TW202136514A - 重組ｃｄｋｌ５蛋白、基因療法及生產方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用於CDKL5基因療法的組成物，以及重組CDKL5蛋白。此類CDKL5基因療法組成物和/或重組CDKL5蛋白可以摻入細胞穿透多肽和/或前導訊息多肽。還提供了生產此類基因療法組成物和重組CDKL5蛋白的方法，以及該基因療法組成物和重組CDKL5蛋白的藥物組成物、治療方法和用途。

Description

重組CDKL5蛋白、基因療法及生產方法
本發明總體上關於激酶缺乏障礙之治療，尤其關於用於治療關於CDKL5缺乏的障礙的新型重組蛋白和基因療法。
CDKL5係絲胺酸/蘇胺酸激酶，以前稱為STK9。最近，該基因的突變被發現與許多神經性障礙有關，例如智力遲鈍、溝通和運動能力喪失、嬰兒痙攣和癲癇發作、非典型Rett綜合征和X連鎖West綜合征。X連鎖基因細胞週期蛋白依賴性激酶樣5（CDKL5）的突變或缺失已被證明會導致癲癇性腦病，伴有早期發作的嚴重神經損傷和頑固性癲癇發作。
目前，醫學文獻中描述的年齡最大的患有CDKL5缺乏的患者已經達到41歲。許多其他患者年齡為十幾歲和二十幾歲，但是由於該疾病僅在最近15年才被發現，因此，大多數新診斷的患者係嬰幼兒。被診斷出患有CDKL5缺乏障礙的個體通常會出現神經發育延遲，並有癲癇發作的高風險，中位發病年齡為6週。一項針對111位受試者的研究發現，癲癇病患者中有85.6%的個體每天都會癲癇發作，平均每天發作6次。
目前的治療方法包括癲癇發作藥物、生酮飲食、迷走神經刺激和手術。通常投與的抗癲癇藥物包括氯巴佔、丙戊酸和托吡酯，在許多情況下，同時使用兩種或更多種藥物治療方案。個體似乎有一個「蜜月期」，在這期間，他們在開始使用新類型藥物後的一段時間內無癲癇發作，但最終會再次癲癇發作。觀察到的蜜月持續時間為2個月至7年，中位數為6個月。例如，該研究發現，111名受試者中目前有16名沒有癲癇發作，並且一名個體從未有過癲癇發作。
病理表現的確切機制尚不清楚。一些實驗數據表明，C端的某些無義突變會導致該蛋白組成性地定位於細胞核，而其他錯義突變在細胞質中高度存在。核定位訊號和核輸出訊號均已在該蛋白的C端被鑒定出。
一些突變酶變體導致磷酸化功能的部分或全部喪失，而其他突變和截短導致磷酸化能力的增加，表明功能喪失和功能獲得均可能是致病的。由酶活性喪失/功能獲得以及酶核定位與在細胞質中的停留所引起的相互作用和致病作用尚不清楚。對具有廣泛CDKL5突變並表現出臨床症狀的患者進行的分析表明，引起臨床症狀的突變更可能在C端或激酶活性結構域中發現，這表明CDKL5的激酶活性和蛋白轉運能力可能影響症狀的臨床表現。
因此，本發明的各個方面關於新的重組CDKL5蛋白和基因療法組成物，該蛋白和組成物可用於治療CDKL5介導的神經性障礙，例如CDKL5缺乏或者由CDKL5突變或缺乏引起的非典型Rett綜合征。本發明的其他方面關於生產此類重組CDKL5蛋白和基因療法組成物的方法，以及此類重組蛋白和基因療法組成物的藥物組成物、治療方法、以及用途。
本發明的一個方面關於包含基因療法遞送系統和編碼CDKL5多肽的CDKL5多核苷酸的組成物。在各種實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26具有至少98%的序列同一性。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26具有至少98%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多核苷酸與SEQ ID NO: 123具有至少90%的序列同一性。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少98%的序列同一性。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25具有至少98%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多核苷酸與SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147或1 SEQ ID NO: 149具有至少90%的序列同一性。
在一個或多個實施方式中，該基因療法遞送系統包含病毒載體、脂質體、脂質-核酸奈米粒子、外顯子和基因編輯系統中的一項或多項。在一個或多個實施方式中，該基因編輯系統包含規律間隔成簇短回文重複（CRISPR）相關蛋白9（CRISPR-Cas-9）、轉錄激活因數樣效應核酸酶（TALEN）或ZNF（鋅指蛋白）中的一項或多項。
在一個或多個實施方式中，該基因療法遞送系統包含病毒載體。在一個或多個實施方式中，該病毒載體包含腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、痘病毒載體或單純皰疹病毒載體中的一項或多項。在一個或多個實施方式中，該病毒載體包含與CDKL5多核苷酸可操作連接的病毒多核苷酸。在一個或多個實施方式中，該病毒載體包含至少一個反向末端重複（ITR）。
在一個或多個實施方式中，該組成物進一步包含SV40內含子、聚腺苷酸化訊號或穩定化元件中的一項或多項。
在一個或多個實施方式中，該方法進一步包括啟動子。在一個或多個實施方式中，該啟動子與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30具有至少90%的序列同一性。
在一個或多個實施方式中，該組成物進一步包含編碼細胞穿透多肽的多核苷酸。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有至少90%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，編碼該細胞穿透肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172或SEQ ID NO: 173具有至少90%的序列同一性。
在一個或多個實施方式中，該組成物進一步包含編碼前導訊息多肽的多核苷酸。在一個或多個實施方式中，該前導訊息多肽與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166或SEQ ID NO: 168具有至少90%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，編碼該前導訊息多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 155具有至少90%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，編碼該前導訊息多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 169具有至少90%的序列同一性。
本發明的另一個方面關於包含如本文該之組成物和藥學上可接受的載體的藥物配製物。
本發明的另一個方面關於治療CDKL5介導的神經性障礙的方法，該方法包括將如本文所述之組成物或配製物投與至對其有需要的患者。在一個或多個實施方式中，該組成物或配製物係鞘內、靜脈內、椎管內、側腦室內或實質內投與的。在一個或多個實施方式中，該CDKL5介導的神經性障礙係CDKL5缺乏或者由CDKL5突變或缺乏引起的非典型Rett綜合征中的一項或多項。
本發明的另一個方面關於一種治療CDKL5介導的神經性障礙的方法，該方法包括將本文所述之組成物或配製物投與至離體細胞，並將離體細胞投與至對其有需要的患者。在一個或多個實施方式中，離體細胞係鞘內、靜脈內、椎管內、側腦室內或實質內投與的。在一個或多個實施方式中，該CDKL5介導的神經性障礙係CDKL5缺乏或者由CDKL5突變或缺乏引起的非典型Rett綜合征中的一項或多項。
本發明的另一個方面關於新型CDKL5多肽。在各種實施方式中，該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25具有至少99%的序列同一性的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 13的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 14的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 15的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 16的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 17的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 18的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 19的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 20的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 21的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 22的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 23的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 24的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 25的序列。
本發明的另一個方面關於一種融合蛋白，該融合蛋白包含如本文所述之CDKL5多肽和可操作地偶聯至CDKL5多肽的前導訊息多肽。在一個或多個實施方式中，該前導訊息多肽與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 168具有至少90%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，該前導訊息多肽包含SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 168的序列。
本發明的另一個方面關於一種融合蛋白，該融合蛋白包含如本文所述之CDKL5多肽和可操作地偶聯至CDKL5多肽的細胞穿透多肽。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有至少90%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167的序列。在一個或多個實施方式中，該融合蛋白進一步包含前導訊息多肽。在一個或多個實施方式中，該前導訊息多肽與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 168具有至少90%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，該前導訊息多肽包含SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 168的序列。
在一個或多個實施方式中，該融合蛋白進一步包含一個或多個親和標籤、一個或多個蛋白酶切割位點或其組合。在一些實施方式中，該親和標籤包含MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep tag®、麩胱甘肽 S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）、HPC4或其組合中的一項或多項。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點對凝血酶、弗林蛋白酶、因數Xa、金屬蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶、HRV3C、TEV或其組合中的一項或多項敏感。
本發明的另一個方面關於一種藥物配製物，該藥物配製物包含如本文所述之CDKL5多肽或融合蛋白和藥學上可接受的載體。
本發明的另一個方面關於治療CDKL5介導的神經性障礙的方法，該方法包括將如本文所述之CDKL5多肽或融合蛋白或配製物投與至對其有需要的患者。在一個或多個實施方式中，該多肽或融合蛋白或配製物係鞘內、靜脈內、椎管內、側腦室內或實質內投與的。在一個或多個實施方式中，該CDKL5介導的神經性障礙係CDKL5缺乏或者由CDKL5突變或缺乏引起的非典型Rett綜合征中的一項或多項。
本發明的另一個方面關於生產如本文所述之CDKL5多肽或融合蛋白的方法。在各種實施方式中，該方法包括表現CDKL5多肽或融合蛋白並純化CDKL5多肽或融合蛋白。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽或融合蛋白在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、HeLa細胞、人胚腎（HEK）細胞或大腸桿菌（Escherichia coli ）細胞中表現。
本發明的另一個方面關於生產包含CDKL5多肽的蛋白的方法，該方法包括在昆蟲細胞中表現該蛋白並從該昆蟲細胞中純化該蛋白。在一個或多個實施方式中，該昆蟲細胞係Sf9細胞或BTI-Tn-5B1-4細胞。
在一個或多個實施方式中，該蛋白包括含有該CDKL5多肽和可操作地偶聯至該CDKL5多肽的細胞穿透多肽的融合蛋白。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽可操作地偶聯至該CDKL5多肽的N端。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽可操作地偶聯至該CDKL5多肽的C端。在一個或多個實施方式中，該融合蛋白進一步包含前導訊息多肽。
在一個或多個實施方式中，該融合蛋白進一步包含一個或多個親和標籤、一個或多個蛋白酶切割位點或其組合。在一些實施方式中，該親和標籤包含MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep tag®、麩胱甘肽 S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）、HPC4或其組合。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點對凝血酶、弗林蛋白酶、因數Xa、金屬蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶、HRV3C、TEV或其組合中的一項或多項敏感。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26具有至少98%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26具有至少98%的序列同一性。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少98%的序列同一性。
在描述本發明的若干示例性實施方式之前，應當理解，本發明不限於以下描述中列出的構建或方法步驟的細節。本發明能夠有其他的實施方式，並且能夠以不同的方式實施或進行。
令人驚訝地發現，當在各種宿主細胞系統中表現和分泌時，包含野生型CDKL5序列的蛋白具有顯著的N-連接糖基化。由於折疊和/或與結合伴侶的相互作用的改變，這種N-連接糖基化可能對酶功能產生負面影響。因此，本發明的各個方面關於包含具有一個或多個突變以去除N-連接糖基化位點的CDKL5多肽的重組蛋白。
此外，在不希望受到任何特定理論約束的情況下，據信保留功能活性的較短的CDKL5變體可提供相對於全長野生型CDKL5多肽的益處，特別是當摻入包含CDKL5多肽的融合蛋白中時。在一個或多個實施方式中，此類益處可包括在蛋白生產過程中宿主細胞的分泌改善、溶解度提高、跨越血腦屏障（BBB）的能力增強和/或穿透靶細胞的能力增強。
本發明的其他方面關於用於表現和分泌包含CDKL5多肽（例如，野生型CDKL5多肽，去除了一個或多個N-連接糖基化位點的CDKL5變體和/或較短的CDKL5變體）的重組蛋白的新細胞系統。
本發明的其他方面關於利用如本文所述之編碼CDKL5多肽的CDKL5多核苷酸以及基因療法遞送系統的基因療法組成物和方法。 定義
如本文所用，術語「CDKL5介導的神經性障礙」係指可藉由表現或過表現CDKL5蛋白來治療的任何疾病或障礙。
如本文所用，術語「CDKL5缺乏」係指蛋白的生物學功能的任何缺乏。該缺乏可以產生自編碼蛋白的DNA或DNA相關調節區中的任何DNA突變，或由於表觀遺傳DNA修飾的任何變化導致的蛋白功能的任何變化，包括但不限於DNA甲基化或組蛋白修飾，CDKL5蛋白的二級、三級或四級結構的任何變化，或CDKL5蛋白相比於野生型或正常受試者執行其生物學功能的能力的任何變化。該缺乏也可能包括CDKL5蛋白的缺少，例如功能完全的蛋白的無效突變或表現不足。
如本文所用，術語「由CDKL5突變或缺乏引起的非典型Rett綜合征」係指具有與Rett綜合征相似的臨床體征但由CDKL5突變或缺乏引起的Rett綜合征的非典型形式。
CDKL5缺乏、Rett綜合征或非典型Rett綜合征的症狀或標誌物包括但不限於癲癇發作、認知障礙、張力減退，以及自主神經、睡眠和胃腸道紊亂。
如本文所用，術語「基因療法遞送系統」係指可用於將外源目的基因遞送至靶細胞從而將在靶細胞中表現或過表現目的基因的任何系統。在一個或多個實施方式中，該靶細胞係患者體內細胞。在一個或多個實施方式中，該靶細胞係離體細胞，並且然後將該細胞投與至患者。
如本文中所使用，術語「載體」旨在係指與化合物一起投與的稀釋劑、助劑、賦形劑、或媒介物。適合的藥物載體係本領域已知的，並且在至少一個實施方式中，其描述於「雷明頓藥物科學」（"Remington's Pharmaceutical Sciences"），E. W.馬丁（E. W. Martin）著，第18版，或其他版本。
如本文中所使用，術語「酶替代療法」或「ERT」旨在代表將外源的、經純化的酶引入具有這種酶缺乏的個體中。投與的蛋白可以從自然來源或藉由重組表現而獲得。該術語也指將經純化的酶引入個體，該個體在其他情況下需要或受益於投與的經純化的酶。在至少一個實施方式中，此類個體患有酶缺乏。該引入的酶可以是在體外產生的經純化的重組酶，或從離體組織或體液例如像胎盤或動物奶，或從植物純化的蛋白。
如本文中所使用，術語「受試者」或「患者」旨在係指人或非人動物。在至少一個實施方式中，該受試者係哺乳動物。在至少一個實施方式中，該受試者係人。
如本文中所使用，該「治療有效劑量」和「有效量」旨在係指足夠導致受試者治療應答的基因療法組成物（例如，包含CDKL5多核苷酸的組成物）或重組蛋白（例如，CDKL5變體或融合蛋白）的量。治療應答可以是使用者（例如，臨床醫生）將會識別為對療法的有效回應的任何應答，包括本文所述和本領域已知的任何替代性臨床標記物或症狀。因此，在至少一個實施方式中，治療應答可以是CDKL5缺乏、Rett綜合征或非典型Rett綜合征（例如本領域已知的那些）的一個或多個症狀或標誌物的改善或抑制。 CDKL5蛋白的功能
