TW202045535A - 具有ｘｔｅｎ之凝血酶可裂解連接子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含經由VWF連接子與異源部分融合之VWF蛋白之嵌合分子。本發明提供可在凝血酶存在下裂解之有效的VWF連接子。該嵌合分子可進一步包含包括FVIII蛋白及第二異源部分之多肽鏈，其中包含該VWF蛋白之鏈與包含該FVIII蛋白之鏈彼此締合。本發明亦包括核苷酸、載體、宿主細胞、使用該嵌合蛋白之方法。

Description

具有XTEN之凝血酶可裂解連接子及其用途
本明發明關於具有XTEN之凝血酶可裂解連接子及其用途。
A型血友病為由編碼凝血因子VIII(FVIII)之基因的缺陷所造成的出血性病症並且在男性新生兒中發病率為萬分之1-2。Graw等人，Nat.Rev.Genet.6(6)：488-501(2005)。罹患A型血友病之患者可藉由輸注純化或重組產生之FVIII來治療。然而，已知所有市售FVIII產品具有約8-12小時之半衰期，從而需要對患者進行頻繁的靜脈內施用。參見Weiner M.A.及Cairo,M.S.,Pediatric Hematology Secrets,Lee,M.T.,12.Disorders of Coagulation,Elsevier Health Sciences,2001；Lillicrap,D.Thromb.Res.122增刊4：S2-8(2008)。另外，已嘗試多種方法以延長FVIII半衰期。舉例而言，為延長凝血因子之半衰期所開發的方法包括聚乙二醇化、糖基化以及與白蛋白結合。參見Dumont 等人，Blood.119(13)：3024-3030(線上公佈於2012年1月13日)。然而，不考慮所用之蛋白質工程改造，目前處於開發中之長效FVIII產品具有改良之半衰期，但該等半衰期據報導為有限的，在臨床前動物模型中僅達到約1.5至2倍改良。參見同上。在人類中已證實一致結果，例如，在A型血友病患者中，與ADVATE®相比，rFVIIIFc經報導使半衰期提高達約1.7倍。參見同上。因此，儘管改良微小，但半衰期增加可指示其他t1/2限制因素之存在。
由於頻繁給藥及由給藥方案所造成之不便，仍有必要開發需要較小頻率施用之FVIII產品，亦即，具有比1.5至2倍半衰期限制更長之半衰期的FVIII產品。
本發明係針對一種包含溫韋伯氏因子(Von Willebrand Factor，VWF)蛋白、異源部分(H1)、XTEN序列及連接該VWF蛋白與該異源部分之VWF連接子的嵌合分子，其中該VWF連接子包含選自以下之多肽：(i)來自因子VIII(FVIII)之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合，且其中該XTEN序列連接至該VWF蛋白、該異源部分(H1)、該VWF連接子或其任何組合。在一個實施例中，該XTEN序列連接VWF蛋白與VWF連接子或者VWF連接子與異源部分。在另一實施例中，該 嵌合分子進一步包含包括FVIII蛋白之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈彼此締合。在其他實施例中，嵌合分子中之FVIII蛋白進一步包含另一XTEN序列。該另一XTEN序列可連接至FVIII蛋白之N端或C端或者插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間。在其他實施例中，第二多肽鏈進一步包含第二異源部分(H2)。
本揭示內容亦包括一種嵌合分子，其包括包含VWF蛋白、異源部分(H1)及連接該VWF蛋白與該異源部分(H1)之VWF連接子之第一多肽鏈及包含FVIII蛋白及XTEN序列之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈中之該VWF連接子包含：(i)來自FVIII之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合，且其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈彼此締合。在一個實施例中，該XTEN序列連接至FVIII蛋白之N端或C端或者插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間。在另一實施例中，該嵌合分子進一步包含另一XTEN序列，其連接至該VWF蛋白、該異源部分、該VWF連接子或其任何組合。在其他實施例中，該嵌合分子進一步包含第二異源部分(H2)。在其他實施例中，該第二異源部分連接至FVIII蛋白、XTEN序列，或兩者。
對於本揭示內容之嵌合分子，連接至嵌合分子中之VWF蛋白、VWF連接子、FVIII蛋白或任何其他組分之XTEN序列包含約42個胺基酸、約72個胺基酸、約108 個胺基酸、約144個胺基酸、約180個胺基酸、約216個胺基酸、約252個胺基酸、約288個胺基酸、約324個胺基酸、約360個胺基酸、約396個胺基酸、約432個胺基酸、約468個胺基酸、約504個胺基酸、約540個胺基酸、約576個胺基酸、約612個胺基酸、約624個胺基酸、約648個胺基酸、約684個胺基酸、約720個胺基酸、約756個胺基酸、約792個胺基酸、約828個胺基酸、約836個胺基酸、約864個胺基酸、約875個胺基酸、約912個胺基酸、約923個胺基酸、約948個胺基酸、約1044個胺基酸、約1140個胺基酸、約1236個胺基酸、約1318個胺基酸、約1332個胺基酸、約1428個胺基酸、約1524個胺基酸、約1620個胺基酸、約1716個胺基酸、約1812個胺基酸、約1908個胺基酸或約2004個胺基酸。在一些實施例中，XTEN多肽係選自AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288或AG144。在其他實施例中，XTEN多肽係選自SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：42。
在其他態樣中，嵌合分子中之另一XTEN序列包含約42個胺基酸、約72個胺基酸、約108個胺基酸、約144個胺基酸、約180個胺基酸、約216個胺基酸、約252個胺基酸、約288個胺基酸、約324個胺基酸、約360個胺基酸、約396個胺基酸、約432個胺基酸、約468個胺基酸、 約504個胺基酸、約540個胺基酸、約576個胺基酸、約612個胺基酸、約624個胺基酸、約648個胺基酸、約684個胺基酸、約720個胺基酸、約756個胺基酸、約792個胺基酸、約828個胺基酸、約836個胺基酸、約864個胺基酸、約875個胺基酸、約912個胺基酸、約923個胺基酸、約948個胺基酸、約1044個胺基酸、約1140個胺基酸、約1236個胺基酸、約1318個胺基酸、約1332個胺基酸、約1428個胺基酸、約1524個胺基酸、約1620個胺基酸、約1716個胺基酸、約1812個胺基酸、約1908個胺基酸或約2004個胺基酸。在一些實施例中，另一XTEN多肽係選自AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288或AG144。在某些實施例中，另一XTEN多肽係選自SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：42。
在一個實施例中，可用於連接嵌合分子中之VWF蛋白與異源部分之VWF連接子包含a2區域，其包含與對應於全長FVIII之Glu720至Arg740具至少約80%、約85%、約90%、約95%或100%一致性的胺基酸序列，其中該a2區域能夠由凝血酶裂解。在一特定實施例中，a2區域包含ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：4)。在另一實施例中，可用於連接VWF蛋白與異源部分之VWF連接子包含a1區域，其包含與對應於全長 FVIII之Met337至Arg372具至少約80%、約85%、約90%、約95%或100%一致性的胺基酸序列，其中該a1區域能夠由凝血酶裂解。在一些實施例中，a1區域包含ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(SEQ ID NO：5)。
在其他實施例中，可用於連接VWF蛋白與異源部分之VWF連接子包含a3區域，其包含與對應於全長FVIII之Glu1649至Arg1689具至少約80%、約85%、約90%、約95%或100%一致性的胺基酸序列，其中該a3區域能夠由凝血酶裂解。在一特定實施例中，a3區域包含ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ(SEQ ID NO：6)。
在其他實施例中，可用於連接VWF蛋白與異源部分之VWF連接子包含包括X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，且其中該PAR1外位點相互作用基元包含S-F-L-L-R-N(SEQ ID NO：7)。在一個實施例中，PAR1外位點相互作用基元進一步包含選自以下之序列：P、P-N、P-N-D、P-N-D-K(SEQ ID NO：8)、P-N-D-K-Y(SEQ ID NO：9)、P-N-D-K-Y-E(SEQ ID NO：10)、P-N-D-K-Y-E-P(SEQ ID NO：11)、P-N-D-K-Y-E-P-F(SEQ ID NO：12)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W(SEQ ID NO：13)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(SEQ ID NO：14)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(SEQ ID NO：20)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(SEQ ID NO：21)、P-N-D-K-Y-E-P-F- W-E-D-E-E(SEQ ID NO：22)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(SEQ ID NO：23)或其任何組合。在其他實施例中，其中該脂族胺基酸係選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸。在一特定實施例中，VWF連接子包含GGLVPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEES(SEQ ID NO：24)。
在某些實施例中，若在嵌合分子中用凝血酶裂解位點替代VWF連接子，則凝血酶裂解VWF連接子之速率比凝血酶將裂解凝血酶裂解位點之速率快。在其他實施例中，若在嵌合分子中用凝血酶裂解位點替代VWF連接子，則凝血酶裂解VWF連接子之速率為凝血酶將裂解凝血酶裂解位點之速率的至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍或至少約100倍。
在一些實施例中，VWF連接子進一步包含具有至少約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸之長度的一或多個胺基酸。在一個實例中，該一或多個胺基酸包含gly肽。在另一實例中，該一或多個胺基酸包含GlyGly。在其他實例中，該一或多個胺基酸包含gly/ser肽。在一些實例中，該gly/ser肽具有(Gly4Ser)n或S(Gly4Ser)n之式，其中n為選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100之正整數。在某些實例中，(Gly4Ser)n連接子為(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：89)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：90)。
可用於本發明之嵌合分子之VWF蛋白可包含VWF之D'結構域及D3結構域，其中該D'結構域及該D3結構域能夠結合至FVIII蛋白。在一個實施例中，VWF蛋白之D'結構域包含與SEQ ID NO：2之胺基酸764至866具至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在另一實施例中，VWF蛋白之D3結構域包含與SEQ ID NO：2之胺基酸867至1240具至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在其他實施例中，VWF蛋白在對應於SEQ ID NO：2之殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142之殘基處含有至少一個胺基酸取代。在其他實施例中，在VWF蛋白之序列中，用除半胱胺酸之外的胺基酸取代對應於SEQ ID NO：2之殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142之殘基。在其他實施例中，VWF蛋白之序列包含SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240。在某些實施例中，VWF蛋白進一步包含VWF之D1結構域、D2結構域、或D1及D2結構域。在一些實施例中，VWF蛋白進一步包含選自A1結構域、A2結構域、A3結構域、D4結構域、B1結構域、B2結構域、B3結構域、C1結構域、C2結構域、CK結構域、其一或多個片段或其任何組合之VWF結構域。在其他實施例中，VWF蛋白基本 上由以下組成或由以下組成：(1)VWF之D'及D3結構域或其片段；(2)VWF之D1、D'及D3結構域或其片段；(3)VWF之D2、D'及D3結構域或其片段；(4)VWF之D1、D2、D'及D3結構域或其片段；或(5)VWF之D1、D2、D'、D3及A1結構域或其片段。在其他實施例中，VWF蛋白進一步包含VWF之信號肽。在其他實施例中，VWF蛋白經聚乙二醇化、糖基化、羥乙基澱粉化(hesylated)或聚唾液酸化。術語「聚乙二醇化」係指在蛋白質上具有聚乙二醇(PEG)；術語「糖基化」係指在蛋白質上具有糖基化；術語「羥乙基澱粉化」係指在蛋白質上具有羥乙基澱粉(HES)；以及術語「聚唾液酸化」係指在蛋白質上具有聚唾液酸(PSA)。PEG、HES及PSA之實例顯示於本文他處。
在一些態樣中，經由VWF連接子與VWF蛋白融合之異源部分(H1)能夠延長嵌合分子之半衰期。在一個實施例中，異源部分(H1)包含免疫球蛋白恆定區或其部分、白蛋白、白蛋白結合部分、PAS、HAP、轉鐵蛋白或其片段、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、PSA、人類絨毛膜促性腺激素之β亞單位之C端肽(CTP)或其任何組合。在另一實施例中，異源部分包含FcRn結合搭配物。在其他實施例中，異源部分包含Fc區。在其他實施例中，異源部分(H1)包含清除受體或其片段，其中該清除受體阻斷FVIII蛋白結合於FVIII清除受體。在一些實施例中，其中該清除受體為低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)或其FVIII結合片段。
在一些態樣中，經由視情況選用之FVIII連接子與FVIII蛋白融合之第二異源部分包含免疫球蛋白恆定區或其部分、白蛋白、白蛋白結合多肽、PAS、人類絨毛膜促性腺激素之β亞單位之C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合小分子或其任何組合。在一個實施例中，第二異源部分(H2)能夠延長FVIII蛋白之半衰期。在另一實施例中，第二異源部分(H2)包含多肽、非多肽部分，或兩者。在其他實施例中，第二異源部分(H2)包含免疫球蛋白恆定區或其部分。在其他實施例中，第二異源部分包含FcRn結合搭配物。在其他實施例中，第二異源部分包含第二Fc區。
在一些實施例中，經由VWF連接子與VWF蛋白融合之第一異源部分與經由視情況選用之連接子與FVIII蛋白融合之第二異源部分彼此締合，其中XTEN序列與該等組分中之任一者融合。在一個實施例中，第一多肽鏈與第二多肽之間的締合為共價鍵。在另一實施例中，第一異源部分與第二異源部分之間的締合為二硫鍵。在其他實施例中，第一異源部分為FcRn結合搭配物且第二異源部分為FcRn結合搭配物。在其他實施例中，第一異源部分為Fc區，且第二異源部分為Fc區。
在某些實施例中，FVIII蛋白係藉由FVIII連接子連接至第二異源部分。在一個實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在另一實施例中，FVIII連接子與VWF連接子相同。在其他實施例中，FVIII連接子與VWF連接子 不同。
在一些態樣中，本發明之嵌合分子包含選自以下之式：(a)V-L1-X1-H1：H2-L2-X2-C；(b)V-X1-L1-H1：H2-L2-X2-C；(c)V-L1-X1-H1：H2-X2-L2-C；(d)V-X1-L1-H1：H2-X2-L2-C；(e)V-L1-X1-H1：H2-L2-C(X2)；(f)V-X1-L1-H1：H2-L2-C(X2)；(g)C-X2-L2-H2：H1-X1-L1-V；(h)C-X2-L2-H2：H1-L1-X1-V；(i)C-L2-X2-H2：H1-L1-X1-V；(j)C-L2-X2-H2：H1-L1-X1-V；(k)C(X2)-L2-H2：H1-X1-L1-V；或(1)C(X2)-L2-H2：H1-L1-X1-V；其中V為VWF蛋白；L1為VWF連接子；L2為視情況選用之FVIII連接子；H1為第一異源部分；H2為第二異源部分；X1為XTEN序列；X2為視情況選用之XTEN序列；C為FVIII蛋白；C(X2)為與XTEN序列融合之FVIII蛋白，其中該XTEN序列插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；以及(：)為H1與H2之間的共價鍵。
在其他態樣中，嵌合分子包含選自以下之式：(a)V-L1-X1-H1：H2-L2-X2-C；(b)V-X1-L1-H1：H2-L2-X2-C；(c)V-L1-X1-H1：H2-X2-L2-C；(d)V-X1-L1-H1：H2-X2-L2-C；(e)V-L1-X1-H1：H2-L2-C(X2)；(f)V-X1-L1-H1：H2-L2-C(X2)；(g)C-X2-L2-H2：H1-X1-L1-V；(h)C-X2-L2-H2：H1-L1-X1-V；(i)C-L2-X2-H2：H1-L1-X1-V；(j)C-L2-X2-H2：H1-L1-X1-V；(k)C(X2)-L2-H2：H1-X1-L1-V；或(1)C(X2)-L2-H2：H1-L1-X1-V；其中V為VWF蛋白；L1為VWF連接子；L2為視情況選用之FVIII連接 子；H1為第一異源部分；H2為第二異源部分；X1為視情況選用之XTEN序列；X2為XTEN序列；C為FVIII蛋白；C(X2)為與XTEN序列融合之FVIII蛋白，其中該XTEN序列插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；以及(：)為H1與H2之間的共價鍵。
在本發明之嵌合分子中，VWF蛋白可抑制或防止內源性VWF結合於FVIII蛋白。
在某些態樣中，嵌合分子中之FVIII蛋白可包含第三異源部分(H3)。該第三異源部分(H3)可為XTEN序列。在其他態樣中，FVIII蛋白包含第四異源部分(H4)。該第四異源部分(H4)可為XTEN序列。在一些態樣中，FVIII蛋白包含第五異源部分(H5)。該第五異源部分可為XTEN序列。在其他態樣中，FVIII蛋白包含第六異源部分(H6)。該第六異源部分可為XTEN序列。在某些態樣中，第三異源部分(H3)、第四異源部分(H4)、第五異源部分(H5)及第六異源部分(H6)中之一或多者能夠延長嵌合分子之半衰期。在其他態樣中，第三異源部分(H3)、第四異源部分(H4)、第五異源部分(H5)及第六異源部分(H6)連接至FVIII之C端或N端或者插入FVIII蛋白之兩個胺基酸之間。在其他態樣中，第三異源部分、第四異源部分、第五異源部分及第六異源部分中之一或多者包含選自約42個胺基酸、約72個胺基酸、約108個胺基酸、約144個胺基酸、約180個胺基酸、約216個胺基酸、約252個胺基酸、約288個胺基酸、約324個胺基酸、約360個胺基酸、約396個胺基 酸、約432個胺基酸、約468個胺基酸、約504個胺基酸、約540個胺基酸、約576個胺基酸、約612個胺基酸、約624個胺基酸、約648個胺基酸、約684個胺基酸、約720個胺基酸、約756個胺基酸、約792個胺基酸、約828個胺基酸、約836個胺基酸、約864個胺基酸、約875個胺基酸、約912個胺基酸、約923個胺基酸、約948個胺基酸、約1044個胺基酸、約1140個胺基酸、約1236個胺基酸、約1318個胺基酸、約1332個胺基酸、約1428個胺基酸、約1524個胺基酸、約1620個胺基酸、約1716個胺基酸、約1812個胺基酸、約1908個胺基酸或約2004個胺基酸中之一或多者之長度。舉例而言，第三異源部分、第四異源部分、第五異源部分或第六異源部分之XTEN序列可選自AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288或AG144。更特定言之，XTEN序列可選自SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：42。
在某些實施例中，嵌合分子之半衰期相比於野生型FVIII延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
本揭示內容亦提供編碼嵌合分子或其互補序 列之聚核苷酸或一組聚核苷酸。該聚核苷酸或該組聚核苷酸可進一步包含編碼PC5或PC7之聚核苷酸鏈。
亦包括包含該聚核苷酸或該組聚核苷酸及可操作地連接至該聚核苷酸或該組聚核苷酸之一或多個啟動子的載體或一組載體。在一些實施例中，該載體或該組載體可進一步包含編碼PC5或PC7之另一聚核苷酸鏈。
本發明亦包括一種宿主細胞，其包含該聚核苷酸或該組聚核苷酸或者該載體或該組載體。在一個實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在另一實施例中，宿主細胞係選自HEK293細胞、CHO細胞或BHK細胞。
在一些態樣中，本發明包括一種醫藥組合物，其包含本文揭示之嵌合分子、編碼該嵌合分子之聚核苷酸或一組聚核苷酸、包含該聚核苷酸或該組聚核苷酸之載體或一組載體、或本文揭示之宿主細胞，及醫藥學上可接受之載劑。在一個實施例中，該組合物中之嵌合分子相比於野生型FVIII蛋白具有延長之半衰期。在另一實施例中，其中組合物中之嵌合分子之半衰期相比於野生型FVIII延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
亦包括一種降低有需要之個體中出血事件之頻率或程度的方法，其包括施用有效量之本文揭示之嵌合分子、編碼該嵌合分子之聚核苷酸或一組聚核苷酸、本文 揭示之載體或一組載體、本文揭示之宿主細胞、或本文揭示之組合物。本發明亦包括一種預防有需要之個體中出血事件之發生的方法，其包括施用有效量之本文揭示之嵌合分子、編碼該嵌合分子之聚核苷酸或一組聚核苷酸、本文揭示之載體或一組載體、本文揭示之宿主細胞、或本文揭示之組合物。在一個實施例中，出血事件係來自出血凝血障礙、關節積血、肌肉出血、口腔出血、溢血、溢血進入肌肉、口腔溢血、創傷、創傷性頭癬、胃腸道出血、顱內溢血、腹內溢血、胸內溢血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血、髖腰肌鞘中出血或其任何組合。在另一實施例中，本文揭示之嵌合分子、編碼該嵌合分子之聚核苷酸或一組聚核苷酸、本文揭示之載體或一組載體、本文揭示之宿主細胞或本文揭示之組合物可藉由選自局部施用、眼內施用、非經腸施用、鞘內施用、硬膜下施用、經口施用或其任何組合之途徑施用。
本揭示內容亦包括一種製備嵌合分子之方法，其包括用本文揭示之聚核苷酸或本文揭示之載體轉染一或多個宿主細胞且在該宿主細胞中表現該嵌合分子。該方法進一步包含分離該嵌合分子。在一些實施例中，嵌合分子之FVIII活性可藉由aPTT檢定或ROTEM檢定量測。
圖1顯示包含兩個多肽鏈之嵌合分子(FVIII-XTEN/VWF異質二聚體)之例示圖，第一個鏈包含經由凝 血酶可裂解VWF連接子與Fc區融合之VWF蛋白(例如，VWF之D'結構域及D3結構域)並且第二個鏈包含經由FVIII連接子與第二Fc區融合之FVIII蛋白。該FVIII蛋白在FVIII之多個結構域中包含一或多個XTEN。
圖2顯示各種VWF構築體，各構築體包含經由凝血酶可裂解VWF連接子與Fc區融合之D'結構域及D3結構域，對照物(亦即，VWF-052)除外。VWF-031包含包括L-V-P-R(SEQ ID NO：25)之凝血酶裂解位點的具有48個胺基酸之連接子。VWF-034包含具有288個胺基酸之XTEN序列及包含L-V-P-R(SEQ ID NO：25)之凝血酶裂解位點的具有35個胺基酸之連接子。VWF-035包含包括L-V-P-R(SEQ ID NO：25)之凝血酶裂解位點的具有73個胺基酸之連接子。VWF-036包含包括L-V-P-R(SEQ ID NO：25)之凝血酶裂解位點的具有98個胺基酸之連接子。VWF-039包含包括L-V-P-R(SEQ ID NO：25)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元的具有26個胺基酸之VWF連接子。VWF-051包含包括A-L-R-P-R-V-V(SEQ ID NO：26)之凝血酶裂解位點的具有54個胺基酸之連接子。VWF-052包含不具有任何凝血酶裂解位點之具有48個胺基酸之連接子(對照物)。VWF-054包含包括來自FVIII之a1區域的具有40個胺基酸之VWF連接子。VWF-055包含包括來自FVIII之a2區域的具有34個胺基酸之VWF連接子。VWF-056包含包括來自FVIII之a3區域的具有46個胺基酸之VWF連接子。
圖3A顯示VWF-Fc融合構築體、亦即VWF- 031、VWF-034、VWF-036、VWF-039、VWF-051及VWF-052之凝血酶介導性裂解速率(單位為共振單位/秒(RU/s))隨捕捉密度(單位為RU)變化之函數關係。圖3B顯示VWF-Fc融合構築體、亦即VWF-031、VWF-034、VWF-036、VWF-051及VWF-052之凝血酶介導性裂解速率(單位為共振單位/秒(RU/s))隨捕捉密度(單位為RU)變化之函數關係。在此等實驗中，各VWF-Fc融合構築體以不同密度捕捉且隨後暴露於固定濃度之人類α-凝血酶。圖3A及圖3B中各曲線之斜率直接反映各構築體之凝血酶裂解易感性，裂解速率與起始捕捉含量成正比。
圖4A顯示VWF-Fc融合構築體、亦即VWF-054、VWF-055及VWF-056之凝血酶介導性裂解速率(單位為共振單位/秒(RU/s))隨捕捉密度(單位為RU)變化之函數關係。圖4B顯示VWF-Fc融合構築體、亦即VWF-031、VWF-039、VWF-054、VWF-055及VWF-056之凝血酶介導性裂解速率(單位為共振單位/秒(RU/s))隨捕捉密度(單位為RU)變化之函數關係。在此等實驗中，各VWF-Fc融合構築體以不同密度捕捉且隨後暴露於固定濃度之人類α-凝血酶。圖4A及圖4B中各曲線之斜率直接反映各構築體之凝血酶裂解易感性。
