CN107875400A - 一种壳‑核结构的siRNA仿病毒递送系统及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种壳‑核结构的siRNA仿病毒递送系统，内核为多聚精氨酸或多聚组氨酸修饰的壳聚糖包覆siRNA，外壳为含有RGD基序的多肽和精氨酸共同修饰的白蛋白。本发明所述的递送系统能够靶向识别肿瘤细胞，进入内体‑溶酶体酸性环境中后，脱去蛋白外壳，暴露的内核能够从内体‑溶酶体中逃逸，随后在胞内GSH还原条件下释放siRNA。本发明所述的递送系统稳定性好，基因载量高，主动靶向性能优异，能够显著提高siRNA的基因沉默效果，有效抑制肿瘤细胞生长及转移。

Description

一种壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统及应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近些年发展起来的一种新技术，其可通过外源性或内源性的双链RNA特异性降解目的基因mRNA，起到抑制基因表达进而下调目的蛋白表达量的作用，该技术在临床治疗遗传性疾病和肿瘤等方面具有独特的优势。小干扰RNA(siRNA)可以根据目的基因mRNA的序列人工设计合成，具有设计灵活、针对性强的特点。目前，已有四种siRNA药物用于肿瘤的早期临床研究。裸siRNA不能直接用于肿瘤的基因治疗，因其在体内易被核酸酶降解，半衰期短，转染效率低。因此，siRNA需要借助递送载体进入细胞发挥治疗作用，而设计安全高效的siRNA递送载体是基因治疗的关键。
目前，siRNA的递送系统主要有病毒及其相关载体和非病毒载体。病毒及其相关载体是目前基因治疗领域应用最多的基因药物载体。病毒载体具有胞外稳定、转染效率高等特点，但病毒制备困难，靶向特异性差以及自身安全性和免疫原性等问题在应用过程中饱受争议。目前为止，仅欧洲医药局于2012年批准首个用于基因治疗的腺相关病毒介导的基因递送系统Glybra在欧盟销售。
鉴于病毒载体的生物安全性问题，非病毒载体成为当前研究的热点。阳离子载体可以有效结合荷负电的siRNA，起到压缩基因和保护siRNA体内稳定性的作用而得到广泛应用。常用的阳离子载体有阳离子脂质(DOTAP、DOTMA等)及其辅助脂质(DOPE)，阳离子聚合物(PEI、壳聚糖、精胺等)，阳离子氨基酸(精氨酸、组氨酸、赖氨酸等)及其聚合物，阳离子蛋白(精蛋白)以及阳离子无机物(CaP等)。阳离子载体正电荷密度高，体内毒性作用大，进入机体后易与血浆蛋白及调理素结合而快速被单核巨噬细胞系统消除。为屏蔽阳离子载体的正电荷，提高基因载体在血液循环中的时间和稳定性，PEG常被结合或修饰于载体表面以增加载体的亲水性。但是，PEG化削弱了载体与肿瘤细胞表面的结合，降低了药物的细胞摄取量。此外，PEG化提高了纳米粒的稳定性，使其难以从内涵体逃逸并释放siRNA于胞浆中，因而限制了其沉默基因的效果。
研究人员针对上述的“PEG困境”提出了一些解决方案，比如将主动靶向的配体结合于PEG化的载体上增加载体的主动靶向性和细胞摄取的能力，或利用肿瘤部位的微环境设计在肿瘤组织能够及时解离的PEG片段，或提高PEG化载体的内涵体膜融合和破坏的能力等。但这些载体的设计仍然不能全面解决siRNA从进入机体到胞内释放，最终实现高效的基因沉默的问题。
发明内容
本发明针对现有技术siRNA递送载体目前仍然存在的基因载量低、压缩能力有限、体内消除快、内涵体逃逸能力差及胞内释放缓慢等问题，模拟病毒的结构功能设计具有功能性蛋白外壳和基因压缩内核构成的仿病毒壳核结构载体，该siRNA递送系统具有胞外稳定、靶向摄取、内涵体逃逸及胞内迅速释放siRNA等功能。
本发明具体技术方案如下：
一种壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统，递送系统的纳米内核包覆siRNA，递送系统的外壳为由包含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的线性多肽、环状多肽或拟肽化合物中的一种或几种以及精氨酸共同修饰的白蛋白。
