WO1999061063A1

WO1999061063A1 - Preparations geniques stables

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Publication number: WO1999061063A1
Application number: PCT/JP1999/002595
Authority: WO
Inventors: Masaaki Terada; Takahiro Ochiya; Akihiko Sano; Akihiko Hisada; Shunji Nagahara
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited; Koken Co., Ltd.
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 1999-12-02
Also published as: CN1310632A; AU3848899A; EP1623723A3; KR20010043764A; AU755126B2; NZ508785A; EP1078639A4; JP4424850B2; CA2329129C; CA2329129A1; EP1623723A2; CN1173744C; EP1078639A1; US7052875B1; KR100600464B1

Description

一

1 明細書安定な遺伝子製剤技術分野

本発明は遺伝子治療に使用される安定な遺伝子製剤に関する。さらに詳細には、本発明は製造工程中および組成物の保存安定性が良好な遺伝子または該遺伝子を組み込んだべクターを含有する製剤に関する。背景技術

近年、疾病、特に遺伝病の治療あるいは予防を目的として遺伝子治療が試験的に臨床応用されるようになっている。遺伝子治療に関する研究の初期においては、細胞に導入される遺伝子の導入効率が高レ、ことを主たる理由としてウィルスをべクタ一として用いる手法が専ら研究されてきた。し力し、自己翻訳能力を有するプラスミド DNA(pDNA)を動物の筋肉内に直接投与することで遺伝情報を発現できることが見いだされて以来、 pDNAがウィルスベクターに比べて安全性が高く、また工業的に生産しやすいため、 pDNAを用いる遺伝子治療法が盛んに研究されるようになっている。

pDNAを用いる遺伝子治療の基礎研究における現在の最大の関心事は、 pDNAの細胞への導入効率の向上と遺伝情報発現期間の延長である。 pDNAの細胞への導入効率の向上を目的としては、 pDNAをカチオン性のリボソームに封入する方法やポリマーと複合体を形成させる方法が報告されている。また、遺伝情報発現期間を延長することを目的としては、生体との親和性が高いコラーゲン（特開平 9- 71542) あるいはポリエチレンビニル酢酸 (Journal of Control led Release 47, 123， (1997) ) を担体として用いた徐放性製剤に関する報告がなされている。これらの目的が解決できたとしても、遺伝子を含有している遺伝子製剤自体が一定の高品質を保持でき、安定かつ経済的に供給できなければ、実際には、遺伝子治療を広く普及させることはできない。

遺伝子製剤における有効成分たる遺伝子の生物活性を製剤の製造工程あるいは _

2 保存中に安定に保持させることは重要である。閉環状の pDNAを制限酵素で切断し、それを筋肉内に投与すると遺伝情報の発現が閉環状の pDNAを投与した場合の 1 0 %程度に低下することが知られている。よって、遺伝子の生物活性保持のために pDNAの一次構造を製造工程中あるいは様々な条件が予想される保存中に保持させることが重要となる。

先述の基礎研究においても pDNAの保存時の安定性に言及した報告が一部にあるか (Proceedings of National Academy of Sciences of the USA, 93. 7305 (1996) ) 、遺伝子製剤の製造あるいは製剤の安定性について系統的な検討はこれまで殆ど行われていない。後述の試験例に示すように、 pDNAを単独で含有する、または pDNAの導入効率を高めるための化合物もしくは遺伝子発現期間を延長するための化合物を添加した遺伝子調製物を、製剤化工程で一般に用いられる凍結乾燥条件に曝すと、あるいは品質が安定に保持されるべき保存状態に曝すと、有効成分である pDNAは分解を受け、生物活性が著しく損なわれてしまう。発明の開示

本発明者らは、安定な遺伝子製剤を得ることを目的として鋭意研究を重ねた結果、 pDNAを含有する溶液中に糖類および Zまたは非疎水性ァミノ酸類および/またはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）を添加した場合、またはコラ一ゲンまたはゼラチンを含有するときにはァミノ酸類を添加した場合、溶液状態での保存中および Zまたは当該溶液を凍結乾燥する工程中および/または当該溶液の乾燥品の保存中での pDNAの分解が大きく抑えられることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

本発明は 1つの態様として、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクタ一と、少なくとも 1つの糖類および/または少なくとも 1つの非疎水性アミノ酸類および Zまたは少なくとも 1つのカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）とを含む安定な遺伝子製剤に関する。

糖類は具体的には単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖またはそれらの糖アルコールであり、より具体的にはグルコース、ガラクト一ス、フルクト一ス、シユークロース、マ/レトース、ラクトース、トレノヽ口一ス、ソノレビトー/レまたはマンニト _

3 ールである。

非疎水性ァミノ酸類は具体的にはグルタミン酸、ァスパラギン酸またはその塩である。

カルボキシル基を 2個以上有する有機酸類は具体的にはカルボキシル基を 2個もしくは 3個有する有機酸またはその塩であり、より具体的にはクェン酸または酒石酸である。

所望の遺伝子を組み込んだベクターは具体的にはプラスミド D NAである。本発明の遺伝子製剤は、細胞への遺伝子導入を促進する物質、または医学的に許容される添加剤をさらに含んでもよい。細胞への遺伝子導入を促進する物質としてはカチオン性脂質、カチオン性ポリマーまたは疎水性ポリマーがある。医学的に許容される添加剤としては生体親和性材料がある。

本発明遺伝子製剤に含まれる所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクターは生体親和性材料に担持されていてもよレヽ。生体親和性材料は具体的にはコラーゲン、ゼラチンまたはそれらの混合物である。

本発明には、溶液状態、ゲル状態あるいは懸濁液状態である所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベタターを含む調製物を乾燥工程、好ましくは凍結乾燥に付することにより得られる本発明遺伝子製剤が包含される。

また、本発明には、溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態である遺伝子製剤または溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態の工程を経て製造される遺伝子製剤において、溶液状態、ゲル状態または懸濁液状態における糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）の全体に対する含有量が約 1 wZ v %以上である本宪明遺伝子製剤が包含される。本発明は別の態様として、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクタ一を含む遺伝子調製物に、少なくとも 1つの糖類および Zまたは少なくとも 1 つの非疎水性ァミノ酸類および Zまたは少なくとも 1つのカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）を添加することからなる、遺伝子製剤を安定化する方法に関する。

さらに別の態様として、本発明は本発明の遺伝子製剤を生体に投与することからなる遺伝子治療方法に関する。 .—

4 本発明は、もう 1つの態様として、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクター、少なくとも 1つのァミノ酸類、および生体親和性材料、特にコラ一ゲンまたはゼラチンを含む安定な遺伝子製剤に関する。かかる遺伝子製剤は、細胞への遺伝子導入を促進する物質、例えばカチオン性脂質、カチオン性ポリマ —または疎水性ポリマーをさらに含むことができる。本発明は、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクタ一が生体親和性材料、特にコラーゲンあるいはゼラチンに担持されていることを特徴とする遺伝子製剤を包含する。

本発明はこの態様においても、溶液状態、ゲル状態あるいは懸濁液状態である所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターを含む調製物を乾燥状態、特に凍結乾燥に付することにより得られる本発明遺伝子製剤を包含する。

また、本発明には、溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態である遺伝子製剤または溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態の工程を経て製造される遺伝子製剤において、溶液状態、ゲル状態または懸濁液状態におけるアミノ酸類の全体に対する含有量が約 1 w/ v %以上である本発明遺伝子製剤が包含される。

別の態様として、本発明は、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクタ一と生体親和性材料、特にコラーゲンまたはゼラチンとを含む遺伝子調製物に、少なくとも 1つのァミノ酸類を添加することからなる、遺伝子製剤を安定化する方法に関する。

さらに別の態様として、本発明は、上記本発明遺伝子製剤を生体に投与することからなる遺伝子治療方法に関する。図面の簡単な説明

図 1は、アミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例 1 ) に含まれる pCAHST - 1の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。

図 2は、糖類を含有する遺伝子製剤（実施例 2 ) に含まれる pCAHST- 1の一 7火構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。

図 3は、カルボキシル基 2個を含む有機酸類およびァミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例 3 ) に含まれる pCAHST-1の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。 _

5 図 4は、糖類および遺伝子導入促進成分を含有する遺伝子製剤（実施例 4 ) に含まれる pCAHST- 1の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。

図 5は、糖類を含有する遺伝子製剤（実施例 2 ) を 4 0 °Cで保存した後、 pCAHST-1の一次構造を評価した結果を示す電気泳動の写真である。

図 6は、糖類および遺伝子導入促進成分を含有する遺伝子製剤（実施例 4 ) を

3 7 °C- 4週間保存した後、 pCAHST-1の一次構造を評価した結果を示す電気泳動の写真である。

図 7は、糖類および遺伝子導入促進成分を含有する溶液状遺伝子製剤（実施例 5 ) を 4 0 °C- 4週間保存した後、 pCAHST - 1の一次構造を評価した結果を示す電気泳動の写真である。

図 8は、コラーゲンを含有するスポンジ状遺伝子製剤（実施例 7 ) に含まれる pCAHST-1の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。

図 9は、コラーゲンを含有する棒状の遺伝子製剤（実施例 8 ) に含まれる pCAHST-1の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。

