DE69636659T2

DE69636659T2 - Verfahren zum auffinden von arzneimitteln zur behandlung von alzheimer-krankheit

Info

Publication number: DE69636659T2
Application number: DE69636659T
Authority: DE
Inventors: M. David West Roxbury WILSON; I. Lester Graylake BINDER
Original assignee: UAB Research Foundation
Current assignee: UAB Research Foundation
Priority date: 1995-08-08
Filing date: 1996-08-07
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2016-08-08
Also published as: CA2225647A1; EP0912086A1; DE69636659D1; JP4135810B2; JP2000502043A; AU6843896A; EP0912086B1; AU718462B2; EP0912086A4; ATE343381T1; WO1997005780A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete von Neurologie und Proteinchemie im Allgemeinen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Regulierung von Proteinen, die mit Alzheimer-Krankheit in Beziehung stehen.
Beschreibung des Standes der Technik
Alzheimer-Krankheit ist eine Hirnstörung, die durch veränderten Proteinkatabolismus gekennzeichnet ist. Aus der Arbeit von verschiedenen Laboratorien ging hervor, dass veränderte Proteinabscheidung in die Bildung von intrazellulären neurofibrillären Knäueln, die bei Alzheimer-Krankheit gefunden wurden, verwickelt ist. Die intrazelluläre fibrilläre Pathologie von Alzheimer-Krankheit zeichnet sich durch das Vorliegen von Filamenten mit einer geraden oder gepaarten helikalen Morphologie aus (Kidd, 1963; Yagishita et al., 1981). Diese Filamente akkumulieren sowohl in den somalen neurofibrillären Knäuel (neurofibrilläres Knäuel) 1 als auch den dystrophischen neuropilen Fäden (Braak et al., 1986; Kowall und Kosik, 1987). Die Bildung von neurofibrillärem Knäuel und dystrophischen Neuriten sind räumlich korreliert (Probst et al., 1989; Yamaguchi et al., 1990), und beide Läsionen sind mit der Stärke der Demenz stark korreliert (McKee et al., 1991). Filamentöse Einschlüsse dieses Typs werden auch beim Down-Syndrom (Wis niewski et al., 1985), Guam-Parkinson-Demenz (Hirano et al., 1968) und anderen Krankheitszuständen (Wisniewski et al., 1979) beobachtet. Bei der fortschreitenden supranuklearen Paralyse sind neurofibrilläre Knäuel primär aus Filamenten zusammengesetzt, die die gerade, ungepaarte Morphologie besitzen (Tellez-Nagel und Wisniewski, 1973; Bugiani et al., 1979). Obwohl der Tod von Polymer-beladenen Neuronen durch das Vorliegen von unlöslichen Knäuelresten in dem extrazellulären Raum nachgewiesen wird, ist es nicht bekannt, ob Polymermassen die neuronale Funktion ausreichend unterbrechen, um Degeneration einzuleiten, oder ob sie sich nur bevorzugt innerhalb Neuronen, die bereits in den nekrotischen Vorgang einbezogen sind, bilden.
Gerade Filamente (SF) und gepaarte helikale Filamente (gepaartes helikales Filament) bilden sich unter ähnlichen Bedingungen, wie durch deren gemeinsames Vorliegen innerhalb des einzelnen neurofibrillären Knäuels nachgewiesen wurde (Perry et al., 1987). Gerade Filamente teilen Epitope mit gepaarten helikalen Filamenten und reinigen gemeinsam mit gepaarten helikalen Filamenten in Versuchsvorgängen, die deren Resistenz auf SDS- oder Proteasebehandlungen nutzen (Perry et al., 1987; Crowther, 1991). Zusätzlich gibt es verschiedene Berichte über Übergangsformen von Fibrillen, die Streckungen der Gerade, also gepaarte helikale Morphologie, kontinuierlich innerhalb eines einzelnen Filaments besitzen (Wischik et al., 1985; Perry et al., 1987; Papasozomenos, 1989; Crowther, 1991). Dieses Auffinden und anderes haben zu der Überlegung geführt, dass gerade Filamente und gepaarte helikale Filamente durch ähnliche Mechanismen der Zusammenfügung gebildet werden (Perry et al., 1987; Crowther, 1991; Wille et al., 1992).
Der einzige bekannte Strukturbestandteil der gepaarten helikalen Filamente ist das Mikrotubulus-assoziierte Protein Tau (für eine Übersicht der normalen Biologie von Tau siehe Lee, 1990). Das Vorliegen von Tau-Proteinen wurde durch sowohl immunochemische Mittel (Grundke-Iqbal et al., 1986; Kosik et al., 1986) als auch durch Sequenzieren von Peptiden, die aus gepaarten helikalen Filamenten extrahiert wurden (Wischik et al., 1988; Kondo et al., 1988), gezeigt. Aus gepaarten helikalen Filamenten extrahiertes Tau enthält mehr phosphorylierte Reste als aus normalem Hirn isoliertes Tau (Hasegawa et al., 1992; Ksiezak-Reding et al., 1992), und diese Phosphorylierungen werden häufig zur Bestätigung herangezogen, dass sie in das Polymerisationsverfahren einbezogen sind.
Es wurde mitgeteilt, dass direkt aus dem Hirn oder aus Hirn-Mikrotubuli (MT) gereinigtes Tau eine Vielzahl von Polymeren bildet, die geraden Filamenten oder gepaarten helikalen Filamenten ähneln. Dialyse von Schweinemikrotubulus-Tau von verschiedenen Tagen gegen 6-8 M Harnstoff erzeugte Polymere im Bereich einer Breite von 5-35 nm, die einen Subset enthielten, der gepaarten helikalen Filamenten ähnelt (Montejo de Garcini et al., 1986; Montejo de Garcini und Avila, 1987). Die Wirkungen von Harnstoff wurden Desaminierung von Glutaminresten oder Carbamylierung von Lysinresten zugeschrieben, obwohl das Erzeugen von diesen Modifizierungen durch enzymatische oder chemische Mittel die Wirkungen von Harnstoffbehandlung allein nicht vollständig reproduzierte. Es wurde mitgeteilt, dass sich Harnstoff-behandeltes Tau unabhängig von NaCl-Konzentration im Bereich von 0,1-1 M zusammenfügt. Unter Anwendung von gereinigtem Tau direkt aus Rinderganzhirn wurden 10 nm Filamente in Gegenwart des Vernetzungsenzyms Transglutaminase unter Bedingungen, die auf die enzymatische Aktivität optimiert wurden, gebildet (Dudek und Johnson, 1993). Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass dieses Enzym für die Tau-Polymerisation in vivo erforderlich ist, da monomeres Tau aus isoliertem neurofibrillärem Knäuel solubilisiert wird (Greenberg und Davies, 1990; Lee et al., 1991). Die Polymerbildung wurde auch unter Anwendung von bakteriell exprimiertem Human-rekombinanten Tau gezeigt. Zwei Gruppen sind unter Anwendung von Deletionskonstrukten grob äquivalent zu der Mikrotubulus-Bindungsdomäne von Tau und ähnliche saure Bedingungen erzeugten verschiedene Polymerspezies, die eine Unterreihe einschlossen, die verdrehte Morphologie von gepaarten helikalen Filamenten besaß (Wille et al., 1992; Crowther et al., 1992). Volllängen-Tau-Konstrukte bauen sich unter diesen Bedingungen nicht zusammen. Vor kurzem wurden jedoch unter Anwendung von Bedingungen von neutralem pH-Wert und hoher Ionenstärke (1,25M CH₃CO₂-K⁺) beobachtet, dass sich Volllängen-Tau-Konstrukte Filamente bilden, wobei einige von ihnen gepaarten helikalen Filamenten ähneln (Crowther et al., 1994).
Das Aufstellen von kausalen Beziehungen zwischen dem Zusammenfügung von Tau zu geraden Filamenten und gepaarten helikalen Filamenten und potenziellen Modulierungsfaktoren, wie Phosphorylierung oder anderen enzymatischen oder chemischen Behandlungen, würde von einem In-vitro-Zusammenfügungsystem profitieren, bei dem von diesen Polymeren gezeigt werden kann, dass sie sich unter physiologisch relevanten Bedingungen bilden. Obwohl kinetisch ein relativ langsamer Vorgang, wird die In-vitro-Filamentbildung unter im Wesentlichen physiologischen Bedingungen beobachtet.
Dem Stand der Technik fehlen wirksame Mittel zum Bestimmen der Bedingungen, worin aus Ratten- oder Schweinemikrotubuli gereinigtes Tau sich zu einer homogenen Population von Filamenten, die geraden Filamente ähneln und die Proliferation von Tau steuern, zusammenfügen wird. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen lang ausstehenden Bedarf und Wunsch auf dem Fachgebiet.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screening eines Arzneistoffs, der bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendbar ist, bereitgestellt, umfassend die Schritte von: Erhöhen der Polymerisation von Aß- oder Tau-Peptiden in einem Medium durch In-Kontakt-Bringen des Mediums mit einer wirksamen Menge von mindestens einer unveresterten Fettsäure; und Testen eines Arznei stoffs von Interesse, um zu bestimmen, ob der Arzneistoff die durch die unveresterte Fettsäure induzierte Polymerisation von Aß- oder Tau-Peptiden hemmt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screening eines bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendbaren Arzneistoffs bereitgestellt, umfassend die Schritte von: Erhöhen der Polymerisation von Aß- oder Tau-Peptiden in einer Zellkultur durch In-Kontakt-Bringen der Zellkultur mit einer wirksamen Menge von Melittin, um Fettsäurefreisetzung und -abgabe zu induzieren; und Testen eines Arzneistoffs von Interesse, um zu bestimmen, ob der Arzneistoff die durch das Melittin induzierte Polymerisation von Aß- oder Tau-Peptiden hemmt.
Andere und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die für den Zweck der Offenbarung angegeben werden, deutlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In dem Maße, wie die vorstehend angeführten Merkmale, Vorteile und Gegenstände der Erfindung, sowie andere, die deutlich werden, erreicht werden und im Einzelnen verstanden werden können, können genauere Beschreibungen der Erfindung, die kurz vorstehend zusammengefasst wurden, durch Bezug auf bestimmte Ausführungsformen davon, die in den beigefügten Zeichnungen erläutert werden, erhalten werden. Diese Zeichnungen bilden einen Teil der Beschreibung. Es ist jedoch anzumerken, dass die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung erläutern und deshalb nicht als ihren Umfang begrenzend betrachtet werden.
1 zeigt die Polymerisierung von Ratten- und Schweine-Tau-Protein. Mikrotubulus-Tau aus P14 Ratte (1A, 1F, 1G), P10 Ratte (1B), adulter Ratte (1C, 1D) oder adultem Schwein (1E, 1H-K) wurden, wie nachstehend beschreiben, polymerisiert und mit Uranylacetat angefärbt. Zusätzlich zu dispergierten Zubereitungen werden typische Muster von nicht-filamentöser (1B) und inter-filamentöser (1C) Aggregation gezeigt. Taxol-stabilisierter Mikrotubulus (Pfeilköpfe) wurde auf einigen Gittern zum Größenbezug gemeinsam ausgefällt. Der Balken entspricht 500 nm (1A-E) oder 100 nm (1F-K).
2 zeigt den Vergleich von Tau-Polymeren, die in vivo und in vitro zusammengefügt wurden. Gereinigtes neurofibrilläres Knäuel (2A und 2B) und Tau-Filamente (2C) wurden mit 2 %igem Uranylacetat angefärbt. Beispiele für sowohl gepaartes helikales Filament (2A) als auch gerades Filament (2B) werden gezeigt. Der Balken entspricht 0,2 μm.
3 zeigt die Reinigung von Tau zur erkennbaren Homogenität. (A-D) Mikrotubulus Tau aus P14 Ratte (5 mg--A,C) oder adulter Ratte (10 mg--B,D) wurde auf 4-20 %igen Gelen getrennt und mit Coomassie Blue (A, B) angefärbt, oder mit einem monoklonalen Antikörper geblottet, der an das 68 kD Neurofilamentprotein (C, D) bindet. Neurofilamentprotein wurde auch geblottet (40 ng--E) oder mit Coomassie Blue (15 mg--F) angefärbt. Molekulargewichtsmarker (in absteigender Reihenfolge; 208, 101, 71, 44, 29 und 18 kDa) werden links und die Neurofilament-Dreifachproteine rechts angezeigt. Bahnen C-E wurden aus dem gleichen Blot entfernt.
4 zeigt das Antikörpermarkieren von Tau-Polymeren. Schweine-Tau wurde über Nacht zusammengefügt, und Filamente wurden entweder direkt auf Gittern (4A-D) abgeschieden, oder in 500 mM KCl für 30 Minuten bei 37°C vor dem Abscheiden auf Gittern (4E, 4F) inkubiert. Die Gitter wurden dann mit dem monoklonalen Tau-Antikörper, Tau-2 (4A, 4B, 4E, 4F) oder Kontrollpuffer (4C, 4D) inkubiert, gefolgt von Inkubation mit einem sekundären Antikörper, der an 10 nm kolloidales Gold konjugiert wurde. Die Gitter wurden dann mit Uranylacetat angefärbt. Zwei Beispiele von Goldmarkierungen für jede Bedingung werden gezeigt. Der Balken entspricht 0,2 Mikrometer.
