JP2020515644A - 非メラノーマ皮膚癌（ｎｍｓｃ）の予防および治療 - Google Patents

非メラノーマ皮膚癌（ｎｍｓｃ）の予防および治療 Download PDF

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Abstract

本発明は、5'CAP領域、5'非翻訳領域（5'-UTR）、コード領域、3'非翻訳領域（3'-UTR）およびポリアデノシンテール（ポリAテール）を有する、非メラノーマ皮膚癌（NMSC）の予防および治療での使用のためのインターフェロンアルファ（IFN-α）メッセンジャーRNA（mRNA）およびこのIFN-α mRNAをヒト患者に投与するためのキットを開示する。

Description

本発明は、非メラノーマ皮膚癌（NMSC）の予防および治療のための組成物および方法に関する。
非メラノーマ皮膚癌（NMSC）は、世界中で最も一般的な癌の形態である。NMSCには、メラニン細胞で発生しないあらゆる形態の皮膚癌、最も顕著なものは基底細胞癌（BCC）（全NMSCの約75〜80％）および扁平上皮癌（SCC）（全NMSCの約20〜25％）が含まれまる。
光線角化症（AK）は、重要なNMSC実体である。歴史的に、それはSCCの前駆病変であると考えられていた。今日、科学界は、それが浸潤性段階に進行する可能性のある上皮内癌であることを理解している。他のNMSCとは対照的に、AKは非常に豊富である。
AKは、通常、日光にさらされた慢性的な皮膚の領域で発生する皮膚疾患である。現在、上皮内癌と考えられているAKの病態生理学的概念の変化は、細胞学のレベルではAKはSCCと区別がつかず、分子生物学のレベルではSCCと複数の類似点を共有しているという事実によって推進されている。
AKは、表皮の非定型ケラチン生成細胞の範囲に基づいて、病理組織学的に3つのグレード（AK I-III）に分類される。臨床的には、AKは通常、紅斑性基部に鱗状の斑点として現れる。触診により、サンドペーパーのような質感が明らかになる。周囲の皮膚は、毛細血管拡張症、異色症および弾性線維症を含む慢性的な日焼け（sun damage）の兆候を示す。ダーモスコピーは、鑑別診断（例えば、顔の色素性病変の診断）と臨床的グレーディングの両方をサポートする。解剖学的分布（顔、禿げ頭、首、手の甲）は、AKの発症の主要なリスク要因としての慢性的な日光曝露の重要性をさらに強調している。他のリスク因子には、高齢、男性の性別、色白の肌タイプが含まれる。免疫抑制（例：移植レシピエント）もAKのリスクを高める。UVB放射は、直接DNA損傷を引き起こし得る。その結果、p53などの腫瘍抑制タンパク質の機能が抑制される。実際、p53経路の調節不全はAK病変の発生とSCCへのさらなる進行において最も重要な役割を果たすようである。いくつかの証拠は、ヒト乳頭腫ウイルスの感染が補因子として作用することを示唆している。
AKは、広域発癌（field cancerization）の文脈で単一病変（<5）として、または複数病変（>6）として発生する（つまり、1つの身体領域またはフィールド（field）、および慢性日焼けの連続領域で少なくとも6のAK病変））。一般的な分類では、4番目のサブグループであるAKを有する免疫抑制患者を推奨している。
AKの自然史に関して入手可能なデータは、適切な治療なしでのAKの存在は、動的だが慢性的な状態であることを示している。AKから浸潤SCCへの進行のリスクは、個々の病変について10％と推定される。現在、どのAK病変がSCCに進行するかを予測することは不可能であるため、すべての場合にできるだけ早く介入することが重要である。
現在のAK療法は2つの主要なクラス：病変指向とフィールド指向に分けることができる。最も一般的な病変指向療法は、凍結手術とその後の外科的除去である。両方の病変指向方法の主な欠点は、目に見える病変にしか対処できず、損傷した領域には対処できないことである。さらに、それらの美容結果は、フィールド指向治療の結果よりも劣ると判断される。これらの理由から、臨床的に目に見える病変だけでなく、SCCへの移行を防ぐために無症状の病変も除去するために、フィールド指向療法がますます使用されている。
現在のフィールド指向療法には、イミキモド（AldaraR、ZyclaraRとして販売）、ジクロフェナク（SolarazeRとして販売）、5-フルオロウラシル（EfudixRまたはActikerallRとして販売）、インゲノールメブテート（PicatoRとして販売）などの外用剤および光線力学的治療（AmeluzR、MetvixR）が含まれる。フィールド療法は、無症状の病変に影響を及ぼす可能性がある。
これらの現行の治療法は、頻繁に家庭での使用を伴う広範な治療期間とかなりの中断時間を必要とする。これは、患者のコンプライアンスを著しく低下させ、臨床診療におけるNMSC治療の有効性を制限している。さらに、既存の治療に対するレスポンダー率（responder rates）は異なり、標準治療の後のAKの組織学的クリアランス率はフルオロウラシルの後で67%、イミキモドの後で73%の低さであると報告されている。フィールド指向療法の長期の有効性と再発率に関する情報は不足していて、印象的ではない。1年時点での再発率の範囲は10〜56％である。
これらの驚くほど低い成功率は、NMSCの治療における医学的ニーズを満たすための新しい治療パラダイムの開発を保証する。
I型インターフェロンであるインターフェロンアルファ（インターフェロンα、IFN-α、IFNa）は、抗ウイルス、抗血管新生、およびプロアポトーシス特性を示し、実証済みの治療的抗腫瘍効果を持つ重要な免疫刺激分子である。インターフェロンは、1957年に最初に記載された。IFNa遺伝子のクローニング、そしてその後、インターフェロンベータ（IFN-β；IFNb）およびインターフェロンガンマ（IFN-γ；IFNg）は、1980年代初期にのみ報告された。
1980年代には、AKおよび他のNMSCの治療に組換えIFNaタンパク質が提案された。当時、複数の報告が、BCCおよびSCCの治療に対する組換えIFNaタンパク質の安全性と有効性を主張していた。週1.5x106 IU IFNa 3xの用量で3週間にわたって繰り返し病変周囲投与を行うと、ほとんどのBCCおよびSCCに適切であることがわかった（大きな腫瘍ではより高い総用量が必要である）。
米国特許第5002764A号および米国特許第5028422A号は、組換えヒトIFNa-2タンパク質によるAKの病巣内投与治療を開示している。
さまざまなBCCサブタイプは、結節性タイプよりもIFNa療法の影響を受けやすい表在性および潰瘍性タイプで異なる反応を示すようである。ヒトBCCの治療のための組換えヒトIFNa-2bの3週間にわたる3回の病巣内投与もEP0248583B1で議論されている。
SCCは一般にBCCよりも攻撃的であり、生命を脅かす可能性がある。原発性皮膚SCCの5年全体の再発率は8％である（BCCで<0.1％と比べて）。
扁平上皮癌の病巣内IFNaを評価する研究に関する報告がいくつかある。
高用量の病巣内IFNaの頻繁かつ長期にわたる適用は、小扁平上皮癌の治療に有効である。AKについて、Edwardsと同僚は、AKを除去するために、1回の投与あたり5x105 IUの高用量の6回の病変周囲注射を報告した（Arch. Dermatol., 1986. 122(7): p.779-82）。IFNaタンパク質の低用量（注射あたり1x105、1x104 IU）は、それぞれ、in situでのAKクリアランスにおいて効果が低いことが証明された。
さまざまなタイプのNMSCの治療におけるIFNaの作用メカニズムは部分的に知られている。抗腫瘍効果は、腫瘍間質と微小環境に依存する、直接的な抗増殖効果と間接的な効果の組み合わせによるものと思われる。後者には、自然免疫系と適応免疫系の両方と腫瘍血管への影響が含まれる。カポジ肉腫および血管腫におけるIFNaの有効性は、その抗血管新生活性の臨床的関連性を示している。
IFNaはNMSC、特にAK、BCCおよびSCCで有効であることが示されているが、臨床ルーチンの治療オプションになることはなかった。理由は明らかである。治療には、数週間にわたって頻繁に（毎日または毎週3回）病変周囲注射が必要である。また、組換えIFNaタンパク質は高価であり、製剤の品質および重要なことに生物活性は異なっていた。IFNaは、遺伝子組み換えされた大腸菌株を使用した組換えDNA技術によって生産された。大腸菌による発現は高いタンパク質収率をもたらすが、製品中のさまざまな程度の非活性および活性タンパク質による治療に匹敵するレベルの生物活性を提供するために、製品を広範に精製し、効力および生物活性について試験する必要があった。
インターフェロン、特にIFNaを回避したいという現代医学の要望がある理由は、これらのタンパク質には多くの特徴的な毒性効果があるためである。副作用の4つの主要なグループが生じる：体質的、神経精神医学的、血液学的/免疫学的および肝臓の副作用。これらの副作用の多くの重篤度は、IFNタンパク質療法の用量と期間に直接関係しているようである（Bordenら、Semin Oncol, 1998. 25(1 Suppl 1): p. 3-8）。
体質的症状には、疲労、発熱、悪寒および硬直などのインフルエンザ様症状が含まれる。体質的症状は早期に、しばしば投薬後3〜6時間以内に起こる。患者はまた、頭痛、筋肉痛、不快感も経験することがある。高トランスアミナーゼ血症と好中球減少症は、治療の最初の数日以内に発生する可能性があり、用量を減らすことで制御できる。高トランスアミナーゼ血症は、適切に処理されない場合、致命的な肝毒性を引き起こす可能性がある。IFNによって患者が経験する最も頻繁な慢性症状には、疲労（70〜100％）、食欲不振（40〜70％）および神経精神障害（最大30％）が含まれる。これらの症状は用量に関連していて累積的であり、時間とともに悪化する。自己免疫毒性には、エリテマトーデス、乾癬および甲状腺機能障害の誘発が含まれる。明白なものから無症状の甲状腺機能亢進症または甲状腺機能低下症に至るまでの甲状腺機能障害は、IFNa療法を受けている患者の8〜20％で発生する。ほとんどの患者が従うパターンは、自己免疫性甲状腺炎の1つであり、甲状腺機能亢進症の後に甲状腺機能低下症が続く。
タンパク質インターフェロン、特にIFNaタンパク質を交換する必要性は、C型肝炎の治療におけるレジパスビル／ソフォスブビルの組み合わせ（Harvoniの商品名で販売）の市場での大きな成功につながった（IFNaの代わりに（リバビリンと組み合わせて））。
しかしながら、これらの商業的に成功したNMSC、特にAKの治療オプションは、治療中に重大な副作用と限られた有効性を示す：注目すべきは、特別な個人では、TLR7アゴニストであるイミキモドのような局所IFN誘導物質は、亜急性皮膚エリテマトーデスの発症などの自己免疫毒性のより懸念のあるタイプになる可能性がある。さらに、特定の個人は、TLR7に一塩基多型を保有しているため、イミキモドなどのTLR7アゴニストに対し非応答となる（Pharmacogenomics. 2015. Nov.; 16 (17): p. 1913-17）。
したがって、改善された患者のコンプライアンスと改善された副作用事象を提供するNMSCの改善された予防および治療スキームに対する医学的ニーズは依然として大きい。
現在のフィールド指向療法は、イミキモド、インゲノールメブテート、ジクロフェナク、光線力学療法（PDT）用の光増感剤およびフルオロウラシルを含む局所薬剤の異種クラスを表す。これらの最新の治療法は、標準治療後のAKの組織学的クリアランス率がフルオロウラシル後は67％、イミキモド後は73％と低く報告されている。これらの現在の最新の薬剤はすべて、NMSC/AK療法のごく直接的なメカニズム（例えば、フルオロウラシル、インゲノールメブテート、PDT）または間接的なメカニズム（イミキモド）に依存している。
最も広く使用されている治療薬の1つであるイミキモドは、自然免疫系の活性化を介して作用し、それが抗腫瘍活性を発揮する。
イミキモド投与は、一般的に病原体認識に関与するToll様受容体7（TLR7）シグナル伝達を活性化する。重要なことに、NMSCのイミキモド活性の標的細胞としての表皮角化細胞は、TLRファミリーのいくつかのメンバーを構成的に発現している。しかしながら、TLR7の発現は存在しないか、ごくわずかしか検出できない。したがって、角化細胞に対するイミキモドの直接的な影響はありそうにない。
対照的に、イミキモドの間接的な抗腫瘍機能の説得力のある証拠がある：イミキモドはTLR-7を介して先天性免疫細胞を活性化し、とりわけ、サイトカイン、主にインターフェロン-α（IFNa）、インターロイキン-6（IL-6）、および腫瘍壊死因子-α（TNF-α）の広範な分泌、および形質細胞様樹状細胞（pDC）の皮膚適用側への急速な補充をもたらす。イミキモドは、pDCの成熟と、細胞溶解性キラー細胞への変換を誘導し、この細胞溶解性キラー細胞は適応免疫系とは独立して腫瘍を排除できる。イミキモドによって活性化される他の細胞タイプには、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージが含まれる。さらに、イミキモドを局所的に皮膚に適用すると、ランゲルハンス細胞の活性化につながり、その後局所リンパ節に移動してBリンパ球を含む適応免疫系を活性化するという説得力のある証拠もある。
NMSC、BCC、SCC、および特にAKの異常細胞に対するイミキモドの単なる間接効果またはフルオロウラシル、インゲノールメブテートおよびPDTの単なる直接効果とは対照的に、IVT mRNAを介したIFNaタンパク質の発現は、影響を受ける細胞（例：正常にトランスフェクションされ、IFNaを発現しているケラチン生成細胞）に特定の直接および間接効果を発揮する。IFNaは、IFN刺激遺伝子（ISG）と呼ばれる遺伝子のサブセットの誘導から生じる腫瘍細胞のアポトーシス、増殖、または細胞分化に直接影響することが知られている。抗血管新生、免疫調節および細胞周期阻害効果に関係するISGに加えて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ研究により、アポトーシス機能を備えたISGが同定された。これらには、TNF-α関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL/Apo2L）、Fas/FasL、XIAP関連因子-1（XAF-1）、カスパーゼ-4、カスパーゼ-8、dsRNA活性化プロテインキナーゼ（PKR）、2'5'Aオリゴアデニル酸合成酵素（OAS）、細胞死活性化プロテインキナーゼ（DAPキナーゼ）、リン脂質スクランブラーゼ、ガレクチン9、IFN調節因子（IRF）、前骨髄球性白血病遺伝子（PML）、およびIFN誘導死の調節因子（RID）が含まれる。注目すべきことに、IFNaは、イミキモドの抗腫瘍活性の発揮（excerting）に関与する主要な要因の1つであると現在期待されているため、免疫調節剤によって発揮される（excerted）間接的な抗腫瘍活性も活用する。
したがって、IVT mRNAベースのIFNa発現は、いくつかの抗腫瘍戦略（直接および間接）を同時に活用することにより、NMSC、BCC、SCCおよび特にAKの治療における現在の最先端技術を変える可能性を示している。具体的には、標的細胞における直接的なIFNa活性、および免疫調節剤を使用した現在の最先端のアプローチとして、自然免疫系の細胞の活性化およびその後の抗腫瘍活性。そうすることにより、そのような二重戦略は有効性を高め、および/または治療に反応する患者のサブセットを拡大するため、治療の全体的な活動を強化することが容易に想像できる。
本発明のさらなる目的は、容易に逆にでき（reversible）、患者の身体に全体として深刻な影響（すなわち、治療による（有害な）全身的結果）を与えない方法を提供することである。さらに、通常患者に伴う負担なしにサイトカイン治療を提供し、治療効率、レスポンダー率、および患者コンプライアンスを向上させることが望まれる。
したがって、上記で要約した現在の治療オプションの制限を克服するために、本発明は、非メラノーマ皮膚癌（NMSC）の予防および治療のためのインターフェロンアルファ（IFN-α）メッセンジャーRNA（mRNA）を提供し、該mRNAは、5'CAP領域、5'非翻訳領域（5'-UTR）、コード領域、3'非翻訳領域（3'-UTR）およびポリアデノシンテール（ポリAテール）を有する。
図１は、ヒトBJ細胞のトランスフェクション後24〜120時間でのIVT mRNAのRT-PCRベースの検出を示す（24〜120h：トランスフェクション後24〜120時間で採取した試料；0μg：TransITのみで処理し、トランスフェクション24時間後に回収した細胞；H2O：cDNAを含まない負の対照；pos. Control：細胞RNAおよびIVT mRNA変異体からのcDNA；empty cells：非トランスフェクションBJ線維芽細胞）。
図２は、コドンおよびGC含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、ヒトBJ線維芽細胞でヒトIFNa2aタンパク質の増大した発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ；ctrl：緩衝液のみ；A：トランスフェクション後24時間での分析；B：トランスフェクション後72時間での分析）。
図３は、コドンおよびAU含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、ヒトBJ線維芽細胞でヒトIFNa2aタンパク質の低い発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ；ctrl：緩衝液のみ；A：トランスフェクション後24時間での分析；B：トランスフェクション後72時間での分析）。
図４は、コドンおよびGC含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、ブタ皮膚上皮シートでヒトIFNa2aタンパク質の増大した発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ；ctrl：緩衝液のみ；A：トランスフェクション後24時間での分析；B：トランスフェクション後48時間での分析）。
図５は、コドンおよびAU含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、ブタ皮膚上皮シートでヒトIFNa2aタンパク質の低い発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ；ctrl：緩衝液のみ；A：トランスフェクション後24時間での分析；B：トランスフェクション後48時間での分析）。
図６は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬を使用したブタ上皮シートのEGFP mRNAトランスフェクションがブタ皮膚上皮シートでeGFP発現を誘導することを示す（A：リポソームのみをトランスフェクションしたブタ皮膚；B：TransITで製剤した0.5μg/ml eGFP IVTm RNAをトランスフェクションしたブタ皮膚；C：TransITで製剤した1μg/ml eGFP IVTm RNAでトランスフェクションしたブタ皮膚）。
図７は、mRNA/リポソーム複合体を使用したブタ上皮シートのEGFP mRNAトランスフェクションがブタ皮膚上皮シートでeGFP発現を誘導することを示す（A：リポソームのみでトランスフェクションしたブタ皮膚；B：リポソームで製剤した2μg/ml eGFP IVTm RNAでトランスフェクションしたブタ皮膚；C：リポソームで製剤した10μg/ml eGFP IVTm RNAでトランスフェクションしたブタ皮膚）。
図８は、LacZ IVT mRNAのトランスフェクション後24時間でのブタ皮膚外植片での全組織標本β-ガラクトシダーゼ（bGal）活性の検出を示す（A：Rnase阻害剤なしでDOTAPリポソームのみでトランスフェクションしたブタ皮膚；B：Rnase阻害剤なしのDOTAPリポソームで製剤化した5μg LacZ IVTm RNAでトランスフェクションしたブタ皮膚；C：DOTAPリポソームのみ+Rnase阻害剤でトランスフェクションしたブタ皮膚；D：Rnase阻害剤なしのDOTAPリポソームで製剤化した5μg LacZ IVTm RNAでトランスフェクションしたブタ皮膚；トランスフェクションの成功は、それぞれBとDの丸で囲まれた領域で強調表示されている）。
図９は、eGFP IVT mRNAのトランスフェクション後24時間でのブタ皮膚外植片でのeGFP発現の検出を示す（untreated：未処理生検；LNP ctrl：LNP対照で処理したブタ皮膚；eGFP-LNP：mRNA-Lipid-Nano Particlesでトランスフェクションしたブタ皮膚（濃度表示：2.4μg eGFP mRNA/用量）；eGFP 5μgおよびeGFP 10μg：非複合eGFP IVT-mRNAでトランスフェクションしたブタ皮膚（濃度表示：5+10μg mRNA/用量）；buffer ctrl：緩衝液のみで処理したブタ皮膚）。
図１０は、マウス3T3細胞のトランスフェクション後24〜120時間でのIVT mRNAの検出を示す（24-120h：トランスフェクション後24〜120時間で採取した試料；0.1〜1μg：トランスフェクションに使用したmRNA用量；0μg：細胞をTransITのみで処理し、トランスフェクション後24時間で回収；H2O：cDNAを含まない負の対照；ctr：マウスACTB（muACTB）を対照／参照遺伝子として使用したRT PCR対照）。
図１１は、コドンおよびGC含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、マウス3T3線維芽細胞において増大したヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ；ctrl：緩衝液のみ；A：トランスフェクション後96時間での分析；B：トランスフェクション後120時間での分析）。
図１２は、コドンおよびAU含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、マウス3T3線維芽細胞においてトランスフェクション後24時間で低いヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ；ctrl：緩衝液のみ）。
図１３は、コドンおよびGC含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、ブタ皮膚上皮シートにおいてトランスフェクション後48時間で増大したヒトIFNa2aタンパク質発現を誘発することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ）。
図１４は、UをプソイドUで、Cを5mCで100％置換したIVT mRNAが、ブタ上皮シートにおいてトランスフェクション後24〜72時間で差異的なヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；インビトロ転写には非修飾ヌクレオチドのみを使用；SEQ ID NO1_MN/SEQ ID NO：3_MN：UをPseudo-Uで、Cを5mCで完全に置換したmRNA）。
図１５は、UをプソイドUで、Cを5mCで100％置換したIVT mRNAが、ヒトBJ線維芽細胞においてトランスフェクション後24〜120時間で差異的なヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；インビトロ転写には非修飾ヌクレオチドのみを使用；SEQ ID NO1_MN/SEQ ID NO：3_MN：UをPseudo-Uで、Cを5mCで完全に置換したmRNA）。A）IVT mRNAの配列番号1とSEQ ID NO1_MNの比較；B）IVT mRNAの配列番号3とSEQ ID NO3_MNの比較。
図１６は、コドンおよびGC含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、ヒトBJ細胞においてトランスフェクション後24時間から72時間で増大したヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列）。
図１７は、コドンおよびGC含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、ブタ皮膚上皮シートにおいてトランスフェクション後24時間および48時間で増大したヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ）。
図１８は、従来のアガロースゲル電気泳動を使用した、IVT mRNA被覆金粒子（1μg/μl IVT-mRNAをローディングした1.6μm金マイクロキャリア）のローディングの制御を示す。同等のIVT mRNA量が金粒子に固定されている。
図１９は、コドンおよびGC含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNA微粒子銃トランスフェクションが、トランスフェクション後24時間でヒト皮膚からの増大したヒトIFNa2aタンパク質分泌を誘導することを示す（SeqID：各IFNa2 mRNA配列を被覆した金粒子；CTRL：非トランスフェクション皮膚からの培地；eGFP：eGFP被覆金粒子処理した皮膚からの培地）。結果は平均+/-SEMとして表示。A）5人のヒトドナーの平均；B）個々のドナー＃1の例（値：3つの生検からプールされた上清）；C）個々のドナー＃2の例（値：3つの生検からプールされた上清）