人CDKL5基因由24個外顯子組成，其中前三個（外顯子1、1a和1b）未翻譯。
最初發現的人CDKL5變體係1030個胺基酸，分子量為115 kDa（CDKL5115 ）。另一個突出的變體CDKL5107 包含改變的C端區域，因為可變剪接組合了與CDKL5115 變體不同的外顯子。CDKL5107 （107 kDa）較短，因為它包含外顯子19的替代版本，並且不包含CDKL5115 變體中存在的外顯子20-21。已經發現hCDKL5107 mRNA在人腦中的豐度係hCDKL5115 轉錄本的37倍，而鼠CDKL5107 在鼠腦中的豐度係鼠CDKL5105 變體的160倍。與人CDKL5115 變體相比，人和鼠CDKL5107 同工型均展示更長的半衰期和抗降解性。
已使用Lox-Cre重組系統生成了CDKL5基因敲除小鼠模型，該等小鼠表現出社交互動中的自閉症樣缺陷、運動控制受損和恐懼記憶喪失的症狀（Wang等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 109(52), 21516-21521）。例如，基因敲除CDKL5小鼠具有運動協調能力降低的症狀，並在反復受到刺激時展示出記憶力減退和恐懼應答。該等變化使科學家們推測CDKL5激酶活性的喪失會導致神經元網路發育受損。以前的數據表明，CDKL5使甲基-CpG結合蛋白2（MeCP2）磷酸化，並且MeCP2中獨立的功能喪失突變導致Rett綜合征表型。CDKL5的其他底物包括Netrin G1配體（NGL-1）、Shootin1（SHTN1）、Mindbomb 1（MIB1）、DNA (胞嘧啶5)-甲基轉移酶1（DNMT1）、雙親蛋白1（AMPH1）、末端結合蛋白EB2、微管相關蛋白1S（MAP1S）和組蛋白脫乙醯基酶4（HDAC4）。儘管尚未確定CDKL5的確切作用，但該等數據表明CDKL5在下游靶標的磷酸化中起著作用，該等下游靶標對正確的神經元發育（包括MeCP2）至關重要。在人中，CDKL5中的突變與一種表型有關，該表型與Rett綜合征重疊，並且另外表現出早發性癲癇發作。雖然CDKL5 KO小鼠沒有表現出任何早發性癲癇發作症狀，但它們確實表現出運動缺陷、社交能力下降以及學習和記憶受損（Chen等人, a protein associated with Rett Syndrome, regulates neuronal morphogenesis via Rac1 signaling [與Rett綜合征相關的蛋白CDKL5藉由Rac1傳訊調控神經元形態發生], J Neurosci [神經科學雜誌]30: 12777-12786）。
在大鼠中發現兩種CDKL5同工型，一種標記為CDKL5a，另一種標記為CDKL5b。（Chen等人）。通常，除C端附近的最後100-150個胺基酸外，物種人、大鼠和小鼠的CDKL5基因均具有高度的序列保守性。westernblot數據顯示，這兩種變體在大鼠發育過程中都存在，而成年大鼠顯現主要表現一種變體。此外，CDKL5以可鑒定出的量存在於腦、肝和肺中。
CDKL5在細胞核中起作用，但也在培養的神經元樹突中被發現，表明可能存在替代細胞質作用。在培養的皮層神經元中，RNAi（RNA干擾）對CDKL5表現的下調抑制了神經突生長和樹突狀分枝化（分支），而CDKL5的過表現則具有相反的作用（Chen等人）。為了表徵CDKL5的細胞核和細胞質作用，在培養的皮層神經元RNAi模型中表現了具有核輸出序列（NES）的CDKL5a變體。該NES-CDKL5a變體對用於使野生型基因表現沈默的RNAi具有抗性，因此當僅在細胞質中表現時，可用於建模CDKL5a。在使用GFP標籤確認該CDKL5變體僅存在於細胞質中後，神經突的長度和神經突分支的數量均增加。當使用RNAi敲除內源性CDKL5表現時，觀察到的NES-GFP-CDKL5a部分挽救疾病表型的能力表明，CDKL5在細胞質中的表現係神經突發育和生長的重要因素。
CDKL5中的人突變與類似於Rett綜合征的表型有關，並且具有CDKL5突變的個體也出現早發性癲癇發作。這種癲癇發作不同於經典Rett綜合征表型，後者在Rett症狀發作之前有一個早期正常發育期。患有經典Rett綜合征（RTT）的患者直到6-18個月大時顯現都能正常發育，然後開始出現神經性症狀，包括語言和運動能力喪失。RTT大腦的屍體解剖顯示較小、較密集的神經元，運動和額葉皮層中的樹突較短，表明神經元發育受到損害。大多數經典RTT病例歸因於MECP2基因的突變，該基因係X連鎖基因，編碼與哺乳動物基因組中的CpG二核苷酸選擇性結合並藉由募集複合物調節轉錄的核蛋白。儘管所知甚少，但通常認為由MECP2中的突變引起的基因表現失調係Rett綜合征的根本原因。大約20%的經典Rett綜合征病例和60%-80%的其他Rett綜合征變體在MECP2中不攜帶突變，表明發病機理的另一種遺傳原因。最近，已在具有某些RTT變體和其他嚴重腦病的患者中鑒定出一些CDKL5突變，並且已證明CDKL5在體內和體外均可與MeCP2相互作用。除MeCP2以外，已顯示CDKL5與許多下游靶標（包括NGL-1）相互作用並使其磷酸化。磷酸化後，NGL-1與PSD95相互作用，並且對於樹突棘的正確起源和發育以及突觸形成至關重要（Ricciardi S等人「CDKL5 ensures excitatory synapse stability by reinforcing NGL-1-PSD95 interaction in the postsynaptic compartment and is impaired in patient iPSC-derived neurons. [CDKL5藉由增強突觸後室中NGL-1-PSD95的相互作用確保興奮性突觸的穩定性，並在患者iPSC衍生的神經元中受損]」Nat Cell Biol [自然細胞生物學] 14(9):911-923）。
還已經證明CDKL5可以使蛋白DNA甲基轉移酶1（DNMT1）磷酸化（Kameshita I等人, 「Cyclin-dependent kinase-like 5 binds and phosphorylates DNA methyltransferase 1. [細胞週期蛋白依賴性激酶樣5結合並磷酸化DNA甲基轉移酶1]」.Biochem Biophys Res Commun [生物化學與生物物理研究通訊] 377:1162-1167）。這種磷酸化導致DNMT1的激活，DNMT1係一種維持型甲基化蛋白，優先甲基化半甲基化的DNA。此過程可用於在DNA複製過程中維持DNA甲基化模式，以便新合成的子代DNA股能夠維持其所替換的親本股的甲基化模式。由於通常認為DNA甲基化係用以使基因表現沈默的表觀遺傳機制，因此DNMT1的這種維持功能對於跨細胞世代保存基因表現模式至關重要。
現有模型表明，CDKL5激酶結構域使GSK-3β磷酸化，並且GSK-3β的磷酸化導致其失活。因此，缺乏CDKL5活性的個體似乎表現出增加的GSK-3β活性。先前的研究已顯示，GSK-3β調節海馬神經發生，並且增加的GSK-3β活性嚴重損害了新生海馬神經元的樹突形態。此外，GSK-3β似乎充當著諸如神經元存活和成熟等關鍵發育事件的負調節因數。使用CDKL5 KO小鼠進行的一項研究展示，用GSK-3β抑製劑治療幾乎可以完全挽救CDKL5活性不足的小鼠的海馬發育和行為缺陷（Fuchs等人, 「Inhibition of GSK3β Rescues Hippocampal Development and Learning in a Mouse Model of CDKL5 Disorder. [抑制GSK3β可以挽救CDKL5障礙小鼠模型的海馬發育和學習]」Neurobiology of Disease [疾病的神經生物學] 82: 298-310。這種發育挽救似乎還持續到治療之後。 CDKL5107 多肽構建體
圖1A顯示了CDKL5107 的多肽圖譜。SEQ ID NO: 1提供了野生型全長人CDKL5107 同工型的胺基酸序列。CDKL5107 蛋白由960個胺基酸組成，激酶結構域包含在前約300個胺基酸中。960中的殘基42係位於激酶結構域內的關鍵賴胺酸殘基，在磷酸化反應過程中參與ATP結合，並且該殘基的突變通常導致激酶活性喪失（「激酶失活」）。另外，存在跨越殘基312-315（NLS1）和784-789（NLS2）的兩個核定位訊號，並且存在跨越殘基836-845的核輸出訊號（NES）。C端從殘基905跨越到960的胺基酸係CDKL5107 所特有的胺基酸，在CDKL5115 中不存在。CDKL5115 和CDKL5107 之間胺基酸殘基1-904係相同的。SEQ ID NO: 26提供了野生型全長人CDKL5115 同工型的胺基酸序列。
本發明的各種實施方式提供了新穎的CDKL5變體。圖1B和1C顯示了全長人CDKL5107 同工型（構建體1）和新型CDKL5構建體（命名為構建體2-12）的多肽。該等CDKL5構建體通常歸為兩類：C端缺失一些胺基酸的構建體（構建體2-7）和多肽鏈的中間缺失一些胺基酸的構建體（構建體8-12）。此外，在CDKL5在C端與另外的N端胺基酸序列融合的那些構建體中，CDKL5的初始甲硫胺酸被去除。在該等構建體中，該CDKL5多肽以第二個胺基酸賴胺酸開始。構建體1包含全長人CDKL5107 同工型的所有960個胺基酸。包含完整960個胺基酸鏈的前851個胺基酸的構建體2代表縮短的CDKL5多肽，其中去除了CDKL5107 和CDKL5115 之間不同的尾序列，但激酶結構域、核定位訊號（NLS1和NLS2）和核輸出訊號（NES）保持完整。構建體3進一步縮短，其中另外去除了核定位訊號（NLS2）和核輸出訊號（NES）。如圖1B和1C所示，構建體4-7甚至進一步縮短。構建體2-7均包含活性激酶結構域，而構建體3-7不包含該NLS2或NES序列。構建體7進一步縮短至NLS1序列。其餘的構建體（構建體8-12）在多肽鏈的中間部分均有缺失，同時保留了CDKL5107 特有的C端胺基酸。在該等構建體中，構建體12缺失NES和NLS2序列。SEQ ID NO: 1-12分別提供了構建體1-12的胺基酸序列。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。該CDKL5多肽可能含有相對於SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12的缺失、取代和/或插入，如具有相對於SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12所描述的胺基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽序列與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 26具有至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。該CDKL5多肽可能包含相對於SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26的缺失、取代和/或插入，如具有相對於SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26所描述的胺基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含一個或多個親和標籤。在一個或多個實施方式中，該親和標籤位於CDKL5多肽的N端或C端的一個或多個上。可添加到融合蛋白的標籤的實例包括但不限於表位標籤（例如MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep tag®、HPC4）、麩胱甘肽S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）及其組合。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含一個或多個蛋白酶切割位點。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點位於CDKL5多肽的N端或C端的一個或多個上。示例性蛋白酶切割位點包括但不限於對凝血酶、弗林蛋白酶、因數Xa、金屬蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶、HRV3C、TEV及其組合敏感的切割位點。
可以使用不同比對演算法和/或程式來計算兩個序列之間的同一性，包括可用作GCG序列分析包（威斯康辛大學，麥迪森市，威斯康辛州）的一部分的FASTA或BLAST，並且可以與例如，默認設置一起使用。例如，考慮與本文所述之特定多肽具有至少98%、98.5%、99%或99.5%同一性，並且較佳的是表現出基本相同功能的多肽，以及編碼此類多肽的多核苷酸。除非另有說明，相似性分數將基於BLOSUM62的使用。當使用BLASTP時，相似性百分比係基於BLASTP陽性得分，並且序列同一性百分比係基於BLASTP同一性得分。BLASTP「身份」顯示了高得分序列對中相同的總殘基的數量和分數；BLASTP「正」表示比對得分為正值並且彼此相似的殘基的數量和分數。本揭露考慮和涵蓋具有與本文揭露的胺基酸序列具有該等程度的同一性或相似性或任何中間程度的同一性或相似性的胺基酸序列。使用遺傳密碼推導出的相似多肽的多核苷酸序列，並且可以藉由常規手段（具體地藉由使用遺傳密碼來逆轉錄其胺基酸序列）獲得。
熟悉該項技術者可以容易地獲得編碼特定多肽序列的多核苷酸序列。可以使用市售產品，例如使用OptimumGeneTM 密碼子優化工具（金斯瑞公司（GenScript），皮斯卡塔韋，新澤西州），對此類多核苷酸序列進行密碼子優化以在靶細胞中表現。 CDKL5107 N-連接糖基化變體
本發明的各種實施方式提供具有一個或多個突變以從CDKL5多肽去除一個或多個N-連接糖基化位點的新型CDKL5變體。野生型人同工型CDKL5107 包含10個潛在的N-連接糖基化位點，而野生型人同工型CDKL5115 包含8個潛在的N-連接糖基化位點。該等糖基化位點之一包括TEY（Thr-Glu-Tyr）基序：NYTEY（Asn-Tyr-Thr-Glu-Tyr），因此糖基化位點之一位於激酶結構域中。這樣，Asn-Tyr-Thr-Glu-Tyr位點處的糖基化很可能會干擾Thr-Glu-Tyr基序的磷酸化。通常，除了X不能係His或Pro以外，在蛋白胺基酸序列中的Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列指示潛在的糖基化位點。因此，本發明的各種實施方式提供了具有被不同胺基酸例如麩醯胺酸（亦稱Gln或Q）殘基取代的一個或多個天冬醯胺（亦稱Asn或N）殘基的CDKL5多肽。選擇麩醯胺酸進行取代的一個潛在優勢係，這種胺基酸在結構上類似於天冬醯胺，而麩醯胺酸殘基中只存在一個額外的亞甲基單元。然而，其他胺基酸也可以用作該一個或多個天冬醯胺殘基的取代。可替代地，可以藉由將Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列中的第三個胺基酸改變為不是絲胺酸（亦稱S或Ser）或蘇胺酸（亦稱T或Thr）的另一個胺基酸和/或將第二個胺基酸改變為組胺酸（亦稱H或His）或脯胺酸（亦稱P或Pro）來改變糖基化位點。
本發明的實施方式還提供了編碼一個或多個Asn殘基被另一個胺基酸（例如Gln殘基）取代的CDKL5多肽的CDKL5多核苷酸。例如，一個或多個AAC、AAT或AAU序列（編碼Asn）可以被一個或多個CAA或CAG序列（編碼Gln）取代。再次，CDKL5多核苷酸中的其他改變可編碼糖基化位點的其他改變，例如用His或Pro取代第二個胺基酸和/或將第三胺基酸改變為非Ser或Thr的另一個胺基酸。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25具有至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。該CDKL5多肽可能含有相對於SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的缺失、取代和/或插入，如具有相對於SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25所描述的胺基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含一個或多個親和標籤。在一個或多個實施方式中，該親和標籤位於CDKL5多肽的N端或C端的一個或多個上。可添加到融合蛋白的標籤的實例包括但不限於表位標籤（例如MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep tag®、HPC4）、麩胱甘肽 S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）及其組合。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含一個或多個蛋白酶切割位點。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點位於CDKL5多肽的N端或C端的一個或多個上。示例性蛋白酶切割位點包括但不限於對凝血酶、弗林蛋白酶、因數Xa、金屬蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶、HRV3C、TEV及其組合敏感的切割位點。 細胞穿透肽（CPP）
多種病毒和細胞蛋白具有介導跨細胞膜轉運的鹼性多肽序列。跨細胞膜轉運的能力已成為跨膜遞送高分子量多肽的重要工具。短語「蛋白轉導結構域」（PTD）和「細胞穿透肽」（CPP）通常用於指可以穿越許多（如果不是全部）哺乳動物細胞的質膜的短肽（＜ 30個胺基酸）。在研究確定允許它們共同跨越質膜的結構域的特定特性之後，研究人員觀察到該等結構域含有大量的鹼性胺基酸殘基，例如賴胺酸和精胺酸。因此，細胞穿透肽分為兩類：第一類由含有賴胺酸殘基的兩親螺旋肽組成，其中賴胺酸殘基帶有正電荷，而第二類係富含精胺酸的肽。如果與難以遞送至細胞內靶標的其他蛋白組合使用，該等肽可能具有治療潛力。PTD的最常見實驗用途係TAT、穿膜肽（Antp）和其他多精胺酸肽。