5 zeigt die Filamentlänge, die von der Zeit und Temperatur abhängig ist. Tau, das aus P14 Rattenmikrotubul gereinigt wurde, wurde in 10 mM DTT bei 22°C (5A-E) oder 37°C (5F-J) für 15 Minuten (5A, 5F), 30 Minuten (5B, 5G), 60 Minuten (5C, 5H), 120 Minuten (5D, 5I), oder 240 Minuten (5E, 5J), inkubiert. Die Proben wurden hinsichtlich EM verarbeitet und repräsentative Gebiete wurden aufgezeichnet. Der Balken entspricht 1,5 Mikrometer.
6 zeigt, dass Filamentlängen eine exponentielle Verteilung zeigen. P14 Ratten-Tau wurde in 10 mM DTT bei 22°C (6A-6E) oder 37°C (6F-6J) auf die angezeigte Zahl an Stunden (t) inkubiert. Histogramme wurden unter Anwendung von Filamentmessungen, die, wie nachstehend beschrieben, erhalten wurden, erzeugt. Mittlere Filamentlänge (x) und Probengröße (n) wurden auch für jede Datenreihe angegeben. Die Bin-Breite ist 200 nm.
7 zeigt die Polymerisation von Tau-Filamenten, die von der Ionenstärke abhängig ist. Schweine-Tau in Puffer A wurde 1:1 in neuronales 50 mM Tris/20 mM DTT, ergänzt mit einer variablen Menge KCl, verdünnt. Die Proben wurden 24 Stunden bei 37°C inkubiert, dann mit weiteren 500 mM KCl ergänzt. Eine aliquote Menge wurde sofort zum EM-Verarbeiten (offene Kreise) und weitere nach weiteren 24 Stunden Inkubation bei 37°C (gefüllte Kreise) genommen. Statistische Gebiete wurden digitalisiert, dann wurden Filamente gemessen und deren Längen zusammengefasst. Die mittlere Gesamtpolymerlänge/Gebiet ± S.E.M. wird als eine Funktion der anfänglichen Kationenkonzentration aufgetragen, n > 10.
8 zeigt, dass die Tau-Polymerisation von dem Reduktionspotenzial abhängig ist. P14 Ratten-Tau wurde über Nacht bei pH 7,2 mit bME, zugesetzt zu 1,0 M (8A), 0,1 M (8B), 10 mM (8C), 1,0 mM (8D), 0,1 mM (8E) oder 0,0 mM (8F), inkubiert. Die Proben wurden hinsichtlich EM verarbeitet und repräsentative Gebiete werden gezeigt. Der Balken entspricht 1 μm.
9 zeigt, dass die Filamentlängen eine Funktion des Reduktionspotenzials sind. 9A-E. Schweine-Mikrotubulus-Tau wurde 24 Stunden mit der ausgewiesenen Konzentration an DTT inkubiert. Die Proben wurden auf Gittern abgeschieden und Filamente von 10 statistisch ausgewählten Gebieten wurden digitalisiert und gemessen. Die Bin-Breite ist 300 nm. 9F zeigt, dass die mittlere Länge von jeder Filamentpopulation als eine Funktion der DTT-Konzentration aufgetragen wird.
10 zeigt die Arachidonsäureabhängigkeit der Tau-Zusammenfügung. 10A: Proben von juveniler Ratte MTt, verwendet bei 100 μg/ml (≈ 2,5 μM), wurden mit den ausgewiesenen Konzentrationen an Arachidonsäure ergänzt und für 24 Stunden (ausgefüllte Quadrate), 66 Stunden (offene Quadrate), 108 Stunden (ausgefüllte Kreise) oder 214 Stunden (offene Kreise) angeordnet. 10B zeigt die Daten von 10A, mit Polymermasse, die erneut als eine Funktion der Zeit aufgetragen wurde. Die Proben wurden in Gegenwart von 20 μM (gefüllte Kreise), 40 μM (offene Kreise) oder 80 μM Arachidonsäure (gefüllte Quadrate) inkubiert. 10C zeigt, dass die Tau-Polymere aus adulten Ratten-MTt (100 mg/ml) (gefüllte Kreise), Tau, gereinigt aus Schweineganzhirn (200 μg/ml) (offene Kreise), oder gereinigtem Human-rekombinantem Tau, exprimiert in E. coli (200 μg/ml) (gefüllte Quadrate), zusammengefügt wurden. Die Proben wurden 66 Stunden inkubiert. Allgemeine Schlussfolgerungen können aufgrund des Ursprungs der verschiedenen Spezies bezüglich der relativen Wirksamkeit der Zusammenfügung von Tau, gereinigt durch die verschiedenen Verfahren, nicht getroffen werden. Alle Proben (10A und 10B) waren negativ, angefärbt mit 2 %igem Uranylacetat, und Elektronenmikrographien von statistischen Gebieten wurden digitalisiert und verfolgt. Die gezeigten Werte sind der Durch schnitt der zusammengefassten Polymerlänge/Gebiet ± S.E.M., n ≥ 12.
11 zeigt die Morphologie von Tau-Filamenten, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Arachidonsäure gebildet wurden. Tau-Polymere wurden unter Anwendung von adulten Ratten MTt (11A, 11B), Schweineganzhirn-Tau (11C) oder humanem rekombinantem Tau (11D) angeordnet. Die Proben wurden 72 Stunden in Abwesenheit (11A) oder Gegenwart (11B-D) von 50 μM Arachidonsäure inkubiert. Balken = 100 nm.
12 zeigt die Wirkungen von verschiedenen Fettsäuren auf die Tau-Polymerisation. Tau-Polymere wurden, wie vorstehend beschrieben, zusammengefügt und quantifiziert, unter Verwendung von Tau, gereinigt aus P11 Rattenhirnmikrotubuli. Proben wurden 72 Stunden in Gegenwart von 50 μM Fettsäure inkubiert. Im Allgemeinen stimulierten für jede gegebene Kettenlänge ungesättigte Fettsäuren die Tau-Zusammenfügung in einem größeren Ausmaß als gesättigte Fettsäuren. Eine 20- bis 30-fache Erhöhung in der Polymerbildung wurde beobachtet, wenn Arachidonsäure, Palmitoleinsäure oder Linolensäure verwendet wurde. Die Messungen der kritischen micellaren Konzentration (CMC) von repräsentativen Fettsäuren unter Zusammenfügungsbedingungen weisen aus, dass die Micellierung weder zu deren stimulatorischen Aktivität beitrug, noch diese senkte. CMC-Werte wurden, basierend auf der Phasenteilung des Fluoreszenzindikators, Phenylnaphthylamin erhalten (Kovatchev, et al., (1981) J. Biol. Chem. 256(20): 10369-10374).
13 zeigt die Modulierung der Tau-Polymerisation in Gegenwart von Arachidonsäure. Alle Proben enthielten 100 μg/ml Ratten MTt und 50 μM Arachidonsäure und wurden 72 Stunden inkubiert. Elektronenmikrographien von negativ angefärbten Proben wurden digitalisiert und verfolgt, und der Polymergehalt wurde als Gesamtmasse (13A und 13B) oder als mittlere Filamentlänge und Anzahl an Filamenten/Gebiet (13C) ausgedrückt. In allen Fällen sind gezeigte Werte der Mit telwert ± S.E.M., n = 12. 13A zeigt die Proben von juvenilen (offene Kreise) oder adulten Tau (gefüllte Quadrate), die bei 4°C, 22°C oder 37°C inkubiert wurden (13B). Adulten-Tau wurde in Gegenwart der angezeigten Konzentration an NaCl (siehe nachstehend für die Pufferbedingungen) angeordnet. 13C: Adulten-Tau wurde in Gegenwart der ausgewiesenen Konzentration an DTT angeordnet. Eine Erhöhung in der mittleren Filamentlänge (offene Kreise), gesehen mit ansteigenden Konzentrationen an DTT, wurde durch eine Absenkung in der Anzahl der Filamente/Gebiet (gefüllte Quadrate) reflektiert.
14 zeigt die Fettsäure-abhängige Zusammenfügung von Amyloid : Elektronenmikroskopie. 14A und B zeigen filamentöse Aggregate, die in Lösungen von Amyloidpeptid vorliegen, vor (14A) oder nach (14B) einer Inkubation von 24 Stunden in Abwesenheit von freien Fettsäuren. 14C und 14D zeigen lange Filamente, die sich aus einer Inkubation von 24 Stunden mit 40 mM Ölsäure (14C) oder 50 mM Linolensäure (14D) ergeben. Alle Proben wurden mit 4 %igem Uranylacetat angefärbt und bei einer Nominalvergrößerung von 30 k photographiert. Balken = 275 nm.
15 zeigt die Fluoreszenz-spektroskopische Analyse der Amyloidzusammenfügung. Amyloidpeptid wurde 24 Stunden mit der ausgewiesenen Konzentration an Ölsäure (offene Kreise) oder Linolensäure (gefüllte Quadrate) inkubiert. Die Fluoreszenzwerte (willkürliche Einheiten), die nach Mischung mit Thioflavin T erhalten wurden, werden als Mittelwert ± S.D., n = 3, dargestellt.
16 zeigt das freie Fettsäuremodell von AD-Pathogenese. Die Beziehung zwischen den verschiedenen Elementen, von denen postuliert wurde, dass sie zur Bildung von NP und NFT beitragen, wird für den Fall, in dem apoE ein Risikodefinierender Faktor ist, gezeigt. Das gemeinsame Effektormolekül ist die freie Fettsäuren, welche von ihrem Ursprungspunkt in dem NP zu anatomisch beabstandeten Stellen der NFT-Formation durch das zirkulierende CSF getragen werden kann.
17 zeigt, dass gepaarte helikale Filamente, die von Dr. Sharon Greenberg bereitgestellt werden, durch das Verfahren von Greenberg und Davies (keine SDS-Extraktion) gereinigt wurden und in Puffer A erneut suspendiert wurden. P11 Rattenmikrotubulus-Tau (400 μg/ml), PHF (250 μg/ml) und Puffer B (Boratsalzlösung, 20 mM DTT) wurde mit einem Verhältnis von 1:1:2 gemischt und 2-3 Tage bei 37°C in Gegenwart von 50 μM Arachidonsäure inkubiert. Die erhaltenen Hybridmorphologien werden als zwei gerade Filamente interpretiert, die von dem gleichen Ende von einem PHF stammen (17A-C) oder von einem einzelnen geraden Filament, das von beiden Enden von einem PHF stammt (17D). Balken = 100 nm.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
Ein Verfahren zum Screening für einen bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendbaren Arzneistoff umfasst die Schritte von: Erhöhen der Polymerisation von Aβ-Peptiden in einem Medium durch In-Kontakt-Bringen der Kultur mit einer wirksamen Menge von mindestens einer unveresterten Fettsäure oder einer Verbindung, die die Fettsäurefreisetzung und -abgabe induziert; und Testen eines Arzneistoffs von Interesse, um zu bestimmen, ob der Arzneistoff die durch die unveresterte Fettsäure induzierte Polymerisation von Aβ-Peptiden inhibiert. Repräsentative Beispiele von verwendbaren Fettsäuren schließen Arachidonsäure, Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Stearinsäure ein. Vorzugsweise wird die unveresterte Fettsäure in einer Menge von etwa 1 Mikromolar bis etwa 100 Mikromolar gefunden. Die Verbindung, die die Fettsäurefreisetzung und -abgabe induziert, ist Melittin. Vorzugsweise wird das Melittin in einer Menge von etwa 0,1 Mikromolar bis etwa 1,0 Mikromolar gefunden. Vorzugsweise ist das Medium ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellkultur oder einem Reagenzglas.
Ein Verfahren zum Screening für einen Arzneistoff, der bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendbar ist, umfasst die Schritte von: Erhöhen der Polymerisation von Tau- Peptiden in einem Medium durch In-Kontakt-Bringen der Kultur mit einer wirksamen Menge von mindestens einer unveresterten Fettsäure oder einer Verbindung, die die Fettsäurefreisetzung und -abgabe induziert; und Testen eines Arzneistoffs von Interesse, um zu bestimmen, ob der Arzneistoff die Polymerisation von Tau-Peptiden, die durch die unveresterte Fettsäure induziert werden, inhibiert. Repräsentative Beispiele von verwendbaren Fettsäuren schließen Arachidonsäure, Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Stearinsäure ein. Vorzugsweise wird die unveresterte Fettsäure in einer Menge von etwa 1 Mikromolar bis etwa 100 Mikromolar gefunden. Die Verbindung, die die Fettsäurefreisetzung und -abgabe induziert, ist Melittin. Vorzugsweise wird das Melittin in einer Menge von etwa 0,1 Mikromolar bis etwa 1,0 Mikromolar gefunden. Vorzugsweise ist das Medium ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellkultur oder einem Reagenzglas.
Die nachstehenden Beispiele werden für den Zweck der Erläuterung von verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung angegeben und sind nicht beabsichtigt, die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise zu begrenzen.