図２０は、コドンおよびGC含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNA微粒子銃トランスフェクションが、ヒト皮膚においてトランスフェクション後24時間で増大したヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：各IFNa2 mRNA配列を被覆した金粒子；CTRL：非トランスフェクション皮膚からの抽出物；eGFP：eGFP被覆金粒子処理した皮膚からの抽出物）。結果は平均+/-SEMとして表示。A）5人のヒトドナーの平均；B）個々のドナー＃1の例（値：3つの生検からプールされた上清）；C）個々のドナー＃2の例（値：3つの生検からプールされた上清）
図２１は、IVT mRNAの微粒子銃トランスフェクションが、使用したIVT mRNAによって誘導される表皮タンパク質の発現をもたらすことを示す。eGFP発現は、凍結切片の抗eGFP免疫組織化学により検出できる。（A、H、I、J、K、L）トランスフェクションされていない対照生検。（B、C、D、E、F、G）1μg/μl eGFP-mRNAで処理した生検。
図２２は、コドンおよびAU含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNAトランスフェクションが、ブタ皮膚上皮シートにおいてトランスフェクション後24時間および48時間で増大したヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：TransITと複合した各IFNa2 mRNA配列；TransIT：TransIT mRNAトランスフェクション試薬のみ）。
図２３は、コドンおよびAU含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNA微粒子銃トランスフェクションが、トランスフェクション後24時間でヒト皮膚からの増大したヒトIFNa2aタンパク質分泌を誘導することを示す（SeqID：各IFNa2 mRNA配列を被覆した金粒子；CTRL：非トランスフェクション皮膚からの培地；eGFP：eGFP被覆金粒子処理した皮膚からの培地）。結果は平均+/-SEMとして表示。A）5人のヒトドナーの平均；B）個々のドナー＃1の例（値：3つの生検からプールされた上清）；C）個々のドナー＃2の例（値：3つの生検からプールされた上清）
図２４は、コドンおよびAU含量が最適化されたmRNA変異体のIVT mRNA微粒子銃トランスフェクションが、ヒト皮膚においてトランスフェクション後24時間で増大したヒトIFNa2aタンパク質発現を誘導することを示す（SeqID：各IFNa2 mRNA配列を被覆した金粒子；CTRL：非トランスフェクション皮膚からの抽出物；eGFP：eGFP被覆金粒子処理した皮膚からの抽出物）。結果は平均+/-SEMとして表示。A）5人のヒトドナーの平均；B）個々のドナー＃1の例（値：3つの生検からの平均）；C）個々のドナー＃2の例（値：3つの生検からの平均）
図２５は、カチオンポリマーと複合したFLuc IVT mRNA（0.03-0.1μg mRNA/トランスフェクション）または非複合FLuc IVT mRNA（0.1μg mRNA/トランスフェクション）の皮内注射後24時間および48時間でのブタ皮膚におけるホタルルシフェラーゼ（FLuc）の検出を示す。非トランスフェクションブタ皮膚を対照として使用した。A：トランスフェクション後24時間での相対蛍光単位（RLU）の検出；B：トランスフェクション後48時間でのRLUの検出；0.03μg FLuc_polymerおよび0.1μg FLuc_polymer：トランスフェクション試薬と複合したIVT mRNA；0.1μg FLuc：複合していないmRNA；untreated：トランスフェクションしていない皮膚。
驚くべきことに、（組換え）IFN-αタンパク質の投与に関連することが知られている不当な結果なしに、IFN-αmRNAをNMSCに罹患した患者に適用することが可能であった。本発明により、IFN-α治療に通常関連する全身的副作用なしに、例えば、NMSC患者、特に光線角化症（AK）に罹患している患者の皮膚上または皮膚中への局所投与が可能である。
重要なことに、本発明は、組換え分子の代わりに完全長IFNa前駆体分子を使用する：例えば、これまで臨床応用に使用された組換えヒトIFNa2aは、細菌製造起源の165aa長タンパク質であるが、本発明で使用される構築物は、トランスフェクション細胞における完全ヒト188aa前駆体タンパク質を生成する。この完全長の前駆体は細胞内でプロセスを受け、165aaの分泌生物活性タンパク質の形成を可能にする。重要なことに、また、細菌で生産されたロフェロンAのような組換えタンパク質とは対照的に、この自然にプロセスを受けたタンパク質には、哺乳動物、特にヒトでの完全な生物活性に必要な天然の翻訳後修飾も含まれる。したがって、組換え精製IFNaとは対照的に、本発明で提供されるIVT mRNAから産生されるすべてのタンパク質は、主要な全身曝露なしで目的の標的臓器において局所的に100％の生物活性を有すると予期される。
このことは、組換えIFNa（組換え材料の一部のみが生物活性であり、タンパク質の高用量と注入量、および投与様式により全身的にも活性である）とは対照的である。例えば、ロフェロンAの筋肉内注射後、バイオアベイラビリティは80％を超えていた。3,600万IUの筋肉内および皮下投与後、平均血清濃度は3.8時間のピークまでの平均時間で1,500から2,580pg/ml（平均：2,020pg/ml）、7.3時間のピークまでの平均時間で1,250から2,320pg/ml（平均：1,730pg/ml）であった（イスラエル保健省（MOH）は2001年12月の処方情報を承認した）。興味深いことに、組換えIFNaはボーラス投与後、5.1hの平均排出半減期で迅速に排出され、患者のNMSC治療に必要な頻繁で高用量の適用の必要性を説明していた。
本発明により、当技術分野で知られているIFNaタンパク質療法の欠点が驚くほど克服された。一方、（より良いIFNa製品を提供する、より良い投与経路を開発するなどによって）タンパク質投与をさらに開発する代わりに、本発明はNMSC治療の方向に大きな変化をもたらす：すなわち、IFNa-mRNAの投与。驚くべきことに、IFNa-mRNAは組換えIFNaで観察される副作用のほとんどを引き起こさない。したがって、IFNaのmRNA形式は、IFNaタンパク質を使用した従来の治療法に比べて大きな利点を提供する。本発明によれば、例えば局所および/またはフィールド指向の投与の後、IFNa mRNAは標的細胞に残り、ボーラス様投与スケジュールや過剰投与を必要とすることなく、非定型ケラチン生成細胞の除去に十分なレベルで数日間局所的に発現する。このことは、本発明の実施例のセクションに見事に示されている。本発明によるIFNaインビトロ転写（IVT）mRNAは、主として投与様式、すなわち局所的かフィールド指向かに依存して、単数および複数の両AK病変の治療に適している。同様に、例えばAKの全3段階（グレードI〜III）が、本発明によるIFNa IVT mRNAによる治療の標的である。
本発明はまた、インビボでのIVT mRNAの持続的発現に基づいて、理想的には単一の投与で、低侵襲性、効率的な局所またはフィールド指向療法としてIFNa IVT mRNAの使用を可能にする。また、この戦略により、患者コンプライアンスが無関係になり、AKおよびおそらくSCCとBCCの直接治療の現在の標準治療よりも高いレスポンダー率、特に30年前より示唆されたIFNaタンパク質よりも高いレスポンダー率で治療効果が向上することが明らかになった。長期再発率や美容結果を含むその他のパラメーターは、AKおよびNMSCの文脈において考慮するに値し、同様に現在の標準治療と比較しても優れている。
本発明で使用されるmRNAは、当業者に知られ利用可能な（5'から3'の順序で）（少なくとも）5つの要素を含む：5'CAP領域、5'非翻訳領域（5'-UTR）、IFN-αのコード領域、3'非翻訳領域（3'-UTR）およびポリアデノシンテール（ポリAテール）。コード領域は、もちろん（ヒト）IFN-αをコードする必要があり、他の成員は（天然の）IFN-α UTRまたは好ましくは他のUTRであってよい。本発明による特に好ましいUTRは、本発明によるmRNA分子の特性を改善する、すなわち、投与部位でのmRNAのIFN-αタンパク質へのより良いおよび/またはより長いおよび/またはより効果的な翻訳を行うことにより改善するUTRである。
「CAP領域」（「5'CAP」）とは、mRNA分子の5'末端にある構造を指し、通常、異常な5'から5'への三リン酸結合を介してmRNAに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。このグアノシンヌクレオチドは、生体内でメチルトランスフェラーゼによってキャッピングされた直後の7位でメチル化される（「7-メチルグアニル酸CAP」（「m7G」）、「cap-0」）。さらなる修飾には、mRNAの5'末端の最初の2つのリボース糖の2'ヒドロキシ基の可能なメチル化が含まれる（すなわち、「CAP1」および「CAP2」）：「CAP1」は最初のリボース糖にメチル化された2'-ヒドロキシ基を有し、「CAP2」は最初の2つのリボース糖にメチル化された2'-ヒドロキシ基を有する。5'CAPは、RNA分子の3'末端と化学的に類似している（CAPリボースの5'炭素は結合しており、3'炭素は結合していない）。このことは、5'エキソヌクレアーゼに対する顕著な耐性を提供し、したがって、インビボでの安定性も提供する。本発明によるmRNAの生成のため、CAPアナログを使用することもでき、これには、限定されないが以下が含まれる：モノメチル化CAPアナログ（mCAP）、アンチリバースCAPアナログ（Anti-Reverse Cap Analog、ARCA CAP）、m7G(5')ppp(5')A RNA CAP構造アナログ、G(5')ppp(5')A RNA CAP構造アナログ、およびG(5')ppp(5')G RNA CAP構造アナログ。
「（5'-または3'-）UTR」という語は、分子遺伝学におけるmRNAの非翻訳領域の確立された概念を指す。mRNA鎖のコード配列の両側に1つのUTRがある。5'側のUTRは5'-UTR（またはリーダー配列）であり、3'側のUTRは3'-UTR（またはトレーラー配列）である。5'-UTRはコード配列の上流にある。5'-UTR内には、リボソームによって認識され、リボソームが結合して翻訳を開始できる配列がある。翻訳開始のメカニズムは、原核生物と真核生物で異なる。3'-UTRは翻訳停止コドンの直後にある。3'-UTRは、翻訳終結および転写後の遺伝子発現において重要な役割を果たす。本発明で使用されるUTRは、通常、本発明によるmRNA分子に有益な安定性および発現（翻訳）特性を付与する。3'-UTRの3'末端にはまた、核の輸送、翻訳、およびmRNAの安定性に重要な複数のアデノシン一リン酸の領域が含まれる。このいわゆるポリアデノシン（ポリA）テールは、少なくとも60個のアデノシン一リン酸、好ましくは100個、最も好ましくは120個のアデノシン一リン酸からなる。
「ポリAテール」は、複数のアデノシン一リン酸で構成されている。それは、アデニン塩基のみを持つ天然に存在するmRNAの一部である。「ポリアデニル化」と呼ばれるこのプロセスは、遺伝子発現過程での翻訳のための成熟メッセンジャーRNA（mRNA）を生成するプロセスの一部である。ポリアデニル化の天然のプロセスは、遺伝子の転写が終了すると始まる。新しく作られたpre-mRNAの最も3'のセグメントは、最初に一連のタンパク質によって切断される。ついで、これらのタンパク質はRNAの3'末端でポリ（A）テールを合成する。いくつかの遺伝子では、これらのタンパク質はいくつかの可能な部位の1つにポリ（A）テールを追加する。したがって、ポリアデニル化は、選択的スプライシングと同様に、単一の遺伝子から複数の転写産物を生成できる（代替ポリアデニル化）。ポリ（A）テールは、核の輸送、翻訳、およびmRNAの安定性にとって重要である。したがって、本発明に関しては、本発明によるmRNA分子の十分なポリアデニル化に重要なのは、主に翻訳および安定性特性である。タンパク質の生成中、テールは時間とともに短縮され、十分に短くなるとmRNAは酵素的に分解される。本発明によるポリAテールは、ヒト療法においてmRNA分子を投与する技術分野で現在使用および適用されている方法で提供される。例えば、ポリAテールは少なくとも60個のアデノシン一リン酸長であり得る。好ましい実施形態によれば、ポリAテールは少なくとも100個のアデノシン一リン酸であり、特に少なくとも120個のアデノシン一リン酸である。これにより、優れた安定性とタンパク質生成が可能になる。しかし、他の特徴に関しては、本発明によるmRNA分子の作用および活性はまた、ポリAテールの特徴によっても調節され得る。
本発明によるmRNA分子に使用される配列は、天然のものであっても天然のものでなくてもよい。このことは、IFN-αコードコード領域およびUTRにも当てはまる。
「天然」という語は、その自然環境におけるヒトIFN-α mRNAに関する。
好ましくは、配列は天然のものではないが、有効性、安定性、送達性、生産性、翻訳開始および翻訳などのmRNA分子のさまざまなパラメーターを増加させるために改善される。
例えば、天然のIFN-αコード配列を使用する代わりに、GC含量またはコドン適応指数（CAI）に関して最適化された配列が、本発明の好ましい実施形態に従って使用され得る（以下を参照）。
本発明は、そのメカニズムにより、一般にNMSCの治療および予防を標的とする。しかし、光線角化症（AK）、基底細胞癌（BCC）および扁平上皮癌（SCC）、特にAKは、本発明で対処される好ましい適応症である。本発明は、患者のための成功した臨床結果および少なくとも疾患、特にAKの有意な改善を得るために、非常に入念な方法で強力な分子（IFN-αをコードするmRNA）の投与を可能にする。AKの場合、病気の改善は、事前に定義された領域、通常は同程度の発がん性物質（主に紫外線）にさらされた皮膚の領域の病変の数を評価することで測定される。病変のカウントは、ベースラインと、治療後の定義された時点、通常は1〜3か月後に行われる。個々の病変の反応は、視覚的および触診により評価される。報告されるパラメーターには、ベースラインから評価までの病変カウントの平均減少、事前定義フィールド内のすべての病変の完全なクリアランスを持つ参加者の割合、事前定義フィールド内のAK病変カウントの少なくとも75％減少を持つ参加者の割合が含まれる。
好ましい実施形態によれば、本発明によるIFN-αmRNAは、IFN-α1型mRNA（IFNa1）、IFN-α2a型mRNA（IFNa2a）、またはIFN-α2b型mRNA（IFNa2b）である。これら３つのタイプは、本発明が追求する最も単純なIFN-α実体である。
本発明の主要な治療/予防領域はヒト医学であるため、最も好ましい実施形態は、もちろん、コード領域がヒトIFN-α、特にヒトIFNa1、ヒトIFNa2a、またはヒトIFNa2bをコードする（IFN-αをコードする本発明の実施例のセクションに開示されている様々な配列番号によってコードされるように）mRNAである。
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のmRNAは、5'-UTRおよび／または3'-UTR（好ましくは3'UTR）に細胞内でのmRNAの半減期を増加させることができる１つ以上の安定化配列を含む。これらの安定化配列は、ウイルス、細菌および真核細胞に天然に存在する配列と100％の配列相同性を示すものであってよいが、部分的または完全に合成されたものであってもよい。そのような安定化配列の例には、Nucleic Acids Res. 2010; 38（データベース発行）：D75-D80. UTRdb and UTRsite（2010年公開）：a collection of sequences and regulatory motifs of the untranslated regions of eukaryotic mRNAsおよびhttp://utrdb.ba.itb.cnr.it/が含まれる。
本発明において使用され得る安定化配列のさらなる例として、例えばホモサピエンスまたはアフリカツメガエルのβ-グロビン遺伝子の非翻訳配列（UTR）が挙げられ得る。
安定化配列の別の例は、Holcik et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410-2414）に記載されており、一般式：
(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC（配列番号38）
を有し、これは、例えばα（1）-コラーゲンまたはαグロビン、およびALOX15またはチロシンヒドロキシラーゼをコードする非常に安定したmRNAの3'UTRに含まれている（ここで「x」は（NxおよびPyxで独立して）0〜10、好ましくは0〜5の整数（Holcikら、1997）、特に0、1、2、4および/または5である）。
このような安定化配列は、本発明のmRNAを安定化するために個別にまたは互いに組み合わせて、および当業者に知られている他の安定化配列と組み合わせて使用することができる。例えば、ヒトのβ-グロビン3'-UTR配列の安定化効果は、ヘッドトゥーテールの方向に配置された2つのヒトのβ-グロビン3'-UTRを使用することによりさらに増強される。
したがって、本発明によるIFN-α mRNAの好ましい実施形態は、5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが天然IFN-α mRNAとは異なるmRNAであり、好ましくは、5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが少なくとも1つの安定化配列、好ましくは一般式：(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC（配列番号38）の安定化配列を含む。
好ましくは、5'-UTRおよび/または3'-UTRは、好ましくはアルファグロビン、ベータグロビン、アルブミン、リポキシゲナーゼ、ALOX15、アルファ（1）コラーゲン、チロシンヒドロキシラーゼ、リボソームタンパク質32L、真核生物伸長因子1a（EEF1A1）、オルソポックスウイルスに存在する5'-UTR要素、およびこれらの混合物から選択され、特に、アルファグロビン、ベータグロビン、アルファ（1）コラーゲン、およびその混合物から選択される、IFN-αとは異なるヒトmRNAの5'-UTRおよび/または3'-UTRである。
したがって、本発明は、好ましくは、サイトゾル中のmRNAの半減期を増加させることができる１つまたは複数の安定化配列を3'-UTRに含むmRNAに関する。これらの安定化配列は、ウイルス、細菌および真核細胞に存在する天然の配列と100％の配列相同性を示すものであってよいが、部分的または完全に合成されたものであってもよい。本発明において使用され得る安定化配列の例として、例えばホモサピエンスまたはアフリカツメガエルのβ-グロビン遺伝子の非翻訳配列（UTR）が挙げられ得る。既に記載したように、安定化配列の別の例には、一般式：(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CCがあり、これは、α-グロビン、α-（1）-コラーゲン、15-リポキシゲナーゼまたはチロシンヒドロキシラーゼをコードする非常に安定したmRNAの3'-UTRに含まれている（Holcikら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94:2410-2414を参照）。そのような安定化配列は、本発明の修飾mRNAを安定化するために個別にまたは互いに組み合わせて、および当業者に知られている他の安定化配列と組み合わせて使用することができる。
本発明の別の好ましい実施形態は、リボソームタンパク質32Lに由来する5'-TOP-UTRであり、その後にアルブミン-3'-UTRに由来する安定化配列が続く。
したがって、本発明によるIFN-αmRNAの好ましい実施形態は、3'-UTRの3'末端に複数のアデノシン一リン酸の領域を含むmRNA分子である。このいわゆるポリアデノシン（ポリA）テールは、少なくとも60個のアデノシン一リン酸、好ましくは少なくとも100個、最も好ましくは少なくとも120個のアデノシン一リン酸からなる。さらなる安定化および翻訳効率の良いmRNAは、例えば、WO02/098443A2およびEP3112469A1に開示されている。
特定の場合には、mRNAを不安定化することも、タンパク質生産の期間を制限するために望ましい場合がある。この効果は、AUリッチエレメントなどの不安定化配列エレメント（DSE）を3'-UTRに組み込み、これによりmRNAの迅速な分解と短期間のタンパク質発現を保証することで実現できる。
特定の実施形態では、3'および/または5'UTRに不安定化配列エレメント（DSE）を欠くmRNAを提供することが望ましいが、そのようなDSEの存在または導入が有利である他の実施形態があり得る。一般に、「DSE」とは、転写産物の半減期、例えば細胞および/または生物、例えば、ヒト患者内での本発明によるmRNAの半減期を短縮する配列を指す。したがって、DSEはRNA転写物の細胞内半減期を短縮するヌクレオチドの配列を含む。
DSE配列は、たとえば、c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、ウロキナーゼ、bcl-2、SGL T1（Na（+）-共役グルコース輸送体）、Cox-2（シクロオキシゲナーゼ2）、PAI-2（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤2型）、ベータ（1）-アドレナリン受容体またはGAP43（5'-UTRおよび3'-UTR）などの短命のmRNAに認められる。
その他のDSEは、九量体UUAUUUA(U/A)(U/A)（ここで、U/AはAまたはUである）および/または五量体AUUUAおよび/または四量体AUUUの単一、タンデムまたは複数または重複コピーを含む、AUリッチ要素（ARE）および/またはUリッチ要素（URE）である。さらなるDSEはNucleic Acids Res. 2010; 38（データベース発行）：D75-D80. UTRdb and UTRsite（2010年公開）：a collection of sequences and regulatory motifs of the untranslated regions of eukaryotic mRNAsおよびhttp://utrdb.ba.itb.cnr.it/に記載されている。
したがって、5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが少なくとも1つの不安定化配列エレメント（DSE）、好ましくはAUリッチエレメント（ARE）および/またはUリッチエレメント（URE）、特に五量体AUUUAおよび/または四量体AUUUなどの、九量体UUAUUUA(U/A)(U/A)（ここで、U/AはAまたはUを意味する）の単一、タンデム、または複数または重複コピーを含むのも好ましい。
これらの安定化および不安定化エレメントは、タンパク質生産の所定の持続時間を目指し、および本発明の治療を特定のNMSCタイプ、疾患の特定の段階、特定の患者グループまたはさらには特定の疾患状態にある特定の患者に合わせるため、単独または組み合わせて使用することができる。
IFNaをコードする核酸も治療用途に示唆されてきたが、これらの提案はかなり前に示唆されており、ほとんどがDNA（RNAまたは具体的にmRNAではなく）に関し、まったく異なる分野と投与方法に関連していた。さらに、本発明の文脈で明らかにされた利点は、IFNa-mRNAのこれらの先行技術の使用では観察されなかった。IFNa核酸を含む治療計画は、主にC型肝炎などの肝臓疾患およびウイルス性疾患に使用されてきた。WO98/17801A1は、膀胱内肝癌（intravesical hepatoma）治療用の医薬組成物を開示しており、該組成物は、肝臓特異的プロモーター配列およびIFNa-bコード配列を含む組換えアデノウイルスベクターを含む。WO2006/134195A2に記載された異なるアプローチでは、IFNa DNAは、ウイルス性疾患を治療するためにIL-6ファミリー、Gp130ファミリーまたはADN配列のいずれかとの併用療法として投与される。同様に、WO00/69913A1は、肝炎の治療に使用される、シグナル配列、免疫グロブリンFc領域、およびIFNaを含む標的タンパク質配列を含む核酸配列またはウイルス発現ベクターについて論じている。
皮膚疾患の文脈では、IFNa-DNA治療は、尖圭コンジローマ（性器疣贅）を罹患した患者に適用されてきた。１つのアプローチにおいて、出願WO/9000406A1は、尖圭コンジローマの患者における局所的ポドフィリン治療薬またはその活性成分と組換えヒトDNA IFN-2aまたは2bのいずれかの病巣内注射との組み合わせを記載した。WO/9004977A2では、同じ疾患に対する併用療法が、液体窒素による凍結外科治療後の組換えヒトDNA IFN-2aまたは2bの病巣内注射を開示した。
