM EDTA)中、106細胞/mLに希釈した。1〜2×105の細胞を、U字型底の96ウェルプレート中の各ウェルに加えた。細胞を、300g、4℃で2分間遠心分離した。プレート(複数可)を反転させることにより、上清を廃棄した。各IgG試料の50μlを加え(スクリーニング用に、FACS緩衝液中、濃度5μg/mLに希釈した)、氷上で1時間インキュベートした。細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞をFACS緩衝液150μLで2回洗浄した。1:400に希釈したヤギ抗ヒトIgG PE(Invitrogen)50μLを加え、暗所において氷上で30分間インキュベートした。FACS緩衝液を加えた後、細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、FACSCantoフローサイトメーター(Becton and Dickinson)において、HTS設定で解析した。抗体の細胞への結合は、染色した細胞集団の平均蛍光強度(MFI)を測定することによって評価した。抗体は、MFIが、(陰性対照)非結合抗体(破傷風トキソイドを標的とする)で染色した同一の細胞集団のMFIの少なくとも5倍である場合、これらの標的に結合しているものとみなした。
細胞を採取し、FACS緩衝液(PBS/0.5%BSA/0.5mM EDTA)中、106細胞/mLに希釈した。1〜2×105の細胞を、U字型底の96ウェルFACSプレート中の各ウェルに加えた。細胞を、300g、4℃で2分間遠心分離した。プレート(複数可)を反転させることにより、上清を廃棄した。各IgG試料の50μLを、5μg/mLで開始する7段階の2倍希釈系列に加え、氷上で1時間インキュベートした。細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞をFACS緩衝液150μLで2回洗浄した。1:400に希釈したマウス抗ヒトIgG PE(Invitrogen)50μLを加え、暗所において氷上で30分間インキュベートした。FACS緩衝液を加えた後、細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、FACSCantoフローサイトメーターにおいて、HTS設定で解析した。平均蛍光強度(MFI)を測定し、MFIを染色に用いた抗体濃度の関数として得られたプロットから得られた曲線下面積(AUC)を算出することにより、抗体の細胞への結合を定量化した。
AEKTAexplorer 100システムにおいて、HiTrap MabSelect Sureカラム及びHiTrap脱塩カラムを用い、中規模精製を実施した。試料は5mL/分でロードした。カラムを、カラム2つ分の体積のPBSで洗浄した。IgGをpH3.0で0.1Mクエン酸緩衝液によって溶出させた。次に、試料を脱塩し、最終的な緩衝液をPBS pH7.4とした。IgGを、0.45μMフィルタ(Sartorius)で濾過した。IgG濃度を、OD280を用いて測定した。タンパク質試料は、−80℃で保存した。
mLgr4結合反応を試験するため、ELISAアッセイを用いた。LGR4標的抗体及びLGR5標的抗体を、組み換えmLgr4−Fc(RND systems、カタログ番号8077−GP)タンパク質に対する反応について試験した。mLgr4−Fcを、MAXISORP(登録商標)ELISAプレートに終夜コーティングした。ELISAプレートのウェルを、5%のBSAを含むPBS(pH7.2)で1時間阻害した。選定した抗体を、PBS−5%BSAで希釈した単一濃度5μg/mLで試験し、25℃で1時間結合させた。対照として、コーティングした抗原に特異的な市販の抗体及び対照(抗TT cLC)抗体について、この手順を同時に実施した。ELISAプレートをPBS−T(PBS−0.05%v/v Tween 20)で3回洗浄した。結合したIgGを1:2000に希釈したHRP複合体(ヤギ抗ヒトIgG、Becton Dickinson)によって検出し、25℃で1時間結合させた。ELISAプレートをPBS−T(PBS−0.05% Tween 20)で3回洗浄し、結合したIgGをTMB/H2O2染色によって可視化し、染色をOD450nmの測定によって定量化した。
全ての4つのWNT標的は、R−スポンジンをこれらのリガンドとして有する(Prog Biophys Mol Biol.2015 Sep;118(3):112〜8;J Struct Biol.2015 Aug;191(2):149〜55)。各標的について、リガンド阻害アッセイを開発し、標的(LGR4、LGR5、ZNRF3又はRNF43)特異的抗体が、R−スポンジン3の標的への結合を阻害する能力を試験した。それぞれの標的のECDのFc融合タンパク質の、コーティングされたR−スポンジン3への結合を、LGR4、LGR5、ZNRF3又はRNF43を標的とする過剰のcLC IgGの存在下で試験した。cLC IgGがR−スポンジン3結合部位に結合する場合、Fc融合タンパク質はもはやコーティングに結合できず、ELISAシグナルが喪失する。組み換えR−スポンジン3(RND systems)をMAXISORP(登録商標)ELISAプレートのウェルにコーティングした。ELISAプレートのウェルを、5%のBSAを含むPBS(pH7.2)で1時間阻害した。選定した抗体を、PBS−5%BSAで希釈した濃度15μg/mLで、組み換えヒト標的タンパク質(rhLGR4−Fc、rhLGR5−Fc、rhZNRF3−Fc又はrhRNF43−Fc)の存在下、阻害について試験した。IgG/組み換えヒト標的タンパク質複合体を10分間プレインキュベートした後、R−スポンジン3でコーティングしたプレートに10分間〜2時間加えた。阻害の対照として、IgGの代わりに過剰(15μg/mL)のrhR−スポンジン3を加え、この手順を同時に実施した。ELISAプレートをPBS−T(PBS−0.05%v/v Tween 20)で3回洗浄した。結合したFcタンパク質を1:2000に希釈した抗ヒトIgG HRP複合体(ヤギ抗ヒトIgG、Bethyl labs)によって検出し、25℃で1時間結合させた。ELISAプレートをPBS−T(PBS−0.05% Tween 20)で3回洗浄し、結合した複合体をTMB/H2O2染色によって検出し、染色をOD450nmの測定によって定量化した。
van Uhmらによって記載された手順に従い、IODO−GENを用い、アフコシル化PB10651を125Iで放射標識した。放射線標識後の抗体の免疫反応性を、Lindmoらによって記載された方法によって検査した。125I−PB10651の定常状態の細胞親和性測定を、EGFR又はLRG5のいずれかを発現するCHO細胞を用いて実施し、EGFR及びLGR5それぞれへの親和性を検査した。更に、EGFRを内因性に発現するが、検出可能なLGR5は発現しないDLD−1細胞株への親和性もまた測定した。アッセイでは、一定濃度の標的(細胞)を用い、定常状態条件における親和性測定の背景にある前提を妨害することなく、放射性リガンドの量をタイトレーションした。非特異的結合(NSB)を、100倍モル過剰の非標識PB10651の存在により、並行して評価した。アッセイを2回繰り返し、推定KD値を、3回の独立した実験の平均として報告する。KD値の推定は、GraphPad Prism v.6.0h非線形回帰、1部位−全て(One−Site−−Total)を用い、非特異的結合ではKD値は0より大きくなくてはならないという制約で実施した。
Lindmo T,Boven E,Cuttitta F,Fedorko J,Bunn PA.Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.J Immunol Methods.1984;72:77〜89.
van Uhm JI,Visser GW,van der Schans MJ,Geldof AA,Meuleman EJ,Nieuwenhuijzen JA.The ultimate radiochemical nightmare:upon radio−iodination of Botulinum neurotoxin A,the introduced iodine atom itself seems to be fatal for the bioactivity of this macromolecule.EJNMMI Res.2015;5:5.
PB10651によって認識されたEGFR及びLGR5上のエピトープを、Davidsonらにより記載された方法(2014)に従い、ショットガン突然変異誘発分析によって測定した。2つの変異ライブラリーを2つの抗原から作製した。一方のライブラリーはヒトEGFR(GenBank参照配列NP_005219.2)のアミノ酸300〜520(リガンド結合ドメインL2又はドメインIII)を含み、もう一方はヒトLGR5(GenBank参照配列AAH96324.1)のアミノ酸22〜560(第1の膜貫通ヘリックスまではN末端ドメインである)を含んでいた。LGR5発現構造体を、アミノ酸834で短縮し、受容体の細胞表面発現を増加させた。異なるエピトープを標的とする自社開発の抗体を、変異体の発現の対照抗体として用いた。
Davidson,E.and Doranz,B.J.(2014)A high−throughput shotgun mutagenesis approach to mapping B−cell antibody epitope.Immunology 143,13〜20.
米国特許第8,628,774(B2)に記載の抗体OMP88R20の文献に基づく複製品(PG7711と呼ぶ)をリガンド阻害対照として用い、抗LGR5 Fabアームのリガンド阻害能力を実証するアッセイを設定した。LGR5をコードする発現構造体を有するCHO−K1細胞の一過性トランスフェクションによってヒトLGR5を過剰発現するCHO−K1由来の細胞クローンを作製した後、限界希釈法により、抗生物質(G418)耐性クローンを選定した。次いで、OMP88R20の複製品のこの細胞株への結合を、抗体の希釈系列において試験し、結合のEC50を測定した。次に、抗体の、LGR5発現CHO細胞クローンへのEC50濃度での結合を、FACSにおいて、その都度量を増加させたリガンドR−スポンジン1(R&D Systems、カタログ番号4645−RF/CF)の存在下で測定した。PB10651の抗LGR5 Fab(MF5816)のLGR5への結合がリガンドの結合によって抑制されるか否かを試験するため、抗体を、LGR5結合について100ng/mLで、その都度量を増加させたR−スポンジン1の存在下で試験した。LGR5の膜近傍領域に結合することが報告されているラット抗LGR5抗体1D9(de Lau et al.,2011)を用いて同様のアッセイを実施し、相互作用の特異性を示した。
抗EGFR IgGを、EGF誘導シグナル伝達に対する抗EGFR IgGの効果について試験するため、EGF誘導によるA431細胞のアポトーシス細胞死を抑制する能力について抗EGFR IgGを試験した。要約すると、高濃度(10nM)のEGFは、A431細胞において(アポトーシス)細胞死を誘導する(Gulli et al.,1996)。この効果は、セツキシマブ(マウス225抗体は、セツキシマブのマウス同等物である)等のリガンド阻害抗EGFR抗体の添加により、用量依存的に回復可能である。A431細胞を1500細胞/ウェルで96ウェル組織培養プレートに接種し、終夜培養した。翌日、抗体を表示濃度で、62.5ng/mL(10nM)の組み換えヒトEGF(R&D Systems、カタログ番号236−EG)と共に加え、細胞を3日間培養した。3日後、アラマーブルー(Invitrogen、カタログ番号DAL1100)の添加、及び590nm発光、560nm励起の蛍光の測定により、代謝的に活性な細胞の数を測定した。全ての抗EGFR IgGを、抗EGFR IgGのEGF阻害効果について、このアッセイでセツキシマブと比較して試験した。
Gulli,L.F.,et al.,Epidermal growth factor−induced apoptosis in A431 cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity.Cell Growth Differ,1996.7(2):p.173〜178.