BEISPIEL 1
Hirngewebe
Frische Rinderhirne wurden von John Morrell Fleischverpackung, Montgomery, AL, erhalten. Frische Schweinehirne wurden von Bryan Fleischverpackung, Westpoint MS erhalten. Menschenhirn wurde durch Dr. Richard Powers von dem Brain Resource Center, University of Alabama, Birmingham, bereitgestellt. Sprague-Dawley-Ratten wurden von Charles River, Wilmington, MA, erhalten und durch Decapitation getötet. Gereinigte neurofibrilläre Knäuel (Iqbal et al., 1984) wurden von Dr. Khalid Iqbal, Institute for Basic Research in Developmental Disabilities, Staten Island, NY, bereitgestellt. Neurofilamentantikörper (Amersham) und Protein wurden von Dr. Robert Goldman, Northwestern University Medical School, Chicago, IL, bereitgestellt.
BEISPIEL 2
Proteinreinigung
Mikrotubuli wurden von dem Hirn durch zwei Zyklen von temperaturabhängiger Zusammenfügung, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben (Shelanski et al., 1973), mit zu 25 % während der ersten Warminkubation nur zugesetztem Glycerin, gereinigt. Tubulin wurde weiter gereinigt durch Phosphocellulosechromatographie (Weingarten et al., 1975), unter Anwendung von Phosphocellulose, vorzyklisiert wie beschrieben (Sloboda et al., 1976). Taxol-stabilisierte Mikrotubuli (Vallee, 1982) wurden durch Inkubieren von gereinigtem Schweinetubulin bei 5 mg/ml mit 10 μM Taxol für 30 Minuten bei 37°C, dann Verdünnen 1:20 für Elektronenmikroskopie, hergestellt.
Tau wurde unter Anwendung von Versuchsvorschriften isoliert, die ähnlich zu jenen sind, die durch Andere veröffentlicht wurden (Sandoval und Weber, 1980; Johnson et al., 1989), unter Nutzung der Proteinstabilität gegen Wärmebehandlung (Cleveland et al., 1977a) und Löslichkeit in Perchlorsäure (Lindwall und Cole, 1984). Zur Isolierung aus Mikrotubuli wurden Pellets in Zyklisierungspuffer (100 mM PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, pH 6,9), ergänzt mit 0,8 M NaCl und 2 mM DTT, resuspendiert, und 30 Minuten auf Eis gerührt, 10 Minuten gekocht, 30 Minuten auf Eis gerührt und bei 100 000 × G für 45 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden über eine Amicon YM10 Ultrafiltrationsmembran aufkonzentriert und auf eine Bio-Gel A-1.5 Siebsäule (32 × 430 mm, Durchlauf bei 15 ml/Stunde), gegeben, mit Puffer A (20 mM MES, 80 mM NaCl, 2 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, pH 6,8), ergänzt mit 0,8 M NaCl und 2 mM DTT (Puffer A+), ins Gleichgewicht gebracht. Tau-enthaltende Fraktionen wurden auf 2,5 % Perchlorsäure gebracht, für 30 Minuten auf Eis gerührt und bei 100 000 × G für 30 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden gegen Puffer A dialysiert und durch Ultrafiltration aufkonzentriert. Restliches DTT wurde auf < 0,2 μM geschätzt. Alle Verfahren, ausgenommen Kochen, wurden bei 4°C ausgeführt.
Zur Isolierung von Tau direkt aus Ganzhirn wurde gefrorenes Gewebe aufgetaut und homogenisiert (1:1 Gewicht/Volumen) in einem Waring-Mischer in Puffer A+, ergänzt mit einem zusätzlichen Trockengewicht von NaCl, ausreichend, um das Homogenisat auf 0,8 M NaCl zu bringen. Nach Zentrifugierung bei 150 000 × G für 45 Minuten wurde der Überstand 10 Minuten gekocht, 30 Minuten auf Eis gelagert und wie vorstehend gesponnen. Die Überstände wurden dann mit (NH₄)₂SO₄ auf 60 % Sättigung gebracht, 45 Minuten auf Eis gerührt und zentrifugiert. Die Pellets wurden insgesamt in 50 ml Puffer A+ resuspendiert, gegen die gleiche Lösung dialysiert, durch Ultrafiltration aufkonzentriert und auf die Siebsäule beladen. Dem vorstehend für die Isolierung von Tau aus Mikrotubuli beschriebenen Verfahren wurde dann gefolgt.
BEISPIEL 3
Bedingungen für die Tau-Polymerisation
Im Allgemeinen wurde Tau, gelagert bei –80°C in Puffer A, bei 4°C aufgetaut, in 100 mM Tris pH 7,2, enthaltend DTT oder β-Mercaptoethanol (βME), verdünnt und bei 37°C inkubiert. 100 mM MES wurden für Versuche verwendet, die das Puffern unter pH 7 erfordern. Tau-Endkonzentrationen lagen im Bereich von 1-10 μM. Wesentliche Variationen in der Zeit, Temperatur, dem pH-Wert, der Ionenstärke und Konzentration von Reduktionsmittel waren ersichtlich.
BEISPIEL 4
Elektronenmikroskopie
Die Proben wurden in 10 ml aliquoten Mengen auf 400 Mesh Nickelgittern, beschichtet mit 0,4 % Formvar, abgeschieden und mit 5 Tropfen H₂O gespült und mit 5 Tropfen 2 %igem Uranylacetat angefärbt, wobei der letzte Tropfen 1 Minute vor dem Auftragen gesetzt wurde. Die Gitter wurden unter Anwendung eines JEOL JEM-100CX Transmissions-Elektronen-Mikroskops, das bei 80 kV arbeitete, geprüft. Für Filamentlängenmessungen wurden die Mikrographien, die bei einer nominalen Vergrößerung von 15K (6) oder 10K (7 und 9) erhalten wurden, unter Anwendung einer SIT68 Kamera (MTI), digitalisiert, und die Längen wurden unter Anwendung von Software von Universal Imaging Corporation bestimmt. Nur Filamente, die vollständig innerhalb eines Gebiets und Messen bei mindestens 50 nm enthalten waren, wurden in die Datenreihen eingeschlossen. Gebiete, die statistisch ausgewählt wurden, wurden bei niedriger Beleuchtung und ohne die Hilfe der 10-fachen Biokularen ausgewählt, sodass die Formvar-Integrität ohne das Betrachten der vorliegenden Filamente bewertet werden konnte. Filamentbreitenmessungen wurden manuell unter Anwendung von Mikrographien, die ähnlich zu jenen in 1F-K gezeigten waren, ausgeführt. Die Mikrotubuli (24 nm angenommener Durchmesser, mit 6-7 unterscheidbaren Protofilamenten) wurden für den Größenbezug verwendet.
Für kolloidale Goldmarkierungen wurden nach Abscheidung auf Gittern und einer H₂O-Spülung Gitter für 1 Stunde auf einem 10 ml-Tropfen des primären Antikörpers (Tau-2; Papasozomenos und Binder, 1987), verdünnt in Boratsalzlösung (0,1 M H₃BO₃, 25 mM Na₂B₄O₇, 75 mM NaCl), invertiert. Die Gitter wurden mit Boratsalzlösung gespült, auf einem Tropfen von sekundärem Antikörper (Ted Pella, verdünnt 1:125), invertiert, mit Boratsalzlösung, ergänzt mit 1,5 M NaCl, gespült und mit 2 %igem Uranylacetat angefärbt.
BEISPIEL 5
Elektrophorese
Die Proteine wurden durch SDS-PAGE (Laemmli, 1970) getrennt und mit Coomassie blue angefärbt oder zu Nitrocellulose (Towbin et al., 1979) überführt. Zum Westernblotting wurden Antikörper und Blockierung (2 % Nicht-Fett-Trockenmilch)- Inkubationen in Boratsalzlösung ausgeführt. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Anwendung des Verfahrens von Lowry bestimmt, nachdem Proben in Laemmli Probenpuffer mit 10 Volumen 10 %iger Perchlorsäure und 1 %iger Phosphowolframsäure ausgefällt wurden.
BEISPIEL 6
Polymerisation von Mikrotubulus-Tau
Die Polymerisation von Mikrotubulus-Tau wurde durch Verdünnen des gereinigten Proteins in neutralem Tris- oder MES-Puffer ausgeführt, worin die Sulfhydrylreaktivität durch das Vorliegen von Reduktionsmitteln begrenzt wurde. Unter einer Vielzahl von Bedingungen gebildete Polymere werden in 1 gezeigt. Die Polymerisation wurde unter Anwendung von Tau von juvenilen Ratten (ausgewiesen durch postnatales (P) Alter), adulten Ratten und adultem Schwein bei Proteinkonzentrationen von 1,6-6,5 μM gezeigt. Die Inkubationen wurden bei 37°C für 5-26 Stunden unter Anwendung von 5-25 mM bME oder 2-20 mM DTT ausgeführt. Diese Filamente sind ähnlich dem geradkettigen Filament, bekannt als Rückstand innerhalb des neurofibrillären Knäuels, in dem Sinne, dass sie nicht helikal und ungepaart sind. Die augenscheinliche Flexibilität von einigen Filamenten (1D) macht sie jedoch in einem strikt Nicht-Euklidischen Sinne gerade und unterscheidet sie von dem eher starr erscheinenden Paar von helikalem Filament (Wisniewski et al., 1984) und geradem Filament (Crowther, 1991). Die Tau-Polymere haben an ihrem breitesten Ausmaß eine mittlere Breite von 10,5 nm, mit einem gemessenen Bereich von 6,5-13 nm. Filamente verengen sich für variable Abstände mit unregelmäßigen Intervallen (1H, J) bis etwa 50 % von ihrem breitesten Ausmaß an. Diese Verengungen können die Kreuzungspunkte von einem leicht verdrehten Filament wiedergeben. Gerades Filament, das aus neurofibrillärem Knäuel isoliert wurde, zeigt auch eine Modulierung der Breite, die so interpretiert wurde, dass sie sich aus einem Verdrehen der Längsachse ergibt, (Crowther, 1991). Es wird angenommen, dass sich der relativ große Bereich der beobachteten radialen Abmessungen aus diesem variablen Verdrehen, kombiniert mit der Endabscheidung der Filamente auf dem Gitter, und nicht aus Mehrfachfilamentmorphologien ergibt. Die Unterschiede in der Anfärbungsintensität, die das Erscheinen der Mehrfachfilamentpopulationen innerhalb eines einzelnen Gebiets (1A) erzeugen können, werden üblicherweise beobachtet. Diese sind auf die ungleichmäßigen Verteilungen von positivem und negativem Anfärben über der Gitteroberfläche zurückzuführen und weisen nicht das Vorliegen von Mehrfachfilamentmorphologien aus.
Wie auch in 1 gezeigt, werden zwei Arten von Aggregation häufig in Zubereitungen von polymerisiertem Tau beobachtet. Die erste ist am üblichsten in den juvenilen Tau-Proben und scheint die Ausfällung von nichtfilamentösem Tau auf Tau-Filamente zu beinhalten (1B). Aufgrund der Elektronenopazität von diesen Aggregaten kann die Möglichkeit, dass sie aus stark verdichteten Kurzfilamenten zusammengesetzt sind, nicht ausgeschlossen werden. Sie sind jedoch gewöhnlich mit einem einzelnen unterscheidbaren Tau-Filament verbunden. Das Auftreten von solchen Aggregaten ist gewöhnlich mit einer augenscheinlichen Abnahme in der Dichte der Filamente, wie durch Elektronenmikroskopie ersichtlich, verbunden, und vereitelt Versuche, die Polymerisation durch Zentrifugaltrennung von löslichem und filamentösem Tau zu quantifizieren. Das Bündeln von Tau-Filamenten wurde gelegentlich auch beobachtet (1C). Beide Formen von Aggregation scheinen vermindert zu sein, wenn der Tris-Zusammenfügungs-Puffer gegen Boratsalzlösung (Daten nicht gezeigt) ersetzt wurde, obwohl dies Polymerausbeuten vermindern kann.
Fünfzehn Tau-Isolate wurden auf ihre Fähigkeit zum Bilden von Filamenten geprüft. Obwohl alle von den Tau-Zubereitungen, aus zweimal zyklisierten Mikrotubuli gereinigt, die Fähigkeit zum Zusammenfügen zeigen, zeigte keine der Zubereitungen, die direkt aus Ganzhirnextrakten gereinigt wurden, diese Eigenschaft. Die Zusammenfügung von inkompetentem Tau schloss Isolate von Rinder-, Schweine- und Humanhirn ein. Es wird angenommen, dass das durch beide Verfahren gereinigte Tau die gleiche Primärstruktur aufweist, jedoch ist wahrscheinlich, dass sie in verschiedenen Zuständen von Phosphorylierung vorliegt, aufgrund der Aktivität von Phosphatasen und Kinasen, die während des Mikrotubulus-Zyklisierens vorliegen (Tsuyama et al., 1986; Burns, 1991). Unterschiede in den Anteilen von spezifischen post-translationalen Modifizierungen können in das Stimulieren oder Unterdrücken der Polymerisation einbezogen sein.