腫瘍抗原をコードする遊離mRNAと組み合わせたカチオン性またはポリカチオン性化合物と複合化したアジュバントmRNAを含む免疫刺激性組成物の使用が、以前に、腫瘍疾患、自己免疫、感染性およびアレルギー疾患の予防、治療および/または改善のためにWO2010/037408A1に記載されている。このアプローチにより、投与された遊離mRNAの目的のタンパク質への効率的な翻訳が可能になり、一方、アジュバント成分と複合したmRNAは免疫応答を誘導する。WO99/47678A2は、癌治療のためのIFN-αプラスミドの使用を開示している。インビボ適用のために核酸を安定化する別のアプローチは、プロテアーゼ阻害剤であるクニッツドメインの追加などの核酸配列の修飾である（WO2009/030464A2）。
希少皮膚疾患の治療のためおよびAKを含む医療皮膚科で使用するための治療のためおよび審美医学のためのRNAベースの治療法が提案されている：WO2015/117021A1は、AKの治療のための1つまたは複数の非標準（non-canonical）ヌクレオチドからなるRNAを含む医薬組成物の使用を開示しており、ここで該核酸は皮膚特異的な構造または成長因子タンパク質のグループの目的タンパク質かまたは遺伝子編集タンパク質標的のいずれかをコードする。同様に、WO2016/131052A1は、日光角化症を含む外皮系の疾患を治療するための、インターロイキン、LIF、FGF成長因子、SERPINB1、カスパーゼ-1またはBMPのファミリーのタンパク質のいずれかをコードする非標準ヌクレオチドを含むRNAの投与について論じている。両方の特許出願において、合成RNAを含む医薬組成物の投与は、皮下注射、皮内注射、真皮下注射または筋肉内注射、および局所注射などの複数の方法で行うことができる。
しかし、インターフェロン、特にIFNaなどのサイトカインは、この文脈での適用は示唆されていない。
改善されたmRNAベースの治療法の一般的な概念（例えば、Sahinら、Nat. Rev. Drug Disc. 2014. 13(10): 759-780を参照）も本発明に適用可能である。
例えば、別の好ましい実施形態によれば、本発明によるIFN-α mRNAは、シチジン（C）、ウリジン（U）、アデノシン（A）またはグアノシン（G）残基以外の残基を含んでいてもよい。これらのヌクレオシドの天然に存在する相当数のアナログと、（それ以上に多くの）これらmRNA残基の合成変異体がある。そのような変異体の好ましい実施形態は、例えば、WO2014/153052A2およびWO2015/062738A1に見出すことができる。
好ましい実施形態によれば、本発明のIFN-α mRNAにおいて、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、好ましくは少なくとも30％、特に少なくとも50％の
− シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および／または
− シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および／または
− シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および／または
− シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および／または
− シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および／または
− アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される。
特に好ましい実施形態は、本発明のIFN-α mRNAにおいて、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、好ましくは少なくとも30％、特に少なくとも50％の
− シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換された
IFN-α mRNAである。
本発明の過程において、驚くべきことに、mRNAのGC含量（またはAUに対するGC比）をさらに増加させると、さらに一層改善された結果が得られることが見出された。これが特に驚くべきことである理由は、天然のIFNa配列がすでに翻訳/発現効率に関して最適であると見なされていたからである。しかし、本発明によるIFN-α mRNAを、少なくとも49.5％、またはより好ましくは少なくとも49.6％（例えば、少なくとも49.7、少なくとも49.8、少なくとも49.9）のGC/AU比にデザインすると、本発明による性能はさらに増大する。したがって、GC/AU比は、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも55％、特に少なくとも60％である。
上記のヌクレオシド変異体に関連して、上記の特定の好ましい変異体はGC含量に影響を与えないこと、すなわち、変異体はこの点に関して保存的であること（例えば、シチジン変異体は、GC含量の計算にはなおシチジンとしてカウントされる）に注意することが重要である。
本発明の過程で明らかにされた別の驚くべき観察は、コドン適応指数（CAI）が増加したIFNa-mRNAはまた、特に細胞内の発現能に関して、本発明において改善された性能を示すという事実であった。
CAIは、高発現遺伝子のコドン使用頻度に対する遺伝子のコドン使用頻度の相対的適応性の測定値である。各コドンの相対的な適応性（w）は、各コドン使用頻度の、同じアミノ酸の最も豊富なコドンの使用頻度に対する比率である。CAI指数は、これらの相対的な適応性値の幾何平均として定義される。非同義コドンおよび終止コドン（遺伝暗号に依存）は除外される。CAI値の範囲は0〜1であり、この値が大きいほど、最も豊富なコドンの割合が高いことを示す（Sharpら、Nucleic Acids Res. 15 (1987): 1281-1295., Jansenら、Nucleic Acids Res. 31 (2003): 2242-2251)）。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、IFN-α mRNAに関し、該IFN-α mRNAは少なくとも0.8、好ましくは少なくとも0.81、少なくとも0.82、少なくとも0.83、少なくとも0.84、少なくとも0.85、少なくとも0.86、少なくとも0.87、少なくとも0.88、少なくとも0.89のコドン適応指数（CAI）を有する。本発明によるmRNAのさらに好ましいCAIは、少なくとも0.9、特に少なくとも0.91である。
比較のため：IFNa1の天然のGC/AU比は49.5％、IFNa2aのGC/AU比は48.7％、IFNa2bのGC/AU比は48.9％である：IFNa1の天然のCAIは0.8、IFNa2aのCAIは0.8、およびIFNa2bのCAIは0.8である。
さらにより好ましくは、本発明によるmRNAは、少なくとも0.8のCAIおよび少なくとも49.5％のGC含量を有する（またはさらにより好ましくは、より高いCAI/GC含量)。
IFNa2aに対する本発明によるmRNAの好ましいコンセンサス配列は、配列番号12、13および14；最も好ましくは配列番号12である。
配列番号12はGCリッチ配列のみを含む；配列番号13も最適化されており、AUリッチ配列を含む；配列番号14は最適化された配列である。
したがって、ヒトIFNa2aをコードするIFN-α mRNAのコード領域は、好ましくは配列番号12、特に配列番号2、3、5、6、7、8、9、10、または11である；ヒトIFNa2bをコードするIFN-α mRNAのコード領域は、好ましくは配列番号26、特に配列番号19、20、22、または25である；ヒトIFNa1をコードするIFN-α mRNAのコード領域は、好ましくは配列番号36、特に配列番号29、30、31、32、34、または35である。
本発明の好ましい実施形態は、本発明の過程において改善された性能を示したIFN-α mRNA、特に以下の分子である：
− IFN-α mRNAが0.8以上のCAIおよび48.7％以上のGC含量を有する；
− IFN-α mRNAが0.8〜0.99、好ましくは0.81〜0.97、特に0.83〜0.85のCAIを有する（例えば、配列番号3のように)；
− IFN-α mRNAが48.7％〜63.7％、好ましくは48.7％〜60％、特に48.7％〜58.0％のGC含量を有する；
− IFN-α mRNAが0.80〜0.97のCAIおよび48.7％〜63.7％のGC含量を有する；
− IFN-α mRNAが0.6〜0.8のCAIおよび48.7％〜65.0％のAU含量を有する；
− IFN-α mRNAが0.6〜0.8、好ましくは0.6〜0.7、特に0.65〜0.75のCAIを有する（例えば、配列番号4のように)；および
− IFN-α mRNAが48.7％〜65.0％、好ましくは51.3〜60.0％のAU含量を有する。
本発明はまた、本発明で提供されるmRNA分子にも関する（天然RNA配列およびIFN-αの天然コード領域を含むすべてのmRNA配列を除く）。
好ましい実施形態によれば、本発明によるIFN-αmRNAは、皮下、皮内、経皮、表皮、または局所、特に表皮に投与される。
本発明のIFN-α mRNAの投与は、投与するmRNAの量、mRNA分子の安定性および疾患の状態に応じて、最適化された発現目標に従って実施することができる。例えば、IFN-α mRNAは、少なくとも１回、少なくとも２回、１ヶ月以内に、好ましくは毎週、少なくとも２回投与され得る。例えば、IFN-α mRNAが少なくとも２回投与される場合、１ヶ月以内に、好ましくは毎週、少なくとも２回投与する用量は変動し得る。
用量あたり送達されるmRNAの量は、分子の安定性などに依存するようにすることもできる。好ましくは、本発明によるIFN-α mRNAは、用量あたり0.001μg〜100mg、好ましくは用量あたり0.01μg〜100mg、より好ましくは用量あたり0.1μg〜10mg、特に用量あたり1μg〜1mgの量で投与される。
mRNA治療薬に適した製剤は、当技術分野で十分に利用可能である（例えば、Sahinら、2014; WO2014/153052A2（段落122〜136）などを参照）。
したがって、本発明は、本発明によるIFN-α mRNAを含む医薬製剤にも関する。本発明の製剤は、薬学的に許容される環境にて、例えば、通常mRNA治療薬に含まれる適切な成分（賦形剤、担体、緩衝液、補助物質（例えば、安定剤）など）とともにmRNAを含む。
本発明によるmRNA製剤は、好ましくは適切な担体を含む。適切な担体には、ポリマーベースの担体、例えば、直鎖および分岐PEIおよびビロマー（viromers）を含むカチオン性ポリマー、脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、カチオン性両親媒性脂質、例えば、：SAINTR-Lipids、天然および合成由来のエキソソーム 、天然、合成および半合成の層状体、ナノ粒子、リンケイ酸カルシウム（calcium phosphor-silicate）ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、乾燥粉末、ポリ（D-アルギニン）、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、エマルジョン、ゾルゲル、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ペプチド結合体、小分子標的結合体、およびその他のベクタータグが含まれる。適切な担体としてのバイオナノカプセルおよび他のウイルスキャプシドタンパク質集合体の使用も考えられる（Hum. Gene Ther. 2008 Sep;19(9):887-95）。
好ましい担体は、直鎖および分岐PEIおよびビロマーを含むカチオン性ポリマー、脂質ナノ粒子およびリポソーム、トランスファーソーム、およびリン酸カルシウムナノ粒子を含むナノ粒子（すなわち、CaCl2で沈殿させてから投与される裸のRNA）である。
本発明の好ましい実施形態は、非複合mRNA、すなわち、適切な緩衝水溶液、好ましくは生理的グルコース緩衝水溶液（生理学的）中の非複合mRNAの使用に関する。例えば、1xHEPES緩衝液；1xリン酸緩衝液、Na-クエン酸緩衝液；酢酸ナトリウム緩衝液；好ましくはグルコースを含む（例えば、5％グルコース）；生理学的溶液を好ましくは適用することができる。
好ましくは、本発明は、リポソーム、特にDOTAP、DOTMA、Dotap-DOPE、DOTAP-DSPE、Dotap-DSPE-PEG、Dotap-DOPE-PEG、Dotap-DSPE-PEG-Na-Cholate、Dotap-DOPE-PEG-Na-Cholate、カチオン性両親媒性高分子（CAM）を複合体として有するDOTAP、およびそれらの組み合わせを適用する。
別の態様によれば、本発明は、
− 本明細書で定義されるIFN-α mRNAおよび
− 皮膚送達装置
を含む、患者に本発明のIFN-α mRNAを投与するためのキットに関する。
好ましくは、皮膚送達装置は、
− 針ベースの注射システムおよび無針注射システムからなる群から好ましくは選択される皮内送達装置、
− 経皮パッチ、中空および中実マイクロニードルシステム、微細構造経皮システム、電気泳動システム、およびイオン導入システムからなる群から好ましくは選択される経皮送達装置、または
− 無針注射システム、レーザーベースのシステム、特にエルビウム（Erbium）YAGレーザーシステム、および遺伝子銃システムからなる群から好ましくは選択される表皮送達装置
である。
これらの投与デバイスは、原則として当技術分野で利用可能である。本発明によるmRNAの投与への適応は、当業者にとって容易に可能である。
本発明はまた、NMSC、好ましくはAK、BCCおよびSCCを治療および予防する方法に関し、該方法において、本発明によるmRNAは、それを必要とする患者に有効量で投与される。
さらなる態様によれば、本発明は、コンジローマおよび血管奇形（vascular deformities）の予防または治療のための本発明によるmRNAの使用にも関する。これらの態様についても、本発明は適している。
NMSC（特に：AK、BCCおよびSCC）に加えて、他の皮膚の状態／疾患の治療も本発明の対象となり得る。これらの状態／疾患には、血管腫瘍および／または血管腫などの奇形、およびポートワイン染色（母斑、火傷（firemark））が含まれるが、これらに限定されない。
表在性血管腫は皮膚のより高い位置にあり、真っ赤な紅斑から赤紫色の外観をしている。表在性病変は扁平で末梢血管拡張性であり、小さな多様な分岐毛細血管の斑またはパッチで構成される。表在性病変はまた、皮膚から隆起して、丘疹および隆起した島のようなコンフルエントな真っ赤なプラークを形成する。後頭部の頭皮、首のしわ（neck folds）および径部／肛門周囲などの特定の場所の表在性血管腫は、潰瘍化の潜在的なリスクがある。潰瘍性血管腫は、黒い外皮のある（crusted）丘疹またはプラーク、または痛みを伴うびらんまたは潰瘍として現れることがある。潰瘍は二次的な細菌感染を起こしやすく、黄色い皮（crusting）、排液、痛み、臭気を伴うことがある。潰瘍はまた、特に深部病変または摩擦領域での出血のリスクがある。5つ以上の複数の表在性血管腫は、皮膚外血管腫に関連する可能性があり、最も一般的なのは肝臓（肝）血管腫であり、これらは超音波検査を保証する。
深部血管腫は、最初は、丘疹、小結節、またはより大きな腫瘍に増殖することができる、明確に定められていない青みがかった斑として現れる。増殖性病変はしばしば圧縮性であるが、かなり硬い。多くの深部血管腫には、主要な深部成分または周囲の静脈隆起の上に明らかないくつかの表面的な毛細血管が見える場合がある。深部血管腫は、表在性血管腫よりも少し遅れて発症する傾向があり、増殖期も長く遅くなる。深部血管腫は潰瘍化することはめったにないが、その場所、大きさ、増殖によっては問題を引き起こす可能性がある。敏感な構造の近くにある深部血管腫は、増殖期に、外耳道やまぶたなどの周囲の柔らかい構造を圧迫することがある。混合血管腫は、表在性血管腫と深部血管腫の単なる組み合わせであり、数ヶ月間明らかではない場合がある。患者は、表在性血管腫、深部血管腫または混合血管腫の任意の組み合わせを有していてよい。
血管腫の治療選択肢には、医学療法（全身、病巣内および局所）、手術、およびレーザー療法が含まれる。2008年以前は、問題のある血管腫の治療の主力は経口コルチコステロイドであった。これは効果的であり、β遮断薬療法が禁忌であるか忍容性が不十分な患者の選択肢である。非選択的β遮断薬であるプロプラノロールが血管腫の治療に十分に耐えられ、効果的であるという偶然の（serendipitous）観察に続いて、この薬剤は大規模な無作為化対照試験で研究され、この適応について2014年に米国食品医薬品局によって承認された。プロプラノロールは、その後、これらの病変の治療のための最前線の全身療法になった。血管腫の治療に有効な他の全身療法には、ビンクリスチン、インターフェロン、および抗血管新生特性を持つ他の薬剤が含まれる。投与に中心静脈アクセスを必要とするビンクリスチンは、伝統的に化学療法薬として使用されてきたが、血管腫やカポジ型血管内皮腫や房状血管腫などの他の小児血管腫瘍に対する効能があることが実証されている。皮下注射で投与したインターフェロン-アルファ2aおよび2bは、血管腫に対して有効性を示したが（Wilsonら、Ophthalmology 2007; 114(5): 1007-11）、治療を受けた子供の最大20％で痙性麻痺を引き起こす可能性がある（Barlowら、J. Pediatr. 1998; 132(3 pt 1):527-30;およびWorleら、Eur. J. Pediatr. 1999;158(4):344）。したがって、IFNa剤は現在、血管腫のβ遮断薬療法の時代にはほとんど利用されていない。
配列：
配列番号:1 IFNa2a
auggccuuga ccuuugcuuu acugguggcc cuccuggugc ucagcugcaa gucaagcugc
ucugugggcu gugaucugcc ucaaacccac agccugggua gcaggaggac cuugaugcuc
cuggcacaga ugaggaaaau cucucuuuuc uccugcuuga aggacagaca ugacuuugga
uuuccccagg aggaguuugg caaccaguuc caaaaggcug aaaccauccc uguccuccau
gagaugaucc agcagaucuu caaucucuuc agcacaaagg acucaucugc ugcuugggau
gagacccucc uagacaaauu cuacacugaa cucuaccagc agcugaauga ccuggaagcc
ugugugauac aggggguggg ggugacagag acuccccuga ugaaggagga cuccauucug
gcugugagga aauacuucca aagaaucacu cucuaucuga aagagaagaa auacagcccu
ugugccuggg agguugucag agcagaaauc augagaucuu uuucuuuguc aacaaacuug
caagaaaguu uaagaaguaa ggaauga
配列番号:2 IFNa2a
auggcacuga cauuugcccu gcucguugcu cuuuuggucc uuuccugcaa gaguagcugc
ucuguuggcu gugauuugcc ccaaacccac ucucucgguu caaggagaac ucugaugcug
cuugcccaaa ugcggaagau uagccuguuc ucaugccuga aagaccggca ugauuucggc
uuuccucagg aggaauuugg gaaccaguuc cagaaagcgg aaaccauucc cguccuucac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuu ucuaccaagg auuccagugc ugcuugggau
gagacacugc uggacaaguu cuacacugag cucuaucagc agcugaauga ccuggaagcc
ugugugaucc aaggaguagg agugacugag acaccacuca ugaaagagga cuccauacuc
gcagugcgca aguacuucca gaggauuacc cuguaucuga aggagaagaa auacaguccg
ugugcauggg aaguggugag agccgagauc augcguagcu uuucccuguc aacgaaucug
caggaaagcu ugcgaagcaa agaauga
配列番号:3 IFNa2a
auggcacuga cauucgcccu gcucgucgcu cuccucgucc ucuccugcaa gaguagcugc
ucugucggcu gugauuugcc ccaaacccac ucccucgguu ccaggcgcac ucugaugcug
cucgcccaga ugcggaagau uagccuguuc ucaugccuga aggaccggca ugauuucggc
uucccucagg aggaauucgg gaaccaguuc cagaaggcgg agaccauccc cguccuccac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc ucuaccaagg acuccagugc ugcuugggac
gagacccugc ucgacaaguu cuacacugag cucuaccagc agcugaacga ccuggaggcc
ugugugaucc aaggagucgg agugacugag acaccacuca ugaaggagga cuccauccuc
gcaguccgca aguacuucca gaggaucacc cuguaccuga aggagaagaa guacaguccg
ugugcauggg agguggugag agccgagauc augcguagcu ucucccuguc aacgaaccug
caggagagcc uccgaagcaa ggaguga
配列番号:4 IFNa2a
auggcacuga cauuugcccu gcucguugcu cuuuuggucc uuucuugcaa gaguagcugu
ucuguuggau gugauuugcc ucaaacucau ucuuuggguu caagaagaac uuugaugcuu
cuugcacaaa ugagaaagau uagccuuuuc ucauguuuga aagaucgaca ugauuucgga
uuuccucaag aagaauuugg uaaccaauuc caaaaagcug aaaccauucc uguccuucau
gaaaugaucc aacaaaucuu caaucuuuuu ucuacuaagg auucuagugc ugcuugggau
gaaacacuuc uugauaaguu cuacacugaa cucuaucaac agcugaauga cuuggaagcc
uguguuaucc aaggaguugg aguuacugag acaccacuca ugaaagaaga uuccauacuc
gcaguucgca aguacuucca aaggauuacc uuguaucuga aggaaaagaa auacaguccu
ugugcauggg aagugguuag agcugaaauc augcguagcu uuucccuguc aacgaauuug
caggaaagcu ugcgaagcaa agaauga
配列番号:5 IFNa2a
auggcccuga cauucgcucu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugu
agcgugggcu gcgaccugcc ucagacacac agccugggca gcagacggac ccugaugcug
cuggcccaga ugcggaagau cagccuguuc agcugccuga aggaccggca cgacuucggc
uucccucagg aagaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agacaauccc cgugcugcac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc uccaccaagg acagcagcgc cgccugggac
gagacacugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaauga ccuggaagcc
ugcgugaucc agggcguggg cgugacagag acaccccuga ugaaggaaga uagcauccug
gccgugcgca aguacuucca gcggaucacc cuguaccuga aagagaagaa guacagcccc
ugcgccuggg aggucgugcg ggccgagauc augagaagcu ucagccugag caccaaccug
caggaaagcc ugcggagcaa agaguga
配列番号:6 IFNa2a
auggcucuca ccuucgcccu gcugguggca cuucuugucc ucucauguaa aucuagcugu
agcguuggcu gcgaucugcc ucagacucau agucugggau cucggaggac gcuuaugcug
