WO2010119061A1 - Verfahren zur bestimmung der cbl-b expression - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der cbl-b expression Download PDF

Info

Publication number
WO2010119061A1
WO2010119061A1 PCT/EP2010/054886 EP2010054886W WO2010119061A1 WO 2010119061 A1 WO2010119061 A1 WO 2010119061A1 EP 2010054886 W EP2010054886 W EP 2010054886W WO 2010119061 A1 WO2010119061 A1 WO 2010119061A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cbl
cells
disease
antibody
protein
Prior art date
Application number
PCT/EP2010/054886
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans Loibner
Gottfried Baier
Günther LAMETSCHWANDTNER
Manfred Schuster
Thomas Gruber
Dominik Wolf
Original Assignee
Apeiron Biologics Ag
Medizinische Universität Innsbruck
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Apeiron Biologics Ag, Medizinische Universität Innsbruck filed Critical Apeiron Biologics Ag
Priority to CA2758624A priority Critical patent/CA2758624A1/en
Priority to EP10714250A priority patent/EP2419735A1/de
Priority to AU2010238500A priority patent/AU2010238500A1/en
Priority to US13/264,463 priority patent/US20120040864A1/en
Publication of WO2010119061A1 publication Critical patent/WO2010119061A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease

Definitions

  • the present invention relates to methods for the determination of intracellular proteins and biomarkers.
  • Cbl-b deficient mice are viable and their immune system is capable of efficiently recognizing autologous-induced tumors and building up a lytic immune response based primarily on CD8 + T cells (Loeser et al., JEM (2007) doi: 10.1084 / iem.20061699).
  • complete shutdown of the enzyme also led to an increased autoimmunity after immunization with superantigens.
  • Loeser at al. were able to demonstrate that Cbl-b is a negative regulator responsible for the "immunoreactivity" of T cells.
  • the determination of the intracellular Cbl-b protein in T cells of the patient is therefore a relevant biomarker for the status of the immune response to certain antigens.
  • This enzyme represents a crucial set point in the control of immunoreactivity (Chiang et al., J. Clin Invest (2007) doi: 10.1172 / JCI29472).
  • WO 2004/108896 A2 relates to gene expression profiling in uterine and ovarian cancer.
  • genes studied is the cbl-b gene.
  • WO 2008/021431 A2 relates to the monitoring of organ transplants and immune disorders, wherein the cbl-b gene has been monitored.
  • the present invention relates to a method for the determination of intracellular Cbl-b protein in cells of a sample comprising
  • the present invention therefore relates to the direct measurement of the intracellular content of Cbl-b in immune cells, for example, directly from the blood or other tissues (eg tumor tissue, organ biopsies, intestinal biopsies and lavage, joint fluid, cerebral spinal fluid, etc.) of patients can.
  • the cells of the patient can be contacted by an in vitro or ex vivo method with an antigen that is functionally related eg to a corresponding disease (eg a pathogen isolate for infectious diseases, tumor antigens in cancers, autoantigens in autoimmune diseases, alloantigen in Allotrans - plantates, allergens in allergies, etc.) in order to prevent the immunoreactive determine the cells against such stimulants.
  • a corresponding disease eg a pathogen isolate for infectious diseases, tumor antigens in cancers, autoantigens in autoimmune diseases, alloantigen in Allotrans - plantates, allergens in allergies, etc.
  • Cbl-b sequences are e.g. in the NCBI GenBank database under the Acc. Nos. DQ349203 (nucleic acid) and ABC86700 (protein).
  • Anti-Cbl-b antibodies are commercially available, but none have been reported to determine intracellular Cbl-b protein content.
  • the intracellular measurement of certain proteins by antibodies depends on various factors that are not comparable to batch methods, such as measurements in homogenates for Western blots.
  • an intracellular measurement requires that an antibody be introduced into a cell.
  • the cell is permeabilized, allowing certain molecules to enter the cell through artificially created pores. This penetration is not possible with any antibody sizes.
  • the antibodies should be kept as small as possible.
  • antibodies can be modified to attach a marker. Normally, fluorescent dyes are used as markers in the intracellular measurement. This may result in previous methods a problem with a lower detection limit and an increased signal / noise ratio.
  • proteins and possibly also nucleic acids of the cell are cross-linked by cross-linking reagents so that they form a stable network framework.
  • a cross-linking reagent is, for example, formaldehyde. Therefore, for an antibody to be capable of intracellularly determining Cbl-b, it must be able to recognize its cross-linked form in the cellular context.
  • proteins are not isolated or isolated to a small extent but form complexes with diverse binding partners. In particular, phosphoepitopes, which also occur on Cbl-b, are generally hidden by complexation with other proteins (Krutzik et al., Clin. Immun. - A -
  • Antibodies suitable for intracellular measurement should be able to recognize the protein in its three-dimensionally folded state. Since many antibodies which have been generated with the aid of peptides or short recombinant fragments of the antigen, can preferably recognize linear epitopes, this does not immediately make them suitable for intracellular applications. The intracellular fixation of the cells often complicates the recognizability of epitopes by antibodies additionally. The antibodies may recognize denatured Cbl-b, but only in the form of linear epitopes and no longer in the cellular context of the complete protein in permeabilized and fixed cells.
  • At least one antibody is suitable for determining the Cbl-b protein content in cells.
  • the detection of the binding events between the antibody and Cbl-b can be carried out in a conventional manner, for example by labeling the antibodies, whereby only those antibodies are detected which also bind Cbl-b proteins in the cells.
  • unbound antibodies may be removed by a washing step.
  • a corresponding label is, for example, a fluorescence label or else a radioactive label.
  • an enzymatic label should also be unsuitable for certain applications and cell permeabilization methods.
  • the detection per se can e.g. If necessary, signals can also be amplified by photomultipliers.
  • Suitable detection means comprise a light source suitable for fluorescence excitation of a selected fluorescence marker and an optical detector.
  • the cells may be detected in a measuring cell, such as a flow cell, in which the cells are made of e.g. be passed through a cell suspension.
  • Antibody according to the present invention relates to all antibody forms and functional antibody equivalents, in particular antibodies of IgA, IgD, IgE, IgG, IgM type including all subtypes such as IgGl or IgG2, as well as functional antigen-specific fragments such as Fab, F (ab) 2 , Fv etc .. Likewise artificial and artificially modified antibodies, such as single chain antibody fragments (scFv) are understood as “antibodies” of the present invention.
  • scFv single chain antibody fragments
  • the antibody may be monoclonal or polyclonal. It may be derived from any organism (including isolated cells thereof), in particular a mammal, in particular a primate or human, or a rodent such as a mouse, rat or hamster.
  • the antibodies are labeled, preferably fluorescently labeled.
  • the cells comprise leukocytes, preferably PBMCs (peripheral blood mononuclear cells).
  • the cells to be used according to the invention are leucocytes (T lymphocytes, B lymphocytes, NK cells or NKT cells, monocytes, macrophages and / or dendritic cells), in particular PBMCs, T lymphocytes, CD8 + T lymphocytes, CD4 + T Lymphocytes, especially ThI, Th2, Thl7, Tregs (regulatory T cells).
  • the differentiation of the different T-cell subpopulations may include surface markers, preferably CD4, CD8, CD25, CD69, CD70, CD27, CD39, CD54, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD73, CD95, CD107a, CD127, CD134, CDwl37, CD152, CD154, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, GITR, PD-I, A2AR, cytokines especially IL-2, IL-6, IL-7, IL-IO, IL-15, IL-17A, IL-17F, IL- 21, IL-22, IL-26, IL-27, interferon- ⁇ , lymphotxin- ⁇ , TNF- ⁇ , and other intracellular molecules, particularly Foxp3, GATA-3, RORc, T-bet.
  • surface markers preferably CD4, CD8, CD25, CD69, CD70, CD27, CD39, CD54, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD73, CD95, CD107
  • NK cells preferably due to the expression of CD1, CD3, CD16, CD69, CD95, CD107a, CD127, KIR and NKR molecules.
  • B-cell subpopulations preferably due to the expression of CD19, CD20, CD22, CD27, CD38, CD40, CD267, CD268, CD269, (membrane-bound) IgD.
  • the reactivity of leukocytes of individuals against certain antigens in different subfractions of immune cells can be determined.
  • the leukocytes are isolated from blood or tissue, and then contacted with relevant for the corresponding disease antigen. This can be done by direct addition to the unseparated leukocyte preparation (eg PBMCs).
  • the contacting with the antigen can also take place in vivo - for example in the course of a disease.
  • antigen presenting cells may be used for the presentation of the antigen, preferably dendritic cells, monocytes, macrophages or B cells. Lymphocytes, preferably T cells, may then be contacted with such antigen-loaded cells to achieve antigen-specific in vitro stimulation.
  • the T cells stimulated in this manner may then, after a certain period of time, preferably after 4, 8, 12, 16, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 hours for their Cbl-b Expression can be examined, and the Cbl-b expression can be correlated with the expression of the previously mentioned classes of molecules.
  • the cells are individually measured for detection of binding events, preferably with simultaneous classification or determination of the cell type.
  • a single measurement of the cells it is possible to isolate from a cell population those cells which have a particularly high or particularly low Cbl-b protein amount.
  • Cbl-b and low levels of Cblb in other cells only an average would be determined which would not allow for any specific immunological behavior.
  • the single measurement of cells it is possible simultaneously e.g. use different different markers, in particular different colored fluorescence markers that provide a second signal due to detected cell surface markers, which cell types can be distinguished, as already stated above.
  • the cells are measured at high throughput of at least 20, preferably at least 50, in particular at least 100, more preferably at least 200, cells per second.
  • High-throughput methods have the advantage that a large number of cells are measured per unit of time.
  • one or more further markers besides Cbl-b can additionally be measured simultaneously and a parallel assignment or sorting of the cells according to these parameters is made possible.
  • flow cytometry in which even up to 1,000 cells per second or more can be typed and measured according to the Cbl-b content, can be used.
