CN113101279B - 负载雷帕霉素的ctsk响应性纳米粒、制备方法、应用及药物组合物 - Google Patents

负载雷帕霉素的ctsk响应性纳米粒、制备方法、应用及药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种负载雷帕霉素的组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)响应性纳米粒、其制备方法、其在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用及药物组合物。该负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒包括靶向嵌段聚合物PLGA‑PEG‑c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA‑Cys‑acp‑GQPGGPH‑PEG和负载在靶向嵌段聚合物PLGA‑PEG‑c(RGDfC)和CTSK响应性嵌段聚合物PLGA‑Cys‑acp‑GQPGGPH‑PEG上的雷帕霉素。该靶向控释纳米粒可以靶向动脉粥样硬化部位，并在病灶部位高表达CTSK的微环境下特异性的释放药物，具有较好的治疗效果。

Description

负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒、制备方法、应用及药物组 合物
技术领域
本发明是关于一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒、其制备方法、其在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用及药物组合物，属于治疗动脉粥样硬化的药物技术领域。
背景技术
心血管疾病是全球发病率和致死率最高的疾病之一，是人类健康的杀手。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)占心血管疾病死亡人数的一半以上，严重危害人类的生命健康。动脉粥样硬化是一种血管慢性炎症疾病，其主要病理特征为内膜增厚、平滑肌增殖、脂质堆积、管腔狭窄和血管顺应性降低。目前，动脉粥样硬化的治疗主要包括球囊扩张支架和药物治疗两种方式。球囊扩张支架的植入往往会造成血管内皮剥落或气压伤等血管壁损伤，还会在病灶部位诱导白细胞等免疫细胞的黏附并引起炎症反应造成较差的预后效果。此外，支架的使用还有一定的限制，当血管直径狭窄达到70％-80％的时才会考虑使用支架介入治疗。动脉粥样硬化的治疗药物包括降脂类、溶栓类、抗血小板、抗凝血等。这些药物可以有效的治疗和缓解动脉粥样硬化的进展。但药物治疗也有一些缺陷，如毒副作用较大、难以达到有效的血药浓度。此外，部分药物难溶于水因此其给药具有一定的难度。
发明内容
发明人研究发现，纳米给药可以有效地将药物递送到病灶部位，提高药物的生物利用度并减少毒副作用。动脉粥样硬化部位具有一些特异性的靶点可以作为纳米粒的靶点，例如动脉粥样硬化部位高表达ICAM-1、VCAM-1、Integrinαvβ3和p-选择素等受体，可以作为纳米粒的靶点。动脉粥样硬化局部的特殊微环境也可以作为纳米载体设计的响应性媒介，例如动脉粥样硬化部位高的氧化应激(ROS)可以作为纳米释放的催化剂控制释放药物。实验室前期研究长期关注于流体剪切力与血管疾病的关系，前期的研究也发现动脉粥样硬化常发生于动脉分支、分岔和弯曲的区域，这些区域暴露于扰动的血流状态和较低的剪切应力(<4dyn/cm2)。因此，发明人希望从动脉粥样硬化好发区域的力学微环境差异出发，探寻潜在的给药靶向和纳米设计的依据。
组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)是由329个氨基酸残基组成的一条末糖基化的单链，分子量为38kDa。具有木瓜蛋白酶家族的典型特性：信号肽(signal peptide)、前体肽(pro-peptide)和成熟的蛋白酶的活性中心。CTSK是组织蛋白酶家族的一种，首先发现于破骨细胞中，参与骨吸收和骨重建。此外，其还参与其他生理过程，如动脉粥样硬化、角质细胞分化和肿瘤的侵袭与转移。其主要功能是降解细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分，包括胶原蛋白、弹性蛋白等成分。CTSK在动脉粥样硬化的发生发展过程中扮演着十分重要的作用，其可以水解细胞外基质成分，进而平滑肌细胞迁移至内膜增生引起早期的内膜增厚。此外，CTSK还与成熟斑块的稳定性有紧密的联系。研究发现，振荡的剪切力可以促进主动脉内皮细胞高表达CTSK，动脉粥样硬化部位CTSK表达较高而正常组织中几乎无表达。
因此，发明人从动脉粥样硬化好发区域的力学微环境的差异出发，找到正常组织和动脉粥样硬化部位的差异蛋白CTSK，利用CTSK的水解胶原的能力，设计可以被CTSK特异性水解的纳米粒，并用动脉粥样硬化靶向环状多肽c(RGDfC)修饰纳米粒。
本发明的第一目的在于提供一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒，能够靶向控释纳米粒，可以将雷帕霉素递送至动脉粥样硬化部位并特异性水解释放以治疗动脉粥样硬化。
本发明的第二目的在于提供一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种药物组合物。
本发明的第四目的在于提供一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
第一方面，本发明提供了一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒，其包括靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG、以及负载在靶向嵌段聚合物以及CTSK响应性嵌段聚合物上的雷帕霉素。
能够靶向控释纳米粒，可以将雷帕霉素递送至动脉粥样硬化部位并被CTSK特异性水解释放以治疗动脉粥样硬化。
在一种可行地实施方式中，负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的平均直径为200～300nm，分散度为0.10。其有利于药物的水解释放，更加容易被吸收；且位于体外时可以均匀分散，不易聚集。需要说明的是：此处的分散度为0.1，并不仅仅是指0.1，只要是接近0.1，使其不易聚集的纳米粒均在本申请的保护范围之内。
在一种可行的实施方式中，靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)的平均分子量7603，CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG的平均分子量为8563。聚合物的分子量相对较低，容易被吸收。
