JP7219928B2 - 抗トランスサイレチン抗体 - Google Patents

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Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１５年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／１０９，００１号および２０１５年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／２６６，５５７号に関するものであり、上記出願はそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる。
（配列表の参照）
本願には、ファイル名４７３３８０＿ＳＥＱＬＳＴ．ＴＸＴ、作成日２０１６年１月２８日、容量７０，７７５バイトの電子配列表が含まれ、この配列表は、その全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる。
疾患特異的タンパク質のフォールディングおよび凝集の異常が原因であると考えられている疾患がいくつかある。このようなタンパク質は、アミロイドとして知られる病理診断的な蓄積物として蓄積することがあり、特定の組織学的染色によって可視化される。アミロイドは、炎症性応答を誘発すると考えられており、関係のある組織に複数の負の結果をもたらす。さらに、フォールディングが異常なタンパク質の小さい凝集体が存在し細胞毒性効果をもたらすこともある。
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、ミスフォールドして凝集する（例えば、アミロイドを形成する）ことが知られている多数のタンパク質の１つである。トランスサイレチン関連アミロイドーシスには、変異ＴＴＲまたはバリアントＴＴＲのミスフォールディングによって生じる家族性疾患および野生型ＴＴＲの不適切な凝集を原因とする孤発性非遺伝性疾患の２つの形態の疾患が含まれる。ＴＴＲアミロイド形成の過程で、神経系および／または心臓ならびにそれ以外の組織に病態が生じることがある。
一態様では、本発明は、実質的に抗体６Ｃ１に由来する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む、トランスサイレチンを特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの上記の抗体は、抗体６Ｃ１の３つのＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲ（それぞれ配列番号１０～１２）と３つの軽鎖ＣＤＲ（それぞれ配列番号１８～２０）とを含む。いくつかの抗体では、重鎖ＣＤＲ－Ｈ１はＫａｂａｔ－Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１複合体（配列番号６３）である。いくつかの上記の抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの上記の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、またはヒト抗体である。いくつかの上記の抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する。いくつかの上記の抗体は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプまたはヒトＩｇＧ４アイソタイプを有する。
いくつかの上記の抗体は、トランスサイレチンに特異的に結合するヒト化６Ｃ１抗体またはキメラ６Ｃ１抗体であり、６Ｃ１は配列番号１の成熟重鎖可変領域および配列番号１３の成熟軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である。
いくつかの抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は６Ｃ１の３つの重鎖ＣＤＲを含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は６Ｃ１の３つの軽鎖を含む。いくつかの抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は６Ｃ１の３つのＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲ（配列番号１０～１２）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は６Ｃ１の３つのＫａｂａｔ軽鎖ＣＤＲ（配列番号１８～２０）を含む。
いくつかの抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は配列番号９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ヒト化成熟軽鎖可変領域は配列番号１７に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、Ｈ７７位がＴによって占められている。いくつかの上記の抗体では、Ｈ４９位がＡによって占められている。いくつかの上記の抗体では、Ｈ７６位およびＨ８２（ａ）位がＳによって占められている。いくつかの上記の抗体では、Ｈ４９位がＡによって占められている。いくつかの上記の抗体では、Ｈ１９位、Ｈ４４位、Ｈ８３位、およびＨ８９位が、それぞれＫ、Ｒ、Ｋ、およびＭによって占められている。いくつかの上記の抗体では、Ｈ４９位がＡによって占められている。いくつかの上記の抗体では、Ｌ４５位がＫによって占められている。いくつかの上記の抗体では、Ｌ２位がＶによって占められている。
いくつかの抗体は、配列番号９に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号１７に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む。いくつかの抗体は、配列番号９に少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号１７に少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの上記の抗体では、成熟軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの抗体では、抗体はインタクト抗体である。いくつかの抗体では、抗体は結合フラグメントである。いくつかの抗体では、抗体は一本鎖抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦａｂ’２フラグメントである。
いくつかの抗体では、成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合され、成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合される。いくつかの上記の抗体では、重鎖定常領域は、天然ヒト重鎖定常領域に比してＦｃγ受容体への結合が低下した天然ヒト重鎖定常領域の変異体である。いくつかの上記の抗体では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。いくつかの上記の抗体では、成熟重鎖可変領域は、配列番号２６の配列を有する重鎖定常領域に融合し、かつ／または成熟軽鎖可変領域は、配列番号２８の配列を有する成熟軽鎖可変領域に融合している。
いくつかの抗体では、それぞれ配列番号１および１３由来の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域ＣＤＲでの差はいずれも、Ｈ６０位～Ｈ６５位にある。
別の態様では、本発明は、上記のいずれかの抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、上記のいずれかの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸を提供する。別の態様では、本発明は、このような核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。別の態様では、本発明は、このような組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、抗体をヒト化する方法であって、
（ａ）アクセプター抗体を選択することと、
（ｂ）保持されるべきマウス抗体のアミノ酸残基を特定することと、
（ｃ）マウス抗体重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸およびマウス抗体軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成することと、
（ｄ）核酸を宿主細胞内で発現させてヒト化抗体を作製することと
を含み、
マウス抗体が配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体を作製する方法であって、
（ａ）細胞が抗体を分泌するように、抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸で形質転換した細胞を培養することと、
（ｂ）細胞培地から抗体を精製することと
を含み、
抗体がヒト化型、キメラ型、またはベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型の６Ｃ１である、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体を産生する細胞系を作製する方法であって、
（ａ）細胞内に抗体の重鎖および軽鎖と選択マーカーとをコードするベクターを導入することと、
（ｂ）ベクターのコピー数が増加した細胞を選択する条件下で細胞を増殖させることと、
（ｃ）選択された細胞から単一の細胞を単離することと、
（ｄ）抗体の産生量に基づいて選択された単一の細胞からクローン化した細胞をバンク化することと
を含み、
抗体がヒト化型、キメラ型、またはベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型の６Ｃ１である、方法を提供する。
いくつかの上記の方法は、細胞を選択条件下で増殖させることと、２４時間で細胞１０６個当たり少なくとも１００ｍｇ／Ｌを天然に発現し分泌する細胞系をスクリーニングすることをさらに含む。
別の態様では、本発明は、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中のトランスサイレチンの凝集を阻害または軽減する方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより対象中のトランスサイレチンの凝集を阻害または軽減することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中のトランスサイレチン原線維形成を阻害または軽減する方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより対象中のトランスサイレチン蓄積を阻害または軽減することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中のトランスサイレチン沈着物を減少させる方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより対象中のトランスサイレチン沈着物を減少させることを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中の凝集トランスサイレチンを除去する方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより、抗体を投与していないトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象に比して対象から凝集トランスサイレチンを除去することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中の非毒性立体構造のトランスサイレチンを安定化させる方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより対象中の非毒性立体構造のトランスサイレチンを安定化させることを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象中のトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスの治療または予防する方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象中のトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスの発症を遅らせる方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象中のトランスサイレチン介在性のるアミロイドーシスを診断する方法であって、対象由来の生体試料を有効量の上記のいずれかの抗体と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの上記の方法は、トランスサイレチンへの抗体の結合を検出することをさらに含み、結合した抗体の存在が対象にトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスがあることを示す。いくつかの上記の方法は、生体試料への抗体の結合を、対照試料への抗体の結合と比較することをさらに含み、生体試料への抗体の結合が対照試料に比して増大していることが対象にトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスがあることを示す。
いくつかの上記の方法では、生体試料と対照試料は、同じ組織起源の細胞を含む。いくつかの上記の方法では、生体試料および／または対照試料は、血液、血清、血漿、または固形組織である。いくつかの上記の方法では、固形組織は、心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管に由来する。
いくつかの方法では、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスは、家族性トランスサイレチンアミロイドーシスまたは孤発性トランスサイレチンアミロイドーシスである。いくつかの上記の方法では、家族性トランスサイレチンアミロイドーシスは、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、家族性アミロイドニューロパチー（ＦＡＰ）、または中枢神経系選択性アミロイドーシス（ＣＮＳＡ）である。いくつかの上記の方法では、孤発性トランスサイレチンアミロイドーシスは、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）または老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）である。
いくつかの方法では、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスは、対象の心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管へのアミロイド蓄積と関連する。
別の態様では、本発明は、対象中のトランスサイレチン沈着物の有無を検出する方法であって、アミロイド蓄積を有することが疑われる対象由来の生体試料を、有効量の上記のいずれかの抗体と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの上記の方法は、トランスサイレチンへの抗体の結合を検出することをさらに含み、結合した抗体の検出がトランスサイレチン沈着物の存在を示す。いくつかの上記の方法は、生体試料への抗体の結合を、対照試料への抗体の結合と比較することをさらに含み、生体試料への抗体の結合が対照試料に比して増大していることが、対象にトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスがあることを示す。いくつかの上記の方法では、生体試料と対照試料は、同じ組織起源の細胞を含む。いくつかの上記の方法では、生体試料および／または対照試料は、血液、血清、血漿、または固形組織である。いくつかの上記の方法では、固形組織は、心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管に由来する。
別の態様では、本発明は、対象中のトランスサイレチン沈着物のレベルを決定する方法であって、上記のいずれかの抗体を投与することと、対象中の結合した抗体の存在を検出することとを含む。いくつかの上記の方法では、結合した抗体の存在を陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）によって決定する。
マウス６Ｃ１抗体、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、およびヒト化型６Ｃ１抗体の重鎖可変領域のアライメントを示す図である。Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲが四角で囲われており、例外的に最初の四角で囲われた部分はＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１とＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｈ１の複合体であり、下線が施された太字の部分がＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｈ１である。 マウス６Ｃ１抗体、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、およびヒト化型６Ｃ１抗体の軽鎖可変領域のアライメントを示す図である。Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲが四角で囲われている。 図３Ａは、ｐｈ４処理ＴＴＲに対するマウス５Ａ１抗体、６Ｃ１抗体、９Ｄ５抗体、および１４Ｇ８抗体の結合曲線を示す図である。 図３Ｂは、ｐｈ４処理ＴＴＲまたは天然ＴＴＲに対するマウス５Ａ１抗体、６Ｃ１抗体、９Ｄ５抗体、および１４Ｇ８抗体の結合曲線を示す図である。 図４Ａは、ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体によるＴＴＲ－Ｙ７８Ｆ線維形成の阻害を示す図である。 図４Ｂは、１４Ｇ８によるＴＴＲ－Ｖ１２２Ｉ線維形成の阻害を示す図である。 図４Ｃは、対照抗体によるＴＴＲ－Ｖ１２２Ｉ線維形成の阻害を示す図である。 図５Ａは、９Ｄ５ ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体を用いた、Ｖ３０Ｍ ＡＴＴＲが確認された患者由来の血漿試料（試料番号１１、１２、１５、１８、１９、２０）および正常対象由来の試料（試料番号２１、２２、２３、２４、２５および２７）のウエスタンブロット解析のデンシトメトリー解析を示す図である。 図５Ｂは、５Ａ１ ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体を用いた同じ試料のウエスタンブロット解析のデンシトメトリー解析を示す図である。 ６Ｃ１抗体を用いた、Ｖ３０Ｍ ＡＴＴＲが確認された患者由来の血漿試料（試料番号１１、１２、１５、１８、１９、２０）および正常対象由来の試料（番号２１、２２、２３、２４、２５、２７）のＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートアッセイを示す図である。 図７Ａは、ＴＨＰ－１細胞によるＦ８７Ｍ／Ｌ１１０Ｍ ＴＴＲ取込みに対する抗体１４Ｇ８の効果を示す図である。 図７Ｂは、ＴＨＰ－１細胞によるＶ３０Ｍ ＴＴＲ取込みに対する各ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体の効果を示す図である。
配列の簡単な説明
配列番号１は、マウス６Ｃ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号２は、マウス重鎖可変領域構造の鋳型のアミノ酸配列を表す。
配列番号３は、重鎖可変アクセプターアクセッション番号ＡＤＸ６５６５０のアミノ酸配列を表す。
配列番号４は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン１（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１）のアミノ酸配列を表す。
配列番号５は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン１ｂ（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１ｂ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号６は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン２（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２）のアミノ酸配列を表す。
配列番号７は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン２ｂ（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号８は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン３（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３）のアミノ酸配列を表す。
配列番号９は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン３ｂ（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０は、マウス６Ｃ１抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１は、マウス６Ｃ１抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２は、マウス６Ｃ１抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３は、マウス６Ｃ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号１４は、マウス軽鎖可変領域構造の鋳型のアミノ酸配列を表す。
配列番号１５は、軽鎖可変アクセプターアクセッション番号ＡＢＩ７４０８４のアミノ酸配列を表す。
配列番号１６は、ヒト化６Ｃ１抗体の軽鎖可変領域バージョン１（Ｈｕ６Ｃ１ＶＬｖ１）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１７は、ヒト化６Ｃ１抗体の軽鎖可変領域バージョン２（Ｈｕ６Ｃ１ＶＬｖ２）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１８は、マウス６Ｃ１抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号１９は、マウス６Ｃ１抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号２０は、マウス６Ｃ１抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号２１は、シグナルペプチドを有するマウス６Ｃ１抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列を表す。
配列番号２２は、シグナルペプチドを有するマウス６Ｃ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号２３は、シグナルペプチドを有するマウス６Ｃ１抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列を表す。
配列番号２４は、シグナルペプチドを有するマウス６Ｃ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号２５は、例示的ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号２６は、例示的ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３重鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号２７は、例示的ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３重鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号２８は、Ｎ末端アルギニンを有する例示的軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号２９は、Ｎ末端アルギニンを有さない例示的軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号３０は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖領域バージョン１のアミノ酸配列を表す。
配列番号３１は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖領域バージョン１ｂのアミノ酸配列を表す。
配列番号３２は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖領域バージョン２のアミノ酸配列を表す。
配列番号３３は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖領域バージョン２ｂのアミノ酸配列を表す。
配列番号３４は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖領域バージョン３のアミノ酸配列を表す。
配列番号３５は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖領域バージョン３ｂのアミノ酸配列を表す。
配列番号３６は、ヒト化６Ｃ１抗体の軽鎖領域バージョン１のアミノ酸配列を表す。
配列番号３７は、ヒト化６Ｃ１抗体の軽鎖領域バージョン２のアミノ酸配列を表す。
配列番号３８は、アクセッション番号Ｐ０２７６６．１（ＵｎｉＰｒｏｔ）で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列を表す。
配列番号３９は、アクセッション番号ＡＡＢ３５６３９．１（ＧｅｎＢａｎｋ）で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列を表す。
配列番号４０は、アクセッション番号ＡＡＢ３５６４０．１（ＧｅｎＢａｎｋ）で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列を表す。
配列番号４１は、アクセッション番号およびＡＢＩ６３３５１．１（ＧｅｎＢａｎｋ）で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列を表す。
配列番号４２は、ヒトトランスサイレチンの残基８９～９７のアミノ酸配列を表す。
配列番号４３は、潜在的トランスサイレチン免疫原のアミノ酸配列を表す。
配列番号４４は、潜在的トランスサイレチン免疫原のアミノ酸配列を表す。
配列番号４５は、潜在的トランスサイレチン免疫原のアミノ酸配列を表す。
配列番号４６は、例示的ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３重鎖定常領域をコードする核酸配列を表す。
配列番号４７は、Ｎ末端アルギニンを有する例示的軽鎖定常領域をコードする核酸配列を表す。
配列番号４８は、Ｎ末端アルギニンを有さない例示的軽鎖定常領域をコードする核酸配列を表す。
配列番号４９は、重鎖定常領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号５０は、重鎖定常領域シグナルペプチドをコードする核酸配列を表す。
配列番号５１は、軽鎖定常領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号５２は、軽鎖定常領域シグナルペプチドをコードする核酸配列を表す。
配列番号５３は、マウス６Ｃ１可変軽鎖領域をコードする核酸配列を表す。
配列番号５４は、マウス６Ｃ１可変重鎖領域をコードする核酸配列を表す。
配列番号５５は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン１（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１）をコードする核酸配列を表す。
配列番号５６は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン１ｂ（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１ｂ）をコードする核酸配列を表す。
配列番号５７は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン２（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２）をコードする核酸配列を表す。