図 1 0は、コラーゲンを含有する棒状の遺伝子製剤（実施例 8 ) における血中での pCAHST - 1の検出期間を示すグラフである。

図 1 1は、コラーゲンを含有する棒状の遺伝子製剤（実施例 8 ) における血中の HST-1濃度の経時変化を示すグラフである。

図 1 2は、試験例 1 0における投与部位での HST-1量の経時変化を示すグラフである。

図 1 3は、実施例 1 0における血中の血小板数の経時変化を示すグラフである。図 1 4は、アミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例 9 ) に含まれる pCAHST- 1の凍結乾燥時の安定化度を示すグラフである（試験例 1 1 ) 。

図 1 5は、糖類を含有する遺伝子製剤（実施例 1 0 ) に含まれる pCAHST-1の凍結乾燥時の安定化度を示すグラフである（試験例 1 2 ) 。

図 1 6は、ァテロコラーゲンおよびアミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例 1 1 ) に含まれる pCAHST- 1の凍結乾燥時における安定ィヒ度を示すグラフである（試験例 1 3 ) 。

図 1 7は、ァテロコラーゲンおよび糖類を含有する遺伝子製剤（実施例 1 2 ) _

6 に含まれる pCAHST-lの凍結乾燥時における安定化度を示すダラフである（試験例 1 4 ) ₀

図 1 8は、アミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例 9 ) および糖類を含有する遺伝子製剤（実施例 1 0 ) を 4 0 °Cで保存した場合の pCAHST-1の安定化度を示すグラフである（試験例 1 5 ) 。

図 1 9は、ァテロコラーゲンおよびアミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例 1 1 ) およびァテロコラーゲンおよび糖類を含有する遺伝子製剤（実施例 1 2 ) を 4 0 °Cで保存した場合の pCAHST- 1の安定化度を示すグラフである（試験例 1 6 ) 。発明を実施するための最良の形態

上記のように、本発明の要旨は、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクターと少なくとも 1つの糖類および Zまたは少なくとも 1つの非疎水性ァミノ酸類および Zまたは少なくとも 1つのカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類とを含む安定な遺伝子製剤、ならぴに所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクター、コラーゲンまたはゼラチンおよび少なくとも 1つのアミノ酸類を含む安定な遺伝子製剤である。本発明製剤は別の局面では、これら糖類、非疎水性ァミノ酸類および Zまたは有機酸類を含む、あるいはコラーゲンまたはゼラチンおよびアミノ酸類を含む、含有される遺伝子またはベクターの安定化（分解抑制作用）増強製剤である。

「所望の遺伝子」としては、遺伝子治療が可能な遺伝子であればいずれでもよい。ここに、遺伝子治療とは、遺伝子を用いて行われる治療を意味する。例えば、遺伝子治療時に発現が要求されるタンパク質の遺伝子情報をコードする遺伝子、細胞内で特定の DNAや RNAと対合し遺伝子の発現を抑制するァンチセンス配列が挙げられる。アンチセンス配列は、ベクター等に組み込まれることなく使用することができる。

「所望の遺伝子を組み込んだベクター」としては、細胞内に導入されたとき、コードした遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が好ましく、プロモータ一等、目的遺伝子の発現に必要な要素を含有する、あるいは染色体への組み込みを可能とする要素を含有するベクター、例えば pDNAが挙げられる。本発明の遺伝子製剤中には、別個の所望の遺伝子を組み込んだ数種類のべクタ —が同時に存在してもよい。また、一つのベクタ一には複数の遺伝情報がコードされていてもよい。遺伝子製剤中に含有されるベクターの量に特に制限はない。遺伝子治療時に発現が要求されるタンパク質をコードする遺伝子には遺伝病の処置に用いられ得る遺伝子、例えばアデノシンデァミナーゼ、チミジンキナーゼ等の酵素類、 GM-CSF, IL- 2等のサイトカイン類、または繊維芽細胞増殖因子 HST- 1 (FGF4)をコードする遺伝子が挙げられるがこれに限られるものではな!/、。また、遺伝子治療時に発現が要求される別のタンパク質をコードする遺伝子として、発現されるタンパク質あるいはペプチドが抗原として免疫を誘導し、感染症もしくは腫瘍の予防または治療を行うことを目的とする遺伝子、即ち上記の抗原となり得るタンパク質あるいはぺプチドをコ一ドする遺伝子、例えばインフルエンザゥィルスの表面タンパク質である HAや NAまたは核タンパク質である NPの各タンパク質、 C型肝炎ウィルスの E2や NS 1タンパク質、 B型肝炎ウィルスの HBs抗原タンパク質、 A型肝炎ウィルスのカプシドタンパク質である VP 1や VP 3、あるいはカプシド様タンパク質、デングウィルスの Egpタンパク質、 RSウィルスの Fあるいは G タンパク質、狂犬病ウィルスの構造タンパク質である Gや Nタンパク質、ヘルぺスウィルスの gDタンパク質、日本脳炎ウィルスの E 1あるいは pre - Mタンパク質、口タウィルスの外殻糖タンパク質 VP 7や外殻タンパク質 VP 4 、ヒト免疫不全ウイルスの gp 120や gp 160タンパク質、 Leishmania majorの主要表面抗原タンパク質、マラリァのスポロゾィドの主要表面抗原（circum sporozoite protein)タンパク質、トキソプラズマの 54-kdや CSタンパク質、虫歯の原因となる Str印 tococcus mutansの菌体表層タンパク質 PAcをコードする遺伝子；また、 MAGE- 1、 MAGE- 3または BAGEなどの癌退縮抗原や、チロシナーゼ、 Mart- 1、 gpl00、 gp75などの組織特異抗原、 pl5、 Mucl、 CEA、 HPV E6、 E7、 HPR2/neuなどをコードする遺伝子、および I Immunization witn DNA」： Journal of Immunological Methods, 176 卷， 1994年， 145 - 152頁に記載されている遺伝子の核酸を挙げることができるが、これに限定されるものではない。

「糖類」としては、医学的に許容される単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖もしくはこれらの糖アルコールまたはこれらの誘導体が挙げられる。本発明の遺伝子 —

8 製剤に添加されることにより、製剤の安定性を改善するならば、糖類の種類は特に限定されない。また、本発明遺伝子製剤は 2つ以上の糖類の混合物を含有することができる。

糖類としては例えば、単糖としてグルコース、ガラクトース、フルクトース等が挙げられ、好ましくはグルコースである。二糖としてはシユークロース、マルトース、ラクトース、トレハロースが好ましい例として挙げられる。

糖アルコ一ルとしてはソルビトール、マンニトール等が挙げられ、好ましくはマンニト一ノレである。

糖誘導体には、デォキシ糖、アミノ糖、リン酸エステル類等、およびこれらを構成成分とする二糖がある。

「非疎水性アミノ酸類」とは、アミノ酸類の中でも、非疎水性の性質を有するアミノ酸類を意味する。ここに、「非疎水性」とは、水との親和性が比較的強い性質を意味し、本発明では、グリシンの水親和性を基準として、それよりも水親和性が強い性質を「非疎水性」と称する。なお、水親和性を数値ィヒする指標は、例えは yte， J. &Doolittele, R. R , 1982, J. Mol. Biol. 157, 105-132に記載されている。この基準によれば、非疎水性でないアミノ酸はグリシン、ァラニン、メチォニン、フエ二ルァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンである。「非疎水性ァミノ酸類」として、好ましくはグレタミン、ァスパラギン、グルタミン酸ナトリウム、ァスパラギン酸ナトリウム、プロリンが挙げられ、より好ましくはグルタミン、グルタミン酸ナトリウム、ァスパラギン酸ナトリウムが挙げられる。コラ一ゲンまたはゼラチンを含む本発明製剤における「アミノ酸類」としては医学的に許容されるアミノ酸およびその塩、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。本発明の遺伝子製剤に添カ卩されることにより、製剤の安定性を改善するならばァミノ酸類はこれらに限定されない。ァミノ酸類としてはグルタミン酸またはァスパラギン酸などの酸性アミノ酸のみならず、一般に塩基性アミノ酸として分類されるリジン、アルギニン、ヒスチジン、および酸性、塩基性アミノ酸以外のグリシン、ァラニン、メチォニン、プロリン、シスチン、セリン、スレオニン、ァスパラギン、グルタミン、イソロイシン、システィン、チロシン、トリプトフアン、ロイシンも包含される。よって、本発明におけるアミノ酸類とは、その水 _

9 溶液における液性とは無関係であり、他に塩基性あるいは中性の側鎖が存在しているアミノ酸も包含される。アミノ酸の塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。コラーゲンまたはゼラチンを含む本発明製剤における「アミノ酸類」として、好ましくはグルタミン、ァスパラギン、グルタミン酸ナトリウム、ァスパラギン酸ナトリウム、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、リジンが挙げられる。より好ましくは、コラーゲンと DNAの静電的な相互作用を弱める働きを有するグルタミン酸ナトリウム、ァスパラギン酸ナトリウム、アルギニン、ヒスチジン、リジンが挙げられ、さらに好ましくはアルギニン、ヒスチジンが挙げられる。

