KR102671551B1 - 전구약물 전환 효소를 포함하는 개질된 미토콘드리아 및 이의 용도 - Google Patents

전구약물 전환 효소를 포함하는 개질된 미토콘드리아 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아 외막에 암세포 특이적 단백질에 결합하는 항체 및 사이토신 디아미네이즈를 포함하는 개질된 미토콘드리아에 관한 것이다. 본 발명에 의한 미토콘드리아를 5-FC와 함께 췌장암 세포주에 병용 처리 시, 5-FC 처리에 의한 세포 독성이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 상기 효과는 미토콘드리아 외막에 발현된 사이토신 디아미네이즈에 의해 5-FC가 5-FU로 변환되어 췌장암 세포의 세포자멸가 유도된 것임을 확인하였다. 따라서 본 발명의 개질된 미토콘드리아는 5-FC를 항암제로 사용하는 항암치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

Description

전구약물 전환 효소를 포함하는 개질된 미토콘드리아 및 이의 용도{MODIFIED MITOCHONDRIA COMPRISING PRODRUG CONVERTING ENZYME AND USE THEREOF}
본 발명은 전구약물 전환 효소가 미토콘드리아의 외막에 존재하는 개질된 미토콘드리아 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
전구약물 전환 효소(prodrug converting enzyme)는 인체에 무해하거나 독성이 약한 전구약물(prodrug)을 강한 세포독성을 지닌 약물(drug)로 전환시키는 기능이 있어 전구약물 투여시 그 효소 주변의 세포자살을 유도할 수 있는 효소이다. 이러한 전구약물 전환 효소 중 하나인 사이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase, CD)는 포유동물 세포에 무해한 전구약물인 5-플루오로사이토신(5-fluorocytosine, 5-FC)을 세포독성이 큰 약물인 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)로 전환시키는 기능이 있는 것으로 알려져 있다.
5-FU은 단백질 합성과 DNA 합성을 억제함을 통해 세포사멸을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 세포 내에서 5-FU는 세포 내 효소에 의해 5-FUTP로 변환되어, 세포 내에서 mRNA의 생합성을 억제함으로서 단백질의 생합성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한 5-FU는 세포 내 효소에 의해 5-fluoro-dUTP(5-FdUTP)의 형태로 변환되어 지는 것으로도 알려져 있는데, thymidylate synthase의 활성을 억제하여 dTTP의 결핍을 유도함으로써 DNA 복제를 억제하는 것으로 알려져 있다.
이러한 사이토신 디아미네이즈를 항암제로 사용하는 방법으로는 바이러스 유전자를 매개체로 하는 유전자 요법을 주로 많이 사용한다. 그러나, 운반 전달체로서 바이러스의 사용은 안전성의 문제가 있어 그 사용이 매우 제한적이다. 또 다른 방법으로는 암세포로의 homing 효과를 가지고 있는 중간엽줄기세포에 자살유전자인 사이토신 디아미네이즈를 발현시키고 중간엽줄기세포를 주입하는 방법을 사용하고 있다. 이 때 5-FC는 중간엽줄기세포 내에서 5-FU로 변환이 되고, 세포 밖으로 분비되어 주변에 인접한 암세포를 죽이는 주변인 효과(by-stander effect)를 지닌다(대한민국 공개특허공보 제10-2007-0036289호).
그러나 중간엽줄기세포에 의한 암세포로의 homing 효과는 매우 미약하여 세포독성의 문제점을 여전히 극복하기 어려운 단점이 있다.
KR 10-2007-0036289 A
본 발명은 미토콘드리아 외막에 암세포 특이적인 단백질에 결합하는 항체 및 전구약물 전환 효소를 결합시킴으로써 암세포 특이적으로 전구약물 전환 효소를 암세포 주변으로 운반하고, 전구약물을 투여함으로써 암 세포 특이적으로 항암제를 활성화 시켜 암을 치료할 수 있는 물질, 이를 이용한 암 치료용 조성물 및 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편 및 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편이 미토콘드리아 외막에 존재하는 개질된 미토콘드리아를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 종양관련항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편이 미토콘드리아 외막에 존재하는 개질된 미토콘드리아를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 개질된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 상기 개질된 미토콘드리아의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 개질된 미토콘드리아를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 개질된 미토콘드리아 및 전구약물을 포함하는 암 치료용 키트를 제공한다.
본 발명 따른 암세포 특이적인 단백질에 결합하는 항체 및 전구약물 전환 효소인 사이토신 디아미네이즈가 외막에 발현된 개질된 미토콘드리아를 5-FC와 함께 췌장암 세포에 처리 시, 개질되지 않은 미토콘드리아 처리군에 비하여 높은 세포 독성을 나타냈다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 전구약물 전환 효소를 포함하는 개질된 미토콘드리아는 5-FC를 항암제로 사용하는 항암 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 단편을 미토콘드리아에 융합된 형태로 발현시키기 위한 발현벡터(pCMV-yCD-myc-TOM7)를 도식한 도면이다.
도 2는 pCMV-yCD-myc-TOM7를 인간 태아 신장 세포주(HEK293)에 형질전환하여 세포 내에서 발현된 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 단편을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. Lane 1은 HEK293 세포, Lane 2는 공벡터 형질전환 세포(HEK293-EV) 및 Lane 3은 효모 유래 사이토신 디아미네이즈를 코딩하는 유전자가 적재된 벡터가 형질전환 세포(HEK293-CD)이다.
도 3은 5-FC(5-fluorucytosine) 및 5-FU(5-Fluoruacil)의 흡광도 314 nm에서 측정하여 각 농도별 흡광도를 표준곡선(standard curve)으로 나타낸 그래프이다.
도 4는 HEK293-CD 세포에서 발현된 사이토신 디아미네이즈가 5-FC를 5-FU로 전환시키는 효소 활성도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 HEK293 세포 및 사이토신 디아미네이즈를 코딩하는 유전자가 적재된 벡터가 형질전환된 HEK293-CD 세포에 항암제 5-FU의 전구물질인 5-FC를 처리한 후, 세포 형태 변화를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 HEK293 세포 및 사이토신 디아미네이즈를 코딩하는 유전자가 적재된 벡터가 형질전환된 HEK293-CD 세포에 항암제 5-FU의 전구물질인 5-FC를 처리한 후, 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 효모 유래 사이토신 디아미네이즈(yCD-myc-TOM7)를 안정적으로 발현하는 HEK293-CD 세포주(Stable cell line)를 선별하기 위하여 yCD-myc-TOM7의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 HEK293-CD 세포주에서 발현된 효모 유래 사이토신 디아미네이즈(yCD-myc-TOM7)가 세포 내 미토콘드리아와 같은 위치에 존재함을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 HEK293-CD 세포주에서 발현된 효모 유래 사이토신 디아미네이즈(yCD-myc-TOM7)의 세포 내 위치를 공초첨 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 인간 췌장암 세포주(AsPc-1, Capan-1, Capan-2 및 MIA Paca-2)에 MT 또는 효모 유래 사이토신 디아미네이즈가 결합된 개질된 미토콘드리아(MTyCD-myc-TOM7)를 주입시킨 후, 5-FC를 처리하여 암세포의 형태적 변화 및 세포 사멸을 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, MT는 HEK293 세포에서 분리한 효모 유래 사이토신 디아미네이즈가 결합되지 않은 미토콘드리아이다.
도 11은 인간 췌장암 세포주(AsPc-1, Capan-1, Capan-2 및 MIA Paca-2)에 MT 또는 MTyCD-myc-TOM7를 농도별로 주입시킨 후, 5-FC를 처리하여 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 인간 췌장암 세포주(AsPc-1, Capan-1, Capan-2 및 MIA Paca-2)에 MT 또는 MTyCD-myc-TOM7를 주입시킨 후, 5-FC를 농도별로 처리하여 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간 췌장암 세포주(AsPc-1, Capan-1, Capan-2 및 MIA Paca-2)에 MT 또는 MTyCD-myc-TOM7를 주입시킨 후, 5-FC를 처리하여 야기되는 세포사멸을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
융합 단백질
본 발명의 일 측면은 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편 및 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "전구약물(prodrug)"는 약물 그 자체로는 약효가 없거나 약하나 체내 흡수 시 효소적 또는 화학적 변화를 통하여, 약효를 갖는 활성대사체로 전환되는 약물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "전구약물 전환 효소(prodrug-conversion enzyme)"는 비독성의 전구약물을 독성이 있는 약물로 전환시키는 활성을 가지고 있는 효소를 의미한다. 상기 전구약물 전환 효소는 통상적으로 효소/전구약물 치료법에 사용된다.
