ES2627822T3 - Péptidos de penetración celular para administración intracelular de moléculas - Google Patents

Péptidos de penetración celular para administración intracelular de moléculas Download PDF

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ES2627822T3 ES13773241.8T ES13773241T ES2627822T3 ES 2627822 T3 ES2627822 T3 ES 2627822T3 ES 13773241 T ES13773241 T ES 13773241T ES 2627822 T3 ES2627822 T3 ES 2627822T3
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Gilles Divita
Sébastien DESHAYES
Karidia KONATE
May Catherine Morris
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Abstract

Un péptido de penetración celular que se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoácidos: X3X4X1X2X5X4X1X2X6X7X1X8X9X10X11X12X13 (SEQ ID No: 11), en donde X1 es F o W, X2 es F, W o Y, X3 es beta-A o S, X4 es K, R o L, X5 es E, R o S, X6 es R, T o S, X7 es E, R o S, X8 no es ni F ni W, X9 es P o R, X10 es R o L, X11 es K, W o R, X12 es R o F y X13 es R o K.

Description

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DESCRIPCION
Peptidos de penetracion celular para administracion intracelular de moleculas
La presente invencion pertenece al campo de la administracion intracelular de moleculas tales como acidos nucleicos y moleculas hidrofobicas pequenas. En particular, la invencion se refiere a una nueva familia de peptidos de penetracion celular (CPP, del ingles “Cell-Penetrating Peptide”), que presenta una elevada eficacia, una baja toxicidad y un tropismo natural para tejidos cerebrales y de nodo linfatico.
Aunque las moleculas pequenas siguen siendo los principales farmacos utilizados en la practica clmica, en numerosos casos su impacto terapeutico ha alcanzado limitaciones tales como una capacidad insuficiente para alcanzar dianas, una falta de especificidad, el requisito de elevadas dosis que conducen a toxicidad y efectos secundarios importantes. A lo largo de los ultimos diez anos, con el objetivo de solventar las limitaciones de las moleculas pequenas y de las terapias basadas en genes, hemos presenciado una aceleracion drastica en el descubrimiento de moleculas terapeuticos de mayor tamano tales como protemas, peptidos y acidos nucleicos que presentan una elevada especificidad por su diana pero que no siguen las reglas de Lipinski. La potencia farmaceutica de dichas moleculas sigue estando restringida por su baja estabilidad in vivo y por su baja captacion en celulas. Por lo tanto, la “administracion” se ha convertido en el tema central del puzle terapeutico, y se han establecido nuevos objetivos para validar las estrategias de administracion: (a) carencia de toxicidad, (b) eficacia a baja dosis in vivo, (c) facilidad de manejo para aplicaciones terapeuticas, (d) liberacion endosomatica rapida, y (e) capacidad para alcanzar la diana. Aunque se han puesto muchas esperanzas en las estrategias de administracion vmca para terapias genicas y celulares, su aplicacion clmica se ha visto perjudicada por efectos secundarios y de toxicidad [1,2]. Las investigaciones se han centrado principalmente en el desarrollo de estrategias no vmcas, y se han propuesto diferentes metodos que incluyen nanopartmulas policationicas no lipfdicas y formulaciones basadas en peptidos, pero solo algunas de dichas tecnologfas han sido efectivas in vivo y han alcanzado la practica clmica. Las Partmulas de Penetracion Celular (CPP) son una de las estrategias no vmcas mas prometedoras. Aunque la definicion de las CPPs esta evolucionando continuamente, generalmente se describen como peptidos cortos de menos de 30 aminoacidos, derivados de protemas o de secuencias quimericas. Habitualmente son anfipaticas y poseen una carga neta positiva [3-5]. Las CPPs son capaces de penetrar membranas biologicas, para activar el movimiento de diversas biomoleculas a traves de las membranas celulares hacia el citoplasma, y para mejorar su ruta intracelular, facilitando de este modo las interacciones con la diana. Las CPPs pueden subdividirse en dos clases principales, la primera requiere un enlace qrnmico con la carga y la segunda implica la formacion de complejos no covalentes estables. Se ha publicado que las CPPs de ambas estrategias favorecen la administracion de un gran panel de cargas (ADN de plasmido, oligonucleotido, siARN, PNA, protema, peptido, liposoma, nanopartmula...) en una amplia variedad de tipos celulares y modelos in vivo [3-7].
Hace veinte anos se propuso el concepto de dominio de transduccion de protema (PTD, del ingles “Protein Transduction Domain”) en base a la observacion de que algunas protemas, principalmente factores de transcripcion, podfan transportarse en el interior de las celulas y desde una celula a otra [para una revision vease las ref. 3,4]. La primera observacion se realizo en 1988, por Frankel y Pabo. Ellos demostraron que la protema transactivadora de la transcripcion (Tat) del VIH-1 podfa entrar en las celulas y traslocalizarse en el nucleo. En 1991, el grupo de Prochiantz alcanzo las mismas conclusiones con el homeodominio de Drosophila Antennapedia y demostraron que dicho dominio era internalizado por celulas neuronales. Estos trabajos fueron el origen del descubrimiento en 1994 del primer Dominio de Transduccion de Protema: un peptido de 16 unidades derivado de la tercera helice del homeodominio de Antennapedia denominado Penetratina. En 1997, el grupo de Lebleu identifico la secuencia minima de Tat requerida para la captacion celular y las primeras pruebas-de-concepto de la aplicacion de PTD in vivo fueron publicadas por el grupo de Dowdy, para la administracion de peptidos pequenos y protemas grandes. Historicamente, la nocion de Peptido de Penetracion Celular (CPP) fue introducida por el grupo de Langel, en 1998, con el diseno del primer vehmulo peptido quimerico, el Transportan, que fue derivado del fragmento N-terminal del neuropeptido galanina, ligado a mastoparan, un peptido de veneno de avispa. Originalmente, el transportan fue empleado para mejorar la administracion de PNAs en celulas cultivadas e in vivo. En 1997, el grupo de Heitz y Divita propusieron una nueva estrategia que implicaba CPP en la formacion de complejos estables pero no covalentes con su carga [7]. La estrategia se baso primeramente en el vehmulo peptido corto (MPG) que consistfa en dos dominios: un dominio hidrofflico (polar) y un domino hidrofobico (apolar). El MPG se diseno para la administracion de acidos nucleicos [7]. El peptido anfipatico primario Pep-1 fue propuesto entonces para la administracion no covalente de protemas y peptidos [8]. A continuacion los grupos de Wender y Futaki demostraron que las secuencias de poliarginina (Arg8) son suficientes para conducir moleculas pequenas y grandes al interior de celulas e in vivo. Desde entonces, se han identificado muchos CPPs derivados de secuencias naturales o no naturales y la lista esta aumentando constantemente. Se han derivado peptidos de la protema VP22 del Virus del Herpes Simple, de calcitonina, de peptidos antimicrobianos o de toxina, de protemas implicadas en la regulacion del ciclo celular, asf como en peptidos ricos en poliprolina [revisiones 4-6].
Los inventores ahora han disenado una nueva familia de peptidos de penetracion celular para la administracion de peptidos/protemas y moleculas hidrofobicas, denominada VEPEP-3. Las estrategias de administracion usando peptidos VEPEP-3 como capa exterior de nanopartmulas se denominan NANOPEP-3.
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VEPEP-3 son peptidos anfipaticos primarios cortos que forman nanopartfculas estables con moleculas tales como peptido, protema, analogo de peptido, PNA y moleculas hidrofobicas pequenas, designadas a partir de este punto SHM (del ingles “Small Hydrophobic Molecules”). Los vectores VEPEP-3 comprenden la siguiente secuencia de aminoacidos: X3X4X1X2X5X4X1X2X6X7X1X8X9X10X11X12X13 (SEQ ID No: 11), en donde:
XI es F o W (independiente uno del otro);
X2 es F, W o Y (independiente uno del otro);
X5 es E, R o S;
X6 es R, T o S;
X7 es E, R o S;
X8 no es ni F ni W;
X9 es P o R;
X10 es R o L;
XII es K, W o R;
X12 es R o F; y X13 es R o K.
Segun una realizacion particular, dicho peptido de penetracion celular comprende una secuencia de aminoacidos X3X4WX2EX4WX2X6X7X1PRX11RX13 (SEQ ID No: 12), en donde
XI es F o W (independiente uno del otro);
X2 es F, W o Y (independiente uno del otro);
X3 es beta-A o S;
X4 es K o R;
X6 es T o R;
X7 es E o R;
XII es R o K; y X13 es R o K.
Los ejemplos no limitativos de peptidos de penetracion celular segun el parrafo anterior comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:
X3KWFERWFREWPRKRR (SEQ ID No: 1)
X3KWWERWWREWPRKRK (SEQ ID No: 2)
X3RWWEKWWTRWPRKRK (SEQ ID No: 3), y
X3RWYEKWYTEFPRRRR (SEQ ID No: 4),
en donde X3 es beta-A o S.
Segun otra realizacion particular de la presente invencion, el peptido de penetracion celular comprende la siguiente secuencia de aminoacidos: X3X4X1WX5X4X1WX6X7WX8X9X10WX12R (SEQ ID No: 13), en donde
><
es F o W (independiente uno del otro)
X3
es beta-A o S;
X4
es K, R o L;
X cn
es R o S;
X6
es R o S;
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X7 es R o S;
X8 es F o W; Xg es R o P; X10 es L o R; y
X12 es R o F.
Segun una realizacion particular del anterior peptido de penetracion celular, X12 es R.
Los ejemplos no limitativos de peptidos de penetracion celular segun los anteriores parrafos comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:
X3RWWRLWWRSWFRLWRR (SEQ ID No: 5)
X3LWWRRWWSRWWPRWRR (SEQ ID No: 6)
X3LWWSRWWRSWFRLWFR (SEQ ID No: 7), y
X3KFWSRFWRSWFRLWRR (SEQ ID No: 8),
en donde X3 es beta-A o S.