uuggcccaga ugaggaagau cucccuguuc uccugucuca aagaccggca cgauuuuggc
uucccacagg aggaguuugg gaaccaguuc cagaaagcug agaccauccc ggugcuucau
gaaaugaucc agcagaucuu caaucuguuc aguacaaagg auaguucugc ugcuugggac
gagacacucc ucgacaaauu uuacacugaa cuguaucagc aguugaacga ccuugaggcu
ugcguuauuc agggagucgg ugugacagaa acuccccuca ugaaggagga cagcauccuc
gccguucgaa aguauuucca acgaaucaca cuguaucuua aggagaaaaa guacagccca
ugugccuggg agguuguccg ggcugagaua augcgaaguu ucucacugag uacaaacuug
caggagagcc uccgaucaaa ggaguga
配列番号:7 IFNa2a
auggcucuua cguucgcucu uuugguugcc cucuuggugc ugaguuguaa auccucaugu
uccgugggau gcgaucugcc gcagacucac ucucuuggca guagaaggac ccugaugcug
cuggcucaaa ugcggaagau uagucuguuc uccugccuga aggaccggca ugacuucggu
uuuccacagg aggaauucgg aaaccaguuu cagaaggcug agacaauccc ugugcugcac
gaaaugaucc aacagauuuu caaccuuuuc ucaaccaagg acuccucagc cgccugggac
gaaacacugc uggauaaauu cuauaccgag cucuaccaac agcugaacga uuuggaggca
ugugucaucc agggggucgg ggucacugag acuccacuga ugaaggaaga cuccauucuc
gcgguaagga aauacuucca gaggaucacg cuguaccuga aggaaaagaa auacagcccu
ugcgcauggg aggugguucg cgcugagauc augcggagcu ucagucugag cacuaaucug
caggaaagcc ucaggucaaa ggaauag
配列番号:8 IFNa2a
auggcuuuga ccuucgcccu ccugguggcc cuguuggugc ucucaugcaa auccagcugc
ucagugggcu gcgauuugcc ccagacccac ucacugggaa guaggaggac uuugaugcug
uuggcucaga ugcggaaaau cucucuguuc uccugccuga aggauaggca ugacuuuggu
uuuccucaag aggaguuugg aaaccaguuc caaaaggccg aaaccauccc ugugcuccac
gaaaugaucc agcagauauu uaaccuuuuc ucuacuaaag auuccagcgc cgcaugggac
gagacccugc uugacaaguu cuacacugag cucuaccagc agcucaacga ccuggaggcg
ugugugaucc agggugucgg ugugacggag acuccccuua ugaaagagga uucuauccug
gcagugcgga aauauuuuca gagaaucacg cuguauuuga aggagaagaa guauagcccc
ugcgccuggg aaguggugag ggcugaaauu augcgcaguu ucagcuugag caccaaccug
caggaauccc uucgguccaa ggaauaa
配列番号:9 IFNa2a
auggcccuga ccuucgcacu gcugguggca cugcugguuc uuuccuguaa gagcaguugc
agcguuggau gugaccugcc acagacucau ucucugggua gccggcgcac ucuuaugcuc
cucgcacaaa ugaggaagau uagucuguuc agcugucuca aagauagaca cgauuuuggc
uucccucagg aagaauucgg aaaccaguuu cagaaggccg agaccauccc cguguugcau
gagaugauuc agcagaucuu caaccuguuu ucuaccaagg acagcuccgc ugcuugggac
gagacucugc uggacaaguu cuacacugag cucuaccagc agcugaacga ccuugaagcc
ugcguuauuc agggcgucgg cgugacagag acuccacuga ugaaagagga caguauccug
gccgugcgga aguauuuuca gaggauuaca cuuuauuuga aggaaaagaa guacuccccc
ugcgcauggg aagugguaag ggcugaaauc augcggagcu uuucccuguc uaccaaccug
caggaauccc ugagauccaa agaauaa
配列番号:10 IFNa2a
auggcacuga cauuugccuu gcucgucgcc cugcuuguuc uguccuguaa gagcuccugc
ucaguuggcu gcgaucuucc ucaaacccau agccucggua gccgccgaac ccugaugcug
cuggcccaga ugcgcaagau uagucuguuc ucuugucuga aagacaggca cgauuucgga
uucccacagg aggaguucgg caaucaauuc cagaaagcgg agaccauccc cgugcuucac
gagaugauuc agcaaauuuu caaccuguuc aguacuaaag auucuagcgc ugcgugggac
gagacccugc uggacaaauu cuauacagaa cucuaucagc agcugaacga ucuggaggcc
uguguuaucc aggggguagg ugugaccgaa accccucuua ugaaggaaga uuccauccug
gccguuagga aauacuucca gcgcaucaca uuguaccuga aggagaaaaa guacagcccu
ugcgcauggg agguggucag agcugaaauc augcgaucau uuagucucag uacuaaucuc
caagagucac ugcgcuccaa ggaguaa
配列番号:11 IFNa2a
auggcccuga ccuucgcccu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugc
agcgugggcu gcgaccugcc ccagacccac agccugggca gccgccgcac ccugaugcug
cuggcccaga ugcgcaagau cagccuguuc agcugccuga aggaccgcca cgacuucggc
uucccccagg aggaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agaccauccc cgugcugcac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc agcaccaagg acagcagcgc cgccugggac
gagacccugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaacga ccuggaggcc
ugcgugaucc agggcguggg cgugaccgag accccccuga ugaaggagga cagcauccug
gccgugcgca aguacuucca gcgcaucacc cuguaccuga aggagaagaa guacagcccc
ugcgccuggg agguggugcg cgccgagauc augcgcagcu ucagccugag caccaaccug
caggagagcc ugcgcagcaa ggaguaa
配列番号:12 IFNa2aコンセンサス(GCリッチ配列のみ)
auggchyuba cvuuygchyu byusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwsywshugy
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshcubgghw shmgvmgvac byukaugcus
yubgchcara ugmgsaarau ywsycuguuc wshugycusa argaymgvca ygayuuyggh
uuycchcarg argaruuygg vaaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay
garaugauyc arcarauhuu yaaycukuuy wshachaarg aywsywshgc ygcnugggay
garachcusc ubgayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn
ugygubauyc arggnguvgg ngusacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus
gcvgunmgva aruayuuyca rmgvauyacv yukuayyuka argaraaraa ruaywsyccn
ugygcmuggg argubgunmg vgcygarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus
cargarwsmy ubmgvwsmaa rgarurr
配列番号:13 IFNa2aコンセンサス(GCリッチ配列＋ATリッチ配列)
auggchyuba cvuuygchyu byusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwsywshugy
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshyubgghw shmgvmgvac byukaugcub
yubgchcara ugmgvaarau ywsycukuuc wshugyyusa argaymgvca ygayuuyggh
uuycchcarg argaruuygg naaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay
garaugauyc arcarauhuu yaaycukuuy wshachaarg aywsywshgc ygcnugggay
garachcubc ubgayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn
ugygubauyc arggngungg ngubacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus
gcvgunmgva aruayuuyca rmgvauyacv yukuayyuka argaraaraa ruaywsyccn
ugygcmuggg argubgunmg vgcygarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus
cargarwsmy ubmgvwsmaa rgarurr
配列番号:14 IFNa2aコンセンサス(天然の配列を含む全ての配列
auggchyuba cvuuygchyu nyusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwshwshugy
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshyubgghw shmgvmgvac byukaugcub
yubgchcara ugmgvaarau ywsycukuuc wshugyyusa argaymgvca ygayuuyggh
uuycchcarg argaruuygg naaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay
garaugauyc arcarauhuu yaaycubuuy wshachaarg aywshwshgc ygcnugggay
garachcubc ungayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn
ugygubauhc arggngungg ngubacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus
gcngunmgva aruayuuyca rmgvauyacn yubuayyuka argaraaraa ruaywsyccn
ugygcmuggg argubgunmg vgchgarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus
cargarwshy unmgvwshaa rgarurr
配列番号:15 IFNa2aタンパク質
MALTFALLVA LLVLSCKSSC SVGCDLPQTH SLGSRRTLML LAQMRKISLF SCLKDRHDFG FPQEEFGNQF
QKAETIPVLH EMIQQIFNLF STKDSSAAWD ETLLDKFYTE LYQQLNDLEA CVIQGVGVTE TPLMKEDSIL
AVRKYFQRIT LYLKEKKYSP CAWEVVRAEI MRSFSLSTNL QESLRSKE
配列番号:16 5’UTRを含むモデル配列(aグロビン,ヒト+コザック)
gggagacata aaccctggcg cgctcgcggc ccggcactct tctggtcccc acagactcag
agagaaccca cc
配列番号:17 3’UTRを含むモデル配列(aグロビン,ヒト+ポリA部位および最初のA(120のうち))
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc
ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc aaaaaaaaaa
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
配列番号:18 IFNa2b
auggccuuga ccuuugcuuu acugguggcc cuccuggugc ucagcugcaa gucaagcugc
ucugugggcu gugaucugcc ucaaacccac agccugggua gcaggaggac cuugaugcuc
cuggcacaga ugaggagaau cucucuuuuc uccugcuuga aggacagaca ugacuuugga
uuuccccagg aggaguuugg caaccaguuc caaaaggcug aaaccauccc uguccuccau
gagaugaucc agcagaucuu caaucucuuc agcacaaagg acucaucugc ugcuugggau
gagacccucc uagacaaauu cuacacugaa cucuaccagc agcugaauga ccuggaagcc
ugugugauac aggggguggg ggugacagag acuccccuga ugaaggagga cuccauucug
gcugugagga aauacuucca aagaaucacu cucuaucuga aagagaagaa auacagcccu
ugugccuggg agguugucag agcagaaauc augagaucuu uuucuuuguc aacaaacuug
caagaaaguu uaagaaguaa ggaauga
配列番号:19 IFNa2b
auggcccuga ccuucgcccu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugc
agcgugggcu gcgaccugcc ccagacccac agccugggca gccgccgcac ccugaugcug
cuggcccaga ugcgccgcau cagccuguuc agcugccuga aggaccgcca cgacuucggc
uucccccagg aggaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agaccauccc cgugcugcac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc agcaccaagg acagcagcgc cgccugggac
gagacccugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaacga ccuggaggcc
ugcgugaucc agggcguggg cgugaccgag accccccuga ugaaggagga cagcauccug
gccgugcgca aguacuucca gcgcaucacc cuguaccuga aggagaagaa guacagcccc
ugcgccuggg agguggugcg cgccgagauc augcgcagcu ucagccugag caccaaccug
caggagagcc ugcgcagcaa ggaguaa
配列番号:20 IFNa2b
auggcccuga cauucgcucu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugu
agcgugggcu gcgaccugcc ucagacacac agccugggca gcagacggac ccugaugcug
cuggcccaga ugcggagaau cagccuguuc agcugccuga aggaccggca cgacuucggc
uucccucagg aagaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agacaauccc cgugcugcac
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc uccaccaagg acagcagcgc cgccugggac
gagacacugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaauga ccuggaagcc
ugcgugaucc agggcguggg cgugacagag acaccccuga ugaaggaaga uagcauccug
gccgugcgca aguacuucca gcggaucacc cuguaccuga aagagaagaa guacagcccc
ugcgccuggg aggucgugcg ggccgagauc augagaagcu ucagccugag caccaaccug
caggaaagcc ugcggagcaa agaguga
配列番号:21 IFNa2b
auggcuuuga cauucgcacu guuggucgcc cugcuugugc ucucaugcaa aagcaguugu
uccguggguu gcgauuugcc acagacucac agucugggau cucgccgcac ucugaugcuu
cucgcgcaaa ugcgccggau uagucuuuuc uccugucuga aggauagaca cgacuuuggg
uuuccccagg aggaguuugg gaaucaguuc caaaaggcgg aaacuauucc uguccuucac
gaaaugaucc agcagauauu uaauuuguuc ucaacaaaag auucaucagc ugcaugggac
gaaacccugc uggauaaguu cuacacggag cucuaccagc agcugaauga ucucgaagcc
ugugucaucc agggcguagg agugacagaa accccacuga ugaaggagga uucaauccug
gcggugagga aguauuucca gcggaucacc cuguaucuga aggaaaagaa guauucccca
ugugcuuggg aggugguccg agcagagauc augaggagcu ucucucucuc aacaaaucug
caggagaguc uuagguccaa ggaguga
配列番号:22 IFNa2b
auggcucuca cuuucgcacu ccucguggca cugcuugugc uguccugcaa aaguucuugc
agcguggggu gcgaccuccc acagacccac ucacuggggu caaggcgcac ccugaugcug
cuggcccaga ugagacgaau uucccuguuu uccugccuca aggaucggca ugacuucggc
uuuccccaag aggaguucgg caaccaguuc cagaaagccg agaccauccc ugugcugcau
gagaugaucc agcaaauauu caaucucuuu uccaccaagg acagcuccgc cgccugggau
gagacauugc ucgauaaguu uuauacugaa cuguaccagc agcugaacga ucuugaggcc
uguguaauac aggguguagg cgugacagag accccccuua ugaaggagga cucaauucug
gcagucagga aauauuucca gcggauaacu cuguaccuga aggagaaaaa guauagucca
ugugcuuggg aaguggugcg ggccgagauc augcgcagcu uuucacuuag uacuaaucuc
caggagucuu ugaggucaaa ggaguga
配列番号:23 IFNa2b
auggcacuua ccuucgcccu uuugguggca cugcugguac ucucaugcaa gaguaguugc
aguguggggu gcgaucuccc acagacucac uccuugggau caaggcggac gcucaugcuc
cuggcucaaa ugagaagaau uuccuuguuc ucaugcuuga aagauagaca cgacuuuggc
uucccacagg aggaauuugg gaaccaguuc caaaaagcug agacgauccc aguccugcac
gagaugauac agcagaucuu uaaucuuuuu uccaccaagg acagcagugc cgccugggac
gagacucucc uugauaaauu cuacacugaa cucuaucaac aguugaauga cuuggaagcc
ugugugaucc aaggagucgg cgugaccgaa acaccacuua ugaaggagga cagcauccuu
gccguuagaa aguacuuuca acggaucacu cucuaucuca aagagaaaaa guacaguccc
ugugcuuggg aggugguccg cgccgaaauc augaggaguu ucagccucuc cacuaaucuu
caagaauccc uccgaagcaa agaauga
配列番号:24 IFNa2b
auggcucuca ccuucgcacu guugguggcu cuccuugugc ugagcuguaa aucuuccugu
ucugucgguu gcgauuugcc gcagacacac agccugggga gucggagaac ccugauguug
cuggcucaga ugcggagaau uucucuguuc aguugccuua aggaccgcca ugauuuuggg
uucccccagg aggaauuugg aaaucaguuu cagaaggcgg agacgauccc gguucugcac
gaaaugaucc agcagaucuu caauuuguuu ucaaccaagg acuccucugc ugccugggau
gaaacacugc uggacaaguu cuauaccgag cuguaccaac agcugaacga ucuugaggca
ugugugauuc aaggagucgg ggucaccgaa accccacuga ugaaagaaga uucuauucug
gcugugagaa aauauuucca aagaauaacu cucuaccuga aggagaagaa auauucacca
ugugccuggg aagucgugcg cgcugagaua augcgcagcu uuagucuuag uacaaaccug
caggagucuc ugcgcucuaa ggaguga
配列番号:25 IFNa2b
auggcccuua cuuuugcccu gcugguggca cuucuggucc ucucuugcaa gucaagcugc
aguguuggau gcgaucuucc ucagacacac ucccugggga guagaagaac ucugauguug
