TW202118782A

TW202118782A - 抗甲狀腺素運送蛋白抗體

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Publication number: TW202118782A
Application number: TW110100084A
Authority: TW
Inventors: 塔羅辰 S. 尼加爾; 阿維吉特查克拉波提; 傑佛瑞 N. 檜垣
Original assignee: 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司; 大學健康網絡
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2016-01-27
Publication date: 2021-05-16
Also published as: EA201791711A1; CU20170096A7; JP2021129562A; CN107428822B; ES2905311T3; TW201636372A; SA517381991B1; CU24532B1; CN107428822A; AU2016210887B2; KR102619359B1; CA2974911A1; JP6875280B2; TWI781507B; ZA201705662B; JP2018509889A; MX2017009804A; WO2016120809A1; KR20170120607A; TWI718121B

Abstract

本發明提供特異性結合至甲狀腺素運送蛋白(TTR)之抗體。該等抗體可用於治療或實現預防與TTR累積或TTR沉積物之累積相關聯的疾病或病症(例如，TTR類澱粉變性)。該等抗體亦可用於診斷TTR類澱粉變性及抑制或減少TTR之聚集以及其他應用。

Description

抗甲狀腺素運送蛋白抗體

相關申請案之交互參照

本申請案係關於2015年1月28日申請之美國臨時申請案第62/109,001號及2015年12月11日申請之美國臨時申請案第62/266,557號，該等案中每一者以全文引用之方式併入。

對序列表之引用

本申請案包括檔案形式的電子序列表，該檔案名稱為472678_SEQLST.txt，建立於2015年12月11日且含有70,699個位元組，該序列表以全文引用之方式併入本文用於所有目的。

本發明係有關於抗甲狀腺素運送蛋白抗體。

據認為，數種疾病係由疾病特異性蛋白質之異常折疊及聚集所引起。此等蛋白質可累積成稱為類澱粉蛋白之病理學診斷累積物，其藉由某些組織學染色物顯現。據認為，類澱粉蛋白引出炎性反應且對所涉及組織具有多種負面結果。此外，異常折疊蛋白質之較小聚集物可存在且發揮細胞毒性效應。

甲狀腺素運送蛋白(TTR)為已知錯誤折疊且聚集(例如，經歷類澱粉蛋白生成(amyloidogenesis))的許多蛋白質中之一種。甲狀腺素運送蛋白相關的類澱粉變性(amyloidosis)涵蓋兩種形式的疾病：由突變或變異TTR之錯誤折疊所產生的家族性疾病，及由野生型TTR之錯誤聚集所引起的散發性、非遺傳性疾病。TTR類澱粉蛋白生成之過程可引起神經系統及/或心臟以及其他組織中之病理學。

在一個態樣中，本發明提供特異性結合甲狀腺素運送蛋白之抗體，其包含實質上來自抗體6C1之三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR。一些此類抗體包含抗體6C1之三個Kabat重鏈CDR(分別為SEQ ID NO：10-12)及三個輕CDR(分別為SEQ ID NO：18-20)。在一些抗體中，重鏈CDR-H1為複合Kabat-Chothia CDR-H1(SEQ ID NO：63)。一些此類抗體為單株抗體。一些此類抗體為嵌合抗體、人類化抗體、鑲飾(veneered)抗體或人類抗體。一些此類抗體具有人類IgG1同型。一些此類抗體具有人類IgG2或IgG4同型。

一些此類抗體為特異性結合至甲狀腺素運送蛋白之人類化或嵌合6C1抗體，其中6C1為特徵為SEQ ID NO：1之成熟重鏈可變區及SEQ ID NO：13之成熟輕鏈可變區的小鼠抗體。

在一些抗體中，人類化成熟重鏈可變區包含6C1之三個重鏈CDR，且人類化成熟輕鏈可變區包含6C1之三個輕鏈CDR。在一些抗體中，人類化成熟重鏈可變區包含6C1之三個Kabat重鏈CDR(SEQ ID NO：10-12)，且人類化成熟輕鏈可變區包含6C1之三個Kabat輕鏈CDR(SEQ ID NO：18-20)。

在一些抗體中，人類化成熟重鏈可變區具有與SEQ ID NO：9至少90%一致的胺基酸序列，且人類化成熟輕鏈可變區具有與SEQ ID NO：17至少90%一致的胺基酸序列。在一些此類抗體中，位置H77由T佔據。在一些此類抗體中，位置H49由A佔據。在一些此類抗體中，位置H76及H82(a)由S佔據。在一些此類抗體中，位置H49由A佔據。在一些此類抗體中，位置H19、H44、H83及H89分別由K、R、K及M佔據。在一些此類抗體中，位置H49由A佔據。在一些此類抗體中，位置L45由K佔據。在一些此類抗體中，位置L2由V佔據。

一些抗體包含具有與SEQ ID NO：9至少95%一致的胺基酸序列之成熟重鏈可變區，及具有與SEQ ID NO：17至少95%一致的胺基酸序列之成熟輕鏈可變區。一些抗體包含具有與SEQ ID NO：9至少98%一致的胺基酸序列之成熟重鏈可變區，及具有與SEQ ID NO：17至少98%一致的胺基酸序列之成熟輕鏈可變區。

在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列。

在一些此類抗體中，成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列。

在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列。

在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列。

在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列。

在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列。

在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列。

在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列，且成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列。

在一些抗體中，抗體為完整抗體。在一些抗體中，抗體為結合片段。在一些此類抗體中，結合片段為單鏈抗體、Fab或Fab’2片段。

在一些抗體中，成熟輕鏈可變區融合至輕鏈恆定區，且成熟重鏈可變區融合至重鏈恆定區。在一些此類抗體中，重鏈恆定區為天然人類重鏈恆定區之突變體形式，其相對於天然人類重鏈恆定區與Fcγ受體的結合減小。在一些此類抗體中，重鏈恆定區為IgG1同型。在一些此類抗體中，成熟重鏈可變區融合至具有SEQ ID NO：26之序列的重鏈恆定區，及/或成熟輕鏈可變區融合至具有SEQ ID NO：28之序列的輕鏈恆定區。

在一些抗體中，分別來自SEQ ID NO：1及13之成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區之CDR中的任何差異駐存於位置H60-H65中。

在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含任何上文所提及之抗體及醫藥學上可接受之載劑。

在另一態樣中，本發明提供一種核酸，其編碼任何上文所提及之抗體之重鏈及/或輕鏈。在另一態樣中，本發明提供一種重組表現載體，其包含此類核酸。在另一態樣中，本發明提供一種寄主細胞，其用此類重組表現載體轉型。

在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗體之方法，該方法包含：

(a)選擇受體抗體；

(b)鑑別小鼠抗體中待保留之胺基酸殘基；

(c)合成編碼包含小鼠抗體重鏈之CDR的人類化重鏈的核酸，及編碼包含小鼠抗體輕鏈之CDR的人類化輕鏈的核酸；以及

(d)於寄主細胞中表現核酸以產生人類化抗體；

其中小鼠抗體包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區及具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在另一態樣中，本發明提供一種產生人類化、嵌合或鑲飾抗體之方法，該方法包含：

(a)培養用編碼抗體之重鏈及輕鏈的核酸轉型的細胞，以使得該等細胞分泌抗體；以及

(b)純化來自細胞培養基之抗體；

其中抗體為6C1之人類化、嵌合或鑲飾形式。

在另一態樣中，本發明提供一種產生細胞系之方法，該細胞系產生人類化、嵌合或鑲飾抗體，該方法包含：

(a)將編碼抗體之重鏈及輕鏈之載體及可選擇標記物引入至細胞中；

(b)在條件下繁殖細胞以選擇載體之複本數目增大的細胞；

(c)自所選細胞分離單一細胞；以及

(d)將自基於抗體之產率選擇的單一細胞選殖之細胞存入庫；

其中抗體為6C1之人類化、嵌合或鑲飾形式。

一些此類方法進一步包含在選擇性條件下繁殖細胞及篩選天然表現且分泌至少100mg/L/10⁶個細胞/24小時的細胞系。

在另一態樣中，本發明提供一種抑制或減少患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性或冒有其患病風險的受試者中甲狀腺素運送蛋白之聚集的方法，其包含向受試者投與任何上文所提及抗體之有效方案，從而抑制或減少受試者中甲狀腺素運送蛋白之聚集。

在另一態樣中，本發明提供一種抑制或減少患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性或冒有其患病風險的受試者中甲狀腺素運送蛋白原纖成形的方法，其包含向受試者投與任何上文所提及抗體之有效方案，從而抑制或減少受試者中甲狀腺素運送蛋白累積。

在另一態樣中，本發明提供一種減少患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性或冒有其患病風險的受試者中甲狀腺素運送蛋白沉積物的方法，其包含向受試者投與任何上文所提及抗體之有效方案，從而減少受試者中甲狀腺素運送蛋白沉積物。

在另一態樣中，本發明提供一種清除患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性或冒有其患病風險的受試者中經聚集甲狀腺素運送蛋白的方法，其包含向受試者投與任何上文所提及抗體之有效方案，從而相對於未接受抗體的患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性或冒有其患病風險的受試者清除受試者中經聚集甲狀腺素運送蛋白。

在另一態樣中，本發明提供一種穩定患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性或冒有其患病風險的受試者中甲狀腺素運送蛋白之非毒性構形的方法，其包含向受試者投與任何上文所提及抗體之有效方案，從而穩定受試者中甲狀腺素運送蛋白之非毒性構形。

在另一態樣中，本發明提供一種治療或實現預防受試者中甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性的方法，其包含向受試者投與任何上文所提及抗體之有效方案。

在另一態樣中，本發明提供一種延緩受試者中甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性發作的方法，其包含向受試者投與任何上文所提及抗體之有效方案。

在另一態樣中，本發明提供一種診斷受試者中甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性的方法，其包含將受試者之生物樣本與有效量任何上文所提及抗體接觸。一些此類方法進一步包含偵測抗體對甲狀腺素運送蛋白之結合，其中經結合抗體之存在指示受試者患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性。一些此類方法進一步包含將抗體對生物樣本之結合與抗體對對照樣本之結合進行比較，由此抗體對生物樣本之結合相對於對照樣本增大指示受試者患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性。

在一些此類方法中，生物樣本及對照樣本包含相同組織起源之細胞。在一些此類方法中，生物樣本及/或對照樣本為血液、血清、血漿或實體組織。在一些此類方法中，實體組織來自心臟、周邊神經系統、自主神經系統、腎、眼睛或胃腸道。

在一些方法中，甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性為家族性甲狀腺素運送蛋白類澱粉變性或散發性甲狀腺素運送蛋白類澱粉變性。在一些此類方法中，家族性甲狀腺素運送蛋白類澱粉變性為家族性類澱粉蛋白心肌病變(FAC)、家族性類澱粉蛋白多發性神經病變(FAP)或中樞神經系統選擇性類澱粉變性(CNSA)。在一些此類方法中，散發性甲狀腺素運送蛋白類澱粉變性為老年全身性類澱粉變性(SSA)或老年心臟類澱粉變性(SCA)。

在一些方法中，甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性與受試者之心臟、周邊神經系統、自主神經系統、腎、眼睛或胃腸道中類澱粉蛋白累積相關聯。

在另一態樣中，本發明提供一種偵測受試者中甲狀腺素運送蛋白沉積物存在或不存在的方法，其包含將來自受試者的疑似包含類澱粉蛋白累積物之生物樣本與有效量任何上文所提及抗體接觸。一些此類方法進一步包含偵測抗體對甲狀腺素運送蛋白之結合，其中經結合抗體之偵測指示甲狀腺素運送蛋白沉積物之存在。一些此類方法進一步包含將抗體對生物樣本之結合與抗體對對照樣本之結合進行比較，由此抗體對生物樣本之結合相對於對照樣本增大指示受試者患有甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性。在一些此類方法中，生物樣本及對照樣本包含相同組織起源之細胞。在一些此類方法中，生物樣本及/或對照樣本為血液、血清、血漿或實體組織。在一些此類方法中，實體組織來自心臟、周邊神經系統、自主神經系統、腎、眼睛或胃腸道。

在另一態樣中，本發明提供一種測定受試者中甲狀腺素運送蛋白沉積之水準的方法，其包含投與任何上文所提及抗體及偵測受試者中經結合抗體之存在。在一些此類方法中，經結合抗體之存在藉由正電子發射斷層攝影術(PET)來測定。

圖1描繪小鼠6C1抗體、小鼠模型抗體、人類受體抗體及6C1抗體之人類化版本之重鏈可變區的比對。將如Kabat所定義的CDR封閉於框中，只不過第一封閉框為Chothia CDR-H1及Kabat CDR-H1之複合物，其中Kabat CDR-H1加有底線及加粗。

圖2描繪小鼠6C1抗體、小鼠模型抗體、人類受體抗體及6C1抗體之人類化版本之輕鏈可變區的比對。將如Kabat所定義的CDR封閉框中。

圖3A及3B：圖3A描繪鼠類5A1、6C1、9D5及14G8抗體對ph4處理的TTR之結合曲線。圖3B描繪鼠類5A1、6C1、9D5及14G8抗體對ph4處理的或原態TTR之結合曲線。

圖4A、4B及4C：圖4A描繪TTR-Y78F纖維形成受mis-TTR抗體的抑制。圖4B描繪TTR-V122I纖維形成受14G8的抑制。圖4C描繪TTR-V122I纖維形成受對照抗體的抑制。

圖5A及5B：圖5A描繪使用9D5 mis-TTR抗體進行的對來自確認V30M ATTR的患者之血漿樣本(樣本#11、#12、#15、#18、#19、#20)及來自正常受試者之樣本(樣本#21、#22、#23、#24、#25及#27)的西方墨點法分析之密度測定法分析。圖5B描繪使用5A1 mis-TTR抗體進行的對相同樣本的西方墨點法分析之密度測定法分析。

圖6描繪使用6C1抗體對來自確認V30M ATTR的患者之血漿樣本(樣本#11、#12、#15、#18、#19、#20)及來自正常受試者之樣本(#21、#22、#23、#24、#25、#27)之MesoScale Discovery(MSD)板分析。

圖7A及7B：圖7A描繪抗體14G8對THP-1細胞攝取F87M/L110M TTR的作用。圖7B描繪mis-TTR抗體中每一者對THP-1細胞攝取V30M TTR的作用。

序列簡述

SEQ ID NO：1闡明小鼠6C1抗體之重鏈可變區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：2闡明小鼠重鏈可變區結構模板之胺基酸序列。

SEQ ID NO：3闡明重鏈可變受體登錄號ADX65650之胺基酸序列。

SEQ ID NO：4闡明人類化6C1抗體版本1之重鏈可變區(Hu6C1VHv1)之胺基酸序列。

SEQ ID NO：5闡明人類化6C1抗體版本1b之重鏈可變區(Hu6C1VHv1b)之胺基酸序列。

SEQ ID NO：6闡明人類化6C1抗體版本2之重鏈可變區(Hu6C1VHv2)之胺基酸序列。

SEQ ID NO：7闡明人類化6C1抗體版本2b之重鏈可變區(Hu6C1VHv2b)之胺基酸序列。

SEQ ID NO：8闡明人類化6C1抗體版本3之重鏈可變區(Hu6C1VHv3)之胺基酸序列。

SEQ ID NO：9闡明人類化6C1抗體版本3b之重鏈可變區(Hu6C1VHv3b)之胺基酸序列。

SEQ ID NO：10闡明小鼠6C1抗體之Kabat CDR-H1之胺基酸序列。

SEQ ID NO：11闡明小鼠6C1抗體之Kabat CDR-H2之胺基酸序列。

SEQ ID NO：12闡明小鼠6C1抗體之Kabat CDR-H3之胺基酸序列。

SEQ ID NO：13闡明小鼠6C1抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：14闡明小鼠輕鏈可變區結構模板之胺基酸序列。

SEQ ID NO：15闡明輕鏈可變受體登錄號ABI74084之胺基酸序列。

SEQ ID NO：16闡明人類化6C1抗體版本1之輕鏈可變區(Hu6C1VLv1)之胺基酸序列。

SEQ ID NO：17闡明人類化6C1抗體版本2之輕鏈可變區(Hu6C1VLv2)之胺基酸序列。

SEQ ID NO：18闡明小鼠6C1抗體之Kabat CDR-L1之胺基酸序列。

SEQ ID NO：19闡明小鼠6C1抗體之Kabat CDR-L2之胺基酸序列。

SEQ ID NO：20闡明小鼠6C1抗體之Kabat CDR-L3之胺基酸序列。

SEQ ID NO：21闡明編碼小鼠6C1抗體的具有訊號肽之重鏈可變區之核酸序列。

SEQ ID NO：22闡明小鼠6C1抗體的具有訊號肽之重鏈可變區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：23闡明編碼小鼠6C1抗體的具有訊號肽之輕鏈可變區之核酸序列。

SEQ ID NO：24闡明小鼠6C1抗體的具有訊號肽之輕鏈可變區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：25闡明示範性IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：26闡明示範性IgG1 G1m3重鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：27闡明示範性IgG1 G1m3重鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：28闡明具有N端精胺酸的示範性輕鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：29闡明不具有N端精胺酸的示範性輕鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：30闡明人類化6C1抗體版本1之重鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：31闡明人類化6C1抗體版本1b之重鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：32闡明人類化6C1抗體版本2之重鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：33闡明人類化6C1抗體版本2b之重鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：34闡明人類化6C1抗體版本3之重鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：35闡明人類化6C1抗體版本3b之重鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：36闡明人類化6C1抗體版本1之輕鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：37闡明人類化6C1抗體版本2之輕鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：38闡明登錄號P02766.1(UniProt)中所闡明之人類甲狀腺素運送蛋白之胺基酸序列。