圖5顯示測定各種VWF-Fc構築體VWF-031、VWF-034、VWF-036、VWF-039、VWF-051、VWF-052、VWF-054、VWF-055及VWF-056對於凝血酶介導性裂解之易感性之線性回歸分析的結果。數值以s-1為單位表示且反映圖3及圖4中所示之曲線的斜率。兩種不同構築體之相對 易感性係得自其相應斜率之商。斜率VWF-039/斜率VWF-031為71，指示VWF-Fc融合構築體VWF-039對於凝血酶介導性裂解之易感性為VWF-031之71倍。斜率VWF-055/斜率VWF-031為65，以及斜率VWF-051/斜率VWF-031為1.8。
圖6顯示藉由全血ROTEM檢定所量測之各種嵌合分子於HemA患者中之凝血時間。FVII155/VWF-031包含兩個多肽鏈，第一個鏈包含與Fc區融合之BDD FVIII且第二個鏈包含經由最小凝血酶裂解位點(亦即，L-V-P-R(SEQ ID NO：25))與Fc區融合之VWF之D'結構域及D3結構域。FVII155/VWF-039包含兩個多肽鏈，第一個鏈包含與Fc區融合之BDD FVIII且第二個鏈包含經由包含L-V-P-R(SEQ ID NO：25)及PAR1外位點相互作用基元之VWF連接子與Fc區融合的VWF之D'結構域及D3結構域。FVII155/VWF-055包含兩個多肽鏈，第一個鏈包含與Fc區融合之BDD FVIII且第二個鏈包含經由包含來自FVIII之a2區域之VWF連接子與Fc區融合的VWF之D'結構域及D3結構域。
圖7顯示代表性FVIII-VWF異質二聚體以及FVIII169、FVIII286、VWF057、VWF059及VWF062構築體之圖。舉例而言，FVIII169構築體包含與Fc區融合之具有R1648A取代之B結構域缺失FVIII蛋白，其中在對應於成熟全長FVIII之胺基酸745處插入XTEN序列(例如，AE288)(A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-Fc)。FVIII286構築體包含與Fc區融合之具有R1648取代之B結構 域缺失FVIII蛋白，其中在對應於成熟全長FVIII之胺基酸745處插入XTEN序列(例如，AE288)，在FVIII與Fc之間具有另一a2區域(A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-a2-Fc)。VWF057為包含經由VWF連接子連接至Fc區之VWF蛋白之D'D3結構域(在D'D3結構域中具有兩個胺基酸取代，亦即，C336A及C379A)的VWF-Fc融合構築體，該VWF連接子包含LVPR凝血酶位點(「LVPR」)及GS連接子(「GS」)，其中XTEN序列(亦即144XTEN)插入D'D3結構域與VWF連接子之間(D'D3-144XTEN-GS+LVPR-Fc)。VWF059為包含經由作為VWF連接子之酸性區域2(a2)區域連接至Fc區之VWF蛋白之D'D3結構域(在D'D3結構域中具有兩個胺基酸取代，亦即，C336A及C379A)的VWF-Fc融合構築體，其中XTEN序列插入D'D3結構域與VWF連接子之間。VWF062為包含連接至Fc區之VWF蛋白之D'D3結構域(在D'D3結構域中具有兩個胺基酸取代，亦即，C336A及C379A)的VWF-Fc融合構築體，其中XTEN序列插入D'D3結構域與Fc區之間(D'D3-144XTEN-Fc)。
圖8顯示FVIII-XTEN-Fc/D'D3-連接子-Fc異質二聚體(亦即，FVIII169/VWF034、FVIII169/VWF059及FVIII169/VWF057)相比於B結構域缺失FVIII(「SQ BDD FVIII」或「BDD-rFVIII」)或媒劑對照物在HemA小鼠尾部剪斷模型中之急性功效。BDD-rFVIII以圓形顯示，而FVIII169/VWF034以正方形顯示，FVIII169/VWF059以三角形顯示，FVIII169/VWF057以中空圓形顯示，以及媒劑 以倒三角形顯示。VWF034為包含經由VWF連接子與Fc區融合之VWF之D'結構域及D3結構域的VWF-Fc融合構築體，該VWF連接子包含LVPR，其中XTEN序列(亦即288XTEN)插入D'D3結構域與VWF連接子之間(D'D3-288XTEN-LVPR-Fc)。FVIII169、VWF059及VWF057之構築體詳情示於本文他處。在各治療組中給與75IU/kg構築體之後的小鼠中值失血量(uL)由水平線指示。
本發明係針對包含XTEN序列及連接VWF蛋白或FVIII蛋白與異源部分(例如，半衰期延長部分)之凝血酶可裂解連接子的嵌合分子。本發明亦提供包含兩個多肽鏈之嵌合分子，第一個鏈包含與異源部分融合之VWF蛋白，且第二個鏈包含FVIII蛋白及第二異源部分，其中該嵌合分子在該第一或第二多肽鏈中包含XTEN序列且其中該VWF蛋白或該FVIII蛋白(或兩者)經由VWF連接子或FVIII連接子(或兩者)與異源部分融合。該凝血酶可裂解連接子(VWF連接子或FVIII連接子)可在容易獲得凝血酶之損傷部位由凝血酶有效裂解。例示性嵌合分子說明於本說明書及圖式中。在一些實施例中，本發明係關於具有例如圖1至圖7中所示之結構的嵌合分子。在其他實施例中，本發明係關於編碼本文所揭示之嵌合分子構築體之聚核苷酸。
為提供對本說明書及申請專利範圍之清晰理解，下文提供以下定義。
I.定義
應注意到，術語「一個」實體係指一或多個該實體；例如，「核苷酸序列」應理解為表示一或多個核苷酸序列。因而，術語「一個」、「一或多個」及「至少一個」在本文可互換使用。
術語「約」在本文用於意謂大約、大致、左右或附近。當術語「約」與數值範圍結合使用時，其藉由擴展邊界高於及低於所述數值來調節該範圍。一般而言，術語「約」在本文用於調節數值高於及低於所述值，變化為±10%(更高或更低)。
術語「聚核苷酸」或「核苷酸」意欲涵蓋單數個核酸以及複數個核酸，且係指分離之核酸分子或構築體，例如，信使RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。在某些實施例中，聚核苷酸包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如，醯胺鍵，諸如見於肽核酸(PNA)中)。術語「核酸」係指聚核苷酸中存在之任何一或多個核酸區段，例如，DNA或RNA片段。「分離之」核酸或聚核苷酸意指已自其自然環境中移出之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，就本發明而言，編碼載體中所含之因子VIII多肽之重組聚核苷酸視為分離的。分離聚核苷酸之其他實例包括保持於異源宿主細胞中或於溶液中自其他聚核苷酸純化(部分地或實質上)之重組聚核苷酸。分離RNA分子包括本發明之聚核苷酸之活體內或活體外RNA轉錄物。根據本發明之分離 聚核苷酸或核酸進一步包括合成產生之此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可包括調控元件，諸如啟動子、增強子、核糖體結合位點或轉錄終止信號。
如本文所用，「編碼區」或「編碼序列」為聚核苷酸之一部分，其由可轉譯成胺基酸之密碼子組成。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)通常並不轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區之一部分，但任何側接序列，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子以及其類似物，並非編碼區之一部分。編碼區之邊界通常在5'端由起始密碼子決定，其編碼所得多肽之胺基端，以及在3'端由轉譯終止密碼子決定，其編碼所得多肽之羧基端。本發明之兩個或更多個編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如，單一載體上，或單獨聚核苷酸構築體中，例如，單獨(不同)載體上。反之，單一載體可僅含有單一編碼區，或者包含兩個或更多個編碼區，例如，單一載體可獨立編碼如下所述之嵌合分子之第一多肽鏈及第二多肽鏈。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼與編碼本發明嵌合分子之核酸融合或未融合之異源編碼區。異源編碼區包括(不限於)專業元件或基元，諸如分泌信號肽或異源功能結構域。
由哺乳動物細胞分泌之某些蛋白質與分泌信號肽締合，一旦生長蛋白鏈穿過粗面內質網之輸出已起始，即自成熟蛋白質裂解出該分泌信號肽。一般技術者認識到，信號肽一般與多肽之N端融合，且自完整或「全長」 多肽裂解以產生分泌或「成熟」形式之多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽，例如FVIII信號肽或VWF信號肽，或者保留引導可操作性締合之多肽分泌之能力的該序列之功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，例如，人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖苷酸酶信號肽，或其功能衍生物。
術語「下游」係指位於參考核苷酸序列之3'的核苷酸序列。在某些實施例中，下游核苷酸序列係指在轉錄起始點後之序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點下游。
術語「上游」係指位於參考核苷酸序列之5'的核苷酸序列。在某些實施例中，上游核苷酸序列係指位於編碼區之5'側或轉錄起始點上之序列。舉例而言，大部分啟動子位於轉錄起始位點上游。
如本文所用，術語「調控區」係指位於編碼區上游(5'非編碼序列)、其內或下游(3'非編碼序列)且影響所締合之編碼區之轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯之核苷酸序列。調控區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點及莖-環結構。若編碼區意欲表現於真核細胞中，則多腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'。
編碼基因產物(例如，多肽)之聚核苷酸可包括啟動子及/或與一或多個編碼區可操作性締合之其他轉錄或轉譯控制元件。在可操作締合中，基因產物(例如，多 肽)之編碼區以使得基因產物之表現處於一或多個調控區之影響或控制下之方式與該一或多個調控區締合。舉例而言，若啟動子功能之誘導導致編碼由編碼區編碼之基因產物之mRNA的轉錄，並且若啟動子與編碼區之間之連接的性質不幹擾啟動子引導基因產物表現之能力或不幹擾待轉錄之DNA模板之能力，則該編碼區與該啟動子係「可操作性締合」。除啟動子之外，其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、阻遏子及轉錄終止信號亦可與編碼區可操作性締合以引導基因產物表現。
多種轉錄控制區為熟習此項技術者所知。其包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如(但不限於)來自巨細胞病毒(立即早期啟動子，結合內含子-A)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如Rous肉瘤病毒)之啟動子及增強子區段。其他轉錄控制區包括源自脊椎動物基因者，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他合適之轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及淋巴因子誘導性啟動子(例如，可由幹擾素或介白素誘導之啟動子)。
類似地，多種轉譯控制元件為一般技術者所知。其包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及源自小核糖核酸病毒之元件(尤其是內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。
如本文所用之術語「表現」係指聚核苷酸產 生基因產物(例如，RNA或多肽)之過程。其包括(但不限於)將聚核苷酸轉錄成信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小幹擾RNA(siRNA)或任何其他RNA產物，以及將mRNA轉譯成多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸，例如，由基因轉錄產生之信使RNA，或自轉錄物轉譯之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如，多腺苷酸化或剪接)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如，甲基化、糖基化、添加脂質、與其他蛋白質亞單位締合，或蛋白水解裂解)之多肽。
「載體」係指用於將核酸選殖及/或轉移至宿主細胞中之任何運載體。載體可為可連接至另一核酸區段以產生所連接區段之複製的複製子。「複製子」係指在活體內充當自主複製單元，亦即能夠在其自身控制下複製之任何遺傳元件(例如，質體、噬菌體、黏粒、染色體、病毒)。術語「載體」包括在活體外、離體或在活體內用於將核酸引入細胞中之病毒及非病毒運載體。大量載體為已知的且用於此項技術中，包括例如質體、經修飾真核病毒或經修飾細菌病毒。可藉由將適當聚核苷酸片段連接至具有互補性黏性末端之所選載體來將聚核苷酸插入合適載體中。
載體可經工程改造以編碼可選擇標記或報導體，其提供已併有該載體之細胞之選擇或鑒別。可選擇標記或報導體之表現允許鑒別及/或選擇併有且表現於載體 上所含之其他編碼區之宿主細胞。此項技術中已知且使用之可選擇標記基因之實例包括：提供對胺苄青黴素、鏈黴素、慶大黴素、卡那黴素、潮黴素、畢拉草除草劑、磺醯胺及其類似物具抗性之基因；以及用作表型標記之基因，亦即，花青素調控基因、異戊烯基轉移酶基因及其類似物。此項技術中已知且使用之報導體之實例包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、-半乳糖苷酶(LacZ)、-葡糖苷酸酶(Gus)及其類似物。可選擇標記亦可視為報導體。
術語「質體」係指通常帶有並非細胞中心代謝部分之基因的染色體外元件，並且通常呈環狀雙鏈DNA分子形式。該等元件可為源自任何來源之單鏈或雙鏈DNA或RNA之線性、環狀或超螺旋狀自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中多個核苷酸序列已經接合或重組成獨特構造，其能夠將所選基因產物之啟動子片段及DNA序列與適當的3'非轉譯序列一起引入細胞中。
可使用之真核病毒載體包括(但不限於)腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒(例如牛痘病毒)載體、杆狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。
「選殖載體」係指「複製子」，其為連續複製之單位長度之核酸並且其包含複製起點，諸如質體、噬菌體或黏粒，另一個核酸區段可與其連接以產生所連接區 段之複製。某些選殖載體能夠於一種細胞類型(例如細菌)中複製且於另一種細胞類型(例如真核細胞)中表現。選殖載體通常包含可用於選擇包含載體之細胞的一或多個序列及/或用於插入相關核酸序列之一或多個多選殖位點。
術語「表現載體」係指經設計以實現所插入核酸序列在插入宿主細胞中之後之表現的運載體。所插入核酸序列與如上所述之調控區處於可操作性締合。
藉由此項技術中熟知之方法將載體引入宿主細胞中，例如，轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂質轉染(溶酶體融合)、使用基因槍、或DNA載體轉運體。
如本文所用之「培養」意謂在允許細胞生長或分裂或維持細胞處於存活狀態之活體外條件下培育細胞。如本文所用之「經培養細胞」意謂在活體外繁殖之細胞。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數個「多肽」以及複數個「多肽」，且係指由藉由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)組成的分子。術語「多肽」係指具有兩個或更多個胺基酸之任何一或多個鏈，且並非指代特定長度之產物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指代具有兩個或更多個胺基酸之一或多個鏈的任何其他術語包括於「多肽」之定義內，且術語「多肽」可替代任何此等術語使用或與任何此等術語互換使用。術語「多肽」亦意欲指代多肽之表 現後修飾產物，該等修飾包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團衍生、蛋白水解裂解或藉由非天然存在之胺基酸進行修飾。多肽可源自天然生物來源或產生重組技術，但未必自所設計之核酸序列轉譯。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成。
「分離」多肽或其片段、變異體或衍生物係指並非處於其天然環境中之多肽。不需要特定程度之純化。舉例而言，分離多肽可簡單地自其自然或天然環境移除。就本發明而言，表現於宿主細胞中之重組產生多肽及蛋白質視為分離的，因為原生或重組多肽已藉由任何合適技術分離、分餾、或部分地或實質上純化。
本發明中亦包括多肽之片段或變異體及其任何組合。術語「片段」或「變異體」當指代本發明之多肽結合域或結合分子時，包括保留參考多肽之至少一些特性(例如，FcRn結合域或Fc變異體之FcRn結合親和力、FVIII變異體之凝血活性，或VWF蛋白之FVIII結合活性)的任何多肽。除本文他處所討論之特定抗體片段之外，多肽之片段包括蛋白水解片段，以及缺失片段，但不包括天然存在之全長多肽(或成熟多肽)。本發明之多肽結合域或結合分子之變異體包括如上文所述之片段，以及由於胺基酸取代、缺失或插入而具有改變之胺基酸序列的多肽。變異體可為天然存在或非天然存在的。非天然存在之變異體可使用此項技術中已知之突變誘發技術產生。變異多肽可包含保守性或非保守性胺基酸取代、缺失或添加。
本文使用之術語「VWF片段」意謂與FVIII相互作用且保留通常由全長VWF向FVIII提供之至少一或多種特性的任何VWF片段，例如，預防FVIIIa過早活化、預防過早蛋白水解、預防可導致過早清除的與磷脂膜之締合、預防與可結合裸FVIII但不結合VWF結合FVIII之FVIII清除受體的結合，及/或穩定FVIII重鏈及輕鏈相互作用。在一特定實施例中，如本文所用之「VWF片段」包含VWF蛋白之D’結構域及D3結構域，但不包括VWF蛋白之A1結構域、A2結構域、A3結構域、D4結構域、B1結構域、B2結構域、B3結構域、C1結構域、C2結構域及CK結構域。
如本文所用之術語「半衰期限制因子」或「FVIII半衰期限制因子」指示防止FVIII蛋白之半衰期相比於野生型FVIII(例如，ADVATE®或REFACTO®)為其1.5倍或2倍之因子。舉例而言，全長或成熟VWF可藉由利用一或多種VWF清除路徑誘導FVIII與VWF複合物自系統清除而充當FVIII半衰期限制因子。在一個實例中，內源性VWF為FVIII半衰期限制因子。在另一實例中，與FVIII蛋白非共價結合之全長重組VWF分子為FVIII半衰期限制因子。
如本文所用之術語「內源性VWF」指示血漿中天然存在之VWF分子。該內源性VWF分子可為多聚體，但可為單體或二聚體。血漿中之內源性VWF結合於FVIII且與FVIII形成非共價複合物。
「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有 類似側鏈之胺基酸殘基置換的胺基酸取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已於此項技術中定義，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電之極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分枝側鏈(例如，酥胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自相同側鏈家族之另一胺基酸置換，則將該取代視為保守性。在另一實施例中，一串胺基酸可經側鏈家族成員在結構上類似而次序及/或組成不同之串保守性置換。
如此項技術中已知，兩個多肽之間的「序列一致性」係藉由比較一個多肽之胺基酸序列與第二多肽之序列來確定。當在本文中討論時，可使用此項技術中已知之方法及電腦程式/軟體(諸如但不限於BESTFIT程式)(Wisconsin序列分析套件，Unix第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)來測定任何特定多肽是否與另一多肽具至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性。BESTFIT使用Smith及Waterman,Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)之局部同源性演算法來找出兩個序列之間的最佳同源性區段。當 使用BESTFIT或任何其他序列比對程式來測定特定序列是否與根據本發明之參考序列具例如95%一致性時，參數當然經設定以使得一致性百分比係在參考多肽序列之全長上計算並且允許參考序列中胺基酸總數之至多5%之同源性空隙。
如本文所用，VWF序列或FVIII蛋白序列中之「對應於......之胺基酸」或「等效胺基酸」係藉由比對鑒別以最大化第一VWF或FVIII序列與第二VWF或FVIII序列之間的一致性或類似性。用於鑒別第二VWF或FVIII序列中之等效胺基酸之編號係基於用於鑒別第一VWF或FVIII序列中之相應胺基酸之編號。
「融合」或「嵌合」分子包含第一胺基酸序列連接至其本質上並非天然連接之第二胺基酸序列。通常存在於獨立蛋白質中之胺基酸序列可集合於融合多肽中，或者通常存在於相同蛋白質中之胺基酸序列可置於融合多肽中之新排列中，例如，本發明之因子VIII結構域與免疫球蛋白Fc結構域之融合。融合蛋白係例如藉由化學合成或藉由產生且轉譯以所需關係編碼肽區域之聚核苷酸而產生。嵌合蛋白可進一步包含藉由共價、非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合之第二胺基酸序列。
如本文所用，術語「半衰期」係指特定多肽在活體內之生物半衰期。半衰期可由施用至個體之量的一半自動物中之循環及/或其他組織中清除所需的時間表示。當既定多肽之清除曲線經理解為時間之函數時，該曲線 通常為具有快速α相及較長β相之雙相。該α相通常表示所施用多肽在血管內空間與血管外空間之間的平衡且由多肽大小部分地決定。該β相通常表示多肽在血管內空間中之分解代謝。在一些實施例中，本發明之嵌合分子為單相的，且因此不具有α相，而僅為單一β相。因此，在某些實施例中，如本文所用之術語半衰期係指β相中多肽之半衰期。人類抗體在人類中之典型β相半衰期為21天。
如應用於聚核苷酸或多肽之術語「異源」意謂聚核苷酸或多肽係源自與其相比較之實體相異之實體。因此，連接至VWF蛋白之異源多肽意謂多肽鏈連接至VWF蛋白且並非VWF蛋白之天然存在部分。例如，異源聚核苷酸或抗原可源自不同物種、不同細胞類型之個體、或相同或不同細胞類型之相異個體。
如本文所用之術語「連接(linked)」、「融合(fused)」或「連接(connected)」係指第一胺基酸序列或核苷酸序列接合於第二胺基酸序列或核苷酸序列(例如，分別經由肽鍵或磷酸二酯鍵)。術語「共價連接的」或「共價連接」係指連接在一起的兩個部分之間的共價鍵，例如，二硫鍵、肽鍵或一或多個胺基酸，例如，連接子。第一胺基酸或核苷酸序列可直接接合於第二胺基酸或核苷酸序列或者插入序列可接合第一序列與第二序列。術語「連接」、「融合」或「連接」不僅意謂第一胺基酸序列與第二胺基酸序列在C端或N端融合，且亦包括將整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或第一胺 基酸序列)中之任何兩個胺基酸中。在一個實施例中，第一胺基酸序列可藉由肽鍵或連接子接合於第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接子接合於第二核苷酸序列。連接子可為肽或多肽(對於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(對於核苷酸鏈)或任何化學部分(對於多肽及聚核苷酸鏈)。共價連接有時以(-)或連字符指示。
如本文所用，術語「與......締合」係指第一胺基酸鏈與第二胺基酸鏈之間形成的共價或非共價鍵。在一個實施例中，術語「與......締合」意謂共價、非肽鍵或非共價鍵。在一些實施例中，此種締合由冒號(亦即，(：))指示。在另一實施例中，其意謂除肽鍵之外的共價鍵。在其他實施例中，如本文所用之術語「共價締合」意謂兩個部分之間由共價鍵(例如，二硫鍵、肽鍵或一或多個胺基酸(例如，連接子))締合。舉例而言，胺基酸半胱胺酸包含可與第二半胱胺酸殘基上之硫醇基形成二硫鍵或橋聯之硫醇基。在大部分天然存在之IgG分子中，CH1及CL區域係藉由二硫鍵締合且兩個重鏈係藉由在對應於使用Kabat編號系統之239及242之位置(位置226或229，EU編號系統)處的兩個二硫鍵締合。共價鍵之實例包括(但不限於)肽鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、σ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、不可知鍵、彎曲鍵、偶極鍵、π反向鍵、雙鍵、參鍵、四重鍵、五重鍵、六重鍵、共軛、超共軛、芳香性、哈普托數(hapticity)或反鍵。非共價鍵之非限制性實例包括離子鍵(例如，陽離子π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如，二氫鍵 、二氫複合物、低障壁氫鍵或對稱氫鍵)、範德華力、倫敦分散力、機械鍵、鹵鍵、金鍵(aurophilicity)、插層(intercalation)、堆疊、熵力或化學極性。
如本文所用，術語「裂解位點」或「酶促裂解位點」係指由酶識別之位點。在一個實施例中，多肽具有藉由在凝血級聯期間活化之酶裂解的酶促裂解位點，以使得此等位點之裂解發生在凝塊形成部位。在另一實施例中，連接FVIII蛋白與第二異源部分之FVIII連接子可包含裂解位點。例示性此類位點包括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa所識別者。例示性FXIa裂解位點包括例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO：27)及SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：28)。例示性凝血酶裂解位點包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：29)、TTKIKPR(SEQ ID NO：30)、LVPRG(SEQ ID NO：31)及ALRPR(SEQ ID NO：26之胺基酸1至5)。其他酶促裂解位點為此項技術中已知。可由凝血酶裂解之裂解位點在本文稱為「凝血酶裂解位點」。
