ES2293648T3 - Preparaciones de genes que contienen atelocolageno. - Google Patents
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Abstract
PREPARADOS GENICOS QUE CONSTAN DE LOS GENES DESEADOS O DE LOS VECTORES QUE CONTIENEN LOS GENES DESEADOS INTEGRADOS A ESTE RESPECTO Y PORTADORES PARA SU VEHICULIZACION.
Description
Preparaciones de genes que contienen
atelocolágeno.
La presente invención se refiere al campo de la
medicina, especialmente la terapia génica. Especialmente, la
presente invención se refiere a una preparación conteniendo un gen.
La preparación retiene establemente un vector génico o un gen, lo
libera gradualmente y mantiene el efecto terapéutico durante largo
tiempo cuando se administra a un cuerpo vivo. La preparación hace
posible interrumpir un tratamiento en un período favorable.
La terapia génica es una zona de investigación
activa, y la expectación de una terapia exitosa es sumamente alta.
En los acercamientos de terapia génica en los que el gen es la
medicina, la terapia de la enfermedad se lleva a cabo transfiriendo
un gen de una enzima designada, citoquina, y análogos a células de
un paciente. El gen introducido produce entonces la sustancia
designada en el cuerpo del paciente. Esta terapia génica se puede
clasificar en dos tipos. La finalidad del primer tipo es la
expresión semipermanente del gen designado integrando el gen en el
genoma de un paciente. La finalidad del otro tipo es la expresión
transitoria de un gen sin expectación de su integración en el
genoma. En este último tipo de terapia génica, a menudo se adopta
un método usando adenovirus y análogos como un método para
transferir al paciente un gen que codifica, por ejemplo, una
citoquina que incrementa la potencia inmune contra células
cancerosas (Cardiovascular Research, 28, 445 (1994); Science, 256,
808 (1992); Gastroenterology, 106, 1076 (1994); TIBTECH, 11, 182
(1993); J. Biol. Chem., 266, 3361 (1991); Nature Medicine, 1, 583,
(1995); y las referencias citadas en ellas).
En el caso de usar un vector vírico, aunque la
eficiencia de la transferencia del gen es generalmente alta, las
administraciones repetidas son difíciles debido a las respuestas
inmunes (J. Biol. Chem., 269, 13695 (1994), Am. J. Respir. Cell
Mol., 10, 369 (1994)).
Una preparación usando colágeno para liberar
gradualmente medicinas conteniendo compuestos orgánicos o una
preparación de proteína se describe en J. Controlled Release 33,
307-315 (1995), etc. Sin embargo, la medicina
descrita y usual (por ejemplo, medicamento de proteína, medicina
químicamente sintetizada, etc) se disuelve aproximadamente en
1-2 días cuando se retiene, por ejemplo, en gel de
colágeno.
WO 94/23699 describe diferentes moléculas
portadoras que promueven la toma o el transporte de oligo
deoxirribonucleidos a la célula deseada con el fin de controlar la
expresión del gen en animales o humanos. Sin embargo, el grupo de
vehículos sugeridos no incluye colágenos solubles (por ejemplo,
atelocolágeno).
En un método que se usa actualmente en terapia
génica e incluye administrar un vector génico (un vector insertado
en gen) o un gen directamente, el vector génico o el gen contacta
las células inmediatamente después de la administración, e
inmediatamente después empieza la transferencia del gen y se termina
enseguida. Además, el gen transducido a células es diluido (es
decir, su número de copias disminuye) con la división celular o se
reduce por degradación en las células. Por lo tanto, la expresión
del gen transferido se puede mantener solamente durante varias
semanas que en la práctica es demasiado corto para poner en práctica
un tratamiento suficiente, y esto es una deficiencia del método.
Consiguientemente, son necesarias administraciones repetidas de un
vector génico o un gen. Por lo tanto, un objeto de la presente
invención es superar estos defectos y proporcionar una preparación
que puede liberar gradualmente un vector génico o un gen y puede
mantener el efecto terapéutico durante un tiempo largo.