SEQ ID NO：39闡明登錄號AAB35639.1(GenBank)中所闡明之人類甲狀腺素運送蛋白之胺基酸序列。

SEQ ID NO：40闡明登錄號AAB35640.1(GenBank)中所闡明之人類甲狀腺素運送蛋白之胺基酸序列。

SEQ ID NO：41闡明登錄號ABI63351.1(GenBank)中所闡明之人類甲狀腺素運送蛋白之胺基酸序列。

SEQ ID NO：42闡明人類甲狀腺素運送蛋白之殘基89-97之胺基酸序列。

SEQ ID NO：43闡明潛在甲狀腺素運送蛋白免疫原之胺基酸序列。

SEQ ID NO：44闡明潛在甲狀腺素運送蛋白免疫原之胺基酸序列。

SEQ ID NO：45闡明潛在甲狀腺素運送蛋白免疫原之胺基酸序列。

SEQ ID NO：46闡編碼示範性IgG1 G1m3重鏈恆定區之核酸序列。

SEQ ID NO：47闡明編碼具有N端精胺酸的示範性輕鏈恆定區之核酸序列。

SEQ ID NO：48闡明編碼不具有N端精胺酸的示範性輕鏈恆定區之核酸序列。

SEQ ID NO：49闡明重鏈恆定區訊號肽之胺基酸序列。

SEQ ID NO：50闡明編碼重鏈恆定區訊號肽之核酸序列。

SEQ ID NO：51闡明輕鏈恆定區訊號肽之胺基酸序列。

SEQ ID NO：52闡明編碼輕鏈恆定區訊號肽之核酸序列。

SEQ ID NO：53闡明編碼小鼠6C1可變輕鏈區之核酸序列。

SEQ ID NO：54闡明編碼小鼠6C1可變重鏈區之核酸序列。

SEQ ID NO：55闡明編碼人類化6C1抗體版本1之重鏈可變區(Hu6C1VHv1)之核酸序列。

SEQ ID NO：56闡明編碼人類化6C1抗體版本1b之重鏈可變區(Hu6C1VHv1b)之核酸序列。

SEQ ID NO：57闡明編碼人類化6C1抗體版本2之重鏈可變區(Hu6C1VHv2)之核酸序列。

SEQ ID NO：58闡明編碼人類化6C1抗體版本2b之重鏈可變區(Hu6C1VHv2b)之核酸序列。

SEQ ID NO：59闡明編碼人類化6C1抗體版本3之重鏈可變區(Hu6C1VHv3)之核酸序列。

SEQ ID NO：60闡明編碼人類化6C1抗體版本3b之重鏈可變區(Hu6C1VHv3b)之核酸序列。

SEQ ID NO：61闡明編碼人類化6C1抗體版本1之輕鏈可變區(Hu6C1VLv1)之核酸序列。

SEQ ID NO：62闡明編碼人類化6C1抗體版本2之輕鏈可變區(Hu6C1VLv2)之核酸序列。

SEQ ID NO：63闡明小鼠6C1抗體之複合CDR-H1(殘基26-35)之胺基酸序列。

定義

單株抗體或其他生物實體通常以分離形式提供。此意謂抗體或其他生物實體通常為干擾蛋白質及由其產生或純化所引起的其他污染物之至少50% w/w純，但不排除單株抗體與過量醫藥學上可接受之載劑或旨在有助於其使用的其他媒劑組合的可能性。有時單株抗體為干擾蛋白質及來自產生或純化的污染物之至少60%、70%、80%、90%、95%或99% w/w 純。分離單株抗體或其他生物實體常常為在其純化之後剩餘的主要巨分子物質。

抗體對其靶標抗原之特異性結合意謂至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰M^-1之親和力。特異性結合之量級可偵測為較高的且其可與對至少一種不相關靶標發生的非特異性結合區分。特異性結合可為在具體官能基或具體空間配合(例如，鎖-匙型)之間鍵的形成之結果，然而非特異性結合通常為凡得瓦力之結果。然而特異性結合不必暗示抗體結合一個且僅一個靶標。

基本抗體結構單元為次單元之四聚物。各四聚物包括兩對一致的多肽鏈，每一對具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基端部分包括具有約100個至110個或110個以上胺基酸之主要負責抗原識別的可變區。此可變區最初經表現連接至可裂解訊號肽。不具有訊號肽的可變區有時稱為成熟可變區。因此，例如，輕鏈成熟可變區意謂不具有輕鏈訊號肽的輕鏈可變區。各鏈之羧基端部分界定主要負責效應功能之恆定區。

輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，且將抗體之同型分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區與恆定區係由具有約12個或12個以上胺基酸的「J」區接合，其中重鏈亦包括具有約10個或10個以上胺基酸的「D」區。一般而言參見，Fundamental Immunology,Paul,W.編，第2版，Raven Press,N.Y.,1989，第7章(其以全文引用之方式併入以用於所有目的)。

免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(本文亦分別稱為「輕鏈可變域」(「VL域」)或「重鏈可變域」(「VH域」))由藉由三個「互補決定區」或「CDR」中斷的「架構」區組成。架構區用以比對用於特異性結合至抗原之抗原決定位的CDR。CDR包括抗體主要負責抗原結合的胺基酸殘基。自胺基端至羧基端，VL域及VH域均包含以下架構(FR)及CDR區：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。VL域之CDR1、2及3在本文亦分別稱為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；VH域之CDR1、2及3在本文亦分別稱為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。

各VL域及VH域之胺基酸之指定係根據CDR之任何習知定義。習知定義包括：Kabat定義(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(美國國家衛生研究院，Bethesda,MD,1987及1991)；Chothia定義(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917,1987；Chothia等人，Nature 342：878-883,1989)；Chothia Kabat CDR的複合定義，其中CDR-H1為Chothia CDR及Kabat CDR之複合物；AbM定義，其由Oxford Molecular之抗體模型化軟體使用；以及Martin等人之接頭定義(bioinfo.org.uk/abs)(參見表1)。Kabat提供一種廣泛使用的編號慣例(Kabat編號)，其中將不同重鏈之間或不同輕鏈之間的對應殘基指定相同編號。當藉由CDR之某一定義(例如，Kabat)將抗體表述為包含CDR時，該定義指定抗體中存在的CDR殘基(亦即，Kabat CDR)之最小數目。不排除亦存在屬於另一習知CDR定義但不屬於該規定定義之其他殘基。舉例而言，包含由Kabat定義的CDR之抗體在其他可能性中包括CDR含有Kabat CDR殘基且無其他CDR殘基之抗體，而CDR H1為複合Chothia-Kabat CDR H1且其他CDR含有Kabat CDR殘基且無基於其他定義的另外CDR殘基的抗體。

* Chothia之CDR-H1可結束於H32、H33或H34(視環之長度而定)。此可因為Kabat編號方案於35A及35B處放置額外殘基之插入，然而Chothia編號將其放置於31A及31B處。若H35A或H35B(Kabat編號)均不存在，則Chothia CDR-H1結束於H32處。若僅H35A存在，則其結束於H33處。若H35A及H35B均存在，則其結束於H34處。

術語「抗體」包括完整抗體及其結合片段。通常，片段與其來源的完整抗體競爭特異性結合至包括單獨重鏈、輕鏈Fab、Fab'、F(ab')₂、F(ab)c、Dab、奈米抗體及Fv之靶標。片段可藉由重組DNA技術，或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學分離來製造。術語「抗體」亦包括雙特異性抗體及/或人類化抗體。雙特異性或雙功能性抗體為具有兩個不同重/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體(參見例如，Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.,148：1547-53(1992))。在一些雙特異性抗體中，兩個不同重/輕鏈對包括一對人類化6C1重鏈/輕鏈及一對特異於不同於6C1所結合的甲狀腺素運送蛋白上之抗原決定位的重鏈/輕鏈。

在一些雙特異性抗體中，一對重鏈/輕鏈為如以下所進一步揭露之人類化6C1抗體，且另一對重鏈/輕鏈來自於結合至血腦阻障上所表現的受體的抗體，該受體諸如胰島素受體、類胰島素生長因子(IGF)受體、瘦素受體或脂蛋白受體，或運鐵蛋白受體(Friden等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4771-4775,1991；Friden等人，Science 259：373-377,1993)。此類雙特異性抗體可藉由受體介導的胞吞轉送來轉移跨過血腦阻障。雙特異性抗體之腦攝取可進一步藉由將雙特異性抗體工程改造以減小其對血腦阻障受體之親和力來增強。受體之親和力減小導致腦中之分佈更寬(參見例如，Atwal等人，Sci.Trans.Med.3,84ra43,2011；Yu等人，Sci.Trans.Med.3,84ra44,2011)。

示範性雙特異性分子亦可為：(1)雙重可變域抗體(DVD-Ig)，其中各輕鏈及重鏈含有經由短肽鍵聯串連的兩個可變域(Wu等人，Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig^TM)Molecule,In：Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010)中)；(2)Tandab，其為兩個單鏈雙功能抗體之融合，得到具有針對靶標抗原中每一者的兩個結合位點的四價雙特異性抗體；(3)撓性抗體(flexibody)，其為scFv與雙功能抗體之組合，得到多價分子；(4) 所謂的「對接及鎖定(dock and lock)」分子，基於蛋白質激酶A之「二聚及對接域」，當施加至Fab時，其可得到由連接至不同Fab片段之兩個一致Fab片段組成的三價雙特異性結合蛋白質；或(5)所謂的蠍(Scorpion)分子，其包含例如融合至人類Fc區之兩個末端的兩個scFv。可用於製備雙特異性抗體之平台的實例包括BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab及Mab2(F-star)、Fc工程改造IgG1(Xencor)或DuoBody(基於Fab臂交換，Genmab)。

術語「抗原決定位」係指抗體結合的抗原上之位點。抗原決定位可由鄰接胺基酸或藉由一或多種蛋白質之三級折疊並列的非鄰接胺基酸形成。由鄰接胺基酸形成之抗原決定位(亦稱為線性抗原決定位)通常在暴露於變性溶劑時保留，然而由三級折疊形成之抗原決定位(亦稱為構形抗原決定位)通常在用變性溶劑處理時喪失。抗原決定位通常包括呈獨特空間構形之至少3個，且更通常至少5個或8-10個胺基酸。測定抗原決定位之空間構形的方法包括例如x射線結晶學及二維核磁共振。參見例如，Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology,第66卷，Glenn E.Morris，編(1996)。抗原決定位可為線性，諸如SEQ ID NO：38之例如2-5、3-5、3-9或5-9個鄰接胺基酸之抗原決定位。抗原決定位亦可為構形抗原決定位，包括例如SEQ ID NO：38之殘基89-97內胺基酸之兩個或多個非鄰接段。舉例而言，若稱抗體結合至甲狀腺素運送蛋白(TTR)之胺基酸89-97內之抗原決定位，則意謂該抗原決定位在所述胺基酸範圍內，包括定義範圍之外極限的彼等者。不必意謂範圍內之每一胺基酸皆構成抗原決定位之部分。因此，例如，TTR之胺基酸89-97內之抗原決定位可除了SEQ ID NO：42之其他線性段之外由胺基酸89-97、89-96、90-96、91-96、92-96、93-96、94-96、89-96、89-95、89-94、89-93、89-92或89-93組成，或就構形抗原決定位而言，由SEQ ID NO：42之胺基酸之非鄰接段組成。

鑑別相同或重疊抗原決定位的抗體可以簡單的免疫分析鑑別，該免疫分析展示一種抗體與另一抗體競爭結合至靶標抗原的能力。抗體之抗原決定位亦可藉由結合至其抗原的抗體之X射線結晶學來定義以鑑別接觸殘基。或者，若抗原中減少或消除一種抗體之結合的所有胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則兩種抗體具有相同抗原決定位。若減少或消除一種抗體之結合的一些胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則兩種抗體具有重疊抗原決定位。

藉由其中受測試抗體抑制參考抗體對共同抗原的特異性結合之分析來測定抗體之間的競爭(參見例如，Junghans等人，Cancer Res.50：1495,1990)。若如競爭性結合分析中所量測，過量測試抗體(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制參考抗體之結合至少50%，則測試抗體與參考抗體競爭。一些測試抗體抑制參考抗體之結合至少75%、90%或99%。藉由競爭分析(競爭抗體)所鑑別之抗體包括結合至與參考抗體相同抗原決定位之抗體，及就發生位阻而言結合至足夠接近於參考抗體所結合的抗原決定位的相鄰抗原決定位之抗體。

相對於結構甲狀腺素運送蛋白(TTR)之術語「原態」係指TTR以其正確起作用的狀態之正常折疊結構(亦即，TTR四聚物)。由於TTR之原態折疊形式為四聚物，所以TTR之非原態形式包括例如錯誤折疊的TTR四聚物、TTR單體、TTR之聚集形式及TTR之原纖維形式。TTR之非原態形式可包括包含野生型TTR胺基酸序列或突變的分子。

相對於TTR之術語「錯誤折疊」係指TTR多肽單體或多聚物之二級及三級結構，且指示多肽呈現對於以其正確起作用的狀態之蛋白質而言不正常的構形。儘管TTR錯誤折疊可由蛋白質的突變(例如，缺失、取代或增加)引起，但是野生型TTR蛋白質亦可在疾病中錯誤折疊，進而暴露特異性抗原決定位。

術語「醫藥學上可接受」係指載劑、稀釋劑、賦形劑或輔助劑可與調配物之其他成分相容且對其接受者實質上無害。

術語「患者」包括接受預防或治療性治療之人類及其他哺乳動物受試者。

若受試者具有至少一種已知的風險因素(例如，遺傳、生物化學、家族病史及情境暴露)，則個體處於增加的疾病風險下，該風險因素將具有該風險因素之個體相比於不具有該風險因素之個體置於統計學上顯著更大的發展疾病之風險。

術語「生物樣本」係指在例如人類或哺乳動物受試者之生物來源內或可自其獲得的生物材料之樣本。此類樣本可為器官、胞器、組織、組織切片、體液、周邊血液、血漿、血清、細胞、諸如蛋白質及肽之分子及自其來源的任何部分或組合。術語生物樣本亦可涵蓋藉由處理該樣本所來源的任何材料。來源材料可包括細胞或其子代。生物樣本之處理可涉及過濾、蒸餾、萃取、濃縮、固定、干擾組分之去活化及其類似操作中之一或多者。

術語「對照樣本」係指已知不包括或疑似包括甲狀腺素運送蛋白(TTR)之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式，諸如以TTR類澱粉蛋白沉積物形式的生物樣本。對照樣本可獲自未患有TTR類澱粉變性或TTR類澱粉變性之特定所選類型的個體。或者，對照樣本可獲自罹患TTR類澱粉變性或TTR類澱粉變性之特定所選類型的患者。此類樣本可與認為包含TTR類澱粉變性之生物樣本同時或在不同時刻獲得。生物樣本及對照樣本可均獲自相同組織(例如，含有TTR類澱粉蛋白沉積物及周圍正常組織兩者之組織切片)。較佳地，對照樣本基本上或全部由不含TTR類澱粉蛋白沉積物的組織組成，且可用於與認為包含TTR類澱粉蛋白沉積物的生物樣本進行比較。較佳地，對照樣本中之組織與生物樣本中之組織(例如，心臟之心肌細胞)為相同類型。

術語「疾病」係指損害生理功能之任何異常病狀。該術語廣泛用於涵蓋生理功能受損的任何病症、疾患、異常、病理學、病態(sickness)、病狀或症候群，不管病因學之本質。

術語「症狀」係指如受試者所感知的疾病之主觀跡象，諸如步態改變。「徵象」係指如醫師所觀察的疾病之客觀跡象。

出於將胺基酸取代分類為保守或非保守的目的，將胺基酸如下分組：第I組(疏水性側鏈)：met、ala、val、leu、ile；第II組(中性親水性側鏈)：cys、ser、thr；第III組(酸性側鏈)：asp、glu；第IV組(鹼性側鏈)：asn、gln、his、lys、arg；第V組(影響鏈定向之殘基)：gly、pro；以及VI組(芳族側鏈)：trp、tyr、phe。保守取代涉及相同類的胺基酸之間的取代。非保守取代構成將該些類別中一者之成員交換為另一者之成員。

序列一致性百分比由藉由Kabat編號慣例最大程度比對的抗體序列測定。在比對之後，若將受試者抗體區(例如，重鏈或輕鏈之全部成熟可變區)與參考抗體之相同區進行比較，則在受試者抗體區與參考抗體區之間的序列百分比一致性為受試者及參考抗體區兩者中相同胺基酸所佔據的位置數目除以兩個區之所比對位置的總數目(不計入間隙)乘以100以轉換成百分比。

「包含」或「包括」一或多種所述要素之組成物或方法可包括未特定描述的其他要素。舉例而言，「包含」或「包括」抗體之組成物可含有單獨的或與其他成分組合的抗體。

值之範圍的指定包括該範圍內或定義該範圍的所有整數，及由該範圍內的整數所定義的所有子範圍。

除非上下文中另外明顯指出，否則術語「約」涵蓋所述值之量測誤差之標準限度內(例如，SEM)之值。

統計顯著性意謂p

0.05。

除非上下文另外清楚指定，否則冠詞「一個」、「一種」及「該」之單數形式包括複數參考。舉例而言，術語「化合物」或「至少一種化合物」可包括複數種化合物，包括其混合物。

詳細描述

I.概要

本發明提供特異性結合至甲狀腺素運送蛋白(TTR)之殘基89-97的抗體。抗體具有結合至TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式的能力。抗體可用於治療或實現預防與TTR累積或TTR沉積物之累積相關聯的疾病或病症(例如，TTR類澱粉變性)。抗體亦可用於診斷TTR類澱粉變性及抑制或減少TTR之聚集以及其他應用。

II.靶標分子

甲狀腺素運送蛋白(TTR)為主要由肝合成的127個胺基酸、55kDa之血清及腦脊髓液運送蛋白。其亦稱為前白蛋白、甲狀腺素結合前白蛋白、ATTR及TBPA。在其原態狀態中，TTR以四聚物的形式存在。在同型合子中，四聚物包含一致的127個胺基酸富含β-褶板之次單元。在異型合子中，TTR四聚物由變體及/或野生型次單元構成，通常以統計方式組合。

血液中TTR之確立功能為運送全視黃醇結合蛋白。儘管TTR為齧齒動物之血液中甲狀腺素(T₄)之主要載體，但是利用正交於用於全視黃醇結合蛋白的結合位點之結合位點，T₄結合位點在人類中未獲有效佔據。

TTR為至少三十種不同人類蛋白質中之一種，該等人類蛋白質據認為細是胞外錯誤折疊及/或錯誤組裝(類澱粉蛋白生成)成一系列聚集物結構以引起稱為類澱粉蛋白疾病的變性疾病。TTR經歷構形改變從而變得類澱粉蛋白生成。部分折疊暴露延伸構形中大的不帶電疏水性殘基之伸長段(stretch)，該等伸長段有效地錯誤組裝成大的非結構化球形聚集物，該等聚集物最終經歷構形轉換成交叉β-褶板類澱粉蛋白結構。

除非上下文中另外明顯指出，否則對甲狀腺素運送蛋白(TTR)或其片段或域之參考包括天然人類胺基酸序列，包括其同功型、突變體及對偶變體。示範性TTR多肽序列藉由以下指定：登錄號P02766.1(UniProt)(SEQ ID NO：38)、AAB35639.1(GenBank)(SEQ ID NO：39)、AAB35640.1(GenBank)(SEQ ID NO：40)及ABI63351.1(GenBank)(SEQ ID NO：41)。根據Swiss Prot P02766.1將殘基編號，其中成熟蛋白質(亦即，不包括20個胺基酸訊號序列)之第一胺基酸指定為殘基1。在任一其他TTR蛋白質中，根據關於最大比對的P02766.1中之對應殘基將殘基編號。