  • Fluorescent dyes are preferably used for the detection of Cbl-b or other cellular markers ("multicolor" -based method) .
  • multicolor cellular markers
  • the additional measurement of other intracellular proteins makes it possible to normalize and balance the Cbl-b amount if next to the Cbl-b content further control values or control proteins are measured, which represent a constant reference value of the respective cells of interest and for the normalization or comparison of CbI-b values are suitable.
  • the quantification of Cbl-b on the one hand to distinguish the amount of Cbl-b in the individual cells or to detect those cells to quantify in the Cbl-b is detected (from a certain threshold).
  • the proportion of cells in which Cbl-b is detected and / or the amount of Cbl-b protein in the cells is quantified.
  • the cell is stimulated with an antigen prior to detection of the binding events, preferably also prior to introduction of the antibody, wherein preferably the cells comprise antigen-presenting cells.
  • the cells comprise antigen-presenting cells.
  • the extent of cell stimulation can be determined by the simultaneous measurement of additional markers, and thus a Cbl-b increase by cell stimulation can be differentiated from the Cbl-b increase by anergy.
  • the cells can also be treated with other immunomodulating substances, such as cytokines or ligands of immunomodulating receptors. Therefore, preferably during or prior to detection of the binding events, the cells are treated with immunostimulating substances, preferably cytokine (s) or ligands of immunomodulating receptors, in particular TLR (toll-like receptors) or antibodies to surface molecules, in particular CD3 and / or CD28.
  • immunomodulating substances preferably cytokine (s) or ligands of immunomodulating receptors, in particular TLR (toll-like receptors) or antibodies to surface molecules, in particular CD3 and / or CD28.
  • Cbl-b is a potentially phosphorylated or ubiquitinated protein.
  • selections of the detected Cbl-b may optionally be made. Therefore, in particularly preferred embodiments, the amount of post-translationally modified, preferably phosphorylated and / or ubiquitinated Cbl-b protein is determined.
  • the present invention relates to a method of diagnosing a disease or prognosis of the occurrence or course of a disease
  • the present invention describes for the first time a method for, for example, flow cytometric determination of the Cbl-b protein content in leukocytes and thus enables a detailed analysis of the immune status of the patient.
  • a method for, for example, flow cytometric determination of the Cbl-b protein content in leukocytes and thus enables a detailed analysis of the immune status of the patient.
  • the Cbl-b protein content in leukocytes of the patient they become isolated from patient tissue, preferably from peripheral blood, body fluids or tissue biopsies.
  • measurements of the Cbl-b protein content are 2, preferably 3 or more preferably 4 or more, made at different times. These data can be correlated with the Cbl-b protein content of the subject of comparison to detect significant deviations from a healthy state or characteristic of the course or occurrence of a particular disease.
  • These different times may be at least 4, 8, 12, 16, minimum 24, minimum 36, minimum 48, minimum 72, minimum 96, minimum 120, minimum 144, minimum 168, minimum 192, minimum 216, minimum 240 hours, of at least 2 days, preferably at least 1 week, more preferably at least 2 weeks or 1 month or more.
  • the subject is a sucker or a bird, preferably a primate, human, rodent, in particular a mouse, a rat, a hamster, a pet, in particular a pig, horse, cow, chicken, turkey, dog or cat.
  • the subject is a human.
  • these cells can be contacted with a particular antigen to detect a particular immunological response.
  • an antigen is selected which is related to the diseases, for example, which can trigger or influence the diseases.
  • antigens are for example allergens or immunogens of pathogens.
  • This also includes the use of the epitopes of the antigens.
  • cancer antigens or cancer epitopes can also be selected.
  • cell markers are used in the diagnosis and / or prognosis, in particular for distinguishing certain cell types and populations.
  • a specific cell type or a specific cell population is often decisive (or causative) and thus the relevant cell group can be specifically diagnosed or prognosticated. be spoken.
  • diseases which can be investigated according to the invention are all those associated with influencing an immunological response.
  • diseases in which a change in the immune response is the cause of the disease are particularly preferred.
  • "disease” should be regarded as a general health-damaging condition, which differs from a normal condition of a healthy person.
  • a particularly specific disease is a chronic infection.
  • the invention can be determined via Cbl-b as a biomarker, whether an immune response against a particular infection (eg contacting cells of the immune system with an antigen as described above) is sufficient to combat an infection or if there is a risk that an infection forms a chronic infection that can not be sufficiently or not successfully prevented by the immune system.
  • Cbl-b is a co-responsible immunomodulator that, when up-regulated, or at least not down-regulated, leads to inadequate control of tumors with certain tumor antigens by the immune system.
  • Cbl-b is a co-responsible immunomodulator that, when up-regulated, or at least not down-regulated, leads to inadequate control of tumors with certain tumor antigens by the immune system.
  • tumor disease Another important application for Cbl-b as a biomarker is tumor disease.
  • the proportion of regulatory and anergic cells in tumor tumor counts as a negative prognostic marker. Therefore, the determination of the protein content of Cbl-b in the tumor cells as well as circulating immune cells (especially in T cells and NK cells) is a relevant biomarker. Since some of the homing T cells also circulate through the blood, the determination of Cbl-b in immune cells of peripheral blood of patients can also be used as a biomarker.
  • the disease is an inflammatory or autoimmune disease.
  • Cbl-b as a biomarker autoimmune diseases (eg MS, colitis, psoriasis, arthritis, SLE) and inflammatory diseases (eg allergic asthma).
  • the origin of these immune diseases is causally related to the reaction against the body's own antigens or harmless foreign antigens.
  • Such an autoimmune reaction or allergic immune reaction against harmless foreign antigens is suppressed by regulatory T cells in the normal case and T cells, which also have a certain reactivity against endogenous antigens, therefore, are predominantly in an anergic state.
  • autoreactive T cells are activated and chronic inflammatory processes occur in affected tissues.
  • the disease comprises an immune response to allografts.
  • Cbl-b as a biomarker, it is possible to monitor transplant rejection in patients with allografts. Again, there is a need for biomarkers that can be determined without biopsy of the transplanted organ. Since the same molecular mechanisms as outlined above are relevant in the immune tolerance to the graft, Cbl-b expression in leukocytes is a suitable biomarker also for the immune status of patients with respect to the rejection of the transplanted organ.
  • the disease may include, in particular in specific embodiments, an immune response to allergens, exogenous antigens or endogenous antigens (autoreactivity). Allergies belong to the classic immune-modulated diseases, which can be significantly influenced, for example, by down-regulation of Cbl-b. This makes it possible to use Cbl-b as a marker for the diagnosis or prognosis, in particular the prognosis of the course of the disease.
  • Cbl-b as a biomarker is the determination of the general disposition of still healthy individuals to immunological reactivity. Because of this disposition the individual response affects both exogenous and endogenous antigens, their determination is relevant for predicting the response of healthy individuals to antigens introduced by vaccination, infection or other contact into the organism, as well as for the predisposition to immunological autoreactivity. Therefore, in a further aspect, the present invention relates to a method for determining the immunoreactivity of cells of a subject, especially leukocytes, against an antigen
  • Cbl-b expression can be used as a biomarker for the immunological disposition of individuals for reactivity to allergens, exogenous antigens or endogenous antigens (autoreactivity).
  • T cell activation leads to an increase in the amount of Cbl-b mRNA and protein. This means that it is not a foregone conclusion whether changes in the total amount of Cbl-b in peripheral blood leukocytes are due to full functional T cell activation as such or, on the contrary, to an anergic phenotype, thus being beneficial in addition thereto distinguish whether the cells are those which require an immune reaction by their activation (T H , T c ) or throttling (T reg ). Also, in peripheral blood, not only T cells contain Cbl-b protein but, as is known, almost all subtypes of leukocytes.
  • the comparison values by a significantly different Cbl-b Quantities can be determined from samples of other subjects, preferably wherein the antigen with which the cells are contacted is identical to the reference antigen to normalize the general reactivity of the antigen with cells. Some antigens are more likely to bind and activate cells more and others tend to be weaker.
  • the antigens are preferably allergens, exogenous antigens or endogenous antigens of the subject.
  • the above-mentioned parameters or selection of the cells (or co-determination of special cell classifier markers) are preferably carried out.
  • an antibody capable of binding intracellular Cbl-b in particular, which binds an epitope of Cbl-b in the intracellular environment, particularly after fixation, in particular cross-linking in the cellular context.
  • Such an antibody is also a subject of the invention, particularly for use in the intracellular determination of Cbl-b. Therefore, the present invention provides a further aspect the use of an antibody which intracellular Cbl-b binds to the intacellular determination of Cbl-b.
  • Included herein are antibody derivatives or fragments as already described herein. The antibody is preferably directed against (or specific to) the C-terminus of Cbl-b.
  • the antibody binds an epitope in the region of the C-terminal 300, preferably 250 or 200, preferably 180, especially preferably 170, particularly preferably 150 or 149, amino acids of Cbl-b.
  • the antibody is specific or directed against the amino acids from 833 to the C-terminus, preferably amino acids 833 to 964 of Cbl-b (or binds an epitope in this region), wherein the numbering of the amino acids corresponds to human Cbl-b.
  • the antibody can be generated, for example, by immunization with a fragment comprising amino acids 833-964 from Cbl-b.