cucgcucaga ugcgcagaau aagucuguuu aguugucuga aggaucgcca cgauuucggg
uuuccacagg aagaguucgg caaccaguuc cagaaagcug agacuauccc uguacuucac
gaaaugauuc agcagaucuu uaaucuguuc uccaccaagg acuccucugc cgcuugggau
gagacucucc uggacaaauu uuacacugag cuguaucaac agcugaauga ucuggaagcc
ugcguaaucc aggggguggg ugugacagaa acaccguuga ugaaggaaga cuccauacuu
gcugugcgca aguacuuuca gcggaucacu cuguaucuga aagagaagaa auauucuccu
ugcgcuuggg aggucgucag ggcggaaaua augcggucuu ucagccucuc uaccaaucug
caggaguccc ugagaucuaa ggaauga
配列番号:26 IFNa2bコンセンサス配列
auggcycuba chuuygchcu scusguggcm cukcukgusc uswsyugcaa rwshwsyugy
agygukggvu gcgaycubcc hcagacmcac wsmcugggsw shmgvmgvac ycugaugyug
cusgcycaga ugmgvmgmau hwsycuguuy wsyugycusa aggaycgsca ygayuucggs
uuycchcarg argaguucgg caaccaguuc cagaargcyg agachauccc ygurcukcay
garaugauyc agcaraumuu yaaycusuuy wscaccaagg acwscwsygc cgcyugggay
gagachyusc usgayaaruu yuayacygar cuguaycarc agcugaayga ycukgargcc
ugyguraumc agggbgurgg ygugacmgar acmccsyuka ugaaggarga ywsmauhcuk
gchgusmgsa aruayuuyca gcgsaumacy cuguaycuga argagaaraa ruaywsycch
ugygcyuggg argusgusmg sgcsgaraum augmgvwsyu uywsmcubws yacyaaycus
caggarwsyy ugmgvwshaa rgarura
配列番号:27 IFNa2bタンパク質
MALTFALLVA LLVLSCKSSC SVGCDLPQTH SLGSRRTLML LAQMRRISLF SCLKDRHDFG FPQEEFGNQF
QKAETIPVLH EMIQQIFNLF STKDSSAAWD ETLLDKFYTE LYQQLNDLEA CVIQGVGVTE TPLMKEDSIL
AVRKYFQRIT LYLKEKKYSP CAWEVVRAEI MRSFSLSTNL QESLRSKE
配列番号:28 IFNa1
auggccucgc ccuuugcuuu acugaugguc cugguggugc ucagcugcaa gucaagcugc
ucucugggcu gugaucuccc ugagacccac agccuggaua acaggaggac cuugaugcuc
cuggcacaaa ugagcagaau cucuccuucc uccugucuga uggacagaca ugacuuugga
uuuccccagg aggaguuuga uggcaaccag uuccagaagg cuccagccau cucuguccuc
caugagcuga uccagcagau cuucaaccuc uuuaccacaa aagauucauc ugcugcuugg
gaugaggacc uccuagacaa auucugcacc gaacucuacc agcagcugaa ugacuuggaa
gccuguguga ugcaggagga gaggguggga gaaacucccc ugaugaaugc ggacuccauc
uuggcuguga agaaauacuu ccgaagaauc acucucuauc ugacagagaa gaaauacagc
ccuugugccu gggagguugu cagagcagaa aucaugagau cccucucuuu aucaacaaac
uugcaagaaa gauuaaggag gaaggaauaa
配列番号:29 IFNa1
auggccucuc cauucgcccu gcugauggug cugguggugc ugagcugcaa gagcagcugc
agccugggcu gcgaccugcc ugagacacac agccuggaca accggcggac ccugaugcug
cuggcccaga ugagcagaau cagccccagc agcugccuga uggaccggca cgauuucggc
uucccucagg aagaguucga cggcaaccag uuccagaagg ccccugccau cagcgugcug
cacgagcuga uccagcagau cuucaaccug uucaccacca aggacagcag cgccgccugg
gacgaggacc ugcuggauaa guucugcacc gaacuguauc agcagcugaa cgaccuggaa
gccugcguga ugcaggaaga gagagugggc gagacacccc ugaugaacgc cgacucuauc
cuggccguga agaaguacuu ucggcggauc acccuguacc ugaccgagaa aaaguacagc
cccugcgccu gggaagucgu gcgggccgag aucaugagaa gccugagccu gagcaccaac
cugcaggaac ggcugcggcg gaaagaguaa
配列番号:30 IFNa1
auggccagcc ccuucgcccu gcugauggug cugguggugc ugagcugcaa gagcagcugc
agccugggcu gcgaccugcc cgagacccac agccuggaca accgccgcac ccugaugcug
cuggcccaga ugagccgcau cagccccagc agcugccuga uggaccgcca cgacuucggc
uucccccagg aggaguucga cggcaaccag uuccagaagg cccccgccau cagcgugcug
cacgagcuga uccagcagau cuucaaccug uucaccacca aggacagcag cgccgccugg
gacgaggacc ugcuggacaa guucugcacc gagcuguacc agcagcugaa cgaccuggag
gccugcguga ugcaggagga gcgcgugggc gagacccccc ugaugaacgc cgacagcauc
cuggccguga agaaguacuu ccgccgcauc acccuguacc ugaccgagaa gaaguacagc
cccugcgccu gggagguggu gcgcgccgag aucaugcgca gccugagccu gagcaccaac
cugcaggagc gccugcgccg caaggaguaa
配列番号:31 IFNa1
auggccucuc ccuucgcuuu gcugaugguu cucgugguuc ucagcugcaa guccuccugu
agucuggggu gugaccuucc cgagacucac agccuugaca accgacggac ucugaugcug
cuggcccaga ugagucgcau auccccuucu ucuugcuuga uggauagaca cgauuucggc
uucccucagg aggaguucga ugggaaccaa uuccagaaag cgccugcgau cagcguacuc
caugagcuga uccagcagau cuuuaauuug uucacaacga aggacagcag ugcugcuugg
gacgaagacc ugcuggacaa guucuguaca gaauuguacc agcagcugaa ugaccucgag
gccuguguga ugcaggagga aagagucggc gagacuccuc ucaugaacgc cgacagcauc
cucgccguga agaaguauuu ccggcggauc acccucuauc ugacagagaa gaaguacucc
cccugcgccu gggagguggu gcgagccgaa auaaugcgca gccucucucu gucaacuaau
cuccaggagc ggcuucggcg aaaggaguga
配列番号:32 IFNa1
auggcaucuc cauucgcucu gcugauggug cugguggucc ugucauguaa gagcagcugc
ucccuggggu gcgaucugcc agagacccac agccuugaca acagaagaac cuugaugcuc
uuggcccaaa ugucaagaau aagcccuagc ucaugucuga uggaccggca ugauuucggc
uuuccgcagg aggaguucga cggaaaucag uuucagaaag caccagcaau aagcgugcuc
cacgaacuca uucagcagau uuucaaucug uuuacuacaa aagauucauc cgcugcuugg
gaugaagacu ugcuugacaa guucugcacu gagcucuacc aacaacugaa cgaucuggag
gcaugcguca ugcaagagga gagagugggg gaaacccccc ugaugaacgc ugauuccaua
cuggccguga agaaauauuu ccgcagaauc acucuguacu ugacugagaa gaaguauucu
cccugcgcuu gggagguggu gcgcgcugag auaaugcggu ccuugucacu cagcaccaau
cuucaagagc ggcugaggcg caaggaauga
配列番号:33 IFNa1
auggccucuc ccuucgcucu ucucaugguc cuugucguuc ugaguuguaa gagcaguugu
uccuugggcu gugacuugcc cgaaacucac agucuggaca accgccgcac gcucaugcuc
cucgcccaga ugucacggau cagcccguca aguugccuga uggacaggca cgauuucggg
uucccacagg aagaguucga ugguaaucaa uuccaaaaag cuccugcaau uucuguacug
caugaacuua uucagcagau cuucaaccuc uuuaccacua aagauuccuc ugccgccugg
gaugaggauu ugcucgauaa guucugcacc gaacucuacc agcagcugaa cgaccucgag
gcuuguguua ugcaggaaga gcgggugggg gagacacccc ucaugaacgc cgacagcauu
cuggccguga aaaaguacuu uagaagaaua acgcuguacc ucaccgaaaa gaaauacucc
cccugcgcuu gggaggucgu gcgcgccgag auaaugcgcu cacucucuuu gagcacaaau
cuccaagaac ggcugaggag aaaagaguga
配列番号:34 IFNa1
auggcaucuc cuuucgcucu gcuuauggug cugguugugc ucucuugcaa guccagcugu
agccuuggau gcgaccuucc ugagacccau ucucuggaua accggaggac gcucaugcug
cuggcacaga ugagucggau cagcccgucc agcugucuca uggacaggca cgacuuuggu
uuuccccagg aggaguucga ugguaaccag uuccagaagg cgccagcaau aagcgugcug
cacgagcuga uucagcagau cuuuaaccuc uucacuacua aggacaguag cgcugcaugg
gacgaggauc uguuggauaa guucuguacg gaacuguauc agcagcucaa ugaucucgaa
gcauguguga ugcaagaaga gcgcgucggu gaaacuccac ugaugaacgc ugauagcauc
cuggccguua agaaauacuu uaggcgcauu acucuguauc ugacugagaa aaaguauagc
ccaugcgcau gggagguagu gcgagccgag aucaugcgca gccugucauu gucaacuaac
cuccaggaac gccuccgacg aaaggaguga
配列番号:35 IFNa1
auggcaucac ccuucgcucu gcugaugguc cugguggugc ugucauguaa auccagcugc
agcuugggau gcgaccugcc ggaaacacau ucccucgaca auaggcggac gcugaugcug
cucgcucaga ugucccgcau aagcccauca agcugccuca uggaccggca cgauuuuggu
uucccacagg aggaguucga uggaaaccag uuccagaagg cucccgcuau cuccguucug
caugagcuua uucagcagau uuucaaccuc uuuacgacaa aggauucauc cgccgccugg
gaugaagacc ugcuggauaa guucuguacc gaguuguacc aacagcugaa cgaucucgaa
gccuguguca ugcaggagga gcgcgugggg gagacucccu ugaugaacgc agacucaauu
cuugcaguga agaaauacuu ucgccggauu acucuuuauc ucaccgagaa gaaguacagu
cccugcgcau gggaagucgu ucgggccgaa aucaugcggu cccugucccu uuccaccaac
cugcaggaac gccuucgcag aaaagaguaa
配列番号:36 IFNa1コンセンサス配列
auggcmwshc chuucgcyyu gcukauggub cusgukgubc uswshugyaa rwscwscugy
wsyyukggvu gygaycukcc ngarachcay wsycubgaya aymgvmgvac byusaugcus
yusgchcara ugwshmgvau mwscccnwsh wshugyyusa uggaymgvca ygayuuyggy
uuyccncagg argaguucga yggnaaycar uuycagaarg cncchgcnau mwscgudcus
caygarcuba uycagcagau yuuyaayyus uuyacnacna argaywshws ygcygchugg
gaygargayy ugyukgayaa guucugyacn garyusuayc arcarcusaa ygaycusgar
gcmugygusa ugcargarga rmgmgusggb garachcchy usaugaacgc hgaywshauh
cubgcmguka agaaruayuu ymgsmgvauy acycubuayy usachgagaa raaguaywsy
ccmugcgchu gggarguvgu kcgvgcygar aumaugmgvw scyuswshyu bwsmacyaay
cubcargarc gscubmgvmg vaargarura
配列番号:37 IFNa1タンパク質
MASPFALLMV LVVLSCKSSC SLGCDLPETH SLDNRRTLM LLAQMSRISP SSCLMDRHDF
GFPQEEFDGN QFQKAPAISV LHELIQQIFN LFTTKDSSAA WDEDLLDKFC TELYQQLNDL
EACVMQEERV GETPLMNADS ILAVKKYFRR ITLYLTEKKY SPCAWEVVRA EIMRSLSLST
NLQERLRRKE
配列番号:38 一般式安定化配列（general formula stabilisation sequence）
yccancccwn ucycc
配列番号:39
agcgtggctg tctcctctc
配列番号:40
gagccttgaa tacagcaggc
配列番号:41
gcttgggatg agaccctcct a
配列番号:42
cccaccccct gtatcacac
配列番号:43
cacgagatga tccagcagat
配列番号:44
cttgtccagc agtgtctcgt
配列番号:45
ctgctctgtt ggctgtgatt
配列番号:46
caggcatgag aacaggctaa
配列番号:47
tgatgcttct tgcacaaatg
配列番号:48
aggacaggaa tggtttcagc
配列番号:49
caaggagtcg gagtgactga
配列番号:50
cagggtgat cctctggaag t
配列番号:51
ggctgtattc ccctccatcg
配列番号:52
ccagttggta acaatgccatg t
配列番号:53 5'末端および3'末端に天然IFNa2a UTRsを含む天然IFNa2a;ポリAテールの最初のAを含む(ポリA 120ヌクレオチド)
gggagaugag ccuaaaccuu aggcucaccc auuucaacca gucuagcagc aucugcaaca
ucuacaaugg ccuugaccuu ugcuuuacug guggcccucc uggugcucag cugcaaguca
agcugcucug ugggcuguga ucugccucaa acccacagcc uggguagcag gaggaccuug
augcuccugg cacagaugag gaaaaucucu cuuuucuccu gcuugaagga cagacaugac
uuuggauuuc cccaggagga guuuggcaac caguuccaaa aggcugaaac caucccuguc
cuccaugaga ugauccagca gaucuucaau cucuucagca caaaggacuc aucugcugcu
ugggaugaga cccuccuaga caaauucuac acugaacucu accagcagcu gaaugaccug
gaagccugug ugauacaggg ggugggggug acagagacuc cccugaugaa ggaggacucc
auucuggcug ugaggaaaua cuuccaaaga aucacucucu aucugaaaga gaagaaauac
agcccuugug ccugggaggu ugucagagca gaaaucauga gaucuuuuuc uuugucaaca
aacuugcaag aaaguuuaag aaguaaggaa ugaaaacugg uucaacaugg aaaugauuuu
cauuaauucg uaugccagcu caccuuuuua ugaucugcca uuucaaagac ucauguuucu
gcuaugacca ugacacgauu uaaaucuuuu ucaaauguuu uuaggaguau uaaucaacau
uguauucagc ucuuaaggca cuagucccuu acagaggacc augcugacug auccauuauc
uauuuaaaua uuuuuaaaau auuauuuauu uaacuauuua uaaaacaacu uauuuuuguu
cauauuacgu caugugcacc uuugcacagu gguuaaugua auaaaaua
コンセンサス配列の配列番号12、13、14、26および36は、以下のIUPAC命名法で示されている：
表１：IFNa2a変異体のコドン適応指数とGC含量（配列番号1は発現の標準である；配列番号2、3および5：高い；配列番号4：低い；したがってCAI>0.8およびGC含量>49,5％が好ましい；天然配列の配列番号1、18および28と比較して）
表２：IFNa2b変異体のコドン適応指数とGC含量（表１での好ましいCAIおよびGCはここでも適用される）
表３：IFNa1変異体のコドン適応指数とGC含量（表１での好ましいCAIおよびGCはここでも適用される）
材料および方法：
マウス3T3線維芽細胞およびヒトB.J.皮膚線維芽細胞のトランスフェクション：
トランスフェクションのために、マウス3T3線維芽細胞およびヒトB.J.皮膚線維芽細胞を12ウェルプレートに4-6x104細胞/ウェルで播種した。完全なEMEMまたはDMEM培地（Gibco、Thermo Fisher、USA）で24時間インキュベートした後、培地を交換した。TransIT mRNAトランスフェクション試薬（Mirus Bio；製造業者の指示に従う複合体形成）と複合した異なるIVT mRNA製剤を調製し、細胞に加えた。トランスフェクション後24時間で培地を完全なDMEMに交換した。結果を評価するまで毎日培地を交換しながら、細胞を最大5日間標準条件下でさらに培養した。
無傷のブタ皮膚生検の単離およびトランスフェクション：
ブタから全厚のブタ皮膚皮弁を死後に単離し（試料は現行の国内法（すなわちTierversuchsgesetz 2012、TVG 2012）に完全に準拠して取得される）、OcteniseptR消毒剤（Schuelke+Mayr GmbH、ドイツ）を使用して消毒した。
無傷のブタ皮膚のトランスフェクションは、IVT-mRNA溶液（1-10μg mRNA/用量）の直接皮内注射により行った。LacZ IVT mRNA（5-メチルシチジン、プソイドウリジンを使用して完全に修飾；Trilink Inc.、米国）は、製造元の指示に従って（Kaikoらによるわずかな変更を加えた；Mol. Ther. 2012. 20(5): 948-53）TransITR-mRNAトランスフェクションキット(Mirus BioTM)を用いるかまたはDOTAPベースのリポソーム製剤（Sigma Aldrich、米国）を用いて製剤した。DOTAPベースの製剤は、5/1（μg/μg）の脂質/RNA比を使用して調製した。さらに、mRNA複合体にRNAse阻害剤（5U/用量、RNasin、Promega、USA）をも追加した。注入量は20μlから30μLの範囲であった。
別法として、無傷のブタ皮膚のトランスフェクションは、eGFP IVT-mRNA溶液（0.5〜25μg mRNA/用量）の直接皮内注射によって行った。eGFP IVTmRNA（AMPTec、ドイツ）は、製造元の指示に従って（Karikoら、2012によるわずかな変更を加えた）TransITR-mRNAトランスフェクションキット（Mirus BioTM）を用いるか、またはDOTAPベースのリポソーム製剤（Sigma Aldrich、米国）、または脂質ナノ粒子製剤（Polymun、オーストリア）またはSAINTベースのリポソーム製剤（Synvolux、オランダ）を用いて製剤した。DOTAPベースのリポソーム製剤は、5/1（μg/μg）の脂質/RNA比を使用して調製した。SAINT脂質ベースの製剤は、2.5-4/1（μg/μg）の脂質/RNA比を使用して調製した。さらに、生理的緩衝液中の非複合mRNAも皮内に投与した。注入量は20μlから30μLの範囲であった。
注入後、注入領域のパンチ生検（直径8mm）を採取し、皮下脂肪を除去し、生検をペトリディッシュ中の標準の完全培地（5mL；以下を含む：GlutaMAX（DMEM）、10％FCS、1Xペニシリン-ストレプトマイシン-フンギゾンを含むダルベッコの改変イーグル培地；Gibco. Life Technologiesから入手）に表皮を上にして移した。その後の培養を37℃/5％CO2で24時間行った。生検の採取は、通常、トランスフェクションの24時間後に行った。
ブタ上皮シートの単離およびトランスフェクション：
ブタから全厚のブタ皮膚皮弁を死後に単離し（試料は現行の国内法（すなわちTierversuchsgesetz 2012、TVG 2012）に完全に準拠して取得される）、OcteniseptR消毒剤（Schuelke+Mayr GmbH、ドイツ）を使用して消毒した。パンチ生検（直径6または8mm）を全層の皮膚弁から採取し、皮下脂肪を除去し、生検を2つの部分に切断した。すぐに切断生検を表皮を上にして、5mLディスパーゼII消化液（約2.5単位/mL;ディスパーゼII; Sigma Aldrich、USA）を含む9cm（直径）ペトリ皿に移した。その後の消化を4℃で一晩行った。ディスパーゼII消化液は、ディスパーゼIIストック溶液（50mM HEPES/150mM NaCl中に10mg/mL；pH-7.4）を1xDMEM（Gibco）で1：2に希釈し、1xペニシリン/ストレプトマイシンを添加して調製した。翌日、ピンセットを使用して表皮シートを下にある真皮から除去し、短い（5分間）洗浄ステップのためにDMEMに移した。続いて、シートを完全なDMEM培地に入れ、24ウェル培養プレートでトランスフェクションを行うまで37℃/5％CO2でインキュベートした（6〜8時間）。ブタ表皮シートのトランスフェクションは、eGFP IVTmRNA（AmpTec、ドイツ）またはIFNa用のIVT mRNAコンストラクト（例えば、配列番号1〜5および配列番号53）を使用して行った。mRNAは、製造元の指示に従ってTransITR-mRNAトランスフェクションキット（Mirus BioTM）またはリポソーム製剤（Polymun、オーストリア）を使用して製剤した。5/1（μg/μg）の脂質/RNA比を使用して、リポソーム製剤を調製した。トランスフェクション用のリポプレックス溶液はすべて0.1μg〜10μg mRNA/mL DMEM培地を含み、表皮シートを1〜3日間培養した。