III.甲狀腺素運送蛋白類澱粉變性

甲狀腺素運送蛋白(TTR)類澱粉變性為一種全身性病症，其特徵為病原性錯誤折疊TTR及由TTR構成的類澱粉蛋白原纖維之細胞外沉積。TTR類澱粉變性一般而言由以下造成：原態TTR四聚物形式之去穩定化(歸因於環境或遺傳條件)，引起TTR解離、錯誤折疊及聚集成累積於各種器官及組織中的類澱粉蛋白原纖維，從而造成進行性功能不良。參見例如，Almeida及Saraiva,FEBS Letters 586：2891-2896(2012)；Ando等人，Orphanet Journal of Rare Diseases 8：31(2013)。

在引起有絲分裂後組織變性的類澱粉蛋白生成之過程的情況下，在人類中，野生型TTR四聚物及包含突變體及野生型次單元之混合四聚物兩者可解離、錯誤折疊且聚集。因此，TTR類澱粉變性涵蓋由起因於TTR之突變或起因於非突變、錯誤折疊的TTR的病原性錯誤折疊TTR所造成的疾病。

舉例而言，老年全身性類澱粉變性(SSA)及老年心臟類澱粉變性(SCA)為與年齡相關的類型的類澱粉變性，其起因於心臟之心肌細胞外或內的野生型TTR類澱粉蛋白之沉積。TTR類澱粉變性亦為遺傳性(家族性)類澱粉變性之最常見形式，其由將TTR蛋白去穩定化的突變造成。與TTR基因中之點突變相關聯的TTR類澱粉變性包括家族性類澱粉蛋白多發性神經病變(FAP)、家族性類澱粉蛋白心肌病變(FAC)及罕見的中樞神經系統選擇性類澱粉變性(CNSA)。患有遺傳性(家族性)TTR類澱粉變性的患者幾乎始終為異型合子，其意謂TTR四聚物由突變體及/或野生型TTR次單元構成，一般而言為統計學分佈。TTR類澱粉變性之遺傳性(家族性)版本一般而言為體染色體顯性，且其發作通常早於散發性疾病(SSA及SCA)。

在編碼TTR的基因中存在超過100種牽涉體染色體顯性病症FAP及FAC之突變。參見例如，US 2014/0056904；Saraiva,Hum.Mutat.17(6)：493-503(2001)；Damas及Saraiva,J.Struct.Biol.130：290-299；Dwulet及Benson,Biochem.Biophys.Res.Commun.114：657-662(1983)。此等類澱粉蛋白造成的突變分佈遍及TTR之整個分子。一般而言，TTR四聚物結構之突變體次單元去穩定化越多，類澱粉蛋白疾病發作越早。TTR變體之病原潛能一般而言藉由其不穩定性及其細胞分泌效率來測定。由一些TTR變體造成的最初病理學源自其心臟組織之選擇性破壞，然而其他TTR變體之病理學源自危及周邊及自主神經系統。由TTR類澱粉蛋白生成所造成的組織損傷似乎主要源於小的擴散性TTR聚集物之毒性，儘管細胞外類澱粉蛋白之累積可導致且幾乎必然在TTR類澱粉變性晚期折損器官結構。

TTR類澱粉變性以許多不同形式存在，其中跨個體及地理位置具有相當大的表現型變化。舉例而言，TTR類澱粉變性可表現為進行性、軸突感覺自主及運動神經病變。TTR類澱粉變性亦可表現為浸潤性心肌病變。

疾病相關症狀發作之年齡在二十與九十歲之間，其中不同人群變化較大。TTR類澱粉變性之多系統牽連為其診斷之線索。舉例而言，當存在以下一種或數種時，考慮為TTR類澱粉變性診斷：(1)神經病性疾病之家族病史，特定言之與心臟衰竭相關聯者；(2)未知病因學之神經病性疼痛或進行性感覺障礙；(3)無明顯原因之腕隧道症候群，尤其是雙側性的情況且需要手術鬆弛(release)；(4)未知病因學之胃腸道運動性障礙或自主神經功能不良(例如，勃起功能不良、起立性低血壓、神經性膀胱功能障礙(gladder))；(5)特徵為不存在高血壓之心室壁增厚的心臟病；(6)未知起因的房室傳導阻滯增強，具體而言當伴隨有心臟增厚時；以及(6)棉絨型之玻璃體內容物。參見Ando等人，Orphanet Journal of Rare Diseases 8：31(2013)。其他症狀可包括例如多發性神經病變、感覺喪失、疼痛、下肢無力、流汗異常、腹瀉、便秘、體重下降及尿失禁/滯留。

TTR類澱粉變性之診斷通常依賴於靶標器官生檢，接著用類澱粉蛋白特異性染料剛果紅將切除組織進行組織染色。若觀察到對類澱粉蛋白為陽性測試，則隨後進行TTR之免疫組織化學染色以確保造成類澱粉蛋白形成的前驅蛋白確實為TTR。就家族性形式的疾病而言，在可進行診斷之前，就需要證明編碼TTR的基因中之突變。此可例如經由等電聚焦電泳、聚合酶鏈式反應或雷射切除/液相層析-串聯質譜來實現。參見例如，US 2014/0056904；Ruberg及Berk,Circulation 126：1286-1300(2012)；Ando等人，Orphanet Journal of Rare Diseases 8：31(2013)。

IV.抗體

A.結合特異性及功能性質

本發明提供結合至甲狀腺素運送蛋白(TTR)，更特定言之，結合至TTR之胺基酸殘基89-97(SEQ ID NO：42)內之抗原決定位的單株抗體。此類抗原決定位埋在原態TTR四聚物中且暴露於TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式中。

指定為6C1的抗體為此類示範性小鼠抗體。此抗體在TTR之胺基酸殘基89-97(SEQ ID NO：42)內特異性結合。此抗體進一步特徵為其結合至TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式，但不結合至TTR之原態四聚物形式的能力。此外，此抗體特徵為其對TTR介導之類澱粉變性心臟組織具有免疫反應性，但對健康心臟組織無免疫反應性。結合至特異性蛋白質或其片段的能力可使用實例中所提供的示範性分析形式來證明。

一些抗體結合至與指定6C1的抗體相同或重疊抗原決定位。6C1之重鏈及輕鏈成熟可變區之序列分別指定為SEQ ID NO：1及13。具有此類結合特異性之其他抗體可藉由以下產生：用TTR或其包括所要抗原決定位之部分(例如，SEQ ID NO：42)使小鼠免疫，且篩選結合至單體TTR或包含SEQ ID NO：42的肽的所得抗體，該等抗體視情況與具有小鼠6C1(IgG1,κ)之可變區的抗體競爭。TTR中包括所要抗原決定位之片段可連接至幫助引出對該片段之抗體反應的載體及/或可與幫助引出此類反應的佐劑組合。可針對相較於特定殘基之突變體對TTR之野生型、單體版本或其片段(例如，SEQ ID NO：38)的不同結合篩選此類抗體。對此類突變體的篩選更精確地定義結合特異性，允許鑑別結合受具體殘基之突變誘發抑制且可能分享其他例證抗體之功能特性的抗體。突變可為遍及靶標或遍及其已知駐存有抗原決定位之切片，用丙胺酸(或絲胺酸，若已經存在丙胺酸)，一次或更廣泛地隔開間隔，全身置換取代一種殘基。若相同組突變顯著降低兩種抗體之結合，則兩種抗體結合相同抗原決定位。

具有所選擇的鼠類抗體(例如，6C1)之結合特異性的抗體亦可使用噬菌體顯示方法之變體產生。參見Winter,WO 92/20791。此方法具體而言適用於產生人類抗體。在此方法中，所選擇的鼠類抗體之重鏈或輕鏈可變區用作起始材料。若例如選擇輕鏈可變區作為起始材料，則構建成員顯示相同輕鏈可變區(亦即，鼠類起始材料)及不同重鏈可變區的噬菌體文庫。重鏈可變區可例如獲自重排人類重鏈可變區之文庫。選擇展示對單體TTR或其片段(例如，胺基酸殘基89-97)強特異性結合(例如，至少10⁸及較佳至少10⁹M^-1)的噬菌體。此噬菌體之重鏈可變區隨後充當構建另一噬菌體文庫之起始材料。在此文庫中，各噬菌體顯示相同重鏈可變區(亦即，自第一顯示文庫鑑別的區)及不同輕鏈可變區。輕鏈可變區可例如獲自重排人類輕鏈可變區之文庫。此外，選擇展示對單體TTR或其片段(例如，胺基酸殘基89-97)強特異性結合的噬菌體。所得抗體通常具有與鼠類起始材料相同或類似的抗原決定位特異性。

其他抗體可藉由突變誘發編碼諸如6C1之示範性抗體之重鏈及輕鏈的cDNA來獲得。本發明亦包括與成熟重鏈及/或輕鏈可變區之胺基酸序列中之6C1至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致且維持其功能性質的，及/或與各別抗體不同之處在於少量功能上無關的胺基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的單株抗體。亦包括具有如藉由習知定義所定義的六種CDR中之一種或全部，但較佳為Kabat之單株抗體，其與6C1之對應CDR 90%、95%、99%或100%一致。

本發明亦包括具有完全或實質上來自6C1的一些或所有(例如，3、4、5及6個)CDR之抗體。此類抗體可包括具有完全或實質上來自6C1之重鏈可變區之至少兩種，且通常所有三種CDR之重鏈可變區，及/或具有完全或實質上來自6C1之輕鏈可變區之至少兩種，且通常所有三種CDR之輕鏈可變區。抗體可包括重鏈及輕鏈兩者。當含有不超過4、3、2或1個取代、插入或缺失時，CDR實質上來自對應的6C1 CDR，只不過CDR-H2(當由Kabat定義時)可具有不超過6、5、4、3、2或1個取代、插入或缺失。此類抗體可與成熟重鏈及/或輕鏈可變區之胺基酸序列中之6C1至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致且維持其功能特性，及/或與6C1的不同之處在於少量功能上無關的胺基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入。

藉由此類分析所鑑別的一些抗體可結合至TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式，但不結合至TTR之原態四聚物形式，如實例中或另外所述。同樣，一些抗體對TTR介導之類澱粉變性組織具有免疫反應性，但對健康組織不具有免疫反應性。

一些抗體可抑制或減少TTR之聚集，抑制或減少TTR原纖成形，減少或清除TTR沉積物或聚集TTR，或穩定動物模型或臨床試驗中TTR之非毒性構形。一些抗體可治療TTR類澱粉變性、實現其預防或延緩其發作，如動物模型或臨床試驗中所示。用於測試對TTR類澱粉變性的活性的示範性動物模型包括以下所述者：Kohno等人，Am.J.Path.150(4)：1497-1508(1997)；Teng等人，Laboratory Investigations 81：385-396(2001)；Wakasugi等人，Proc.Japan Acad.63B：344-347(1987)；Shimada等人，Mol.Biol.Med.6：333-343(1989)；Nagata等人，J.Biochem.117：169-175(1995)；Sousa等人，Am.J.Path.161：1935-1948(2002)；以及Santos等人，Neurobiology of Aging 31：280-289(2010)。

B.非人類抗體

針對單體TTR或其片段(例如，胺基酸殘基89-97)之其他非人類抗體(例如，鼠類、天竺鼠、靈長類、兔或大鼠)的產生可藉由例如用TTR或其片段使動物免疫來實現。參見Harlow及Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988)(以引用之方式併入以用於所有目的)。此類免疫原可來自天然來源，藉由肽合成，或藉由重組表現獲得。視情況，可投與免疫原以與載體蛋白融合或以其他方式複合。視情況，可與佐劑一起投與免疫原。可如以下所述使用數種類型佐劑。完全弗氏佐劑接著不完全佐劑較佳用於實驗動物之免疫。兔或天竺鼠通常用於製作多株抗體。小鼠通常用於製作單株抗體。針對單體TTR或TTR內之抗原決定位(例如，包含胺基酸殘基89-97中一或多者的抗原決定位)的特異性結合篩選抗體。此類篩選可藉由以下實現：測定抗體對一系列單體TTR變體之結合，該等TTR變體諸如含有胺基酸殘基89-97或在此等殘基內的突變的TTR變體，且測定哪些TTR變體結合至抗體。可例如藉由西方墨點法、FACS或ELISA來估計結合。

C.人類化抗體

人類化抗體為將非人類「供體」之CDR植入至人類「受體」抗體序列中的基因工程改造抗體(參見例如，Queen,US 5,530,101及5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205；以及Foote,US 6,881,557)。受體抗體序列可為例如成熟人類抗體序列、此類序列之複合物、人類抗體序列之共通序列或生殖細胞系區序列。因此，人類化抗體為具有全部或實質上來自供體抗體之至少三種、四種、五種或所有CDR及全部或實質上來自人類抗體序列之可變區架構序列及恆定區(若存在)的抗體。類似地，人類化重鏈具有全部或實質上來自供體抗體重鏈的至少一種、兩種及通常所有三種CDR，及實質上來自人類重鏈可變區架構及恆定區序列的重鏈可變區架構序列及重鏈恆定區(若存在)。類似地，人類化重鏈具有全部或實質上來自供體抗體重鏈的至少一種、兩種及通常所有三種CDR，及實質上來自人類重鏈可變區架構及恆定區序列的重鏈可變區架構序列及重鏈恆定區(若存在)。不同於奈米抗體及dAb，人類化抗體包含人類化重鏈及人類化輕鏈。人類化抗體中之CDR實質上來自非人類抗體中之CDR，當至少85%、90%、95%或100%對應殘基(如藉由任何習知定義所定義，但較佳不由Kabat定義)在各自CDR之間一致時。抗體鏈之可變區架構序列或抗體鏈之恆定區實質上分別來自人類可變區架構序列或人類恆定區，當至少85%、90%、95%或100%任何習知定義所定義但較佳不由Kabat定義的對應殘基為一致時。

儘管人類化抗體經常併入小鼠抗體之所有六種CDR(較佳如Kabat所定義)，但其亦可應少於小鼠抗體之所有CDR(例如，至少3、4或5中CDR)製作(例如，Pascalis等人，J.Immunol.169：3076,2002；Vajdos等人，J.of Mol.Biol.,320：415-428,2002；Iwahashi等人，Mol.Immunol.36：1079-1091,1999；Tamura等人，J.Immunol.,164：1432-1441,2000)。

在一些抗體中，僅部分CDR，亦即結合所需的CDR殘基之子集，稱作SDR，需要保留在人類化抗體中之結合。未接觸抗原且不在SDR中的CDR殘基可基於先前研究(例如常常不需要CDR H2中之殘基H60-H65)，自位於Chothia高度變異環外側之Kabat CDR之區(Chothia,J.Mol.Biol.196：901,1987)，藉由分子模型化及/或憑經驗，或如Gonzales等人，Mol.Immunol.41：863,2004中所述來鑑別。在不存在一或多種供體CDR殘基或省略全部供體CDR的位置處之此類人類化抗體中，佔據該位置的胺基酸可為佔據受體抗體序列中對應位置(藉由Kabat編號)的胺基酸。CDR中之供體胺基酸將包括的受體之此類取代的數目反映競爭考慮的平衡。此類取代在減少人類化抗體中小鼠胺基酸之數目及因此減少潛在免疫原性方面為潛在地有利的。然而，取代亦可造成親和力之改變，且親和力之顯著降低較佳得以避免。亦可憑經驗選擇待取代的CDR及胺基酸內取代的位置。

人類受體抗體序列可視情況選自許多已知人類抗體序列以提供在人類受體序列可變區架構與供體抗體鏈之對應可變區架構之間的高序列一致性(例如，65-85%一致性)。

重鏈之受體序列之實例為具有NCBI登記代碼ADX65650(SEQ ID NO：3)的人類成熟重鏈可變區。此受體序列包括具有與小鼠6C1重鏈相同典範形式的兩種CDR。輕鏈之受體序列之實例為具有NCBI登錄代碼ABI74084(SEQ ID NO：15)的人類成熟輕鏈可變區。此受體序列包括具有與小鼠6C1輕鏈相同典範形式的兩種CDR。

人類可變區架構殘基之某些胺基酸可選擇用於取代，基於其可能影響CDR構形及/或結合至抗原。對此類可能影響之研究系藉由模型化，檢查具體位置處胺基酸之特徵，或憑經驗觀察具體胺基酸之取代或突變誘發之效果。

舉例而言，當胺基酸在鼠類可變區架構殘基與所選擇的人類可變區架構殘基之間有差異時，人類架構胺基酸可由小鼠抗體之等效架構胺基酸取代，當可合理地預期胺基酸以下時：

(1)直接非共價地接合抗原；

(2)相鄰於CDR區或在CDR內，如Chothia而非Kabat所定義；

(3)以其他方式與CDR區相互作用(例如，在約6 Å CDR區內)，(例如，藉由在同源已知免疫球蛋白鏈之解決結構上模型化輕鏈或重鏈)；或

(4)為參與VL-VH界面之殘基。

如Queen,US 5,530,101所定義之類別(1)至(3)之架構殘基有時可替代地稱為典範及游標(vernier)殘基。幫助定義CDR環之構形的架構殘基有時稱為典範殘基(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Thornton及Martin,J.Mol.Biol.263：800-815(1996))。支援抗原結合環構形且在微調抗體對抗原之配合方面起作用的架構殘基有時稱為游標殘基(Foote及Winter,J.Mol.Biol 224：487-499(1992))。

作為取代之候選者的其他架構殘基為產生潛在醣化位點的殘基。取代之其他候選者還為就該位置處的人類免疫球蛋白而言不尋常的受體人類架構胺基酸。此等胺基酸可經來自小鼠供體抗體之等效位置或更典型人類免疫球蛋白之等效位置之胺基酸取代。

示範性人類化抗體為小鼠6C1抗體之人類化形式，指定為Hu6C1。小鼠抗體包含分別具有包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：13之胺基酸序列的成熟重鏈及輕鏈可變區。本發明提供六種例證人類化成熟重鏈可變區：Hu6C1VHv1(SEQ ID NO：4)、Hu6C1VHv1b(SEQ ID NO：5)、Hu6C1VHv2(SEQ ID NO：6)、Hu6C1VHv2b(SEQ ID NO：7)、Hu6C1VHv3(SEQ ID NO：8)及Hu6C1VHv3b(SEQ ID NO：9)。本發明進一步提供兩種例證人類成熟輕鏈可變區：Hu6C1VLv1(SEQ ID NO：16)及Hu6C1VLv2(SEQ ID NO：17)。圖1及2展示6C1、小鼠模型抗體、人類受體抗體及6C1之人類化抗體版本之分別重鏈可變區及輕鏈可變區之比對。

出於諸多原因，諸如對CDR構形及/或結合至抗原的影響、介導重鏈與輕鏈之間的相互作用、與恆定區相互作用、作為轉譯後修飾所要或非所要的位點、作為人類可變區序列中其位置之不常見殘基且因此潛在地免疫原性、產生聚集潛能及其他原因，以下十種可變區構架位置考慮為六種例證人類成熟輕鏈可變區及兩種例證人類成熟重鏈可變區之候選者，如實例中進一步指定：L2、L45、H19、H44、H49、H76、H77、H82(a)、H83及H89。