配列番号５８は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン２ｂ（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂ）をコードする核酸配列を表す。
配列番号５９は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン３（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３）をコードする核酸配列を表す。
配列番号６０は、ヒト化６Ｃ１抗体の重鎖可変領域バージョン３ｂ（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂ）をコードする核酸配列を表す。
配列番号６１は、ヒト化６Ｃ１抗体の軽鎖可変領域バージョン１（Ｈｕ６Ｃ１ＶＬｖ１）をコードする核酸配列を表す。
配列番号６２は、ヒト化６Ｃ１抗体の軽鎖可変領域バージョン２（Ｈｕ６Ｃ１ＶＬｖ２）をコードする核酸配列を表す。
配列番号６３は、マウス６Ｃ１抗体のＣＤＲ－Ｈ１複合体（残基２６～３５）のアミノ酸配列を表す。
定義
モノクローナル抗体をはじめとする生物学的実体は通常、単離形態で提供される。このことは、抗体をはじめとする生物学的実体が通常、その作製または精製から生じる妨害タンパク質をはじめとする夾雑物に対し純度が少なくとも５０重量％であることを意味するが、モノクローナル抗体が、その使用を容易にすることを目的とする過剰の薬学的に許容される担体（１つまたは複数）をはじめとする媒体と組み合わされる可能性を排除するものではない。モノクローナル抗体は場合によっては、作製または精製から生じる妨害タンパク質をはじめとする夾雑物に対し純度が少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％または９９重量％である。多くの場合、単離されたモノクローナル抗体をはじめとする生物学的実体は、その精製後に残っている主要な高分子種である。
その標的抗原への抗体の特異的な結合とは、親和性が少なくとも１０６Ｍ－１、１０７Ｍ－１、１０８Ｍ－１、１０９Ｍ－１、または１０１０Ｍ－１であることを意味する。特異的結合は、強度が検出可能により高く、少なくとも１つの無関係な標的に対して起こる非特異的結合と区別可能である。特異的結合は、特定の官能基の間の結合形成または特定の空間的嵌合（例えば、鍵－鍵穴型）の結果であり得るが、これに対し非特異的結合は通常、ファンデルワールス力の結果である。特異的結合はしかし、抗体がただ１つの標的のみを結合することを必ずしも意味しない。
抗体の基本的な構造単位はサブユニットの四量体である。各四量体にはポリペプチド鎖の同一のペアが２組含まれており、各ペアは１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）と１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識を担う約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。この可変領域は最初、切断可能なシグナルペプチドに連結されて発現する。シグナルペプチドを有さない可変領域を成熟可変領域と呼ぶこともある。したがって、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを有さない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定める。
軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定める。軽鎖および重鎖内では、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって可変領域と定常領域が連結され、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．編，第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，第７章（その全体があらゆる目的において参照により組み込まれる）を参照されたい。
免疫グロブリンの軽鎖可変領域または重鎖可変領域（本明細書ではそれぞれ「軽鎖可変ドメイン」（「ＶＬドメイン」）または「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨドメイン」）とも呼ぶ）は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって分断される「フレームワーク」領域からなる。「フレームワーク領域」には、抗原のエピトープへの特異的結合のためにＣＤＲを整列させる役割がある。ＣＤＲは、主に抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を含む。ＶＬドメインおよびＶＨドメインはともに、アミノ末端からカルボキシル末端へと、以下のフレームワーク（ＦＲ）領域およびＣＤＲ領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、本明細書ではそれぞれＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３とも呼び、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、本明細書ではそれぞれＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３とも呼ぶ。
各ＶＬドメインおよびＶＨドメインへのアミノ酸の割当ては、従来のＣＤＲの定義に準ずるものである。従来の定義としては、Ｋａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７ ａｎｄ １９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａの定義（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３，１９８９）；ＣＤＲ－Ｈ１がＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲとＫａｂａｔ ＣＤＲの複合体であるＣｈｏｔｈｉａ Ｋａｂａｔ ＣＤＲ複合体；Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社の抗体モデリングソフトウェアで使用されるＡｂＭ定義；およびＭａｒｔｉｎらの接触定義（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）（ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ）が挙げられる（表１を参照されたい）。Ｋａｂａｔは、広く用いられている慣例的な番号付け（Ｋａｂａｔ番号付け）を提供しており、この番号付けでは、異なる重鎖同士または異なる軽鎖同士で対応する残基に同じ番号を割り当てる。抗体が特定のＣＤＲの定義（例えば、Ｋａｂａｔ）によるＣＤＲを含むと言う場合、その定義は抗体に存在するＣＤＲ残基の最小数を明記する（すなわち、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ）。それは、別の従来のＣＤＲの定義には当てはまるが、指定される定義には当てはまらない他の残基を排除するものではない。例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲを含む抗体としては、考え得る抗体のなかでもとりわけ、ＣＤＲにＫａｂａｔ ＣＤＲ残基を含み他のＣＤＲ残基を含まない抗体および、ＣＤＲ Ｈ１がＣｈｏｔｈｉａ－Ｋａｂａｔ ＣＤＲ Ｈ１複合体であり他のＣＤＲがＫａｂａｔ ＣＤＲ残基を含み別の定義に基づく追加のＣＤＲ残基を含まない抗体が挙げられる。
Figure 0007219928000001
「抗体」という用語は、「インタクト抗体」およびその結合フラグメントを包含する。フラグメントは通常、標的への特異的結合に関して元のインタクト抗体と競合し、分離した重鎖、分離した軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｄａｂ、ナノボディ、およびＦｖを含む。フラグメントは、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクト免疫グロブリンの酵素的分離もしくは化学的分離によって作製できる。「抗体」という用語はまた、二重特異性抗体および／またはヒト化抗体も包含する。二重特異性抗体または二機能性抗体とは、２種類の異なる重鎖／軽鎖ペアと２種類の異なる結合部位とを有する人工ハイブリッド抗体である（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５－３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７－５３（１９９２）を参照されたい）。いくつかの二重特異性抗体では、２種類の異なる重鎖／軽鎖ペアは、ヒト化６Ｃ１重鎖／軽鎖ペアと、６Ｃ１が結合するものとは異なるトランスサイレチン上のエピトープに対して特異的な重鎖／軽鎖ペアとを含む。
いくつかの二重特異性抗体では、一方の重鎖／軽鎖ペアが、のちにさらに開示するヒト化６Ｃ１抗体であり、他方の重鎖／軽鎖ペアが、血液脳関門に発現する受容体、例えばインスリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体などに結合する抗体に由来する（Ｆｒｉｄｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４７７１－４７７５，１９９１；Ｆｒｉｄｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：３７３－３７７，１９９３）。このような二重特異性抗体は、受容体介在型トランスサイトーシスによって血液脳関門を通過可能である。血液脳関門受容体に対するその親和性が低下するよう二重特異性抗体を設計することによって、二重特異性抗体の脳での取込みをさらに増大させることができる。受容体に対する親和性を低下させることによって、脳内にさらに広範囲に分布するという結果が得られている（例えば、Ａｔｗａｌら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４３，２０１１；Ｙｕら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４４，２０１１を参照されたい）。
例示的な二重特異性抗体はまた、（１）各軽鎖および重鎖が短いペプチド結合を介して２つの可変ドメインをタンデムに含む、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０）のＷｕら，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）；（２）各標的抗原に対して２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの単一鎖ダイアボディの融合物である、Ｔａｎｄａｂ；（３）ｓｃＦｖとダイアボディとを組み合わせて得られる多価分子であるフレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）；（４）Ｆａｂに適用すると、異なる１つのＦａｂフラグメントに連結される２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質をもたらす、プロテインキナーゼＡでの「二量体化／ドッキングドメイン」を土台とする、いわゆる「ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ）」分子；または（５）例えばヒトＦｃ領域の両端に融合される２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるＳｃｏｒｐｉｏｎ分子であってよい。二重特異性抗体の調製に有効なプラットフォームの例としては、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ社）、ＦｃａｂおよびＭａｂ２（Ｆ－ｓｔａｒ社）、Ｆｃ操作ＩｇＧ１（Ｘｅｎｃｏｒ社）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアームの交換に基づくもの、Ｇｅｎｍａｂ社）が挙げられる。
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸または１つまたは複数のタンパク質の三次フィールディングによって並列される非連続のアミノ酸から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープ（直線状エピトープとしても知られる）は通常、変性溶媒に曝露しても保持されるのに対し、三次フォールディングによって形成されるエピトープ（立体構造エピトープとしても知られる）は通常、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは通常、固有の空間的構造の少なくとも３個、より通常には少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的構造を明らかにする方法としては、例えばＸ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。エピトープは、例えば、配列番号３８の２～５、３～５、３～９、または５～９の連続するアミノ酸からなるエピトープのような直線状であり得る。エピトープはまた、例えば、配列番号３８の残基８９～９７内のアミノ酸の２つ以上の非連続セグメントを含む立体構造エピトープであり得る。抗体がトランスサイレチン（ＴＴＲ）のアミノ酸８９～９７内のエピトープに結合すると言う場合、例えばその意味は、エピトープが、範囲の外側の境界を定めるものを含み記載されるアミノ酸の範囲内にあるということである。それは必ずしも、その範囲内のあらゆるアミノ酸がエピトープの一部を構成することを意味するわけではない。したがって、例えば、ＴＴＲのアミノ酸８９～９７内のエピトープは、配列番号４２の直線状のセグメントのなかでもとりわけ、アミノ酸８９～９７、８９～９６、９０～９６、９１～９６、９２～９６、９３～９６、９４～９６、８９～９６、８９～９５、８９～９４、８９～９３、８９～９２または８９～９３からなるか、立体構造エピトープの場合、配列番号４２のアミノ酸の非連続セグメントからなるものであり得る。
同じエピトープまたは重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原へのある抗体の結合に関して別の抗体と競合するある抗体の能力を示す単純なイムノアッセイで特定できる。抗体のエピトープもまた、接触残基を特定するためにその抗原に結合した抗体のＸ線結晶構造解析によって明らかにできる。あるいは、一方の抗体の結合を低下または消失させる抗原中の全てのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を低下または消失させる場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低下または消失させるいくつかのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を低下または消失させる場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
抗体間の競合は、被験抗体が共通の抗原への参照抗体の結合を阻害するアッセイにより決定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照されたい）。競合結合アッセイで測定して過剰の被験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍）が参照抗体の結合を少なくとも５０％阻害する場合、被験抗体は参照抗体と競合する。参照抗体の結合を少なくとも７５％、９０％または９９％阻害する被験抗体もある。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）としては、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および、立体障害を起こす程度に参照抗体が結合するエピトープに近い位置にある近接エピトープに結合する抗体が挙げられる。
構造トランスサイレチン（ＴＴＲ）に関する「天然の」という用語は、正常にフォールドし正しく機能する状態にあるＴＴＲの構造（すなわち、ＴＴＲ四量体）を指す。ＴＴＲは天然にフォールドした形態で四量体であることから、非天然形態のＴＴＲとしては、例えば、ミスフォールドしたＴＴＲ四量体、ＴＴＲ単量体、凝集形態のＴＴＲ、および原線維形態のＴＴＲが挙げられる。非天然形態のＴＴＲは、野生型ＴＴＲのアミノ酸配列または変異を含む分子を含み得る。
ＴＴＲに関する「ミスフォールドした」という用語は、ＴＴＲポリペプチドの単量体または多量体の二次構造または三次構造を指し、ポリペプチドが、正しく機能する状態にあるそのタンパク質には正常ではない立体構造をとっていることを表す。ＴＴＲのミスフォールディングはタンパク質の変異（例えば、欠失、置換、または付加）によって引き起こされ得るが、野生型ＴＴＲタンパク質が疾患でミスフォールドすることもあり、特定のエピトープを曝露する。
「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、補形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合し、その被投与者に実質的に有害でないことを意味する。
「患者」という用語は、予防処置または治療処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を包含する。
ある個体は、既知の危険因子（例えば、遺伝学的因子、生化学的因子、家族歴、および環境曝露）であって、その危険因子を有する個体がそれをもたない個体よりも疾患を発症するリスクが統計的に有意に高い危険因子をその対象が少なくとも１つ有する場合、その疾患のリスクが高い。
「生体試料」という用語は、生物学的供給源、例えばヒトまたは哺乳動物対象中の、またはそれらの対象から採取できる生物学的材料の試料を指す。このような試料は、器官、細胞小器官、組織、組織切片、体液、末梢血、血漿、血清、細胞、タンパク質およびペプチドなどの分子、およびそれらに由来する任意の部分または組合せであり得る。生体試料という用語はまた、試料を処理することによって得られる任意の材料を包含し得る。得られる材料は、細胞またはそれらの子孫を含み得る。生体試料の処理は、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、固定、妨害成分の不活化などの１つまたは複数を含み得る。
「対照試料」という用語は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のトランスサイレチン（ＴＴＲ）、例えばＴＴＲアミロイド沈着物などを含むと知られていない、または推測されない生体試料を指す。対照試料は、ＴＴＲアミロイドーシスまたは具体的に選択した種類のＴＴＲアミロイドーシスに罹患していない個体から得られる。あるいは、対照試料は、ＴＴＲアミロイドーシスまたは具体的に選択した種類のＴＴＲアミロイドーシスに罹患している患者から得られる。このような試料は、ＴＴＲアミロイドーシスを含むと考えられる生体試料と同時に得ても、異なる機会に得てもよい。生体試料および対照試料はともに、同じ組織（例えば、ＴＴＲアミロイド沈着物と周囲の正常組織の両方を含む組織切片）から得てもよい。好ましくは、対照試料は実質的にまたは完全に、ＴＴＲアミロイド沈着物を含まない組織からなり、ＴＴＲアミロイド沈着物を含むと考えられる生体試料との比較に用いることができる。好ましくは、対照試料中の組織は、生体試料中の組織と同じ種類（例えば、心臓中の心筋細胞）である。
「疾患」という用語は、生理的機能を損なう任意の異常な状態を指す。この用語は広義に使用され、病因の性質に関係なく生理的機能が損なわれる任意の障害、病気、異常、病態、疾病、状態、または症候群を包含する。
「症状」という用語は、対象によって知覚される疾患の主観的証拠、例えば歩行異常などを指す。「徴候」は、医師によって観察される疾患の客観的証拠を指す。
アミノ酸置換を保存的置換または非保存的置換に分類する目的で、アミノ酸を以下のグループに分ける：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラスのアミノ酸の間で置換を含む。非保存的置換は、上記のうちの１つクラスのメンバーが別のクラスのメンバーに置き換わるものである。
配列同一性のパーセントは、慣習的なＫａｂａｔ番号付けによって最大に整列させた抗体の配列によって求められる。整列後、目的の抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）を参照抗体の同じ領域と比較する場合、目的の抗体の領域と参照抗体の領域との間の配列同一性のパーセントは、目的の抗体の領域および参照抗体の領域の両方で同じアミノ酸によって占められる位置の数を、２つの領域の整列された位置の総数で除し、ギャップをカウントせずに、１００を乗じてパーセントに変換したものである。
１つまたは複数の記載される要素を「含む」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む」組成物は、抗体を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。
数値の範囲の指定は、その範囲内に含まれる整数またはその範囲を定める整数、およびその範囲内の整数によって定められる全ての部分範囲を含む。
「約」という用語は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、記載される数値の測定標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の数値を包含する。
統計的に有意であるとは、ｐ≦０．０５を意味する。
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数形の指示対象を包含する。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」は、複数の化合物をその混合物も含んで包含し得る。
（詳細な説明）
Ｉ．概略
本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）の残基８９～９７に特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲに結合する能力を有する。この抗体は、ＴＴＲの蓄積またはＴＴＲ沈着物の蓄積に関連する疾患または障害（例えば、ＴＴＲアミロイドーシス）を治療または予防するために使用できる。この抗体はまた、諸用途のなかでもとりわけ、ＴＴＲアミロイドーシスを診断するためおよびＴＴＲ凝集を阻害または軽減するために使用できる。
ＩＩ．標的分子
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、血清中および脳脊髄液中に存在する１２７アミノ酸、５５ｋＤａの輸送タンパク質であり、主に肝臓で合成される。それはまたプレアルブミン、チロキシン結合プレアルブミン、ＡＴＴＲ、およびＴＢＰＡとも呼ばれている。その天然の状態では、ＴＴＲは四量体として存在する。ホモ接合体では、四量体は同一の１２７アミノ酸ベータシートリッチサブユニットを含む。ヘテロ接合体では、ＴＴＲ四量体は、通常は統計的に組み合わされるバリアントサブユニットおよび／または野生型サブユニットからなる。
血液中での確立されたＴＴＲの機能は、ホロ－レチノール結合タンパク質の輸送である。げっ歯類の血液中でＴＴＲはチロキシン（Ｔ４）の主要な担体であり、ホロ－レチノール結合タンパク質に用いられるものと直交する結合部位を利用するが、ヒトではこのＴ４結合部位は事実上空いている。
ＴＴＲは、様々な凝集構造へのその細胞外でのミスフォールドおよび／または誤会合（アミロイド形成）がアミロイド疾患と呼ばれる変性性疾患を引き起こすと考えられる、少なくとも３０種類の異なるヒトタンパク質のうちの１つである。ＴＴＲは立体構造変化を受けてアミロイド原性となる。部分的なアンフォールディングによって、伸長した立体構造の、大部分が非荷電で疎水性のひと続きの残基が露出し、これがほぼ不定形の球状凝集体へと効率的に誤会合し、最終的にはクロスベータシートアミロイド構造へと立体構造変換する。
文脈上そうでないことが明らかでない限り、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはそのフラグメントもしくはドメインへの言及は、アイソフォーム、変異体、および対立遺伝子変異体を含む天然のヒトアミノ酸配列を含む。例示的なＴＴＲポリペプチド配列は、アクセッション番号Ｐ０２７６６．１（ＵｎｉＰｒｏｔ）（配列番号３８）、ＡＡＢ３５６３９．１（ＧｅｎＢａｎｋ）（配列番号３９）、ＡＡＢ３５６４０．１（ＧｅｎＢａｎｋ）（配列番号４０）、およびＡＢＩ６３３５１．１（ＧｅｎＢａｎｋ）（配列番号４１）で表される。残基はＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０２７６６．１に従って番号付けされ、成熟タンパク質（すなわち、２０アミノ酸のシグナル配列を含まない）の最初のアミノ酸を残基１と表す。他の任意のＴＴＲタンパク質では、最大アライメントでＰ０２７６６．１中の対応する残基に合わせて残基を番号付けする。
ＩＩＩ．トランスサイレチンアミロイドーシス
トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスは、病原性のミスフォールドＴＴＲおよびＴＴＲからなるアミロイド原線維の細胞外沈着を特徴とする全身障害である。ＴＴＲアミロイドーシスは、天然のＴＴＲ四量体形態の不安定化（環境条件または遺伝条件による）により一般に引き起こされ、ＴＴＲの解離、ミスフォールディング、およびアミロイド原線維への凝集が起こり、これが様々な器官および組織に蓄積し、進行性の機能不全を引き起こす。例えば、ＡｌｍｅｉｄａおよびＳａｒａｉｖａ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８６：２８９１－２８９６（２０１２）；Ａｎｄｏら，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ８：３１（２０１３）を参照されたい。
ヒトでは、野生型ＴＴＲ四量体および変異体サブユニットと野生型サブユニットとからなる混合型四量体の両方が、有糸分裂終了組織の変性をもたらすアミロイド形成の過程で、解離、ミスフォールド、および凝集し得る。したがって、ＴＴＲアミロイドーシスは、ＴＴＲにおける変異により生じるまたは変異していないミスフォールドＴＴＲによって生じる病原性のミスフォールドＴＴＲを原因とする疾患を包含する。
例えば、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）および老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）は加齢に関連する種類のアミロイドーシスであり、心臓の心筋細胞の外側と内側に野生型ＴＴＲアミロイドが沈着することによって起こる。ＴＴＲアミロイドーシスはまた、最も頻度の高い形態の遺伝性（家族性）アミロイドーシスでもあり、ＴＴＲタンパク質を不安定化する変異を原因とする。ＴＴＲ遺伝子中の点変異に関連するＴＴＲアミロイドーシスとしては、家族性アミロイドニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、およびまれな中枢神経系選択性アミロイドーシス（ＣＮＳＡ）が挙げられる。遺伝性（家族性）ＴＴＲアミロイドーシスの患者はほぼ例外なくヘテロ接合体であり、このことは、ＴＴＲ四量体が、一般には統計的に分布する変異体ＴＴＲサブユニットおよび／または野生型ＴＴＲサブユニットからなることを意味する。遺伝性（家族性）のＴＴＲアミロイドーシスは一般に常染色体優性であり、通常、孤発性の疾患（ＳＳＡおよびＳＣＡ）よりも早期に発症する。
ＴＴＲをコードする遺伝子中の変異で、常染色体優性障害のＦＡＰおよびＦＡＣに関与すると考えられているものは１００を超える。例えば、米国特許出願公開第２０１４／００５６９０４号；Ｓａｒａｉｖａ，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１７（６）：４９３－５０３（２００１）；ＤａｍａｓおよびＳａｒａｉｖａ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３０：２９０－２９９；ＤｗｕｌｅｔおよびＢｅｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１４：６５７－６６２（１９８３）を参照されたい。これらのアミロイドを生じる変異はＴＴＲの分子全体にわたって分布している。一般に、変異体サブユニットがＴＴＲの四量体構造をより不安定化させるほど、アミロイド疾患の発症がより早くなる。ＴＴＲバリアントが病原性となる可能性は一般に、その不安定性と細胞分泌効率とを組み合わせて求められる。ＴＴＲバリアントが引き起こす初期の病態は、ＴＴＲバリアントが心組織を選択的に破壊することによるものもあれば、ＴＴＲバリアントによって末梢神経系および自律神経系が損なわれることによるものもある。ＴＴＲアミロイド形成を原因とする組織損傷は、小さい拡散性のＴＴＲ凝集体の毒性によるものがほとんどであると思われるが、細胞外アミロイドの蓄積が一因であることもあり、その場合、ＴＴＲアミロイドーシスの後期に器官構造がほぼ確実に損なわれる。