二重特異性IgGの安定性についての指標を得るため、全てのIgGを、血清を含む培地(DMEM、高グルコース(Gibco、カタログ番号41966−029)、9%ウシ胎児血清(Thermo Scientific、カタログ番号SV30180)を添加)中、40℃で1週間インキュベートした後、結合ELISAで(本質的に上記のように)、結合について試験した。このELISAは、2μg/mLの抗原(rhLGR4−Fc、rhLGR5−Fc、rhZNRF3−Fc又はrhRNF43−Fc)をコーティングすること、5μg/mLのIgGにおいて100μLを用いること、及びPBS中5%のBSAで阻害することからなる。このアッセイにおいて、2〜8℃(冷蔵庫)で保存した同一のIgG(血清を含む培地中)の抗原への結合を、40℃で保存したIgGの結合と比較した。40℃で1週間インキュベートした後の結合の低下(%)を算出した。
CRCオルガノイドを、ワーキング細胞バンクとして、上記(Van de Wetering et al.2015 Cell 161:933〜45)のように作製し、スクリーニングアッセイ用に、ドライアイス上で凍結バイアルとして、凍結培地(凍結保護物質として10%のDMSOを含むウシ胎児血清)1mL当たり1,500,000細胞の密度で発送した。凍結チューブは、3箇月以内の使用には−80℃で、長期間の保存には−150℃で保存した。
アドバンストDMEM(Thermo Fisher 12491−023)500mLを、100×ペニシリン−ストレプトマイシン(Thermo Fisher 15140−122)5mL、100×Glutamax(Thermo Fisher 35050−038)5mL及び1Mヘペス(Thermo Fisher 15630−056)5mLで強化することにより、チューモロイド拡大培地を作製した。強化したアドバンストDMEM 70mLに、R−スポンジン1でコンディショニングした培地20mL及びノギンでコンディショニングした培地(Van de Wetering et al.2015 Cell 161:933〜45)10mLを加え、チューモロイド拡大培地100mLを調製し、これに、50×B27サプリメント(Thermo Fisher 17504−044)2mL、1Mニコチンアミド(Sigma−Aldrich N0636)1mL、500mM N−アセチルシステイン(Sigma−Aldrich A9165)250μL、5mM A83−01(TGFβ阻害剤、Tocris 2939)10μL及び30mM SB202190(p38阻害剤、Sigma Aldrich S7067)33μLを更に添加した。チューモロイド拡大培地には、ヒトEGF(Peprotech AF−100−15)又はヒトNRG−1/HRG(ImmunoTools 11343047)の存在下で結腸チューモロイドを新たに接種した後、10mM Y27632(Rhoキナーゼ阻害剤、Abmole Y−27632二塩酸塩)100μLを更に添加した。EGF及びHRGはオルガノイドの拡大を刺激する成長因子であり、これらの用量が、スクリーニングアッセイの感度を決定する。EGFは、スクリーニング中は用量2.5ng/mL、5ng/mL若しくは10ng/mLで、又は、拡大中は10ng/mL若しくは50ng/mLで加えた。HRGは、5ng/mLで単独で用いた。
凍結した結腸チューモロイドを水浴中37℃で速やかに解凍し、強化したアドバンストDMEM 5mL中に採取した。オルガノイドは、4℃において1000rpmで5分間遠心分離することにより、ペレット化した。上清を除去し、オルガノイドを、成長因子を含まないチューモロイド拡大培地中に取り出した。このオルガノイド懸濁液を、Cultrex成長因子低減基底膜抽出物、タイプ2、PathClear(Amsbio 3533−010−02)と混合した。最終的なCultrexゲルの割合は60%であり、1mL当たりの細胞数は100,000であった。
患者由来オルガノイドが成長因子の処理に反応するか否かを測定するため、患者由来オルガノイドを、成長因子(EGF(5ng/mL)、又はNRG(5ng/mL))の存在下又は非存在下で上記のように接種した後、5日間培養した。次いで、生細胞数を、Cell Titer Glo細胞生存率アッセイ(Promega、カタログ番号G7571)を用い、測定した。次いで、成長因子刺激細胞を用いた発光の読み取りを用い、非刺激細胞を用いて得られた読み取りと比較した。
ゲル化は、あらかじめ温めた培養プレートでは、より速やかであった。そのため、細胞接種前日に、全ての培養プレートを、加湿したCO2インキュベーター(Eppendorf)中で37℃に置いた。
参照抗体(セツキシマブ(4℃)、陰性対照抗体、単一HER3又はEGFR標的抗体、かつHER3/EGFR抗体(ドライアイス上))を発送し、スクリーニング用に4℃で保存した。二重特異性抗体及び単一特異性抗体は、ディープウェル96ウェルプレート(deep-well 96-wells plates)中に密封され、4℃で発送して提供された。概して、単一特異性cLC抗体についての表記は、実施例を通じて接頭辞「PG」によって識別され、一方、二重特異性cLC抗体についての表記は、接頭辞「PB」によって認識される。疑義回避のため説明すると、cLC抗体のFabフラグメントについての表記は、接頭辞「MF」によって認識される。抗体を、4つのV字型底の96ウェルプレート(Greiner Bio−One 736−0118)のウェルB02〜ウェルG11(内側の60ウェル)の範囲の無作為に割り付けた位置に、手作業で移した。参照抗体も、無作為に割り付けた位置のプレートに、等しい濃度で加えた。これらの抗体マスタープレートを用い、1:10のPBS希釈プレートを調製した。マスタープレート及び希釈プレートは、密封して4℃で保存した。
高用量及び低用量V字型底の96ウェル抗体マスタープレートを、暴露前に培地で1:10に希釈した。一次スクリーニングに適用した抗体濃度は10μg/mL及び1μg/mL又は40μg/mL及び4μg/mLであり、検証選別において、抗体用量は10μg/mL及び2μg/mLであった。抗体を、接種の30分後にオルガノイドに加えた。プレート固定前の抗体暴露は最低7日間、最高9日間であった。
暴露されたチューモロイドプレートを撮像用に調製するため、オルガノイドを固定し、染色して細胞核及びアクチン細胞骨格をそれぞれ、前述のように可視化した(Di et al PlosOne 2014,PMID 25289886)。プレートの撮像は、Twister IIロボットアームに連結したMolecular Devices ImageXpress Micro XLSを用い、前述のように実施した(Sandercock et al,Molecular Cancer 2015,PMID 26227951)。簡潔に説明すると、384ウェルプレート中の各ウェルのzスタックを、4倍のレンズを用い、zステップサイズ50μmで取得した。1ウェル当たりの断面の数は20断面〜24断面の範囲であり、各ウェル中のゲルの深さの範囲全体を網羅した。
取得した画像を、OcellO Ominer(登録商標)3D画像解析プラットフォームによってアクセス可能な中央データサーバに保存した。これにより、分散計算設計による、3D画像スタックの直接の並行解析が可能となる。ソフトウェアが、各ウェル中で検出された対象物(細胞核及び細胞骨格)の構造と、これらの相対的な位置を解析する。解析に際し、出力を確認し、原画像の品質と解析方法を検出する。ソフトウェアが生成した対象物ごとの測定(細胞核、オルガノイド、オルガノイド内の細胞核、管腔、オルガノイド及び構造体全体(オルガノイド、細胞核及び管腔)の中の管腔の相対的な位置)を、続いてウェルごと、かつプレートのレイアウト情報(細胞株、成長因子の状態、処理等)に連結したデータに集計した。データ集計に際し、データを、対照処理内の整合性、エッジ効果がないこと、反復実験間及びz’因子間、陽性対照及び陰性対照間の整合性について確認した。次に、データをzスコアについて規準化し、データをTIBCO Spotfire(登録商標)にロードして検査し、更なる異常値を排除した。500の異なる形態的特徴を収集した。次いで、データを一連の統計処理にかけ、zスタック画像から収集した約500の特徴から、特徴のこの集合が、参照処理効果を陰性対照の形態から判別させる能力に基づき、3〜20の分割選定を行った。参照と陰性対照との距離をユークリッド距離の測定値として算出し(図5)、0と1との間にスケーリングした。形態変化のこの統合スコアを用い、化合物スクリーニング中の該当物を識別した。個々の選定した特徴の測定値を、画像による裏付けと共に用い、オルガノイドに対する該当物の効果を実証し、確認した。
結腸直腸癌試料由来のオルガノイドを、100%基底膜抽出物(BME,Amsbio)中で、37℃及び5%CO2において、2mM GlutaMax(Invitrogen)、10mMヘペス(Invitrogen)、1×B27レチノイン酸フリー体(Invitrogen)、50ng/mL EGF(Peprotech)、0.1μg/mLノギン(Peprotech)、ロック阻害剤Y−27632(Sigma−Aldrich)、10nM PGE2(Sigma−Aldrich)、3μm SB202190(Sigma−Aldrich)、10nMガストリン(Tocris)、1μg/mL R−SPO1(自社製)、10mMニコチノミド(Nicotinomide)(Sigma−Aldrich)、1.25mM N−アセチルシステイン(Sigma−Aldrich)、0.5μM A83−01(Tocris)を添加したアドバンストDMEM/F12(Invitrogen)から構成される培地によって培養した。解析の前日、オルガノイドを単一細胞に脱凝集させた。この目的のために、培地を取り除き、BMEを細胞回収溶液(BD Biosciences)中に再懸濁し、氷上で1時間インキュベートすることにより、オルガノイドをまずBMEから遊離させた。続いて、オルガノイドを遠心分離した(全ての遠心分離工程は、4℃において、200gで5分間であった)。ペレットを1mLの50%トリプシン/EDTA溶液(TE)、50%PBS中に再懸濁し、ピペットによる吸い上げ及び流出を繰り返し、単一細胞の懸濁液が得られたかを定期的に視覚的に評価した。TEをPBS 10mLで希釈し、遠心分離した。