此處，如在其他情況下，第一提及的殘基為藉由植入Kabat CDR所形成的人類化抗體之殘基或就CDR-H1進入人類受體架構而言的複合Chothia Kabat CDR，且第二提及的殘基為考慮用於置換此類殘基的殘基。因此，在可變區架構內，第一提及的殘基為人類，且在CDR內，第一提及的殘基為小鼠。

例證抗體包括例證成熟重鏈及輕鏈可變區之排列或組合(例如，Hu6C1VHv1/VLv1或H1L1、Hu6C1VHv1b/VLv1或H1bL1、Hu6C1V Hv1/VLv2或H1L2、Hu6C1VHv1b/VLv2或H1bL2、Hu6C1VHv2/VLv1或H2L1、Hu6C1VHv2b/VLv1或H2bL1、Hu6C1VHv2/VLv2或H2L2、Hu6C 1VHv2b/VLv2或H2bL2、Hu6C1VHv3/VLv1或H3L1、Hu6C1VHv3b/VLv1或H3bL1、Hu6C1VHv3/VLv2或H3L2及Hu6C1VHv3b/VLv2或H3bL2)。

本發明提供人類化抗體之變體，其中人類化成熟重鏈可變區展示與SEQ ID NO：4-9至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，且人類化成熟輕鏈可變區展示與SEQ ID NO：16或17至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些此類抗體中，保留SEQ ID NO：4-9、16及17中回復突變或其他突變中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或所有10種。

在一些抗體中，V_H區中位置H19、H44、H49、H76、H77、H82(a)、H83及H89中之至少一者分別由K、R、A、S、T、S、K及V佔據。在一些抗體中，V_H區中位置H77由T佔據，如在Hu6C1VHv1。在一些抗體中，V_H區中位置H49及H77分別由A及T佔據，如在Hu6C1VHv1b。在一些抗體中，V_H區中位置H76、H77及H82(a)分別由S、T及S佔據，如在Hu6C1VHv2。在一些抗體中，V_H區中位置H49、H76、H77及H82(a)分別由A、S、T及S佔據，如在Hu6C1VHv2b。在一些抗體中，V_H區中位置H19、H44、H77、H83及H89分別由K、R、T、K及M佔據，如在Hu6C1VHv3。在一些抗體中，V_H區中位置H19、H44、H49、H77、H83及H89分別由K、R、A、T、K及M佔據，如在Hu6C1VHv3b。在一些抗體中，V_L區中位置L45由K佔據。在一些抗體中，V_L區中位置L2由I佔據。在一些抗體中，V_L區中位置L2及L45中之一者或兩者分別由V及K佔據，如在Hu6C1VLv1。在一些抗體中，V_L區中位置L2及L45中之一者或兩者分別由I及K佔據，如在Hu6C1VLv2。此類人類化抗體之CDR區可與6C1小鼠供體抗體之CDR區一致或實質上一致。該等CDR區可藉由任何習知定義(例如，Chothia，或Chothia及Kabat之複合物)所定義，但較佳如Kabat所定義。

除非另外說明，否則可變區架構位置係根據Kabat編號。其他此類變體通常與例證Hu6C1變體之序列相差少量(例如，通常不超過1、2、3、5、10或15個)置換、缺失或插入。此類差異通常在架構中，但可發生於CDR中。

人類化6C1變體中另外變化之可能性為可變區架構中另外的回復突變。不接觸人類化mAb中CDR的許多架構殘基可適應供體小鼠mAb或其他小鼠或人類抗體之對應位置之胺基酸的取代，且甚至許多潛在的CDR接觸殘基亦適合於取代。甚至CDR內之胺基酸可例如經用於提供可變區架構的人類受體序列之對應位置處所見的殘基改變。此外，交替的人類受體序列可用於例如重鏈及/或輕鏈。若使用不同受體序列，則可不進行上文所推薦之回復突變中之一或多者，因為對應供體及受體殘基在無回復突變之情況下已經相同。

較佳地，Hu6C1變體(不管是否為保守)中之置換或回復突變對人類化mAb之結合親和力或潛能無實質作用，亦即，其結合至單體TTR之能力(例如，在本發明變體人類化6C1抗體之實例中所述的一些或所有分析中之潛能與鼠類6C1之潛能實質上相同(亦即，在實驗誤差內))。

D.嵌合及鑲飾抗體

本發明進一步提供非人類抗體、尤其實例之6C1抗體之嵌合及鑲飾形式。

嵌合抗體為非人類抗體(例如，小鼠)之輕鏈及重鏈之成熟可變區與人類輕鏈及重鏈恆定區組合的抗體。此類抗體實質上或全部保留小鼠抗體之結合特異性，且為約2/3人類序列。

鑲飾抗體為人類化抗體之一種類型，其保留一些且通常所有CDR及非人類抗體之一些非人類可變區架構殘基，但用人類抗體序列之對應位置之殘基置換可造成B細胞或T細胞抗原決定位的其他可變區架構殘基，例如暴露殘基(Padlan,Mol.Immunol.28：489,1991)。結果為一抗體，其中CDR全部或實質上來自非人類抗體且非人類抗體之可變區架構藉由取代被製成更類似於人類的。本發明中包括6C1抗體之鑲飾形式。

E.人類抗體

藉由以下所述的各種技術提供針對單體TTR或其片段(例如，TTR之胺基酸殘基89-97(SEQ ID NO：42))之人類抗體。一些人類抗體藉由競爭性結合實驗，藉由Winter之噬菌體顯示方法(上文)，或以其他方式來選擇以具有與具體小鼠抗體相同的抗原決定位特異性，諸如實例中所述的小鼠單株抗體中之一種。藉由僅使用TTR之片段，諸如僅含有TTR之胺基酸殘基89-97之TTR變體作為靶標抗原，及/或藉由篩選抗針對一系列TTR變體的抗體來篩選人類抗體之具體抗原決定位特異性，該等變體含有TTR之胺基酸殘基89-97內各種突變的TTR變體。

用於產生人類抗體之方法包括Oestberg等人，Hybridoma 2：361-367(1983)；Oestberg，美國專利第4,634,664號；以及Engleman等人，美國專利4,634,666之三源雜交瘤(trioma)方法，其使用包括人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠(參見例如，Lonberg等人，WO93/12227(1993)；US 5,877,397；US 5,874,299；US 5,814,318；US 5,789,650；US 5,770,429；US 5,661,016；US 5,633,425；US 5,625,126；US 5,569,825；US 5,545,806；Neuberger,Nat.Biotechnol.14：826(1996)；以及Kucherlapati,WO 91/10741(1991))及噬菌體顯示方法(參見例如，Dower等人，WO 91/17271；McCafferty等人，WO 92/01047；US 5,877,218；US 5,871,907；US 5,858,657；US 5,837,242；US 5,733,743；以及US 5,565,332)。

F.恆定區之選擇

嵌合、鑲飾或人類化抗體之重鏈及輕鏈可變區可連接至人類恆定區之至少一部分。恆定區之選擇部分取決於是否需要抗體依賴性細胞介導之細胞毒性、抗體依賴性細胞吞噬及/或補體依賴性細胞毒性。舉例而言，人類同型IgG1及IgG3具有補體依賴性細胞毒性且人類同型IgG2及IgG4不具有補體依賴性細胞毒性。人類IgG1及IgG3亦包括強於人類IgG2及IgG4之細胞介導之效應子功能。輕鏈恆定區可為λ或κ。

輕鏈或重鏈之胺基端或羧基端之一種或數種胺基酸，諸如重鏈之C端離胺酸，可在一部分或所有分子中缺少或經衍生。取代可在恆定區中進行以減少或增加諸如補體介導之細胞毒性或ADCC的效應子功能(參見例如，Winter等人，美國專利第5,624,821號；Tso等人，美國專利第5,834,597號；以及Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005,2006)，或延長在人類中的半衰期(參見例如，Hinton等人，J.Biol.Chem.279：6213,2004)。示範性取代包括位置250處之Gln及/或位置428處之Leu(就恆定區而言，EU編號用於此段中)用於增加抗體之半衰期。位置234、235、236 及/或237中之任一者或所有的取代減少對於Fcγ受體，具體而言FcγRI受體的親和力(參見例如，US 6,624,821)。人類IgG1之位置234、235及237處之丙胺酸取代可用於減少效應子功能。一些抗體具有人類IgG1之位置234、235及237處之丙胺酸取代用於減少效應子功能。視情況，人類IgG2中之位置234、236及/237經丙胺酸取代，且位置235經麩醯胺取代(參見例如，US 5,624,821)。在一些抗體中，使用藉由人類IgG1之EU編號之位置241、264、265、270、296、297、322、329及331中之一或多者處之突變。在一些抗體中，使用藉由人類IgG1之EU編號之位置318、320及322中之一或多者處之突變。在一些抗體中，位置234及/或235經丙胺酸取代，及/或位置329經甘胺酸取代。在一些抗體中，位置234及235經丙胺酸取代，諸如在SEQ ID NO：27中。在一些抗體中，同型為人類IgG2或IgG4。

示範性人類輕鏈κ恆定區具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列。SEQ ID NO：28之N端精胺酸可省略，在此狀況下，輕鏈κ恆定區具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列。示範性人類IgG1重鏈恆定區具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列(具有或不具有C端離胺酸)。抗體可表現為含有兩個輕鏈及兩個重鏈的四聚物，單獨重鏈、輕鏈，Fab、Fab'、F(ab')2及Fv，或重鏈及輕鏈成熟可變域經由間隔連接的單鏈抗體。

人類恆定區展示不同個體之間的同種異型變化及同種同型(isoallotypic)變化，亦即，不同個體中之恆定區可在一或多個多型位置處有所不同。同種同型與同種異型之不同之處在於識別同種同型之血清結合至一或多種其他同型之非多型區。因此，例如，另一重鏈恆定區為IgG1 G1m3同種異型且具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列。IgG1 G1m3同種異型之另一重鏈恆定區具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列(具有或不具有C端離胺酸)。對人類恆定區的參考包括具有任何天然同種異型或佔據天然同種異型中位置的殘基之任何排列的恆定區。

G.重組抗體之表現

已知許多用於使用抗體表現細胞系(例如，融合瘤)產生嵌合及人類化抗體的方法。舉例而言，可使用熟知的方法將抗體之免疫球蛋白可變區選殖且定序。在一種方法中，重鏈可變VH區藉由RT-PCR使用製備自融合瘤細胞的mRNA選殖。共通引子用於VH區前導肽，其涵蓋轉譯起始密碼子作為5'引子及g2b恆定區特異性3'引子。示範性引子描述於Schenk等人(在下文中「Schenk」)之美國專利公開案US 2005/0009150中。可比較多種獨立衍生殖株之序列以確保在擴增期間未引入變化。VH區之序列亦可藉由定序由5' RACE RT-PCR方法論獲得之VH片段及3' g2b特異性引子來測定或證實。

可以同功方式選殖輕鏈可變VL區。在一種方法中，設計共通引子組用於VL區之擴增，其使用經設計以雜交至涵蓋轉譯起始密碼子的VL區的5’引子及對V-J接合區之下游Ck區具有特異性的3'引子。在第二種方法中，採用5'RACE RT-PCR方法論以選殖編碼cDNA的VL。示範性引子描述於Schenk中，見前文。隨後將選殖序列與編碼人類(或其他非人類物種)恆定區的序列組合。編碼恆定區的示範性序列包括SEQ ID NO：46，其編碼人類IgG1恆定區，及SEQ ID NO：47及48，其編碼人類κ輕鏈恆定區。

在一種方法中，重鏈及輕鏈可變區經再工程改造以編碼各自VDJ或VJ連結下游的剪接供體序列，且選殖至哺乳動物表現載體中，諸如重鏈之pCMV-hγ1及輕鏈之pCMV-Mcl。此等載體編碼人類γ1及Ck恆定區作為插入可變區匣之下游外顯子片段。在序列驗證之後，重鏈及輕鏈表現載體可共轉染至CHO細胞中以產生嵌合抗體。轉染後48小時收集條件培養基，且藉由西方墨點法分析來分析其抗體產生或藉由ELISA來分析其抗原結合。如上文所述將嵌合抗體人類化。

通常藉由重組表現產生嵌合、鑲飾、人類化及人類抗體。重組多核苷酸結構通常包括可操作地連接至抗體鏈之編碼序列的表現控制序列，其包括原態締合或異源性表現控制元件，諸如啟動子。表現控制序列可為載體中能夠轉型或轉染真核或原核寄主細胞的啟動子系統。一旦載體併入至適當寄主中，就將寄主維持在適於核苷酸序列之高水準表現及交叉反應性抗體之收集及純化的條件下。

此等表現載體通常可在寄主有機體中作為游離基因體或寄主染色體DNA之整體部分複製。通常，表現載體含有選擇標誌物，例如，安比西林抗性或濕黴素抗性，以允許彼等經所要DNA序列轉型的細胞之偵測。

大腸桿菌為一種可用於表現抗體、尤其抗體片段之原核寄主。諸如酵母之微生物亦可用於表現。酵母菌為一種具有合適載體的酵母寄主，其具有表現控制序列、複製起點、終止序列及如所要的類似者。典型啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶及其他解糖酶。可誘導酵母啟動子尤其包括來自乙醇脫氫酶、異細胞色素C及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶的啟動子。

哺乳動物細胞可用於表現編碼免疫球蛋白或其片段的核苷酸段。參見Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。許多能夠分泌完整異源性蛋白質的合適的寄主細胞系已得以發展，且包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HeLa細胞、HEK293細胞、L細胞及包括Sp2/0及NS0的非抗體產生骨髓瘤。細胞可為非人類。此等細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子、增強子(Queen等人，Immunol.Rev.89：49(1986))及必要的處理資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點及轉錄終止子序列。表現控制序列可包括來源於內源性基因、細胞巨大病毒、SV40、腺病毒、牛乳突瘤病毒及其類似者的啟動子。參見Co等人，J.Immunol.148：1149(1992)。

或者，可將抗體編碼序列併入轉殖基因中以供引入基因轉殖動物之基因組中且隨後於基因轉殖動物之乳汁中表現(參見例如，美國專利第5,741,957號；美國專利第5,304,489號；以及美國專利第5,849,992號)。合適的轉殖基因包括與諸如酪蛋白或β乳球蛋白的乳腺特異性基因之啟動子及增強子可操作地連接的輕鏈及/或重鏈的編碼序列。

含有受關注DNA段之載體可藉由取決於細胞寄主類型的方法轉移至寄主細胞中。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，然而，磷酸鈣處理、電穿孔、脂質轉染、基因槍(biolistic)或基於病毒的轉染可用於其他細胞寄主。用於轉型哺乳動物細胞之其他方法包括使用凝聚胺(polybrene)、原生質融合、脂質體、電穿孔及顯微注射。就產生基因轉殖動物而言，轉殖基因可顯微注射至受精卵母細胞中，或可併入至胚胎幹細胞之基因體中，且此類細胞之核轉移至除核卵母細胞中。

將編碼抗體重鏈及輕鏈的載體引入至細胞培養物中，可篩選細胞池之物血清培養基中之生長生產率及產物品質。可隨後將產生最多的細胞池經歷基於FACS的單細胞選殖以產生單株株系。可使用高於50pg或100pg每細胞每天的比生產率，其對應於大於7.5g/L培養物的產物效價。可測試由單細胞殖株產生的抗體之混濁度、過濾性質、PAGE、IEF、UV掃描、HP-SEC、醣-寡醣映射、質譜及結合分析，諸如ELISA或Biacore。可隨後將所選擇的殖株保存入庫於多個小瓶中，且冷凍保存用於後續使用。

一旦表現，就可根據此項技術之標準程序純化抗體，其包括蛋白質A捕獲、HPLC純化、柱層析、凝膠電泳及其類似程序(一般而言參見，Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。

可採用用於抗體之商業生產之方法，包括密碼子最佳化、啟動子之選擇、轉錄元件之選擇、終止子之選擇、無血清單細胞選殖、細胞保存入庫、針對複本數之擴增的選擇標誌物之使用、CHO終止子或蛋白質效價之改良(參見例如，US 5,786,464；US 6,114,148；US 6,063,598；US 7,569,339；W02004/050884；W02008/012142；W02008/012142；W02005/019442；W02008/107388；W02009/027471；以及US 5,888,809)。

H.抗體篩選分析

可將抗體經受數種篩選，其包括結合分析、功能篩選、與TTR沉積物相關聯的疾病之動物模型的篩選及臨床試驗。結合分析測試對單體TTR或其片段的特異性結合，及視情況，親和力及抗原決定位特異性。舉例而言，結合分析可篩選結合至TTR之胺基酸殘基89-97(SEQ ID NO：42)之抗體，其為埋在原態TTR四聚物中且暴露於TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式中的抗原決定位。亦可針對結合TTR之前原纖維、非原態構形及TTR類澱粉蛋白原纖維，但不結合原態TTR構形的能力篩選抗體。舉例而言，抗體可針對結合至藉由原態四聚物TTR之解離或解聚所產生的TTR之單體形式的能力進行篩選，且可針對原態四聚物TTR進行反向篩選，如實例中或另外所述。同樣，抗體亦可針對其TTR介導之類澱粉變性組織具有免疫反應性，但對健康組織不具有免疫反應性進行篩選。此類篩選有時以與諸如具有6C1或IgG1 κ同型之可變區的抗體的示範性抗體競爭的形式進行。視情況，抗體或TTR靶標在此類分析中經固定。

可在包括天然表現TTR或經編碼TTR或其片段之DNA轉染的細胞的細胞模型中進行功能分析。合適的細胞包括來源於心臟組織或受TTR類澱粉蛋白生成影響的其他組織的細胞。可針對TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之水準減少(例如，藉由細胞萃取物或上清液之西方墨點法或免疫沉澱)或由於TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式而細胞毒性減小來對細胞進行篩選。舉例而言，可針對抑制或減少TTR之聚集、抑制或減少TTR原纖成形、減少TTR沉積物、清除聚集TTR或穩定TTR之非毒性構形的能力來對抗體進行測試。

可於溶液中進行其他功能分析，諸如測試當溶液中單體TTR或錯誤折疊TTR中間物於抗體接觸時，抗體是否能夠干擾或減少TTR原纖成形。原纖成形之程度可藉由渾濁度量測，例如，在400nm下在裝備有四聚物控制單元的UV-可見光譜儀上探測。硫代黃素-T亦可用於估計類澱粉蛋白原纖成形之程度。舉例而言，可將五倍莫爾過量的硫代黃素-T添加至TTR樣本，且在進行量測之前放置在室溫下30分鐘。可使用光譜螢光計監測硫代黃素-T螢光。參見US 2014/0056904。

