KR19990028522A

KR19990028522A - 유전자 제제

Info

Publication number: KR19990028522A
Application number: KR1019970709840A
Authority: KR
Inventors: 마사아끼 데라다; 다까히로 오찌야; 데루오 미야따; 히로시 이또
Original assignee: 데루오 미야따; 가부시끼가이샤 고껜; 다께우찌 마사야쓰; 스미또모 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 1995-07-03
Filing date: 1996-07-02
Publication date: 1999-04-15
Also published as: EP0844004A1; IL122802A; WO1997002047A1; AU704694B2; AU6243696A; CN1230205C; DE69637243D1; CA2225998C; TW577747B; CN1193916A; DE69637243T2; ES2293648T3; KR100431779B1; EP0844004A4; IL122802A0; NZ311175A; EP0844004B1; CA2225998A1; ATE372787T1

Abstract

목적하는 유전자 또는 목적하는 유전자가 결합된 벡터 및 그를 지지하는 담체를 함유하는 유전자 제제.

Description

유전자 제제

유전자 치료는 활발한 연구 분야이며, 성공적인 치료에 대한 기대가 극도로 높다. 유전자 그 자체가 의약인 유전자 치료 접근에서, 질병에 대한 치료는 지정된 효소, 사이토킨 등의 유전자를 환자의 세포로 전이시킴으로써 수행된다. 이어서, 도입된 유전자는 환자의 몸 안에서 지정된 기질을 생산한다. 상기 유전자 치료는 두 가지 유형으로 나눌 수 있다. 첫 번째 유형의 목적은 유전자를 환자의 제놈 (genome) 으로 통합하면서 지정된 유전자의 반영구적인 발현이다. 또다른 유형의 목적은 제놈으로의 통합이 없는 유전자의 임시 발현이다. 후자의 유전자 치료 유형에서, 아데노바이러스 (adenovirus) 등을 사용한 방법은 환자에게 유전자 코드화, 예를 들면, 암 세포에 대항하는 면역력을 증가시키는 사이토킨 (cytokine) 을 전이시키기 위한 방법으로서 종종 적용된다 (Cardiovascular Research,28, 445 (1994); Science,256, 808 (1992); Gastroenterology,106, 1076 (1994); TIBTECH,11, 182 (1993); J. Biol. Chem.,266, 3361 (1991); Nature Medicine,1, 583, (1995); 및 그의 인용 참고).

바이러스 벡터를 사용한 경우에, 일반적으로 유전자 전이의 효율이 높을지라도, 면역 반응 때문에, 반복 투여는 어렵다 (J. Biol. Chem.,269, 13695 (1994), Am. J. Respir. Cell Mol.,10, 369 (1994)).

유기 화합물 또는 단백질 제제를 함유하는 의약을 점진적으로 방출하기 위한 콜라겐 사용 제제가 J. Controlled Release33, 307-315 (1995) 등에 개시되어 있다. 그러나, 상기 개시된 통상의 의약 (예를 들면, 단백질 약물, 화학적으로 합성된 의약 등) 은 예를 들면, 콜라겐 겔을 내부에 보유할 때, 약 1 내지 2 일 후에 용해된다.

유전자 치료에 현재 사용되며, 유전자 벡터 (유전자 삽입 벡터) 또는 유전자를 직접적으로 투여하는 것을 포함하는 방법에서, 유전자 벡터 또는 유전자는 투여 직후 세포에 접촉하고, 그 직후에, 유전자 전이가 시작되며, 한번에 완성된다. 또한 세포로 변환된 유전자는 세포 분열로 희석되거나 (즉, 그 복제 수가 감소한다) 또는 세포 내 분해에 의해 감소된다. 그 결과 전이된 유전자의 발현은 충분한 치료를 수행하기에는 너무 짧은 수 주 동안만 유지될 수 있으며, 이는 상기 방법의 결점이다. 따라서, 유전자 벡터 또는 유전자의 반복 투여가 필요하다. 그러므로, 본 발명의 목적은 상기 단점을 극복하고, 유전자 벡터 또는 유전자를 점진적으로 방출할 수 있고, 치료 효과를 장기간 유지할 수 있는 제제를 제공하는 것이다.

또한, 이는 바이러스 벡터 등을 사용한 유전자 치료에서는 어렵기 때문에 반복 투여를 가능하게 하는 방법이 기대된다. 따라서, 본 발명의 두 번째 목적은 바이러스 벡터 등을 사용한 유전자 치료에서 반복 투여를 가능하게 하는 유전자 제제를 제공하는 것이다.