細胞をPBS 10mL中で2回洗浄した後、BME中に再懸濁し、あらかじめ温めたプレート(37℃)上に、50μLのアリコートに分割して滴下した。BMEの滴下を15分間放置した後、1滴当たり500μLの培地を加えた。12時間後、細胞回収溶液を用い、細胞をBMEから分離した。氷上に1時間放置した後、細胞を遠心分離し、0.5%のBSA及び0.5mMのEDTAを含むPBS(染色緩衝液)10mLで1回洗浄した。次いでペレットを染色緩衝液中に懸濁し、カウントした。最大で抗体100μL当たり100,000の細胞を用いた。細胞の概数をカウントした後、細胞を遠心分離し、10μg/mLに希釈した一次抗体(モノクローナルかつ二重特異性IgG)を含む染色緩衝液100μL中に再懸濁した。チューブを規則的に反転して均質な染色を確保しながら、細胞を氷上で45分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1mLの染色緩衝液で洗浄し、遠心分離した。細胞を1mLの染色緩衝液中で再度洗浄した後、1:400に希釈したR−PEに結合された抗ヒトIgG抗体(Invitrogen、H10104)を含む染色緩衝液100μLでインキュベートした。細胞を、遮光し、氷上で20分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1mLの染色緩衝液中で2回洗浄した後、0.1μM DAPI(Sigma−Aldrich)を含む染色緩衝液中に、細胞を再懸濁した。細胞を遮光して氷上に維持し、直ちに解析した。SSC−W対SSC−Aを用いて二重線を排除し、DAPIを用いて死細胞を排除した。LGR5抗体のゲーティングは、破傷風毒素(MF1337)に対して上昇する、陰性対照抗体の染色に基づいて設定した。蛍光は、BD FACS Aria Fusionを用い、DAPI用に設定したUVレーザー及び450/50フィルター、並びにR−PE蛍光を検出するための緑色レーザーを582/15フィルターと共に用いて検出した。
LGR5 FACS染色がLGR5を発現する細胞を強化したか否かを評価するため、染色された細胞の上位及び下位の15%が分離されるように設定した選別ゲートによって、細胞を選別した。合計2000の細胞をピクロプロファイリング緩衝液(IRB genomics facilityより提供された)中に選別した後、選別した細胞をIRB genomics facilityにより、RNA抽出及びcDNA合成用に処理した。LGR5の発現を、定量的PCRを用い、TaqManプローブ及びTaqMan Universal PCR Master Mix(両者ともApplied Biosystemsより)を用いて評価した。StepOnePlusリアルタイムPCR装置(Applied Biosystems)を用い、光学カバーを備えたクリアオプティカル96ウェル反応プレート(clear optical 96-well reaction plates)中で、製造業者の使用説明書に従って反応を実施した。陰性及び陽性のLGR5分画間の発現を、LGR5プローブ(Hs00173664_m1)を用いて評価し、内因性対照遺伝子B2M(Hs99999907_m1)の発現を用いて規準化した。標的遺伝子の発現の差を、StepOne 2.2 plusソフトウェアを用いて求めた。
細胞を前述のように染色し、染色された細胞の上位及び下位15%が、Primocin(Invitrogen)を含む200μLの培地中に選別されるように、選別ゲートを設定した。選別した細胞の数を、FACS選別の実施数に基づいて測定した。選別後、細胞を遠心分離し、BME 25μL当たり2000の細胞密度で接種した。2週間後、形成されたオルガノイドの数を、倒立光学顕微鏡を用い、手作業でカウントした。
抗体処理実験のため、培地を変更し、ガストリン又はPGE2を含まず、EGFの濃度を低下させた(2.5ng/mL)。オルガノイドを脱凝集させた後、トリファンブルー(Tryphan Blue)染色(Sigma−Aldrich)を用いて生細胞の数を測定し、5000の細胞を、48ウェル組織培養プレート中の25μLのBMEに接種した。各処理において技術的反復実験を8回行い、1ウェル当たり250μLの培地で培養した。単一細胞接種の3日後、培地を取り出し、抗体処理(2μg/mL)を含む培地と交換した。抗体を加えてから7日後、Olympus ScanRを用い、4倍の光学対物レンズを用いてプレートをスキャンし、ImageJを用い、IRB microscopy facilityによって設計されたマクロを実行してオルガノイドの数を定量化した。実験を3回別々に繰り返し、対応のあるサンプルの両側t検定を実施し、処理間の有意差を評価した。
処理したチューモロイドの組織培養プレートを計数のためにスキャンした後、チューモロイドを細胞回収溶液を用いて分離し、氷上で1時間インキュベートした。次いで、チューモロイドを遠心分離し、1mLのTRIzol(登録商標)Plus RNA精製キット(Life Technologies)中に再懸濁し、全RNAを抽出した。クロロホルムで相分離した後、上部の水相を70%エタノールと混合し、製造業者より提供された手順書に従い、RNAカラム(PureLink(登録商標)RNA Miniキット、Life Technologies)を通して洗浄した。Nanodrop分光光度計を用い、RNAを定量した。次いで、High Capacity cDNAキット(Applied Biosystems)を用い、RNAをcDNAに逆転写した。TaqManプローブ及びTaqMan Universal PCR Master Mix(両者ともApplied Biosystemsより)を用いた定量的リアルタイムPCRを用い、mRNAのLGR5(Hs00173664_m1)レベル及びCK20 (Hs00300643_m1)レベルを定量した。発現の違いは、2−ΔΔCT法及びStepOne 2.2 plusソフトウェアを用いて検出した。
in vivoで培養したPDX腫瘍から抽出したmRNAを用い、RNA配列決定(RNAseq)によって、LGR5遺伝子及びEGFR遺伝子の発現レベルを分析した。Crown Bioscienceデータベース(http://hubase2.crownbio.com)のデータを、キロベース100万当たりのフラグメント(FKPM)のlog2換算で表示した(表9)。更に、in vivoで培養した異なるPDX腫瘍から抽出した腫瘍細胞を、15μg/mLのPG5816(抗LGR5)、PG3755(抗EGFR)及び(対照)PG1337で染色した後、結合した抗体をPE標識抗ヒトIgGで検出した。表10は、いくつかの癌の適応症における全ての抗体染色の平均蛍光強度を示している。
4つの異なるWNT標的によるMeMo(登録商標)マウスの免疫化。
MeMo(登録商標)マウスを、完全長ヒトLGR4及びLGR5(pVax1_hLGR4−FLAG−HA及びpVax1_hLGR5−FLAG−HA)をコードする発現構造体、LGR4若しくはLGR5(pVax1_hLGR4(ECD)−GPA33−FLAG及びpVax1_hLGR5(ECD)−GPA33−FLAG)の細胞外ドメイン、又は組み換えタンパク質rhLGR4−Fc、rhLGR5−Fc、rhZNRF3−Fc若しくはrhRNF43−Fc(RND systems)のいずれかで免疫した。それぞれの抗原を安定的に過剰発現する、自社で作製したFreestyle 293F細胞株を用いたFACSアッセイによって、標的に対する体液性免疫反応のエビデンスについて、マウス血清をスクリーニングした。図6は、データの例を示している。4つのWNT標的で良好に免疫されたマウスの血清IgG力価(免疫化の前に採取された血清のMFIの少なくとも3倍の標的を安定的に発現するFreestyle 293F細胞株の染色をもたらす最高の血清希釈と定義した)を、表1に示す。次いで、それぞれの抗原に対して有意かつ特異的な免疫反応を備えたことが示されたマウスを試験から取り出し、これらのマウスのリンパ組織(鼠径リンパ節)を採取した。得られたリンパ節から、RT−PCRによって、非溶解性ファージの表面でFabフラグメントを発現するファージミドにおいて、IgG及びVH特異的プライマー対、並びにVHをコードするcDNAのポリクローナルプールのクローニングを用い、「免疫」ファージ抗体レパートリーを作製した。作製した全てのライブラリは、サイズが10^6クローン超(個々の形質転換体)であり、挿入頻度は80%超であった。
本質的にMarksらによって記載されたように(J.Mol.Biol.1991 Dec 5;222(3):581−97)、標的hLGR4、hLGR5、hZNRF3及びhRNF43を標的とするcLC抗体パネルを作製するため、rhLGR4−Fc、rhLGR5−Fc、rhZNRF3−Fc、rhRNF43−Fc(RND systems)又はhRNF43若しくはmZNRF3の可溶性ECD(自社で調製した)を固体の支持体にコーティングし、自社で作製した合成cLCファージ抗体レパートリーを、過剰なヒトIgGの存在下(Fc結合ファージの選定を防止するため)でコーティングした抗原に結合するために選別した。並行して、標的で良好に免疫された動物から作製した「免疫」ファージ抗体レパートリーも、選定に用いた。コーティングしたタンパク質に基づく選定はマイクロタイタープレート(NUNC、maxisorp)において実施し、それぞれの標的を過剰発現したFreestyle 293F細胞に基づく選定は溶液中で実施し、結合したファージの溶出は、100mMグリシン(pH2)又は100mM TEA(pH12)を用いたpHショックによって実施した。合成ファージ抗体ライブラリーを用いた1回目の選定後、選定したクローンのポリクローナルプールを用い、再度ファージを調製し、ファージを、同一の抗原への結合のために選別した、又は、それぞれの抗原を安定的に過剰発現する、自社で作製したFreestyle 293F細胞に基づいて選定した。1回(免疫ライブラリー)又は2回(合成ライブラリー)の選定後、単一クローンを採取し、モノクローナルファージの調製に用いた。これらのモノクローナルファージは、これらの標的への結合について、2つの細胞株、すなわち、親(抗原陰性)Freestyle 293F細胞株と、WNT標的を安定的に過剰発現したDiD標識293F Freestyle細胞との混合物を用いて、FACSで試験した。(DiD標識)抗原陽性細胞集団を認識し、抗原陰性細胞を認識しなかったファージクローンを抗原特異的とみなし、そのため、更に特徴分析を行った。図7は、選定したクローンを、標的発現細胞への抗原特異的結合について、FACSによって試験した実験を示している。