ＴＴＲアミロイドーシスには多数の異なる形態がみられ、表現型に相当な個体差および地域差がある。例えば、ＴＴＲアミロイドーシスは進行性の軸索性感覚性自律神経性運動性ニューロパチーとしてみられることがある。ＴＴＲアミロイドーシスはまた、浸潤性心筋症としてみられることがある。
疾患関連症状が発現する年齢は１０代～８０代の間で様々であり、集団間で大きなばらつきがみられる。ＴＴＲアミロイドーシスが多系統に及ぶことは、その診断の手掛かりの１つとなる。例えば、以下に挙げるものが１つまたは複数みられる場合、ＴＴＲアミロイドーシスの診断が考慮される：（１）特に心不全に関わる、神経障害性疾患の家族歴；（２）原因不明の神経因性疼痛または進行性感覚障害；（３）原因が明らかでなく、特に両側性で外科的開放を必要とする手根管症候群；（４）原因不明の消化管運動障害または自律神経機能不全（例えば、勃起不全、起立性低血圧症、神経因性膀胱）；（５）高血圧がみられず心室壁肥厚を特徴とする心疾患；（６）原因が不明であり、特に心肥大を伴う高度房室ブロック；および（６）綿花状の硝子体封入体。Ａｎｄｏら，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ８：３１（２０１３）を参照されたい。その他の症状としては、例えば、多発性ニューロパチー、間隔消失、疼痛、下肢脱力、発汗異常、下痢、便秘、体重減少、および尿失禁／尿閉が挙げられる。
ＴＴＲアミロイドーシスの診断は通常、標的器官の生検を頼りにし、次いで、摘出組織をアミロイド特異的色素であるコンゴー赤で組織学的に染色する。検査結果がアミロイド陽性である場合、次いでＴＴＲの免疫組織化学染色を実施してアミロイド形成の原因である前駆体タンパク質が実際にＴＴＲであることを確認する。家族性の疾患では、ＴＴＲをコードする遺伝子に変異があることを次いで明らかにしてから診断を下す必要がある。これは、例えば、等電点電気泳動、ポリメラーゼ連鎖反応、またはレーザー分析／液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析によって遂行され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１４／００５６９０４号；ＲｕｂｅｒｇおよびＢｅｒｋ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２６：１２８６－１３００（２０１２）；Ａｎｄｏら，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ８：３１（２０１３）を参照されたい。
ＩＶ．抗体
Ａ．結合特異性および機能的特性
本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質に、より具体的にはＴＴＲのアミノ酸残基８９～９７（配列番号４２）内のエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。このようなエピトープは天然のＴＴＲ四量体では埋没しており、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲでは露出している。
６Ｃ１と称する抗体は、このようなマウス抗体の一例である。この抗体は、ＴＴＲのアミノ酸残基８９～９７（配列番号４２）内に特異的に結合する。この抗体は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲに結合できるが天然の四量体形態のＴＴＲには結合できないという特徴をさらに有する。さらに、この抗体は、ＴＴＲ媒介性アミロイドーシスの心組織に対して免疫反応を示すが健常な心組織に対しては免疫反応を示さないという特徴を有する。特定のタンパク質またはそのフラグメントに結合する能力は、実施例に記載する例示的アッセイフォーマットを用いて示され得る。
いくつかの抗体は、６Ｃ１と称する抗体と同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する。６Ｃ１の重鎖成熟可変領域および軽鎖成熟可変領域の配列は、それぞれ配列番号１および１３と称される。このような結合特異性を有する他の抗体は、マウスをＴＴＲまたは所望のエピトープを含むＴＴＲの一部分（例えば、配列番号４２）で免疫し、得られた抗体について単量体ＴＴＲまたは配列番号４２を含むペプチドに結合するかどうかを、任意選択でマウス６Ｃ１の可変領域を有する抗体（ＩｇＧ１、カッパ）と競合させて、スクリーニングすることによって作製できる。所望のエピトープを含むＴＴＲのフラグメントを、フラグメントに対する抗体応答を誘発しやすくする担体に連結し、かつ／またはそのような応答を誘発しやすくするアジュバントと組み合わせてもよい。このような抗体について、野生型ＴＴＲ、単量体型ＴＴＲまたはそのフラグメント（例えば、配列番号３８）への差異的結合を特定の残基の変異体と比較してスクリーニングできる。このような変異体に対するスクリーニングは、より正確に結合特異性を明らかにして、特定の残基の変異誘発によってその結合が阻害されかつ他の例示抗体と同じ機能的特性を有する可能性のある抗体の特定を可能にする。変異は、標的全体でまたはエピトープが存在することがわかっているその区画全体で、１回に１残基またはさらに間隔を空けて実施するアラニン（または既にアラニンが存在する場合はセリン）による系統的置換であり得る。同じ変異のセットによって２つ抗体の結合が有意に低下すれば、その２つの抗体は同じエピトープを結合する。
選択したマウス抗体（例えば、６Ｃ１）の結合特異性を有する抗体はまた、ファージディスプレイ方法の変法を用いて作製できる。Ｗｉｎｔｅｒの国際公開第９２／２０７９１号を参照されたい。この方法は、ヒト抗体の作製に特に適している。この方法では、選択したマウス抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかを出発物質として用いる。例えば、軽鎖可変領域を出発物質として選択する場合、メンバーが同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウス出発物質）および異なる重鎖可変領域を提示するファージライブラリーが構築される。重鎖可変領域は、例えば、再編成されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから得ることができる。単量体ＴＴＲまたはそのフラグメント（例えば、アミノ酸残基８９～９７）に対して強い特異的結合（例えば、少なくとも１０８Ｍ－１、好ましくは少なくとも１０９Ｍ－１）を示すファージを選択する。このファージから得た重鎖可変領域は、次いでさらなるファージライブラリーを構築するための出発物質となる。このライブラリーでは、各ファージは同じ重鎖可変領域（すなわち、最初のディスプレイライブラリーで特定された領域）および異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、例えば、再編成したヒト可変軽鎖領域のライブラリーから得ることができる。同じく、単量体ＴＴＲまたはそのフラグメント（例えば、アミノ酸残基８９～９７）に対して強い特異的結合を示すファージを選択する。得られる抗体は通常、マウス出発物質と同じないし類似のエピトープ特異性を有する。
６Ｃ１などの例示的抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発によって、他の抗体を得ることができる。成熟重鎖可変領域および／もしくは成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列において６Ｃ１に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であり、その機能的特性を維持し、かつ／または少数の機能的に重要ではないアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、欠失、もしくは挿入を有する点で各抗体と異なるモノクローナル抗体も本発明に含まれる。任意の従来の定義（ただし、Ｋａｂａｔが好ましい）によって定義されるＣＤＲを少なくとも１つまたは６つとも有し、６Ｃ１の対応するＣＤＲに９０％、９５％、９９％または１００％同一であるモノクローナル抗体も含まれる。
本発明はまた、完全にまたは実質的に６Ｃ１に由来するＣＤＲを一部または全部（例えば、３つ、４つ、５つ、および６つ）有する抗体も提供する。このような抗体は、６Ｃ１の重鎖可変領域に完全にもしくは実質的に由来するＣＤＲを２つ、通常は３つとも有する重鎖可変領域および／または６Ｃ１の軽鎖可変領域に完全にもしくは実質的に由来するＣＤＲを少なくとも２つ、通常は３つとも有する軽鎖可変領域を含み得る。抗体は重鎖および軽鎖の両方を含み得る。ＣＤＲは、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の置換、挿入、または欠失を含む場合、対応する６Ｃ１のＣＤＲに実質的に由来するが、ただし、ＣＤＲ－Ｈ２（Ｋａｂａｔによって定義される場合）は、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の置換、挿入、または欠失を有し得る。このような抗体は、成熟重鎖可変領域および／もしくは成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列において６Ｃ１に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有し、それらの機能的特性を維持し、かつ／または少数の機能的に重要ではないアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、欠失、もしくは挿入を有する点で６Ｃ１と異なり得る。
上記のようなアッセイによって特定されるいくつかの抗体は、実施例をはじめとする箇所に記載されるように、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲに結合できるが、天然の四量体形態のＴＴＲには結合できない。同じように、ＴＴＲ媒介性アミロイドーシスの組織に対して免疫反応を示すが、健常組織に対しては免疫反応を示さない抗体もある。
いくつかの抗体は、動物モデルまたは臨床試験でＴＴＲの凝集を阻害もしくは軽減し、ＴＴＲ原線維形成を阻害もしくは軽減し、ＴＴＲ沈着物もしくは凝集したＴＴＲを減少させるか除去し、またはＴＴＲの非毒性立体構造を安定化させ得る。いくつかの抗体は、動物モデルまたは臨床試験で示されるように、ＴＴＲアミロイドーシスを治療もしくは予防し得るか、ＴＴＲアミロイドーシスの発症を遅らせ得る。ＴＴＲアミロイドーシスに対する活性を検討するための例示的動物モデルとしては、Ｋｏｈｎｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０（４）：１４９７－１５０８（１９９７）；Ｔｅｎｇら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ８１：３８５－３９６（２００１）；Ｗａｋａｓｕｇｉら，Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．６３Ｂ：３４４－３４７（１９８７）；Ｓｈｉｍａｄａら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６：３３３－３４３（１９８９）；Ｎａｇａｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１６９－１７５（１９９５）；Ｓｏｕｓａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６１：１９３５－１９４８（２００２）；およびＳａｎｔｏｓら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ ３１：２８０－２８９（２０１０）に記載されているものが挙げられる。
Ｂ．非ヒト抗体
単量体ＴＴＲまたはそのフラグメント（例えば、アミノ酸残基８９～９７）に対する他の非ヒト抗体、例えば、マウス抗体、モルモット抗体、霊長類抗体、ウサギ抗体またはラット抗体の作製は、例えば、動物をＴＴＲまたはそのフラグメントで免疫することによって遂行できる。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ ＮＹ，１９８８）（あらゆる目的において参照により組み込まれる）を参照されたい。このような免疫原は、天然源から、ペプチド合成によって、または組換え発現によって得ることができる。任意選択で、融合をはじめとする方法で免疫原を担体タンパク質と複合体形成させて投与してもよい。任意選択で、免疫原をアジュバントとともに投与してもよい。のちに記載する通り、いくつかの種類のアジュバントを用いることができる。実験動物の免疫感作には、フロイント完全アジュバント、次いで不完全アジュバントが好ましい。ポリクローナル抗体の作製には通常、ウサギまたはモルモットを用いる。モノクローナル抗体の作製には通常、マウスを用いる。単量体ＴＴＲまたはＴＴＲ内のエピトープ（例えば、アミノ酸残基８９～９７のうちの１つまたは複数のものを含むエピトープ）に特異的に結合する抗体をスクリーニングする。このようなスクリーニングは、単量体ＴＴＲバリアント、例えばアミノ酸残基８９～９７を有するかその残基内に変異を有するＴＴＲバリアントなどの収集物への抗体の結合を決定し、その抗体にどのＴＴＲバリアント抗体が結合するかを決定することによって遂行できる。結合は、例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによって評価できる。
Ｃ．ヒト化抗体
ヒト化抗体は、遺伝子操作によって非ヒト「ドナー」抗体のＣＤＲをヒト「アクセプター」抗体配列内に移植した抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｃａｒｔｅｒ，米国特許第６，４０７，２１３号；Ａｄａｉｒ，米国特許第５，８５９，２０５号；および米国特許第６，８８１，５５７号を参照されたい）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列または生殖系列領域の配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体に由来するＣＤＲを少なくとも３つ、４つ、５つまたは全部ならびに、存在する場合は、完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同じように、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来するＣＤＲを少なくとも１つ、２つ、通常は３つ全部ならびに、存在する場合は、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク配列および定常領域配列に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同じように、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖に由来するＣＤＲを少なくとも１つ、２つ、通常は３つ全部ならびに、存在する場合は、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列および定常領域配列に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびｄＡｂ以外にも、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体のＣＤＲは、各ＣＤＲ間で対応する残基（任意の従来の定義、好ましくはＫａｂａｔによって定義されるもの）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が一致する場合、非ヒト抗体での対応するＣＤＲに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、任意の従来の定義、好ましくはＫａｂａｔによって定義される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一である場合、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。
ヒト化抗体はマウス抗体由来の６つのＣＤＲ（好ましくはＫａｂａｔによって定義されるもの）を全て組み込むことが多いが、マウス抗体由来のＣＤＲが全部に満たない（例えば、ＣＤＲが少なくとも３つ、４つまたは５つである）ヒト化抗体を作製することもできる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓら，Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２０：４１５－４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９－１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１４３２－１４４１，２０００）。
いくつかの抗体では、ヒト化抗体での結合を保持するためにＣＤＲの一部、すなわち、ＳＤＲと呼ばれる結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットのみを必要とする。抗原と接触せずＳＤＲにも存在しないＣＤＲ残基は、これまでの研究に基づき、分子モデリングおよび／または経験的に、またはＧｏｎｚａｌｅｓら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３，２００４に記載されている通りに、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７）の外側に存在するＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から識別できる（例えば、ＣＤＲ Ｈ２の残基Ｈ６０～Ｈ６５は多くの場合必要とされない）。このようなヒト化抗体では、１つまたは複数のドナーＣＤＲ残基が存在しない位置またはドナーＣＤＲ全体が除去されている位置で、この位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列での対応する位置（Ｋａｂａｔ番号付けによるもの）を占めるアミノ酸であり得る。ＣＤＲ中に含まれるべきこのようなドナーアミノ酸からアクセプターアミノ酸への置換の数は、相容れない考慮事項のバランスを反映する。このような置換は、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減らし、その結果、潜在的免疫原性を低下させるのに有利である可能性がある。しかし、置換によって親和性が変化する可能性もあり、親和性の大幅な低下は回避するのが好ましい。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸は、経験的に選択することもできる。
ヒトアクセプター抗体配列は任意選択で、ヒトアクセプター配列の可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの間に高い配列同一性（例えば、６５～８５％の同一性）が得られるよう多数の既知のヒト抗体配列のなかから選択できる。
重鎖のアクセプター配列の例は、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＤＸ６５６５０（配列番号３）のヒト成熟重鎖可変領域である。このアクセプター配列は、マウス６Ｃ１重鎖と同じカノニカル形態を有する２つのＣＤＲを含む。軽鎖のアクセプター配列の例は、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＢＩ７４０８４（配列番号１５）のヒト成熟軽鎖可変領域である。このアクセプター配列は、マウス６Ｃ１軽鎖と同じカノニカル形態を有する２つのＣＤＲを含む。
ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸が、ＣＤＲの立体構造および／または抗原への結合に及ぼすそれらの予想される影響に基づき、選択され得る。そのような予想される影響の調査は、モデリング、特定の位置でのアミノ酸の特徴の検討、または特定のアミノ酸の置換または変異誘発の影響の経験的な観察による。
例えば、あるアミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択したヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なっている場合、ヒトフレームワークのアミノ酸をマウス抗体からの同等のフレームワークのアミノ酸で置換可能であり、その場合、そのアミノ酸は、
（１）直接抗原と非共有結合する；
（２）ＫａｂａｔではなくＣｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲ領域に隣接するか、そのＣＤＲ内にある；
（３）別の方法でＣＤＲ領域（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å以内にある）、（例えば、相同な既知の免疫グロブリン鎖で明らかになった構造上で軽鎖もしくは重鎖をモデル化することによって同定される）と相互作用する；または
（４）ＶＬ－ＶＨ界面に関与する残基である
ことが合理的に予想される。
Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号によって定義されるクラス（１）～（３）のフレームワーク残基は、カノニカル残基およびバーニヤ残基と代わりに呼ばれることがある。ＣＤＲループの立体構造を規程するのに役立つフレームワーク残基は、カノニカル残基と呼ばれることがある（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；ＴｈｏｒｎｔｏｎおよびＭａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００－８１５（１９９６））。抗原結合ループの立体構造を支え、抗体と抗原の嵌合の微調整に何らかの役割を果たすフレームワーク残基をバーニヤ残基と言うことがある（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２２４：４８７－４９９（１９９２））。
置換の候補となる他のフレームワーク残基は、潜在的なグリコシル化部位を形成する残基である。また別の置換の候補は、ヒト免疫グロブリンのその位置には通常みられないアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の同等の位置からのアミノ酸またはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換できる。
例示的ヒト化抗体は、Ｈｕ６Ｃ１と称されるヒト化型のマウス６Ｃ１抗体である。このマウス抗体は、配列番号１を含むアミノ酸配列および配列番号１３を含むアミノ酸配列をそれぞれ有する成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域を含む。本発明は、６種類の例示されるヒト化成熟重鎖可変領域、すなわち、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１（配列番号４）、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１ｂ（配列番号５）、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２（配列番号６）、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂ（配列番号７）、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３（配列番号８）、およびＨｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂ（配列番号９）を提供する。本発明はさらに、２種類の例示されるヒト成熟軽鎖可変領域、すなわち、Ｈｕ６Ｃ１ＶＬｖ１（配列番号１６）およびＨｕ６Ｃ１ＶＬｖ２（配列番号１７）を提供する。６Ｃ１、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、およびヒト化抗体型６Ｃ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアライメントをそれぞれ図１および２に示す。
ＣＤＲの立体構造および／または抗原への結合に対する予想される影響、重鎖と軽鎖との間の相互作用を仲介すること、定常領域との相互作用、望ましい翻訳後修飾または望ましくない翻訳後修飾の部位であること、ヒト可変領域配列のその位置には通常みられない残基でありしたがって免疫原となる可能性がある、凝集能を獲得すること、および他の理由などのため、実施例でさらに明記する以下の１０個の可変領域フレームワーク位置を、６種類の例示されるヒト成熟軽鎖可変領域および２種類の例示されるヒト成熟重鎖可変領域での置換の候補として考慮した：Ｌ２、Ｌ４５、Ｈ１９、Ｈ４４、Ｈ４９、Ｈ７６、Ｈ７７、Ｈ８２（ａ）、Ｈ８３、およびＨ８９。
別の箇所と同じくここでも、１番目に記載される残基は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲまたはＣＤＲ－Ｈ１の場合はＣｈｏｔｈｉａ－Ｋａｂａｔ ＣＤＲ複合体をヒトアクセプターフレームワーク内に移植することによって形成されるヒト化抗体の残基であり、２番目に記載される残基は、そのような残基を置き換えるのに考慮される残基である。したがって、可変領域フレームワーク内では、１番目に記載される残基はヒト残基であり、ＣＤＲ内では、１番目に記載される残基はマウス残基である。
例示される抗体は、例示される成熟重鎖可変領域と軽鎖可変領域の任意の順列または組合せ（例えば、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１／ＶＬｖ１またはＨ１Ｌ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１ｂ／ＶＬｖ１またはＨ１ｂＬ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１／ＶＬｖ２またはＨ１Ｌ２、Ｈｕ６Ｃ１ ＶＨｖ１ｂ／ＶＬｖ２またはＨ１ｂＬ２、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２／ＶＬｖ１またはＨ２Ｌ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂ／ＶＬｖ１またはＨ２ｂＬ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２／ＶＬｖ２またはＨ２Ｌ２、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂ／ＶＬｖ２またはＨ２ｂＬ２、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３／ＶＬｖ１またはＨ３Ｌ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂ／ＶＬｖ１またはＨ３ｂＬ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３／ＶＬｖ２またはＨ３Ｌ２、およびＨｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂ／ＶＬｖ２またはＨ３ｂＬ２）を含む。
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が配列番号４～９に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖可変領域が配列番号１６または１７に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す、ヒト化抗体のバリアントを提供する。いくつかのこのような抗体では、配列番号４～９、１６ および１７の復帰変異をはじめとする変異が少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個とも保持されている。
いくつかの抗体では、ＶＨ領域のＨ１９位、Ｈ４４位、Ｈ４９位、Ｈ７６位、Ｈ７７位、Ｈ８２（ａ）位、Ｈ８３位、およびＨ８９位の少なくとも１つをそれぞれＫ、Ｒ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｓ、Ｋ、およびＶが占める。いくつかの抗体では、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１でのように、ＶＨ領域のＨ７７位をＴが占める。いくつかの抗体では、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１ｂでのように、ＶＨ領域のＨ４９位およびＨ７７位をそれぞれＡおよびＴが占める。いくつかの抗体では、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２でのように、ＶＨ領域のＨ７６位、Ｈ７７位、およびＨ８２（ａ）位をそれぞれＳ、Ｔ、およびＳが占める。いくつかの抗体では、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂでのように、ＶＨ領域のＨ４９位、Ｈ７６位、Ｈ７７位、およびＨ８２（ａ）位をそれぞれＡ、Ｓ、Ｔ、およびＳが占める。いくつかの抗体では、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３でのように、ＶＨ領域のＨ１９位、Ｈ４４位、Ｈ７７位、Ｈ８３位、およびＨ８９位をそれぞれＫ、Ｒ、Ｔ、Ｋ、およびＭが占める。いくつかの抗体では、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂでのように、ＶＨ領域のＨ１９位、Ｈ４４位、Ｈ４９位、Ｈ７７位、Ｈ８３位、およびＨ８９位をそれぞれＫ、Ｒ、Ａ、Ｔ、Ｋ、およびＭが占める。いくつかの抗体では、ＶＬ領域のＬ４５位をＫが占める。いくつかの抗体では、ＶＬ領域のＬ２位をＩが占める。いくつかの抗体では、Ｈｕ６Ｃ１ＶＬｖ１でのように、ＶＬ領域のＬ２位およびＬ４５位の一方または両方をそれぞれＶおよびＫが占める。いくつかの抗体では、Ｈｕ６Ｃ１ＶＬｖ２でのように、ＶＬ領域のＬ２位およびＬ４５位の一方または両方をそれぞれＩおよびＫが占める。このようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、６Ｃ１マウスドナー抗体のＣＤＲ領域と同一または実質的に同一であり得る。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＣｈｏｔｈｉａとＫａｂａｔの複合体）によって定義され得るが、Ｋａｂａｔによって定義されるのが好ましい。