「カルボキシル基を 2個以上有する有機酸」としては、医学的に許容される力ルポキシル基を 2個以上する有機酸（アミノ酸類を除く）およびその塩、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。本発明の遺伝子製剤に添加されることにより、製剤の安定性を改善するならば有機酸類の種類はァミノ酸類以外であれば、特に限定されない。

カルボキシル基を 2個以上有する有機酸およびその塩としては、好ましくは力ルポキシル基を 2あるいは 3個含む有機酸およびその塩が挙げられ、より好ましくは飽和または不飽和脂肪族の該有機酸である。カルボキシル基を 2あるいは 3 個含む有機酸およびその塩として、例えばクェン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸およびその塩が挙げられ、好ましくはクェン酸、酒石酸の塩である。本発明の遺伝子製剤には、上記の糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類のいずれかを含有する製剤およびこれらのうち任意の 2者または 3者すベてを含有する製剤が含まれ、またいずれの場合でも糖類、アミノ酸類および有機酸類ともに一つ以上を含有することができる。

本発明の遺伝子製剤における、糖類、非疎水性アミノ酸類、カルボキシル基を 2個以上有する有機酸類の個別の、またはこれらを混合して用いた場合の全体の含有量、あるいはコラーゲンもしくはゼラチンを含む本発明遺伝子製剤におけるアミノ酸類の含有量は、本発明製剤に含有される遺伝子またはベクターの分解を抑制する効果が得られる量以上に設定することが望ましいが、該遺伝子またはべクタ一の濃度および量あるレ、は遺伝子製剤の実施形態によつて適宜設定すること _

10 ができる。例えば、 pDNAを 1 0 μ g /m 1の濃度で溶解した 150mM NaCl, lOm Tris- HCl (pH7. 4)溶液を凍結乾燥して目的の遺伝子製剤を得る、あるいはこのようにして乾燥した遺伝子製剤を保存する場合には、 l % (w/v)以上の糖類および/ または非疎水性ァミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類を溶液に含有することが好ましい。なお、乾燥前あるいは実施形態である溶液状態の遺伝子製剤の通常用いられる pHは pH5〜pH8の範囲であるが、好ましくは pH6〜_PH8の範囲であり、より好ましくは pH7〜pH8の範囲である。

本発明遺伝子製剤には、医学的に許容される添加剤あるいは遺伝子発現を改善し得る物質を添加することができる。糖類、アミノ酸類および有機酸類の量は従つてこれらの添加剤の種類および量によっても変動し得る。

医学的に許容される添加剤として、例えば生体親和性材料あるいはゴマ油、スクヮレン等の油類等が挙げられるがこれに限定されるものではな!/、。

添加剤として使用する生体親和性材料に所望の遺伝子または該遺伝子を含むベクタ一を担持させれば、本発明遺伝子製剤を徐放性製剤にすることができる。ここに言う生体親和'性材料とは、例えば、 1 ) コラーゲン、ゼラチン、フイブリン、アルブミン、ヒアルロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、ぺクチン、ァガロースおよびアラビアゴム、 2 ) グリコール酸、乳酸、アミノ酸の重合体およびこれらの二以上の共重合体、ならびに、 3 ) ハイドロキシアパタイト、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォロエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレン等を挙げることができるがこれに限られるものではない。好ましい例として、コラーゲン、ゼラチンまたはその混合物が挙げられる。

ここに、「担持させる」とは、所望の遺伝子または該遺伝子を含むベクターを生体親和性材料に均一に分散または包括させることを意味する。

遺伝子発現を改善し得る物質としては、遺伝子の細胞への導入を促進する物質または遺伝子の核への移行を促進する物質を挙げることができる。前者の例として、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、疎水性ポリマー等を挙げることができる。「カチオン性脂質」として、 DOTMA ( N— [ 1— ( 2 , 3—ジォレイルォキシ）プロピル] —N—トリメチルアンモニゥムクロライド）、 D0SPA ( 2 , 3 .一

11 ージォレイルォキシ _ N— [ 2 - (スペルミンカルポキサミド）ェチル] _ N， N_ジメチルー 1一プロパンアミニゥムトリフルォロアセテート）、 DDAB (ジメチルジォクタクレシノレアンモニゥムブロミド）、 TM- TPS (N, N ¹ , Ν^π， N^m—テトラメチル _ Ν， Ν' , Ν' '， Ν' "—テトラパルミチルスペルミン）、 DMRIE ( 1， 2—ジミリスチルォキシプロピル一 3—ジメチルヒドロキシェチルアンモニゥムブロミド）、 Ν _ ( α—トリメチルアンモニオアセチル）ージドデシル— D—グノレタメートクロフィト (Biochemical Biophysical Research Communication, 196, 1042 (1994) ) 等が挙げられ、これらのカチオン性脂質と DOPE (ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン）等の中性脂質からなるカチオン性リポソーム、カチオン性脂質とコレステロールとの混合物も用いることができる。「力チオン性ポリマー」は遺伝子と静電的な相互作用をするポリマーであり、例えば DOGS (ジォクタデシルァミドグリシルスペルミン）等のリポポリアミン、 AlkCWK _{1 8}等のペプチド、ポリリジンやその誘導体 (Proceedings of Academy Sciences of the USA, 89, 6094 (1992) ) 等のカチオン性ポリアミノ酸およびその誘導体、ポリエチレンィミン、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。「疎水性ポリマー」は遺伝子と疎水的な相互作用をするポリマ一であり、例えばポリビニルアルコールやポリビュルピロリドン等が挙げられる。その他、 AlkCWK₁₈等のぺプチドも用いることができる。ここに、カチオン性リボソームとしては、例えば D0SPAと DOPEを 1 ： 1で含む LIPOFECTAMINE (登録商標、 Life Technologies, Inc. , ロックビル, MD， USA) 、 D0TMAと DOPEを 1 ： 1で含むリボソーム、 DDABと DOPEを

1 ： 2 . 5で含む LIP0FECTACE (登録商標、 Life Technologies, Inc. ,ロックビル， MD, USA) 、 TM - TPSと DOPEを 1 ： 1 . 5で含む CELLFECTIN (登録商標、 Life Technologies, Inc.，ロックビル, D， USA) 等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、ここで言うカチオン性脂質とコレステロールの混合物とは、例えは 1DMRIEとコレステロ一ルのモル比で 1 ： 1の混合物である DMRIE- C (Life

Technologies, Inc. ,ロックビル， MD， USA) を挙げることできる。あるいは、遺伝子の細胞内におけるェンドソームでの分解を抑えるために、例えばェンドソームの内容物を放出する能力を有する不活化したアデノウイルス、 CHEMS (コレステロールへミスクシネートモルホリン塩）等を用いることもできる。一

12 遺伝子の核への移行を促進する物質としては、 HMG— 1、 2混合物 (high mobility group_l, 2 mixture：実験医学， 12， 184 (1994) ) 等を挙げることがでさる。

本発明遺伝子製剤の形状には特に制限はなく、例えば溶液状、懸濁液状、ゲル状、スポンジ状、粉末状、微粒子状、棒状、フィルム状などの形態をとることができる。

溶液状の遺伝子製剤の製造方法としては、例えば、

1) 必要に応じて添加剤を添加した所望の遺伝子または該遺伝子を含有するべクターの溶液に糖類および/または非疎水性ァミノ酸類およびまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類を加えて溶解し、均一な溶液状態の遺伝子製剤を得る方法、および

2) 必要に応じて添加剤を添加した所望の遺伝子または該遺伝子を含有するべクターの溶液に糖類および/または非疎水性ァミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類の溶液を加えて混合し、均一な溶液状態の遺伝子製剤を得る方法、が挙げられる。

あるいは、コラーゲンまたはゼラチンを含む溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望の遺伝子または該遺伝子を含有するべクターの溶液およびァミノ酸類またはアミノ酸類の溶液を加えて溶解または混合し、均一な溶液状態の遺伝子製剤を得る方法も包含される。

微粒子状の遺伝子製剤の製造方法としては、例えば、

1) 所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および/または非疎水性ァミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添カ卩した溶液を噴霧乾燥する方法、および

2) 所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および/または非疎水性アミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕する方法、が挙げられる。

あるいは、コラーゲンまたはゼラチンを含む溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望の遺伝子または該遺伝子を含有するべクタ一の溶液およびァミノ酸類一

13 またはァミノ酸類の溶液を加えて溶解または混合して得た溶液を噴霧乾燥し、あるレ、は該溶液を凍結乾燥し該凍結乾燥品を粉砕する方法も包含される。

棒状の遺伝子製剤の製造方法としては、例えば、

1) 所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および/または非疎水性アミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を噴霧乾燥して得られた微粒子を棒状に圧縮成形する方法、

2) 所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および Zまたは非疎水性ァミノ酸類および/またはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して得られた微粒子を棒状に圧縮成形する方法、

3) 所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および Zまたは非疎水性ァミノ酸類および/またはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添カ卩した溶液を凍結乾燥し、得られたスポンジを棒状に圧縮成形する方法、

4) 所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および Zまたは非疎水性ァミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を凍結乾燥し、得られたスポンジに水等を加えた後、練合し、ノズルから棒状に押し出し、乾燥する方法、および