第二方面，本发明还提供了一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的制备方法，其包括：将靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和雷帕霉素加入到氯仿中，室温下搅拌得到混合溶液，将混合溶液滴加到6～14倍体积的水中并搅拌，去除氯仿，离心后取上清液并使用微孔滤膜过滤，取滤液后冷冻干燥得到负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒。
该方法制备得到的负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒，能够靶向控释纳米粒，可以将雷帕霉素递送至动脉粥样硬化部位并被CTSK特异性水解释放以治疗动脉粥样硬化。
在一种可行的实施方式中，靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)的制备方法包括：将聚合物PLGA-PEG-NHS和多肽cRGDfC加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至7.8～8.2得到第一混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，透析除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为靶向聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)。
可选地，聚合物PLGA-PEG-NHS和多肽cRGDfC的摩尔比为1:1～1:1.4。
可选地，聚合物PLGA-PEG-NHS在第一混合液中的浓度为0.8～1.2mg/mL。
可选地，透析所用膜的截留分子量为7500。
在一种可行的实施方式中，CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG的制备方法包括：将聚合物PLGA-Mal与响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH加入到无水DMF中，并用三乙胺溶液调整pH值至7～7.4得到第二混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，第一次透析除去剩余多肽，溶液冻干后得到响应性多肽LGA-Cys-acp-GQPGGPH，将LGA-Cys-acp-GQPGGPH与PEG-NHS加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至7.8～8.2得到第三混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，第二次透析除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG。
可选地，聚合物PLGA-Mal和响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH的摩尔比为1.2:1～1.6:1。
可选地，响应性多肽LGA-Cys-acp-GQPGGPH与聚合物PEG-NHS的摩尔比为1:1～1.4:1。
可选地，聚合物PLGA-Mal在第二混合液中的浓度为0.8～1.2mg/mL。
可选地，第一次透析所用膜的截留分子量分别为3500，第二次透析所用膜的截留分子量分别为7500。
在一种可行的实施方式中，靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和雷帕霉素的质量比为(5～20):(5～20):1。
可选地，使用微量进样器滴加混合溶液至水中，微量进样器的滴加速度为1mL/h。
可选地，离心的条件为2000～5000rpm/min和10～20min。
可选地，微孔滤膜的孔径为450nm。
第三方面，本发明还提供了一种药物组合物，其含有本发明所述的CTSK响应性纳米粒。
第四方面，本发明还提供了所述的CTSK响应性纳米粒在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明提供的负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒、其制备方法、其在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用及药物组合物能达到以下有益效果：
能够靶向控释纳米粒(靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)和响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG)，可以将雷帕霉素递送至动脉粥样硬化部位并被CTSK特异性水解释放以治疗动脉粥样硬化。且通过体外细胞试验与动物体内实验结果显示，负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒可以实现对动脉粥样硬化的高效治疗。
附图说明
图1为负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的粒度分布图。
图2为负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的体外药物释放情况图。
图3为负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的体外选择性抑制血管平滑肌细胞增殖情况图。
图4为负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的体内选择性抑制巨噬细胞细胞增殖情况图。
图5为负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的体内治疗动脉粥样硬化斑块情况图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本申请提供一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S10、制备靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)