Además, se espera un método que permita
administraciones repetidas porque son difíciles en terapia génica
usando un vector vírico y análogos. Consiguientemente, un segundo
objeto de la presente invención es proporcionar una preparación
génica que permita administraciones repetidas en terapia génica
usando un vector vírico y análogos.
Además, es deseable que la expresión del gen en
el cuerpo pueda ser parada en cualquier momento para asegurar la
seguridad, porque un gen se expresa durante varias semanas que es un
período más largo que el término para la preparación de la
proteína. Consiguientemente, un tercer objeto de la presente
invención es proporcionar una preparación génica que puede hacer
posible detener rápidamente la transferencia del gen cuando se
prevea la terminación del tratamiento.
Los autores de la presente invención han
examinado varias preparaciones para liberar gradualmente un vector
génico o un gen y han hallado que, cuando se administra a un cuerpo
vivo una preparación donde se incorpora un gen o un vector
insertado con un gen a un vehículo hecho de un material
biocompatible, el gen se expresa inesperadamente durante muchos
meses. Los autores de la presente invención también han hallado que
la preparación puede ser administrada repetidas veces a un cuerpo
vivo y así se ha realizado la presente invención.
Por lo tanto, las características distintivas de
la presente invención son las siguientes.
(1) Una preparación génica de liberación
sostenida en forma de gel incluyendo un atelocolágeno y un gen
deseado o un vector incluyendo dicho gen deseado.
(2) La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 1, donde dicho atelocolágeno está
presente en la cantidad de 0,01-25% p/p de la
preparación.
(3) La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 1, donde dicho atelocolágeno está
presente en la cantidad de 0,05-10% p/p de la
preparación.
(4) La preparación génica de liberación
sostenida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha
preparación incluye además un aditivo.
(5) La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 4, donde dicho atelocolágeno está
presente en la cantidad de 2% p/p o más de la preparación, y dicho
aditivo está presente en la cantidad de 5-900% p/p
del atelocolágeno.
(6) Una preparación génica de liberación
sostenida en forma de película que se puede obtener secando un gel
incluyendo 0,2-30% p/p de un atelocolágeno, y un gen
deseado o un vector incluyendo dicho gen deseado.
(7) La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 6, donde el atelocolágeno es
0,3-5% p/p en el gel.
(8) La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 6, donde el atelocolágeno es
0,4-2% p/p en el gel.
(9) La preparación génica de liberación
sostenida de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde dicho
gel incluye además un aditivo.
(10) La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 9, donde dicho atelocolágeno es 1% o
más en el gel, y el aditivo es 5-900% p/p de dicho
atelocolágeno.
(11) Una preparación génica de liberación
sostenida en forma de varilla sólida que se puede obtener secando
un gel incluyendo 10-30% p/p de un atelocolágeno, y
un gen deseado o un vector incluyendo dicho gen deseado.
(12) La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 11, donde dicho gel incluye además
un aditivo.
(13) La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 12, donde dicho aditivo está presente
en la cantidad de 5-100% p/p del atelocolágeno.
(14) Una composición farmacéutica incluyendo la
preparación génica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y
opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
(15) Una preparación génica de liberación
sostenida en forma de varilla obtenible por el proceso que
incluye:
obtener una esponja liofilizando un gel
incluyendo 0,05 a 5% p/p de atelocolágeno, y un gen deseado o un
vector incluyendo dicho gen deseado;
obtener un gel en el que la concentración de
atelocolágeno es 10 a 30% p/p añadiendo agua destilada a la
esponja;
formar una varilla por moldeo por presión del
gel; y
secar.
(16) Uso de la preparación génica de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 u obtenible por el proceso de la
reivindicación 15 para la preparación de una composición
farmacéutica para administrar un gen para captación por una
célula.
(17) El uso de la reivindicación 16, donde dicha
composición farmacéutica ha de ser administrada subcutáneamente,
por vía intramuscular o intraperitonealmente a un sujeto.
La figura 1 es un gráfico que representa un
período de tiempo del número de plaquetas en el ejemplo de prueba 1
y el ejemplo comparativo 1.