動物模型篩選測試抗體治療上或預防上治療模擬與TTR或TTR沉積物之累積相關聯的人類疾病的動物模型中之徵象或症狀。此類疾病包括以下TTR類澱粉變性之類型，諸如老年全身性類澱粉變性(SSA)、老年心臟類澱粉變性(SCA)、家族性類澱粉蛋白多發性神經病變(FAP)、家族性類澱粉蛋白心肌病變(FAC)及中樞神經系統選擇性類澱粉變性(CNSA)。可監測的合適徵象或症狀包括諸如胃腸道或心臟的各種組織中類澱粉蛋白沉積物之存在及程度。類澱粉蛋白沉積物之減少程度可藉由與適當對照進行比較來測定，諸如接受對照抗體(例如，同型匹配對照抗體)治療、安慰劑治療或未治療的對照動物中TTR類澱粉蛋白沉積物之水準。測試針對TTR類澱粉變性之活性的示範性動物模型為攜帶內源性小鼠Ttr基因座之無效突變及包含與家族性類澱粉蛋白多發性神經病變相關聯的V30M突變的人類突變體TTR基因的小鼠模型。參見例如，Kohno等人，Am.J.Path.150(4)：1497-1508(1997)；Cardoso及Saraiva,FASEB J 20(2)：234-239(2006)。類似模型亦存在，包括TTR類澱粉變性之家族性版本的其他模型及TTR類澱粉變性之散發性版本的模型。參見例如，Teng等人，Lab.Invest.81(3)：385-396(2001)；Ito及Maeda,Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis，於Recent Advances in Transthyretin Evolution,Structure,and Biological Functionshs中，第261-280頁(2009)(Springer Berlin Heidelberg)。基因轉殖動物可包括人類TTR轉殖基因，諸如具有與TTR類澱粉變性相關聯的突變的TTR轉殖基因或野生型TTR轉殖基因。為了促進動物模型中之測試，可使用具有適用於動物模型的恆定區的嵌合抗體(例如，小鼠-大鼠嵌合體可用於測試大鼠中之抗體)。可推斷，抗體之人類化版本將為有效的，若對應小鼠抗體或嵌合抗體在適當動物模型中有效，且人類化抗體具有類似的結合親和力(例如，在實驗誤差內，諸如1.5、2或3之因子)。

臨床實驗測試患有與TTR類澱粉變性相關聯的疾病的人類中之安全性及效力。

I.核酸

本發明進一步提供編碼上文所述之任何重鏈及輕鏈之核酸(例如，SEQ ID NO：4-9、16及17)。視情況，此類核酸進一步編碼訊號肽且可與連接至恆定區之訊號肽一起表現(例如，具有SEQ ID NO：49(重鏈)及51(輕鏈)之胺基酸序列的訊號肽，其可分別由SEQ ID NO：50(重鏈)及52(輕鏈)編碼)。核酸之編碼序列可可操作地與調節序列一起連接以確保編碼序列之表現，諸如啟動子、增強子、核糖體結合位點、轉錄終止訊號及其類似物。編碼重鏈及輕鏈之核酸可以分離形式存在，或可選殖至一或多種載體中。核酸可藉由例如重疊寡核苷酸之固態合成或PCR來合成。編碼重鏈及輕鏈的核酸可接合成鄰近核酸，例如，在表現載體內，或可為單獨的，例如，各自選殖至其自有表現載體中。

J.結合抗體

特異性結合至以TTR之病原形式但不以TTR之原態四聚物形式暴露的抗原之結合抗體，諸如TTR之胺基酸殘基89-97(SEQ ID NO：42)，可用於偵測TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在；監測且評估用於治療診斷有TTR類澱粉變性之患者的治療劑之效力；抑制或減少TTR之聚集；抑制或嫌少TTR原纖成形；減少或清除TTR沉積物；穩定TTR之非毒性構形；或治療或實現預防患者中TTR類澱粉變性。舉例而言，此類抗體可與其他治療部分、其他蛋白質、其他抗體及/或可偵測標記結合。參見WO 03/057838；US 8,455,622。

結合治療部分可為可由於治療、減弱、改善、預防或改良患者中諸如TTR類澱粉變性的非所要病狀或疾病的任何試劑。治療部分可包括例如免疫調節劑或促進或增強抗體活性之任何生物活性試劑。免疫調節劑可為刺激或抑制免疫反應之發展或維持的任何試劑。若此類治療部分偶合至對TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式具有特異性之抗體，諸如本文所述之抗體，則偶合的治療部分對TTR之非原態病原形式的特異性親和力超過TTR之原態四聚物形式。因此，結合抗體之投與直接靶向包含TTR之病原形式的組織，而對周圍正常健康組織之損傷最小。此可具體而言用於毒性太大以致於無法本身投與之治療部分。此外，可使用較少量之治療部分。

合適的治療部分之實例包括減少TTR之水準、穩定TTR之原態四聚物結構、抑制TTR之聚集、干擾TTR原纖維或類澱粉蛋白形成或抵消細胞毒性的藥物。參見例如，Almeida及Saraiva,FEBS Letters 586：2891-2896(2012)；Saraiva,FEBS Letters 498：201-203(2001)；Ando等人，Orphanet Journal of Rare Diseases 8：31(2013)；Ruberg及Berk,Circulation 126：1286-1300(2012)；以及Johnson等人，J.Mol.Biol.421(2-3)：185-203(2012)。舉例而言，抗體可結合至他發米帝司(tafamidis)、二氟尼柳(diflunisal)、ALN-TTR01、ALNTTR02、ISIS-TTRRx、去氧羥四環素(doxy)、牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)、Doxy-TUDCA、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、薑黃素或白藜蘆醇(3,5,4’-三羥基茋)。其他代表性治療部分包括已知可用於治療、管理或改善TTR類澱粉變性或TTR類澱粉變性之症狀的其他試劑。參見例如，Ando等人，Orphanet Journal of Rare Diseases 8：31 (2013)，其針對TTR類澱粉變性之常見臨床症狀及用於治療該等症狀之典型試劑。

抗體亦可與其他蛋白質偶合。舉例而言，抗體可與Fynomer偶合。Fynomer為來源於人類Fyn SH3域之小結合蛋白(例如，7kDa)。其可為穩定的且可溶的，且其可缺乏半胱胺酸殘基及雙硫鍵。Fynomer可經工程改造以結合至具有與抗體相同親和力及特異性的靶標分子。其可適於產生基於抗體之多特異性融合蛋白。舉例而言，Fynomer可融合至抗體之N端及/或C端以產生具有不同架構的雙特異性及三特異性FynomAb。Fynomer可使用Fynomer文庫，經由使用FACS、Biacore及基於細胞的分析的篩選技術來進行選擇，從而允許有效選擇具有最佳特性的Fynomer。Fynomer之實例揭示於以下中：Grabulovski等人，J.Biol.Chem.282：3196-3204(2007)；Bertschinger等人，Protein Eng.Des.Sel.20：57-68(2007)；Schlatter等人，MAbs.4：497-508(2011)；Banner等人，Acta.Cystallogr.D.Biol.Crystallogr.69(Pt6)：1124-1137(2013)；以及Brack等人，Mol.Cancer Ther.13：2030-2039(2014)。

本文所揭示之抗體亦可偶合或結合至一或多種其他抗體(例如，以形成抗體異結合物)。此類其他抗體可結合至TTR或其部分內不同抗原決定位或可結合至不同靶標抗原。

抗體亦可與可偵測標記偶合。此類抗體可用於例如診斷TTR類澱粉變性，用於檢測TTR類澱粉變性之進展，及/或用於估計治療之效力。此類抗體具體而言可用於在患有或易患TTR澱粉樣變性的受試者中，或在獲自此類受試者之適當生物樣本中進行此類測定。可偶合或連接至人類化6C1抗體之代表性可偵測標記包括各種酶，諸如山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼脂酶；輔基，諸如鏈黴親和素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光材料，諸如繖形酮、螢光素、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，諸如流明諾；生物發光材料，諸如螢光素酶、冷光素(luciferin)及水母素(aequorin)；放射性材料，諸如釔⁹⁰(90Y)、放射銀-111、放射銀-199、鉍²¹³、碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(⁵S)、氚(³H)、銦(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)、鎝(⁹⁹Tc)、鈦(²⁰¹Ti)、鎵(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、鈀(¹⁰³Pd)、鉬(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn及¹¹⁷Tin；正子發射材料，其使用各種正子發射斷層攝影術；非放射性順磁金屬離子；以及放射性標記或結合至特異性放射性同位素的分子。

放射性同位素向抗體之鍵聯可用習知雙官能螯合物進行。就放射銀-111及放射銀-199鍵聯而言，可使用基於硫的連接子。參見Hazra等人，Cell Biophys.24-25：1-7(1994)。銀放射同位素之鍵聯可涉及用抗壞血酸減少免疫球蛋白。就諸如111In及90Y之放射同位素而言，可使用替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)且將於此類同位素反應以分別形成111In-替伊莫單抗及90Y-替伊莫單抗。參見Witzig,Cancer Chemother.Pharmacol.,48增刊1：S91-S95(2001)。

治療部分、其他蛋白質、其他抗體及/或可偵測標記可使用此項領域中已知的技術直接或經由中間物(例如，連接子)間接偶合或結合至鼠類、嵌合、鑲飾或人類化6C1抗體。參見例如，Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld等人(編)，第243-56頁(Alan R.Liss，公司1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery中(第2版),Robinson等人(編)，第623-53頁(Marcel Dekker,公司1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications中，Pinchera等人(編)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編)，第303-16頁(Academic Press 1985)；以及Thorpe等人，Immunol.Rev.,62：119-58(1982)。合適的連接子包括例如可裂及非可裂連接子。可採用以下不同連接子，其在酸性或還原性條件下，在暴露於特異性蛋白酶，或在其他所限定的條件下釋放偶合的治療部分、蛋白質、抗體及/或可偵測標記。

V.治療應用

以上抗體可用於治療或實現預防患者之疾病，該患者患有至少部分由甲狀腺素運送蛋白(TTR)且尤其由TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式介導的疾病或出於該疾病風險中。儘管機制之理解並非實踐所需，咸信任何或所有以下機制可有助於使用上文抗體治療TTR類澱粉變性：TTR聚集及原纖成形之抗體介導抑制、TTR之非毒性構形(例如，四聚物形式)之抗體介導穩定或聚集TTR、寡聚TTR或單體TTR之抗體介導清除。抗體-藥物結合物可具有藉由結合部分所決定的另外作用機制。

以有效方案投與抗體，其意謂劑量、投與途徑及投與頻率延緩發作、降低嚴重性、抑制進一步惡化，及/或改善所治療病症之至少一種徵象或症狀。若患者已罹患病症，則該方案可稱為治療有效性方案。若患者處於相對於一般人群高的病症風險，但仍未經歷症狀，則該方案可稱為預防有效性方案。在一些情況下，治療或預防效力可於個別患者中相對於病史對照或相同患者之過去經驗進行觀察。在其他情況下，治療或預防效力可於臨床前或臨床試驗中於治療人群相對於未治療對照人群進行證明。

除了其他因素，投與頻率取決於循環中抗體之半衰期、患者之病狀及投與途徑。頻率可為每天、每週、每月、每季度或無規間隔，其根據患者病狀之變化或治療之病症之進展。靜脈內投與之示範性頻率在治療的連續療程內介於每週與每季度之間，儘管更大或更小頻率給藥亦為可能的。就皮下投與而言，示範性給藥頻率為每天至每月，儘管大或更小頻率給藥亦為可能的。

所投與劑量之數目取決於病症為急性還是慢性及病症對治療之反應。就急性病症或慢性病症之急性加重而言，在1個與10個劑量之間常常為足夠的。有時單一彈丸式劑量(bolus dose)，視情況以分開形式，足夠用於急性病症或慢性病症之急性加重。就急性病症或急性加重復發而言，可重複治療。就慢性病症而言，可在規律間隔下投與抗體，例如，每週、每兩週、每月、每季度、每六個月持續至少1、5或10年或患者之生命期。

VI.醫藥組成物及使用方法

本文提供診斷、監測、治療或實現預防至少部分由甲狀腺素運送蛋白(TTR)、及尤其藉由TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式(例如，TTR類澱粉變性)介導之疾病或病狀的數種方法。此類疾病之實例包括家族性TTR類澱粉變性，諸如家族性類澱粉蛋白心肌病變(FAC)、家族性類澱粉蛋白多發性神經病變(FAP)或中樞神經系統選擇性類澱粉變性(CNSA)，及散發性TTR類澱粉變性，諸如老年全身性類澱粉變性(SSA)或老年心臟類澱粉變性(SCA)。上文所述之抗體可併入之醫藥組成物中用於此類方法中。一般而言，抗體或含有抗體之醫藥組成物投與至有需要的受試者。接受治療的患者包括處於TTR類澱粉變性風險但不展示症狀的個體，以及當前展示症狀的患者。一些患者可在TTR類澱粉變性之前驅階段期間治療。

醫藥組成物可預防性地投與至具有已知TTR類澱粉變性之遺傳風險的個體。此類個體包括親屬已經歷此類疾病之個體，及風險藉由遺傳或生物化學標誌物(例如，TTR中與TTR類澱粉變性相關聯的突變)之分析，包括使用本文所提供的診斷方法測定的個體。舉例而言，編碼TTR之基因中存在超過100種牽涉TTR類澱粉變性之突變。參見例如，US 2014/0056904；Saraiva,Hum.Mutat.17(6)：493-503(2001)；Damas及Saraiva,J.Struct.Biol.130：290-299；Dwulet及Benson,Biochem.Biophys.Res.Commun.114：657-662(1983)。

罹患TTR澱粉樣變性之個體可有時根據TTR澱粉樣變性之臨床表現加以識別，該等臨床表現包括以下中一或多者：(1)神經病性疾病之家族病史，特定言之與心臟衰竭相關聯者；(2)未知病因學之神經病性疼痛或進行性感覺障礙；(3)無明顯原因之腕隧道症候群，尤其是雙側性的情況且需要手術鬆弛；(4)未知病因學之胃腸道運動性障礙或自主神經功能不良(例如，勃起功能不良、起立性低血壓、神經性膀胱功能障礙(gladder))；(5)特徵為不存在高血壓之心室壁增厚的心臟病；(6)未知起因的房室傳導阻滯增強，具體而言當伴隨有心臟增厚時；以及(6)棉絨型之玻璃體內容物。參見Ando等人，Orphanet Journal of Rare Diseases 8：31(2013)。然而，TTR類澱粉變性之決定性診斷通常依賴於靶標器官生檢，接著用類澱粉蛋白特異性染料剛果紅將切除組織進行組織染色。若觀察到對類澱粉蛋白為陽性測試，則隨後進行TTR之免疫組織化學染色以確保造成類澱粉蛋白形成的前驅蛋白確實為TTR。就家族性形式的疾病而言，在可進行決定性診斷之前，就需要證明編碼TTR的基因中之突變。

受試者之鑑別可發生於臨床環境中，或在其他情況下，諸如在受試者家中，例如經由受試者自己使用自測套組。舉例而言，受試者可基於以下各種症狀鑑別，諸如：周邊神經病變(感覺及運動)、自主神經病變、胃腸道損傷、心肌病變、腎病變或眼沉積。參見Ando等人，Orphanet Journal of Rare Diseases 8：31(2013)。受試者亦可藉由受試者之血漿樣本中TTR之非原態形式之水準相較於對照樣本增加來鑑別，如實例中所揭示。

根據TTR類澱粉變性之家族病史、遺傳測試或醫學篩選，治療可在任何年齡(例如，20、30、40、50、60或70歲)開始。治療通常需要在一段時間內多個劑量，且可藉由分析治療劑(例如，包含胺基酸殘基89-97的TTR之截斷形式)隨時間的抗原或活化T細胞或B細胞反應來監測。若反應下降，則指示為加強劑量。

在預防性應用中，將抗體或包含該抗體之醫藥組成物，以有效減少風險、減輕嚴重程度或延緩疾病之至少一種徵象或症狀發作之方案(劑量、頻率及投與途徑)，投與至易患疾病(例如，TTR類澱粉變性)，或另外處於疾病風險的受試者。在治療性應用中，將抗體或誘導抗體的免疫原，以有效改善或至少部分抑制疾病之至少一種徵象或症狀之進一步惡化之方案(劑量、頻率及投與途徑)，投與至易患或已罹患疾病(例如，TTR類澱粉變性)的患者。

若個別經治療受試者達成比未藉由本文所揭示之方法治療的可比較受試者之對照群體中的平均結果更有利的結果，或若在p<0.05或0.01或甚至0.001水準下，在受控臨床試驗(例如，II期、II/III期或III期試驗)或動物模型中證明方案在受治療受試者中相對對照受試者之更有利結果，則認為方案為治療或預防有效。

抗體之有效方案可用於例如：抑制或減少患有與TTR累積相關聯的病狀或冒其風險的受試者中TTR之聚集；抑制或減少患有與TTR 累積相關聯的病狀或冒其風險的受試者中TTR原纖成形；減少或清除患有與TTR累積相關聯的病狀或冒其風險的受試者中TTR沉積物或聚集TTR；穩定患有與TTR累積相關聯的病狀或冒其風險的受試者中TTR之非毒性構形；抑制患有與TTR累積相關聯的病狀或冒其風險的受試者中TTR聚集物、原纖維或沉積物之毒性作用；診斷疑似包含類澱粉蛋白累積之組織中TTR類澱粉蛋白累積物之存在或不存在；在投與抗體之後藉由偵測受試者中結合抗體之存在測定受試者中TTR沉積物之水準；偵測受試者中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在；監測且評估用於治療診斷有TTR類澱粉變性的患者的治療藥劑之效力；誘導受試者中包含抗體對TTR之免疫反應；延緩受試者中與TTR類澱粉蛋白相關聯的病狀之發作；或治療或實現預防患者中之TTR類澱粉變性。

有效劑量取決於許多不同因素而變化，諸如投與手段、靶標位點、受試者之生理學狀態、受試者為人類還是動物、所投與之其他藥物，及治療為預防性還是治療性。

抗體之示範性劑量範圍可為約0.1-20或0.5-5mg/kg體重(例如，0.5、1、2、3、4或5mg/kg)或10-1500mg作為固定劑量。劑量取決於患者之病狀及治療前反應(若存在)、治療為預防性還是治療性及病症為急性還是慢性，以及其他因素。

可以此類劑量每天、隔天、每週、每兩週、每月、每季度，或根據藉由憑經驗分析所判定的其他時程投與抗體。示範性治療需要以多劑量形式經延長的時間(例如至少六個月)進行投與。其他示範性治療方案需要每兩週投與一次或一月投與一次或每3至6個月投與一次。

可經由外周途徑投與抗體。投與途徑包括局部、靜脈內、經口、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腹膜內、鼻內或肌肉內。抗體之投與途徑可為靜脈內或皮下。靜脈內投與可例如藉由輸注經諸如30-90分鐘之時間段。注射類型最通常在手臂或腿部肌肉內進行。在一些方法中，將試劑直接注射至沉積物已聚集的具體組織中，例如顱內注射。