5) 所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および/または非疎水性ァミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添カ卩した溶液を噴霧乾燥し、得られた微粒子を液状あるいは混粘可能な程度に柔らかいゴム状のシリコーンと混合し、硬化剤を加え、ノズルから棒状に押し出す方法、が挙げられる。

あるいは、コラ一ゲンまたはゼラチンを含む場合は、上記方法にコラーゲンまたはゼラチンおよびアミノ酸類を使用する以外は同様の方法が包含される。

本発明の遺伝子製剤は、治療目的の疾患、標的臓器等に応じ、種々の方法で投与することができる。例えば、皮下、筋肉内等に投与することができ、また腎臓、肝臓、肺、脳等の疾患の対象部位に直接投与することができる。疾患部位に直接 _

14 投与すれば臓器選択的に治療することができる。

本発明により得られる遺伝子製剤の効果を、所望の遺伝子を含有するベクターとしてプラスミド D N A (pDNA) を用いた場合を例に以下説明する。

1) pDNA単独あるいは pDNAと糖類、非疎水性ァミノ酸類およびカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類以外の添加物（医学的に許容される添加剤、生体親和性材料、遺伝子導入を促進する物質等）を含有した溶液を製剤化すべく一般に用いられる凍結乾燥に付した場合、いずれの場合も凍結乾燥後に pDNAの分解がみられるが、糖類および Zまたは非疎水性ァミノ酸類および /またはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類を含有する組成で凍結乾燥した場合、これらを含まない組成で凍結乾燥した場合に比べて、 pDNAの分解が抑制された。

2) pDNA単独あるレ、は pDNAと糖類、非疎水性ァミノ酸類およびカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類以外の添加物（医学的に許容される添加剤、生体親和性材料、遺伝子導入を促進する物質等）を含有した溶液を乾燥させて得た乾燥品を 40°Cで保存した場合、いずれの場合も pDNAの分解が見られるが、糖類および/または非疎水性ァミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類を含有する組成の溶液を乾燥させて得た乾燥品を保存した場合、これらを含まない場合に比べて、 pDNAの分解が抑制された。

3) pDNAとコラーゲンまたはゼラチンを含有する溶液を製剤化すべく一般に用いられる凍結乾燥に付した場合、いずれの場合にも凍結乾燥後に pDNAの分解が見られるが、アミノ酸類を含有する組成で凍結乾燥した場合、これらを含まない組成で凍結乾燥した場合に比べ、 pDNAの分解が抑制された。

4) pDNAとコラーゲンまたはゼラチンを含有する溶液を乾燥させて得た乾燥品を 4 0 °Cで保存した場合、いずれの場合も pDNAの分解が見られるが、アミノ酸類を含有する組成の溶液を乾燥させて得た乾燥品を保存した場合、これらを含まなレヽ場合に比べ、 pDNAの分解が抑制された。

このような糖類および Zまたは非疎水性ァミノ酸類および/またはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類を含有する組成による pDNAの安定化効果は、上記のような乾燥工程および乾燥状態での保存時のみならず、溶液状態でも得ることができる。特に、遺伝子の導入効率を向上させることを目的に用いられるカチォ —

15 ン脂質類を含有した組成でその効果が顕著である。すなわち、

5) pDNA単独あるいは pDNAと糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類以外の添加物（医学的に許容される添加剤、生体親和性材料、遺伝子導入を促進する物質等）およびカチオン脂質類を含有した組成の溶液を溶液状態で保存した場合、いずれの場合も pDNAの分解が見られるが、糖類およびまたは非疎水性ァミノ酸類および Zまたはカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類を含有する組成の溶液を保存した場合、これらを含まない場合に比べて、 pDNAの分解が抑制された。

前記本発明製剤の遺伝子分解抑制（安定化）効果は、後述の試験例と表 9に具体的に示されている。

また、本発明で得られた HST- 1/FGF4をコードする pDNAとコラーゲンおよびグルコースからなる棒状の遺伝子製剤をマウスの筋肉内に投与した場合、投与後 38日間に亘って血中に pDNAが検出され、投与後 60日以上に亘って HST-1遺伝子の発現が血中および投与部位で認められた。一方、溶液で pDNAを投与した場合には、投与後 30日間し力 HST-1遺伝子の発現が認められなかった。この結果は、 pDNAはコラ一ゲンおよびグルコースからなる棒状の遺伝子製剤から徐放されたのと同時に、遺伝子製剤内で長期間安定に保存されていることを示している。実施例

以下に実施例、参考例および試験例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例および試験例により限定されるものではない。以下の実施例にぉレ、ては、繊維芽細胞増殖因子 HST-1 (FGF4)の遺伝子（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980- 2984 (1987) )を組み込んだプラスミドベクタ一 pCAHST- 1を含む製剤の調製につき説明する。 HST- 1遺伝子産物は巨核球に対して血小板増加因子として作用するものであり、癌の化学療法や放射線療法の際の重篤な副作用である血小板減少症を効果的に抑制することが明らかとなつている

(J. Clin. Invest. , 96 : 1125-2230, 1995, Oncogene, 13 : 9-19, 1996) 。 pCAHST- 1 は、発現ベクター pCAGGS (Gene, 108， 193 - 200 (1991) )の CAGプロモータ一部とポリ A配列との間に HST - 1遺伝子を組み込んだプラスミドベクタ一である。なお、 CAGプロモーターは、高発現ベクターとして特開平 3-168087号公報に記載されている。実施例 1

アミノ酸を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）

1 0 μ g / 1の pCAHST - 1および 1 0 m g /m 1のグリシン、ァラニン、グルタミン酸ーナトリゥムまたはリジン塩酸塩を含有する 150mM NaCl, 10m Tris- HCl (pH7. 4)溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の 1 m 1を一 40°Cで凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。

実施例 2

糖類を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）

1 0 M g /m 1の pCAHST_lおよび 1 0 m g Zm 1のグルコース、シユークロース、マルト一ス、ラクトースまたはマンニトールを含有する 150mM NaCl, lOmM Tris- H (pH7. 4)溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の 1 m 1を— 40°Cで凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。

実施例 3

カルボキシル基 2個以上を含む有機酸類およびァミノ酸を含有する遺伝子製剤 (乾燥状態）

1 0 μ g /m 1の pCAHST- 1および 1 0 m g /m 1のグルタミン酸ーナトリゥム、ァスパラギン酸ナリゥム、酒石酸ナトリゥムニ水和物またはクェン酸三ナトリウムニ水和物を含有する 150mM NaCl, 10mM Tris_HCl (pH7. 4)溶液を調製した。調製した溶液の l m 1を一 40°Cで凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。

実施例 4

糖類およびカチオン性脂質を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）

3 μ g /m 1の pCAHST- 1、 2 4 μ g /m 1の DMRIE- C (Gibco BRL社製、遺伝子導入促進成分）および 1 O m g Zm lのシユークロースを含有する OmM NaCl , _

17 lOmM Tris- HC1(_PH7.4)溶液を調製した。調製した溶液の l m 1を一 40°Cで凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。

実施例 5

糖類および遺伝子導入促進成分を含有する遺伝子製剤（溶液状）

150mM NaCl, 10mM Tris_HCl (pH7.4)溶液に、 pCAHST- 1、 DMRIE- C (Gibco BRL社製）およびグルコースをそれぞれの最終濃度が 3 μ g/m 1 24 μ g/m 1 Omg/m 1になるように混合した。このようにして、液状の遺伝子製剤を得た。

実施例 6

徐放性遺伝子製剤（ゲル状）

0. 1 wZw%ァテロコラーゲン溶液 (50 Omg) に 1 00 / g/m 1の pCAHST- 1溶液 (200 1 ) および 1 0 m g 1のグルコース、シユークロースまたはグルタミン酸ーナトリゥム溶液（5 00 μ 1 ) を加え、混合後 37°Cに保温することによって、ゲル状の遺伝子製剤を調製した。なお、本実施例および以下の実施例 ·参考例において用いたァテロコラーゲンは（株）高研から入手できる。

実施例 7

徐放性遺伝子製剤（スポンジ状）

実施例 6で調製した、グルコースを含有するゲル状の遺伝子製剤を凍結乾燥した。これにより 500 μ gのァテロコラーゲン、 20 μ gの pCAHST - 1、 5mgのグルコース、シュ一クロースまたはグルタミン酸ナトリウム塩を含有するスポンジ状の遺伝子製剤を得た。

実施例 8

徐放性遺伝子製剤（棒状）

0. 8 6 wZwO/oァテロコラーゲン溶液（2 9. l g) に水（60 g) 、 1 1 mg m 1のグルコース溶液（1 0m l ) を加え混合した後、 1 0 0 g/m 1 の pCAHST_l溶液（80m l ) を加え混合した。得られた溶液を凍結乾燥した後、この凍結乾燥品に適当量の蒸留水を加えて練合した。その後、練合品をシリンジ一

18 に入れ押し出しを行い、さらに乾燥して pCAHST-1の収率 7 4 %の製剤を得た。すなわち、 1 m gあたり 1 7 μ gの pCAHST- 1、 3 0 0 μ gのグルコースを含有する棒状の遺伝子製剤を得た。参考例

