JP2021072853A - Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用 - Google Patents

Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2021072853A
JP2021072853A JP2021018123A JP2021018123A JP2021072853A JP 2021072853 A JP2021072853 A JP 2021072853A JP 2021018123 A JP2021018123 A JP 2021018123A JP 2021018123 A JP2021018123 A JP 2021018123A JP 2021072853 A JP2021072853 A JP 2021072853A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
vwf
fviii
amino acids
protein
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2021018123A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7005800B2 (ja
Inventor
セス チャブラ エクタ
Seth Chhabra Ekta
セス チャブラ エクタ
クルマン ジョン
Kulman John
クルマン ジョン
リウ トンヤオ
Tongyao Liu
リウ トンヤオ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioverativ Therapeutics Inc
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc
Publication of JP2021072853A publication Critical patent/JP2021072853A/ja
Priority to JP2021163956A priority Critical patent/JP7297837B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7005800B2 publication Critical patent/JP7005800B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification

Abstract

【課題】ＶＷＦリンカーを介して異種部分に融合されるＶＷＦタンパク質を含むキメラ分子を提供すること。【解決手段】本発明は、トロンビンの存在下で切断され得る効率的なＶＷＦリンカーを提供する。本キメラ分子は、ＦＶＩＩＩタンパク質及び第２の異種部分を含むポリペプチド鎖をさらに含むことができ、ＶＷＦタンパク質を含む鎖とＦＶＩＩＩタンパク質を含む鎖とが互いに会合する。本方法はまた、ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、キメラタンパク質の使用方法も含む。【選択図】なし

