CN113307882B - 靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1及其偶联纳米药物 - Google Patents

靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1及其偶联纳米药物 Download PDF

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Abstract

靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1及其偶联纳米药物，属于生物医药学领域，本发明提供了能够有效抑制全部4种Rspo亚型的高效融合蛋白SZ1，并在细胞、类器官、实验动物等水平全面表征SZ1抑制Rspo所介导的促进结直肠癌发生发展的关键细胞信号通路以及相应肿瘤的生长。同时，结合纳米载药技术和肿瘤细胞靶向技术，制备了不同材料的融合蛋白SZ1的偶联纳米药物，并确认了融合蛋白SZ1的偶联纳米药物可以更有效地抑制全部4种Rspo亚型的活性，更进一步增加了融合蛋白SZ1的稳定性，增强了融合蛋白SZ1的偶联纳米药物对肿瘤的靶向性，能够更有效地在体内抑制并杀伤肿瘤组织起到更好的治疗效果。

Description

靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1及其 偶联纳米药物
技术领域
本发明属于生物医药学领域，具体涉及靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1及其偶联纳米药物。
背景技术
靶向治疗作为新兴的抗肿瘤疗法在近年来受到广泛的关注。这种治疗方法不同于传统的手术、放化疗，其能够精准、有效地针对具有特异性靶点的肿瘤组织进行杀伤，而对正常组织的伤害较小。靶向治疗的理论和概念来源于人们对恶性肿瘤病因研究的不断深入。恶性肿瘤作为危害人类的重大疾病，虽然都是从基因突变产生的不受控制的细胞过度增殖中产生，然而不同器官的肿瘤、同一类器官的不同分型的肿瘤，乃至同一患者的肿瘤中的各个局部在成因上都有着很大的差异。目前，临床上特异性针对HER2、EGFR、CDK4/6等靶点的小分子和蛋白类药物在肺癌、乳腺癌等临床治疗中广泛应用，其他诸如针对Akt、Wnt等原癌基因的靶向药物也存在于多种肿瘤的临床试验。
R-spondin(Rspo)家族蛋白属于细胞成型素(morphogen)，共有Rspo1-4四种亚型。Rspo以分泌蛋白的形式与细胞膜上其特异性受体结合从而关键性调控胚胎发育、器官稳态维持、细胞增殖与分化等重要的生理过程，同时其失调会造成多种人类重大疾病。作为近十年来发育生物学、肿瘤生物学等领域的研究热点，Rspo发挥作用的分子机制逐渐被科学家所揭示。经研究表明，Rspo可以抑制细胞内关键泛素连接酶RNF43/ZNRF3，从而提高Wnt蛋白受体Frizzled的水平，进而极大地增强由Wnt介导的转录共因子β-catenin的累积效应，最终显著地促进细胞干性维持和细胞增殖。
在2012年，美国肿瘤研究的权威机构TCGA(The Cancer Genome Atlas)与知名生物医药公司Genentech公司通过研究大量病例并发表于Nature杂志的关于结直肠癌病因测序分析的文章中指出，由Rspo super fusion(即Rspo基因超融合而产生的过表达)所引起的结直肠癌约占全部结直肠癌病例的10％。在后续的研究中，多个国际顶尖实验室也通过了实验分别证实了Rspo的过表达能够直接引起结直肠癌的发生和发展。英国生物医药Mereo BioPharma于2015年注册了针对Rspo3的单克隆抗体OMP-131R10(rosmantuzumab)，并已与2020年完成了临床治疗结直肠癌的1a/b期试验。在2016年，美国Genentech公司中deSauvage团队于Nature杂志发表论文研发并证明了该针对Rspo3的单克隆抗体在治疗由Rspo3过表达所引起的结直肠癌具有良好的效果。从此可见，作为一种十分新颖且极具重要生理意义的细胞成型素，Rspo在肿瘤中的基础医学研究结束后立即受到临床方面的密切关注，靶向Rspo的药物作为新型的肿瘤治疗手段正在进行多种临床试验。截至目前，从通过发表的论文和公开的专利来看，不论在实验室阶段还是在临床试验阶段，能够靶向针对Rspo的药物仅有OMP-131R10这一款，而且该药物作为单克隆抗体只能够有效针对Rspo家族中其中之一的Rspo3。因此，该药物对于由其他Rspo所引起的结直肠癌不具有有效性。
纳米载药技术是纳米科学、生物学和现代医学的交叉学科，是一门近年来兴起的新型技术。纳米粒(nanoparticle，NP)是指大小在10-1000nm之间的固态胶体颗粒，一般由天然高分子物质或合成高分子物质构成，具有多种物理学与生物学活性，可作为传导或输送药物的载体。由于纳米载体具有保护药物、缓释、控释和靶向给药等优点，在现代医学中纳米载药在治疗肿瘤等疾病方面具有巨大的潜力和优势。
发明内容
基于以上的国际研究现状，我们希望能够设计并研发出一款由我国自主支配知识产权的，能够全面有效针对全部4种Rspo亚型的靶向蛋白类药物。同时，我们希望进一步借助纳米载药等方向的优势，将我们所设计的融合蛋白进行改良，从而进一步提高药效和创新性。我们希望通过“靶向蛋白”和“靶向细胞”的双靶向手段最终研发出一款在创意、设计和实用性上均能够比肩甚至超过目前国际水平的靶向结直肠癌的抗肿瘤药物。
本发明提供的产品为融合蛋白SZ1及以标记RGD短肽的纳米粒子为载体的SZ1，具体包括：SZ1与RGD短肽修饰的金纳米棒(SZ1-cRGD-AuNRs)、SZ1与RGD短肽修饰的二氧化硅包被的金纳米棒(SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs)、SZ1与RGD短肽修饰的小鼠/人血清蛋白纳米颗粒(SZ1-cRGD-SA-NPs)(图1)。融合蛋白SZ1的设计是由结构生物学分析Rspo及与Rspo紧密相互作用的蛋白而来(图2)。经过本项目多次自我改良所产生的融合蛋白SZ1，提高了之前几代融合蛋白与Rspo1-4的亲和力，并且提高了融合蛋白的稳定性。融合蛋白SZ1能够在37℃下于PBS缓冲溶液或具有血清的DMEM等培养基下稳定存在120小时，并且在细胞系水平和类器官水平显著降低Rspo1-4所介导的β-catenin累积，同时破坏类器官维持干性的能力，从而充分证明了融合蛋白SZ1能够在体外水平有效地抑制Rspo活性。在Rspo过表达导致的结直肠癌的小鼠模型中，静脉注射融合蛋白SZ1能够显著抑制由Rspo过表达所引起的结直肠癌，并未引起肠道正常的增殖与稳态维持或其他器官的病理性变化，具有较低毒性。SZ1-cRGD-AuNRs、SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs、SZ1-cRGD-SA-NPs在体外细胞、类器官水平与小鼠中也同样经过实验证明其对Rspo活性的有效抑制，并且在单位体积内SZ1-cRGD-AuNRs、SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs、SZ1-cRGD-SA-NPs具有相对于融合蛋白SZ1更高的稳定性与抑制作用。
