JP7264867B2 - 非メラノーマ皮膚癌(nmsc)の予防および治療 - Google Patents
非メラノーマ皮膚癌(nmsc)の予防および治療 Download PDFInfo
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- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
Description
(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(配列番号38)
を有し、これは、例えばα(1)-コラーゲンまたはαグロビン、およびALOX15またはチロシンヒドロキシラーゼをコードする非常に安定したmRNAの3'UTRに含まれている(ここで「x」は(NxおよびPyxで独立して)0~10、好ましくは0~5の整数(Holcikら、1997)、特に0、1、2、4および/または5である)。
- シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および/または
- アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される。
- シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換された
IFN-α mRNAである。
- IFN-α mRNAが0.8以上のCAIおよび48.7%以上のGC含量を有する;
- IFN-α mRNAが0.8~0.99、好ましくは0.81~0.97、特に0.83~0.85のCAIを有する(例えば、配列番号3のように);
- IFN-α mRNAが48.7%~63.7%、好ましくは48.7%~60%、特に48.7%~58.0%のGC含量を有する;
- IFN-α mRNAが0.80~0.97のCAIおよび48.7%~63.7%のGC含量を有する;
- IFN-α mRNAが0.6~0.8のCAIおよび48.7%~65.0%のAU含量を有する;
- IFN-α mRNAが0.6~0.8、好ましくは0.6~0.7、特に0.65~0.75のCAIを有する(例えば、配列番号4のように);および
- IFN-α mRNAが48.7%~65.0%、好ましくは51.3~60.0%のAU含量を有する。
- 本明細書で定義されるIFN-α mRNAおよび
- 皮膚送達装置
を含む、患者に本発明のIFN-α mRNAを投与するためのキットに関する。
- 針ベースの注射システムおよび無針注射システムからなる群から好ましくは選択される皮内送達装置、
- 経皮パッチ、中空および中実マイクロニードルシステム、微細構造経皮システム、電気泳動システム、およびイオン導入システムからなる群から好ましくは選択される経皮送達装置、または
- 無針注射システム、レーザーベースのシステム、特にエルビウム(Erbium)YAGレーザーシステム、および遺伝子銃システムからなる群から好ましくは選択される表皮送達装置
である。
配列番号:1 IFNa2a
auggccuuga ccuuugcuuu acugguggcc cuccuggugc ucagcugcaa gucaagcugc
ucugugggcu gugaucugcc ucaaacccac agccugggua gcaggaggac cuugaugcuc
cuggcacaga ugaggaaaau cucucuuuuc uccugcuuga aggacagaca ugacuuugga
uuuccccagg aggaguuugg caaccaguuc caaaaggcug aaaccauccc uguccuccau
gagaugaucc agcagaucuu caaucucuuc agcacaaagg acucaucugc ugcuugggau
gagacccucc uagacaaauu cuacacugaa cucuaccagc agcugaauga ccuggaagcc
ugugugauac aggggguggg ggugacagag acuccccuga ugaaggagga cuccauucug
gcugugagga aauacuucca aagaaucacu cucuaucuga aagagaagaa auacagcccu
ugugccuggg agguugucag agcagaaauc augagaucuu uuucuuuguc aacaaacuug
caagaaaguu uaagaaguaa ggaauga
auggcacuga cauuugcccu gcucguugcu cuuuuggucc uuuccugcaa gaguagcugc
ucuguuggcu gugauuugcc ccaaacccac ucucucgguu caaggagaac ucugaugcug
cuugcccaaa ugcggaagau uagccuguuc ucaugccuga aagaccggca ugauuucggc
uuuccucagg aggaauuugg gaaccaguuc cagaaagcgg aaaccauucc cguccuucac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuu ucuaccaagg auuccagugc ugcuugggau
gagacacugc uggacaaguu cuacacugag cucuaucagc agcugaauga ccuggaagcc
ugugugaucc aaggaguagg agugacugag acaccacuca ugaaagagga cuccauacuc
gcagugcgca aguacuucca gaggauuacc cuguaucuga aggagaagaa auacaguccg
ugugcauggg aaguggugag agccgagauc augcguagcu uuucccuguc aacgaaucug
caggaaagcu ugcgaagcaa agaauga
auggcacuga cauucgcccu gcucgucgcu cuccucgucc ucuccugcaa gaguagcugc
ucugucggcu gugauuugcc ccaaacccac ucccucgguu ccaggcgcac ucugaugcug
cucgcccaga ugcggaagau uagccuguuc ucaugccuga aggaccggca ugauuucggc
uucccucagg aggaauucgg gaaccaguuc cagaaggcgg agaccauccc cguccuccac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc ucuaccaagg acuccagugc ugcuugggac
gagacccugc ucgacaaguu cuacacugag cucuaccagc agcugaacga ccuggaggcc
ugugugaucc aaggagucgg agugacugag acaccacuca ugaaggagga cuccauccuc
gcaguccgca aguacuucca gaggaucacc cuguaccuga aggagaagaa guacaguccg
ugugcauggg agguggugag agccgagauc augcguagcu ucucccuguc aacgaaccug
caggagagcc uccgaagcaa ggaguga
auggcacuga cauuugcccu gcucguugcu cuuuuggucc uuucuugcaa gaguagcugu
ucuguuggau gugauuugcc ucaaacucau ucuuuggguu caagaagaac uuugaugcuu
cuugcacaaa ugagaaagau uagccuuuuc ucauguuuga aagaucgaca ugauuucgga
uuuccucaag aagaauuugg uaaccaauuc caaaaagcug aaaccauucc uguccuucau