La figura 2 es un gráfico que representa un
período de tiempo de HST-1 en sangre periférica en
el ejemplo de prueba 1 y el ejemplo comparativo 1.
La figura 3 es un gráfico que representa un
período de tiempo del número de plaquetas en el ejemplo de prueba 4
y el ejemplo comparativo 1.
La figura 4 es un gráfico que representa un
período de tiempo del número de plaquetas en el ejemplo de prueba
5.
La figura 5 es un gráfico que representa
dependencia de dosis del colágeno en la cantidad de
HST-1 en sangre periférica en el ejemplo de prueba
6.
La figura 6 es un gráfico que representa un
período de tiempo del número de plaquetas en el ejemplo de prueba 7
y el ejemplo comparativo 2.
La presente invención se describirá a
continuación con más detalle.
"Un vector para inserción de gen" puede ser
cualquier vector que pueda transferir un gen a células e incluye,
por ejemplo, un vector vírico, un vector liposómico, un vector
liposómico fusogénico en el que se funden un virus y un liposoma, o
análogos (Cardiovascular Research, 28, 445 (1994); Science, 256, 808
(1992); Gastroenterology, 106, 1076 (1994); TIBTECH, 11, 182
(1993); J. Biol. Chem., 266, 3361 (1991); Nature Medicine, 1, 583,
(1995); y las referencias citadas en ellas).
Un vector vírico puede ser cualquier vector que
pueda ser usado como un vector ordinario en terapia génica e
incluye, por ejemplo, un adenovirus, un virus adenoasociado, un
virus vaccinia, un retrovirus, un virus VIH, un herpesvirus, o
análogos. El vector génico puede ser obtenido insertando un gen para
transferencia a un vector vírico directamente según un método
convencional, por ejemplo, descrito en las referencias
anteriores.
Un vector liposómico puede ser cualquier vector
que pueda ser usado como un vector liposómico ordinario en terapia
génica e incluye, por ejemplo, un vector liposómico obtenido
mezclando DOTMA, DOPE, DOGS, etc. Cuando se usa un vector
liposómico catiónico, la eficiencia de la transferencia a las
células es alta. Los ejemplos del vector liposómico fusogénica en
el que se funden un virus y un liposoma incluyen un vector
liposómico fusogénico en el que se funden un virus Sendai (HVJ:
hemagglutinating virus de Japón) y un liposoma, y análogos. Un
vector génico puede ser obtenido encerrando un gen para
transferencia a un vector liposómico o un vector liposómico
fusogénico según un método convencional, por ejemplo, el descrito en
las referencias anteriores. El gen encerrado puede estar en
cualquier forma que pueda expresar el gen en un cuerpo vivo y es
preferiblemente una forma estable en un cuerpo vivo tal como un
plásmido, etc.
Un gen propiamente dicho puede ser retenido en
una preparación génica de la presente invención sin ser insertado
en "un vector para inserción de gen" que transfiere un gen a
células. En este caso, una forma de un gen puede ser cualquier
forma que pueda expresar el gen en un cuerpo vivo. Por ejemplo, un
gen puede ser insertado en lo que se denomina un vector de
expresión y análogos. Una forma de un gen es preferiblemente una
forma estable en un cuerpo vivo tal como un plásmido, etc.
"Un gen" para transferir puede ser
cualquier gen que pueda ser usado en terapia génica e incluye, por
ejemplo, un gen de adenosina deaminasa, un gen
GM-CSF, un gen de timidina quinasa, o análogos.
"Material biocompatible" es el material que
tiene alta biocompatibilidad y puede retener un vector génico o un
gen establemente en un cuerpo vivo.
El material biocompatible a usar es
atelocolágeno.