分析のため、組織培養上清をその後のELISA分析のために回収した。RNAおよびタンパク質の抽出、およびそれぞれqPCRとELISAによる分析のために、シートを回収した。さらに、eGFPをトランスフェクションした表皮シートも、直接蛍光顕微鏡法およびeGFPをその場で検出する免疫組織化学によってeGFP発現について分析した。
IVT mRNA調製物を使用してトランスフェクションした細胞のRT-PCR分析：
ヒトB.J.細胞およびマウス3T3線維芽細胞を、TransIT mRNAトランスフェクション試薬と複合した0.1〜1μg IFNa2 IVT mRNAを使用してトランスフェクションした。Tri-Reagent（Thermo Fisher、USA、製造元の指示）を使用したトランスフェクション後のさまざまな時点で、マウスおよびヒト線維芽細胞またはブタ上皮シートから全細胞RNAを単離し、mRNAを従来のRT-PCR（Protoscript First Strand cDNA合成キット、New England Biolabs、メーカーの指示に従って）によりcDNAに逆転写した。次に、cDNA試料を従来のPCRおよびqPCRにかけた。使用したプライマーは、Invitrogenから入手した。
IFNa2変異体を検出するPCR分析を、Platinum Taq Polymerase（Invitrogen、米国）およびIFNa2変異体特異的プライマー（Invitrogen、米国）を使用して異なるIFNa2変異体でトランスフェクションした細胞/シートから得られたcDNAから行った。ヒトRPL4およびマウスACTB（Eurofins Genomics）を正の対照として使用した。PCR産物を従来のアガロースゲル電気泳動を使用して分析した。
IVT mRNAにより誘導したヒトIFNa2タンパク質の分析：
TransIT mRNAトランスフェクション試薬と複合したさまざまなIFNa2変異体の0.1〜1μg IVT mRNAを使用してヒトB.J.細胞およびブタ上皮シートをトランスフェクションし、トランスフェクション後120時間まで培養した。トランスフェクションした細胞および上皮シートからの上清を、トランスフェクション後のいくつかの時点で得た。同様に、同じ時点で細胞を回収し、タンパク質を抽出した。細胞抽出緩衝液（10mM HEPES、10mM KCl、0.1μM EDTA、0.3％NP40およびRoche Protease Inhibitor、製造元のプロトコルに従う）を用い、タンパク質を抽出した。上清および細胞抽出物におけるIFN-αの測定を、ヒトIFN-α（サブタイプ2；IFNa2）ELISA developmentキット（MABTECH AB、スウェーデン、製造元の指示に従う）を使用して行い、測定はInfinite 200 PROマルチモードリーダー（Tecan AG、スイス）で行った。
IVT mRNA誘導eGFPタンパク質の分析：
無傷のブタ皮膚外植片およびブタ上皮シートを、TransIT mRNAトランスフェクション試薬または異なるリポソーム担体と複合した、または複合していない（生理学的緩衝液中の「裸」）0.1〜10μg eGFP IVT mRNAを使用してトランスフェクションし、トランスフェクション後24時間培養した。試料を回収し、細胞抽出緩衝液（10mM HEPES、10mM KCl、0.1μM EDTA、0.3％NP40、およびRoche Protease Inhibitor、製造元のプロトコルに従う）を用いてタンパク質を抽出した。GFPインビトロSimpleStepELISARキット（Abcam Plc., UK、製造元の指示に従う）を使用してeGFPの決定を行い、Infinite 200 PROマルチモードリーダー（Tecan AG、スイス）で測定を行った。
ブタ組織におけるβガラクトシダーゼ活性の検出：
生検の全組織標本βガラクトシダーゼ（bGal）染色を、24ウェル培養プレートで24時間または48時間、37℃で行った。正の染色対照を、ブタ皮膚にbGal酵素（1U組換えbGalタンパク質/注射）を皮内注射することにより生成した。染色手順を開始する前に、生検を室温で1時間4％ホルムアルデヒド溶液（PBS）で穏やかに固定した。固定後、試料をPBS（3x）で洗浄し、続いてLacZ洗浄緩衝液（PBSに溶解した2mM MgCl2、0.01％デオキシコール酸Naおよび0.02％NP-40）で平衡化した。LacZ緩衝液で平衡化した後、試料を一晩（4°C）貯蔵した。その後、試料を37℃の染色溶液中でインキュベートし、呈色反応をモニターした。染色溶液を新たに調製し（LacZ緩衝液中の5mM K4Fe(CN)6および5mM K3Fe(CN)6）、1mg/mLの5-ブロモ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（Bluo-Gal）を発色基質として加えた。染色を48時間行う場合、染色溶液を24時間後に置き換えた。染色量は一般に0.5 mL/ウェルであった。LacZ洗浄緩衝液および3xPBSで洗浄することにより、染色を停止した。その後、試料を緩衝4％ホルムアルデヒド溶液で一晩固定し、標準的な組織学のためにさらに処理するか、あるいはその後の組織学的分析のためにOCTで凍結した。
無傷のヒト皮膚生検の分離および微粒子銃トランスフェクション：
全層のヒト皮膚の皮弁を、標準的な審美および再建外科処置から取得し（試料は現在の国内法に完全に準拠して取得される）、OcteniseptR消毒剤（Schuelke+Mayr GmbH、ドイツ）を使用して消毒した。
微粒子銃mRNAトランスフェクションにはBioRad Helios遺伝子銃システムを使用した。このシステムに、IVT mRNAコーティング金粒子（1μg/μl IVT-mRNAをローディングした1.6μm金マイクロキャリア；Biorad、製造元のプロトコルによる）をローディングした。ヒト皮膚外植片まで2.5cmの距離で400psiのヘリウムガス圧を使用して、微粒子銃トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、トランスフェクション領域のパンチ生検（直径8mm）を採取し、皮下脂肪を除去し、生検をペトリ皿中の標準的な完全培地に表皮を上にして移した。生検は、5％CO2の気液界面で、αMEM+10％pHPL培地で24時間維持した。生検の採取は、通常、トランスフェクション後24時間で行った。
ヒト皮膚のin situでのeGFPタンパク質の分析：
微粒子銃トランスフェクションには、BioRad Helios遺伝子銃システムを使用し、ヒト皮膚外植片まで2.5cmの距離で400psiのヘリウムガス圧を使用して、eGFP-mRNAコーティング金粒子（1μg/μlのeGFP-mRNAをローディングした1.6μm金マイクロキャリア）を8mmのヒト皮膚外植片にローディングした。外植片は、5％CO2の気液界面で、αMEM+10％pHPL培地で24時間維持した。生検を4％パラホルムアルデヒド中、4℃で一晩固定し、10μmの凍結切片を得た。GFP抗体（抗GFP、ニワトリIgY）を用い、Alexa Fluor 488結合ロバ抗ニワトリIgY抗体により検出した。Alexa Fluor 568ファロイジンを使用してF-アクチンを染色することにより細胞骨格を検出し、対比染色のためにDAPI（4',6-ジアミジン-2-フェニルインドール）を含むRoti-mount Fluor Care DAPIにスライドをマウントした。スライドを、Olympus Slidescanner VS-120-L 100-Wシステムによって20倍の倍率でスキャンした。（A、B）のスケールバー＝500μm；（C-L）のスケールバー＝50μm
ホタルルシフェラーゼIVT mRNAのインビボ投与およびIVT mRNA誘導FLucタンパク質の分析：
すべての動物実験は、University Clinic for Swine（ウィーン獣医大学）でのみ実施され、ブタ（混合品種；Edelschwein x Pietrain）を使用してオーストリア動物実験法（TVG2012）に従って実施された。実験はウィーン獣医大学およびオーストリア連邦教育科学研究省の動物実験倫理委員会によって承認され、承認番号：GZ68.205/0192-WF/V/3b/2017の下で実施された。実験開始時のブタは30kg〜50kgであった。計画された注射の前日に、皮膚の刺激を可能な限り避けるため、すべての豚の脇腹をできるだけ広く慎重に剃る。注射の日に、ブタに麻酔をかける。注射の前に、剃毛した皮膚領域を温水で徹底的に洗浄し、Octenisept（Schuelke+Mayr GmbH、ドイツ）で2回消毒する。皮内注射は、インスリン注射器（BD Micro-FineTM+）を用いて30μLを注射した。注射スポットは適切なマーカー（SecurlineRLaboratory Markers）で明確にマークが付され、注射スキームに従って標識される。試料分析のため、注射後24時間および48時間で深い麻酔下、訓練を受けた人員によりブタを安楽死させた。すべての注射スポットを含む皮膚弁を切除し、すぐに氷上に置いた。標識された領域からのブタ皮膚生検を、10mmパンチ生検を使用して採取した。試料を、白い96ウェルプレート（MicroWellTM、Nunc）に入れた100μLのダルベッコ変法イーグル培地、DMEM、高グルコース（Gibco）に回収した。試料を直接ルシフェラーゼ活性測定にかけた。ホタルLucワンステップグローアッセイキット（Thermo Scientific、米国、製造元の指示に従う）を使用して測定を行い、Infinite 200 PROマルチモードリーダー（Tecan AG、スイス）で分析した。
トランスフェクションの24時間から120時間後のヒトBJ線維芽細胞から得られたcDNAからのIFNa2変異体特異的PCRによる異なるIFNa2変異体をコードするmRNAの検出：
IFNa2 mRNA変異体が長期間にわたってヒト皮膚線維芽細胞で安定であるかどうかを評価するため、配列番号1〜5をコードする異なるmRNAを使用してB.J.細胞をトランスフェクションした。RNAを異なる時点（トランスフェクション後24〜120時間）で単離し、トランスフェクションした細胞内のmRNAの存在を非定量的RT PCRによりトランスフェクション後120時間まで測定した。
結果：図1に示すように、すべてのIFNa2 mRNA変異体は、トランスフェクション後、評価したすべての時点で1μg mRNA/12ウェルを使用して検出でき、>120時間でのヒト細胞のコドン最適化またはGC含量に関係なく、mRNAの安定性を示していた。
図1は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬と複合した1μg mRNAを使用しないで、または使用してトランスフェクションしたBJ細胞を示す。トランスフェクション後のさまざまな時点（24時間〜120時間）で全細胞RNAを単離し、従来のRT-PCRによりmRNAをcDNAに逆転写した。次に、トランスフェクションしたIFNa2 mRNAおよびPCR対照としてのヒトRPL4（ctrとして示される）の検出のため、配列番号1〜5用のプライマーを使用してcDNA試料を変異体特異的PCRにかけた。したがって、存在するすべてのIFNa2a変異体は、ヒト細胞で長期間にわたって安定であった（ブタ上皮シートでもmRNAは長時間検出可能であった）。その結果、CAIおよびG+C含量に応じてIFNαの発現/分泌に差が生じる。
ヒトIFNαIVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間および72時間でのヒトBJ線維芽細胞の細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
ヒトシステムでの最適な翻訳効率のためのコドン最適化（コドン適応指数、CAIによって決定される）およびIFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）でのGC含量の同時増加がヒト皮膚線維芽細胞においてヒトIFNa2aタンパク質の発現を変化させるかどうかを評価するため、BJ線維芽細胞を異なるIFNa2a mRNA変異体でトランスフェクションした。配列番号1、2、3および5をコードするmRNAを使用して、BJ細胞をトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
結果：4つのIFNa2 mRNA変異体はすべて、評価したすべての時点で1μg mRNA/ウェルを使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図2）。天然ヒトIFNa2aおよび3つの変異体をコードするIVT mRNAの比較分析は、mRNAのCDSにおけるコドン最適化（すなわち、CAIレベル>0.8）およびG+C含量の増加（GC含量>49.5％）という予期しない組み合わせ効果を示した。図2は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μgmRNA/ウエル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションしたBJ細胞（4*104-5*104/ウエル）を示す。上清（<n＝6/条件(condition)）を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
閾値（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）を超えた配列は、初期および後期にIFNa2aの著しく高い発現レベルを誘導し、発現の大きさと寿命において野生型の天然配列よりも驚くほど高い利益を示した。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間および72時間でのヒトBJ線維芽細胞の細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）における閾値よりも低いGC含量（49.5％）および低CAIレベル（すなわち、CAI<0.8）について、差異的な（differential）コドン最適化の効果を評価した。BJ線維芽細胞を、上記のように、天然（配列番号１）ならびにCAI<0.8および／またはGC含量<49.5％を示す変異体（例えば：配列番号４）でトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
結果：両方のIFNa2 mRNA変異体は、評価したすべての時点で1μg mRNA/12ウェルを使用して、高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図3）。それにもかかわらず、天然の非修飾IFNa2a mRNAは、評価したすべての時点で配列番号4 mRNAと比較してIFNa2aタンパク質のより高い発現を示した。図3は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μg mRNA/ウェル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションしたBJ細胞（50.000/ウェル）を示す。上清（<n＝6/条件）を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
したがって、最適化を受けたが（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）の閾値を下回った配列は、ヒト細胞でIFNa2aを誘導する効率が低かった（発現の大きさおよび寿命）。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間および72時間でのブタ上皮シートの細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
ヒトシステムでの最適な翻訳効率のためのコドン最適化（コドン適応指数、CAIによって決定される）およびIFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）でのGC含量の同時増加がブタの皮膚においてヒトIFNa2aタンパク質の発現を変化させるかどうかを評価するため、ブタの皮膚に由来する上皮シートを異なるIFNa2a mRNA変異体でトランスフェクションした。配列番号1、2、3および5をコードするmRNAを使用して、上皮シートをトランスフェクションした。TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。その後、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後72時間まで測定した。
結果：4つのIFNa2 mRNA変異体はすべて、評価したすべての時点で1μg mRNA/ウェルを使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図4、詳細データについては図13も参照）。天然ヒトIFNa2aおよび3つの変異体をコードするIVT mRNAの比較分析は、mRNAのCDSにおけるコドン最適化（すなわち、CAIレベル>0.8）およびG+C含量の増加（GC含量>49.5％）という予期しない組み合わせ効果を示した。図4は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μgmRNA/ウエル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションしたブタ上皮シートを示す。上清（<n＝6/条件）を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
閾値（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）を超えた配列は、初期および後期にIFNa2aの発現レベルを著しく高く誘導し、無傷のブタ組織での発現の大きさと寿命において野生型の天然配列よりも驚くほど高い利益を示した。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間および72時間でのブタ上皮シートの細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）における閾値よりも低いGC含量（49.5％）および低CAIレベル（すなわち、CAI<0.8）について、差異的なコドン最適化の効果を評価した。ブタ上皮シートを、上記のように、天然（配列番号１）ならびにCAI<0.8および／またはGC含量<49.5％を示す変異体（例えば：配列番号４）でトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後72時間まで測定した。
結果：両方のIFNa2 mRNA変異体は、評価したすべての時点で1μg mRNA/12ウェルを使用して、高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図5）。それにもかかわらず、天然の非修飾IFNa2a mRNAは、評価したすべての時点で配列番号4 mRNAと比較してIFNa2aタンパク質のより高い発現を示した。図5は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μg mRNA/ウェル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションしたブタ上皮シートを示す。上清（<n＝6/条件）を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
したがって、最適化を受けたが（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）の閾値を下回った配列は、ブタ組織でIFNa2aを誘導する効率が低かった（発現の大きさおよび寿命）。
TransIT mRNAトランスフェクション試薬を使用して製剤したeGFP IVT mRNAによるトランスフェクション後24時間でのブタ上皮シートにおけるeGFPの検出：
この実施例では、実施例４および５で行った実験のトランスフェクション効率について、eGFP発現を正の対照として経時的にモニターした。
上記のように、ブタ上皮シートをTransITおよびeGFP mRNAと複合したTransITでトランスフェクションした。さらに、TransITおよびeGFP mRNAの第二の製剤（すなわち、0.5μg mRNA/ウェル）も投与量対照として含まれていた。続いて、トランスフェクションした組織におけるeGFPタンパク質の発現を直接蛍光顕微鏡法によりモニターした。
結果：分析した両実施例で同様のレベルのeGFP発現が検出可能であり、両方の実験でトランスフェクション効率の比較可能性が示された（図6）。重要なことに、eGFP発現の用量依存効果もこの実験で検出できた。
図6は、さまざまな濃度：0.5および1μg mRNA/mlで使用されるTransITで製剤されたeGFP mRNAを示す。トランスフェクション後24時間で、天然臓器試料をVectashield DAPI-Hardセット包埋媒体を使用してSuperfrostプラススライドガラスにマウントし、Apotome 2を搭載したZeiss AxioImage Z2顕微鏡を使用して直接蛍光検出を行った。リポソームのみで処理したシートと比較して、上皮シートのeGFP陽性細胞によりトランスフェクションの成功がそれぞれ検出された。
リポソームトランスフェクション試薬を使用して製剤したeGFP IVT mRNAによるトランスフェクション後24時間でのブタ上皮シートにおけるeGFPの検出：
この実施例では、別のトランスフェクション製剤によって誘導されたeGFP発現を経時的にモニターした。
上記の2つの異なるeGFP mRNA濃度（2μg/mlおよび10μg/ml mRNA）を使用して、ブタ上皮シートをリポソームベースの製剤でトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションした組織におけるeGFPタンパク質の発現を直接蛍光顕微鏡法によりモニターした。
結果：この実験では、eGFP発現が用量依存的に検出できた（図7および表5）。全体的なトランスフェクション効率は、それぞれ実施例4〜6で得られた結果に匹敵した。
図7は、さまざまな濃度：2および10μg mRNA/mlで使用されるリポソームで製剤されたeGFP mRNAを示す。トランスフェクション後24時間で、天然臓器試料をVectashield DAPI-Hardセット包埋媒体を使用してSuperfrostプラススライドガラスにマウントし、Apotome 2を搭載したZeiss AxioImage Z2顕微鏡を使用して直接蛍光検出を行った。リポソームのみで処理したシートと比較して、上皮シート中のeGFP陽性細胞の濃度依存性の増加によりトランスフェクションの成功がそれぞれ検出された。
DOTAPベースのリポソームトランスフェクション試薬を使用して製剤したLacZ IVT mRNAによるトランスフェクション後24時間でのブタ皮膚外植片における全組織標本β-ガラクトシダーゼ（bGal）活性の検出：
mRNA変異体がin situで哺乳動物の皮膚にトランスフェクションできるかどうかを評価するため、ブタの皮膚から得られたパンチ生検を異なるLacZ mRNA製剤でトランスフェクションした。この実施例では、皮内トランスフェクションにより誘導されたLacZ発現を、トランスフェクション後24時間での全組織標本β-ガラクトシダーゼ染色によりモニターした。
無傷のブタ皮膚のトランスフェクションを、IVT-mRNA溶液（5μg mRNA/用量；+/-Rnase阻害剤）の直接皮内注射により行った。DOTAPリポソームを用いてmRNAを製剤した。トランスフェクション後24時間で、臓器試料を全組織標本β-ガラクトシダーゼ（bGal）染色に供した。in situでのBluoGal染色により、トランスフェクションの成功が検出できる。続いて、注射領域のパンチ生検（直径8mm）を採取し、皮下脂肪を除去し、生検を24時間培養した。
結果：トランスフェクションした生検におけるbGal活性の検出により、LacZ発現を視覚化した（図8）。bGal活性は、LacZ mRNAの異なる製剤（+/-RNAse阻害剤）に匹敵し、トランスフェクションした生検の真皮上部の青色染色で見られるように、発現を検出できた。
様々なトランスフェクション試薬と非複合RNAを使用して製剤したeGFP IVT mRNAによるトランスフェクション後24時間でのブタ皮膚外植片におけるeGFP発現の検出：
mRNA変異体がin situで哺乳動物の皮膚にトランスフェクションできるかどうかを評価するため、ブタの皮膚から得られたパンチ生検を異なるeGFP mRNA製剤でトランスフェクションした。この実施例では、皮内トランスフェクションにより誘導されたeGFP発現を、トランスフェクション後24時間で得られた組織抽出物からのeGFPタンパク質ELISAによりモニターした。これらの線に沿って、eGFP mRNAのさまざまな製剤を製造し、注射した（詳細については表6を参照）。