gaaaugaucc aacaaaucuu caaucuuuuu ucuacuaagg auucuagugc ugcuugggau
gaaacacuuc uugauaaguu cuacacugaa cucuaucaac agcugaauga cuuggaagcc
uguguuaucc aaggaguugg aguuacugag acaccacuca ugaaagaaga uuccauacuc
gcaguucgca aguacuucca aaggauuacc uuguaucuga aggaaaagaa auacaguccu
ugugcauggg aagugguuag agcugaaauc augcguagcu uuucccuguc aacgaauuug
caggaaagcu ugcgaagcaa agaauga
auggcccuga cauucgcucu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugu
agcgugggcu gcgaccugcc ucagacacac agccugggca gcagacggac ccugaugcug
cuggcccaga ugcggaagau cagccuguuc agcugccuga aggaccggca cgacuucggc
uucccucagg aagaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agacaauccc cgugcugcac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc uccaccaagg acagcagcgc cgccugggac
gagacacugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaauga ccuggaagcc
ugcgugaucc agggcguggg cgugacagag acaccccuga ugaaggaaga uagcauccug
gccgugcgca aguacuucca gcggaucacc cuguaccuga aagagaagaa guacagcccc
ugcgccuggg aggucgugcg ggccgagauc augagaagcu ucagccugag caccaaccug
caggaaagcc ugcggagcaa agaguga
auggcucuca ccuucgcccu gcugguggca cuucuugucc ucucauguaa aucuagcugu
agcguuggcu gcgaucugcc ucagacucau agucugggau cucggaggac gcuuaugcug
uuggcccaga ugaggaagau cucccuguuc uccugucuca aagaccggca cgauuuuggc
uucccacagg aggaguuugg gaaccaguuc cagaaagcug agaccauccc ggugcuucau
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ugugccuggg agguuguccg ggcugagaua augcgaaguu ucucacugag uacaaacuug
caggagagcc uccgaucaaa ggaguga
auggcucuua cguucgcucu uuugguugcc cucuuggugc ugaguuguaa auccucaugu
uccgugggau gcgaucugcc gcagacucac ucucuuggca guagaaggac ccugaugcug
cuggcucaaa ugcggaagau uagucuguuc uccugccuga aggaccggca ugacuucggu
uuuccacagg aggaauucgg aaaccaguuu cagaaggcug agacaauccc ugugcugcac
gaaaugaucc aacagauuuu caaccuuuuc ucaaccaagg acuccucagc cgccugggac
gaaacacugc uggauaaauu cuauaccgag cucuaccaac agcugaacga uuuggaggca
ugugucaucc agggggucgg ggucacugag acuccacuga ugaaggaaga cuccauucuc
gcgguaagga aauacuucca gaggaucacg cuguaccuga aggaaaagaa auacagcccu
ugcgcauggg aggugguucg cgcugagauc augcggagcu ucagucugag cacuaaucug
caggaaagcc ucaggucaaa ggaauag
auggcuuuga ccuucgcccu ccugguggcc cuguuggugc ucucaugcaa auccagcugc
ucagugggcu gcgauuugcc ccagacccac ucacugggaa guaggaggac uuugaugcug
uuggcucaga ugcggaaaau cucucuguuc uccugccuga aggauaggca ugacuuuggu
uuuccucaag aggaguuugg aaaccaguuc caaaaggccg aaaccauccc ugugcuccac
gaaaugaucc agcagauauu uaaccuuuuc ucuacuaaag auuccagcgc cgcaugggac
gagacccugc uugacaaguu cuacacugag cucuaccagc agcucaacga ccuggaggcg
ugugugaucc agggugucgg ugugacggag acuccccuua ugaaagagga uucuauccug
gcagugcgga aauauuuuca gagaaucacg cuguauuuga aggagaagaa guauagcccc
ugcgccuggg aaguggugag ggcugaaauu augcgcaguu ucagcuugag caccaaccug
caggaauccc uucgguccaa ggaauaa
auggcccuga ccuucgcacu gcugguggca cugcugguuc uuuccuguaa gagcaguugc
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gagaugauuc agcagaucuu caaccuguuu ucuaccaagg acagcuccgc ugcuugggac
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ugcguuauuc agggcgucgg cgugacagag acuccacuga ugaaagagga caguauccug
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ugcgcauggg aagugguaag ggcugaaauc augcggagcu uuucccuguc uaccaaccug
caggaauccc ugagauccaa agaauaa
auggcacuga cauuugccuu gcucgucgcc cugcuuguuc uguccuguaa gagcuccugc
ucaguuggcu gcgaucuucc ucaaacccau agccucggua gccgccgaac ccugaugcug
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uucccacagg aggaguucgg caaucaauuc cagaaagcgg agaccauccc cgugcuucac
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gagacccugc uggacaaauu cuauacagaa cucuaucagc agcugaacga ucuggaggcc
uguguuaucc aggggguagg ugugaccgaa accccucuua ugaaggaaga uuccauccug