La presente invencion tambien pertenece a un peptido de penetracion celular grapado procedente de un peptido de penetracion celular VEPEP-3 como el descrito anteriormente. Un peptido “grapado” designa un peptido que comprende un enlace qmmico (ademas de la cadena de aminoacidos) entre dos residuos. En una realizacion particular de los peptidos VEPEP-3 grapados, el peptido VEPEP-3 comprende un enlace hidrocarbonado entre dos residuos que estan separados por tres o seis residuos. El especialista puede obtener dichos peptidos usando tecnicas disponibles en la tecnica, por ejemplo tal como se describe en Verdine y Hilinski, Methods in Enzymology, 2012 [12].
Una realizacion particular de VEPEP-3 grapado segun la presente invencion comprende una secuencia de aminoacidos derivada de la SEQ ID No: 11 o de la SEQ ID No: 12 por adicion de un aminoacido no natural entre los aminoacidos de las posiciones 2 y 3 de dicha secuencia (correspondientes a X14), sustitucion del aminoacido de la posicion 10 (correspondiente a X7) de la SEQ ID No: 12 por un aminoacido no natural, y adicion de un enlace hidrocarbonado entre estos dos aminoacidos no naturales. Un ejemplo de dicho CPP VEPEP-3 grapado comprende la secuencia de aminoacidos X3KX14WWERWWRX7WPRKRK (SeQ ID No: 9), en donde X3 es una beta-alanina o una serina, en donde X14 y X7 son aminoacidos no naturales usados para la union de un enlace hidrocarbonado.
Otra realizacion de VEPEP-3 grapado segun la presente invencion comprende una secuencia de aminoacidos disenada por sustitucion de los aminoacidos de las posiciones 5 y 12 de la SEQ ID No: 13 por aminoacidos no naturales, y por la adicion de un enlace hidrocarbonado entre los dos aminoacidos no naturales (entendiendose que el proceso de smtesis integra directamente los aminoacidos no naturales). Por ejemplo, un peptido VEPEP-3 grapado comprende la secuencia de aminoacidos X3RWWX5LWWRSWX8RLWRR (sEq ID No: 10), en la que X3 es una beta-alanina o una serina, y en donde X5 y X8 son aminoacidos no naturales usados para la union de un enlace hidrocarbonado.
La estrategia de VEPEP-3 mejora tanto la administracion ex vivo como in vivo y la eficacia del peptido/protema/analogo de peptido y de moleculas hidrofobicas pequenas, sin activar la respuesta inmune innata o ni inducir efectos secundarios toxicos.
Segun una realizacion preferida, un peptido de penetracion celular de la presente invencion comprende ademas, ligado covalentemente al extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos, una o varias entidades qrnmicas seleccionadas del grupo que consiste en un acetilo, un acido graso, un colesterol, un poli-etilen glicol, una senal de localizacion nuclear, una senal de exportacion nuclear, un anticuerpo, un polisacarido y una molecula dirigida a diana (peptido, acido graso, sacarido).
Tal como se desarrolla mas adelante y como se muestra al menos en el Ejemplo 5 presentado a continuacion, la PEGilacion de peptidos VEPEP-3 es particularmente ventajosa para estabilizar nanopartfculas in vivo.
Adicional o alternativamente, un peptido de penetracion celular segun la invencion puede comprender, ligado covalentemente al extremo C-terminal de su secuencia de aminoacidos, uno o varios grupos seleccionados del grupo que consiste en una cisteamida, una cistema, un tiol, una amida, un acido nitrilotriacetico sustituido opcionalmente, un carboxilo, un alquilo C1-C6 lineal o ramificado opcionalmente sustituido, una amina primaria o secundaria, un derivado osfdico, un lfpido, un fosfolfpido, un acido graso, un colesterol, un polietilen glicol, una senal de localizacion nuclear, una senal de exportacion nuclear, un anticuerpo, un polisacarido y una molecula dirigida a diana.
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Otro aspecto de la presente invencion es un complejo que comprende un peptido de penetracion celular como el descrito anteriormente y una carga seleccionada entre protema/peptido y moleculas hidrofobicas. Los ejemplos de cargas de polipeptidos son peptidos o protemas pequenos, peptidos dclicos, biomarcadores basados en peptidos, bio-farmacos, PNA u oligonucleotidos no cargados electricamente. En una realizacion preferida del complejo segun la invencion, la carga es una molecula pequena (de tamano inferior a 1,5 kDa), tanto hidrofobica como cargada electricamente. Las cargas preferidas de los complejos segun la presente invencion son farmacos anticancengenos y antivmicos. Los ejemplos no limitativos de moleculas hidrofobicas pequenas que pueden usarse incluyen aminoacidos, di- o tri-peptidos (marcados o no), daunomicina, Paclitaxel, doxorrubicina, aZt, porfirina, nucleosidos marcados fluorescentemente o nucleotidos (FAM-Guanosina, CY5-UTP, CY3-UTP), maghemita hidrofobica (agentes de contraste o nanopartmulas magneticas de Fe2O3) y colorantes fluorescentes.
El tamano de los complejos descritos anteriormente preferiblemente se encuentra entre 50 y 300 nm, mas preferiblemente entre 50 y 200 nm (el tamano del complejo en la presente memoria designa su diametro medio).
En los complejos segun la invencion, la ratio molar carga/VEPEP-3 depende de la naturaleza y del tamano de la carga, pero generalmente esta comprendida entre 1/1 y 1/50. Para cargas de peptidos pequenos, la ratio molar carga/VEPEP-3 preferiblemente oscila entre 1/5 y 1/20. Para cargas de moleculas pequenas, la ratio molar carga/VEPEP-3 preferiblemente oscila entre 1/3 y 1/10. Para cargas de protemas grandes, la ratio molar carga/VEPEP-3 preferiblemente oscila entre 1/10 y 1/40.
Segun una realizacion ventajosa de los complejos tal como se han descrito anteriormente, los peptidos VEPEP-3 comprenden un grupo polietilen glicol o un grupo acetilo unido covalentemente a su extremo N, y/o un grupo cisteamida unido covalentemente a su extremo C.
Los complejos anteriores pueden usarse ventajosamente como “envolturas de nucleo” para obtener complejos mas grandes, o nanopartmulas, mediante una etapa adicional de recubrimiento del complejo carga/VEPEP-3 con otra capa de peptidos de penetracion celular, que pueden ser diferentes de los peptidos VEPEP-3 descritos anteriormente. Los ejemplos de dichas nanopartmulas son VEPEP-3/CADY (en donde CADY es un CPP como el descrito en la patente EP1795539 y en [11], por ejemplo CADY-1: Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID No: 28)), VEPEP-3/PEP-1 (en donde Pep-1 es un CPP como el descrito en [8]), VEPEP-3/MPG (en donde MPG es un CPP como el descrito en la patente US7.514.530 y en [7,10]), asf como nanopartmulas con una capa exterior fabricada de un CPP que pertenece a otra familiar VEPEp, por ejemplo seleccionada de la siguiente lista:
VEPEP-6a: Ac-X3LFRALWRLLRSLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 29)
VEPEP-6b: Ac-X3LWRALWRLWRSLWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID No: 30)
VEPEP-6c: Ac-X3LWRALWRLLRSLWRLWRKA-cisteamida (SEQ ID No: 31)
VEPEP-6d: Ac-X3LWRALWRLWRSLWRLWRKA-cisteamida (SEQ ID No: 32)
VEPEP-6e: Ac-X3LWRALWRLLRALWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID No: 33)
VEPEP-6f: Ac-X3LWRALWRLLRNLWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID No: 34)
VEPEP-9a1: Ac-X3LRWWLRWASRWFSRWAWWR-cisteamida (SEQ ID No: 35)
VEPEP-9a2: Ac-X3LRWWLRWASRWASRWAWFR-cisteamida (SEQ ID No: 36)
VEPEP-9b1: Ac-X3RWWLRWASRWALSWRWWR-cisteamida (SEQ ID No: 37)
VEPEP-9b2: Ac-X3RWWLRWASRWFLSWRWWR-cisteamida (SEQ ID No: 38)
VEPEP-9c1: Ac-X3RWWLRWAPRWFPSWRWWR-cisteamida (SEQ ID No: 39)
VEPEP-9c2: Ac-X3RWWLRWASRWAPSWRWWR-cisteamida (SEQ ID No: 40)
VEPEP-9d: Ac-X3WWRWWASWARSWWR-cisteamida (SEQ ID No: 41)
VEPEP-9e: Ac-X3WWGSWATPRRRWWR-cisteamida (SEQ ID No: 42)
VEPEP-9f: Ac-X3WWRWWAPWARSWWR-cisteamida (SEQ ID No: 43)
ST-VEPEP-6a: Ac-X3LFRALWRSLLRSSLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 44)
ST-VEPEP-6aa: Ac-XaLFLARWRSLLRSSLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 45)
ST-VEPEP-6ab: Ac-X3LFRALWSSLLRSSLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 46)
ST-VEPEP-6ad: Ac-X3LFRARWSSLLRSSLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 47)
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ST-VEPEP-6b: Ac-XaLFRALWRLLRsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 48)
ST-VEPEP-6ba: Ac-XaLFRARWRLLRsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 49)
ST-VEPEP-6bb: Ac-XaLFRALWRLLSsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 50)
ST-VEPEP-6bd: Ac-XaLFRARWRLLSsSLWSsLLWK-cisteamida (sEQ ID No: 51) sT-VEPEP-6c: Ac-XaLFARsLWRLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID No: 52),
as^ como todas las variantes de los mismos (con respecto a la secuencia de aminoacidos y/o los grupos qmmicos Ny C-terminales), en donde X3 es beta-A o S y donde los residuos seguidos de una “s” en submdice estan unidos mediante un enlace hidrocarbonado. Las variantes preferidas de las anteriores secuencias para formar nanopartfculas segun la invencion estan PEGiladas en su extremo N-terminal en lugar de estar acetiladas.