또한, 유전자가 단백질 제제를 위한 기간보다 장기간인 수 주 동안 발현되기 때문에, 생체 내의 유전자 발현은 안전하게 확인되는 임의의 시간에 중지될 수 있을 것이 요망된다. 따라서, 본 발명의 세 번째 목적은 치료의 종료가 목적될 때, 유전자 전이를 신속하게 중지할 수 있는 유전자 제제를 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명자는 유전자 벡터 또는 유전자를 점진적으로 방출하기 위한 다양한 제제를 시험해 왔으며, 유전자 또는 유전자로 삽입된 벡터가 생물학적으로 적합한 물질로 이루어진 담체로 결합되는 제제가 생체 내로 투여될 때, 유전자는 예상 외로 수 개월간 발현됨을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 상기 제제가 생체로 반복 투여될 수 있음을 발견하였으며, 따라서 본 발명이 수행되었다.

따라서, 본 발명의 특성은 하기와 같다.

(1) 유전자 또는 상기 유전자로 삽입된 벡터가 생물학적으로 적합한 물질로 이루어진 담체에 결합되는 것을 포함하는 유전자 제제.

(2) (1) 에 있어서, 상기 생물학적으로 적합한 물질이 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 알부민, 히알루론산, 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 키틴, 키토산, 알긴산, 펙틴, 아가로오스, 히드록시아파티트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리디메틸실록산, 글리콜산, 락트산 또는 아미노산의 중합체 또는 공중합체, 및 상기 생물학적으로 적합한 물질의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 제제.

(3) 유전자 또는 상기 유전자로 삽입된 벡터가 콜라겐을 함유하는 생물학적으로 적합한 물질로 이루어진 담체에 결합되는 것을 포함하는 유전자 제제.

(4) 유전자 또는 상기 유전자로 삽입된 벡터가 콜라겐으로 이루어진 담체에 결합되는 것을 포함하는 유전자 제제.

(5) (1) 에 있어서, 생체 내에 투여되었을 때, 상기 유전자 제제 내의 상기 생물학적으로 적합한 물질의 함량이 0.01 내지 30 w/w % 인 유전자 제제.

(6) (1) 에 있어서, 용액, 현탁액, 수-함유 겔, 필름, 스폰지, 막대 또는 구의 형태인 유전자 제제.

(7) (1) 에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터, 리포솜 벡터 및 바이러스와 리포솜이 융합된 유전자융합성 (fusogenic) 리포솜 벡터인 유전자 제제.

(8) (1) 에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 유전자 제제.

(9) (1) 에 있어서, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인 유전자 제제.

(10) 유전자 또는 상기 유전자로 삽입된 벡터가 생물학적으로 적합한 물질로 이루어진 담체에 결합되어 있으며, 상기 담체가 상기 유전자 또는 상기 유전자 벡터가 통과하여 침투할 수 있는 용기 내에 함유된 유전자를 포함하는 유전자 제제.

본 발명은 의약 분야, 특히 유전자 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전자를 함유하는 제제에 관한 것이다. 상기 제제는 생체 내로 투여되었을 때, 유전자 벡터 (vector) 또는 유전자를 안정적으로 보유하며, 이를 점진적으로 방출하며, 그리고 장기간 치료 효과를 유지한다. 상기 제제는 알맞은 시기에 치료를 중지할 수 있도록 한다.

도 1 은 시험예 1 및 비교예 1 에서 시간 경과에 따른 혈소판 수를 나타내는 그래프이다.

도 2 는 시험예 1 및 비교예 1 에서 시간 경과에 따른 말초 혈액 내의 HST-1 를 나타내는 그래프이다.

도 3 은 시험예 4 및 비교예 1 에서 시간 경과에 따른 혈소판 수를 나타내는 그래프이다.

도 4 는 시험예 5 에서 시간 경과에 따른 혈소판 수를 나타내는 그래프이다.

도 5 는 시험예 6 에서 말초 혈액 내 HST-1 양에 대한 콜라겐 투여 의존성을 나타내는 그래프이다.

도 6 은 시험예 7 및 비교예 2 에서 시간 경과에 따른 혈소판 수를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 하기에 더욱 상세히 기술될 것이다.