gccguuagga aauacuucca gcgcaucaca uuguaccuga aggagaaaaa guacagcccu
ugcgcauggg agguggucag agcugaaauc augcgaucau uuagucucag uacuaaucuc
caagagucac ugcgcuccaa ggaguaa
auggcccuga ccuucgcccu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugc
agcgugggcu gcgaccugcc ccagacccac agccugggca gccgccgcac ccugaugcug
cuggcccaga ugcgcaagau cagccuguuc agcugccuga aggaccgcca cgacuucggc
uucccccagg aggaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agaccauccc cgugcugcac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc agcaccaagg acagcagcgc cgccugggac
gagacccugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaacga ccuggaggcc
ugcgugaucc agggcguggg cgugaccgag accccccuga ugaaggagga cagcauccug
gccgugcgca aguacuucca gcgcaucacc cuguaccuga aggagaagaa guacagcccc
ugcgccuggg agguggugcg cgccgagauc augcgcagcu ucagccugag caccaaccug
caggagagcc ugcgcagcaa ggaguaa
auggchyuba cvuuygchyu byusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwsywshugy
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshcubgghw shmgvmgvac byukaugcus
yubgchcara ugmgsaarau ywsycuguuc wshugycusa argaymgvca ygayuuyggh
uuycchcarg argaruuygg vaaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay
garaugauyc arcarauhuu yaaycukuuy wshachaarg aywsywshgc ygcnugggay
garachcusc ubgayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn
ugygubauyc arggnguvgg ngusacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus
gcvgunmgva aruayuuyca rmgvauyacv yukuayyuka argaraaraa ruaywsyccn
ugygcmuggg argubgunmg vgcygarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus
cargarwsmy ubmgvwsmaa rgarurr
auggchyuba cvuuygchyu byusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwsywshugy
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshyubgghw shmgvmgvac byukaugcub
yubgchcara ugmgvaarau ywsycukuuc wshugyyusa argaymgvca ygayuuyggh
uuycchcarg argaruuygg naaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay
garaugauyc arcarauhuu yaaycukuuy wshachaarg aywsywshgc ygcnugggay
garachcubc ubgayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn
ugygubauyc arggngungg ngubacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus
gcvgunmgva aruayuuyca rmgvauyacv yukuayyuka argaraaraa ruaywsyccn
ugygcmuggg argubgunmg vgcygarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus
cargarwsmy ubmgvwsmaa rgarurr
auggchyuba cvuuygchyu nyusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwshwshugy
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshyubgghw shmgvmgvac byukaugcub
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uuycchcarg argaruuygg naaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay
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garachcubc ungayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn
ugygubauhc arggngungg ngubacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus
gcngunmgva aruayuuyca rmgvauyacn yubuayyuka argaraaraa ruaywsyccn
ugygcmuggg argubgunmg vgchgarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus
cargarwshy unmgvwshaa rgarurr
MALTFALLVA LLVLSCKSSC SVGCDLPQTH SLGSRRTLML LAQMRKISLF SCLKDRHDFG FPQEEFGNQF
QKAETIPVLH EMIQQIFNLF STKDSSAAWD ETLLDKFYTE LYQQLNDLEA CVIQGVGVTE TPLMKEDSIL
AVRKYFQRIT LYLKEKKYSP CAWEVVRAEI MRSFSLSTNL QESLRSKE
gggagacata aaccctggcg cgctcgcggc ccggcactct tctggtcccc acagactcag
agagaaccca cc
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc
ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc aaaaaaaaaa
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
auggccuuga ccuuugcuuu acugguggcc cuccuggugc ucagcugcaa gucaagcugc