Otro aspecto de la presente invencion pertenece a nanopartfculas preparadas a partir de una “envoltura de nucleo” que comprende una carga y una primera molecula vehuculo, rodeada de peptidos VEPEP-3. En la presente memoria estas se denominan partfculas “NANOPEP-3”. La tecnologfa NANOPEP-3 constituye un sistema de administracion “construido a medida” que contiene una partfcula nucleo comun, que atrapa la molecula terapeutica, con peptidos VEPEP-3 superficiales que preferiblemente estan funcionalizados para ser dirigidos in vivo a un tumor o un tejido. Desde un punto de vista estructural, las partfculas NANOPEP-3 estan constituidas por un “nucleo” que esta recubierto por una capa de peptidos VEPEP-3. El “nucleo” corresponde a un complejo que comprende una carga y un vector o vehfculo tal como un primer peptido de penetracion celular, un liposoma, una estructura policationica, una nanopartfcula de carbono, etc. En las partfculas NANOPEP-3, la capa de peptidos VEPEP-3 (peptido periferico) estabiliza la partfcula y puede ser funcionalizada. La funcionalizacion de la superficie de la partfcula NANOPEP-3 con moleculas de colesterol, lfpidos o PEG mejora la estabilidad de las partfculas in vivo, favorece su administracion por ruta sistemica o topica y permite una rapida liberacion de cargas activas dentro de las celulas o tejidos tumorales. Se ha demostrado que la funcionalizacion de la superficie de las partfculas NANOPEP-3 con fragmentos FAB pequenos, peptidos, anticuerpos y lfpidos favorece el ataque in vivo a dianas de tejido o tumor. Asimismo, la funcionalizacion de la superficie de la partfcula NANOPEP-3 con un polisacarido tal como PLGA, puede usarse como formulacion de liberacion lenta de farmacos y cargas, y permite una respuesta in vivo a largo plazo. Tal como se muestra a continuacion en el Ejemplo 5, los inventores han observado que la PEGilacion N-terminal de al menos parte de los peptidos VEPEP-3 que rodean a las partfculas NANOPEP-3 aumenta la biodistribucion de cargas en el tumor, probablemente estabilizando las partfculas NANOPEP-3 en el plasma.
La tecnologfa NANOPEP-3 mejora la administracion celular e in vivo de cargas biologicamente activas, y ha sido validada en un numero grande de lmeas celulares que incluyen lmeas celulares adherentes y en suspension, lmeas celulares diffciles de transfectar. Las partmulas NANOPEP-3 interactuan fuertemente con las membranas celulares y entran en la celula independientemente de la ruta endosomica, o escapan rapidamente de los endosomas tempranos. La tecnologfa NANOPEP-3 presenta varias ventajas que incluyen una rapida administracion con una eficacia muy elevada, estabilidad en tampones fisiologicos, proteccion de la carga contra degradacion, falta de toxicidad y de sensibilidad frente al suero, capacidad para formar nanopartmulas mixtas, pueden funcionalizarse y se han aplicado con exito a la administracion de diferentes tipos de cargas en una amplia variedad de niveles terapeuticos y diagnosticos/teragnosticos, asf como en obtencion de imagenes, por ejemplo obtencion de imagenes cerebrales.
En una realizacion particular de partmulas NANOPEP-3 segun la presente invencion, la carga esta formando un complejo con un primer peptido de penetracion celular, que puede seleccionarse, por ejemplo, entre CADY, MPG, PEP-1, PPTG1, estructura poli Arginina, peptido de familia vEpEP (VEPEP-3, VEPEP-6, VEPEP-9, grapados o no) como se ha descrito anteriormente (tal como las SEQ ID Nos: 1 a 13 y 19 a 52, y variantes de las mismas), o cualquier otro CPP conocido. Dicho complejo carga/CPP se recubre entonces con una capa de peptidos VEPEP-3. Segun esta realizacion, el especialista en la tecnica elegira de forma ventajosa el primer CPP en funcion de la naturaleza de la carga, de tal modo que el complejo de la carga y el primer CPP sea estable. Por tanto, se puede incluir una amplia diversidad de cargas en partfculas NANOPEP-3.
En las nanopartfculas descritas anteriormente, la ratio molar nucleo/VEPEP-3 depende de la naturaleza y del tamano del nucleo, pero generalmente comprende entre 1/1 y 1/50. Para peptidos/nucleos de CPP pequenos, la ratio molar nucleo/VEPEP-3 periferico preferiblemente oscila entre 1/5 y 1/30, dependiendo de la naturaleza de la carga del peptido (hidrofobicidad y carga).
En una realizacion preferida de las nanopartfculas segun la invencion, el tamano de la nanopartfcula esta entre 20 y 300 nm.
Segun una realizacion ventajosa de las partfculas NANOPEP-3 segun la invencion, los peptidos VEPEP-3 que forman la capa periferica de las nanopartfculas comprenden un polietilen glicol o un grupo acetilo unido covalentemente a su extremo N, y /o un grupo cisteamida unido covalentemente a su extremo C.
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Segun otra realizacion preferida, la envoltura de nucleo de las partmulas esta recubierta con un peptido VEPEP-3 funcionalizado con NTA (por ejemplo, un peptido VEPEP-3 con acido nitrilotriacetico unido covalentemente a su extremo C). Esto permite la union posterior a la superficie de la partmula, de cualquier protema (u otra molecula) que albergue una etiqueta de histidina. Esta estrategia ofrece la ventaja principal de presentar partmulas bicapa comunes “NANOPEPHIS-3” que pueden asociarse con cualquier molecula marcada con His.
En realizaciones particulares de los complejos y nanopartmulas segun la invencion, al menos parte de los peptidos de penetracion celular VEPEP-3 estan ligados a una molecula dirigida a diana. En el caso de las partmulas NANoPEP-3, al menos parte de los peptidos de penetracion celular que se encuentran en la periferia de la nanopartmula estan ligados preferentemente a una molecula dirigida a diana. Los ejemplos de moleculas dirigidas a diana incluyen anticuerpos, nanocuerpos y fragmentos Fc o FAB (por ejemplo dirigidos a HEK2/MUC1/EGF/XCCR4), ligandos, especialmente dirigidos a receptores que estan sobre-expresados en la superficie de determinados tipos celulares y que albergan peptidos espedficos de organos seleccionados. Los ejemplos no limitativos de dichos ligandos y peptidos albergadores son: peptido-RGD, peptidos albergadores dirigidos a diana (peptido NT1 cerebral, peptido GM1 de ganglio, asf como todos los demas peptidos descritos previamente para atacar tejidos y lmeas celulares), acido folico, polisacaridos, y la estructura de peptido dirigido a metaloproteasa de matriz (MmP-9 o MMP3 para selectividad de tumor).
Segun una realizacion particular de la presente invencion, los complejos o nanopartmulas se formulan de tal modo que puedan almacenarse durante varios meses sin perder su estabilidad y eficacia funcional. Tal como se describe a continuacion en el ejemplo 5, los complejos y nanopartmulas de la invencion pueden liofilizarse de forma ventajosa en presencia de un azucar. Los ejemplos no limitativos de azucares que pueden usarse para tal fin son sacarosa, glucosa, manitol y una mezcla de los mismos, y pueden usarse, por ejemplo, en una concentracion que oscila entre el 5% y el 20%, preferiblemente entre el 5% y el 10%, entendiendose que una concentracion del 5% se obtiene anadiendo 5 gramos por litro de disolucion antes de la liofilizacion.
Otro aspecto de la presente invencion es el uso de un complejo o nanopartmula como los descritos anteriormente, como medicamento y como marcador o agente para la obtencion de imagenes.
En particular, los complejos VEPEP-3/carga y las partmulas NANOPEP-3 pueden usarse de forma ventajosa en el tratamiento de una enfermedad cerebral y/o una enfermedad de nodos linfaticos, por ejemplo dirigidos a un patogeno latente localizado en el cerebro y/o en un nodo linfatico. Tambien pueden usarse para la obtencion de imagenes cerebrales o de nodos linfaticos.
La presente invencion tambien pertenece a una composicion terapeutica, cosmetica o diagnostica que comprende un complejo o una nanopartmula como los descritos anteriormente. Por ejemplo, una composicion que comprende un complejo o nanopartmula que tiene un peptido dirigido a interacciones protema/protema, que implica como carga una protema esencial CDL y Cliclina requeridas para la progresion del ciclo celular, y una molecula dirigida a diana espedfica de celulas tumorales (por ejemplo: peptido RGD, acido folico, anticuerpos o nanocuerpos MUC-1 o hEK2), es parte de la presente invencion. Dependiendo de la aplicacion, esta composicion se puede formular para administracion intravenosa, intratumoral, topica, intrarrectal, intranasal, transdermica o intradermica, o para administracion a traves de un spray bucal, o para administracion como implante subcutaneo para una liberacion lenta de un farmaco.
La presente invencion tambien pertenece a un metodo para administrar una molecula al interior de una celula in vitro, que comprende una etapa de poner dicha celula en contacto con un complejo o nanopartmula como los descritos anteriormente.
En los siguientes ejemplos se desarrollan mas detalladamente varios aspectos de la presente invencion, ilustrados por las figuras (que se describen en los ejemplos).
Ejemplo 1: Materiales y metodos
Peptidos VEPEP-3
Todos los peptidos fueron sintetizados mediante smtesis de peptidos en fase solida usando AEDI-resina expensina con (fluorenilmetoxi)-carbonilo (Fmoc) en un Sintetizador de Peptidos Pioneer (Pioneer™, Applied Biosystems, Foster City, CA) partiendo de resina Fmoc-PAL-PEG-PS en una escala de 0,2 mmol. Las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo con HATU 0,5 M en presencia de DIEA 1 M. La eliminacion del grupo protector y la liberacion final de la resina se llevaron a cabo con TFA/Fenol/H2O/Tioanisol/Etanoditiol (82,5/5/5/5/2,5 %) durante 3h y 30 minutos. Todos los peptidos presentaron un grupo cisteamida en el extremo C y estaban acetilados en el extremo N. La smtesis de peptidos comenzo en el extremo C, usando una resina AEDl-expensina a partir de un enlace de cisteamida, tal como describen Mery et al., 1992 [9]. Todos los peptidos conteman una beta-Alanina o una serina en el extremo N para favorecer cualquier funcionalizacion posterior sin usar el grupo cisteamida C-terminal.