アミノ酸を加えないこと以外は、実施例 1に記載の操作に従い、乾燥状態の組成物を調製した。

参考例 2

シユークロースを加えないこと以外は、実施例 4に記載の操作に従い、乾燥状態の組成物を調製した。

参考例 3

グルコースを加えないこと以外は、実施例 5に記載の操作に従い、液状の組成物を得た。

参考例 4

糖類の溶液またはグルタミン酸ーナトリゥム溶液を加えないこと以外は、実施例 6および 7に記載の操作に従い、 5 0 0 μ gのァテロコラーゲンおよび 2 0 μ gの pCAHST-lを含有するスポンジ状の組成物を得た。

参考例 5

グルコース溶液を加えないこと以外は、実施例 8に記載の操作に従い、 l m g あたり 2 0 μ gの pCAHST- 1を含有する棒状の乾燥組成物を得た。

参考例 6

pCAHST - 1溶液を加えないこと以外は、実施例 8に記載の操作に従い、 1 m gあたり 3 0 0 μ gのグルコースを含有する棒状の乾燥組成物を得た。試験例 1

凍結乾燥時におけるアミノ酸の遺伝子分解抑制効果

実施例 1の遺伝子製剤および参考例 1の組成物を、凍結乾燥直後に水に溶解し、ァガロ一ス電気泳動に付して pCAHST - 1の一次構造を評価した。

ァガロース電気泳動は水平型電気泳動ユニット（M u p i d、（株）ァドノ _

19 ス）にて、 T A E緩衝液中で 0 . 8 %ァガロースゲルを用いて行った。電気泳動後、ェチジゥムブロマイドでゲルを染色し、トランスイルミネーター上で撮影した。その映像を写真スキャナーで取り込み、一次構造が保持されたスーパーコィル型 pDNA (CC) と切断された pDNA (0C) のバンドを含むすべてのバンドの強度を解析ソフトで算出し、 CCの比率、すなわち一次構造保持率（CC保持率）を計算した。この場合、無処理の pDNAの CC保持率を 1 0 0とした。試験例 2以降においてもァガロース電気泳動を実施する場合にはこの方法を用いた。

得られた結果を以下の表 1および図 1に示す。図中、 C Cは一 7火構造が保持されたスーパーコイル型 pCAHST- 1を示し、 O Cは切断された pCAHST- 1を示す。各レ一ンは次を意味する；

レーン 1：分子量マーカー（ L Hind III)

レーン 2：無添加（参考例 1 )

レーン 3 _:グルタミン酸ーナトリウム（実施例 1 )

レーン 4：グリシン（実施例 1 )

レーン 5：ァラニン（実施例 1 )

レーン 6：フエニノレアラニン

レ一ン 7 _: リジン塩酸塩（実施例 1 )

レーン 8：無処理

表 1

ァミノ酸を含有する pCAHST_l溶液の凍結乾燥後の CC保持率（％無処理）処 ¾ CC保持率（％無処理）

無添加（参考例 1 ) 7 2

グルタミン酸ーナトリウム（実施例 1 ) 9 6

ダリシン（実施例 1 ) 7 9

ァラニン（実施例 1 ) 8 3

フエ二ルァラニン 7 3

リジン塩酸塩（実施例 1 ) 8 4

無処理 1 0 0

結果は、グルタミン酸ーナトリゥムを製剤に加えることで、ァミノ酸無添加の .

20 製剤に比べて、 pCAHST-1の分解が抑えられることを示している。試験例 2

凍結乾燥時における糖類の遺伝子分解抑制効果

実施例 2の遺伝子製剤および参考例 1の組成物を、凍結乾燥直後に水に溶解し、試験例 1の操作に従い、ァガロース電気泳動に付して pCAHST- 1の一次構造を評価した。得られた結果を以下の表 2および図 2に示す。結果は、グルコース、シュ一クロース、マルトース、ラクト一スおよびマンニトールを製剤に加えることで、糖類無添加の製剤に比べて pCAHST-1の分解が大幅に抑えられることを示している。表 2

糖類を含有する pCAHST- 1溶液の凍結乾燥後の CC保持率（％無処理）

処方 ― _CC保持率（％無処理） ―

無添加（参考例 1) 78

グルコース（実施例 2) 95

シユークロース（実施例 2) 96

マルトース（実施例 2) 95

ラタトース（実施例 2) 00

マンニトール（実施例 2) 95

無処理 00

図 2中、 CCは一次構造が保持されたスーパ一コイル型 pCAHST - 1を示し、〇C は切断された pCAHST- 1を示す。各レーンは次を意味する；

レーン 1：分子量マーカ一（ Hind III)

レーン 2 _:無添カ卩（参考例 1)

レーン 3：グノレコース（実施例 2)

レーン 4 :シユークロース（実施例 2)

レーン 5 :マルトース（実施例 2)

レーン 6：ラクトース（実施例 2)

レーン 7：マンニトール（実施例 2)

レーン 8：無処理 .

21

試験例 3

凍結乾燥時におけるカルボキシル基 2個以上を含む有機酸類およびァミノ酸の遺伝子分解抑制効果

実施例 3の遺伝子製剤および参考例 1の組成物を凍結乾燥直後に水で溶解し、試験例 1に記載の操作に従って、ァガロース電気泳動に付して pCAHST- 1の一次構造を評価した。得られた結果を以下の表 3および図 3に示す。結果は、ダルタミン酸ーナトリゥム、ァスパラギン酸ナトリゥム、酒石酸ナトリゥムニ水和物あるいはクェン酸三ナトリゥムニ水和物を製剤に加えることで、有機酸類無添加の製剤に比べて pCAHST - 1の分解が大幅に抑えられることを示している。

表 3

カルボキシル基 2個以上を含む有機酸類およびァミノ酸

を含有する PCAHST-I緩衝液の凍結乾燥後の CC保持率 (。/。無処理）

処方 CC保持率（％無処理）無添カ卩（参考例 1 ) 7 6 グルタミン酸ーナトリウム（実施例 3 ) 1 0 3 ァスパラギン酸ナトリウム（実施例 3 ) 9 1 酒石酸ナトリゥムニ水和物（実施例 3 ) 9 5 クェン酸三ナトリゥムニ水和物（実施例 3 ) 1 0 2

無処理 1 0 0 図 3中、 C Cは一次構造が保持されたスーパーコイル型 pCAHST- 1を示し、 O C は切断された pCAHST- 1を示す。各レーンは次を意味する；

レーン 1：分子量マーカー（ Hind III)

レーン 2 _:無添カ卩（参考例 1 )

レーン 3：グルタミン酸ーナトリウム（実施例 3 )

レーン 4：ァスパラギン酸ナトリウム（実施例 3 )

レーン 5：酒石酸ナトリゥムニ水和物（実施例 3 )

レーン 6：クェン酸三ナトリゥムニ水和物（実施例 3 )

レーン 7：無処理 _

22

試験例 4

カチオン性脂質を含有する遺伝子溶液の凍結乾燥時におけるシュ一クロースの遺伝子分解抑制効果

実施例 4の遺伝子製剤および参考例 2の組成物を凍結乾燥直後に水で溶解し、試験例 1の操作に従ってァガロース電気泳動に付して pCAHST-1の一次構造を評価した。得られた結果を以下の表 4および図 4に示す。結果は、シユークロースを製剤に加えることで、無添力卩の製剤に比べて pCAHST - 1の分解が抑制されることを示している。

表 4

カチオン性脂質を含有する pCAHST-1溶液の凍結乾燥後の CC保持率（％無処理）

^ ≤ CC保持率（％無処理）

無添カ卩（参考例 2 ) 6 9

シュ一クロース（実施例 4 ) 1 0 0

無処理 1 0 0

図 4中、 C Cは一次構造が保持されたスーパーコイル型 pCAHST- 1を示し、 O C は切断された pCAHST- 1を示す。各レーンは次を意味する；

レ一ン 1：分子量マーカ一（ Hind III)

レーン 2：無添加（参考例 2 )

レーン 3 : シユークロース（実施例 4 )

レーン 4：無処理試験例 5

4 0 °C保存時におけるグルコースの遺伝子分解抑制効果（ 1 )

実施例 2の遺伝子製剤のうちグルコース処方の乾燥状態の製剤および参考例 1 の組成物を 4 0 °Cで 1、 2、および 4週間保存した。保存後の pCAHST- 1の一次構造を試験例 1の操作に従ってァガロース電気泳動で評価した。得られた結果を以下の表 5および図 5に示す。結果は、グルコースを製剤に加えることで、ダルコース無添加の製剤に比べ、係る条件下での pCAHST-1の保存安定性が大幅に改善さ一

23 れることを示している。

表 5

グルコースを含有する pCAHST- 1乾燥品の 40 °C保存後の CC保持率（％無処理）処 ≤ CC保持率（％無処理）無添カ卩（参考例 1 40 °C_ 1週間） 67