본 발명에서 전구약물 전환 효소는 사이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase, CD), 카르복실 에스터라아제(carboxyl esterase, CE), 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-TK), 시토크롬 P450(Cytochrome P450, CYP450), 퓨린-뉴클레오사이드-인산화효소(purine-nucleoside-phosphorylase, PNP) 및 양고추냉이과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 전구약물을 독성이 있는 약물로 전환시키는 활성을 가지고 있는 효소라면 이에 제한된지 않는다.
본 발명에서 상기 전구약물 전환 효소는 천연형, 변이체 및 이들의 단편을 모두 포함한다. 상기 천연형은 각각의 천연형 전구약물 전환 효소의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 일반적으로 지칭하며, 상기 천연형 전구약물 전환 효소의 아미노산 서열이란 각각의 천연 발생 전구약물 전환 효소에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 또한, 천연형 전구약물 전환 효소와 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 효소를 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 서열로 구성될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 전구약물 전환 효소는 각각의 천연형 효소의 아미노산 서열과 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "전구약물 전환 효소 단편"은 각각의 효소에 있어서 N 말단, C 말단 또는 N 말단 및 C 말단의 일부가 결실된(truncated) 형태로 전구약물을 독성이 있는 약물로 전환시키는 효소활성을 가지고 있는 단편을 의미한다. 여기서 전구약물 전환 효소의 활성은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다. 이때, 상기 전구약물 전환 효소는 변이체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "변이체"는 상술한 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편의 일부가 치환된 형태를 의미하며, 전구약물을 독성이 있는 항암제로 활성화 시키는 기능을 가진다. 즉, 전구약물 전환 효소 변이체는 천연형 전구약물 전환 효소와 다른 서열을 가질 수 있는 것으로, 전구약물을 활성화 시키는 기능을 보유한 효소를 의미한다. 여기서 전구약물 활성화 시키는 효소 활성은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 전구약물 전환 효소는 사이토신 디아미네이즈일 수 있다. 상기 사이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase, CD)는 사이토신을 기질로 하여 아미노기를 가수분해함으로써 우라실(uracil)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 사이토신 디아미나아제는 무독성의 전구약물인 5-플루오로사이토신(5-fluorocytosine, 5-FC)을 반응물로 탈아미노기 반응에 의해 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)을 생성하고, 생성된 5-FU는 DNA의 합성을 저해함으로써 빠르게 세포 분열하는 암세포에 특이적 독성을 나타낸다. 본 발명의 사이토신 디아미네이즈는 효모 유래(서열번호 1) 또는 박테리아 유래(서열번호 2)일 수 있다. 바람직하게는 효모 유래의 사이토신 디아미네이즈일 수 있다.
상기 사이토신 디아미네이즈에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 일 구체예로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 사이토신 디아미네이즈는 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 사이토신 디아미네이즈는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 사이토신 디아미네이즈는 변이체 및 이의 단편을 포함한다. 여기서 변이체 및 단편은 상술한 바와 동일하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막 단백질"은 생물학적인 막의 일부분이거나 생물학적인 막과 상호작용하는 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 막 단백질은 막의 일부분이거나 막에 영구적으로 부착된 내재성 막 단백질 및 일시적으로 인지질 이중층 또는 다른 내재성 막 단백질에 부착되는 외재성 막 단백질을 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "미토콘드리아 외막 단백질"은 미토콘드리아의 외막에 위치할 수 있는 단백질을 의미한다. "미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질"은 미토콘드리아의 외막에 존재하는 단백질의 N 말단 또는 C 말단을 포함하는 단백질로, 미토콘드리아의 외막에 특이적으로 위치하게 하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이때, 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 본 발명에서 개시된 융합 단백질이 미토콘드리아의 외막에 부착되어 있을 수 있도록 한다. 그뿐 아니라, 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 본 발명에서 개시된 융합 단백질이 미토콘드리아의 내부로 들어가지 않도록 한다.
상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 진핵 세포 내에 존재하는 미토콘드리아에 존재하는 단백질에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 효모, 동물세포, 또는 인간세포 내에 존재하는 미토콘드리아 외막에 존재하는 단백질에서 선택될 수 있다.
상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질의 일 구체예로는 TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 N 말단 또는 C 말단을 포함하는 단백질일 수 있다.
특히, 상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질이 TOM20, TOM70 및 OM45로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 경우에는, TOM20, TOM70 또는 OM45의 N 말단 영역을 포함할 수 있다. 상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질의 일 구체예로는 서열번호 8로 표시되는 효모 유래의 TOM70이거나, 서열번호 9로 표시되는 인간 유래의 TOM70일 수 있다. 또 다른 구체예로는 서열번호 10으로 표시되는 효모 유래의 TOM20이거나, 서열번호 11로 표시되는 인간 유래의 TOM20일 수 있다. 또 다른 구체예로는 서열번호 12로 표시되는 효모 유래의 OM45일 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질이 TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 경우에는, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 C 말단 영역을 포함할 수 있다. 상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질의 일 구체예로는 서열번호 13으로 표시되는 효모 유래의 TOM5이거나, 서열번호 14로 표시되는 인간 유래의 TOM5일 수 있다. 또 다른 구체예로는 서열번호 15로 표시되는 효모 유래의 TOM7이거나, 서열번호 16으로 표시되는 인간 유래의 TOM7일 수 있다. 또 다른 구체예로는 서열번호 17로 표시되는 효모 유래의 TOM22이거나, 서열번호 18로 표시되는 인간 유래의 TOM22일 수 있다. 또 다른 구체예로는 서열번호 19로 표시되는 효모 유래의 Fis1이거나, 서열번호 20으로 표시되는 인간 유래의 Fis1일 수 있다. 또 다른 구체예로는 서열번호 21로 표시되는 인간 유래의 Bcl-2 alpha일 수 있다. 또 다른 구체예로는 서열번호 22로 표시되는 효모 유래의 VAMP1이거나, 서열번호 23으로 표시되는 인간 유래의 VAMP1 일 수 있다.
상기 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편은 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질에 의해 미토콘드리아의 외막에 결합될 수 있다. 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질 및 전구약물 전환 효소는 N 말단으로부터 C 말단으로 결합된 것일 수 있다.
이러한 융합 단백질은 하기의 순서로 결합된 것일 수 있다:
<구조식 1>
N 말단-미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질-전구약물 전환 효소 또는 이의 단편-C 말단.
또는
<구조식 2>
N 말단-전구약물 전환 효소 또는 이의 단편-미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질-C 말단.
상기 구조식 1에 있어서, 상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 TOM20, TOM70, OM45로 구성되는 군에서 선택되는 단백질의 N 말단 서열일 수 있다.
상기 구조식 2에 있어서, 상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-X, 및 VAMP1B로 구성되는 군에서 선택되는 단백질의 C 말단 서열일 수 있다. 이때, 전구약물 전환 효소는 또는 이의 단편은 상술한 바와 동일하다.
또한, 상기 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질 사이에 링커를 더 포함할 수 있다. 상기 링커는 1개 내지 150개의 아미노산으로 구성되거나, 10개 내지 100개의 아미노산으로 구성되거나, 20개 내지 50개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 링커는 20개의 아미노산 중에서 적절히 선택되어 이루어 질 수 있으며, 바람직하게는 글리신 및/또는 세린으로 이루어질 수 있다. 상기 링커의 일 구체예로는 글리신과 세린으로 구성된 5개 내지 50개의 아미노산 일 수 있다. 상기 링커의 일 구체예로는(G4S)n으로서(서열번호 24), n은 1 내지 10의 정수이며, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다.
이러한 융합 단백질은 하기의 순서로 결합된 것일 수 있다:
<구조식 3>
N 말단-미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질-링커-전구약물 전환 효소 또는 이의 단편-C 말단.
또는
<구조식 4>
N 말단-전구약물 전환 효소 또는 이의 단편-링커-미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질-C 말단.
상기 구조식 3에 있어서, 상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 TOM20, TOM70, OM45로 구성되는 군에서 선택되는 단백질의 N 말단 서열일 수 있다.
상기 구조식 4에 있어서, 상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-X, 및 VAMP1B로 구성되는 군에서 선택되는 단백질의 C 말단 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질이 포함된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질 및 융합 단백질은 상술한 바와 동일하다.
상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리펩타이드를 코딩한다면, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오티드 합성법 등을 들 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질이 포함된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 적재한 벡터를 제공한다. 상기 융합 단백질은 상술한 바와 동일하다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터, 미니-염색체 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 등이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주 세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 적재한 벡터가 도입된 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "형질전환 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵세포 및 진핵세포를 나타낸다. 상기 형질전환 세포는 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있다. 또한, 상기 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 융합 단백질을 생산할 수 있다.