将聚合物PLGA-PEG-NHS和多肽cRGDfC加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至7.8～8.2得到第一混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，透析除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为靶向聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)。
可选地，聚合物PLGA-PEG-NHS和多肽cRGDfC的摩尔比为1:1～1:1.4。作为示例性地，聚合物PLGA-PEG-NHS和多肽cRGDfC的摩尔比为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3或1:1.4。
可选地，聚合物PLGA-PEG-NHS在第一混合液中的浓度为0.8～1.2mg/mL。作为示例性地，聚合物PLGA-PEG-NHS在第一混合液中的浓度为0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL或1.2mg/mL。
可选地，透析所用膜的截留分子量为7500。
具体地，按照聚合物PLGA(50:50,5000)-PEG(2000)-NHS:多肽cRGDfC摩尔比1:1.2加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至8.0，4℃下缓慢搅拌过夜，透析(MWCO＝7500)除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为靶向聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)。
S20、制备CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG
将聚合物PLGA-Mal与响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH加入到无水DMF中，并用三乙胺溶液调整pH值至7～7.4得到第二混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，第一次透析除去剩余多肽，溶液冻干后得到响应性多肽LGA-Cys-acp-GQPGGPH，将LGA-Cys-acp-GQPGGPH与PEG-NHS加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至7.8～8.2得到第三混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，第二次透析除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG。
可选地，聚合物PLGA-Mal和响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH的摩尔比为1.2:1～1.6:1。作为示例性地，聚合物PLGA-Mal和响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH的摩尔比为1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1。
可选地，响应性多肽LGA-Cys-acp-GQPGGPH与聚合物PEG-NHS的摩尔比为1:1～1.4:1。作为示例性地，响应性多肽LGA-Cys-acp-GQPGGPH与聚合物PEG-NHS的摩尔比为1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1或1.4:1。
可选地，聚合物PLGA-Mal在第二混合液中的浓度为0.8～1.2mg/mL。作为示例性地，聚合物PLGA-Mal在第二混合液中的浓度为0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL或1.2mg/mL。
可选地，第一次透析所用膜的截留分子量分别为3500，第二次透析所用膜的截留分子量分别为7500。
具体地，将PLGA(50:50,5000)-Mal与响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH按摩尔比1.4:1加入到无水DMF中，并用3％的三乙胺溶液调整pH值至7.2，4℃下搅拌过夜，透析(MWCO＝3000)除去剩余多肽，溶液冻干后备用。称取上述反应所得聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH适量，按摩尔比1.2:1加入PEG-NHS至无水DMF中并用三乙胺调节pH值至8.0，4℃下缓慢搅拌过夜，透析(MWCO＝7500)除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG。
S30、制备负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒
将靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和雷帕霉素加入到氯仿中，室温下搅拌得到混合溶液，将混合溶液滴加到6～14倍体积的水中并搅拌，去除氯仿，离心后取上清液并使用微孔滤膜过滤，取滤液后冷冻干燥得到负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒。
可选地，靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和雷帕霉素的质量比为(5～20):(5～20):1。作为示例性地，靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和雷帕霉素的质量比为5:5:1、5:10:1、10:5:1、10:10:1、10:20:1、20:10:1或20:20:1。
可选地，使用微量进样器滴加混合溶液至水中，微量进样器的滴加速度为1mL/h。
可选地，离心的条件为2000～5000rpm/min和10～20min。作为示例性地，离心的速率为2000rpm/min、3000rpm/min、4000rpm/min或5000rpm/min；离心的时间为10min、12min、14min、16min、18min或20min。
可选地，微孔滤膜的孔径为450nm。