如本文所用，術語「加工位點」或「細胞內加工位點」係指多肽中之一類酶促裂解位點，其為在多肽轉譯後起作用之酶的靶標。在一個實施例中，此等酶在自高爾基體(Golgi)內腔轉運至轉運高爾基體功能區期間起作用。細胞內加工酶在自細胞中分泌蛋白質之前裂解多肽。此等加工位點之實例包括例如由內肽酶之PACE/furin(其中PACE為配對鹼性胺基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)之縮寫)家族所靶向者。此等酶定位於高 爾基體膜且在序列基元Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg之羧基末端側上裂解蛋白。如本文所用，酶之「furin」家族包括例如PCSK1(亦稱為PC1/Pc3)、PCSK2(亦稱為PC2)、PCSK3(亦稱為furin或PACE)、PCSK4(亦稱為PC4)、PCSK5(亦稱為PC5或PC6)、PCSK6(亦稱為PACE4)或PCSK7(亦稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。其他加工位點為此項技術中所知。本文提及之術語「可加工連接子」意謂包含細胞內加工位點之連接子。
術語「furin」係指對應於EC No.3.4.21.75之酶。Furin為枯草桿菌蛋白酶樣前蛋白轉化酶，其亦稱為配對鹼性胺基酸裂解酶(PACE，Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)。Furin缺失非活性前體蛋白之部分以將其轉化成生物活性蛋白。在其細胞內轉運期間，藉由高爾基體中之furin酶自成熟VWF分子裂解出前肽。
在包括一個以上加工或裂解位點之構築體中，應瞭解，此等位點可相同或不同。
如本文所用之止血障礙意謂一種基因遺傳性或後天性病狀，其特徵為自發地或由創傷所致，由於形成纖維蛋白凝塊之能力受損或不能形成纖維蛋白凝塊而溢血之傾向。此等病症之實例包括血友病。三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏)、B型血友病(因子IX缺乏或「聖誕病」)及C型血友病(因子XI缺乏、輕度出血傾向)。其他止血障礙包括例如血管性血友病(von Willebrand disease)、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、纖維蛋白原、凝 血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏或結構異常、伯納德-蘇裏爾症候群(Bernard-Soulier syndrome)(其為GPIb有缺陷或缺乏)。GPIb為VWF之受體，其可能具有缺陷且導致缺乏初級凝塊形成(初級止血)及出血傾向增加，以及Glanzman及Naegeli之血小板功能不全(血小板無力症(Glanzmann thrombasthenia))。在肝衰竭(急性及慢性形式)中，肝臟產生之凝血因子不足；此可能增加出血風險。
本發明之嵌合分子可預防性使用。如本文所用，術語「預防性治療」係指在出血事件之前施用分子。在一個實施例中，需要一般止血劑之個體正在進行手術，或將要進行手術。本發明之嵌合蛋白可在手術之前或之後作為預防劑施用。本發明之嵌合蛋白可在手術期間或之後施用以控制急性出血事件。手術可包括(但不限於)肝移植、肝切除、牙科手術或幹細胞移植。
本發明之嵌合分子亦用於按需(亦稱為「偶發性」)治療。術語「按需治療」或「偶發性治療」係指回應於出血事件之症狀或在可造成出血之活動之前而施用嵌合分子。在一個態樣中，按需(偶發性)治療可給予開始出現(諸如在手術後)或預期出血(諸如在手術前)之個體。在另一態樣中，可在增加出血風險之活動(諸如接觸性運動)之前給予按需治療。
如本文所用，術語「急性出血」係指不考慮潛在原因之出血事件。舉例而言，個體可具有創傷、尿毒 癥、遺傳性出血性病症(例如，因子VII缺乏)、血小板病症或由於產生凝血因子抗體而造成的抗性。
如本文所用之治療係指例如疾病或病狀之嚴重程度降低；疾病過程之持續時間縮短；與疾病或病狀相關之一或多種症狀之改善；向具有疾病或病狀之個體提供有益作用，而未必治癒該疾病或病狀，或預防與疾病或病狀相關之一或多種症狀。在一個實施例中，術語「治療」意謂藉由施用本發明之嵌合分子在個體中維持FVIII穀底含量為至少約1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或20IU/dL。在另一實施例中，治療意謂維持FVIII穀底含量介於約1至約20IU/dL、約2至約20IU/dL、約3至約20IU/dL、約4至約20IU/dL、約5至約20IU/dL、約6至約20IU/dL、約7至約20IU/dL、約8至約20IU/dL、約9至約20IU/dL、或約10至約20IU/dL。疾病或病狀之治療亦可包括將個體中FVIII活性維持在相當於非血友病個體中至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%之FVIII活性的程度。治療所需之最低谷底含量可藉由一或多種已知方法量測且可針對每個人進行調節(增加或減少)。
II.嵌合分子
本發明之嵌合分子經設計以改進VWF蛋白或FVIII蛋白自該VWF蛋白或FVIII蛋白所融合之另一部分的釋放。本發明提供可在損傷部位快速且有效裂解之凝血酶可裂解連接子。在本發明之一個態樣中，嵌合分子可包含溫韋伯氏因子(VWF)蛋白、異源部分(H1)、XTEN序列及連接該VWF蛋白與該異源部分之VWF連接子，其中該VWF連接子包含選自以下之多肽：(i)來自因子VIII(FVIII)之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合，且其中該XTEN序列連接至該VWF蛋白、該異源部分(H1)、該VWF連接子或其任何組合。在本發明之另一態樣中，嵌合分子可包括包含VWF蛋白、異源部分(H1)及連接該VWF蛋白與該異源部分(H1)之VWF連接子之第一多肽鏈及包含FVIII蛋白及XTEN序列之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈中之該VWF連接子包含：(i)來自FVIII之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合，且其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈彼此締合。
在本發明之其他態樣中，嵌合分子包含包括經由FVIII連接子與異源部分融合之FVIII蛋白之多肽鏈，其中該FVIII連接子包含：(i)來自FVIII之a2區域；(ii)來自 FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合。
II.A.具有VWF、XTEN、VWF連接子之嵌合分子
本發明提供包含經由VWF連接子與XTEN序列融合之VWF蛋白之嵌合分子，其中該VWF連接子包含選自以下之多肽：(i)來自FVIII之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合。
在一個實施例中，嵌合分子包含VWF蛋白、異源部分(H1)、XTEN序列，及連接該VWF蛋白與該異源部分之VWF連接子，其中該XTEN序列位於該VWF蛋白與該VWF連接子之間且其中該VWF連接子包含選自以下之多肽：(i)來自因子VIII(FVIII)之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合。在另一實施例中，嵌合分子包含VWF蛋白、異源部分(H1)、XTEN序列，及連接該VWF蛋白與該異源部分之VWF連接子，其中該XTEN序列位於該VWF連接子與該異源部分之間且其中該VWF連接子包含選自以下之多肽：(i)來自FVIII之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv) 包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合。
在其他實施例中，嵌合分子進一步包含包括FVIII蛋白之多肽鏈，其中包含VWF蛋白之第一個鏈及包含FVIII蛋白之第二個鏈彼此締合。在一個實例中，締合可為共價(例如，二硫鍵)締合。在其他實施例中，包含FVIII蛋白之多肽鏈進一步包含另一XTEN序列。該另一XTEN序列可連接至FVIII蛋白之N端或C端或者插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間。在其他實施例中，包含FVIII蛋白之鏈進一步包含第二異源部分(H2)。在一些實施例中，FVIII蛋白經由FVIII連接子與第二異源部分融合。在某些實施例中，FVIII連接子與連接VWF蛋白與異源部分之VWF連接子相同。在其他實施例中，FVIII連接子與連接VWF蛋白與異源部分之VWF連接子不同。
在某些實施例中，嵌合分子包含選自以下之式：(i)V-L1-X1-H1：H2-L2-X2-C；(ii)V-X1-L1-H1：H2-L2-X2-C；(iii)V-L1-X1-H1：H2-X2-L2-C；(iv)V-X1-L1-H1：H2-X2-L2-C；(v)V-L1-X1-H1：H2-L2-C(X2)；(vi)V-X1-L1-H1：H2-L2-C(X2)；(vii)C-X2-L2-H2：H1-X1-L1-V；(viii)C-X2-L2-H2：H1-L1-X1-V；(ix)C-L2-X2-H2：H1-L1-X1-V；(x)C-L2-X2-H2：H1-L1-X1-V；(xi)C(X2)-L2-H2：H1-X1-L1-V；或(xii)C(X2)-L2-H2：H1-L1-X1-V；其中V為VWF蛋白；L1為VWF連接子；L2為視情況選用之 FVIII連接子；H1為第一異源部分；H2為第二異源部分；X1為XTEN序列；X2為視情況選用之XTEN序列；C為FVIII蛋白；C(X2)為與XTEN序列融合之FVIII蛋白，其中該XTEN序列插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；以及(：)為H1與H2之間的共價鍵。
在一些實施例中，嵌合分子中之FVIII蛋白包含第三異源部分(H3)，其可為XTEN序列。在其他實施例中，嵌合分子中之FVIII蛋白包含第四異源部分(H4)，其可為XTEN序列。在其他實施例中，嵌合分子中之FVIII蛋白包含第五異源部分(H5)，其可為XTEN序列。在其他實施例中，嵌合分子中之FVIII蛋白包含第六異源部分(H6)，其可為XTEN序列。在某些實施例中，第三異源部分(H3)、第四異源部分(H4)、第五異源部分(H5)及第六異源部分(H6)中之一或多者能夠延長嵌合分子之半衰期。在一些實施例中，第三異源部分(H3)、第四異源部分(H4)、第五異源部分(H5)及第六異源部分(H6)連接至FVIII之C端或N端或者插入FVIII蛋白之兩個胺基酸之間。
II.B.具有FVIII、XTEN、VWF蛋白、VWF連接子之嵌合分子
本發明亦提供一種嵌合分子，其包括包含VWF蛋白、異源部分(H1)及連接該VWF蛋白與該異源部分(H1)之VWF連接子之第一多肽鏈及包含FVIII蛋白及XTEN 序列之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈中之該VWF連接子包含：(i)來自FVIII之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合，且其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈彼此締合。在一個實施例中，其中該XTEN序列連接至FVIII蛋白之N端或C端或者插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間。在另一實施例中，該嵌合分子進一步包含另一XTEN序列，其連接至該VWF蛋白、該異源部分、該VWF連接子或其任何組合。在其他實施例中，該嵌合分子進一步包含第二異源部分(H2)。在其他實施例中，該嵌合分子之該第二異源部分連接至FVIII蛋白、XTEN序列，或兩者。在其他實施例中，該第二異源部分經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白或XTEN序列。在其他實施例中，FVIII連接子與VWF連接子相同。在一些實施例中，FVIII連接子與VWF連接子不同。
在某些實施例中，嵌合分子包含選自以下之式：(i)V-L1-X1-H1：H2-L2-X2-C；(ii)V-X1-L1-H1：H2-L2-X2-C；(iii)V-L1-X1-H1：H2-X2-L2-C；(iv)V-X1-L1-H1：H2-X2-L2-C；(v)V-L1-X1-H1：H2-L2-C(X2)；(vi)V-X1-L1-H1：H2-L2-C(X2)；(vii)C-X2-L2-H2：H1-X1-L1-V；(viii)C-X2-L2-H2：H1-L1-X1-V；(ix)C-L2-X2-H2：H1-L1-X1-V；(x)C-L2-X2-H2：H1-L1-X1-V；(xi)C(X2)-L2-H2：H1-X1-L1-V；或(xii)C(X2)-L2-H2：H1-L1-X1-V；其中 V為VWF蛋白；L1為VWF連接子；L2為視情況選用之FVIII連接子；H1為第一異源部分；H2為第二異源部分；X1為視情況選用之XTEN序列；X2為XTEN序列；C為FVIII蛋白；C(X2)為與XTEN序列融合之FVIII蛋白，其中該XTEN序列插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；以及(：)為H1與H2之間的共價鍵。在一個實施例中，VWF連接子與FVIII連接子可相同。在另一實施例中，VWF連接子與FVIII連接子不同。
在某些實施例中，嵌合分子之FVIII蛋白包含第三異源部分(H3)，其可為XTEN序列。在其他實施例中，嵌合分子之FVIII蛋白包含第四異源部分(H4)，其為XTEN序列。在其他實施例中，嵌合分子之FVIII蛋白包含第五異源部分(H5)，其可為XTEN序列。在其他實施例中，FVIII蛋白包含第六異源部分(H6)，其可為XTEN序列。在某些實施例中，第三異源部分(H3)、第四異源部分(H4)、第五異源部分(H5)及第六異源部分(H6)中之一或多者能夠延長嵌合分子之半衰期。在一些實施例中，第三異源部分(H3)、第四異源部分(H4)、第五異源部分(H5)及/或第六異源部分(H6)連接至FVIII之C端或N端或者插入FVIII蛋白之兩個胺基酸之間。
II.C.具有FVIII、XTEN及FVIII連接子之嵌合分子
本發明之嵌合分子可包含FVIII蛋白、XTEN序列、及藉由FVIII連接子融合之異源部分，該FVIII連接子 包含(i)來自FVIII之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合。在某些實施例中，嵌合分子包含兩個多肽鏈，第一個鏈包含經由FVIII連接子與第一Fc區融合之FVIII蛋白，且第二個鏈包含與Fc區融合之VWF蛋白(例如，VWF之D'結構域及D3結構域)，其中該第一多肽鏈中之該FVIII連接子包含：(i)來自FVIII之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合，且其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈彼此締合且其中XTEN序列連接至第一多肽(例如，FVIII蛋白之N端或C端、連接子或第一Fc區或FVIII蛋白內部)、第二多肽(例如，VWF蛋白之N端或C端或Fc區或FVIII蛋白內部)，或兩者。在一特定實施例中，第一多肽鏈中之連接子包含來自FVIII之a2區域。
在某些實施例中，嵌合分子包含選自以下之式：(i)V-L2-X2-H2：H1-L1-X1-C；(ii)V-X2-L2-H2：H1-L1-X1-C；(iii)V-L2-X2-H2：H1-X1-L1-C；(iv)V-X2-L2-H2：H1-X1-L1-C；(v)V-L2-X2-H2：H1-L1-C(X1)；(vi)V-X2-L2-H2：H1-L1-C(X1)；(vii)C-X1-L1-H1：H2-X2-L2-V；(viii)C-X1-L1-H1：H2-L2-X2-V；(ix)C-L1-X1-H1：H2-L2-X2-V；(x)C-L1-X1-H1：H2-L2-X2-V；(xi)C(X1)-L1- H1：H2-X2-L2-V；或(xii)C(X1)-L1-H1：H2-L2-X2-V，其中V為VWF蛋白；L1為FVIII連接子；L2為視情況選用之VWF連接子；H1為第一異源部分；H2為第二異源部分；X1為視情況選用之XTEN序列；X2為視情況選用之XTEN序列；C為FVIII蛋白；C(X1)為與XTEN序列融合之FVIII蛋白，其中該XTEN序列插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；以及(：)為H1與H2之間的共價鍵，且其中至少一個XTEN序列存在於嵌合分子中。在一個實施例中，VWF連接子與FVIII連接子相同。在另一實施例中，VWF連接子與FVIII連接子不同。
II.D.嵌合分子之組分
II.C.1.VWF連接子或FVIII連接子
可用於本發明之嵌合分子之VWF連接子或FVIII連接子為融合VWF蛋白與異源部分或者融合FVIII蛋白與異源部分之凝血酶可裂解連接子。在一個實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含FVIII之a1區域。在另一實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含FVIII之a2區域。在其他實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含FVIII之a3區域。在其他實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含包括X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸。
在一個實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含a1區域，其包含與對應於全長成熟FVIII之Met337至 Arg372具至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的胺基酸序列，其中該a1區域能夠由凝血酶裂解。在另一實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含a1區域，其包含與對應於全長成熟FVIII之胺基酸337至374具至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的胺基酸序列，其中該a1區域能夠由凝血酶裂解。在其他實施例中，VWF連接子或FVIII連接子進一步包含其他胺基酸，例如，一個、兩個、三個、四個、五個、十個或更多個。在一特定實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(SEQ ID NO：5)。
在一些實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含a2區域，其包含與對應於全長成熟FVIII之Glu720至Arg740具至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的胺基酸序列，其中該a2區域能夠由凝血酶裂解。在其他實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含a2區域，其包含與對應於全長成熟FVIII之胺基酸712至743具至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的胺基酸序列。在其他實施例中，VWF連接子或FVIII連接子進一步包含其他胺基酸，例如，一個、兩個、三個、四個、五個、十個或更多個。在一特定實施例中，VWF連接子包含ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNN AIEPRSFS (SEQ ID NO：4)。
在某些實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含a3區域，其包含與對應於全長成熟FVIII之Glu1649至Arg1689具至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的胺基酸序列，其中該a3區域能夠由凝血酶裂解。在一些實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含a3區域，其包含與對應於全長成熟FVIII之胺基酸1649至1692具至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的胺基酸序列，其中該a3區域能夠由凝血酶裂解。在其他實施例中，VWF連接子或FVIII連接子進一步包含其他胺基酸，例如，一個、兩個、三個、四個、五個、十個或更多個。在一特定實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ(SEQ ID NO：6)。
在其他實施例中，VWF連接子或FVIII連接子包含包括X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元且其中該PAR1外位點相互作用基元包含S-F-L-L-R-N(SEQ ID NO：7)。在一些實施例中，PAR1外位點相互作用基元進一步包含選自以下之胺基酸序列：P、P-N、P-N-D、P-N-D-K(SEQ ID NO：8)、P-N-D-K-Y(SEQ ID NO：9)、P-N-D-K-Y-E(SEQ ID NO：10)、P-N-D-K-Y-E-P(SEQ ID NO：11)、P-N-D-K-Y-E-P-F(SEQ ID NO：12)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W(SEQ ID NO：13) 、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(SEQ ID NO：14)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(SEQ ID NO：20)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(SEQ ID NO：21)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E(SEQ ID NO：22)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(SEQ ID NO：23)或其任何組合。在其他實施例中，包含X-V-P-R之凝血酶裂解位點之脂族胺基酸係選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸。在一特定實施例中，凝血酶裂解位點包含L-V-P-R。在一些實施例中，若用凝血酶裂解位點(L-V-P-R)分別替代VWF連接子或FVIII連接子(亦即，不存在PAR1外位點相互作用基元)，則凝血酶裂解VWF連接子或FVIII連接子之速率比凝血酶將裂解凝血酶裂解位點(例如，L-V-P-R)之速率快。在一些實施例中，若用凝血酶裂解位點(例如，L-V-P-R)替代VWF連接子或FVIII連接子，則凝血酶裂解VWF連接子或FVIII連接子之速率為凝血酶將裂解凝血酶裂解位點(例如，L-V-P-R)之速率的至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍或至少約100倍。
在一些實施例中，包含(i)a1區域、(ii)a2區域、(iii)a3區域或(iv)凝血酶裂解位點X-V-P-R及PAR1外位點相互作用基元之VWF連接子或FVIII連接子進一步包含一或多個具有至少約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350 、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸之長度的胺基酸。在一個實施例中，該一或多個胺基酸包含gly肽。在另一實施例中，該一或多個胺基酸包含GlyGly。在其他實施例中，該一或多個胺基酸包含IleSer。在其他實施例中，該一或多個胺基酸包含gly/ser肽。在其他實施例中，該一或多個胺基酸包含具有(Gly4Ser)n或S(Gly4Ser)n之式的gly/ser肽，其中n為選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100之正整數。在一些實施例中，該一或多個胺基酸包含(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：89)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：90)。
II.C.2.VWF蛋白
VWF(亦稱為F8VWF)為存在於血漿中且在內皮(在Weibel-Palade小體中)、巨核細胞(血小板之α-顆粒)及內皮下層結締組織中組成性產生的大型多聚糖蛋白。基本VWF單體為具2813個胺基酸之蛋白質。每個單體包含多個具有特定功能之特定結構域，D'/D3結構域(其結合於因子VIII)、A1結構域(其結合於血小板GPIb-受體、肝素及/或可能地膠原蛋白)、A3結構域(其結合於膠原蛋白)、C1結構域(其中RGD結構域當其經活化時結合於血小板整合素αIIbβ3)，及在蛋白質之C端之「半胱胺酸結」結構域(該VWF與血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β (TGFβ)及β-人類絨毛膜促性腺激素(βHCG)共用))。
如本文所用之術語「VWF蛋白」包括(但不限於)包含D’結構域及D3結構域之全長VWF蛋白或功能性VWF片段，其能夠抑制內源性VWF與FVIII之結合。在一個實施例中，VWF蛋白結合於FVIII。在另一實施例中，VWF蛋白阻斷FVIII上之VWF結合位點，從而抑制FVIII與內源性VWF之相互作用。在其他實施例中，VWF蛋白未藉由VWF清除路徑清除。VWF蛋白包括保留VWF之此等活性之衍生物、變異體、突變體或類似物。
人類VWF之2813單體胺基酸序列在Genbank中報導為寄存編號_NP_000543.2__。編碼人類VWF之核苷酸序列在Genbank中報導為寄存編號__NM_000552.3_。人類VWF之核苷酸序列指定為SEQ ID NO：1。SEQ ID NO：2為由SEQ ID NO：1編碼之胺基酸序列。VWF之各結構域列於表1中。
Figure 109104938-A0202-12-0051-1
Figure 109104938-A0202-12-0052-2
Figure 109104938-A0202-12-0053-3
Figure 109104938-A0202-12-0054-4
Figure 109104938-A0202-12-0055-5
Figure 109104938-A0202-12-0056-6
Figure 109104938-A0202-12-0057-7
Figure 109104938-A0202-12-0058-8
Figure 109104938-A0202-12-0059-9