可変領域フレームワークの位置は、特に明記されない限りＫａｂａｔ番号付けに従う。他のこのようなバリアントは通常、少数（例えば、通常１個以下、２個以下、３個以下、５個以下、１０個以下、または１５個以下）の置換、欠失または挿入により例示されるＨｕ６Ｃ１抗体の配列と異なる。このような差は通常、フレームワーク内にみられるが、ＣＤＲにみられることもある。
ヒト化６Ｃ１での追加の変異として考えられるものは、可変領域フレームワーク中の追加の復帰変異である。ヒト化ｍＡｂにおいてＣＤＲと接していないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスｍＡｂまたは他のマウス抗体またはヒト抗体の対応する位置からのアミノ酸の置換を受け入れることができ、多くの潜在的なＣＤＲ接触残基もまた置換に適している。ＣＤＲ内のアミノ酸でさえ、例えば、可変領域フレームワークを供給するのに使用されるヒトアクセプター配列の対応する位置にみられる残基で改変され得る。さらに、代替のヒトアクセプター配列を、例えば重鎖および／または軽鎖に使用できる。異なるアクセプター配列を使用する場合、上で推奨した復帰変異の１つまたは複数は、復帰変異がなくても対応するドナー残基とアクセプター残基が既に同じであることを理由に実施されない。
好ましくは、Ｈｕ６Ｃ１バリアントにおける置換または復帰変異（保存的であるかどうかを問わず）は、ヒト化ｍＡｂの結合親和性にも力価にも、つまり、単量体ＴＴＲに結合するその能力に何ら実質的な影響を及ぼさない（例えば、バリアントヒト化６Ｃ１抗体の本発明の実施例に記載されるアッセイのいくつかまたは全部における力価は、マウスの６Ｃ１抗体の力価と実質的に同じである、つまり、実験誤差の範囲内にある）。
Ｄ．キメラ抗体およびベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体
本発明はさらに、キメラ型およびベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型の非ヒト抗体、具体的には実施例の６Ｃ１抗体を提供する。
キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域がヒト抗体の軽鎖定常領域および重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を実質的にまたは完全に保持しており、約３分の２がヒト配列である。
ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体はヒト化抗体の一種であり、いくつかの、通常は全部のＣＤＲおよび非ヒト抗体の非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部を保持しているが、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出残基（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）がヒト抗体配列の対応する位置からの残基に置き換わっている。その結果、抗体はＣＤＲが完全にまたは実質的に非ヒト抗体由来であり、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってさらにヒト抗体様にされる。本発明にはベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型の６Ｃ１抗体が含まれる。
Ｅ．ヒト抗体
以下に記載する様々な技術によって単量体ＴＴＲまたはそのフラグメント（例えば、ＴＴＲのアミノ酸残基８９～９７（配列番号４２））に対するヒト抗体が得られる。いくつかのヒト抗体は、特定のマウス抗体、例えば実施例に記載されるマウスモノクローナル抗体の１つと同じエピトープ特異性を有するように、上記の競合結合実験により、Ｗｉｎｔｅｒのファージディスプレイ法により選択される。ヒト抗体はまた、ＴＴＲのフラグメント、例えばＴＴＲのアミノ酸残基８９～９７のみを含むＴＴＲバリアントのみを標的抗原として使用することによって、および／またはＴＴＲバリアントの収集物、例えばＴＴＲのアミノ酸残基８９～９７内に様々な変異を有するＴＴＲバリアントに対する抗体をスクリーニングすることによって、特定のエピトープ特異性に関してスクリーニングされ得る。
ヒト抗体を作製する方法としては、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１－３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎら，米国特許第４，６３４，６６６号のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら，国際公開第９３／１２２２７号（１９９３）；米国特許第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号；同第５，８１４，３１８号；同第５，７８９，６５０号；同第５，７７０，４２９号；同第５，６６１，０１６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，５４５，８０６号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，国際公開第９１／１０７４１号（１９９１）を参照されたい）ならびにファージディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒら，国際公開第９１／１７２７１号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，国際公開第９２／０１０４７号；米国特許第５，８７７，２１８号；同第５，８７１，９０７号；同第５，８５８，６５７号；同第５，８３７，２４２号；同第５，７３３，７４３号；および同第５，５６５，３３２号を参照されたい）が挙げられる。
Ｆ．定常領域の選択
キメラ抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体またはヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部分に連結できる。定常領域の選択は部分的に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、抗体依存性細胞食作用および／または補体依存性細胞傷害を所望するかどうかに左右される。例えば、ヒト同位体のＩｇＧ１およびＩｇＧ３には補体依存性細胞傷害性があり、ヒトアイソタイプのＩｇＧ２およびＩｇＧ４にはない。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はまた、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも強力な細胞仲介性エフェクター機能を誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパであり得る。
軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端で１つまたは複数のアミノ酸、例えば重鎖のＣ末端リジンは、分子の一部または全部で欠損しているか、誘導体化されていてよい。定常領域に置換を施して、補体仲介性細胞傷害性またはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を低下または増大させたり（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら，米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏら，米国特許第５，８３４，５９７号；およびＬａｚａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４００５，２００６を参照されたい）、ヒトでの半減期を長くしたり（例えば、Ｈｉｎｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照されたい）してもよい。例示的な置換としては、抗体の半減期を増大させるための２５０位のＧｌｎおよび／または４２８位のＬｅｕ（この段落では定常領域にＥＵ番号付けを用いる）が挙げられる。２３４位、２３５位、２３６位および／または２３７位のいずれかまたは全部での置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低下させる（例えば、米国特許第６，６２４，８２１号を参照されたい）。エフェクター機能を低下させるために、ヒトＩｇＧ１の２３４位、２３５位および２３７位のアラニン置換を用いることができる。いくつかの抗体は、エフェクター機能を低下させるために、ヒトＩｇＧ１の２３４位、２３５位および２３７位にアラニン置換を有する。任意選択で、ヒトＩｇＧ２の２３４位、２３６位および／または２３７位をアラニンで置換し、２３５位をグルタミンで置換する（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）。いくつかの抗体では、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる２４１位、２６４位、２６５位、２７０位、２９６位、２９７位、３２２位、３２９位、および３３１位の１つまたは複数の位置での変異を用いる。いくつかの抗体では、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる３１８位、３２０位、および３２２位のうちの１つまたは複数の位置での変異を用いる。いくつかの抗体では、２３４位および／または２３５位をアラニンで置換し、かつ／または３２９位をグリシンで置換する。いくつかの抗体では、配列番号２７でのように、２３４位および２３５位をアラニンで置換する。いくつかの抗体では、アイソタイプはヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。
例示的ヒト軽鎖カッパ定常領域は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する。配列番号２８のＮ末端アルギニンが除去されていてもよく、その場合、軽鎖カッパ定常領域は配列番号２９のアミノ酸配列を有する。例示的ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を有する（Ｃ末端リジンの有無を問わず）。抗体は、２つの軽鎖と２つの重鎖とが含まれる四量体として、分離した重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖と軽鎖の成熟可変ドメインがスペーサーを介して連結される一本鎖抗体として発現させてもよい。
ヒト定常領域は個体間でアロタイプ変異およびイソアロタイプ変異を示し、つまり、定常領域は１つまたは複数の多型位置で個体によって異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が１つまたは複数の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点でアロタイプとは異なる。したがって、例えば、別の重鎖定常領域はＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプのものであり、配列番号２６のアミノ酸配列を有する。ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプの別の重鎖定常領域は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する（Ｃ末端リジンの有無を問わず）。ヒト定常領域への言及は、任意の天然のアロタイプまたは天然のアロタイプでの位置を占める残基の任意の順列を含む。
Ｇ．組換え抗体の発現
抗体発現細胞系（例えば、ハイブリドーマ）を用いてキメラ抗体およびヒト化抗体を作製する方法が多数知られている。例えば、周知の方法を用いて抗体の免疫グロブリン可変領域をクローン化し配列を決定できる。１つの方法では、ハイブリドーマ細胞から調製したｍＲＮＡを用いるＲＴ－ＰＣＲにより重鎖可変ＶＨ領域をクローン化する。翻訳開始コドンを含むＶＨ領域リーダーペプチドに対しては、５’プライマーおよびｇ２ｂ定常領域特異的３’プライマーとしてコンセンサスプライマーを用いる。例示的なプライマーはＳｃｈｅｎｋによる米国特許公開第２００５／０００９１５０号（以下「Ｓｃｈｅｎｋ」）に記載されている。別個に得た複数のクローンの配列を比較して、増幅の際に変化が導入されないことを確実にできる。ＶＨ領域の配列はまた、５’ＲＡＣＥ ＲＴ－ＰＣＲ法および３’ｇ２ｂ特異的プライマーによって得られるＶＨフラグメントの配列のシーケンシングによって、決定または確認することができる。
軽鎖可変ＶＬ領域は同じようにクローン化できる。１つの方法では、翻訳開始コドンを含むＶＬ領域にハイブリダイズするよう設計した５’プライマーおよびＶ－Ｊ連結領域下流のＣｋ領域に特異的な３’プライマーを用いるＶＬ領域の増幅のために、コンセンサスプライマーセットを設計する。第二の方法では、５’ＲＡＣＥ ＲＴ－ＰＣＲ法を用いてＶＬをコードするｃＤＮＡをクローン化する。例示的なプライマーは上記のＳｃｈｅｎｋに記載されている。次いで、クローン化した配列を、ヒト（またヒト以外の種）の定常領域をコードする配列と組み合わせる。ヒト定常領域をコードする例示的な配列としては、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする配列番号４６、ならびにヒトカッパ軽鎖定常領域をコードする配列番号４７および４８が挙げられる。
１つの方法では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれのＶＤＪ連結部またはＶＪ連結部の下流にスプライスドナー配列をコードするよう再設計し、哺乳動物発現ベクター中に、例えば重鎖はｐＣＭＶ－ｈγ１中に、軽鎖はｐＣＭＶ－Ｍｃｌ中にクローン化する。これらのベクターは、挿入した可変領域カセットの下流のエキソンフラグメントとしてヒトγ１およびＣｋ定常領域をコードする。配列を検証した後、重鎖および軽鎖の発現ベクターをＣＨＯ細胞中に共トランスフェクトしてキメラ抗体を産生させることができる。トランスフェクションから４８時間後に、馴化培地を収集し、ウエスタンブロット解析により抗体産生に関してアッセイするか、ＥＬＩＳＡにより抗原結合に関してアッセイする。キメラ抗体は上記のようにヒト化される。
キメラ抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体は通常、組換え発現によって生産される。組換えポリヌクレオチド構築物は通常、プロモーターなどの天然に結合している発現制御エレメントまたは異種の発現制御エレメントを含む、抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。発現制御配列は、真核宿主細胞または原核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトできるベクター中のプロモーター系であり得る。ベクターをしかるべき宿主内に組み込んだ後、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応抗体の収集および精製に適した条件下で宿主を維持する。
上記の発現ベクターは通常、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡと一体になった部分として宿主生物体内で複製できる。発現ベクターは通常、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を検出できるよう選択マーカー、例えばアンピシリン耐性またはヒグロマイシン耐性を含む。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、抗体、特に抗体フラグメントの発現に有用な原核宿主の１つである。酵母などの微生物も発現に有用である。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、所望に応じて発現制御配列、複製起点、終止配列などを有する適切なベクターを持つ酵母宿主の１つである。典型的なプロモーターとしては、３－ホスホグリセリン酸キナーゼをはじめとする糖分解酵素が挙げられる。誘導性の酵母プロモーターとしてはとりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素に由来するプロモーターが挙げられる。
免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドの発現に、哺乳動物細胞を用いることができる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照されたい。インタクトの異種タンパク質を分泌できる適切な宿主細胞系が多数開発されており、ＣＨＯ細胞系、様々なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞ならびに、Ｓｐ２／０およびＮＳ０を含む非抗体産生骨髄腫を含む。細胞は非ヒト細胞であってよい。これらの細胞に用いる発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））ならびに、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含み得る。発現制御配列は、内在遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターを含み得る。Ｃｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
あるいは、抗体コード配列を導入遺伝子に組み込んで、トランスジェニック動物のゲノム内に導入した後トランスジェニック動物の乳の中に発現させてもよい（例えば、米国特許第５，７４１，９５７号；米国特許第５，３０４，４８９号；および米国特許第５，８４９，９９２号を参照されたい）。適切な導入遺伝子としては、カゼインまたはベータラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に連結された、軽鎖および／または重鎖のコード配列が挙げられる。
目的とするＤＮＡセグメントを含むベクターは、細胞宿主の種類に応じた方法により宿主細胞に導入できる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく用いられ、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃、またはウイルスベースのトランスフェクションを用いることができる。哺乳動物細胞の形質転換に用いられる方法としては、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられる。トランスジェニック動物の作製には、導入遺伝子をマイクロインジェクションにより受精卵母細胞内に注入するか胚性幹細胞のゲノム内に組み込み、そのような細胞の核を除核卵母細胞内に移入できる。
抗体の重鎖および軽鎖をコードするベクター（１つまたは複数）を細胞培養物中に導入した後、細胞プールを無血清培地中で増殖力および産物の品質についてスクリーニングできる。次いで、最も産生量の多い細胞プールをＦＡＣＳベースの単一細胞クローン化に供して、モノクローナル系を作製できる。培地１Ｌ当たり７．５ｇ超に相当する、１日当たり５０ｐｇ／細胞または１００ｐｇ／細胞超の具体的な産生量を用いることができる。単一細胞クローンにより産生される抗体を濁度、ろ過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰ－ＳＥＣ、炭水化物－オリゴ糖マッピング、質量分析ならびに、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの結合アッセイについて試験できる。次いで、選択したクローンを複数のバイアルに貯蔵しのちの使用のために凍結保存する。
発現後、抗体をプロテインＡ捕捉、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該技術分野の標準的方法に従って精製できる（全般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照されたい）。
コドン最適化、プロモーターの選択、転写エレメントの選択、ターミネーターの選択、無血清単一細胞クローン化、細胞バンキング、コピー数増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、またはタンパク質力価の向上を含む、抗体の商業的生産の方法論を用いることができる（例えば、米国特許第５，７８６，４６４号；同第６，１１４，１４８号；同第６，０６３，５９８号；同第７，５６９，３３９号；国際公開第ＷＯ２００４／０５０８８４号；同第２００８／０１２１４２号；同第２００８／０１２１４２号；同第２００５／０１９４４２号；同第２００８／１０７３８８号；同第Ｗ０２００９／０２７４７１号；および米国特許第５，８８８，８０９号を参照されたい）。
Ｈ．抗体スクリーニングアッセイ
抗体に結合アッセイ、機能スクリーニング、ＴＴＲ沈着物による疾患の動物モデルを用いるスクリーニング、および診療試験を含むいくつかのスクリーニングを実施できる。結合アッセイでは、単量体ＴＴＲまたはそのフラグメントに対する特異的結合ならびに、任意選択で親和性およびエピトープ特異性を試験する。例えば、結合アッセイによって、天然のＴＴＲ四量体では埋没しており単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲでは露出しているエピトープである、ＴＴＲのアミノ酸残基８９～９７（配列番号４２）に結合する抗体をスクリーニングできる。抗体はまた、天然のＴＴＲの立体構造ではなく前原線維性の非天然の立体構造のＴＴＲおよびＴＴＲアミロイド原線維を結合する能力についてスクリーニングされる。例えば、抗体は、実施例その他に記載されるように、天然の四量体ＴＴＲの解離または脱凝集によって生じる単量体型ＴＴＲに結合する能力についてスクリーニングされ、かつ天然の四量体ＴＴＲに対してカウンタースクリーニングされる。同じように、抗体はまた、健常組織に対してではなくＴＴＲ媒介性アミロイドーシス組織に対するそれらの免疫反応性についてスクリーニングされる。このようなスクリーニングは場合によっては、６Ｃ１またはＩｇＧ１カッパアイソタイプの可変領域を有する抗体などの例示的抗体と競合して実施する。このようなアッセイでは、任意選択で抗体またはＴＴＲ標的を固定化する。
機能アッセイは、天然にＴＴＲを発現する細胞またはＴＴＲもしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞を含む細胞モデルで実施できる。適切な細胞としては、ＴＴＲアミロイド形成が認められる心組織または他の組織に由来する細胞が挙げられる。細胞は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲのレベル低下について（例えば、細胞の抽出物または上清のウエスタンブロッティングまたは免疫沈降によって）または単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲに起因する毒性低下に関してスクリーニングされる。例えば、抗体は、ＴＴＲの凝集を阻害もしくは軽減する能力、ＴＴＲ原線維形成を阻害もしくは軽減する能力、ＴＴＲ沈着物を減少させる能力、凝集したＴＴＲを除去する能力、またはＴＴＲの非毒性立体構造を安定化する能力について試験される。
その他の機能アッセイを溶液中で実施でき、例えば、溶液中の単量体ＴＴＲまたはミスフォールドＴＴＲ中間体を抗体と接触させたとき、抗体がＴＴＲ原線維形成を妨害または軽減することができるかどうかなどを試験できる。原線維の形成度は、例えば、温度制御ユニットを備えた紫外可視光分光光度計で４００ｎｍでの濁度測定によって調べることができる。チオフラビンＴもまた、アミロイド原線維の形成度の評価に用いることができる。例えば、５倍モル過剰のチオフラビンＴをＴＴＲ試料に加え、室温で３０分間放置した後、測定を実施できる。チオフラビンＴの蛍光は蛍光光度計を用いてモニターできる。米国特許出願公開第２０１４／００５６９０４号を参照されたい。
動物モデルを用いるスクリーニングでは、ＴＴＲまたはＴＴＲ沈着物の蓄積に関連するヒト疾患を模倣する動物モデルにおける徴候または症状を治療または予防する抗体の能力を試験する。このような疾患としては、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）、家族性アミロイドニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、および中枢神経系選択性アミロイドーシス（ＣＮＳＡ）などの各種ＴＴＲアミロイドーシスが挙げられる。モニターし得る適切な徴候または症状としては、消化管または心臓などの様々な組織でのアミロイド沈着物の存在および程度が挙げられる。アミロイド沈着物の減少度は、しかるべき対照、例えば対照抗体（例えば、アイソタイプが一致する対照抗体）、プラセボを投与した対照動物、または治療を一切実施していない対照動物中のＴＴＲアミロイド沈着物のレベルなどとの比較によって求めることができる。ＴＴＲアミロイドーシスに対する活性を試験するための例示的動物モデルは、内在性マウスＴｔｒ遺伝子座でのヌル変異と、家族性アミロイド性多発性ニューロパチーと関連するＶ３０Ｍ変異を含むヒト変異型ＴＴＲ遺伝子とを有するマウスモデルである。例えば、Ｋｏｈｎｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０（４）：１４９７－１５０８（１９９７）；ＣａｒｄｏｓｏおよびＳａｒａｉｖａ，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０（２）：２３４－２３９（２００６）を参照されたい。同様のモデルも存在し、家族性のＴＴＲアミロイドーシスの他のモデルおよび孤発性のＴＴＲアミロイドーシスのモデルがこれに含まれる。例えば、Ｔｅｎｇら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１（３）：３８５－３９６（２００１）；Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２６１－２８０のＩｔｏおよびＭａｅｄａ，Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ（２００９）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。トランスジェニック動物は、ヒトＴＴＲ導入遺伝子、例えばＴＴＲアミロイドーシスに関連する変異を有するＴＴＲ導入遺伝子または野生型ＴＴＲ導入遺伝子などを含み得る。動物モデルでの試験を容易にするため、動物モデルに適した定常領域を有するキメラ抗体を使用できる（例えば、ラットでの抗体の試験にはマウス－ラットキメラを使用し得る）。あるヒト化型の抗体は、対応するマウス抗体またはキメラ抗体がしかるべき動物モデルで効果的であり、かつそのヒト化抗体が同程度の結合親和性（例えば、１．５倍、２倍または３倍などの実験誤差の範囲内で）を有する場合、効果的であると結論付けることができる。
臨床試験では、ＴＴＲアミロイドーシスに関連する疾患を有するヒトを対象に安全性および有効性を試験する。
Ｉ．核酸
本発明はさらに、上記の重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸（例えば、配列番号４～９、１６、および１７）を提供する。このような核酸は任意選択で、シグナルペプチドをさらにコードし、定常領域に連結されたシグナルペプチド（例えば、配列番号５０（重鎖）および配列番号５２（軽鎖）によってそれぞれコードされ得る配列番号４９（重鎖）および配列番号５１（軽鎖）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド）とともに発現させることができる。コード配列を確実に発現させるため、核酸のコード配列はプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終止シグナルなどの制御配列と作動可能に連結され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、分離形態で存在しても、１つまたは複数のベクター中にクローン化されていてもよい。核酸は、例えば固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのＰＣＲによって合成できる。重鎖と軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内で、１つの連続する核酸として連結されていてもよく、または例えばそれぞれの発現ベクター中にクローン化されて、分離していてもよい。