Description

血友病Ａは、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする遺伝子の欠損によって引
き起こされる出血性疾患であり、男児出生１万人のうち１〜２人に発症する。Ｇｒａｗ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．６（６）：４８８−５０１（２００５）。
血友病Ａに罹患した患者は、精製または組替え産生されたＦＶＩＩＩの点滴で治療するこ
とができる。しかしながら、すべての市販のＦＶＩＩＩ製品は、約８〜１２時間の半減期
を有し、患者への頻繁な静脈内投与を必要とすることが公知である。Ｗｅｉｎｅｒ Ｍ．
Ａ．ａｎｄ Ｃａｉｒｏ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｅ
ｃｒｅｔｓ，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｔ．，１２．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｃｏａｇｕｌａｔｉ
ｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００１；Ｌｉｌｌｉｃｒ
ａｐ，Ｄ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２２ Ｓｕｐｐｌ ４：Ｓ２−８（２００８）を参
照。加えて、ＦＶＩＩＩ半減期を延長するために、数々のアプローチが試されてきた。例
えば、凝固因子の半減期を延長するための開発におけるアプローチとしては、ＰＥＧ化、
糖ＰＥＧ化（ｇｌｙｃｏｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、及びアルブミンとの共役が挙げられる
。Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１１９（１３）：３０２４−３０３０（２
０１２年１月１３日、オンラインで発行）を参照。しかしながら、使用されるタンパク質
工学にかかわらず、現在開発中の長時間作用型ＦＶＩＩＩ製品は半減期を改善しているが
、半減期は、前臨床動物モデルでは約１．５〜２倍の改善のみに制限されることが報告さ
れている。（同文献を参照。）一貫した結果がヒトにおいて論証されており、例えば、ｒ
ＦＶＩＩＩＦｃは、血友病Ａ患者において、半減期をＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較し
て最大約１．７倍まで改善することが報告された。（同文献を参照。）それゆえに、半減
期増加は、小さな改善にもかかわらず、他のｔ１／２制限因子の存在を示し得る。
頻繁な投与及びその投与計画によって引き起こされる不便さに起因して、より少ない頻
度の投与を要するＦＶＩＩＩ製品、すなわち、１．５〜２倍の半減期制限よりも長い半減
期を有するＦＶＩＩＩ製品を開発する必要性が依然としてある。
Ｇｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．６（６）：４８８−５０１（２００５） Ｗｅｉｎｅｒ Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｃａｉｒｏ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｒｅｔｓ，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｔ．，１２．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００１ Ｌｉｌｌｉｃｒａｐ，Ｄ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２２ Ｓｕｐｐｌ ４：Ｓ２−８（２００８） Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１１９（１３）：３０２４−３０３０（２０１２年１月１３日）
本発明は、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）タンパク質、異種部分（Ｈ１）、ＸＴ
ＥＮ配列、及びＶＷＦタンパク質を異種部分と接続するＶＷＦリンカーを含むキメラ分子
を対象とし、該ＶＷＦリンカーは、（ｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）からのａ２領域
、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）
Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含み、Ｘが脂
肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または（ｖ）それらの任意の組み合わせから
選択されるポリペプチドを含み、該ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦタンパク質、異種部分（Ｈ１
）、ＶＷＦリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される。一実施形態におい
て、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦタンパク質をＶＷＦリンカーと、またはＶＷＦリンカーを異
種部分と接続する。別の実施形態において、本キメラ分子は、ＦＶＩＩＩタンパク質を含
む第２のポリペプチド鎖をさらに含み、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖と
が互いに会合する。他の実施形態において、キメラ分子内のＦＶＩＩＩタンパク質は、追
加のＸＴＥＮ配列をさらに含む。追加のＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端
もしくはＣ末端に結合され得るか、または互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間
に挿入され得る。依然として他の実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、第２の異
種部分（Ｈ２）をさらに含む。
本開示はまた、ＶＷＦタンパク質、異種部分（Ｈ１）、及びＶＷＦタンパク質と異種部
分（Ｈ１）とを接続するＶＷＦリンカーを含む第１のポリペプチド鎖と、ＦＶＩＩＩタン
パク質及びＸＴＥＮ配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含むキメラ分子であって、第１
のポリペプチド鎖内のＶＷＦリンカーが、（ｉ）ＦＶＩＩＩからのａ２領域、（ｉｉ）Ｆ
ＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−
Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸
である、トロンビン切断部位、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含み、第１のポ
リペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が互いに会合する、キメラ分子も含む。一実施形態
において、ＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に接続される
か、または互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に挿入される。別の実施形態に
おいて、本キメラ分子は、ＶＷＦタンパク質、異種部分、ＶＷＦリンカー、またはそれら
の任意の組み合わせに接続される追加のＸＴＥＮ配列をさらに含む。他の実施形態におい
て、本キメラ分子は第２の異種部分（Ｈ２）をさらに含む。依然として他の実施形態にお
いて、第２の異種部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、または双方に接続され
る。
本開示のキメラ分子では、ＶＷＦタンパク質、ＶＷＦリンカー、ＦＶＩＩＩタンパク質
、またはキメラ分子内の他の任意の構成要素のいずれかに接続されるＸＴＥＮ配列は、約
４２個のアミノ酸、約７２個のアミノ酸、約１０８個のアミノ酸、約１４４個のアミノ酸
、約１８０個のアミノ酸、約２１６個のアミノ酸、約２５２個のアミノ酸、約２８８個の