迄今為止，TAT一直係PTD中最佳表徵的一種，已被成功地用於將短肽和寡核苷酸等小分子物質遞送到細胞間靶點。HIV-TAT（HIV轉錄反式激活因數）係含有86個胺基酸的蛋白，參與人1型免疫缺陷病毒（HIV-1）的複製，許多研究顯示TAT能夠藉由質膜轉運並到達細胞核以激活病毒基因組的轉錄。研究還顯示，當與幾種不同的蛋白偶聯時，TAT保留了其穿透特性。為了理解TAT蛋白的哪些區域對於轉運特性至關重要，已經進行了實驗，其中合成了不同長度的TAT肽片段，並評估了它們的穿透能力。（Lebleu等人「A Truncated HIV-1 TAT Protein Basic Domain Rapidly Translocates through the Plasma Membrane and Accumulates in the Cell Nucleus. [截短HIV-1 TAT蛋白鹼性結構域通過質膜快速轉運並在細胞核中積聚]」J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 1997, 272:16010-16017）。鹼性胺基酸區域已被確定為保留穿透特性的TAT的方面，並且進行了實驗，其中不含該鹼性胺基酸簇的TAT蛋白無法穿透細胞質膜。在某些情況下，較短序列的細胞穿透肽經過修飾，以防止在分泌過程中被內切蛋白酶（如弗林蛋白酶）切割。該等修飾將縮短的細胞穿透TAT胺基酸序列從YGRKKRRQRRR改變為YARKAARQARA，這種短肽稱為TATκ。
TAT跨質膜轉運的確切機制尚不確定。最近的研究探索了一種特殊類型的內吞作用參與TAT攝取的可能性，並且已經鑒定出一些對TAT穿透具有抗性的細胞系。由TAT遞送的特定貨物也可能在遞送效率中發揮作用。先前的研究數據表明，在變性條件下製備時，TAT融合蛋白具有更好的細胞攝取能力，因為由於結構上的限制，正確折疊的蛋白貨物可能需要更多的能量（Δ-G）才能跨越質膜。
細胞內蛋白伴侶重新折疊TAT貨物的能力可能會因要重新折疊的蛋白貨物的身份和大小而不同。在某些情況下，TAT融合蛋白在置於水性環境中時會沈澱，因此無法以變性方式製備，也無法在天然構象中保持很長時間的穩定。TAT融合蛋白的設計還必須針對要遞送的特定貨物進行定製。如果貨物蛋白在N端緊密結合並且TAT結構域也在N端發現，則TAT轉運結構域可能被埋在貨物蛋白中，並且轉導可能很差。
許多TAT貨物變體已成功地遞送到多種細胞類型中，包括原代培養細胞、轉化細胞和小鼠組織中存在的細胞。在培養物中，TAT融合蛋白通常容易擴散到細胞內外，導致非常迅速地建立均勻濃度。
許多藥物，例如酶、抗體、其他蛋白，或甚至載有藥物的載體顆粒，都需要在細胞內遞送，以在細胞質、細胞核或其他特定細胞器內部發揮其治療作用。因此，該等不同類型的大分子的遞送代表了生物製劑發展中的重大挑戰。現有數據表明，TAT可以藉由多種機制跨越質膜。
也已將TAT轉導結構域與酶超氧化物歧化酶（SOD）融合。（Torchilin, 「Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. [蛋白和肽治療劑的細胞內遞送]」Protein Therapeutics. [蛋白治療學雜誌]2008. 5(2-3):e95-e103）。這種融合蛋白被用來展示它可以跨細胞膜轉運，以便將SOD酶遞送到細胞內環境，因此，這種融合蛋白在治療酶缺乏障礙方面具有治療潛力，這種酶的缺乏會導致宿主細胞上活性氧類的大量積累和氧化應激。
TAT融合蛋白還被證明可以跨血腦屏障進行轉導。與神經保護蛋白Bcl-xL融合的TAT結構域能夠在培養中快速穿透細胞，當投與至患有腦缺血的小鼠時，融合蛋白在1-2小時內轉導腦細胞。轉導後，腦梗塞的大小呈劑量依賴性式減小（Cao, G.等人, 「In Vivo Delivery of a Bcl-xL Fusion Protein Containing the TAT Protein Transduction Domain Protects against Ischemic Brain Injury and Neuronal Apoptosis. [含TAT蛋白轉導結構域的Bcl-xL融合蛋白的體內遞送保護免於缺血性腦損傷和神經元凋亡]」J. Neurosci. [神經科學雜誌] 22, 5423, 2002）。
在各種實施方式中，本文所述之CDKL5變體可操作地連接至CPP，例如TAT、修飾的TAT（TATκ）、轉運肽、穿膜肽或P97。如本文所用，TAT可以指具有11個胺基酸的原始TAT肽（命名為TAT11）或可以指具有衍生自用於選殖的質粒的多接頭的另外16個N端胺基酸的TAT肽（命名為TAT28）。類似地，TATκ可以代表TAT11的修飾版本（命名為TATκ11）或TAT28的修飾版本（命名為TATκ28）。TATκ28可以進一步修飾（命名為TATκκ28）以去除潛在的其他弱弗林蛋白酶位點。CPP（TAT28、TATκ28、TAT11、TATκ11、轉運肽、穿膜肽、P97和TATκκ28）的胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO: 167中提供。
在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有至少90%的序列同一性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有至少95%的序列同一性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有100%的序列同一性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有至少90%的序列同一性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有至少95%的序列同一性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有100%的序列同一性。在各種實施方式中，該CPP不具有SEQ ID NO: 34的序列。
在各種實施方式中，該CPP可具有添加的N端甘胺酸。例如，如不添加，TATκ28和TAT28將具有穩定性較低的N端天冬胺酸殘基。向該序列添加N端甘胺酸可藉由N端規則增加蛋白穩定性。因此，在一些實施方式中，具有先導訊息多肽的任何融合蛋白可具有添加在先導訊息多肽的C端的甘胺酸，使得在切割先導訊息多肽時，融合蛋白的新N端將以甘胺酸開始。以類似的方式，缺少前導訊息多肽的那些融合蛋白也可以在N端甲硫胺酸和融合蛋白的其餘部分之間添加甘胺酸。同樣以類似的方式，具有除TAT28或TATκ28以外的CPP的那些融合蛋白也可以在前導訊息多肽和CPP之間添加甘胺酸。
在一個或多個實施方式中，該CPP可操作地偶聯至CDKL5多肽的N端。在一個或多個實施方式中，該CPP可操作地偶聯至CDKL5多肽的C端。
在一個或多個實施方式中，該CPP包含一個或多個親和標籤。在一個或多個實施方式中，該親和標籤位於CPP的N端或C端的一個或多個上。可添加到CPP的標籤的實例包括但不限於表位標籤（例如MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep tag®、HPC4）、麩胱甘肽 S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）及其組合。
在一個或多個實施方式中，該CPP包含一個或多個蛋白酶切割位點。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點位於CPP的N端或C端中的一個或多個上。示例性蛋白酶切割位點包括但不限於對凝血酶、弗林蛋白酶、因數Xa、金屬蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶、HRV3C、TEV及其組合敏感的切割位點。 包含CDKL5變體的融合蛋白
如上該，CDKL5變體可用於融合蛋白，如同樣含有CPP的蛋白。其他多肽也可摻入此類融合蛋白中，如用於增強蛋白分泌的先導訊息多肽或用於檢測和/或純化該融合蛋白的親和標籤，以及可用於連接功能性多肽的接頭多肽。
前導訊息多肽的實例包括但不限於人免疫球蛋白重鏈結合蛋白的修飾片段（修飾的BiP，例如SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 168）、鼠Igκ鏈前導多肽（SEQ ID NO: 42，例如來自賽默飛世爾公司載體的pSecTag2）或胰島素生長因數肽（IGF2）如野生型IFG2（SEQ ID NO: 156）或其變體（例如SEQ ID NO: 157-166）。修飾的BiP訊息多肽的實例包括美國專利號9,279,007中描述的那些，該專利藉由引用以其整體併入本文。修飾的BiP訊息多肽的其他實例包括mvBIP，其具有在mBiP中在賴胺酸之前添加的纈胺酸，如SEQ ID NO:168中所示。
在一個或多個實施方式中，該融合蛋白包含具有N端CPP的CDKL5多肽，視需要在N端CPP之前具有前導訊息多肽。在一個或多個實施方式中，該融合蛋白包含具有C端CPP的CDKL5多肽，視需要在CDKL5多肽之前具有前導訊息多肽。在一個或多個實施方式中，該融合蛋白包含前導訊號肽和不含CPP的CDKL5多肽。
可添加到融合蛋白的親和標籤的實例包括但不限於表位標籤（例如MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep tag®、HPC4）、麩胱甘肽 S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）及其組合。
融合蛋白的一些實施方式還可包含蛋白酶切割位點。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點位於親和標籤的N端。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點位於親和標籤的C端。示例性蛋白酶切割位點包括但不限於對凝血酶、弗林蛋白酶、因數Xa、金屬蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶、HRV3C、TEV及其組合敏感的切割位點。 蛋白生產方法
重組蛋白（例如CDKL5變體或融合蛋白）可以使用合適的載體在宿主細胞中表現和分泌。例如，可以使用哺乳動物細胞（例如，CHO、HeLa或HEK細胞）、昆蟲細胞（例如，Sf9或BTI-Tn-5B1-4）或細菌細胞（例如，大腸桿菌或遊海假交替單胞菌（P. haloplanktis ）TAC 125細胞）。示例性質粒在以下實施方式中描述，並在圖2A-2BK中顯示。熟悉該項技術者可選擇適於轉化、轉染或轉導細胞的替代載體以生產本文所述之CDKL5變體和融合蛋白。圖10顯示了在細菌、哺乳動物和昆蟲細胞表現系統中的相對CDKL5表現和產量。
表現和分泌後，可以使用標準技術從周圍細胞培養基中回收和純化重組蛋白。可替代地，可以直接從細胞而不是培養基中分離和純化重組蛋白。
在一些實施方式中，將該BTI-Tn-5B1-4細胞用於表現和純化CDKL5變體或融合蛋白。
為了裂解，可以將表現該CDKL變體或融合蛋白的細胞沈澱，隨後重懸於裂解緩衝液中。然後可以將重懸的細胞在空化室（cavitation chamber）中孵育，該空化室中充入約100 PSI至約2000 PSI的氮氣。可將重懸的細胞在充氣的空化室中孵育約5分鐘至約60分鐘。在一些實施方式中，該重懸的細胞可以在用氮氣充至750 PSI的空化室中孵育。在一些實施方式中，該重懸的細胞可以在充氣的空化室中孵育15分鐘。孵育後，來自空化室的流出物然後可轉移到冰上。可以在廢水中加入洗滌劑，隨後在冰上孵育約5分鐘至約60分鐘。在一些實施方式中，該洗滌劑以約0.1%（w/v）至約5%（w/v）的量添加。在一些實施方式中，該洗滌劑係Triton X-100。然後將含有洗滌劑的流出物超音波處理以裂解細胞。裂解後，可將可溶級分和不可溶級分分離。在一些實施方式中，該可溶級分和不可溶級分可藉由離心分離。可對可溶材料進行過濾。在一些實施方式中，該可溶材料可通過0.45 μm過濾器過濾。
為了純化該CDKL5變體或融合蛋白，然後對過濾的可溶物質進行純化。在一些實施方式中，該CDKL5變體或融合蛋白藉由層析技術純化。在一些實施方式中，該層析技術係親和層析。在一些實施方式中，該CDKL5變體或融合蛋白包含一個或多個親和標籤。在一些實施方式中，該親和標籤包括但不限於表位標籤（例如MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep tag®、HPC4）、麩胱甘肽 S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）及其組合。在一些實施方式中，該CDKL5變體或融合蛋白具有標籤Twin-Strep-tag®。在一些實施方式中，將該具有親和標籤的CDKL5變體或融合蛋白在純化樹脂上純化。在該CDKL5變體或具有Twin-Strep-tag®標籤的融合蛋白的一些實施方式中，該純化樹脂係strep-tactin樹脂。
該CDKL5變體或融合蛋白的一些實施方式還可包括一個或多個蛋白酶切割位點。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點位於CDKL5變體或融合蛋白的N端。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點位於CDKL5變體或融合蛋白的C端。在一些實施方式中，該蛋白酶切割位點位於CDKL5變體或融合蛋白的N端和C端。在一些實施方式中，當CDKL5變體或融合蛋白與純化樹脂結合時進行切割。在一些實施方式中，當CDKL5變體或具有Twin-Strep-tag®標籤的融合蛋白與strep-tactin樹脂結合時進行切割。 蛋白替代療法
在一個或多個實施方式中，可以向受試者投與CDKL5蛋白或變體或融合蛋白。在一些實施方式中，該受試者可以是人、家畜和農場動物，以及實驗室、動物園動物、體育運動動物或寵物動物，如狗、馬、貓、乳牛、綿羊、山羊、豬、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。在一些實施方式中，該受試者係人。
在一個或多個實施方式中，在從受試者分離的細胞中確定CDKL5蛋白或變體或融合蛋白的細胞攝取。在一些實施方式中，該細胞可以從大鼠分離。在一些實施方式中，該細胞可以是神經元細胞。在一些實施方式中，該細胞可以是胚胎原代皮層神經元。在一些實施方式中，該胚胎原代皮層神經元可以從大鼠中分離。在一些實施方式中，該細胞可以進行培養並與CDKL5蛋白或變體一起孵育一個持續時間。該持續時間可以是至少5分鐘、至少10分鐘、至少15分鐘、至少20分鐘、至少25分鐘、至少30分鐘、至少40分鐘、至少50分鐘或至少60分鐘。在一些實施方式中，該持續時間可以是5分鐘到24小時、15分鐘到24小時、30分鐘到24小時、1小時到24小時、4小時到24小時、8小時到24小時、12小時到24小時、5分鐘到12小時、15分鐘到12小時、30分鐘到12小時、1小時到12小時、2小時到12小時、4小時到12小時、6小時到12小時、8小時到12小時、10小時到12小時、5分鐘到6小時、15分鐘到6小時、30分鐘到6小時、1小時到6小時、1.5小時到6小時、2小時到6小時、2.5小時到6小時、3小時到6小時、4小時到6小時、5小時到6小時、5分鐘到4小時、15分鐘到4小時、30分鐘到4小時、1小時到4小時、1.5小時到4小時、2小時到4小時、2.5小時到4小時、3小時到4小時、5分鐘到2小時、15分鐘到2小時、30分鐘到2小時、1小時到2小時、1.5小時到2小時、5分鐘到1小時、15分鐘到1小時或30分鐘到1小時。 基因療法
本文所述之任何CDKL5多肽和/或融合蛋白可經由編碼所需CDKL5多肽和/或融合蛋白的適當多核苷酸（例如DNA或RNA）用於基因療法。
在各種實施方式中，藉由使用包含基因療法遞送系統和CDKL5多核苷酸的組成物來提供基因療法。示例性基因療法遞送系統包括但不限於病毒載體、脂質體、脂質-核酸奈米顆粒、外來體和基因編輯系統。例如，可以使用諸如規律間隔成簇短回文重複（CRISPR）相關蛋白9（CRISPR-Cas-9）、轉錄激活因數樣效應物核酸酶（TALEN）或ZNF（鋅指蛋白）之類的基因編輯系統將CDKL5多核苷酸插入宿主細胞的DNA中。
病毒載體包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒（AAV）載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、痘病毒載體或單純皰疹病毒載體。病毒載體通常利用病毒顆粒（病毒粒子），病毒顆粒包括外殼蛋白（衣殼）和包裹在衣殼中的一個或多個DNA或RNA序列（病毒多核苷酸）。例如，AAV載體通常包括一個或多個反向端重複（ITR）序列、複製（Rep）基因序列和衣殼（Cap）基因序列。ITR、Rep和Cap序列可以包括在同一質粒中（順式），或者可以在單獨的質粒中提供（反式）。衣殼可以衍生自與ITR序列相同的血清型，或者該AAV載體可以是利用ITR序列和衍生自不同AAV血清型的衣殼的雜合載體。示例性AAV血清型包括AAV 1、AAV 2、AAV 3、AAV 4、AAV 5、AAV 6、AAV 7、AAV 8、AAV 9、AAV10、AAV11、雜交血清型和合成血清型。SEQ ID NO: 27（L-ITR）和SEQ ID NO: 28（R-ITR）提供了一組示例性的ITR，該等ITR衍生自AAV2。
該病毒載體還可包括用於增加表現和/或穩定載體的其他元件，如啟動子（例如雜合CBA啟動子（CBh）和人突觸蛋白1啟動子（hSyn1）、聚腺苷酸化訊號（例如牛生長激素聚腺苷酸化訊號（bGHpolyA））、穩定元件（例如，土撥鼠肝炎病毒（WHP）轉錄後調控元件（WPRE））和/或SV40內含子。CBh和hSyn1的DNA序列分別在SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30中提供。
該基因療法遞送系統可以用於將CDKL5多核苷酸遞送至靶細胞，從而可以在靶細胞中表現CDKL5多肽（或包含該多肽的融合蛋白）。在各種實施方式中，該CDKL5多肽（例如野生型CDKL5多肽，去除了一個或多個N-連接糖基化位點的CDKL5變體和/或較短的CDKL5變體）（或包含該多肽的融合蛋白）在靶細胞中表現並在同一細胞中利用。在其他實施方式中，該CDKL5多肽（或包含該多肽的融合蛋白）在第一細胞中表現、分泌，然後穿透到第二細胞中。在此類實施方式中，可使用前導訊息多肽和/或細胞穿透來增強CDKL5多肽的分泌和/或穿透。在不希望受到任何特定理論約束的情況下，據信CDKL5多肽的分泌和穿透可用於增強基因療法相對於傳統基因療法方法的效果，而傳統的基因療法方法僅將DNA和RNA引入患者體內，因為基因療法中的轉導可能僅限於患者細胞的某一部分（例如，10%的靶標患者細胞成功地被DNA/RNA轉導）。藉由這種方式，成功轉導的細胞可用於針對轉導細胞和未成功轉導的相鄰細胞表現CDKL5多肽（或包含該多肽的融合蛋白）。 交叉校正
本發明的另一個方面可以包括交叉校正。基因療法可能無法有效地成功轉染所有缺陷細胞。在一個或多個實施方式中，可以藉由相鄰的成功轉染的細胞校正未轉染的細胞中的遺傳缺陷。例如，該CDKL5多肽或融合蛋白可以在成功轉染的細胞中表現，從該細胞分泌，並被未成功轉染的相鄰細胞吸收。該缺陷可由本文所述之任何基因療法方法，藉由合適的編碼所需的CDKL5多肽和/或融合蛋白的多核苷酸（例如DNA或RNA）進行交叉校正。本文所述之任何CDKL5多肽和/或融合蛋白均可用於交叉校正CDKL5相關的缺陷。