Ｊ．コンジュゲート抗体
病原性形態のＴＴＲでは露出しているが、天然の四量体形態のＴＴＲでは露出していない抗原、例えばＴＴＲのアミノ酸残基８９～９７（配列番号４２）に特異的に結合するコンジュゲート抗体は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、もしくは原線維形態のＴＴＲの有無の検出；ＴＴＲアミロイドーシスと診断された患者の治療に使用される治療剤の有効性のモニタリングおよび評価；ＴＴＲの凝集の阻害もしくは軽減；ＴＴＲ原線維形成の阻害もしくは軽減；ＴＴＲ沈着物の減少もしくは除去；ＴＴＲの非毒性立体構造の安定化；または患者のＴＴＲアミロイドーシスの治療もしくは予防に有用である。例えば、このような抗体は別の治療部分、別のタンパク質、別の抗体、および／または検出可能な標識とコンジュゲートできる。国際公開第０３／０５７８３８号；米国特許第８，４５５，６２２号を参照されたい。
コンジュゲートされる治療部分は、患者の望ましくない病態または疾患、例えばＴＴＲアミロイドーシスを治療、対処、寛解、予防、または改善するために使用し得る任意の薬剤であり得る。治療部分としては、例えば、抗体の活性を促進または増強する免疫調節物質または任意の生物学的に活性な薬剤が挙げられる。免疫調節物質は、免疫応答の発現または維持を刺激または抑制する任意の薬剤であり得る。このような治療部分を単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲに特異的な抗体、例えば本明細書に記載される抗体にカップリングすると、カップリングされた治療部分は、非天然の病原性形態のＴＴＲに対して天然の四量体形態のＴＴＲを上回る特異的親和性を有するようになる。このため、コンジュゲート抗体の投与は病原性形態のＴＴＲを含む組織を直接標的とし、周囲の正常な健常組織への損傷は最小限である。これは、毒性が強すぎてそのものを投与できない治療部分に関して特に有用である。さらに、より少量の治療部分を使用できる。
適切な治療部分の例としては、ＴＴＲレベルを低下させる薬物、ＴＴＲの天然の四量体構造を安定化させる薬物、ＴＴＲの凝集を阻害する薬物、ＴＴＲ原線維もしくはＴＴＲアミロイドの形成を妨害する薬物、または細胞毒性を打ち消す薬物が挙げられる。例えば、ＡｌｍｅｉｄａおよびＳａｒａｉｖａ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８６：２８９１－２８９６（２０１２）；Ｓａｒａｉｖａ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４９８：２０１－２０３（２００１）；Ａｎｄｏら，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ８：３１（２０１３）；ＲｕｂｅｒｇおよびＢｅｒｋ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２６：１２８６－１３００（２０１２）；ならびにＪｏｈｎｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２１（２－３）：１８５－２０３（２０１２）を参照されたい。例えば、抗体をタファミジス、ジフルニサル、ＡＬＮ－ＴＴＲ０１、ＡＬＮＴＴＲ０２、ＩＳＩＳ－ＴＴＲＲｘ、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、Ｄｏｘｙ－ＴＵＤＣＡ、エピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）、クルクミンまたはレスベラトロール（３，５，４’－トリヒドロキシスチルベン）にコンジュゲートできる。他の代表的な治療部分としては、ＴＴＲアミロイドーシスまたはＴＴＲアミロイドーシスの症状の治療、管理、または寛解に有用であることが知られている他の薬剤が挙げられる。例えば、よくみられるＴＴＲアミロイドーシスの臨床症状およびその症状の治療に使用される典型的な薬剤については、Ａｎｄｏら，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ８：３１（２０１３）を参照されたい。
抗体はまた、他のタンパク質とカップリングできる。例えば、抗体はフィノマーとカップリングできる。フィノマーは、ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに由来する小さい結合タンパク質（例えば、７ｋＤａ）である。それらは安定かつ可溶性であり、システイン残基およびジスルフィド結合を欠くこともある。フィノマーは、抗体と同じ親和性および特異性で標的分子に結合するよう設計できる。フィノマーは、抗体をベースとする多特異性融合タンパク質の作製に適している。例えば、フィノマーを抗体のＮ末端および／またはＣ末端に融合して、異なる構造を有する二特異性ＦｙｎｏｍＡｂおよび三特異性ＦｙｎｏｍＡｂを作製できる。最適な特性を有するフィノマーを効率的に選択できるＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ、および細胞ベースのアッセイを用いるスクリーニング技術によりフィノマーライブラリーを用いて、フィノマーを選択できる。フィノマーの例は、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３１９６－３２０４（２００７）；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０：５７－６８（２００７）；Ｓｃｈｌａｔｔｅｒら，ＭＡｂｓ．４：４９７－５０８（２０１１）；Ｂａｎｎｅｒら，Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６９（Ｐｔ６）：１１２４－１１３７（２０１３）；およびＢｒａｃｋら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３：２０３０－２０３９（２０１４）に開示されている。
本明細書に開示される抗体はまた、１つまたは複数の他の抗体にカップリングまたはコンジュゲートできる（それにより例えば、抗体ヘテロコンジュゲートを作製する）。そのような他の抗体は、ＴＴＲもしくはその一部分の中の異なるエピトープに結合するか、異なる標的抗原に結合できる。
抗体はまた、検出可能な標識とカップリングできる。このような抗体は、例えば、ＴＴＲアミロイドーシスの診断、ＴＴＲアミロイドーシスの進行のモニタリング、および／または治療効果の評価に用いることができる。このような抗体は、ＴＴＲアミロイドーシスに罹患しているか罹患しやすい対象中で、またはそのような対象から採取したしかるべき生体試料で上記のような決定を実施するのに特に有用である。ヒト化６Ｃ１抗体にカップリングまたは連結し得る代表的な検出可能な標識としては、様々な酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；蛍光物質、例えばウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの発光物質；放射性物質、例えばイットリウム９０（９０Ｙ）、放射性銀－１１１、放射性銀－１９９、ビスマス２１３、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎ；様々な陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放出金属；非放射性常磁性金属イオン；ならびに放射標識した分子または特定の放射性同位元素にコンジュゲートした分子が挙げられる。
抗体への放射性同位元素との連結は、従来の二官能性キレートを用いて実施し得る。放射性銀－１１１および放射性銀－１９９の連結には、硫黄系リンカーを用い得る。Ｈａｚｒａら，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４－２５：１－７（１９９４）を参照されたい。銀放射性同位元素の連結は、免疫グロブリンをアスコルビン酸で還元することを含み得る。１１１Ｉｎおよび９０Ｙなどの放射性同位元素には、イブリツモマブチウキセタンを用いることができ、イブリツモマブチウキセタンは上記の同位体と反応して、それぞれ１１１Ｉｎ－イブリツモマブチウキセタンおよび９０Ｙ－イブリツモマブチウキセタンを形成する。Ｗｉｔｚｉｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ９１－Ｓ９５（２００１）を参照されたい。
治療部分、その他のタンパク質、その他の抗体、および／または検出可能な標識は、当該技術分野で公知の技術を用いてマウス抗体、キメラ抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、またはヒト化６Ｃ１に直接カップリングまたはコンジュゲートしても、介在物（例えば、リンカー）を介して間接的にカップリングまたはコンジュゲートしてもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編），ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）のＡｒｎｏｎら，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），ｐｐ．６２３－５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）のＴｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編），ｐｐ．３０３－１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；およびＴｈｏｒｐｅら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８（１９８２）を参照されたい。適切なリンカーとしては、例えば、切断可能なリンカーおよび切断可能でないリンカーが挙げられる。酸性または還元性の条件下で、特定のプロテアーゼに曝露したとき、またはその他の定められた条件下で、カップリングした治療部分、タンパク質、抗体、および／または検出可能な標識を放出する様々なリンカーを用いることができる。
Ｖ．治療応用
上記の抗体は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）により少なくとも部分的に、および特に単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲにより媒介される疾患を有するか、そのような疾患のリスクのある患者における疾患の治療または予防に使用できる。実施にあたって機序を理解する必要はないが、上記の抗体を用いるＴＴＲアミロイドーシスの治療に以下の機序：ＴＴＲ凝集および原線維形成の抗体介在性阻害、ＴＴＲの非毒性立体構造（例えば、テトラマー形態）の抗体介在性安定化、または凝集ＴＴＲ、オリゴマーＴＴＲ、もしくは単量体ＴＴＲの抗体介在性除去のいずれかまたは全部が寄与するものと考えられる。抗体－薬物コンジュゲートは、コンジュゲート部分によって決まるさらなる作用機序を有し得る。
抗体は有効なレジメン、つまり、発症を遅らせ、重症度を軽減し、さらなる増悪を抑制し、かつ／または治療する障害の少なくとも１つの徴候もしくは症状を寛解する用量、投与経路および投与頻度で、投与される。患者が既に障害に罹患している場合、そのレジメンを治療上有効なレジメンと呼ぶことができる。患者が一般集団よりも障害のリスクが高いが未だ症状を認めない場合、そのレジメンを予防上有効なレジメンと呼ぶことができる。いくつかの場合には、治療有効性または予防有効性が、個々の患者において既存対照または同一患者での過去の経験と比較して観察され得る。別の場合には、治療有効性または予防有効性は、前臨床試験または臨床試験で、治療を実施した患者の集団と未治療患者の対照集団とを比較して明らかにできる。
投与頻度は、様々な因子のなかでもとりわけ、循環血中の抗体の半減期、患者の状態および投与経路によって決まる。頻度は、患者の状態または治療する障害の進行度の変化に応じて、連日、週１回、月１回、年４回、または不規則な間隔であり得る。静脈内投与の例示的な頻度は、治療の連続的な原因にわたって週１回～年４回であるが、より多いまたは少ない頻度も可能である。皮下投与では、例示的な投与頻度は連日～月１回であるが、より多いまたは少ない投与頻度も可能である。
投与回数は、障害が急性であるのか慢性であるのか、および障害の治療に対する応答によって決まる。急性障害または慢性障害の急性増悪には、多くの場合１～１０回で十分である。急性障害または慢性障害の急性増悪には、任意選択で分割形態での、単回ボーラス投与で十分なこともある。急性障害または急性増悪の再発に対しては治療を反復し得る。慢性障害には、抗体を少なくとも１年間、５年間または１０年間、ないし患者の生涯にわたって定期的な間隔で、例えば週１回、隔週、月１回、年４回、６か月に１回、投与し得る。
ＶＩ．医薬組成物および使用方法
本明細書では、トランスサイレチン（ＴＴＲ）により少なくとも部分的に、および特に単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲにより媒介される疾患または病態（例えば、ＴＴＲアミロイドーシス）を診断、モニタリング、治療または予防するいくつかの方法が提供される。このような疾患の例としては、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、家族性アミロイドニューロパチー（ＦＡＰ）、または中枢神経系選択性アミロイドーシス（ＣＮＳＡ）などの家族性ＴＴＲアミロイドーシス、および老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）または老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）などの孤発性ＴＴＲアミロイドーシスが挙げられる。上記の抗体は、このような方法で使用する医薬組成物中に組み込まれ得る。一般に、抗体または抗体を含有する医薬組成物が、それを必要とする対象に投与される。治療に適する患者としては、ＴＴＲアミロイドーシスのリスクはあるが症状を認めない個体ならびに、現時点で症状を呈する患者が挙げられる。患者によっては、ＴＴＲアミロイドーシスの前駆段階の間に治療され得る。
医薬組成物は、ＴＴＲアミロイドーシスの既知の遺伝的リスクのある個体に予防的に投与できる。このような個体としては、そのような疾患を経験した親類をもつ個体および、本明細書に提供される診断方法の使用を含む遺伝子マーカーまたは生化学マーカー（例えば、ＴＴＲアミロイドーシスに関連するＴＴＲ中の変異）の分析によってリスクが決定される個体が挙げられる。例えば、ＴＴＲをコードする遺伝子中に、ＴＴＲアミロイドーシスに関与する１００種類を超える変異がある。例えば、米国特許出願公開第２０１４／００５６９０４号；Ｓａｒａｉｖａ，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１７（６）：４９３－５０３（２００１）；ＤａｍａｓおよびＳａｒａｉｖａ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３０：２９０－２９９；ＤｗｕｌｅｔおよびＢｅｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１４：６５７－６６２（１９８３）を参照されたい。
ＴＴＲアミロイドーシスに罹患している個体は、（１）特に心不全に関わる、神経障害性疾患の家族歴；（２）原因不明の神経因性疼痛または進行性感覚障害；（３）原因が明らかでなく、特に両側性で外科的開放を必要とする手根管症候群；（４）原因不明の消化管運動障害または自律神経機能不全（例えば、勃起不全、起立性低血圧症、神経因性膀胱）；（５）高血圧がみられず心室壁肥厚を特徴とする心疾患；（６）原因が不明であり、特に心肥大を伴う高度房室ブロック；および（６）綿花状の硝子体封入体の１つまたは複数を含むＴＴＲアミロイドーシスの臨床症状から認識されることもある。Ａｎｄｏら，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ８：３１（２０１３）を参照されたい。しかし、ＴＴＲアミロイドーシスの確定診断は通常、標的器官の生検を頼りにし、次いで、析出組織をアミロイド特異的色素であるコンゴー赤で組織学的に染色する。検査結果がアミロイド陽性である場合、次いでＴＴＲの免疫組織化学染色を実施してアミロイド形成の原因である前駆体タンパク質が実際にＴＴＲであることを確認する。家族性の疾患では、ＴＴＲをコードする遺伝子に変異があることを次いで明らかにしてから診断を下す必要がある。
対象の特定は、臨床現場で実施しても、あるいはそれ以外の場所で、例えば対象の自宅で、例えば対象自身が自己検査キットを用いて実施してもよい。例えば、末梢性ニューロパチー（感覚性ニューロパチーおよび運動性ニューロパチー）、自律神経性ニューロパチー、胃腸障害、心筋症、腎障害または眼内沈着などの様々な症状に基づいて対象を特定できる。Ａｎｄｏら，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ８：３１（２０１３）を参照されたい。対象はまた、実施例に開示されるように、対照試料に比して対象からの血漿試料中の非天然形態のＴＴＲのレベルが上昇していることによっても特定できる。
家族歴、遺伝子検査、または医学的スクリーニングによってＴＴＲアミロイドーシスが裏付けられると、任意の年齢（例えば、２０歳、３０歳、４０歳、５０歳、６０歳または７０歳）で治療を開始し得る。治療は通常、一定期間にわたる反復投与を必要とし、治療剤（例えば、アミノ酸残基８９～９７を含む短縮形態のＴＴＲ）に対する抗体または活性化されたＴ細胞もしくはＢ細胞の応答を経時的にアッセイすることによってモニターできる。応答が低下した場合、追加投与が適応される。
予防応用では、疾患（例えば、ＴＴＲアミロイドーシス）に罹患しやすいか、または疾患のリスクがある対象に、疾患のリスクを軽減する、疾患の重症度を軽減する、または疾患の少なくとも１つの徴候または症状の発現を遅らせるために有効なレジメン（投与の用量、頻度および経路）で、抗体またはその医薬組成物を投与する。治療応用では、疾患（例えば、ＴＴＲアミロイドーシス）が疑われるか、または既に疾患に罹患している対象に、疾患の少なくとも１つの徴候または症状のさらなる増悪を寛解するか少なくともそれを抑制するために有効なレジメン（投与の用量、頻度および経路）で、抗体または抗体を誘導する免疫原を投与する。
レジメンは、治療を実施した個々の対象が、本明細書に開示される方法による治療を実施していない同等の対象からなる対照集団での平均転帰よりも良好な転帰を達成した場合、あるいはあるレジメンで治療を実施した対象が、対照臨床試験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相試験）での対照対象または動物モデルよりもｐ＜０．０５もしくはｐ＜０．０１、場合によってはｐ＜０．００１のレベルで良好な転帰を示した場合に、治療上または予防上有効であると見なされる。
ある抗体の有効なレジメンは、例えば、ＴＴＲ蓄積に関わる病態を有するかそのリスクのある対象中のＴＴＲ凝集を阻害もしくは軽減する；ＴＴＲ蓄積に関わる病態を有するかそのリスクのある対象中のＴＴＲ原線維形成を阻害もしくは軽減する；ＴＴＲ蓄積に関わる病態を有するかそのリスクのある対象中のＴＴＲ沈着物もしくは凝集ＴＴＲを減少もしくは除去する；ＴＴＲ蓄積に関わる病態を有するかそのリスクのある対象中のＴＴＲの非毒性立体構造を安定化する；ＴＴＲ蓄積に関わる病態を有するかそのリスクのある対象中のＴＴＲ凝集体、原線維もしくは沈着物の毒性作用を阻害する；アミロイド蓄積を有することが疑われる組織中へのＴＴＲアミロイド蓄積の有無を診断する；抗体投与後の対象中の結合抗体の有無を検出することにより対象中のＴＴＲ沈着物レベルを決定する；対象中の単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、もしくは原線維形態のＴＴＲの存在を検出する；ＴＴＲアミロイドーシスと診断された患者を治療するために使用される治療剤の有効性をモニタリングおよび評価する；対象中でＴＴＲに対する抗体を含む免疫応答を誘導する；対象中でＴＴＲアミロイド蓄積に関わる病態の発症を遅延する；または患者中のＴＴＲアミロイドーシスを治療もしくは予防するために使用できる。
有効量は、多数の異なる因子、例えば投与手段、標的部位、対象の生理的状態、対象がヒトであるのか動物であるのか、投与する他の薬剤、および治療が予防的であるのか治療的であるのかなどによって異なる。
抗体の例示的な用量範囲は、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは０．５～５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）または固定用量として１０～１５００ｍｇであり得る。用量は、様々な因子のなかでもとりわけ、患者の状態および、もしあれば以前の治療に対する応答、治療が予防的であるのか治療的であるのか、および障害が急性であるのか慢性であるのかによって決まる。
抗体は上記の用量で連日、隔日、週１回、隔週、月１回、年４回、または経験的解析によって定められる他の任意の計画に従って投与し得る。例示的な治療は、例えば少なくとも６か月間の長期間にわたる反復投与を必要とする。追加の例示的な治療レジメンは、２週間に１回、１か月に１回または３～６か月に１回の投与を必要とする。
抗体は末梢経路により投与できる。投与経路としては、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内が挙げられる。抗体の投与経路は、静脈内または皮下であり得る。静脈内投与は、例えば３０～９０分などの時間にわたる注入によるものであり得る。この種の注射は、腕または脚の筋肉でもっとも典型的に実施される。いくつかの方法では、薬剤を沈着物が蓄積した特定の組織の中に直接注射し、例えば頭蓋内に注射する。
非経口投与用の医薬組成物は、無菌で実質的に等張（２５０～３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）であり得、ＧＭＰ条件下で製造できる。医薬組成物は、単位用量形態（すなわち、単回投与のための用量）で提供できる。医薬組成物は、１つまたは複数の生理的に許容される担体、希釈剤、補形剤または補助剤を用いて製剤化できる。製剤は、選択する投与経路によって決まる。注射用に、抗体を水溶液中、例えばハンクス液、リンガー溶液、生理食塩水または酢酸塩緩衝液などの生理的に適合する緩衝液中で製剤化できる（注射部位の不快感を軽減するため）。溶液は、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用剤を含有し得る。あるいは、抗体は、使用前に適切な媒体、例えば無菌無発熱物質水で構築するための凍結乾燥形態であり得る。
レジメンは、治療される疾患の治療または予防に効果のある別の薬剤と組み合わせて投与され得る。このような薬剤としては、ＴＴＲの発現を阻害するｓｉＲＮＡまたは四量体形態のＴＴＲの安定剤であるＶｙｎｄａｑｅｌが挙げられる。
治療後に、対象の状態を評価して、そのような治療の進行状況または有効性を決定できる。このような方法は好ましくは、ＴＴＲアミロイドのレベルまたは非天然形態のＴＴＲのレベルの変化を検査する。例えば、ＴＴＲアミロイドのレベルを評価して、治療前の同等の状況下での対象のＴＴＲアミロイドのレベルに比する改善を決定し得る。対象のＴＴＲアミロイドのレベルもまた同等の状況下の対照集団と比較できる。対照集団は、（様々な対照対象のなかでもとりわけ）同じように罹患した未治療対象または正常な未治療対象であり得る。同じように罹患した未治療対象に比して改善がみられる場合または諸レベルが未治療の正常対象のレベルに近づいているか到達している場合、それは治療に対する正の応答を示す。
ＴＴＲアミロイドのレベルは、イメージング技術を含む多数の方法によって測定できる。適切なイメージング技術の例としては、放射標識したそのフラグメントのＴＴＲ、ＴＴＲ抗体またはそのフラグメント、コンゴー赤系のアミロイド造影剤、例えばＰＩＢ（米国特許出願公開第２０１１／０００８２５５号）、アミロイドイメージングペプチドｐ３１（Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ－ｉｍａｇｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ，ｐ３１，ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｗａｌｌら，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１５７３，２０１１ ＩＳＮＭ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ）など、およびその他のＰＥＴ標識を用いるＰＥＴスキャンが挙げられる。非天然形態のＴＴＲのレベルは、例えば、実施例に記載されるように、対象からの血漿試料または生検試料に本明細書に開示される抗体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットまたはＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプレートアッセイを実施し、対照試料と比較することによって測定できる。
Ａ．診断およびモニタリングの方法
ＴＴＲ沈着または病原性形態のＴＴＲ（例えば、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態または原線維形態のＴＴＲ）に関連する疾患に罹患しているか罹患しやすい患者中でＴＴＲに対する免疫応答を検出する方法も提供される。この方法は、本明細書に提供される薬剤による治療的処置または予防的処置の経過をモニターするのに使用できる。受動免疫後の抗体プロファイルは通常、抗体濃度の直後のピークとそれに続く指数関数的減衰を示す。さらなる投与を実施しなければ、投与した抗体の半減期に応じて数日～数か月以内に減衰が治療前のレベルに近づく。例えば、いくつかのヒト抗体の半減期は２０日程度である。
いくつかの方法では、投与前に対象中のＴＴＲに対する抗体のベースライン値を測定し、投与直後に２回目の測定を実施して抗体レベルのピーク値を求め、かつ間隔を空けてさらに１回または複数回の測定を実施して抗体レベルの減衰をモニターする。抗体レベルがベースライン値またはピーク値とベースライン値の差の所定の割合（例えば、５０％、２５％または１０％）に低下したとき、追加の用量抗体を投与する。いくつかの方法では、ピーク値またはその後に測定したレベルからバックグラウンドを減じた値を、予め求めた参照レベルと比較して、他の対象に有益な予防処置または治療処置のレジメンを設定する。測定した抗体レベルが参照レベルよりも有意に低い（例えば、治療から利益を得る対象の集団での参照値の平均マイナス１または、好ましくはマイナス２標準偏差よりも低い）場合、追加の用量の抗体の投与が適応される。
対象中の単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲを、例えば、対象由来の試料中のＴＴＲアミロイドまたは病原性形態のＴＴＲ（例えば、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲ）を測定することによって、または対象中のＴＴＲのｉｎ ｖｉｖｏイメージングによって検出する方法も提供される。このような方法は、上記の病原性形態のＴＴＲ（例えば、ＴＴＲアミロイドーシス）に関連する疾患、またはそれに対する易罹患性の診断または診断の確定に有用である。この方法はまた、無症候性の対象に用いることができる。単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲの存在は、今後症候性の疾患に罹患しやすいことを示す。この方法はまた、既にＴＴＲアミロイドーシスであると診断されている対象における疾患の進行および／または治療に対する応答をモニタリングするのに有用である。
ＴＴＲアミロイドーシスを有する、有することが疑われる、または有するリスクのある対象から採取した生体試料を、本明細書に開示される抗体と接触させて、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲの有無を評価することができる。例えば、上記の対象中の単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲのレベルを健常対象中のものと比較し得る。あるいは、疾患に対する治療を受けている上記の対象中のＴＴＲアミロイドまたは病原性形態のＴＴＲ（例えば、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲ）のレベルを、ＴＴＲアミロイドーシスに対する治療を実施していない対象のものと比較してもよい。いくつかのこのような検査は、上記の対象から採取した組織の生検を含む。ＥＬＩＳＡアッセイもまた、例えば液体試料中の単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲのレベルを評価するのに有用であり得る。いくつかのこのようなＥＬＩＳＡアッセイは、正常な四量体形態のＴＴＲと比べて単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲを優先的に結合する抗ＴＴＲ抗体を含む。