BEISPIEL 7
Morphologie von in vitro angeordneten Tau-Polymeren
Die Morphologie von in vitro angeordneten Tau-Polymeren wurde mit jener von geradem Alzheimer-Filament und gepaartem helikalen Filament (2) verglichen. Neurofibrilläre Knäuel wurden unter Anwendung eines SDS-Extraktionsprotokolls isoliert (Iqbal et al., 1984) und zur Elektronenmikroskopie in der gleichen Weise wie die Tau-Filamente verarbeitet. Die meisten der Filamente, die in der neurofibrillären Knäuelzubereitung gefunden wurden, zeigten die typische gepaarte helikale Filamentmorphologie (2A). Gelegentlich wurden gerade Filamente beobachtet und selten wurde ein Neurofibrillärknäuelfragment, das fast ausschließlich aus geradem Filament zusammengesetzt war, beobachtet (2B). Ein Vergleich von geradem Filament und Tau-Filamenten (2C) zeigte zwei Filamentpopulationen, die ähnlich in der Breite waren und die eine glatte Oberfläche ohne nachweisbare Substruktur durch dieses Anfärbeverfahren wiedergaben. Das gepaarte helikale Filament war an seinem breitesten Ausmaß wesentlich breiter als das gerade Filament oder die in vitro angeordneten Tau-Filamente. Das gerade Filament, das in neurofibrillären Knäueln gefunden wurde, war scheinbar starrer als Tau-Filamente (1D), und schien häufig gebrochen zu sein, wenn durch Interfi lamentkontakte gezwungen, um wesentliches Verbiegen zu versuchen. Dies kann von geradem Filament stammen, das eine größere Anzahl an phosphorylierten Resten enthält, analog zu der erhöhten Steifigkeit von Parakristallen, die aus phosphoryliertem Tau gebildet wurden (Hagestedt et al., 1989).
Aufgrund der Tatsache, dass die Polymere auch in der Größe zu Neurofilamenten ähnlich waren und dass Neurofilamente eine bekannte Verunreinigung des zyklisierten Mikrotubulus waren, aus dem die Zusammenfügung von kompetenten Tau (Berkowitz et al., 1977) gereinigt wurde, wurden Tau-Isolate auf mögliche Verunreinigung durch Neurofilamentproteine geprüft. Eine Coomassie-Anfärbung von zwei typischen Tau-Zubereitungen, die durch SDS-PAGE getrennt wurden, zeigte das Farbstoffbinden nur zu den Tau-Banden (3A, 3B). Ein Westernblot von einem identischen Gel unter Anwendung eines monoklonalen Antikörpers, gerichtet gegen leichte Neurofilamentkette, zeigte das Binden an 40 ng einer teilweise gereinigten Neurofilamentzubereitung (3E; das Binden wurde auch bei 10 ng nachgewiesen), jedoch kein Binden an die Tau-Proteine, die bei 5-10 μg/Weg (3C, 3D) beladen wurden. Die maximale Potenzial-Neurofilament-Verunreinigung wurde mit < 0,1 % berechnet.
Um weiterhin zu bestätigen, dass in vitro angeordnete Filamente aus Tau zusammengesetzt waren, wurde EM-Lokalisierung unter Verwendung eines monoklonalen Tau-Antikörpers, in Konjugation mit Gold-konjugierten, sekundären Antikörpern ausgeführt. Die Goldteilchen wurden speziell mit Filamenten assoziiert, wenn Filamente mit dem monoklonalen Tau-2-Antikörper vorinkubiert wurden (4A, 4B), jedoch nicht, wenn der primäre Antikörper weggelassen wurde (4C, 4D). Die Behandlung von Filamenten mit 0,5 M KCl, um Proteine, die nichtspezifisch an die Oberfläche der Filamente gebunden waren, zu entfernen, beeinflusste nicht das Markieren (4E, 4F).
Die Analyse von Filamentzusammenfügung ergab, dass das Ausmaß der Polymerisation von Inkubationszeiten und Temperaturen abhängig war (5). Erhöhte Inkubationszeiten ergaben sich im Vorliegen von längeren Filamenten auf der Gitteroberfläche. Wenn Tau bei 37°C inkubiert wird (5F-5J), erscheinen die gebildeten Filamente größer in der Länge und Anzahl als jene, die bei 22°C gebildet wurden (5A-5E). In dieser Zubereitung von P14 Ratten-Tau wurde keine Polymerisation nach einer Inkubation von 4 Stunden bei 4°C deutlich. In anschließenden Versuchen mit adultem Ratten-Tau wurde jedoch etwas Polymerisation bei 4°C beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Elektronenmikrographien, ähnlich zu jenen, die in 5 ersichtlich waren, wurden derart digitalisiert, dass Filamentlängen gemessen werden konnten (6). Die erzeugten Histogramme bestätigen, dass die mittlere Filamentlänge sich mit der Zeit erhöht, und bei jeder gegebenen Zeit die Filamente in der Probe von 37°C länger wurden. Die Daten zeigen auch, dass Filamente eine exponentielle Verteilung, anstatt der Gaußschen Verteilung, anzeigen; das wird gewöhnlich in Mikrotubuluspopulationen beobachtet (Symmons und Burns, 1991). Diese Verteilungsart würde mit einer Filamentpopulation übereinstimmen, die mit einer konstanten Rate Nukleationsstellen addierte und begrenzte Untereinheitsdissoziation zeigte.
Die Abhängigkeit der Filamentzusammenfügung von der Ionenstärke wurde auch geprüft. Wenn neutrale Lösungen (25 mM Tris, 40 mM NaCl) mit 0-75 mM KCl ergänzt wurden, wurde die Filamentmasse anschließend auf Gitteroberflächen als stark vermindert gefunden (7). Alle Proben wurden mit 500 mM KCl ergänzt, vor ihrer Abscheidung auf Gittern, somit erfolgt diese Abnahme nicht aufgrund des verschiedenen Anhaftens an der Gitteroberfläche, was sich ansonsten aus dem variablen Salzgehalt der Proben ergeben könnte. Filamente wurden bei niederer Dichte beobachtet, wenn KCl bei 100 mM (Tris + Na + K = 165 mM) zugegeben wurde, jedoch vollständige Inhibierung wurde routinemäßig bei höheren Salzkonzentrationen beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Bezüglich Filamentdepolymerisation verursachte das Erhöhen der KCl-Konzentrationen deutlich oberhalb der Zusammenfügungs-Inhibierungskonzentrationen nur begrenzte Filamentzerlegung. Die Filamente wurden noch beobachtet, wenn Proben, 24 Stunden vorher zusammengefügt, auf über 500 mM KCl erhöht wurden und weitere 24 Stunden inkubiert wurden (7). Dies lässt vermuten, dass angeordnete Filamente nur begrenzte Untereinheitsdissoziation zeigen, was mit den für die Filamentlängenverteilungen erhaltenen Daten übereinstimmt (6).
Die Wirkung des pH-Werts auf die Tau-Polymerisation wird in Tabelle 1 gezeigt. Tau von P14 und adulter Ratte wurden über Nacht in 20 mM bME, gepuffert bei variablem pH-Wert, inkubiert, dann auf Filamentbildung durch Elektronenmikroskopie bewertet. Die über den breiten pH-Wert-Bereich zwischen 6 und 11 aufgetretene Zusammenfügung wurde bei einem pH-Wert von 5,6 stark inhibiert und vollständig bei einem niederen pH-Wert inhibiert. Proben, die über Nacht bei Inhibitor-pH-Wert inkubiert wurden und dann auf neutralen pH-Wert erhöht wurden, zeigten normale Zusammenfügung (Daten nicht gezeigt). TABELLE 1

*Tau, gereinigt aus Mikrotubuli, wurde 1:8 in 100 mM MES oder Tris, gepuffert bei dem ausgewiesenen pH-Wert, verdünnt. Die Proben wurden 16 Stunden bei 37°C in 20 mM bME inkubiert, dann durch Elektronenmikroskopie beobachtet.
≠⁣ Filamente wurden beobachtet, jedoch bei sehr niedriger Dichte.

Bei frühesten Versuchen bei In-vitro-Polymerisation von P14 Ratten-Tau wurde es schnell deutlich, dass Reduktionsmittel in den Inkubationspuffer eingeschlossen sein müssen, wenn Filamente von ausreichender Länge, um als solche erkannt zu werden, gebildet werden sollten. Die Beziehung zwischen bME-Konzentration und der Länge der Filamente, die von P14 Tau angeordnet wurden, wird qualitativ in 8 gezeigt. Wenn die bME-Konzentration von 0,1 M (8B) zu 0,1 mM (8E) sank, wurde eine Abnahme in der maximalen Filamentlänge beobachtet. Bei niedrigen bME-Konzentrationen wurde häufig eine Erhöhung in den Teilchen beobachtet, die kleiner als jene waren, die als Filamente erkannt wurden, (8D und 8E). Diese können Minimallängenpolymere wiedergeben. Ähnliche Daten wurden unter Anwendung von Schweine-Tau und DTT als das Reduktionsmittel (9) erzeugt. Obwohl die mittlere Filamentlänge deutlich sank, wenn die Konzentration von DTT sank (9F), war die Länge der an dem untersten Anteil von Reduktionsmittel beobachteten Filamente variabler als jene, die bei anderen Versuchen beobachtet wurde (8), wobei Filamente mit einer Länge von 2,4 μm aufgezeichnet wurden. Diese Variation reflektierte das variable Ausmaß, zu dem man Polymerisieren der verschiedenen Zubereitungen von Mikrotubulus-Tau beobachtete, wobei jene Zubereitungen, die den höchsten Anteil von Polymer erzeugten, typischerweise eine gleichförmiger kurze Population von Filamenten bei niedrigen Konzentrationen von Reduktionsmitteln zeigte. Obwohl hohe Konzentrationen der Reduktionsmittel in vielen Versuchen verwendet wurden, um die Zusammenfügung von langen Filamenten zu maximieren, sollte betont werden, dass der Bereich von reduzierenden Potenzialen, wiedergegeben in 9, deutlich Werte umfassen würde, von denen erwartet wird, dass sie im Zytoplasma auftauchen. Physiologische Konzentrationen von Glutathion (1-10 mM, Hwang et al., 1992) – das Tripeptid, das das Meiste der Redox-Pufferungskapazität des Zytoplasmas ausmacht – förderten auch die Zusammenfügung von Mikrotubulus-Tau, gereinigt von P11 Ratte, adulter Ratte und adultem Schweinehirn.
BEISPIEL 8
Proteinisolierung
Sprague-Dawley-Ratten wurden von Charles River, Wilmington, MA, erhalten und durch Decapitation am postnatalen Tag 11 (Juvenile) oder bei einem Alter von mehr als sechs Wochen (Adulte) getötet. Frische Schweinehirne wurden von Bryan Fleischverpackung, Westpoint MS, erhalten. Detaillierte Versuchsvorschriften für die Isolierung von Tau aus dem Ganzhirn oder zweimal zyklisierten Hirnmikrotubuli wurden vorstehend beschrieben. Nichtphosphoryliertes, rekombinantes Human-Tau (hTau40; Goedert et al., 1989) war ein Geschenk von Dr. Jeff Kuret, Northwestern University Medical School, Chicago, I11. Rekombinantes Tau wurde in E. coli als ein Fusionsprotein mit einem Polyhistidin tag erzeugt, und zur nahezu Homogenität durch Nickel-Chelat- und Gel-Filtrations-Chromatographie (Carmel et al., 1994) gereinigt. Nach Reinigung wurden Tau-Isolate gegen Puffer A (20 mM Morpholinethansulfonsäure, pH 6,8, 80 mM NaCl, 2 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA) dialysiert und bei –80°C gelagert. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Verfahrens von Lowry (Lowry et al., 1951) bestimmt, nachdem die Proben in Laemmli-Probenpuffer (Laemmli, 1970) mit 10 Volumen 10 %iger Perchlorsäure und 1 %iger Phosphowolframsäure ausgefällt wurden. Rinderserumalbumin wurde als der Standard verwendet.
BEISPIEL 9
Zubereitung von Fettsäuren
Alle freien Fettsäuren wurden in der cis-Konformation und bei maximal verfügbarer Reinheit von Sigma Chemical Company bezogen. Freie Fettsäuren wurden in Tau und Amyloidproben von einer 200-fachen ethanolischen Stammlösung verdünnt, sodass die Ethanol-Endkonzentration in allen Proben und Kontrol len 0,5 % war. Die Werte für die kritische micellare Konzentration (CMC) wurden erhalten, basierend auf der Phasenverteilung, die von 10 mM Phenylnaphthylamin (Kovatcbev et al., 1981) teilnahm, wenn freie Fettsäuren in dem Zusammenfügungspuffer verdünnt wurden.
BEISPIEL 10
Tau-Proteinzusammenfügung
Für die meisten Versuche wurden Tau-Proteine 2-fach zu der gewünschten Konzentration in Puffer A verdünnt, dann 1/2 in Boratsalzlösung (0,1 M H₃BO₃, 25 mM Na₂B₄O₇, 75 mM NaCl), ergänzt mit 20 mM Dithiothreitol (DTT), und 2-fach der erforderlichen Konzentration von freien Fettsäuren (End-pH-Wert etwa 8,4). Die Zusammenfügung wurde bei 37°C in silikonisierten Mikrozentrifugenröhrchen ausgeführt. Zum Bewerten der Abhängigkeit der Zusammenfügung von der Ionenstärke, wurde Tau 1:10 in 111 mM Tris, pH 7,2, verdünnt, 11 mM DTT ergänzt, um die ausgewiesenen Endkonzentrationen von NaCl zu ergeben. Bei 250 mM NaCl war die gemessene CMC von Arachidonsäure in dem Tris-Pufferungssystem > 2 mM.