  • the antibody may be from any organism, especially mammals and rodents as discussed above.
  • an antibody which can be used according to the invention is the antibody Abcam Ab54362 (commercially available from Abcam, www.abcam.com/CBLB-antibody- 246C5a-ab54362.html), a mouse monoclonal antibody raised against a recombinant C-terminal fragment (aa833-964) of human Cbl-b.
  • Abcam Ab54362 commercially available from Abcam, www.abcam.com/CBLB-antibody- 246C5a-ab54362.html
  • a mouse monoclonal antibody raised against a recombinant C-terminal fragment aa833-964
  • the antibody is used to determine a disease as described herein.
  • the invention relates to a kit comprising this antibody, preferably labeled, in particular fluorescently labeled, and cell fixatives and / or cell permeabilizers, preferably selected from formaldehyde, methanol, ethanol, acetone, Triton X-100 (octoxynol-9) and sapo - Nin, preferably additionally one or more antibodies against a surface receptor of lymphocytes, in particular T cells or NK cells, preferably selected from CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD45RA, CD45RO, CD69, or CD4, CD8, CD25 , CD69, CD70, CD27, CD39, CD62L, CD45R, CD95RO, CD62L, CD73, CD95, CD107a, CD127, CD134, CDwl37, CD152, CD154, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, GITR, PD-I, A2AR Cytokines, particularly IL-2, IL-6, and cell fixatives and
  • FIG. 1 shows that in human T cells the Cbl-b protein content through the anergy-mediating sole stimulation of the T cell receptor is substantially higher than that of optimally stimulated (anti-CD3 and anti-CD28) T cells and high Cbl-b expression can thus be used as a marker for anergic T cells.
  • FIG. 3 shows the correlation of the expression determination of Cbl-b by RT-PCR (A), Western blot (B) and icFACS (C) of human T cells and thus the validation of the Cbl-b specificity of icFACS staining of Cbl- b by specific silencing of Cbl-b expression by Cbl-b directed siRNA.
  • FIG. 4 shows the simultaneous FACS determination of the Cbl-b protein content of human immune cells from peripheral blood (PBMCs) and the expression of two further immune cell markers (CD45RA and CD3).
  • FIG. 5 shows the FACS determination of Cbl-b expression together with CD45RA in NK cells.
  • Fig. 6 shows that patients suffering from an autoimmune disease have a reduced Cbl-b content in their T cells, which can not be significantly induced even by normally anergy-inducing antigenic contact.
  • A Comparison of the proportion of low Cbl-b cells in lymphocytes of SLE patients and healthy controls;
  • B Cbl-b content in CD3 + cells of SLE patients and healthy controls;
  • C anergic Cbl-b stimulation of SLE patients and healthy controls by an allergen.
  • Example 1 Anergic T cells have a particularly high content of intracellular Cbl-b protein.
  • PBMCs from healthy volunteer donors were prepared using the standard density gradient centrifugation protocol (Ficoll) and the CD8 T cells were isolated by MACS (Miltenyi, protocol following the manufacturer's recommendations). The T cells were then stimulated with anti-CD3 or anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, harvested after 24 h, and the amount of Cbl-b protein was determined by Western blot using anti-Cbl-b antibodies. It was found that a particularly high Cbl-b protein content by the anergy-mediating sole Stimulation of the T cell receptor is achieved.
  • Example 2 Determination of the intracellular content of CbI-b in primary murine splenocytes by flow cytometry
  • the cells were stained according to the following protocol: One million cells were washed once with 200 ⁇ l of FACS buffer (PBS + 2% FCS) and then fixed and permeabilized by incubation for 20 minutes in 250 ⁇ l of Cytofix / Cytoperm solution (manufacturer: Becton Dickinson). Thereafter, the cells were washed once with 200 ⁇ l of Perm / Wash Buffer from the same manufacturer and incubated with antibody (diluted in perm / wash buffer to an antibody concentration of 2 ⁇ g / ml) to room temperature for 30 minutes.
  • FACS buffer PBS + 2% FCS
  • Cytofix / Cytoperm solution manufactured by Becton Dickinson
  • the cells were then washed twice in 200 ⁇ l of perm / wash buffer and incubated with a fluorescence-labeled second darantikorper (anti mouse IgG-PE, manufacturer: Southern Biotech) for a further 30 minutes incubated. Finally, cells were washed once each with wash / perm buffer and FACS buffer and resuspended in 250 ⁇ l FACS buffer for FACS analysis.
  • the fluorescent dye of the secondary antibody is freely selectable in this protocol, all possible multicolor tints can also be carried out with other markers in order to detect Cbl-b expression specifically in specific subpopulations of cells.
  • Example 3 Validation of the intracellular Cbl-b staining protocol by the Cbl-b determination of preceding inhibition of Cbl-b expression by cblb-specific siRNA
  • the human T cells were treated according to the following protocol:
  • Example 4 The combination of Cbl-b detection with other immune cell markers allows the simultaneous determination of the Cbl-b protein content in a wide variety of disease-relevant immune cells.
  • PBMCs from healthy volunteer donors were prepared using the standard protocol for density gradient centrifugation (Ficoll) and stained with Cbl-b antibody and secondary detection antibody as described above.
  • the cells were stained with antibodies directed against CD54RA and CD3 (directly labeled CD45RA-FITC and CD3-PE-Cy7 antibodies, manufacturer Invitrogen).
  • Results of the FACS determination are shown in FIG.
  • SSC lateral
  • FSC forward
  • individual cell types - if specified - can be specifically determined. It shows that the Cbl-b content in the T-cell fraction of healthy persons is comparatively uniform (FIG. 4A, morphology gate, SSC and FSC adjustment on lymphocytes), regardless of whether they are naive (FIG. CD45RA +) or Memory T cells (CD45RA-)
  • FIG. 4C shows that relevant amounts of Cbl-b are also expressed in these cells.
  • Figure 4D shows that myeloid cells (morphology gate in SSC vs. FSC on monocytes / macrophages) also express relevant levels of Cbl-b protein, although preferably CD14-positive monocytes express Cbl-b protein compared to CD14- negative myeolid cells (mainly macrophages).
  • Example 5 Expression of CbI-b in NK cells.
  • Fig. 5 shows results of NK cells isolated from PBMCs by MACS (NK Cell Isolation Kit, Invitrogen) and stained as in Example 4 for co-determination of Cbl-b and CD45RA. It shows that all classical NK cells (CD45RA-positive) express Cbl-b.
  • CD45RA-negative cells The low proportion of CD45RA-negative cells in this preparation can be described in the literature as so-called “killer dendritic cells", which have properties of NK cells and dendritic cells (see, for example, Bonmort et al., Current Opinion in Immunology 2008, 20 : 558-565), as their cell morphology identifies them as somewhat larger than classical lymphocytes, and is also described by CD45RA-negative subsets (Bangert et al., J.
  • Example 5 thus shows that the definition of distinct cellular subpopulations by the determination of their cbl-b expression allows an improved functional characterization of the state of activity of the immune system in the context of a tumor disease.
  • Example 6 Patients suffering from uterine autoimmune disease due to pathologically increased immunoreactivity have a reduced Cbl-b content in T cells.
  • a reduced Cbl-b protein content in immune cells leads to an increased activation of the immune system. While this is desirable in the situation of a tumor disease, pathologically increased immunity to endogenous antigens is pathologically relevant in the context of autoimmune diseases. Therefore, the Cbl-b protein content of immune cells in patients with active systemic lupus erythematosus (SLE) was investigated. PBMCs from SLE patients or from healthy controls were prepared and stained with Cbl-b, CD45RA and CD3 antibodies as described in Example 4 and analyzed by flow cytometry. This allows the identification of different cell populations for their Cbl-b protein content.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • PBMCs of a SLE patient or a healthy comparator were therefore contacted with a harmless plant antigen (phytohemagglutinin) from the common bean (Phaseolus vulgaris).
  • the antigen may, in higher concentrations, result in activation of T cells, which usually results in an anergic reaction of the contacting T cells in the absence of other T cell-specific stimuli.
  • T cells from a healthy control responded with a marked increase in Cbl-b protein content (Figure 7C) characteristic of anergic T cells (incubation of 2 million PBMCs in ImI Xvivo medium with 2 ⁇ l phytohemaglutinin suspension ( Figure 7C). Invitrogen-GIBCO for 48 h.)
  • T-cells of an SLE patient, who already had an already reduced Cbl-b protein content no longer reacted with an increase in Cbl-b protein content.
  • Example 7 therefore illustrates that the subject method for determining the Cbl-b protein content in immune cells is particularly suitable in complex immune cell mixtures with different compositions and also allows predictive statements on the response of immune cells of patients in the context of their Cbl-b content to different stimuli.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung von intrazellulärem Cbl-b-Protein in Zellen einer Probe umfassend • Einbringen eines Antikörpers, welcher Cbl-b intrazellulär bindet, in eine Zelle, • Kontaktieren lassen des Antikörpers und potentiell vorhandenem Cbl-b-Protein in der Zelle, • Detektieren von Bindungsereignissen zwischen dem Antikörper und Cbl-b, • Quantifizieren der detektierten Bindungsereignisse, wodurch der Gehalt an Cbl-b-Protein bestimmt wird.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Cbl-b Expression
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Proteine und Biomarker.
Der Verlauf einer Reihe von lebensbedrohlichen Erkrankungen hängt wesentlich von der Reaktion des patienteneigenen Immunsystems ab. Dies ist klarerweise bei Infektionskrankheiten der Fall, und von besonderer Bedeutung bei chronischen Infektionskrankheiten, bei denen es zu einer dauerhaften Etablierung des Erregers im Körper des Patienten kommen kann. Einer der dafür verantwortlichen Mechanismen liegt in der Entstehung von sogenannten regulatorischen T-Zellen, die in weiterer Folge die Immunantwort von Effektorzellen gegen den Erreger unterdrücken. Diese Suppression von Effektor T-Zellen erfolgt unter anderem durch von regulatorischen T-Zellen generiertes Adenosin, welches T-Zellen in einen anergischen Zustand versetzen kann. In einem solchen anergischen Zustand befindliche T-Zellen haben einen erhöhten intrazellulären Gehalt der E3-Ubiquitinligase Cbl-b.
In Abwesenheit von Cbl-b können verabreichte aber kaum immu- nogene Substanzen zur Induktion einer starken Immunantwort führen. Ferner sind Cbl-b defiziente Mäuse (homozygotischer Gen knock-out) lebensfähig und deren Immunsystem ist in der Lage effizient autolog-induzierte Tumore zu erkennen und dagegen eine vor allem auf CD8+ T Zellen-beruhende lytische Immunantwort aufzubauen (Loeser et al . , JEM (2007) doi : 10.1084/iem.20061699) . Allerdings führte die beschriebene, gänzliche Abschaltung des Enzyms ebenfalls zu einer erhöhten Autoimmunität nach Immunisierung mit Superantigenen. Loeser at al . konnten aufzeigen, dass Cbl-b als negativer Regulator maßgeblich für die „Immunreaktivität" von T-Zellen verantwortlich ist.