ｉｎ ｖｉｖｏイメージング法は、試薬、例えば対象の単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲに結合する抗体を投与した後、その試薬が結合してからそれを検出することによって実施できる。このような抗体は通常、ＴＴＲの残基８９～９７内のエピトープに結合する。必要に応じて、完全長の定常領域を欠く抗体フラグメント、例えばＦａｂを使用することによって除去応答を回避できる。いくつかの方法では、同じ抗体が治療試薬および診断試薬の両方の役割を果たし得る。
診断試薬は、対象の体内への静脈内注射によって、または妥当であると考えられるその他の経路により投与できる。試薬の用量は、治療方法のものと同じ範囲内に収めるべきである。通常、試薬を標識するが、いくつかの方法では、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲに対する親和性を有する一次試薬は非標識であり、二次標識剤を用いて一次試薬に結合させる。標識の選択は検出手段によって決まる。例えば、蛍光標識は光学的検出に適している。常磁性標識の使用は、外科的介入のない断層撮影による検出に適している。放射性標識もまた、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを用いて検出され得る。
診断は、標識部位の数、大きさ、および／または強度を対応するベースライン値と比較することによって実施する。ベースライン値は、未罹患の個体の集団での平均レベルであり得る。ベースライン値はまた、同じ対象で以前に求めたレベルであり得る。例えば、治療開始前に対象におけるベースライン値を求め、測定した値をその後にベースライン値と比較することができる。値がベースライン値に比べ低下していることは一般に、治療に対する正の応答を示す。
ＩＸ．キット
本発明はさらに、本明細書に開示されるヒト化６Ｃ１抗体と、それに関連する材料、例えば使用指示書（例えば、添付文書）とを含む、キット（例えば、容器）を提供する。使用指示書は、例えば、抗体および任意選択で１つまたは複数の追加の薬剤の投与に関する指示を含み得る。抗体の容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数用量包装）、または小単位用量であり得る。
添付文書は、治療用製品の市販の包装品に慣例的に含まれ、そのような治療用製品の使用に係る適応症、用法、用量、投与、禁忌および／または注意事項に関する情報を含む指示書を指す。
キットはまた、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびブドウ糖溶液を含む、第二の容器を含み得る。それはまた、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む商業上の観点および使用者の観点から望ましい他の材料を含み得る。
Ｘ．その他の応用
抗体は、臨床診断、臨床治療または研究において単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、もしくは原線維形態のトランスサイレチン（ＴＴＲ）またはそのフラグメントを検出するのに用いることができる。例えば、抗体を用いて、生体試料がＴＴＲアミロイド沈着物を含むことの指標として生体試料中の単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲの存在を検出できる。生体試料への抗体の結合を、対照試料への抗体の結合と比較できる。対照試料と生体試料は、同じ組織を起源とする細胞を含み得る。対照試料と生体試料は、同じ個体または異なる個体から同じ機会または異なる機会に採取され得る。必要に応じて、複数の生体試料と複数の対照試料を複数の機会に評価して、試料間の差とは無関係のランダムな変動から保護する。次いで、生体試料（１つまたは複数）と対照試料（１つまたは複数）とを直接比較して、生体試料（１つまたは複数）への抗体の結合（すなわち、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲの存在）が対照試料（１つまたは複数）への抗体の結合に比して増大しているのか、減少しているのか、同じであるのかを決定できる。生体試料（１つまたは複数）への抗体の結合が対照試料（１つまたは複数）に比して増大していることは、生体試料（１つまたは複数）中に単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲが存在することを示す。いくつかの場合には、抗体結合の増大は統計的に有意である。任意選択で、生体試料への抗体の結合は、対照試料への抗体の結合の少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍高い。
さらに、抗体を用いて、ＴＴＲアミロイドーシスと診断された患者を治療するために使用される治療剤の有効性をモニタリングおよび評価するために生体試料中の単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲの有無を検出できる。治療剤で治療を開始する前に、ＴＴＲアミロイドーシスと診断された患者からの生体試料を評価して試料への抗体の結合のベースライン値（すなわち、試料中に単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲが存在するときのベースライン値）を設定する。いくつかの場合には、患者からの複数の生体試料を複数の機会に評価して、ベースライン値および治療とは無関係のランダムな変動の測定値の両方を設定する。次いで、治療剤をレジメンに従って投与する。レジメンは、一定期間にわたる薬剤の反復投与を含み得る。任意選択で、患者からの複数の生体試料中の抗体の結合（すなわち、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲの存在）を複数の機会に評価して、ランダムな変動の測定を行い免疫療法に対する応答の傾向を明らかにする。生体試料への抗体結合の様々な評価を次いで比較する。評価を２回のみ実施する場合、２回の評価を直接比較して、抗体結合（すなわち、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態または原線維形態のＴＴＲの存在）が２回の評価の間で増大したのか、減少したのか、同じままなのかを決定できる。評価を３回以上実施する場合、治療剤で治療する前に始まり治療過程を進行する経時変化として測定値を解析できる。生体試料への抗体の結合（すなわち、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のＴＴＲの存在）が減少した患者では、患者におけるＴＴＲアミロイドーシスを治療するのに治療剤が効果的であると結論付けることができる。抗体結合の減少は統計的に有意であり得る。任意選択で、結合は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少する。抗体結合の評価は、ＴＴＲアミロイドーシスの他の徴候および症状の評価とともに実施できる。
抗体はまた、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、もしくは原線維形態のＴＴＲまたはそのフラグメントを検出する際の研究用の研究試薬として使用できる。このような用途では、抗体は蛍光分子、スピン標識分子、酵素、または放射性同位元素で標識され、検出アッセイを実施するのに必要な全試薬を収納したキットの形態で提供され得る。抗体はまた、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態もしくは原線維形態のＴＴＲまたは単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、もしくは原線維形態のＴＴＲ結合パートナーを精製するのに使用できる。
抗体はまた、生体試料のＴＴＲの凝集を阻害もしくは軽減する、ＴＴＲ原線維形成を阻害もしくは軽減する、ＴＴＲ沈着物もしくはＴＴＲ凝集体を減少もしくは除去する、またはＴＴＲの非毒性立体構造を安定化するために使用できる。生体試料は、例えば血液、血清、血漿、または組織（例えば、心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管由来の組織）を含み得る。いくつかの場合には、ＴＴＲ凝集、ＴＴＲ原線維形成、またはＴＴＲ沈着は少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％（例えば、１０％～７５％または３０％～７０％）阻害または軽減される。原線維形成を検出するアッセイについては本明細書の別の箇所に記載する。米国特許出願公開第２０１４／００５６９０４号も参照されたい。
これまでに、またはのちに引用される特許出願、ウェブサイト、その他の刊行物、アクセッション番号などはいずれも、個々の項目の全体があらゆる目的で参照により組み込まれることが具体的かつ個別に明記された場合と同様に組み込まれる。ある配列の様々なバージョンを様々な時点のアクセッション番号と関連付ける場合、本願の有効出願日の時点のアクセッション番号と関連するバージョンとする。有効出願日は、該当するアクセッション番号に関して実際の出願日または優先出願の出願日のうち早い方を意味する。同じように、刊行物、ウェブサイトなどの公開時期が版によって異なる場合、特に明記されない限り、本願の有効出願日の時点で最新版のものとする。特に明記されない限り、本発明の任意の特徴、段階、要素、実施形態、または態様を他の任意のものと組み合わせて用いることができる。ここまで、本発明を明確に示し理解させることを目的に、説明および具体例によってある程度詳細に記載してきたが、添付の「特許請求の範囲」の範囲内で何らかの変更および修正を施し得ることは明らかであろう。
実施例
実施例１．ｍｉｓ－ＴＴＲモノクローナル抗体の同定
材料および方法（ａ～ｄ）に記載する通りに単量体形態、ミスフォールド形態、原線維形態または凝集形態のＴＴＲ（ｍｉｓ－ＴＴＲ）に対する立体構造特異的モノクローナル抗体を作製し、スクリーニングし、発現させ、精製した。ｍｉｓ－ＴＴＲモノクローナル抗体を作製するため、ヒト四量体ＴＴＲの結晶構造を調べて、四量体では埋没しているが、四量体を単量体サブユニットに解離すると露出するタンパク質の領域を明らかにした。特定された領域は、ＴＴＲのＦ鎖内に位置し四量体タンパク質の二量体界面で隔離されている残基８９～９７（ＥＨＡＥＶＶＦＴＡ）（配列番号４２）であった。タンパク質データベースのＢＬＡＳＴ検索を実施したところ、この配列を有する他のヒトタンパク質は見出されなかった。
この配列を含むペプチド（ｇｇＥＨＡＥＶＶＦＴＡｇｇｋｇ）（配列番号４３）を合成した。大文字はＴＴＲの残基８９～９７を表す。小文字は、抗原性ペプチドの溶解度を増大させ、内部配列として９アミノ酸のフラグメントを確立するために付加した追加のリンカー残基を表す。このペプチドをポリ－リジン樹状コアに連結して、リジン残基のコアを含み複数の分岐がＴＴＲ８９－９７ペプチドに連結された多抗原性ペプチド免疫原（ＴＴＲ－ＭＡＰ）を作製した。表２に記載する抗体はＴＴＲ－ＭＡＰに対して作製したものである。
この多抗原性ペプチドに加えて、Ｎ末端およびＣ末端のシステイン残基を介して同様のＴＴＲ８９－９７ペプチド（Ａｃ－ｃｇｇＥＨＡＥＶＶＦＴＡ－アミド（配列番号４４）およびＡｃ－ＥＨＡＥＶＶＦＴＡｃｇｇ－アミド）（配列番号４５）をキーホールリンペットヘモシアニンに共有結合させることにより、同じＴＴＲフラグメントを含む別の免疫原を２つ作製した（ＴＴＲ８９－９７－Ｎ－ＫＬＨおよびＴＴＲ８９－９７－Ｃ－ＫＬＨ）。
抗体を作製し、スクリーニングし、発現させ、精製した後、表２に示すように、組換えヒトＴＴＲ Ｆ８７Ｍ／Ｌ１１０Ｍに対する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、リードｍｉｓ－ＴＴＲ抗体の詳細な結合動態パラメータ（結合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、および結合親和性定数（ＫＤ））を求めた。抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の抗マウスキットに添付された指示書に従って、アミンカップリングによりセンサーチップＣ５（デキストラン鎖を欠く）上に固定化し、ｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂを、分析物の結合最大値が確実に３０～５０ＲＵとなるレベルまで捕捉した。様々な濃度の分析物（組換えヒトＴＴＲ Ｆ８７Ｍ／Ｌ１１０Ｍ）を、３倍希釈でランニング緩衝液（ＨＢＳ＋０．０５％Ｐ－２０、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中３０μｌ／分にて捕捉したリガンド上を通過させた。各濃度について、会合時により高濃度の分析物が平衡状態に達するような、かつ解離時にシグナルの少なくとも１０％が減衰するような時間の間、反応を進行させた。少なくとも１種類の濃度（最高濃度でも最低濃度でもない）を二重反復で実施した。分析物の濃度範囲は、予備実験に基づき少なくともＫＤの１０倍～ＫＤの１０分の１に渡るよう選択した。
リードｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂのＳＰＲ解析の結果を下の表２に示す。
Figure 0007219928000002
実施例２．ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体のＴＴＲ抗原への結合
４種類のリードｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂ（９Ｄ５、１４Ｇ８、６Ｃ１および５Ａ１）を０．３１～２．５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、コーティング抗原としてｐＨ４．０処理ＴＴＲ（ｐＨ４－ＴＴＲ）および天然ＴＴＲの両方を用いるＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＴＴＲ抗原の調製およびＥＬＩＳＡのプロトコルについては、材料および方法（ｅ～ｇ）に別途記載する。
得られた結合曲線および表形式のＫｄ値およびＢｍａｘ値を図３および下の表３に示す。図３の結果は、ｙ軸上に任意単位（ａ．ｕ．）で表されている。いずれのｍＡｂも、ｐＨ４－ＴＴＲへの有意な結合を示し、Ｋｄ値の範囲は１６ｎＭ（６Ｃ１）～２８２ｎＭ（９Ｄ５）であった。ｐＨ４－ＴＴＲへの結合のＢｍａｘ値は、最小値０．６５ａ．ｕ．（１４Ｇ８）～最大値２．０２（９Ｄ５）の範囲であった。ｐＨ４－ＴＴＲへの結合とは対照的に、天然ＴＴＲへの有意な結合を示した抗体はなく、作製したＴＴＲ抗体が全て非天然形態のＴＴＲに対して特異的であったことを示唆する。
Figure 0007219928000003
実施例３．ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびネイティブＰＡＧＥによるｍｉｓ－ＴＴＲ抗体の分析
９Ｄ５および１４Ｇ８をＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンにより分析し、単量体形態／変性形態のＴＴＲに対する結合特異性を天然ＴＴＲと比較して示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ネイティブＰＡＧＥ、およびウエスタンブロットのプロトコルについては、方法および材料（ｈ～ｊ）に別途記載する。
非変性のＴＴＲまたはｐＨ４－ＴＴＲを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で熱変性ＴＴＲおよび熱変性ｐＨ４－ＴＴＲと並べて泳動させた。電気泳動後、ゲルをニトロセルロース上にウエスタンブロットし、ＴＴＲ ｍＡｂの９Ｄ５および１４Ｇ８で染色した。両抗体は、ＴＴＲがｐＨ４で処理されるか、ＴＴＲまたはｐＨ４－ＴＴＲがＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施する前に最初に熱変性された場合に、ＴＴＲのみを認識した。したがって、これらの９Ｄ５および１４Ｇ８は、ＴＴＲの変性、またはｐＨ４でのＴＴＲの処理によって作製したＴＴＲ配座異性体に対して特異性を示す。
６Ｃ１および５Ａ１ならびに全ＴＴＲ ｍＡｂ（７Ｇ７、８Ｃ３）およびＳｉｇｍａ社の市販のポリクローナル抗体をまた、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンにより分析した。各ブロットは、染色した分子量マーカー、天然ＴＴＲ、およびｐＨ４－ＴＴＲを含んだ。
染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから、天然ＴＴＲ試料中に存在する主要な種は約３８ｋＤａの二量体であることがわかった。これに対し、ｐＨ４－ＴＴＲ試料中に存在する主要な成分は、約３５ｋＤａの二量体と約１５ｋＤａの単量体からなる少量の二量体として泳動した。この二量体は、天然ＴＴＲ試料中に存在する二量体よりわずかに小さいタンパク質として泳動し、これらの２つのＴＴＲ二量体種の立体構造に差があることを示唆する。
４種類のｍｉｓ－ＴＴＲ抗体を用いたＴＴＲおよびｐＨ４－ＴＴＲのウエスタンブロットから、これらのｍＡｂは天然ＴＴＲを認識しないが、ｐＨ４－ＴＴＲ試料中に存在する変性単量体および二量体の両方に結合することがわかった。したがって、この４種類のｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂ（９Ｄ５、１４Ｇ８、６Ｃ１、および５Ａ１）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンにより分析した場合、ＴＴＲの非天然の立体構造に対して同様の特異性を示す。
４種類のｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂとは対照的に、マウスをインタクトのＴＴＲで免疫して作製した２種類のＴＴＲ対照ｍＡｂである７Ｇ７および８Ｃ３は、四量体ＴＴＲ種を含む、ＴＴＲ試料およびｐＨ４－ＴＴＲ試料中に存在する全ＴＴＲ種を認識した。したがって、ｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂとは異なり、これらの対照ｍＡｂはＴＴＲを結合するが、立体構造特異性はない。Ｓｉｇｍａ社のポリクローナル抗体は、対照ｍＡｂの７Ｇ７および８Ｃ３と同様の挙動を示した。
ＴＴＲおよびｐＨ４－ＴＴＲをネイティブゲル上でも泳動させ、４種類のｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂが未変性ゲル条件下で立体構造特異性を示すことができるかどうかを確認した。染色したネイティブＰＡＧＥゲル上では、ＴＴＲは約３５ｋＤａの天然の二量体および少量の四量体として泳動した。これに対し、ｐＨ４－ＴＴＲは主として高分子量のスメアと微量の約３５ｋＤａの二量体として泳動した。Ｓｉｇｍａ社の非特異的ポリクローナル抗体は、ＴＴＲ試料およびｐＨ４－ＴＴＲ試料の両方に存在する全ＴＴＲ種を認識した。これに対し、９Ｄ５は、ｐＨ４－ＴＴＲ試料中に存在する高分子量ＴＴＲ種のみを認識した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンの実験で観察された通り、９Ｄ５は天然ＴＴＲ種をいずれも認識しなかった。
次いで、４種類全部のｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂをネイティブＰＡＧＥ／ウエスタンブロットにより解析した。予想された通り、９Ｄ５と同じく、他のｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂ、すなわち１４Ｇ８、６Ｃ１、および５Ａ１はｐＨ４－ＴＴＲ試料中に存在する高分子量の非天然形態のＴＴＲに特異的に結合した。上記の抗体のいずれも約３５ｋＤａの天然ＴＴＲ二量体を認識しなかった。以上の結果は、４種類のｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂが同様に挙動し、天然ＴＴＲと立体構造の異なる非天然のＴＴＲ種のみを認識することを示唆する。
実施例４．ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体によるＴＴＲ線維形成の阻害
ＴＴＲ－Ｙ７８Ｆは、タンパク質配列中の７８位にＴＴＲ四量体を不安定化させる点変異を含むＴＴＲバリアントである。このＴＴＲバリアントは、時間の経過および弱酸性条件下にてその単量体サブユニットへと解離し、次いで凝集して、チオフラビンＴに結合できる線維を形成し得る。このため、４８０ｎｍでチオフラビンＴの蛍光を測定することによって線維形成の程度をモニターできる。解離したＴＴＲ単量体または凝集体に特異的なｍｉｓ－ＴＴＲ抗体を導入すれば、ＴＴＲ線維の集合が妨げられ、無抗体対照の反応に比してチオフラビンＴの蛍光が減少すると考えられる。ＴＴＲ線維形成の阻害を検討するプロトコルについては、材料および方法（ｋ）に別途記載する。
ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体は４種類とも、チオフラビンＴ反応性ＴＴＲ－Ｙ７８Ｆ線維の形成をアイソタイプ対照に比して強力に阻害した（その結果を図４Ａのｙ軸上に任意単位（ａ．ｕ．）で示す）。ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体５Ａ１は線維形成をほぼ完全に阻害した。これらの結果は、ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体が単量体形態および／または凝集形態のＴＴＲを結合し、それによりＴＴＲ線維の形成を妨げるという考えと一致する。
非天然形態のＴＴＲに対して優れた立体構造選択性を示した４種類のｍｉｓ－ＴＴＲ抗体（９Ｄ５、１４Ｇ８、６Ｃ１、および５Ａ１）の組から得た特徴付けデータを表４にまとめる。これらの抗体は、ｐＨ４－ＴＴＲに対する親和性（ＫＤ）の範囲が１４．５ｎＭ（６Ｃ１）～２５７ｎＭ（９Ｄ５）であり、Ｂｍａｘ値の範囲が０．６５ａ．ｕ．（１４Ｇ８）～２．０２（９Ｄ５）であった。いずれの抗体も天然ＴＴＲを認識しなかったが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンでｐＨ４－ＴＴＲに結合し、ネイティブＰＡＧＥ／ウエスタンで高分子量ＴＴＲ凝集体に結合した。上記の抗体はまた、リードアウトとしてチオ－Ｔを用いる原線維形成アッセイでＴＴＲ原線維の形成を阻害した。
Figure 0007219928000004
ＴＴＲ－Ｖ１２２Ｉは、１２２位に四量体を不安定化させる単一点変異を含むＴＴＲバリアントである。原線維形成はＴｈＴ蛍光の増大と関連した。１４Ｇ８ ｍＡｂ濃度が増大するとＴｈＴ蛍光が単調に減少し、ＴＴＲ原線維形成の準化学量論的阻害を示唆した（ＩＣ５０＝０．０２８±０．００９ｍｇ／ｍＬ；ｎ＝３；図４Ｂおよび表４ａ）。アイソタイプ対照ｍＡｂがＴＴＲ原線維形成を阻害しなかった（図４Ｃ）ことは、１４Ｇ８介在性の阻害の特異性を示唆する。
５Ａ１および６Ｃ１について決定された同等の準化学量論的ＩＣ５０値（表４ａ）は、これらのｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂそれぞれの類似した原線維阻害機序を示唆した。これに対し、９Ｄ５は、非天然ＴＴＲに対して同様の特異性および親和性を示したものの、ＴＴＲ－Ｖ１２２Ｉの原線維形成を予想外にも阻害できなかった。９Ｄ５が、用いるアッセイ条件に対してより感受性であるのかを今後検討する必要がある。
Figure 0007219928000005
実施例５．ｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂを用いるＡＴＴＲ組織の免疫組織化学的（ＩＨＣ）特徴付け
トランスサイレチンタンパク質のＴＴＲ８９－９７フラグメントに対して産生したリードｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂを、ＴＴＲ心アミロイドーシスが確定された患者からの新鮮な凍結組織およびパラフィン処理組織を用いて、免疫組織化学的に検討した。心組織試料の採取および調製、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ならびに画像解析のプロトコルについては、材料および方法（ｌ～ｏ）に別途記載する。ＩＨＣに使用した抗体を表５に記載する。
Figure 0007219928000006
ＡＴＴＲ変異が確定診断された患者から心組織試料を採取した。免疫組織化学的検査を実施した症例の背景は下の表６にまとめた通りであった：ＦＡＣ＝家族性アミロイドーシス心筋症；ＦＡＰ＝家族性アミロイドーシス多発性ニューロパチー；１ｏＡＬ＝軽鎖アミロイドーシス；ＡＴＴＲ＝トランスサイレチンによるアミロイドーシス；Ｕｎｋ＝不明
Figure 0007219928000007
トランスサイレチンタンパク質の８９－９７フラグメントに対して産生したマウスモノクローナル抗体（ｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂ）を、ＴＴＲ心アミロイドーシスが確定された患者からの新鮮な凍結組織およびパラフィン処理組織を用いて、免疫組織化学的に検討した。ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体はそれぞれ、ＡＴＴＲ心組織に対して免疫反応性を示した。心筋および血管系全体にわたる沈着物に濃い染色が観察された。免疫反応性をチオフラビンＴのコンゴー赤による染色と比較したところ、組織での免疫反応性の大部分がコンゴー赤の複屈折およびチオフラビンＴ陽性染色との高い一致を示した。このことは、この組織中に沈着したＴＴＲアミロイドがベータプリーツシートの性状を有することを裏付ける。上記のｍｉｓ－ＴＴＲ抗体はまた、ＴＴＲ免疫陽性であるがコンゴー赤もチオフラビンＴも陰性である心筋の領域に局在する前アミロイドＴＴＲを検出した。ＩｇＧ－アイソタイプ対照抗体の切片および一次抗体を省略した切片はともに、全被験組織にわたる染色について陰性であった。他のアミロイドタンパク質（ラムダ軽鎖およびカッパ軽鎖またはアミロイドＡ）に対して反応を示した抗体は、この分析に用いたＡＴＴＲ心組織に対しては反応を示さず、沈着物が本来特異的にＴＴＲであったことであったことを示唆する。
ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体の染色パターンを、十分に特徴付けられた市販のＴＴＲ参照抗体（プレアルブミン、Ａ０００２；Ｄａｋｏ社；カーピンテリア、カリフォルニア州）を用いて得たものと比較した。ＤＡＫＯ社の参照抗体は、ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体と同じ領域で罹患した心筋を染色したが、より散在性の染色パターンが得られた。ＤＡＫＯ社の参照抗体は、血管系に存在するコンゴー赤親和性ＴＴＲアミロイド沈着物をｍｉｓ－ＴＴＲ抗体ほど強く染色しなかった。
ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体は、正常な非罹患組織を染色しなかった。さらに、予想された通り、アイソタイプ対照抗体６Ｆ１０での染色も陰性であった。
ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体の反応性がＴＴＲ沈着物に特異的であるかどうかを明らかにするため、原発性ＡＬアミロイドーシスと診断された患者由来の心組織に対するこれらの抗体の交差反応性を検討した。予想された通り、ＡＬアミロイド組織の染色は観察されず、ＴＴＲ抗体がＡＴＴＲ患部組織に対して特異的に反応することが裏付けられた。
老人性全身性アミロイドーシスと確定診断された患者由来の心組織またはＦＡＣ、もしくはＴＴＲ遺伝子中の点変異を原因とするＦＡＰが確定された患者由来の心組織もまた、１４Ｇ８、９Ｄ５、６Ｃ１、および５Ａ１により陽性に染色された。以上の結果は、ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体がＡＴＴＲ遺伝子型に関係なく心組織のＴＴＲ沈着物を認識する能力を有することを示唆する。
ＴＴＲを発現することがわかっている他の非心組織についても、１４Ｇ８、９Ｄ５、６Ｃ１、および５Ａ１による染色を検討し、ＤＡＫＯ社の参照抗体を用いて得た染色と比較した。予想された通り、肝臓、膵臓および脈絡叢は全て、Ｄａｋｏ社の参照抗体を用いてＴＴＲについて陽性に染色された。これに対し、ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体は、ランゲルハンス島にある膵アルファ細胞および脈絡叢のみを染色し、これらの器官に局在するＴＴＲの一部は肝臓に発現するＴＴＲとは立体構造が異なることが示唆された。肝臓でｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂの免疫反応性がみられなかったことは、肝臓に多量に発現するＴＴＲが主として四量体の天然ＴＴＲであり、露出したｍｉｓ－ＴＴＲエピトープを持たないことを示唆している。
実施例６．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットおよびＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートアッセイによるＡＴＴＲヒト血漿と正常ヒト血漿の比較解析