ファージディスプレイから分離した選定Fabフラグメント(コードMFnnnnで示した)を、DEKK変異を含むIgG1発現ベクターに再クローニングした。この目的のために、VHをコードするcDNAを、抗体フラグメントの選定に用いたファージミドベクターから切除し、(KK)DEKK変異を含むIgG発現ベクターに再クローニングした。相補的(DE)DEKK変異を含む発現構造体とコトランスフェクションし、非結合性対照抗原破傷風トキソイド(TT:MF1337)を標的とするFabフラグメントをコードすることにより、二重特異性抗WNT×TT IgGを得た(WNTは、LGR4、LGR5、ZNRF3又はRNF43を指す)。次いで、WNT標的に対して一価の結合活性を有する二重特異性IgG1パネルを作製し、精製し、これらの産生能及び特異性について特徴分析を行った。
ヒトLGR4、LGR5、ZNRF3又はRNF43に特異的に結合することが確認された二重特異性一価のIgGを、親和性、安定性、R−スポンジン3阻害能力、及びマウスオルソログ交差反応性について更に特徴分析し、その後、更に分割選定を行った。
結合抗体を、制限的抗体FACS(limited antibody FACS)でタイトレーションし、これらの親和性について、これらを順位付けした。hLGR4、hLGR5、hZNRF3又はhRNF43を過剰発現するFreestyle 293F細胞の細胞表面のhLGR4、hLGR5、hZNRF3又はhRNF43を標的とする一価のIgG(全て破傷風トキソイドFabフラグメントと組み合わせた)。各IgGを、それぞれの該当する過剰発現Freestyle 293F細胞株において試験した。IgGの2倍希釈系列(5μg/mL〜0.08μg/mL)を、WNT標的を安定的に発現する一定数の細胞(5×105細胞/ウェル)において試験した。各個々の測定値からの平均蛍光強度(MFI)を、FlowJo(FACS解析ソフトウェアBD)によって測定した。各IgGについてMFI値を抗体の濃度に対してプロットし、これらの曲線から、曲線下面積(AUC)を算出した。AUC値に基づき、二重特異性IgGの順位付けを、標的ごとに行った。親和性順位付けに用いたデータの例を図8に示す。
二重特異性IgGの結合特性を更に明らかにするため、マウスオルソログ交差反応性を測定した。mLgr5、mZNRF3及びmRNF43(pEF1_mLgr5−Myc−HIS、pDisplay_mZnrf3−Myc−PDGFR(TM)、pDisplay_mRnf43−Myc−PDGFR(TM))のマウスオルソログを発現する構造体を、HEK293T細胞中で一過性トランスフェクションした。濃度5μg/mLの一価のIgGを染色に用い、IgGの結合をFACSによって解析した。非トランスフェクションのFreestyle 293F細胞と比べ、平均蛍光強度(MFI)が2倍増加した場合、二重特異性IgGは、マウス交差反応性であるものとみなした。92のうち92の抗ZNRF3 IgGが、mZnrf3と交差反応性であり、29のうち9の抗RNF43 IgGが、mRnf43と交差反応性であり、69のうち18の抗LGR5 IgGが、マウスLgr5オルソログと交差反応性であった。mLgr4交差反応性は、ELISAで、rmLgr4−Fc(RND systems)タンパク質について試験した。二重特異性IgGは、OD450nmがバックグラウンド(陰性対照抗体のOD450nmシグナル)より5倍超高い場合に、mLgr4交差反応性であるものとみなした。IgGを、単一濃度5μg/mLにおけるrmLgr4−Fcへの結合について試験し、交差反応性を確認した。41のうち36の抗LGR4 IgGが、試験の結果、mLgr4交差反応性であった。
LGR4、LGR5、ZNRF3又はRNF43標的抗体がR−スポンジン3結合を阻害し得るか否かを試験可能とするため、全ての二重特異性IgGをリガンド阻害ELISAで試験した。4つのWNT標的の細胞外ドメインのFc融合タンパク質の、コーティングされたR−スポンジン3への結合を、LGR4、LGR5、ZNRF3又はRNF43を標的とする過剰の二重特異性IgGの存在下で試験した。異なる標的を標的とする二重特異性IgGを、それぞれのFc融合タンパク質とrhR−スポンジン3との相互作用を阻害するこれらの能力について試験するため、これらの二重特異性IgGを、阻害ELISAで試験した。IgGは、単一IgG濃度15μg/mLを用いて試験した。
二重特異性IgGの安定性の指標を得るため、全てのIgGを、血清を含む培地において40℃で1週間インキュベートした後、ELISAでの結合を、同一の培地において4℃でインキュベートした二重特異性抗体の結合と比較した。1週間後、IgGをELISAスクリーニングに用い、IgGがこれらの標的への結合を維持しているか否かを測定した。結合は、4℃での1週間のインキュベーションに比べ、40℃での1週間のインキュベーション後に残存したOD450nmシグナルの百分率で求めた。ほとんどのIgGを2回試験し、IgGが2つの独立したアッセイにおいて、その結合を少なくとも50%保持した場合、安定であるとみなした。2つの試験において安定性がばらついた場合、これらのIgGは部分的に安定であるとみなし、IgGの結合の保持が2回とも50%未満であった場合、これらは不安定であるとみなした。LGR4については、41のうち12のIgGが結合を保持し(7つが部分的に安定、2つが未確定で、ELISAにおいて結合しなかった)、LGR5については、69のうち38のIgGが結合を保持し(7つが部分的に安定)、ZNRF3については、92のうち28のIgGが結合を保持し(10が部分的に安定)、RNF43については、29のうち10のIgGが結合を保持した(9が部分的に安定)。
特徴分析終了後、データを収集し、得られた全てのデータに基づいて順位付けを行った。フォローアップの機能的スクリーニング用のWnt標的Fabフラグメントの選定は、下記のように実施した。
40℃で少なくとも50%の結合を保持した二重特異性IgGを選定した。次いで、最も高い親和性結合体を選定した。この選定は、異なる特徴、例えば、マウスオルソログ交差反応性又はR−スポンジン阻害能力を有する結合体を含んだ。機能的スクリーニング用に、4つの異なるWNT標的を標的とする二重特異性Fabフラグメントを、合計54選定した。LGR4については、41のうち10のFabフラグメント、LGR5については、69のうち17のFabフラグメント、ZNRF3については、92のうち18のFabフラグメント、RNF43については、29のうち9のFabフラグメントを選定した(表3)。
選定したhLGR4、hLGR5、hZNRF3又はhRNF43に対するWNT標的Fabフラグメントを、二重特異性抗体の大型パネル(500超の二重特異性抗体)の作製に用いた。選定したWNT標的Fabフラグメントを、受容体型チロシンキナーゼ(RTK)結合Fabフラグメントと組み合わせ、二重特異性IgGのパネルとして作製し、精製した。細胞アッセイにおいて受容体活性化を阻害するために選定された、EGFR及びHER3に特異的なFabフラグメントは、二重特異性形態で組み合わせた場合、他のFabフラグメントの機能は阻害しない。4つのEGFR Fabフラグメント、MF3755、MF4280、MF3370及びMF4289、並びに4つのHER3 Fabフラグメント、MF3178、MF3176、MF3125及びMF4863を、選定したWNT標的Fabフラグメントとの組み合わせで用いた(作製したパネルの分割選定については、表5を参照)。
結腸オルガノイドは、機能的管腔を形成する上皮結腸構造の形成を可能とする、成長因子を含む拡大培地中で培養した、LGR5陽性(癌)幹細胞由来である(Sato et al.2011 Gastroenterology 141:1762〜1772)。オルガノイドの成長、発達及び管腔形成は、結腸直腸癌細胞の遺伝的背景と、成長を刺激する成長因子、上皮成長因子(EGF)又はニューレグリン−1(NRG)/ヘレグリン(HRG)への反応とによって異なる。異なる患者由来のCRCチューモロイドの形態は大きく異なり、形態的プロファイルは、同一起源のチューモロイド間では一致し、チューモロイドは、これらが由来した元の腫瘍と、遺伝的にはほとんど同一である。そのため、培養したCRCオルガノイドの画像のハイコンテンツ定量解析は、異なる患者由来のCRCオルガノイドを区別することができ、また、シグナル伝達経路の活性化(例えば、HER受容体、例えばEGF及びHRGのリガンドによって誘導される)に伴う形態的変化の測定に用いることもできる。同様に、機能阻害抗体又は他の治療用分子によるこれらの反応の抑制を、測定することができる。画像に基づく解析により、細胞増殖とは無関係であり得る形態の変化を測定することができ、化合物の活性について、従来の増殖アッセイから得られる情報に対し、更なる情報をもたらす。そのため、化合物誘導性の表現型の変化は、CRCオルガノイドにおける抗体の機能的スクリーニングに対する基礎となる。
選別に用いる結腸チューモロイドモデルは、EGF、HRG又はWNT3Aに反応した形態的変化の実証に基づいて選定した。これらの因子への形態的な反応を、異なる患者起源の、20のチューモロイドのパネルにおいて検査した(Van de Wetering et al.2015 Cell 161:933〜45)。まず、チューモロイドを拡大させ、分割し、384ウェルプレートに再接種し、成長1週間後の基本的な形態を解析し、記録した。次に、拡大培地中にEGF若しくはHRGが存在する、又は、成長因子が存在しない条件で、同一の20のチューモロイドを、成長因子に対するこれらの反応性について試験した。これを行うため、全500の形態的特徴を解析し、可溶性因子によって誘導された変化を測定した。成長因子反応性の測定、並びに成長因子依存性のチューモロイド培養物と成長因子非依存性のチューモロイド培養物との区別を可能とする、一連の頑健な特徴を、各オルガノイドについて選定した(表4を参照)。これによって、単一の特徴だけでは、異なるCRCオルガノイドにおいて反応を至適に定量化するのに不十分であることが実証された。これらのデータに基づき、以下のチューモロイド株を選定した。すなわち、成長、及びチューモロイド内の分枝化した管腔構造の形成について重度にEGFRシグナル伝達依存性であるP18T(APCmut);EGFR及びHER3シグナル伝達及び抑制に対し、明確な形態的変化効果を示すP14T(APCmut、SMAD4mut);APC変異が欠如し、そのため、拡大についてWNT3Aに依存するチューモロイドモデルとしてのP19Tb(APCwt、ただし、PIK3CA、TP53、BRAF、ARID1A、ARID2、ERBB3、POLE及びRNF43変異体以外);最後に、拡大について成長因子の存在に依存性を呈さないモデルとしてのP26T(APCmut、KRASmut、TP53mut及びCTNNB1mut)。二重特異性抗体の最初のスクリーニングにおいて、P26Tは、いずれの成長因子依存性も、成長因子受容体標的抗体への感応性も示さず、更なる抗体スクリーニングからは除外した。