"유전자 삽입용 벡터" 는 유전자를 세포로 전이시킬 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 예를 들면, 바이러스 벡터, 리포솜 벡터, 바이러스와 리포솜이 융합되어 있는 유전자융합성 리포솜 벡터 등을 포함한다 (Cardiovascular Research,28, 445 (1994); Science,256, 808 (1992); Gastroenterology,106, 1076 (1994); TIBTECH,11, 182 (1993); J.Biol. Chem.,266, 3361 (1991); Nature Medicine,1, 583, (1995)).

바이러스 벡터는 유전자 치료에서 통상적인 벡터로서 사용될 수 있으며, 예를 들면, 아데노바이러스, 아데노-조합 바이러스, 백신성 바이러스, 레트로바이러스 (retrovirus), HIV 바이러스, 허피스바이러스 (herpesvirus) 등을 포함한다. 유전자 벡터는 예를 들면, 상기에 참고로 기술한 통상의 방법에 따라 유전자를 바이러스 벡터에 직접적으로 전이시키기 위해 삽입함으로써 수득될 수 있다.

리포솜 벡터는 유전자 치료에서 통상적인 리포솜 벡터로서 사용될 수 있으며, 예를 들면, DOTMA, DOPE, DOGS 등을 혼합함으로써 수득한 리포솜 벡터를 포함한다. 양이온성 리포솜 벡터가 사용되면, 세포로의 전이 효율이 높다. 바이러스와 리포솜이 융합되어 있는 유전자융합성 리포솜 벡터의 예는 센다이 (Sendai) 바이러스 (HVJ : 일본의 적혈구 응집 바이러스) 와 리포솜이 융합되어 있는 유전자융합성 벡터 등을 포함한다. 유전자 벡터는 예를 들면, 상기에 참고로 기재된 통상의 방법에 따라 유전자를 리포솜 벡터나 유전자융합성 리포솜 벡터로 전이시키기 위해 둘러쌈으로써 수득될 수 있다. 둘러싸인 유전자는 생체 내에서 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형태이며, 바람직하게는 플라즈미드 (plasmid) 등과 같이 생체 내에서 안정한 형태이다.

유전자 그 자체는 유전자를 세포로 전이하는 "유전자 삽입용 벡터" 로 삽입되지 않고 본 발명의 유전자 제제 내에 보유될 수 있다. 이 경우에, 유전자의 형태는 생체 내에서 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들면, 유전자는 소위 발현 벡터라 불리는 것 등으로 삽입될 수 있다. 유전자의 형태는 바람직하게는 플라즈미드 등과 같이 생체 내에서 안정한 형태이다.

전이를 위한 "유전자" 는 유전자 치료에 사용될 수 있는 임의의 유전자일 수 있으며, 예를 들면, 아데노신 데아미나아제 (adenosine deaminase) 유전자, GM-CSF 유전자, 티미딘 키네이즈 (thymidine kinase) 유전자 등을 포함한다.

"생물학적으로 적합한 물질" 은 바람직하게는 높은 생물학적 적합성을 갖는 물질이며, 생체 내에 유전자 벡터 또는 유전자를 안정하게 보유할 수 있다. 생물학적으로 적합한 물질의 예는 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 알부민, 히알루론산, 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 키틴, 키토산, 알긴산, 펙틴, 아가로오스, 히드록시아파티트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리디메틸실록산, 글리콜산, 락트산 또는 아미노산의 중합체 또는 공중합체, 상기 생물학적으로 적합한 물질의 둘 이상의 혼합물 등을 포함한다. 특히 바람직한 생물학적으로 적합한 물질은 콜라겐이다. 콜라겐과 상술한 기타 생물학적으로 적합한 물질을 혼합하는 것 또한 바람직하다. 콜라겐은 임의의 콜라겐일 수 있으며, 예를 들면, 산 가용성 콜라겐, 효소 가용성 콜라겐 (예를 들면, 아텔로콜라겐 (atelocollagen) 등), 알칼리 가용성 콜라겐, 개질된 아미노산 측쇄를 갖는 콜라겐, 가교된 콜라겐, 유전자 공학에 의해 제조된 콜라겐 등을 포함한다. 개질된 아미노산 측쇄를 갖는 콜라겐은 예를 들면, 숙시닐 또는 메틸 콜라겐 등을 포함한다. 가교된 콜라겐은 예를 들면, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 폴리에폭시 화합물로 처리된 콜라겐 등을 포함한다 (Fragrance J., 1989-12, 104-109, 일본 특허 공고 (심사) No. 7 (1995)-59522).