如本文所用之VWF蛋白可包含VWF之D'結構域及D3結構域，其中該VWF蛋白結合於FVIII且抑制內源性VWF(全長VWF)與FVIII之結合。包含D'結構域及D3結構域之VWF蛋白可進一步包含選自A1結構域、A2結構域、A3結構域、D1結構域、D2結構域、D4結構域、B1結構域、B2結構域、B3結構域、C1結構域、C2結構域、CK結構域、其一或多個片段或其任何組合之VWF結構域。在一個實施例中，VWF蛋白包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：(1)VWF之D'及D3結構域或其片段；(2)VWF之D1、D'及D3結構域或其片段；(3)VWF之D2、D'及D3結構域或其片段；(4)VWF之D1、D2、D'及D3結構域 或其片段；或(5)VWF之D1、D2、D'、D3或A1結構域或其片段。本文所述之VWF蛋白不包含VWF清除受體結合位點。本發明之VWF蛋白可包含連接至或融合至VWF蛋白之任何其他序列。舉例而言，本文所述之VWF蛋白可進一步包含信號肽。
在一個實施例中，VWF蛋白結合於FVIII蛋白或與FVIII蛋白締合。藉由結合於FVIII蛋白或與FVIII蛋白締合，本發明之VWF蛋白可保護FVIII免於蛋白酶裂解及FVIII活化，穩定FVIII之重鏈及輕鏈，且防止FVIII由清道夫受體清除。在另一實施例中，VWF蛋白結合於FVIII蛋白或與FVIII蛋白締合且阻斷或防止FVIII蛋白結合於磷脂及活化蛋白C。藉由防止或抑制FVIII蛋白與內源性全長VWF結合，本發明之VWF蛋白可減少FVIII由內源性VWF清除受體清除且因此延長FVIII蛋白之半衰期。FVIII蛋白之半衰期延長因此係由於FVIII蛋白與缺乏VWF清除受體結合位點之VWF蛋白之締合，且從而屏蔽及/或保護FVIII蛋白遠離包含VWF清除受體結合位點之內源性VWF。結合於VWF蛋白或由VWF蛋白保護之FVIII蛋白亦可允許FVIII蛋白之再循環。藉由消除全長VWF分子中之VWF清除路徑受體結合位點，本發明之FVIII/VWF異質二聚體經屏蔽遠離VWF清除路徑，從而進一步延長FVIII半衰期。
在一個實施例中，本發明之VWF蛋白包含VWF之D'結構域及D3結構域，其中該D'結構域與SEQ ID NO：2之胺基酸764至866具至少約60%、70%、80%、85% 、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，其中該VWF蛋白防止內源性VWF結合於FVIII。在另一實施例中，VWF蛋白包含VWF之D'結構域及D3結構域，其中該D3結構域與SEQ ID NO：2之胺基酸867至1240具至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，其中該VWF蛋白防止內源性VWF結合於FVIII。在一些實施例中，本文所述之VWF蛋白包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：VWF之D'結構域及D3結構域，其與SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240具至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，其中該VWF蛋白防止內源性VWF結合於FVIII。在其他實施例中，VWF蛋白包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：D1、D2、D'及D3結構域，其與SEQ ID NO：2之胺基酸23至1240具至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，其中該VWF蛋白防止內源性VWF結合於FVIII。在其他實施例中，VWF蛋白進一步包含可與其操作性連接之信號肽。
在一些實施例中，本發明之VWF蛋白基本上由以下組成或由以下組成：(1)D'D3結構域、D1D'D3結構域、D2D'D3結構域或D1D2D'D3結構域；及(2)至多約10個胺基酸(例如，自SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1250的任何序列)、至多約15個胺基酸(例如，自SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1255的任何序列)、至多約20個胺基酸(例如，自SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1260的任何序列)、至多約25個胺基酸(例如，自SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1265的任何序列)、或至多約30個胺基酸(例如，自SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1260的任何序列)之另一VWF序列。在一特定實施例中，包含D'結構域及D3結構域或基本上由D'結構域及D3結構域組成之VWF蛋白既非SEQ ID NO：2之胺基酸764至1274，亦非全長成熟VWF。在一些實施例中，D1D2結構域與D'D3結構域呈反式表現。在一些實施例中，D1D2結構域與D'D3結構域呈順式表現。
在其他實施例中，包含連接至D1D2結構域之D'D3結構域之VWF蛋白進一步包含細胞內加工位點，例如，(PACE(furin)或PC5之加工位點)，其允許在表現時D1D2結構域自D'D3結構域裂解。細胞內加工位點之非限制性實例揭示於本文他處。
在其他實施例中，VWF蛋白包含D'結構域及D3結構域，但不包含選自以下之胺基酸序列：(1)SEQ ID NO：2之胺基酸1241至2813、(2)SEQ ID NO：2之胺基酸1270至胺基酸2813、(3)SEQ ID NO：2之胺基酸1271至胺基酸2813、(4)SEQ ID NO：2之胺基酸1272至胺基酸2813、(5)SEQ ID NO：2之胺基酸1273至胺基酸2813、(6)SEQ ID NO：2之胺基酸1274至胺基酸2813，或其任何組合。
在其他實施例中，本發明之VWF蛋白包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：對應於D'結構域、D3結構域及A1結構域之胺基酸序列，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸764至1479具至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，其中該VWF蛋白防止內源性VWF結合於FVIII。在一特定實施例中，VWF蛋白不為SEQ ID NO：2之胺基酸764至1274。
在一些實施例中，本發明之VWF蛋白包含D'結構域及D3結構域，但不包含選自以下之至少一個VWF結構域：(1)A1結構域、(2)A2結構域、(3)A3結構域、(4)D4結構域、(5)B1結構域、(6)B2結構域、(7)B3結構域、(8)C1結構域、(9)C2結構域、(10)CK結構域、(11)CK結構域及C2結構域、(12)CK結構域、C2結構域及C1結構域、(13)CK結構域、C2結構域、C1結構域、B3結構域、(14)CK結構域、C2結構域、C1結構域、B3結構域、B2結構域、(15)CK結構域、C2結構域、C1結構域、B3結構域、B2結構域及B1結構域、(16)CK結構域、C2結構域、C1結構域、B3結構域、B2結構域、B1結構域及D4結構域、(17)CK結構域、C2結構域、C1結構域、B3結構域、B2結構域、B1結構域、D4結構域及A3結構域、(18)CK結構域、C2結構域、C1結構域、B3結構域、B2結構域、B1結構域、D4結構域、A3結構域及A2結構域、(19)CK結構域、C2結構域、C1結構域、B3結構域、B2結構域、B1結構 域、D4結構域、A3結構域、A2結構域及A1結構域，或(20)其任何組合。
在其他實施例中，VWF蛋白包含D'D3結構域及一或多個結構域或模組。此等結構域或模組之實例包括(但不限於)Zhour等人，Blood，線上公佈於2012年4月6日：DOI 10.1182/blood-2012-01-405134中所揭示之結構域及模組。舉例而言，VWF蛋白可包含D'D3結構域及選自以下之一或多個結構域或模組：A1結構域、A2結構域、A3結構域、D4N模組、VWD4模組、C8-4模組、TIL-4模組、C1模組、C2模組、C3模組、C4模組、C5模組、C5模組、C6模組或其任何組合。
在某些實施例中，本發明之VWF蛋白形成多聚體，例如，二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體或更高階多聚體。在其他實施例中，VWF蛋白為僅具有一個VWF蛋白之單體。在一些實施例中，本發明之VWF蛋白可具有一或多個胺基酸取代、缺失、添加或修飾。在一個實施例中，VWF蛋白可包括胺基酸取代、缺失、添加或修飾以使得VWF蛋白不能形成二硫鍵或形成二聚體或多聚體。在另一實施例中，胺基酸取代在D'結構域及D3結構域內。在一特定實施例中，本發明之VWF蛋白在對應於SEQ ID NO：2之殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142之殘基處包含至少一個胺基酸取代。該至少一個胺基酸取代可為並不天然存在於野生型VWF中之任何胺基酸。舉例而言，胺基酸取代可為除半胱胺酸之外之任何胺基酸 ，例如，異白胺酸、丙胺酸、白胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、天冬胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、酥胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、甘胺酸、纈胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、精胺酸或組胺酸。在另一實例中，胺基酸取代具有防止或抑制VWF蛋白形成多聚體之一或多個胺基酸。
在一些實施例中，VWF蛋白包含在對應於VWF之D'D3結構域之殘基336(SEQ ID NO：2之殘基1099)處自半胱胺酸至丙胺酸之胺基酸取代，及在對應於VWF之D'D3結構域之殘基379(SEQ ID NO：2之殘基1142)處自半胱胺酸至丙胺酸之胺基酸取代，或兩者。
在某些實施例中，本文可使用之VWF蛋白可經進一步修飾以改善其與FVIII之相互作用，例如，改善與FVIII之結合親和力。作為非限制性實例，VWF蛋白包含在對應於SEQ ID NO：2之胺基酸764之殘基處的絲胺酸殘基及在對應於SEQ ID NO：2之胺基酸773之殘基處的離胺酸殘基。殘基764及/或773可促進VWF蛋白與FVIII之結合親和力。在其他實施例中，可用於本發明之VWF蛋白可具有其他修飾，例如，蛋白質可經聚乙二醇化、糖基化、羥乙基澱粉化或聚唾液酸化。
II.C.3.異源部分
可經由VWF連接子與VWF蛋白融合或經由FVIII連接子與FVIII蛋白融合之異源部分可為異源多肽或異源非多肽部分。在某些實施例中，異源部分為此項技術 中已知之半衰期延長分子且包含多肽、非多肽部分或兩者之組合。異源多肽部分可包含FVIII蛋白、免疫球蛋白恆定區或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結合部分、轉鐵蛋白或其片段、PAS序列、HAP序列、其衍生物或變異體、人類絨毛膜促性腺激素之β亞單位之C端肽(CTP)或其任何組合。在一些實施例中，非多肽結合部分包含聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、羥乙基澱粉(HES)、其衍生物或其任何組合。在某些實施例中，可存在一個、兩個、三個或更多個異源部分，其可各自為相同或不同分子。
II.C.3.a 免疫球蛋白恆定區或其部分
免疫球蛋白恆定區由稱為CH(恆定重)結構域(CH1、CH2等)之結構域組成。視同種型(亦即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)而定，恆定區可由三個或四個CH結構域組成。一些同種型(例如IgG)恆定區亦包含鉸鏈區。參見Janeway等人，2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y。
用於產生本發明之嵌合蛋白之免疫球蛋白恆定區或其部分可獲自多種不同來源。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分係源自人類免疫球蛋白。然而，應瞭解，免疫球蛋白恆定區或其部分可源自另一哺乳動物物種之免疫球蛋白，該等哺乳動物物種包括例如齧齒動物(例如，小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。此外，免疫球蛋白恆定區或其部 分可源自任何免疫球蛋白種類，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，以及任何免疫球蛋白同種型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在一個實施例中，使用人類同種型IgG1。
多種免疫球蛋白恆定區基因序列(例如人類恆定區基因序列)可以公開訪問之存放物形式獲得。可選擇具有特定效應功能(或缺乏特定效應功能)或具有特定修飾以降低免疫原性之恆定區結構域序列。抗體及抗體編碼基因之許多序列已公開且可使用此項技術中公認之技術自此等序列獲得合適的Ig恆定區序列(例如，鉸鏈、CH2及/或CH3序列、或其部分)。使用任何前述方法獲得之遺傳物質隨後可改變或合成以獲得本發明之多肽。應進一步瞭解，本發明之範疇涵蓋恆定區DNA序列之等位基因、變異體及突變。
免疫球蛋白恆定區或其部分之序列可例如使用聚合酶鏈反應及經選擇以擴增相關結構域之引子來選殖。為自抗體選殖免疫球蛋白恆定區或其部分之序列，可自雜交瘤、脾臟或淋巴細胞分離mRNA，反轉錄成DNA，且藉由PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳細描述於美國專利第4,683,195號、第4,683,202號、第4,800,159號、第4,965,188號中；以及例如「PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications」,Innis等人編，Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等人，1989.Gene 77：51；Horton等人，1993.Methods Enzymol.217：270中)。
本文使用之免疫球蛋白恆定區可包括所有結 構域及鉸鏈區或其部分。在一個實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分包含CH2結構域、CH3結構域及鉸鏈區，亦即，Fc區或FcRn結合搭配物。
如本文所用，術語「Fc區」定義為對應於原生免疫球蛋白之Fc區之多肽部分，亦即，如藉由其兩個重鏈之相應Fc結構域之二聚締合形成。原生Fc區與另一Fc區形成均二聚體。
在一個實施例中，「Fc區」係指開始於木瓜蛋白酶裂解位點正上游之鉸鏈區中(亦即IgG中之殘基216，將重鏈恆定區之第一殘基取為114)且結束於抗體之C端的單一免疫球蛋白重鏈的部分。因此，完整Fc結構域至少包含鉸鏈結構域、CH2結構域及CH3結構域。
視免疫球蛋白同種型而定，免疫球蛋白恆定區之Fc區可包括CH2、CH3及CH4結構域以及鉸鏈區。包含免疫球蛋白之Fc區之嵌合蛋白賦予嵌合蛋白若干所需特性，包括增加之穩定性、增加之血清半衰期(參見Capon等人，1989,Nature 337：525)以及結合於Fc受體如新生兒Fc受體(FcRn)(美國專利第6,086,875號、第6,485,726號、第6,030,613號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，該等專利以全文引用之方式併入本文中。
免疫球蛋白恆定區或其部分可為FcRn結合搭配物。FcRn活躍於成人上皮組織中且表現於腸內腔、肺部氣管、鼻表面、陰道表面、結腸及直腸表面(美國專利第6,485,726號)。FcRn結合搭配物為結合於FcRn之免疫球蛋 白之一部分。
FcRn受體已自若干哺乳動物物種(包括人類)中分離。人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列為已知的(Story等人，1994,J.Exp.Med.180：2377)。FcRn受體在相對低pH下結合IgG(而非其他免疫球蛋白種類如IgA、IgM、IgD及IgE)，積極地在管腔內跨細胞轉運IgG至漿膜方向，且隨後在間質液中存在之相對較高pH下釋放IgG。其表現於成人上皮組織(美國專利第6,485,726號、第6,030,613號、第6,086,875號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)中，包括肺及腸上皮(Israel等人，1997,Immunology 92：69)、腎近端小管上皮(Kobayashi等人，2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282：F358)以及鼻上皮、陰道表面及膽管樹表面。
可用於本發明中之FcRn結合搭配物涵蓋可由FcRn受體特異性結合之分子，包括完整IgG、IgG之Fc片段，及包括FcRn受體之完整結合區域之其他片段。已基於X射線晶體學描述結合於FcRn受體之IgG之Fc部分的區域(Burmeister等人，1994,Nature 372：379)。Fc與FcRn之主要接觸區域接近CH2與CH3結構域之交界處。Fc-FcRn接觸皆在單一Ig重鏈內。FcRn結合搭配物包括完整IgG、IgG之Fc片段，及IgG中包括FcRn之完整結合區域之其他片段。主要接觸位點包括CH2結構域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314以及CH3結構域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。對於免疫球蛋白 或免疫球蛋白片段或區域之胺基酸編號之提及皆基於Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md。
結合於FcRn之Fc區或FcRn結合搭配物可藉由FcRn而有效穿梭跨越上皮障壁，因此提供一種非侵入性方法來系統性施用所需治療分子。另外，包含Fc區或FcRn結合搭配物之融合蛋白係由表現FcRn之細胞內吞。但並非標誌著降解，此等融合蛋白再循環出來以再次進入循環中，因此增加此等蛋白質之活體內半衰期。在某些實施例中，免疫球蛋白恆定區之部分為通常經由二硫鍵及其他非特異性相互作用與另一Fc區或另一FcRn結合搭配物締合以形成二聚體及更高階多聚體之Fc區或FcRn結合搭配物。
FcRn結合搭配物區域為可由FcRn受體特異性結合且隨後由Fc區之FcRn受體活性轉運之分子或其部分。特異性結合係指兩個分子形成在生理條件下相對穩定之複合物。特異性結合之特徵為高親和力及低至中等能力，其與非特異性結合相區別，非特異性結合通常具有低親和力及中等至高能力。通常，當親和常數KA高於106M-1或高於108M-1時，將結合視為特異性。必要時，可藉由改變結合條件來減少非特異性結合而不會實質上影響特異性結合。熟習此項技術者可使用常規技術最佳化適當的結合條件，諸如分子之濃度、溶液之離子強度、溫度、允許結合之時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)之濃度等。
無數突變體、片段、變異體及衍生物描述於 例如PCT公開案第WO 2011/069164 A2號、第WO 2012/006623 A2號、第WO 2012/006635 A2號或第WO 2012/006633 A2號中，其皆以全文引用之方式併入本文中。
II.C.3.b.白蛋白或其片段或變異體
在某些實施例中，經由VWF連接子連接至VWF蛋白或經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白之異源部分為白蛋白或其功能片段。在一些實施例中，融合至VWF蛋白之白蛋白與融合至FVIII蛋白之白蛋白共價締合。
人類血清白蛋白(HSA或HA)為其全長形式為609個胺基酸之蛋白質，其負責顯著比例之血清滲透壓且亦充當內源性及外源性配位體之運載體。如本文所用之術語「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能片段、變異體、衍生物或類似物。白蛋白或其片段或變異體之實例揭示於美國專利公開案第2008/0194481A1號、第2008/0004206 A1號、第2008/0161243 A1號、第2008/0261877 A1號或第2008/0153751 A1號或PCT申請公開案第2008/033413 A2號、第2009/058322 A1號或第2007/021494 A2號中，其以全文引用之方式併入本文中。
II.C.3.c.白蛋白結合部分
在某些實施例中，經由VWF連接子連接至VWF蛋白或經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白之異源部分 為白蛋白結合部分，其包含白蛋白結合肽、細菌白蛋白結合域、白蛋白結合抗體片段或其任何組合。舉例而言，白蛋白結合蛋白可為細菌白蛋白結合蛋白、抗體或抗體片段，包括結構域抗體(參見美國專利第6,696,245號)。白蛋白結合蛋白例如可為細菌白蛋白結合域，諸如鏈球菌蛋白G之一(Konig,T.及Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。可用作結合搭配物之白蛋白結合肽之其他實例為例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys一致序列者，其中Xaa1為Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2為Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa3為Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；且Xaa4為Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如美國專利申請案2003/0069395或Dennis等人(Dennis等人，(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043)中所述。
II.C.3.d.PAS序列
在其他實施例中，經由VWF連接子連接至VWF蛋白或經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白之異源部分為PAS序列。在一個實施例中，嵌合分子包含經由VWF連接子融合至PAS序列之本文所述之VWF蛋白。在另一實施例中，本發明之嵌合分子包含包括經由VWF連接子融合至PAS序列之VWF蛋白之第一個鏈及包括FVIII蛋白及另一視情況選用之PAS序列之第二個鏈，其中該PAS序列屏蔽或保護FVIII蛋白上之VWF結合位點，從而抑制或防止FVIII蛋白與內源性VWF之相互作用。兩個PAS序列可彼此共價 締合。
如本文所用，PAS序列意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸殘基之胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成無規捲曲構型。因此，PAS序列為架構基塊、胺基酸聚合物或包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸、基本上由丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸組成或由丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸組成之序列盒，其可用作嵌合蛋白中異源部分之一部分。然而，熟習此項技術者認識到，當除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之外之殘基作為PAS序列中之次要成分添加時，胺基酸聚合物亦可形成無規捲曲構型。如本文所用之術語「次要成分」意謂除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之外之胺基酸可在某種程度上添加於PAS序列中，例如，PAS序列之至多約12%(亦即，100個胺基酸中約12個)、PAS序列之至多約10%(亦即，100個胺基酸中約10個)、至多約9%(亦即，100個胺基酸中約9個)、至多約8%(亦即，100個胺基酸中約8個)、約6%(亦即，100個胺基酸中約6個)、約5%(亦即，100個胺基酸中約5個)、約4%(亦即，100個胺基酸中約4個)、約3%(亦即，100個胺基酸中約3個)、約2%(亦即，100個胺基酸中約2個)、約1%(亦即，100個胺基酸中約1個)。不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸可選自由Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val組成之群。
在生理條件下，PAS序列伸展形成無規捲曲構 型且從而可介導VWF因子或具凝血活性之蛋白質之活體內及/或活體外穩定性增加。由於無規捲曲結構域不採用穩定結構或自身起作用，由與其融合之VWF蛋白或FVIII蛋白介導之生物活性基本上得以保留。在其他實施例中，形成無規捲曲結構域之PAS序列呈生物惰性，尤其關於在血漿中之蛋白水解、免疫原性、等電點/靜電行為、結合於細胞表面受體或內化，但仍可生物降解，其提供明顯優於合成聚合物如PEG之優勢。
形成無規捲曲構型之PAS序列之非限制性實例包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO：32)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO：33)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO：34)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO：35)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO：36)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO：37)及ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO：38)或其任何組合。PAS序列之其他實例可自例如美國專利公開案第2010/0292130 A1號及PCT申請公開案第WO 2008/155134 A1號已知。
II.C.3.e.HAP序列
在某些實施例中，經由VWF連接子連接至VWF蛋白或經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白之異源部分 為富含甘胺酸之胺基酸均聚物(HAP)。HAP序列可包含甘胺酸之重複序列，其具有長度為至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸或500個胺基酸。在一個實施例中，HAP序列能夠延長融合至或連接至HAP序列之部分的半衰期。HAP序列之非限制性實例包括(但不限於)(Gly)n、(Gly4Ser)n或S(Gly4Ser)n，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一個實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。參見例如Schlapschy M等人，Protein Eng.Design Selection,20：273-284(2007)。