用於腸胃外投與之醫藥組成物可為無菌的且實質上等張的(250-350mOsm/kg水)且在GMP條件下製造。醫藥組成物可以單位劑量形式(例如，單一投與的劑量)提供。醫藥組成物可使用一或多種生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑調配。調配物取決於所選擇的投與途徑。就注射而言，抗體可於水溶液中調配，例如於生理上相容的緩衝液中，諸如漢克氏(Hank's)溶液、林格氏溶液或生理鹽水或乙酸鹽緩衝液(以減少注射位點處的不適)。溶液可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑的調配試劑。在使用前，替代抗體可呈凍乾形式用於與合適媒劑，例如無菌無熱原水組合。

方案可與有效治療或預防治療疾病之另一試劑組合投與。此類試劑可包括抑制TTR之表現的siRNA或作為四聚物形式TTR之穩定劑的Vyndaqel。

治療之後，可評估受試者病狀以測定此類治療之進程或效力。此類方法較佳測試TTR類澱粉蛋白水準或TTR之非原態形式之水準的變化。舉例而言，可評估TTR類澱粉蛋白水準以測定相對於治療之前在可比較環境下受試者TTR類澱粉蛋白水準的改良。受試者TTR類澱粉蛋白水準亦可在可比較環境下與對照人群進行比較。對照群體可為類似患病的未治療受試者或正常未治療受試者(及其他對照受試者)。相對於類似患病、未治療受試者或接近或達到為治療正常受試者之水準的水準之改良指示對治療的陽性反應。

TTR類澱粉蛋白水準可藉由許多方法，包括成像技術來量測。合適的成像技術之實例包括用以下進行的PET掃描：放射標記TTR或其片段、TTR抗體或其片段、基於剛果紅的類澱粉蛋白成像試劑(諸如PIB(US 2011/0008255)，類澱粉蛋白成像肽p31(基於剛果紅染色組織染色，類澱粉蛋白成像肽p31之生物分佈與類澱粉蛋白定量相關，Wall等人，摘要編號1573,2011 ISNM年會))及其他PET標記。TTR之非原態形式之水準可例如藉由用本文所揭示之抗體對受試者之血漿樣本或活檢樣本進行SDS-PAGE/西方墨點法或Meso Scale Discovery板分析且如實例中所述與對照樣本進行比較來量測。

A.診斷及監測方法

本文亦提供偵測患者中針對TTR的免疫反應之方法，該患者罹患或易患與TTR沉積或TTR之病原形式(例如，TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式)相關聯的疾病。該等方法可用於監測用本文所提供的試劑的治療性或預防性治療之療程。被動免疫之後的抗體曲線通常展示抗體濃度之當前峰，接著指數衰減。在無另一劑量的情況下，衰減在數天至數月的時間段內接近治療前水準，其取決於所投與抗體之半衰期。舉例而言，一些人類抗體之半衰期為大約20天。

在一些方法中，受試者中抗體對TTR之基線量測可在投與之前進行，第二次量測在投與之後不久進行以測定峰抗體水準，且一或多次另外量測間隔地進行以監測抗體水準之衰減。當抗體之水準下降至基線或低於基線的預定百分比峰(例如，50%、25%或10%)時，投與另一劑量抗體之投與。在一些方法中，將低於背景的峰或後續量測的水準與先前測定的參考水準進行比較以構成其他受試者中有益的預防性或治療性治療方案。若所量測的抗體水準顯著小於參考水準(例如，在受益於治療的受試者之群體中小於平均值減一倍或較佳兩倍參考值之標準偏差)，則指示投與額外劑量的抗體。

亦提供例如藉由量測受試者之樣本中TTR類澱粉蛋白或TTR之病原形式(例如，TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式)或藉由受試者中TTR之體內成像，偵測受試者中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之方法。此類方法可用於診斷與TTR之病原形式(例如，TTR類澱粉變性)相關聯的疾病或疾病易感性或確認其診斷。該等方法亦可用於無症狀受試者。TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在指示對未來無症狀疾病的易感性。該等方法亦可用於監測先前診斷有TTR類澱粉變性的受試者中疾病進展及/或治療反應。

獲自患有TTR類澱粉變性、疑似患有TTR類澱粉變性或冒TTR類澱粉變性風險的受試者之生物樣本可與本文所揭示之抗體接觸以估計TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在。舉例而言，此類受試者中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之水準可相較於健康受試者中存在的水準。或者，接受疾病治療的此類受試者中TTR類澱粉蛋白或TTR之病原形式(例如，TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式)之水準可與未治療TTR類澱粉變性的受試者中之水準進行比較。一些此類測試涉及獲自此類受試者之組織的生檢。ELISA分析亦可為例如用於估計流體樣本中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之水準的可用方法。一些此類ELISA分析涉及相對於TTR之正常四聚物形式較佳結合TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式的抗TTR抗體。

體內成像方法可藉由投與諸如結合受試者中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式的抗體的試劑，且隨後在其結合之後偵測試劑來工作。此類抗體通常結合至TTR之殘基89-97內的抗原決定位。若需要，則清除反應可藉由使用缺乏諸如Fab之全長恆定區的抗體片段來避免。在一些方法中，相同抗體可充當治療及診斷試劑兩者。

診斷試劑可藉由靜脈內注射至受試者體內，或經由認為合理的其他途徑來投與。試劑之劑量應在與治療方法相同的範圍內。通常，試劑經標記，儘管在一些方法中，具有TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之親和力的一級試劑未經標記，且二級標記試劑用於結合該一級試劑。標記之選擇取決於偵測手段。舉例而言，螢光標記適用於光偵測。順磁標記之使用適用於斷層攝影偵測而無手術介入。放射性標記亦可使用PET或SPECT偵測。

診斷係藉由將標記基因座之數目、大小及/或強度與對於基線值比較來進行。基線值可代表未患病個體之群體中之平均水準。基線值亦可代表相同受試者中所測定的先前水準。舉例而言，基線值可在治療之前於受試者中測定，且之後將量測值與基線值進行比較。值相對於基線的減小一般而言標誌治療之陽性反應。

IX.套組

本發明進一步提供包含本文所揭示之人類化6C1抗體及諸如使用說明書(例如，包裝插頁)之相關材料的套組(例如，容器)。使用說明書可含有例如投與抗體及視情況一或多種另外試劑的說明書。抗體之容器可為單位劑量、大包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。

包裝插頁係指習慣上包括於治療產品之商業包裝中之說明書，其含有關於涉及此等治療產品之使用之適應症、用法、劑量、投與、禁忌及/或警告之資訊。

套組亦可包括第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝液、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可亦包括自商業及使用者觀點看來合乎需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

X.其他應用

在臨床診斷或治療之情景中或在研究中，抗體可用於偵測甲狀腺素運送蛋白(TTR)之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式，或其片段。舉例而言，抗體可用於偵測生物樣本中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在作為生物樣本包含TTR類澱粉蛋白沉積物之指示。抗體對生物樣本之結合可與抗體對對照樣本之結合比較。對照樣本及生物樣本可包含相同組織起源之細胞。對照樣本及生物樣本可獲自相同個體或不同個體且在相同情況下或在不同情況下。若需要，則在多種情況下評估多種生物樣本及多種對照樣本以避免與樣本之間差異無關的隨機變化。隨後可在生物樣本與對照樣本之間進行直接比較以測定生物樣本之抗體結合(亦即，TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在)相對於對照樣本之抗體結合增大、減小還是相同。抗體對生物樣本之結合相對於對照樣本增大指示生物樣本中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在。在一些情況下，抗體結合增大為統計學顯著的。視情況，結合至生物樣本的抗體為至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍高於對照樣本之抗體結合。

此外，抗體可用於偵測生物樣本中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在以監測及評估用於治療診斷患有TTR類澱粉變性之患者的治療劑的效力。評估診斷有TTR類澱粉變性的患者之生物樣本以在用治療劑開始治療之前確立抗體對樣本之結合基線(亦即，樣本中TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在的基線)。在一些情況下，在多個情況下評估患者之多種生物樣本以確立與治療無關的隨機變異的基線及量度。隨後以一方案投與治療劑。方案可包括在一段時間內試劑的多次投與。視情況，在多種情況下於患者之多種生物樣本中評估抗體之結合(亦即，TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在)以確立隨機變異之量度且展示對免疫療法的反應的傾向。隨後比較抗體結合至生物樣本的各種估計值。若僅進行兩次估計，則可在兩次估計之間進行直接比較以測定兩次估計之間的抗體結合(亦即，TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在)增加、減少還是保持相同。若進行超過兩次量測，則可以在用治療劑治療之前開始及進行經過療法療程的時程的形式分析量測。在抗體結合至生物樣本降低的患者(亦即，TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之存在)中，可推斷治療劑在治療患者中之TTR類澱粉變性方面為有效的。抗體結合之降低可為統計學顯著的。視情況，結合降低至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。抗體結合之估計可結合估計TTR類澱粉變性之其他徵象及症狀進行。

抗體亦可用作偵測TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式，或其片段的實驗室研究之研究劑。在此類用途中，可將抗體用螢光分子、自旋標記分子、酶或放射性同位素標記，且可以具有進行偵測分析的所有必需試劑的套組形式提供。抗體亦可用於例如藉由親和力層析來純化TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式，或TTR之單體、錯誤折疊、聚集或原纖維形式之結合配偶體。

抗體亦可用於抑制或減少TTR之聚集、抑制或減少TTR原纖成形、減少或清除TTR沉積物或TTR聚集物或穩定生物樣本中TTR之非毒性構形。生物樣本可包含例如血液、血清、血漿或組織(例如，心臟、周邊神經系統、自主神經系統、腎、眼睛或胃腸道之組織)。在一些情況下，TTR聚集、TTR原纖成形或TTR沉積物抑制或減少至少10%、20%、25%、30%、40%、50%或75%(例如，10%-75%或30%-70%)。本文其他處描述偵測原纖成形之分析。亦參見US 2014/0056904。

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實例

實例1. mis-TTR單株抗體之鑑別

如材料及方法(a-d)中所述產生、篩選、表現且純化針對TTR之單體、錯誤折疊、原纖維或聚集形式(mis-TTR)的構形特異性單株抗體。為了產生mis-TTR單株抗體，檢查人類四聚物TTR之晶體結構以找出埋在四聚物中，但在將四聚物解離成其單體次單元之後暴露的蛋白質之區。所鑑別之區為殘基89-97(EHAEVVFTA)(SEQ ID NO：42)，其定位於TTR之F鏈內且在四聚蛋白質之二聚物界面處螯合。蛋白質資料庫之BLAST搜索未顯示擁有此序列之任何其他人類蛋白質。

合成包含此序列(ggEHAEVVFTAggkg)(SEQ ID NO：43)的肽。大寫字母代表TTR之殘基89-97。小寫字母代表另外的連接子殘基，添加該等連接子殘基以提高抗原肽之溶解度且將9個胺基酸片段建立為內部序列。此肽連接至聚離胺酸樹突狀核，產生包含多個支鏈連接至TTR 89-97肽的離胺酸殘基之核的多抗原肽免疫原(TTR-MAP)。產生表2中所列舉的針對TTR-MAP之抗體。

除此多抗原肽之外，藉由將類似的TTR 89-97肽(Ac-cggEHAEVVFTA-醯胺(SEQ ID NO：44)及Ac-EHAEVVFTAcgg-醯胺)(SEQ ID NO：45)經由N端及C端半胱胺酸殘基共價連接至鑰孔血藍蛋白(TTR89-97-N-KLH及TTR89-97-C-KLH)產生含有相同TTR片段的兩種其他免疫原。

在抗體產生、篩選、表現及純化之後，藉由對於重組人類TTR F87M/L110M進行表面電漿子共振(SPR)測定先導mis-TTR抗體之詳細結合動力學參數(締合速率(k_a)、解離速率(k_d)及結合親和力常數(K_D))，如表2中所示。根據GE Healthcare抗小鼠套組中所提供的說明書，將抗小鼠IgG(GE Healthcare)經由胺偶合固定於感測器晶片C5(缺乏聚葡糖鏈)上，且捕獲mis-TTR mAb至一水準以確保分析物之最大結合為30-50RU。將各種濃度的分析物(重組人類TTR F87M/L110M)以30μl/min於3倍稀釋液中的電泳緩衝液(HBS+0.05% P-20,1mg/mL BSA)中經過所捕獲的配體。就各濃度而言，反應進行使得在締合期間較高分析物濃度達到平衡，以及在解離期間至少10%的訊號衰減的時間段。至少一個濃度(不為最高或最低)進行兩次。基於初步實驗選擇分析物之濃度範圍以使跨度為至少高於K_D 10倍至低於K_D 10倍。

先導mis-TTR mAb之SPR分析結果展示於以下表2中。

實例2. mis-TTR抗體對TTR抗原的結合

藉由ELISA在0.31至2.5μg/ml範圍的濃度下使用pH 4.0處理的TTR(pH4-TTR)及原態TTR作為披覆抗原分析四種先導mis-TTR mAb(9D5、14G8、6C1及5A1)。TTR抗原製備及ELISA協定描述於材料及方法中其他處(e-g)。

所得抗原曲線以及表列K_d及B_最大值展示於以下圖3及表3中。圖3中之結果以任意單位(a.u.)表示於y軸上。所有mAb展示對pH4-TTR的顯著結合，其中K_d值在16nM(6C1)至282nM(9D5)範圍內。結合至pH4-TTR的B_最大值在下限0.65 a.u.(14G8)至上限2.02(9D5)範圍內。與對 pH4-TTR的結合相反，沒有抗體展示對原態TTR的顯著結合，從而指示所產生的所有TTR抗體皆對TTR之非原態形式具有特異性。

實例3. 藉由SDS-PAGE及原態-PAGE分析mis-TTR抗體

藉由SDS-PAGE/西方墨點分析9D5及14G8以證明對於TTR之單體/變性形式相對原態非變性TTR之結合特異性。SDS-PAGE、原態-PAGE及西方墨點法協定描述於方法及材料中其他處(h-j)。

將非變性TTR或pH4-TTR與熱變性TTR及熱變性pH4-TTR並排在SDS-PAGE凝膠上進行電泳。在電泳之後，將凝膠於硝化纖維素上進行西方墨點且用TTR mAb 9D5及14G8染色。兩種抗體僅識別當在pH4下處理時或當TTR或pH4-TTR在SDS-PAGE之前首先熱變性的TTR。此等9D5及14G8因此展示對於藉由TTR之變性或藉由在pH4下處理TTR所產生的TTR構形的特異性。

亦藉由SDS-PAGE/西方墨點分析6C1及5A1連同全部TTR mAb(7G7,8C3)及可商購獲得的Sigma多株抗體。各墨點含有染色分子量標誌物、非變性TTR及pH4-TTR。

染色SDS-PAGE凝膠展示非變性TTR樣本中存在的主要物質為約38kDa二聚物。相反，pH4-TTR樣本中存在的主要組分以約35kDa二聚物形式進行，其中少量二聚物為約15kDa單體之二聚物。此二聚物以略小於非變性TTR樣本中存在的二聚物之蛋白質形式進行，指示兩種TTR二聚物物質之間的構形差異。

使用四種mis-TTR抗體的TTR及pH4-TTR之西方墨點法展示此等mAb不識別非變性TTR，但結合至pH4-TTR樣本中存在的變性單體及二聚物。因此，當藉由SDS-PAGE/西方墨點分析時，四種mis-TTR mAb(9D5、14G8、6C1及5A1)展示對TTR之非原態構形的類似特異性。

與四種mis-TTR mAb相反，作為兩種TTR對照mAb，經由具有完整TTR的小鼠之免疫所產生之7G7及8C3識別TTR及pH4-TTR樣本中存在的所有TTR物質，包括四聚物TTR物質。因此，不同於mis-TTR mAb，此等對照mAb結合TTR但不具有構形特異性。Sigma多株抗體之行為類似於7G7及8C3對照mAb。

亦在原態凝膠上對TTR及pH4-TTR進行實驗以看是否四種mis-TTR mAb能夠展示在非變性凝膠條件下的構形特異性。在染色原態PAGE凝膠上，TTR以具有少量四聚物的約35kDa原態二聚物形式進行。相反，pH4-TTR主要以具有少量約35kDa二聚物之高分子量塗片(smear)形式進行。非特異性Sigma多株抗體識別TTR及pH4-TTR樣本中存在的所有TTR物質。相反，9D5僅識別pH4-TTR樣本中存在的高分子量TTR物質。如SDS-PAGE/西方墨點研究中所觀察，9D5不識別原態TTR物質中之任一者。

隨後藉由原態-PAGE/西方墨點法分析所有四種mis-TTR mAb。如所預期且類似於9D5，其他mis-TTR mAb，14G8、6C1及5A1，特異性結合至pH4-TTR樣本中存在的TTR之高分子量非原態形式。此等抗體中沒有抗體識別約35kDa原態TTR二聚物。此等結果指示，四種mis-TTR mAb之行為類似且僅識別構形不同於原態TTR的非原態TTR物質。

實例4. mis-TTR抗體對TTR纖維形成的抑制

TTR-Y78F為一種含有在蛋白質序列之位置78處使TTR四聚物去穩定化的點突變的TTR變體。隨著時間的推移且在略微酸性條件下，TTR變體解離成其單體次單元，其隨後可繼續聚集且形成能夠結合至硫代黃素-T的纖維。纖維形成之程度可因此藉由量測480nm下之硫代黃素-T螢光來監測。引入對解離TTR單體或聚集物具有特異性的mis-TTR抗體可防止TTR纖維之組裝導致硫代黃素-T螢光相對於無抗體對照反應物減小。用於檢查TTR纖維形成的抑制的協定描述於材料及方法中其他處(k)。

所有四種mis-TTR抗體相對於同型對照強烈抑制硫代黃素-T反應性TTR-Y78F纖維之形成(結果展示於圖4中且以任意單位(a.u.)呈現於y軸上)。mis-TTR抗體5A1幾乎完全抑制纖維形成。此等結果與mis-TTR抗體結合TTR之單體及/或聚集形式，從而防止TTR纖維形成之想法一致。

表4總結針對4種mis-TTR抗體(9D5、14G8、6C1及5A1)組所獲得的特徵化資料，其展示對TTR之非原態形式之良好的構形選擇性。此等抗體對pH4-TTR的親和力(K_D)在14.5nM(6C1)至257nM(9D5)範圍內，且B_最大值在0.65 a.u.(14G8)至2.02(9D5)範圍內。此等抗體中沒有抗體識別原態TTR，但關於結合至SDS-PAGE/西方墨點法的pH4-TTR及原態-PAGE/西方墨點法的高分子量TTR聚集物。在使用Thio-T的纖維形成分析中，根據讀出，此等抗體亦抑制TTR纖維之形成。

TTR-V122I為一種含有在位置122處使四聚物去穩定化的單點突變之TTR變體。原纖成形與ThT螢光增大相關聯。增大14G8 mAb濃度造成ThT螢光中單體減少，指示TTR纖維化之次化學計量抑制(IC₅₀=0.028±0.009mg/mL；n=3；圖4B及表4a)。同型對照mAb不造成TTR纖維化之抑制(圖4C)，因此證明14G8介導之抑制的特異性。