"첨가제" 는 유전자 벡터 등을 안정화하거나, 세포 또는 핵으로의 유전자 전이를 촉진하거나, 또는 유전자 벡터의 방출을 조절하는 것 등을 위해서 필요에 따라 본 발명의 제제에 첨가될 수 있다. 첨가제는 상기 목적을 이룰 수 있는 임의의 첨가제일 수 있으며, 예를 들면, 쉬크로오스, 글리신, 콘드로이틴 술페이트, 젤라틴, 알부민, 사이토킨, 고 이동성 군 단백질 HGM-1 과 HGM-2 의 혼합물 (High Mobility Group-1,-2 Mixture; Experimental Medicine,12, 184 (1994), BIOTHERAPY,8, 1265 (1994)), 클로로퀸, 폴리라이신 (Hepatology,22, 847 (1995)), 트랜스펙탐 (상표명, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 등을 포함할 수 있다.

콜라겐이 기타 생물학적으로 적합한 물질 또는 첨가제와 혼합된 경우에, 콜라겐의 함량은 10 w/w % 이상, 바람직하게는 30 w/w % 이상, 더욱 바람직하게는 50 w/w % 이상, 그리고 가장 바람직하게는 70 w/w % 이상일 수 있다.

유전자 제제 내에서 생물학적으로 적합한 물질의 함량은 유전자 벡터 또는 유전자의 크기, 종류 등, 및 생물학적으로 적합한 물질의 종류에 따라 다양하다.

유전자 제제 내에서 생물학적으로 적합한 물질의 바람직한 함량은 유전자 제제가 생체 내에 존재하는 조건 하에서, 0.01 내지 30 w/w %, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 10 w/w %, 그리고 가장 바람직하게는 0.05 내지 5 w/w % 이다.

또한, 유전자 제제에서, 생물학적으로 적합한 물질의 합량은 특정 제제에 따라 다양하다. 예를 들면, 콜라겐이 생물학적으로 적합한 물질로서 사용되는 경우에, 함량의 바람직한 범위는 하기에 기술될 것이다.

제제가 겔 형태일 때, 콜라겐의 바람직한 함량은 0.01 내지 25 w/w %, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 10 w/w %, 그리고 가장 바람직하게는 0.05 내지 5 w/w % 이다. 그러나, 콜라겐 함량이 2 % 이상이면, 첨가제가 콜라겐의 5 내지 900 w/w % 로 첨가되는 것이 바람직하다.

제제가 필름 형태일 때, 콜라겐의 바람직한 함량은 건조 전 함량으로서, 0.2 내지 30 w/w %, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 5 w/w %, 가장 바람직하게는 0.4 w/w % 이다. 그러나, 콜라겐 함량이 1 % 이상이면, 첨가제가 콜라겐의 5 내지 900 w/w % 로 첨가되는 것이 바람직하다.

제제가 고형 막대 형태일 때, 콜라겐의 바람직한 함량은 10 내지 30 w/w % 이며, 첨가제가 콜라겐의 5 내지 100 w/w % 로 첨가되는 것이 바람직하다.

본 발명의 유전자 제제는 구체적인 형태로 제한되지는 않는다. 상기 제제는 용액, 현탁액, 수-함유 겔, 필름 또는 스폰지일 수 있다. 고체 형태는 막대, 구 등으로 성형될 수 있다. 그러나, 비록 제제의 형태가 유전자 삽입용 벡터의 종류, 크기 등에 따라 다양하더라도, 바람직한 형태는 일반적으로 용액, 현탁액 또는 수-함유 겔이다.

유전자 제제는 유전자 제제가 생체 내에 존재하는 조건 하에서, 생물학적으로 적합한 물질의 함량을 상기 바람직한 범위 내로 유지시킴으로써 수득된다.

용액, 현탁액 또는 수-함유 겔 형태의 유전자 제제의 제조 방법의 예는 (1) 유전자 벡터 또는 유전자 (이하, '유전자 벡터 등' 이라 함) 의 분말, 현탁액 또는 겔을 필요에 따라 첨가제가 첨가되는 용액 또는 겔 형태의 담체와 혼합하는 방법, (2) 유전자 벡터 등의 용액, 현탁액 또는 겔을 필요에 따라 첨가제가 첨가되는 분말 형태의 담체로 침투하도록 하는 방법, 또는 (3) 유전자 벡터 등의 용액, 현탁액 또는 겔 등을 필요에 따라 첨가제가 첨가되는 스폰지인 담체에 침투하도록 하고, 이들을 함께 혼련하는 방법을 포함한다. 본 발명의 유전자 제제를 제조하기 위한 방법은 이와 같은 방법에 한정되지 않는다.