具体地，称量20mg上述靶向性聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)20mg，20mg CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG以及1mg雷帕霉素，将其溶解到1mL氯仿溶液中，室温下搅拌20minmin后，将所得溶液按1mL/h的速度滴加到10mL的去离子水中，室温下搅拌过夜除去氯仿，3000rpm/min离心10minmin后取上清液使用450nm孔径的微孔滤膜过滤。所得溶液冻干即得负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒。
通过上述方法制备得到负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒，其可以用来制备药物组合物，以进行动脉粥样硬化的治疗。
通过控制聚合物载体与药物之间的配比、浓度以及搅拌时间，使得提供的载药纳米粒具有合适、均一的粒度大小。通过控制纳米颗粒粒度、雷帕霉素加入量、搅拌时间等，使得提供的载药纳米粒具有良好的药物缓释行为。通过控制雷帕霉素的加入量和聚合物浓度等，使得纳米载体具有良好的雷帕霉素负载能力，其载药量可达14％，包封率可以达到58％。
该负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒，包括靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG、以及负载在靶向嵌段聚合物以及CTSK响应性嵌段聚合物上的雷帕霉素。
可选地，负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的平均直径为200～300nm，分散度为0.10。需要说明的是：此处的分散度为0.1，并不仅仅是指0.1，只要是接近0.1，使其不易聚集的纳米粒均在本申请的保护范围之内。
进一步地，靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)的平均分子量7603，CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG的平均分子量为8563。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)按照聚合物PLGA(50:50,5000)-PEG(2000)-Mal(西安瑞禧生物科技有限公司)多肽cRGDfC(合肥国肽生物科技有限公司)摩尔比1:1.2加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至8.0，4℃下缓慢搅拌过夜，透析(MWCO＝7500)除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为靶向聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)，其分子量为7603。
(2)将PLGA(50:50,5000)-Mal(西安瑞禧生物科技有限公司)与响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH(由合肥国肽生物科技有限公司合成)(按摩尔比1.4:1加入到无水DMF中，并用3％的三乙胺溶液调整pH值至7.2，4℃下搅拌过夜，透析(MWCO＝3000)除去剩余多肽，溶液冻干后备用。称取上述反应所得聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH适量，按摩尔比1.2:1加入PEG-NHS(西安瑞禧生物科技有限公司)至无水DMF中并用三乙胺调节pH值至8.0，4℃下缓慢搅拌过夜，透析(MWCO＝7500)除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG，其分子量为8563。
(3)将10mg靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、10mg响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和2mg雷帕霉素按质量比加入到2mL氯仿中，室温下充分搅拌20min。将上述溶液使用微量进样器将溶液按1mL/h滴加到20mL的蒸馏水中并不停搅拌。室温下搅拌过夜除去氯仿，离心后取上清液使用450nm的微孔滤膜过滤。所得溶液使用冷冻干燥机冻干即得负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒。
实施例2
一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)按照聚合物PLGA(50:50,5000)-PEG(2000)-NHS:多肽cRGDfC摩尔比1:1.2加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至8.0，4℃下缓慢搅拌过夜，透析(MWCO＝7500)除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为靶向聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)，其分子量为7603。
(2)将PLGA(50:50,5000)-Mal与响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH按摩尔比1.4:1加入到无水DMF中，并用3％的三乙胺溶液调整pH值至7.2，4℃下搅拌过夜，透析(MWCO＝3000)除去剩余多肽，溶液冻干后备用。称取上述反应所得聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH适量，按摩尔比1.2:1加入PEG-NHS至无水DMF中并用三乙胺调节pH值至8.0，4℃下缓慢搅拌过夜，透析(MWCO＝7500)除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG，其分子量为8563。
(3)将10mg靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、10mg响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和1mg雷帕霉素按质量比加入到1mL氯仿中，室温下充分搅拌20min。将上述溶液使用微量进样器将溶液按1mL/h滴加到20mL的蒸馏水中并不停搅拌。室温下搅拌过夜除去氯仿，离心后取上清液使用450nm的微孔滤膜过滤。所得溶液使用冷冻干燥机冻干即得负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒。
实施例3