Se puede añadir "un aditivo" a una
preparación de la presente invención si es necesario con el fin de
estabilizar un vector génico y análogos, acelerar la transferencia
del gen a células o núcleos o regular la liberación de un vector
génico y análogos. Un aditivo puede ser cualquier aditivo que pueda
lograr la finalidad e incluye, por ejemplo, sucrosa, glicina,
sulfato de condroitina, gelatina, albúmina, citoquina, una mezcla de
las proteínas del grupo de alta movilidad HGM-1 y
HCM-2 (mezcla de los grupos de alta movilidad 1, 2;
Experimental Medicine, 12, 184 (1994), BIOTHERAPY, 8.1265 (1994)),
cloroquina, polilisina (Hepatology, 22, 847 (1995)), Transfectam
(marca comercial, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), o
análogos.
En el caso donde se mezcla atelocolágeno con
otro material biocompatible o un aditivo, el contenido de colágeno
puede ser al menos 10% p/p, preferiblemente al menos 30% p/p, más
preferiblemente al menos 50% p/p, y muy preferiblemente al menos
70% p/p.
El contenido de material biocompatible en la
preparación génica varía dependiendo del tamaño, el tipo y análogos
del vector génico o el gen y tipo y análogos del material
biocompatible.
Un contenido preferido de material biocompatible
en una preparación génica es 0,01-30% p/p bajo la
condición de que la preparación génica esté en un cuerpo vivo, más
preferiblemente 0,05-10% p/p, y muy preferiblemente
0,05-5% p/p.
Además, el contenido de material biocompatible
en la preparación génica se varía dependiendo de la preparación
particular.
Cuando la preparación tiene forma de gel, un
contenido preferido de atelocolágeno es 0,01-25%
p/p, más preferiblemente 0,05-10% p/p, muy
preferiblemente 0,05-5% p/p. Sin embargo, cuando el
contenido de atelocolágeno es 2% o más, se prefiere que un aditivo
sea añadido a 5-900% p/p de atelocolágeno.
Cuando la preparación tiene forma de película,
un contenido preferido de atelocolágeno es 0,2-30%
p/p como un contenido antes del secado, más preferiblemente
0,3-5% p/p, muy preferiblemente
0,4-2% p/p. Sin embargo, cuando un contenido de
atelocolágeno es 1% o más, se prefiere que un aditivo sea añadido a
5-900% p/p de atelocolágeno.
Cuando la preparación tiene forma de varilla
sólida, el contenido preferido de atelocolágeno es
10-30% p/p y se prefiere que un aditivo sea añadido
a 5-100% p/p de colágeno.
Una preparación génica de la presente invención
no se limita a una forma específica. La preparación puede estar en
solución, suspensión, gel conteniendo agua, película o esponja. La
forma sólida puede tener forma de varilla, esfera y análogos. Sin
embargo, una forma preferida es generalmente una solución,
suspensión o gel conteniendo agua, aunque la forma de la
preparación varía dependiendo del tipo, tamaño y análogos de un
vector para introducción del gen.
Se obtiene una preparación génica manteniendo un
contenido de atelocolágeno en la preparación génica dentro del
rango preferido anterior en la condición de que la preparación
génica esté en un cuerpo vivo.
Los ejemplos de métodos para producir una
preparación génica en una forma de solución, suspensión o gel
conteniendo agua incluyen (1) un método que incluye mezclar un
polvo, solución, suspensión o gel de un vector génico o un gen
(denominado un vector génico y análogos a continuación) con un
vehículo en una forma de una solución o gel a la que se añade según
sea necesario, (2) un método que incluye hacer que una solución,
suspensión o gel de un vector génico y análogos penetre en un
vehículo que tiene forma de polvo al que se añade un aditivo según
sea necesario, o (3) un método que incluye hacer que una solución,
suspensión o gel de un vector génico y análogos penetre en un
vehículo que sea una esponja a la que se añade un aditivo según sea
necesario y amasarlos juntamente. Los métodos para hacer una
preparación génica de la presente invención no se limitan a tales
métodos.