在一個或多個實施方式中，將CDKL5無效受試者用於確定融合蛋白誘導的交叉校正。在一些實施方式中，該受試者係小鼠。在一些實施方式中，可使用病毒載體校正CDKL5缺陷。在一個特定的實施方式中，使用AAV載體來校正CDKL5缺陷。在一個特定的實施方式中，該AAV載體包含AAV-PHP.B.CBH.BIP-TATκ28-CDKL5.SV40。在一個特定的實施方式中，包含校正基因的病毒載體以足以校正遺傳缺陷的劑量投與。在一些實施方式中，小鼠中足以校正遺傳缺陷的劑量在10 x e2 GC/小鼠至10 x e15 GC/小鼠的範圍內。在一些實施方式中，小鼠中足以校正遺傳缺陷的劑量可以是10 x e2 GC/小鼠、10 x e3 GC/小鼠、10 x e4 GC/小鼠、10 x e5 GC/小鼠、10 x e6 GC/小鼠、10 x e7 GC/小鼠、10 x e8 GC/小鼠、10 x e9 GC/小鼠、10 x e10 GC/小鼠、10 x e11 GC/小鼠、10 x e12 GC/小鼠、10 x e13 GC/小鼠、10 x e14 GC/小鼠或10 x e15 GC/小鼠。示例性投與途徑包括但不限於鞘內、靜脈內、腦池內、眶後、腹腔內、側腦室內或腦實質內投與。
在一個或多個實施方式中，可將該CDKL5無效小鼠分為治療組和對照組。根據投與途徑，每個組（治療組和對照組）可以進一步分為兩個亞組。如果需要，可以同時使用多於一種途徑。在一個或多個實施方式中，可以藉由腦室內（ICV）或眶後（RO）投與途徑對每個亞組投與AAV-PHP.B.CBH.BIP-TATκ28-CDKL5.SV40劑量。每個亞組接受的AAV-PHP.B.CBH.BIP-TATκ28-CDKL5.SV40劑量的量為10 x e8 GC/小鼠、10 x e9 GC/小鼠或10 x e10 GC/小鼠。投與後三個月，可以評估載體對行為終點的影響，並且可以對小鼠實施安樂死以進行轉基因表現分析。
對小鼠實施安樂死後，可以採集大腦的各個切面，包括但不限於矢狀切面。切片可以用DAPI、抗NeuN抗體、抗CDKL5 RNA抗體和抗CDKL5蛋白抗體進行免疫染色。該等切片可取自大腦新皮層、紋狀體、丘腦和海馬結構切片。
免疫染色圖像可使用Visiopharm軟體進行分析。免疫染色的細胞可分為六組：（1）DAPI染色以鑒定細胞；（2）NeuN染色以鑒定神經元；（3）具有CDKL5 mRNA和CDKL5蛋白的神經元；（4）具有CDKL5 mRNA的神經元；（5）交叉校正的神經元；以及（6）交叉校正的非神經元。圖像分析的結果可進一步進行交叉校正的神經元和非神經元的統計分析。 配製物、治療方法和使用
可以根據常規程序將基因療法組成物（例如，包含CDKL5多核苷酸）或蛋白替代療法組成物（例如，包含含有CDKL5變體或融合蛋白的重組蛋白）配製成適於向人投與的藥物組成物。例如，在一個或多個實施方式中，用於靜脈內投與的組成物係在無菌等滲水緩衝液中的溶液。必要時，該組成物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑以緩解注射部位的疼痛。通常，成分以單位劑型分開或混合在一起提供，例如，作為在氣密容器中的乾燥凍乾粉或無水濃縮物，氣密容器如指明活性劑的量的安瓿或小藥囊。在藉由輸注投與組成物時，可以用包含無菌藥用級的水、鹽水或右旋糖/水的輸液瓶進行分配。在藉由注射投與組成物時，可以提供無菌注射用水或鹽水的安瓿，這樣使得可以在投與前將該等成分混合。
基因療法組成物（例如，包含CDKL5多核苷酸）或蛋白替代療法組成物（例如，包含含有CDKL5變體或融合蛋白的重組蛋白）（或包含基因療法組成物或蛋白替代療法組成物的組成物或藥物）藉由適當的途徑投與。在一個或多個實施方式中，該基因療法組成物或蛋白替代療法組成物係靜脈內投與的。在其他實施方式中，該基因療法組成物或蛋白替代療法組成物藉由直接投與於靶組織來投與，例如投與於心臟或骨骼肌（例如，肌肉內；腦室內）或神經系統（例如，鞘內遞送-向腦或脊髓蛛網膜下的空間遞送）。如果需要，可以同時使用多於一種途徑。示例性投與途徑包括但不限於鞘內、靜脈內、腦池內、側腦室內或腦實質內投與。
該基因療法組成物（例如，包含CDKL5多核苷酸）或蛋白替代療法組成物（例如，包含含有CDKL5變體或融合蛋白的重組蛋白）（或包含此類基因療法組成物或蛋白替代療法的組成物或藥物）以治療有效量投與（例如，當以固定間隔投與時，足以治療疾病的劑量，如藉由改善與疾病相關的症狀、預防或延遲疾病的發生和/或減輕疾病症狀的嚴重性或降低頻率）。在治療疾病中治療有效量將取決於疾病影響的性質和程度。另外，可以視需要採用體外或體內測定來幫助鑒定最佳劑量範圍。待採用的確切劑量還取決於投與途徑和疾病的嚴重程度，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況來決定。有效劑量可以從源自體外或動物模型測試系統的劑量-應答曲線推算。
治療有效量的基因療法組成物（例如，包含CDKL5多核苷酸）或蛋白替代療法組成物（例如，包含含有CDKL5變體或融合蛋白的重組蛋白）（或包含此類基因療法組成物或蛋白替代療法的組成物或藥物）可以是根據疾病影響的性質和程度以固定間隔投與和/或持續投與。如本文中所使用，以「規律的間隔」投與表示，將該治療有效量定期地投與（如區別於一次性劑量）。單個個體的投與間隔不需要係固定的間隔，但是可以是隨時間變化的，其取決於該個體的需要。
基因療法組成物（例如，包含CDKL5多核苷酸）或蛋白替代療法組成物（例如，包含含有CDKL5變體或融合蛋白的重組蛋白）（或包含此類基因療法組成物或蛋白替代療法組成物的組成物或藥物）可製備以供以後使用，例如製備於單位劑量的小瓶或注射器中，或用於靜脈注射的瓶子或袋子中。可以將包含基因療法組成物（例如，包含CDKL5多核苷酸）或蛋白替代療法組成物（例如，包含含有CDKL5變體或融合蛋白的重組蛋白）（或包含此類基因療法組成物或蛋白替代療法組成物的組成物或藥劑）以及視需要賦形劑或其他活性成分如其他藥物的試劑盒封裝在包裝材料中，並且伴隨著用於治療需要治療的受試者（例如患有CDKL5缺乏、Rett綜合征或Rett綜合征變體的患者）的關於重組、稀釋或劑量的說明書。 實例 實例1-12 - CDKL5融合蛋白
圖2A-2BK顯示用於在適當細胞中表現融合蛋白的質粒，例如哺乳動物細胞（例如，CHO細胞或HEK細胞）、昆蟲細胞（例如，Sf9細胞）或細菌細胞（例如，大腸桿菌細胞）。該等蛋白具有SEQ ID NO: 43-105所示的胺基酸序列。包含CDKL5截短變體的SEQ ID NO: 49-59的融合蛋白的缺失或截短的編號相對於全長CDKL5107 多肽（1-960）。包含CDKL5糖基化變體的SEQ ID NO: 93-105的融合蛋白具有藉由Asn取代為Gln而改變的特定N-連接糖基化位點，例如「1-10NQ」表示所有10個N-連接糖基化位點都藉由Asn取代為Gln而改變，「2NQ」表示只有第二個N-連接糖基化位點藉由Asn取代為Gln而改變。另外，據預測某些N-連接糖基化位點比其他位點具有更高的糖基化可能性，因此首先研究了該等位點。基於此，所研究的前7個N-連接糖基化位點標記為位點1-7，並在胺基酸序列中以粗體表示，接下來所研究的3個N-連接糖基化位點標記為位點8-10，在胺基酸序列中以粗體和底線表示。因此，從N端到C端的N-連接糖基化位點的順序係1、2、3、8、4、9、10、5、6和7。相對於全長CDKL5-107多肽（1-960）的N-連接糖基化位點編號和基序序列如下：1 = Asn159，NLS；2 = Asn167，NYT；3 = Asn348，NLS；4 = Asn500，NLS；5 = Asn764，NIS；6 = Asn942，NRT；7 = Asn945，NRS；8 = Asn363，NES；9 = Asn731，NVS；10 = Asn748，NHS。
在CDKL5在C端與另外的N端胺基酸序列融合的那些構建體中，CDKL5的初始甲硫胺酸（胺基酸1）被去除。在該等構建體中，該CDKL5多肽以第二個胺基酸賴胺酸開始。儘管特別提及了N端胺基酸序列（例如N端CPP），但是本揭露還涵蓋了C端胺基酸序列（例如C端CPP）。
下表1匯總了圖2A-2BK和SEQ ID NO: 43-105中使用的縮寫： [表1]
特徵 描述
pOptiVec 用於CHO DG44細胞的表現載體，使用pCMV啟動子來高表現重組蛋白；來自賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific Inc.）
pEX-1 用於細菌細胞的表現載體，使用T7啟動子來高表現重組蛋白；來自奧利金科技公司（OriGene Technologies, Inc）
pT7CFE1 用於人細胞的表現載體，使用T7啟動子來高表現重組蛋白；來自賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific Inc.）
pVL1393 用於昆蟲細胞的表現載體，使用多角體啟動子來高表現重組蛋白；來自表現系統公司（Expression Systems, LLC）
pCMV增強子和啟動子 允許重組蛋白的高表現水平
Kozak共有 用於正確啟動翻譯
MBiP 修飾的BiP前導訊息多肽（來自美國專利號9,279,007；SEQ ID NO.20），用於重組蛋白的分泌； MKLSLVAAMLLLLSLVAAMLLLLSAARA
mvBIP 進一步修飾的BiP前導訊息多肽，包括賴胺酸之前的纈胺酸， MVKLSLVAAMLLLLSLVAAMLLLLSAARA
Igκ 用於分泌重組蛋白的鼠Igκ鏈前導多肽（來自賽默飛世爾公司載體；例如pSecTag2）；METDTLLLWVLLLWVPGSTG
TATκ28、TATκ28p、Tκ28p TATκ28肽， GDAAQPARRARRTKLAAYARKAARQARA
TATκκ28 TATκκ28肽， GDAAQPAARARRTKLAAYARKAARQARA
TAT28、TAT28p、TT28p TAT28肽， GDAAQPARRARRTKLAAYGRKKRRQRRR
TATκ11 TATκ11肽， YARKAARQARA
TAT11 TAT11肽， YGRKKRRQRRR
Antp 穿膜肽， RQIKIWFQNRRMKWKK
Transp 轉運肽， AGYLLGKINLKALAALAKKIL
P97 P97肽， DSSHAFTLDELR
G4S接頭 由4個甘胺酸和1個絲胺酸組成的短接頭
CDKL5(107) CDKL5_107 人CDKL5-107同工型
CDKL5(115) CDKL5_115 人CDKL5-115同工型
Δ###-### 指缺失###-###胺基酸以形成蛋白的截短形式
##-##NQ 指在##-## N-連接糖基化位點處將Asn取代為Gln
AMPH1 編碼人雙載蛋白1的基因
eGFP 編碼增強的綠色螢光蛋白的基因；允許使用抗GFP或螢光進行檢測
NLS 編碼核定位訊號的基因
GST 麩胱甘肽 S-轉移酶
切割前， P 切割前蛋白酶切割位點
TEV切割 TEV蛋白酶切割識別位點；允許在初步純化後去除3XFLAG-HIS標籤（或其他標籤）
3XFlagHis， FH 3XFLAG標籤，隨後係甘胺酸-丙胺酸-脯胺酸（短接頭）和6xHis標籤；Flag和His標籤允許檢測帶有抗Flag和抗His的融合蛋白並進行純化
EMCV IRES 腦心肌炎病毒的內部核糖體進入位點允許DHFR的帽獨立翻譯
DHFR 小家鼠（Mus musculus ，小鼠）DHFR可以對轉染的DG44細胞進行營養缺陷型選擇，並使用胺甲喋呤（Mtx）對穩定細胞系進行基因組擴增
HSV Tk polyA 單純皰疹病毒胸苷激酶聚腺苷酸化訊號允許實現mRNA的有效轉錄終止和聚腺苷酸化
pUC起點 pUC起點允許在大腸桿菌細胞中實現高拷貝數複製和生長
bla啟動子 胺苄青黴素（bla ）抗性基因的啟動子
Bla 胺苄青黴素抗性基因（β-內醯胺酶）
圖2A顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 43的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和全長人CDKL5107 同工型。
圖2B顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 44的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含鼠Igκ鏈前導多肽、TATκ28和全長人CDKL5107 同工型。
圖2C顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 45的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和全長人CDKL5115 同工型。
圖2D顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 46的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含鼠Igκ鏈前導多肽、TATκ28和全長人CDKL5115 同工型。
圖2E顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 47的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和全長人CDKL5107 同工型。
圖2F顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 48的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和全長人CDKL5107 同工型。
圖2G顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 49的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體2的CDKL5107 變體。
圖2H顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 50的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體3的CDKL5107 變體。
圖2I顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 51的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體4的CDKL5107 變體。
圖2J顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 52的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體5的CDKL5107 變體。
圖2K顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 53的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體6的CDKL5107 變體。
圖2L顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 54的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體7的CDKL5107 變體。
圖2M顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 55的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體8的CDKL5107 變體。
圖2N顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 56的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體9的CDKL5107 變體。
圖2O顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 57的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體10的CDKL5107 變體。
圖2P顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 58的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體11的CDKL5107 變體。
圖2Q顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 59的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體12的CDKL5107 變體。
圖2R顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 60的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT28和全長人CDKL5107 同工型。
圖2S顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 61的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和增強型綠色螢光蛋白（eGFP）。
圖2T顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 62的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含無CPP的eGFP。
圖2U顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 63的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含人雙載蛋白1（AMPH1）。
圖2V顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 64的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含人雙載蛋白1（AMPH1）。
圖2W顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 65的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ11和全長人CDKL5107 同工型。
圖2X顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 66的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含鼠Igκ鏈前導多肽、TATκ11和全長人CDKL5107 同工型。