Ｖ３０Ｍ ＡＴＴＲが確定された患者由来の血漿試料６例（試料番号１１、１２、１５、１８、１９、２０）および正常対象由来の試料６例（番号２１、２２、２３、２４、２５、２７）をＭ．Ｓａｒａｉｖａ氏（ポルト大学、ポルトガル）から入手した。試料番号Ｃ６は商業的供給源（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社）から入手した正常ヒト血清試料である。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥとウエスタンブロットにより、またはＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートアッセイにより解析した。これらのアッセイのプロトコルについては、材料および方法（ｐ～ｒ）に別途記載する。６Ｃ１を用いてＭＳＤプレートアッセイの標準曲線を作成した。
９Ｄ５ ｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂまたは５Ａ１ ｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂのいずれかを用いたウエスタンブロットでは、正常血漿試料とＴＴＲ－Ｖ３０Ｍ罹患血漿試料との間の差が明らかであった。全血漿試料に、ｐＨ４－ＴＴＲ参照試料中に存在する非天然のＴＴＲ単量体と共泳動した約１４ｋＤａのＴＴＲのバンドが含まれていた。全般的に、ＴＴＲ－Ｖ３０Ｍ患者由来の血漿試料（番号２１、２２、２３、２４、２５、および２７）にこのｍｉｓ－ＴＴＲ種がより多くみられた。さらに、Ｖ３０Ｍ患者由来の血漿試料には、参照試料中に存在する非天然のＴＴＲ二量体と共泳動する約３０ｋＤａのバンドも含まれていた。正常個体由来の血漿試料では、試料番号１２および１８を除いて、この二量体種はより少なかった。
得られたウエスタンブロットをスキャンし、各試料について９Ｄ５反応性ＴＴＲまたは５Ａ１反応性ＴＴＲの二量体と単量体のバンドの合計強度をプロットした（その結果を図５Ａ（９Ｄ５）および５Ｂ（５Ａ１）のｙ軸上に任意単位（ａ．ｕ．）で示す）。血漿試料番号１５および１８を除く正常個体由来の血漿試料（１１、１２、１９および２０）は、Ｖ３０Ｍ患者由来の試料（２１～２５および２７）よりも９Ｄ５反応性の二量体および単量体をより少なく含んだ。
９Ｄ５および５Ａ１のウエスタンブロットにより解析した血清試料１２例をまた、ｍｉｓ－ＴＴＲ捕捉抗体として６Ｃ１および検出抗体としてＤａｋｏ－ＳｕｌｆｏＴａｇ抗体を用いるＭＳＤプレートアッセイにより分析した。これらのＭＳＤアッセイの結果を図６のｙ軸上に任意単位（ａ．ｕ．）で示す。試料１１、１２、１５、１８、１９、および２０は正常血漿を表す。試料２１～２５および２７はＶ３０Ｍ罹患血漿を表す。
正常個体由来の血漿試料中に存在する６Ｃ１反応性ＴＴＲの量は、血漿試料番号１５および１８を除いて、ＴＴＲ－Ｖ３０Ｍ罹患個体由来の血漿中で観察された量よりも少なかった。ＭＳＤアッセイによって測定した６Ｃ１反応性のレベルは、上でＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンにより観察された９Ｄ５反応性の二量体および単量体の量と極めてよく相関していた。
血漿試料中に存在する反応性ＴＴＲ種の濃度を求めるため、捕捉抗体として６Ｃ１および検出抗体として８Ｃ３－ＳｕｌｆｏＴａｇを用いて同じ試料を再アッセイした。上で作成したＴＴＲ Ｆ８７Ｍ／Ｌ１１０Ｍ標準曲線を用いてＭＳＤシグナルを反応性ＴＴＲ種のｎｇ／ｍｌ濃度に変換した。この解析に基づくと、対照試料中に存在する６Ｃ１反応性ＴＴＲの平均濃度は２７１＋／－１８５ｎｇ／ｍｌであった。これに対し、Ｖ３０Ｍ罹患血漿試料中に存在する反応性ＴＴＲの平均濃度はより高く、３３１＋／－９５ｎｇ／ｍｌであった。以上のＭＳＤの結果を考え合わせると、ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体はＡＴＴＲ疾患血漿と正常血漿とを識別できることが示唆される。このことは、ＡＴＴＲ疾患の診断検査で使用するためのｍｉｓ－ＴＴＲ抗体の開発をさらに進める根拠となる。
実施例７．ヒト化６Ｃ１抗体の設計
ヒト化の出発点、すなわちドナー抗体はマウス抗体６Ｃ１であった。成熟ｍ６Ｃ１の重鎖可変アミノ酸配列を配列番号１で表す。成熟ｍ６Ｃ１の軽鎖可変アミノ酸配列を配列番号１３で表す。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０～１２で表す。軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１８～２０で表す。この実施例全体を通じてＫａｂａｔ番号付けを用いる。
ｍ６Ｃ１の可変カッパ（Ｖｋ）は、ヒトＫａｂａｔサブグループ２に対応するマウスＫａｂａｔサブグループ２に属する。ｍ６Ｃ１の可変重鎖（Ｖｈ）は、Ｋａｂａｔサブグループ３に対応するマウスＫａｂａｔサブグループ３ｄに属する。Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１を参照されたい。Ｖｋでは、１６残基ＣＤＲ－Ｌ１はカノニカルクラス４に属し、７残基ＣＤＲ－Ｌ２はカノニカルクラス１に属し、９残基ＣＤＲ－Ｌ３はカノニカルクラス１に属する。ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００－１５，１９９６を参照されたい。１０残基ＣＤＲ－Ｈ１（Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１とＫａｂａｔ ＣＤＲ－Ｈ１の複合体、表７に示される残基２６～３５）はカノニカルクラス１に属し、１７残基ＣＤＲ－Ｈ２はカノニカルクラス１に属する。ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００－１５，１９９６を参照されたい。ＣＤＲ－Ｈ３にはカノニカルクラスは存在しない。
ＶｋドメインとＶｈドメインの間の界面にある残基は、共通してみられる残基である。
６Ｃ１の大まかな構造モデルとなり得る構造を見つけるため、ＰＤＢデータベースのタンパク質配列を検索した（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３３－７，２００５）。Ｖｋの構造には、解像度に優れ（１．９５Ａ）全体的な配列が６Ｃ１ Ｖｋと類似し、６Ｃ１と同じループのカノニカル構造を保持していることから、抗体ｆａｂ（ｐｄｂコード３ＥＹＳ）の結晶構造（Ｇａｒｄｂｅｒｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）Ｖｏｌ．４８（２３），ｐｐ．５２１０－５２１７）を用いた。Ｖｈの構造には、配列類似性および解像度（１．６８Ａ）に優れ、６Ｃ１ ＶＨのものと同じＣＤＲ－Ｈ１およびＣＤＲ－Ｈ２のカノニカル構造を有することから、二量体抗体（ｐｄｂコード２ＯＴＵ）（Ｌｉら，Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏ ＧｅｎＢａｎｋ（２００７））を用いた。６Ｃ１の大まかな構造のモデル化にはＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社のライセンスを取得）を用いた。
ＮＣＢＩの非冗長タンパク質配列データベースを検索することにより、マウスＣＤＲを移植するのに適したヒトフレームワークを選択できた。Ｖｈには、ヒトＩｇ重鎖ＡＤＸ６５６５０（ＧＩ：３２３４３２０１５）（配列番号３）を選択した（Ｓｈｒｉｎｅｒら，Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏ ＧｅｎＢａｎｋ（２０１０））。この重鎖は６Ｃ１と同じカノニカル形態を有する。Ｖｋには、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＢＩ７４０８４のヒトカッパ軽鎖（ＧＩ：１１４３８５６５２）のヒトカッパ軽鎖を選択した（配列番号１５）（Ｓｈｒｉｎｅｒら，Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏ ＧｅｎＢａｎｋ（２００６））。この軽鎖は、親Ｖｋのものと同じＣＤＲ－Ｌ１およびＣＤＲ－Ｌ２のカノニカルクラスを有する。
様々な順列の置換を含んでヒト化重鎖可変領域バリアント６種類およびヒト化軽鎖可変領域バリアント２種類を構築した（Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１ｂ、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂ、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３、およびＨｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂ（それぞれ配列番号４～９）およびＨｕ６Ｃ１ＶＬｖ１～２（それぞれ配列番号１６および１７））（表７および８）。選択したヒトフレームワークに基づく復帰変異および他の変異を有する例示的なヒト化Ｖｈおよびヒト化Ｖｋの設計を、それぞれ表７および８に示す。表７および８中の第１列の灰色の影を付けた領域は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲを示し、表７および８中の残りの列の灰色の影を付けた領域は、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲを示す。配列番号４～９、１６および１７は、表９に示すように復帰変異および他の変異を含む。Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１ｂ、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂ、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３、およびＨｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂ中の、ならびにＨｕ６Ｃ１ＶＬｖ１～２中のＬ２位、Ｌ４５位、Ｈ１９位、Ｈ４４位、Ｈ４９位、Ｈ７６位、Ｈ７７位、Ｈ８２（ａ）位、Ｈ８３位、ならびにＨ８９位でのアミノ酸を表１０に記載する。
Figure 0007219928000008
Figure 0007219928000009
Figure 0007219928000010
Figure 0007219928000011
Figure 0007219928000012
Figure 0007219928000013
Figure 0007219928000014
Figure 0007219928000015
Figure 0007219928000016
Figure 0007219928000017
マウス６Ｃ１ Ｖｈ配列（配列番号１）とマウスモデル配列（２ＯＴＵ＿Ｂ．ｐｒｏ；配列番号２）、ヒトアクセプター配列（ＡＤＸ６５６５０；配列番号３）、ならびにＨｕ６Ｃ１ＶＨｖ１、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ１ｂ、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ２ｂ、Ｈｕ６Ｃ１ＶＨｖ３、およびＨｕ６Ｃ１ＶＨｖ３ｂ配列（それぞれ配列番号４～９）とのアライメントを図１に示す。Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ領域には影が付けてある。カノニカル残基、バーニヤ残基、または界面残基がマウス配列とヒトアクセプター配列とで異なっている位置が置換の候補である。バーニヤ／ＣＤＲ土台残基の例としては、表７中のＫａｂａｔ残基２、４９、６９、７１、７５、７８、および９４が挙げられる。カノニカル／ＣＤＲ相互作用残基の例としては、表７中のＫａｂａｔ残基２４、４８、および７３が挙げられる。界面／パッキング（ＶＨ＋ＶＬ）残基の例としては、表７中のＫａｂａｔ残基３７、３９、４５、４７、９１、９３、および１０３が挙げられる。
マウス６Ｃ１ Ｖｋ配列（配列番号１３）とマウスモデル配列（３ＥＹＳ＿Ｌ＿Ｓｔ．ｐｒｏ；配列番号１４）、ヒトアクセプター配列（ＡＢＩ７４０８４；配列番号１５）、ならびにＨｕ６Ｃ１ＶＬｖ１およびＨｕ６Ｃ１ＶＬｖ２配列（それぞれ配列番号１６および１７）とのアライメントを図２に示す。Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ領域には影が付けてある。カノニカル残基、バーニヤ残基、または界面残基がマウス配列とヒトアクセプター配列とで異なっている位置が置換の候補である。バーニヤ／ＣＤＲ土台残基の例としては、表８中のＫａｂａｔ残基４、３５、４６、４９、６６、６８、および６９が挙げられる。カノニカル／ＣＤＲ相互作用残基の例としては、表８中のＫａｂａｔ残基２、４８、６４、および７１が挙げられる。界面／パッキング（ＶＨ＋ＶＬ）残基の例としては、表８中のＫａｂａｔ残基３６、３８、４４、８７、および９８が挙げられる。
置換の候補として表９および１０に示した軽鎖可変領域の位置を選択した根拠は、以下の通りである。
Ｉ２Ｖ：これはカノニカルＣＤＲ相互作用残基の１つである。Ｉｌｅのかさの大きい方の側鎖がＣＤＲ Ｌ１およびＣＤＲ Ｌ２のパッキングに干渉する可能性がある。Ｈｕ６Ｃ１ＶＨ１では、この残基をＶａｌに復帰変異させている。
Ｑ４５Ｋ：ヒト配列中のこの位置でＧｌｎよりもＬｙｓの方が頻度が高い。したがって、これは頻度に基づく復帰変異である。
置換の候補として表９および１０に示した重鎖可変領域の位置を選択した根拠は、以下の通りである。
Ｒ１９Ｋ：Ｌｙｓは隣接残基とＨ結合を形成するのに対し、ＡｒｇはＨ結合を形成しない。
Ｇ４４Ｒ：Ａｒｇは軽鎖中の界面残基Ｐｈｅ９８とＨ結合を形成するのに対し、ＧｌｙはＨ結合を形成しない。
Ｓ４９Ａ：ＳｅｒはＣＤＲ－Ｈ２中のＨｙｓとＨ結合を形成する可能性がある。
Ｎ７６Ｓ：この残基で脱アミド化を受けやすい。ヒト生殖系列中のこの位置で、Ｓｅｒが２番目に頻度が高い。
Ｓ７７Ｔ：ヒト関連重鎖フレームワーク中では、この位置でのセリンは極めてまれであるのに対し、トレオニンは７７位で最も頻度が高い。この復帰変異は、免疫原性となる可能性を軽減するために施した。
Ｎ８２（ａ）Ｓ：この残基で脱アミド化を受けやすい。ヒト生殖系列中のこの位置で、Ｓｅｒが２番目に頻度が高い。
Ｒ８３Ｋ：この位置でＬｙｓは隣接残基と複数の相互作用を形成し、ループに対して安定化作用を発揮すると考えられるのに対し、Ａｒｇはそうではない。
Ｖ８９Ｍ：Ｍｅｔは界面残基Ｔｙｒ９１とＨ結合を形成し、界面を安定化させると考えられるのに対し、ＶａｌはＴｙｒ９１と相互作用しない。
２種類のヒト化軽鎖可変領域バリアントおよび５種類のヒト化重鎖可変領域バリアントは、以下の通りである：
Ｈｕ６Ｃ１ＶＬバージョン１（Ｉ２ＶおよびＱ４５Ｋの復帰変異を小文字で表す）：
ＤｖＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰｋＬＬＩＹＫＶＳＫＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１６）
Ｈｕ６Ｃ１ＶＬバージョン２（Ｑ４５Ｋの復帰変異を小文字で表す）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰｋＬＬＩＹＫＶＳＫＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１７）
Ｈｕ６Ｃ１ＶＨバージョン１（Ｓ７７Ｔの復帰変異を小文字で表す）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＩＤＧＮＮＩＹＨＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮｔＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＤＹＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４）
Ｈｕ６Ｃ１ＶＨバージョン１ｂ（Ｓ４９ＡおよびＳ７７Ｔの復帰変異を小文字で表す）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶａＹＩＳＩＤＧＮＮＩＹＨＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮｔＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＤＹＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）
Ｈｕ６Ｃ１ＶＨバージョン２（Ｎ７６Ｓ、Ｓ７７Ｔ、およびＮ８２（ａ）Ｓの復帰変異を小文字で表す）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＩＤＧＮＮＩＹＨＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫｓｔＬＹＬＱＭｓＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＤＹＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）
Ｈｕ６Ｃ１ＶＨバージョン２ｂ（Ｓ４９Ａ、Ｎ７６Ｓ、Ｓ７７Ｔ、およびＮ８２（ａ）Ｓの復帰変異を小文字で表す）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶａＹＩＳＩＤＧＮＮＩＹＨＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫｓｔＬＹＬＱＭｓＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＤＹＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）
Ｈｕ６Ｃ１ＶＨバージョン３（Ｒ１９Ｋ、Ｇ４４Ｒ、Ｓ７７Ｔ、Ｒ８３Ｋ、およびＶ８９Ｍの復帰変異を小文字で表す）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬｋＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫｒＬＥＷＶＳＹＩＳＩＤＧＮＮＩＹＨＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮｔＬＹＬＱＭＮＳＬｋＡＥＤＴＡｍＹＹＣＡＲＤＳＤＹＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）
Ｈｕ６Ｃ１ＶＨバージョン３ｂ（Ｒ１９Ｋ、Ｇ４４Ｒ、Ｓ４９Ａ、Ｓ７７Ｔ、Ｒ８３Ｋ、およびＶ８９Ｍの復帰変異を小文字で表す）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬｋＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫｒＬＥＷＶａＹＩＳＩＤＧＮＮＩＹＨＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮｔＬＹＬＱＭＮＳＬｋＡＥＤＴＡｍＹＹＣＡＲＤＳＤＹＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）
実施例８．ヒト化６Ｃ１抗体の結合動態の解析
バージョン３ｂから選択した重鎖とバージョン２から選択した軽鎖とを含むヒト化６Ｃ１抗体の結合動態の特徴をＢｉａｃｏｒｅによって明らかにし、下に示した。
Figure 0007219928000018
 実施例９．材料および方法
ａ．抗体作製プロトコル
マウスをＲＩＢＩアジュバント中の抗原性ペプチドＴＴＲ－ＭＡＰ、ＴＴＲ８９－９７－Ｎ－ＫＬＨもしくはＴＴＲ８９－９７－Ｃ－ＫＬＨで週１回、またはＴｉｔｅｒＭａｘアジュバント中の上記の抗原性ペプチドで月１回免疫した。融合の３～４日前に、選択したマウスに生理食塩水中の免疫原で最後のＩＶ追加免疫を実施した。脾臓をホモジナイズして脾細胞を調製し、標準的な電気融合プロトコルを用いてＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合した。選択培地中の融合細胞を９６ウェルプレートに播き、７～１０日後にスクリーニングを実施した。
ｂ．抗体スクリーニングプロトコル
ハイブリドーマ選択は以下のＥＬＩＳＡスクリーニングに基づいた：９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをニワトリ抗Ｈｉｓ（１μｇ／ｍＬ ＰＢＳ）でコートし、１時間インキュベートした。プレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で１５分間ブロックした後、０．５μｇ／ｍＬのｐＨ４－ＴＴＲ（５０μＬ／ウェル）を加え、１時間インキュベートした。ｐＨ４－ＴＴＲは、解離／凝集させるために低ｐＨ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）に置かれ、ＴＴＲ８９－９７エピトープを露出するＴＴＲである。プレートをＴＢＳ－Ｔで２回洗浄した。融合プレートからの上清を５０μＬ／ウェルで加え、１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ－Ｔで２回洗浄した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＴＢＳ－Ｔで１：５，０００に希釈した検出抗体のヤギ抗マウス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３特異的）－ＨＲＰを５０μＬ／ウェルで加え、１時間インキュベートした。最後に、プレートをＴＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＴＭＢ基質（１００μＬ／ウェル）を加えた。１５分後、２Ｎ硫酸（５０μＬ／ウェル）で基質の発色を停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。Ｏ．Ｄ．が１．０を上回るウェルを選択し、細胞を２４ウェルプレートに移した。３日間増殖させた後、上記のアッセイによりクローンにカウンタースクリーニングを実施して結合を確認し、陰性カウンタースクリーニングとしてｐＨ４－ＴＴＲを天然ＴＴＲに置き換え、非天然型のＴＴＲに特異的なＴＴＲ ｍＡｂを産生するクローンを選択できた。
ｃ．抗体発現プロトコル
ヒト化モノクローナル抗体配列を保有しＣＭＶによって駆動される軽鎖および重鎖のプラスミドをＣＨＯ－Ｓ１細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）中にトランスフェクトした。二重選択を実施して選択プールを作製した。馴化培地の力価および結合をアッセイし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法により解析した。選択プールを、Ｃｌｏｎｅｐｉｘシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いるクローン作製に使用した。抗体価に基づきクローンに順位を付けた。選択したクローンを拡大しバンク化した。
産生量の最も多いクローンを振盪フラスコで拡大し、その培養物を１０～２５ＬのＷａｖｅバッグ培養物の接種に用いた。振盪フラスコおよびＷａｖｅバッグ培養には、Ｇｌｕｔａｍａｘを添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ－ＣＨＯ、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯおよびＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７発現培地（培地およびＧｌｕｔａｍａｘはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用した。Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ社）を用いて、常時攪拌しながら３７℃、７％ＣＯ２でバッチ培養を実施した。定期的に試料を採取して細胞数、生存率および抗体産生量をモニターした。必要に応じてＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）を添加した。細胞生存率が９０％未満に減少し始めたとき（５～７日）、バッチ培養物を回収した。
ｄ．抗体精製プロトコル
浮遊している細胞を４℃にて重力でＷａｖｅバッグの底に最初に沈降させた後、細胞培養物を回収した。回収した培地をデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ Ｐｏｄ ＣＯＨＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で清澄化し、タンジェンシャルフローろ過（Ｐｅｌｉｃｏｎ ２ＰＬＣ ３０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により１０倍に濃縮し、０．２μｍフィルター（Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で滅菌ろ過した。次いで、ＦＰＬＣ（Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で予め平衡化させたＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に濃縮した馴化培地を負荷した。未結合タンパク質を、ＯＤ２８０がベースラインに達するまでカラム体積の５～１０倍の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムから洗い流した。結合抗体を、カラム体積の２倍のＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でカラムから溶出させた。溶出画分を収集し、２Ｍトリス（ｐＨ９．０）（溶出物１ｍｌ当たり６０μＬ）でｐＨを中性にした。
抗体含有画分をプールし、４℃で一晩、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。次いで、透析した試料を０．２μｍのＰＥＳフィルターで限外ろ過することにより滅菌し、４℃で保管した。最終タンパク質濃度を、タンパク質標準物質であるウシガンマグロブリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてビシンコニン酸（ＢＣＡ）により求めた。
ｅ．組換えＴＴＲの発現および精製プロトコル
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１－Ａ１）細胞を、ＴＴＲインサート（Ｍｅｔ－ｈＴＴＲ－（Ｈｉｓ）６またはＦ８７Ｍ／Ｌ１１０Ｍ二重変異を有するＴＴＲバリアントを含むｐＥＴ２１ａ（＋）プラスミドで形質転換した。細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ＹＴブロスで増殖させた。ＴＴＲの発現を、１ｍＭ ＩＰＴＧおよび００５％アラビノースの存在下にて２０℃で一晩誘導した。
細胞を、４０００×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、使用するまで－８０℃で保管した。細胞ペレット１０～１５ｇを解凍し、ＬＶ－１高剪断プロセッサ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社）で処理することにより緩衝液Ａ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを含有する１×ＰＢＳ）５０ｍｌ中に溶解させた。溶解した細胞を１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、０．２μｍのＰＥＳフィルターでろ過した後、Ｈｉｓ－Ｔｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で精製した。負荷後、カラムをカラム体積の１０倍の緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ｂ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールを含む１×ＰＢＳ）で溶出させた。ＴＴＲに対応するピーク画分を収集し、１×ＰＢＳに対して透析し、使用するまで－８０℃で保管した。
ｆ．ＴＴＲ抗原の調製
組換えＴＴＲ－６Ｈｉｓの濃縮ストックを１×ＰＢＳで最終濃度２．５μｇ／ｍｌに希釈することにより、天然ＴＴＲ抗原を調製した。組換えＴＴＲを５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．９５）中、濃度０．２ｍｇ／ｍｌで７２時間、室温でインキュベートすることにより、ｐＨ４処理ＴＴＲを作製した。この条件下では、ＴＴＲが解離して、天然ＴＴＲとは構造的に異なるＴＴＲ単量体と凝集形態のＴＴＲとの混合物になる。次いで、ｐＨ４－ＴＴＲを、アッセイで使用する直前に１×ＰＢＳで最終濃度２．５μｇ／ｍｌに希釈した。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社、番号３６９０）を、１×ＰＢＳ中１．０μｇ／ｍｌのニワトリ抗ｈｉｓポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社、番号Ａｂ９１０７）５０μｌ／ウェルで室温にて１時間コートした。コーティング溶液を捨て、プレートを１×ＰＢＳで希釈した体積２５０μｌ／ウェルの１×ＢＳＡ含有ブロッキング緩衝液（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、番号７８６－１９３）でブロックした。
ｇ．ＥＬＩＳＡプロトコル