Die Bestimmung des intrazellulären Cbl-b Proteins in T-Zellen des Patienten ist daher ein relevanter Biomarker für den Status der Immunantwort gegen bestimmte Antigene. Dieses Enzym stellt einen entscheidenden Weichenstellpunkt in der Steuerung der Immunreaktivität dar (Chiang et al . , J Clin Invest (2007) doi:10.1172/JCI29472) .
Zhou et al. (Neurosci. Lett. (2008), doi: 10.1016/ j.neu- let .2008.05.089) zeigen einen Zusammenhang der Cbl-b Menge, gemessen mittels Western-Blot von Zellhomogenisaten, und Multipler Sklerose. Der Nachteil dieser Methode liegt darin, dass die Aus- wertung von Zellhomogenisaten diverser Zellen keine einfache Unterscheidung aktivierter und inaktiver Immunzellen zulasst.
Leng et al . (Int. Immunol. (2006) 18(5) : 637-44) beschreiben eine Untersuchung von TGF-beta, Cbl-b und CTLA-4 Werten bei verschiedenen Stadien der Immunaktivierung. Cbl-b wurde durch Anti- korper in Zell-Lysaten durch Western-Blotting nachgewiesen.
Babu et al . (J. Immunol. (2006) 176(5) : 3248-56) beschreiben Cbl-b-induzierte Anergie in Immunzellen. Cbl-b Assays beruhten auf quantitativer RT-PCR.
WO 2004/108896 A2 betrifft Genexpressionsprofiling bei Gebarmutter- und Eierstockkrebs. Unter den untersuchten Genen befindet sich auch das cbl-b Gen.
WO 2008/021431 A2 betrifft die Überwachung von Organtransplantationen und Immunstorungen, wobei das cbl-b Gen überwacht wurde .
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung klinisch relevante Cbl-b Mengen in Zellen bestimmen zu können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von intrazellularem Cbl-b-Protein in Zellen einer Probe umfassend
• Einbringen eines Antikörpers, welcher Cbl-b intrazellular bindet, in eine Zelle,
• Kontaktieren lassen des Antikörpers und potentiell vorhandenem Cbl-b-Protein in der Zelle,
• Detektieren von Bindungsereignissen zwischen dem Antikörper und Cbl-b, und gegebenenfalls
• Quantifizieren der detektierten Bindungsereignisse, wodurch der Gehalt an Cbl-b-Protein bestimmt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die direkte Messung des intrazellularen Gehalts von Cbl-b in Immunzellen, die z.B. direkt aus dem Blut oder anderen Geweben (z.B. Tumorgewebe, Organbiopsien, Darmbiopsien sowie Lavage, Gelenksflussigkeit, Ce- rebrospinalflussigkeit , etc.) von Patienten gewonnen werden können. Zur weiteren Analyse können die Zellen des Patienten dabei durch in vitro oder ex vivo Verfahren mit einem Antigen kontaktiert wurden, das z.B. mit einer entsprechenden Erkrankung in funktionellem Zusammenhang steht (z.B. ein Erregerisolat für Infektionskrankheiten, Tumorantigene bei Krebserkrankungen, Autoantigene bei Autoimmunkrankheiten, Alloantigen bei Allotrans- plantaten, Allergene bei Allergien, etc.) um die Immunreaktivi- tät der Zellen gegenüber solchen Stimulantien festzustellen.
Die Genprodukte des Cbl-b Gens sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben (UniGene Id. Hs.3144 und Hs.381921) . Cbl-b Sequenzen sind z.B. in der NCBI GenBank Datenbank unter den Acc. Nr. DQ349203 (Nukleinsäure) und ABC86700 (Protein) veröffentlicht. Anti-Cbl-b Antikörper sind kommerziell erhältlich, allerdings sind keine davon zur Bestimmung von intrazellulärem Cbl-b Proteingehalt bisher ausgewiesen worden.
Die intrazelluläre Messung von bestimmten Proteinen durch Antikörper hängt von diversen Faktoren ab die nicht mit Batch Methoden, wie beispielsweise die Messungen in Homogenisaten für Western-Blots, vergleichbar sind. Zum einen muss bei der intrazellulären Messung ein Antikörper in eine Zelle eingebracht werden. Dafür wird die Zelle permeabilisiert, wodurch bestimmte Moleküle in die Zelle durch künstlich geschaffene Poren eindringen können. Dieses Eindringen ist nicht bei beliebigen Antikörpergrößen möglich. Die Antikörper sollten möglichst klein gehalten werden. Zur intrazellulären Messung können Antikörper modifiziert werden um einen Marker anzubringen. Normalerweise wird auf Fluoreszenz-Farbstoffe als Marker bei der intrazellulären Messung zurückgegriffen. Dadurch kann sich bei bisherigen Verfahren ein Problem mit einer geringeren Nachweisgrenze und einem erhöhten Signal/Rauschverhältnis ergeben.
Ein weiterer Faktor der bei der intrazellulären Messung berücksichtigt werden muss, ist dass die Zellkomponenten bei der Permeabilisation nicht aus der Zelle heraus diffundieren sollen. Daher werden die Zellen fixiert. Darunter versteht man die Fixierung zumindest der für die Messung relevanten Zellbestandteile (Proteine, Ionen und kleine Moleküle können ausdiffundieren) . Hierzu werde Proteine und gegebenenfalls auch Nukleinsäuren der Zelle durch Quervernetzungsreagenzien quervernetzt, damit diese ein stabiles Netzwerkgerüst bilden. Ein solches Quervernetzungs- reagens ist beispielsweise Formaldehyd. Damit ein Antikörper zur intrazellulären Bestimmung von Cbl-b geeignet ist muss er daher vorzugsweise dessen quervernetzte Form im zellulären Kontext erkennen können. In einer Zelle sind Proteine nicht bzw. nur zu einem geringen Anteil isoliert vorhanden sondern bilden Komplexe mit diversen Bindungspartnern. Insbesondere Phosphoepitope, welche auch auf Cbl-b vorkommen, sind generell durch Komplexierung mit anderen Proteinen verborgen (Krutzik et al . , Clin. Immun. - A -
1 1 0 ( 2 0 04 ) : 2 0 6 - 22 1 ) .
Zur intrazellularen Messung geeignete Antikörper sollten in der Lage sein, das Protein in seinem dreidimensional gefalteten Zustand zu erkennen. Da viele Antikörper, die mit Hilfe von Peptiden oder kurzen rekombinanten Fragmenten des Antigens generiert wurden, bevorzugt lineare Epitope erkennen können ergibt sich daraus nicht unmittelbar eine Eignung für intrazellulare Anwendungen. Die intrazellulare Fixierung der Zellen erschwert die Erkennbarkeit von Epitopen durch Antikörper häufig zusatzlich. Eventuell können die Antikörper zwar denaturiertes Cbl-b erkennen, allerdings nur in Form von linearen Epitopen und nicht mehr im zellularen Kontext des vollständigen Proteins in permea- bilisierten und fixierten Zellen.
Überraschenderweise konnte erfindungsgemaß gezeigt werden, dass zumindest ein Antikörper auch noch nach Zellfixierung dazu geeignet ist, den Cbl-b Proteingehalt in Zellen zu bestimmen.
Die Detektion der Bindungsereignisse zwischen dem Antikörper und Cbl-b kann auf herkömmliche Art und Weise erfolgen, wie beispielsweise durch Markierung der Antikörper wobei nur jene Anti- korper detektiert werden die auch Cbl-b-Proteine in den Zellen binden. Eventuell können hierzu ungebundene Antikörper durch einen Waschschritt entfernt werden. Eine entsprechende Markierung ist beispielsweise eine Fluoreszenz-Markierung oder auch eine radioaktive Markierung. Technisch nicht ausgeschlossen soll auch eine enzymatische Markierung sein, die jedoch für bestimmte Anwendungen und Zellpermeabilisationsmethoden ungeeignet sein konnte .
Die Detektion an sich kann z.B. durch geeignete Detektoren erfolgen, wobei Signale gegebenenfalls auch durch Photomulti- plier verstärkt werden können. Geeignete Detektionsmittel umfassen eine Lichtquelle geeignet zur Fluoreszenz-Anregung eines ausgewählten Fluoreszenz-Markers und einen optischen Detektor. Die Detektion der Zellen kann gegebenenfalls in einer Messzelle wie beispielsweise einer Durchflusszelle erfolgen, in der die Zellen aus z.B. einer Zellsuspension durchgeleitet werden.
"Antikörper" nach der vorliegenden Erfindung betrifft samtliche Antikorperformen und funktionelle Antikorperaquivalente, insbesondere Antikörper vom IgA, IgD, IgE, IgG, IgM Typ inklusive aller Subtypen wie z.B. IgGl oder IgG2, sowie funktionelle Antigen-spezifische Fragmente wie Fab, F(ab)2, Fv etc.. Ebenso werden künstliche und künstlich modifizierte Antikörper, wie z.B. single chain Antikörper-Fragmente (scFv) als "Antikörper" der vorliegenden Erfindung verstanden.
Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Er kann von einem beliebigen Organismus (inklusive isolierten Zellen desselben) stammen, insbesondere einem Säuger, im speziellen einem Primaten oder Menschen, oder einem Nager wie einer Maus, Ratte oder Hamster.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Antikörper markiert, vorzugsweise Fluoreszenz-markiert.
In den weiteren Ausführungsformen umfassen die Zellen Leukozyten, vorzugsweise PBMCs (mononukleare Zellen des peripheren Blutes) . In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß einzusetzenden Zellen Leukozyten, (T-Lymphozyten, B-Lympho- zyten, NK Zellen oder NKT Zellen, Monozyten, Makrophagen und/oder dendritische Zellen) insbesondere PBMCs, T-Lymphozyten, CD8+ T-Lymphozyten, CD4+ T-Lymphozyten, insbesondere ThI, Th2, Thl7, Tregs (regulatorische T-Zellen) . Die Unterscheidung der verschiedenen T-ZeIl Subpopulationen kann Oberflächenmarker, vorzugsweise CD4, CD8, CD25, CD69, CD70, CD27, CD39, CD54, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD73, CD95, CD107a, CD127, CD134, CDwl37, CD152, CD154, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, GITR, PD-I, A2AR, Zytokine insbesondere IL-2, IL-6, IL-7, IL-IO, IL-15, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL-27, Interferon-γ, Lymphotxin-α, TNF-α, und weitere intrazelluläre Moleküle, insbesondere Foxp3, GATA-3, RORc, T-bet umfassen. Ebenso ist die Unterscheidung von verschiedenen Subpopulationen von NK-zellen, vorzugsweise aufgrund der Expression von CDl, CD3, CD16, CD69, CD95, CD107a, CD127, KIR- und NKR-molekülen möglich. Weiters ist die Unterscheidung von verschiedenen B-Zell-Subpopulationen möglich, vorzugsweise aufgrund der Expression von CD19, CD20, CD22, CD27, CD38, CD40, CD267, CD268, CD269, (Membran gebundenes) IgD.
Zusätzlich kann die Reaktivität von Leukozyten von Individuen gegen bestimmte Antigene in verschiedenen Subfraktionen von Immunzellen bestimmt werden. Dazu werden die Leukozyten aus Blut oder Gewebe isoliert, und dann mit für die entsprechende Krankheit relevantem Antigen kontaktiert. Dies kann durch direkte Zugabe zur unseparierten Leukozytenpräparation (z.B. PBMCs) geschehen. Ebenso kann die Kontaktierung mit dem Antigen auch in vivo erfolgen - z.B. im Verlauf einer Erkrankung. Alternativ können für die Präsentation des Antigens antigen-präsentierende Zellen verwendet werden, vorzugsweise dendritische Zellen, Monozyten, Makrophagen oder B-Zellen. Mit derart Antigen-beladenen Zellen können dann Lymphozyten, vorzugsweise T-Zellen, in Kontakt gebracht werden, um eine antigen-spezifische in vitro Stimulation zu erreichen. Die solcherart stimulierten T-Zellen können dann nach einer bestimmten Zeitspanne, vorzugsweise nach 4, 8, 12, 16, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 Stunden auf ihre Cbl-b Expression untersucht werden, und die Cbl-b Expression kann mit der Expression der vorhin angeführten Molekülklassen korreliert werden.