一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)按照聚合物PLGA(50:50,5000)-PEG(2000)-NHS:多肽cRGDfC摩尔比1:1.2加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至8.0，4℃下缓慢搅拌过夜，透析(MWCO＝7500)除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为靶向聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)，其分子量为7603。
(2)将PLGA(50:50,5000)-Mal与响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH按摩尔比1.4:1加入到无水DMF中，并用3％的三乙胺溶液调整pH值至7.2，4℃下搅拌过夜，透析(MWCO＝3000)除去剩余多肽，溶液冻干后备用。称取上述反应所得聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH适量，按摩尔比1.2:1加入PEG-NHS至无水DMF中并用三乙胺调节pH值至8.0，4℃下缓慢搅拌过夜，透析(MWCO＝7500)除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG，其分子量为8563。
(3)将20mg靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、20mg响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和1mg雷帕霉素按质量比加入到1mL氯仿中，室温下充分搅拌20min。将上述溶液使用微量进样器将溶液按1mL/h滴加到10mL的蒸馏水中并不停搅拌。室温下搅拌过夜除去氯仿，离心后取上清液使用450nm的微孔滤膜过滤。所得溶液使用冷冻干燥机冻干即得负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒。
试验例1负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的粒度研究
将实施例1，实施例2，实施例3制得的纳米粒置于37℃下，用动态光散射仪(DLS)测定其粒径变化，其平均粒径大小分别为154nm(实施例1)，258nm(实施例2)，274nm(实施例3)，其中，实施例3的粒度结果见图1。通过实施例3方法制得的纳米微粒具有良好的粒径大小及较为集中的粒径分布，分散度(PDI)为0.11。
试验例2负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的载药量情况研究
对于实施例1，实施例2，及实施例3制得的纳米粒，分别称量2mg并加入2mLDMSO破坏纳米粒结构，取20μL使用高效液相色谱法(HPLC)测纳米粒中雷帕霉素含量。测量结果为：实施例1，实施例2，及实施例3得的纳米药物载药量分别为：9.26％(实施例1)，12.94％(实施例2)及14.62％(实施例3)。实施例1，实施例2，及实施例3得的纳米药物包封率分别为，26.24％(实施例1)，25.88％(实施例2)及58.49％(实施例3)，因此，通过实施例3方法制备的纳米粒具有高的负载能力。
试验例3负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的体外药物释放研究
将2mg实施例3制得的纳米粒分别分散于2mL含有0.1％Brij58的PBS溶液(NaCl8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加蒸馏水至1000ml，调节pH到7.4)或2mL含有0.1％Brij58的醋酸钠溶液(调节pH到5.5)，后转移至透析袋(MWCO＝7500)并将其放入含20mL 0.1％Brij58 PBS溶液中，于37℃的摇床中不断震荡。在透析外液中取样并通过HPLC测定雷帕霉素的累计释放量，以确定载药纳米粒的体外药物释放曲线，如图2。实验发现，实施例3制得的纳米在pH7.4情况下释放仅约40％。而在pH5.5偏酸性条件下8小时释放达78％，说明该纳米粒可在偏酸性条件下释放药物。
试验例4负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的体内抗炎评价
将实施例3制得的载药纳米粒分散于PBS制成100μg/mL悬液。RAW264.7细胞经过50ng/mL脂多糖(LPS)处理24h诱导炎症模型，除去LPS后将纳米粒悬液与细胞共孵育4h，同时以PBS和游离雷帕霉素作为对照。使用ELISA试剂盒分析TNF-α，IL-1β的分泌，结果如图3。从图3可以看出，经过雷帕霉素负载的靶向响应性纳米粒处理后，可以显著减少炎症的巨噬细胞分泌炎症因子。
试验例5负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的体内急性毒性评价
将实施例3制得的载药纳米粒5mg/kg通过尾静脉注射到小鼠体内，以生理盐水为对照。24小时后，提取小鼠全血做血常规分析，血清做血液生化分析，分离主要脏器，心、肝、脾、肺和肾做H&E病理染色。截图如图4。从图4可以看出，不同处理的小鼠血常规指标和生化分析指标无差异，组织病理切片H&E染色显示经过纳米注射小鼠的主要器官无明显改变。说明，雷帕霉素负载的靶向响应性纳米粒无急性的纳米毒性。
试验例6负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒治疗体内动脉粥样硬化斑块情况
将实施例3制得的载药纳米粒5mg/kg通过尾静脉注射入高脂饲养2个月的Apoe-/-小鼠(已形成动脉粥样硬化斑块)。每周注射2次，注射1个月。以正常生理盐水作为药物注射对照。待小鼠安乐死后，分离小鼠颈动脉血管至髂动脉，剖开血管，进行油红O染色，其结果见图5，对照组(Ctrl)为正常小鼠。从图5可以看出，实施例3制备得到的载药纳米粒在体内能够高效的减少动脉粥样硬化斑块的面积。

Claims (8)

1.一种负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒，其特征在于，包括靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG、以及负载在所述靶向嵌段聚合物以及所述CTSK响应性嵌段聚合物上的雷帕霉素。
2.根据权利要求1所述的负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒，其特征在于，负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的平均直径为200～300nm，分散度为0.10；