結腸チューモロイドの形態的特徴を変化させることが可能な機能性二重特異性抗体を同定するため、二重特異性抗体を、EGF刺激のない成長条件と比較し、また、EGF成長条件において、EGFR/MAPKシグナル伝達抑制化合物(例えばセツキシマブ及びトラメチニブ)の効果と比較した。機能性二重特異性抗体は、EGFR/MAPKシグナル伝達阻害剤及び/又はEGFを培地から除外することによって得られた形態的プロファイルの方向への、EGF条件におけるチューモロイドの拡大を制限する二重特異性抗体の能力によって特定した。EGFR標的アームの作用を増強したWNT標的Fabフラグメントは、同等の一価の(二重特異性EGFR×TT)標的Fabフラグメントに比べ、有意に増強した成長抑制能力を示したものであった。
EGFの存在下で、P14T及びP18T結腸チューモロイドの形態に、成長因子の不在下、若しくは参照EGFR/MAPK阻害剤の存在下における表現型に近い、一致する、又は表現型を超える変化を誘導した二重特異性抗体を、潜在的な候補として特定した。EGF条件と同様に、効果が、成長因子がない条件の陰性対照、及び/若しくは参照HER3/PI3K阻害剤の距離に近づく、一致する、又は、陰性対照の距離を超えた場合、HRG培養条件で試験した抗体を、フォローアップに指定した。成長因子処理に比較的非感応性であったP19Tbについては、機能的抗体選定は、トラメチニブ及びPI3K阻害剤CH5132799によって誘導された形態プロファイルを特徴とする陰性対照からの距離の算出に基づいた。
RTK/WNT二重特異性抗体の候補は、EGF及びHRGの両方の培養条件において、潜在的、理論的に関連のある活性を示しているため、二重特異性候補抗体の検証選別もまた、2つの成長因子条件、5ng/mLのEGF又は5ng/mLのHRGにおいて実施した。対照は、EGF又はHRGのいずれも含まない培地を入れたウェルを含んだ。成長因子条件で用いた他の対照は、セツキシマブ(EGFR)、PG3755(EGFR/EGFR)、トラメチニブ(MEK)、CH5132799(PI3K)、PG3178(HER3/HER3)、PG2863(HER3/HER3)、PG3794(HER3/EGFR)及びPB4522(HER3/EGFR)である。PG1337(TT/TT)は陰性対照抗体の役割をし、それぞれ化合物で処理したウェル、又は抗体で処理したウェルとして、同じ体積のDMSO又はPBSを加えたウェルと共に、陰性対照と呼んだ。
PB10651(EGFR/LGR5二重特異性抗体(FabフラグメントMF3755及びMF5816から構成される))を、5ng/mLのEGF条件において、以下の特徴から、第1のリード候補抗体として選定した。すなわち、PB10651は、10μg/mLの試験用量で、24の異なる結腸チューモロイドモデルの75%において、強力な抑制効果を示した。2)PB10651の10μg/mLで処理したウェルの67%(40/60)が、50%超の成長低下を示した。3)52%(59のうち31のウェル)が、PB10651の2μg/mLでの処理に対し、50%超の成長低下を示した。4)PB10651は、セツキシマブ(10μg/mLで47%(56/119)、2μg/mLで29%(35/119))及びEGFR/TT参照抗体PB9919(10μg/mLで27%(16/60)、2μg/mLで5%(3/60))よりも効果が優れていた。
細胞アッセイを用いた二重特異性抗体結合の親和性測定。
ヨウ素化手順を最適化した後、特定の放射能40GBq/μmolで標識されたPB10651タンパク質を入手した。放射化学的純度は、タンパク質沈殿による分析で99%超であった。Lindmoアッセイにおいて、免疫反応性のわずかな低下のみが観察された。EGFR及びLGR5に対する125I−PB10651の免疫反応性は、EGFR又はLRG5のいずれかを発現するCHO細胞を用い、89%超であると推定された。Lindmoアッセイの結果は、図12に示す。定常状態の親和性測定を用い、125I−PB10651のCHO−LGR5細胞に対するKDは、測定の結果0.86±0.13nMであり、CHO−EGFR細胞に対する125I−PB10651のKDは、0.22±0.086nMであることが分かった。125I−PB10651のDLD−1細胞に対するKDは、0.18±0.024nMと推定された。データの例を図13に示す。
PB10651に存在する両方のFabアームによってそれぞれ認識される、EGFR及びLGR5上のエピトープをマッピングするため、ショットガン突然変異誘発法を用いた。両方のFabアームの、それぞれの抗原への結合に関連した残基を、明確に特定することが可能であった。EGFR又はLGR5のいずれかへのPB10651の結合を阻害し、かつ対照抗体(関連の残基を識別する)の結合を抑制しなかった突然変異を、表8に示す。これらのデータは、通常はリガンドEGFに接触している部位と部分的に重複しているドメインIII(Ogiso et al.,2002)を、抗EGFR Fabアームが認識することを示している。これは、PB10651が、リガンドとEGFRとの相互作用を直接阻害し得ることを示している。このエピトープを、図14のEGFRの構造(pdb参照1YY9)中に示す。LGR5を認識するFabアームは、N−CAPドメインと第1のロイシンリッチリピート(LRR)とに配置される残基を認識することが示された。残基を、RSPO 1との複合体中のLGR5の構造(pdb参照4BSR、Peng et al.,2013)で、図15に示す。
Li S,Schmitz KR,et al.,(2005)Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab.Cancer Cell.Apr;7(4):301〜11.
Ogiso,H.Ishitani,R.et al.,(2002)Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains.Cell,Vol.110,775〜787.
Peng,W.C.de Lau W.et al.,(2013)Structure of Stem Cell Growth Factor R−spondin 1 in Complex with the Ectodomain of Its Receptor LGR5.Cell Rep 27;3(6):1885〜1892.
PB10651中に存在する抗LGR5 Fabアームが、リガンドR−スポンジン1の存在下でLGR5に結合する能力の測定を可能とするため、細胞アッセイを設定した。リガンド阻害抗LGR5抗体OMP88R20(PG7711)のLGR5発現細胞クローンへの結合についてのEC50は、測定の結果50ng/mL(333pM)であり、次いで、この濃度を用い、リガンドR−スポンジン1によるLGR5への結合を測定した。図16は、FACSにおいて、加えたR−スポンジン1の濃度の関数として測定した、LGR5発現CHO−K1細胞に結合するOMP88R20のMFIシグナル(R−スポンジン1不在下で得たMFIシグナルに対して規準化した)を示す。次いで、二重特異性抗(TT×LGR5)抗体を、LGR5発現CHO細胞クローンに結合する抗体の能力について、その都度濃度を増加させたR−スポンジン1の存在下で試験した。PG7711を、陽性対照として50ng/mLで含ませた。二重特異性抗体を、まず、LGR5を発現するCHO細胞クローンへの結合について濃度範囲で試験し、FACSにおいて結合のEC50を測定した。EC50は、リードFab MF5816を含むPB10286については156ng/mL、MF5790を含むPB10261については200ng/mLであることが、分かった。しかしながら、用いたアッセイにおける同一濃度の抗原特異的Fab又はPG7711を比較するため、また、場合によっては、アッセイの感度を上げるため、二重特異性抗体は、100ng/mLで試験した。図17は、リード抗LGR5 Fab MF5816は、大過剰モル(120倍)のリガンドの存在下であっても、結合LGR5によって抑制されず、一方、同一のアッセイにおいて、OMP88R20の複製品は完全に抑制されたことを示している。更に、PB10261(LGR5標的アームMF5790を含む)の結合の低下が確認され、このアッセイは、リガンド阻害抗LGR5 Fabとリガンド非阻害抗LGR5 Fabとを区別可能であることが実証された。1D9ラット抗LGR5抗体を阻害アッセイに用いた場合は、差及び競合が確認されず(図17)、相互作用の特異性が実証された。
de Lau W,Barker N,et al.,Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R−spondin signalling.Nature.2011 Jul 4;476(7360):293〜7.
PB10651の抗EGFR Fabアームが、EGFを介したシグナル伝達を阻害する能力を試験するため、細胞アッセイを用いた。図18は、A431細胞におけるEGFを介した細胞死を阻害するPG3755の力価(Gulliらによって記載された方法に従って試験した)を、セツキシマブの力価と比較して示している。抗体は、EGFを介したシグナル伝達を、少なくともセツキシマブの力価と同等の力価で阻害する。
Gulli,L.F.,et al.,Epidermal growth factor−induced apoptosis in A431 cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity.Cell Growth Differ,1996.7(2):p.173〜178.