Vorzugsweise werden die Zellen einzeln zur Detektion der Bindungsereignisse gemessen, vorzugsweise bei gleichzeitiger Klassifizierung oder Bestimmung des Zelltyps. Durch eine Einzelvermessung der Zellen ist es möglich aus einer Zellpopulation jene Zellen zu isolieren, die eine besonders hohe oder besonders niedrige Cbl-b Proteinmenge aufweisen. Bei bisherigen Methoden bei denen z.B. gesamte Zellfraktionen aufgeschlossen wurden besteht immer die Gefahr, dass lediglich ein Mittelwert bestimmt wird und besonders aktivierte bzw. inaktivierte Zellen nicht mehr anhand ihres Cbl-b Gehalts erkannt werden. Beim Vorkommen von gleichzeitig besonderen hohen Cbl-b-Mengen und niederen CbI- b-Mengen in anderen Zellen würde nur ein Mittelwert bestimmt werden, der auf kein besonderes immunologisches Verhalten Rückschlüsse zulassen würde. Bei der Einzelvermessung von Zellen ist es möglich gleichzeitig z.B. andere unterschiedliche Marker, insbesondere andersfarbige Fluoreszenz-Marker einzusetzen, die ein zweites Signal aufgrund festgestellter Zelloberflächenmarker liefern, womit Zelltypen unterschieden werden können, wie oben bereits ausgeführt wurde.
In speziellen Fällen werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen mit hohem Durchsatz von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 50, insbesondere mindestens 100, spezielle bevorzugt mindestens 200, Zellen pro Sekunde gemessen. Verfahren mit hohem Durchsatz (high throughput-Verfahren) haben den Vorteil, dass eine große Anzahl an Zellen pro Zeiteinheit vermessen werden. Dabei ist es insbesondere auch vom Vorteil, wenn eine oder mehrere weitere Marker neben Cbl-b zusätzlich gleichzeitig vermessen werden kann und eine parallele Zuordnung bzw. Sortierung der Zellen nach diesen Parametern ermöglicht wird. Ein sol- ches Verfahren ist beispielsweise die Durchflusszytometrie, bei der sogar bis zu 1.000 Zellen pro Sekunde oder mehr typisiert und nach dem Cbl-b Gehalt vermessen werden können. Vorzugsweise werden Fluoreszenz-Farbstoffe zur Detektion von Cbl-b bzw. weiterer zellulärer Marker verwendet („multicolor"-basiertes Verfahren) . Durch die zusätzliche Messung von anderen intrazellulären Proteine ist es zusätzlich auch möglich die Cbl-b Menge zu Normalisieren und Abzugleichen wenn neben dem Cbl-b Gehalt weitere Kontrollwerte bzw. Kontrollproteine gemessen werden, welche einen konstanten Referenzwert der jeweiligen Zellen von Interesse darstellen und zur Normalisierung bzw. zum Vergleich der CbI- b Werte geeignet sind.
Die in der Literatur verwendeten Bestimmungsmethoden (Wes- tern-Blot) unterscheiden nicht zwischen den verschiedenen Fraktionen von Zellen oder Zelltypen. Eine solche Unterscheidung wäre nur möglich, wenn der intrazelluläre Gehalt von Cbl-b in den entsprechenden Subfraktionen von Zellen detailliert aufgeschlüsselt werden könnte. Eine solche Analyse ist prinzipiell möglich mittels multicolorbasierter durchflusszytometrischer Verfahren. Allerdings gelang es bislang noch nicht, ein solches für klinische Anwendungen geeignetes Verfahren zu etablieren. Dies wurde erstmals mit der vorliegenden Erfindung, durch Zurverfügungstellung eines praxistauglichen Verfahrens zur Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in verschiedenen Subfraktionen von Zellen der Immunsystems, insbesondere von T-Zellen, ermöglicht.
Erfindungsgemäß ist es zudem möglich bei der Quantifizierung von Cbl-b einerseits die Cbl-b-Menge in den einzelnen Zellen zu unterscheiden oder auch jene Zellen zu Quantifizieren in den Cbl-b detektiert wird (ab einen bestimmten Schwellenwert) . In einer Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher der Anteil der Zellen, in welchen Cbl-b detektiert wird, und/oder die Menge an Cbl-b-Protein in den Zellen quantifiziert.
Es ist zudem möglich anhand der Bestimmung des Gehalts an Cbl-b-Protein in den Zellen die Immunreaktivität der Zellen zu bestimmten immunologischen Ereignissen, wie beispielsweise die Exposition zu einem Antigen, zu beurteilen. Daher wird in einer weiteren Ausführungsform die Zelle vor der Detektion der Bindungsereignisse, vorzugsweise auch vor dem Einbringen des Antikörpers, mit einem Antigen stimuliert, wobei vorzugsweise die Zellen Antigen-präsentierende Zellen umfassen. Werden nun die Zellen durch Kontakt mit dem Antigen stimuliert führt dies in weiterer Folge zu einem wesentlich erhöhten Gehalt des Cbl-b- Proteins sofern eine Anergie einsetzt, im Gegensatz zu einer optimalen Stimulation der Zellen. Zusätzlich kann das Ausmaß der Zellstimulation durch die gleichzeitige Messung weiterer Marker bestimmt werden, und damit eine Cbl-b Erhöhung durch Zellstimulation von der Cbl-b Erhöhung durch Anergie differenziert werden .
Analog zu Antigenen können die Zellen auch mit weiteren immunmodulierenden Substanzen behandelt werden, wie beispielsweise Cytokine oder Liganden von immunmodulierenden Rezeptoren. Daher werden vorzugsweise die Zellen während oder vor Detektion der Bindungsereignisse mit immunstimulierenden Substanzen, vorzugsweise Cytokin(e) oder Liganden immunmodulierender Rezeptoren, insbesondere TLR (toll-like receptors) , oder Antikörper gegen Oberflächenmoleküle, insbesondere CD3 und/oder CD28, behandelt.
Cbl-b ist ein potentiell phosphoryliertes oder ubiquitinier- tes Protein. Durch die Auswahl geeigneter Antikörper oder auch Unterbindung von der Detektion von Bindungsereignissen mit Cbl-b ohne Phosphat- oder Ubiquitin-Rest können gegebenenfalls Selektionen des detektieren Cbl-b vorgenommen werden. Daher wird in speziell bevorzugten Ausführungsformen die Menge von posttrans- lational modifiziertem, vorzugsweise phosphoryliertem und/oder ubiquitiniertem Cbl-b-Protein, bestimmt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder Prognose des Auftretens oder des Verlaufs einer Krankheit umfassend
• bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts in Zellen einer Probe eines Subjekts wie hierin beschrieben, vorzugsweise an mindestens 2 verschiedenen Tagen,
• Vergleichen des Cbl-b-Proteingehalts von Zellen erkrankter oder gesunder Vergleichssubjekte,
• Feststellen eines Unterschieds zwischen dem Cbl-b-Proteingehalts des Subjekts und der Vergleichssubjekte, wodurch eine Krankheit bzw. die Prognose festgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmals ein Verfahren zur z.B. durchflusszytometrischen Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in Leukozyten und ermöglicht damit eine detaillierte Analyse des Immunstatus des Patienten. Für die Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in Leukozyten des Patienten werden diese aus Patientengewebe isoliert, vorzugsweise aus dem peripheren Blut, Korperflussigkeiten oder Gewebebiopsien .
Um den Verlauf einer Krankheit zu verfolgen bzw. um eine Prognose des Auftretens einer Krankheiten vorzunehmen im Hinblick auf die Änderung des intrazellularen Gehalts an Cbl-b werden vorzugsweise Messungen des Cbl-b-Proteingehalts an 2, vorzugsweise 3, insbesondere bevorzugt 4 oder mehr, verschiedenen Zeitpunkten vorgenommen. Diese Daten können mit den Cbl-b-Prote- ingehalt der Vergleichssubjekte korreliert werden um signifikante Abweichungen zu einem gesunden Zustand bzw. charakteristisch für den Verlauf oder für das Auftreten einer bestimmten Krankheiten zu erkennen. Diese unterschiedlichen Zeitpunkte können im Abstand von mindestens 4, mindestens 8, mindestens 12, mindestens 16, mindestens 24, mindestens 36, mindestens 48, mindestens 72, mindestens 96, mindestens 120, mindestens 144, mindestens 168, mindestens 192, mindestens 216 oder mindestens 240 Stunden, von mindestens 2 Tagen, vorzugsweise mindestens 1 Woche, insbesondere bevorzugt mindestens 2 Wochen oder 1 Monat oder mehr liegen .
Vorzugsweise ist das Subjekt ein Sauger oder ein Vogel, vorzugsweise ein Primat, Mensch, Nager insbesondere eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Haustier insbesondere ein Schwein, Pferd, Kuh, Huhn, Pute, Hund oder Katze. Insbesondere bevorzugt ist das Subjekt ein Mensch.
Wie bereits oben ausgeführt können vor Bestimmung des Gehalts an Cbl-b-Protein in den Zellen diese Zellen mit einem bestimmten Antigen kontaktiert werden um eine bestimmte immunologische Reaktion festzustellen. Vorzugsweise wird hierbei ein Antigen ausgewählt, welches in einem Zusammenhang mit den Krankheiten steht, beispielsweise welches die Krankheiten auslosen oder beeinflussen kann. Solche Antigene sind beispielsweise Allergene oder Immunogene von Pathogenen. Damit umfasst ist auch die Verwendung der Epitope der Antigene. Ebenso können auch Krebsantigene oder Krebsepitope ausgewählt werden.
Vorzugsweise werden bei der Diagnose und/oder Prognose weitere Zellmarker, insbesondere zur Unterscheidung bestimmter Zelltypen und -population, vorgenommen. Für bestimmte Krankheiten ist oft ein bestimmter Zelltyp bzw. eine bestimmte Zellpopulation maßgeblich (oder ursachlich) und somit kann bei der Diagnose oder Prognose spezifisch die relevante Zellgruppe ange- sprochen werden.
Die Krankheiten die erfindungsgemäß untersucht werden können sind sämtliche die in einem Zusammenhang mit einer Beeinflussung einer immunologischen Antwort stehen. Insbesondere solche Krankheiten, in denen eine Veränderung der Immunantwort ursächlich für die Krankheit ist, sind besonders bevorzugt. Hierbei soll „Krankheit" als allgemeiner gesundheitsschädlicher Zustand angesehen werden, welcher sich von einem Normalzustand einer gesunden Person unterscheidet.
Eine besonders spezielle Krankheit ist eine chronische Infektion. Erfindungsgemäß kann über Cbl-b als Biomarker festgestellt werden, ob eine Immunantwort gegen eine bestimmte Infektion (z.B. Kontaktieren von Zellen des Immunsystems mit einem Antigen wie oben beschrieben) ausreicht um eine Infektion zu bekämpfen oder ob die Gefahr besteht, dass sich aus einer Infektion eine chronische Infektion bildet, welche nicht ausreichend oder nicht erfolgreich durch das Immunsystem verhindert werden kann .
Eine weitere Krankheit die erfindungsgemäß bestimmt oder prognostiziert werde kann, ist eine Tumorerkrankung. Tumore die nicht ausreichend durch das Immunsystem des Subjekt bekämpft werden sind in der Lage weiter zu bestehen bzw. sich auszubreiten. Es konnte gezeigt werden, dass Cbl-b ein mitverantwortlicher Immunmodulator ist, der bei Hochregulation, oder zumindest nicht-herunterregulierung dazu führt, dass Tumore mit bestimmten Tumorantigenen nicht ausreichend durch das Immunsystem bekämpft werden. Somit ist ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet für Cbl-b als Biomarker Tumorerkrankungen. Für viele Tumorerkrankungen gilt der Anteil an regulatorischen und anergischen Zellen im Tumorenviroment als negativer prognostischer Marker. Daher ist auch hier die Bestimmung des Proteingehalts von Cbl-b in den im Tumor befindlichen sowie zirkulierenden Immunzellen (insbesondere in T-Zellen und NK-zellen) ein relevanter Biomarker. Da ein gewisser Anteil der an sich in einem bestimmten Gewebe befindlichen („homing") T-Zellen auch durch das Blut zirkuliert, kann bereits die Bestimmung von Cbl-b in Immunzellen des peripheren Bluts von Patienten ebenfalls als Biomarker genutzt werden.