Funcionalizacion de VEPEP-3
Se usaron dos estrategias para la funcionalizacion de peptidos:
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Se llevaron a cabo conjugaciones de peptido con peptido, anticuerpo, pegilacion, NTA, colesterol, estearilacion en el grupo amino primario del residuo N-terminal, a traves de una beta alanina o serina. Es ventajoso mantener la cisteamida C-terminal libre, ya que se sabe que es requerida para estabilizar la partmula a traves de enlaces disulfuro (SH-SH). Los peptidos funcionalizados fueron purificados adicionalmente mediante HPLC de fase inversa y analizados mediante espectroscopia de masas de ionizacion por electropulverizacion.
Tambien se llevaron a cabo configuraciones de peptido a traves de enlaces disulfuro usando el grupo SH del resto cisteamida del peptido.
VEPEP-3-Funct-1: X-LWWRRWWSRWWPRWRR-CH2-CH2-SH (SEQ ID No: 14)
VEPEP-3-Funct-2: Ac-LWWRRWWSRWWPRWRR-CH2-CH2-S-S-X (SEQ ID No: 15)
VEPEP-3-Funct-3: X-W(W-F)RLW(W-F)RLR-CH2-CH2-SH (SEQ ID No: 16)
VEPEP-3-Funct-4: Ac-W(W-F)RLW(W-F)RLR-CH2-CH2-S-S-X (SEQ ID No: 17)
X: Colesterol, Pegilacion, estearilo, palmitoilo, fragmentos FC o FAB pequenos, nanocuerpo, acido nitrilotriacetico (2 x NTA), peptidos dirigidos a tejidos (cerebro, pulmon, nodo linfatico, pancreas,...)
Estructura VEPEP-3
Los peptidos VEPEP-3 son peptidos anfipaticos primarios; son altamente versatiles y muestran un fuerte polimorfismo estructural. Los VEPEP-3 estan desplegados en disolucion como forma libre y adoptan una conformacion de helice alfa en la parte N-terminal en presencia de lfpidos o membranas celulares artificiales, asf como en presencia de cargas tales como peptidos o protemas.
Peptidos y protemas
Los peptidos dirigidos a CDK/Ciclina (secuencias C4, C2 de las SEQ ID Nos: 20 a 23) o integrasa de VIH (secuencias PC4 y PC6 de las SEQ ID Nos: 24 a 27), version lineal o dclica, fueron obtenidos para Polipeptido.
C2: KKQVLAMEHLVT (SEQ ID No: 20)
C2S: VTLMEAKKQVLT (SEQ ID No: 21)
C4: KKQVRMAHLVLT (SEQ ID No: 22)
C4C: CKKQVRMAHLVLTC (SEQ ID No: 23)
PC4, tambien denominado PC4D: RWTEWEWW (SEQ ID No: 24)
PC4S: TWFTEWFT (SEQ ID No: 25)
PC6, tambien denominado PC6D: KWETWWET (SEQ ID No: 26)
PC6S: KAETWAET (SEQ ID No: 27)
Protemas; que incluyen GFP sobreexpresada en E. coli, y nanocuerpos de protema corta, que corresponden a anticuerpos de chamelidea tambien se expresaron en E. coli.
Oligonucleotidos y PNA
Se sintetizaron oligonucleotidos cortos, PNA y 5' Alexa700 o PNA Cy5 marcado fluorescentemente mediante Eurogentec (Belgica) segun las siguientes secuencias:
Cyc-B1a; TGC CAT CGG GCT TGG AGG-CY5 (SEQ ID No: 18)
Cyc-Bct; TGC CAT CAA GCT TAG AGG-CY5 (SEQ ID No: 19)
Valoraciones de fluorescencia
Se llevaron a cabo experimentos de fluorescencia en un espectrofluonmetro PTI a 25°C en un tampon de NaCl 154 mM. Se excito la fluorescencia-Trp intrmseca del VEPEP-3 a 290 nm y se registro el espectro de emision entre 310 y 400 nm, con un paso de banda espectral de 2 y 8 nm para la excitacion y la emision, respectivamente. La fluorescencia-FITC del peptido marcado se excito a 492 nm y la emision se registro entre 500 y 580 nm. Para la interaccion VEPEP-3/peptido, se valoraron 0,5 pM del peptido marcado con FITC con concentraciones crecientes de VEPEP-3. Todas las medidas fueron corregidas por la dilucion y el ajuste de la curva se realizo mediante el software Grafit (Erithacus).
Caracterizacion de nanoparticulas basadas en peptido
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Se determino la distribucion de tamano medio de partmula con un Coulter N4 Plus (Coulter-Beckman) a 25°C durante 3 minutos por medida, y se midio el potencial zeta con un aparato Zetasizer 4 (Malvern Ltd.).
Cultivo celular y administracion de carga mediada por VEPEP
Se cultivaron lmeas celulares adherentes de fibroblastos HS68, HeLa, PC3, MCF-7, SCK3-Her2 (de la “American Type Culture Collection, ATCC”) en medio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con glutamina 2 mM, un 1% de antibioticos (estreptomicina 10.000 pg/mL, penicilina, 10.000 lU/mL) y un 10% (p/v) de suero fetal de ternero (FCS), a 37°C en una atmosfera humidificada y con un 5% de CO2. Se prepararon disoluciones de reserva de partmulas VEPEP-3/peptido complejando peptido 1 pM con peptidos VEPEP-3 en una ratio molar de 1/20 durante 30 minutos a 37°C. Mediante dilucion en serie de las disoluciones reserva en PBS se obtuvieron concentraciones menores de VEPEP-3-vehmulo/peptido (de 500 nM a 1 pM), con el objetivo de preservar la misma ratio VEPEP-3- velmculo/peptido. Se crecieron 150.000 celulas sembradas en un platillo de 35 mm el dfa antes de la transfeccion, hasta un 60% de confluencia y se recubrieron con 200 pL de complejos preformados, se incubaron durante 3-5 minutos y a continuacion se anadieron 400 pL de DMEM. Despues de 30 minutos de incubacion a 37°C, se anadio 1 mL de DMEM fresco que contema un 16% de suero fetal de ternero (FCS) a fin de alcanzar una concentracion final de FCS del 10%, sin eliminar el recubrimiento de complejos VEPEP-3/peptido. Se devolvieron las celulas al incubador durante 24 horas. Para los peptidos derivados de cdk4 y CDK2 se monitorizo la proliferacion celular tras 24 y 48 h. Para la integrasa dirigida a peptido, se analizo la proliferacion de VIH en celulas PBMC activadas despues de 3 y 5 dfas. Los datos presentados son una media de 3 o 4 experimentos distintos.
Citotoxicidad
La toxicidad de los complejos VEPEP-3/peptido o VEPEP-3/protema se investigo en lmeas celulares Hela y HS-68. 30.000 celulas sembradas en placas de 24 pocillos el dfa antes de la transfeccion fueron incubadas con concentraciones crecientes de peptido o protema acomplejados con VEPEP-3 en una ratio molar de 20/1 entre 1 y 5 pM (VEPEP-3 500 pM), durante 30 minutos antes de la adicion de medio para alcanzar una concentracion final del 10% de FCS. Se midio la respuesta citotoxica 12h o 24h despues de monitorizar el nivel de ARNm de gen ciclofilina domestico (Quantigen, Panomic Inc.) y mediante ensayo MTT colorimetrico (Sigma, Alemania), respectivamente. Para el ensayo MTT, se elimino el medio de cultivo celular y se sustituyo con PBS que contema 2,5 mg/mL de MTT durante 4h. Los resultados corresponden a la media de 3 experimentos separados.
Modelos tumorales de raton
Se inocularon subcutaneamente ratones nude hembra atfmicos (de 6-8 semanas de edad) en el costado con 1 x 106 celulas PC3, A549 o SCK-3-HEK2 en 100 pL de PBS. De dos a tres semanas despues del implante del tumor, cuando el tumor alcanzo un tamano de aproximadamente 100 mm3, los animales fueron tratados mediante inyeccion intratumoral o intravenosa, cada 3 dfas, con una disolucion de 0,1 mL de peptido libre derivado de CDK2 o CDK4 (200 pg), peptido de cifrado de control C4C o peptidos C4 o C2 (10, 50, 100 pg) acomplejados con NANOPEP-3 en una ratio molar de 1/20. Se midio el diametro tumoral en dos direcciones a intervalos regulares usando un calibre digital, y se calculo el volumen tumoral como la longitud x anchura x altura x 0,52. Las curvas muestran el valor medio de tamano tumoral en una cohorte de seis animales y no se observo la muerte de ningun animal ni ningun signo de toxicidad. Los experimentos fueron llevados a cabo segun la normativa nacional y fueron aprobados por el comite local de etica de experimentacion con animales. La significacion estadfstica de los resultados se calculo mediante el test de t de Student y se considero estadfsticamente significativo p>0,05.
Obtencion de imagenes in vivo de la biodistribucion de peptido
Se obtuvieron imagenes de fluorescencia in vivo como se ha descrito previamente en Crombez et al, 2009, Nucleic Acid Res [10]. Se inyectaron ratones intravenosamente con 100 pg (200 pL) de peptido (C4) marcado fluorescentemente Alexa700, tanto solo como formando complejo con VEPEP-3 (n = 4 animales por grupo). Los ratones anestesiados, usando isoflurano al 2%, fueron iluminados mediante diodos emisores de luz de 663 nm equipados con filtros de interferencia, y se grabo pelmula durante los primeros 15 minutos y las imagenes de fluorescencia fueron tomadas cada 5 h y despues cada 24 h, con una camara CCD refrigerada de fondo delgado tal y como se ha descrito previamente (Crombez et al, 2009, Nucleic Acid Res). A las 24 h los ratones fueron sometidos a eutanasia y se extrajeron diferentes organos para cuantificacion de fluorescencia Alexa.