對5A1及6C1所測定的可比較次化學計量IC₅₀值(表4a)表明對於此等mis-TTR mAb中每一者的原纖維抑制之相似機制。相反，9D5 非預期地無法抑制TTR-V122I原纖成形，儘管其展示對於非原態TTR類似的特異性及親和力。仍需研究是否9D5對所使用的分析條件更敏感。

實例5. 使用mis-TTR mAb免疫組織化學(IHC)特徵化ATTR組織

於來自經確認TTR心臟類澱粉變性患者之新鮮冷凍且石蠟處理的組織上對針對甲狀腺素運送蛋白之TTR 89-97片段所產生的先導mis-TTR mAb進行免疫組織化學測試。用於獲得且製備心臟組織樣本的協定、免疫組織化學(IHC)及影像分析皆提供於材料及方法中其他處(l-o)。用於IHC的抗體描述於表5中。

心臟組織樣本獲自確診ATTR突變之患者。免疫組織化學檢查之案例之人口統計如下且總結於表6中：FAC=家族性類澱粉蛋白心肌病變；FAP=家族性類澱粉蛋白多發性神經病變；1° AL=輕鏈類澱粉變性；ATTR=甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性；Unk=未知

於來自經確認TTR心臟類澱粉變性患者之新鮮冷凍且石蠟處理的組織上對針對甲狀腺素運送蛋白之89-97片段所產生的小鼠單株抗體(mis-TTR mAb)進行免疫組織化學測試。各mis-TTR抗體在ATTR心臟組織上展示免疫反應性。遍及心肌及脈管系統之沉積物中觀察到深色染色。當將免疫反應性與用剛果紅染色硫代黃素-T相比較時，組織中免疫反應性之大多數展示與剛果紅雙折射及硫代黃素T陽性染色高度一致。此證實此組織中所沉積的TTR類澱粉蛋白之β褶板本質。此等mis-TTR抗體亦偵測前類澱粉蛋白TTR，其定位於心肌中TTR免疫陽性但剛果紅或硫代黃素T陰性的區域。IgG同型對照抗體及一級抗體省略切片均對於跨所測試的所有組織的染色為陰性。對其他類澱粉蛋白產生蛋白(λ及κ輕鏈或類澱粉蛋白A)具有反應性的抗體對此分析中所使用的ATTR心臟組織不具有反應性，指示沉積物特定言之本質上為TTR。

將mis-TTR抗體之染色圖案與用良好特徵化的市售TTR參考抗體(前白蛋白，A0002；Dako；Carpinteria,CA)所獲得的染色圖案進行比較。DAKO參考抗體染色與mis-TTR抗體相同區域中的患病心肌，但產生更分散的顏色圖案。DAKO參考抗體染色脈管系統上存在的剛果親和性(congophillic)TTR類澱粉蛋白沉積物並不像mis-TTR抗體一樣強。

mis-TTR抗體不染色正常非病組織。此外，如所預期，用同型對照抗體染色，6F10亦為陰性。

為判定mis-TTR抗體之反應性對TTR沉積物是否具有特異性，檢查此等抗體對來源於診斷有原發性AL類澱粉變性的患者之心臟組織的交叉反應性。如所預期，未觀測到AL類澱粉蛋白組織之染色，證實TTR抗體對ATTR患病組織特異性地反應。

確診老年全身性類澱粉變性的患者或證實由TTR基因中點突變所造成的FAC或FAP的患者之心臟組織亦在14G8、9D5、6C1及5A1之情況下為陽性染色。此等結果指示，mis-TTR抗體具有識別心臟組織中TTR沉積物的能力，與ATTR基因型無關。

亦對於由14G8、9D5、6C1及5A1染色檢查已知表現TTR的其他非心臟組織，且相較於使用DAKO參考抗體所獲得的染色。如所預期，使用Dako參考抗體，肝、胰及脈絡叢皆對於TTR為陽性染色。相反，mis-TTR抗體僅染色定位於蘭氏小島(Langerhans)及脈絡叢中的胰α細胞，表明定位於此等器官之TTR中之一些構形上不同於肝中所表現的TTR。肝中缺乏mis-TTR mAb免疫反應性表明，其中所表現之大量TTR主要為四聚原態TTR且不具有所敘述的mis-TTR表型。

實例6. 藉由SDS-PAGE/西方墨點法及藉由Meso Scale Discovery(MSD)板分析進行的ATTR相對正常人類血漿之分析

經確認V30M ATTR之患者之六種血漿樣本(樣本#11、#12、#15、#18、#19、#20)及正常受試者之6種樣本(#21、#22、#23、#24、#25、 #27)獲自M.Saraiva(Porto University,Portugal)。樣本#C6為獲自市售來源(BioreclamationIVT)之正常人類血清樣本。藉由SDS-PAGE及西方墨點法，或藉由MesoScale Discovery(MSD)板分析來分析樣本。用於此等分析之協定描述於材料中其他處(p-r)。產生使用6C1的MSD板分析的標準曲線。

在使用9D5或5A1 mis-TTR mAb的所得西方墨點法中，正常與TTR-V30M患病血漿樣本之間的差異明顯。所有血漿含有約14kDa TTR帶，其與pH4-TTR參考樣本中存在的非原態TTR單體共遷移。一般而言，來源於TTR-V30M患者的血漿樣本(#21、22、23、24、25及27)具有更多此mis-TTR物質。此外，來源於V30M患者的血漿樣本亦含有約30kDa帶，其與參考樣本中存在的非原態TTR二聚物共遷移。除樣本#12及#18之外，血漿樣本亦來源於擁有較少此二聚物物質之正常個體。

掃描所得西方墨點，且將各樣本之組合9D5或5A1反應性TTR二聚物及單體帶之強度作圖(結果展示於圖5A(9D5)及5B(5A1)中且以任意單位(a.u.)呈現於y軸上)。除血漿樣本#15及#18之外，來源於正常個體之血漿樣本(11、12、19及20)含有少於來源於V30M患者之樣本(21-25及27)的9D5反應性二聚物及單體。

藉由9D5及5A1西方墨點法分析的12種血清樣本亦藉由MSD板分析，使用6C1作為mis-TTR捕獲抗體且Dako-SulfoTag抗體作為偵測抗體來分析。此等MSD分析之結果展示於圖6中且以任意單位(a.u.)表示於y軸上。樣本11、12、15、18、19及20代表正常血漿。樣本21-25及27代表V30M患病血漿。

除血漿樣本#15及#18之外，來源於正常個體之血漿樣本中存在的6C1反應性TTR之量低於TTR-V30M患病個體之血漿中所觀測之量。藉由MSD分析所量測的6C1反應性水準與上文藉由SDS-PAGE/西方墨點法所觀測的9D5反應性二聚物及單體之量相關性良好。

為測定血漿樣本中存在的反應性TTR物質之濃度，使用6C1作為捕獲抗體且8C3-SulfoTag作為偵測抗體再分析相同樣本。將MSD訊號使用上文所產生的TTR F87M/L110M標準曲線轉換成ng/ml反應性TTR物質濃度。基於此分析，對照樣本中存在的6C1反應性TTR之平均濃度為271 +/- 185ng/ml。相反，V30M患病血漿樣本中存在的反應性TTR之平均濃度較高，為331 +/- 95ng/ml。總而言之，此等MSD結果表明，mis-TTR抗體能夠在ATTR疾病相較於正常血漿之間進行區分。此保證進一步發展mis-TTR抗體用於ATTR疾病之診斷分析中。

實例7. 人類化6C1抗體之設計

用於人類化之起始點或供體抗體為小鼠抗體6C1。成熟m6C1之重鏈可變胺基酸序列提供為SEQ ID NO：1。成熟m6C1之輕鏈可變胺基酸序列提供為SEQ ID NO：13。重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列分別提供為SEQ ID NO：10-12。輕鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列分別提供為SEQ ID NO：18-20。Kabat編號遍及此實例使用。

m6C1之可變κ(Vk)屬於小鼠Kabat子群2，其對應於人類Kabat子群2。m6C1之可變重(Vh)屬於小鼠Kabat子群3d，其對應於Kabat子群3。參見Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版.NIH出版號91-3242,1991。16個殘基CDR-L1屬於典範類4，7個殘基CDR-L2屬於典範類1，且9個殘基CDR-L3屬於Vk之典範類1。參見Martin及Thornton,J.Mol.Biol.263：800-15,1996。10個殘基CDR-H1(Chothia及Kabat CDR-H1之複合物，如表7所示之殘基26-35)屬於典範類1，且17個殘基CDR-H2屬於典範類1。參見Martin及Thornton,J Mol.Biol.263：800-15,1996。CDR-H3不具有典範類。

在Vk與Vh域之間的界面處的殘基為常見殘基。

對PDB資料庫中之蛋白質進行搜索(Deshpande等人，Nucleic Acids Res.33：D233-7,2005)以找出可提供6C1之粗糙結構模型的結構。抗體fab(pdb代碼3EYS)之晶體結構(Gardberg等人，Biochemistry(2009)第48(23)卷，第5210-5217頁)用於Vk結構，因為其具有良好的解析度(1.95A)、類似於6C1 Vk的整體序列且保留與6C1相同環的典範結構。二聚體抗體(pdb代碼2OTU)(Li等人，Submission to GenBank(2007))用於Vh結構，因為其具有良好的類似性及解析度(1.68 A)且其含有的CDR-H1及CDR-H2的典範結構與6C1 VH的典範結構相同。BioLuminate軟體(得到Schrodinger公司許可)用於建模6C1之粗糙結構。

搜索NCBI之非冗餘蛋白質序列資料庫允許選擇合適移植鼠類CDR的人類架構。就Vh而言，選擇人類Ig重鏈ADX65650(GI：323432015)(SEQ ID NO：3)(Scheel等人，Submission to GenBank(2010))。其分享6C1之典範形式。就Vk而言，選擇NCBI登錄代碼ABI74084(GI：114385652)的人類κ輕鏈(SEQ ID NO：15)(Shriner等人Submission to GenBank(2006))。其CDR-L1及L2之典範類與親代Vk之典範類相同。

構建六種人類化重鏈可變區變體及兩種人類化輕鏈可變區變體，其含有取代之不同排列(Hu6C1VHv1、Hu6C1VHv1b、Hu6C1VHv2、Hu6C1VHv2b、Hu6C1VHv3及Hu6C1VHv3b(分別為SEQ ID NO：4-9)及Hu6C1VLv1-2(分別為SEQ ID NO：16及17))(表7及8)。示範性人類化Vh及Vk設計分別展示於表7及8中，其中回復突變及其他突變係基於所選擇的人類架構。表7及8中之第一欄中灰色陰影區域指示CDR由Chothia定義，且表7及8中剩餘欄中灰色陰影區域指示CDR由Kabat定義。SEQ ID NO：4-9、16及17含有如表9中所展示的回復突變及其他突變。Hu6C1VHv1、Hu6C1VHv1b、Hu6C1VHv2、Hu6C1VHv2b、Hu6C1VHv3及Hu6C1VHv3b，及Hu6C1VLv1-2中位置L2、L45、H19、H44、H49、H76、H77、H82(a)、H83及H89處的胺基酸列舉於表10中。

鼠類6C1 Vh序列(SEQ ID NO：1)與小鼠模型序列(2OTU_B.pro；SEQ ID NO：2)、人類受體序列(ADX65650；SEQ ID NO：3)及Hu6C1VHv1、Hu6C1VHv1b、Hu6C1VHv2、Hu6C1VHv2b、Hu6C1VHv3及Hu6C1VHv3b序列(分別為SEQ ID NO：4及9)之比對展示於圖1中。如Kabat所定義的CDR區帶有陰影。在小鼠與人類受體序列之間典範、游標或界面殘基不同的位置為取代的候選者。游標/CDR基礎殘基之實例包括表7中之Kabat殘基2、49、69、71、75、78及94。典範/CDR相互作用殘基之實例包括表7中之Kabat殘基24、48及73。界面/堆積(VH+VL)殘基之實例包括表7中之Kabat殘基37、39、45、47、91、93及103。

鼠類6C1 Vk序列(SEQ ID NO：13)與小鼠模型序列(3EYS_L_St.pro；SEQ ID NO：14)、人類受體序列(ABI74084；SEQ ID NO：15)及Hu6C1VLv1及Hu6C1VLv2序列(分別為SEQ ID NO：16及17)之比對展示於圖2中。如Kabat所定義的CDR區帶有陰影。在小鼠與人類受體序列之間典範、游標或界面殘基不同的位置為取代的候選。游標/CDR基礎殘基之實例包括表8中之Kabat殘基4、35、46、49、66、68及69。典範/CDR相互作用殘基之實例包括表8中之Kabat殘基2、48、64及71。界面/堆積(VH+VL)殘基之實例包括表8中之Kabat殘基36、38、44、87及98。

選擇輕鏈可變區中表9及10中所指示的位置作為取代之候選者的基本原理為如下。

I2V：此為典範CDR相互反應殘基。Ile之較大側鏈可潛在地與CDR L1及L2堆積相互作用。此殘基回復突變至Hu6C1VH1中之Val。

Q45K：Lys在此位置處比人類序列中之Gln更頻繁；因此為基於頻率的回復突變。

選擇重鏈可變區中表9及10中所指示的位置作為取代之候選者的基本原理為如下。

R19K：Lys與接合殘基形成H鍵，而Arg不會。

G44R：Arg與輕鏈中界面殘基Phe98形成H鍵，而Gly不會。

S49A：Ser可潛在地與CDR-H2中之Hys形成H鍵。

N76S：此殘基處存在高脫醯胺暴露。Ser為此位置處人類生殖系中第二最頻繁。

S77T：此位置處的絲胺酸在人類生殖系重鏈構架中極罕見，然而，蘇胺酸在位置77處最頻繁。進行此回復突變以減輕任何免疫原性潛能。

N82(a)S：此殘基處存在高脫醯胺暴露。Ser為此位置處人類生殖系中第二最頻繁。

R83K：此位置處之Lys與接合殘基形成多種相互作用，似乎對環產生穩定化作用，然而Arg不會。

V89M：Met與干擾殘基殘基Tyr91形成H鍵且似乎穩定該界面，然而Val不與Tyr91相互作用。

兩種人類化輕鏈可變區變體及兩種人類化重鏈可變區變體如下：

Hu6C1VL版本1(以小寫形式的I2V及Q45K回復突變)：

(SEQ ID NO：16)

Hu6C1VL版本2(以小寫形式的Q45K回復突變)：

(SEQ ID NO：17)

Hu6C1VH版本1(以小寫形式的S77T回復突變)：

(SEQ ID NO：4)

Hu6C1VH版本1b(以小寫形式的S49A及S77T回復突變)：

(SEQ ID NO：5)

Hu6C1VH版本2(以小寫形式的N76S、S77T及N82(a)S回復突變)：

(SEQ ID NO：6)

Hu6C1VH版本2b(以小寫形式的S49A、N76S、S77T及N82(a)S回復突變)：

(SEQ ID NO：7)

Hu6C1VH版本3(以小寫形式的R19K、G44R、S77T、R83K及V89M回復突變)：

(SEQ ID NO：8)

Hu6C1VH版本3b(以小寫形式的R19K、G44R、S49A、S77T、R83K及V89M回復突變)：

(SEQ ID NO：9)

實例8. 人類化6C1抗體之結合動力學分析

藉由Biacore特徵化包含選自版本3b的重鏈及選自版本2的輕鏈的人類化6C1抗體之結合動力學且展示如下。

實例9. 材料及方法

a.抗體產生協定

將小鼠每週於RIBI佐劑中或每月於TiterMax佐劑中以抗原肽TTR-MAP、TTR89-97-N-KLH或TTR89-97-C-KLH免疫。在融合之前三至四天，將所選擇的小鼠於鹽水溶液中以免疫原給予最終IV強化。將脾勻漿化以製備脾細胞且使用標準電融合協定用SP2/0骨髓瘤細胞融合。將選擇培養基中融合細胞平板接種於96孔板中且在7-10天之後進行篩選。

b.抗體篩選協定

融合瘤選擇係基於以下ELISA篩選：將96孔ELISA板塗佈雞抗His、1μg/mL PBS且孵育1小時。將板用200uL/孔1% BSA/PBS溶液阻斷15分鐘，隨後添加50μL/孔0.5μg/mL pH4-TTR且孵育1小時。pH4-TTR為已經歷低pH(50mM乙酸鈉，pH 4.0)之TTR以解離/聚集TTR，暴露TTR89-97抗原決定位。將板用TBS-T清洗兩次。以50μL/孔添加融合板之上清液且孵育1小時。將板用TBS-T清洗兩次。以50μL/孔添加偵測抗體，1：5,000稀釋於0.5% BSA/PBS/TBS-T中的山羊抗小鼠(IgG1、2a、2b、3特異性)-HRP，且孵育1小時。最終，將板用TBS-T清洗五次，且以100μL/孔添加TMB基質。15分鐘之後，以50μL/孔用2N硫酸使基質發展停止。在450nm下讀取板。選擇具有O.D.>1.0的孔，且將細胞轉移至24孔板。生長3天之後，將殖株用上文分析進行反向篩選以證實結合，且以原態TTR取代pH4-TTR最陰性反向篩選，允許選擇產生對TTR之非原態形式具有特異性的TTR mAb的殖株。

c.抗體表現協定

將攜帶人類化單株抗體序列的CMV驅動輕鏈及重鏈質體轉染至CHO-S1細胞(Life Technology)中。應用雙重選擇以製造所選擇的池。分析條件培養基之效價、結合且藉由SDS-PAGE/西方墨點法分析。使用 Clonepix系統(Molecular Devices)，所選擇的池用於殖株產生。基於抗體效價將殖株分級。將所選擇的殖株擴展且保存入庫。

將產率最高的殖株於搖瓶中擴展且將培養物用於孵育10-25 L Wave袋培養物。將補充有Glutamax的FreeStyle-CHO、CD OptiCHO及FreeStyle F17表現培養基之混合物(培養基及Glutamax來自Life Technology)用於搖瓶且用於Wave袋培養物。使用Wave Bioreactor(GE Heathcare)，在37℃、7% CO₂下，在持續攪拌下製作分批培養物。週期性地將樣本抽出以監測細胞數目、活力及抗體產生。若需要，用Cell Boost(HyClone)進行補充。當細胞活力開始下降低於90%(5-7天)時收集分批培養物。

d.抗體純化協定

在首先使懸浮液中的細胞經由重力在4℃下沉降至Wave袋底部之後，收集細胞培養物。將收集的培養基經由深度過濾器(Millistak Pod COHC,Millipore)澄清，藉由切向流動過濾(Pelicon 2PLC 30K,Millipore)濃縮10倍，且經由0.2汹μm過濾器(Opticap XL,Millipore)無菌過濾。隨後使用FPLC(Akta Avant,GE Lifesciences)，將濃縮的條件培養基裝載至於pH 7.4的1xPBS中預平衡的蛋白質G瓊脂糖凝膠快速流動柱(GE Lifesciences)上。將未結合蛋白質用5-10倍柱體積pH 7.4的1xPBS洗出柱，直至OD₂₈₀達到基線。將結合抗體用2倍柱體積IgG溶離緩衝液(Thermo Scientific)自柱溶離。將溶離餾出物收集且用pH 9.0的2M Tris(60汹μL每1ml溶離液)進行pH中和。