圖2Y顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 67的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ11和無前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2Z顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 68的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ11和無前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AA顯示了用於在大腸桿菌細胞中表現SEQ ID NO: 69的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT11和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AB顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 70的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT11和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AC顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 71的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含穿膜肽CPP和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AD顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 72的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含轉運肽CPP和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AE顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 73的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT28和不含前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AF顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 74的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、P97 CPP和全長人CDKL5107 同工型。
圖2AG顯示了用於在人細胞中表現SEQ ID NO: 75的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含P97 CPP和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AH顯示了用於在人細胞中表現SEQ ID NO: 76的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AI顯示了用於在人細胞中表現SEQ ID NO: 77的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ11和無前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AJ顯示了用於在人細胞中表現SEQ ID NO: 78的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT28和不含前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AK顯示了用於在人細胞中表現SEQ ID NO: 79的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT11和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AL顯示了用於在人細胞中表現SEQ ID NO: 80的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含穿膜肽CPP和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AM顯示了用於在人細胞中表現SEQ ID NO: 81的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含轉運肽CPP和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AN顯示了用於在人細胞中表現SEQ ID NO: 82的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和全長人CDKL5115 同工型。
圖2AO顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 83的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AP顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 84的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ11和無前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AQ顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 85的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT28和不含前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AR顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 86的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT11和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AS顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 87的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含穿膜肽CPP和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AT顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 88的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含轉運肽CPP和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AU顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 89的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含P97 CPP和沒有前導訊息多肽的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AV顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 90的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含無CPP的eGFP。
圖2AW顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 91的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和eGFP。
圖2AX顯示了用於在昆蟲細胞中表現SEQ ID NO: 92的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含沒有前導訊息多肽或CPP的全長人CDKL5107 同工型。
圖2AY顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 93的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-7NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2AZ顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 94的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和2-7NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BA顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 95的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1,3-7NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BB顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 96的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-2,4-7NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BC顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 97的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-3,5-7NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BD顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 98的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-4,6-7NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BE顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 99的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-5,7NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BF顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 100的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-6NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BG顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 101的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和2NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BH顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 102的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-10NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BI顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 103的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-7,9-10NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BJ顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 104的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-8,10NQ CDKL5107 糖基化變體。
圖2BK顯示了用於在CHO細胞中表現SEQ ID NO: 105的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和1-9NQ CDKL5107 糖基化變體。
各種CDKL5融合蛋白在大腸桿菌、CHO、HEK和昆蟲細胞中表現，並使用HeLa細胞裂解物進行體外轉錄/翻譯，如下所進一步描述。 實例1 - CDKL5截短變體在大腸桿菌細胞中的表現
將TATκ28-CDKL5_107-FH的全長和截短選殖到pET載體pEX-1中，並轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中。將菌落純化的轉化體在LB + 100 µg/mL胺苄青黴素中於37°C培養至指數期。然後將培養物冷卻至20°C，並在有（或沒有）1 mM IPTG的情況下誘導16小時。收集細胞沈澱並在補充有1X完全蛋白酶抑製劑複合物（羅氏公司（Roche））的B-Per完全細菌蛋白提取液（賽默公司（Thermo））中裂解。在室溫下讓裂解進行30分鐘。藉由在4°C下以16,000 x g離心15分鐘，從裂解物中製備可溶級分。蛋白在SDS-PAGE上解析，轉移到硝酸纖維素膜上，用兔抗多組胺酸抗體（賽默公司）探測，並用螢光二抗檢測。
圖3A和3B所示的印跡證實了CDKL5截短變體的表現。在圖3A和3B中，無IPTG誘導的培養物係奇數泳道，有IPTG誘導的培養物係偶數泳道，在無IPTG誘導的泳道中沒有CDKL5融合蛋白表現，而在有IPTG誘導的泳道中有CDKL5融合蛋白表現。
對於圖3A，泳道鑒定如下： [表2]-圖3A的泳道鑒定
# 樣品名稱 AA 大小（差值） 泳道
1 pEX-1空 1,2
2 Tκ28p_107 1038 3,4
3 TT28p_107 1038 5,6
4 Δ853-960 -108 7,8
5 Δ745-960 -216 9,10
6 Δ637-960 -324 11,12
對於圖3B，泳道鑒定如下： [表3]-圖3B的泳道鑒定
# 樣品名稱 AA 大小（差值） 泳道
7 Δ529-960 -432 1,2
8 Δ421-960 -540 3,4
9 Δ315-960 -646 5,6
10 Δ315-420 -106 7,8
11 Δ315-528 -214 9,10
12 Δ315-636 -322 11,12
實例2-CDKL5融合蛋白在CHO細胞中的表現
使用8個質粒用Maxcyte STX電穿孔CHO-S細胞（20 x 10^6個細胞）：（1）pOptiVec空載體；2）TATκ28-CDKL5-107-3xFlagHis；3）TATκ11-CDKL5-107-3xFlagHis；4）TAT11-CDKL5-107-3xFlagHis；5）TAT28-CDKL5-107-3xFlagHis；6）ANTP-CDKL5-107-3xFlagHis；7）TRANSP-CDKL5-107-3xFlagHis和8）MBiP-TATκ28-CDKL5-107-3xFlagHis（編碼序列經過CHO密碼子優化）。在培養基中回收細胞，並培養一天。收穫細胞並裂解。對於每次轉染，將20 µg裂解物進行4%-12% BisTris SDS-PAGE，並使用iBlot2系統轉移到硝酸纖維素印跡上。將印跡在1xTBS-T中的5%牛奶中封閉。藉由與1 : 2000稀釋的兔抗His抗體一起孵育過夜，對印跡進行Western印跡分析。經過一系列洗滌後，將印跡與1 : 10000的抗兔IgG DyaLight 680二抗一起孵育。進行另外的洗滌。將印跡在Licor Odyssey掃描器上成像。圖4A所示的印跡證實了CDKL5融合蛋白的表現。 實例3 - CDKL5融合蛋白在HEK細胞中的表現
用FuGeneHD（24 μl FuGeneHD : 8 μg DNA比）和7個質粒轉染HEK293F細胞（8 x 10^6個細胞）：1）空pOptiVec；2）TATκ11-CDKL5_107-3xFlagHis；3）TAT11-CDKL5_107-3xFlagHis；4）TAT28-CDKL5_107-3xFlagHis；5）ANTP-CDKL5_107-3xFlagHis；6）TRANSP-CDKL5_107-3xFlagHis和7）TATκ28-CDKL5_107-3xFlagHis（編碼序列經過人密碼子優化）。孵育細胞並在轉染後2天收穫。裂解細胞，並對20 µg裂解物進行4%-12% BisTris SDS-PAGE，並使用iBlot2系統轉移到硝酸纖維素印跡上。將印跡在1xTBS-T中的5%牛奶中封閉。藉由與1 : 2000稀釋的兔抗His抗體一起孵育過夜，對印跡進行Western印跡分析。經過一系列洗滌後，將印跡與1 : 10000的抗兔IgG DyaLight 680二抗一起孵育。進行另外的洗滌。將印跡在Licor Odyssey掃描器上成像。圖4B所示的印跡證實了CDKL5融合蛋白的表現。 實例4 - CDKL5融合蛋白在CHO細胞中的胺甲喋呤擴增
用胺甲喋呤擴增法來擴增CDKL5融合蛋白在CHO-DG44細胞中的表現。將TATκ28-CDKL5_107-FH（無訊息序列）、Igκ-TATκ28-CDKL5_107-FH和mBiP-TATκ28-CDKL5_107-FH選殖到pOptiVec載體中，該載體提供了胺甲喋呤抗性的DHFR 基因。將該等質粒轉染到DG44細胞（缺乏dhfr ）中，並藉由在缺乏次黃嘌呤和胸苷的培養基中生長進行選擇。藉由依次在0.1、0.25、0.5和1 µM胺甲喋呤（MTX）中培養細胞，可以獲得抗胺甲喋呤的繼代培養物，使細胞在步驟之間恢復至70%的活力。將細胞沈澱在含75 mM NaCl，1% Triton X-100和1.5X蛋白酶抑製劑混合物（不含EDTA）（pH 7.4）的50 mM Tris-HCl中裂解。在LDS-PAGE上解析40 µg的總蛋白，將其轉移到硝酸纖維素膜上，用兔抗多組胺酸抗體（賽默公司）探測，並用螢光二抗檢測。