상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다, 구체적으로, 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등 이 사용될 수 있다. 또한, 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시킬 수 있다. 또한, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다.
또한, 상기 형질전환 세포의 제작에 사용되는 숙주세포 역시 본 발명의 융합 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 숙주 세포는 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, COS 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, SP2/0 세포, 인간 림프아구(human lymphoblastoid), NSO 세포, HT-1080 세포, PERC.6 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
전술한 바와 같이, 융합 단백질의 치료제로서의 특성을 최적화하거나 기타 다른 목적을 위해, 호스트 세포가 갖고 있는 당화(glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합 단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알 산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
개질된 미토콘드리아
본 발명의 또 다른 측면은, 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편이 미토콘드리아 외막에 존재하는 개질된 미토콘드리아를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "미토콘드리아(mitochondria)"는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵 세포의 세포 소기관으로, 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라, 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.
따라서, 유전적, 환경적 또는 원인 불명의 원인으로 인한 미토콘드리아 기능저하 또는 기능장애는 미토콘드리아 관련 유전병, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환, 허혈성 질환, 감염성 질환, 심장질환, 근질환, 파킨슨병이나 알츠하이머병 등과 같은 퇴행성질환 및 각종 암의 발생과 암 전이 등과 같은 다양한 질환의 발병에 관련있다고 보고된 바 있다.
상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으며, 혈액세포 또는 혈소판으로부터 분리된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 이때, 상기 미토콘드리아는 조직 또는 세포를 농축하여 파쇄 후 분리하여 사용하거나 동결 보관한 후 해동한 조직 또는 세포 시료로부터 파쇄 후 분리된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 세포 및 조직을 체외에서 배양하여 분리하거나 동결 보관한 후 해동한 시료로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 체세포, 생식세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포일 수 있다.
또한, 상기 줄기세포는 여러 종류의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로서, 이에 제한되지는 않으나 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 활액, 정소, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것일 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 자가(autologous), 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic)으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 자가 미토콘드리아는 동일 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 동종 미토콘드리아는 개체와 같은 종에 속하면서 대립유전자에 대해서는 다른 유전자형을 가지는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 이종 미토콘드리아는 개체와 다른 종에 속하는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 이종 미토콘드리아는 개체와 다른 종에 속하는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다.
또한, 상기 미토콘드리아는 세포에서 분리된 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 손상되지 않고, 미토콘드리아 활성을 가지고 있는 것일 수 있다.
한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 비롯하여 이를 변형한 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.
상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 조직 또는 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상층액을 제조하는 단계 및 상기 상층액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.
구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 약 0℃ 내지 약 10℃의 온도, 바람직하게는 약 3℃ 내지 약 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 약 1분 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.
아울러, 상기 제1차 원심분리는 약 100xg 내지 약 1,000xg, 약 200xg 내지 약 700xg 또는 약 300xg 내지 약 450xg의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 약 1xg 내지 약 2,000xg, 약 25xg 내지 약 1,800xg 또는 약 500xg 내지 약 1,600xg의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 약 100xg 내지 약 20,000xg, 약 500xg 내지 약 18,000xg 또는 약 800xg 내지 약 15,000xg의 속도로 수행될 수 있다.
아울러, 상기 수득된 미토콘드리아의 안정화를 위하여 약학적으로 허용 가능한 당이 사용될 수 있다. 구체적으로, 수크로오스(sucrose), 만니톨(mannitol), 트리할로오스(trehalose) 등의 당일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, pH 완충제로서 이에 제한되지는 않으나, 약학적으로 혀용가능 한 Tris, HEPES, phosphate 등이 사용될 수 있다.
한편, 상기 미토콘드리아 수득 후 이온(ion) 유출에 의한 손상을 제거하고, 산화 스트레스를 억제하기 위한, 킬레이터, 항산화제 등의 첨가제를 사용할 수 있으며, 이는 당업계에서 널리 알려진 시약을 제한없이 포함하여 사용할 수 있다. 예컨대, EDTA, EGTA, Citrate, Glycine, Taurine, ATP 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 냉동된 세포 또는 조직을 해동하여 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 상기 미토콘드리아 수득 방법은 세포 또는 조직을 냉동하는 단계, 상기 세포 또는 조직을 해동하는 단계 및 해동된 세포 및 조직을 파쇄하는 단계로 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "개질된 미토콘드리아"는 외래 단백질이 미토콘드리아의 외막에 결합된 미토콘드리아를 의미한다. 구체적으로, 외래 단백질은 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질 및/또는 목적 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질일 수 있다. 여기서, 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 상술한 바와 동일하다.
이때, 목적 단백질은 세포 내외에서 활성을 나타내는 전구 약물 전환 효소 및 세포막에 존재하는 리셉터 또는 리간드에 결합능이 있는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 여기서 전구약물 전환 효소 및 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 목적 단백질은 세포막에 존재하는 리셉터 또는 리간드에 결합능이 있는 단백질일 수 있다. 이때, 세포막에 존재하는 리셉터 또는 리간드에 결합능이 있는 단백질은 종양관련항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
상기 종양관련항원은 CD19, CD20, melanoma antigen E(MAGE), NY-ESO-1, carcinoembryonic antigen(CEA), mucin 1 cell surface associated(MUC-1), prostatic acid phosphatase(PAP), prostate specific antigen(PSA), survivin, tyrosine related protein 1(tyrp1), tyrosine related protein 1(tyrp2), Brachyury, Mesothelin, Epidermal growth factor receptor(EGFR), human epidermal growth factor receptor 2(HER-2), ERBB2, Wilms tumor protein(WT1), FAP, EpCAM, PD-L1, ACPP, CPT1A,IFNG, CD274, FOLR1, EPCAM, ICAM2, NCAM1, LRRC4, UNC5H2 LILRB2, CEACAM, Nectin-3 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 종양 세포 표면에 특이적으로 존재하는 단백질이면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응하는 면역글로불린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 단백질 분자를 의미한다. 이때, 항체의 단편은 항체와 동일한 항원결정영역(CDR)을 가지며, 항원-결합 활성을 갖는 단편을 의미한다. 구체적으로, Fab, scFv, F(ab')2 또는 이의 조합일 수 있다.
상기 목적 단백질이 종양관련항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편인 경우, 상기 목적 단백질은 TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 C 말단 영역을 포함하는 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질과 결합될 수 있으며, 하기의 순서로 결합된 것일 수 있다:
<구조식 5>
N 말단-목적 단백질-TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 C 말단 영역을 포함하는 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질-C 말단.
이때, 목적 단백질은 종양관련항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
또한, 상기 외래 단백질은 목적 단백질과 TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 C 말단 영역 사이에 링커를 더 포함할 수 있다. 이때, 링커는 상술한 바와 동일하며, 하기의 순서로 결합된 것일 수 있다:
<구조식 6>
N 말단-목적 단백질-링커-TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 C 말단 영역을 포함하는 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질-C 말단.
이때, 목적 단백질은 종양관련항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
이러한 목적 단백질이 결합된 개질된 미토콘드리아는 특정 타겟이 쉽게 도입될 수 있으므로, 미토콘드리아를 효율적으로 특정 세포에 들어가게 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 종양관련항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편이 미토콘드리아 외막에 존재하는 개질된 미토콘드리아를 제공한다. 이때, 전구약물 전환 효소, 종양관련항원, 항체 또는 이의 단편 및 개질된 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다.
개질된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 상기 개질된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 약학 조성물의 용도는 암 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "암"은 정상인 조직세포가 어떤 원인으로 무제한 증식하여 그 생체의 생활현상이나 주위의 조직상태 등에 관계없이 급속한 발육을 계속하는 질환으로 구분되며, 본 발명에서의 암은 인체의 각종 암, 예컨대 유방암, 폐암, 췌장암, 신경교모종, 위암, 간암, 대장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 암일 수 있으나, 상기 종류에 한정되지는 않는다.
상기 약학 조성물에 대하여, 미토콘드리아는 약 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 500 ㎍/㎖, 약 0.2 ㎍/㎖ 내지 약 450 ㎍/㎖ 또는 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환자의 병증 개선 정도가 향상될 수 있다. 이때, 미토콘드리아의 용량은 상기 분리된 미토콘드리아의 막 단백질을 정량함으로써, 미토콘드리아를 정량할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 미토콘드리아를 브래드포드 분석법(Bradford Protein Assay)을 통해 정량할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 미토콘드리아를 브래드포드 분석법(bradford protein assay)을 통해 정량할 수 있다(James D. McCully가 저술한 논문(J Vis Exp. 2014;(91): 51682.).