Los ejemplos de métodos para producir una
preparación génica en forma sólida incluyen (1) un método que
incluye mezclar un polvo, solución, suspensión o gel de un vector
génico y análogos con un vehículo en forma de solución o gel a la
que se añade un aditivo según sea necesario y secar la mezcla, (2)
un método que incluye mezclar un polvo, solución, suspensión o gel
de un vector génico y análogos con un vehículo en forma de polvo a
la que se añade un aditivo según sea necesario y secar la mezcla,
(3) un método que incluye hacer que una solución, suspensión o gel
de un vector génico y análogos penetre en un vehículo en forma de
una esponja al que se añade un aditivo según sea necesario y secar
la esponja, (4) un método que incluye hacer que una solución,
suspensión o gel de un vector génico y análogos penetren en un
vehículo en forma de una esponja al que se añade un aditivo según
sea necesario y secar la esponja en reposo o amasar y secar la
esponja después de añadir agua y análogos según sea necesario, (5)
un método que incluye triturar y molear a presión un producto sólido
obtenido por un método según (1) a (4), o (6) un método que incluye
mezclar un polvo de un vector génico y análogos con un soporte que
es un polvo al que se añade un aditivo según sea necesario y moldear
a presión la mezcla. La presente invención no se limita a tales
métodos. El método de secado; temperatura y humedad en secado;
método de mezcla; temperatura y humedad en mezcla; método para
moldear a presión; temperatura, humedad y presión de compresión en
moldeo a presión; velocidad de solución de la solución vehículo y
solución del vector génico; y velocidad de solución de la mezcla de
vehículo y solución de vector génico; y pH pueden ser los mismos que
en los métodos convencionales.
Una preparación génica de la presente invención
puede ser administrado por varios métodos según la enfermedad que
se trate, el órgano al que se dirija y análogos. Por ejemplo, una
preparación génica de la presente invención puede ser administrada
subcutáneamente o por vía intramuscular, o puede ser administrada
directamente a lugares deseados de la enfermedad tal como el riñón,
hígado, pulmón, cerebro y análogos. La administración directa al
lugar enfermo permite la terapia
órgano-selectiva.
Además, son posibles administraciones
repetidas.
Por otra parte, cuando hay que interrumpir la
transferencia del gen dependiendo del tipo o estado de la
enfermedad, una preparación génica puede ser quitada tal como está,
y se puede detener la transferencia de gen. Por ejemplo, si una
preparación génica es un sólido, puede ser quitada por cirugía o
análogos. Cuando la terapia génica se realiza usando una
preparación génica donde un vector génico y análogos es retenido en
un recipiente o análogos que tiene poros a través de los que un
virus puede pasar libremente, el recipiente o análogos puede ser
quitado a la terminación del tratamiento. Por ejemplo, terapia
génica puede ser realizado usando un recipiente (tubo) como se
describe en la Solicitud de Patente japonesa número
3(1991)-120115 (Publicación Internacional
número WO92/20400).
Una preparación génica de la presente invención
puede liberar gradualmente un vector génico y análogos y
simultáneamente puede retener establemente un vector insertado en
gen y análogos en un cuerpo vivo durante la liberación sostenida.
Por lo tanto, el tiempo de expresión efectiva del gen después de una
sola administración se puede prolongar controlando el período de
transferencia de gen a células retardando el contacto entre células
y vectores.
Una preparación de gen de la presente invención
también permite administraciones repetidas de un vector génico tal
como un vector vírico y análogos que de otro modo es difícil de
administrar repetidas veces debido a la aparición de anticuerpos
neutralizantes en un sujeto.
Además, una preparación génica de la presente
invención permite la regulación de la expresión del gen porque la
preparación génica puede ser quitada cuando se prevea la terminación
del tratamiento.
Ejemplo
1
Se preparó una preparación génica mezclando 0,9
ml de medio de cultivo conteniendo 10^{9} pfu (unidad formadora
de placas) de un adenovirus (Adexl HST-1; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 12368 (1994)) insertado con un
factor de crecimiento del fibroblasto de codificación de gen
HST-1 (FGF4) (preparado según el método descrito en
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980-2984 (1987))
con 0,1 ml de solución neutra de atelocolágeno (implante de
atelocolágeno producido por KOKEN: solución de atelocolágeno a 2%).