现有技术下，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序的线性多肽、环状多肽或拟肽化合物均可以用来实现本发明目的，一般常用的氨基酸个数为3-10。例如，常见的五元环肽，为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Cys)(缩写c(RGDfC))，cyclo(Arg-Gly-Asp-Phe-Cys)(缩写c(RGDFC))，cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Glu)(缩写c(RGDfE))，cyclo(Arg-Gly-Asp-Phe-Glu)(缩写c(RGDFE))，cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Val)(缩写c(RGDfV))，cyclo(Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(缩写c(RGDFV))，cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)(缩写c(RGDfK))，cyclo(Arg-Gly-Asp-Phe-Lys)(缩写c(RGDFK))，cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)(缩写c(RGDyC))，cyclo(Arg-Gly-Asp-Tyr-Cys)(缩写c(RGDYC))，cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Glu)(缩写c(RGDyE))，cyclo(Arg-Gly-Asp-Tyr-Glu)(缩写c(RGDYE))，cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Tyr-Lys)(缩写c(RGDyK))，cyclo(Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)(缩写c(RGDYK))，cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Tyr-Val)(缩写c(RGDyV))，cyclo(Arg-Gly-Asp-Tyr-Val)(缩写c(RGDYV))。例如(《90Y标记的不同氨基酸序列的RGD环肽的制备及在荷人神经胶质瘤动物模型中的评价》，核化学与放射化学，2008，Vol.30.No.1)，《含RGD序列环肽以及类似物的合成方法研究》(有机化学，Vol.22,2002，No.4,239～247)、《含杂环残基及非经典环化RGD相关肤的合成》(化学学报，vol 66，2008，No2.257-265)、《新型拟肽cyclo[-RGD-ψ(triazole)-GD-]波谱学数据与结构确证》(波谱学杂志，Vol.33.No.2.Jun.2016)，专利申请CN201610164049.X等文献公开的若干含有RGD基序的环肽和拟肽等。
本发明的一个实施例中使用RGD环肽为c(RGDyK)。
目前应用最广泛的白蛋白主要是人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。白蛋白表面含有许多活性氨基可供结构修饰。本发明先将精氨酸的羧基与白蛋白表面的活性氨基反应形成酰胺键，后将RGD环肽的羧基与白蛋白表面的剩余的活性氨基反应形成酰胺键。本发明模仿病毒蛋白衣壳的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)序列识别细胞表面整合素αvβ3和αvβ5而内化进入内涵体的结构功能，将环肽RGD修饰于白蛋白表面以提高肿瘤细胞和肿瘤新生血管的靶向识别及摄取能力。同时用精氨酸修饰白蛋白以提高蛋白质等电点，使其具有在内体-溶酶体pH值条件下电荷反转的功能，使蛋白外壳脱离内核。优选的，BSA与Arg的摩尔比为1:1-1:100，BSA与环肽RGD的摩尔比为1:1-1:100。本发明的一个优选方案，当BSA：Arg：c(RGDyK)的摩尔比为1:10:5时，修饰的白蛋白的等电点为5.2，具有最优的蛋白外壳脱离内核效果。
本发明所述的递送系统,其特征在于所述包覆siRNA的内核材料选自阳离子脂质体、阳离子细胞穿膜肽、树枝状大分子、阳离子聚合物和纳米无机材料阳离子聚合物中的一种或几种。优选阳离子聚合物。进一步优选聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸、蛋白或多肽及相应的经化学修饰的衍生物。更优选壳聚糖或经化学修饰的壳聚糖衍生物，所述经化学修饰的壳聚糖衍生物选自季胺化壳聚糖、巯基化壳聚糖季铵盐、三乙基壳聚糖、二乙基甲基壳聚糖、二甲基乙基壳聚糖等中的一种或几种。