Ejemplo 2: aplicaciones de peptidos VEPEP-3 para administracion de moleculas
Ejemplo 2.1: los peptidos VEPEP-3 forman nanoestructuras estables con peptidos y protemas
Los peptidos VEPEP-3 forman complejos estables con peptidos y protemas. La union de cargas a VEPEP-3 se monitorizo mediante espectroscopfa de fluorescencia usando los dos grupos Trp intrmsecos de VEPEP-3 (residuos Trp 3 a 5) y cargas extrmsecas marcadas fluorescentemente (usando Cy3, Cy5 o FITC). El ajuste de la curva revela que VEPEP-3 se une fuertemente a las diferentes cargas con una constante de disociacion en el rango nanomolar (en la Figura 1 se presentan ejemplos con VEPEP-3a, VEPEP-3C y VEPEP-3g y tres cargas diferentes, todos los datos se incluyen en la Tabla 1).
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Ejemplo 2.2: los peptidos VEPEP-3 forman nanoestructuras estables con moleculas hidrofobicas pequenas
Los peptidos VEPEP-3 tambien forman partmulas estables con moleculas aromaticas pequenas que incluyen Daunomicina, Paclitaxel, doxorrubicina, porfirina y moleculas cargadas que incluyen nucleotidos, nucleosidos y analogos peptididos de acidos nucleicos o colorantes fluorescentes (Figura 1). La constante de disociacion para moleculas hidrofobicas pequenas oscila entre 0,05 y 2 jM, dependiendo de la naturaleza de los colorantes y de los peptidos.
VEPEP-3
SEQ ID No Cargas
peptido
Peptido ciclico Proteina shm PNA
Union
Kd (nM) Union Kd (nM) Union Kd (jM) Union Kd (JM) Union Kd (nM)
VEPEP-3a
1 Si 10-20 Si 50-100 Si 1 Si 1 Si 100
VEPEP-3b
2 Si 10-20 Si 50-100 Si 0,5 Si 0,5 Si 200
VEPEP-3c
3 Si 10-20 Si 50-100 Si 0,2 Si 0,2 Si 200
VEPEP-3d
4 Si 10-20 Si 50-100 Si 0,1 Si 0,1 Si 100
VEPEP-3e
5 Si 10-20 Si 5-20 Si 0,02-0,1 Si 0,02 Si 5-50
VEPEP-3f
6 Si 10-20 Si 5-20 Si 0,02-0,1 Si 0,02 Si 5-50
VEPEP-3g
7 Si 10-20 Si 5-20 Si 0,02-0,1 Si 0,02 Si 5-50
Tabla 1: Caracterizacion de los complejos VEPEP-3/Carga. Peptido (C4 y C2), Peptido cmlico (PC4), protema (GFP y Nanocuerpo), SHM: molecula hidrofobica pequena de doxorrubicina y PNA (PNA de 15 monomeros).
Ejemplo 2.3: Los peptidos VEPEP-3 forman nanoparticulas estables con sus diferentes cargas
El tamano de las partmulas se monitorizo mediante dispersion de luz dinamica. La ratio molar peptido VEPEP- 3/carga optima oscila entre 1/10 y 1/30. La Figura 2 muestra el analisis DLS de las partmulas VEPEP-3a/peptido, VEPEP3c/peptido dclico, VEPEP-3e-PNA y VEPEP-3g/Doxo formadas con una ratio 1/20 (Figura 2). El tamano de las partmulas es de aproximadamente 100 a 200 nanometros de diametro.
Ejemplo 3: Aplicaciones de VEPEP-3 en celulas cultivadas
Ejemplo 3.1: Administracion mediada por VEPEP-3 de peptido y peptido cclico en diferentes lmeas celulares
Se han usado los peptidos VEPEP-3 para la administracion de diferentes peptidos en diferentes lmeas celulares, que incluyen lmeas celulares primarias, lmeas de celulas madre y lmeas celulares de exposicion. La administracion de peptido se monitorizo usando tres estrategias: espectroscopfa de fluorescencia y monitorizando respuestas biologicas (respuestas de anti proliferacion y anti vmca).
El peptido marcado fluorescente se visualizo en las diferentes lmeas celulares usando microscopfa de fluorescencia o clasificacion FACS (Tabla 2). En la mayona de las lmeas celulares, la captacion de peptidos marcados con Cy-5 es superior al 70% de las celulas.
Los experimentos dosis-respuesta llevados a cabo en diferentes celulas cultivadas revelaron que la administracion mediada por VEPEP-3 de peptidos C2 y C4, dirigidos a complejos cdk2/ciclina A o CDK4/ciclina D, bloquea la proliferacion celular de diferentes celulas cancerosas.
Los experimentos dosis-respuesta llevados a cabo con celulas PBMC activadas infectadas con VIH revelaron que la administracion mediada por VEPEP-3 de peptidos PC4D, dirigidos al complejo de pre-integracion y a integrasa de VOH, bloquea la replicacion vmca (el efecto de PC4D en el complejo con VEPEP-3a, VEPEP-3c y VEPEP-3g se muestra en la Figura 3).
Lmeas celulares
Origen Eficacia de analisis FACS de Cy-5 C4
Hela
Celulas de cancer cervical epitelial humano 75%
Jurkat
Linfocito T humano 90%
HepG2
Hepatocito humano 70%
C2C12
Mioblasto de raton 90%
mef
Fibroblasto de raton 90%
HS-68
Fibroblasto humano 90%
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CEM-SS
Macrofago humano 80%
U2OS
Osteoblasto humano 91%
MCF7
Adenocarcinoma de mama humano 70%
MT4
Linfocito T humano 70%
HER2
Cancer de mama humano 90%
MDA-MB
Cancer de mama humano 70%
PBMC
Macrofago humano 90%
Tabla 2
Ejemplo 3.2: la administracion mediada por VEPEP3 de peptidos dirigidos a Cdk2/ciclina A o CDK4/ciclina D induce el arresto de G2 y bloquea la proliferacion de celulas cancerosas
Los experimentos dosis-respuesta llevados a cabo con celulas cultivadas revelaron que la administracion mediada por VEPEP-3 de peptido C2 y C4 indujo una respuesta biologica robusta asociada al arresto espedfico del ciclo celular de G2 (Figura 4). Una concentracion de peptido C2 o C4 de 200 nM fue suficiente para bloquear la proliferacion de celulas Hela, MCF7, HEK-2, HS-68 y U2OS. Se estimaron valores de IC50 de 35 ±12 nM y 37 ± 15 nM para los peptidos C4 y C2, respectivamente, en celulas Hela, de 58 ± 6 nM y 67 ± 15 nM para los peptidos C4 y C2, respectivamente, en MCF7, y de 78 ± 10 nM y 102 ± 24 nM para los peptidos C4 y C2, respectivamente, en HEK-2. Por el contrario, la proliferacion solo se redujo entre un 10 y un 20% para fibroblastos HS68 no transformados, en perfecta consonancia con el impacto del punto de consigna G2-M de la proliferacion de ciclo celular, y demostrando la especificidad del peptido por celulas cancerosas. La Figura 5 muestra un ejemplo con VEPEP-3a, VEPEP-3d y VEPEP-3g.
La disociacion mediada por C2 y C4 de los complejos CDK2/ciclina A o CDK4/ciclina D se asocio directamente a la acumulacion de celulas con un contenido 4N, consistente con la regulacion a la baja de la actividad de Cdk1-Ciclina B1, y se obtuvo de forma optima con 200 nM de peptido y con valores IC50 estimados de 36 ± 21 nM y 46 ± 14 nM para celulas HeLa y MDA_MB, respectivamente (Figura 5). La Figura 4 muestra un ejemplo que emplea VEPEP-3a con C2 y C4 en una ratio molar de 1/20. Por el contrario, no se observo efecto sobre la progresion del ciclo celular con 500 nM de peptidos C2 codificados formando complejo con VEPEP-3a en una ratio de 20/1, o solo con vehmulo de VEPEP-3a (200 pM).
Ejemplo 3.3: la administracion mediada por VEPEP3 de peptidos dirigidos a integrasa de VIH bloquea la replicacion de virus de VIH
Las actividades anti-VIH de los peptidos (PC4D, PC6D y PC4S) y de los complejos VEPEP-3/peptidos fueron ensayadas de acuerdo a un metodo descrito previamente (Roisin et al, 2004). Celulas mononucleares sangumeas perifericas (PBMC) activadas con fitohemaglutinina-P (PHA-P) tratadas con concentraciones crecientes de peptido (de 100 a 0,1 nM), una hora mas tarde, fueron infectadas con cien dosis infecciosas de cultivo de tejido al 50% (TCID50) por cada 100.000 celulas del VIH-1-LAI o diferentes cepas resistentes (Barre-Sinoussi et al, 1983). Los virus fueron amplificados in vitro en PBMC activadas con PHA-P. La reserva vmca fue valorada usando PBMC activadas con PHA-P, y se calculo la TCID50 al 50% usando la formula de Karber (Karber 1931). Las muestras se mantuvieron a lo largo del cultivo, y se recogieron los sobrenadantes celulares en el dfa 7 tras la infeccion y se almacenaron a -20°C. Se midio la replicacion vmca cuantificando la actividad RT en los sobrenadantes de cultivo celular. En paralelo, se evaluo la citotoxicidad de los compuestos en PBMC activadas con PHA-P no infectadas mediante ensayo colorimetrico de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil tetrazolio (MTT) el dfa 7 (Mossmann 1983). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron con otro donante de sangre. El analisis de datos se llevo a cabo usando el software de microcomputadora SoftMax®Pro 4.6: se represento el porcentaje de inhibicion de actividad RT o de viabilidad celular frente a la concentracion, y se ajusto con curvas cuadraticas; se calcularon las dosis efectivas al 50% (ED50) y las dosis citotoxicas (CD50).