圖5所示的印跡展示，為了選擇更高拷貝數的DHFR變體::CDKL5，隨著胺甲喋呤濃度的增加，出現了基因重排的證據（除了mBiP構建體），並且只有mBiP版本的CDKL5水平升高。用107 kDa（CDKL5_107）和115 kDa（CDKL5_115）版本的CDKL5複製了該模式。此外，只有在mBiP構建體的情況下，顯現的CDKL5的形式才稍微更大。在不希望受到任何特定理論約束的情況下，據信TATκ28-CDKL5的胞質表現對細胞有毒性或減少細胞增殖。當缺少訊息序列或使用Igκ序列時，只有那些重排CDKL5序列、消除其表現的細胞才能被高水平的胺甲喋呤選擇。由mBiP訊息序列產生的較高品質形式與在分泌途徑中N-連接聚糖的添加相一致，而缺少這種具有Igκ訊息序列的較大形式則表明轉運效率較低。 實例5 - 分泌到培養基中和細胞裂解物中的CDKL5表現的比較
除了上面提到的DG44轉染的細胞系（無訊息序列的TATκ28-CDKL5_107-FH、Igκ-TATκ28-CDKL5_107-FH和mBiP-TATκ28-CDKL5_107-FH）之外，還比較了在黏附HEK293T細胞中穩定轉染的Igκ-TATκ28-eGFP-CDKL5_107-MH質粒在培養基中和在細胞裂解物中的CDKL5融合蛋白分泌。mBiP-TATκ28-CDKL5_107-FH細胞系以0 mM MTX和0.5 µM MTX繼代培養物二者為代表。在無血清生長兩天后，收集條件培養基並濃縮200倍。
將細胞沈澱在含75 mM NaCl，1% Triton X-100和1.5X蛋白酶抑製劑混合物（不含EDTA）（pH 7.4）的50 mM Tris-HCl中裂解。在LDS-PAGE上解析細胞裂解物或濃縮條件培養基，將其轉移到硝酸纖維素膜上，用兔抗多組胺酸抗體（賽默公司）探測，並用螢光二抗檢測。
圖6A和6B所示的印跡分別比較了各種訊息序列構建體中CDKL5的分泌和內部貯存。胺甲喋呤擴增的繼代培養物以星號指出 - Bip-TATκ-CDKL5*。胺甲喋呤擴增的mBiP構建體大大提高了表現的CDKL5的水平，並且大多數蛋白陷在細胞內。TATκ28-eGFP-CDKL5構建體僅提供約0.1 µg/L的CDKL5融合蛋白分泌量，而mBiP TATκ28-CDKL5構建體實現了約15 µg/L的CDKL5融合蛋白分泌量（增加150倍）。在相同的表現mBiP-TATκ28-CDKL5的細胞內，CDKL5融合蛋白佔總蛋白的0.1%（1 mg/g）。 實例6 - CDKL5融合蛋白和潛在底物的共表現
將同時含有TATκ28-CDKL5-FH（無訊息序列）和若干假定CDKL5底物（HOMER1、HDAC4、ARHGEF2、MAPRE2、AMPH1或SHANK1）之一或無蛋白伴侶的單一質粒（pCHO 1.0）暫態轉染到HEK293F細胞中。在培養5天后，收穫細胞並在50 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉、0.5% Triton-X100、1X完全蛋白酶抑製劑複合物、無EDTA（pH為7）中於4°C裂解30分鐘。藉由將裂解物在4°C下以16,000 x g離心15分鐘獲得可溶級分。藉由BCA測定確定可溶蛋白，並在SDS-PAGE上解析等量的樣品，轉移到硝酸纖維素膜上，用兔抗多組胺酸（賽默飛世爾公司）和小鼠抗CDKL5抗體（EMD密理博公司（EMD Millipore））進行探測，並用近紅外螢光二抗、抗兔IgG DyaLight 680和抗小鼠IgG DyaLight 800（細胞傳訊技術公司（Cell Signaling Technology））檢測。如圖7的印跡所示，AMPH1的共表現增加了可溶TATκ28-CDKL5的量，而ARHGEF2的共表現減少了可溶TATκ28-CDKL5的量。後者表明消除ARHGEF2表現可能會增加可溶TATκ28-CDKL5的量。 實例7 - CDKL5蛋白的體外轉錄/翻譯
將以下蛋白選殖到T7/EMCV-IRES質粒（pT7CFE1）中：eGFP、CDKL5_115和TAT28-CDKL5_107-FH。將純化的質粒DNA引入基於HeLa細胞的IVT試劑盒（賽默公司）中，以在30°C下進行5小時的非CAP依賴性聯合體外轉錄/翻譯。蛋白樣品在SDS-PAGE上解析，轉移到硝酸纖維素膜上，用兔抗多組胺酸（His）抗體（賽默公司）探測，並用螢光檢測二抗。圖8所示的印跡證實了CDKL5融合蛋白的表現。 實例8 - CDKL5蛋白的糖基化
對MBiP-TATκ28-CDKL5-107-3xFlagHis的進一步分析揭示，該融合蛋白在CHO-DG44和HEK293F細胞中表現時被糖基化。藉由電穿孔將質粒暫態轉染到CHO-DG44和HEK293F細胞中。裂解細胞沈澱，並藉由離心獲得可溶級分。將可溶級分在PNGase F緩衝液中變性，並與PNGase F一起孵育以除去N-連接聚糖。消化的樣品藉由SDS-PAGE解析，轉移到硝酸纖維素膜上，並用抗多組胺酸抗體進行免疫印跡。圖4A中的印跡展示，在用PNGase F處理之前在CHO-DG44細胞中表現時，包含野生型CDKL5107 同工型的融合蛋白被高度糖基化，而當在CHO-DG44細胞中表現時，N-連接糖基化位點的7個Asn殘基被Gln取代（1-7NQ）產生很少或沒有被糖基化的融合蛋白。另外的包含CDKL5糖基化變體1-4,6-7NQ；1-5,7NQ；1-6NQ；2NQ；2-7NQ；1,3-7NQ；1-2,4-7NQ和1-3,5-7NQ的融合蛋白在HEK293F細胞中表現，不處理或用PNGase F處理，如圖4B所示。該等包含其他糖基化變體的融合蛋白具有不同程度的糖基化，並且均比包含野生型CDKL5107 同工型的融合蛋白的糖基化程度低，因此顯示各種N-連接糖基化位點可以單獨進行糖基化。還發現包含野生型CDKL5115 同工型的融合蛋白被糖基化。 實例9 - CDKL5融合蛋白在昆蟲細胞中的表現
還研究了其他表現系統以改善表現，減少糖基化和/或增強純化。一種此種系統利用昆蟲細胞Sf9。為了保護TATκ28-CDKL5和其他CDKL5融合蛋白的N端，將GST標籤與N端基因融合，並藉由HRV3C蛋白酶位點與CDKL5融合蛋白的其餘部分分開。將另一個HRV3C蛋白酶位點添加到CDKL5蛋白的C端，以分離FLAG和多組胺酸（His）親和標籤。將Sf9細胞與線性化桿狀病毒（BV）DNA共轉染並轉移質粒：1）GST-P-TATκ28-eGFP-P-FH；2）GST-P-eGFP-P-FH；3）GST-P-TAT28-CDKL5_107-P-FH；4）GST-P-TATκ28-CDKL5_107-P-FH；5）GST-P-p97p-CDKL5_107-P-FH；6）GST-P-Antp-CDKL5_107-P-FH；7）GST-P-TAT11-CDKL5_107-P-FH和GST-P-Transp-CDKL5_107-P-FH（編碼序列經Sf9密碼子優化）。1 µg蛋白在複製的4%-12%的10孔NuPage凝膠上運行完。凝膠在175 V下運行90分鐘。使用iBLOT在20 v下將蛋白轉移到硝酸纖維素中，持續7分鐘。如圖5A和5B所示，用Sypro寶石紅總蛋白染色分析CDKL5融合蛋白的表現。 實例10 - GST-P-TATκ28-CDKL5蛋白的純化和切割
還純化了來自昆蟲細胞的CDKL5融合蛋白，以從細胞裂解物中分離出CDKL5蛋白。GST-P-TATκ28-CDKL5_107-P-FH蛋白在Sf900II培養基中作為懸浮培養物維持的High Five（BTI-Tn-5B1-4）細胞中表現。感染的細胞沈澱用補充有不含EDTA的1X HALT蛋白酶抑製劑混合物（賽默公司，78437）、1 mM 三2-羧乙基-膦（TCEP）和5 mM EDTA的50 mM NaPO4 、500 mM NaCl、10%甘油（pH為6）裂解，比率為每1億個細胞10 ml裂解緩衝液。使用Parr 4639細胞破碎儀在750PSI下藉由氮氣空化作用裂解15分鐘後，添加Triton X-100至0.5%。藉由以31,000 x g離心20分鐘使裂解物澄清。將可溶材料調節至350 mM NaCl，並施加到HiTrap SP Fast Flow樹脂（GE醫療集團（GE Healthcare），17-5157-01）上。用10個柱體積（CV）NaCl梯度350-2000 mM洗脫結合的蛋白。將CDKL5蛋白峰（525-1225 mM NaCl）用緩衝液交換至緩衝液B（50 mM NaPO4 、500 mM NaCl、10%甘油、無EDTA的1X HALT蛋白酶抑製劑混合物、1 mM TCEP，pH為8）中。將蛋白施加到已填充硫酸鎳並用緩衝液B預平衡的IMAC瓊脂糖凝膠6 FF樹脂（GE醫療集團，17-0921-09）上。用緩衝液B + 60 mM咪唑洗滌該樹脂。將該樹脂與40 U的HRV3C蛋白酶（密理博公司（Millipore），71493）一起在4°C下孵育過夜，以去除GST、FLAG和多組胺酸（His）親和標籤。在3小時和過夜後檢查裂解材料的等分試樣。用50 mM NaPO4、500 mM NaCl、10%甘油、1 mM TCEP + 1X HALT PI-EDTA + 0.5% Triton X-100 + 500 mM咪唑洗滌該樹脂以洗脫CDKL5。洗脫的蛋白缺少親和標籤，並且遷移藉由SDS-PAGE更快。
圖10A和10B顯示了Sypro寶石紅總蛋白染色的凝膠分析。圖11A顯示了與未感染的對照細胞相比，昆蟲細胞中GST-P-TATκ28-CDKL5_107-P-FH的表現以及IMAC樹脂上加標籤蛋白的回收。圖11B顯示了從IMAC樹脂上洗脫的蛋白切割前後的加標籤CDKL5蛋白。類似地，圖12A顯示了細胞裂解物中CDKL5融合蛋白和純化的融合蛋白的Sypro寶石紅染色凝膠。圖12B顯示了展示圖11A的CDKL5融合蛋白的HRV3C蛋白酶切割的Sypro寶石紅染色凝膠 實例11 - CDKL5蛋白在鹽溶液中的溶解度
藉由在50 mM磷酸鈉、500 mM NaCl、10%甘油、1 mM TCEP、1 mM EDTA、1 x HALT蛋白酶抑製劑混合物（pH 6.0）中在室溫下使用氮氣空化裂解15分鐘，釋放在HighFive細胞中藉由感染桿狀病毒表現的GST-P-TATκ28-CDKL5_107-P-FH。細胞破裂後，添加Triton X-100至0.5%，並在4°C下孵育30分鐘。藉由在室溫下以15,000 x g離心15分鐘，將裂解物分為可溶和不可溶級分。然後將可溶級分在以下條件下藉由稀釋至相同的最終體積進行進一步修飾： •       維持在500 mM NaCl •       降低至350 mM NaCl •       降低至250 mM NaCl •       （A）補充2%聚山梨醇酯-80，並降低至350 mM NaCl •       （B）補充50 mM精胺酸/50 mM麩醯胺酸，並降至350 mM NaCl •       （C）補充100 mM甜菜鹼，並降低至350 mM NaCl •       （D）補充100 mM甘胺酸，並降低至350 mM NaCl
在該條件下於室溫下孵育1小時後，藉由離心將溶液再次分離為可溶和不可溶級分。將不可溶級分重懸於等於可溶級分的體積中，並且在LDS-PAGE上解析可溶級分和不可溶級分，然後藉由考馬斯亮藍染色進行檢測。
圖13顯示CDKL5融合蛋白在高鹽濃度（例如，至少500mM NaCl）下可溶，並且低於500 mM的NaCl水平導致不可溶的CDKL5蛋白。CDKL5蛋白可以短暫暴露於低至350 mM的NaCl濃度，但會造成一定的損失。因此，本文所述之大多數純化步驟皆為在高鹽水平下進行的，但是這種高鹽水平可能與體內投與不相容。 實例12 - TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-HPC4蛋白的純化和切割
在本實例中，表現並純化了融合蛋白TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-HPC4。圖14A顯示了該融合蛋白的示意圖。該融合蛋白具有根據SEQ ID NO: 174的胺基酸序列。類似地，該融合蛋白具有根據SEQ ID NO: 175的核苷酸序列。圖14B顯示了融合蛋白表現、純化、藉由HRV3C蛋白酶的柱上消化以及回收的融合蛋白。圖15顯示了純化過程的Western印跡分析。在圖15A中，用抗strep抗體進行了Western印跡分析，結果表明在N端完全消化。相反，圖15B顯示了使用抗HPC4抗體的Western印跡分析，表明在C端消化不完全。圖16顯示了融合蛋白和His-HRV3C蛋白酶的IMAC/Ni樹脂純化。 實例13 - TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-TwinStrep蛋白的純化和切割
純化來自昆蟲細胞的CDKL5融合蛋白以從細胞裂解物中分離CDKL5蛋白。
在本實例中，該融合蛋白係TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-TwinStrep蛋白。該融合蛋白具有根據SEQ ID NO: 176的胺基酸序列。類似地，該融合蛋白具有根據SEQ ID NO: 177的核苷酸序列。圖17顯示了該融合蛋白的示意圖。該融合蛋白在High Five（BTI-Tn-5B1-4）細胞中表現。感染的細胞沈澱並貯存在-80°C下。
為了裂解，將細胞沈澱重懸於補充有不含EDTA的1X HALT蛋白酶抑製劑混合物（賽默公司，78437）的裂解緩衝液（50 mM Tris HCl、500 mM NaCl、10%甘油、1 mM EDTA，pH為8）中。使用Parr 4639細胞破碎儀在750PSI下藉由氮氣空化作用裂解15分鐘後，添加Triton X-100至0.5%。藉由以31,000 x g離心20分鐘使裂解物澄清。將澄清的裂解物收集到可溶級分中。
用裂解緩衝液洗滌不可溶沈澱。然後將洗滌的不可溶沈澱物重懸於2 ml的裂解緩衝液中並進行超音波處理。超音波處理後的可溶級分用於蛋白分析。使用BCA測定來測量蛋白濃度。使用NuPAGE來分析昆蟲細胞中的蛋白表現。在圖18中，開始和上樣分別顯示了總細胞蛋白和可溶級分。
為了從其他可溶蛋白中純化融合蛋白，使用了Strep-Tectin樹脂。將可溶級分上樣到預先平衡的Strep-Tectin柱上。使用His-HRV3C蛋白酶在Strep-Tectin柱上切割親和標籤。為了進行切割，將與Strep-Tectin結合的融合蛋白與His-HRV3C蛋白酶一起孵育約1小時。消化後，收集流通液和洗滌液。在圖18中，洗滌-2顯示了消化的融合蛋白。再重複一次消化過程。在圖18中，洗滌-3顯示了重複消化的融合蛋白。從重複的消化過程中收集流通液。將流通液和洗滌液一起彙集在裂解池中。在圖18中，脫硫生物素洗脫的級分顯示無未消化的融合蛋白。圖18A中的帝國藍染色凝膠分析和使用圖18B的抗strep抗體的Western印跡分析表明，融合蛋白在N端和C端被完全消化。
為了對消化的融合蛋白和His-HRV3C蛋白酶進行緩衝液交換，使用了HiPrep 26/20脫鹽柱（Cytiva 17-5087-01）。用緩衝液A（50 mM Bis-Tris、350 mM NaCl、10%（v/v）甘油，pH為6）預平衡層析柱。將含有His-HRV3C蛋白酶的融合蛋白上樣至柱中，並將各級分彙集到脫鹽池中。
為了從His-HRV3C蛋白酶中純化融合蛋白，使用了SP瓊脂糖凝膠捕獲柱。將脫鹽池應用於SP瓊脂糖凝膠捕獲物，該捕獲物已用緩衝液A預先平衡。將TATκ28-CDKL5蛋白用55%的緩衝液A和45%的緩衝液B（50 mM Bis-Tris、2000 mM NaCl、10%（v/v）甘油，pH為6）洗脫，以從純化的TATκ28-CDKL5蛋白級分中去除His-HVRc3。圖19顯示了使用SP瓊脂糖凝膠捕獲柱進行的純化過程。 實例14 - DIV14胚胎原代皮層神經元中純化的TATκ28-CDKL5蛋白的攝取
在本實例中，確定了在胚胎原代皮層神經元中CDKL5融合蛋白的攝取。從E15健康大鼠胚胎中分離出胚胎原代皮層神經元。將胚胎原代皮層神經元接種在聚-l-賴胺酸包被的玻璃蓋玻片上，並在體外維持14天（DIV14）。藉由親和標籤層析分析從桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統中純化重組TATκ28-CDKL5。藉由蛋白酶切割除去親和標籤，並進一步分離全長蛋白，並藉由陽離子交換層析濃縮。用10 μg/ml重組TATκ28-CDKL5處理培養的胚胎原代皮層神經元6小時。未處理的培養胚胎原代皮層神經元被用作陰性對照。將經處理或未處理的每個樣品在4% PFA中固定，在0.1%皂苷中透化，並使用抗MAP2、抗CDKL5和/或抗磷酸化（S222）EB2抗體染色。用DAPI對細胞進行複染色，並在Prolong Diamond抗褪色固定介質下固定在玻璃顯微鏡載玻片上。使用具有63倍油浸物鏡的Leica SP8點掃描雷射共聚焦顯微鏡對樣品成像。使用Leica Lightning軟體處理圖像，並使用ImageJ軟體進行合併和著色。使用ImageJ軟體對磷酸（S222）EB2訊號進行分析，並使用GraphPad Prism軟體進行繪圖。圖20A-20F顯示了DIV14胚胎原代皮層神經元中TATκ28-CDKL5的攝取。圖20A-20C顯示了用等體積的鹽水處理的陰性對照的圖像。圖20A顯示了在螢光顯微鏡下用抗DAPI和抗MAP2染色的大鼠DIV14胚胎原代皮層神經元的圖像。圖20B係圖20A的部分放大。圖20C顯示了圖20B，但是僅針對抗CDKL5蛋白螢光。圖20D-20F顯示了攝取實驗的結果，其中細胞用TATκ28-CDKL5處理。圖20D顯示了在螢光顯微鏡下用抗DAPI和抗MAP2染色的大鼠DIV14胚胎原代皮層神經元的圖像。圖20E係圖20D的部分放大。圖20F顯示了圖20E，但是僅針對抗CDKL5螢光。
在大鼠DIV7胚胎原代皮層神經元中也進行了類似的實驗，以將結果與大鼠DIV14胚胎原代皮層神經元進行比較。
圖21A-21F顯示了大鼠DIV7胚胎原代皮層神經元中TATκ28-CDKL5的攝取。圖21A-21C係用等體積的鹽水處理的陰性對照。圖21A顯示了在螢光顯微鏡下用抗DAPI、抗MAP2和抗CDKL5蛋白染色的大鼠DIV7胚胎原代皮層神經元的圖像。圖21B係圖21A的部分放大。圖21C顯示了圖21B，但是僅針對DAPI和抗CDKL5蛋白螢光。圖21D-21F顯示了攝取實驗的結果，其中細胞用TATκ28-CDKL5處理。圖21D顯示了在螢光顯微鏡下用抗DAPI、抗MAP2和抗CDKL5蛋白染色的大鼠DIV7胚胎原代皮層神經元的圖像。圖21E係圖21D的部分放大。圖21F顯示了圖21E，但是僅針對DAPI和抗CDKL5蛋白螢光。