El adenovirus anterior (Adexl HST-1) se puede
obtener borrando parte de E1A, E1B y E3 de adenovirus tipo 5 (ATCC
número de catálogo VR-5) según un método descrito
en J. Virol., 54, 711-719 (1985) o Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93, 1320 (1996) y Cell, 13, 181-188
(1978); insertando un gen de factor de crecimiento del fibroblasto
HST-1 al gen de adenovirus de tipo no
prolife-
rativo.
rativo.
Ejemplo
2
Se prepara una preparación génica en forma de
gel mezclando 0,1 ml de solución neutra de atelocolágeno a 2% con
0,9 ml de medio de cultivo conteniendo 10^{9} pfu de Adexl
HST-1 y manteniendo después la mezcla a 37ºC.
Ejemplo
3
Se prepara una preparación génica obteniendo una
esponja liofilizando solución neutra de atelocolágeno; cortando la
esponja en un cuadrado de aproximadamente 5 mm; añadiendo la esponja
cortada a 1 ml de medio de cultivo conteniendo 10^{9} pfu de
Adexl HST-1; y dejando reposar la esponja durante la
noche.
Ejemplo
4
Se prepara una preparación génica liofilizando
una preparación génica en forma de gel preparada en el ejemplo
2.
Ejemplo
5
Se prepara una preparación génica en forma de
pelet (un producto comprimido en forma de varilla) liofilizando de
nuevo la preparación génica obtenida en el ejemplo 3 y comprimiendo
la esponja liofilizada a forma de varilla.
Ejemplo
6
Se prepara una preparación génica mezclando un
vector de plásmido obtenido insertando factor de crecimiento del
fibroblasto HST-1 (FGF4) en un vector de expresión
(pRc/CMV) que tiene un promotor de citomegalovirus (CMV) con un
liposoma (DMRIE-C (producido por GIBCOBRL)) y
mezclando posteriormente una solución conteniendo el liposoma con
el mismo volumen de solución neutra de atelocolágeno.
Ejemplo
7
Se prepara una preparación génica encerrando la
preparación génica obtenida en el ejemplo 1 en una bolsa hecha de
poliéster (hecha de vaso sanguíneo artificial) (Micron (marca
comercial, producido por INTERVASCULAR)).
Ejemplo
8
Como en el ejemplo 1, se preparó 1 ml de una
preparación de gen mezclando medio de cultivo conteniendo 10^{9}
pfu de Adexl HST-1 con solución neutra de
atelocolágeno de manera que fuese 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 o 2,0% p/p en
la concentración final de atelocolágeno.
Ejemplo
9
Se prepara una preparación génica en forma de
gel mezclando 5 ml de solución acuosa que contiene un plásmido
pOG44 (obtenido de Stratagene) en una concentración de 73,25
\mug/ml con 5 g de solución ácida de atelocolágeno (conteniendo
2% atelocolágeno, pH 3,5); liofilizando la mezcla para obtener una
esponja; añadiendo agua destilada a la esponja de manera que sea
0,4, 2, 5, 10 o 20% p/p en una concentración de atelocolágeno.
\newpage
Ejemplo
10
Se prepara una preparación génica en forma de
gel mezclando 5 ml de solución acuosa que contiene un plásmido
pOG44 en una concentración de 73,25 \mug/ml con 5 g o 2,5 g de
solución ácido de atelocolágeno; añadiendo 260 \mul o 640 \mul
de solución acuosa de albúmina de suero humano (80 mg/ml) a la
mezcla y mezclándolos; liofilizando la mezcla para obtener una
esponja; añadiendo agua destilada a la esponja de manera que sea 10%
p/p en la concentración total de atelocolágeno y albúmina de suero
humano.
Ejemplo
11
Se prepara una preparación génica en forma de
película esparciendo y secando gradualmente la preparación génica
en forma de gel obtenida en el ejemplo 9 sobre un vidrio.
Ejemplo
12
Se prepara una preparación génica en forma de
varilla moldeando a presión y secando gradualmente la preparación
génica en forma de gel obtenida en el ejemplo 9 o 10.