Los experimentos de dosis-respuesta llevados a cabo con celulas cultivadas revelaron que la administracion de PC4D y PC6D mediada por VEPEP-3a, VEPEP-3c y VEPEP-3g bloquea de forma significativa la replicacion en PBMC infectadas con VIH-1 lai (Figura 3). Cuando se asocian al peptido vehmulo VEPEP-3, PC4D y pC6D exhiben una actividad antivmca 15 veces mayor que el AZT, que es el inhibidor RT de referencia usando en la practica clmica: IC50 de 0,12 ± 0,05 nM y 0,09 ± 0,05 nM, respectivamente. Por el contrario, los peptidos cifrados PC4S y PC6S no muestran ninguna actividad antivmca. Ninguno de los complejos VEPEP-3/peptido induce una respuesta toxica y presentan un mdice de selectividad superior a 5400, lo cual es 10 veces mas que el AZT.
Ejemplo 3.4: administracion mediada por VEPEP-3 de protemas en diferentes lmeas celulares
Se han usado VEPEP-3 para la administracion de diferentes protemas a diferentes lmeas celulares, que incluyen lmeas celulares primarias, lmeas de celulas madre y lmeas celulares de exposicion. Se monitorizo la captacion de
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protemas usando espectroso^a de fluorescencia y analisis FACS. Las protemas GFP/RFP o las protemas marcadas fluorescentes fueron visualizadas en las diferentes lmeas celulares usando microscopfa de fluorescencia o clasificacion FACS (Tabla 3). En la mayona de las lmeas celulares, la captacion de RFP; GFP, protemas marcadas con Cy-5 es superior al 70% de las celulas.
Lmeas celulares
Origen Eficiencia GFP Eficiencia protema-Cy
Hela
Celulas de cancer cervical epitelial humano 67% 90%
Jurkat
Linfocito T humano 80% 90%
HepG2
Hepatocito humano 69% 70%
C2C12
Mioblasto de raton 80% 90%
MEF
Fibroblasto de raton 75% 90%
HS-68
Fibroblasto humano 80% 90%
CEM-SS
Macrofago humano 80% 80%
U2OS
Osteoblasto humano 70% 91%
MCF7
Adenocarcinoma de mama humano 65% 70%
MT4
Linfocito T humano 50% 55%
Tabla 3
Ejemplo 3.5: la administracion mediada por VEPEP3 de peptidos y protemas no es toxica.
Tal como se muestra en la Figura 6, se investigo la toxicidad de partmulas VEPEP-3 en celulas HeLa y U2OS mediante ensayo MTT y monitorizando el nivel de ARNm de ciclofilina medido mediante tecnologfa quantigen™ (Affymetrix). Se formaron complejos de VEPEP-3a, VEPEP-3b, VEPEP-3c, VEPEP-3d, VEPEP-3e, VEPEP-3f, VEpEP-3g y VEPEP-3h con peptido corto y PNA en una ratio 1/20. No se detecto toxicidad en niveles de hasta 200 nM, y solo se observo una toxicidad moderada en la concentracion maxima de 1 pM.
Ejemplo 3.6: administracion mediada por VEPEP-3 de molecula de PNA en diferentes lmeas celulares
Se han usado peptidos VEPEP-3 para la administracion de analogos de acido nucleico (PNA y morfolino) a diferentes lmeas celulares, que incluyen lmeas celulares primarias y lmeas celulares de exposicion. Hemos demostrado que VEPEP-3a y VEPEP-3h forman complejos estables con PNA pequenos o con oligonucleotido de morfolino de 15 monomeros. Hemos aplicado la estrategia VEPEP-3 a la administracion de Ciclina B1 dirigida a PNA antisentido como se ha descrito previamente (Morris et al, 2007). Los experimentos dosis-respuesta llevados a cabo con diferentes celulas cultivadas revelaron que la administracion mediada por VEPEP-3 de PNA (Ciclina B1) indujo una regulacion a la baja robusta superior al 70% del nivel de protema Ciclina B1 (Figura 7).
Ejemplo 3.7: Administracion mediada por VEPEP-3 de moleculas hidrofobicas pequenas en diferentes lmeas celulares
Se han usado peptidos VEPEP-3 para la administracion de diferentes moleculas hidrofobicas fluorescentes pequenas y cargadas, asf como doxorrubicina/porfirina/taxol en diferentes lmeas celulares, que incluyen lmeas celulares primarias y lmeas celulares de exposicion. Los peptidos VEPEP-3 forman partmulas estables con moleculas aromaticas pequenas que incluyen doxorrubicina o colorantes fluorescentes. La constante de disociacion correspondiente a moleculas hidrofobicas pequenas oscila entre 0,01 y 2 pM, dependiendo de la naturaleza de los colorantes y de los peptidos.
El efecto de la administracion mediada por VEPEP-3a, VEPEP-3c y VEPEP-3g de doxorrubicina, porfirina o taxol ha sido investigado en la viabilidad de celulas cancerosas. Experimentos dosis-respuesta llevados a cabo en cultivos celulares revelaron que la administracion mediada por peptido VEPEP-3 de doxorrubicina y porfirina induda una respuesta biologica asociada al arresto del ciclo celular y a una disminucion de la viabilidad de celulas cancerosas MCF-7 y SCK-3-HEK-2 (la Figura 8 muestra los resultados obtenidos con celulas MCF-7). El impacto de peptidos vehmulo para mejorar la captacion celular de farmacos de molecula pequena se estimo siguiendo la inhibicion de la proliferacion de celulas cancerosas.
En la Tabla 4 se presentan los valores de IC50. Para VEPEP-3/Doxo y Doxo libre se obtuvo una IC50 de 0,4 pM y 10 pM, respectivamente. Los datos demuestran que la Doxo es 25 veces mas eficiente cuando se encuentra formando un complejo con VEPEP-3.
Farmaco
VEPEP-3a Farmaco libre VEPEP-3c VEPEP-3g
1/20 IC50 (pM)
IC50 (pM)
1/20 IC50 (pM)
1/20 IC50 (pM)
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Doxo (SKB3)
0,3 10 0,4 0,2
Doxo (MCF7)
0,2 7 0,5 0,2
Porfirina (MCF7)
0,8 25 1,7 0,5
Porfirina (SKB3)
1,5 17 2,4 1,2
Taxol (MCF7)
0,2 7 0,5 0,7
Taxol (SKB3)
0,5 9 0,9 0,8
Tabla 4
Ejemplo 4: formulaciones NANOPEP-3 y aplicaciones para administracion in vivo
Las nanopartmulas NANOPEP contienen un “peptido-nucleo” o “envoltura de nucleo” que corresponde a la asociacion de peptido VEPEP-3 o de cualquier otro peptido que forme complejos no covalentes con su respectiva carga, que esta rodeado por peptidos adicionales VEPEP-3 “perifericos” que estabilizan la partmula y favorecen la asociacion a la membrana celular. La eficacia de NANOPEP viene controlada principalmente por el tamano y la carga electrica de las partmulas, que debenan oscilar entre 100 - 200 nm y +5 - +20 voltios, respectivamente. Se pueden usar varias combinaciones para el VEPEP-3 de “nucleo”, y periferico puede estar funcionalizado o no. La eleccion de los peptidos del “nucleo” depende de la naturaleza de las cargas y puede ser VEPEP-6, un peptido de otra familia VEPEP (VEPEP-9,...), CADY (Crombez et al, 2009a [10]), MPG (Crombez et al, 2009b [11]) o PEP-1 (Chariot: Morris et al, 2001 [8]), etc.
Las partmulas NANOPEP se forman en un proceso de dos etapas (Figura 9): primero el “nucleo” en una ratio molar de 1/5 o 1/10, despues el “periferico” en una ratio molar de 1/20 hasta 1/80. La organizacion multicapa de la partmula permite su funcionalizacion orientada, que se elegira dependiendo de la naturaleza de la diana celular/tejido y del modo de administracion.
Se ha establecido un protocolo de tres etapas (Figura 9) cuando tiene lugar la funcionalizacion de la partmula a traves de acido nitrilotriacetico (NTA) ligado al VEPEP-3. Es bien sabido que el grupo NTA es capaz de quelar metal e interaccionar fuertemente con protemas marcadas con histidina. El recubrimiento de las partmulas con VEPEP-3 funcionalizado con NTA permite la union de cualquier protema que alberga una etiqueta de histidina a la partmula. Esta estrategia ofrece la ventaja principal de presentar partmulas comunes de 2 capas “NANOPEPHIS” que pueden asociarse a cualquier protema marcada con His. La estrategia de NANOPEPHIS ha sido usada para recubrir partmulas con anticuerpos espedficos dirigidos a antfgeno de superficie celular (EGF, HER-2 o MUC1) o a nanocuerpos seleccionados mediante presentacion de fagos contra lmeas celulares espedficas para administracion de peptidos. La estrategia NANOPEPHIS-3 puede aplicarse universalmente a cualquier peptido o protema que albergue una agrupacion de Histidina en su secuencia.
Ejemplo 5: aplicaciones de la estrategia NANOPEP-3
Se ha usado la estrategia NANOPEP-3 para la administracion y ataque dirigido in vitro de diferentes cargas y diferentes nanopartmulas basadas en peptidos. A continuacion se presentan diferentes ejemplos de aplicaciones de NANOPEP-3.