本发明提供了靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1，所述的融合蛋白SZ1是由人类FZD5分泌信号肽、V5标签肽、人类LGR4部分胞外域、连接区域、人类ZNRF3部分胞外域以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所依次排列组成，是一种能够分泌到细胞外的融合蛋白，该融合蛋白经过收集纯化后可在体内外有效地抑制全部四种Rspo亚型。在Rspo过度激活导致的结直肠癌小鼠模型中，融合蛋白SZ1也能够抑制体内的Rspo，从而抑制肿瘤生长，起到治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的效果。在Rspo过度激活导致的结直肠癌小鼠模型中，通过尾静脉注射给药，每次给药20-50mg·Kg-1，每周给药2-3次。
所述的靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：利用基因合成的方式获得人类FZD5分泌信号肽所对应的DNA序列、V5标签肽所对应的DNA序列、人类LGR4部分胞外域所对应的DNA序列、人类ZNRF3部分胞外域对应的DNA序列、连接二者间的连接域氨基酸所对应的DNA序列以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所分别对应的DNA序列，通过PCR技术扩增上述DNA序列，然后利用overlapping PCR技术将通过PCR技术扩增的6段DNA序列按人类FZD5信号肽-V5标签-人类LGR4部分胞外域-连接区域-人类ZNRF3部分胞外域-小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所分别对应的cDNA序列顺序整合成一段完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列；
步骤二：将得到的完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列插入自构建的慢病毒表达载体EF1α启动子下游，从而得到包含完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列的SZ1质粒；
步骤三：将得到的包含完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列的SZ1质粒使用细胞转染试剂，或通过慢病毒载体psPAX2包装、侵染使得所用的哺乳动物细胞系对完整的表达融合蛋白SZ1的质粒进行蛋白表达；在细胞转染或慢病毒侵染后收集被转染或侵染的哺乳动物细胞的培养基；收集的培养基内含有由完整的表达融合蛋白SZ1的质粒所表达的分泌蛋白，即为融合蛋白SZ1；
步骤四：将包含融合蛋白SZ1的培养基收集完毕后加入anti-V5-agarose树脂球，进行富集；在富集结束后，将包含融合蛋白SZ1的培养基与anti-V5-agarose树脂球的混合物离心；随后移除混合物内清液，对富集了融合蛋白SZ1的anti-V5-agarose树脂球进行洗涤；
步骤五：洗脱、纯化；
①洗脱融合蛋白SZ1：使用V5标签多肽(多肽序列：GKPIPNPLLGLDST)从anti-V5-agarose树脂球上将融合蛋白SZ1竞争洗脱下来；②通过FPLC纯化：洗脱后的上清液离心，对上清液中的蛋白进行浓缩；再以PBS缓冲溶液为流动相，以Sephadex G-100作为分子排阻色谱中填充相，对融合蛋白SZ1进行分离，以紫外吸收为读出手段，收集得到纯化的SZ1。在得到纯化的SZ1以后，将SZ1冻干成粉末，于-70～-80℃环境中长期稳定保存。
上述靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的制备方法，其中：
所述步骤三中，使用的细胞转染试剂是Neofect、Lipofectamine 2000或FugeneHD；在细胞转染或慢病毒侵染后24小时开始收集被转染或侵染的哺乳动物细胞的培养基，共收集72小时。
所述步骤四中，将包含融合蛋白SZ1的培养基收集完毕后加入anti-V5-agarose树脂球，在4℃下摇动富集12-18小时；在富集结束后，以2000-3000rpm将包含融合蛋白SZ1的培养基与anti-V5-agarose树脂球的混合物在4℃下离心10-20分钟；使用PBS缓冲溶液对富集了融合蛋白SZ1的anti-V5-agarose树脂球进行洗涤，每次洗涤加入PBS缓冲溶液后再4℃下摇动10-15分钟，随后以2000-3000rpm在4℃下离心10-15分钟，然后移除离心后上层清液，整个操作流程重复三次。
所述步骤五中，②洗脱后的上清液在4℃下以2000-3000rpm离心20-30分钟。
本发明还提供了靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的偶联纳米药物，该药物通过将融合蛋白SZ1及RGD短肽偶联到不同性质的纳米材料上制备而成。本发明提供了三种融合蛋白SZ1的偶联纳米药物，分别为：SZ1与RGD短肽修饰的金纳米棒SZ1-cRGD-AuNRs、SZ1与RGD短肽修饰的二氧化硅包被的金纳米棒SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs、SZ1与RGD短肽修饰的小鼠/人血清蛋白纳米颗粒SZ1-cRGD-SA-NPs，在Rspo过度激活导致的结直肠癌小鼠模型中，通过尾静脉注射给药，每次给药15-45mg·Kg-1，每周给药2-3次，给药四周后取材进行解剖检测。
所述靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的偶联纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备金纳米棒；
①种子溶液制备：将0.1-10mmol·L-1的氯金酸溶液与等体积的0.01-0.2mol·L-1的CTABr混合均匀后，加入硼氢化钠溶液，控制硼氢化钠在混合溶液中的浓度为0.001-0.01mol·L-1，室温下搅拌2-3小时。
②生长溶液制备：向反应容器中依次加入CTABr、HAuCl4溶液、AgNO3溶液和抗坏血酸溶液，搅拌2-5分钟。
③金纳米棒(Au NRs)制备：在②生长溶液中加入0.01-0.20mL①种子溶液，搅拌2-5分钟后，室温静置即可得到充分生长的Au NRs。制备出的金纳米棒分别在755nm和515nm有着显著的属于纳米金的吸收带，分别对应于透射电子显微镜图片中金纳米棒的长轴(40-60nm)和短轴(3-5nm)。