고체 형태의 유전자 제제의 제조를 위한 방법의 에는 (1) 유전자 벡터 등의 분말, 용액, 현탁액 또는 겔을 필요에 따라 첨가제가 첨가되는 용액이나 겔 형태의 담체와 혼합하고, 상기 혼합물을 건조시키는 방법, (2) 유전자 벡터 등의 분말, 용액, 현탁액 또는 겔을 필요에 따라 첨가제가 첨가되는 분말 형태의 담체와 혼합하고, 상기 혼합물을 건조시키는 방법, (3) 유전자 벡터 등의 용액, 현탁액 또는 겔을 필요에 따라 첨가제가 첨가되는 스폰지 형태의 담체로 침투하도록 하고, 상기 스폰지를 건조시키는 방법, (4) 유전자 벡터 등의 용액, 현탁액 또는 겔을 필요에 따라 첨가제가 첨가되는 스폰지 형태의 담체로 침투하도록 하고, 상기 스폰지를 방치된 채로 건조시키거나, 필요에 따라 물 등을 첨가한 후에, 상기 스폰지를 혼련하고, 건조시키는 방법, (5) (1) 내지 (4) 에 따른 방법에 의해 수득한 고체 생성물을 분쇄 및 압축 성형하는 방법, 또는 (6) 유전자 벡터 등을 필요에 따라 첨가제가 첨가되는 분말인 담체와 혼합하고, 상기 혼합물을 압착 성형하는 방법을 포함한다. 본 발명은 상기 방법에 한정되지는 않는다. 건조 방법; 건조시 온도 및 습도; 혼합 방법; 혼합 시 온도 및 습도; 압축 성형 방법; 압축 성형시 온도, 습도 및 압력; 담체 용액 및 유전자 벡터 용액의 용액 속도; 및 담체 및 유전자 벡터 용액의 혼합물의 용액 속도; 및 pH 는 통상의 방법과 동일할 수 있다.

본 발명의 유전자 제제는 치료될 질병, 목적하는 기관 등에 따라 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자 제제는 피하 또는 근육 내로 투여될 수 있으며, 또는 신장, 간, 폐, 뇌 등과 같은 질병의 목적하는 부위에 직접적으로 투여될 수 있다. 질병 부위로의 직접적인 투여는 기관 선택적 치료를 가능하게 한다.

본 발명에 따라, 생물학적으로 저하가능한 물질이, 생물학적으로 적합한 물질로서 사용될 때, 투여 후에, 생물학적으로 가능한 물질을 생체 외로 제거할 필요는 없다. 또한, 반복 투여가 가능하다.

반면에, 유전자 전이의 중단이 질병의 종류 또는 조건에 따라 요구될 때, 유전자 제제는 방치된 채로 제거될 수 있으며, 유전자 전이는 중단될 수 있다. 예를 들면, 유전자 제제가 고형일 때, 이는 외과 수술 등에 의해 제거될 수 있다. 유전자 벡터 등이 바이러스가 자유롭게 통과할 수 있는 세공을 갖는 용기 등 내에 보유된 유전자 제제를 사용하여, 유전자 치료가 수행될 때, 용기 등은 치료의 종료 후에 제거될 수 있다. 예를 들면, 유전자 치료는 일본 특허 출원 No. 3 (1991) - 120115 (국제 공개 번호 WO92/20400) 에 기술된 바와 같은 용기 (튜브) 를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 유전자 제제는 유전자 벡터 등을 점진적으로 방출할 수 있으며, 동시에 지속적인 방출 동안 생체 내에 안정적으로 유전자 삽입 벡터 등을 보유할 수 있다. 따라서, 단일 투여 후의 효과적인 유전자 발현 시간은 세포와 벡터 사이의 접촉을 지연시켜서 유전자의 세포로의 전이 기간을 조절함으로써 연장될 수 있다.

본 발명의 유전자 제제는 또한 그렇지 않으면, 실질적으로 항체를 중화하는 외관 때문에, 반복 투여를 어렵게 하는 바이러스 벡터 등과 같은 유전자 벡터의 반복 투여를 가능하게 한다.