Ejemplo 5.1: administracion dirigida in vivo de peptido corto mediada por NANOPEP-3 tras inyecciones sistemicas intravenosas o topicas
El potencial terapeutico de la tecnologfa NANOPEP-3 ha sido validado in vivo con peptidos dirigidos a CDK2/CICLINA A/E y CDK4/CICLINA D, protema quinasas esenciales requeridas para el control la progresion del ciclo celular en G1 y G2, y dianas terapeuticas establecidas en varios canceres. La potencia de esta tecnologfa ha sido validada in vivo con peptidos dirigidos a interacciones entre protema quinasas y sus reguladores de ciclina, requeridos para la entrada y la progresion a traves de mitosis. Los inventores han demostrado que la combinacion de un peptido C4 o C2 con NANOPEP previene el crecimiento de tumor de pulmon y prostata en modelos de xenoinjerto de raton, tras inyeccion cada tres dfas de NANOPEP-3/C4 y NANOPEP-3/C2 en una dosis de 1 mg/kg (Figura 10). La envoltura de “nucleo” de las partmulas se formo usando peptido VEVEP-3a o VEPEP-3f en una ratio molar de 20/1 o 40/1 con un peptido C4 o C2. Los peptidos VEPEP-3 fueron solubilizados en agua y la disolucion de reserva de peptido fue sometida a ultrasonidos durante 10 minutos en un bano de agua antes de la formacion de complejos. A continuacion se formaron los complejos VEPEP-3/peptido anadiendo peptido (C2 o C4) en la disolucion de peptido e incubando a 37°C durante 20-30 minutos para permitir que se formaran los complejos vehmulo de peptido/peptido. Entonces se recubrieron las partmulas con peptidos VEPEP-3a (NANO-3A) o VEPEP-3f (NANO-3F) dependiendo de la diana in vivo. El recubrimiento se llevo a cabo anadiendo el peptido de recubrimiento en una ratio molar (peptido/peptido) de 1/5 e incubando despues durante 20 minutos a 37°C para obtener complejos estables, tal como se muestra en la Figura 9. Las disoluciones de reserva de partmulas se llevaron a cabo en agua y son estables durante al menos tres semanas a 4°C. Las partmulas pueden liofilizarse para almacenamiento a largo plazo; en cuyo caso se anade entre un 5 y un 20% de glucosa o manitol a la disolucion de partmulas antes de la
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liofilizacion para estabilizar las pardculas durante el proceso. Antes de la administracion, las pardculas son diluidas en condiciones fisiologicas, en presencia de: 0,9% de NaCl y de 5 a 20% de glucosa o manitol.
Administracion de NANOPEP-3/C4 y NANOPEP-3/C2 tras inyeccion topica y sistemica
El potencial de NANOPEP-3 para administrar peptidos C2 o C4 in vivo se evaluo primeramente en ratones con xenoinjertos PC3 de celula de carcinoma de prostata humana (Figura 10). Se evaluo el efecto de la administracion intratumoral local e intravenosa de partfculas NANOPEP-3/C4 o NaNoPEP-3/C2 (ratio molar 20/1) sobre el crecimiento de tumores subcutaneos establecidos. En el dfa 50, el tamano de los tumores de la cohorte de control, inyectada con PBS, hadan aumentado aproximadamente 4,1 veces. Tras un tratamiento intratumoral local, se observaron reducciones del crecimiento tumoral del 75% y el 80% usando 100 |jg (0,5 mg/kg) de C4/NANOPEP-3a o 3f y de C2/NANOPEP-3a o 3f, el crecimiento tumoral se evito completamente con 500 jg (1 mg/kg) de C2/NANOPEP-3a o 3f y C4/NANOPEP-3a o 3f, respectivamente (Figura 10). Tras la administracion intravenosa sistemica, se observaron reducciones del crecimiento tumoral del 45% y del 47% usando 500 jg (1 mg/kg) de C4/NANOPEP-3 y C2/NANOPEP-3, respectivamente. En ambos casos, la inhibicion del crecimiento tumoral fue espedfica de secuencia de C4 o C2, ya que el peptido C4S codificado acomplejado con NANOPEP-3 e inyectado en ratones en una dosis de 2 mg/kg fue incapaz de inhibir el crecimiento tumoral. Los resultados demostraron que las partfculas NANOPEP-3 son menos eficientes por inyeccion sistemica, lo que probablemente es debido a una menor estabilidad de la partfcula en el torrente sangumeo (ver mas adelante).
Administracion de peptido C2 y C4 mediada por NANOPEP-3 tras inyeccion sistemica
La estabilidad de las formulaciones vedculo de farmacos in vivo y en la circulacion sangurnea es algo cntico para la administracion sistemica de agentes terapeuticos. A fin de mejorar la biodisponibilidad y la estabilidad de las pardculas de NANOPEP-3a/peptido, estas se recubrieron con PEG-VEPEP-3a, haciendolas de este modo mas adecuadas para administracion sistemica; la capa superficial de las partfculas NANOPEP-3a se funcionalizo con un resto PEG en el extremo N de VEPEP-3 (PEG-VEPEP-3a), mediante activacion del grupo amino de la beta alanina N-terminal. Las partfculas NANOPEP-3a/C4 PEGiladas fueron obtenidas paso a paso formando complejos de las moleculas VEPEP-3 con C4 en una ratio molar de 15/1, seguido de un recubrimiento de las partfculas con una segunda capa de PEG-VEPEP3a en una ratio de 1/10. Con el objetivo de analizar si el aumento de la distribucion de peptido C4 asociado a partfculas NANOPEP-3a funcionalizadas afecta directamente a su potencia para inhibir el crecimiento tumoral, las partfculas fueron usadas en administracion intravenosa sistemica en un modelo de raton de tumor de xenoinjerto SKB3-HEK2. Se inyectaron intravenosamente cada tres dfas 100 jg (0,5 mg/kg) de peptido C4 formando complejo con PEG-NANOPEP-3 en una ratio de 1/30 a ratones portadores de tumor de xenoinjerto SKB3- HEK2, y se observo una reduccion significativa del tamano del tumor del 90% en el dfa 50 (Figura 11), lo cual es 10 veces mas potente que con la nanopartfcula NANOPEP-3 no funcionalizada, lo que sugiere que el PEG- incrementa la biodistribucion de peptido en el tumor manteniendo peptido en el plasma y estabilizando la partfcula de NANOPEP-3.
Ejemplo 5.2: administracion antisentido de PNA B1 anticiclina mediada por NANOPEP-3 tras inyeccion sistemica.
Se uso NANOPEP-3 para la administracion in vivo de ciclina B1 antisentido dirigida a PNA antisentido. Se evaluaron partfculas NANOPEP-3H/PNA, NANOPEP-3A/PNA libres o recubiertas con PEG-VEPEP-3A directamente para determinar la potencia de inhibicion del crecimiento tumoral; las partfculas fueron usadas para administracion intravenosa sistemica en un modelo de raton de tumor de xenoinjerto SKB3-HEK2. En las ultimas, la capa superficial de partfculas NANOPEP-3 estaba funcionalizada con un resto Peg en el extremo N de VEPEP-3A (PeG-VePEP- 3a), a traves de la activacion del grupo amino de la beta alanina N-terminal. Las partfculas PEGiladas NANOPEP- 3/PNA fueron obtenidas por etapas formando complejos de moleculas VEPEP-3 con PNA en una ratio molar de 10/1, seguido del recubrimiento de las partfculas con una segunda capa de PEG-VEPEP3 en una ratio de 1/10. Se inyectaron intravenosamente cada tres dfas 5 jg (0,1 mg/kg) y 10 jg de PNA acomplejado con NANOPEP-3 y PEG- nAnOPEP-3 en una ratio 1/30 en ratones portadores de tumor de xenoinjerto SKB3-HEK2. Como se muestra en la Figura 12, en el dfa 50, se obtuvieron reducciones del crecimiento tumoral del 20 y el 43% con 5 jg y 10 jg de PNA acomplejado con NANOPEP-3, respectivamente. Se observo una reduccion significativa del tamano tumoral del 90% con 5 jg de PNA acomplejado con PEG-NANOPEP-3, en el dfa 50 (Figura 12). La inhibicion del crecimiento tumoral fue espedfica de la secuencia de ciclina B1 de PNA ya que 50 jg de PNA codificado acomplejado con NANOPEP-3 e inyectados en ratones fueron incapaces de inhibir el crecimiento tumoral. Estos resultados sugieren que el VEPEP- 3 es un gran vedculo para la administracion in vivo de PNA y que el PEG- aumenta la biodistribucion de PNA en el tumor mejorando la estabilidad de la partfcula NANOPEP-3.
Ejemplo 5.3: ataque dirigido a peptido cerebral in vivo mediado por NANOPEP-3
Se usaron peptidos VEPEP-3 para promover el ataque dirigido a cerebro de nanopartfculas basadas en peptido. Se uso VEPEP-3 como vedculo y se recubrio con VEPEP-3 para ataque a cerebro. Tambien se anadio peptido VEPEP- 3 como peptido de recubrimiento en otros complejos de carga de nanopartfculas basados en peptidos (que incluyen “partfculas de envoltura de nucleo” de otras familias VEPEP, CADY, PEP o MPG/peptido). Las cargas usadas fueron un peptido marcado fluorescentemente o siARN. Las partfculas fueron formadas como se muestra en la Figura 9. En
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todos los casos se inyectaron intravenosamente 5 |jg de cargas acomplejadas con peptido vehmulo. A continuacion se monitorizo la biodistribucion in vivo de las cargas usando imagenes de fluorescencia en animales vivos. El VEPEP-3/peptido da como resultado una gran acumulacion de Peptido en el cerebro (Figura 13), y la presencia de recubrimiento de VEPEP-3 indujo un aumento de la administracion de carga (peptido o siARN) en el cerebro. La monitorizacion de la fluorescencia de cargas marcadas mostro un aumento de 5 a 10 veces en el cerebro, en comparacion con los experimentos de control en ausencia de recubrimiento VEPEP-3 de la partmula. La presencia de recubrimiento VEPEP-3 tambien aumento en un factor de 3 veces el bloqueo de GADPDH en el cerebro (Figura 13). En conjunto estos resultados demostraron que el peptido VEPEP-3 mejora significativamente el ataque dirigido a cerebro de nanopartmulas basadas en peptidos, y que puede usarse para ataques dirigidos a cerebro tanto como vehmulo o como capa de recubrimiento de nanopartfculas basadas en peptidos ya formadas.