PB10651を、その両方の標的であるEGFR及びLGR5のラット及びカニクイザルのオルソログとの交差反応性について試験した。カニクイザルcDNA由来のRT−PCRによって得られたカニクイザルLGR5のcDNA配列は、GenBank(参照XM_005571542)からの予測配列に一致した。ラット及びカニクイザルに加え、ヒトのコーディング構造体を、CHO−K1細胞の一過性トランスフェクションに用いた。次いで、ヒト、ラット、又はカニクイザルのオルソログのいずれかを一過性発現する細胞への抗体結合を、FACSで試験した。図19は、染色に用いた抗体濃度の関数として、染色後にFACSで得られた、平均蛍光強度(MFI)のグラフを示している。EGFRを認識するFabアーム、及びLGR5を認識するFabアームの両方が、標的のカニクイザルオルソログに対し、完全に交差反応性であることが分かり、結合のEC50値は、ヒト又はカニクイザルのオルソログへの結合について、有意な差はなかった。同様の実験において、両方のアームのラットオルソログとの交差反応性を評価した。PB10651は、LGR5のラットオルソログに良好に結合することが分かったが、EC50は、結合性ヒトLGR5について判明した値に比べ、約1log変化した。しかしながら、抗EGFR Fabアームは、EGFRのラットオルソログに対してはほとんど交差反応性はなく(EC50において2logの差)、この抗体は、ラットin vivoモデル又はラットにおける毒性試験には不適当となった。カニクイザルLGR5交差反応性の陽性対照として、hu8E11v2の複製品(PG7543)を用いた。セツキシマブを、カニクイザルEGFR交差反応性の対照として用いた。
FabフラグメントMF5816及びMF5814が、患者由来オルガノイドの表面に発現されたLGR5に結合することを実証するため、FabフラグメントMF5816又はMF5814を含むPG5816及びPG5814(二価のモノクローナルIgG)を用い、オルガノイドP18T由来の個々の細胞の染色に用いた。TTを標的とする陰性対照抗体を用いた染色に比べ、PG5816を用いた結果、P18Tチューモロイド由来細胞の53.6%が染色され、PG5814を用いた結果、P18Tチューモロイド由来細胞の52.5%が染色された。(図20)。
更に、二重特異性形態のLGR5標的Fabフラグメントが、P18Tチューモロイド細胞上のLGR5に実際に結合することを実証するため、抗TT Fabフラグメントと組み合わせたFabフラグメントMF5814又はMF5816を含む二重特異性抗体PB10284及びPB10286で細胞を染色した。染色後、FACSを用いて細胞を選別し、染色された細胞集団及び非染色の細胞集団を、LGR5 mRNAレベルについて、Q−PCRによって分析した。LGR5 FabアームMF5816又はMF5814を含む二重特異性抗体を用いてP18T由来チューモロイド細胞を染色した結果、選別したLGR5陽性細胞分画において、LGR5陰性細胞分画に比べ、6〜14倍強化されたLGR5 mRNA発現レベルが得られた(図21)。
3Dスクリーニングで特定されたリード二重特異性抗LGR5×EGFR抗体の治療効果を測定する独立した方法として、オルガノイドを異なる二重特異性抗体で処理し、オルガノイドの成長を、7日後に、標準的なコロニー形成アッセイにおいて評価した(図23)。図の右側に示した画像は、マクロの解析によって生成された画像の例であり、オルガノイド(黒丸)を含む1滴を示している。実験を3回別々に繰り返し、オルガノイドの数及び大きさを、実験間で平均した。これらのデータは、抗体検証選別を用いて得られたデータを裏付け、リード二重特異性LGR5×EGFR抗体が、患者由来オルガノイドの成長の強力な阻害剤であることを示している。
チューモロイドを、リード二重特異性LGR5/EGFRで7日間処理した後、定量的リアルタイムPCR解析を用い、LGR5及びCK20(分化のマーカー)の発現に対する抗体の効果を評価した(図24)。結果は、EGFR×TT(MF3755×MF1337;PB9919)抗体が、TT×TTに比べ、LGR5 mRNAレベルにおいて0.5倍の増加をもたらし、一方、CK20のレベルは4倍低下させることを示している。LGR5抗体MF5814×TT(MF5814×MF1337;PB10284)及びMF5816−TT(MF5816×MF1337;PB10286)は効果をほとんど示さない。しかしながら、TTアームをEGFRアームで置換する場合、MF5814×EGFR(MF5814×MF3755;LGR5×EGFR;PB10647)抗体及びMF5816−EGFR(MF5816×MF3755;LGR5×EGFR;PB10651)抗体による処理後、LGR5レベルは、それぞれ5.9倍及び7.2倍低下する。CK20発現もまた、PB10647(EGFR/LGR5、MF5814×MF3755)抗体及びPB10651(EGFR/LGR5、MF5816×MF3755)抗体の両方により、10.4倍及び13.7倍低下した。これらのデータは、このチューモロイド株において、LGR5標的アームの追加によって、EGFRの抑制によってもたらされるLGR5 mRNAレベルの相対的な増加を抑制することができ、一方、EGFR抑制の元の効果も増強する(CK20 mRNAの低下)ことを示唆している。
PB10651が選択的に結腸癌由来チューモロイドを標的とし、正常な結腸組織由来オルガノイドは標的としないことを実証するため、オルガノイド培養物を、アフコシル化PB10651又はセツキシマブと共にインキュベートした。図26は、表示した抗体のそれぞれの用量における、オルガノイド(チューモロイド)の大きさを示している。C51Nは、正常な結腸組織由来のオルガノイドである。C1Mは、癌組織由来のオルガノイド(チューモロイド)である(図26B)。図26Aは、正常組織(C55N)由来のオルガノイド及び同一の患者由来の癌組織(C55T)に対する結果を示している。図26Cは、5つの正常組織オルガノイド、3つの原発性結腸癌チューモロイド、及び3つの転移性結腸癌チューモロイドにおける、セツキシマブ及びPB10651についてのIC50の表である。セツキシマブのIC50:PB10651のIC50の比を、図26Cの最後の列に示す。これは、PB10651が、チューモロイドにおいて、セツキシマブよりも20〜200倍強力であり、一方、PB10651の正常オルガノイドにおける効果は、セツキシマブよりも弱いことを示している。更なる試験により、培地中のWNT又はR−スポンジンの存在は、セツキシマブ又はPB10651がチューモロイドの成長を抑制する効果に対して影響を及ぼさないことが実証された(図示せず)。
PB10651の二重特異性の態様が、腫瘍抑制能力をもたらすために必要であることを確認するため、PB10651を、Genentech、Bionomics又はOncoMedによって生産されている他のWNT標的抗体(表7)と比較した。図27において、チューモロイドモデルP18T及びC1Mにおける、LGR5標的抗体(PG7709、PG7711、PG7712及びPG7543)のオルガノイドの成長に対する作用を、PB10651及びセツキシマブを介してもたらされる作用と比較する。これらの結果は、比較抗体のいずれも、結腸チューモロイドの成長を抑制しないことを示している。
二重特異性抗体PB10651は、EGFR標的アーム(MF3755)及びLGR5標的アーム(MF5816)から構成されている。両方のFabアーム間の実際の物理的相互作用が、結腸チューモロイドに対して強力な抑制効果をもたらすために必要であることを示すため、これらを、PB10651(MF3755×MF5816;EGFR×LGR5)、セツキシマブ、PG3755(MF3755×MF3755;EGFR×EGFR)、PG5816(MF5816×MF5816;LGR5×LGR5)、PG1337(MF1337×MF1337;TT×TT)及びPG3755とPG5816との1:1混合物の用量を増加させながらインキュベートした。図28Aは、抗LGR5抗体と抗EGFR抗体との混合物による処理の結果、チューモロイドの成長抑制が、二重特異性抗体PB10651による処理に比べ、より低いことを示している。興味深いことに、正常オルガノイドの成長は、抗EGFR抗体と抗LGR5抗体との混合物により、二重特異性抗体によるよりも、より強力に抑制された。これらの効果を、図28Bの他のチューモロイド及び正常オルガノイドについて、IC50の表にまとめる。
BME2 RGFハイドロゲルに接種されていた間に、抗体がチューモロイドに達することをしめすため、7日齢のP18Tチューモロイドを、表示した抗体(2μg/mL)で24時間処理した後、固定し(4%パラホルムアルデヒド、15分間)、透過処理した(0.1%トリトン−×100及び0.5%のBSAを含むPBS)。続いて、オルガノイドを、ヤギ抗ヒトFITC(Thermo Scientific、1:3000)で対比染色した。細胞核及びアクチンは、記載(Di et al PlosOne 2014,PMID 25289886)のように染色した。図29は、全ての抗体が、ゲルに浸透し、チューモロイド中の全ての細胞に結合できることを示している。EGFR標的抗体セツキシマブ及びPG3755は細胞膜に局在し、一方、PB10651は、細胞内に小斑点が点在した染色パターンを示す。このパターンは、比較LGR5抗体(PG7709、PG7711又はPG7712)のいずれにも確認されない。
更なる結腸チューモロイドモデル及びオルガノイドモデルを、PB10651の対比染色及び撮像アッセイに含めた(上記参照)。図30は、PB10651の細胞内の染色パターンが、P18T、C0M、C55T(PB10651に高感応性、IC50<1μg/mL)において、C31Mの一部のチューモロイド(PB10651に中程度に感応性)において確認されるが、PB10651非感応性(IC50>10μg/mL)のC28T、P8T若しくはP19Tbチューモロイド、又はC51N正常結腸オルガノイドでは確認されないことを示している。PB10651における核近傍の細胞内小斑点は、抗体のインキュベーション時間(24時間又は7日間)とは無関係に、低抗体濃度(PB10651 50ng/mL)及びAlexa−488結合形態において、一貫して認められる。
プラスミドの作製
トランスフェクション用のプラスミドを、プラスミドMV1453及びMV1626から作製した(図31を参照)。これらのプラスミドを、SfiI及びBstEII制限酵素(MV1453)並びにSfiI及びXhoI制限酵素(MV1626)で消化した後、VHs MF3755(消化したSfiI及びBstEII)及びMF5816(消化したSfiI及びXhoI)を結合し、構造体MG3755C453及びMG5816C626を形成した。MV1622はFlagタグされたRMD酵素をコードする(図32)。
タンパク質の作製は、2mM L−グルタミン(Gibco、カタログ番号25030−024)を添加したFreeStyle 293発現培地(Gibco、カタログ番号12338−018)で培養した、抗体のテール部分へのフコース残基の結合が抑制されたFreestyle 293−F懸濁細胞(Invitrogen、カタログ番号R79007)の一過性トランスフェクションによって実施した[Henning von Horsten et.al.,Glycobiology,vol.20,no.12,pp.1607〜1618,2010]。トランスフェクションの1日前に、細胞を密度5.0×105細胞/mLで接種し、37℃、8% CO2において、軌道振とう速度155rpmで、終夜インキュベートした。トランスフェクション用に、プラスミドDNA及びポリエチレンイミン(PEI、分子量25,000ダルトン、Polysciences Inc.、カタログ番号23966)の混合物を含む培地を調製した。25mLのトランスフェクション体積に対し、内毒素を含まないプラスミドDNA 25μgを、PEI 62.5μg及び培地2.5mLと混合した。次いで、混合物をボルテックスで撹拌し、室温で20分間インキュベートし、細胞に加えた。細胞を37℃、8% CO2において、軌道振とう速度155rpmで、6日間インキュベートした。細胞懸濁液を採取し、1000gで10分間遠心分離し、上清を採取し、4000gで10分間遠心分離した。
抗体の精製は、抗体をMabSelectSure LX(GE Healthcare)に、室温で数時間、バッチ式で結合させることによって実施した。次いで、結合した抗体を含むMabSelectSure LXセファロースを、重力流動カラムに移した。カラムをPBSで洗浄し、100mMクエン酸緩衝液pH3.0を用いて抗体を溶出させ、1MトリスpH8.0を用い、pHを7.0に中和した。Vivaspin20(Sartorius)10kDaスピンフィルタを用いて試料を濃縮し、PBS緩衝液であらかじめ平衡化したSuperdex200 26/600カラム(GE Healthcare)を用い、ゲル濾過により更に精製した。
陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX−HPLC)を用い、抗体試料の電荷不均一性を検討し、また、生成物関連の不純物(ホモ二量体及び半量体)の存在及び量を測定した。実験は、周囲温度において、SP STAT 7μmカラム(Tosoh Biosciences)及びUV−vis検出器を備えたDionex HPLCシステムで実施した。試料10μgを測定ごとに注入した。25mMリン酸緩衝液pH6.0のNaCl濃度を0から1Mに増加させるグラジエントを適用し、抗体を分離した。データは、Chromeleonソフトウェアを用いて解析した。