類似地，圖22A-22F顯示了大鼠DIV14胚胎原代皮層神經元中TATκ28-CDKL5的攝取。圖22A-22C代表陰性對照的圖像。圖22A顯示了在螢光顯微鏡下用抗DAPI、抗MAP2和抗CDKL5蛋白染色的胚胎原代皮層神經元的圖像，圖22B係圖22A的部分放大。圖22C顯示了圖22B，但僅針對DAPI和抗CDKL5蛋白螢光。圖22D-22F顯示了攝取實驗的結果，其中細胞用TATκ28-CDKL5蛋白處理。圖22D顯示了在螢光顯微鏡下用抗DAPI、抗MAP2和抗CDKL5蛋白染色的大鼠DIV14胚胎原代皮層神經元的圖像。圖22E係圖22D的部分放大。圖22F顯示了圖22E，但僅針對DAPI和抗CDKL5蛋白螢光。 實例15 - DIV14胚胎原代皮層神經元中純化的TATκ28-CDKL5蛋白的時間依賴性攝取
為了進一步隨時間確定TATκ28-CDKL5，將培養的胚胎原代皮層神經元用10 µg/ml重組TATκ28-CDKL5處理15分鐘、30分鐘、2小時、6小時或24小時。在每個時間點，將處理過的蓋玻片在4% PFA中固定，在0.1%皂苷中透化，並使用抗MAP2、抗CDKL5和/或抗磷酸化（S222）EB2抗體染色。用DAPI對細胞進行複染色，並在Prolong Diamond抗褪色固定介質下固定在玻璃顯微鏡載玻片上。使用具有63倍油浸物鏡的Leica SP8點掃描雷射共聚焦顯微鏡對樣品成像。使用Leica Lightning軟體處理圖像，並使用ImageJ軟體進行合併和著色。圖23A-23J顯示了培養的胚胎原代皮層神經元對TATκ28-CDKL5蛋白的快速攝取。圖23A顯示了用抗DAPI、抗MAP2和抗CDKL5的陰性對照。圖23B-23E顯示分別在15、30、120和360分鐘用抗DAPI、抗MAP2和抗CDKL5染色的皮質神經元。圖23F顯示了圖23A的圖像，但是對抗CDKL5進行了過濾。同樣，圖23G-23J顯示了分別針對抗CDKL5過濾的圖23B-23E圖像。對圖23A-23J的分析表明，在皮層神經元中的TATκ28-CDKL5蛋白積累在至少6小時的時間段內逐漸增加了訊號強度的增加。使用ImageJ軟體對磷酸（S222）EB2訊號進行分析，並使用GraphPad Prism軟體進行繪圖。圖24觀察到攝取後磷酸（S222）EB2訊號強度的增加，這表明TATκ28-CDKL5在細胞內具有活性。
CDKL5蛋白被報導與PSD95在神經元中共定位。在一個特定的實施方式中，用15 μg/ml的TATκ28-CDKL5處理DIV14神經元2小時。然後將神經元用抗PSD95和抗CDKL5染色。圖25A和圖25B分別顯示了CDKL5與PSD95和突觸蛋白1的共定位。 實例16 - CDKL5向大鼠神經元的慢病毒遞送
圖26A-26E顯示以下病毒對原代cdkl5Δ 大鼠神經元的慢病毒遞送：未處理的（13A）、mBiP（12B）、p97（13C）、TATκ28（13D）和穿膜肽（13E）。用200 µl CPP-CKDL5慢病毒上清液處理細胞，並孵育24小時，感染複數（MOI）約為0.03。用ViraPower™慢病毒包裝混合物Invitrogen K487500完成慢病毒遞送的封裝。轉導後，將細胞在PFA中固定，在皂苷中透化，並用Ms抗βIII微管蛋白（紅色）、Shp抗CKDL5（綠色）和DAPI（藍色）標記；用63倍油鏡成像。該等圖像顯示了CDKL5融合蛋白沿神經突的定位。 實例17 - CDKL5 AAV構建體
SEQ ID NO: 106-121提供了CDKL5 AAV載體的示例性序列。
SEQ ID NO: 106提供了使用CBh啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現全長人CDKL5107 同工型的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 107提供了使用CBh啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現全長人CDKL5107 同工型的激酶失活版本的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 108提供了使用CBh啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現eGFP的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 109提供了使用CBh啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含NLS和eGFP的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 110提供了使用CBh啟動子和SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和全長人CDKL5107 同工型的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 111提供了使用CBh啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和全長人CDKL5107 同工型的激酶失活版本的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 112提供了使用CBh啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和eGFP的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 113提供了使用CBh啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28、NLS和eGFP的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 114提供了使用hSyn1啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現全長人CDKL5107 同工型的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 115提供了使用hSyn1啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現全長人CDKL5107 同工型的激酶失活版本的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 116提供了使用hSyn1啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現eGFP的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 117提供了使用hSyn1啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含NLS和eGFP的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 118提供了使用hSyn1啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和全長人CDKL5107 同工型的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 119提供了使用hSyn1啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和全長人CDKL5107 同工型的激酶失活版本的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 120提供了使用hSyn1啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和eGFP的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
SEQ ID NO: 121提供了使用hSyn1啟動子以及SEQ ID NO: 27的L-ITR和SEQ ID NO: 28的R-ITR來表現包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28、NLS和eGFP的融合蛋白的質粒的示例性序列。DNA序列經密碼子優化以在小鼠中表現。
將生成含有SEQ ID NO: 106-121的質粒並在小鼠中測試。將針對小鼠密碼子優化的相似質粒在小鼠中進行測試。
SEQ ID NO: 122提供了用於在人中表現融合蛋白而密碼子優化的示例性DNA序列。SEQ ID NO: 122編碼的融合蛋白包含修飾的BiP前導訊息多肽、TATκ28和全長人CDKL5107同工型。
SEQ ID NO: 123中提供了用於在人中表現全長人CDKL5107 同工型（但沒有起始甲硫胺酸密碼子或終止密碼子）而密碼子優化的示例性DNA序列。
熟悉該項技術者可以藉由缺失全長CDKL5107 同工型的DNA序列的相關部分來獲得用於本文描述的CDKL5截短變體的在人中表現的示例性DNA序列。
SEQ ID NO: 124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148中分別提供了用於在人中表現而密碼子優化的SEQ ID NO:93-105的糖基化變體融合蛋白的示例性DNA序列。
SEQ ID NO: 125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147和149中分別提供了用於在人中表現而密碼子優化（但不含起始蛋胺酸密碼子或終止密碼子）的SEQ ID NO:13-25的糖基化變體CDKL5多肽的示例性DNA序列。
SEQ ID NO: 150-154中分別提供了用於在人中表現而密碼子優化（但沒有起始甲硫胺酸密碼子或終止密碼子）的TATκ11、TATκ28、穿膜肽、轉運肽和P97的示例性DNA序列。SEQ ID NO: 170-173提供了使用不同密碼子優化工具關於在人中表現而密碼子優化（但沒有起始甲硫胺酸密碼子或終止密碼子）的TATκκ28的示例性DNA序列
SEQ ID NO: 155提供了用於在人中表現而密碼子優化（包括起始甲硫胺酸密碼子但無終止密碼子）的mBIP的示例性DNA序列。SEQ ID NO: 169提供了用於在人中表現而密碼子優化（包括起始甲硫胺酸密碼子但無終止密碼子）的mvBIP的示例性DNA序列。 實例18 - CDKL5交叉校正
在本實例中，將CDKL5無效小鼠用於確定BIP-TATκ28-CDKL5誘導的交叉校正。將CDKL5無效小鼠分為治療組和對照組。藉由腦室內（ICV）注射以10 x e9 GC/小鼠或10 x e10 GC/小鼠的劑量將AAV-PHP.B.CBH.BIP-TATκ28-CDKL5.SV40投與至治療組。向對照組小鼠投與PBS。投與後三個月，評估載體對行為終點的影響，並對小鼠實施安樂死以進行轉基因表現分析。
對小鼠實施安樂死後，取出大腦切片。將切片用DAPI、抗NeuN抗體、抗CDKL5 RNA核糖核酸探針和抗CDKL5蛋白抗體染色。圖27-29分別顯示了大腦紋狀體、丘腦和海馬結構區的抗NeuN抗體、抗CDKL5 RNA核糖核酸探針和抗CDKL5蛋白抗體染色的圖像。
使用Visiopharm軟體進行圖像分析，並將細胞分為六組：（1）DAPI染色以鑒定細胞；（2）NeuN染色以鑒定神經元；（3）具有CDKL5 mRNA和CDKL5蛋白的神經元；（4）具有CDKL5 mRNA的神經元；以及（5）交叉校正的神經元。圖30顯示了已鑒定的六個組的圖像。圖29A和29B代表來自對照組的免疫染色的腦切片的圖像，而圖29C和29D代表來自治療組的免疫染色的腦切片的圖像。圖29A和29C代表用DAPI、抗NeuN和抗CDKL5蛋白染色的腦切片的圖像。圖29B和29D代表用DAPI和抗CDKL5mRNA標記的腦切片的圖像。圖31顯示了已鑒定的交叉校正的細胞。圖32A顯示了矢狀切面中交叉校正的神經元的統計分析。圖32B顯示了矢狀切面的特定大腦區域（新皮層、紋狀體、丘腦和海馬結構）中交叉校正的神經元的統計分析。 實例19 - N端和C端CPP的比較
用於表現各種融合蛋白的示例性質粒如圖33所示。該質粒包含EF1a啟動子、多株位點（MCS）、IRES，隨後係嘌呤黴素抗性、核定位的GFP和奈米螢光素酶。IRES之後的蛋白由T2A跳躍肽分離。將針對表現下表4中提供的融合蛋白對質粒進行測試： [表4]
質粒編號 前導訊息多肽 N 端 CPP CDKL5 多肽 C 端 CPP 密碼子優化
1 mBIP TATκ28 CDKL5(107) 無 基因藝術公司（Gene Art）
2 mBIP TATκ11 CDKL5(107) 無 基因藝術公司
3 mBIP 轉運肽 CDKL5(107) 無 基因藝術公司
4 mBIP 穿膜肽 CDKL5(107) 無 基因藝術公司
5 mBIP 黑素轉鐵蛋白p97 CDKL5(107) 無 基因藝術公司
6 mBIP 無 CDKL5(107) TATκ28 基因藝術公司
7 mBIP 無 CDKL5(107) TATκ11 基因藝術公司
8 mBIP 無 CDKL5(107) 轉運肽 基因藝術公司
9 mBIP 無 CDKL5(107) 穿膜肽 基因藝術公司
10 mBIP 無 CDKL5(107) 黑素轉鐵蛋白p97 基因藝術公司
11 mBIP 無 CDKL5(107) 無 基因藝術公司
12 mBIP TATκ28 CDKL5(107) 無 金斯瑞公司
13 mBIP TATκ11 CDKL5(107) 無 金斯瑞公司
14 mBIP 轉運肽 CDKL5(107) 無 金斯瑞公司
15 mBIP 穿膜肽 CDKL5(107) 無 金斯瑞公司
16 mBIP 黑素轉鐵蛋白p97 CDKL5(107) 無 金斯瑞公司
17 mBIP 無 CDKL5(107) TATκ28 金斯瑞公司
18 mBIP 無 CDKL5(107) TATκ11 金斯瑞公司
19 mBIP 無 CDKL5(107) 轉運肽 金斯瑞公司
20 mBIP 無 CDKL5(107) 穿膜肽 金斯瑞公司
21 mBIP 無 CDKL5(107) 黑素轉鐵蛋白p97 金斯瑞公司
22 mBIP 無 CDKL5(107) 無 金斯瑞公司
23 mBIP TATκ28 CDKL5(107) 無 SnapGene
24 mBIP TATκ11 CDKL5(107) 無 SnapGene
25 mBIP 轉運肽 CDKL5(107) 無 SnapGene
26 mBIP 穿膜肽 CDKL5(107) 無 SnapGene
27 mBIP 黑素轉鐵蛋白p97 CDKL5(107) 無 SnapGene
28 mBIP 無 CDKL5(107) TATκ28 SnapGene
29 mBIP 無 CDKL5(107) TATκ11 SnapGene
30 mBIP 無 CDKL5(107) 轉運肽 SnapGene
31 mBIP 無 CDKL5(107) 穿膜肽 SnapGene
32 mBIP 無 CDKL5(107) 黑素轉鐵蛋白p97 SnapGene
33 mBIP 無 CDKL5(107) 無 SnapGene
34 mBIP TATκ28 CDKL5(107) 無 COOL
35 mBIP TATκ11 CDKL5(107) 無 COOL
36 mBIP 轉運肽 CDKL5(107) 無 COOL
37 mBIP 穿膜肽 CDKL5(107) 無 COOL
38 mBIP 黑素轉鐵蛋白p97 CDKL5(107) 無 COOL
39 mBIP 無 CDKL5(107) TATκ28 COOL
40 mBIP 無 CDKL5(107) TATκ11 COOL
41 mBIP 無 CDKL5(107) 轉運肽 COOL
42 mBIP 無 CDKL5(107) 穿膜肽 COOL
43 mBIP 無 CDKL5(107) 黑素轉鐵蛋白p97 COOL
44 mBIP 無 CDKL5(107) 無 COOL
45 mBIP 無 CDKL5(107) TATκκ28 基因藝術公司
46 mBIP 無 CDKL5(107) TATκκ28 金斯瑞公司
47 mBIP 無 CDKL5(107) TATκκ28 SnapGene
48 mBIP 無 CDKL5(107) TATκκ28 COOL
49 mvBIP TATκ28 CDKL5(107) 無 SnapGene
50 mvBIP 無 CDKL5(107) TATκ28 SnapGene
在整個說明書中對「一個實施方式」、「某些實施方式」、「不同實施方式」、「一個或多個實施方式」或「實施方式」的引用意味著與該實施方式相聯繫地描述的具體的特徵、結構、材料或特性被包括在本揭露內容的至少一個實施方式中。因此，在整個說明書的多個位置中出現的短語如「在一個或多個實施方式中」、「在某些實施方式中」、「在不同實施方式中」、「在一個實施方式中」或「在實施方式中」不一定係指本揭露內容的同一實施方式。此外，在一個或多個實施方式中，具體的特徵、結構、材料或特性能以任何合適的方式進行組合。
儘管本揭露內容已經參照具體實施方式提供了描述，但是應當理解該等實施方式僅僅說明本揭露內容的原理和應用。對熟悉該項技術者而言應當清楚的是，在不脫離本揭露內容的精神和範圍的情況下，可以對本揭露內容進行多種修改和變化。因此，意圖係本揭露內容包括在所附請求項及其等效物的範圍內的修改和變化。
無
本專利或申請檔含有至少一張彩色附圖。在請求並支付必要的費用後，官方將會提供帶有一幅或多幅彩色附圖的本專利或專利申請公開的副本。
[圖1A]顯示了CDKL5107 的多肽圖譜。該圖譜鑒定了多肽的重要特徵，包括ATP結合位點、激酶結構域和激酶活性位點、兩個核定位訊號和核輸出訊號。
[圖1B和1C]顯示了如下的圖，其描繪合成的CDKL5構建體變體（1B），並且圖例描述了多肽的長度；連同相關胺基酸缺失資訊，以描述如何合成構建體（1C）。
[圖2A-2BK]顯示用於在諸如CHO細胞、HEK細胞、Sf9或大腸桿菌細胞中表現各種CDKL5多肽和融合蛋白的示例性質粒。
[圖3A和3B]顯示了在大腸桿菌細胞中表現的各種CDKL5融合蛋白的Western印跡。圖4A和4B分別顯示了在CHO和HEK細胞中表現的各種CDKL5融合蛋白的Western印跡。
[圖4A]顯示了CDKL5變體在CHO細胞中的表現。圖4B顯示了CDKL5變體在HEK293F細胞中的表現。
[圖5]顯示了展示在CHO細胞中各種CDKL5融合蛋白的氨甲蝶呤擴增的Western印跡。
[圖6A和6B]分別顯示了展示培養基和細胞裂解物中各種CDKL5融合蛋白的表現和分泌的Western印跡。
[圖7]顯示了在HEK293F的細胞質中與幾種潛在的底物共表現的CDKL5融合蛋白的Western印跡。
[圖8]顯示了在基於HeLa的體外轉錄/翻譯系統中表現的各種CDKL5融合蛋白的Western印跡。
[圖9A和9B]分別顯示了展示在CHO和HEK細胞中表現的各種CDKL5融合蛋白的糖基化的Western印跡。
[圖10]顯示了CDKL5蛋白在細菌、哺乳動物和昆蟲細胞表現系統中的相對表現和產量的定量分析。
[圖11A和11B]顯示了在Sf9昆蟲細胞中表現的各種CDKL5融合蛋白的Sypro寶石紅染色凝膠。