II.C.3.f.轉鐵蛋白或其片段
在某些實施例中，經由VWF連接子連接至VWF蛋白或經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白之異源部分為轉鐵蛋白或其片段。任何轉鐵蛋白可用於製備本發明之嵌合分子。舉例而言，野生型人類Tf(Tf)為具有兩個主要結構域N(約330個胺基酸)及C(約340個胺基酸)之約75KDa之具679個胺基酸的蛋白質(不造成糖基化)，其似乎源自基因複製。參見GenBank寄存編號NM001063、 XM002793、M12530、XM039845、XM 039847及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其皆以全文引用之方式併入本文中。轉鐵蛋白包含兩個結構域，N結構域及C結構域。N結構域包含兩個子結構域，N1結構域及N2結構域，且C結構域包含兩個子結構域，C1結構域及C2結構域。
在一個實施例中，嵌合分子之轉鐵蛋白部分包括轉鐵蛋白剪接變異體。在一個實例中，轉鐵蛋白剪接變異體可為人類轉鐵蛋白之剪接變異體，例如，Genbank寄存編號AAA61140。在另一實施例中，嵌合分子之轉鐵蛋白部分包括轉鐵蛋白序列之一或多個結構域，例如，N結構域、C結構域、N1結構域、N2結構域、C1結構域、C2結構域或其任何組合。
II.C.3.g 聚合物，例如聚乙二醇(PEG)
在其他實施例中，經由VWF連接子連接至VWF蛋白或經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白之異源部分為此項技術中已知之可溶性聚合物，包括(但不限於)聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖或聚乙烯醇。異源部分如可溶性聚合物可連接至嵌合分子內之任何位置。
在某些實施例中，嵌合分子包含經由VWF連接子與異源部分(例如，Fc區)融合之VWF蛋白，其中該VWF蛋白進一步連接至PEG。在另一實施例中，嵌合分子包含經由VWF連接子與Fc區融合之VWF蛋白以及FVIII蛋 白，該VWF蛋白與該FVIII蛋白彼此締合，其中該FVIII蛋白連接至PEG。
本發明亦提供本發明嵌合分子之化學修飾衍生物，其可提供其他優點，諸如增加之多肽溶解性、穩定性及循環時間，或降低之免疫原性(參見美國專利第4,179,337號)。用於修飾之化學部分可選自水溶性聚合物，包括(但不限於)聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖或聚乙烯醇。嵌合分子可在分子內之任意位置或在N端或C端、或在分子內之預定位置經修飾且可包括一個、兩個、三個或更多個連接之化學部分。
聚合物可具有任何分子量，且可為分枝或未分枝的。對於聚乙二醇，在一個實施例中，為了易於處理及製造，分子量介於約1kDa與約100kDa之間。視所需概況(例如，所需持續釋放之持續時間、對生物活性之影響(若存在)、易於處理、抗原性之程度或缺乏以及聚乙二醇對蛋白質或類似物之其他已知作用)而定，可使用其他尺寸。舉例而言，聚乙二醇可具有約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、 70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa之平均分子量。
在一些實施例中，聚乙二醇可具有分枝結構。分枝聚乙二醇描述於例如美國專利第5,643,575號；Morpurgo等人，Appl.Biochem.Biotechnol.56：59-72(1996)；Vorobjev等人，Nucleosides Nucleotides 18：2745-2750(1999)；及Caliceti等人，Bioconjug.Chem.10：638-646(1999)中，其各自以全文引用之方式併入本文中。
連接至各嵌合分子之聚乙二醇部分之數目(亦即，取代程度)亦可改變。舉例而言，本發明之聚乙二醇化蛋白質平均可連接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20個或更多個聚乙二醇分子。類似地，平均取代程度在諸如每個蛋白質分子1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19或18-20個聚乙二醇部分之範圍內。用於測定取代程度之方法討論於例如Delgado等人，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304(1992)中。
在其他實施例中，本發明中使用之FVIII蛋白結合於一或多個聚合物。聚合物可為水溶性的且共價或非共價連接至因子VIII或結合至因子VIII之其他部分。聚合物之非限制性實例可為聚(環氧烷)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯醯基嗎啉)。其他類型之聚合物結合FVIII揭示於美國專利第7,199,223號中。
II.C.3.h.羥乙基澱粉(HES)
在某些實施例中，經由VWF連接子連接至VWF蛋白或經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白之異源部分為聚合物，例如，羥乙基澱粉(HES)或其衍生物。
羥乙基澱粉(HES)為天然存在之支鏈澱粉的衍生物且藉由α-澱粉酶在體內降解。HES為碳水化合物聚合物支鏈澱粉之經取代衍生物，其以至多95重量%之濃度存在於玉米澱粉中。HES展現有利之生物特性且用作血容量替代劑以及在診所用於血液稀釋療法中(Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)；及Weidler等人，Arzneim.-Forschung/Drug Res.,41,494-498(1991))。
支鏈澱粉含有葡萄糖部分，其中在主鏈中存在α-1,4-糖苷鍵且在分枝位點存在α-1,6-糖苷鍵。此分子之物理-化學特性主要由糖苷鍵類型決定。由於帶缺口之α-1,4-糖苷鍵，產生每圈具有約六個葡萄糖單體之螺旋結構。聚合物之物理-化學以及生物化學特性可經由取代修飾。可經由鹼性羥乙基澱粉化達成羥乙基之引入。藉由調整反應條件，有可能利用未經取代之葡萄糖單體中之各別羥基關於羥乙基澱粉化之不同反應性。由此，熟習此項技術者能夠在有限程度上影響取代模式。
HES之主要特徵在於分子量分佈及取代程度。取代程度(以DS指示)係關於莫耳取代，為熟習此項技術者 所知。參見如上文所引用之Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)，尤其是第273頁。
在一個實施例中，羥乙基澱粉具有1至300kD、2至200kD、3至100kD或4至70kD之平均分子量(重量平均值)。羥乙基澱粉可進一步展現0.1至3、較佳0.1至2、更佳0.1至0.9、較佳0.1至0.8之莫耳取代程度，且關於羥乙基之C2：C6取代之間的比率在2至20之範圍內。具有約130kD之平均分子量之HES的非限制性實例為具有0.2至0.8諸如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8、較佳0.4至0.7諸如0.4、0.5、0.6或0.7之取代程度的HES。在一特定實施例中，具有約130kD之平均分子量之HES為來自Fresenius之VOLUVEN®。VOLUVEN®為人工膠體，例如用於治療及預防低容量血症之治療適應症中所用之容量替代。VOLUVEN®之特徵為130,000+/-20,000D之平均分子量、0.4之莫耳取代及約9：1之C2：C6比率。在其他實施例中，羥乙基澱粉之平均分子量範圍為例如4至70kD或10至70kD或12至70kD或18至70kD或50至70kD或4至50kD或10至50kD或12至50kD或18至50kD或4至18kD或10至18kD或12至18kD或4至12kD或10至12kD或4至10kD。在其他實施例中，所用羥乙基澱粉之平均分子量在高於4kD且低於70kD之範圍內，諸如為約10kD，或在9至10kD或10至11kD或9至11kD之範圍內，或為約12kD，或在11至12kD或12至13kD或11至13kD之範圍內，或為約18kD，或 在17至18kD或18至19kD或17至19kD之範圍內，或為約30kD，或在29至30、或30至31kD之範圍內，或為約50kD，或在49至50kD或50至51kD或49至51kD之範圍內。
在某些實施例中，異源部分可為具有不同平均分子量及/或不同取代程度及/或不同C2：C6取代比率之羥乙基澱粉之混合物。因此，可使用具有不同平均分子量及不同取代程度及不同C2：C6取代比率、或具有不同平均分子量及不同取代程度及相同或大致相同C2：C6取代比率、或具有不同平均分子量及相同或大致相同取代程度及不同C2：C6取代比率、或具有相同或大致相同平均分子量及不同取代程度及不同C2：C6取代比率、或具有不同平均分子量及相同或大致相同取代程度及相同或大致相同C2：C6取代比率、或具有相同或大致相同平均分子量及不同取代程度及相同或大致相同C2：C6取代比率、或具有相同或大致相同平均分子量及相同或大致相同取代程度及不同C2：C6取代比率、或具有大致相同平均分子量及大致相同取代程度及大致相同C2：C6取代比率之羥乙基澱粉之混合物。
II.C.3.i.聚唾液酸(PSA)
在某些實施例中，經由VWF連接子連接至VWF蛋白或經由FVIII連接子連接至FVIII蛋白之非多肽異源部分為聚合物，例如，聚唾液酸(PSA)或其衍生物。聚唾液酸(PSA)為藉由某些細菌株且在哺乳動物中在某些細 胞中產生之天然存在之未分枝唾液酸聚合物。Roth J.等人，(1993)Polysialic Acid：From Microbes to Man,Roth J.,Rutishauser U.,Troy F.A.編(Birkhäuser Verlag,Basel,Switzerland)，第335-348頁。其可藉由有限之酸水解或藉由神經胺酸酶消化，或藉由聚合物之天然之細菌源形式分餾，以自n=約80或更多個唾液酸殘基至降至n=2之各種聚合程度產生。不同聚唾液酸之組成亦改變，以使得存在均聚物形式，亦即包含大腸桿菌株K1及B族腦膜炎球菌之莢膜多醣之α-2,8-連接聚唾液酸，其亦存在於神經元細胞黏附分子(N-CAM)之胚胎形式上。亦存在異質聚合物形式，諸如大腸桿菌株K92及C族腦膜炎奈瑟球菌多醣之交替α-2,8 α-2,9聚唾液酸。唾液酸亦可見於與除唾液酸之外之單體諸如W135族或Y族腦膜炎奈瑟球菌之交替共聚物。聚唾液酸具有重要之生物功能，包括藉由致病菌逃避免疫及補體系統以及在胎兒發育期間調控未成熟神經元之神經膠質黏附性(其中該聚合物具有抗黏附功能)(Cho及Troy,P.N.A.S.,USA,91(1994)11427-11431)，但在哺乳動物中不存在聚唾液酸之已知受體。大腸桿菌株K1之α-2,8-連接聚唾液酸亦稱為『多聚乙醯神經酸(colominic acid)』且(以各種長度)用於例示本發明。連接或結合聚唾液酸與多肽之各種方法已經描述(例如，參見美國專利第5,846,951號、WO-A-0187922及US 2007/0191597 A1，其以全文引用之方式併入本文中。
II.C.4.XTEN序列。
如本文所用，「XTEN序列」係指具有主要由小的親水性胺基酸組成之非天然存在之實質上非重複序列的延長長度之多肽，其中序列在生理條件下具有低程度之二級或三級結構或者不具有二級或三級結構。作為嵌合蛋白搭配物，XTEN可充當載劑，當連接至本發明之VWF蛋白或FVIII蛋白以產生嵌合蛋白時賦予某些所需藥物動力學、物理化學及醫藥特性。該等所需特性包括(但不限於)增強之藥物動力學參數及溶解特性。如本文所用，「XTEN」特定排除抗體或抗體片段，諸如單鏈抗體或輕鏈或重鏈之Fc片段。
在一些實施例中，本發明之XTEN序列為具有大於約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸殘基之肽或多肽。在某些實施例中，XTEN為具有大於約20個至約3000個胺基酸殘基、大於30個至約2500個殘基、大於40個至約2000個殘基、大於50個至約1500個殘基、大於60個至約1000個殘基、大於70個至約900個殘基、大於80個至約800個殘基、大於90個至約700個殘基、大於100個至約600個殘基、大於110個至約500個殘基、或大於120個至約400個殘基之肽或多肽。
本發明之XTEN序列可包含一或多個具有9至14個胺基酸殘基之序列基元或與該序列基元具至少80%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列，其中該基元包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：選自由甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)組成之群的4至6種類型之胺基酸。參見US 2010-0239554 A1。
在一些實施例中，XTEN包含非重疊序列基元，其中約80%、或至少約85%、或至少約90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%或約100%之序列由選自自表2A中選出之單一基元家族之非重疊序列的多個單元組成，從而產生家族序列。如本文所用，「家族」意謂XTEN具有僅由來自表2A之單一基元類別選出之基元；亦即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，且XTEN中並非來自家族基元之任何其他胺基酸經選擇以達成所需特性，諸如允許藉由編碼核苷酸併入限制位點，併入裂解序列，或達成與FVIII或VWF之更佳連接。在XTEN家族之一些實施例中，XTEN序列包含AD基元家族、或AE基元家族、或AF基元家族、或AG基元家族、或AM基元家族、或AQ基元家族、或BC家族、或BD家族之非重疊序列基元之多個單元，其中所得XTEN展現上述同源性範圍。在其他實施例中，XTEN包含來自表2A之兩個或更多個基元家族之基元序列的多個單元。此等序列可經選擇以達成所需物理/化學特性，包括諸如淨電荷、親水性、缺乏二級結構或缺乏由基元之胺基酸組成所賦予之重複性等性質，其在 下文更充分描述。在此段落中之上述實施例中，併入XTEN中之基元可使用本文所述之方法選擇且組裝以達成具有約36個至約3000個胺基酸殘基之XTEN。
Figure 109104938-A0202-12-0085-11
XTEN可具有不同長度以供插入或連接至FVIII或VWF或嵌合分子之任何其他組分。在一個實施例中，一 或多個XTEN序列之長度係基於在融合蛋白中待達成之性質或功能而進行選擇。視預期性質或功能而定，XTEN可為可充當載劑之較短或中等長度序列或較長序列。在某些實施例中，XTEN包括具有約6個至約99個胺基酸殘基之短區段、具有約100個至約399個胺基酸殘基之中等長度區段，及具有約400個至約1000個且至多約3000個胺基酸殘基之較長長度區段。因此，插入或連接至FVIII或VWF之XTEN可具有約6、約12、約36、約40、約42、約72、約96、約144、約288、約400、約500、約576、約600、約700、約800、約864、約900、約1000、約1500、約2000、約2500或至多約3000個胺基酸殘基之長度。在其他實施例中，XTEN序列之長度為約6至約50、約50至約100、約100至150、約150至250、約250至400、約400至約500、約500至約900、約900至1500、約1500至2000、或約2000至約3000個胺基酸殘基。插入或連接至FVIII或VWF之XTEN之精確長度可改變而不會不利影響FVIII或VWF之活性。在一個實施例中，本文使用之一或多種XTEN具有36個胺基酸、42個胺基酸、72個胺基酸、144個胺基酸、288個胺基酸、576個胺基酸或864個胺基酸之長度且可選自XTEN家族序列中之一或多者；亦即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。
在一些實施例中，本發明中使用之XTEN序列與選自由以下組成之群之序列具至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%一致性：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908及AG2004。參見US 2010-0239554 A1。
在一個實施例中，XTEN序列與選自由AE42、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何組合組成之群之胺基酸序列具至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在另一實施例中，XTEN序列係選自由AE42、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何組合組成之群。在一特定實施例中，XTEN序列為AE288。本發明之某些XTEN序列之胺 基酸序列示於表2B中。
Figure 109104938-A0202-12-0088-12
Figure 109104938-A0202-12-0089-13
在所用XTEN組分中小於100%之其胺基酸由選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之4、5或6種類型之胺基酸組成、或小於100%之序列由來自表2A之序列基元或表2B之XTEN序列組成的彼等實施例中，XTEN之其他胺基酸殘基係選自任何其他14種天然L-胺基酸，但優先選自親水性胺基酸以使得 XTEN序列含有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%親水性胺基酸。不為甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之XTEN胺基酸散佈於整個XTEN序列內，位於序列基元內或之間，或者集中在XTEN序列之一或多個短伸展物中，例如，以產生XTEN與其他組分(例如，VWF蛋白)之間的連接子。在XTEN組分包含除甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之外之胺基酸的此等情況下，較佳的是小於約2%或小於約1%之胺基酸為疏水性殘基以使得所得序列一般缺乏二級結構，例如，如藉由本文揭示之方法所測定，不具有大於2% α螺旋或2% β折疊。在XTEN之構造中不太偏愛之疏水性殘基包括色胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸及甲硫胺酸。另外，可設計XTEN序列以包含小於5%或小於4%或小於3%或小於2%或小於1%之下列胺基酸或不含下列胺基酸：半胱胺酸(以避免二硫化物形成及氧化)、甲硫胺酸(以避免氧化)、天冬醯胺酸及麩醯胺酸(以避免脫醯胺)。因此，在一些實施例中，包含除甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之外之其他胺基酸的XTEN具有如藉由Chou-Fasman演算法所量測貢獻於α螺旋及β折疊之殘基小於5%的序列且具有如藉由GOR演算法所量測至少90%或至少約95%以上之無規捲曲形成。
在其他實施例中，本發明中使用之XTEN序列 影響本發明嵌合蛋白之物理或化學特性，例如，藥物動力學特性。本發明中使用之XTEN序列可展現下列有利特性中之一或多者：構型靈活性、增強之水溶性、高程度之蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體之低結合或增大之流體動力學(或Stokes)半徑。在一特定實施例中，在本發明中連接至FVIII蛋白之XTEN序列提高藥物動力學特性，諸如較長終末半衰期或增加之曲線下面積(AUC)，以使得本文所述嵌合蛋白相比於野生型FVIII保持在活體內之時間增加。在其他實施例中，本發明中使用之XTEN序列提高藥物動力學特性，諸如較長終末半衰期或增加之曲線下面積(AUC)，以使得FVIII蛋白相比於野生型FVIII保持在活體內之時間增加。
可使用多種方法及檢定來測定包含XTEN序列之蛋白質的物理/化學特性。該等方法包括(但不限於)分析離心、EPR、離子交換HPLC、尺寸排阻HPLC、逆相HPLC、光散射、毛細管電泳、圓二色法、差示掃描熱量測定、螢光法、離子交換HPLC、尺寸排阻HPLC、IR、NMR、拉曼光譜、折射率測定及紫外/可見光譜。其他方法揭示於Amau等人，Prot Expr and Purif 48,1-13(2006)中。
根據本發明可使用XTEN序列之其他實例且其揭示於美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號或第2011/0172146 A1號、或者國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號、第WO 2011028344 A2號或第WO2013123457 A1號、或者國際申請案第PCT/US2013/049989號中。
II.C.5.FVIII蛋白
除非另外說明，否則如本文所用之「FVIII蛋白」意謂在凝血中呈其正常作用之功能性FVIII多肽。術語FVIII蛋白包括在凝血路徑中保持全長野生型因子VIII之功能的其功能性片段、變異體、類似物或衍生物。「FVIII蛋白」可與FVIII多肽(或蛋白質)或FVIII互換使用。FVIII功能之實例包括(但不限於)活化凝血之能力、充當因子IX之輔因子之能力、或在Ca2+及磷脂存在下與因子IX形成tenase複合物且隨後將因子X轉化為活化形式Xa之能力。FVIII蛋白可為人類、豬、犬、大鼠或鼠類FVIII蛋白。另外，來自人類及其他物種之FVIII之間的比較已鑒別可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人，Thromb.Haemost.79：317-22(1998)；US 6,251,632)。
多種測試可用於評估凝血系統之功能：活化部分凝血活酶時間(aPTT)測試、顯色檢定、ROTEM檢定、凝血酶原時間(PT)測試(亦用於測定INR)、血纖維蛋白原測試(通常藉由Clauss法)、血小板計數、血小板功能測試(通常藉由PFA-100)、TCT、出血時間、混合測試(若將患者 之血漿與正常血漿混合時是否校正異常)、凝血因子檢定、抗磷脂抗體、D-二聚體、基因測試(例如因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋Russell毒蛇毒液時間(dRVVT)、雜項血小板功能測試、血栓彈力圖(TEG或Sonoclot)、血栓彈力測定(TEM®，例如ROTEM®)或優球蛋白溶解時間(ELT)。
aPTT測試為量測「固有」(亦稱為接觸活化路徑)及常見凝血路徑之功效的效能指標。此測試通常用於量測市售重組凝血因子(例如，FVIII或FIX)之凝血活性。其與量測外部路徑之凝血酶原時間(PT)結合使用。
ROTEM分析提供關於止血之完全動力學的資訊：凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性及溶解。血栓彈力測定中之不同參數取決於血漿凝血系統之活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響此等相互作用之許多因素。此檢定可提供二次止血之完整見解。
FVIII多肽及聚核苷酸序列為已知的，許多功能性片段、突變體及修飾形式亦如此。人類FVIII序列(全長)之實例顯示為SEQ ID NO：16或18中之子序列。
Figure 109104938-A0202-12-0094-14
Figure 109104938-A0202-12-0095-15
Figure 109104938-A0202-12-0096-16
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FVIII多肽包括全長FVIII、在N端減去Met之全長FVIII、成熟FVIII(減去信號序列)、在N端具有另一Met之成熟FVIII及/或具有B結構域之完全或部分缺失之FVIII。在某些實施例中，FVIII變異體包括B結構域缺失，存在部分或完全缺失。
人類FVIII基因經分離且表現於哺乳動物細胞中(Toole,J.J.等人，Nature 312：342-347(1984)；Gitschier,J.等人，Nature 312：326-330(1984)；Wood,W.I.等人，Nature 312：330-337(1984)；Vehar,G.A.等人，Nature 312：337-342(1984)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；及美國專利第4,757,006號)。如美國專利第4,965,199號中所示，自cDNA推導FVIII胺基酸序列。另外，部分或完全B結構域缺失之FVIII示於美國專利第4,994,371號及第4,868,112號中。在一些實施例中，人類FVIII B結構域經人類因子V B結構域置換，如美國專利第5,004,803號中所示。編碼人類因子VIII之cDNA序列及胺基酸序列分別示於美國專利第7,211,559號之SEQ ID NO：1及2中。
豬FVIII序列公開於Toole,J.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5939-5942(1986)中。此外，自來自豬脾cDNA文庫之FVIII序列之PCR擴增獲得的完整豬cDNA序列已報導於Healey,J.F.等人，Blood 88：4209-4214(1996)中。具有所有結構域、所有亞單位及特定胺基酸序列之取代的雜交人類/豬FVIII揭示於Lollar及Runge之美國專利第5,364,771號中以及WO 93/20093中。近來，豬FVIII之A1及A2結構域以及具有用豬A1及/或A2結構域取代相應人類結構域之嵌合FVIII之核苷酸及相應胺基酸序列報導於WO 94/11503中。Lollar,J.S.之美國專利第5,859,204號亦揭示豬cDNA及推導之胺基酸序列。美國專利第 6,458,563號揭示B結構域缺失之豬FVIII。
Lollar,J.S.之美國專利第5,859,204號報導具有降低之抗原性及降低之免疫反應性的FVIII之功能突變體。Lollar,J.S.之美國專利第6,376,463號亦報導具有降低之免疫反應性之FVIII突變體。Saenko等人之美國申請公開案第2005/0100990號報導FVIII之A2結構域中之功能突變。
在一個實施例中，FVIII蛋白(或嵌合蛋白之FVIII部分)可與SEQ ID NO：18之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：16(不具有信號序列)之胺基酸1至2332之FVIII胺基酸序列具至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，其中該FVIII具有凝血活性，例如，活化作為輔因子之因子IX以將因子X轉化為活化因子X。FVIII(或嵌合蛋白之FVIII部分)可與SEQ ID NO：18之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：16(不具有信號序列)之胺基酸1至2332之FVIII胺基酸序列一致。FVIII蛋白可進一步包含信號序列。