アフコシル化抗体PB10651(MV1622)の活性を、V158(高親和性)FcγRIIIa受容体変異体又はF158(低親和性)FcγRIIIa受容体変異体(Promega)のいずれかを含むADCCリポーター細胞において試験した。抗体の一連のタイトレーション、すなわち、アフコシル化PB10651(PB10651−MV1622)、非アフコシル化PB10651及び非標的IgG1(PG1337)を、高親和性及び低親和性FcγRIII変異体を保有するADCCリポーター細胞[Cartron et.al.,Blood,vol.99,no.3,pp.754〜758,2002;Musolino et.al.,Journal of Clinical Oncology,vol.26,no.11,pp.1789〜1796]と組み合わせ、A431細胞、A549細胞及びBxPC3細胞に加えた。ADCC活性は、ルシフェラーゼ活性の測定によって検出した。
Freestyle 293−F細胞を、MG3755C453、MG5816C626及びMV1622でトランスフェクションし、IgG PB10651p10を得た。精製後、PB10651(MV1622)の収量は、OD280の測定によって測定した結果、1Lの作製体積当たり29mgであった。CEX−HPLC分析を、精製したタンパク質について実施した(図33)。二重特異性PB10651(MV1622)分子に相当する主ピークが、保持時間15分に、いくつかの酸性帯電変異体と共に認められた。MF3755×MF3755 DEDEホモ二量体に相当する小さいピーク(5%未満)が、約11分に見える。
動物モデルの選定
アフコシル化PB10651(MV1622)の治療効果を、結腸直腸患者由来の腫瘍を有する免疫不全マウス(患者由来異種移植(PDX)モデルとして知られる)において評価した。PDXモデルCR2519、CR2161、CR2501、CR0150及びCR0193(Crown Bioscienceデータベース、http://hubase2.crownbio.com)を、RNA配列決定(RNAseq)によって解析したLGR5遺伝子及びEGFR遺伝子の両方の発現に基づいて選定した。モデルは、異なる状態のKRAS遺伝子を呈した。すなわち、CR2519及びCR2161はKRASの野生型であり、一方、CR2501、CR0150はKRAS G12V変異体、CR0193はKRAS G13D変異体であった。CR0231及びCR2501はセツキシマブ感応性であり、一方、CR0150はセツキシマブに低反応性であった。
PDXモデルが、表示したLGR5及びEGFRのmRNA発現レベルを、効力試験で用いた動物において保持していたことを確認するため、生きた腫瘍における発現を、PDXストック腫瘍の発現と比較した。ストック腫瘍(凍結物)及び生きた腫瘍(試験動物)からRNAを抽出し、TRIzol(Ambiom 15596−018)及びTissue Lyser II(Qiagen 85300)と共に均質化した。次いで、RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen 74106)及びRNase−Free DNase Set(Qiagen 76254)によって精製した。RNAの品質を、NanoDropTM分光光度計によって確認した。cDNAを逆転写(ABI 4374966)によって調製した。LGR5及びEGFRの発現を、リアルタイムRT−PCR反応によって、それぞれTaqManプローブHs00969422_m1及びHs01076090_m1を用いて測定し、TaqManプローブHs02758991_g1を用いたグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)の発現に対して規準化した。目的の遺伝子とGAPDHとのCt値の差を算出し、この差を2乗に変換することにより、データを解析した。図35は、効力試験に用いた全ての6つのPDXモデルが、元の凍結PDX腫瘍ストックと同等のEGFR及びLGR5両方の発現を呈したことを示している。これらの6モデルにおけるLGR5発現は、137の結腸直腸癌PDXモデルの利用可能な集合からの、最も低いLGR5発現を呈したPDXモデル(CR01560)におけるよりも、1000倍超高かった。選定した6モデルにおけるEGFRのmRNAの発現は、CRC PDXの集合全体において最も高いEGFR発現を呈したCR1197よりも低かった。
5つの結腸直腸癌PDX腫瘍モデル(CR2519、CR2161、CR2501、CR0150及びCR0193)のうちの1つに由来するPDX腫瘍フラグメント(直径2〜3mm)を、BALB/cヌードマウスの右側腹部に皮下接種した。腫瘍を、100〜200mm3の体積まで成長させた。次いで、マウスを、1週間に4回のPBS(200μL)又はアフコシル化PB10651(1匹当たりPBS中0.5mg)の腹腔内(i.p.)投与で処置した。腫瘍を2週間に1回キャリパーで測定し、腫瘍体積(TV)を、式TV=0.5×a×b2[式中、a及びbはそれぞれ、腫瘍の長径及び短径である]を用いて算出した。アフコシル化PB10651は、強力な腫瘍抑制活性をCR2519及びCR0193 PDXモデルにおいて呈し、この活性は、セツキシマブの活性と同様であった(図36)。アフコシル化PB10651は、限定的ではあるが、有意な抗腫瘍活性をCR2501 PDXモデルにおいて呈し、一方、セツキシマブは腫瘍成長を有意には低下させなかった。PDXモデルCR2161及びCR0150は、セツキシマブ又はアフコシル化PB10651には強く反応せず、アフコシル化PB10651に対して抗腫瘍活性の傾向を示すのみであった(図36)。
材料及び方法
P18チューモロイドの免疫組織化学的検査
抗体の添加から48時間後に培地を取り出し、BME滴を48ウェルプレートにおいてホルマリン300μL中、室温で2時間固定した。次いで、ピペットを用い、BME滴を手作業で砕き、ペレット化し、ペレットを崩壊させずに、新鮮なホルマリンに入れた。ペレットを室温で終夜放置した後、PBS中で3回洗浄した。次いで、ペレットをPBS中に穏やかに再懸濁し、IRB(Institute for Research in Biomedicine)組織学的検査施設による、パラフィン包埋切片作製のための処理用に、マイクロカセットに入れた。
全てのマウスの実験は、バルセロナサイエンスパーク動物管理及び使用委員会(Animal Care and Use Committee of Barcelona Science Park)(CEEA−PCB)及びカタロニア政府により、プロトコル第DAAM7329号の下で承認された。チューモロイドを7日間成長させた後、注射用の単一細胞懸濁液に脱凝集した。培養条件及び単一細胞を作製する方法は、「選定した5つの抗LGR5 cLC抗体を用いてオルガノイドP18Tから得られた細胞のFACS染色」の項に記載されている。全てのマウス試験に、6〜8週齢の雌NOD.CB17/AlhnRj−Prkdcscid/Rjマウス(Janvier Labs)を用いた。異種移植は、200,000のP18T細胞又は1,000,000のC31M細胞を含むBME:PBS(50:50)溶液100μLを皮下注射することにより開始した。腫瘍体積が300mm3に達した時点でマウスを屠殺し、腫瘍を採取した。1つの腫瘍を、約0.5mm×0.5mm×0.5mm(幅×長さ×高さ)の小断片に手作業で切り刻んだ。次いで、1側腹部当たり1断片を用い、レシピエントNOD−SCIDマウスの4つの側腹部に断片を定置させた。トロッカー(trocker)を用い、断片をマウスに埋め込んだ。トロッカーは、腫瘍断片を皮膚の下に押し込む装置である。合計30匹のマウスを移植に用いた。マウスの腫瘍体積が平均50mm3に達した時点で、マウスを無作為に処置群に割り付けた。1週間に1回、4週間、マウスにPBS(pH7.4 Gibco Ref 10010−015)200μL、セツキシマブ(臨床バッチ、5mg/mL)、又はアフコシル化PB10651(2.5mg/mL)を注射した。セツキシマブ及びアフコシル化PB10651は、マウスの体重に関わらず、マウス1匹当たり0.5mgの用量で注射した。腫瘍体積は、手作業のキャリパーを用い、1週間に3回取得した測定値により、式:(長さ×幅×高さ)/2を用いて算出した。腫瘍体積が300mm3を超えた、腫瘍が潰瘍化した、又は試験のエンドポイントである最初の抗体の注射から28日間に達したいずれかの時点で、マウスを屠殺した。大きさの制限/潰瘍形成のために、マウスにおいて単一の腫瘍のみを採取する必要があった場合には、腫瘍の一部を切除し、更なる試験のために、残りをその箇所に留置した。追加の切除又は複数の腫瘍を採取する必要があった場合、マウスを選別し、全ての試料を同時に採取した。データは、0日(処置の第1日目)に対して表し、対応のあるサンプルのt検定の解析は、各処置群間で、GraphPad Prismを用いて実施した。
Ki67染色は、細胞増殖の指標であり、抗体処理によってもたらされる成長に対する作用が増殖の低下によるものであるか否かの判定に用いた。チューモロイドを、固定前にin vitroで48時間(2μg/mL)処理した。チューモロイドのアフコシル化PB10651による処理は、他の処置群に比べ、陽性細胞の数及び染色の強度について低下をもたらした(図37)。セツキシマブ抗体及びEGFR−TT抗体は、TT−TT対照処理に比べ、わずかな、中程度の陽性細胞の数の低下をもたらした。切断カスパーゼ3染色もまた実施し、抗体がアポトーシスを促進したか否かを評価した。低レベルのアポトーシスが、TT対照、EGFR−TT及びセツキシマブ処置群で確認され、同等の染色が3群間で見られた。陽性細胞の数が、アフコシル化PB10651処置群で増加した。これらの結果は、アフコシル化PB10651二重特異性抗体は、セツキシマブ及び他の単一抗EGFRアームよりも、増殖の低下及びアポトーシスの誘導に優れていることを示唆している。
PB10651の可能性のある毒性を評価するため、カニクイザルにおける非GLP反復投与毒性試験を実施した。PB10651に存在するEGFR Fabアームを考慮すると、皮膚及び胃腸(GI)管毒性が予想され得る。抗EGFR抗体であるセツキシマブ(アービタックス(Erbitux))の場合、サルにおいて、1週間用量75mg/kgで重篤な皮膚毒性による死亡が確認され、24mg/kg/週が、サルの慢性毒性試験における最大耐用量であった。パニツムマブ(ベクティビックス(Vectibix))の場合、サルにおいて、4週間試験中のわずか3週間後に、用量30mg/kg/週で死亡が認められ、13週IV毒性試験における、より低い用量(7.5及び15mg/kg/週)で、時折死亡が認められた。この情報に基づき、用量レベル25mg/kgを、本試験におけるPB10651の最高用量として選定した。1群当たり1匹の雄及び1匹の雌のカニクイザルを用い、4群を、対照(媒体のみ)、2.5mg/kg/週、7.5mg/kg/週及び25mg/kg/週とし、週1回の投与を4回、各群に与えた。抗体は、静脈内注入により、1時間にわたってカニクイザルに投与した。
カニクイザルにおけるセツキシマブ及びパニツムマブによる毒性試験は、皮膚毒性(紅斑、乾燥/剥離皮膚/脱毛)及び胃腸(GI)管作用(軟便/下痢、脱水)を、用量制限毒性として示し(EMA−EPAR 2004 cetuximab、EMA−EPAR 2007 panitumumab)、試験品目の抗EGFR活性と一致した。しかしながら、PB10651については、本試験で投与した最高用量においても、反復試験後、皮膚毒性もGI管毒性も共に確認されなかった。毛が細くなる、紫斑、軟便の発生等の臨床徴候が有効成分群及び対照群で同様に確認されたため、これらの臨床徴候は、薬物関連ではないと考えられた。PB10651の投与に関連すると考えられる臓器重量の変化及び/又は臓器重量比の変化はなかった。更に、PB10651の投与に関連すると考えられる肉眼的所見又は顕微鏡的所見はなかった。結論として、PB10651のカニクイザルへの1週間に1回、4週間の静脈内(注入)投与は、PB10651の投与に関連すると考えられる、臓器重量の変化又は臓器重量比の変化、肉眼的所見又は顕微鏡的所見をもたらさなかった。
態様1.ヒトEGFRの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、アミノ酸残基のうち、I462、G465、K489、I491、N493、及びC499が抗体のエピトープへの結合に関与する、抗体。
態様2.I462A、G465A、K489A、I491A、N493A、及びC499Aから選択されるアミノ酸残基置換のうちの1つ以上が、抗体のヒトEGFRへの結合を低下させる、態様1に記載の抗体。
態様3.ヒトEGFRの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、エピトープが、図40に示した配列番号2のアミノ酸残基420〜480内に配置され、抗体のEGFRへの結合が、以下のアミノ酸残基置換I462A、G465A、K489A、I491A、N493A、及びC499Aのうちの1つ以上によって低下される、抗体。
態様4.抗体のヒトEGFRへの結合が、EGFの受容体への結合を阻害する、態様1〜3のいずれか1つに記載の抗体。
態様5.エピトープが立体構造エピトープである、態様1〜4のいずれか1つに記載の抗体。
態様6.エピトープが、図40に示した配列番号2のアミノ酸残基420〜480内に、好ましくは、図40に示した配列番号2の430〜480内に、好ましくは、図40に示した配列番号2の438〜469内に配置される、態様1〜5のいずれか1つに記載の抗体。