本发明的一个优选方案，上述包覆siRNA的内核材料接枝有多聚精氨酸和/或多聚组氨酸，具有内体-溶酶体膜穿孔或质子海绵效应。
本发明的一个优选方案，上述包覆siRNA的内核材料通过二硫键接枝多聚精氨酸、多聚组氨酸，聚醚酰亚胺、精氨酸、组氨酸中的一种或几种，二硫键被胞内GSH还原后断裂而释放siRNA。
上述技术方案，当蛋白外壳脱离内核后，暴露的内核具有内体-溶酶体膜穿孔或质子海绵效应使内体-溶酶体发生破裂，进而从内体-溶酶体中逃逸。随后在胞内GSH还原条件下，二硫键断裂而释放siRNA，达到基因沉默的作用。
本发明的一个优选的方案，所述包覆siRNA的内核材料为经二硫键接枝多聚精氨酸或多聚组氨酸的壳聚糖或季胺化壳聚糖。优选多聚精氨酸或多聚组氨酸与壳聚糖的单元摩尔比为1:5-1:100。
本发明所述的技术方案，带负电的siRNA通过静电吸附紧密压缩于内核，外壳通过静电力、范德华力或疏水作用力包裹载基因的内核形成纳米粒。修饰的蛋白外壳可以屏蔽内核的正电性，减少血浆蛋白和调理素的结合，延长载体在血液循环中的转运时间并使载体具备更好的血浆稳定性。仿病毒纳米粒经RGD介导靶向识别肿瘤细胞，经肿瘤细胞摄取进入内体-溶酶体酸性环境中后，发生电荷反转，蛋白外壳脱离内核。暴露的内核具有内体-溶酶体膜穿孔或质子海绵效应而使内体-溶酶体发生破裂，进而从内体-溶酶体中逃逸。随后在胞内GSH还原条件下，二硫键断裂而释放siRNA，达到基因沉默的作用。该基因载体稳定性好、基因载量高、主动靶向性能优异，能够显著提高siRNA的基因沉默效果，达到有效抑制肿瘤细胞生长及转移的目的。
所述纳米内核粒径为80-300nm，负载外壳的纳米粒粒径为100-350nm。该范围的粒径有助于纳米粒利用肿瘤的EPR效应在肿瘤部位蓄积而发挥作用。
本发明的另一目的在于提供壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。可用于肝细胞癌、肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、黑色素瘤及肿瘤转移等疾病的治疗。
本发明优点：
(1)为解决基因载体在递送过程中的“PEG困境”，本发明首次将功能化的白蛋白外壳包裹于基因内核形成仿病毒基因载体，赋予蛋白外壳保护内核、靶向摄取及环境响应的功能。白蛋白是天然的亲水性蛋白质，安全无毒、无免疫原性、可生物降解，而且性质稳定。白蛋白分子含有多个羧基和氨基，易于进行表面修饰，可在白蛋白上修饰靶向配基，如胆酸、熊去氧胆酸、甘草酸、甘草次酸、抗体等提高载体对靶细胞的主动靶向性。除此之外，白蛋白的亲水性质能有效的降低血浆蛋白在载体上的吸附，具有去调理化作用，可延长载体在血液中的循环时间。本发明模仿病毒蛋白衣壳的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)序列识别细胞表面整合素αvβ3和αvβ5而内化进入内涵体的结构功能，将含有RGD基序的多肽修饰于白蛋白表面以提高肿瘤细胞和肿瘤新生血管的靶向识别及摄取能力。同时用精氨酸修饰白蛋白以提高蛋白质等电点，使其具有在内体-溶酶体pH值条件下电荷反转的功能。
(2)壳聚糖是自然界唯一的碱性多糖，具有生物相容性好、毒性低、免疫原性低等特点。壳聚糖是天然的多聚阳离子，可与带负电的siRNA通过静电吸附和氢键作用力结合，保护siRNA免受核酸酶的降解。然而，壳聚糖水溶性低，内涵体逃逸能力差，转染能力有限，在应用上受到一定的限制。为提高壳聚糖的基因压缩和内涵体逃逸能力，现有技术将富含氨基的化合物接枝于壳聚糖或季胺化壳聚糖的骨架。文献报道的氨基化合物有精胺、精氨酸、多聚精氨酸、赖氨酸、多聚赖氨酸、组氨酸、多聚组氨酸、聚乙烯亚胺等。但高密度的正电荷与siRNA强烈的相互作用使载体进入到胞内后不易释放，进而造成基因沉默效果不佳。还原型谷胱甘肽(GSH)是动物细胞内含量最丰富的含有巯基的生物小分子，在血液循环中、细胞外基质和细胞表面的浓度很低(2-20μm)，而胞内还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和谷胱甘肽还原酶的作用，使GSH浓度达到细胞外环境的100-1000倍(2-10mM)，而肿瘤组织比正常组织具有更高的还原性，其GSH浓度比正常组织至少高4倍。本发明利用肿瘤细胞内外显著的还原性差异，在材料中引入具有GSH还原敏感性的二硫键作为触发微粒胞内释药的开关，实现胞浆内迅速释药。本发明选择具有质子海绵效应的多聚组氨酸和内涵体膜穿破功能的多聚精氨酸分别以二硫键接枝于壳聚糖或季胺化壳聚糖骨架，作为仿病毒基因载体的内核，起到压缩基因、保护siRNA胞外稳定、胞内溶酶体逃逸及胞浆中迅速释药的作用。