コートしブロックした９６ウェルプレートを室温で１時間、２．５μｇ／ｍｌのＴＴＲ抗原（天然ＴＴＲまたはｐＨ４－ＴＴＲのいずれか）５０μｌ／ウェルで処理した。次いで、プレートを２５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する１×トリス緩衝生理食塩水）で２回洗浄した。次いで、洗浄したプレートを１時間、０．３１～２．５μｇ／ｍｌの範囲の濃度のしかるべき抗ＴＴＲモノクローナル抗体５０μｌ／ウェルで処理した。
処理したプレートを２５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、１×ＰＢＳに１：５，０００希釈のペルオキシドコンジュゲートヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、番号１１５－０３５－１６４）を含む検出抗体５０μｌ／ウェルで、プレートを１時間処理した。次いで、プレートを３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）を加えた。室温で１５分間、ＨＲＰ反応を進行させた後、堆積体積５０μｌ／ウェルの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。分光吸光度を波長４５０ｎｍで測定した。
ｈ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を以下の通りに実施した。１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中０．１～１μｇのＴＴＲまたはｐＨ４．０－ＴＴＲを１０％ＮｕＰＡＧＥビス－トリスゲル上に負荷し、ＭＥＳ緩衝液中、一定電圧９０Ｖで１０５分間電気泳動させた。電気泳動後、ゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ社）で染色するか、ニトロセルロースフィルターに転写してウエスタンブロット解析に供した。
ｉ．ネイティブＰＡＧＥ
未変性トリス－グリシンゲルでの電気泳動を以下の通りに実施した。１×トリス－グリシン試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中０．１～１μｇのＴＴＲまたはｐＨ４．０－ＴＴＲを１０～２０％のトリス－グリシンゲル上に負荷し、１×ネイティブトリス－グリシンランニング緩衝液中、一定電圧１２０Ｖで１０５分間電気泳動させた。電気泳動後、ゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ社）で染色するか、ニトロセルロースフィルターに転写してウエスタンブロット解析に供した。
ｊ．ウエスタンブロット
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルまたはネイティブ－ＰＡＧＥゲルをニトロセルロースフィルターペーパー（ｉＢｌｏｔ、Ｐ７ Ｐｒｏｇｒａｍ）上にブロットし、ブロッキング緩衝液（Ｌｉｃｏｒ社）で３０分間ブロックした。次いで、フィルターをブロッキング緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌの一次抗体中にて、室温で１時間（または４℃で一晩）インキュベートした後、１×ＴＢＳで１０分間、３回洗浄した。フィルターをブロッキング緩衝液中の１：２０，０００希釈のＩＲＤｙｅ ８００ＣＷコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体中でインキュベートした。フィルターを二次抗体溶液中、室温で１時間インキュベートした後、フィルターを洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ赤外線撮像装置（Ｌｉｃｏｒ社）で撮像した。
ｋ．ＴＴＲ線維形成アッセイのプロコトル（Ｐｒｏｃｏｔｏｌ）
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）中の３．６μＭ（０．２ｍｇ／ｍｌ）のＴＴＲ－Ｙ７８Ｆの溶液を１．４μＭ（０．２ｍｇ／ｍｌ）のｍｉｓ－ＴＴＲ抗体またはアイソタイプ対照の存在下にて、３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物に５倍モル過剰のチオフラビンＴを加え、３０分間結合させた。励起波長を４４０ｎｍに設定し、発光波長４８０ｎｍでの蛍光定量的測定値を測定した。０％阻害をアイソタイプ対照抗体存在下での蛍光強度（８３ａ．ｕ．）として設定し、１００％阻害点をＴＴＲ－Ｙ７８Ｆタンパク質不在下での蛍光（３８ａ．ｕ．）として設定した。
ｌ．心組織試料
ＡＴＴＲ変異が確定診断された心組織の新鮮な凍結ブロックおよびパラフィン処理ブロックを、インディアナ大学のＭｅｒｒｉｌｌ Ｂｅｎｓｏｎ博士から入手した。試料は新鮮な凍結試料８例およびＦＦＰＥ試料６例を含み、各試料はＡＴＴＲまたは何らかの他の心アミロイドーシスのいずれかと診断された。ＴＴＲ抗体による特徴付けの前に、Ｐｒｏｔｈｅｎａ社にてカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖ならびにアミロイドＡに対する抗体でＩＨＣ染色を実施することにより、組織の診断をさらに裏付けた。
ｍ．免疫組織化学
免疫組織化学を、パラホルマルドヘイド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｈｅｙｄｅ）で軽く固定しスライドに載せた１０μｍの凍結切片および５μｍのパラフィン切片に実施した。免疫ペルオキシダーゼ法が主な検出系であり、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｘ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、バッファローグローブ、イリノイ州）にＢｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＤＳ９８０、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて実施した。一次抗体を１時間インキュベート（表２の濃度に従って）した後、抗体マウスおよび抗ウサギポリマーＨＲＰ－リンカー抗体コンジュゲートとインキュベートした。染色をＤＡＢ色素で可視化し、これは褐色の沈着物を生じた。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、上昇アルコール系列で脱水し、キシレンで透徹し、ＣｙｔｏＳｅａｌ ６０（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；カラマズー、ミシガン州）を塗布してカバーガラスをかけた。陰性対照は、非免疫ＩｇＧアイソタイプ対照を用いるか一次抗体を省いて、隣接する切片に免疫組織化学的手順全体を実施した。
ｎ．アミロイドの実証：コンゴー赤染色およびチオフラビンＴ染色
Ａｍｅｒｉｃａｎ ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ社（ローダイ、カリフォルニア州ローダイ、カリフォルニア州）のキットを用いてコンゴー赤染色を実施し、組織中のＴＴＲアミロイドの存在を明らかにした。染色は製造業者の手順に従って実施した。スライドをコンゴー赤溶液で１時間染色した後、１％水酸化ナトリウムで約１５秒間分別した。次いで、スライドを流水で洗浄し、濃度を漸増させたアルコール系列で脱水し、キシレンを３回交換して透徹し、ＣｙｔｏＳｅａｌ ６０を塗布してカバーガラスをかけた。
改変チオフラビンＴ染色プロトコル（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９５）を用いて組織中のＴＴＲアミロイドの存在を決定した。簡潔に述べれば、スライドをマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、流水で洗浄し、５０％エタノール中の０．０１５％チオフラビンＴ（Ｔ３５１６－２５Ｇ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）のろ過溶液で１０分間染色した。次いで、スライドを流水で洗浄し、１％（ｖ／ｖ）酢酸で１０分間分別し、水で３回洗浄した。スライドを空気乾燥させた後、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を塗布してカバーガラスをかけた。
ｏ．画像解析
スライドを、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１顕微鏡、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ ２．０ＨＴデジタルスライドスキャナまたはＬｅｉｃａ ＳＰＥスペクトル共焦点システムのいずれかで撮像した。画像を収集し、ＴＩＦＦファイルとして保存した。
ｐ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンによるヒト血漿試料の解析
Ｖ３０Ｍ ＡＴＴＲが確定された患者由来の血漿試料６例（試料番号１１、１２、１５、１８、１９、２０）および正常対象由来の試料６例（番号２１、２２、２３、２４、２５、２７）を、Ｍ．Ｓａｒａｉｖａ氏（ポルト大学、ポルトガル）から入手した。試料番号Ｃ６は、商業的供給源（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社）から入手した正常ヒト血清試料であった。上記の血漿試料を以下の通りにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、９Ｄ５でウエスタンブロットした。体積１．４μｌの血漿を、還元剤を含まない１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に１：８で希釈した。試料を、既に記載した通りにＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し０．５μｇ／ｍｌの９Ｄ５でウエスタンブロットした。
ｑ．ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートアッセイによるヒト血漿試料の分析
９６ウェルＭＳＤプレートを、ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬの濃度のモノクローナル抗体６Ｃ１でコートし、振盪しながら室温で２時間、または４℃で一晩インキュベートした。プレートを１×ＴＢＳＴで３回洗浄した後、振盪しながら３％ＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ溶液（１５０μＬ／ウェル）で１時間ブロックした。ヒト血漿試料を０．６％無グロブリンウシ血清アルブミンと、１．５ｍＭリン酸二水素ナトリウムと、８ｍＭリン酸水素ナトリウムと、１４５ｍＭ塩化ナトリウムと、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５と、０．０５％チメロサールとからなる試料緩衝液中に１：１０で希釈し、ブロックしたＭＳＤプレートに体積３０μｌ／ウェルで１時間加えた。プレートを１×ＴＢＳＴで３回洗浄した。試料緩衝液中の１μｇ／ｍｌのスルホタグ化検出抗体（Ｄａｋｏポリクローナル抗体のいずれかの８Ｃ３全ＴＴＲ抗体）を体積５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間振盪した。プレートを１×ＴＢＳＴで３回洗浄した後、１×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ溶液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）を１５０μｌ／ウェルで加えた。次いで、プレートをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ撮像装置で読み取った。
ｒ．ＭＳＤ標準曲線の作成
ヒト血漿試料中に存在する非天然の６Ｃ１反応性ＴＴＲタンパク質の量を定量するため、組換えＴＴＲ－Ｆ８７Ｍ／Ｌ１１０Ｍを６Ｃ１反応性ＴＴＲ標準物質として用いてＭＳＤ標準曲線を作成した。このＴＴＲバリアントは、四量体形成を妨げタンパク質を単量体状態に保つ２つのアミノ酸置換を含む（Ｊｉａｎｇら，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０，１１４４２－１１４５２）。したがって、このＴＴＲバリアントは全てのｍｉｓ－ＴＴＲ ｍＡｂに認識され、このため、ＭＳＤアッセイでの参照標準物質としての使用によく適している。
標準曲線を作成するため、９６ウェルＭＳＤプレートをＰＢＳ中４μｇ／ｍＬの濃度のｍｉｓ－ＴＴＲ抗体６Ｃ１でコートし、室温で振盪しながら２時間、または４℃で一晩、インキュベートした。プレートを１×ＴＢＳＴで３回洗浄した後、３％ＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ溶液（１５０μＬ／ウェル）で１時間、振盪しながらブロックした。次いで、ブロックしたプレートを、１：５で連続希釈し最後の希釈物が緩衝液ブランクである２５μｇ／ｍＬのＴＴＲ－Ｆ８７Ｍ／Ｌ１１０Ｍ（５０μｌ／ウェル）で１時間処理した。プレートを１×ＴＢＳＴで３回洗浄した後、１μｇ／ｍｌのＳｕｌｆｏＴａｇ－検出抗体（８Ｃ３－ＳｕｌｆｏＴａｇまたはＤａｋｏ ｐＡｂ－ＳｕｌｆｏＴａｇ）を体積５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間振盪した。８Ｃ３ ｍＡｂおよびＤａｋｏ抗体はいずれも、全ＴＴＲに結合し立体構造特異的ではないため、ＳｕｌｆｏＴａｇに結合し検出抗体として使用できた。
検出抗体で処理した後、プレートを体積１５０μｌ／ウェルの１×ＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで、１×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤ）を１５０μｌ／ウェルで加えた。プレートをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ撮像装置で読み取り、その結果からＴＴＲ Ｆ８７Ｍ／Ｌ１１０Ｍ検量曲線を作成した。
実施例１０．トランスジェニックマウスモデルでのｍｉｓ－ＴＴＲ抗体の評価
ヒト化トランスジェニックマウスモデルＶ３０Ｍ ｈＴＴＲ（Ｉｎｏｕｅら，（２００８）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：８１７－８２６）でｉｎ ｖｉｖｏ研究を実施し、凝集ｈＴＴＲの結合および除去における抗ＴＴＲ抗体の有効性を評価する。
標準的方法を用いてトランスジェニックマウスを飼育し、それらの循環血中ｈＴＴＲレベルをＥＬＩＳＡにより評価する。血清中ｈＴＴＲレベルが２００～４００μｇ／ｍｌのマウスをのちの有効性試験に用いる。最初の組の研究では、トランスジェニックマウス中の自然なｈＴＴＲ沈着を検討する。ｈＴＴＲ沈着物の検出を１２か月齢で開始し、その後３～６か月毎に検出を繰り返す。トランスジェニックマウス中で許容されるレベルの凝集物がみられるようになってから、有効性試験を開始する。マウスを３つの治療群に分け（ｎ＝１０／グループ）、溶媒、対照抗体（アイソタイプ対照、１０ｍｐｋ）または抗ｈＴＲＲ抗体（１０ｍｐｋ）のＩＰ投与で週１回、４週間にわたって処置する。最後の処置から１週間後にマウスを安楽死させ、組織を採取して処理した後、染色して残存ＴＴＲ沈着物の数および大きさを評価する。定量的方法および統計学を用いて、グループ間でみられる除去の程度を求める。
別の方法では、ｈＴＴＲ凝集体をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製した後、トランスジェニックマウスの腎内に注射して、新たな凝集体の沈着を播種する。本発明者は、上記の調製物の注射が予測可能な様式で新たな凝集体の沈着を促進できることを明らかにした。上記の所見に基づき、マウスを鎮静させ、左腎を露出させ、予め凝集させたｈＴＴＲ物質を腎皮質内に注射する。適切な回復期間の後、マウスを３つの治療群に分け（ｎ＝１０／グループ）、溶媒、対照抗体（アイソタイプ対照、１０ｍｐｋ）または抗ｈＴＲＲ抗体（１０ｍｐｋ）のＩＰ投与で週１回、４～８週間にわたって処置する。最後の処置から１週間後にマウスを安楽死させ、腎臓を採取して処理した後、染色してＴＴＲ沈着物の数および大きさを評価する。定量的方法および統計学を用いて、グループ間で変化の程度を求める。
実施例１１．マトリゲル埋植モデルでのｍｉｓ－ＴＴＲ抗体の評価
本発明者は、予め凝集させたｈＴＴＲをマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号３５４２６３）中に懸濁させ凝固させた後、マウスの皮下に設置できることを明らかにした。移植から４週間後の時点で、マトリゲル埋植物はその構造を維持しており、凝集ｈＴＴＲは依然として埋植物内に存在していた。さらに、埋植物はマウスによく許容され、抗ｈＴＴＲ抗体はマトリゲルに浸透し、マトリゲル中に懸濁される凝集体に結合できた。上記の所見に基づき、抗体の有効性研究を実施する。マウスを鎮静化させ、マトリゲル中に懸濁させた予め凝集したｈＴＴＲを含有する埋植物を、マウスの皮下に設置する。適切な回復期間の後、マウスを３つの治療群に分け（ｎ＝１０／グループ）、溶媒、対照抗体（アイソタイプ対照、１０ｍｐｋ）または抗ｈＴＲＲ抗体（１０ｍｐｋ）のＩＰ投与で週１回、２～４週間にわたって処置する。最後の処置の後、マウスを安楽死させ、埋植物が含まれている皮膚を採取して処理した後、組織学的および／または生化学的方法を用いて、残存ＴＴＲ沈着物の量を評価する。定量分析および統計学を用いて、グループ間でみられる除去の程度を求める。

Claims (29)

  1. トランスサイレチンを特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
    配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１と配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２と配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３という３つのＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲを含む、成熟重鎖可変領域；および
    配列番号１８のＣＤＲ－Ｌ１と配列番号１９のＣＤＲ－Ｌ２と配列番号２０のＣＤＲ－Ｌ３という３つのＫａｂａｔ軽鎖ＣＤＲを含む、成熟軽鎖可変領域；
    を含み、
    前記抗体は、配列番号９の成熟重鎖可変領域と配列番号１７の成熟軽鎖可変領域とを含む抗体ではない、
    抗体。
  2. 前記成熟重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
  3. 重鎖ＣＤＲ－Ｈ１がＫａｂａｔ－Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１複合体（配列番号６３）である、請求項１または２に記載の抗体。
  4. キメラ抗体、ヒト化抗体、またはベニヤ化抗体である、請求項１または請求項３に記載の抗体。
  5. ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する、請求項１、３および４のいずれかに記載の抗体。
  6. ヒトＩｇＧ２アイソタイプまたはヒトＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項１、３および４のいずれか１項に記載の抗体。
  7. 配列番号４～９のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と、配列番号１６～１７のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域と、を含む、請求項４に記載のヒト化抗体。
  8. 以下の位置の全てが、以下に特定される通りのアミノ酸によって占められている、請求項４に記載のヒト化抗体：
    Ｈ１９位がＫによって占められている；
    Ｈ４４位がＲによって占められている；
    Ｈ４９位がＡによって占められている；
    Ｈ７７位がＴによって占められている；
    Ｈ８３位がＫによって占められている；
    Ｈ８９位がＭによって占められている；および
    Ｌ４５位がＫによって占められている。
  9. 配列番号４～９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号１６～１７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域と、を含む、請求項７に記載のヒト化抗体。
  10. 配列番号４の成熟重鎖可変領域および配列番号１６の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号４の成熟重鎖可変領域および配列番号１７の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号５の成熟重鎖可変領域および配列番号１６の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号５の成熟重鎖可変領域および配列番号１７の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号６の成熟重鎖可変領域および配列番号１６の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号６の成熟重鎖可変領域および配列番号１７の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号７の成熟重鎖可変領域および配列番号１６の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号７の成熟重鎖可変領域および配列番号１７の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号８の成熟重鎖可変領域および配列番号１６の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号８の成熟重鎖可変領域および配列番号１７の成熟軽鎖可変領域；または
    配列番号９の成熟重鎖可変領域および配列番号１６の成熟軽鎖可変領域；
    を含む、請求項９に記載のヒト化抗体。
  11. 結合フラグメントである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体。
  12. 前記結合フラグメントが一本鎖抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’） ２ フラグメントである、請求項１１に記載の抗体。
  13. 前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合されており、前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合されている、請求項４～１０のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
  14. 前記重鎖定常領域が、天然ヒト重鎖定常領域に比してＦｃγ受容体への低下した結合を有する天然ヒト重鎖定常領域の変異体である、請求項１３に記載のヒト化抗体。
  15. 前記重鎖定常領域がＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項１３または１４に記載のヒト化抗体。
  16. 前記成熟重鎖可変領域が、Ｃ末端リジンを有するか有さない配列番号２５～２７のうちのいずれか１つの配列を有する重鎖定常領域に融合されている；および／または
    前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号２８～２９のうちのいずれか１つの配列を有する軽鎖定常領域に融合されている、
    請求項１３に記載のヒト化抗体。
  17. 前記成熟重鎖可変領域に融合されている重鎖定常領域が、配列番号３０～３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、前記成熟軽鎖可変領域に融合されている軽鎖定常領域が、配列番号３６～３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト化抗体。
  18. 請求項１～１７のいずれかに記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  19. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする、核酸。
  20. 配列番号２１、２３、４６～４８、５０および５２～６２のうちのいずれか１つを含む配列を有する、請求項１９に記載の核酸。
  21. 請求項１９に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
  22. 請求項２１に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
  23. 抗体をヒト化する方法であって、
    （ａ）マウス抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の配列を決定するステップと、
    （ｂ）前記マウス抗体の重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸および前記マウス抗体の軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成するステップと、
    （ｃ）前記核酸を宿主細胞内で発現させてヒト化抗体を作製するステップと
    を含み、前記マウス抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、方法。
  24. ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化抗体を作製する方法であって、
    （ａ）細胞が抗体を分泌するように、前記抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸で形質転換された細胞を培養するステップと、
    （ｂ）細胞培地から前記抗体を精製するステップと
    を含み、前記抗体が、配列番号１の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号１３の３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体のヒト化型、キメラ型またはベニヤ化型である、方法。
  25. ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化抗体を産生する細胞系を作製する方法であって、
    （ａ）細胞内に抗体の重鎖および軽鎖と選択マーカーとをコードするベクターを導入するステップと、
    （ｂ）前記ベクターの増加したコピー数を有する細胞を選択する条件下で前記細胞を増殖させるステップと、
    （ｃ）前記選択された細胞から単一の細胞を単離するステップと、
    （ｄ）抗体の産生量に基づいて選択された単一の細胞からクローン化された細胞をバンク化するステップと
    を含み、前記抗体が、配列番号１の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号１３の３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体のヒト化型、キメラ型、またはベニヤ化型である、方法。
  26. トランスサイレチンの凝集を阻害または軽減するための、トランスサイレチン原線維形成を阻害または軽減するための、トランスサイレチン沈着物を減少させるための、凝集トランスサイレチンを除去するための、トランスサイレチンの非毒性立体構造を安定化させるための、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを治療または予防するための、あるいはトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスの発症を遅らせるための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
  27. 対象におけるトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスの存在を判定するための方法であって、
    前記対象由来の生体試料を有効量の請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体と接触させるステップと、
    トランスサイレチンへの前記抗体の結合を検出するステップと、
    を含み、
    前記生体試料におけるトランスサイレチンへの前記抗体の結合が、対照試料におけるトランスサイレチンへの前記抗体の結合と比較して増大していれば、前記対象は、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有すると判定される、
    方法。
  28. 前記生体試料および／または前記対照試料が血液、血清、血漿、または固形組織である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記固形組織が心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管由来である、請求項２８に記載の方法。
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