BEISPIEL 11
Amyloid-Peptid-Zusammenfügung
Aβ_1-40 (Amyloid-β-protein, Reste 1-40, Sigma) wurden in Aβ-Zusammenfügungspuffer (100 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl) bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml resuspendiert und in aliquoten Mengen bei –80°C gefroren. Aufgetaute Aliquoten wurden auf 50 mg/ml in Zusammenfügungspuffer verdünnt, gefolgt von einer Vorinkubation von 2 Stunden, und wurden für 10 Minuten bei 14 000 U/min in einer Eppendorf-5415C-Desktop-Zentrifuge zentrifugiert. Die geklärte Lösung wurde dann mit freien Fettsäuren (Aβ-Endkonzentration ≈10 mM) ergänzt und 24 Stunden inkubiert. Man achtete darauf, dass alle Verfahren bei 4°C ausgeführt wurden.
Fluoreszenzspektroskopie wurde im Wesentlichen wie beschrieben (Castano et al., 1995) ausgeführt. Aliquote Mengen wurden 1:6 in 67 mM Glycin, pH 9, 4 mM Thioflavin T, verdünnt, Vortex-behandelt und in eine Quarzküvette gegeben. Die Proben wurden an einem Perkin Elmer LS-50B Lumineszenzspektrometer, Anregung = 435 nm, Emission = 485 nm, Schlitzbreiten = 5 nm, gemessen. Die integrierte Intensität wurde von den anfänglichen zehn 10 s-Probenintervallen gelegt. Das Signal war für mindestens einige Stunden stabil. Die Fluoreszenz von fünf Proben, denen Aβ mangelt, wurde Bemittelt und ein Hintergrund von allen Ablesungen subtrahiert. Freie Fettsäuren trugen nicht zu dem Fluoreszenzsignal über den Bereich von angewendeten Konzentrationen bei.
BEISPIEL 12
Elektronenmikroskopie
Die Proben wurden in 10 ml aliquote Mengen auf 400 Mesh Nickelgittern, beschichtet mit 0,4 % Formvar, für 1 Minute angeordnet. Die Tau-Pr%ben wurden mit 4 Tropfen H₂O gespült und mit 4 Tropfen 2 %igem Uranylacetat angefärbt, wobei der letzte Tropfen 1 Minute vor dem Auftragen gesetzt wurde. Zum Anfärben von Amyloidfilamenten wurden 4 % Uranylacetat verwendet und die H₂O-Spülung wurde weggelassen. Die Gitter wurden unter Anwendung eines JEOL JEM-100CX Transmissions-Elektronen-Mikroskops, das bei 60-80 kV arbeitete, geprüft. Für Filamentlängenmessungen wurden statistische Mikrographien, die bei einer nominalen Vergrößerung von 15K erhalten wurden, digitalisiert, und verfolgt unter Anwendung von entweder Software von Universal Imaging Corporation oder von dem Public Domain NIH Image Programm (für Macintosh; geschrieben von W. Rasband an dem NIH und erhältlich aus dem Internet durch anonymous ftp von zippy.nimh.nih.gov oder von einer Diskette von NTIS, 5285 Port Royal Rd., Springfield, VA, 22161, Teilnummer PB93-504868). Nur Tau-Filamente wurden unter Messen bei mindestens 50 nm in die Datenreihen eingeschlossen. Weil kurze Filamente manchmal schwierig von den Hintergrunddebri von digitalisierten Bildern zu unterscheiden sind, wurden routinemäßig hohe Konzentrationen an DTT verwendet, um die Herstellung von längeren Filamenten zu maximieren. Gebiete, ausgewählt für die Statistik, wurden bei niedriger Beleuchtung und ohne Hilfe von 10-fachen Binokularen ausgewählt, sodass Formvar-Integrität ohne Ansehen der vorliegenden Filamente bewertet werden konnte.
BEISPIEL 13
Fettsäureabhängigkeit von Tau-Zusammenfügung
Unter Anwendung eines Zusammenfügungssystems wurde beobachtet, dass Arachidonsäure (5,8,11,14-Eicosatetraensäure) die die Polymerisation von allen geprüften Tau-Zubereitungen stimuliert. Juvenile MTτ, das in einzigartiger Weise die kleinsten von den sechs Tau-Isoformen im adulten Hirn umfasste, erzeugte (Lee, 1990), wurden in einer dosisabhängigen Weise zusammengefügt (10A). Der scheinbare Schwellenwert zur Stimulierung war eine Funktion der Zeit und war weniger als 10 μM bei dem längsten getesteten Zeitpunkt. Wenn die Daten in 10A erneut aufgetragen wurden, sodass die Polymermasse als eine Funktion der Zeit ausgedrückt wurde (10B), sind die erzeugten Kurven im Wesentlichen linear, ohne Nachweis von Plateaubildung, was anzeigt, dass die Zusammenfügungsgeschwindigkeit bis zu 66 Stunden (80 μM), 108 Stunden (40 μM) oder 214 Stunden (20 μM) relativ konstant ist. Arachidonsäure stimulierte auch die Polymerisation von adulten Ratten MTτ (1C). Diese Zubereitung zeigte ein stärkeres Potenzial für spontane Zusammenfügung, als juveniles MTτ, und stärkere absolute Anstiege in der Polymerbildung bei Arachidonsäurespiegeln von 10-40 μM. Juveniles MTτ zeigte jedoch eine größere prozentuale Erhöhung in der Zusammenfügung, wenn mit 40-80 μM Arachidonsäure stimuliert wurde. Unter den gleichen Bedingungen wurde keine spontane Zusammenfügung durch humanrekombinantes Tau und Tau, gereinigt von Schweineganzhirn, ge zeigt. Filamente wurden jedoch beobachtet, wenn diese Tau-Zubereitungen mit 20-80 μM Arachidonsäure (10C) inkubiert wurden. Obwohl Anteile von spontaner und induzierbarer Zusammenfügung zwischen den verschiedenen Tau-Zubereitungen variierten, konnte die Quelle dieser Varianz nicht aufgrund der Unterschiede in der -Konzentration von angewendetem Protein (100-200 μg/ml), Anteilen von posttranslationaler Modifizierung und Arten spezifischer Unterschiede in der Aminosäuresequenz bestimmt werden.
Um zu bestimmen, welche freien Fettsäuren am wirksamsten als Inducer der Tau-Zusammenfügung verwendet werden könnten, wurden die stimulatorischen Wirkungen der freien Fettsäuren, die sich in der Länge von ihrer Kohlenstoffkette und dem Ausmaß von Sättigung unterschieden, geprüft. Im Allgemeinen waren für jede gegebene, getestete Kettenlänge ungesättigte, freie Fettsäuren stärker als gesättigte freie Fettsäuren (Tabelle II). Eine 20- bis 30-fache Erhöhung in der Polymerbildung wurde beobachtet, wenn 50 μM Arachidonsäure, Palmitoleinsäure oder Linolensäure verwendet wurden. Die stimulatorischen Wirkungen von freien Fettsäuren erfolgten nicht aufgrund von lokalisierten Konzentrationen der Oberflächenladung, die durch Fettsäureaggregation erzeugt wurden, wie gemessen aus der CMC von einigen repräsentativen freien Fettsäuren, was ausweist, dass sie bei Konzentrationen unterhalb dieses Werts wirksam waren (Tabelle II). Bezogen auf die qualitative Prüfung von Gittern, schien die Tau-Zusammenfügung nicht durch die Methyl- oder Ethylester von Arachidonsäure stimuliert zu werden, welche auch bei 50 μM angewendet wurden (unterhalb ihrer gemessenen CMC-Werte). TABELLE II

*Tau-Filamente wurden unter Anwendung von juvenilen Ratten MTτ angeordnet. Die Proben wurden in Gegenwart von 50 μM freien Fettsäuren 72 Stunden inkubiert. Die Polymermasse wird als der Mittelwert ± S.E.M. (n = 12) oder bezogen auf die maximale Zusammenfügung, die mit Arachidonsäure erreicht wurde, ausgedrückt. ≠⁣ Die Daten nicht verfügbar.

BEISPIEL 14
Eigenschaften von Fettsäure-induzierten Tau-Polymeren
Der Zusatz von freien Fettsäuren zu Tau-Proben scheint, die Zusammenfügungsgeschwindigkeit, jedoch nicht die Beschaffenheit der gebildeten Polymere zu modulieren. Von MTτ in Abwesenheit von freien Fettsäuren (11A) angeordneten Fila menten sind von jenen nicht zu unterscheiden, die in Gegenwart von 50 μM Arachidonsäure angeordnet wurden (11B). Filamentmorphologie scheint nicht zu variieren, wenn die Quelle von gereinigtem Tau-Schweineganzhirn (11C) oder humanrekombinantem Tau (11D) stammt.
Die Polymerisation von Tau-Filamenten in Gegenwart von 50 μM Arachidonsäure erfolgte in Abhängigkeit von der Temperatur, Ionenstärke und dem reduzierenden Potenzial, wie vorher für die Polymerisation in Abwesenheit von freien Fettsäuren gezeigt, was die Schlussfolgerung stützt, dass die Filamentstruktur nicht durch freie Fettsäuren verändert wird. Juveniles MTτ zeigte eine ungefähre 500 % Erhöhung in der Zusammenfügung, wenn die Temperatur von 4°C auf 37°C erhöht wurde (13A). Die Zusammenfügung von adultem MTτ war nicht von der Temperatur abhängig (13A), was jedoch erneut anzeigt, dass Adulten-spezifische Aminosäuresequenzen und/oder Zustände von posttranslationaler Modifizierung die thermodynamischen Parameter des Zusammenfügungsverfahrens verändert. Konzentrationen von NaCl, nahe 150 mM, scheinen optimal für die Polymerisation von adultem MTτ, während höhere Konzentrationen inhibitorisch waren (13B). Dies unterscheidet sich etwas von früheren Auffindungen, was die Inhibierung bei Salz (NaCl + KCl)-Konzentrationen von nur 65 mM zeigt, was vermuten lässt, dass freie Fettsäuren die Ionenstärkeabhängigkeit näher zu einem physiologischen Optimum verschieben. Die Zusammenfügung von adultem MTτ war auch eine Funktion des reduzierenden Potenzials (13C). Die Erhöhung in der mittleren Filamentlänge, erzeugt durch Ansteigen der Konzentration an DTT, wurde von einer Abnahme in der Gesamtzahl an Filamenten begleitet. Schließlich wurde die Zusammenfügung von adultem und juvenilem MTτ in Gegenwart von 50 mM Arachidonsäure vollständig unter pH 6 inhibiert, und alle analysierten Filamentpopulationen zeigten eine exponenzielle Verteilung der Filamentlängen, die mit den in Abwesenheit von freien Fettsäuren erzeugten Daten übereinstimmen.
BEISPIEL 15
Fettsäureabhängigkeit von Amyloidzusammenfügung
Unter der Vorgabe des begleitenden Auftretens von Tau und Amyloidpathologie in dem AD-Hirn wurde bestimmt, ob Aβ-Zusammenfügung auch durch freie Fettsäuren stimuliert werden könnte. Öl- und Linolensäure, die 45 % von dem ungesättigten Fettsäuregehalt des CSF umfassen, wurden für diese Versuche ausgewählt, weil ungesättigte freie Fettsäuren scheinbar wirksamer die Tau-Zusammenfügung induzieren. Die Bedingungen wurden ausgewählt, in denen spontane Zusammenfügung von dem Aβ als minimal erwartet werden würde, um die Fähigkeit zum Nachweisen von freier Fettsäure-abhängiger Polymerisation zu optimieren.
Aus ähnlichen Gründen wurde Aβ_1-40 zur Verwendung in diesen Studien ausgewählt, anstatt als die längeren, schneller aggregierenden Aβ-Varianten. Nach einer Vorinkubation von zwei Stunden und einem kurzen Reinigungsspin wurden Peptidlösungen, die durch Elektronenmikroskopie geprüft wurden, durch das Vorliegen von relativ kurzen (< 0,5 mm) Filamenten charakterisiert, die einzeln oder in kleinen Aggregaten über die Gitteroberfläche dispergiert waren (14A). Wenn Proben 24 Stunden in Abwesenheit von freien Fettsäuren inkubiert wurden, wurden die Filamente aggregierter und zeigten eine mittlere Erhöhung in der Länge (14B).