附图说明
图1为本发明所述壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统的内核材料CS-SS-9R的核磁共振氢谱图。
图2为本发明所述壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统的外壳材料SDS-PAGE图。
图3本发明所述内核纳米粒CS-SS-9R/siRNA和递送系统CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)的透射电镜TEM形态。
图4本发明所述壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统内核与siRNA的结合能力。
图5本发明所述壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统与siRNA的结合能力。
图6不同内核材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统GSH响应释放能力。
图7Arg-BSA-c(RGDyK)和BSA-c(RGDyK)等电点的测定。
图8体外模拟溶酶体pH环境中Arg-BSA-c(RGDyK)、BSA-c(RGDyK)和BSA蛋白外壳的离去效应(A为pH值对纳米粒粒径的影响，B为pH值对纳米粒电位的影响)。
图9不同内核和外壳材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统溶酶体逃逸能力。
图10不同外壳材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统肿瘤细胞摄取能力。
图11不同内核和外壳材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统沉默基因的作用。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例一 本发明所述壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统的制备
本发明实施例使用的c(RGDyK)购自于吉尔生化(上海)有限公司。
1.内核材料及外壳材料的制备及表征
(1)内核材料：壳聚糖-二硫键-九聚精氨酸(CS-SS-9R)的制备
10mg壳聚糖(CS，MW：10000)溶解于4mL去离子水中，用2％的三乙胺调节pH值至6.0。9.6mg N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(SPDP)溶解于4mL DMSO中，缓慢滴加CS溶液至SPDP溶液中，室温条件下磁力搅拌反应24h。反应液用去离子水透析48h除去未反应的原料和副产物。随后，1mL 9.5mg/mL的九聚精氨酸(9R-SH)加入透析液中(9R-SH与壳聚糖的单元摩尔比为1:10)，在氮气保护的条件下室温反应24h后，透析72h，冻干后得到产物CS-SS-9R。CS-SS-9R的核磁共振氢谱图如图1所示。
(2)外壳材料：Arg-BSA-c(RGDyK)(精氨酸-白蛋白-c(RGDyK))的制备
第一步：Boc-L-Arg接合BSA
25mg Boc-L-Arg溶解于5mL去离子水中，采用EDC/NHS体系活化，Boc-L-Arg与EDC、NHS的摩尔比为1:1.2:1.5，室温反应12h。随后，将该体系加入5mL 20mg/mL的BSA的pH7.4PBS溶液中，室温反应12h。将反应液置于透析袋(MW：8000-14000)中，用去离子水透析以除去副产物和未反应的Boc-L-Arg和EDC/NHS，每4h换一次新鲜去离子水，透析72h后收集透析液，超滤浓缩透析液至10mL。
第二步：c(RGDyK)接合于BSA-Arg-L-Boc