使用した製剤には以下が含まれていた：TransIT mRNAトランスフェクション試薬と複合したeGFP mRNA、DOTAPベースのリポソーム製剤と複合したeGFP mRNA、SAINT脂質ベースのリポソーム製剤と複合したeGFP mRNA、脂質ナノ粒子を含むeGFP mRNA、および非複合eGFP mRNAとして生理学的緩衝液中で製剤した非複合eGFP mRNA。
無傷のブタ皮膚のトランスフェクションを、IVT-mRNA溶液（eGFP IVTm RNA（1〜25μg mRNA/用量））の直接皮内注射により行った。TransIT mRNAトランスフェクション試薬、DOTAPベースのリポソーム、SAINT脂質ベースのリポソーム、脂質ナノ粒子、または生理学的緩衝液中の非複合mRNAを用いてmRNAを製剤した。続いて、注射領域のパンチ生検（直径8mm）を採取し、皮下脂肪を除去し、生検を24時間培養し、その後eGFP発現について分析した。トランスフェクション後24時間で臓器試料をタンパク質抽出およびそれに続くeGFPタンパク質ELISAに供した。
結果：注射後24時間でのeGFPタンパク質ELISAにより、eGFP発現を検出できた（図9、表5）。eGFPリポプレックス（LNPおよびリポソーム複合体）およびTransIT（標準として使用）は、同様の濃度依存性eGFP誘導を示した。2.4μg〜5μg mRNA/用量で最適な発現が検出された。非複合mRNAもトランスフェクションの成功を示した。しかしながら、この実験設定においてブタ真皮で検出可能なeGFP発現を誘導するために必要な最小濃度は5μg mRNA/用量であり、トランスフェクション試薬の非存在下でmRNAのトランスフェクション効率が低いことを示した。
トランスフェクション後24時間〜120時間でマウス3T3線維芽細胞から得られたcDNAからのIFNa2変異体特異的PCRによる異なるIFNa2変異体をコードするmRNAの検出：
IFNa2 mRNA変異体がマウス線維芽細胞で長期間にわたって安定であるかどうかを評価するため、配列番号1〜5をコードする異なるmRNAを用いて3T3細胞をトランスフェクションした。RNAを異なる時点（トランスフェクション後24〜120時間）で単離し、トランスフェクションした細胞内のmRNAの存在を非定量的RT PCRによりトランスフェクション後120時間まで測定した。
結果：図10に示すように、1μg mRNA/12ウェルを使用したトランスフェクション後に、評価したすべての時点ですべてのIFNa2 mRNA変異体を検出できる。
図10は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬と複合した0.1〜1μg mRNAを使用しないで、または使用してトランスフェクションした3T3細胞を示す。トランスフェクション後のさまざまな時点（24時間〜120時間）で全細胞RNAを単離し、従来のRT-PCRによりmRNAをcDNAに逆転写した。次に、トランスフェクションしたIFNa2 mRNAおよびPCR対照としてのマウスACTB（ctrとして示される）の検出のため、配列番号1〜5用のプライマーを使用してcDNA試料を変異体特異的PCRにかけた。したがって、存在するすべてのIFNa2a変異体は、ヒト細胞で長期間にわたって安定であった。その結果、CAIおよびG+C含量に応じてIFNαの発現/分泌に差が生じる。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後96時間および120時間でのマウス3T3線維芽細胞の細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
ヒトシステムでの最適な翻訳効率のためのコドン最適化（コドン適応指数、CAIによって決定される）およびIFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）でのGC含量の同時増加がヒト皮膚線維芽細胞においてヒトIFNa2aタンパク質の発現を変化させるかどうかを評価するため、3T3線維芽細胞を異なるIFNa2a mRNA変異体でトランスフェクションした。配列番号1、2、3および5をコードするmRNAを使用して、3T3線維芽細胞をトランスフェクションした。その後、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
結果：4つのIFNa2 mRNA変異体はすべて、評価したすべての時点で1μg mRNA/ウェルを使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図11）。天然ヒトIFNa2aおよび3つの変異体をコードするIVT mRNAの比較分析は、mRNAのCDSにおけるコドン最適化（すなわち、CAIレベル>0.8）およびG+C含量の増加（GC含量>49.5％）という予期しない組み合わせ効果を示した。図11は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μgmRNA/ウエル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションした3T3細胞（4*104-5*104/ウエル）を示す。上清を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
閾値（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）を超えた配列は、初期および後期にIFNa2aの著しく高い発現レベルを誘導し、発現の大きさと寿命において野生型の天然配列よりも驚くほど高い利益を示した。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間でのマウス3T3線維芽細胞の細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）における閾値よりも低いGC含量（49.5％）および低CAIレベル（すなわち、CAI<0.8）について、差異的なコドン最適化の効果を評価した。3T3線維芽細胞を、上記のように、天然（配列番号１）ならびにCAI<0.8および／またはGC含量<49.5％を示す変異体（例えば：配列番号４）でトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
結果：両方のIFNa2 mRNA変異体は、評価したすべての時点で1μg mRNA/12ウェルを使用して、高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図12）。それにもかかわらず、天然の非修飾IFNa2a mRNAは、評価したすべての時点で配列番号4 mRNAと比較してIFNa2aタンパク質のより高い発現を示した。図12は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μg mRNA/ウェル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションした3T3細胞（40-50.000/ウェル）を示す。上清を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
したがって、最適化を受けたが（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）の閾値を下回った配列は、ヒト細胞でIFNa2aを誘導する効率が低かった（発現の大きさおよび寿命）。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後48時間でのブタ上皮シートの細胞抽出物からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
ヒトシステムでの最適な翻訳効率のためのコドン最適化（コドン適応指数、CAIによって決定される）およびIFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）でのGC含量の同時増加がブタ皮膚においてヒトIFNa2aタンパク質の発現を変化させるかどうかを評価するため、ブタ皮膚からの上皮シートを異なるIFNa2a mRNA変異体でトランスフェクションした。配列番号1、2、3および5をコードするmRNAを使用して、上皮シートをトランスフェクションした。TransIT単独を対照として使用した。その後、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後72時間まで測定した。
結果：4つのIFNa2 mRNA変異体はすべて、評価したすべての時点で1μg mRNA/ウェルを使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図13はトランスフェクション後48時間での例を示す）。天然ヒトIFNa2aおよび3つの変異体をコードするIVT mRNAの比較分析は、mRNAのCDSにおけるコドン最適化（すなわち、CAIレベル>0.8）およびG+C含量の増加（GC含量>49.5％）という予期しない組み合わせ効果を示した。図13は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μgmRNA/ウエル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションしたブタ上皮シートを示す。細胞抽出物を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
閾値（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）を超えた配列は、初期および後期にIFNa2aの著しく高い発現レベルを誘導し、無傷のブタ組織での発現の大きさと寿命において野生型の天然配列よりも驚くほど高い利益を示した。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間でのブタ上皮シートの細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質のレベルの評価による、配列番号1および配列番号3のmRNAと、UをプソイドUで、Cを5mCで100％置換したそれらの変異体との比較：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体の発現レベルに対する修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドUおよびm5C）の効果を評価する。ブタ上皮シートを、上記のように、2つの形態の天然（配列番号１）IVT mRNA：一つはUをプソイドUで、Cを5mCで100％置換したもの、一つは修飾ヌクレオチドのないもの、ならびにCAI>0.8および／またはGC含量<49.5％を示す2つの形態のIFNa変異体（配列番号3）（例えば、一つはUをプソイドUで、Cを5mCで100％置換した配列番号3の変異体、一つは修飾ヌクレオチドのないもの）でトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後24時間まで測定した。
結果：図14に示すように、細胞上清に分泌されたIFNa2aの検出によりIFNa2a発現を視覚化する。
閾値（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）を超えた配列は、初期および後期にIFNa2aの著しく高い発現レベルを誘導し、無傷のブタ組織での発現の大きさと寿命において野生型の天然配列よりも驚くほど高い利益を示した。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間〜120時間でのヒトBJ線維芽細胞の細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質のレベルの評価による、配列番号1および配列番号3のmRNAと、UをプソイドUで、Cを5mCで100％置換したそれらの変異体との比較：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体の発現レベルに対する修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドUおよびm5C）の効果を評価する。ヒトBJ線維芽細胞を、上記のように、2つの形態の天然（配列番号１）IVT mRNA：一つはUをプソイドUで、Cを5mCで100％置換したもの、一つは修飾ヌクレオチドのないもの、ならびにCAI>0.8および／またはGC含量<49.5％を示す2つの形態のIFNa変異体（配列番号3）（例えば、一つはUをプソイドUで、Cを5mCで100％置換した配列番号3の変異体、一つは修飾ヌクレオチドのないもの）でトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。続いて、トランスフェクションした細胞からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後24時間〜120時間まで測定した。
結果：図15に示すように、細胞上清に分泌されたIFNa2aの検出によりIFNa2a発現を視覚化する。
閾値（CAI>0.8およびGC含量>49.5％）を超えた配列は、初期および後期にIFNa2aの著しく高い発現レベルを誘導し、無傷のブタ組織での発現の大きさと寿命において野生型の天然配列よりも驚くほど高い利益を示した。
ヒトIFNa IVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間〜120時間でのヒトBJ線維芽細胞の細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質のレベルの評価による、配列番号1および配列番号53の比較：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。
ヒトBJ線維芽細胞を、完全にヒトのIFNa（配列番号53）、ならびに天然IFNaコード配列（CDS；配列番号1）を含むIVT mRNAでトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した（示さず）。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後120時間まで測定した。
結果：使用したIFNa2 mRNA変異体はすべて、評価したすべての時点で1μg mRNA/ウェルを使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図16）。それにもかかわらず、完全にヒトのIFNa（配列番号53）は、評価したすべての時点で配列番号1と比較してIFNa2aタンパク質のより低い発現を示した。図16は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μg mRNA/ウェル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションしたヒトBJ線維芽細胞を示す。上清を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
したがって、UTRおよび／またはCDS最適化を受けた配列は、完全にヒトのIFNa mRNAよりもブタ組織でIFNa2aを誘導するのに効率的であった（発現の大きさと寿命）。配列番号53と比較した配列番号1の増加の程度は、それぞれ、トランスフェクション後24時間で6.2倍、トランスフェクション後48時間で4.8倍、トランスフェクション後72時間で92.5倍である。
ヒトIFNa mRNA変異体およびヒトIVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間および48時間でのブタ上皮シートの細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。
ブタ上皮シートを、上記のように、完全にヒトのIFNa（配列番号53）、ならびに天然IFNaコード配列（CDS；配列番号1）を含むIVT mRNAならびにCDS変異体（配列番号3）を含むIVT mRNAでトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した（示さず）。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後48時間まで測定した。
結果：使用したIFNa2 mRNA変異体はすべて、評価したすべての時点で1μg mRNA/ウェルを使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図17）。それにもかかわらず、完全にヒトのIFNa（配列番号53）は、評価したすべての時点で配列番号1〜3と比較してIFNa2aタンパク質のより低い発現を示した。図17は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μg mRNA/ウェル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションしたブタ上皮シートを示す。上清を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
したがって、UTRおよび／またはCDS最適化を受けた配列は、完全にヒトのIFNa mRNAよりもブタ組織でIFNa2aを誘導するのに効率的であった（発現の大きさと寿命）。配列番号53と比較した増加の程度は、それぞれ、配列番号1で7.4倍、および配列番号3で8.6倍である。
ヒトIFNa mRNA変異体およびヒトIVT mRNA変異体のトランスフェクション後24時間での細胞培養上清および微粒子銃トランスフェクションしたヒト皮膚生検の組織抽出物からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質のレベルの評価：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。n=5の異なるドナーからのヒト皮膚生検を、Helios遺伝子銃システムを用い、上記のように、完全にヒトのIFNa（配列番号53）、ならびに天然IFNaコード配列（CDS；配列番号1）またはCDS変異体（配列番号2,3,5）を含むIVT mRNAで微粒子銃トランスフェクションした。トランスフェクションしていない皮膚およびeGFP IVT mRNAでトランスフェクションした皮膚を対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後24時間まで測定した。
結果：図18は、使用したmRNAに関係なく、金粒子のコーティングにおける同様の効果を示す。図19は、IVT mRNA粒子を使用してトランスフェクションしたヒト皮膚生検から分泌されたIFNa2aを示す。上清を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。図20は、IVT mRNA粒子を使用してトランスフェクションしたヒト皮膚生検からの皮膚組織におけるヒトIFNa2aタンパク質のレベルを示す。細胞抽出物を取得し、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。図21は、eGFP粒子の微粒子銃トランスフェクションを使用した表皮トランスフェクションを示す。
eGFP mRNAは、トランスフェクション後、ヒト皮膚からのヒトIFNa2aの非常に低いレベルの分泌を誘導している（157pg/ml；配列番号53（1873pg/ml）よりも12倍低い）。使用したIFNa2 mRNA変異体はすべて、1μg mRNA/μlローディング粒子を使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図18〜20）。それにもかかわらず、完全にヒトのIFNa（配列番号53）は、配列番号1〜5と比較してIFNa2aタンパク質のより低い発現を示した。したがって、UTRおよび／またはCDS最適化を受けた配列は、完全にヒトのIFNa mRNAよりもヒト組織でIFNa2aを誘導するのに効率的であった（発現の大きさと寿命）。5人のすべてのドナーにもとづく配列番号53と比較した増加の程度は、それぞれ、配列番号1で10.9倍、配列番号2で2.7倍、配列番号3で19.2倍、および配列番号5で5.8倍である。図19に示す個々のドナーは、上記の教示を支持するさまざまな大きさを示す。
eGFP mRNAは、トランスフェクション後、ヒト皮膚においてヒトIFNa2aの非常に低いレベルの分泌を誘導している（44pg/mg組織；配列番号53（1150pg/mg組織）よりも26倍低い）。使用したIFNa2 mRNA変異体はすべて、1μg mRNA/μlローディング粒子を使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図18〜20）。それにもかかわらず、完全にヒトのIFNa（配列番号53）は、配列番号1〜5と比較してIFNa2aタンパク質のより低い発現を示した。したがって、UTRおよび／またはCDS最適化を受けた配列は、完全にヒトのIFNa mRNAよりもヒト組織でIFNa2aを誘導するのに効率的であった（発現の大きさと寿命）。5人のすべてのドナーにもとづく配列番号53と比較した増加の程度は、それぞれ、配列番号1で4.2倍、配列番号2で1.4倍、配列番号3で10.1倍、および配列番号5で3倍である。図20に示す個々のドナーは、上記の教示を支持するさまざまな大きさを示す。
eGFP mRNAでのトランスフェクション後24時間での微粒子銃トランスフェクションしたヒト皮膚生検からの免疫蛍光分析によるeGFPタンパク質発現の評価
この実施例では、ヒトの皮膚におけるeGFPタンパク質の発現と局在性を評価した。eGFP IVT mRNAを備えたHelios遺伝子銃システムを用い、異なるドナーからのヒト皮膚生検を微粒子銃トランスフェクションした。空の金粒子で処理した皮膚を対照として使用した。続いて、トランスフェクション後24時間で生検を4％パラホルムアルデヒドで固定し、10μmの凍結切片でeGFP特異的免疫蛍光分析を実施した。
結果：図21に示すように、eGFPの広範な発現が、トランスフェクション後24時間で微粒子銃トランスフェクションしたヒトの皮膚で検出できる。興味深いことに、微粒子銃トランスフェクションは、F-アクチン陽性表皮区画（赤）で検出可能なe-GFP陽性で緑色の細胞で表される表皮区画に限定されており、下層の真皮区画にはなかった。この表皮ターゲティングは、表皮中の罹患した細胞（例えば、ケラチン生成細胞）を直接ターゲティングするという、これまで不可能で新規な概念の実現可能性と適用可能性を強く支持しており、それゆえ、イミキモドのような従来の免疫調節剤の局所適用により対処可能な潜在的な間接効果に加えて、IFNa mRNAを介したタンパク質発現によって罹患細胞に直接影響を与えるものである。
ヒトIFNa mRNA変異体およびヒトIVT mRNA変異体でのトランスフェクション後24時間および48時間でのブタ上皮シートの細胞培養上清からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質レベルの評価：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。
ブタ上皮シートを、上記のように、完全にヒトのIFNa（配列番号53）、ならびにCDS変異体（配列番号4）でトランスフェクションした。この場合も、TransIT単独およびeGFP mRNAと複合したTransITを対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後48時間まで測定した。
結果：使用したIFNa2 mRNA変異体はすべて、評価したすべての時点で1μg mRNA/ウェルを使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図22）。それにもかかわらず、完全にヒトのIFNa（配列番号53）は、評価したすべての時点で配列番号4と比較してIFNa2aタンパク質のより低い発現を示した。図20は、TransIT mRNAトランスフェクション試薬（1μg mRNA/ウェル）と複合したIVT mRNAを使用してトランスフェクションしたブタ上皮シートを示す。上清を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。示した値は、ng/ml IFNa2aタンパク質として測定されている。
したがって、UTRおよび／またはCDS最適化を受けた配列は、完全にヒトのIFNa mRNAよりもブタ組織でIFNa2aを誘導するのに効率的であった（発現の大きさと寿命）。
ヒトIFNa mRNA変異体およびヒトIVT mRNA変異体のトランスフェクション後24時間での細胞培養上清および微粒子銃トランスフェクションしたヒト皮膚生検の組織抽出物からのタンパク質ELISAによるヒトIFNa2aタンパク質のレベルの評価：