Wenn im Gegensatz dazu, Proben mit Öl- oder Linolensäure inkubiert wurden, wurde eine starke Erhöhung in den Filamentlängen beobachtet (14C und 14D). Filamentbreiten waren in der Größenordnung von 5-10 nm, ähnlich zu Werten, die für andere in vitro angeordneten Amyloidfibrillen (Burdick et al., 1992; Castano et al., 1995) berichtet werden. Wenn die Aβ-Konzentration von 10 μM auf 25 μM erhöht wurde, gab es eine beträchtliche Erhöhung in der spontanen Bildung von Amyloidfi lamenten, was die relative Verteilung der freien Fettsäuren schwierig zu bewerten macht. Aufgrund der Filamentaggregation und der nicht gleichförmigen Dispergierung von solchen Aggregaten auf der Gitteroberfläche weisen die Filamentdichten, die in 14 beobachtet werden, nicht notwendigerweise auf Filamentdichten in Lösung hin. Beim Herstellen von Amyloidproben zur Elektronenmikroskopie war es notwendig, die Zusammenfügungsinkubationen auf 24 Stunden oder weniger zu begrenzen, weil größere, bei längeren Inkubationszeiten gebildete Aggregate in der Regel das Formvar kollabieren lassen oder von den Gittern während des Anfärbeverfahrens abgewaschen werden.
Obwohl freie Fettsäuren scheinbar einen ausgeprägten Effekt auf die Filamentverlängerung aufweisen, konnten mikroskopische Verfahren allein dies nicht einer Induktion von Untereinheitseinarbeitung zuschreiben: Filamentverlängerung könnte sich aus der seitlichen oder endweisen Zusammenlagerung von kurzen Filamenten, die in Abwesenheit von freien Fettsäuren beobachtet wurden, ergeben. Ein fluorometrisches Assay wurde deshalb als ein Maß der gesamten Polymermasse, die in Peptidlösungen vorliegt, angewendet. Dieses Assay basiert auf einer einzigartigen Anregung und den Emissionsmaxima, die sich aus dem Binden von Thioflavin T an die β-Blattstruktur von Proteinen ergibt (Naiki et al., 1989; LeVine, 1993). Quantitative Ergebnisse, die durch dieses Verfahren erhalten wurden, stimmten mit den Beobachtungen, die durch Elektronenmikroskopie gemacht wurden, überein. Das Fluoreszenzsignal wies niedrige Anteile von in Abwesenheit der freien Fettsäuren gebildetem Polymer und keine Erhöhung über der Grundlinie in Gegenwart von 10-20 μM freien Fettsäuren (15) auf. Signifikante Erhöhungen im Polymergehalt wurden bei Öl- und Linolsäurekonzentrationen von 40 μM beobachtet. Bei höheren Konzentrationen von freien Fettsäuren war Linolsäure als der stärkere Inducer von Amyloidzusammenfügung unterscheidbar. Diese Demonstration einer Erhöhung in der Gesamtpolymermasse, die durch freie Fettsäuren induziert wurde, zeigt an, dass Filamentverlänge rung nicht nur dem Zusammenlagern von vorliegenden Filamenten zugeschrieben werden kann, sondern stattdessen der weiteren Einfügung von Peptiduntereinheiten beinhalten muss. Es ist bemerkenswert, dass die Polymerisation von Amyloid- und Tau-Filamenten durch ähnliche Konzentrationen von freien Fettsäuren stimuliert wurde, wie erwartet werden würde, wenn die dualen Verfahren von NP- und NFT-Bildung ein übliches Effektormolekül teilen.
BEISPIEL 16
Die vorliegende Erfindung zeigt in einer Ausführungsform das erfolgreiche Zusammenfügen einer homogenen Population von Tau-Filamenten, die zu dem geraden Filament, das bei Alzheimer-Krankheit beobachtet wird, morphologisch scheinbar in Beziehung steht. Es wurde bislang nicht gezeigt, dass Tau Polymere dieser Beschaffenheit unter Bedingungen bilden wird, die für die intrazelluläre Umgebung typisch sind. Frühere Studien, die die Zusammenfügung von Tau-Filamenten beschreiben, welche gerade oder gepaarte helikale Morphologien besitzen (Breitenbereich von 10-25 nm), hingen von der Verwendung von nichtphysiologischen Bedingungen ab. Die Zusammenfügung von Rinder- oder Schweine-Tau wurde vorher nur nach der chemischen (Montejo de Garcini et al., 1986) oder enzymatischen (Dudek und Johnson, 1993) Modifizierung des Proteins erreicht. Die Zusammenfügung von rekombinanten Tau-Konstrukts, die entweder die vollständige oder Teil-Tau-Sequenz enthalten, basierte auf entweder hohen Salzkonzentrationen (1,25 M CH₃CO₂-K⁺; Crowther et al., 1994) oder einem sauren pH-Wert (Wille et al., 1992, Crowther et al., 1992). Keine von diesen vorangehenden Studien wendete Reduktionsmittel in ihren Zusammenfügungsreaktionen an. In einer reduzierenden Umgebung findet die Zusammenfügung von 10 nm Tau-Filamenten statt, wenn die Variablen von Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke auf physiologische Werte eingestellt wurden. Von diesen Variablen war nur die Ionenstärke bei physiologischen Werten begrenzend, mit optimaler Zusammen fügung, die bei niederen Salzkonzentrationen auftritt. Obwohl Filamentdichten, die bei physiologischer Ionenstärke beobachtet werden, niedrig waren, könnte signifikant Polymermasse in situ über einen längeren Zeitraum, im Einklang mit der Pathogenese des Erkrankungszustands, akkumulieren.
Die in vitro gebildeten Tau-Polymere sowie gerades Filament, das in vivo gebildet wurde, sind bandartig in dem Sinne, dass im Querschnitt ihre Breite etwa doppelt in ihrer Dicke ist und dass ihr gemessenes Profil von dem Ausmaß abhängt, zu dem sie entweder eben oder an der Kante liegen. In Übereinstimmung mit dieser Interpretation liegt der zweifache Unterschied im Bereich der Breiten, der für Tau-Filamente gemessen wurde. Ein Beispiel von einem Filament, das vielleicht teilweise auf einer Kante liegt, wird in 1J beobachtet, wenn das Zentralsegment sehr eng ist, allerdings wird beobachtet, dass die Enden sich zu eher typischeren Abmessungen erweitern. Diese Interpretation der Filamentmorphologie impliziert, dass die tatsächliche Maximumbreite von diesen Tau-Polymeren näher zu dem Bereichmaximum (13 nm), als der mittleren gemessenen Breite (10,5 nm), ist. Obwohl Werte von 15 nm, berichtet für die Breite von geradem Filament, in dünnem, geschnittenem Gewebe etwas größer sind (Metuzals et al., 1981; Yagishita et al., 1981), können sich Überschätzungen aufgrund der Abscheidung von positiver Verfärbung aus dieser Technik ergeben (Buben et al., 1993).
Aufgrund ihrer ähnlichen Abmessungen wurde die Möglichkeit, dass die von den Tau-Zubereitungen angeordneten Polymere tatsächlich Neurofilamente darstellen, aufgegriffen. Coomassie-angefärbte Gele von repräsentativen Tau-Proben zeigten kein Neurofilament oder andere Proteinverunreinigungen, und Westernblots von den gleichen Proben zeigten keine Proteine, die kreuz-reaktiv mit einem Antineurofilament-Proteinantikörper sind. Die gebildeten Polymere wurden durch einen Anti-Tau-Antikörper stark markiert, auch nach Inkubieren von Filamenten in hohem Salz, um peripher gebundene Proteine zu entfernen. Es gab auch Schwierigkeiten zwischen den hierin beschriebenen Zusammenfügungsbedingungen und jenen, die früher für die Zusammenfügung von Neurofilamenten mitgeteilt wurden. Die Zusammenfügung von Tau-Filamenten wurde bei niedriger Ionenstärke bevorzugt, und zeigte eine hohe Ionenstärke, während Neurofilamente bei hoher Ionenstärke zusammengefügt wurden (Geisler und Weber, 1981) und bei niedriger Ionenstärke zerfallen (Hisanaga und Hirokawa, 1988). Außerdem hatte das Senken der Temperatur oder Erhöhen des pH-Werts der zur Filamentzusammenfügung verwendeten Puffer keine Wirkung auf die Morphologie von Tau-Filamenten (Daten nicht gezeigt), ergab jedoch die Bildung von Neurofilamenten, die anormale Morphologien zeigen (Aebi et al., 1988).
Nach dem Zeitverlauf der Polymerisation bei verschiedenen Temperaturen gibt es drei Punkte von Interesse. Erstens ist die Beobachtung, dass alle Filamentpopulationen eine exponenzielle Verteilung von Filamentlängen zeigten, eine Tatsache, die durch Längenverteilungen bestätigt wird, welche über einen Bereich von DTT-Konzentrationen erzeugt wird. Diese Art von Verteilung ist, im Gegensatz zu Gaußschen Verteilungen, die in äquilibrierten Mikrotubuluspopulationen (Symmons und Burns, 1991) beobachtet wurden, und stimmt mit einer Filamentpopulation überein, die begrenzte Untereinheitsdissoziation zeigt und Nukleationsstellen bei einer konstanten Geschwindigkeit hinzufügt. Diese Interpretation wird durch die Beobachtung gestützt, dass Tau-Filamente, die bei Salzkonzentrationen inkubiert werden, die ausreichend sind, um die Zusammenfügung zu inhibieren, nur begrenzte Zerlegung zeigten, was wiederum eine relativ langsame Geschwindigkeit von Untereinheitsdissoziation vermuten lässt. Ein zweiter Punkt von Interesse ist, dass sich die gebildete Polymermasse erhöht, wenn sich die Temperatur erhöht. Dies läuft parallel zu den Ergebnissen von zirkularen Dichroismusstudien, welche zeigten, dass der Sekundärstrukturgehalt von auch Tau sich als eine Funktion der Temperatur erhöhte (Ruhen et al., 1991). Es ist deshalb wahr scheinlich, dass vor der Polymerisation das Tau-Molekül eine Konformation höherer Ordnung annimmt. Der dritte Punkt besteht darin, dass sich die Tau-Filamente mit der Zeit unter Beibehalten von konstanten radialen Abmessungen zu verlängern scheinen. Dies lässt vermuten, dass sich Filamente durch die endweise Addition von Untereinheiten verlängern, wie zu der lateralen Kondensation von vorgebildeten Protofilamenten aneinandergelegt. Dies war in vorhergehenden Studien nicht nachgewiesen worden, welche alle geprüften Polymere von einzelnen Zeitpunkten aufweisen.
Eine Rolle für Tau-Dimere in der Zusammenfügung von gepaarten helikalen Filament-artigen Polymeren wurde früher vermutet (Wille et al., 1992). Die Behandlung von Tau-Konstrukten mit Phenylendimaleimid zum Induzieren von nicht reduzierbarem Vernetzen von Cysteinresten ergab die Bildung von Tau-Dimeren, wie durch SDS-PAGE gezeigt, und diese Dimere fügten sich zu Filamenten zusammen, die identisch zu jenen sind, die durch unbehandeltes Tau gebildet werden (Wille et al., 1992). Die Beobachtung, dass Filamentlängen abnehmen, wenn die bME- oder DTT-Konzentration sinkt, lässt vermuten, dass Tau-Dimere, die sich in weniger reduzierender Umgebung bilden, das Polymerisationsverfahren inhibieren können. Es wurde jedoch früher in Mikrotubuluspopulationen gezeigt, dass ein Faktor, welcher die Zusammenfügung (Mikrotubulus-assoziierte Proteine) stimuliert, die mittlere Mikrotubuluslänge vermindert (Sloboda et al., 1976). Dies erläutert die inverse Beziehung, die zwischen Zusammenfügungsgeschwindigkeit und Filamentlänge vorliegen kann. Solche Disulfidbindungen, die zu cytoplasmatischer Verminderung resistent sind, wurden in globulären Proteinen gefunden; sie wurden in einem Protein, wie Tau, nicht erwartet, von dem angenommen wurde, dass es in einer ausgedehnten Konformation mit begrenzter Sekundärstruktur vorliegt (Cleveland et al., 1977b, Hirokawa et al., 1988). Da der Bereich von Tau, der die Cysteinreste enthält, als ein relativ hydrophober Teil des Moleküls bekannt ist (Buben et al., 1991), können jedoch Konfor mationsveränderungen mit Dimerisierungs- und/oder Polymerisationsfalle der relevanten Cysteine in einer zentralen hydrophoben Domäne assoziiert sein, die durch Reduktionsmittel nicht leicht zugänglich wird.
Der Einbezug von Disulfidbindungen kann auch durch die pH-Abhängigkeit der Zusammenfügung (Tabelle I) angezeigt sein. Die Inhibierung der Zusammenfügung, die unter pH 6,0 beobachtet wurde, könnte auf verminderte Sulfhydrylreaktivität zurückgeführt werden, obwohl in diesem pH-Wert-Bereich Wirkungen aufgrund von Histidinprotonierung nicht ausgeschlossen werden können. Von der Zusammenfügung von Tau-Deletionsmutanten wurde auch beobachtet, dass sie vom pH-Wert abhängig sind. Unter nicht reduzierenden Bedingungen wurde nicht beobachtet, dass Konstrukte, die das meiste der Mikrotubulbindungsdomäne umfassen, sich bei neutralem pH-Wert anordnen, sondern Filamente bei pH 5,0-5,5 (Wille et al., 1992) oder pH 4,5-5,0 (Crowther et al., 1992) bildeten. Unter nicht reduzierenden Bedingungen werden Tau-Zubereitungen, die keine Filamente von wesentlicher Länge bei neutralem pH-Wert bilden (8F), lange Filamente bei pH 5,5 (Daten nicht gezeigt) bilden. Zusammengenommen lassen diese Daten vermuten, dass, obwohl ein ausreichend niedriger pH-Wert Polymerisation vollständig blockieren wird, unter Bedingungen, die zum Zusammenfügen nützlicher sind, die Wirkungen von pH-Wert und Reduktionsmittel auf Disulfidstabilität additiv sind, und Erhöhen von entweder [bME] oder [H+], die mittlere Filamentlänge erhöhen wird.