④金纳米棒的纯化：离心除去上清液后，加入乙醇分散后，再次离心除去上清液，再将获得的沉淀分散于水中，离心除去上清液，即可获得纯化的金纳米棒。
步骤二：偶联融合蛋白SZ1与RGD短肽；
①向制备纯化的1-20mg·mL-1的Au NRs溶液中加入1-50μmol cRGD肽段反应4-8小时，离心除去上清液后溶于水中，重复2次离心纯化步骤即可获得纯化的cRGD修饰的AuNRs，即cRGD-Au NRs。
②偶联SZ1：配制1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液，随后取该混合溶液，加入步骤①制备的1-20mg·mL-1cRGD-Au NRs，室温孵育反应15-30分钟，随后加入纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应2-3小时，12000-16000rpm离心除去上清液后再溶于水，反复离心2次即可获得纯化的融合蛋白SZ1偶联的cRGD修饰的金纳米棒SZ1-cRGD-AuNRs。
或：
步骤一：制备二氧化硅包被的金纳米棒；
将制备纯化的Au NRs分散于去离子水中，加入质量分数25％的氨水，后缓慢滴加10mmol·L-1的正硅酸乙酯/乙醇溶液，40℃下反应12-24小时。离心除去上清液后加入乙醇分散后再次离心除去上清液，再将获得的沉淀分散于水中，离心除去上清液即可获得纯化的二氧化硅包被的金纳米棒SiO2@Au NRs。制备出的SiO2@Au NRs在720nm和515nm有着显著的属于纳米金的吸收带，与Au NRs相比，吸收带出现显著的蓝移。
步骤二：偶联SZ1与RGD短肽；
①向制备纯化的浓度为1-20mg·mL-1的SiO2@Au NRs溶液中加入1-50μmol的cRGD肽段，反应4-8小时，离心除去上清液后溶于水，重复2次离心纯化步骤，即可获得纯化的cRGD修饰的SiO2@Au NRs，即cRGD-SiO2@Au NRs。
②偶联SZ1：配制EDC和NHS的混合溶液，加入步骤①制备的1-20mg·mL-1的cRGD-SiO2@Au NRs，室温孵育反应15-30分钟，随后加入纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应2-3小时，12000-16000rpm离心除去上清液后再溶于水，再反复离心2次，即可获得纯化的融合蛋白SZ1偶联的cRGD修饰的二氧化硅包被的金纳米棒SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs。
或：
步骤一：制备小鼠/人血清蛋白纳米粒子；
小鼠/人血清蛋白(MSA/HSA)粉末超声溶解于去离子水中，之后将无水乙醇加入到小鼠/人血清蛋白溶液中，之后加入体积浓度为50％的戊二醛溶液，室温下持续搅拌2-12小时后在12000-16000rpm转速下离心10-15分钟后，将获得的白色沉淀再次溶于去离子水中，反复通过离心机离心2次，即可获得纯化后的小鼠/人血清蛋白纳米粒子SA-NPs。制备的SA-NPs在不同激发波长下的荧光发射峰在420-590nm范围内随着激发波长的增大发生显著红移。动态光散射结果表明：与单独的SA分子相比，制备的SA-NPs的水合粒径范围在80-200nm之间，呈现了粒径的显著增大。Zeta电位测量结果表明，制备的SA-NPs表面具有更强烈的负电荷(-46.5mV)，能在溶液中保持长时间稳定存在。傅立叶红外光谱测定结果表明：与血清蛋白相比，制备的血清蛋白纳米粒子表面的氨基官能团明显减少，同时表面的羟基官能团显著增加，与zeta电位测定结果一致。因此，本方法成果地制备了一种全新的荧光发射波长可调的蛋白纳米粒子。
步骤二：偶联SZ1与RGD短肽；
①将制备纯化的浓度为1-20mg·mL-1的SA-NPs溶液加入到含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中，其中EDC浓度为1-50μmol、NHS浓度为1-50μmol，孵化反应20-30分钟后，加入1-50μmol的cRGD肽段继续反应8-10小时后，12000-16000rpm离心除去上清液后溶于水，再反复离心2次即可获得纯化的cRGD修饰的血清蛋白纳米粒子cRGD-SA-NPs。
②偶联SZ1：配制EDC和NHS的混合溶液，随后向该混合溶液，加入步骤①制备的1-20mg·mL-1的cRGD-SA-NPs，室温孵育反应15-30分钟，随后加入纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应2-3小时，12000-16000rpm离心除去上清液后再溶于水，再反复离心2次即可获得纯化的融合蛋白SZ1偶联的cRGD修饰的血清蛋白纳米粒子SZ1-cRGD-SA-NPs。
本发明的有益效果：
本发明通过结构生物学与生物化学等手段设计并研发了能够有效抑制全部4种Rspo亚型的高效融合蛋白SZ1，并在细胞、类器官、实验动物等水平全面表征SZ1抑制Rspo所介导的促进结直肠癌发生发展的关键细胞信号通路以及相应肿瘤的生长。同时，本发明结合纳米载药技术和肿瘤细胞靶向技术，通过新型纳米载药技术与RGD短肽将SZ1偶联在一起，制备了不同材料的融合蛋白SZ1的偶联纳米药物，经过同样的一系列表征，确认了融合蛋白SZ1的偶联纳米药物可以更有效地抑制全部4种Rspo亚型的活性，同时更进一步增加了融合蛋白SZ1的稳定性，增强了融合蛋白SZ1的偶联纳米药物对肿瘤的靶向性，能够更有效地在体内抑制并杀伤肿瘤组织起到更好的治疗效果。
2020年全球结直肠癌新发病约193万人，Rspo过表达所引起的结直肠癌约占全部结直肠癌病例的10％，传统手段如手术、放化疗等对于结直肠癌的治疗存在极大的局限性，而符合新时代“精准医疗”的大方向和治疗需求的靶向治疗手段在当前对结直肠癌的治疗当中仍处于高度空白阶段。本发明所制备的融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1的偶联纳米药物目前在实验室阶段可以有效地抑制Rspo发挥功能，若该款融合蛋白可以成功地用于临床不仅可以弥补结直肠癌的治疗领域靶向治疗手段的空白，同时也能够增强我国在高精尖医疗领域的科技力量，造福国民健康，推动国民经济的发展。
附图说明
图1本发明的主要功能和基本思路：融合蛋白SZ1与融合蛋白SZ1的偶联纳米药物特异性拮抗致病因子Rspo从而治疗结直肠癌。
图2A.Rspo蛋白结构生物学模型分析；B.融合蛋白SZ1的构建与历代改进策略；C.融合蛋白SZ1的简单分子工作原理示意图；D.融合蛋白SZ1的偶联纳米药物的简要示意图。
图3在细胞水平上融合蛋白SZ1抑制Rspo所介导的Wnt/β-catenin信号。
图4融合蛋白SZ1在小肠类器官中能够抑制由Rspo引起的小肠干细胞干性维持和增殖。
图5在Rspo过度激活的结直肠癌小鼠病理模型中融合蛋白SZ1能够有效降低肿瘤负担。