將含抗體之餾出物合併且在4℃下用pH 7.4的1xPBS透析隔夜。隨後將透析樣本藉由通過0.2μm PES過濾器的超濾殺菌且在4℃下儲存。藉由二喹啉甲酸(BCA)使用牛γ-球蛋白作為蛋白質標準(Thermo Scientific)測定最終蛋白質濃度。

e.重組TTR表現及純化協定

將大腸桿菌(E.coli)(BL21-A1)細胞用含有TTR插入物Met-hTTR-(His)₆或含有F87M/L110M雙突變的TTR變體的pET21a(+)質體轉型。使細胞生長於含有100μg/ml安比西林的2YT培養液中。在20℃下，在1mM IPTG及0.05%阿拉伯糖存在下誘導TTR之表現隔夜。

藉由以4000 x g離心10分鐘收集細胞，且在-80℃下儲存直至使用。藉由經由LV-1高剪切處理器(Microfluidics公司)處理，將10-15g細胞沉澱物解凍且溶解於50ml緩衝液A(含有500mM NaCl、20mM咪唑的1xPBS)中。將溶解細胞以12,000 x g離心15分鐘，過濾通過0.2μm PES過濾器，之後於His-Trap HP柱(GE Lifesciences)上純化。裝載之後，將柱用10 c.v.緩衝液A清洗且用緩衝液B(具有500mM NaCl、500mM咪唑的1xPBS)溶離。將對應於TTR之峰餾出物收集，用1xPBS透析且在-80℃下儲存直至使用。

f. TTR抗原製備

藉由將重組TTR-6His之濃縮儲備液稀釋至於1x PBS中2.5μg/ml的最終濃度來製備原態TTR抗原。藉由在室溫下，在0.2mg/ml的濃度下於50mM pH 3.95的乙酸鈉中孵育重組TTR歷時72小時來產生pH4處理TTR。在此等條件下，TTR解離成TTR單體及結構不同於原態TTR的聚集形式的混合物。隨後將pH4-TTR稀釋至於1xPBS中2.5μg/ml之最終濃度，之後立即用於分析。將96孔板(Costar #3690)在室溫以於1xPBS中的1.0μg/ml雞抗his多株抗體(Abcam #Ab9107)下在50μl每孔之情況下塗佈持續1小時。將塗層溶液捨棄且將板以溶解於1xPBS中含1x BSA的阻斷緩衝液(G-Biosciences #786-193)在250μl/孔體積之情況下阻斷1小時。

g. ELISA協定

將塗佈且阻斷的96孔板在室溫下以2.5μg/ml TTR抗原(原態TTR或pH4-TTR)在50μl每孔之情況下處理1小時。隨後將板以清洗緩衝液(含有0.05% Tween-20的1x Tris緩衝鹽水)在250μl每孔之情況下清洗兩次。隨後將清洗的板以在0.31至2.5μg/ml範圍內的濃度下的適當抗TTR單株抗體在50μl每孔之情況下處理1小時。

將處理的板在250μl每孔之情況下用清洗緩衝液清洗3次。清洗之後，將板以包含過氧化物結合的山羊抗小鼠(Jackson ImmunoResearch #115-035-164)於1xPBS中的1：5,000稀釋液的偵測抗體在50μl每孔之情況下處理1小時。隨後將板清洗3次，之後添加100μl每孔TMB基質(Rockland)。使HRP反應在室溫下進行15分鐘，之後用50μl每孔體積1N H₂SO₄淬滅。在450nm之波長下量測光譜吸收率。

h. SDS-PAGE

如下於SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。將0.1-1μg於1xLDS樣本緩衝液(Life Technologies)中的TTR或pH 4.0-TTR裝載至10% NuPAGE bis-tris凝膠上且在恆定90V下於MES緩衝液中經歷電泳105分鐘。電泳之後，將凝膠於Instant Blue(Expedeon)中染色或轉移至硝化纖維素過濾器用於西方墨點法分析。

i.原態-PAGE

如下於原態Tris-甘胺酸凝膠上進行電泳。將0.1-1μg於1xTris-甘胺酸樣本緩衝液(Life Technologies)中的TTR或pH 4.0-TTR裝載至10-20% Tris-甘胺酸凝膠上且在恆定120V下於1x原態Tris-甘胺酸運行緩衝液中經歷電泳105分鐘。電泳之後，將凝膠於Instant Blue(Expedeon)中染色或轉移至硝化纖維素過濾器用於西方墨點法分析。

j.西方墨點法

將SDS-PAGE凝膠或原態-PAGE凝膠點墨至硝化纖維素過濾紙(iBlot,P7 Program)上且用阻斷溶液(Licor)阻斷30分鐘。隨後將過濾器在室溫下孵育於0.5μg/ml於阻斷緩衝液中的一級抗體中1小時(或在4℃下隔夜)，接著用1xTBS清洗三次，每次10分鐘。將過濾器放置於1：20,000二次稀釋於阻斷緩衝液中的IRDye 800CW結合山羊抗小鼠中。在室溫下將過濾器於二級抗體溶液中孵育1小時之後，將過濾器清洗且成像於Odyssey CLx紅外成像器(Licor)上。

k. TTR纖維形成分析協定

將pH 4.8的3.6μM(0.2mg/ml)TTR-Y78F於50mM乙酸鈉中之溶液在37℃下，在1.4μM(0.2mg/ml)mis-TTR抗體或同型對照存在下孵育72小時。孵育之後，將5X過量硫代黃素-T添加至混合物中且使得結合30分鐘。以480nm之發射波長量測螢光量測值，其中激發波長設置在440nm。0%抑制設置為在同型對照抗體存在下之螢光強度(83 a.u.)，且100%抑制點設置為在TTR-Y78F蛋白質不存在下之螢光(38 a.u.)。

l.心臟組織樣本

確診ATTR突變的新鮮冷凍且石蠟處理的心臟組織塊獲自印地安那大學之Merrill Benson博士。樣本包括八種新鮮冷凍的樣本及六種FFPE樣本，且各樣本診斷有ATTR或一些其他心臟類澱粉變性。組織之診斷在Prothena經由用κ及λ輕鏈及類澱粉蛋白A之抗體IHC染色，之後用TTR抗體特徵化來進一步證實。

m.免疫組織化學

對多聚甲醛輕微固定之10μm玻片安裝低溫切片(cryosection)及對5μm石蠟切片進行免疫組織化學。免疫過氧化酶法為主要偵測系統，其使用結合聚合物精煉偵測套組(DS980,Leica Biosystems)在Leica Bond Rx(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)上進行。將一級抗體孵育一小時(根據表2中之濃度)，接著用抗小鼠及抗兔聚合物HRP連接子抗體結合物孵育。染色用DAB色素原顯現，其產生棕色沉積物。將玻片用蘇木精複染，於上升系列醇中脫水，於二甲苯中澄清，且用CytoSeal 60(Richard Allen Scientific；Kalamazoo,MI)蓋上蓋玻片。陰性對照由對具有非免疫IgG同型對照或一級抗體之省略的相鄰切片進行整個免疫組織化學程序組成。

n.類澱粉蛋白之證明：剛果紅及硫代黃素T染色

使用American MasterTech(Lodi,California)之套組進行剛果紅染色以證明組織中之TTR類澱粉蛋白。根據製造商之程序進行染色。將玻片染色於剛果紅溶液中1小時，接著於1%氫氧化鈉中分化大致15秒。隨後將玻片於流水中沖洗，經由遞增濃度的醇系列脫水，且經由三次改變二甲苯來澄清，且用CytoSeal 60蓋上蓋玻片。

採用修改的硫代黃素T染色協定(Schmidt等人1995)以測定組織中TTR類澱粉蛋白之存在。簡言之，將玻片用Mayers蘇木精複染色，於流水中沖洗且用0.015%硫代黃素T(T3516-25G；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)於50%乙醇中之過濾溶液染色十分鐘。隨後將玻片於流水中沖洗且於1%(v/v)乙酸中分化10分鐘，且於水中沖洗三次。使玻片空氣乾燥，之後用ProLong Gold(Life Technologies)蓋上蓋玻片。

o.影像分析

將玻片用Olympus BX61顯微鏡、Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT數位玻片掃描儀或Leica SPE光譜共焦系統成像。將影像收集且以TIFF檔案形式儲存。

p.藉由SDS-PAGE/西方墨點法分析人類血漿樣本

經確認V30M ATTR之患者之六種血漿樣本(樣本#11、#12、#15、#18、#19、#20)及正常受試者之6種樣本(#21、#22、#23、#24、#25、#27)獲自M.Saraiva(Porto University,Portugal)。樣本#C6為獲自市售來源(BioreclamationIVT)的正常人類血清樣本。將此等血漿樣本如下藉由SDS-PAGE分離且用9D5進行西方墨點法。將1.4μl體積血漿1：8稀釋成不存在還原劑(Life Technologies)的1xLDS樣本緩衝液。使樣本如先前所述經歷SDS-PAGE分離且用0.5μg/ml 9D5進行西方墨點法。

q.藉由MesoScale Discovery(MSD)板分析來分析人類血漿樣本

將96孔MSD板塗佈有於PBS中4μg/mL之濃度的單株抗體6C1且在室溫下在搖動情況下孵育2小時，或在4℃下孵育隔夜。將板用1xTBST清洗三次，之後在搖動情況下用3% MSD阻斷劑A溶液以150μL每孔阻斷1小時。將1：10稀釋於樣本緩衝液中的人類血漿樣本以30μl每孔體積添加至阻斷MSD板1小時，該樣本緩衝液包含0.6%無球蛋白牛血清白蛋白、1.5mM磷酸二氫鈉、8mM磷酸氫二鈉、145mM氯化鈉、0.05% Triton X-405及0.05%硫柳汞。將板用1xTBST清洗3次。在室溫下，在搖動之情況下，添加50μl每孔體積的1μg/ml於樣本緩衝液中的磺基標記偵測抗體(Dako多株抗體之8C3總TTR抗體)持續1小時。將板用1xTBST清洗三次，接著添加150μl每孔1X讀取緩衝液T溶液(Meso Scale Discovery)。隨後將板於MSD Sector成像器中讀取。

r. MSD標準曲線之產生

為定量人類血漿樣本中存在的非原態6C1反應性TTR蛋白質之量，使用重組TTR-F87M/L110M作為6C1反應性TTR標準產生MSD標準曲線。此TTR變體含有防止四聚物形成的兩種胺基酸取代基且保持蛋白質呈單體狀態(Jiang等人(2001)Biochemistry 40,11442-11452)。同樣地，此TTR變體由所有mis-TTR mAb識別且因此非常適用於MSD分析中之參考標準。

為產生標準曲線，將96孔MSD板塗佈有於PBS中4μg/mL之濃度的mis-TTR抗體6C1且在室溫下在搖動情況下孵育2小時，或在4℃下孵育隔夜。將板用1xTBST清洗三次，之後在搖動情況下用3% MSD阻斷劑A溶液以150μL每孔阻斷1小時。隨後將阻斷的板在50μl每孔之情況下以1：5連續稀釋的25μg/mL TTR-F87M/L110M處理1小時，其中最後一種稀釋液為空白緩衝液。將板用1xTBST清洗3次，之後在室溫下，在搖動之情況下添加50μl每孔體積的1μg/ml SulfoTag偵測抗體(8C3-SulfoTag或Dako pAb-SulfoTag)持續1小時。將8C3 mAb及Dako抗體兩者偶合至SulfoTag且可在偵測抗體處使用，因為其結合至全部TTR且不具構形特異性。

用偵測抗體處理之後，將板用150μl每孔體積1xTBST清洗三次，接著添加150ul每孔1x讀取緩衝液T(MSD)。將板於MSD Sector成像器中讀取且產生所得TTR F87M/L110M校準曲線。

實例10. 基因轉殖小鼠模型中mis-TTR抗體之評估

於人類化基因轉殖小鼠模型V30M hTTR中進行體內研究(Inoue等人，(2008)Specific pathogen free conditions prevent transthyretin amyloidosis in mouse models.Transgenic Research 17：817-826)以估計聚集hTTR之結合劑移除中抗TTR抗體之效力。

使用標準程序繁殖基因轉殖小鼠且藉由ELISA估計其循環hTTR水準。將血清水準為200-400μg/ml hTTR的小鼠用於隨後效力研究。第一組研究檢查基因轉殖小鼠中hTTR之天然沉積。hTTR沉積物之偵測開始於12月齡且其後每3-6個月重複。一旦於基因轉殖小鼠中發現可接受水準的聚集物，就開始效力研究。將動物分成三個治療群(n=10/群)且用IP劑量之媒劑、對照抗體(同型對照，10mpk)或抗hTTR抗體(10mpk)每週治療持續四週。最後一次治療之後一週將小鼠安樂死，收集組織且處理，且隨後染色以估計剩餘TTR沉積物之數目及大小。採用定量方法及統計學以測定在群之間所見的清除度。

在替代方法中，體外製備hTTR聚集物且隨後將其注射至基因轉殖小鼠之腎中以接種新聚集物之沉積。申請人已判定，注射此等製劑可以可預料方式加快新聚集物之沉積。基於此等發現，使動物鎮靜，左腎暴露且將預聚集hTTR材料注射至腎之皮質中。在合適的恢復期之後，將小鼠分成三個治療群(n=10/群)且用IP劑量之媒劑、對照抗體(同型對照，10mpk)或抗hTTR抗體(10mpk)每週治療持續四至八週。最後一次治療之後一週將小鼠安樂死，收集腎且處理，且隨後染色以估計TTR沉積物之數目及大小。採用定量方法及統計學以測定在群之間所見的改變度。

實例11. Matrigel植入物模型中mis-TTR抗體之評估

申請人已判定，預聚集hTTR可懸浮於Matrigel(BD Bioscience,Cat #354263)中，允許固化且隨後皮下放置於小鼠中。植入後四週，Matrigel植入物維持其結構且聚集hTTR仍存在於植入物內。此外，植入物由小鼠良好地耐受，且抗hTTR抗體能夠穿透且結合至懸浮於Matrigel中的聚集物。基於此等發現，進行抗體效力研究。使動物鎮靜且將含有預聚集hTTR的植入物懸浮於皮下放置於小鼠中之Matrigel中。在合適的恢復期之後，將小鼠分成三個治療群(n=10/群)且用IP劑量之媒劑、對照抗體(同型對照，10mpk)或抗hTTR抗體(10mpk)每週治療持續二至四週。在最後一次治療之後，將小鼠安樂死，將含有植入物的皮膚收集且處理，且隨後使用組織學及/或生物化學方法估計TTR沉積物之量。採用定量分析及統計學以測定在群之間所見的清除度。

<110> 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司(PROTHENA BIOSCIENCES LIMITED) 大學健康網絡(UNIVERSITY HEALTH NETWORK)

<120> 抗甲狀腺素運送蛋白抗體

<140> TW 110100084

<141> 2016-01-27

<150> US 62/109001

<151> 2015-01-28

<150> US 62/266557

<151> 2015-12-11

<160> 63

<170> FastSEQ 4.0版(Windows系統)

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

<210> 4

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

<210> 6

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

<210> 9

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

<210> 21

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

<210> 22

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

<210> 23

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

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<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 24

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

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<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 27

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

<210> 29

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 29

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<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

<210> 31

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

<210> 32

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 32

<210> 33

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

<210> 34

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

<210> 35

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 41

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 42

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 44

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 45

<210> 46

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 46

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<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

<210> 48

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 50

<210> 51

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 51

<210> 52

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

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<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 55

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<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 57

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<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 58

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<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 59

<210> 60

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 60

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 61

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 62

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 63

Claims

一種特異性結合至甲狀腺素運送蛋白的抗體，其包含一重鏈及一輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：4至9中任一者之成熟重鏈可變區，其與SEQ ID NO：25、26或27之一重鏈恆定區融合，該重鏈恆定區具有或不具有C端離胺酸，以及其中該輕鏈包含SEQ ID NO：16或17之成熟輕鏈可變區，其融合至SEQ ID NO：28之輕鏈恆定區。
如請求項1之抗體，其包含SEQ ID NO：9之一成熟重鏈可變區以及SEQ ID NO：17之一成熟輕鏈可變區。
如請求項1之抗體，其中該重鏈包含SEQ ID NO：30-35中任一者之胺基酸序列，其具有或不具有C端離胺酸，且該輕鏈包含SEQ ID NO：36或37之胺基酸序列。
如請求項3之抗體，其中該重鏈包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，其具有或不具有C端離胺酸，且該輕鏈包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
如請求項1之抗體，其中該重鏈恆定區具有SEQ ID NO：26之序列，其具有或不具有C端離胺酸，及/或該輕鏈恆定區具有SEQ ID NO：28之序列。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至5中任一項之抗體及一醫藥學上可接受的載體。
一種核酸，其編碼如請求項1所述之抗體的重鏈及輕鏈，其中該編碼該成熟重鏈可變區的核酸包含SEQ ID NO：55-60中任一者，該編碼該重鏈恆定區之核酸包含SEQ ID NO：46，該編碼該成熟輕鏈可變區的核酸包含SEQ ID NO：61或62，以及該編碼該輕鏈恆定區之核酸包含SEQ ID NO：47。
如請求項7之核酸，其中該編碼該成熟重鏈可變區的核酸包含SEQ ID NO：60，該編碼該重鏈恆定區之核酸包含SEQ ID NO：46，該編碼該成熟輕鏈可變區的核酸包含SEQ ID NO：62，以及該編碼該輕鏈恆定區之核酸包含SEQ ID NO：47。
一種重組表現載體，其包含如請求項8之核酸。
一種寄主細胞，其由如請求項9之重組表現載體轉型。
一種如請求項1之抗體於製備藥劑之用途，該藥劑是用於抑制或減少甲狀腺素運送蛋白之聚集、抑制或減少甲狀腺素運送蛋白原纖成形、減少甲狀腺素運送蛋白沉積物、清除經聚集之甲狀腺素運送蛋白、使甲狀腺素運送蛋白之一非毒性構形穩定、治療或實現預防甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性或延緩甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性發作。
一種體外診斷一受試者中一甲狀腺素運送蛋白介導之類澱粉變性的方法，其包含將來自該受試者之一生物樣本與一有效量的如請求項1之抗體接觸。
如請求項12之方法，其中該生物樣本及/或對照樣本為血液、血清、血漿或實體組織。
如請求項13之方法，其中該實體組織來自心臟、周邊神經系統、自主神經系統、腎、眼睛或胃腸道。