Obwohl beobachtet wurde, dass Tau, gereinigt aus Mikrotubulus, Filamente unter Anwendung von Zusammenfügungsbedingungen bildet, scheint Tau, gereinigt von Ganzhirn, inkompetent zum Zusammenfügen zu sein. Eine weitere Studie war jedoch in der Lage, das Vorliegen von 10 nm Filamenten in Proben von Ganzhirn-Tau, inkubiert mit Transglutaminase, ein Enzym, das intermolekulare Vernetzungen zwischen Glutaminsäure und Lysinresten katalysiert, zu zeigen (Dudek und Johnson, 1993). Die Bildung von Filamenten, die morphologisch ähnlich zu jenen, hierin gezeigten, sind, lässt vermuten, dass Ganzhirn-Tau in der Lage ist, in einer Weise zu assoziieren, die ähnlich zu jener ist, die der Polymerisation von Mikrotubulus-Tau vorangeht. Jedoch in Abwesenheit des Vernetzungsenzyms scheint es wahrscheinlich, dass im Fall von Ganzhirn-Tau diese Assoziation reversibel ist. Dies impliziert, dass Unterschiede in der post-translationalen Modifizierung von Tau, gereinigt durch diese zwei Verfahren, direkte Stabilität von kohäsiven Tau-Wechselwirkungen beeinflussen können und dass Transglutaminase die Zusammenfügung, unabhängig von diesen Modifizierungen, induzieren kann.
Die Phosphorylierung beeinflusst viele der strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Tau. Vorausgesetzt, dass normales Tau nicht in einem Phosphorylierungszustand isoliert wurde, der mit jenem von Tau, der in ein gepaartes helikales Filament und gerades Filament eingebaut ist, identisch ist; ist es nicht überraschend, dass diese Morphologien nicht dupliziert wurden. Tau-Filamente, die in vitro angeordnet sind, ähnelten keinem gepaarten helikalen Filament und zeigten größere Flexibilität als ein gerades Filament. Spezielle Phospate, die die seitliche Assoziation von Untereinheiten während der gepaarten helikalen Filamentzusammenfügung erlauben könnten, könnten abwesend oder durch andere Phosphate, die in dem Tau vorliegen, das von zyklisiertem Mikrotobulus gereinigt wurde, okkludiert sein. Gleichfalls könnte die erhöhte Phosphorylierung von Tau, die in gerades Filament und gepaartes helikales Filament eingebaut ist, zur erhöhten Strukturstarrheit beitragen, die analog zu dem Anstieg in der Starrheit von Tau-Parakristallen ist, die durch Phosphorylierung induziert wird (Hagestedt et al., 1989). Es ist wahrscheinlich, dass, wenn der Phosphorylierungszustand von geradem Filament und gepaartem helikalem Filament dupliziert werden könnte, sich identische Strukturen unter diesen Zusammenfügungsbedingungen bilden würden.
Das Anwenden der Bedingungen für die Tau-Polymerisation, die in der vorliegenden Erfindung definiert wurden, hat verschiedene potenzielle Vorteile gegenüber vorher berichteten Verfahren. Erstens wurden angemessene Filamentausbeuten bei relativ niedrigen Tau-Konzentrationen (1-10 mM) erhalten. Vorangehende Studien haben Konzentrationen von 50 mM (< 10 Filamente/Gebiet; Montejo de Garcini und Avila, 1987) bis 250 mM (Crowther et al., 1994) verwendet. Eine Studie berichtete über die Zusammenfügung bei einer Tau-Konzentration von 2,5 mM, jedoch nur in Gegenwart von Transglutaminase (Dudek und Johnson, 1993). Da dieses Enzym potenziell Polymerakkumulation in einer von physiologisch relevanten post-translationalen Modifizierungen unabhängigen Weise induzieren könnte, könnte das Protokoll zum Definieren jener Proteinmodifizierungen, die Veränderungen in der Filamentmorphologie oder Raten der Zusammenfügung ergeben, nicht geeignet sein. Zweitens sind, im Gegensatz zu den Bedingungen, die für die Zusammenfügung von Tau-Fragmenten mitgeteilt werden (Wille et al., 1992; Crowther et al., 1992), die hierin definierten Bedingungen für die Zusammenfügung des Tau-Proteins in voller Länge nützlich. Dies ist wichtig, wenn der Beitrag von allen Regionen der Tau-Sequenz zu dem Zusammenfügungsverfahren bewertet werden soll. Drittens, die Verwendung von diesen Zusammenfügungsbedingungen ergibt die Polymerisation von einer morphologisch homogenen Population von Filamenten. Deshalb kann Analysieren der Veränderungen in der Morphologie, die sich aus Proteinmodifizierung ergeben, geradliniger sein, als wenn Bedingungen angewendet werden, von denen berichtet wird, dass sie heterogene Filamentpopulationen ergeben (Montejo de Garcini et al., 1986; Wille et al., 1992; Crowther et al., 1992; Crowther et al., 1994). Wenn schließlich chemische oder enzymatische Behandlungen von Tau auf ihre potenzielle Fähigkeit untersucht werden, Tau-Polymerisation in vivo zu modulieren, sollten sie vorzugsweise unter Bedingungen, möglichst nahe den physiologischen, geprüft werden.
Eine ursächliche Beziehung wurde zwischen freien Fettsäuren und der In-vitro-Zusammenfügung von Polymeren festgestellt, die von jenen abgeleitet sind, die in dem AD-Hirn beobachtet werden. Von Arachidonsäure wurde beobachtet, dass sie die Polymerisation von All-Tau-Zubereitungen, geprüft mit der Zusammenfügung, die durch nur 10-20 μM freie Fettsäuren bei Tau-Konzentrationen von 2,5-5 μM eingeleitet wurden, stimuliert. Zusätzlich weisen gemessene Unterschiede in der spontanen und induzierbaren Zusammenfügung der verschiedenen Tau-Isolate aus, dass die Sequenz und/oder die Phosphorylierung wahrscheinlich eine Rolle beim Modulieren der Tau-Polymerisation spielen. Von der Aktivität von Kinasen und Phosphatasen, die während des Gewebeverarbeitens und Mikrotubuluszyklisierens vorliegen, wird erwartet, dass sie einen Phosphorylierungszustand für Mikrotubulus-Tau erzeugen, der von jenem von Tau, gereinigt von Ganzhirn, verschieden ist, wie für Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2 gezeigt. Da juveniles und adultes Hirn verschiedene Reihen von entwicklungsmäßig regulierten Kinasen und Phosphatasen enthalten, wird sich MTτ, gereinigt von diesen zwei Quellen, auch in seinem Phosphatgehalt unterscheiden. Von rekombinanten Tau-Proteinen wird angenommen, dass sie keine phosphorylierten Reste enthalten. Es sollte betont werden, dass keiner von diesen Phosphorylierungszuständen notwendiger Weise in vivo stattfindet. Ein Vergleich von Tau, angeordnet in Gegenwart und Abwesenheit von freien Fettsäuren, zeigt eine ähnliche Abhängigkeit von verschiedenen physikalischen Parametern und die Bildung von morphologisch nicht unterscheidbaren Filamenten. Da freie Fettsäuren die Zusammenfügung ohne Verändern der Art des gebildeten Filaments zu stimulieren scheinen, sollten sie sich im Allgemeinen beim Untersuchen der Wirkungen von Phosphorylierung und anderen Faktoren, die weiterhin die Tau-Polymerisation modulieren könnten, als verwendbar erweisen.
Ein Ergebnis, das engere Prüfung aufgrund seiner Verwicklungen für den Mechanismus der Tau-Zusammenfügung recht fertigt, ist die reziproke Beziehung zwischen der Filamentlänge und Filamentzahlen, die beobachtet wird, wenn das Reduktionspotenzial variiert wird. Wenn Kernbildung und Dehnungsereignisse für einen begrenzten Pool an Untereinheiten in Konkurrenz treten, könnten dann die Wirkungen des Erhöhens des Reduktionspotenzials, wodurch Disulfid-abhängige Dimerisation abnimmt, auf zwei Wegen interpretiert werden. Erstens könnte das Senken der Dimerisation Elongation bei der Erhöhung der Kernbildung fördern. Dies impliziert, dass in einem Übermaß an DTT gebildete Tau-Dimere die Zugabe von Tau-Monomeren zu Filamentenden inhibieren können, was unwahrscheinlich scheint angesichts des großen Überschusses an Monomeren, der unter diesen Bedingungen vorzuliegen erwartet wird. Zweitens kann das Senken der Dimerisierung Kernbildung inhibieren, unter Erlauben von größerer Dehnung. Konsistent mit der letzteren Interpretation ist eine > 50 %ige Senkung in der Gesamtpolymermasse (Filamentzahl × mittlere Länge, 13C), beobachtet, wenn die Zusammenfügung bei 10 mM DTT mit der Zusammenfügung bei 0,01-1,0 mM DTT verglichen wird, was anzeigt, dass ein größeres reduzierendes Potenzial eine Gesamtinhibitorwirkung auf die Zusammenfügung aufweist. Diese Interpretation der Daten stützt die früheren Berichte, dass auf intermolekularem Disulfid basierende Dimerisation Polymerisation von einem Tau-Deletionskonstrukt vorangeht (Wille et al., 1992; Schweers et al., 1995). Eine hydrophobe Domäne, die durch die Faltungsereignisse erzeugt wurde, welche Polymerisation vorangehen, könnte eine Disulfidbindung, geteilt von zwei benachbarten Tau-Monomeren, schützen, unter Erlauben der Bildung von wesentlichen Zahlen an Dimeren unter reduzierenden Bedingungen. Die stimulatorische Wirkung der freien Fettsäuren auf die Tau-Polymerisation könnte durch eine Stabilisierung von dieser hydrophoben Domäne und die verbundene gefaltete Konformation von Tau vermittelt werden.
Die Fähigkeit der freien Fettsäuren, Amyloidzusammenfügung zu stimulieren, könnte sich auch aus der Stabilisierung einer Zusammenfügungs-Konkurrenz-Konformation von dem Aβ-Peptid ergeben. Das Thioflavin-Bindungsassay zeigt an, dass freie Fettsäuren eine Erhöhung in der Polymermasse stimulieren, jedoch löst dies nicht die relativen Beiträge zu der Filamentkernbildung und -ausdehnung. Die Zahl von kurzen Filamenten in freier Fettsäure behandelten Proben lässt jedoch vermuten, dass Kernbildung begrenzt ist. Da spontane Zusammenfügung bei 25 μM, jedoch nicht 10 μM Peptid, beobachtet wird, könnte in einer 10 μM Lösung ohne freie Fettsäuren die Konzentration von löslichem, Zusammenfügungs-kompetentem Peptid unter der kritischen Konzentration, die für die Zusammenfügung erforderlich ist, liegen. Die Stabilisierung von der Zusammenfügungskompetenten Konformation des Peptids durch freie Fettsäuren könnte Konzentrationen oberhalb der kritischen Konzentration treiben, die sich aus der Dehnung der Population von kurzen Filamenten, die anfänglich in der Peptidlösung vorliegen, ergeben. Potenzielle Konformationsänderungen werden wahrscheinlich durch die Wechselwirkung der freien Fettsäuren mit hydrophoben Resten von dem Aβ-Peptid vermittelt. Die berichtete Wechselwirkung von dem apoE mit Aβ ist auch von den hydrophoben Eigenschaften des Peptids abhängig und wird durch die Lipidbindungsdomäne von apoE vermittelt. Somit kann die Zusammenfügungs-fördernde Wirksamkeit von apoE und freien Fettsäuren geeigneterweise von einer Vielzahl von hydrophoben Substraten geteilt werden. Gegeben sei, dass β-Amyloidpolymerisation als ein reversibles Verfahren erscheint, wobei beliebige Faktoren, die die Geschwindigkeit der Filamentdehnung steigern, die Nettozerstörung und normale Reinigung von Amyloidpolymeren senken, wodurch zur Amyloidabscheidung beigetragen wird.