ucugugggcu gugaucugcc ucaaacccac agccugggua gcaggaggac cuugaugcuc
cuggcacaga ugaggagaau cucucuuuuc uccugcuuga aggacagaca ugacuuugga
uuuccccagg aggaguuugg caaccaguuc caaaaggcug aaaccauccc uguccuccau
gagaugaucc agcagaucuu caaucucuuc agcacaaagg acucaucugc ugcuugggau
gagacccucc uagacaaauu cuacacugaa cucuaccagc agcugaauga ccuggaagcc
ugugugauac aggggguggg ggugacagag acuccccuga ugaaggagga cuccauucug
gcugugagga aauacuucca aagaaucacu cucuaucuga aagagaagaa auacagcccu
ugugccuggg agguugucag agcagaaauc augagaucuu uuucuuuguc aacaaacuug
caagaaaguu uaagaaguaa ggaauga
auggcccuga ccuucgcccu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugc
agcgugggcu gcgaccugcc ccagacccac agccugggca gccgccgcac ccugaugcug
cuggcccaga ugcgccgcau cagccuguuc agcugccuga aggaccgcca cgacuucggc
uucccccagg aggaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agaccauccc cgugcugcac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc agcaccaagg acagcagcgc cgccugggac
gagacccugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaacga ccuggaggcc
ugcgugaucc agggcguggg cgugaccgag accccccuga ugaaggagga cagcauccug
gccgugcgca aguacuucca gcgcaucacc cuguaccuga aggagaagaa guacagcccc
ugcgccuggg agguggugcg cgccgagauc augcgcagcu ucagccugag caccaaccug
caggagagcc ugcgcagcaa ggaguaa
auggcccuga cauucgcucu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugu
agcgugggcu gcgaccugcc ucagacacac agccugggca gcagacggac ccugaugcug
cuggcccaga ugcggagaau cagccuguuc agcugccuga aggaccggca cgacuucggc
uucccucagg aagaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agacaauccc cgugcugcac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc uccaccaagg acagcagcgc cgccugggac
gagacacugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaauga ccuggaagcc
ugcgugaucc agggcguggg cgugacagag acaccccuga ugaaggaaga uagcauccug
gccgugcgca aguacuucca gcggaucacc cuguaccuga aagagaagaa guacagcccc
ugcgccuggg aggucgugcg ggccgagauc augagaagcu ucagccugag caccaaccug
caggaaagcc ugcggagcaa agaguga
auggcuuuga cauucgcacu guuggucgcc cugcuugugc ucucaugcaa aagcaguugu
uccguggguu gcgauuugcc acagacucac agucugggau cucgccgcac ucugaugcuu
cucgcgcaaa ugcgccggau uagucuuuuc uccugucuga aggauagaca cgacuuuggg
uuuccccagg aggaguuugg gaaucaguuc caaaaggcgg aaacuauucc uguccuucac
gaaaugaucc agcagauauu uaauuuguuc ucaacaaaag auucaucagc ugcaugggac
gaaacccugc uggauaaguu cuacacggag cucuaccagc agcugaauga ucucgaagcc
ugugucaucc agggcguagg agugacagaa accccacuga ugaaggagga uucaauccug
gcggugagga aguauuucca gcggaucacc cuguaucuga aggaaaagaa guauucccca
ugugcuuggg aggugguccg agcagagauc augaggagcu ucucucucuc aacaaaucug
caggagaguc uuagguccaa ggaguga
auggcucuca cuuucgcacu ccucguggca cugcuugugc uguccugcaa aaguucuugc
agcguggggu gcgaccuccc acagacccac ucacuggggu caaggcgcac ccugaugcug
cuggcccaga ugagacgaau uucccuguuu uccugccuca aggaucggca ugacuucggc
uuuccccaag aggaguucgg caaccaguuc cagaaagccg agaccauccc ugugcugcau
gagaugaucc agcaaauauu caaucucuuu uccaccaagg acagcuccgc cgccugggau
gagacauugc ucgauaaguu uuauacugaa cuguaccagc agcugaacga ucuugaggcc
uguguaauac aggguguagg cgugacagag accccccuua ugaaggagga cucaauucug
gcagucagga aauauuucca gcggauaacu cuguaccuga aggagaaaaa guauagucca
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マウス3T3線維芽細胞およびヒトB.J.皮膚線維芽細胞のトランスフェクション:
トランスフェクションのために、マウス3T3線維芽細胞およびヒトB.J.皮膚線維芽細胞を12ウェルプレートに4-6x104細胞/ウェルで播種した。完全なEMEMまたはDMEM培地(Gibco、Thermo Fisher、USA)で24時間インキュベートした後、培地を交換した。TransIT mRNAトランスフェクション試薬(Mirus Bio;製造業者の指示に従う複合体形成)と複合した異なるIVT mRNA製剤を調製し、細胞に加えた。トランスフェクション後24時間で培地を完全なDMEMに交換した。結果を評価するまで毎日培地を交換しながら、細胞を最大5日間標準条件下でさらに培養した。
ブタから全厚のブタ皮膚皮弁を死後に単離し(試料は現行の国内法(すなわちTierversuchsgesetz 2012、TVG 2012)に完全に準拠して取得される)、OcteniseptR消毒剤(Schuelke+Mayr GmbH、ドイツ)を使用して消毒した。