图6A.制备的金纳米棒的吸收光谱；B.制备的金纳米棒的透射电子显微镜照片；C.制备的SiO2@Au NRs的吸收光谱。
图7制备的HSA和HSA-NPs溶液的动态光散射谱图。
图8制备的SZ1-cRGD-SA-NPs滞留于细胞膜外用于捕获培养基中的Rspo蛋白。
图9制备的SZ1-cRGD-SA-NPs在小肠类器官中能够抑制由Rspo引起的小肠干细胞干性维持和增殖。
图10在Rspo过度激活的结直肠癌小鼠病理模型中，使用制备的SZ1-cRGD-SA-NPs能够有效降低肿瘤负担。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明中的方案进行进一步说明，实施例不作为对本发明的限定。如果无特殊说明，实施例中的实验操作均采用分子生物学领域成熟的现有技术，所用的原料和试剂等均可通过市购获得。
实施例1
靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的制备方法，具体包括：
本实施例中，所述用于靶向治疗Rspo过度激活的结直肠癌的融合蛋白SZ1的表达载体为质粒表达载体，所述质粒表达载体整合有人类FZD5分泌信号肽所对应的DNA序列、V5标签肽所对应的DNA序列、人类LGR4部分胞外域所对应的DNA序列、人类ZNRF3部分胞外域对应的DNA序列、连接二者间的连接域氨基酸所对应的DNA序列以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所对应的DNA序列；所述人类FZD5分泌信号肽所对应的DNA序列为1号氨基酸到26号氨基酸区域、V5标签肽所对应的DNA序列为IPNPLLGLD氨基酸、人类LGR4部分胞外域对应的DNA序列为25号氨基酸到527号氨基酸区域、人类ZNRF3部分胞外域DNA序列为120号氨基酸到284号氨基酸区域、连接二者间的连接域氨基酸所对应的DNA序列为GSGSGSGSGSGS氨基酸、小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所分别对应的DNA序列为229-461号氨基酸与17-246号氨基酸区域；所述人类FZD5分泌信号肽所对应的DNA序列、V5标签肽所对应的DNA序列、人类LGR4部分胞外域DNA序列、人类ZNRF3部分胞外域对应的DNA序列、连接二者间的连接域氨基酸所对应的DNA序列和小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所对应的DNA序列受表达载体上游启动子调控；所述编码融合蛋白SZ1的质粒可用于瞬时转染、慢病毒侵染于哺乳动物细胞系进行表达，并于细胞培养基中收集。
首先通过设计引物PCR得到了上述所说的人类FZD5分泌信号肽、V5标签肽、人类LGR4部分胞外域、人类ZNRF3部分胞外域DNA片段以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域，随后通过Overlapping PCR将以上片段连接到一起形成了融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列，然后将所述完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列插入自构建的慢病毒表达载体EF1α启动子下游，从而得到包含完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列的SZ1质粒，同时构建了慢病毒载体psPAX2包装的SZ1质粒，可以侵染使得所用的哺乳动物细胞系对完整的表达融合蛋白SZ1的质粒进行蛋白表达。
本实施例中所用到的引物的组序号和DNA序列如表1所示。所用引物的DNA序列和酶切位点，从左至右为5’-3’。
表1引物的组序号和DNA序列
Figure BDA0003061708650000081
Figure BDA0003061708650000091
步骤一：首先通过检索NCBI GenBank查找cDNA序列，利用基因合成的方式获得PCR人类FZD5分泌信号肽、V5标签肽、人类LGR4部分胞外域、人类ZNRF3部分胞外域以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域的cDNA序列所需的引物，并将这些cDNA序列通过PCR技术大量扩增出来，然后利用overlapping PCR技术将上述的通过PCR技术扩增后的cDNA序列按顺序整合成一段完整的cDNA序列。
步骤二：利用酶切-连接(酶切采用EcoRI和XbaI/SpeI限制性内切酶)的方式将该段融合蛋白SZ1的cDNA序列插入到自构建的质粒上面，位于EF1α启动子下游，从而得到包含融合蛋白SZ1 cDNA序列的SZ1质粒。将包含融合蛋白SZ1 cDNA序列的SZ1质粒利用CaCl2热介导方式转入到大肠杆菌DH5α质粒表达菌株当中，由于SZ质粒中携带有氨苄青霉素抗性基因，因此转化后的DH5α质粒表达菌株培养在LB+Amp培养基上面，通过Sanger测序的方式确定融合蛋白SZ1的DNA序列没有突变。从而获得正确的、携带有融合蛋白SZ1 cDNA序列的SZ1质粒。
步骤三：为了验证SZ1质粒是否能够在细胞内表达并分泌，我们使用HEK293T细胞系进行验证。步骤如下：
(1)使用DMEM(10％FBS+1％PSG)培养基培养HEK293T细胞，待培养皿中细胞生长至50％-70％时，使用转染试剂Neofect进行转染(24孔板每个孔转染500ng的SZ1质粒)。
(2)转染24小时后更换新鲜培养基，48小时后收集细胞培养基，同时裂解细胞收集细胞裂解液，将收集到的细胞培养基和细胞裂解液分别与SDS page loading buffer按照2:1的比例混合，95℃孵育5分钟随后进行Westernblot检验。
为了验证慢病毒载体psPAX2包装的SZ1质粒是否能够进行慢病毒包装制备稳定细胞系，首先按照以上步骤验证psPAX2包装的SZ1质粒能否正常表达，随后按照以下步骤制备能够稳定分泌SZ1的HEK293T细胞系：
(1)使用DMEM(10％FBS+1％PSG)培养基培养HEK293T细胞，待培养皿中细胞生长至50％-70％时，使用转染试剂Neofect将包装慢病毒所需的质粒元件连同SZ1质粒进行转染。
(2)转染24小时后更换新鲜培养基，48小时后收集一次细胞培养基，72小时后再收集一次细胞培养基，慢病毒包含在收集的细胞培养基中，将包含慢病毒的细胞培养基使用0.22μm滤膜过滤去除细胞残渣。
(3)使用DMEM(10％FBS+1％PSG)培养基培养HEK293T细胞，待培养皿中细胞生长至50％-70％时，将培养基更换为上述滤过的包含慢病毒的培养基，同时加入终浓度为10μg·mL-1的polybrene。
(4)48小时后使用1μg·mL-1的puromycin进行筛选，能够分泌SZ1的稳定细胞系带有puromycin的抗性基因，故在使用puromycin进行筛选时能够存活下来。