또한 상기 약학 조성물에 대하여, 미토콘드리아에 결합하는 전구약물 전환 효소는 0.1 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 0.2 ㎍/㎖ 내지 450 ㎍/㎖ 또는 0.5 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위로 전구약물 전환 효소를 포함함으로써, 투여 시 전구약물 전환 효소 용량 조절이 용이하고, 환자의 병증 개선 정도가 향상될 수 있다. 전구약물 전환 효소는 상술한 바와 동일하다.
또한 상기 약학 조성물에 대하여, 미토콘드리아를 특정 세포에 전달할 수 있게 하는 종양관련항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 약 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 500 ㎍/㎖, 약 0.2 ㎍/㎖ 내지 약 450 ㎍/㎖ 또는 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위로 상기 항체 또는 이의 단편을을 포함함으로써, 투여 시 종양관련항원 결합 항체 용량 조절이 용이하고, 환자의 병증 개선 정도가 향상될 수 있다.
상기 약학 조성물에 대하여, 개질된 미토콘드리아가 외래 단백질로 전구약물 전환 효소; 및 종양관련항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 모두 포함하는 경우, 상기 전구약물 전환 효소 및 항체는 적절한 비율로 미토콘드리아의 외막에 존재할 수 있다. 예를 들어 중량비를 기준으로 전구약물 전환 효소 및 항체 또는 이의 단편의 비율은 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:9 내지 약 9:1, 약 1:8 내지 약 8:1, 약 1:7 내지 약 7:1, 약 1:6 내지 약 6:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 약 1:4 내지 약 4:1, 약 1:3 내지 약 3:1, 약 1:2 내지 약 2:1, 또는 약 1:1의 중량비일 수 있다. 바람직하게 약 1:5일 수 있다. 이때, 전구약물 전환 효소은 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 또한, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "효능(efficacy)"은 1년, 5년, 또는 10년과 같이 일정 기간에 걸쳐 생존 또는 질병이 없는 상태에서 생존(disease-free survival)과 같은 하나 이상의 파라미터에 의해 결정될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 파라미터는 개체에서 적어도 하나의 종양의 크기가 억제되는 것을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 그 유효성분은 항암 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 항암 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(Phosphate Buffered Saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다.
상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 약 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 피로설파이트(pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylene diaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 인산수산화칼륨, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨 또는 트리스(Tris)일 수 있다. 일 구체예로, 상기 약학 조성물은 TTG(trehalose-tris-glycine) 용액과 같은 혼합 보존용액을 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 약품제재에 통상적으로 이용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 개질된 미토콘드리아 이외에 주사용 액상 조성물을 포함할 수 있다. 이때, 개질된 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 약학 조성물이 주사용 액상 조성물을 포함함으로써 미토콘드리아 기능 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물로, 주사를 통해 미토콘드리아 투여 시 미토콘드리아의 응집, 혈소판의 감소 및 응집 등에 의해 야기될 수 있는 혈전 생성을 억제할 수 있고, 미토콘드리아의 안정성을 유지 및/또는 강화할 수 있으며, 미토콘드리아의 활성 또한 안정적으로 유지시킬 수 있다.
여기서, 상기 액상 조성물은 글라이신(glycine), 당류, 버퍼(buffer)를 포함할 수 있다.
상기 글라이신(glycine)은 이에 제한되지는 않으나, 주사용 액상 조성물 중 약 15 mM 이상의 농도로 존재할 수 있고, 구체적으로는 약 15 mM 내지 약 150 mM의 농도, 약 17 mM 내지 약 130 mM의 농도, 약 20 mM 내지 약 120 mM의 농도, 약 22 mM 내지 약 110 mM의 농도, 또는 약 25 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재할 수 있다. 또한, 상기 글라이신(glycine)은 이에 제한되지는 않으나 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신아세테이트, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민산, 프롤린, 세린 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 아미노산과 함께 사용 가능하다.
또한, 상기 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 당류는 이에 제한되지는 않으나 수크로오스(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 만니톨(mannitol), 소르비톨, 글루코오스, 프락토오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 이소말토오스, 덱스트란 및 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 특히, 상기 당류는 트레할로오스, 만니톨 또는 수크로오스일 수 있다. 바람직하게, 상기 당류는 트레할로오스일 수 있다.
상기 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 버퍼는 이에 제한되지는 않으나 트리스(tris) 버퍼, HEPES(hydroxyethyl piperazine ethane sulfonicacid) 버퍼, MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 버퍼 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 버퍼는 주사가 가능한 트리스(tris) 버퍼일 수 있다.
이때, 상기 버퍼의 pH는 이에 제한되지는 않으나, 약 7.0 내지 약 7.8 범위, 약 7.2 내지 약 7.6 범위 또는 약 7.3 내지 약 7.5 범위일 수 있다.
또한, 상기 버퍼는 이에 제한되지는 않으나, 주사용 액상 조성물 중 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도,약 8 mM 내지 약 40 mM의 농도, 약 10 mM 내지 약 35 mM의 농도, 약 13 mM 내지 약 30 mM의 농도 또는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도로 존재할 수 있다.
상기 주사용 액상 조성물은 약 200 내지 약 400 mOsm, 약 230 내지 약 380 mOsm, 약 250 내지 약 350 mOsm, 약 260 내지 약 320 mOsm, 약 270 내지 약 330 mOsm 또는 약 280 내지 약 300 mOsm 범위의 오스몰농도(osmolarity)를 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 범위의 오스몰농도는 2℃ 내지 8℃ 또는 그 이상의 온도에서의 장시간 보관을 촉진하는 한편, 조성물을 비경구용 투여, 예컨대, 혈관내, 근육내 또는 피하 주사를 통해 개체에 부작용 유발없이 투여가 적합하도록 한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "오스몰농도(osmolarity)"는 용매의 킬로그램 당 용액의 삼투압에 기여하는 용질의 몰을 지칭하는 것으로, 오스몰농도는 삼투압계(osmometer)를 사용하여 샘플의 빙점강하(freezing point depression)를 측정함으로써 결정된다.
또한, 상기 주사용 액상 조성물은 킬레이트제를 더 포함할 수 있다.
상기 킬레이트제는 이에 제한되지는 않으나, 주사가능한 등급의 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 및 BAPTA(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 킬레이트제는 상기 주사용 액상 조성물에 포함되는 미토콘드리아 수득 후 이온(ion) 유출에 의한 손상을 제거할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 첨가제로, 미토콘드리아의 기능 유지 및 활성에 유효한 항산화제, ATP, 마그네슘(magnesium) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 바이알, 카트리지, 주사기 및 자동주사기(autoinjector)로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에 보관될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물이 보관된 용기는 치료가 필요한 개체에게 투여될 때까지 실온, 2℃ 내지 8℃ 냉장온도, 또는 25℃ 내지 40℃로 저장될 수 있다.
상기 개체는 이에 제한되지는 않으나, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트(rat)와 같은 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 4 ㎎/㎏ 또는 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 2.5 ㎎/㎏ 양의 미토콘드리아를 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 약학 조성물이 암조직이 존재하는 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 항암제를 내포하는 개질된 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 1 내지 10회, 3 내지 8회 또는 5 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1 내지 7일 또는 2 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
이때, 상기 약학 조성물은이에 제한되지는 않으나, 약 5 ㎖ 이하, 약 3 ㎖ 이하 또는 약 2 ㎖ 이하의 부피로 18G 내지 32G 바늘을 사용하여 비경구 투여될 수 있다.
상기 용어 "개체"란 본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상을 의미하며, 암을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물일 수 있으나, 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 개질된 미토콘드리아 이외에, 항암 활성의 상승, 보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항암 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물 및 항암 활성을 갖는 화합물 또는 천연 추출물은 동시 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
개질된 미토콘드리아의 용도
본 발명의 또 다른 측면은 암 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 상기 개질된 미토콘드리아의 용도를 제공한다.
여기서, 암, 치료 및 개질된 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다. 이때, 상기 개질된 미토콘드리아는 외래 단백질 전달 수단으로서 제공될 수 있다. 구체적으로, 개질된 미토콘드리아는 목적 단백질로 세포 내에서 기능할 수 있는 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편을 세포 내로 전달하는 수단으로서 이용될 수 있다. 또한, 상기 개질된 미토콘드리가 종양관련항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 미토콘드리아 외막에 포함함으로써 효과적으로 종양 세포를 타겟팅하여 목적 단백질인 전구약물 전환 효소를 세포 내로 도입시킬 수 있다.