49mgc(RGDyK)与46mg二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)分别溶解于5mL pH7.4的PBS中，将5mLc(RGDyK)的PBS溶液缓慢滴加于5mL BS3的PBS溶液中，室温条件下磁力搅拌5min。随后，将上述反应液缓慢滴加入BSA-Arg-L-Boc的透析浓缩液中，室温条件下磁力搅拌，继续反应24h后加入30％的三氟醋酸脱去精氨酸上的Boc保护。待反应结束后，将反应液置于透析袋(MW：8000-14000)中，用去离子水透析以除去副产物和未反应的c(RGDyK)和BS3，每4h换一次新鲜去离子水，透析72h后收集透析液，冻干后得到产物Arg-BSA-c(RGDyK)。
Arg-BSA-c(RGDyK)的分子量采用SDS-PAGE验证，结果如图2所示。
2.壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统的制备
(1)内核材料CS-SS-9R和siRNA质量比选择5～200:1。将siRNA溶解于用DEPC处理过的水中，滴加入CS-SS-9R溶液，涡旋30s，室温放置30min，形成内核CS-SS-9R/siRNA纳米粒。结果显示，内核材料CS-SS-9R和siRNA质量比选择5:1～200:1，均可形成具有较好压缩能力的纳米基因内核。
(2)内核材料CS-SS-9R与外壳材料Arg-BSA-c(RGDyK)的质量比选择20:1～20:20。将Arg-BSA-c(RGDyK)的pH7.4PBS滴加入内核纳米粒CS-SS-9R/siRNA体系中，用移液器吹打30s后，室温放置30min，形成CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒。结果显示，内核材料CS-SS-9R与外壳材料Arg-BSA-c(RGDyK)的质量比从20:1到20:20，均可形成壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统。
3.本发明所述壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统的形态
透射电镜TEM用于观察内核纳米粒CS-SS-9R/siRNA和壳-核结构的siRNA类病毒递送系统CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)的形态，如图3所示，图3A为内核纳米粒CS-SS-9R/siRNA，图3B为壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)。从图3可以看出，内核纳米粒呈较圆整的球形，粒径约150nm，壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统外层不光滑，提示有蛋白包裹，粒径约180-200nm。
实施例二 考察本发明所述壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统运载siRNA的能力
选择CS-SS-9R与siRNA质量比为5:1、10:1、20:1，CS、9R与siRNA的质量比分别均为5:1。将siRNA溶解于用DEPC处理过的水中，分别滴加入相应剂量的CS、9R以及CS-SS-9R溶液，涡旋30s，室温放置30min。采用凝胶阻滞实验分别考察CS、9R以及CS-SS-9R与siRNA的结合能力，结果见图4。图中凝聚在孔中的条带说明载体与siRNA的接合能力较强，迁移条带说明结合能力弱。
结果表明，壳聚糖与九聚精氨酸结合后与siRNA的结合能力增加。内核材料与siRNA的重量比为5:1时，CS-SS-9R对siRNA的阻滞能力高于CS和9R。而当CS-SS-9R与siRNA的重量比增加到10:1和20:1，内核材料对siRNA结合能力进一步增加，siRNA可以完全阻滞在孔内。
依次考察内核材料、siRNA、外壳材料重量比为20:1:5～20:1:20运载siRNA的能力。结果见图5。结果表明外壳蛋白Arg-BSA-c(RGDyK)包裹压缩基因的内核纳米粒，在外壳质量比小于20:1:20时，siRNA可以很好的被保护于壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统中，而外壳的量过高时，会有条带迁移出来，会影响到内核和siRNA的结合。