無添カ卩（参考例 1 40 °C— 2週間） 56

無添カ卩（参考例 1 40 °C— 4週間） 34

グルコース（実施例 2 40 °C— 1週間） 92

ダルコース（実施例 2 40。C一 2週間） 9 1

グルコース（実施例 2ノ 40 °C— 4週間） 71

無処理 1 00

図 5中、 CCは一次構造が保持されたスーパーコイル型 pCAHST-1を示し、 OC は切断された pCAHST-1を示す。各レーンは次を意味する；

レーン 1：分子量マーカー（ Hind III)

レーン 2：無添カ卩（参考例 1 Z40°C_ 1週間）

レーン 3 _:無添カ卩（参考例 1 40°C— 2週間）

レーン 4：無添加（参考例 1 Z40 °C_ 4週間）

レーン 5：グルコース（実施例 2Z40°C- 1週間）

レーン 6：グルコース（実施例 2 40°C— 2週間）

レーン 7：ダルコ一ス（実施例 2Z40°C_4週間）

レーン 8：無処理試験例 6

37°C保存時におけるシユークロースの遺伝子分解抑制効果

実施例 4の遺伝子製剤および参考例 2の組成物を 37 °Cで 4週間保存した。保存後の pCAHST- 1の構造を試験例 1記載のァガロース電気泳動で評価した。得られた結果を以下の表 6および図 6に示す。結果は、シユークロースを製剤に加えることで、シュ一クロース無添加の製剤に比べ、係る条件下での pCAHST-1の保存安定性が大幅に改善されることを示している。 ―

24

表 6

カチオン性脂質を含有する pCAHST- 1溶液の乾燥品

37 _4週間保存後の((保持率（％無処理） _

^ ≤ CC保持率（。/。無処理）無添加（参考例 2 37 °C— 4週間） 8. 5 シユークロース（実施例 4 37。C— 4週間） 67

無処理 100 図 6中、 CCは一次構造が保持されたス一パーコイル型 pCAHST-1を示し、 OC は切断された pCAHST- 1を示す。各レーンは次を意味する；

レーン 1：分子量マーカー（； LHind III)

レーン 2 _:無添加（参考例 2/37°C— 4週間）

レーン 3 :シユークロース（実施例 4/37°C_4週間）

レーン 4：無処理試験例 7

40 °C保存時におけるダルコースの遺伝子分解抑制効果（ 2 )

実施例 5の液状遺伝子製剤および参考例 3の組成物を 40 で 4週間保存した。保存後の pCAHST- 1の一次構造を試験例 1記載のァガロース電気泳動で評価した。得られた結果を図 7に示す。結果は試験例 5における乾燥製剤と同様に、ダルコ一スを製剤に加えることで、グルコース無添加の製剤に比べ、係る条件下での pCAHST_lの保存安定性が大幅に改善されることを示している。

図 7中、 CCは一次構造が保持されたス一パーコイル型 pCAHST- 1を示し、 OC は切断された pCAHST- 1を示す。各レーンは次を意味する；

レーン 1：無処理

レーン 2：グルコース（実施例 5 _ 40 °C— 4週間）

レーン 3：無添加（参考例 3Z40°C— 4週間）

レーン 4：分子量マーカー（ LHind III) 試験例 8

コラーゲン含有時における糖類等の遺伝子分解抑制効果（ 1 )

実施例 7のスポンジ状の遺伝子製剤および参考例 4のスポンジ状の組成物を 150mM NaCl, lOmM Tris-HCl (pH7. 4)溶液で加温下に溶解し、コラゲナ一ゼで処理した。処理後、試験例 1に記載のようにしてァガロース電気泳動に付して pCAHST- 1の一次構造を評価した。その結果、グルコース、シユークロースおよびグルタミン酸ーナトリゥムを製剤に加えることで、糖顏無添加の製剤に比べて pCAHST_lの分解を大幅に抑えることができた（図 8、表 7 )。

表 7

コラーゲン、糖類およびアミノ酸を含有する

pCAHST- 1溶液の凍結乾燥後の CC保持率（％無処理)

処友 CC保持率（％無処理）

無添カ卩（参考例 4 ) 8 5

グルコース（実施例 7 ) 9 4

シュ一クロース（実施例 7 ) 9 5

グルタミン酸ーナトリウム（実施例 7 ) 9 5

無処理 1 0 0

図 8中、 C Cは一次構造が保持されたス一パーコイル型 pCAHST- 1を示し、〇C は切断された pCAHST- 1を示す。各レーンは次を意味する；

レーン 1：分子量マーカー（； L Hind III)

レーン 2：グノレコース（実施例 7 )

レーン 3 : シユークロース（実施例 7 )

レーン 4：グルタミン酸ーナトリウム（実施例 7 )

レーン 5：無添カ卩（参考例 4 )

レーン 6：無処理試験例 9

コラーゲン含有時における糖類等の遺伝子分解抑制効果（ 2 )

実施例 8の棒状の遺伝子製剤および参考例 5の棒状の組成物を 137mM NaCl, .一

26

2. 7mM KC1, 25mM Tris- HC1 (ρΗ7· 4)溶液で加温下で溶解し、コラゲナーゼで処理した。処理後、試験例 1に記載のようにしてァガロース電気泳動に付し、 pCAHST- 1の構造を評価した。その結果、グルコースを製剤に加えることで、ダルコース無添加の製剤に比べて pCAHST-1の分解を大幅に抑えることができた（図 9、表 8 ) 。

表 8

棒状組成物中に含まれる pCAHST- 1の CC保持率（％無処理）

処 £ CC保持率（％無処理）

無添加（参考例 5 ) 6 6

グルコース（実施例 8 ) 9 2

無処理 1 0 0

図 9中、 C Cは一次構造が保持されたスーパーコイル型 pCAHST-1を示し、 O C は切断された pCAHST- 1を示す。各レーンは次を意味する；

レーン 1：分子量マ一カー（； L Hind III)

レーン 2：無添加① （参考例 5 )

レーン 3：無添加② （参考例 5 )

レーン 4 :グルコース① （実施例 8 )

レーン 5 ：グルコース② （実施例 8 )

レーン 6：無処理試験例 1 0

安定な遺伝子製剤を用いた遺伝子導入

実施例 8の棒状の遺伝子製剤（ァテロコラ一ゲンノダルコ一ス— pCAHST-1) および参考例 5の棒状の組成物（ァテロコラーゲン一 pCAHST- 1) をそれぞれ 50 /i g の pCAHST- 1を含有するように切断した。これらを ICRマウス（雌性、 6- 7週齢）の右大腿部筋肉内に投与した（投与群 1 ：実施例 8の遺伝子製剤、投与群 2 ：参考例 5の組成物）。また、 50 μ gの pCAHST- 1を含有するリン酸緩衝液 100 μ 1 もマウス右大腿部筋肉内に投与した（投与群 3 ) 。

インビボにおける徐放効果を調べるため、血中 pCAHST- 1の検出、血中および投一

27 与部位の HST-1量および血中の血小板数の 3つの測定値を利用した。血中の pCAHST_lは PCR法で検出し、血中および投与部位（筋肉組織中）の HST-1量は ELISA法で測定し、血中の血小板数は顕微鏡下でのカウントにて、それぞれ経時的に行った。

PCR法では、 pCAHST- 1 (約 8 kbp)中の 262 bpを検出するプローブを使用し、

Ampridirect法（島津製作所）を用いた。測定限界は、サザンプロッティングで 1 pg/δ μ 1、ェチジゥム染色で 2 pg/5 / 1であった。 ELISA法では、 FGF4キット

( R & Dシステムス社、アメリカ合衆国、検出限界 20 pg/ml) を使用した。血小板数の測定は、採血後、血小板以外の血球成分を分解処理し、顕微鏡下でカウントすることにより実施した。

PCR法による血中 pCAHST- 1の測定結果を図 1 0に示す。投与群 1では、血中で pCAHST - 1は投与後 6時間から検出され、その後 38日間に亘つて検出された。投与群 2では、血中で pCAHST-1は投与後 6時間から検出され、その後 18日間に亘つて検出された。投与群 3では、血中で pCAHST-1は投与後 7 0間のみ検出された。血中および投与部位での HST-1量の測定結果をそれぞれ図 1 1、図 1 2に示す。図 1 1中、各記号は次を意味する；白抜き丸：ァテロコラーゲングルコース — pCAHST_l (投与群 1、実施例 8 ) 、黒塗り丸：ァテロコラーゲン— pCAHST- 1 (投与群 2、参考例 5 ) 、黒塗り四角： pCAHST- 1を含有するリン酸緩衝液（投与群 3、対照例）、白抜き四角：ァテロコラーゲン _/ /グルコース（参考例 6 )。

図 1 2中、各記号は次を意味する；白抜き丸：ァテロコラーゲンノダルコ一スー pCAHST - 1 (投与群 1、実施例 8 ) 、黒塗り丸：ァテロコラーゲン— pCAHST - 1 (投与群 2、参考例 5 ) 、黒塗り四角： pCAHST- 1を含有するリン酸緩衝液（投与群 3、対照例）、白抜き四角：ァテロコラーゲン Zグルコース（参考例 6 )。投与群 1では、 HST-1量は血中および投与部位共に投与後増加し、 30日後に最大に達した後徐々に減少したが、 60日後も検出された。投与群 2では、投与群 1 と同様に血中および投与部位での HST-1量は投与後増加し、 30日後に最大に達した後徐々に減少し 40日後殆ど検出限界となり、総体的に投与群 1に比べて産生された HST-1量は少なかった。投与群 3では、血中および投与部位での HST- 1量は、投与後増加し、 10日後に最大に達した後徐々に減少し、 30日後には検出されなか .一