Ejemplo comparativo
1
Se administró un ml de medio de cultivo
conteniendo 10^{9} pfu de Adex HST-1
intraperitonealmente a un ratón. Entonces, aproximadamente el
duodécimo día después de la administración, el número de plaquetas
se duplicó más o menos, y este efecto duró hasta el día
20-30. Además, la concentración de
HST-1 en sangre periférica era 50 ng/ml y fue
máxima el día 20 después de la administración. Sin embargo, la
concentración de HST-1 no se pudo mantener a un
nivel fijo a diferencia de la preparación del ejemplo 1 siguiente y
HST-1 no pudo ser detectado en sangre el día 60
después de la administración. Estos resultados se representan en las
figuras 1 y 2.
Ejemplo de prueba
1
Se administró intraperitonealmente a un ratón
1,0 ml de una preparación génica preparada en el ejemplo 1.
Entonces, aproximadamente el día 12 después de la administración, el
número de plaquetas se duplicó más o menos, y este efecto duró más
allá del día 50. Además, la concentración de HST-1
en sangre periférica se mantuvo a 20 ng/ml más allá del día 80
después de la administración. Estos resultados se representan en las
figuras 1 y 2.
Ejemplo de prueba
2
Se administra intraperitonealmente a un ratón
1,0 ml de una preparación génica preparada como en el Ejemplo 2.
Entonces, aproximadamente el día 12 después de la administración, el
número de plaquetas se duplicó aproximadamente, y este efecto dura
más allá del día 60 después de la administración.
Ejemplo de prueba
3
Se administra intraperitonealmente a un ratón
una preparación génica preparada como en el ejemplo 3. Entonces,
aproximadamente el día 12 después de la administración, el número de
plaquetas se duplicó más o menos, y este efecto dura más allá del
día 60 después de la administración.
Ejemplo de prueba
4
Se administró intraperitonealmente a un ratón
una preparación génica preparada en el ejemplo 1, y la preparación
génica se quitó al tercer día después de la administración. Como
resultado, aproximadamente el día 12 después de la administración,
el número de plaquetas se duplicó aproximadamente, después disminuyó
y volvió al nivel normal aproximadamente el día 25 después de la
administración. Estos resultados se representan en la figura 3.
Ejemplo de prueba
5
Se administró intraperitonealmente a un ratón
una preparación génica que se había preparado en el ejemplo 1 y la
preparación génica se quitó al tercer día después de la
administración. El día 20 después de la administración se
administró de nuevo una preparación génica preparada en el ejemplo
1. Como resultado, aproximadamente el día 12 después de la
administración el número de plaquetas se duplicó aproximadamente,
posteriormente disminuyó y volvió al nivel normal aproximadamente
el día 20 después de la administración. Inmediatamente después de
la segunda administración, el número de plaquetas se duplicó de
nuevo más o menos, y este efecto duró más allá del día 40 después
de la primera administración. Estos resultados se representan en la
figura 4.
Ejemplo de prueba
6
Se administró intraperitonealmente a un ratón
cada una de 5 preparaciones de gen que habían sido preparadas en el
ejemplo 10 o 1 ml de medio de cultivo que contenía 10^{9} pfu de
Adex HST-1 y estaba completamente libre de
colágeno. La concentración de proteína HST-1 en
sangre periférica se determinó el día 5 después de la
administración. Los resultados se representan en la figura 5. Los
datos muestran que la concentración de suero de proteína
HST-1 disminuyó con el aumento de la concentración
de colágeno en la preparación.
Ejemplo de prueba
7
Como resultado de administrar
intraperitonealmente a un ratón 1 ml de medio de cultivo conteniendo
10^{9} pfu de Adex HST-1, el número de plaquetas
se duplicó aproximadamente el día 12 después de la administración,
posteriormente disminuyó y volvió al nivel normal aproximadamente el
día 35 después de la administración. El día 37 después de la
primera administración, se administró de nuevo 1 ml de una
preparación génica conteniendo atelocolágeno que se había preparado
en el ejemplo 1. Inmediatamente después, el número de plaquetas se
duplicó aproximadamente, y este efecto duró todo el período
restante del experimento. Estos resultados se representan en la
figura 6.