또한, 본 발명의 유전자 제제는 치료의 종료가 의도되는 때에, 유전자 제제가 제거될 수 있기 때문에, 유전자 발현의 조절을 가능하게 한다.

실시예 1

섬유아세포 성장 인자 HST-1 (FGF4) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 2980-2984 (1987) 에 따라 제조) 를 코드화하는 유전자로 삽입된 아데노바이러스 (Adex1 HST-1; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, 12368 (1994)) 10⁹pfu (플라그 형성 단위) 를 함유하는 배양 배지 0.9 ml 와 안텔로콜라겐 중성 용액 (KOKEN 에 의해 제조된 안텔로콜라겐 이식: 2 % 안텔로콜라겐 용액) 0.1 ml 을 혼합하여 유전자 제제를 제조하였다. 상기 아데노바이러스 (Adex1 HST-1) 는 J. Virol.,54, 711-719 (1985) 또는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93, 1320 (1996) 및 Cell,13, 181-188 (1978) 에 기술된 방법에 따라 아데노바이러스 5 형 (ATCC 카탈로그 No. VR-5) 의 E1A, E1B 및 E3 을 제거하고; 섬유아세포 성장 인자 HST-1 의 유전자를 비증식형 아데노바이러스 유전자로 삽입함으로써 제조될 수 있다.

실시예 2

2 % 아텔로콜라겐 중성 용액 0.1 ml 과 Adex1 HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지 0.9 ml 을 혼합한 다음, 혼합물을 37 ℃ 에서 유지함으로써 겔 형태의 유전자 제제를 제조한다.

실시예 3

안텔로콜라겐 중성 용액을 친액화함으로써 스폰지를 수득하고; 상기 스폰지를 약 5 mm²으로 절단하고; 절단된 스폰지를 Adex1 HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지 1 ml 에 첨가하고; 그리고 스폰지를 밤새 방치함으로써 유전자 제제를 제조한다.

실시예 4

실시예 2 에서 제조된 겔 형태의 유전자 제제를 친액화함으로써 유전자 제제를 제조한다.

실시예 5

실시예 3 에서 수득된 유전자 제제를 다시 친액화하고, 상기 친액화된 스폰지를 막대형으로 압축함으로써 펠렛 형태 (막대 형태로 압축된 제품) 의 유전자 제제를 제조한다.

실시예 6

섬유아세포 성장 인자 HST-1 (FGF4) 를 사이토메가로바이러스 (CMV) 촉진제를 함유하는 발현 벡터 (pRc/CMV) 에 삽입함으로써 수득된 플라즈미드 벡터와 리포솜 (DMRIE-C (GIBCO-BRL 제조)) 을 혼합한 다음, 리포솜과 안텔로콜라겐 중성 용액 동량을 함유하는 용액을 혼합함으로써 유전자 제제를 제조한다.

실시예 7

Adex1 HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지 1 ml 과 1 % 알긴산 용액 1 ml 을 혼합하고; 벡터를 함유하는 알긴산 용액을 노즐을 통해 0.5 % 염화 칼슘 용액에 적가하여 직경 1 mm 의 비드를 수득하고; 원심분리에 의해 상기 비드를 수거함으로써 비드 형태의 유전자 제제를 제조한다.

실시예 8

Adex1 HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지 1 ml 과 45 ℃ 로 승온된 5 % 아가로오스 겔 용액 1 ml 을 혼합하고; 혼합된 용액을 노즐을 통해 10 ℃ 에서 포스페이트 완충 염용액에 적가하여 직경 1 mm 의 비드를 수득하고; 원심분리에 의해 상기 비드를 수거함으로써 비드 형태의 유전자 제제를 제조한다.

실시예 9

실시예 1 에서 수득한 유전자 제제를 폴리에스테르로 만든 벡 (인공 혈액 용기로부터 제조) (Micron 상표명, INTERVASCULAR 제조) 내에 둘러싸음으로써 유전자 제제를 제조한다.

실시예 10

실시예 1 과 동일한 방법으로, Adex1 HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지와 안텔로콜라겐 중성 용액을 혼합하여 안텔로콜라겐 최종 농도가 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 또는 2.0 w/w % 가 되도록 함으로써 유전자 제제 1 ml 를 제조하였다.