实施例三 考察不同内核材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统GSH响应释放能力
以内核材料CS-9R作为对比例，考察不同内核材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统GSH响应释放能力。
1.CS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)的制备：
制备CS-9R：10mg壳聚糖(MW：10000)溶解于4mL水中，用2％三乙胺调节pH值至6.0，13.5mg Sulfo-SMCC溶解于2mL水中，将Sulfo-SMCC水溶液滴加入CS溶液中，室温条件下磁力搅拌反应24h，透析24h除去副产物。随后，透析液中加入9.5mg 9R-SH，室温磁力搅拌条件下反应24h，去离子水透析72h以除去副产物，冻干后得到产物CS-9R。
CS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒的制备分为两步：首先，将siRNA溶解于用DEPC处理过的水中，滴加入CS-9R溶液，涡旋30s，室温放置30min，形成内核CS-9R/siRNA纳米粒。然后，将Arg-BSA-c(RGDyK)的pH7.4PBS溶液滴加入内核纳米粒CS-9R/siRNA体系中，用移液器吹打30s后，室温放置30min，形成CS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒，其中CS-9R、siRNA、Arg-BSA-c(RGDyK)的重量比为20:1:12。
2.GSH响应释放实验
模仿肿瘤细胞浆中高浓度谷胱甘肽(10-20mM)环境，分别将CS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)和CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)分散于不同浓度的GSH中，采用凝胶阻滞实验考察siRNA的释放行为。结果见图6，图中条带迁移说明siRNA的释放。结果表明，本发明所述递送载体在5mM谷胱甘肽中可以顺利的释放siRNA，而无二硫键的对照组在GSH浓度高达20mM依然不能很好的释放siRNA，表明本发明所述递送载体中的二硫键具有肿瘤细胞浆中GSH还原响应性，能在胞浆中迅速释放siRNA起到沉默基因的作用。
实施例四 考察具有不同内核和外壳材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统溶酶体逃逸能力
以没有9R的内核材料CS和外壳材料BSA-c(RGDyK)作为对比例，考察不同内核和外壳材料组合的蛋白外壳离去和9R内核暴露的协同作用引发的溶酶体逃逸效应。
1.BSA-c(RGDyK)的合成
49mg c(RGDyK)与46mg BS3分别溶解于5mL pH7.4的PBS中，100mg BSA溶解于10mLpH7.4的PBS中。将5mL c(RGDyK)的PBS溶液缓慢滴加于5mL BS3的PBS中，室温条件下磁力搅拌5min。随后，将上述反应液缓慢滴加入10mL BSA的PBS溶液中，室温条件下磁力搅拌，继续反应24h。待反应结束后，将反应液置于透析袋(MW：8000-14000)中，用去离子水透析以除去副产物和未反应的c(RGDyK)和BS3，每4h换一次新鲜去离子水，透析72h后收集透析液，冻干后得到产物BSA-c(RGDyK)。
2.Arg-BSA-c(RGDyK)和BSA-c(RGDyK)等电点的测定
蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值为蛋白质的等电点，测定蛋白质分子在不同pH值中的zeta电位来估算蛋白质的等电点。结果如图7所示，结果表明，经c(RGDyK)修饰的BSA等电点为4.5，经RGD和Arg修饰的BSA等电点为5.2。在肿瘤细胞溶酶体pH4.5的条件下，Arg-BSA-c(RGDyK)会发生电荷反转，产生蛋白外壳离去效应。
3.蛋白外壳的离去效应