この実施例では、IFNa2 mRNA変異体のコード配列（CDS）におけるUTR修飾および差異的なコドン最適化の効果を評価した。n=5の異なるドナーからのヒト皮膚生検を、Helios遺伝子銃システムを用い、上記のように、完全にヒトのIFNa（配列番号53）、ならびにCDS変異体（配列番号4）を含むIVT mRNAで微粒子銃トランスフェクションした。トランスフェクションしていない皮膚およびeGFP IVT mRNAでトランスフェクションした皮膚を対照として使用した。続いて、トランスフェクションした組織からのヒトIFNa2aの分泌レベルを、トランスフェクション後24時間まで測定した。
結果：図23は、IVT mRNA粒子を使用してトランスフェクションしたヒト皮膚生検から分泌されたIFNa2aを示す。上清を得、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。図24は、IVT mRNA粒子を使用してトランスフェクションしたヒト皮膚生検からの皮膚組織におけるヒトIFNa2aタンパク質のレベルを示す。細胞抽出物を取得し、ヒトIFNa2特異的タンパク質ELISA（MABTECH）にかけた。
eGFP mRNAは、トランスフェクション後、ヒト皮膚からのヒトIFNa2aの非常に低いレベルの分泌を誘導している（157pg/ml；配列番号53（1873pg/ml）よりも12倍低い）。使用したIFNa2 mRNA変異体はすべて、1μg mRNA/μlローディング粒子を使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質分泌を誘導している（図23）。それにもかかわらず、完全にヒトのIFNa（配列番号53）は、配列番号4と比較してIFNa2aタンパク質のより低い発現を示した。したがって、UTRおよび／またはCDS最適化を受けた配列は、完全にヒトのIFNa mRNAよりもヒト組織でIFNa2aを誘導するのに効率的であった（発現の大きさと寿命）。図23に示す個々のドナーは、上記の教示を支持するさまざまな大きさを示す。
eGFP mRNAは、トランスフェクション後、ヒト皮膚においてヒトIFNa2aの非常に低いレベルを誘導している（44pg/mg組織；配列番号53（1150pg/mg組織）よりも26倍低い）。使用したIFNa2 mRNA変異体はすべて、1μg mRNA/μlローディング粒子を使用して高レベルのヒトIFNa2aタンパク質を誘導している（図24）。それにもかかわらず、完全にヒトのIFNa（配列番号53）は、配列番号4と比較してIFNa2aタンパク質のより低い発現を示した。したがって、UTRおよび／またはCDS最適化を受けた配列は、完全にヒトのIFNa mRNAよりもヒト組織でIFNa2aを誘導するのに効率的であった（発現の大きさと寿命）。図24に示す個々のドナーは、上記の教示を支持するさまざまな大きさを示す。
カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション試薬を使用して製剤したホタルルシフェラーゼIVT mRNAでのトランスフェクション後24時間および48時間でのブタ皮膚におけるホタルルシフェラーゼ活性のインビボ検出：
この実施例では、カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション製剤により誘導されるインビボホタルルシフェラーゼ（FLuc）発現を経時的にモニターした。ルシフェラーゼ活性を検出するため、上記のように、ブタ（約45kg、混合品種；Edelschwein x Pietrain）に2種類の異なるmRNA用量：1ng/μl（すなわち、0.03μg/用量）および3.3ng/μl（すなわち：0.1μg/用量）のmRNAならびに非複合mRNA（3.3ng/μl；すなわち：0.1μg/用量）を皮内注射した。天然の非トランスフェクション臓器試料（すなわち、皮膚生検）をバックグラウンド対照として使用した。その後、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションした組織を、トランスフェクション後24時間および48時間で直接活性測定によりモニターした。分析のため、注射部位を単離し、得られた生検材料をFirefly Luc One-Step Glow Assay Kitにかけた。トランスフェクションの成功は、生物発光によって検出された（検出：相対発光量（RLU））。
結果：トランスフェクション後、複合FLuc mRNAの両方の用量を使用してルシフェラーゼ活性を検出できた（図25）。この実験では、ルシフェラーゼ活性は、インビボでの皮内注射後24時間（図25A；0.03μg/用量でn=6試料、0.1μg/用量でn=9；非複合mRNA：n=3；未処理の生検：n=6）および48時間（図25B；0.03μg/用量でn=9試料；0.1μg/用量でn=9；未処理の生検：n=6）に、mRNA用量依存的に（0.1μgのFLuc mRNA複合体が誘導したRLU > 0.03μgのFLuc mRNA複合体が誘導したRLU）検出できた。非複合FLuc mRNAは、未処理の皮膚試料でもそれぞれ検出可能なバックグラウンドシグナルと同様のRLUを誘導した。
したがって、本発明は以下の好ましい態様に関する。
１．5'CAP領域、5'非翻訳領域（5'-UTR）、ヒトIFN-αをコードするコード領域、3'非翻訳領域（3'-UTR）およびポリアデノシンテール（ポリAテール）を有する、ヒト患者の非メラノーマ皮膚癌（NMSC）の予防および治療での使用のためのインターフェロンアルファ（IFN-α）メッセンジャーRNA（mRNA）。
２．NMSCが、光線角化症（AK）、基底細胞癌（BCC）および扁平上皮癌（SCC）、特にAKである、態様１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
３．IFN-α1型mRNA（IFNa1）、IFN-α2a型mRNA（IFNa2a）、およびIFN-α2b型mRNA（IFNa2b）から選ばれる、態様１または２に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
４．ポリAテールが、少なくとも100個のアデノシン一リン酸、好ましくは少なくとも120個のアデノシン一リン酸を含む、態様１〜３のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
５．5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが天然IFN-α mRNAとは異なるmRNAであり、好ましくは、5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが少なくとも1つの安定化配列、好ましくは一般式：(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC（配列番号38）（式中、「x」は、NxおよびPyxで独立して、0〜10、好ましくは0〜5、特に0、1、2、4および/または5の整数である）の安定化配列を含む、態様１〜４のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
６．5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが天然IFN-α mRNAとは異なるmRNAであり、少なくとも1つの不安定化配列エレメント（DSE）、好ましくはAUリッチエレメント（ARE）および/またはUリッチエレメント（URE）、特に九量体UUAUUUA(U/A)(U/Aの単一、タンデム、または複数または重複コピーを含む、態様１〜５のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
７．5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが天然IFN-α mRNAとは異なるmRNAであり、5'-UTRおよび/または3'-UTRが、アルファグロビン、ベータグロビン、アルブミン、リポキシゲナーゼ、ALOX15、アルファ（1）コラーゲン、チロシンヒドロキシラーゼ、リボソームタンパク質32L、真核生物伸長因子1a（EEF1A1）、オルソポックスウイルスに存在する5'-UTR要素、およびこれらの混合物から好ましくは選択され、特にアルファグロビン、ベータグロビン、アルファ（1）コラーゲン、およびその混合物から選択される、IFN-αとは異なるヒトmRNAの5'-UTRおよび/または3'-UTRである、態様１〜６のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
８．少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、好ましくは少なくとも30％、特に少なくとも50％の
− シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および／または
− シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および／または
− シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および／または
− シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および／または
− シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および／または
− アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される
態様１〜７のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
９．少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、好ましくは少なくとも30％、特に少なくとも50％の
− シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および／または
− ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換される
態様１〜８のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１０．GC/AU比が、少なくとも49.5％、好ましくは少なくとも49.6、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに一層好ましくは少なくとも55％、特に少なくとも60％である、態様１〜９のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１１．コドン適応指数（CAI）が少なくとも0.8、好ましくは少なくとも0.9である、態様１〜１０のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１２．コード領域がヒトIFNa2aをコードし、好ましくは配列番号12、特に配列番号2、3、5、6、7、8、9、10、または11である、態様１〜１１のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１３．コード領域がヒトIFNa2bをコードし、好ましくは配列番号26、特に配列番号19、20、22、または25である、態様１〜１０のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１４．コード領域がヒトIFNa1をコードし、好ましくは配列番号36、特に配列番号29、30、31、32、34、または35である、態様１〜１０のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１５．皮下、皮内、経皮、表皮、または局所、特に表皮に投与される、態様１〜１１のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１６．１ヶ月以内に、好ましくは毎週、少なくとも２回投与する、態様１〜１５のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１７．用量あたり0.001μg〜100mg、好ましくは用量あたり0.01μg〜100mg、より好ましくは用量あたり0.1μg〜10mg、特に用量あたり1μg〜1mgの量で投与される、態様１〜１６のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１８．0.8以上のCAIおよび48.7％以上のGC含量を有する、態様１〜１７のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
１９．0.8〜0.99、好ましくは0.81〜0.97、特に0.83〜0.85のCAIを有する、態様１〜１８のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
２０．48.7％〜63.7％、好ましくは48.7％〜60％、特に48.7％〜58.0％のGC含量を有する、態様１〜１９のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
２１．0.80〜0.97のCAIおよび48.7％〜63.7％のGC含量を有する、態様１〜２０のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
２２．0.6〜0.8のCAIおよび48.7％〜65.0％のAU含量を有する、態様１〜９および１２〜１７のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
２２．0.6〜0.8、好ましくは0.6〜0.7、特に0.65〜0.75のCAIを有する、態様１〜１０および１２〜１７のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
２３．48.7％〜65.0％、好ましくは51.3〜60.0％のAU含量を有する、態様１〜９および１１〜１７のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
２４．態様１〜２３のいずれか１に記載のIFN-α mRNAを含む、NMSC、好ましくはAK、BCCおよびSCC、特にAKの予防および治療での使用のための医薬製剤。
２５．薬学的に許容される担体、好ましくはポリマーベースの担体、特に、直鎖および分岐PEIおよびビロマーを含むカチオン性ポリマー；脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、カチオン性両親媒性脂質、例えば、：SAINT-Lipids、天然および合成由来のエキソソーム、天然、合成および半合成の層状体、ナノ粒子、リンケイ酸カルシウムナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、乾燥粉末、ポリ（D-アルギニン）、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、エマルジョン、ゾルゲル、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ペプチド結合体、ベクタータグ、好ましくは小分子標的結合体、またはウイルスキャプシドタンパク質、好ましくはバイオナノカプセルを含む、態様２４に記載の使用のための医薬製剤。
２６．直鎖および分岐PEIおよびビロマーを含むカチオン性ポリマー、脂質ナノ粒子およびリポソーム、トランスファーソーム、およびナノ粒子、好ましくはリン酸カルシウムナノ粒子を含む、態様２４または２５に記載の使用のための医薬製剤。
２７．該mRNAが非複合mRNAであり、好ましくは、該非複合mRNAが適切な緩衝水溶液、特に生理的グルコース緩衝水溶液中に含まれる、態様２４に記載の使用のための医薬製剤。
２８．1xHEPES緩衝液；1xリン酸緩衝液、Na-クエン酸緩衝液；酢酸ナトリウム緩衝液；好ましくはさらにグルコース、特に、5％グルコースを含む、態様２４〜２７のいずれか１に記載の使用のための医薬製剤。
２９．態様１〜２３のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNAを患者に投与するためのキットであって、
− 態様１〜２３のいずれか１に記載の使用のためのIFN-α mRNA、および
− 皮膚送達装置
を含む、キット。
３０．皮膚送達装置が、針ベースの注射システムおよび無針注射システムからなる群から好ましくは選択される皮内送達装置である、態様２９に記載のキット。
３１．皮膚送達装置が、経皮パッチ、中空および中実マイクロニードルシステム、微細構造経皮システム、電気泳動システム、およびイオン導入システムからなる群から好ましくは選択される経皮送達装置である、態様２９に記載のキット。
３２．皮膚送達装置が、無針注射システム、レーザーベースのシステム、特にエルビウム（Erbium）YAGレーザーシステム、および遺伝子銃システムからなる群から好ましくは選択される表皮送達装置である、態様２９に記載のキット。
３３．NMSC、好ましくはAK、BCCおよびSCCを治療および予防する方法であって、態様１〜２３のいずれか１に記載のIFN-α mRNAをそれを必要とする患者に有効量で投与することを特徴とする方法。
３４．天然のIFN-α mRNAを除く、請求項１〜２３のいずれか１に記載のヌクレオチド配列を含むmRNA分子。

Claims (15)

  1. 5'CAP領域、5'非翻訳領域（5'-UTR）、ヒトIFN-αをコードするコード領域、3'非翻訳領域（3'-UTR）およびポリアデノシンテール（ポリAテール）を有する、ヒト患者の非メラノーマ皮膚癌（NMSC）の予防および治療での使用のためのインターフェロンアルファ（IFN-α）メッセンジャーRNA（mRNA）であって、特に、NMSCが、光線角化症（AK）、基底細胞癌（BCC）および扁平上皮癌（SCC）、特にAKである、IFN-α mRNA。
  2. IFN-α1型mRNA（IFNa1）、IFN-α2a型mRNA（IFNa2a）、およびIFN-α2b型mRNA（IFNa2b）から選ばれる、請求項１に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  3. ポリAテールが、少なくとも100個のアデノシン一リン酸、好ましくは少なくとも120個のアデノシン一リン酸を含む、請求項１または２に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  4. 5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが天然IFN-α mRNAとは異なるmRNAであり、好ましくは、5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが少なくとも1つの安定化配列、好ましくは一般式：(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC（配列番号38）（式中、「x」は、NxおよびPyxで独立して、0〜10、好ましくは0〜5、特に0、1、2、4および/または5の整数である）の安定化配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  5. 5'-UTRまたは3'-UTRまたは5'-UTRおよび3'-UTRが天然IFN-α mRNAとは異なるmRNAであり、5'-UTRおよび/または3'-UTRが、好ましくはアルファグロビン、ベータグロビン、アルブミン、リポキシゲナーゼ、ALOX15、アルファ（1）コラーゲン、チロシンヒドロキシラーゼ、リボソームタンパク質32L、真核生物伸長因子1a（EEF1A1）、オルソポックスウイルスに存在する5'-UTR要素、およびこれらの混合物から選択され、特にアルファグロビン、ベータグロビン、アルファ（1）コラーゲン、およびこれらの混合物から選択される、IFN-αとは異なるヒトmRNAの5'-UTRおよび/または3'-UTRである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  6. 少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、好ましくは少なくとも30％、特に少なくとも50％の
    − シチジン残基が5-メチルシチジン残基で置換され、および／または
    − シチジン残基が2-アミノ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および／または
    − シチジン残基が2-フルオロ-2-デオキシシチジン残基で置換され、および／または
    − シチジン残基が2-チオシチジン残基で置換され、および／または
    − シチジン残基が5-ヨードシチジン残基で置換され、および／または
    − ウリジン残基がプソイドウリジン残基で置換され、および／または
    − ウリジン残基が1-メチルプソイドウリジン残基で置換され、および／または
    − ウリジン残基が2-チオウリジン残基で置換され、および／または
    − ウリジン残基が5-メチルウリジン残基で置換され、および／または
    − アデノシン残基がN6-メチルアデノシン残基で置換される
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  7. GC/AU比が、少なくとも49.5％、好ましくは少なくとも49.6、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに一層好ましくは少なくとも55％、特に少なくとも60％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  8. コドン適応指数（CAI）が少なくとも0.8、好ましくは少なくとも0.9である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  9. IFN-α mRNAのコード領域が
    − ヒトIFNa2aをコードし、好ましくは配列番号12、特に配列番号2、3、5、6、7、8、9、10、または11であるか、および／または
    − ヒトIFNa2bをコードし、好ましくは配列番号26、特に配列番号19、20、22、または25であるか、および／または
    − ヒトIFNa1をコードし、好ましくは配列番号36、特に配列番号29、30、31、32、34、または35である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  10. 皮下、皮内、経皮、表皮、または局所、特に表皮に投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNA。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のIFN-α mRNAを含む、NMSC、好ましくはAK、BCCおよびSCC、特にAKの予防および治療での使用のための医薬製剤。
  12. 薬学的に許容される担体、好ましくはポリマーベースの担体、特に、直鎖および分岐PEIおよびビロマーを含むカチオン性ポリマー；脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、カチオン性両親媒性脂質、例えば、：SAINT-Lipids、天然および合成由来のエキソソーム、天然、合成および半合成の層状体、ナノ粒子、リンケイ酸カルシウムナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、乾燥粉末、ポリ（D-アルギニン）、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、エマルジョン、ゾルゲル、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ペプチド結合体、ベクタータグ、好ましくは小分子標的結合体、またはウイルスキャプシドタンパク質、好ましくはバイオナノカプセルを含む、請求項１１に記載の使用のための医薬製剤。
  13. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNAを患者に投与するためのキットであって、
    − 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのIFN-α mRNA、および
    − 皮膚送達装置
    を含む、キット。
  14. 皮膚送達装置が、
    − 針ベースの注射システムおよび無針注射システムからなる群から好ましくは選択される皮内送達装置であるか、または
    − 経皮パッチ、中空および中実マイクロニードルシステム、微細構造経皮システム、電気泳動システム、およびイオン導入システムからなる群から好ましくは選択される経皮送達装置であるか、または
    − 無針注射システム、レーザーベースのシステム、特にエルビウム（Erbium）YAGレーザーシステム、および遺伝子銃システムからなる群から好ましくは選択される表皮送達装置である、請求項１３に記載のキット。
  15. NMSC、好ましくはAK、BCCおよびSCCを治療および予防する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のIFN-α mRNAをそれを必要とする患者に有効量で投与することを特徴とする方法。
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