ブタから全厚のブタ皮膚皮弁を死後に単離し(試料は現行の国内法(すなわちTierversuchsgesetz 2012、TVG 2012)に完全に準拠して取得される)、OcteniseptR消毒剤(Schuelke+Mayr GmbH、ドイツ)を使用して消毒した。パンチ生検(直径6または8mm)を全層の皮膚弁から採取し、皮下脂肪を除去し、生検を2つの部分に切断した。すぐに切断生検を表皮を上にして、5mLディスパーゼII消化液(約2.5単位/mL;ディスパーゼII; Sigma Aldrich、USA)を含む9cm(直径)ペトリ皿に移した。その後の消化を4℃で一晩行った。ディスパーゼII消化液は、ディスパーゼIIストック溶液(50mM HEPES/150mM NaCl中に10mg/mL;pH-7.4)を1xDMEM(Gibco)で1:2に希釈し、1xペニシリン/ストレプトマイシンを添加して調製した。翌日、ピンセットを使用して表皮シートを下にある真皮から除去し、短い(5分間)洗浄ステップのためにDMEMに移した。続いて、シートを完全なDMEM培地に入れ、24ウェル培養プレートでトランスフェクションを行うまで37℃/5%CO2でインキュベートした(6~8時間)。ブタ表皮シートのトランスフェクションは、eGFP IVTmRNA(AmpTec、ドイツ)またはIFNa用のIVT mRNAコンストラクト(例えば、配列番号1~5および配列番号53)を使用して行った。mRNAは、製造元の指示に従ってTransITR-mRNAトランスフェクションキット(Mirus BioTM)またはリポソーム製剤(Polymun、オーストリア)を使用して製剤した。5/1(μg/μg)の脂質/RNA比を使用して、リポソーム製剤を調製した。トランスフェクション用のリポプレックス溶液はすべて0.1μg~10μg mRNA/mL DMEM培地を含み、表皮シートを1~3日間培養した。
ヒトB.J.細胞およびマウス3T3線維芽細胞を、TransIT mRNAトランスフェクション試薬と複合した0.1~1μg IFNa2 IVT mRNAを使用してトランスフェクションした。Tri-Reagent(Thermo Fisher、USA、製造元の指示)を使用したトランスフェクション後のさまざまな時点で、マウスおよびヒト線維芽細胞またはブタ上皮シートから全細胞RNAを単離し、mRNAを従来のRT-PCR(Protoscript First Strand cDNA合成キット、New England Biolabs、メーカーの指示に従って)によりcDNAに逆転写した。次に、cDNA試料を従来のPCRおよびqPCRにかけた。使用したプライマーは、Invitrogenから入手した。
TransIT mRNAトランスフェクション試薬と複合したさまざまなIFNa2変異体の0.1~1μg IVT mRNAを使用してヒトB.J.細胞およびブタ上皮シートをトランスフェクションし、トランスフェクション後120時間まで培養した。トランスフェクションした細胞および上皮シートからの上清を、トランスフェクション後のいくつかの時点で得た。同様に、同じ時点で細胞を回収し、タンパク質を抽出した。細胞抽出緩衝液(10mM HEPES、10mM KCl、0.1μM EDTA、0.3%NP40およびRoche Protease Inhibitor、製造元のプロトコルに従う)を用い、タンパク質を抽出した。上清および細胞抽出物におけるIFN-αの測定を、ヒトIFN-α(サブタイプ2;IFNa2)ELISA developmentキット(MABTECH AB、スウェーデン、製造元の指示に従う)を使用して行い、測定はInfinite 200 PROマルチモードリーダー(Tecan AG、スイス)で行った。
無傷のブタ皮膚外植片およびブタ上皮シートを、TransIT mRNAトランスフェクション試薬または異なるリポソーム担体と複合した、または複合していない(生理学的緩衝液中の「裸」)0.1~10μg eGFP IVT mRNAを使用してトランスフェクションし、トランスフェクション後24時間培養した。試料を回収し、細胞抽出緩衝液(10mM HEPES、10mM KCl、0.1μM EDTA、0.3%NP40、およびRoche Protease Inhibitor、製造元のプロトコルに従う)を用いてタンパク質を抽出した。GFPインビトロSimpleStepELISARキット(Abcam Plc., UK、製造元の指示に従う)を使用してeGFPの決定を行い、Infinite 200 PROマルチモードリーダー(Tecan AG、スイス)で測定を行った。
生検の全組織標本βガラクトシダーゼ(bGal)染色を、24ウェル培養プレートで24時間または48時間、37℃で行った。正の染色対照を、ブタ皮膚にbGal酵素(1U組換えbGalタンパク質/注射)を皮内注射することにより生成した。染色手順を開始する前に、生検を室温で1時間4%ホルムアルデヒド溶液(PBS)で穏やかに固定した。固定後、試料をPBS(3x)で洗浄し、続いてLacZ洗浄緩衝液(PBSに溶解した2mM MgCl2、0.01%デオキシコール酸Naおよび0.02%NP-40)で平衡化した。LacZ緩衝液で平衡化した後、試料を一晩(4°C)貯蔵した。その後、試料を37℃の染色溶液中でインキュベートし、呈色反応をモニターした。染色溶液を新たに調製し(LacZ緩衝液中の5mM K4Fe(CN)6および5mM K3Fe(CN)6)、1mg/mLの5-ブロモ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド(Bluo-Gal)を発色基質として加えた。染色を48時間行う場合、染色溶液を24時間後に置き換えた。染色量は一般に0.5 mL/ウェルであった。LacZ洗浄緩衝液および3xPBSで洗浄することにより、染色を停止した。その後、試料を緩衝4%ホルムアルデヒド溶液で一晩固定し、標準的な組織学のためにさらに処理するか、あるいはその後の組織学的分析のためにOCTで凍結した。
全層のヒト皮膚の皮弁を、標準的な審美および再建外科処置から取得し(試料は現在の国内法に完全に準拠して取得される)、OcteniseptR消毒剤(Schuelke+Mayr GmbH、ドイツ)を使用して消毒した。
微粒子銃トランスフェクションには、BioRad Helios遺伝子銃システムを使用し、ヒト皮膚外植片まで2.5cmの距離で400psiのヘリウムガス圧を使用して、eGFP-mRNAコーティング金粒子(1μg/μlのeGFP-mRNAをローディングした1.6μm金マイクロキャリア)を8mmのヒト皮膚外植片にローディングした。外植片は、5%CO2の気液界面で、αMEM+10%pHPL培地で24時間維持した。生検を4%パラホルムアルデヒド中、4℃で一晩固定し、10μmの凍結切片を得た。GFP抗体(抗GFP、ニワトリIgY)を用い、Alexa Fluor 488結合ロバ抗ニワトリIgY抗体により検出した。Alexa Fluor 568ファロイジンを使用してF-アクチンを染色することにより細胞骨格を検出し、対比染色のためにDAPI(4',6-ジアミジン-2-フェニルインドール)を含むRoti-mount Fluor Care DAPIにスライドをマウントした。スライドを、Olympus Slidescanner VS-120-L 100-Wシステムによって20倍の倍率でスキャンした。(A、B)のスケールバー=500μm;(C-L)のスケールバー=50μm