Ejemplo 5.4: administracion in vivo mediada por NANOPEP-3 de cargas a traves de diferentes rutas de administracion
Se han evaluado nanopartmulas basadas en NANOPEP-3 usando diferentes rutas de administracion que incluyen administraciones sistemicas intravenosa, intrarrectal, intranasal y transdermica.
Se formo un complejo de peptido o protema (nanocuerpo pequeno) marcado fluorescentemente con Alexa 700 con partmulas NANOPEP-3. Se evaluo la biodistribucion del peptido/protema marcado fluorescentemente in vivo en ratones Balb6, 5 h despues de una unica administracion de 10 jg de peptido o protema en partmulas NANOPEP-3. Las administraciones intravenosa e intrarrectal del complejo NANOPEP-3/peptido o NANOPEP-3/protema permitieron la administracion del peptido en la mayona de los tejidos analizados, con una administracion significativa en el cerebro y los ganglios (Figuras 14 A-B). Para la protema, la administracion fue principalmente en el pulmon, hngado, rinon, cerebro y nodos linfaticos. Las administraciones intranasal e intratraqueal permitieron la administracion del peptido principalmente en el cerebro, pulmon, hngado, pancreas y rinon, y de la protema en el pulmon, hngado y cerebro. Finalmente, la administracion transdermica se limita a la administracion de peptido y la protema a traves y en piel y musculos, pero no en los otros tejidos (Figuras 14 C-D).
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REFERENCIAS
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Claims (21)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un peptido de penetracion celular que se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoacidos: X3X4X1X2X5X4X1X2X6X7X1X8X9X10X11X12X13 (SEQ ID No: 11), en donde X1 es F o W, X2 es F, W o Y, X3 es beta-A o S, X4 es K, R o L, X5 es E, R o S, X6 es R, T o S, X7 es E, R o S, Xa no es ni F ni W, X9 es P o R, X10 es R o L, X11 es K, W o R, X12 es R o F y X13 es R o K.
  2. 2. El peptido de penetracion celular de la reivindicacion 1, que se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoacidos X3X4WX2EX4WX2X6X7X1PRX11RX13 (SEQ ID No: 12), en donde X1 es F o W, X2 es F, W o Y, X3 es beta-A o S, X4 es K o R, X6 es T o R, X7 es E o R, X11 es R o K, y X13 es R o K.
  3. 3. El peptido de penetracion celular de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en donde la secuencia de aminoacidos se selecciona del grupo que consiste en:
    - X3KWFERWFREWPRKRR (SEQ ID No: 1)
    - X3KWWERWWREWPRKRK (SEQ ID No: 2)
    - X3RWWEKWWTRWPRKRK (SEQ ID No: 3), y
    - X3RWYEKWYTEFPRRRR (SEQ ID No: 4),
    en donde X3 es beta-A o S.
  4. 4. Un peptido de penetracion celular derivado de un peptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 por adicion de un aminoacido no natural entre los aminoacidos de las posiciones 2 y 3 de la SEQ ID No: 11 o la SEQ ID No: 12, por reemplazamiento del aminoacido de la posicion 10 (correspondiente a X7) de la SEQ ID No: 11 o la SEQ ID No: 12 por un aminoacido no natural, y por adicion de un enlace hidrocarbonado entre los dos aminoacidos no naturales.
  5. 5. El peptido de penetracion celular de la reivindicacion 4, que se caracteriza porque comprende la secuencia de aminoacidos X3KX14WWERWWRX7WPRKRK (SEQ ID No: 9), en donde X3 es una beta-alanina o una serina, X14 es un aminoacido no natural, X7 esta reemplazado por un aminoacido no natural, y existe un enlace hidrocarbonado entre los dos aminoacidos no naturales.
  6. 6. El peptido de penetracion celular de la reivindicacion 1, que se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoacidos: X3X4X1WX5X4X1WX6X7WX8X9X10WX12R (SEQ ID No: 13), en donde X1 es F o W, X3 es beta-A o S, X4 es K, R o L, X5 es R o S, X6 es R o S, X7 es R o S, Xa es F o W, X9 es R o P, X10 es L o R, y X12 es R o F.
  7. 7. El peptido de penetracion celular de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 6, en donde la secuencia de aminoacidos se selecciona del grupo que consiste en:
    - X3RWWRLWWRSWFRLWRR (SEQ ID No: 5)
    - X3LWWRRWWSRWWPRWRR (SEQ ID No: 6)
    - X3LWWSRWWRSWFRLWFR (SEQ ID No: 7), y
    - X3KFWSRFWRSWFRLWRR (SEQ ID No: 8),
    en donde X3 es beta-A o S.
  8. 8. Un peptido de penetracion celular derivado de un peptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1, 6 y 7 por reemplazamiento de los aminoacidos de la posicion 5 (correspondiente a X5) y 12 (correspondiente a Xa) de la SEQ ID No: 13 por aminoacidos no naturales, y por adicion de un enlace hidrocarbonado entre los dos aminoacidos no naturales.
  9. 9. El peptido de penetracion celular de la reivindicacion 8, que se caracteriza porque comprende la secuencia de aminoacidos X3RWWX5LWWRSWX8RLWRR (SEQ ID No: 10), en donde X3 es una beta alanina o una serina, y en donde X5 y Xa estan reemplazados por aminoacidos no naturales usados para la union de un enlace hidrocarbonado.
  10. 10. El peptido de penetracion celular de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que ademas comprende:
    - ligado covalentemente al extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos, una o varias entidades qmmicas seleccionadas del grupo que consiste en un acetilo, un acido graso, un colesterol, un poli-etilen glicol, una senal de localizacion nuclear, una senal de exportacion nuclear, un anticuerpo, un polisacarido y una molecula dirigida a diana; o
    - ligado covalentemente al extremo C-terminal de dicha secuencia de aminoacidos, uno o varios grupos seleccionados del grupo que consiste en una cisteamida, una cistema, un tiol, una amida, un acido nitriloaceitco sustituido opcionalmente, un carboxilo, un alquilo C1-C6 lineal o ramificado sustituido opcionalmente, una amina primaria o secundaria, un derivado osfdico, un lfpido, un fosfolfpido, un acido graso, un colesterol, un poli-etilen glicol, una senal de exportacion nuclear de localizacion nuclear, un anticuerpo, un polisacarido y una molecula dirigida a diana; o
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    - ligado covalentemente al extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos, una o varias entidades qmmicas seleccionadas del grupo que consiste en un acetilo, un acido graso, un colesterol, un poli-etilen glicol, una senal de localizacion nuclear, una senal de exportacion nuclear, un anticuerpo, un polisacarido y una molecula dirigida a diana, y ligado covalentemente al extremo C-terminal de dicha secuencia de aminoacidos, uno o varios grupos seleccionados del grupo que consiste en una cisteamida, una cistema, un tiol, una amida, un acido nitriloaceitco sustituido opcionalmente, un carboxilo, un alquilo C1-C6 lineal o ramificado sustituido opcionalmente, una amina primaria o secundaria, un derivado osfdico, un lfpido, un fosfolfpido, un acido graso, un colesterol, un poli-etilen glicol, una senal de exportacion nuclear de localizacion nuclear, un anticuerpo, un polisacarido y una molecula dirigida a diana.
  11. 11. Un complejo que comprende un peptido de penetracion celular segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y una carga seleccionada entre peptidos, protemas, analogos peptfdicos, oligonucleotidos no cargados electricamente, PNAs y moleculas hidrofobicas pequenas que incluyen aminoacidos, di- o tri-peptidos, daunomicina, Paclitaxel, doxorrubicina, AZT, porfirina, nucleosidos o nucleotidos marcados fluorescentemente, maghemita hidrofobica y colorantes fluorescentes.
  12. 12. Una nanopartfcula que comprende un nucleo que comprende una carga que forma un complejo con una primera entidad seleccionada del grupo que consiste en peptidos de penetracion celular, liposomas, estructuras policationicas y nanopartfculas de carbono, en donde dicho nucleo esta recubierto por un peptido de penetracion celular segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
  13. 13. La nanopartfcula de la reivindicacion 12, en donde dicha primera entidad es un peptido de penetracion celular seleccionado del grupo que consiste en VEPEP-6a (SEQ ID No: 29), VEPEP-6b (SeQ ID No: 30), VEPEP-6c (SEQ ID No: 31), VEPEP-6d (SEQ ID No: 32), VEPEP-6e (SEQ ID No: 33), VEPEP-6f (SEQ ID No: 34), VEPEP-9a1 (SEQ ID No: 35), VEPEP-9a2 (SEQ ID No: 36), VEPEP-9b1 (SEQ ID No: 37), VEPEP-9b2 (SEQ ID No: 38), VEPEP-9c1 (SEQ ID No: 39), VEPEP-9c2 (SEQ ID No: 40), CADY, MPG, PEP-1, PPTG1, estructura de poli Arginina y peptidos de penetracion celular segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
  14. 14. El complejo de la reivindicacion 11, o de la nanopartfcula de la reivindicacion 12 o 13, en donde el tamano del complejo o de la nanopartfcula esta entre 20 y 300 nm.
  15. 15. El complejo o nanopartfcula de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el peptido de penetracion celular segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 comprende un grupo poli-etilen glicol ligado covalentemente a su extremo N, y/o un grupo cisteamida ligado covalentemente a su extremo C.
  16. 16. El complejo o nanopartfcula de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde al menos parte de los peptidos de penetracion celular estan ligados a una molecula dirigida a diana.
  17. 17. El complejo o nanopartfcula de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, para uso como medicamento.
  18. 18. El complejo o nanopartfcula de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, para uso como marcador o como agente de obtencion de imagenes.
  19. 19. El complejo o nanopartfcula de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, para uso en el tratamiento de una enfermedad cerebral o una enfermedad de nodos linfaticos.
  20. 20. Una composicion terapeutica, cosmetica o diagnostica que comprende un complejo o una nanopartfcula segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16.
  21. 21. Un metodo para administrar una molecula a una celula in vitro, que comprende una etapa de poner dicha celula en contacto con un complejo o nanopartfcula segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, que comprende dicha molecula.
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