考察外壳分别为Arg-BSA-c(RGDyK)、BSA-c(RGDyK)和BSA的纳米粒在体外模拟的溶酶体pH环境中的离去效应(以内核纳米粒为对照)。选取pH值分别为4.2、4.5、4.7、5.0、5.2、5.5的醋酸盐缓冲体系，考察上述三种纳米粒的粒径和zeta电位的变化。结果如图8所示，图8A显示，不同蛋白外壳的纳米粒随着pH值的降低，粒径逐步降低，当到达等电点时达到最低点，当小于等电点时，粒径与内核纳米粒粒径近似，图8B显示，不同蛋白外壳的纳米粒随着pH值的逐步降低，zeta电位升高，当到达等电点时达到最高点，当小于等电点时，zeta电位与内核纳米粒电位接近。结果表明，当pH小于等于外壳蛋白的等电点时，纳米粒的粒径和zeta电位接近于内核，表明蛋白外壳完全脱离内核。三种纳米粒的外壳中，Arg-BSA-c(RGDyK)的等电点最高(5.2)，因此，在溶酶体逐渐变酸的条件下(pH 6.0-4.5)，Arg-BSA-c(RGDyK)最易从内核脱离，最快实现溶酶体逃逸功能。
4.CS/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)和CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)的制备
参考实施例一方法制备内核材料CS-SS-9R。CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒的制备分为两步：首先，将siRNA溶解于用DEPC处理过的水中，滴加入CS-SS-9R溶液，涡旋30s，室温放置30min，形成内核CS-SS-9R/siRNA纳米粒。然后，将Arg-BSA-c(RGDyK)pH7.4PBS溶液滴加入内核纳米粒CS-SS-9R/siRNA体系中，用移液器吹打30s后，室温放置30min，形成CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒，其中CS-SS-9R、siRNA、Arg-BSA-c(RGDyK)的重量比为20:1:12。
CS-SS-9R/siRNA/BSA-c(RGDyK)纳米粒的制备分为两步：首先，siRNA溶解于用DEPC处理过的水中，滴加入相应剂量的CS-SS-9R溶液，涡旋30s，室温放置30min，形成内核CS-SS-9R/siRNA纳米粒。然后，将BSA-c(RGDyK)pH7.4PBS溶液滴加入内核纳米粒CS-SS-9R/siRNA体系中，用移液器吹打30s后，室温放置30min，形成CS-SS-9R/siRNA/BSA-c(RGDyK)纳米粒，其中CS-SS-9R、siRNA、BSA-c(RGDyK)的重量比为20:1:12。
5.溶酶体逃逸实验
分别将CS/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒、CS-SS-9R/siRNA/BSA-c(RGDyK)纳米粒和CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒与Bel-7402细胞孵化4h后，其在胞内溶酶体的逃逸行为如图9所示。结果表明，没有9R结合的CS和没有Arg和c(RGDyK)修饰的BSA外壳的仿病毒纳米粒从溶酶体中逃逸的程度均有限。九聚精氨酸有一定的膜致孔能力，能够穿破溶酶体膜从而实现纳米粒的溶酶体逃逸能力。但外壳蛋白的存在会影响到内核的暴露，进而影响九聚精氨酸发挥破膜的作用。经Arg和c(RGDyK)修饰的白蛋白外壳Arg-BSA-c(RGDyK)，在溶酶体酸性条件下会迅速发生电荷反转，进而从内核表面脱离，内核纳米粒的九聚精氨酸基团暴露发挥破膜的作用，而使纳米粒顺利从溶酶体中逃逸。
实施例五 考察具有不同外壳材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统肿瘤细胞摄取能力以外壳材料BSA作为对比例，考察不同外壳材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统肿瘤细胞摄取能力。
CS-SS-9R/siRNA/BSA纳米粒的制备分为两步：首先，siRNA溶解于用DEPC处理过的水中，滴加入CS-SS-9R溶液，涡旋30s，室温放置30min，形成内核CS-SS-9R/siRNA纳米粒。然后，将BSA pH7.4PBS溶液滴加入内核纳米粒CS-SS-9R/siRNA体系中，用移液器吹打30s后，室温放置30min，形成CS-SS-9R/siRNA/BSA纳米粒，其中CS-SS-9R、siRNA、BSA的重量比为20:1:12。