すべての動物実験は、University Clinic for Swine(ウィーン獣医大学)でのみ実施され、ブタ(混合品種;Edelschwein x Pietrain)を使用してオーストリア動物実験法(TVG2012)に従って実施された。実験はウィーン獣医大学およびオーストリア連邦教育科学研究省の動物実験倫理委員会によって承認され、承認番号:GZ68.205/0192-WF/V/3b/2017の下で実施された。実験開始時のブタは30kg~50kgであった。計画された注射の前日に、皮膚の刺激を可能な限り避けるため、すべての豚の脇腹をできるだけ広く慎重に剃る。注射の日に、ブタに麻酔をかける。注射の前に、剃毛した皮膚領域を温水で徹底的に洗浄し、Octenisept(Schuelke+Mayr GmbH、ドイツ)で2回消毒する。皮内注射は、インスリン注射器(BD Micro-FineTM+)を用いて30μLを注射した。注射スポットは適切なマーカー(SecurlineRLaboratory Markers)で明確にマークが付され、注射スキームに従って標識される。試料分析のため、注射後24時間および48時間で深い麻酔下、訓練を受けた人員によりブタを安楽死させた。すべての注射スポットを含む皮膚弁を切除し、すぐに氷上に置いた。標識された領域からのブタ皮膚生検を、10mmパンチ生検を使用して採取した。試料を、白い96ウェルプレート(MicroWellTM、Nunc)に入れた100μLのダルベッコ変法イーグル培地、DMEM、高グルコース(Gibco)に回収した。試料を直接ルシフェラーゼ活性測定にかけた。ホタルLucワンステップグローアッセイキット(Thermo Scientific、米国、製造元の指示に従う)を使用して測定を行い、Infinite 200 PROマルチモードリーダー(Tecan AG、スイス)で分析した。
IFNa2 mRNA変異体が長期間にわたってヒト皮膚線維芽細胞で安定であるかどうかを評価するため、配列番号1~5をコードする異なるmRNAを使用してB.J.細胞をトランスフェクションした。RNAを異なる時点(トランスフェクション後24~120時間)で単離し、トランスフェクションした細胞内のmRNAの存在を非定量的RT PCRによりトランスフェクション後120時間まで測定した。
ヒトシステムでの最適な翻訳効率のためのコドン最適化(コドン適応指数、CAIによって決定される)およびIFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)でのGC含量の同時増加がヒト皮膚線維芽細胞においてヒトIFNa2aタンパク質の発現を変化させるかどうかを評価するため、BJ線維芽細胞を異なるIFNa2a mRNA変異体でトランスフェクションした。配列番号1、2、3および5をコードするmRNAを使用して、BJ細胞をトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)における閾値よりも低いGC含量(49.5%)および低CAIレベル(すなわち、CAI<0.8)について、差異的な(differential)コドン最適化の効果を評価した。BJ線維芽細胞を、上記のように、天然(配列番号1)ならびにCAI<0.8および/またはGC含量<49.5%を示す変異体(例えば:配列番号4)でトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
ヒトシステムでの最適な翻訳効率のためのコドン最適化(コドン適応指数、CAIによって決定される)およびIFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)でのGC含量の同時増加がブタの皮膚においてヒトIFNa2aタンパク質の発現を変化させるかどうかを評価するため、ブタの皮膚に由来する上皮シートを異なるIFNa2a mRNA変異体でトランスフェクションした。配列番号1、2、3および5をコードするmRNAを使用して、上皮シートをトランスフェクションした。TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。その後、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後72時間まで測定した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)における閾値よりも低いGC含量(49.5%)および低CAIレベル(すなわち、CAI<0.8)について、差異的なコドン最適化の効果を評価した。ブタ上皮シートを、上記のように、天然(配列番号1)ならびにCAI<0.8および/またはGC含量<49.5%を示す変異体(例えば:配列番号4)でトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後72時間まで測定した。
この実施例では、実施例4および5で行った実験のトランスフェクション効率について、eGFP発現を正の対照として経時的にモニターした。
この実施例では、別のトランスフェクション製剤によって誘導されたeGFP発現を経時的にモニターした。
mRNA変異体がin situで哺乳動物の皮膚にトランスフェクションできるかどうかを評価するため、ブタの皮膚から得られたパンチ生検を異なるLacZ mRNA製剤でトランスフェクションした。この実施例では、皮内トランスフェクションにより誘導されたLacZ発現を、トランスフェクション後24時間での全組織標本β-ガラクトシダーゼ染色によりモニターした。
mRNA変異体がin situで哺乳動物の皮膚にトランスフェクションできるかどうかを評価するため、ブタの皮膚から得られたパンチ生検を異なるeGFP mRNA製剤でトランスフェクションした。この実施例では、皮内トランスフェクションにより誘導されたeGFP発現を、トランスフェクション後24時間で得られた組織抽出物からのeGFPタンパク質ELISAによりモニターした。これらの線に沿って、eGFP mRNAのさまざまな製剤を製造し、注射した(詳細については表6を参照)。
IFNa2 mRNA変異体がマウス線維芽細胞で長期間にわたって安定であるかどうかを評価するため、配列番号1~5をコードする異なるmRNAを用いて3T3細胞をトランスフェクションした。RNAを異なる時点(トランスフェクション後24~120時間)で単離し、トランスフェクションした細胞内のmRNAの存在を非定量的RT PCRによりトランスフェクション後120時間まで測定した。
ヒトシステムでの最適な翻訳効率のためのコドン最適化(コドン適応指数、CAIによって決定される)およびIFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)でのGC含量の同時増加がヒト皮膚線維芽細胞においてヒトIFNa2aタンパク質の発現を変化させるかどうかを評価するため、3T3線維芽細胞を異なるIFNa2a mRNA変異体でトランスフェクションした。配列番号1、2、3および5をコードするmRNAを使用して、3T3線維芽細胞をトランスフェクションした。その後、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)における閾値よりも低いGC含量(49.5%)および低CAIレベル(すなわち、CAI<0.8)について、差異的なコドン最適化の効果を評価した。3T3線維芽細胞を、上記のように、天然(配列番号1)ならびにCAI<0.8および/またはGC含量<49.5%を示す変異体(例えば:配列番号4)でトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