따라서, 상기 개질된 미토콘드리아는 효과적인 단백질 전달 시스템으로 이용될 수 있다. 여기서 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편은 상술한 바와 동일하다.
개질된 미토콘드리아를 이용한 암 치료 방법
본 발명의 또 다른 측면은 상기 개질된 미토콘드리아를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
이때, 상기 개질된 미토콘드리아는 항암제 전구약물(prodrug)과 병용 투여할 수 있으며, 항암제 전구약물은 5-플루오로사이토신(5-fluorocyytosine, 5-FC), 이리노테칸(Irinotecan), 간시클로버(Ganciclovir), 옥사자포스포린(Oxazaphosphorine), 6-메틸퓨린 디옥시리보사이드(6-Methylpurine Deoxyriboside) 및 인돌-3-아세트산(Indole-3-Acetic Acid, IAA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 그러나, 상기 전구약물 전환 효소에 의해 무독성 화합물에서 독성을 지닌 항암제로 전환되는 화합물이면 모두 포함할 수 있다.
또한, 하나 이상의 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편을 포함하는 개질된 미토콘드리아를 투여하는 경우, 결합된 전구약물 전환 효소에 따라 상기 전구약물을 하나 이상 조합하여 병용 투여할 수 있다. 이때, 개질된 미토콘드리아는 각각의 전구약물 전환 효소를 포함하는 것일 수도 있고, 하나 이상의 전구약물 전환 효소를 포함하도록 개질된 미토콘드리아일 수 있다.
상기 개질된 미토콘드리아, 암 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
상기 개체는 개체는 암을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
개질된 미토콘드리아를 포함하는 암 치료용 키트
본 발명의 또 다른 측면은 상기 개질된 미토콘드리아 및 전구약물을 포함하는 암 예방 및 치료용 키트를 제공한다. 여기서 개질된 미토콘드리아, 전구약물, 암, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
또한, 하나 이상의 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편을 포함하는 개질된 미토콘드리아를 키트에 포함하는 경우, 결합된 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편에 따라 상기 전구약물에서 하나 이상 조합하여 포함할 수 있다. 이때, 개질된 미토콘드리아는 각각의 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편을 포함하는 것일 수도 있고, 하나 이상의 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편을 포함하는 미토콘드리아일 수 있다.
개질된 미토콘드리아 제조 방법
본 발명의 또 다른 측면은 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편을 세포 내 미토콘드리아의 외막에 발현시키는 단계; 및 상기 미토콘드리아를 분리하는 단계;를 포함하는 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편이 미토콘드리아의 외막에 발현하는 개질된 미토콘드리아를 제조하는 방법을 제공한다. 여기서 전구약물 전환 효소 및 개질된 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 종양관련항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 세포 내 미토콘드리아의 외막에 발현시키는 단계; 및 상기 미토콘드리아를 분리하는 단계;를 포함하는 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 종양관련항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편이 미토콘드리아의 외막에 발현된 개질된 미토콘드리아를 제조하는 방법을 제공한다. 여기서 전구약물 전환 효소, 종양관련항원, 항체 및 개질된 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다.
이때, 상기 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편 및 종양관련항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 적절한 비율로 미토콘드리아의 외막에 존재할 수 있다. 예를 들어 중량비를 기준으로 상기 효소 또는 이의 단편 및 항체 또는 이의 단편의 비율은 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:9 내지 약 9:1, 약 1:8 내지 약 8:1, 약 1:7 내지 약 7:1, 약 1:6 내지 약 6:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 약 1:4 내지 약 4:1, 약 1:3 내지 약 3:1, 약 1:2 내지 약 2:1, 또는 약 1:1의 중량비일 수 있다. 바람직하게 약 1:5일 수 있다.
융합 단백질 제조 방법
본 발명의 또 다른 측면은 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질 및 전구약물 전환 효소가 포함된 융합 단백질을 암호화하는 벡터가 도입된 세포로부터 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 융합 단백질 제조 방법을 제공한다. 융합 단백질은 상술한 바와 동일하다. 이때, 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다.
그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미토콘드리아 외막에 융합 가능한 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 발현 벡터 제조
실시예 1.1. 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 발현벡터 제작
효모 유래 사이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase)를 재조합 단백질로 발현시키기 위하여, ㈜바이오닉스에 유전자 합성을 의뢰하여 수득된 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 유전자가 적재된 발현 벡터를 pUC57-yCD라고 명명하였으며, 효모 유래 사이토신 디아미네이즈의 염기서열은 서열번호 3의 염기 서열과 같다.
실시예 1.2. 미토콘드리아 외막에 융합 가능한 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 발현 벡터 제작
미토콘드리아 외막에 결합하는 TOM7이 융합된 형태의 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 단백질을 제조하기 위해서 TOM7이 융합된 형태의 효모 유래 사이토신 디아미네이즈를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제조하였다.
프라이머 서열 서열번호
RyCD 5'- AAA AAA GAA TTC ATG GTG ACA GGG GGA ATG GCA AGC -3' 서열번호 4
yCD-myc-TOM7-F 5'-GGT TTG AAG ATA TTG GTG AGG AAC AAA AAC TCA TCT CAG AAG AGG ATC TGG TGA AGC TGA GCA AAG AGG CCA AG -3' 서열번호 5
yCD-myc-TOM7-R 5'-CTT GGC CTC TTT GCT CAG CTT CAC CAG ATC CTC TTC TGA GAT GAG TTT TTG TTC CTC ACC AAT ATC TTC AAA CC -3' 서열번호 6
XTOM7(T) 5'- AAA AAA CTC GAG TTA TCC CCA AAG TAG GCT CAA AAC -3' 서열번호 7
상기 실시예 1.1.의 방법으로 수득한 플라스미드 pUC57-yCD를 주형으로하여 0.2 pmol 프라이머(RyCD) 및 0.2 pmol 프라이머(yCD-myc-TOM7-R)를 dNTP 0.2 nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃에서 40초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분의 증폭 반응을 25번 수행하여 유전자 yCD-myc을 수득하였다. 상기 방법을 통해 증폭된 DNA 절편을 N-yCD-myc으로 명명하였다.
대한민국 공개특허 제2019-0124656호에 개재된 방법으로 확보한 플라스미드 pT-TOM7을 주형으로 하여 0.2 pmol 프라이머(yCD-myc-TOM7-F)및 0.2 pmol 프라이머(XTOM7(T))를 넣고 dNTP 0.2 nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃에서 40초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분의 증폭 반응을 25번 수행하여 유전자 myc-TOM7을 수득하였다. 상기 방법을 통해 증폭된 DNA 단편을 C-myc-TOM7이라 명명하였다.
증폭된 DNA 단편 N-yCD-myc 및 C-myc-TOM7를 주형으로 하여 0.2 pmol 프라이머(RyCD), 0.2 pmol 프라이머(XTOM7(T))를 dNTP 0.2 nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃에서 40초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분의 증폭 반응을 25번 수행하여 증폭된 TOM7이 융합된 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 유전자 yCD-myc-TOM7(서열번호 26)를 수득하였다.
증폭된 yCD-myc-TOM7 유전자를 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 절단하고, 2% 아가로스겔 전기영동하여 DNA 단편을 얻은 후, 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 절단된 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen, USA)에 T4 DNA 연결효소를 이용하여 삽입하여 플라스미드 pCMV-yCD-myc-TOM7을 제작하였다(도 1).
실시예 2. 인간 태아 신장세포로 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 유전자의 형질전환 및 발현 확인
실시예 1과 동일한 방법으로 제작한 사이토신 디아미네이즈 발현 벡터인 pCMV-yCD-myc-TOM7을 인간 태아 신장 세포주(HEK293)에 도입하기 위해 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)(Thermo Scintific, 11668019)을 이용하고 제조사가 제공하는 실험 방법을 참조하여 진행하였다.
HEK293 세포는 10% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, 이하 FBS)(Gibco, 12483-020) 및 페니실린-스트렙토마이신(Hyclone, SV30010)이 포함된 DMEM(hyclone, SH30243) 배양배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
플라스미드 도입을 위해, HEK293 세포를 6-well plate에 1Х106 cells/well 로 접종하여 24시간 배양하였다. Opti-MEM(Gibco, 31985-070)에 2.5 ㎍의 플라스미드 및 12.5 ㎕의 Lipofectamine 2000을 첨가하고 혼합하여 DNA-Lipid 복합체(complex)를 형성시킨 후, HEK293 세포에 처리하여 플라스미드를 도입하였다. 24시간 후, PBS로 세포를 세척하여 새 배양 배지로 교체하고 24시간 추가 배양하였다.