Im weiteren Ausführungsformen ist die Krankheit eine Entzün- dungs- oder Autoimmunerkrankung. Ein weiteres Anwendungsgebiet für Cbl-b als Biomarker sind Autoimmunerkrankungen (z.B. MS, Colitis, Psoriasis, Arthritis, SLE) sowie Inflammationserkrankun- gen (z.B. allergisches Asthma) . Die Entstehung dieser Immunerkrankungen steht in ursächlichem Zusammenhang mit der Reaktion gegen körpereigene Antigene oder an sich unschädliche Fremdantigene. Eine solche Autoimmunreaktion bzw. allergische Immunreaktion gegen unschädliche Fremdantigene wird im Normalfall durch regulatorische T-Zellen unterdrückt und T-Zellen, die auch eine gewisse Reaktivität gegen körpereigene Antigene haben befinden sich daher vorwiegend in einem anergischen Zustand. Im Verlauf von (Auto) -Immunerkrankungen werden aber autoreaktive T-Zellen aktiviert und es kommt zu chronischen entzündlichen Prozessen in betroffenen Geweben. Es wurde bereits gezeigt, dass die Menge von Cbl-b in peripheren Lymphozyten des Bluts signifikant zwischen Multipe Sklerose (MS) Patienten und gesunden Kontrollpersonen differierte (Zhou et al . , Neuroscience Letters 2008 Aug 8; 440 (3) : 336-9) . Darüber hinaus war eine hochsignifikante Korrelation mit dem momentanen Zustand der MS-Patienten (Relapse versus Remission) gegeben.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst bzw. ist die Krankheit eine Immunreaktion auf Allotransplantate . Mittels Cbl-b als Biomarker ist das Monitoring von Transplantatabstoßung in Patienten mit Allotransplantaten möglich. Auch hier herrscht ein Bedarf an Biomarkern, die ohne Biopsie des transplantierten Organs bestimmt werden können. Da in der Immuntoleranz gegenüber dem Transplantat dieselben molekularen Mechanismen wie oben skizziert relevant sind, ist die Cbl-b Expression in Leukozyten ein geeigneter Biomarker auch für den Immunstatus von Patienten in Bezug auf die Abstoßung des transplantierten Organs.
Die Krankheit kann insbesondere in speziellen Ausführungsformen eine Immunreaktion gegen Allergene, exogene Antigene oder gegen körpereigene Antigene (Autoreaktivität) umfassen. Allergien gehören zu den klassischen immunmodulierten Krankheiten welche beispielsweise auch durch eine Herunterregulation von Cbl-b maßgeblich beeinflusst werden können. Dadurch ist es möglich Cbl-b als Marker für die Diagnose oder Prognose insbesondere der Prognose des Verlaufs der Kranheit einzusetzen.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für Cbl-b als Biomarker ist die Bestimmung der generellen Disposition von noch gesunden Individuen auf immunologische Reaktivität. Da diese Disposition die individuelle Reaktion sowohl auf exogene als auch auf körpereigene Antigene beeinflusst, ist deren Bestimmung relevant für zur Prognose der Reaktion von gesunden Individuen auf durch Impfung, Infektion oder sonstigen Kontakt in den Organismus eingebrachte Antigene sowie für die Disposition bezuglich immunologischer Autoreaktivitat . Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung der Immunreaktivitat von Zellen eines Subjekts, insbesondere Leukozyten, gegen ein Antigen umfassend
• kontaktieren der Zellen mit dem Antigen,
• bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts in Zellen einer Probe des Subjekts wie hierin beschrieben,
• Vergleichen des Cbl-b-Proteingehalts mit Vergleichswerten eines Cbl-b-Proteingehalts bei Immunreaktivitat gegen ein Vergleichsantigen oder Ausbleiben einer Immunreaktivitat gegen ein Vergleichsantigen,
• Feststellen eines Unterschieds zwischen des Cbl-b-Proteingehalts des Subjekts und den Vergleichswerten.
Daher kann die Cbl-b Expression als Biomarker für die immunologische Disposition von Individuen bezuglich der Reaktivität gegen Allergene, exogene Antigene oder körpereigene Antigene (Autoreaktivitat) verwendet werden.
Die Expression von Cbl-b in T-Zellen ist unter anderem abhangig vom Aktivierungszustand der Zellen, T-Zellaktivierung fuhrt zu einem Anstieg der Menge von Cbl-b mRNA und Protein. Dies bedeutet, dass es nicht von vornherein klar ist, ob Änderungen in der Gesamtmenge von Cbl-b in Leukozyten des peripheren Bluts auf volle funktionelle T-Zellaktivierung an sich oder im Gegenteil auf einen anergischen Phänotyp zurückzuführen sind, hierin ist es daher vorteilhaft zusatzlich zu unterscheiden ob es sich bei den Zellen um solche handelt die durch ihre Aktivierung eine Immunreaktion fordern (TH, Tc) oder drosseln (Treg) . Auch beinhalten im peripheren Blut nicht nur T-Zellen Cbl-b Protein sondern bekanntermaßen beinahe alle Subtypen von Leukozyten. Es ist daher vorteilhaft, die Menge von Cbl-b Protein spezifisch nur in bestimmten Fraktionen von T-Zellen bestimmen zu können. Dies wird erfindungsgemaß z.B. durch Co-Bestimmung des Zelltyps, zumindest zur Unterscheidung Immunantwort-steigender oder -abschwächender Zellen ermöglicht.
Die Vergleichswerte um eine signifikant abweichende Cbl-b- Menge festzustellen können aus Proben anderer Subjekte ermittelt werden, vorzugsweise wobei das Antigen, mit dem die Zellen kontaktiert werden, identisch mit dem Vergleichsantigen ist, um die allgemeine Reaktivität des Antigens mit Zellen abzugleichen bzw. normalisieren. Manche Antigene neigen eher zu einer starken Bindung und Zellaktivierung und andere eher zu einer schwachen.
Vorzugsweise sind auch bei diesem Verfahren die Antigene Allergene, exogene Antigene oder körpereigene Antigene des Subjekts .
Auch bei der Bestimmung der Immunreaktivität von Zellen eines Subjekts werden vorzugsweise die oben genannten Parameter oder Auswahl der Zellen (bzw. Kobestimmung spezieller Zell-Klas- sifierzungsmarker) vorgenommen.
Hierin beschrieben ist die Auswahl eines Antikörpers der geeignet ist intrazelluläres Cbl-b zu binden, im speziellen welcher ein Epitop von Cbl-b im intrazellulärem Umfeld bindet, insbesondere nach einer Fixierung, im speziellen einer Quervernetzung im zellulären Kontext. Ein solcher Antikörper stellt ebenfalls einen Erfindungsgegenstand dar, insbesondere zur Verwendung zur intrazellulären Bestimmung von Cbl-b. Daher liefert die vorliegende Erfindung einen weiteren Aspekt die Verwendung eines Antikörpers welcher intrazelluläres Cbl-b bindet zur intazellu- lären Bestimmung von Cbl-b. Mitumfasst sind hierbei Antikörperderivate oder -fragmente, wie hierin bereits beschrieben wurde. Der Antikörper ist vorzugsweise gegen den C-Terminus von Cbl-b gerichtet (bzw. spezifisch hierfür) . In speziellen Ausführungsformen bindet der Antikörper ein Epitop im Bereich der C-termi- nalen 300, vorzugsweise 250 oder 200, vorzugsweise 180, im speziellen bevorzugt 170, besonders bevorzugt 150 oder 149, Aminosäuren von Cbl-b. Vorzugsweise ist der Antikörper spezifisch bzw. gerichtet gegen die Aminosäuren ab 833 bis zum C-Terminus, vorzugsweise Aminosäuren 833 bis 964 von Cbl-b (bzw. bindet ein Epitop in diesem Bereich) , wobei die Nummerierung der Aminosäuren menschlichem Cbl-b entspricht. Der Antikörper kann z.B. durch Immunisierung mit einem Fragment umfassend Aminosäuren 833-964 von Cbl-b erzeugt werden. Der Antikörper kann von einem beliebigen Organismus, insbesondere Säuger und Nagetiere wie oben erläutert, sein. Ein Beispiel für einen erfindungsgemäß verwendbaren Antikörper ist der Antikörper Abcam ab54362 (kommerziell erhältlich von Abcam, www.abcam.com/CBLB-antibody- 246C5a-ab54362.html), ein monoklonaler Mausantikörper, welcher gegen ein rekombinantes C-terminales Fragment (aa833-964) von humanem Cbl-b erzeugt wurde. Ein solcher Antikörper kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Insbesondere wird der Antikörper zur Bestimmung einer Krankheit wie hierin beschrieben, verwendet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit umfassend diesen Antikörper, vorzugsweise markiert, insbesondere fluoreszenzmarkiert, und Zellfixierungsmittel und/oder Zellper- meabilisierungsmittel, vorzugsweise ausgewählt aus Formaldehyd, Methanol, Ethanol, Aceton, Triton X-IOO (Octoxynol-9) und Sapo- nin, vorzugsweise zusätzlich einen oder mehrere Antikörper gegen einen Oberflächenrezeptor von Lymphozyten, insbesondere T-Zellen oder NK-Zellen, vorzugsweise ausgewählt aus CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD45RA, CD45RO, CD69, oder auch CD4, CD8, CD25, CD69, CD70, CD27, CD39, CD54, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD73, CD95, CD107a, CD127, CD134, CDwl37, CD152, CD154, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, GITR, PD-I, A2AR, Zytokine insbesondere IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL-27, Interferon-γ, Lymphotxin-α, TNF-α, und weitere intrazelluläre Moleküle, insbesondere Foxp3, GATA-3, RORc, T-bet, und weitere Oberflächenmarker zur funktionellen Charakterisierung von anderen Immunzellen als CD4 oder CD8 T-Zellen wie CDl, CD3, CD16, CD69, CD95, CD107a, CD127, KIR- und NKR-moleküle, CD19, CD20, CD22, CD27, CD38, CD40, CD267, CD268, CD269, IgD.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele illustriert, ohne darauf beschränkt zu sein.
F i g u r e n :
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 dass bei humanen T-Zellen der Cbl-b Proteingehalt durch die Anergie-vermittelnde alleinige Stimulation des T-ZeIl- rezeptors wesentlich höher ist, als der von optimal stimulierten (anti-CD3 und anti-CD28) T-Zellen und hohe Cbl-b Expression somit als ein Marker für anergische T-Zellen benutzt werden kann.
Fig. 2 den Test verschiedener gegen humanes und murines CbI- b gerichteter Antikörper, ob sie im durchflusszytometrischen Be- stimmungsverfahren zur Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in fixierten und permeabilisierten murinen Leukozyten geeignet sind.
Fig. 3 die Korrelation der Expressionsbestimmung von Cbl-b durch RT-PCR (A) , Western-Blot (B) und icFACS (C) von humanen T- Zellen und damit die Validierung der Cbl-b Spezifität des icFACS Stainings von Cbl-b durch ein spezifisches Silencing der Cbl-b Expression durch gegen Cbl-b gerichtete siRNA.
Fig. 4 die simultane FACS-Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts von humanen Immunzellen aus peripherem Blut (PBMCs) und der Expression zweier weiterer Immunzellmarker (CD45RA und CD3) . A: Cbl-b und CD3; B: CD45RA und Cbl-b; C: CD45RA und Cbl-b der CD3-negativen Zellen; D: Cbl-b Expression in CD14-positiven bzw. -negativen myeloiden Zellen.
Fig. 5 die FACS-Bestimmung der Cbl-b Expression zusammen mit CD45RA in NK-Zellen.
Fig. 6 dass Patienten, die an einer Autoimmunkrankheit leiden, einen verringerten Cbl-b Gehalt in ihren T-Zellen aufweisen, der auch durch normalerweise Anergie auslösenden Antigenkontakt nicht wesentlich induziert werden kann. A: Vergleich des Anteils an Zellen mit niedrigem Cbl-b Gehalt in Lymphozyten von SLE Patienten und gesunden Kontrollpersonen; B: Cbl-b Gehalt in CD3+ Zellen von SLE Patienten und gesunden Kontrollpersonen; C: anergische Cbl-b Stimulierung von SLE Patienten und gesunden Kontrollpersonen durch ein Allergen.
B e i s p i e l e :
Beispiel 1: Anergische T-Zellen haben einen besonders hohen Gehalt an intrazellulärem Cbl-b Protein.
Für Fig. 1 wurden PBMCs von gesunden freiwilligen Donoren mittels dem Standardprotokoll für Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll) präpariert und die CD8 T-Zellen durch MACS isoliert (Miltenyi, Protokoll folgend den Herstellerempfehlungen) . Die T- Zellen wurden dann mittels anti-CD3 oder anti-CD3 und anti-CD28- Antikörpern stimuliert, nach 24h geerntet und die Menge an Cbl-b Protein wurde durch Western-Blot mithilfe von anti-Cbl-b Antikörpern bestimmt. Dabei zeigte sich, dass ein besonders hoher Cbl-b Proteingehalt durch die Anergie-vermittelnde alleinige Stimulation des T-Zellrezeptors erreicht wird.
Beispiel 2 : Bestimmung des intrazellulären Gehalts von CbI-b in primären murinen Splenozyten mittels Durchflusszytometrie