Unter Erkennen des potenziellen Beitrags der freien Fettsäuren zur AD-Pathologie, ist es von Interesse, zu prüfen, ob Konzentrationen von freien Fettsäuren, von denen gezeigt wurde, dass sie Polymerzusammenfügung in vitro stimulieren, von physiologischer Relevanz in vivo sein könnten. Die intra zelluläre Konzentration der freien Fettsäuren wurde nicht direkt gemessen, jedoch ist es wahrscheinlich, dass sie in dem niedermikromolaren Bereich, wie von den Dissoziationskonstanten (0,2-3,0 μM), die für das Binden von freien Fettsäuren an Fettsäurebindungsproteine berichtet werden, überlagert wird, wobei von einer Klasse von Proteinen angenommen wird, dass sie die Diffusion erleichtern und als intrazelluläre Puffer von freien Fettsäuren wirken. Von der Induktion von freien Fettsäuren abhängiger, pathologischer Wirkung könnte deshalb erwartet werden, dass sie bei freien Fettsäurekonzentrationen in dem Bereich von niederem Molekulargewicht (d.h. leicht höher als normal physiologisch) auftreten, was mit dem scheinbaren Schwellenwert von 5-10 μM übereinstimmt, welcher für die Stimulierung von Tau-Zusammenfügung gezeigt wird. In dem CSF wurden unveresterte Fettsäurekonzentrationen im niederen mikromolaren Bereich (10^–6-10^–5) gemessen, es wird jedoch berichtet, dass sie bei Reaktion auf physikalische Trauma auf 30-50 μM steigen. Da die Konzentration von Albumin in dem CSF nur 2-3 μM ist, auch mit 6-8 Hochaffinitäts-freien Fettsäurenbindungsstellen, kann die puffernde Kapazität von Albumin unter gewissen Trauma-bedingten Zuständen überschritten werden, was zu Erhöhungen in sowohl extrazellulärer als auch durch Transmembrandiffusion intrazellulären freien Fettsäurespiegeln führt. Bezüglich dieser letzteren Hinsicht gibt es eine erhöhte Amyloidabscheidung und eine erhöhte Prevalenz von AD unter den Opfern von Kopftrauma.
Die Fähigkeit von ungesättigten freien Fettsäuren, Tau und Aβ_1-40-Zusammenfügung zu stimulieren, lässt vermuten, dass Enzyme mit Phospholipase A₂-(PLA₂)-Aktivität für die Erzeugung von AD-Pathologie relevant sein können. Viele PLA₂-Enzyme sind Ca⁺⁺-aktiviert und direkt oder indirekt an Signalleitung, heterotrimere G-Proteine gekoppelt, die wiederum durch viele Faktoren aktiviert werden, einschließlich Rezeptor-gebundene Neurotransmitter, Hormone und Zytokine, bakterielle Toxine und Aluminiumfluorat. Die Spiegel von Arachidonsäure, die durch PLA₂-Aktivität erzeugt wurden, werden während Langzeitpotenzierung (LTP) erhöht, ein Phänomen, das mit dem Verfahren der Gedächtnisformation verbunden ist. Unter einigen Bedingungen zeigen auch Lezithin : Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) eine PLA₂-Aktivität. Serum LCAT setzt normalerweise Fettsäuren aus Phospholipiden frei und katalysiert deren Veresterung mit freiem Cholesterin: in Abwesenheit von ausreichend freiem Cholesterin ist die Nettowirkung die Erzeugung von freien Fettsäuren. Dieses Enzym, das im Hirn synthetisiert wird und eine Komponente von Lipoproteinen in dem CSF darstellt, kann von besonderer Wichtigkeit sein, vorausgesetzt, dass es durch apoE aktiviert ist, ein kürzlich identifizierter genetischer Risikofaktor für AD. Es ist nicht bekannt, ob die Risikodefinierenden allelen Variationen in apoE seine Aktivierung von LCAT modulieren können.
Bei einer multifaktoriellen Erkrankung, die durch das Auftreten von zwei verschiedenen Läsionen charakterisiert ist, die gleichzeitig stattfinden, jedoch nichtsdestoweniger durch das Hirn in einer nicht korrelativen Weise verteilt sind, sind die diffundierbaren freien Fettsäuren attraktive Kandidaten als Bewirker von Pathogenese. Das nachstehende Modell (schematisiert in 16) wird als ein Beispiel davon vorgeschlagen, wie sich der räumliche und zeitliche Fortschritt von AD aus der freien Fettsäure-Dysäquilibrie ergeben könnte. Beginnend mit der frühesten Stufe der NP-Bildung ergibt ein toxischer Effekt, der durch die anfängliche Abscheidung von filamentösem Amyloid hergestellt wurde, einen Abbau von Neuriten und die Aktivierung von Glialzellen in dem umgebenden Neuropil. Diese anfängliche Polymerisation von Amyloid findet statt, wenn die lokale Konzentration von Ab die kritische Konzentration für die Zusammenfügung überschreitet: dies könnte eine Erhöhung in der Peptidkonzentration oder eine Abnahme in der kritischen Konzentration ergeben, wobei jede davon zu einer Vielzahl von Faktoren von genetischem oder umweltmäßigem Ursprung beitragen könnte. Wenn Astrozyten, mit primordialer Plaque verbunden, aktiviert werden, zeigen sie eine Erhöhung in apoE-Produktion, wie tatsächlich in dem AD-Hirn beobachtet. Die verschiedenen Isoformen von apoE sind aufgrund ihrer Rolle bei der Regulierung von Lipidwanderung und -metabolismus in der Lage, Isoform-abhängige Erhöhung in freier Fettsäurefreisetzung zu bewirken. Dies könnte als durch Auftreten auf einer Vielzahl an Wegen unter Zuhilfenahme von nur Elementen von vorher definierten metabolischen Pathways angenommen werden. Mit der apoE-abhängigen Stimulierung von freier Fettsäurefreisetzung kommt eine weitere Induktion von Amyloidzusammenfügung und die Feststellung einer positiven Zurückführschleife, die die weitere Entwicklung von Plaque beschleunigt. Zusätzlich würden lokale Erhöhungen an freien Fettsäuren die Zusammenfügung von Tau-Polymeren innerhalb von degenerierenden Neuriten, die mit der Plaque verbunden sind, induzieren. Bezüglich der Tau-Polymerisation in NFT- und neuropilen Fäden, sollte zuerst angemerkt werden, dass Tau-Proteine konstitutiv etwas der Grundlinienkonzentration der freien Fettsäuren ausgesetzt werden, als ein Ergebnis der normalen Aktivität von intrazellulären Lipasen. Neuronen könnten für die Zusammenfügung von Tau-Filamenten durch beliebige Anzahl an Bedingungen geprimed werden, die dazu beitragen, um diesen Grundlinienspiegel der Aussetzung zu erhöhen. Wenn intrazelluläre Anteile an freien Fettsäuren zu einem ausreichenden Grad durch NP-abgeleitete freie Fettsäuren ergänzt werden, welche in dem CSF zirkulieren, dann würde das Verfahren der Tau-Polymerisation innerhalb der Population von geprimten Neuronen gestartet werden.
Da Lipidmetabolismus im Hirn gegenwärtig schlecht verständlich ist, müssen die Mittel, durch die erhöhte Spiegel an apoE potenziell die freie Fettsäurefreisetzung modulieren könnten, zum großen Teil im Lichte der bekannten Regeln von diesem Protein im Serumlipidmetabolismus erörtert werden. Wie vorstehend erwähnt, ist apoE ein Aktivator von LCAT. Wenn die Geschwindigkeit der Cholesterinveresterung durch LCAT durch die Verfügbarkeit von unverestertem Cholesterin in dem CSF be grenzt ist, dann könnte eine erhöhte Aktivierung von LCAT die Desacylierungsaktivität des Enzym veranlassen, die Cholesterinveresterungsaktivität des Enzyms zu übersteigen, was eine extrazelluläre Freisetzung von freien Fettsäuren von apoE-verbundenen Lipiden ergibt. Alternativ könnte apoE intrazelluläre Freisetzung von freien Fettsäuren durch sein Vorliegen von Lipiden an Zellen modulieren. In dieser Hinsicht wurde ein Isoform-spezifisches Binden von apoE an Lipoproteine und den LDL-Rezeptor gezeigt. Ein weiterer apoE-Rezeptor, der Lipoproteinrezeptor mit sehr niederer Dichte, liegt bei erhöhten Spiegeln in dem AD-Hirn vor und wurde als ein Risikofaktor für AD in der japanischen Bevölkerung identifiziert: Eine zweifache Erhöhung bei dem Auftreten von AD wurde unter Individuen beobachtet, homozygot für ein spezifisches Allel von diesem Rezeptor waren.
In dem freien Fettsäurenmodell der Pathogenese ist das relevante Startereignis die Zusammenfügung von Amyloidfilamenten, die mit der Amyloidkaskadenhypothese übereinstimmen. Im Gegensatz zu dieser Hypothese jedoch, würden Risikofaktoren für AD nicht auf jene begrenzt sein, die die Geschwindigkeiten der Amyloidpolymerisation erhöhen, sondern würden auch Faktoren einschließen, die NP-Genese zu Mechanismen von freier Fettsäurefreisetzung verbinden. Das freie Fettsäuremodell impliziert auch, dass das Zielen von einem Neuron für NFT-Bildung von dem anschließenden Tod von dem Neuron abtrennbar ist und dass Tau-Polymerisation direkt zu neuronaler Fehlfunktion und den sich ergebenden klinischen Manifestationen der Krankheit beiträgt. Dies ist im Gegensatz zu der Ansicht, dass NFT nur "Grabsteine" von dem nekrotischen Verfahren sind. Da freie Fettsäuren, abgeleitet von Quellen, die von NP verschieden sind, auch potenziell Tau-Polymerisation induzieren können, könnte von NFT erwartet werden, dass sie in anderen pathologischen Zuständen auftreten, die durch intrazelluläre freie Fettsäurefreisetzung und die Abwesenheit von NP charakterisiert sind. In ähnlicher Weise könnte in der Abwesenheit von Risikofaktoren, die die Abscheidung von Amyloid an freier Fettsäurefreisetzung verbinden, die Zusammenfügung von Amyloidfilamenten ohne eine gleichzeitige Induktion von Tau-Pathologie auftreten. Wie angemerkt, sind Faktoren, die zu der anfänglichen Abscheidung von Amyloid und dem Primen von Neuronen für die NFT-Bildung beitragen, geeigneterweise zahlreich und von variiertem Ursprung, was die beträchtliche Variation in der relativen Anzahl an NFT und NP erlaubt, die in AD-Fallvergleichen aufgezählt werden.
Die Demonstration von freien Fettsäuren-stimuliertem Tau und Amyloidzusammenfügung liefert einen neuen Beweis, dass die Bildung von diesen strukturell gleichen Läsionen in AD durch ein übliches Effektormolekül vermittelt werden könnte. Die Relevanz von freien Fettsäuren für biologische Systeme führt zu einem geradlinigen Modell der Pathogenese, das wirksam identifizierte Risikofaktoren und viel von der beobachteten Pathologie einbezieht. Das freie Fettsäurenmodell der Pathogenese sagt voraus, dass CSF-Spiegel von freien Fettsäuren in AD erhöht sind und dass diese Spiegel zu der Gesamtplaquebeladung im Hirn proportional sein werden. Dieses Modell regt auch eine Erläuterung für das gleichzeitige Auftreten von dem extrazellulären Amyloid und den intrazellulären Tau-Polymeren an, die einzigartig in dem AD-Hirn beobachtet wird. Die Verwicklung von verschiedenen Enzymen mit Lipaseaktivität in AD-Pathogenese lässt potenzielle therapeutische Ziele für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit vermuten.
Hierin zitierte Literaturstellen schließen ein:

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Beliebige Patente oder Veröffentlichungen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, sind für die Niveaus der Fachleute hinweisend, die die Erfindung betrifft.
Der Fachmann wird leicht einschätzen, dass die vorliegende Erfindung gut angepasst ist, um die Ziele auszuführen und die Ergebnisse und erwähnten Vorteile zu erhalten, sowie jene, die darin inhärent sind. Die vorliegenden Beispiele, zusammen mit den Verfahren, Prozeduren, Behandlungen, Molekülen und spezifischen, hierin beschriebenen Verbindungen, sind gegenwärtig repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen, sind beispielhaft und sind nicht als Begrenzungen des Umfangs der Erfindung beabsichtigt.

Claims

Verfahren zum Screening für einen Arzneistoff, der bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit nützlich ist, umfassend die Schritte von: – Erhöhen der Polymerisation von Aß- oder tau-Peptiden in einem Medium durch In-Kontakt-Bringen des Mediums mit einer wirksamen Menge von mindestens einer unveresterten Fettsäure; und – Testen eines Arzneistoffs von Interesse, um zu bestimmen, ob der Arzneistoff die durch die unveresterte Fettsäure induzierte Polymerisation von Aß- oder tau-Peptiden hemmt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fettsäure aus der Gruppe, bestehend aus Arachidonsäure, Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Stearinsäure, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die unveresterte Fettsäure in einer Menge von etwa 1 Mikromolar bis etwa 100 Mikromolar gefunden wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medium aus der Gruppe, bestehend aus Zellkultur oder einem Reagenzglas, ausgewählt ist.
Verfahren zum Screening für einen Arzneistoff, der bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit nützlich ist, umfassend die Schritte von: – Erhöhen der Polymerisation von Aß- oder tau-Peptiden in einer Zellkultur durch In-Kontakt-Bringen der Zellkultur mit einer wirksamen Menge von Melittin, um Fettsäurefreisetzung und -abgabe zu induzieren; und – Testen eines Arzneistoffs von Interesse, um zu bestimmen, ob der Arzneistoff die durch das Melittin induzierte Polymerisation von Aß- oder tau-Peptiden hemmt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Melittin in einer Menge von etwa 0,1 Mikromolar bis etwa 1,0 Mikromolar gefunden wird.