HEK293 세포 내 도입된 유전자의 발현을 확인하기 위하여 Cell lysis buffer(Cell Signaling Technologies, 9803)를 이용하여 세포를 분해하고, 단백질을 추출한 다음 웨스턴 블롯을 수행하였다. 발현된 효모 유래 사이토신 디아미네이즈를 확인하기 위하여 1차 항체로 항-myc 항체(Roche, 11667149001)를, 2차 항체로는 항-마우스 IgG HRP(Abcam, 6789)를 사용하였다.
그 결과, 도 2에서 보여지는 바와 같이, 효모 유래 사이토신 디아미네이즈가 HEK293 세포에서 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 3. 효모 유래 사이토신 디아미네이즈 효소 활성도 측정
상기 실시예 2에서 제작한 HEK293 세포로부터 발현된 효모 유래 사이토신 디아미네이즈의 효소 활성도를 측정하기 위하여, 314 nm의 흡광도를 이용해 5-FC로부터 전환되는 5-FU의 양을 측정하였다.
구체적으로, HEK293 또는 사이토신 디아미네이즈가 발현된 HEK293(HEK293-yCD) 세포를 6-well plate에 1Х106 cells/well로 접종하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 0.05% trypsin-EDTA(gibco, 25300)를 처리하여 세포를 채취하여, PBS로 2회 세척하였다. 이후, PBS(pH7.4)에 세포를 재현탁하여 초음파 파쇄기를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 2,000Хg로 10분 동안 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 뒤, 5 mM 5-FC(sigma, F7129)를 처리하고 37℃에서 반응시켰다.
1시간, 2시간, 4시간 및 16시간 간격으로 반응액을 취하여 반응액을 96-well plate에 200 ㎕씩 분주한 뒤, ELISA 리더기를 이용하여 314 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 흡광도 314 nm에서 5-FC는 측정되지 않고 5-FU만 측정되는 것을 확인하였고, 5-FU(sigma, F6627)의 농도별 표준 곡선(standard curve)를 이용해 반응액으로부터 얻어지는 5-FU의 양을 정량하였다.
도 3은 5-FU의 농도별 표준 곡선(standard curve)을 나타낸 결과이고, 도면 3의 B는 검출된 5-FU의 양을 시간별 그래프로 나타낸 결과이다. HEK293 세포로부터 얻어진 반응액 에서는 5-FU가 검출되지 않았으나 사이토신 디아미네이즈가 발현된 HEK293 세포로부터 얻어진 반응액의 경우 5-FU가 12.3 mM이 검출됨으로써 효모 유래 사이토신 디아미네이즈에 의해 5-FC가 5-FU로 변환되었음을 알 수 있다.
실시예 4. 전구 약물인 5-FC에 의한 세포 독성 측정
96-well plate에 상기 실시예 1에서 제작한 세포주 HEK293 또는 사이토신 디아미네이즈가 발현된 HEK293(HEK293-yCD) 세포를 5,000 cells/well로 접종하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 프로드럭 5-FC(sigma, F7129)를 500㎍/㎖ 농도로 처리하고 120시간 배양하였다. 120시간 배양한 HEK293 세포의 사멸정도를 광학현미경으로 관찰하였고, 세포 증식 여부를 WST-1(Roche, 11644807001) 분석법을 통해 측정하였다.
그 결과, 도 5 및 도 6에서 보여지는 바와 같이, 5-FC 무처리군에서는 HEK293 또는 사이토신 디아미네이즈가 발현된 HEK293(HEK293-yCD) 세포 모두에서 세포 증식 억제 효과가 관찰되지 않았다. 반면, 5-FC 처리군에서는 HEK293 세포 대비 HEK293-yCD 세포에서 90%의 세포 성장이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 5. 효모 유래 사이토신 디아미네이즈가 안정화된 세포주 제작
상기 실시예 2에서 제작한 사이토신 디아미네이즈가 발현된 HEK293(HEK 293-yCD) 세포에서 지속적으로 사이토신 디아미네이즈가 발현되는 세포주를 제작하기 위해, G418(Promega, V7983) 항생물질을 1,000 ㎍/㎖ 투여하여 내성을 지닌 세포들을 선택하여 형질전환 세포주(stable cell line)를 제작하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 선별된 사이토신 디아미네이즈가 발현된 HEK293(HEK 293-yCD) 세포를 100 mm dish plate에서 80% 정도의 세포 밀도로 배양한 다음, 2일에 한 번씩 1,000 ㎍/㎖의 G418(Promega, V7983)이 함유된 배양배지로 2주간 교체하여 플라스미드가 도입되지 않은 세포들의 사멸을 유도하였다. 2주간의 G418 처리 후에 80~90%의 세포가 사멸하였고, 살아남은 세포들이 성장 및 분열하여 생성한 콜로니를 관찰되면, 0.05% trypsin-EDTA(gibco, 25300)를 이용하여 각각의 콜로니를 24-well plate에 옮겨서 배양하였다. 이후 배양 과정에서는 항상 1,000㎍/㎖의 농도의 G418이 첨가된 배양배지를 사용하였다.
선택된 콜로니가 24-well plate에서 60% 이상의 세포 밀도로 자라면, 웨스턴 블롯을 통해 단백질 발현량이 높은 콜로니를 선택적으로 분리하였다. 이 과정에서 선택된 콜로니는 스케일업(scale-up)하여 배양하였다.
그 결과, 도 7에서와 같이, 단백질 발현양이 높은 HEK293-CD#5, HEK293-CD#6, HEK293-CD#7 콜로니를 스케일업 하여 배양하고, HEK293-CD#5 콜로니를 이용하여 이후 실험들을 진행하였다.
실시예 6. 효모 유래 사이토신 디아미네이즈의 세포 내 발현 위치 확인 및 MT yCD 제조
상기 실시예 5에서 제작한 HEK293-CD#5에서 사이토신 디아미네이즈가 HEK293(HEK293-yCD) 세포의 미토콘드리아에서 발현되는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯과 세포면역화학염색법을 실시하였다.
웨스턴 블롯은 하기 방법을 통해 수행하였다. 구체적으로 사이토신 디아미네이즈가 발현된 HEK293-CD#5 세포를 1Х107 cells 만큼 수득하여 PBS로 2회 세척 후, 300 ㎕의 SHE(Sucrose 250 mM, HEPES 20 mM(pH 7.4), EGTA 2 mM) 완충용액(buffer)에 세포를 현탁하여 초음파 파쇄기를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 2,000Хg로 10분 동안 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 수득하여 새로운 마이크로튜브에 옮긴 뒤 12,000Хg로 15분 동안 원심분리 하여 상등액으로부터 세포질을 분리하고, 침전된 부분은 미토콘드리아로 분리하였다.
상기 분획을 각각 전기 영동하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 발현된 사이토신 디아미네이즈, 미토콘드리아 마커 및 세포질 마커 단백질을 확인하기 위하여 1차 항체로 항-myc 항체(Roche, 11667149001), 항-COX4 항체(abcam, 33985) 및 항-β-tubulin 항체(Thermo, MA5-16308)를 각각 사용하였다. 2차 항체로는 항-마우스 IgG HRP(abcam, 6789) 또는 항-래빗 IgG HRP(abcam, 6721)를 사용하였다.
그 결과, 도면 8에서 보여지는 바와 같이, 사이토신 디아미네이즈는 미토콘드리아 마커로 사용된 COX4와 함께 미토콘드리아 분획에서 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 세포질 마커인 β-tubulin이 존재하는 분획에는 존재하지 않음을 확인하였다.
세포면역화학염색법는 하기 방법을 통해 수행하였다. 구체적으로, HEK293 세포 및 HEK293-CD#5 세포주를 24-well plate에 5Х104 cells/well로 접종하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 세포를 PBS로 2회 세척한 후 4% 포름알데하이드(Thermo, 28908)로 고정시켰다. 포름알데하이드를 제거하고 1차 항체로 항-myc 항체(Roche, 11667149001) 및 항-MTCO2 항체(abcam, 79393)를 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin), 0.1% TritonX-100과 1% 염소혈청(life technologies, 500622)이 포함된 PBS에 1:1000으로 희석하여 세포에 처리하고 4℃에서 18시간 반응시켰다.