態様7.抗体が更なる可変ドメインを含み、この更なる可変ドメインが更なるタンパク質に結合可能である、態様1〜6のいずれか1つに記載の抗体。
態様8.更なるタンパク質が、細胞外部分を含む膜タンパク質である、態様7に記載の抗体。
態様9.更なるタンパク質がWNT経路の膜結合メンバーである、態様7又は態様8に記載の抗体。
態様10.抗体が、ヒトEGFRに結合する可変ドメインと、更なるタンパク質に結合する可変ドメインと、を含む二重特異性抗体である、態様1〜9のいずれか1つに記載の抗体。
態様11.上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、少なくとも、図1に示したMF3755のVHのCDR3配列を含む、又は、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、最大3個、好ましくは最大2個、好ましくは1個以下のアミノ酸が、図1に示したMF3755のVHのCDR3配列と異なる重鎖CDR3配列を含む、態様1〜10のいずれか1つに記載の抗体。
態様12.上記の可変ドメインが、少なくとも、図1に示したMF3755のVHのCDR1、CDR2及びCDR3配列、又は、最大3個、好ましくは最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を有する、図1に示したMF3755のVHのCDR1、CDR2及びCDR3を含む、重鎖可変領域を含む、態様10又は態様11に記載の抗体。
態様13.EGFRに結合する可変ドメインが、図1に示したMF3755のVH鎖の配列、又は、図1に示したMF3755のVH鎖のアミノ酸配列において、MF3755のVH鎖に関し、最大15個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個、好ましくは1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、態様11又は態様12に記載の抗体。
態様14.更なるタンパク質がLGR4、LGR5、LGR6、RNF43又はZNRF3である、態様7〜13のいずれか1つに記載の抗体。
態様15.更なるタンパク質がLGR5である、態様14に記載の抗体。
態様16.EGFRの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインと、更なるタンパク質に結合可能な可変ドメインと、を含む二重特異性抗体であって、EGFRエピトープが、図40に示した配列番号2のアミノ酸残基420〜480内に配置され、これらのアミノ酸残基のうち、I462、G465、K489、I491、N493、及びC499が抗体のエピトープへの結合に関与する、二重特異性抗体。
態様17.可変ドメインのEGFRへの結合が、以下のアミノ酸残基置換I462A、G465A、K489A、I491A、N493A、及びC499Aのうちの1つ以上によって低下される、態様16に記載の二重特異性抗体。
態様18.更なるタンパク質が、細胞外部分を含む膜タンパク質である、態様16又は態様17に記載の二重特異性抗体。
態様19.更なるタンパク質がWNT経路の膜結合メンバー、好ましくはLGR5である、態様16〜18のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
Claims (28)
- 上皮成長因子(EGF)受容体ファミリー又はcMETの膜結合型メンバーの細胞外部分、及び、WNTシグナル伝達経路の膜結合型メンバーの細胞外部分に結合するタンパク質。
- 前記タンパク質が抗体、好ましくは二重特異性抗体である、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記WNT経路が古典的(canonical)WNT経路である、請求項1又は2に記載のタンパク質又は抗体。
- 前記EGF受容体ファミリーのメンバーが上皮成長因子受容体(EGFR若しくはErbb−1)又はErbb−3である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質又は抗体。
- 前記WNTシグナル伝達経路の膜結合型メンバーが、LRP5、LRP6、LGR4、LGR5、LGR6、FRZ1、FRZ2、FRZ3、FRZ4、FRZ5、FRZ6、FRZ7、FRZ8、FRZ9、FRZ10、ZNRF3、RNF43、N−カドヘリン、Kremen1及びKremen2、ROR2、又はRYKを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質又は抗体。
- 前記WNTシグナル伝達経路の膜結合型メンバーが、WNTシグナル伝達に関与するLGRファミリーのメンバー、好ましくはLGR4、若しくはLGR5、又はZNRF3、若しくはRNF43を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質又は抗体。
- 前記タンパク質が、二重特異性抗体、又はその機能性部分、誘導体及び/若しくは類似体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質又は抗体。
- 上皮成長因子(EGF)受容体ファミリー又はcMETの膜結合型メンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインと、WNTシグナル伝達経路の膜結合型メンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインとを含む、二重特異性抗体、又はその機能性部分、誘導体及び/若しくは類似体。
- EGFR及びLGR4、EGFR及びLGR5、EGFR及びZNRF3、EGFR及びRNF43、HER3及びLGR4、HER3及びLGR5、HER3及びZNRF3、又はHER3及びRNF43に結合する可変ドメインを含む、請求項8に記載の二重特異性抗体、又はその機能性部分、誘導体及び/若しくは類似体。
- EGFRに結合する可変ドメインと、LGR5に結合する可変ドメインと、を含み、
EGFRに結合する前記可変ドメインのVH鎖が、図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列、又は、図1に示したVH鎖MF3755のアミノ酸配列において、前記VHに関し、最大15個、好ましくは10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下、1個以下、好ましくは5個以下、4個以下、3個以下、2個以下若しくは1個以下のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
LGR5に結合する前記可変ドメインのVH鎖が、図1に示したVH鎖MF5816のアミノ酸配列、又は、図1に示したVH鎖MF5816のアミノ酸配列において、前記VHに関し、最大15個、好ましくは10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下、1個以下、好ましくは5個以下、4個以下、3個以下、2個以下若しくは1個以下のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、請求項8又は9に記載の二重特異性抗体、又はこの機能性部分、誘導体及び/若しくは類似体。 - 癌を有する個体の治療で用いるための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項8〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記癌が腺癌である、請求項11に規定の使用のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項8〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、黒色腫、精巣癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、又はカルチノイド癌である、請求項11又は12に規定の使用のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項8〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記癌が結腸直腸癌である、請求項11〜13のいずれか一項に規定の使用のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項8〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 癌を有する個体の治療のための方法であって、前記方法が、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項8〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、又は前記抗体の機能性部分、誘導体及び/若しくは類似体を、これらを必要とする前記個体に投与することを含む、方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項8〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、上皮成長因子(EGF)受容体ファミリーの膜結合型メンバーを発現し、かつ前記WNT経路の膜結合型メンバーを発現する細胞と、を含む、細胞系。
- 上皮成長因子(EGF)受容体ファミリーの膜結合型メンバーを発現し、かつ前記WNT経路の膜結合型メンバーを発現する細胞の増殖を、前記細胞の増殖を許容する系において抑制するための方法であって、前記方法が、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項8〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を前記系に提供することを含む、方法。
- LGR5の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、前記エピトープが、図39に示した配列番号1のアミノ酸残基21〜118内に位置し、前記アミノ酸残基のうち、D43、G44、M46、F67、G90、及びF91が、前記抗体の前記エピトープへの結合に関与する、抗体。
- D43A、G44A、M46A、F67A、G90A、及びF91Aのアミノ酸残基置換のうちの1つ以上が、前記抗体のLGR5への前記結合を低下させる、請求項18に記載の抗体。
- LGR5の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、前記エピトープが、図39に示した配列番号1のアミノ酸残基21〜118内に位置し、前記抗体のLGR5への前記結合が、以下のアミノ酸残基置換D43A、G44A、M46A、F67A、G90A、及びF91Aのうちの1つ以上によって低下される、抗体。
- LGR5発現細胞上のLGR5との前記抗体の相互作用が、Rスポンジン(RSPO)のLGR5への結合を20%を超えて抑制しない、請求項18〜20のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体のLGR5への結合の抑制が、前記抗体及び前記RSPOが、モル比0.1以下、好ましくはモル比0.1〜0.001(両端の値を含む)、好ましくは0.1〜0.01(両端の値を含む)で存在する場合に測定される、請求項21に記載の抗体。
- 図39に示した配列番号1のアミノ酸残基21〜118内に位置するLGR5上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、LGR5発現細胞上のLGR5との前記抗体の相互作用が、RSPOのLGR5への結合を、前記抗体及び前記RSPOがモル比0.1以下、好ましくはモル比0.1〜0.001(両端の値を含む)、好ましくは0.1〜0.01(両端の値を含む)で存在する場合、20%を超えて抑制しない、抗体。
- 前記エピトープが立体構造エピトープである、請求項18〜23のいずれか一項に記載の抗体。
- 二重特異性抗体であり、更に、上皮成長因子(EGF)受容体ファミリー又はcMETの膜結合型メンバーに結合することができる可変ドメインを含む、請求項18〜24のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒトEGFRの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、アミノ酸残基のうち、I462、G465、K489、I491、N493、及びC499が前記抗体の前記エピトープへの結合に関与する、抗体。
- I462A、G465A、K489A、I491A、N493A、及びC499Aから選択されるアミノ酸残基置換のうちの1つ以上が、前記抗体のヒトEGFRへの前記結合を低下させる、請求項26に記載の抗体。
- ヒトEGFRの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、前記エピトープが、図40に示した配列番号2のアミノ酸残基420〜480内に位置し、前記抗体のEGFRへの前記結合が、以下のアミノ酸残基置換I462A、G465A、K489A、I491A、N493A、及びC499Aのうちの1つ以上によって低下される、抗体。
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