Für die Etablierung eines Protokolls zur Färbung mit spezifischen Antikörpern für die nachfolgende Erfassung mittels Durchflusszytometrie ist es wichtig, die Spezifität der Färbung zu validieren. Idealerweise verwendet man dafür zur Spezifizi- tätskontrolle Zellen, die das zu bestimmende Protein nicht mehr enthalten. Bedauerlicherweise stehen aber keine humanen Zellen zur Verfügung, die genetisch vollständig defizient für cblb gemacht wurden, sondern nur murine Zellen aus cblb knockout-Mäu- sen. Jedoch ist die Homologie des humanen und des murinen Cbl-b Proteins außerordentlich hoch (>= 95%) . Dies wird auch in der Spezifikation der meisten getesteten anti-Cbl-b Antikörper widergespiegelt, die als reaktiv sowohl gegen humanes als auch murines Cbl-b beschrieben wurden, allerdings nur für andere Anwendungen als die Durchflusszytometrie (Western-Blot, Immunhisto- chemie) , keiner der getesteten Antikörper wurde als in der Durchflusszytmoetrie funktionell beschrieben. Ein Test eines Panels kommerziell erhältlicher Antikörper ergab aber das überraschende Resultat, dass doch einer der getesteten Antikörper spezifisch Wildtypzellen färben konnte, allerdings nicht Zellen von Cbl-b defizienten Mäusen. Dieser Antikörper (Antikörper 4) ist der Antikörper Abcam ab54362, erzeugt gegen ein rekombinantes C- terminales Fragment (aa833-964) von humanem Cbl-b. Fig. 2 zeigt eine Zusammenfassung dieser Versuchsreihe, gezeigt wird dabei jeweils der Prozentanteil von Zellen der in der positiven Markerregion im Histogramm der durchflusszytometrisch detektierten Antikörper-vermittelten Fluoreszenz liegt.
Die Zellen wurden dabei nach folgendem Protokoll gefärbt: Eine Million Zellen wurden mit 200μl FACS Puffer (PBS + 2% FCS) einmal gewaschen und dann fixiert und permeabilisiert durch Inkubation für 20 Minuten in 250μl Cytofix/Cytoperm-Lösung (Hersteller: Becton Dickinson) . Danach wurden die Zellen einmal mit 200μl Perm/Wash-Buffer desselben Herstellers gewaschen und mit Antikörper (verdünnt in Perm/Wash-Buffer auf eine Antikörper- Konzentration von 2μg/ml) auf Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen zweimal in 200μl Perm/Wash Buffer gewaschen und mit einem Fluoreszenz-gelabelten Sekun- darantikorper (anti mouse IgG-PE, Hersteller: Southern Biotech) für weitere 30 Minuten inkubiert. Schlussendlich wurden die Zellen jeweils einmal mit Wash/Perm-Buffer und mit FACS Puffer gewaschen und für die FACS-Analyse in 250μl FACS Puffer resuspendiert .
Da der Fluoreszenzfarbstoff des Sekundarantikorpers in diesem Protokoll frei wahlbar ist, können auch alle möglichen MuI- ticolorfarbungen mit anderen Markern erfolgen, um die Cbl-b Expression spezifisch in bestimmten Subpopulationen von Zellen zu detektieren .
Beispiel 3: Validierung des intrazellulären Cbl-b staining Protokolls durch der Cbl-b Bestimmung vorangehende Inhibition der Cbl-b Expression durch cblb spezifische siRNA
Um nachzuweisen, dass die Detektion durch den oben beschriebenen anti-Cbl-b Antikörper spezifisch für Cbl-b ist, wurden nun humane T-Zellen wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert und mittels Nukleofektion mit Cbl-b siRNA transfiziert . Die Inhibition der mRNA Neusynthese von Cbl-b wurde mittels quantitativer Real- Time PCR nachgewiesen (Fig. 3A) . Folgerichtig zeigte sich auch eine signifikante Verringerung von Cbl-b im Western-Blot nach 24h anti CD3/28 Stimulation (Fig. 3B) .
Zur Färbung von intrazellularem Cbl-b wurden die humanen T- Zellen nach folgendem Protokoll behandelt:
100000 T-Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, in 50μl PBS resuspendiert und durch Zugabe von 50μl 4%-Paraformaldehydlosung fixiert. Danach wurden die Zellen einmal in 200μl PBS und dann 2x in 200μl Perm Puffer (PBS mit 2% FCS und 0,1% Saponin) gewaschen. Zur Färbung mit dem Cbl-b Antikörper wurden die Zellen mit einer 2μg/ml Losung in 50μl Perm Puffer 30 Minuten auf 4° inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal mit Perm Puffer gewaschen und mit direkt gelabeltem Sekundarantikorper (anti mouse IgG-PE, Hersteller: Southern Biotech) weitere 30 Minuten auf 4° inkubiert. Schlussendlich wurden die Zellen jeweils einmal mit Perm-Buffer und mit FACS Puffer gewaschen und für die FACS-Analyse in 250μl FACS Puffer resuspendiert.
In Übereinstimmung mit den Daten des Western-Blots wurde auch eine signifikante Verringerung der Cbl-b Staining-Intensi- tat in der Messung mittels Durchflusszytometrie detektiert (Fig. 3C) . Diese Daten weisen somit eindeutig nach, dass das erfin- dungsgemäße Protokoll zur spezifischen Bestimmung des zellulären Cbl-b Proteingehalts von humanen Leukozyten mittels Durchfluss- zytometrie geeignet ist.
Beispiel 4: Die Kombination von Cbl-b Detektion mit weiteren Im- munzellmarkern erlaubt die gleichzeitige Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in verschiedensten erkrankungsrelevanten Immunzellen.
Es wurden PBMCs von gesunden freiwilligen Donoren mittels dem Standardprotokoll für Dichtegradientenzentrifugation (Fi- coll) präpariert und wie oben beschrieben mit Cbl-b Antikörper und sekundärem Detektionsantikörper gefärbt. Zusätzlich wurden die Zellen mit gegen CD54RA und CD3 gerichteten Antikörpern gefärbt (direkt markierte CD45RA-FITC und CD3-PE-Cy7 Antikörper, Hersteller Invitrogen) . Ergebnisse der FACS-Bestimmung sind in Fig. 4 dargestellt. Mittels seitwärts (SSC) und vorwärts (FSC) Streuungsbestimmung können einzelne Zelltypen - wenn angegeben - spezifisch bestimmt werden. Dabei zeigt sich, dass der Cbl-b Gehalt in der T-Zellfraktion von gesunden Personen vergleichsweise einheitlich ist (Fig. 4A, Morphologie-Gate, SSC und FSC Einstellung auf Lymphozyten) , und zwar auch unabhängig davon, ob es sich um naive (CD45RA+) oder Memory T-Zellen (CD45RA-) handelt
(Fig. 4B, Cbl-b durchschnittliche Fluoreszenz ist nahezu ident 2,03 vs. 2,07) . Dies stimmt auch mit dem Befund überein, dass in gesunden Personen nur ein minimaler Anteil aktivierter T-Zellen im Blut zirkuliert. Zusätzlich zeigen diese Daten, dass in der CD3-negativen Fraktion der PBMCs ebenfalls der Grossteil der Immunzellen Cbl-b exprimiert (Fig. 4C) . Die Relevanz von Cbl-b für die Immunreaktivität von B- und invarianten NKT-Zellen wurde auch in der Literatur gezeigt (Kojo et al . , PNAS
(2009) /doi: 10.1073/pnas.0904078106) .
Ein wesentlicher Anteil der CD3-negativen Immunzellen in PBMCs sind allerdings NK-Zellen, die CD3-negativ und CD45RA-po- sitiv sind. Fig. 4C zeigt, dass auch in diesen Zellen relevante Mengen von Cbl-b exprimiert werden. Zusätzlich zeigt Fig. 4D, dass myeloide Zellen (Morphologie-Gate im SSC vs . FSC auf Monozyten/Makrophagen) ebenfalls relevante Mengen von Cbl-b Protein exprimieren, wobei allerdings vorzugsweise CD14-positive Monozyten Cbl-b Protein exprimieren im Vergleich zu CD14-negativen myeolide Zellen (vornehmlich Makrophagen) . Beispiel 5: Expression von CbI-b in NK-Zellen.
In Fig. 5 werden Ergebnisse von NK-Zellen gezeigt, die aus PBMCs durch MACS isoliert (NK-Zellisolationskit, Invitrogen) und wie in Beispiel 4 zur gleichzeitigen Bestimmung von Cbl-b und CD45RA gefärbt wurden. Dabei zeigt sich, dass alle klassischen NK-Zellen (CD45RA-positiv) Cbl-b exprimieren. Der geringe Anteil an CD45RA-negativen Zellen in dieser Praparation kann in Übereinstimmung mit der Literatur als sogenannte „Killer Dendritic Cells", welche Eigenschaften von NK-Zellen und dentritischen Zellen aufweisen (siehe beispielsweise Bonmort et al . , Current Opinion in Immunology 2008, 20:558-565), identifiziert werden, da ihre Zellmorphologie sie als etwas großer als klassische Lymphozyten ausweist, und auch durch CD45RA-negative Subsets beschrieben werden (Bangert et al . , J. Investigat. Dermatology 2003 121:1409-1418) . Interessanterweise sind gerade diese hier als Cbl-b negativ beobachteten „Killer Dendritic Cells" als ein wichtiger Faktor der Immunantwort gegen Tumore identifiziert worden (Larmonier et al . , Cancer Immunol Immunother (2010) 59:1- 11) . Beispiel 5 zeigt damit, dass die Definition von distinkten zellularen Subpopulationen durch die Bestimmung ihrer cbl-b Expression eine verbesserte funktionelle Charakterisierung des Ak- tivitatszustands des Immunsystems im Kontext einer Tumorerkrankung erlaubt.
Beispiel 6: Patienten, die an einer Αutoimmunkrankheit aufgrund einer krankhaft erhöhten Immunreaktivität leiden, weisen einen verringerten Cbl-b Gehalt in T-Zellen auf.
Ein verringerter Cbl-b Proteingehalt in Immunzellen fuhrt zu einer erhöhten Aktivierung des Immunsystems. Wahrend dies in der Situation einer Tumorerkrankung wünschenswert ist, ist eine krankhaft erhöhte Immunitat gegen körpereigene Antigene im Kontext von Autoimmunerkrankungen pathologisch relevant. Es wurde daher der Cbl-b Proteingehalt von Immunzellen in Patienten mit aktivem systemischem Lupus erythematosus (SLE) untersucht. PBMCs von SLE-Patienten oder von gesunden Vergleichspersonen wurden präpariert und wie in Beispiel 4 beschrieben mit Antikörpern gegen Cbl-b, CD45RA und CD3 gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. Dies erlaubt die Identifikation verschiedener Zellpopulationen bezuglich ihres Cbl-b Proteingehalts. Auffalligerwei- se war bei den SLE-Patienten der Anteil der CD3"CD45RA" Lymphozy- ten mit geringem bzw. ohne Cbl-b (unterhalb der FACS-Nachweis- grenze) dramatisch erhöht (Fig. 7A, je 3 Donoren pro Gruppe, p=0, 00025) . Zusatzlich wurde der Cbl-b Proteingehalt in CD3-po- sitiven T-Zellen bestimmt. Fig. 7B zeigt, dass der Gehalt von Cbl-b in T-Zellen von Patienten mit Autoimmunerkrankung wesentlich verringert war im Vergleich zu gesunden Vergleichspersonen (Stain Index = Median der Fluoreszenz der Cbl-b Färbung dividiert durch den der Fluoreszenz der Isotyp Färbung p<0,0003) . Dies ist in Übereinstimmung mit der generell erhöhten Aktivierung von Immunzellen in SLE-Patienten (siehe bspw. Doreau et al., Nature Immunology 2009, doi : 10.1038/ni .1741) .
Einen weiteren pathologischen Kontext von erhöhten Immunre- aktivitaten stellen beispielsweise Allergien dar. PBMCs eines SLE Patienten bzw. einer gesunden Vergleichsperson wurden daher mit einem an sich harmlosen Pflanzenantigen (Phytohemagglutinin) aus der Gartenbohne (Phaseolus vulgaris) kontaktiert. Das Antigen kann in höheren Konzentrationen zu einer Aktivierung von T- Zellen fuhren, die in Abwesenheit weiterer T-Zellspezifischer Stimuli üblicherweise zu einer anergischen Reaktion der kontaktieren T-Zellen fuhrt. In Übereinstimmung damit reagierten T- Zellen von einer gesunden Vergleichsperson mit einer starken Erhöhung des Cbl-b Proteingehalts (Fig. 7C) wie er für anergische T-Zellen charakteristisch ist (Inkubation von 2 Millionen PBMCs in ImI Xvivo Medium mit 2μl Phytohemaglutinin-Suspension (Invi- trogen-GIBCO für 48h) . Im Gegensatz dazu reagierten T-Zellen eines SLE-Patienten, die bereits einen ohnehin verringerten Cbl-b Proteingehalt aufwiesen nicht mehr mit einer Erhöhung des Cbl-b Proteingehalts .
Beispiel 7 illustriert daher, dass das gegenstandliche Verfahren zur Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in Immunzellen insbesondere in komplexen Immunzellgemischen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen geeignet ist und auch pradiktive Aussagen zur Reaktion von Immunzellen von Patienten im Kontext mit ihrem Cbl-b Gehalt auf verschiedene Stimuli erlaubt.