(5)puromycin筛选48小时后能够活下来的细胞就是能够分泌SZ1的稳定细胞系，随后传代细胞，并裂解部分细胞，同时收集细胞培养基，使用Westernblot验证稳定细胞系构建成功。
步骤四：在制得能够稳定分泌融合蛋白SZ1的稳定细胞系后，使用该细胞系收集培养基并纯化融合蛋白SZ1，具体步骤如下：
将所述包含融合蛋白SZ1的培养基收集后加入anti-V5-agarose树脂球，在4℃下旋转摇动，富集12小时；在富集结束后，以2000rpm将包含融合蛋白SZ1的培养基与anti-V5-agarose树脂球的混合物在4℃下离心10分钟；随后使用移液器移除离心后所述混合物内清液，并随后使用PBS缓冲溶液对富集了融合蛋白SZ1的anti-V5-agarose树脂球进行洗涤；每次洗涤加入PBS缓冲溶液后再4℃下摇动10分钟，随后以2000rpm在4℃下离心10分钟，进而使用移液器移除离心后上层清液，整个操作流程重复三次。
步骤五：在使用V5标签肽段洗脱后，将样品流经FPLC，以PBS缓冲溶液为流动相，以Sephadex G-100作为分子排阻色谱中填充相进行分离纯化，即可得到纯化后的融合蛋白SZ1，利用冷冻干燥技术，即可得到粉末状的融合蛋白SZ1。
试验实施例1
通过上述实施例1，制得了纯化的融合蛋白SZ1，进一步验证其是否能够发挥抑制Rspo的功能，利用HEK293T B/R细胞系进行验证，具体步骤如下：
(1)使用DMEM(10％FBS+1％PSG)培养基培养HEK293T B/R细胞，待培养皿中细胞生长至50％-70％时，更换培养基，加入含有500ng·mL-1的Rspo1/3DMEM(10％FBS+1％PSG)培养基，同时加入融合蛋白SZ1使其终浓度达到1mg·mL-1。
(2)24小时后裂解细胞，使用化学发光的手段来检测Wnt信号通路的激活情况。同时使用Digitonin裂解液处理细胞，分离出细胞质内的β-catenin，通过Westernblot来检验Wnt信号通路的激活情况。
在细胞层面验证了融合蛋白SZ1能够抑制Rspo后，使用小鼠小肠类器官来进一步验证融合蛋白SZ1的作用，首先建立小鼠小肠类器官模型，具体步骤如下：
(1)解剖小鼠，取小鼠小肠部位3-4厘米，用剪刀将小肠剖开铺平，用预冷PBS将其冲洗干净，去除食物残渣；
(2)随后将小肠剪成5毫米左右的小段，放入预冷2mM的EDTA溶液当中，EDTA溶液用PBS溶液配制，冰置30分钟；
(3)冰置后用PBS冲洗，洗去EDTA，随后用枪头反复吹打小肠组织，此时可见溶液明显变浑浊，弃浑浊液，留小肠组织，该步骤除去的为小肠上皮绒毛；
(4)然后加入PBS再次反复吹打，此次吹打下来的为小肠隐窝，即为所需部分；
(5)将溶液过70μm的滤膜，即可得到小肠隐窝干细胞；
(6)取滤液，900g离心5分钟，去上清，加PBS洗两遍，即得到最终小肠隐窝干细胞；
(7)将干细胞用PBS吹匀，用Matrigel包被，Matrigel与PBS体积比为2:1-1:1均可，混匀后将其接种到24孔板或者48孔板；
(8)接种后将其放入37℃培养箱5分钟，待Matrigel凝固后加入类器官培养基培养；
在小鼠肠道类器官的培养过程中，Rspo是维持类器官干性以及活性必须的生长因子，因此我们借此来验证融合蛋白SZ1的功能，具体步骤如下：
(1)待类器官传代后对照组加入正常的类器官培养基，实验组加入终浓度为1mg·mL-1的融合蛋白SZ1；
(2)每天观察并记录不同组别间类器官的的形态以及其生长、存活状况，据此来推断融合蛋白SZ1是否能在类器官层面发挥作用。
在体外细胞系以及类器官层面验证了融合蛋白SZ1的功能之后，验证融合蛋白SZ1是否也能够在体内发挥作用，首先构建了Rspo过度激活的结直肠癌小鼠模型，具体步骤如下：
(1)取4周龄同种性别的C57BL/6小鼠，通过尾静脉注射100μL滴度大于等于1x1012VG·mL-1的Rspo腺相关病毒(购自于和元生物科技有限公司)，同时注射PBS溶液作为对照；
(2)在Rspo腺相关病毒注射后第7周进行小鼠肠道的取材，石蜡包埋切片后通过HE染色观察小鼠肠道形态的变化以及小鼠肠道是否出现肿瘤；
(3)对小鼠肠道取材后进行Ki67以及β-catenin的免疫组化染色，Ki67为细胞增殖的标志物，β-catenin标志着Wnt信号通路激活的情况，由此判断Rspo腺相关病毒是否在体内发挥了作用。
在成功构建了Rspo过度激活的结直肠癌小鼠模型后，使用纯化的融合蛋白SZ1进行体内功能的表征，具体步骤如下：
(1)取4周龄同种性别的C57BL/6小鼠，通过尾静脉注射100μL滴度大于等于1x1012VG·mL-1的Rspo腺相关病毒，3周后通过尾静脉注射纯化后的融合蛋白SZ1同时注射PBS溶液作为对照；
(2)每周尾静脉注射两次融合蛋白SZ1，每次注射30mg·kg-1，注射之前进行小鼠体重的记录，在使用融合蛋白SZ1治疗4周后进行小鼠肠道组织的取材。同上述步骤，进行HE染色以及Ki67、β-catenin的免疫组化染色，观察融合蛋白SZ1的治疗效果。
在动物模型体内验证了融合蛋白SZ1也能发挥作用后，通过最新的纳米载药技术来进一步增加融合蛋白SZ1的稳定性，同时偶联RGD短肽靶向肿瘤细胞，增强融合蛋白SZ1的偶联纳米药物的靶向性。因此，采用实施例1中制得的融合蛋白SZ1制备了其偶联纳米药物，分别为：SZ1与RGD短肽修饰的金纳米棒SZ1-cRGD-AuNRs、SZ1与RGD短肽修饰的二氧化硅包被的金纳米棒SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs、SZ1与RGD短肽修饰的小鼠/人血清蛋白纳米颗粒SZ1-cRGD-SA-NPs。
实施例2
SZ1与RGD短肽修饰的金纳米棒SZ1-cRGD-AuNRs的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备金纳米棒；
①种子溶液制备：将一定体积的氯金酸溶液(5mmol·L-1)与等体积的CTABr(0.1mol·L-1)混合均匀后，加入用4℃纯净水配置的硼氢化钠溶液(0.5mL，0.005mol·L-1)，室温下保持搅拌2小时。②生长溶液制备：向反应容器中依次加入5mL 0.2mol·L- 1CTABr，5mL 1mmol·L-1HAuCl4溶液，0.5mL5mmol·L-1AgNO3溶液，0.07mL 0.1mol·L-1抗坏血酸溶液，搅拌3分钟。③金纳米棒(Au NRs)制备：在②生长溶液中加入0.1mL①种子溶液，搅拌2分钟后，室温静置即可得到充分生长的Au NRs。如图5所示，制备出的金纳米棒分别在755nm和515nm有着显著的属于纳米金的吸收带，分别对应于透射电子显微镜图片中金纳米棒的长轴(40-60nm)和短轴(3-5nm)。制得的金纳米棒的吸收光谱及透射电子显微镜照片如图6A、6B所示。④金纳米棒的纯化：离心除去上清液后，加入乙醇分散后，再次离心除去上清液，再将获得的沉淀分散于水中，离心除去上清液，即可获得纯化的金纳米棒。