실시예 11

73.25 ㎍/ml 의 농도로 플라즈미드 pOG44 (Startagene 으로부터 구입) 을 함유하는 수용액 5 ml 와 안텔로콜라겐 산 용액 (2 % 안텔로콜라겐 함유, pH 3.5) 5 g 을 혼합하고; 상기 혼합물을 친액화하여 스폰지를 수득하고; 상기 스폰지에 증류수를 첨가하여 안텔로콜라겐 농도가 0.4, 2, 5, 10 또는 20 w/w % 가 되도록 함으로써 겔 형태의 유전자 제제를 제조한다.

실시예 12

73.25 ㎍/ml 의 농도로 플라즈미드 pOG44 를 함유하는 수용액 5 ml 와 안텔로콜라겐 산 용액 5 g 또는 2.5 g 을 혼합하고; 인간 혈청 알부민 수용액 (80 mg/ml) 260 ㎕ 또는 640 ㎕ 을 상기 혼합물에 첨가하여 이를 혼합하고; 상기 혼합물을 친액화하여 스폰지를 수득하고; 상기 스폰지에 증류수를 첨가하여 안텔로콜라겐 및 인간 혈청 알부민 총 농도가 10 w/w % 가 되도록 함으로써 겔 형태의 유전자 제제를 제조한다.

실시예 13

실시예 11 에서 수득한 겔 형태의 유전자 제제를 글래스 상에 넓게 펴고, 점진적으로 건조시킴으로써 필름 형태의 유전자 제제를 제조한다.

실시예 14

실시예 11 또는 12 에서 수득한 겔 형태의 유전자 제제를 압착 성형하고, 점진적으로 건조시킴으로써 막대 형태의 유전자 제제를 제조한다.

비교예 1

Adex HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지 1 ml 를 마우스에 복강 내 투여하였다. 그 다음에, 투여 후 약 12 일째에, 혈소판의 수가 약 2 배로 증가하였고, 상기 효과는 20 내지 30 일째까지 지속되었다. 또한, 말초 혈액 내의 HST-1 농도는 50 ng/ml 이었고, 투여 후 20 일째에 최대값이었다. 그러나, HST-1 의 농도는 실시예 1 의 제제와 상이하게 고정된 수준 이하로 유지되지 못했고, HST-1 은 투여 후 60 일째에 혈액 내에서 검출되지 않았다. 상기 결과를 도 1 및 도 2 에 나타낸다.

시험예 1

실시예 1 에서 제조된 유전자 제제 1.0 ml 을 마우스에 복강 내 투여하였다. 그 다음에, 투여 후 약 12 일째에 혈소판의 수는 약 2 배로 증가하였고, 상기 효과는 50 일 이상 지속되었다. 또한, 말초 혈액 내의 HST-1 농도는 투여 후 80 일째 이후에 20 ng/ml 로 유지되었다. 상기 결과를 도 1 및 도 2 에 나타낸다.

시험예 2

실시예 2 와 같이 제조된 유전자 제제 1.0 ml 을 마우스에 복강 내 투여하였다. 그 다음에, 투여 후 약 12 일째에 혈소판의 수가 약 2 배로 증가하였고, 상기 효과는 투여 후 60 일 이상 지속되었다.

시험예 3

실시예 3 과 같이 제조된 유전자 제제를 마우스에 복강 내 투여하였다. 그 다음에, 투여 후 약 12 일째에 혈소판의 수가 약 2 배로 증가하였고, 상기 효과는 투여 후 60 일 이상 지속되었다.

시험예 4

실시예 1 에서 제조된 유전자 제제를 마우스에 복강 내 투여하고, 투여 후 3 일째에 상기 유전자 제제를 제거하였다. 그 결과, 투여 후 약 12 일째에 혈소판의 수가 약 2 배가 되었고, 이어서 감소하여, 투여 후 약 25 일째에 정상 수준으로 되돌아갔다. 상기 결과를 도 3 에 나타낸다.

시험예 5

실시예 1 에서 제조된 유전자 제제를 마우스에 복강 내 투여하고, 투여 후 3 일째에 상기 제제를 제거하였다. 투여 후 20 일째에 실시예 1 에서 제조된 유전자 제제를 다시 투여하였다. 그 결과, 투여 후 약 12 일째에 혈소판의 수가 약 2 배로 된 다음 감소하고, 투여 후 약 20 일째에는 정상 수준으로 되돌아왔다. 두 번째 투여 직후, 혈소판의 수는 다시 약 2 배로 증가하였고, 상기 효과는 첫 번째 투여 후 약 40 일 이상 지속되었다. 상기 결과를 도 4 에 나타낸다.