分别将CS-SS-9R/siRNA/BSA纳米粒和CS-SS-9R/siRNA/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒与人肝癌细胞Bel-7402孵化6h，摄取行为如图10所示，结果表明，蛋白外壳修饰c(RGDyK)的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统的肿瘤细胞摄取量显著增加。
实施例六 考察具有不同内核和外壳材料的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统沉默基因的作用
以抗VEGF的siRNA为模型，采用qRT-PCR考察CS-SS-9R/siVEGF、CS-SS-9R/siVEGF/BSA、CS-SS-9R/siVEGF/Arg-BSA-c(RGDyK)、CS-9R/siVEGF/Arg-BSA-c(RGDyK)、CS-SS-9R/siNC/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒对Bel-7402细胞VEGF mRNA的基因沉默作用，以PBS组为空白，UltraFectin阳离子组为阳性对照。将上述纳米粒与人肝癌细胞Bel-7402孵化4h，待转染结束，再孵育44h。随后提取转染细胞的总RNA，将RNA逆转录成cDNA，用qRT-PCR分析VEGF和GAPDH的mRNA的表达量，其中GAPDH作为细胞内参。结果见图11。结果表明，CS-SS-9R/siVEGF/Arg-BSA-c(RGDyK)纳米粒具有高效的基因沉默效率。基因沉默的效率与该纳米粒能被精准高效摄取，快速从溶酶体中逃逸并在胞浆中迅速释放药物有关。

Claims (10)

1.一种壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统，其特征在于递送系统的纳米内核包覆siRNA，递送系统的外壳为由包含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的线性多肽、环状多肽或拟肽化合物中的一种或几种以及精氨酸共同修饰的白蛋白。
2.如权利要求1所述的递送系统,其特征在于所述包含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的环状多肽的氨基酸数量为3-10。
3.如权利要求2所述的递送系统,其特征在于所述包含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的环状多肽选自c(RGDfC)，c(RGDFC)，c(RGDfE)，c(RGDFE)，c(RGDfV)，c(RGDFV)，c(RGDfK)，c(RGDFK)，c(RGDyC))，c(RGDYC)，c(RGDyE)，c(RGDYE)，c(RGDyK)，c(RGDYK)，c(RGDyV)，c(RGDYV)中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的递送系统,其特征在于所述包覆siRNA的内核材料选自阳离子脂质体、阳离子细胞穿膜肽、树枝状大分子、阳离子聚合物和纳米无机材料阳离子聚合物中的一种或几种。
5.如权利要求2所述的递送系统,其特征在于所述包覆siRNA的内核材料选自阳离子聚合物。
6.如权利要求3所述的递送系统,其特征在于所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸、蛋白或多肽及相应的经化学修饰的衍生物。
7.如权利要求4所述的递送系统,其特征在于所述阳离子聚合物为壳聚糖或经化学修饰的壳聚糖衍生物。
8.如权利要求1-7任一项所述的递送系统,其特征在于所述包覆siRNA的内核材料通过二硫键接枝多聚精氨酸、多聚组氨酸，聚醚酰亚胺、精氨酸、组氨酸中的一种或几种。
9.如权利要求8所述的递送系统,其特征在于所述递送系统的纳米内核粒径为80-300nm，递送系统的外壳的纳米粒粒径为100-350nm。
10.如权利要求1-9任一项所述的壳-核结构的siRNA仿病毒递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
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