如本文所用，FVIII之「B結構域」與此項技術中已知由內部胺基酸序列一致性及蛋白水解裂解位點界定之B結構域相同，例如，全長人類FVIII之殘基Ser741-Arg1648。其他人類FVIII結構域係由以下胺基酸殘基界定：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Asn2019；C1，殘基Lys2020-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基 Ser1690-Tyr2332。其餘序列(殘基Glu1649-Arg1689)通常稱為a3酸性區域。所有結構域(包括豬、小鼠及犬FVIII之B結構域)之邊界位置亦為此項技術中已知。在一個實施例中，FVIII之B結構域缺失(「B結構域缺失之因子VIII」或「BDD FVIII」)。BDD FVIII之實例為REFACTO®(重組BDD FVIII)，其具有與表5中之序列之因子VIII部分相同的序列。(BDD FVIII重鏈加雙下劃線；B結構域為斜體字；且BDD FVIII輕鏈為普通文字)。
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「B結構域缺失之FVIII」可具有美國專利第6,316,226號、第6,346,513號、第7,041,635號、第5,789,203號、第6,060,447號、第5,595,886號、第6,228,620號、第5,972,885號、第6,048,720號、第5,543,502號、第5,610,278號、第5,171,844號、第5,112,950號、第4,868,112號及第6,458,563號中所揭示之完全或部分缺失。在一些實施例中，本發明之B結構域缺失之FVIII序列包含美國專利第6,316,226號(亦於US 6,346,513中)之第4欄第4行至第5欄第28行及實例1-5中所揭示之缺失中的任一者。在另一實施例中，B結構域缺失之因子VIII為S743/Q1638 B結構域缺失之因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如，具有胺基酸744至胺基酸1637之缺失之因子VIII，例如，具有SEQ ID NO：16之胺基酸1-743及胺基酸1638-2332之因子VIII，亦即，SEQ ID NO：18)。在一 些實施例中，本發明之B結構域缺失之FVIII具有在美國專利第5,789,203號(以及US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620)之第2欄第26-51行及實例5-8中揭示之缺失。在一些實施例中，B結構域缺失之因子VIII具有美國專利第5,972,885號之第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利第6,048,720號之第6欄第1-22行及實例1；美國專利第5,543,502號之第2欄第17-46行；美國專利第5,171,844號之第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利第5,112,950號之第2欄第55-68行、圖2及實例1；美國專利第4,868,112號之第2欄第2行至第19欄第21行及表2；美國專利第7,041,635號之第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利第6,458,563號之第4欄第25-53行中所述之缺失。
在一些實施例中，B結構域缺失之FVIII具有大部分B結構域之缺失，但仍包含對於將主要轉譯產物活體內蛋白水解加工成兩個多肽鏈所必需之B結構域之胺基末端序列，如WO 91/09122中所揭示。在一些實施例中，B結構域缺失之FVIII經構築具有胺基酸747-1638之缺失，亦即，B結構域之幾乎完全缺失。Hoeben R.C.等人，J.Biol.Chem.265(13)：7318-7323(1990)。B結構域缺失之因子VIII亦可包含FVIII之胺基酸771-1666或胺基酸868-1562之缺失。Meulien P.等人，Protein Eng.2(4)：301-6(1988)。作為本發明之部分的其他B結構域缺失包括：胺 基酸982至1562或760至1639(Toole等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797至1562(Eaton等人，Biochemistry(1986)25：8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公開申請案第WO 87/04187號))、747-1560(Sarver等人，DNA(1987)6：553-564))、741至1648(Pasek(PCT申請案第88/00831號))或816至1598或741至1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82：16-25,EP 295597))之缺失。在其他實施例中，BDD FVIII包括包含保留一或多個N連接糖基化位點(例如，殘基757、784、828、900、963或視情況943，其對應於全長FVIII序列之胺基酸序列)之B結構域片段之FVIII多肽。B結構域片段之實例包括B結構域之226個胺基酸或163個胺基酸，如Miao,H.Z.等人，Blood 103(a)：3412-3419(2004)；Kasuda,A等人，J.Thromb.Haemost.6：1352-1359(2008)；及Pipe,S.W.等人，J.Thromb.Haemost.9：2235-2242(2011)中所揭示(亦即，B結構域之前226個胺基酸或163個胺基酸得以保留)。在一些實施例中，具有部分B結構域之FVIII為FVIII198。FVIII198為含有單鏈FVIIIFc分子-226N6之部分B結構域。226表示FVIII B結構域之N端226胺基酸，且N6表示B結構域中之六個N糖基化位點。在其他實施例中，BDD FVIII進一步包含殘基309處之點突變(Phe至Ser)以改良BDD FVIII蛋白之表現。參見Miao,H.Z.等人，Blood 103(a)：3412-3419(2004)。在其他實施例中，BDD FVIII包括包含B結構域之一部分的FVIII多肽，但不包含一或多 個furin裂解位點(例如，Arg1313及Arg 1648)。參見Pipe,S.W.等人，J.Thromb.Haemost.9：2235-2242(2011)。在任何FVIII序列中可進行各前述缺失。
可用於本發明中之FVIII蛋白可包括其中具有一或多個其他異源序列或化學或物理修飾之FVIII，其不影響FVIII凝血活性。此等異源序列或化學或物理修飾可與FVIII蛋白之C端或N端融合或插入FVIII蛋白中之兩個胺基酸殘基中之一或多者之間。FVIII蛋白中之此等插入不影響FVIII凝血活性或FVIII功能。在一個實施例中，插入可改良FVIII蛋白之藥物動力學特性(例如，半衰期)。在另一實施例中，插入可超過兩個、三個、四個、五個或六個位點。
在一個實施例中，FVIII在胺基酸1648(在全長因子VIII或SEQ ID NO：16中)、胺基酸754(在S743/Q1638 B結構域缺失之因子VIII或SEQ ID NO：16中)或相應精胺酸殘基(在其他變異體中)處緊鄰精胺酸後裂解，從而產生重鏈及輕鏈。在另一實施例中，FVIII包含重鏈及輕鏈，其係藉由金屬離子介導之非共價鍵連接或締合。
在其他實施例中，FVIII為尚未在胺基酸1648(在全長因子FVIII或SEQ ID NO：16中)、胺基酸754(在S743/Q1638 B結構域缺失之因子FVIII或SEQ ID NO：18中)或相應精胺酸殘基(在其他變異體中)處緊鄰精胺酸後裂解的單鏈FVIII。單鏈FVIII可包含一或多個胺基酸取代。在 一個實施例中，胺基酸取代在對應於全長成熟因子VIII多肽(SEQ ID NO：16)之殘基1648、殘基1645或兩者或SQ BDD因子VIII(SEQ ID NO：18)之殘基754、殘基751或兩者的殘基處。胺基酸取代可為除精胺酸之外的任何胺基酸，例如，異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酥胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、脯胺酸、硒代半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸、組胺酸、鳥胺酸、吡咯離胺酸或牛磺酸。
FVIII可進一步由凝血酶裂解且隨後活化為FVIIIa，從而充當活化因子IX之輔因子(FIXa)。且活化FIX與活化FVIII一起形成Xase複合物且將因子X轉化為活化因子X(FXa)。對於活化，FVIII係在胺基酸372、740及1689(對應於B結構域缺失之FVIII序列中之胺基酸372、740及795)處三個精胺酸殘基後由凝血酶裂解，裂解產生之FVIIIa具有50kDa A1、43kDa A2及73kDa A3-C1-C2鏈。在一個實施例中，可用於本發明之FVIII蛋白為非活性FVIII。在另一實施例中，FVIII蛋白為活化FVIII。
具有連接至VWF蛋白或與VWF蛋白締合之FVIII多肽的蛋白質可包含與SEQ ID NO：16或18具至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列，其中該序列具有FVIII凝血活性，例如，活化作為輔因子之因子IX以將因子X轉化為活化因子X(FXa)。
在一些實施例中，FVIII蛋白進一步包含與FVIII蛋白之C端或N端融合或插入FVIII蛋白中之兩個相鄰胺基酸之間的一或多個異源部分。在其他實施例中，異源部分包含具有至少約50個胺基酸、至少約100個胺基酸、至少約150個胺基酸、至少約200個胺基酸、至少約250個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約800個胺基酸、至少約850個胺基酸、至少約900個胺基酸、至少約950個胺基酸或至少約1000個胺基酸之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合分子之半衰期相比於野生型FVIII延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
其他例示性FVIII變異體亦揭示於2013年1月17日公開之美國公開案第US2013/0017997號、2013年8月22日公開之國際公開案第WO 2013/122617號、或2014年1月16日公開之國際公開案第WO 2014/011819號、或國際公開案第WO2013123457 A1號、或國際申請案第PCT/US2013/049989號中。
III.聚核苷酸、載體、宿主細胞及製備方法
本發明中亦提供編碼本文所述之嵌合分子之聚核苷酸。當VWF蛋白經由VWF連接子連接至異源部分且連接至嵌合蛋白中之FVIII蛋白及XTEN序列作為單一多肽鏈時，本發明係關於編碼單一多肽鏈之單一聚核苷酸。當嵌合蛋白包含第一多肽鏈及第二多肽鏈時，該第一多肽鏈包含經由VWF連接子連接之VWF蛋白、XTEN序列及第一異源部分(例如，第一Fc區)且該第二多肽鏈包含FVIII蛋白及第二異源部分(例如，第二Fc區)，聚核苷酸可包含第一核苷酸區域及第二核苷酸區域。在一個實施例中，第一核苷酸區域及第二核苷酸區域處於相同聚核苷酸上。在另一實施例中，第一核苷酸區域及第二核苷酸區域處於兩個不同聚核苷酸(例如，不同載體)上。在某些實施例中，本發明係針對一組包含第一核苷酸鏈及第二核苷酸鏈之聚核苷酸，其中該第一核苷酸鏈編碼VWF蛋白、XTEN序列、VWF連接子及嵌合蛋白之異源部分且該第二核苷酸鏈編碼FVIII蛋白及第二異源部分。在一些實施例中，本發明係針對一組包含第一核苷酸鏈及第二核苷酸鏈之聚核苷酸，其中該第一核苷酸鏈編碼VWF蛋白及嵌合蛋白之異源部分且該第二核苷酸鏈編碼經由FVIII連接子與第二異源部分融合之FVIII蛋白，其中至少一個XTEN序列與嵌合蛋白融合。在其他實施例中，本發明係針對一組包含第一核苷酸鏈及第二核苷酸鏈之聚核苷酸，其中該第一核苷酸鏈編碼VWF蛋白、VWF連接子及嵌合蛋白之異源部分且該第二核苷酸鏈編碼FVIII蛋白、FVIII連接子及第二異源部分，其 中至少一個XTEN序列與嵌合蛋白融合。
在其他實施例中，該組聚核苷酸進一步包含編碼蛋白質轉化酶之另一核苷酸鏈(例如，當嵌合多肽係由單一聚核苷酸鏈編碼時的第二核苷酸鏈，或當嵌合蛋白係由兩個聚核苷酸鏈編碼時的第三核苷酸鏈)。蛋白質轉化酶可選自5型前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin(PCSK5或PC5)、7型前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin(PCSK7或PC5)、酵母Kex 2、3型前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin(PACE或PCSK3)，或其中兩者或更多者之組合。在一些實施例中，蛋白酶轉化酶為PACE、PC5或PC7。在一特定實施例中，蛋白質轉化酶為PC5或PC7。參見國際申請案第PCT/US2011/043568號，其以引用之方式併入本文中。在另一實施例中，蛋白酶轉化酶為PACE/furin。
在某些實施例中，本發明包括一組聚核苷酸，其包含編碼經由VWF連接子與第一異源部分融合之包含VWF之D'結構域及D3結構域之VWF蛋白的第一核苷酸序列、編碼FVIII蛋白及第二異源部分之第二核苷酸序列，及編碼VWF之D1結構域及D2結構域之第三核苷酸序列，且其中XTEN序列存在於第一個鏈或第二個鏈中。在此實施例中，D1結構域及D2結構域分別表現(並不連接至VWF蛋白之D'D3結構域)以使得適當二硫鍵形成及D'D3結構域折疊。D1D2結構域表現可為順式或反式。
如本文所用，表現載體係指當引入適當宿主 細胞中時，包含插入編碼序列之轉錄及轉譯所必需之元件或在RNA病毒載體之情況下為複製及轉譯所必需之元件的任何核酸構築體。表現載體可包括質體、噬菌體、病毒及其衍生物。
本發明之表現載體將包括編碼嵌合分子之聚核苷酸。
在一個實施例中，嵌合分子之編碼序列可操作地連接至表現控制序列。如本文所用，當兩個核酸序列以允許各組分核酸序列保留其功能性之方式共價連接時，其係可操作地連接。當編碼序列及基因表現控制序列以將編碼序列之表現或轉錄及/或轉譯置於基因表現控制序列之影響或控制下的方式共價連接時，將其稱為可操作地連接。若5'基因表現序列中之啟動子之誘導產生編碼序列之轉錄且若兩個DNA序列之間之連接的性質不會(1)導致移碼突變之引入，(2)幹擾啟動子區域引導編碼序列之轉錄的能力，或(3)幹擾相應RNA轉錄物轉譯成蛋白質之能力，則將該兩個DNA序列稱為可操作地連接。因此，若基因表現序列能夠實現編碼核酸序列之轉錄以使得所得轉錄物轉譯成所需蛋白質或多肽，則該基因表現序列將可操作地連接至該編碼核酸序列。
如本文所用之基因表現控制序列為任何調控核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-增強子組合，其促進與其可操作地連接之編碼核酸之有效轉錄及轉譯。基因表現控制序列可例如為哺乳動物或病毒啟動子，諸如組 成性或可誘導啟動子。組成性哺乳動物啟動子包括(但不限於)以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子及其他組成性啟動子。在真核細胞中組成性地起作用之例示性病毒啟動子包括例如來自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如，SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、Rous肉瘤病毒、巨細胞病毒、Moloney白血病病毒之長末端重複序列(LTR)及其他反轉錄病毒之啟動子，以及單純皰疹病毒之胸苷激酶啟動子。其他組成性啟動子為一般技術者所知。可用作本發明之基因表現序列之啟動子亦包括可誘導啟動子。可誘導啟動子在誘導劑之存在下表現。舉例而言，金屬硫蛋白啟動子經誘導以促進在某些金屬離子存在下轉錄及轉譯。其他可誘導啟動子為一般技術者所知。
一般而言，基因表現控制序列必要時應包括分別涉及轉錄及轉譯之起始的5'非轉錄及5'非轉譯序列，諸如TATA盒、封端序列、CAAT序列及其類似物。尤其是，此等5'非轉錄序列將包括啟動子區域，其包括用於可操作地接合之編碼核酸之轉錄控制的啟動子序列。必要時，基因表現序列視情況包括增強子序列或上游激活子序列。
病毒載體包括(但不限於)來自以下病毒之核酸序列：反轉錄病毒，諸如Moloney鼠類白血病病毒、Harvey鼠類肉瘤病毒、鼠類乳腺腫瘤病毒及Rous肉瘤病 毒；腺病毒、腺相關病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)；乳頭狀瘤病毒；皰疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；及RNA病毒，諸如反轉錄病毒。可容易地採用此項技術中熟知之其他載體。某些病毒載體係基於非細胞致病性真核病毒，其中非必需基因已置換為相關基因。非細胞致病性病毒包括反轉錄病毒，其生命週期涉及基因組病毒RNA反向轉錄成DNA，隨後前病毒整合至宿主細胞DNA中。反轉錄病毒已經批准用於人類基因療法試驗。大部分有用者為彼等複製缺陷型反轉錄病毒(亦即，能夠引導所需蛋白之合成，但不能製造感染性粒子)。此等基因改變之反轉錄病毒表現載體具有基因在活體內高效轉導之一般效用。用於產生複製缺陷型反轉錄病毒之標準方案(包括以下步驟：將外源遺傳物質併入質體中，用質體轉染包裝細胞株，藉由包裝細胞株產生重組反轉錄病毒，自組織培養基收集病毒粒子，及用病毒粒子感染靶細胞)提供於Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman Co.,New York(1990)及Murry,E.J.,Methods in Molecular Biology，第7卷，Humana Press,Inc.,Cliffton,N.J.(1991)中。
在一個實施例中，病毒為腺相關病毒、雙鏈DNA病毒。腺相關病毒可經工程改造為複製缺陷型且能夠感染廣泛多種細胞類型及物種。其進一步具有以下優點，諸如熱及脂質溶劑穩定性；在不同譜系細胞(包括造血細胞)中之高轉導頻率；及缺乏二重感染抑制，因而允許多 個系列之轉導。據報導，腺相關病毒可以位點特異性方式整合至人類細胞DNA中，從而將插入突變誘發之可能性及反轉錄病毒感染之插入基因表現特徵之可變性最小化。另外，野生型腺相關病毒感染已在不存在選擇性壓力之情況下在組織培養中傳代100次以上，表明腺相關病毒基因組整合為相對穩定之事件。腺相關病毒亦可以染色體外方式起作用。
其他載體包括質體載體。質體載體已在此項技術中廣泛描述且為本領域技術人員所熟知。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。近年來，已發現質體載體特別有利於在活體內傳遞基因至細胞，此係由於其不能在宿主基因組中複製及整合至宿主基因組中。然而，具有可與宿主細胞相容之啟動子之此等質體可自在質體內可操作地編碼之基因表現肽。一些可獲自商業供應商之常用質體包括pBR322、pUC18、pUC19、各種pcDNA質體、pRC/CMV、各種pCMV質體、pSV40及pBlueScript。特定質體之其他實例包括pcDNA3.1，目錄號V79020；pcDNA3.1/hygro，目錄號V87020；pcDNA4/myc-His，目錄號V86320；及pBudCE4.1，目錄號V53220，均來自Invitrogen(Carlsbad,CA.)。其他質體為一般技術者所熟知。另外，可使用標準分子生物學技術來定制設計質體以移除及/或添加特定DNA片段。
在可用於產生本發明之蛋白質的一個昆蟲表 現系統中，使用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)作為載體來表現外來基因。該病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中生長。可將編碼序列選殖至病毒之非必需區域(例如，多面體基因)中且置於ACNPV啟動子(例如，多面體啟動子)之控制下。編碼序列之成功插入將導致多面體基因之失活及非閉合重組病毒(亦即，缺乏由多面體基因編碼之蛋白質包衣之病毒)的產生。此等重組病毒隨後用於感染已表現插入基因之草地夜蛾細胞。(參見例如Smith等人，(1983)J Virol 46：584；美國專利第4,215,051號)。此表現系統之其他實例可見於Ausubel等人編，(1989)Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience中。
可用於表現本發明蛋白質之另一系統為麩醯胺酸合成酶基因表現系統，亦稱為「GS表現系統」(Lonza Biologics PLC,Berkshire UK)。此表現系統詳細描述於美國專利第5,981,216號中。
在哺乳動物宿主細胞中，可利用多種基於病毒之表現系統。在使用腺病毒作為表現載體之情況下，可將編碼序列連接至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如，後期啟動子及三重前導序列。隨後可藉由活體外或活體內重組將此嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組之非必需區域(例如，區域E1或E3)中將產生有活力且能夠在感染宿主中表現肽之重組病毒。參見例如Logan及Shenk (1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：3655)。或者，可使用牛痘7.5K啟動子。參見例如Mackett等人，(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：7415；Mackett等人，(1984)J Virol 49：857；Panicali等人，(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：4927。
為增加產生效率，可設計聚核苷酸以編碼由酶促裂解位點分離之本發明蛋白之多個單元。所得多肽可裂解(例如，藉由用適當的酶處理)以回收多肽單元。此可增加由單一啟動子驅動之多肽之產率。當用於適當的病毒表現系統中時，在轉錄物中內部引導由mRNA編碼之各多肽之轉譯；例如，藉由內部核糖體進入位點IRES。因此，多順反子構築體引導單一大型多順反子mRNA之轉錄，而該單一大型多順反子mRNA又引導多個個別多肽之轉譯。此方法消除聚蛋白之產生及酶促加工且可顯著增加由單一啟動子驅動之多肽的產率。
用於轉化中之載體通常將含有用於鑒別轉化株之可選擇標記。在細菌系統中，此可包括抗生素抗性基因，諸如胺苄青黴素或卡那黴素。用於經培養哺乳動物細胞中之可選擇標記包括賦予藥物(諸如新黴素、潮黴素及甲胺喋呤)以抗性之基因。可選擇標記可為可擴增可選擇標記。一種可擴增可選擇標記為二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。Simonsen C C等人，(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：2495-9。可選擇標記係由Thilly(1986)Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.評 述，且可選擇標記之選擇完全處於一般技術者之技術水準內。
可選擇標記可與相關基因同時引入另一質體上之細胞中，或其可引入相同質體上。若處於相同質體上，則可選擇標記及相關基因可處於不同啟動子或相同啟動子之控制下，後者之排列產生雙順反子訊息。此類型之構築體為此項技術中已知(例如，美國專利第4,713,339號)。
表現載體可編碼允許易於純化重組產生之蛋白質的標簽。實例包括(但不限於)載體pUR278(Ruther等人，(1983)EMBO J 2：1791)，其中待表現之蛋白質之編碼序列可連接至與lac z編碼區同框之載體中，以便產生經標記之融合蛋白；可使用pGEX載體來表現具有麩胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽之本發明蛋白質。此等蛋白質通常可溶且可容易地藉由吸附至麩胱甘肽-瓊脂糖珠粒、接著在遊離麩胱甘肽存在下溶離而自細胞中純化。該等載體包括用於在純化後容易移除標簽之裂解位點(凝血酶或因子Xa蛋白酶或PRESCISSION PROTEASETM(Pharmacia,Peapack,N.J.))。
隨後將一或多個表現載體轉染或共轉染至合適靶細胞中，其將表現多肽。此項技術中已知之轉染技術包括(但不限於)磷酸鈣沈澱(Wigler等人，(1978)Cell 14：725)、電穿孔(Neumann等人，(1982)EMBO J 1：841)及基於脂質體之試劑。多種宿主-表現載體系統可用於表現 本文所述之蛋白質，包括原核及真核細胞。此等包括(但不限於)微生物，諸如用含有適當編碼序列之重組噬菌體DNA或質體DNA表現載體轉化之細菌(例如，大腸桿菌)；用含有適當編碼序列之重組酵母或真菌表現載體轉化之酵母或絲狀真菌；用含有適當編碼序列之重組病毒表現載體(例如，杆狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；用含有適當編碼序列之重組病毒表現載體(例如，花椰菜花葉病毒或煙草花葉病毒)感染或用含有適當編碼序列之重組質體表現載體(例如，Ti質體)轉化之植物細胞系統；或動物細胞系統，包括哺乳動物細胞(例如，HEK 293、CHO、Cos、HeLa、HKB11及BHK細胞)。
在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞。如本文所用，真核細胞係指任何具有明確細胞核之動物或植物細胞。真核動物細胞包括脊椎動物(例如哺乳動物)之細胞，及無脊椎動物(例如，昆蟲)之細胞。真核植物細胞特定可包括(但不限於)酵母細胞。真核細胞相異於原核細胞(例如，細菌)。
在某些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞為源自哺乳動物之任何細胞。哺乳動物細胞特定包括(但不限於)哺乳動物細胞株。在一個實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。在另一實施例中，哺乳動物細胞為HEK 293細胞，其為人類胚胎腎細胞株。HEK 293細胞可以CRL-1533獲自American Type Culture Collection,Manassas,VA，且以293-H細胞(目錄號11631- 017)或293-F細胞(目錄號11625-019)獲自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)。在一些實施例中，哺乳動物細胞為PER.C6®細胞，其為源自視網膜之人類細胞株。PER.C6®細胞可獲自Crucell(Leiden,The Netherlands)。在其他實施例中，哺乳動物細胞為人類倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞可獲自American Type Culture Collection,Manassas,VA(例如，CHO-K1；CCL-61)。在其他實施例中，哺乳動物細胞為幼倉鼠腎(BHK)細胞。BHK細胞可獲自American Type Culture Collection,Manassas,Va(例如，CRL-1632)。在一些實施例中，哺乳動物細胞為HKB11細胞，其為HEK293細胞與人類B細胞株之雜交細胞株。Mei等人，Mol.Biotechnol.34(2)：165-78(2006)。