Ejemplo comparativo
2
Se administró intraperitonealmente a un ratón 1
ml de medio de cultivo conteniendo 10^{9} pfu de Adex
HST-1 y de nuevo se administró el día 37 después de
la primera administración. Como resultado, aproximadamente el día
12 después de la primera administración, el número de plaquetas se
duplicó aproximadamente, después disminuyó y volvió al nivel normal
aproximadamente el día 35 después de la primera administración. Las
plaquetas no aumentaron después de la segunda administración de
Adex HST-1. Estos resultados se representan en la
figura 6.
Los resultados del ejemplo de prueba 7 y del
ejemplo comparativo 2 ponen de manifiesto que es posible administrar
repetidas veces una preparación génica preparada en el ejemplo 1 en
contraposición con el resultado obtenido con administraciones
repetidas de un adenovector vírico no formulado según la presente
invención. La incapacidad de realizar una administración repetida
se debe a la aparición de anticuerpos neutralizantes.
Claims (17)
1. Una preparación génica de liberación
sostenida en forma de gel incluyendo un atelocolágeno y un gen
deseado o un vector incluyendo dicho gen deseado.
2. La preparación génica de liberación sostenida
de la reivindicación 1, donde dicho atelocolágeno está presente en
la cantidad de 0,01-25% p/p de la preparación.
3. La preparación génica de liberación sostenida
de la reivindicación 1, donde dicho atelocolágeno está presente en
la cantidad de 0,05-10% p/p de la preparación.
4. La preparación génica de liberación sostenida
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha
preparación incluye además un aditivo.
5. La preparación génica de liberación sostenida
de la reivindicación 4, donde dicho atelocolágeno está presente en
la cantidad de 2% p/p o más de la preparación, y dicho aditivo está
presente en la cantidad de 5-900% p/p del
atelocolágeno.
6. Una preparación génica de liberación
sostenida en forma de película que se puede obtener secando un gel
incluyendo 0,2-30% p/p de un atelocolágeno, y un gen
deseado o un vector incluyendo dicho gen deseado.
7. La preparación génica de liberación sostenida
de la reivindicación 6, donde el atelocolágeno es
0,3-5% p/p en el gel.
8. La preparación génica de liberación sostenida
de la reivindicación 6, donde el atelocolágeno es
0,4-2% p/p en el gel.
9. La preparación génica de liberación sostenida
de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde dicho gel
incluye además un aditivo.
10. La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 9, donde dicho atelocolágeno es 1% o
más en el gel, y el aditivo es 5-900% p/p de dicho
atelocolágeno.
11. Una preparación génica de liberación
sostenida en forma de varilla sólida que se puede obtener secando
un gel incluyendo 10-30% p/p de un atelocolágeno, y
un gen deseado o un vector incluyendo dicho gen deseado.
12. La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 11, donde dicho gel incluye además
un aditivo.
13. La preparación génica de liberación
sostenida de la reivindicación 12, donde dicho aditivo está presente
en la cantidad de 5-100% p/p del atelocolágeno.
14. Una composición farmacéutica incluyendo la
preparación génica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y
opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Una preparación génica de liberación
sostenida en forma de varilla obtenible por el proceso que
incluye:
obtener una esponja liofilizando un gel
incluyendo 0,05 a 5% p/p de atelocolágeno, y un gen deseado o un
vector incluyendo dicho gen deseado;
obtener un gel en el que la concentración de
atelocolágeno es 10 a 30% p/p añadiendo agua destilada a la
esponja;
formar una varilla por moldeo por presión del
gel; y
secar.
16. Uso de la preparación génica de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 u obtenible por el proceso de la
reivindicación 15 para la preparación de una composición
farmacéutica para suministrar un gen para captación por una
célula.
17. El uso de la reivindicación 16, donde dicha
composición farmacéutica ha de ser administrada subcutáneamente,
por vía intramuscular o intraperitonealmente a un sujeto.
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