반응이 끝난 뒤, 0.1% BSA가 포함된 PBS로 4회 세척하여 1차 항체를 제거한 뒤, Alexa Fluor®488가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Invitrogen, 11001) 및 항-래빗 IgG 항체(Invitrogen, 21428)를 0.1% BSA가 포함된 PBS에 1:1000으로 희석하여 세포에 처리하여, 상온에서 약 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 0.1% BSA가 포함된 PBS 및 증류수로 4회씩 세척하고, DAPI가 함유된 마운팅 미디어(VECTASHIELD, H-1200)를 이용하여 핵을 염색하고 공초점 현미경으로 세포를 관찰하였다.
그 결과, 도 9에서 보여지는 바와 같이 미토콘드리아 양성 마커인 MTCO-2를 표지하는 Red 형광의 위치와 사이토신 디아미네이즈를 표지하는 Green 형광의 위치가 일치하는 것을 확인하였다.
상기 HEK293 세포 및 HEK293-CD#5 세포에서 미토콘드리아 분획 방법으로부터 수득한 미토콘드리아를 각각 MT 또는 MTyCD 라 명명하였다. 이때, MT는 효모 유래 사이토신 디아미네이즈가 발현되지 않은 대조군 HEK293 세포로부터 수득한 미토콘드리아이며, MTyCD는 HEK293-CD#5 세포주에서 분리한 미토콘드리아로서 미토콘드리아 외막에 사이토신 디아미네이즈가 융합된 형태의 미토콘드리아이다.
실시예 7. 효모 유래 사이토신 디아미네이즈를 포함하는 미토콘드리아의 암세포에 대한 항암 활성 평가
상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수득된 MT 또는 MTyCD를 인간 췌장암 세포주(AsPc-1, Capan-1, Capan-2 및 MIA Paca-2)에 처리 후, 프로드럭 5-FC를 처리하여 암세포의 형태적 변화를 광학현미경으로 관찰하였고, 암세포 사멸 및 세포 증식 여부를 WST-1분석법을 통해 측정하였다.
AsPc-1, Capan-1 및 Capan-2 세포는 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 RPMI-1640(welgene, LM011-51)에서 배양하였다. MIA Paca-2 세포는 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(hyclone, SH30243)에서 배양하였다.
구체적으로 96-well plate에 각각의 인간 췌장암 세포주(AsPc-1, Capan-1, Capan-2 및 MIA Paca-2)를 5,000 cells/well로 접종하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수득된 MT 또는 MTyCD를 각 well에 0 ㎍, 0.5 ㎍, 1 ㎍ 또는 2 ㎍를 처리하고 2시간 반응시켰다. 2시간 후, 배양배지를 이용해 세포를 1회 세척하여 암세포주로 전달되지 못한 미토콘드리아는 제거하였다. 이후 프로드럭 5-FC를 0 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 또는 500 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 120시간 배양하였다.
그 결과, 도 10 내지 도 12에서 보여지는 바와 같이, 5-FC 무처리군에서는 MT 또는 MTyCD 처리에 의한 세포 증식 억제 효과가 관찰되지 않았다. 반면, 5-FC 처리군에서는 MTyCD 처리에 의해 MT 처리군 대비 약 60% 내지 90% 이상의 세포 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, MTyCD 처리 농도 또는 5-FC의 처리 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 세포의 사멸률이 높아짐을 알 수 있다.
실시예 8. 웨스턴 블롯 분석을 통한 MT yCD 처리에 의한 암세포 자연세포사멸 확인
상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수득된 MT 또는 MTyCD를 인간 췌장암 세포주에 처리 후, 프로드럭 5-FC를 처리하여 자연세포사멸 마커에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다.
구체적으로, 인간 췌장암 세포주 인간 췌장암 세포주(AsPc-1, Capan-1, Capan-2 및 MIA Paca-2)를 6-well plate에서 5Х105 cells/well로 각각 접종하고 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수득된 MT 또는 MTyCD를 각 well에 50 ㎍씩 처리하고 2시간 반응하였다. 2시간 후, 배양배지를 이용해 세포를 1회 세척하여 암세포주로 전달되지 못한 미토콘드리아는 제거하였다.
이후 프로드럭 5-FC를 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 96시간 배양한 후, Cell lysis buffer(Cell Signaling Technologies, 9803)를 이용하여 세포를 분해하고 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 BCA 분석법(Thermo Scientific, 23225)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 각 샘플에 대하여 동량의 단백질을 전기영동한 후, 웨스턴 블롯을 수행하였다.
1차 항체는 항-phospho-p53 항체(ABclonal, AP0762), 항-cleaved caspase 3 항체(Cell signaling, 9664) 및 항-βtubulin 항체(Thermo MA5-16308)를 각각 사용하였다. 2차 항체는 항-마우스 IgG HRP(abcam, 6789) 또는 항-래빗 IgG HRP(abcam, 6721)를 사용하였다. 단백질 양은 β-tubulin 단백질 발현양을 통해 보정하였다.
그 결과, 도 13에서 보여지는 바와 같이, MTyCD 처리시 5-FC 처리군에서만 자연세포사멸 시 관찰되는 절단된 형태의 caspase-3 및 인산화된 p53가 관찰되었다. 이외, MT 또는 MTyCD 또는 5-FC 단독 처리군, 및 5-FC 처리군에서의 MT 처리 시에는 대조군(untreated)와 유사하게 자연세포사멸 마커의 발현은 관찰되지 않았다.
<110> Paean Biotechnology Inc. <120> MODIFIED MITOCHONDRIA COMPRISING PRODRUG CONVERTING ENZYME AND USE THEREOF <130> SPD21-121-PBT <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cytosine deaminase of S. cerevisiae <400> 1 Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu 145 150 155 <210> 2 <211> 427 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cytosine deaminase of E. coli <400> 2 Met Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly 1 5 10 15 Glu Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala 20 25 30 Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp 35 40 45 Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His 50 55 60 Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly 65 70 75 80 Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu 85 90 95 Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln 100 105 110 Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp 115 120 125 Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val 130 135 140 Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu 165 170 175 Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu 180 185 190 Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr 195 200 205 Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser 210 215 220 Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly 225 230 235 240 Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly 245 250 255 Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn 260 265 270 Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp 275 280 285 Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu 290 295 300 Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp 305 310 315 320 Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu 325 330 335 His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn 340 345 350 Leu Ile Thr His His Ser Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly 355 360 365 Ile Ala Ala Gly Asn Ser Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn 370 375 380 Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg 385 390 395 400 Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr 405 410 415 Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg 420 425 <210> 3 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding cytosine deaminase of S. cerevisiae <400> 3 atggtgacag ggggaatggc aagcaagtgg gatcagaagg gtatggacat tgcctatgag 60 gaggcggcct taggttacaa agagggtggt gttcctattg gcggatgtct tatcaataac 120 aaagacggaa gtgttctcgg tcgtggtcac aacatgagat ttcaaaaggg ttccgccaca 180 ctacatggtg agatctccac tttggaaaac tgtgggagat tagagggcaa agtgtacaaa 240 gataccactt tgtatacgac gctgtctcca tgcgacatgt gtacaggtgc catcatcatg 300 tatggtattc cacgctgtgt tgtcggtgag aacgttaatt tcaaaagtaa gggcgagaaa 360 tatttacaaa ctagaggtca cgaggttgtt gttgttgacg atgagaggtg taaaaagatc 420 atgaaacaat ttatcgatga aagacctcag gattggtttg aagatattgg tgag 474 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RyCD primer <400> 4 aaaaaagaat tcatggtgac agggggaatg gcaagc 36 <210> 5 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yCD-myc-TOM7-F primer <400> 5 ggtttgaaga tattggtgag gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg gtgaagctga 60 gcaaagaggc caag 74 <210> 6 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yCD-myc-TOM7-R primer <400> 6 cttggcctct ttgctcagct tcaccagatc ctcttctgag atgagttttt gttcctcacc 60 aatatcttca aacc 74 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XTOM7(T) primer <400> 7 aaaaaactcg agttatcccc aaagtaggct caaaac 36 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM70 of S. cerevisiae <400> 8 Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Phe Ala Thr Val 1 5 10 15 Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr 20 25 <210> 9 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM70 of Homo sapiens <400> 9 Met Ala Ala Ser Lys Pro Val Glu Ala Ala Val Val Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Pro Ser Ser Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Gly Thr Ala Gly Pro Gly 20 25 30 Thr Gly Gly Leu Pro Arg Trp Gln Leu Ala Leu Ala Val Gly Ala Pro 35 40 45 Leu Leu Leu Gly Ala Gly Ala Ile Tyr Leu Trp Ser 50 55 60 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM20 of S. cerevisiae <400> 10 Met Ser Gln Ser Asn Pro Ile Leu Arg Gly Leu Ala Ile Thr Thr Ala 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Ser Ala Thr Gly Tyr Ala Ile Tyr Phe 20 25 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM20 of Homo