和/或，所述靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)的平均分子量为7603，所述CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG的平均分子量为8563。
3.一种权利要求1或2所述的负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒的制备方法，其特征在于，包括：
将靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和雷帕霉素加入到氯仿中，室温下搅拌得到混合溶液，将所述混合溶液滴加到6～14倍体积的水中并搅拌，去除所述氯仿，离心后取上清液并使用微孔滤膜过滤，取滤液后冷冻干燥得到负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)的制备方法包括：将聚合物PLGA-PEG-NHS和多肽cRGDfC加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至7.8～8.2得到第一混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，透析除去未反应所述聚合物和所述多肽，液体冻干后即为靶向聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)；
和/或，所述聚合物PLGA-PEG-NHS和所述多肽cRGDfC的摩尔比为1:1～1:1.4；
和/或，所述聚合物PLGA-PEG-NHS在所述第一混合液中的浓度为0.8～1.2mg/mL；
和/或，透析所用膜的截留分子量为7500。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG的制备方法包括：将聚合物PLGA-Mal与响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH加入到无水DMF中，并用三乙胺溶液调整pH值至7～7.4得到第二混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，第一次透析除去剩余多肽，溶液冻干后得到响应性多肽LGA-Cys-acp-GQPGGPH，将所述LGA-Cys-acp-GQPGGPH与PEG-NHS加入到无水DMF中并用三乙胺调节pH值至7.8～8.2得到第三混合液，在2～6℃搅拌反应至少8h，第二次透析除去未反应聚合物和多肽，液体冻干后即为CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG；
和/或，所述聚合物PLGA-Mal和所述响应性多肽Cys-acp-GQPGGPH的摩尔比为1.2:1～1.6:1；
和/或，所述响应性多肽LGA-Cys-acp-GQPGGPH与所述聚合物PEG-NHS的摩尔比为1:1～1.4:1；
和/或，所述聚合物PLGA-Mal在所述第二混合液中的浓度为0.8～1.2mg/mL；
和/或，所述第一次透析所用膜的截留分子量分别为3500，所述第二次透析所用膜的截留分子量分别为7500。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述靶向嵌段聚合物PLGA-PEG-c(RGDfC)、所述CTSK响应性嵌段聚合物PLGA-Cys-acp-GQPGGPH-PEG和所述雷帕霉素的质量比为(5～20):(5～20):1；
和/或，使用微量进样器滴加所述混合溶液至水中，所述微量进样器的滴加速度为1mL/h；
和/或，离心的条件为2000～5000rpm/min和10min～20min；
和/或，所述微孔滤膜的孔径为450nm。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒。
8.一种权利要求1或2中所述的负载雷帕霉素的CTSK响应性纳米粒在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140147485A1 (en) * 2009-03-03 2014-05-29 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Polymer for creating hemocompatible surface
CN107875400A (zh) * 2017-11-20 2018-04-06 南通大学 一种壳‑核结构的siRNA仿病毒递送系统及应用
CN110483785A (zh) * 2019-07-01 2019-11-22 中山大学 一种三嵌段聚合物、载药纳米胶束、纳米药物及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140147485A1 (en) * 2009-03-03 2014-05-29 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Polymer for creating hemocompatible surface
CN107875400A (zh) * 2017-11-20 2018-04-06 南通大学 一种壳‑核结构的siRNA仿病毒递送系统及应用
CN110483785A (zh) * 2019-07-01 2019-11-22 中山大学 一种三嵌段聚合物、载药纳米胶束、纳米药物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Non-proinflammatory and responsive nanoplatforms for targeted treatment of atherosclerosis;Dou Y.，et al.;《Biomaterials》;20171031;第143卷;第93-108页 *
Recent applications of PLGA based nanostructures in drug delivery;Maria M.，et al.;《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》;20170728;第159卷;第217-231页 *
聚合物PEG-PLGA在纳米给药系统中的应用研究进展;张文君 等;《药学研究》;20191231;第38卷(第9期);第532-538页 *

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