시험예 6

실시예 10 에서 제조된 유전자 제제 각 5 개 또는 콜라겐이 전혀 없이 Adex HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지 1 ml 을 마우스에 복강 내 투여하였다. 말초 혈액 내의 HST-1 단백질 농도는 투여 후 5 일째에 측정되었다. 상기 결과를 도 5 에 나타낸다. 데이터는 HST-1 단백질 혈청 농도가 제제 내의 콜라겐 농도가 증가함에 따라 감소함을 나타낸다.

시험예 7

Adex HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지 1 ml 를 마우스에 복강 내 투여한 결과, 투여 후 12 일까지 혈소판 수가 약 2 배가 된 다음, 감소하여, 투여 후 약 35 일 째에는 정상 수준으로 되돌아갔다. 첫 번째 투여 후 37 일째에 실시예 1 에서 제조한 아텔로콜라겐 함유 유전자 1 ml 을 다시 투여하였다. 투여 직후, 혈소판 수가 약 2 배로 증가하였고, 상기 효과는 남은 실험 기간 내내 지속되었다. 상기 결과를 도 6 에 나타낸다.

비교예 2

Adex HST-1 10⁹pfu 를 함유하는 배양 배지 1 ml 을 마우스에 복강 내 투여하고, 첫 번째 투여 후 37 일째에 다시 투여하였다. 그 결과, 첫 번째 투여 후 약 12 일째에 혈소판의 수가 약 2 배가 된 다음, 감소하였고, 첫 번째 투여 후 약 35 일째에는 정상 수준으로 되돌아갔다. Adex HST-1 의 두 번째 투여 후에 혈소판은 증가하지 않았다. 상기 결과를 도 6 에 나타낸다.

시험예 7 및 비교예 2 의 결과는 아데노바이러스 벡터의 반복적인 투여로 수득된 결과가 본 발명에 따라 형성되지 않는 것과 대조적으로 실시예 1 에서 제조된 유전자 제제를 반복 투여하는 것을 가능하게 한다. 반복 투여를 가능하게 하는 것은 항체의 중화에 기인한다.

Claims

유전자 또는 상기 유전자가 삽입된 벡터가 생물학적으로 적합한 물질로 이루어진 담체에 결합된 의도된 유전자를 함유하는 유전자 제제.
제 1 항에 있어서, 상기 생물학적으로 적합한 물질이 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 알부민, 히알루론산, 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 키틴, 키토산, 알긴산, 펙틴, 아가로오스, 히드록시아파티트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리디메틸실록산, 글리콜산, 락트산 또는 아미노산의 중합체 또는 공중합체, 및 상기 생물학적으로 적합한 물질의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 제제.
유전자 또는 상기 유전자가 삽입된 벡터가 콜라겐을 함유하는 생물학적으로 적합한 물질로 이루어진 담체에 결합된 의도된 유전자를 함유하는 유전자 제제.
유전자 또는 상기 유전자가 삽입된 벡터가 콜라겐으로 이루어진 담체에 결합된 의도된 유전자를 함유하는 유전자 제제.
제 1 항에 있어서, 생체 내에 투여될 때, 상기 유전자 제제 중의 상기 생물학적으로 적합한 물질의 함량이 0.01 내지 25 w/w % 인 유전자 제제.
제 1 항에 있어서, 용액, 현탁액, 수-함유 겔, 필름, 스폰지, 막대 또는 구의 형태인 유전자 제제.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터, 리포솜 벡터 및 바이러스와 리포솜이 융합된 유전자융합성 리포솜 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 제제.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 유전자 제제.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인 유전자 제제.
유전자 또는 상기 유전자가 삽입된 벡터가 생물학적으로 적합한 물질로 이루어진 담체에 결합되고, 상기 담체는 상기 유전자 벡터 또는 상기 유전자가 침투할 수 있는 용기 내에 함유되는 의도된 유전자를 함유하는 유전자 제제.
유전자 또는 상기 유전자가 삽입된 벡터가 생물학적으로 적합한 물질로 이루어진 담체에 결합된 의도된 유전자 제제를 함유하는 유전자 제제를 투여하는 단계를 포함하는 유전자로의 생체 치료 방법.