sapiens <400> 11 Met Val Gly Arg Asn Ser Ala Ile Ala Ala Gly Val Cys Gly Ala Leu 1 5 10 15 Phe Ile Gly Tyr Cys Ile Tyr Phe 20 <210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OM45 of S. cerevisiae <400> 12 Met Ser Ser Arg Ile Ile Val Gly Ser Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ile 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Met Val 20 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM5 of S. cerevisiae <400> 13 Ala Ala Tyr Val Ala Ala Phe Leu Trp Val Ser Pro Met Ile Trp His 1 5 10 15 Leu Val Lys Lys Gln Trp Lys 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM5 of Homo sapiens <400> 14 Ile Arg Asn Phe Leu Ile Tyr Val Ala Leu Leu Arg Val Thr Pro Phe 1 5 10 15 Ile Leu Lys Lys Leu Asp Ser Ile 20 <210> 15 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM7 of S. cerevisiae <400> 15 Ile Leu Thr Leu Thr His Asn Val Ala His Tyr Gly Trp Ile Pro Phe 1 5 10 15 Val Leu Tyr Leu Gly Trp Ala His Thr Ser Asn Arg Pro Asn Phe Leu 20 25 30 Asn Leu Leu Ser Pro Leu Pro Ser Val 35 40 <210> 16 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM7 of Homo sapiens <400> 16 Phe Ala Ile Arg Trp Gly Phe Ile Pro Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe 1 5 10 15 Lys Arg Gly Ala Asp Pro Gly Met Pro Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu 20 25 30 Leu Trp Gly 35 <210> 17 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM22 of S. cerevisiae <400> 17 Leu Ala Trp Thr Leu Thr Thr Thr Ala Leu Leu Leu Gly Val Pro Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Leu Ala Glu Gln Gln Leu Ile Glu Met Glu Lys Thr 20 25 30 Phe Asp Leu Gln Ser Asp Ala Asn Asn Ile Leu Ala Gln Gly Glu Lys 35 40 45 Asp Ala Ala Ala Thr Ala Asn 50 55 <210> 18 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TOM22 of Homo sapiens <400> 18 Ala Ala Leu Trp Ile Gly Thr Thr Ser Phe Met Ile Leu Val Leu Pro 1 5 10 15 Val Val Phe Glu Thr Glu Lys Leu Gln Met Glu Gln Gln Gln Gln Leu 20 25 30 Gln Gln Arg Gln Ile Leu Leu Gly Pro Asn Thr Gly Leu Ser Gly Gly 35 40 45 Met Pro Gly Ala Leu Pro Ser Leu Pro Gly Lys Ile 50 55 60 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fis1 of S. cerevisiae <400> 19 Gly Val Val Val Ala Gly Gly Val Leu Ala Gly Ala Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Ser Phe Phe Leu Arg Asn Lys Arg Arg 20 25 <210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fis1 of Homo sapiens <400> 20 Gly Leu Val Gly Met Ala Ile Val Gly Gly Met Ala Leu Gly Val Ala 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu Ala Val Ser Lys Ser Lys Ser 20 25 30 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 alpha of Homo sapiens <400> 21 Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala Cys Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys 20 25 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VAMP1 of S. cerevisiae <400> 22 Met Ile Met Leu Gly Ala Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile Val 1 5 10 15 Arg Arg Asp <210> 23 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VAMP1 of Homo sapiens <400> 23 Met Met Ile Met Leu Gly Ala Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile 1 5 10 15 Val Ile Tyr Phe Phe Thr 20 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> yCD-myc-TOM7 <400> 25 Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Glu Gln 145 150 155 160 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Val Lys Leu Ser Lys Glu Ala Lys 165 170 175 Gln Arg Leu Gln Gln Leu Phe Lys Gly Ser Gln Phe Ala Ile Arg Trp 180 185 190 Gly Phe Ile Pro Leu Val Ile Tyr Leu Gly Phe Lys Arg Gly Ala Asp 195 200 205 Pro Gly Met Pro Glu Pro Thr Val Leu Ser Leu Leu Trp Gly 210 215 220 <210> 26 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding yCD-myc-TOM7 <400> 26 atggtgacag ggggaatggc aagcaagtgg gatcagaagg gtatggacat tgcctatgag 60 gaggcggcct taggttacaa agagggtggt gttcctattg gcggatgtct tatcaataac 120 aaagacggaa gtgttctcgg tcgtggtcac aacatgagat ttcaaaaggg ttccgccaca 180 ctacatggtg agatctccac tttggaaaac tgtgggagat tagagggcaa agtgtacaaa 240 gataccactt tgtatacgac gctgtctcca tgcgacatgt gtacaggtgc catcatcatg 300 tatggtattc cacgctgtgt tgtcggtgag aacgttaatt tcaaaagtaa gggcgagaaa 360 tatttacaaa ctagaggtca cgaggttgtt gttgttgacg atgagaggtg taaaaagatc 420 atgaaacaat ttatcgatga aagacctcag gattggtttg aagatattgg tgaggaacaa 480 aaactcatct cagaagagga tctggtgaag ctgagcaaag aggccaagca gagactacag 540 cagctcttca aggggagcca gtttgccatt cgctggggct ttatccctct tgtgatttac 600 ctgggattta agaggggtgc agatcccgga atgcctgaac caactgtttt gagcctactt 660 tgggga 666

Claims (23)

  1. 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편 및 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질을 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 전구약물 전환 효소는 비독성-전구약물(non-toxic prodrug)을 독성을 지닌 약물로 전환시키는 활성을 갖는 효소인 사이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase, CD), 카르복실 에스터라아제(carboxyl esterase, CE), 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-TK), 시토크롬 P450(Cytochrome P450, CYP450), 퓨린-뉴클레오사이드-인산화효소(purine-nucleoside-phosphorylase, PNP) 및 양고추냉이과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질이 TOM20, TOM70 또는 OM45일 경우, 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질 및 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편이 N 말단으로부터 C 말단으로 결합된 것인, 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질이 TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x 및 VAMP1B로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 경우, 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 미토콘드리아 타겟팅 단백질이 N 말단으로부터 C 말단으로 결합된 것인, 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    전구약물 전환 효소 또는 이의 단편, 및 미토콘드리아 외막 타겟팅 단백질은 링커로 연결된 것인, 융합 단백질.
  8. 제1항, 제4항 내지 제7항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  10. 제9항의 벡터가 도입된 형질 전환된 세포.
  11. 전구약물 전환 효소 또는 이의 단편이 미토콘드리아 외막에 존재하는 개질된 미토콘드리아.
  12. 제11항에 있어서,
    종양관련항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편이 미토콘드리아 외막에 더 존재하는 것인, 개질된 미토콘드리아.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 전구약물 전환 효소는 사이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase, CD), 카르복실 에스터라아제(carboxyl esterase, CE), 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-TK), 시토크롬 P450(Cytochrome P450, CYP450), 퓨린-뉴클레오사이드-인산화효소(purine-nucleoside-phosphorylase, PNP) 및 양고추냉이과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 개질된 미토콘드리아.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 종양관련항원은 CD19, CD20, melanoma antigen E(MAGE), NY-ESO-1, carcinoembryonic antigen(CEA), mucin 1 cell surface associated(MUC-1), prostatic acid phosphatase(PAP), prostate specific antigen(PSA), survivin, tyrosine related protein 1(tyrp1), tyrosine related protein 1(tyrp2), Brachyury, Mesothelin, Epidermal growth factor receptor(EGFR), human epidermal growth factor receptor 2(HER-2), ERBB2, Wilms tumor protein(WT1), FAP, EpCAM, PD-L1, ACPP, CPT1A,IFNG, CD274, FOLR1, EPCAM, ICAM2, NCAM1, LRRC4, UNC5H2 LILRB2, CEACAM, Nectin-3 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 개질된 미토콘드리아.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 항체의 단편은 Fab, Fab', scFv 및 F(ab)2로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 개질된 미토콘드리아.
  16. 제11항 또는 제12항의 개질된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 폐암, 췌장암, 신경교모종, 위암, 간암, 대장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제11항의 개질된 미토콘드리아 및 전구약물을 포함하는 암 치료용 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 전구약물은 5-플루오로사이토신(5-fluorocyytosine, 5-FC), 이리노테칸(Irinotecan), 간시클로버(Ganciclovir), 옥사자포스포린(Oxazaphosphorine), 6-메틸퓨린 디옥시리보사이드(6-Methylpurine Deoxyriboside) 및 인돌-3-아세트산(Indole-3-Acetic Acid, IAA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 치료용 키트.
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