28 つた。

血中の血小板数を経時的に測定した結果（図 1 3 ) 、投与群 1では、血小板数は投与後増加し、 30 後に最大に達した後徐々に減少したが、 60日後も増加傾向を維持した。投与群 2では、血小板数は投与後徐々に増加し、 14 S後に最大に達した後減少し、 28 3以降も低^ Sながら増加傾向を維持した。投与群 3では、血小板数は投与後増加し、 10日後に最大に達した後徐々に減少し、 25日間に正常値に戻った。

図 1 3中、各記号は次を意味する；白抜き丸：ァテロコラーゲン Zダルコ一ス— pCAHST- 1 (投与群 1、実施例 8 ) 、黒塗り丸：ァテロコラ一ゲン— pCAHST- 1 (投与群 2、参考例 5 ) 、黒塗り四角： pCAHST- 1を含有するリン酸緩衝液（投与群 3、対照例）、白抜き四角：ァテロコラーゲン Zグルコース（参考例 6 ) 。対照として、 pCAHST- 1を含まない参考例 6の組成物も同様にマウス右大腿部筋肉内に投与し、投与後、血中および投与部位の HST-1量を ELISA法で測定し、血中の血小板数を経時的に測定した。その結果、測定期間中、血中および投与部位で HST- 1は検出されなかった。また、測定期間中、血小板数は増加しなかった。このことは、実施例 8の遺伝子製剤を用いて得られた投与群 1および投与群 2での HST- 1の産生および血小板数の増加が、製剤中に含有された pCAHST-1が細胞内に導入され、細胞内で HST- 1の遺伝情報を発現したことによって生じたことを示している。

投与群 1と投与群 3の結果から、 pCAHST - 1を単独で投与した場合、 HST-1の体内での発現および産生された HST-1による生物学的な効果は一過的であるのに対して、実施例 8の遺伝子製剤では長期間 pCAHST-1を徐放すると共に、安定に体内で保持して HST- 1の発現期間を延長し、かつ産生された HST-1による生物学的な効果を長期間維持できることが判った。

投与群 1と投与群 2の結果から、実施例 8と参考例 5の遺伝子製剤では共に、 pCAHST-1を単独で投与した場合に比べて、 pCAHST- 1を徐放すると共に HST- 1の発現期間を延長できるが、グルコースを含有する実施例 8の遺伝子製剤では参考例 5の遺伝子製剤に比べて、 pCAHST-1を安定に体内で保持し、 HST-1の発現期間を高レ、産生量で延長維持し、それによつて HST-1による生物学的な効果をより高い .■一

29 状態で長期間維持できることが判った。以下、実施例 9一 1 2により調製した調製物について試験例 1 1—1 6を行い、コラーゲンの存在または不存在下におけるアミノ酸または糖類の遺伝子に対する安定性の寄与を主として調べた。

実施例 9

アミノ酸を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）

lO z g/mlの pCAHST- 1および 10mg/mlのアルギニン、リジン塩酸塩、ァスパラギン、ァスパラギン酸ナトリウム、グルタミン、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、プロリン、セリン、トレオニン、グリシン、ァラニン、メチォニン、バリン、イソロイシンあるいは 5mg/mlのロイシンを含有する 150mM NaCl、 10mM Tris - HC1 (pH7. 4)溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の lmlを- 40°Cで凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。実施例 1 0

糖類を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）

10 / g/mlの pCAHST- 1および 10mg/mlのトレハロース、マルチトール、ラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、コンドロイチン硫酸ナトリウムまたはキシリトールを含有する ΙδΟηιΜ NaCl、 lOmM Tris-HCl (pH7. 4)溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の lmlを- 40°Cで凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。実施例

アミノ酸を含有する徐放性遺伝子製剤（スポンジ状）

0. lw/w%7テロコラーゲン溶液（500mg)に 20 // g/mlの pCAHST- 1溶液（lml)および 40mg/mlのアルギニン、リジン塩酸塩、ァスパラギン、ァスパラギン酸ナトリウム、グルタミン、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、プロリン、セリン、トレオニン、グリシン、ァラニン、メチォニン、バリン、イソロイシンあるいは 20mg/mlの口ィシン溶液（125 μ 1)を混合した溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の lmlを- 40°Cで凍結させた後、陰圧下室温でー晚乾燥した。このように凍結乾燥によって、スポンジ状の遺伝子製剤を調製した。実施例 1 2

糖類を含有する徐放性遺伝子製剤（スポンジ状）

0. lw/w%7テロコラーゲン溶液（500mg)に 20 μ g/mlの pCAHST- 1溶液（lml)および 40mg/mlのトレノヽロース、マノレチトール、ラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、コンドロイチン硫酸ナトリウムまたはキシリトール溶液（125 / 1) を混合した溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の lmlを- 40°Cで凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、スポンジ状の遺伝子製剤を調製した。試験例

凍結乾燥時におけるアミノ酸の遺伝子分解抑制効果

実施例 9の遺伝子製剤および参考例 1の組成物を、凍結乾燥直後に水に溶解し、試験例 1の操作に従い、ァガロース電気泳動に付して pCAHST- 1の一次構造を解析した。電気泳動後、ェチジゥムブロマイドでゲルを染色し、トランスイルミネーター上で撮影した。その映像を写真スキャナーで取り込み、一次構造が保持されたスーパーコィル型 pDNA (CC)と一力所が切断されたリラックス型 pDNA (0C)、さらに切断され開環状になった直鎖型 DNA (LS)のバンドの強度を解析ソフトで算出し、下式に従ってアミノ酸の添カ卩による安定ィヒ度を計算した。結果を図 1 4に示した。図 1 4中のアミノ酸の順は、疎水親水度（Kyte, J. & Dool ittele, R. F. , 1982, J. Mol. Biol. 157, 105- 132)の順である。結果は、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸ナトリウム、グルタミン、グルタミン酸ナトリウム、ヒシチジン、プロリン、セリンまたはトレオニンを製剤に加えることで、アミノ酸無添加の製剤に比べて pCAHST - 1の分解が抑制されていることを示している。 _

31 参考例 1の CCの/、"ンド強度

参考例 1の CC保持率（％) ： X 100 参考例 1の全ハ、'ンド強度の総和（CC + LS + 0C) 実施例 9の CCの/、"ンに強度

実施例 9の CC保持率（％) = X 100 実施例 9の全ノ、"ント "強度の総和（CC +LS + 0C) 実施例 9の CC保持率 -参考例 1の CC保持率

安定化度（％) = X 100

100 -参考例 1の CC保持率試験例 1 2

凍結乾燥時における糖類の遺伝子分解抑制効果

実施例 1 0の遺伝子製剤および参考例 1の組成物を、凍結乾燥直後に水に溶解し、試験例 1 1の操作に従い、ァガロース電気泳動に付して pCAHST- 1の一次構造を解析した。試験例 1 1と同様に安定化度を算出し、その結果を図 1 5に示した。結果は、糖類を製剤に加えることで、糖類無添力卩の製剤に比べて pCAHST- 1の分解が抑制されていることを示している。試験例 1 3

コラーゲン含有時におけるアミノ酸類の遺伝子分解抑制効果

実施例 1 1のスポンジ状の遺伝子製剤及び参考例 4のスポンジ状の組成物を 150mM NaCl, 10 mM Tris-HCl ( H 7. 4) 溶液で加温下に溶解し、コラゲナーゼで処理した。処理後、試験例 1 1に記載したようにしてァガロース電気泳動に付して pCAHST- 1の一次構造を評価した。試験例 1 1と同様に安定化度を算出し、その結果を図 1 6に示した。図 1 6中のアミノ酸の順は、疎水親水度（Kyte, J. & Dool ittele, R. F. , 1982, J. Mol. Biol. 157, 105-132)の順である。結果は、ァミノ酸類を製剤に加えることで、ァミノ酸類無添加の製剤に比べて pCAHST-1の _

32 分解を大幅に抑えることができたことを示す。試験例 1 4

コラーゲン含有時における糖類の遺伝子分解抑制効果

実施例 1 2のスポンジ状の遺伝子製剤及び参考例 4のスポンジ状の組成物を

150mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7. 4) 溶液で加温下に溶解し、コラゲナーゼで処理した。処理後、試験例 1 1に記載したようにしてァガロース電気泳動に付して pCAHST_lの一次構造を評価した。試験例 1 1と同様に安定化度を算出し、その結果を図 1 7に示した。糖類を製剤に加えることで、糖類無添力卩の製剤に比べて pCAHST - 1の分解を大幅に抑えることができた。試験例 1 5