步骤二：偶联SZ1与RGD短肽：①向5mL制备纯化的Au NRs溶液(10mg·mL-1)中加入5mLcRGD肽段(50μmol)的溶液继续反应8小时，离心除去上清液后再溶于水，再重复2次离心纯化步骤即可获得纯化的cRGD修饰的Au NRs(cRGD-Au NRs)。②偶联SZ1：配制EDC(2mM)和NHS(5mM)的混合溶液，随后取1mL该混合溶液，加入步骤①制备的cRGD-Au NRs(10mg·mL-1)，室温孵育反应15分钟，随后加入20mg纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应2小时，12000rpm离心除去上清液后再溶于水，再反复离心2次即可获得纯化的SZ1偶联的cRGD修饰的金纳米棒(SZ1-cRGD-AuNRs)。
实施例3
SZ1与RGD短肽修饰的二氧化硅包被的金纳米棒SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备二氧化硅包被的金纳米棒：将50mg纯化制备Au NRs重新分散于25mL去离子水中，加入50μL氨水(质量分数25％)后缓慢滴加1mL浓度为10mmol·L-1的正硅酸乙酯/乙醇溶液，40℃下反应24小时。离心除去上清液后加入乙醇分散后再次离心除去上清液，再将获得的沉淀分散于水中，离心除去上清液即可获得纯化的二氧化硅包被的金纳米棒(SiO2@Au NRs)。制备出的SiO2@Au NRs在720nm和515nm有着显著的属于纳米金的吸收带，与Au NRs相比，吸收带出现显著的蓝移。制备的SiO2@Au NRs的吸收光谱如图6C所示。
步骤二：偶联SZ1与RGD短肽：①向5mL制备纯化的SiO2@Au NRs溶液(10mg·mL-1)中加入5mLcRGD肽段(25μmol)继续反应8小时，离心除去上清液后再溶于水，再重复2次离心纯化步骤即可获得纯化的cRGD修饰的SiO2@Au NRs(cRGD-SiO2@Au NRs)。②偶联SZ1：配制EDC(2mM)和NHS(5mM)的混合溶液，随后取1mL该混合溶液，加入步骤①制备的cRGD-SiO2@AuNRs(10mg·mL-1)，室温孵育反应15分钟，随后加入20mg纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应2小时，12000rpm离心除去上清液后再溶于水，再反复离心2次即可获得纯化的SZ1偶联的cRGD修饰的二氧化硅包被的金纳米棒(SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs)。
实施例4
SZ1与RGD短肽修饰的小鼠/人血清蛋白纳米颗粒SZ1-cRGD-SA-NPs的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备小鼠/人血清蛋白纳米粒子：100mg的小鼠/人血清蛋白(MSA/HSA)粉末超声溶解于3mL去离子水中，之后将5mL无水乙醇加入到小鼠/人血清蛋白溶液中，之后加入50μL体积浓度为50％的戊二醛溶液，室温下保持持续搅拌6小时后在12000rpm转速下离心10分钟后，将获得的白色沉淀再次溶于去离子水中，反复通过离心机离心2次，即可获得纯化后的小鼠/人血清蛋白纳米粒子(SA-NPs)。制备的SA-NPs在不同激发波长下的荧光发射峰在420-590nm范围内随着激发波长的增大发生显著红移动，动态光散射结果表明：与单独的SA分子相比，制备的SA-NPs的水合粒径范围在80-200nm之间，呈现了粒径的显著增大。Zeta电位测量结果表明，制备的SA-NPs表面具有更强烈的负电荷(-46.5mV)，能在溶液中保持长时间稳定存在。傅立叶红外光谱测定结果表明：与血清蛋白相比，制备的血清蛋白纳米粒子表面的氨基官能团明显减少，同时表面的羟基官能团显著增加，与zeta电位测定结果一致。因此，本方法成果地制备了一种全新的荧光发射波长可调的蛋白纳米粒子。制备的HSA和HSA-NPs溶液的动态光散射谱图如图7所示。
步骤二：偶联SZ1与RGD短肽：①5mL制备纯化的SA-NPs溶液10mg·mL-1中加入5mL含有EDC25μmol和NHS25μmol的溶液中，孵化反应20分钟后，加入cRGD肽段25μmol继续反应8小时后，12000rpm离心除去上清液后再溶于水，再反复离心2次即可获得纯化的cRGD修饰的血清蛋白纳米粒子(cRGD-SA-NPs)。②偶联SZ1：配制EDC(2mM)和NHS(5mM)的混合溶液，随后取1mL该混合溶液，加入步骤①制备的cRGD-SA-NPs 10mg·mL-1，室温孵育反应15分钟，随后加入20mg纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应2小时，12000rpm离心除去上清液后再溶于水，再反复离心2次即可获得纯化的SZ1偶联的cRGD修饰的血清蛋白纳米粒子(SZ1-cRGD-SA-NPs)。制备的SZ1-cRGD-SA-NPs滞留于细胞膜外用于捕获培养基中的Rspo蛋白如图8所示。
通过上述实施例2-4，制备得到了三种融合蛋白SZ1的偶联纳米药物，分别是SZ1-cRGD-AuNRs、SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs以及SZ1-cRGD-SA-NPs。
通过使用同表征融合蛋白SZ1功能一样的方法(试验实施例1)分别从细胞水平、类器官水平以及Rspo过度激活的结直肠癌小鼠模型水平对上述三种融合蛋白SZ1的偶联纳米药物(即SZ1-cRGD-AuNRs、SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs以及SZ1-cRGD-SA-NPs)进行了功能的表征，融合蛋白SZ1的偶联纳米药物也可以有效地抑制Rspo的活性及其所导致的结直肠癌。
本发明方法制备得到的融合蛋白SZ1及其偶联纳米药物的验证结果：
(1)体外细胞水平效果
使用HEK293T B/R细胞系，通过化学发光的手段来检测Wnt信号通路激活的情况来检测融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1偶联的三种纳米粒子对四种亚型的Rspo蛋白的抑制效果。从图3A结果可以看出Rspo蛋白可以激活Wnt信号通路，在使用了融合蛋白SZ1后可以有效的抑制Rspo发挥功能；随后使用Westernblot检验胞质内β-catenin的积累情况，结果如图3B所示，随着融合蛋白SZ1的梯度增加，胞质内β-catenin逐渐减少；同样的使用融合蛋白SZ1偶联的三种纳米药物我们也得到了同样的结果。实验结果表明，融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1偶联的三种纳米药物可在体外细胞系层面有效的抑制Rspo发挥作用。
(2)体外类器官水平效果