Claims

Ansprüche :
1. Verfahren zur Bestimmung von intrazellulärem Cbl-b-Protein in Zellen einer Probe umfassend
• Einbringen eines Antikörpers, welcher Cbl-b intrazellulär bindet, in eine Zelle,
• Kontaktieren lassen des Antikörpers und potentiell vorhandenem Cbl-b-Protein in der Zelle,
• Detektieren von Bindungsereignissen zwischen dem Antikörper und Cbl-b,
• Quantifizieren der detektierten Bindungsereignisse, wodurch der Gehalt an Cbl-b-Protein bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Leukozyten umfassen, vorzugsweise PBMCs.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper markiert sind, vorzugsweise fluoreszenzmarkiert .
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen einzeln zur Detektion der Bindungsereignisse gemessen werden, vorzugsweise bei gleichzeitiger Klassifizierung oder Bestimmung des Zelltyps.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit hohem Durchsatz von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 50, insbesondere mindestens 100, spezielle bevorzugt mindestens 200, Zellen pro Sekunde gemessen werden .
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durchflusszytometrisch gemessen werden .
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der Zellen, in welchen Cbl-b detek- tiert wird, und/oder die Menge an Cbl-b-Protein in den Zellen quantifiziert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor der Detektion der Bindungsereignisse, vorzugsweise auch vor dem Einbringen des Antikörpers, mit einem Antigen stimuliert werden, wobei vorzugsweise die Zellen Antigen-präsentierende Zellen umfassen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit immunstimulierenden Substanzen, vorzugsweise Cytokin(e) oder Liganden immunmodulierender Rezeptoren, insbesondere TLR (toll-like receptors) , oder Antikörper gegen Oberflächenmoleküle, insbesondere CD3 und/oder CD28, behandelt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge von posttranslational modifiziertem, vorzugsweise phosphoryliertem und/oder ubiquitiniertem Cbl-b- Protein, bestimmt wird.
11. Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder Prognose des Auftretens oder des Verlaufs einer Krankheit umfassend
• Bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts in Zellen einer Probe eines Subjekts nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche
1 bis 10, vorzugsweise an mindestens 2 verschiedenen Tagen,
• Vergleichen des Cbl-b-Proteingehalts mit erkrankten oder gesunden Vergleichssubjekten,
• Feststellen eines Unterschieds zwischen des Cbl-b-Proteingehalts des Subjekts und der Vergleichssubjekte, wodurch eine Krankheit bzw. die Prognose festgestellt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11 gekennzeichnet durch Bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts an 2, vorzugsweise 3, insbesondere bevorzugt 4 oder mehr, verschiedenen Zeitpunkten und korrelieren des Cbl-b-Proteingehalts des Subjekts an den unterschiedlichen Zeitpunkten mit dem Cbl-b-Proteingehalt der Vergleichssubjekte.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die 2 oder mehr Zeitpunkte im Abstand von mindestens 2 Tagen, vorzugsweise mindestens 1 Woche, insbesondere bevorzugt mindestens
2 Wochen oder 1 Monat oder mehr, sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Subjekt ein Säuger, vorzugsweise ein Mensch ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, in Verbindung mit dem Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein Antigen ausgewählt wird, welches die Krankheit auslösen oder beeinflussen kann.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine chronische Infektion ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine Tumorerkrankung ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine Entzündungs- und Autoimmunerkrankung ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine Immunreaktion auf Al- lotransplantate umfasst.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine Immunreaktion gegen Allergene, exogene Antigene oder gegen körpereigene Antigene umfasst.
21. Verfahren zur Bestimmung der Immunreaktivität von Zellen eines Subjekts, insbesondere Leukozyten, gegen ein Antigen umfassend
• Kontaktieren der Zellen mit dem Antigen,
• Bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts in Zellen einer Probe des Subjekts nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
• Vergleichen des Cbl-b-Proteingehalts mit Vergleichswerten eines Cbl-b-Proteingehalts bei Immunreaktivität gegen ein Vergleichsantigen oder Ausbleiben einer Immunreaktivität gegen ein Vergleichsantigen,
• Feststellen eines Unterschieds zwischen des Cbl-b-Proteingehalts des Subjekts und den Vergleichswerten.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Vergleichswerte aus Proben anderer Subjekte festgestellt wurden, vorzugsweise wobei das Antigen identisch mit dem Vergleichsantigen ist.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene Allergene, exogene Antigene oder körpereigene Antigene des Subjekts sind.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich der Gehalt oder die Aktivität von PKCtheta bestimmt wird und vorzugsweise zusätzlich mit PKCtheta Kontollwerten verglichen wird und zur Bestimmung der Immunreaktivität der Zellen verwendet wird.
25. Verwendung eines Antikörpers, welcher ein Epitop von Cbl-b im intrazellulärem Umfeld bindet, insbesondere ein Epitop der C- terminalen 300 Aminosäuren von Cbl-b, zur intrazellulären Bestimmung von Cbl-b.
26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Bestimmung nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 24 durchgeführt wird, insbesondere zur Bestimmung einer Krankheit definiert wie in einem der Ansprüche 16 bis 20.
27. Kit umfassend Antikörper, welcher ein Epitop von Cbl-b im intrazellulärem Umfeld bindet, insbesondere ein Epitop der C- terminalen 300 Aminosäuren von Cbl-b, vorzugsweise markiert, insbesondere fluoreszenzmarkiert, und Zellfixierungsmittel und/oder Zellpermeabilisierungsmittel, vorzugsweise ausgewählt aus Formaldehyd, Methanol, Ethanol, Aceton, Triton X-100 und Sa- ponin, vorzugsweise zusätzlich einen oder mehrere Antikörper gegen einen Oberflächenrezeptor von Lymphozyten, insbesondere T- Zellen oder NK-Zellen, vorzugsweise ausgewählt aus CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD45RA, CD45RO, CD69.
PCT/EP2010/054886 2009-04-14 2010-04-14 Verfahren zur bestimmung der cbl-b expression WO2010119061A1 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2758624A CA2758624A1 (en) 2009-04-14 2010-04-14 Method for determining the cbl-b expression
EP10714250A EP2419735A1 (de) 2009-04-14 2010-04-14 Verfahren zur bestimmung der cbl-b expression
AU2010238500A AU2010238500A1 (en) 2009-04-14 2010-04-14 Method for determining the Cbl-b expression
US13/264,463 US20120040864A1 (en) 2009-04-14 2010-04-14 Method for Determining the Cbl-b Expression

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ATA573/2009 2009-04-14
AT0057309A AT508109A1 (de) 2009-04-14 2009-04-14 Verfahren zur bestimmung der cbl-b expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010119061A1 true WO2010119061A1 (de) 2010-10-21

Family

ID=42232619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2010/054886 WO2010119061A1 (de) 2009-04-14 2010-04-14 Verfahren zur bestimmung der cbl-b expression

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20120040864A1 (de)
EP (1) EP2419735A1 (de)
AT (1) AT508109A1 (de)
AU (1) AU2010238500A1 (de)
CA (1) CA2758624A1 (de)
WO (1) WO2010119061A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2471548A1 (de) * 2010-12-28 2012-07-04 Apeiron Biologics AG siRNA gegen Cbl-b und optional IL2 und IL12 zur Verwendung in der Behandlung von Krebs

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130203068A1 (en) * 2012-02-06 2013-08-08 Perkinelmer Biosignal, Inc. Dual-acceptor time-resolved-fret
CN110412289B (zh) * 2019-07-25 2022-08-02 北京美迪阿姆科技发展有限公司 抑制性t细胞及筛选方法和抑制自身免疫反应中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004108896A2 (en) 2003-06-03 2004-12-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Gene expression profiling of uterine serous papillary carcinomas and ovarian serous papillary tumors
WO2008021431A2 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004108896A2 (en) 2003-06-03 2004-12-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Gene expression profiling of uterine serous papillary carcinomas and ovarian serous papillary tumors
WO2008021431A2 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BABU ET AL., J. IMMUNOL., vol. 176, no. 5, 2006, pages 3248 - 56
BANGERT ET AL., J. INVESTIGAT. DERMATOLOGY, vol. 121, 2003, pages 1409 - 1418
BONMORT ET AL., CURRENT OPINION IN IMMUNOLOGY, vol. 20, 2008, pages 558 - 565
CHIANG ET AL., J CLIN INVEST, 2007
DOREAU ET AL., NATURE IMMUNOLOGY, 2009
KRUTZIK ET AL., CLIN. IMMUN., vol. 110, 2004, pages 206 - 221
LARMONIER ET AL., CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER, vol. 59, 2010, pages 1 - 11
LENG ET AL., INT. IMMUNOL., vol. 18, no. 5, 2006, pages 637 - 44
LOESER ET AL., JEM, 2007
LOESER S ET AL: "Regulation of peripheral T cell tolerance by the E3 ubiquitin ligase Cbl-b", SEMINARS IN IMMUNOLOGY, W.B. SAUNDERS COMPANY, PA, US LNKD- DOI:10.1016/J.SMIM.2007.02.004, vol. 19, no. 3, 1 June 2007 (2007-06-01), pages 206 - 214, XP025323077, ISSN: 1044-5323, [retrieved on 20070529] *
SHAMIM MOHAMMED ET AL: "Cbl-b regulates antigen-induced TCR down-regulation and IFN-gamma production by effector CD8 T cells without affecting functional avidity.", JOURNAL OF IMMUNOLOGY (BALTIMORE, MD. : 1950) 1 DEC 2007 LNKD- PUBMED:18025165, vol. 179, no. 11, 1 December 2007 (2007-12-01), pages 7233 - 7243, XP002586676, ISSN: 0022-1767 *
ZHOU ET AL., NEUROSCI. LETT., 2008
ZHOU ET AL., NEUROSCIENCE LETTERS, vol. 440, no. 3, 8 August 2008 (2008-08-08), pages 336 - 9

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2471548A1 (de) * 2010-12-28 2012-07-04 Apeiron Biologics AG siRNA gegen Cbl-b und optional IL2 und IL12 zur Verwendung in der Behandlung von Krebs
WO2012089736A1 (de) 2010-12-28 2012-07-05 Apeiron Biologics Ag Sirna gegen cbl-b und optional il2 und il12 zur verwendung in der behandlung von krebs
US9186373B2 (en) 2010-12-28 2015-11-17 Apeiron Biologics Ag SiRNA against Cbl-b and optionally IL-2 and IL-12 for use in the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
AT508109A1 (de) 2010-10-15
CA2758624A1 (en) 2010-10-21
AU2010238500A1 (en) 2011-11-24
EP2419735A1 (de) 2012-02-22
US20120040864A1 (en) 2012-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Phan et al. Natural killer cell subsets and receptor expression in peripheral blood mononuclear cells of a healthy Korean population: reference range, influence of age and sex, and correlation between NK cell receptors and cytotoxicity
Fattorossi et al. Circulating and thymic CD4+ CD25+ T regulatory cells in myasthenia gravis: effect of immunosuppressive treatment
Delmonte et al. Flow cytometry: Surface markers and beyond
EP1913387B1 (de) Verfahren zur identifizierung regulatorischer t-zellen
Méndez-Flores et al. Inflammatory chemokine profiles and their correlations with effector CD4 T cell and regulatory cell subpopulations in cutaneous lupus erythematosus
US9448229B2 (en) Kit for monitoring immune status after transplant and method for monitoring immune status using same
Oras et al. Comprehensive flow cytometric reference intervals of leukocyte subsets from six study centers across Europe
Roesner et al. T‐cell receptor sequencing specifies psoriasis as a systemic and atopic dermatitis as a skin‐focused, allergen‐driven disease
US20200011865A1 (en) Methods and kits for detecting basophil activation
EP2419735A1 (de) Verfahren zur bestimmung der cbl-b expression
Kasten-Jolly et al. Differential blood leukocyte populations based on individual variances and age
Popple et al. T lymphocyte dynamics in methylisothiazolinone‐allergic patients
US20100190155A1 (en) Methods and kits for measurement of lymphocyte function
EP3467507B1 (de) Verfahren zum testen der nk-zellaktivität mit synergistischer rezeptorwirkung und verfahren zur diagnose von krankheiten im zusammenhang mit der nk-zellaktivität damit
Mardomi et al. New insights on the monitoring of solid-organ allografts based on immune cell signatures
KR102576597B1 (ko) 면역 노화 평가용 조성물 및 키트
Balinas et al. Investigation of mast cell toll-like receptor 3 in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis and Systemic Mastocytosis using the novel application of autoMACS magnetic separation and flow cytometry
US20230349890A1 (en) Method for determination of basophil activation and kits therefore
DE102021116416A1 (de) Verfahren zur diagnose einer covid-19 erkrankung
Hussen et al. Flow cytometric analysis of immune cell populations in the bronchial and mesenteric lymph nodes of the dromedary camel
CA2996299C (en) Methods and compositions for the detection of fc receptor binding activity of antibodies
EP3611504B1 (de) Verfahren zum nachweis von regulatorischen t-zellen des effektortyps, vorrichtung und system zur analyse von t-zellen
KR101349249B1 (ko) 시험관내 피부 감작성 평가 방법
WO2023064893A1 (en) IgE+PLASMABLASTS AS A PREDICTIVE BIOMARKER OF ALLERGY
Yandamuri et al. A Noncanonical CD56dimCD16dim/− NK Cell Subset Indicative of Prior Cytotoxic Activity Is Elevated in Patients with Autoantibody-Mediated Neurologic Diseases

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10714250

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2758624

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13264463

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010714250

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2010238500

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20100414

Kind code of ref document: A