4 0 °C保存時におけるアミノ酸類および糖類の遺伝子分解抑制効果

実施例 9の遺伝子製剤のうちァスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ーナトリウム、プロリン、グルタミン処方の乾燥状態の製剤と実施例 1 0の遺伝子製剤のうちグノレコース、シユークロース、マノレトース、ラクトース、マンニト一ノレ処方の乾燥状態の製剤および参考例 1の組成物を 4 0 °Cで 1、 2、および 4週間保存した。保存後の pCAHST- 1の一次構造を試験例 1の操作に従ってァガロース電気泳動で評価した。得られた結果を図 1 8に示す。結果は、非疎水性アミノ酸類あるいは糖類を製剤に加えることで、無添加の製剤に比べ、かかる条件下での pCAHST-1の保存安定性が大幅に改善されることを示している。試験例 1 6

4 0 °C保存時におけるコラーゲン含有遺伝子製剤に対するアミノ酸類および糖類の遺伝子分解抑制効果

実施例 1 1のスポンジ状の遺伝子製剤のうちリジン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン処方の乾燥状態の製剤と実施例 1 2のスポンジ状遺伝子製剤のうちグノレコース、シユークロース、マノレトース、ラクト一ス、マンニトーノレ処方の乾燥状態の製剤および参考例 4のスポンジ状の組成物を 4 0 °Cで 1、 2、および 4週 _

33 間保存した。保存後の pCAHST-1の一次構造を試験例 1 3の操作に従ってァガロース電気泳動で評価した。得られた結果を図 1 9に示す。結果は、アミノ酸類あるいは糖類を製剤に加えることで、無添加の製剤に比べ、係る条件下での pCAHST-1 の保存安定性が大幅に改善されることを示している。発明の効果

試験例 1から 9にて得られた本発明製剤の遺伝子分解抑制（安定化）効果を以下の表 9にまとめる。

表 9

本発明製剤における遺伝子分解抑制効果

(1) 凍結乾燥時の安定性

①添加剤がない場合 a) b)

：3ン卜口ール 72% ( 76 %)

アミノ酸類：グリシン 79%

ァラニン 83%

リジン 84%

ァスパラギン酸 ( 91 %)

グルタミン酸 ― 96% (103 %)

c)

コン卜口ール 78%

糖類：グルコース 95%

シユークロース 96%

マルトース 95%

ラクト一ス 100 %

マン-トール 95%

b)

riン卜口ール 76%

有機酸類：酒石酸 95 %

クェン酸 02% .一

34

②添加剤がある場合：

(コラーゲン） d)

ニン卜 π—ル 8 5%

安定化剤：グルコース 94%

シユークロース 9 5%

グノレタミン酸 9 5%

(DMRIE-C) e)

iン卜 π—ル 6 9%

安定化剤：シユークロース 00%

[注] a) 試験例 1 (表 1) 、 b) 試験例 3 (表 3) c) 試験例 2 (表 2) d) 試験例 8 (表 7) 、 e) 試験例 4 (表 4)

(2) 凍結乾燥製剤の保存安定性

①添加剤がない場合： c) f ) f ) f )

(40°C) (凍乾時）週間後 2週間後 4週間後コント口ール ( 78 %) 6 7% 56 % 34% 安定化剤：グルコース

( 95 %) 9 2% 9 1 % 7 1 %

②添加剤（DMRIE-C) がある場合：

( 3 7 °C) e) g)

(凍乾時） 4週間後

コント口ール ( 69 %) 8. 5%

安定化剤：シュ一クロース

( 1 00 %) ― 6 7%

[注] f ) 試験例 5 (表 5) 、 g) 試験例 6 (表 6)

(3) ゲル化 '練合わせ時の安定性

(凍乾品の練合わせによる棒状製剤形成時）

d) h)

(凍乾時）棒状製剤形成後コント口ール ( 8 5 %) 66% .

35 安定化剤：グルコース

添加剤：コラーゲン（95%) 92%

[注] h) 試験例 8 (表 8)

(4) 水溶液製剤の保存安定性 I)

( 40 °C) 4週間後

mン卜 π—ルベクタ一消失

安定化剤：グルコース

―添加剤： DMRIE- C ベクター残存

[注] I) 試験例 7 (図 7) 産業上の利用の可能性

安定性が増強された遺伝子または遺伝子を組み込んだベクターを含有する安定な遺伝子製剤は、今後利用頻度が高くなると思われる遺伝子治療に安全かつ容易に利用される。本発明製剤は、遺伝子治療が広く普及するための基盤を提供できる。特に本発明製剤は遺伝子または遺伝子を組込んだベクターを常温で流通あるいは保管することを可能とし、コールドチェーンが整備されていない地域で使用可能な DN Aワクチンを提供できる。

Claims

請求の範囲

1 . 所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクターと、少なくとも 1 つの糖類およびまたは少なくとも 1つの非疎水性ァミノ酸類および/または少なくとも 1つのカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）とを含む安定な遺伝子製剤。

2 . 糖類が、単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖またはそれらの糖アルコールである請求項 1記載の遺伝子製剤。

3 . 糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、シユークロース、マノレト一ス、ラタトース、トレハロ一ス、ソノレビトールまたはマンニトールである請求項 2記載の遺伝子製剤。

4 . 非疎水性アミノ酸類が、グルタミン酸、ァスパラギン酸またはその塩である請求項 1記載の遺伝子製剤。

5 . カルボキシル基を 2個以上有する有機酸類が、カルボキシル基を 2個もしくは 3個有する有機酸またはその塩である請求項 1記載の遺伝子製剤。

6 . カルボキシル基を 2個もしくは 3個有する有機酸が、クェン酸または酒石酸である請求項 5記載の遺伝子製剤。

7 . 所望の遺伝子を組み込んだベクターがプラスミド D N Aである請求項 1ないし 6レ、ずれかに記載の遺伝子製剤。

8 . 溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態である遺伝子製剤または溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態の工程を経て製造される遺伝子製剤において、溶液状態、ゲル状態または懸濁液状態における糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）の全体に対する含有量が約 1 wZ V %以上である請求項 1記載の遺伝子製剤。

9 . 細胞への遺伝子導入を促進する物質をさらに含む請求項 1ないし 8いずれかに記載の遺伝子製剤。

1 0 . 細胞への遺伝子導入を促進する物質が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーまたは疎水性ポリマーである請求項 9記載の遺伝子製剤。

1 1 . 医学的に許容される添加剤をさらに含む請求項 1ないし 1 0記載の遺伝子製剤。

1 2 . 添加剤が生体親和性材料である請求項 1 1記載の遺伝子製剤。

1 3 . 所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクタ一が生体親和性材料に担持されていることを特徴とする請求項 1 2記載の遺伝子製剤。

1 4 . 生体親和性材料が、コラーゲン、ゼラチンまたはそれらの混合物である請求項 1 2または 1 3記載の遺伝子製剤。

1 5 . 乾燥状態にある請求項 1ないし 1 4いずれかに記載の遺伝子製剤。

1 6 . 溶液状態、ゲル状態あるいは懸濁液状態である所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターを含む調製物を乾燥工程に付することにより得られる請求項 1ないし 1 5レ、ずれかに記載の遺伝子製剤。

1 7 . 乾燥工程が凍結乾燥である請求項 1 6記載の遺伝子製剤。

1 8 . 所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターを含む遺伝子調製物に、少なくとも 1つの糖類および Zまたは少なくとも 1つの非疎水性ァミノ酸類および Zまたは少なくとも 1つのカルボキシル基を 2個以上有する有機酸類 (アミノ酸類を除く）を添加することからなる、遺伝子製剤を安定化する方法。

1 9 . 請求項 1ないし 1 7いずれかに記載の遺伝子製剤を生体に投与することからなる、遺伝子治療方法。

2 0 . 所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクタ一、少なくとも 1 つのァミノ酸類、およびコラーゲンまたはゼラチンを含む安定な遺伝子製剤。

2 1 . 溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態である遺伝子製剤または溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態の工程を経て製造される遺伝子製剤において、溶液状態、ゲル状態または懸濁液状態におけるアミノ酸類の全体に対する含有量が約 1 w/ V %以上である請求項 2 0記載の遺伝子製剤。

2 2 . 細胞への遺伝子導入を促進する物質をさらに含む請求項 2 0または 2 1 記載の遺伝子製剤。

2 3 . 細胞への遺伝子導入を促進する物質が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーまたは疎水性ポリマーである請求項 2 2記載の遺伝子製剤。

2 4 . 所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクタ一がコラーゲンあるいはゼラチンに担持されていることを特徴とする請求項 2 0ないし 2 3いずれかに記載の遺伝子製剤。

2 5 . 乾燥状態にある請求項 2 0ないし 2 4 、ずれかに記載の遺伝子製剤。

2 6 . 溶液状態、ゲル状態あるいは懸濁液状態である所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだべクターを含む調製物を乾燥状態に付することにより得られる請求項 2 0ないし 2 5いずれかに記載の遺伝子製剤。

2 7 . 乾燥工程が凍結乾燥である請求項 2 6記載の遺伝子製剤。

2 8 . 所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベタターとコラーゲンまたはゼラチンとを含む遺伝子調製物に、少なくとも 1つのァミノ酸類を添加することからなる、遺伝子製剤を安定化する方法。

2 9 . 請求項 2 0ないし 2 7いずれかに記載の遺伝子製剤を生体に投与することからなる、遺伝子治療方法。