成功构建了小鼠小肠类器官模型，小鼠小肠类器官细胞干性以及活性的维持需要Rspo蛋白。使用小鼠小肠类器官来验证融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1偶联的三种纳米药物在类器官层面对Rspo的作用。实验结果如图4和图9所示，在类器官培养基中加入融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1的偶联纳米药物后可导致类器官的逐渐死亡，说明在类器官层面融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1的偶联纳米药物也可有效的抑制Rspo活性。
(3)体内Rspo过度激活导致的结直肠癌小鼠模型水平效果
为进一步研究融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1的偶联纳米药物能否在体内发挥作用从而起到治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的效果，使用Rspo过度激活的结直肠癌小鼠模型，向小鼠体内通过尾静脉注射融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1的偶联纳米药物，连续给药4周后，取小鼠肠道切片，通过HE染色观察小鼠肠道形态以及免疫组化检测细胞增殖的标志物Ki67以及β-catenin.如图5和图10所示，从实验结果可以看出，在使用融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1的偶联纳米药物治疗后，小鼠肠道形态恢复正常，肠道增殖现象减少，表明融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1的偶联纳米药物同样能够在体内发挥作用。
通过取材对照组以及实验组小鼠的肝脏及肾脏，通过HE染色观察发现对照组以及实验组小鼠的肝脏及肾脏形态无差别，说明融合蛋白SZ1以及融合蛋白SZ1的偶联纳米药物毒性较小，不影响动物体正常的组织器官。

Claims (7)

1.一种靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1，其特征在于，所述的融合蛋白SZ1是由人类FZD5分泌信号肽、V5标签肽、人类LGR4部分胞外域、连接区域、人类ZNRF3部分胞外域以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所依次排列组成；
其中，通过检索NCBI GenBank查找cDNA序列，利用基因合成的方式获得用于扩增人类FZD5分泌信号肽、V5标签肽、人类LGR4部分胞外域、连接区域、人类ZNRF3部分胞外域以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域的cDNA序列所需的PCR引物；
用于扩增人类FZD5分泌信号肽及V5标签肽对应的cDNA序列所需的PCR引物为：FWD：CCGGAATTCGCCACCATGGCTCGGCCT；REV：CCGCTCGAGCGTAGAATCGAGACCGAGGA；
用于扩增人类LGR4部分胞外域对应的cDNA序列所需的PCR引物为：FWD：GCGTCGACGCGCCACCTCTCTGCGCTG；REV：ACCTGTTGAAGGTGTACAATGGATGATTA；
用于扩增连接区域及人类ZNRF3部分胞外域对应的cDNA序列所需的PCR引物为：FWD：TAATCATCCATTGTACACCTTCAACAGGTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTAAGGAGACGGCGTTCGTGGAGGT；REV：CATGTCAAAGTATTCAGTGGGTTGTCG；
用于扩增小鼠IgG2αFc域对应的cDNA序列所需的PCR引物为：FWD：CGACAACCCACTGAATACTTTGACATGGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTCCCAGAGGGCCCACAATCAAG；REV：CCACTAGTCTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG；
用于扩增人IgGH3 Fc域对应的cDNA序列所需的PCR引物为：FWD：CGACAACCCACTGAATACTTTGACATGGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTCCCAGAGGGCCCACAATCAAG；REV：CCACTAGTCTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG；
通过PCR技术扩增得到以上cDNA序列，利用overlapping PCR技术将通过PCR技术扩增后的cDNA序列按顺序整合成一段完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列；
将得到的完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列插入自构建的慢病毒表达载体EF1α启动子下游，从而得到包含完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列的SZ1质粒；
将得到的包含完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列的SZ1质粒使用细胞转染试剂，或通过慢病毒载体psPAX2包装、侵染使得所用的哺乳动物细胞系对完整的表达融合蛋白SZ1的质粒进行蛋白表达；在细胞转染或慢病毒侵染后收集被转染或侵染的哺乳动物细胞的培养基；收集的培养基内含有由完整的表达融合蛋白SZ1的质粒所表达的分泌蛋白，即为融合蛋白SZ1。
2.一种权利要求1所述的靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：利用基因合成的方式获得人类FZD5分泌信号肽以及V5标签肽所对应的cDNA序列所需的引物、人类LGR4部分胞外域所对应的cDNA序列所需的引物、连接域以及人类ZNRF3部分胞外域对应的cDNA序列所需的引物、以及小鼠IgG2αFc域或人IgGH3 Fc域所分别对应的cDNA序列所需的引物，通过PCR技术扩增得到对应的cDNA序列，然后利用overlappingPCR技术将通过PCR技术扩增的4段cDNA序列按人类FZD5信号肽-V5标签-人类LGR4部分胞外域-连接区域-人类ZNRF3部分胞外域-小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所分别对应的cDNA序列顺序整合成一段完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列；