在一個實施例中，編碼VWF蛋白、VWF連接子、異源部分或本發明嵌合蛋白之質體進一步包括可選擇標記，例如，博萊黴素抗性，且轉染於HEK 293細胞中，以用於產生嵌合蛋白。
在其他實施例中，轉染細胞經穩定轉染。使用本領域技術人員已知之習知技術，此等細胞可選擇且維持為穩定細胞株。
含有蛋白質之DNA構築體之宿主細胞生長於適當生長培養基中。如本文所用，術語「適當生長培養基」意謂包含細胞生長所需之營養素之培養基。細胞生長所需之營養素可包括碳源、氮源、必要胺基酸、維生素、礦物及生長因子。視情況，培養基可含有一或多種選擇因 子。視情況，培養基可含有牛血清或胎牛血清(FCS)。在一個實施例中，培養基實質上不含IgG。生長培養基一般將針對含有DNA構築體之細胞進行選擇，藉由例如在由DNA構築體上之可選擇標記補充或與DNA構築體共轉染之必要營養素中之藥物選擇或其缺乏。培養之哺乳動物細胞一般生長於市售含血清或不含血清之培養基(例如，MEM、DMEM、DMEM/F12)中。在一個實施例中，培養基為CD293(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。在另一實施例中，培養基為CD17(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。適於所用特定細胞株之培養基之選擇在熟習此項技術者之技術水準內。
為了共表現如本文所述之嵌合分子之兩個多肽鏈，宿主細胞在允許兩個鏈表現之條件下培養。如本文所用，培養係指將活細胞在活體外至少保持一段確定的時間。保持可以(但無需)包括活細胞群體之增加。舉例而言，保持培養之細胞可為靜態群體，但仍存活且能夠產生所需產物，例如，重組蛋白或重組融合蛋白。用於培養真核細胞之合適條件為此項技術中所熟知且包括培養基、培養基補充劑、溫度、pH、氧飽和度及其類似條件之適當選擇。對於商業目的，培養可包括使用任何各種類型之規模擴大系統，包括震盪瓶、滾瓶、中空纖維生物反應器、攪拌槽生物反應器、氣升式生物反應器、Wave生物反應器以及其他。
細胞培養條件亦經選擇以允許嵌合分子中第一個鏈與第二個鏈之締合。允許嵌合分子表現之條件可包 括維生素K源之存在。舉例而言，在一個實施例中，將穩定轉染之HEK 293細胞培養於補充有4mM麩醯胺酸之CD293培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)或OptiCHO培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。
在一個態樣中，本發明係針對表現、製備或產生嵌合蛋白之方法，其包括a)用編碼嵌合分子之聚核苷酸轉染宿主細胞及b)在適於表現嵌合分子之條件下在培養基中培養該宿主細胞，其中該嵌合分子經表現。
在其他實施例中，含有嵌合分子之蛋白質產物分泌於培養基中。培養基自細胞中分離，濃縮，過濾且隨後穿過兩個或三個親和管柱，例如，蛋白質A管柱及一或兩個陰離子交換管柱。
在某些態樣中，本發明係關於由本文所述之方法產生之嵌合多肽。
活體外產生允許擴大規模以得到大量的本發明之所需變異多肽。在組織培養條件下用於哺乳動物細胞培養之技術為此項技術中所知且包括均質懸浮培養，例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中；或固定化或包埋細胞培養，例如在中空纖維、微囊中、在瓊脂糖微珠粒或陶瓷濾筒上。必要時及/或需要時，可藉由習用層析方法，例如凝膠過濾、離子交換層析、疏水性相互作用層析(HIC)、DEAE纖維素層析或親和層析來純化多肽之溶液。
本發明亦包括改良包含與第一異源部分及XTEN序列融合之VWF蛋白及與第二異源部分融合之FVIII 蛋白之嵌合FVIII蛋白之FVIII活性的方法，該方法包括將VWF連接子插入該VWF蛋白與該第一異源部分之間，其中該VWF連接子包含選自以下之多肽：(i)來自因子VIII(FVIII)之a2區域；(ii)來自FVIII之a1區域；(iii)來自FVIII之a3區域；(iv)包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或(v)其任何組合。在一些實施例中，藉由aPTT檢定或ROTEM檢定量測FVIII活性。
IV.醫藥組合物
含有本發明之嵌合分子之組合物可含有合適之醫藥學上可接受之載劑。舉例而言，其可含有促進將活性化合物加工成設計用於傳遞至作用部位之製劑的賦形劑及/或助劑。
醫藥組合物可經調配以藉由團式注射進行非經腸施用(亦即，靜脈內、皮下或肌肉內)。用於注射之調配物可以單位劑型呈現，例如，於安瓿中或於具有外加防腐劑之多劑量容器中。組合物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式，且含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑等調配劑。或者，活性成分可呈粉末形式以用合適之媒劑(例如，無熱原質之水)配製。
適於非經腸施用之調配物亦包括水溶性形式之活性化合物(例如，水溶性鹽)之水溶液。另外，可施用呈適當的油性注射懸浮液形式之活性化合物懸浮液。合適 之親脂溶劑或媒劑包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或三甘油酯。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及葡聚糖。視情況，懸浮液亦可含有穩定劑。亦可使用脂質體來囊封本發明之分子以傳遞至細胞或間隙空間中。例示性醫藥學上可接受之載劑為生理學相容性溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑吸收延遲劑、水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物。在一些實施例中，組合物包含等滲劑，例如，糖、多元醇諸如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化鈉。在其他實施例中，組合物包含醫藥學上可接受之物質諸如濕潤劑或微量的助劑物質諸如濕潤或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增強活性成分之存放期或有效性。
本發明之組合物可呈多種形式，包括例如液體(例如，可注射及可輸注溶液)、分散液、懸浮液、半固體劑固體劑型。較佳形式取決於施用模式及治療應用。
組合物可調配成溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構。可藉由將所需量之活性成分與所需要之上文所列成分之一或組合併入適當溶劑中，接著過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將活性成分併入含有鹼性分散介質及來自上文所列者之所需其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其得到活性成分粉末以及來自先 前無菌過濾溶液之任何其他所需成分。可例如藉由使用諸如卵磷脂等包衣，在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)來產生可注射組合物之延長吸收。
活性成分可用控制釋放調配物或裝置來調配。此等調配物及裝置之實例包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此等調配物及裝置之方法為此項技術中所知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可藉由形成藥物於生物可降解聚合物諸如聚丙交酯-聚乙交酯中之微囊封基質來製備可注射儲槽式調配物。視藥物與聚合物之比率及所用聚合物之性質而定，可控制藥物釋放速率。其他例示性生物可降解聚合物為聚原酸酯及聚酸酐。亦可藉由將藥物包埋於脂質體或微乳液中來製備儲槽式可注射調配物。
補充性活性化合物可併入組合物中。在一個實施例中，將本發明之嵌合分子與另一凝血因子、或其變異體、片段、類似物或衍生物一起調配。舉例而言，凝血因子包括(但不限於)因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、血 纖維蛋白原、溫韋伯氏因子或重組可溶性組織因子(rsTF)或前述任一者之活化形式。止血劑之凝血因子亦可包括抗纖維蛋白溶解藥，例如，ε-胺基-己酸、胺甲環酸。
可調節給藥方案以提供最佳所需反應。舉例而言，可施用單一大丸劑，可隨時間施用若干分次劑量，或可按照治療情形之緊急程度所指示按比例降低或增加劑量。為易於施用及劑量均勻性，宜將非經腸組合物調配成單位劑型。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.1980)。
除活性化合物之外，液體劑型可含有惰性成分，諸如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇脂肪酸酯。
合適之醫藥學載劑之非限制性實例亦描述於E.W.Martin之Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑之一些實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。組合物亦可含有pH緩衝試劑，及濕潤或乳化劑。
對於經口施用，醫藥組合物可採用藉由習知方式製備之錠劑或膠囊形式。組合物亦可製成液體，例如糖漿或懸浮液。液體可包括懸浮劑(例如，山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或 阿拉伯膠)、非水性媒劑(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)，及防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。製劑亦可包括調味劑、著色劑及甜味劑。或者，組合物可呈現為用於用水或另一合適媒劑配製之無水產品形式。
對於經頰施用，根據習知方案，組合物可採用錠劑或口含錠形式。
對於藉由吸入施用，根據本發明使用之化合物宜以具有或不具有賦形劑之噴霧氣霧劑形式或以氣霧劑噴霧形式自視情況具有推進劑之加壓包或噴霧器傳遞，推進劑為例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適之氣體。在加壓氣霧劑之情況下，可藉由提供閥來確定計量單位以傳遞計量量。用於吸入器或吹入器中之例如明膠之膠囊及濾筒可經調配含有化合物與合適之粉末基質諸如乳糖或澱粉之粉末混合物。
醫藥組合物亦可經調配以例如含有習知栓劑基質諸如可可脂或其他甘油酯之栓劑或保留灌腸劑形式經直腸施用。
V.基因療法
本發明之嵌合分子可使用治療出血性疾病或病症之基因治療方法在哺乳動物(例如，人類患者)中活體內產生，該出血性疾病或病症選自出血凝血障礙、關節積血、肌肉出血、口腔出血、溢血、溢血進入肌肉、口腔溢 血、創傷、創傷性頭癬、胃腸道出血、顱內溢血、腹內溢血、胸內溢血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血或髖腰肌鞘中出血，其將是治療上有益的。在一個實施例中，出血性疾病或病症為血友病。在另一實施例中，出血性疾病或病症為A型血友病。此涉及施用可操作地連接至合適表現控制序列之編碼合適嵌合分子之核酸。在某些實施例中，此等序列經併入病毒載體中。適於此種基因療法之病毒載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、杆狀病毒載體、愛潑斯坦-巴爾病毒載體、乳多空病毒載體、牛痘病毒載體、單純皰疹病毒載體及腺相關病毒(AAV)載體。病毒載體可為複製缺陷型病毒載體。在其他實施例中，腺病毒載體在其E1基因或E3基因中具有缺失。當使用腺病毒載體時，哺乳動物可能不暴露於編碼可選擇標記基因之核酸。在其他實施例中，將序列併入熟習此項技術者所知之非病毒載體中。
VI.嵌合蛋白之使用方法
本發明進一步提供使用本發明之嵌合分子降低有需要之個體中出血事件之頻率或程度的方法。例示性方法包括向該有需要之個體施用治療有效量之本發明之嵌合分子。在其他態樣中，本發明包括使用本發明之嵌合分子預防有需要之個體中出血事件之發生的方法。在其他態樣中，可向有需要之個體施用包含編碼本發明之重組蛋白之DNA的組合物。在本發明之某些態樣中，可向有需要之 個體施用表現本發明之嵌合分子之細胞。在本發明之某些態樣中，醫藥組合物包含(i)嵌合分子、(ii)編碼嵌合分子之分離核酸、(iii)包含編碼嵌合分子之核酸之載體、(iv)包含編碼嵌合分子之分離核酸及/或包含編碼嵌合分子之核酸之載體的細胞，或(v)其組合，且該等醫藥組合物進一步包含可接受之賦形劑或載劑。
出血事件可由凝血障礙造成或獲得。凝血障礙亦可稱為凝血功能異常。在一個實例中，可用本揭示內容之醫藥組合物治療之凝血障礙為血友病或von Willebrand病(vWD)。在另一實例中，可用本揭示內容之醫藥組合物治療之凝血障礙為A型血友病。
在一些實施例中，與出血性病狀相關之出血類型係選自關節積血、肌肉出血、口腔出血、溢血、溢血進入肌肉、口腔溢血、創傷、創傷性頭癬、胃腸道出血、顱內溢血、腹內溢血、胸內溢血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血、髖腰肌鞘中出血或其任何組合。
在其他實施例中，罹患出血性病狀之個體需要手術治療，包括例如手術預防或圍手術期管理。在一個實例中，手術係選自小手術及大手術。例示性外科手術包括拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝切開術、滑膜切除術、開顱手術、骨接合術、創傷手術、顱內手術、腹腔內手術、胸內手術、關節置換手術(例如，全膝關節置換、髖關節置換及其類似物)、心臟手術及剖宮產術。
在另一實例中，用因子IX伴隨治療個體。由於本發明化合物能夠活化FIXa，因此其可用於在向個體施用FIXa之前預活化FIXa多肽。
可向需要預防治療或按需治療之個體實踐本發明之方法。
包含本發明嵌合分子之醫藥組合物可經調配用於任何適當施用方式，包括例如局部(例如，經皮或經眼)、經口、經頰、經鼻、經陰道、經直腸或非經腸施用。
如本文所用之術語非經腸包括皮下、皮內、血管內(例如，靜脈內)、肌肉內、脊柱、顱內、鞘內、眼內、眼周、眼眶內、滑膜內及腹膜內注射，以及任何類似注射或輸注技術。組合物亦可為例如懸浮液、乳液、持續釋放調配物、乳膏、凝膠或散劑。組合物可經調配為具有傳統黏合劑及載劑諸如三甘油酯之栓劑。
現已詳細描述本發明，藉由參考以下實例將更清楚地理解本發明，該等實例僅出於說明目的包括於此且不欲限制本發明。本文提及之所有專利及公開案係以引用之方式明確併入。
實例
在整個實例中，除非另外說明，否則使用以下材料及方法。
材料及方法
一般而言，除非另外說明，否則本發明之實踐使用習知化學、生物物理學、分子生物學、重組DNA技術、免疫學技術(尤其是例如抗體技術)，以及標準電泳技術。參見例如Sambrook,Fritsch及Maniatis,Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty編，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow等人，CS.H.L.Press,Pub.(1999)；及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編，John Wiley & Sons(1992)。
實例1. 評估各種VWF構築體之凝血酶介導性D'D3釋放
本實例評估圖2中所提及之各種VWF構築體在37℃下之凝血酶介導性D'D3釋放的動力學。用在VWF之D'D3結構域與Fc之間含有不同凝血酶可裂解連接子之VWF-Fc構築體來進行Biocore實驗。最終目的在於將自VWF-Fc凝血酶消化採集之資訊應用於如本文所述之FVIII-VWF異質二聚體。所有VWF-D'D3構築體皆在晶片上操作以達成在100-700RU範圍內之蛋白質捕捉密度。於晶片上捕捉VWF構築體之後，將5U/ml凝血酶注射於表面上持續5分鐘。Fc保持結合於晶片，而可裂解構築體中之D'D3得 以釋放。如圖3及圖4中所示繪製速率(RU/s)對捕捉密度(RU)之曲線。清除速率與起始捕捉密度成正比，而斜率提供各構築體之凝血酶裂解易感性之量度。
圖3顯示如所預期之VWF-052(其在連接子區域中不具有凝血酶裂解位點)並未由凝血酶裂解。VWF-039(具有PAR1位點之LVPR)之速率與FVIII裂解速率相當(資料未示)。因此，VWF-039充當自Fc完全釋放D'D3之基準。使用各種VWF-Fc構築體相對於VWF-039之斜率的比率來測定凝血酶裂解效率。用凝血酶使VWF-039(具有PAR1位點之LVPR)裂解之速率為VWF-031(LVPR)之約70-80倍。VWF-51(ALRPRVV)之裂解速率為VWF-031(LVPR)之1.8倍。含有288 XTEN以及LVPR位點之VWF-034相比於VWF-031顯示較緩慢之裂解。
亦藉由在連接子區域中引入FVIII蛋白之不同酸性區域(a1、a2及a3)來制得VWF-Fc構築體。VWF-055(其在D'D3與Fc區之間含有a2區域)顯示與VWF-039構築體類似之凝血酶裂解。如圖4中所示，VWF-054(a1區域)及VWF-056(a3區域)顯示約5倍降低之凝血酶裂解。
圖5顯示不同VWF構築體之凝血酶裂解曲線之斜率值。根據此等結果，FVIII之酸性區域2(a2)似乎為高效凝血酶裂解位點且併入如本文所述之FVIII-VWF異質二聚體中。
實例2. 利用HemA患者全血ROTEM檢定評估FVIII/ VWFD'D3異質二聚體之止血效能
在HemA供體全血旋轉血栓彈力測定(rotational thromboelastometry，ROTEM)檢定中評估含有不同凝血酶可裂解連接子之FVIII/VWFD'D3異質二聚體的止血效能。利用檸檬酸鈉作為抗凝血劑，自患有重度A型血友病出血障礙之供體採集全血樣品。在血樣採集後40分鐘，將含有不同凝血酶可裂解連接子-FVIII155/VWF031(48aa，LVPR位點)、FVIII155/VWF039(26aa，LVPR+PAR1位點)、FVIII155/VWF055(34aa，來自FVIII之a2)之FVIII/VWFD'D3異質二聚體變異體稀釋於全血樣品中至最終濃度為正常值之100%、30%、10%及3%，如藉由FVIII顯色檢定所量測。在添加FVIII/VWFD'D3異質二聚體之後不久，藉由添加CaCl2來起始ROTEM反應。藉由儀器記錄凝血時間(自測試開始至達到2mm幅值之時間)且針對樣品中之FVIII濃度繪製曲線(圖6)。假定更有效之FVIII/VWFD'D3異質二聚體將誘導更快凝血過程，因此導致相比於效力較低之FVIII/VWFD'D3異質二聚體之凝血時間較短。如圖6中所示，添加有FVIII/VWF039異質二聚體之樣品在已測試之所有濃度下皆具有最短凝血時間，且添加有FVIII/VWF031異質二聚體之樣品在所有濃度下皆具有最長凝血時間。添加有FVIII155/VWF055異質二聚體之樣品之凝血時間居中。因此，止血效能等級為FVIII155/VWF039>FVIII155/VWF055>FVIII155/VWF031。由於該三種分子之間的唯一差異在於VWF蛋白 與Fc區之間的凝血酶可裂解連接子，因此結果指示含有LVPR位點及PAR1外位點相互作用基元及FVIII之a2區域之連接子相比於僅含有LVPR位點之連接子的作用更佳。
實例3. 評估FVIII/VWF異質二聚體之活性
使用以下三種質體將FVIII-XTEN/VWF異質二聚體構築體轉染於HEK293F細胞中：第一表現FVIII-XTEN-Fc、第二表現VWF-XTEN-Fc及第三表現PACE。使用聚乙烯亞胺(PEI)標準方案進行轉染並且在轉染5天后，收集組織培養基。自該培養基純化FVIII-VWF異質二聚體之各種組合。使用標準方案在顯色(兩階段)及aPTT(一階段)凝血檢定中測試純化蛋白質之活性。將FVIII之酸性區域2(a2)引入FVIII與Fc之間或D'D3與Fc之間(如表7A及圖7中所示)可改良FVIII-VWF異質二聚體之aPTT活性，如表7C中所示。舉例而言，FVIII169/VWF059異質二聚體在D'D3-Fc連接子區域中具有a2凝血酶裂解位點且具有比FVIII169/VWF057更佳之aPTT活性，該FVIII169/VWF057在D'D3Fc連接子中含有LVPR凝血酶位點，如表7C中所示。
類似地，將a2區域併入FVIII與Fc之間可增加異質二聚體之一階段凝血活性，如由表7B中所示之FVIII286/VWF059及FVIII286/VWF062之改良的顯色/aPTT比所示。
Figure 109104938-A0202-12-0133-21
Figure 109104938-A0202-12-0133-22
Figure 109104938-A0202-12-0133-23
實例4：FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc異質二聚體在HemA小鼠尾部剪斷出血模型中之急性功效
使用HemA小鼠尾部剪斷出血模型評估含有不同凝血酶可裂解連接子之異質二聚體的急性功效。
將8-12周齡雄性HemA小鼠隨機分配至5個治 療組，且分別用SQ BDD-FVIII、rFVIII169/VWF034、rFVIII169/VWF057、rFVIII169/VWF059或媒劑溶液之單次靜脈內施用來治療。為了模擬FVIII之情形治療(以重構50-100%之正常FVIII血漿含量)，如藉由FVIII aPTT活性所量測，所選FVIII治療劑量為75IU/kg。在此劑量水準下，所有測試FVIII變異體將在給藥後5分鐘重構約70%之正常鼠類血漿FVIII活性。
如下進行尾部剪斷程序。簡言之，在尾部損傷前用50mg/kg氯胺酮/0.5mg/kg右美托咪定混合液麻醉小鼠且將其置於37℃加熱墊上以幫助維持體溫。隨後將小鼠尾部浸於37℃鹽水中持續10分鐘以擴張側靜脈。在靜脈擴張後，經由尾靜脈注射FVIII變異體或媒劑溶液且隨後在給藥後5分鐘使用直邊#11解剖刀切掉尾部末端5mm。將流出之血收集於13ml之37℃鹽水中持續30分鐘且藉由血液收集管之重量變化確定失血量：失血量=(收集管最終重量-開始重量+0.10)ml。使用t檢定(Kolmogorov-Smirnov檢定)及單因子ANOVA(KRUSKAL-Wallis檢定，後檢定：Dunns多重比較檢定)進行統計分析。
將研究中各個別動物之失血量繪製於圖8中。觀測到所有FVIII治療組相比於媒劑處理動物之失血量顯著減少(p<0.05，表8)。自所有異質二聚體治療組觀測到相比於BDD-FVIII治療之類似失血減少(p>0.5，表8)，表明對於按需治療，異質二聚體分子可潛在地與SQ BDD-FVIII同樣有效。
Figure 109104938-A0202-12-0135-24
pSYN VWF057核苷酸序列(連接子中具有LVPR凝血酶位點之VWF D'D3-Fc)(SEQ ID NO：79)
Figure 109104938-A0202-12-0135-25
Figure 109104938-A0202-12-0136-26
Figure 109104938-A0202-12-0137-27
pSYN VWF057蛋白質序列(連接子中具有LVPR凝血酶位點之VWF D'D3-Fc)：粗體下劃線區域顯示含有連接子區域之凝血酶可裂解LVPR(SEQ ID NO：80)
Figure 109104938-A0202-12-0137-29
pSYN VWF059核苷酸序列(連接子中具有酸性區域2(a2)凝血酶位點之VWF D'D3-Fc)(SEQ ID NO：81)
Figure 109104938-A0202-12-0138-554
Figure 109104938-A0202-12-0139-31
Figure 109104938-A0202-12-0140-32
pSYN VWF059蛋白質序列(連接子中具有LVPR凝血酶位點之VWF D'D3-Fc)-粗體下劃線區域顯示a2區域(SEQ ID NO：82)
Figure 109104938-A0202-12-0141-33
pSYN VWF062核苷酸序列(連接子中不具有凝血酶位點之VWF D'D3-Fc)(SEQ ID NO：83)
Figure 109104938-A0202-12-0142-34
Figure 109104938-A0202-12-0143-35
Figure 109104938-A0202-12-0144-36
pSYN VWF062蛋白質序列(連接子中不具有凝血酶位點之VWF D'D3-Fc)(SEQ ID NO：84)
Figure 109104938-A0202-12-0144-37
pSYN FVIII 286核苷酸序列(FVIII與Fc之間具有另一a2區域之FVIII-Fc)(SEQ ID NO：85)
Figure 109104938-A0202-12-0145-38
Figure 109104938-A0202-12-0146-39
Figure 109104938-A0202-12-0147-40
pSYN FVIII 286蛋白質序列(FVIII與Fc之間具有另一a2區域之FVIII-Fc；以粗體及下劃線顯示)(SEQ ID NO：86)
Figure 109104938-A0202-12-0148-41
FVIII 169核苷酸序列(SEQ ID NO：87)
Figure 109104938-A0202-12-0148-42
Figure 109104938-A0202-12-0149-43
Figure 109104938-A0202-12-0150-44
FVIII 169蛋白質序列(SEQ ID NO：88)
Figure 109104938-A0202-12-0151-45
VWF034核苷酸序列(SEQ ID NO：91)
Figure 109104938-A0202-12-0152-46
Figure 109104938-A0202-12-0153-47
Figure 109104938-A0202-12-0154-48
VWF034蛋白質序列(SEQ ID NO：92)
Figure 109104938-A0202-12-0155-49
特定實施例之前述描述將完全揭示本發明之一般性質，以使得其他人在無需過多實驗且不悖離本發明之一般概念之情況下，藉由應用此項技術技能範圍內之知識而容易地針對各種應用來修改及/或改適此等特定實施例。因此，基於本文呈現之教示及指導，該等改適及修改意欲在所揭示實施例之等效物之含義及範圍內。應瞭解，本文之短語或術語係出於描述目的而非限制目的，因此熟習此項技術者應鑒於教示及指導來理解本說明書之術語或 短語。
根據對本文揭示之本發明之說明書及實踐的考慮，本發明之其他實施例對於熟習此項技術者將為顯而易見的。預期本說明書及實例應理解為僅具例示性，而本發明之真實範疇及精神係由以下申請專利範圍指示。
本文引用之所有專利及公開案係以全文引用之方式併入本文中。
本申請案主張2013年6月28日申請之美國臨時專利申請案第61/840,872號之優先權。上述申請案之內容係以全文引用之方式併入本文中。
<110> 美商百歐維拉提夫治療公司(BIOVERATIV THERAPEUTICS INC.)