[圖12A]顯示了細胞裂解物中CDKL5融合蛋白和純化的融合蛋白的Sypro寶石紅染色凝膠。
[圖12B]顯示了展示圖11A的CDKL5融合蛋白的HRV3C蛋白酶切割的Sypro寶石紅染色凝膠。
[圖13]顯示了展示CDKL5融合蛋白在各種鹽和賦形劑系統中的溶解度的考馬斯染色凝膠。
[圖14A]顯示了TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-HPC4蛋白的示意圖。
[圖14B]顯示了TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-HPC4蛋白的純化和切割。
[圖15]顯示了TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-HPC4蛋白純化和切割的Western印跡分析。圖15A顯示了使用抗strepII抗體的Western印跡分析。圖15B顯示了使用抗HPC4抗體的Western印跡分析。
[圖16]顯示了TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-HPC4蛋白的IMAC純化。
[圖17]顯示了TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-TwinStrep蛋白的示意圖。
[圖18A]顯示了TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-TwinStrep蛋白的純化和切割。圖18B顯示了TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-TwinStrep蛋白純化和切割的Western印跡分析。
[圖19]顯示了TwinStrep-HRV3C-TATκ28-CDKL5-HRV3C-FLAG-His-TwinStrep蛋白的陽離子交換層析純化。
[圖20]顯示了大鼠DIV14胚胎原代皮層神經元中TATκ28-CDKL5蛋白的攝取。
[圖21]顯示了大鼠DIV7胚胎原代皮層神經元中TATκ28-CDKL5蛋白的攝取。
[圖22]顯示了大鼠DIV14胚胎原代皮層神經元中TATκ28-CDKL5蛋白的攝取。
[圖23]顯示了DIV14胚胎原代皮層神經元中TATκ28-CDKL5蛋白的時間依賴性攝取。
[圖24]顯示了DIV14胚胎原代皮層神經元中TATκ28-CDKL5蛋白攝取隨時間的統計分析。
[圖25A]顯示了TATκ28-CDKL5蛋白與PSD95的共定位。圖25B顯示了TATκ28-CDKL5蛋白與突觸蛋白1的共定位。
[圖26A-26E]顯示了藉由慢病毒遞送各種CDKL5融合蛋白處理的大鼠神經元。
[圖27]顯示了紋狀體中BIP-TATκ28-CDKL5誘導的交叉校正。
[圖28]顯示了丘腦中BIP-TATκ28-CDKL5誘導的交叉校正。
[圖29]顯示了海馬結構中BIP-TATκ28-CDKL5誘導的交叉校正。
[圖30]顯示了DAPI染色細胞、神經元、具有BIP-TATκ28-CDKL5 mRNA和BIP-TATκ28-CDKL5蛋白的神經元、僅具有BIP-TATκ28-CDKL5 mRNA的神經元、交叉校正的神經元和交叉校正的非神經元的原始圖像和重疊圖像。
[圖31]顯示了使用visioopharm量化交叉校正的細胞。
[圖32A]顯示了矢狀切面中交叉校正的神經元的統計分析。圖32B顯示了在包括新皮層、紋狀體、丘腦和海馬結構的特定腦區中的交叉校正的神經元的統計分析。
[圖33]顯示了用於轉染本文所述融合蛋白的示例性質粒。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
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Claims (77)

  1. 一種組成物，該組成物包含： 基因療法遞送系統；以及 編碼CDKL5多肽的CDKL5多核苷酸，其中該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26具有至少98%的序列同一性。
  2. 如請求項1所述之組成物，其中該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26具有至少98%的序列同一性。
  3. 如請求項1或2所述之組成物，其中該CDKL5多核苷酸與SEQ ID NO: 123具有至少90%的序列同一性。
  4. 如請求項1所述之組成物，其中該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少98%的序列同一性。
  5. 如請求項1所述之組成物，其中該CDKL5多肽與SEQ ID: 13、SEQ ID: 14、SEQ ID: 15、SEQ ID: 16、SEQ ID: 17、SEQ ID: 18、SEQ ID: 19、SEQ ID: 20、SEQ ID: 21、SEQ ID: 22、SEQ ID: 23、SEQ ID: 24或SEQ ID: 25具有至少98%的序列同一性。
  6. 如請求項1或5所述之組成物，其中該CDKL5多核苷酸與SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147或1 SEQ ID NO: 149具有至少90%的序列同一性。
  7. 如請求項1-6中任一項所述之組成物，其中該基因療法遞送系統包含病毒載體、脂質體、脂質-核酸奈米粒子、外顯子和基因編輯系統中的一項或多項。
  8. 如請求項7所述之組成物，其中該基因編輯系統包含規律間隔成簇短回文重複（CRISPR）相關蛋白9（CRISPR-Cas-9）、轉錄啟動因數樣效應核酸酶（TALEN）或ZNF（鋅指蛋白）中的一項或多項。
  9. 如請求項1-7中任一項所述之組成物，其中該基因療法遞送系統包含病毒載體。
  10. 如請求項9所述之組成物，其中該病毒載體包含腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、痘病毒載體或單純皰疹病毒載體中的一項或多項。
  11. 如請求項9或10所述之組成物，其中該病毒載體包含與CDKL5多核苷酸可操作連接的病毒多核苷酸。
  12. 如請求項9-11中任一項所述之組成物，其中該病毒載體包含至少一個反向末端重複（ITR）。
  13. 如請求項9-12中任一項所述之組成物，該組成物進一步包含：SV40內含子、聚腺苷酸化訊號或穩定元件中的一項或多項。
  14. 如請求項9-13中任一項所述之組成物，該組成物進一步包含：啟動子。
  15. 如請求項14所述之組成物，其中該啟動子與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30具有至少90%的序列同一性。
  16. 如請求項1-15中任一項所述之組成物，該組成物進一步包含：編碼細胞穿透多肽的多核苷酸。
  17. 如請求項16所述之組成物，其中該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有至少90%的序列同一性。
  18. 如請求項16或17所述之組成物，其中編碼該細胞穿透肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172或SEQ ID NO: 173具有至少90%的序列同一性。
  19. 如請求項1-18中任一項所述之組成物，該組成物進一步包含：編碼前導訊息多肽的多核苷酸。
  20. 如請求項19所述之組成物，其中該前導訊息多肽與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166或SEQ ID NO: 168具有至少90%的序列同一性。
  21. 如請求項19或22所述之組成物，其中編碼該前導訊息多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 155或SEQ ID NO: 169具有至少90%的序列同一性。
  22. 一種藥物配製物，該藥物配製物包含如請求項1-21中任一項所述之組成物；以及藥學上可接受的載體。
  23. 一種治療CDKL5介導的神經性障礙的方法，該方法包括將如請求項1-21中任一項所述之組成物或如請求項22所述之配製物投與至對其有需要的患者。
  24. 如請求項23所述之方法，其中該組成物或配製物係鞘內、靜脈內、椎管內、側腦室內或實質內投與的。
  25. 如請求項23或24所述之方法，其中該CDKL5介導的神經性障礙係CDKL5缺乏或者由CDKL5突變或缺乏引起的非典型Rett綜合征中的一項或多項。
  26. 一種治療CDKL5介導的神經性障礙的方法，該方法包括將如請求項1-21中任一項所述之組成物或如請求項22所述之配製物投與至離體細胞，並將該離體細胞投與至對其有需要的患者。
  27. 如請求項26所述之方法，其中該離體細胞係鞘內、靜脈內、椎管內、側腦室內或實質內投與的。
  28. 如請求項26或27所述之方法，其中該CDKL5介導的神經性障礙係CDKL5缺乏或者由CDKL5突變或缺乏引起的非典型Rett綜合征中的一項或多項。
  29. 一種CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25具有至少99%序列同一性的序列。
  30. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的序列。
  31. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 13的序列。
  32. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 14的序列。
  33. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 15的序列。
  34. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 16的序列。
  35. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 17的序列。
  36. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 18的序列。
  37. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 19的序列。
  38. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 20的序列。
  39. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 21的序列。
  40. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 22的序列。
  41. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 23的序列。
  42. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 24的序列。
  43. 如請求項29所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含SEQ ID NO: 25的序列。
  44. 一種CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含具有相對於SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26的一個或多個突變以除去一個或多個N-連接糖基化位點的序列。
  45. 如請求項44所述之CDKL5多肽，其中該序列與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26具有至少99%的序列同一性。
  46. 如請求項44或45所述之CDKL5多肽，其中SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26的至少一個天冬醯胺殘基已被不同的胺基酸取代。
  47. 如請求項44-46中任一項所述之CDKL5多肽，其中SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26的至少一個天冬醯胺殘基已被麩醯胺酸取代。
  48. 如請求項44-47中任一項所述之CDKL5多肽，其中SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26的至少一個絲胺酸或蘇胺酸殘基已被不同的胺基酸取代。
  49. 如請求項44-48中任一項所述之CDKL5多肽，其中SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26的天冬醯胺-X-絲胺酸序列或天冬醯胺-X-蘇胺酸序列中的至少一個胺基酸已被脯胺酸或組胺酸取代。
  50. 一種融合蛋白，該融合蛋白包含如請求項29-49中任一項所述之CDKL5多肽和可操作地偶聯至該CDKL5多肽的前導訊息多肽。
  51. 如請求項50所述之融合蛋白，其中該前導訊息多肽與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 168具有至少90%的序列同一性。
  52. 如請求項50或51所述之融合蛋白，其中該前導訊息多肽包含SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 168的序列。
  53. 一種融合蛋白，該融合蛋白包含如請求項29-49中任一項所述之CDKL5多肽和可操作地偶聯至該CDKL5多肽的細胞穿透多肽。
  54. 如請求項53所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167具有至少90%的序列同一性。
  55. 如請求項353或54所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 167的序列。
  56. 如請求項53-55中任一項所述之融合蛋白，該融合蛋白進一步包含：前導訊息多肽。
  57. 如請求項56所述之融合蛋白，其中該前導訊息多肽與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 168具有至少90%的序列同一性。
  58. 如請求項57或58所述之融合蛋白，其中該前導訊息多肽包含SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 168的序列。
  59. 如請求項29-58中任一項所述之融合蛋白，該融合蛋白進一步包含：一個或多個親和標籤、一個或多個蛋白酶切割位點或其組合。
  60. 如請求項59所述之融合蛋白，其中該親和標籤包含MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep-tag®、麩胱甘肽 S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）、HPC4或其組合中的一項或多項。
  61. 如請求項59或60所述之融合蛋白，其中該蛋白酶切割位點對凝血酶、弗林蛋白酶、因數Xa、金屬蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶、HRV3C、TEV或其組合中的一項或多項敏感。
  62. 一種藥物配製物，該藥物配製物包含： 如請求項29-49中任一項所述之CDKL5多肽或如請求項50-61中任一項所述之融合蛋白；以及 藥學上可接受的載體。
  63. 一種治療CDKL5介導的神經性障礙的方法，該方法包括將如請求項29-49中任一項所述之CDKL5多肽、如請求項50-61中任一項所述之融合蛋白或如請求項62所述之配製物投與至對其有需要的患者。
  64. 如請求項63所述之方法，其中CDKL5多肽、該融合蛋白或該配製物係鞘內、靜脈內、椎管內、側腦室內或實質內投與的。
  65. 如請求項63或64所述之方法，其中該CDKL5介導的神經性障礙係CDKL5缺乏或者由CDKL5突變或缺乏引起的非典型Rett綜合征中的一項或多項。
  66. 一種生產如請求項29-49中任一項所述之CDKL5多肽或如請求項50-61中任一項所述之融合蛋白的方法，該方法包括： 表現該CDKL5多肽或該融合蛋白；以及 純化該CDKL5多肽或該融合蛋白。
  67. 如請求項66所述之方法，其中該CDKL5多肽或該融合蛋白在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、HeLa細胞、人胚腎（HEK）細胞、昆蟲細胞或大腸桿菌細胞中表現。
  68. 一種生產包含CDKL5多肽的蛋白的方法，該方法包括： 在昆蟲細胞中表現該蛋白；以及 從該昆蟲細胞中純化該蛋白。
  69. 如請求項68所述之方法，其中該昆蟲細胞係Sf9細胞或BTI-Tn-5B1-4細胞。
  70. 如請求項68或69所述之方法，其中該蛋白包括含有該CDKL5多肽和可操作地偶聯至該CDKL5多肽的細胞穿透多肽的融合蛋白。
  71. 如請求項70所述之方法，其中該融合蛋白進一步包含前導訊息多肽。
  72. 如請求項68-71中任一項所述之方法，其中該融合蛋白進一步包含親和標籤、一個或多個蛋白酶切割位點或其組合中的一項或多項。
  73. 如請求項72所述之方法，其中該親和標籤包含MYC、HA、V5、NE、StrepII、Twin-Strep-tag®、麩胱甘肽 S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®、多組胺酸（His）、HPC4或其組合中的一項或多項。
  74. 如請求項72或73所述之方法，其中該蛋白酶切割位點對凝血酶、弗林蛋白酶、因數Xa、金屬蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶、HRV3C、TEV或其組合中的一項或多項敏感。
  75. 如請求項68-74中任一項所述之方法，其中該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26具有至少98%的序列同一性。
  76. 如請求項68-75中任一項所述之方法，其中該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 26具有至少98%的序列同一性。
  77. 如請求項68-76中任一項所述之方法，其中該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少98%的序列同一性。
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