步骤二：将得到的完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列插入自构建的慢病毒表达载体EF1α启动子下游，从而得到包含完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列的SZ1质粒；
步骤三：将得到的包含完整的融合蛋白SZ1所对应的cDNA序列的SZ1质粒使用细胞转染试剂，或通过慢病毒载体psPAX2包装、侵染使得所用的哺乳动物细胞系对完整的表达融合蛋白SZ1的质粒进行蛋白表达；在细胞转染或慢病毒侵染后收集被转染或侵染的哺乳动物细胞的培养基；收集的培养基内含有由完整的表达融合蛋白SZ1的质粒所表达的分泌蛋白，即为融合蛋白SZ1；
步骤四：将包含融合蛋白SZ1的培养基收集完毕后加入anti-V5-agarose树脂球，进行富集；在富集结束后，将包含融合蛋白SZ1的培养基与anti-V5-agarose树脂球的混合物离心；随后移除混合物内清液，对富集了融合蛋白SZ1的anti-V5-agarose树脂球进行洗涤；
步骤五：洗脱、纯化；
①洗脱融合蛋白SZ1：使用V5标签多肽从anti-V5-agarose树脂球上将融合蛋白SZ1竞争洗脱下来；
②通过FPLC纯化：洗脱后的上清液离心，对上清液中的蛋白进行浓缩；再以PBS缓冲溶液为流动相，以Sephadex G-100作为分子排阻色谱中填充相，对融合蛋白SZ1进行分离，以紫外吸收为读出手段，收集得到纯化的SZ1。
3.根据权利要求2所述的一种靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，使用的细胞转染试剂为Neofect、Lipofectamine2000或Fugene HD；所述步骤四中，使用PBS缓冲溶液对富集了融合蛋白SZ1的anti-V5-agarose树脂球进行洗涤。
4.一种权利要求1所述的靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的偶联纳米药物，其特征在于，所述的纳米药物通过将融合蛋白SZ1及RGD短肽偶联到纳米材料上制备成：SZ1与RGD短肽修饰的金纳米棒SZ1-cRGD-AuNRs、SZ1与RGD短肽修饰的二氧化硅包被的金纳米棒SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs或SZ1与RGD短肽修饰的小鼠/人血清蛋白纳米颗粒SZ1-cRGD-SA-NPs。
5.一种权利要求4所述的靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的偶联纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备金纳米棒；
①种子溶液制备：将0.1-10mmolL-1的氯金酸溶液与等体积的0.01-0.2mol·L-1的CTABr混合均匀后，加入硼氢化钠溶液，控制硼氢化钠在混合溶液中的浓度为0.001-0.01mol·L-1，室温下搅拌；
②生长溶液制备：向反应容器中依次加入CTABr、HAuCl4溶液、AgNO3溶液和抗坏血酸溶液，搅拌；
③金纳米棒制备：在②生长溶液中加入0.01-0.20mL①种子溶液，搅拌，室温静置得到充分生长的金纳米棒；
④金纳米棒的纯化：离心除去上清液后，加入乙醇分散后，再次离心除去上清液，获得纯化的金纳米棒；
步骤二：偶联融合蛋白SZ1与RGD短肽；
①向制备纯化的1-20mg·mL-1的Au NRs溶液中加入1-50μmol cRGD肽段反应，离心除去上清液后溶于水中，重复离心纯化步骤获得纯化的cRGD修饰的Au NRs，即cRGD-Au NRs；
②偶联SZ1：配制EDC和NHS的混合溶液，随后向该混合溶液，加入步骤①制备的1-20mg·mL-1cRGD-Au NRs，室温孵育反应，随后加入纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应，离心除去上清液后获得纯化的融合蛋白SZ1偶联的cRGD修饰的金纳米棒SZ1-cRGD-AuNRs。
6.一种权利要求4所述的靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的偶联纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备二氧化硅包被的金纳米棒；
将制备纯化的Au NRs分散于去离子水中，加入质量分数25％的氨水，后缓慢滴加10mmol·L-1的正硅酸乙酯/乙醇溶液，反应；离心除去上清液后加入乙醇分散后再次离心除去上清液获得纯化的二氧化硅包被的金纳米棒SiO2@Au NRs；
步骤二：偶联SZ1与RGD短肽；
①向制备纯化的浓度为1-20mg·mL-1的SiO2@Au NRs溶液中加入1-50μmol的cRGD肽段，反应，离心除去上清液后获得纯化的cRGD修饰的SiO2@Au NRs，即cRGD-SiO2@Au NRs；
②偶联SZ1：配制EDC和NHS的混合溶液，随后向该混合溶液，加入步骤①制备的1-20mg·mL-1的cRGD-SiO2@Au NRs，室温孵育反应，随后加入纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应，离心除去上清液后获得纯化的融合蛋白SZ1偶联的cRGD修饰的二氧化硅包被的金纳米棒SZ1-cRGD-SiO2@AuNRs。
7.一种权利要求4所述的靶向治疗Rspo过度激活导致的结直肠癌的融合蛋白SZ1的偶联纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备小鼠/人血清蛋白纳米粒子；
小鼠/人血清蛋白粉末超声溶解于去离子水中，之后将无水乙醇加入到小鼠/人血清蛋白溶液中，之后加入体积浓度为50％的戊二醛溶液，室温下持续搅拌后离心，将获得的白色沉淀再次溶于去离子水中，反复离心次，获得纯化后的小鼠/人血清蛋白纳米粒子SA-NPs；
步骤二：偶联SZ1与RGD短肽；
①将制备纯化的浓度为1-20mg·mL-1的SA-NPs溶液加入到含有EDC和NHS的混合溶液中，其中EDC浓度为1-50μmol、NHS浓度为1-50μmol，孵化反应，加入1-50μmol的cRGD肽段继续反应，离心除去上清液后获得纯化的cRGD修饰的血清蛋白纳米粒子cRGD-SA-NPs；
②偶联SZ1：配制EDC和NHS的混合溶液，随后向该混合溶液加入步骤①制备的1-20mg·mL-1的cRGD-SA-NPs，室温孵育反应，随后加入纯化后的融合蛋白SZ1，室温反应，离心除去上清液后获得纯化的融合蛋白SZ1偶联的cRGD修饰的血清蛋白纳米粒子SZ1-cRGD-SA-NPs。
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