<120> 具有XTEN之凝血酶可裂解連接子及其用途
<130> 2159.420PC01
<140> 109104938
<141> 2014-06-30
<150> US 61/840,872
<151> 2013-06-28
<160> 92
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 8442
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
Figure 109104938-A0202-12-0157-51
Figure 109104938-A0202-12-0158-52
Figure 109104938-A0202-12-0159-53
Figure 109104938-A0202-12-0160-54
Figure 109104938-A0202-12-0161-55
Figure 109104938-A0202-12-0162-56
Figure 109104938-A0202-12-0163-57
<210> 2
<211> 2813
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2016)..(2016)
<223> 其中Xaa可為除半胱胺酸之外的任何胺基酸
<400> 2
Figure 109104938-A0202-12-0164-58
Figure 109104938-A0202-12-0165-59
Figure 109104938-A0202-12-0166-60
Figure 109104938-A0202-12-0167-61
Figure 109104938-A0202-12-0168-62
Figure 109104938-A0202-12-0169-63
Figure 109104938-A0202-12-0170-64
Figure 109104938-A0202-12-0171-65
Figure 109104938-A0202-12-0172-66
Figure 109104938-A0202-12-0173-67
Figure 109104938-A0202-12-0174-68
Figure 109104938-A0202-12-0175-69
Figure 109104938-A0202-12-0176-313
Figure 109104938-A0202-12-0177-314
Figure 109104938-A0202-12-0178-315
Figure 109104938-A0202-12-0179-316
Figure 109104938-A0202-12-0180-317
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 其中X為脂族胺基酸
<400> 3
Figure 109104938-A0202-12-0181-318
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> a2區域
<400> 4
Figure 109104938-A0202-12-0181-319
<210> 5
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> a1區域
<400> 5
Figure 109104938-A0202-12-0182-320
<210> 6
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> a3區域
<400> 6
Figure 109104938-A0202-12-0182-321
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 7
Figure 109104938-A0202-12-0183-324
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 8
Figure 109104938-A0202-12-0183-323
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 9
Figure 109104938-A0202-12-0183-322
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 10
Figure 109104938-A0202-12-0184-325
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 11
Figure 109104938-A0202-12-0184-326
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 12
Figure 109104938-A0202-12-0184-327
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 13
Figure 109104938-A0202-12-0185-330
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 14
Figure 109104938-A0202-12-0185-329
<210> 15
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號肽
<400> 15
Figure 109104938-A0202-12-0185-328
<210> 16
<211> 2332
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Figure 109104938-A0202-12-0186-331
Figure 109104938-A0202-12-0187-332
Figure 109104938-A0202-12-0188-333
Figure 109104938-A0202-12-0189-334
Figure 109104938-A0202-12-0190-335
Figure 109104938-A0202-12-0191-336
Figure 109104938-A0202-12-0192-337
Figure 109104938-A0202-12-0193-338
Figure 109104938-A0202-12-0194-339
Figure 109104938-A0202-12-0195-340
Figure 109104938-A0202-12-0196-341
Figure 109104938-A0202-12-0197-342
Figure 109104938-A0202-12-0198-343
Figure 109104938-A0202-12-0199-344
<210> 17
<211> 7053
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
Figure 109104938-A0202-12-0200-345
Figure 109104938-A0202-12-0201-346
Figure 109104938-A0202-12-0202-347
Figure 109104938-A0202-12-0203-348
Figure 109104938-A0202-12-0204-349
Figure 109104938-A0202-12-0205-350
<210> 18
<211> 1438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B結構域缺失之FVIII
<400> 18
Figure 109104938-A0202-12-0205-351
Figure 109104938-A0202-12-0206-352
Figure 109104938-A0202-12-0207-353
Figure 109104938-A0202-12-0208-354
Figure 109104938-A0202-12-0209-355
Figure 109104938-A0202-12-0210-356
Figure 109104938-A0202-12-0211-357
Figure 109104938-A0202-12-0212-358
Figure 109104938-A0202-12-0213-359
<210> 19
<211> 4371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B結構域缺失之FVIII
<400> 19
Figure 109104938-A0202-12-0214-360
Figure 109104938-A0202-12-0215-361
Figure 109104938-A0202-12-0216-362
Figure 109104938-A0202-12-0217-363
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 20
Figure 109104938-A0202-12-0217-364
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 21
Figure 109104938-A0202-12-0218-367
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 22
Figure 109104938-A0202-12-0218-366
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1外位點相互作用基元
<400> 23
Figure 109104938-A0202-12-0218-365
<210> 24
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF連接子
<400> 24
Figure 109104938-A0202-12-0219-368
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 25
Figure 109104938-A0202-12-0219-369
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 26
Figure 109104938-A0202-12-0219-370
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FXIa裂解位點
<400> 27
Figure 109104938-A0202-12-0220-373
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FXIa裂解位點
<400> 28
Figure 109104938-A0202-12-0220-372
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 29
Figure 109104938-A0202-12-0220-371
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 30
Figure 109104938-A0202-12-0221-374
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 31
Figure 109104938-A0202-12-0221-375
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 32
Figure 109104938-A0202-12-0221-376
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 33
Figure 109104938-A0202-12-0222-379
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 34
Figure 109104938-A0202-12-0222-378
<210> 35
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 35
Figure 109104938-A0202-12-0222-377
Figure 109104938-A0202-12-0223-380
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 36
Figure 109104938-A0202-12-0223-381
<210> 37
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 37
Figure 109104938-A0202-12-0223-382
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 38
Figure 109104938-A0202-12-0224-384
<210> 39
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE42
<400> 39
Figure 109104938-A0202-12-0224-383
<210> 40
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE72
<400> 40
Figure 109104938-A0202-12-0225-385
<210> 41
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE144
<400> 41
Figure 109104938-A0202-12-0225-386
Figure 109104938-A0202-12-0226-387
<210> 42
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AG144
<400> 42
Figure 109104938-A0202-12-0226-388
Figure 109104938-A0202-12-0227-389
<210> 43
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE288
<400> 43
Figure 109104938-A0202-12-0227-390
Figure 109104938-A0202-12-0228-391
Figure 109104938-A0202-12-0229-392
<210> 44
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AG288
<400> 44
Figure 109104938-A0202-12-0229-393
Figure 109104938-A0202-12-0230-394
Figure 109104938-A0202-12-0231-395
<210> 45
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE576
<400> 45
Figure 109104938-A0202-12-0231-396
Figure 109104938-A0202-12-0232-397
Figure 109104938-A0202-12-0233-398
Figure 109104938-A0202-12-0234-399
<210> 46
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AG576
<400> 46
Figure 109104938-A0202-12-0235-400
Figure 109104938-A0202-12-0236-401
Figure 109104938-A0202-12-0237-402
Figure 109104938-A0202-12-0238-403
<210> 47
<211> 864
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE864
<400> 47
Figure 109104938-A0202-12-0238-404
Figure 109104938-A0202-12-0239-405
Figure 109104938-A0202-12-0240-406
Figure 109104938-A0202-12-0241-407
Figure 109104938-A0202-12-0242-408
Figure 109104938-A0202-12-0243-409
<210> 48
<211> 864
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AG864
<400> 48
Figure 109104938-A0202-12-0243-410
Figure 109104938-A0202-12-0244-411
Figure 109104938-A0202-12-0245-412
Figure 109104938-A0202-12-0246-413
Figure 109104938-A0202-12-0247-414
Figure 109104938-A0202-12-0248-415
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AD
<400> 49
Figure 109104938-A0202-12-0248-416
<210> 50
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AD
<400> 50
Figure 109104938-A0202-12-0249-419
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AD
<400> 51
Figure 109104938-A0202-12-0249-418
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AD
<400> 52
Figure 109104938-A0202-12-0249-417
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AE、AM
<400> 53
Figure 109104938-A0202-12-0250-420
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AE、AM、AQ
<400> 54
Figure 109104938-A0202-12-0250-421
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AE、AM、AQ
<400> 55
Figure 109104938-A0202-12-0250-422
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AE、AM、AQ
<400> 56
Figure 109104938-A0202-12-0251-425
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AF、AM
<400> 57
Figure 109104938-A0202-12-0251-424
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AF、AM
<400> 58
Figure 109104938-A0202-12-0251-423
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AF、AM
<400> 59
Figure 109104938-A0202-12-0252-426
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AF、AM
<400> 60
Figure 109104938-A0202-12-0252-427
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AG、AM
<400> 61
Figure 109104938-A0202-12-0252-428
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AG、AM
<400> 62
Figure 109104938-A0202-12-0252-429
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AG、AM
<400> 63
Figure 109104938-A0202-12-0253-430
<210> 64
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AG、AM
<400> 64
Figure 109104938-A0202-12-0253-431
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AQ
<400> 65
Figure 109104938-A0202-12-0253-432
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AQ
<400> 66
Figure 109104938-A0202-12-0254-433
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AQ
<400> 67
Figure 109104938-A0202-12-0254-434
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AQ
<400> 68
Figure 109104938-A0202-12-0254-435
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AQ
<400> 69
Figure 109104938-A0202-12-0255-438
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族AQ
<400> 70
Figure 109104938-A0202-12-0255-437
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族BC
<400> 71
Figure 109104938-A0202-12-0255-436
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族BC
<400> 72
Figure 109104938-A0202-12-0256-439
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族BC
<400> 73
Figure 109104938-A0202-12-0256-440
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族BC
<400> 74
Figure 109104938-A0202-12-0256-441
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族BD
<400> 75
Figure 109104938-A0202-12-0257-444
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族BD
<400> 76
Figure 109104938-A0202-12-0257-443
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族BD
<400> 77
Figure 109104938-A0202-12-0257-442
<210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN基元家族BD
<400> 78
Figure 109104938-A0202-12-0258-445
<210> 79
<211> 4974
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF057(連接子中具有LVPR凝血酶位點之VWF D’ D3-Fc)
<400> 79
Figure 109104938-A0202-12-0258-446
Figure 109104938-A0202-12-0259-447
Figure 109104938-A0202-12-0260-448
Figure 109104938-A0202-12-0261-449
Figure 109104938-A0202-12-0262-450
<210> 80
<211> 1662
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF057(連接子中具有LVPR凝血酶位點之VWF D’ D3-Fc)
<400> 80
Figure 109104938-A0202-12-0262-451
Figure 109104938-A0202-12-0263-452
Figure 109104938-A0202-12-0264-453
Figure 109104938-A0202-12-0265-454
Figure 109104938-A0202-12-0266-455
Figure 109104938-A0202-12-0267-456
Figure 109104938-A0202-12-0268-457
Figure 109104938-A0202-12-0269-458
Figure 109104938-A0202-12-0270-459
Figure 109104938-A0202-12-0271-460
Figure 109104938-A0202-12-0272-461
<210> 81
<211> 4959
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF059(連接子中具有酸性區域凝血酶位點之VWF D’ D3-Fc)
<400> 81
Figure 109104938-A0202-12-0272-462
Figure 109104938-A0202-12-0273-463
Figure 109104938-A0202-12-0274-464
Figure 109104938-A0202-12-0275-465
Figure 109104938-A0202-12-0276-466
<210> 82
<211> 1652
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF059(連接子中具有LVPR凝血酶位點之VWF D’ D3-Fc)
<400> 82
Figure 109104938-A0202-12-0276-467
Figure 109104938-A0202-12-0277-468
Figure 109104938-A0202-12-0278-469
Figure 109104938-A0202-12-0279-470
Figure 109104938-A0202-12-0280-471
Figure 109104938-A0202-12-0281-472
Figure 109104938-A0202-12-0282-473
Figure 109104938-A0202-12-0283-474
Figure 109104938-A0202-12-0284-475
Figure 109104938-A0202-12-0285-476
<210> 83
<211> 4860
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF062(連接子中不具有凝血酶位點之VWF D’ D3-Fc)
<400> 83
Figure 109104938-A0202-12-0286-477
Figure 109104938-A0202-12-0287-478
Figure 109104938-A0202-12-0288-479
Figure 109104938-A0202-12-0289-480
<210> 84
<211> 1619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF062(連接子中不具有凝血酶位點之VWF D’ D3-Fc)
<400> 84
Figure 109104938-A0202-12-0290-481
Figure 109104938-A0202-12-0291-482
Figure 109104938-A0202-12-0292-483
Figure 109104938-A0202-12-0293-484
Figure 109104938-A0202-12-0294-485
Figure 109104938-A0202-12-0295-486
Figure 109104938-A0202-12-0296-487
Figure 109104938-A0202-12-0297-488
Figure 109104938-A0202-12-0298-489
Figure 109104938-A0202-12-0299-490
<210> 85
<211> 6033
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 286(在FVIII與Fc之間具有另一a2區域之FVIII-Fc)
<400> 85
Figure 109104938-A0202-12-0299-491
Figure 109104938-A0202-12-0300-492
Figure 109104938-A0202-12-0301-493
Figure 109104938-A0202-12-0302-494
Figure 109104938-A0202-12-0303-495
Figure 109104938-A0202-12-0304-496
<210> 86
<211> 1991
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 286(在FVIII與Fc之間具有另一a2區域之FVIII-Fc)
<400> 86
Figure 109104938-A0202-12-0304-497
Figure 109104938-A0202-12-0305-498
Figure 109104938-A0202-12-0306-499
Figure 109104938-A0202-12-0307-500
Figure 109104938-A0202-12-0308-501
Figure 109104938-A0202-12-0309-502
Figure 109104938-A0202-12-0310-503
Figure 109104938-A0202-12-0311-504
Figure 109104938-A0202-12-0312-505
Figure 109104938-A0202-12-0313-506
Figure 109104938-A0202-12-0314-507
Figure 109104938-A0202-12-0315-508
Figure 109104938-A0202-12-0316-509
<210> 87
<211> 5937
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 169
<400> 87
Figure 109104938-A0202-12-0316-510
Figure 109104938-A0202-12-0317-511
Figure 109104938-A0202-12-0318-512
Figure 109104938-A0202-12-0319-513
Figure 109104938-A0202-12-0320-514
<210> 88
<211> 1978
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 169
<400> 88
Figure 109104938-A0202-12-0321-515
Figure 109104938-A0202-12-0322-516
Figure 109104938-A0202-12-0323-517
Figure 109104938-A0202-12-0324-518
Figure 109104938-A0202-12-0325-519
Figure 109104938-A0202-12-0326-520
Figure 109104938-A0202-12-0327-521
Figure 109104938-A0202-12-0328-522
Figure 109104938-A0202-12-0329-523
Figure 109104938-A0202-12-0330-524
Figure 109104938-A0202-12-0331-525
Figure 109104938-A0202-12-0332-526
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly/Ser連接子
<400> 89
Figure 109104938-A0202-12-0333-527
<210> 90
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly/Ser連接子
<400> 90
Figure 109104938-A0202-12-0333-528
<210> 91
<211> 5379
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF034
<400> 91
Figure 109104938-A0202-12-0333-529
Figure 109104938-A0202-12-0334-530
Figure 109104938-A0202-12-0335-531
Figure 109104938-A0202-12-0336-532
Figure 109104938-A0202-12-0337-533
<210> 92
<211> 1778
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF034
<400> 92
Figure 109104938-A0202-12-0338-534
Figure 109104938-A0202-12-0339-535
Figure 109104938-A0202-12-0340-536
Figure 109104938-A0202-12-0341-537
Figure 109104938-A0202-12-0342-538
Figure 109104938-A0202-12-0343-539
Figure 109104938-A0202-12-0344-540
Figure 109104938-A0202-12-0345-541
Figure 109104938-A0202-12-0346-542
Figure 109104938-A0202-12-0347-543
Figure 109104938-A0202-12-0348-544

Claims (24)

  1. 一種嵌合分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈包含含有D'結構域及D3結構域之VWF蛋白、第一FcRn結合搭配物、異源部分(H1)及連接該VWF蛋白與該異源部分(H1)之VWF連接子，該第二多肽鏈包含FVIII蛋白、第二FcRn搭配物及第一XTEN序列，其中該第一多肽鏈中的該VWF連接子包含：
    i.來自FVIII之a2區域；
    ii.來自FVIII之a1區域；
    iii.來自FVIII之a3區域；
    iv.包含X-V-P-R(SEQ ID NO：3)之凝血酶裂解位點及PAR1外位點相互作用基元，其中X為脂族胺基酸；或
    v.其任何組合，且其中該第一多肽與該第二多肽係以共價鍵彼此締合。
  2. 如申請專利範圍第1項之嵌合分子，其進一步包含含有FVIII蛋白之第二多肽鏈，其中該第一多肽與該第二多肽係彼此締合。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之嵌合分子，其中該XTEN序列連接至FVIII蛋白之N端或C端或者插入彼此相鄰之兩個FVIII胺基酸之間。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之嵌合分子，其中該異源部分(H1)包含第二XTEN序列，其連接至該VWF蛋白、該異源部分、該VWF連接子或其任何組合。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之嵌合分子， 其中該第一或第二XTEN序列係選自AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288或AG144。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之嵌合分子，其中該第一或第二XTEN序列係選自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：42。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之嵌合分子，其中該VWF蛋白之該D'結構域包含與SEQ ID NO：2之胺基酸764至866具至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之嵌合分子，其中該VWF蛋白之該D3結構域包含與SEQ ID NO：2之胺基酸867至1240具至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之嵌合分子，其中該VWF蛋白在對應於SEQ ID NO：2之殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142之殘基處含有至少一個胺基酸取代。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之嵌合分子，其中在該VWF蛋白之序列中，以除半胱胺酸之外的胺基酸取代對應於SEQ ID NO：2之殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142二者之殘基。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之嵌合分子，其中該VWF蛋白進一步包含VWF之D1結構域、D2結構域、或D1及D2結構域。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之嵌合分子，其係經聚乙二醇化、糖基化、羥乙基澱粉化(hesylated)或聚唾液酸化。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之嵌合分子，其中該FcRn搭配物包含Fc區。
  14. 一種聚核苷酸或一組聚核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項之嵌合分子或其互補序列。
  15. 如申請專利範圍第14項之聚核苷酸或一組聚核苷酸，其進一步包含編碼PC5或PC7或PACE/FURIN之聚核苷酸鏈。
  16. 一種載體或一組載體，其包含如申請專利範圍第14或15項之聚核苷酸或一組聚核苷酸及一或多個可操作地連接至該聚核苷酸或該組聚核苷酸之啟動子。
  17. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第14或15項之聚核苷酸或一組聚核苷酸或如申請專利範圍第16項之載體或一組載體。
  18. 如申請專利範圍第17項之宿主細胞，其係哺乳動物細胞。
  19. 如申請專利範圍第18項之宿主細胞，其中該哺乳動物細胞係選自HEK293細胞、CHO細胞或BHK細胞。
  20. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1至 13項中任一項之嵌合分子，及醫藥學上可接受之載劑。
  21. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之嵌合蛋白於製造藥物之用途，該藥物用於降低有需要之個體的出血事件之頻率或程度，其包括施用有效量之如申請專利範圍第1至13項中任一項之嵌合分子、如申請專利範圍第14或15項之聚核苷酸、如申請專利範圍第16項之載體、如申請專利範圍第17至19項中任一項之宿主細胞、或如申請專利範圍第20項之組合物。
  22. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該出血事件係來自出血凝血障礙、關節積血、肌肉出血、口腔出血、溢血、溢血進入肌肉、口腔溢血、創傷、創傷性頭癬、胃腸道出血、顱內溢血、腹內溢血、胸內溢血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血、髖腰肌鞘中出血，或其任何組合。
  23. 如申請專利範圍第21或22項之用途，其中該藥物係藉由選自局部施用、眼內施用、非經腸施用、鞘內施用、硬膜下施用、經口施用或其任何組合之途徑施用。
  24. 一種製備嵌合分子之方法，其包括使用如申請專利範圍第14或15項之聚核苷酸或一組聚核苷酸或如申請專利範圍第16項之載體或一組載體轉染一或多個宿主細胞且在該宿主細胞中表現該嵌合分子。
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