ヒトシステムでの最適な翻訳効率のためのコドン最適化(コドン適応指数、CAIによって決定される)およびIFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)でのGC含量の同時増加がブタ皮膚においてヒトIFNa2aタンパク質の発現を変化させるかどうかを評価するため、ブタ皮膚からの上皮シートを異なるIFNa2a mRNA変異体でトランスフェクションした。配列番号1、2、3および5をコードするmRNAを使用して、上皮シートをトランスフェクションした。TransIT単独を対照として使用した。その後、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後72時間まで測定した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体の発現レベルに対する修飾ヌクレオチド(例えば、プソイドUおよびm5C)の効果を評価する。ブタ上皮シートを、上記のように、2つの形態の天然(配列番号1)IVT mRNA:一つはUをプソイドUで、Cを5mCで100%置換したもの、一つは修飾ヌクレオチドのないもの、ならびにCAI>0.8および/またはGC含量<49.5%を示す2つの形態のIFNa変異体(配列番号3)(例えば、一つはUをプソイドUで、Cを5mCで100%置換した配列番号3の変異体、一つは修飾ヌクレオチドのないもの)でトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後24時間まで測定した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体の発現レベルに対する修飾ヌクレオチド(例えば、プソイドUおよびm5C)の効果を評価する。ヒトBJ線維芽細胞を、上記のように、2つの形態の天然(配列番号1)IVT mRNA:一つはUをプソイドUで、Cを5mCで100%置換したもの、一つは修飾ヌクレオチドのないもの、ならびにCAI>0.8および/またはGC含量<49.5%を示す2つの形態のIFNa変異体(配列番号3)(例えば、一つはUをプソイドUで、Cを5mCで100%置換した配列番号3の変異体、一つは修飾ヌクレオチドのないもの)でトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。続いて、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後24時間~120時間まで測定した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。n=5の異なるドナーからのヒト皮膚生検を、Helios遺伝子銃システムを用い、上記のように、完全にヒトのIFNa(配列番号53)、ならびに天然IFNaコード配列(CDS;配列番号1)またはCDS変異体(配列番号2,3,5)を含むIVT mRNAで微粒子銃トランスフェクションした。トランスフェクションしていない皮膚およびeGFP IVT mRNAでトランスフェクションした皮膚を対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後24時間まで測定した。
この実施例では、ヒトの皮膚におけるeGFPタンパク質の発現と局在性を評価した。eGFP IVT mRNAを備えたHelios遺伝子銃システムを用い、異なるドナーからのヒト皮膚生検を微粒子銃トランスフェクションした。空の金粒子で処理した皮膚を対照として使用した。続いて、トランスフェクション後24時間で生検を4%パラホルムアルデヒドで固定し、10μmの凍結切片でeGFP特異的免疫蛍光分析を実施した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列(CDS)におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。n=5の異なるドナーからのヒト皮膚生検を、Helios遺伝子銃システムを用い、上記のように、完全にヒトのIFNa(配列番号53)、ならびにCDS変異体(配列番号4)を含むIVT mRNAで微粒子銃トランスフェクションした。トランスフェクションしていない皮膚およびeGFP IVT mRNAでトランスフェクションした皮膚を対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後24時間まで測定した。
この実施例では、カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション製剤により誘導されるインビボホタルルシフェラーゼ(FLuc)発現を経時的にモニターした。ルシフェラーゼ活性を検出するため、上記のように、ブタ(約45kg、混合品種;Edelschwein x Pietrain)に2種類の異なるmRNA用量:1ng/μl(すなわち、0.03μg/用量)および3.3ng/μl(すなわち:0.1μg/用量)のmRNAならびに非複合mRNA(3.3ng/μl;すなわち:0.1μg/用量)を皮内注射した。天然の非トランスフェクション臓器試料(すなわち、皮膚生検)をバックグラウンド対照として使用した。その後、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションした組織を、トランスフェクション後24時間および48時間で直接活性測定によりモニターした。分析のため、注射部位を単離し、得られた生検材料をFirefly Luc One-Step Glow Assay Kitにかけた。トランスフェクションの成功は、生物発光によって検出された(検出:相対発光量(RLU))。
1.5'CAP領域、5'非翻訳領域(5'-UTR)、ヒトIFN-αをコードするコード領域、3'非翻訳領域(3'-UTR)およびポリアデノシンテール(ポリAテール)を有する、ヒト患者の非メラノーマ皮膚癌(NMSC)の予防および治療での使用のためのインターフェロンアルファ(IFN-α)メッセンジャーRNA(mRNA)。
- シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および/または
- アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される
態様1~7のいずれか1に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換される
態様1~8のいずれか1に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- 態様1~23のいずれか1に記載の使用のためのIFN-α mRNA、および
- 皮膚送達装置
を含む、キット。
Claims (35)
- 5'CAP領域、5'非翻訳領域(5'-UTR)、ヒトIFN-αをコードするコード領域、3'非翻訳領域(3'-UTR)およびポリアデノシンテール(ポリAテール)を有する、ヒト患者の非メラノーマ皮膚癌(NMSC)の予防および治療での使用のためのインターフェロンアルファ(IFN-α)メッセンジャーRNA(mRNA)であって、ここで5'-UTRおよび/または3'-UTRが、少なくとも1つの安定化配列を含む、および/または、ここで5'-UTRおよび/または3'-UTRが、アルファグロビン、ベータグロビン、アルブミン、リポキシゲナーゼ、ALOX15、アルファ(1)コラーゲン、チロシンヒドロキシラーゼ、リボソームタンパク質32L、真核生物伸長因子1a(EEF1A1)、オルソポックスウイルスに存在する5’-UTR要素、およびこれらの混合物からなる群より選択される、IFN-αとは異なるヒトmRNAの5'-UTRおよび/または3'-UTRである、IFN-α mRNA。
- NMSCが、光線角化症(AK)、基底細胞癌(BCC)または扁平上皮癌(SCC)である、請求項1に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- NMSCが、AKである、請求項2に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- IFN-α1型mRNA(IFNa1)、IFN-α2a型mRNA(IFNa2a)、およびIFN-α2b型mRNA(IFNa2b)からなる群より選ばれる、請求項1~3のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- ポリAテールが、少なくとも100個のアデノシン一リン酸を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- ポリAテールが、少なくとも120個のアデノシン一リン酸を含む、請求項5に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- 安定化配列が、一般式:(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(配列番号38)(式中、「x」は、NxおよびPyxで独立して、0~10、好ましくは0~5、特に0、1、2、4および/または5の整数である)で表される、請求項1~6のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- 5'-UTRおよび/または3'-UTRが、アルファグロビン、ベータグロビン、アルファ(1)コラーゲン、およびこれらの混合物からなる群より選択される、IFN-αとは異なるヒトmRNAの5'-UTRおよび/または3'-UTRである、請求項7に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- 少なくとも5%の
- シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および/または
- アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される
請求項1~8のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。 - 少なくとも10%の
- シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および/または
- アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される
請求項9に記載の使用のためのIFN-α mRNA。 - 少なくとも30%の
- シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および/または
- アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される
請求項10に記載の使用のためのIFN-α mRNA。 - 少なくとも50%の
- シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および/または
- シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および/または
- ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および/または
- アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される
請求項11に記載の使用のためのIFN-α mRNA。 - GC/AU比が、少なくとも49.5%である、請求項1~12のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- GC/AU比が、少なくとも49.6%である、請求項13に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- GC/AU比が、少なくとも50%である、請求項14に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- GC/AU比が、少なくとも55%である、請求項15に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- GC/AU比が、少なくとも60%である、請求項16に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- コドン適応指数(CAI)が少なくとも0.8である、請求項1~17のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- コドン適応指数(CAI)が少なくとも0.9である、請求項18に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- IFN-α mRNAのコード領域が
- ヒトIFNa2aをコードするか、および/または
- ヒトIFNa2bをコードするか、および/または
- ヒトIFNa1をコードする、請求項1~19のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。 - IFN-α mRNAのコード領域が
- ヒトIFNa2aをコードし、配列番号12であるか、および/または
- ヒトIFNa2bをコードし、配列番号26であるか、および/または
- ヒトIFNa1をコードし、配列番号36である、請求項20に記載の使用のためのIFN-α mRNA。 - IFN-α mRNAのコード領域が
- ヒトIFNa2aをコードし、配列番号2、3、5、6、7、8、9、10、または11であるか、および/または
- ヒトIFNa2bをコードし、配列番号19、20、22、または25であるか、および/または
- ヒトIFNa1をコードし、配列番号29、30、31、32、34、または35である、請求項20に記載の使用のためのIFN-α mRNA。 - 皮下、皮内、経皮、表皮、または局所に投与される、請求項1~22のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- 表皮に投与される、請求項23に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載のIFN-α mRNAを含む、NMSCの予防および治療での使用のための医薬製剤。
- AK、BCCまたはSCCの予防および治療での使用のためのものである、請求項25に記載の使用のための医薬製剤。
- AKの予防および治療での使用のためのものである、請求項26に記載の使用のための医薬製剤。
- 薬学的に許容される担体を含む、請求項25~27のいずれか1項に記載の使用のための医薬製剤。
- 薬学的に許容される担体が、ポリマーベースの担体;脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、カチオン性両親媒性脂質、SAINT-Lipids、天然および合成由来のエキソソーム、天然、合成および半合成の層状体、ナノ粒子、リンケイ酸カルシウムナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、乾燥粉末、ポリ(D-アルギニン)、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、エマルジョン、ゾルゲル、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ペプチド結合体、ベクタータグ、またはウイルスキャプシドタンパク質である、請求項28に記載の使用のための医薬製剤。
- ポリマーベースの担体が、直鎖および分岐PEIおよびビロマーを含むカチオン性ポリマーである、請求項29に記載の使用のための医薬製剤。
- ベクタータグが、小分子標的結合体である、請求項29に記載の使用のための医薬製剤。
- ウイルスキャプシドタンパク質が、バイオナノカプセルである、請求項29に記載の使用のための医薬製剤。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNAを患者に投与するためのキットであって、
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の使用のためのIFN-α mRNA、および
- 皮膚送達装置
を含む、キット。 - 皮膚送達装置が、
- 針ベースの注射システムおよび無針注射システムからなる群から選択される皮内送達装置であるか、または
- 経皮パッチ、中空および中実マイクロニードルシステム、微細構造経皮システム、電気泳動システム、およびイオン導入システムからなる群から選択される経皮送達装置であるか、または
- 無針注射システム、レーザーベースのシステム、および遺伝子銃システムからなる群から選択される表皮送達装置である、請求項33に記載のキット。 - レーザーベースのシステムが、エルビウム(Erbium)YAGレーザーシステムである、請求項34に記載のキット。
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