アミノ酸、約３２４個のアミノ酸、約３６０個のアミノ酸、約３９６個のアミノ酸、約４
３２個のアミノ酸、約４６８個のアミノ酸、約５０４個のアミノ酸、約５４０個のアミノ
酸、約５７６個のアミノ酸、約６１２個のアミノ酸、約６２４個のアミノ酸、約６４８個
のアミノ酸、約６８４個のアミノ酸、約７２０個のアミノ酸、約７５６個のアミノ酸、約
７９２個のアミノ酸、約８２８個のアミノ酸、約８３６個のアミノ酸、約８６４個のアミ
ノ酸、約８７５個のアミノ酸、約９１２個のアミノ酸、約９２３個のアミノ酸、約９４８
個のアミノ酸、約１０４４個のアミノ酸、約１１４０個のアミノ酸、約１２３６個のアミ
ノ酸、約１３１８個のアミノ酸、約１３３２個のアミノ酸、約１４２８個のアミノ酸、約
１５２４個のアミノ酸、約１６２０個のアミノ酸、約１７１６個のアミノ酸、約１８１２
個のアミノ酸、約１９０８個のアミノ酸、または約２００４個のアミノ酸を含む。いくつ
かの実施形態において、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、Ａ
Ｅ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、またはＡＧ
１４４から選択される。他の実施形態において、ＸＴＥＮポリペプチドは、配列番号３９
、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４５、配列番号４４、配列番号４１、配列番号
４８、配列番号４６、配列番号４４、または配列番号４２から選択される。
他の態様において、キメラ分子内の追加のＸＴＥＮ配列は、約４２個のアミノ酸、約７
２個のアミノ酸、約１０８個のアミノ酸、約１４４個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸
、約２１６個のアミノ酸、約２５２個のアミノ酸、約２８８個のアミノ酸、約３２４個の
アミノ酸、約３６０個のアミノ酸、約３９６個のアミノ酸、約４３２個のアミノ酸、約４
６８個のアミノ酸、約５０４個のアミノ酸、約５４０個のアミノ酸、約５７６個のアミノ
酸、約６１２個のアミノ酸、約６２４個のアミノ酸、約６４８個のアミノ酸、約６８４個
のアミノ酸、約７２０個のアミノ酸、約７５６個のアミノ酸、約７９２個のアミノ酸、約
８２８個のアミノ酸、約８３６個のアミノ酸、約８６４個のアミノ酸、約８７５個のアミ
ノ酸、約９１２個のアミノ酸、約９２３個のアミノ酸、約９４８個のアミノ酸、約１０４
４個のアミノ酸、約１１４０個のアミノ酸、約１２３６個のアミノ酸、約１３１８個のア
ミノ酸、約１３３２個のアミノ酸、約１４２８個のアミノ酸、約１５２４個のアミノ酸、
約１６２０個のアミノ酸、約１７１６個のアミノ酸、約１８１２個のアミノ酸、約１９０
８個のアミノ酸、または約２００４個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、
追加のＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２
８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、またはＡＧ１４４から選択さ
れる。ある実施形態において、追加のＸＴＥＮポリペプチドは、配列番号３９、配列番号
４０、配列番号４７、配列番号４５、配列番号４３、配列番号４１、配列番号４８、配列
番号４６、配列番号４４、または配列番号４２から選択される。
一実施形態において、キメラ分子内のＶＷＦタンパク質と異種部分とを接続するのに有
用なＶＷＦリンカーは、全長ＦＶＩＩＩに相当するＧｌｕ７２０〜Ａｒｇ７４０と少なく
とも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含
むａ２領域を含み、ａ２領域はトロンビンによって切断されることが可能である。特定の
実施形態において、ａ２領域は、ＩＳＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮ
ＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号４）を含む。別の実施形態において、ＶＷＦタンパク質と
異種部分とを接続するのに有用なＶＷＦリンカーは、全長ＦＶＩＩＩに相当するＭｅｔ３
３７〜Ａｒｇ３７２と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１０
０％同一のアミノ酸配列を含むａ１領域を含み、ａ１領域はトロンビンによって切断され
ることが可能である。いくつかの実施形態において、ａ１領域は、ＩＳＭＫＮＮＥＥＡＥ
ＤＹＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶ（配列番号５）を含む
。
他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質と異種部分とを接続するのに有用なＶＷＦリ
ンカーは、全長ＦＶＩＩＩに相当するＧｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９と少なくとも約８
０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むａ３領
域を含み、ａ３領域はトロンビンによって切断されることが可能である。特定の実施形態
において、ａ３領域は、ＩＳＥＩＴＲＴＴＬＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥ
ＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱ（配列番号６）を含む。
依然として他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質と異種部分とを接続するのに有用
なＶＷＦリンカーは、Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モ
チーフを含むトロンビン切断部位を含み、該ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフはＳ−
Ｆ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｎ（配列番号７）を含む。一実施形態において、ＰＡＲ１非活性部位相
互作用モチーフは、Ｐ、Ｐ−Ｎ、Ｐ−Ｎ−Ｄ、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ（配列番号８）、Ｐ−Ｎ−
Ｄ−Ｋ−Ｙ（配列番号９）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ（配列番号１０）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ
−Ｙ−Ｅ−Ｐ（配列番号１１）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ（配列番号１２）、Ｐ
−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ（配列番号１３）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ
−Ｗ−Ｅ（配列番号１４）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ（配列番号２
０）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ−Ｅ（配列番号２１）、Ｐ−Ｎ−Ｄ
−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ（配列番号２２）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ
−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｓ（配列番号２３）、またはそれらの任意の組み合わせ
から選択される配列をさらに含む。他の実施形態において、脂肪族アミノ酸は、グリシン
、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される。特定の実施形態に
おいて、ＶＷＦリンカーは、ＧＧＬＶＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（
配列番号２４）を含む。
ある特定の実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部位がキメラ分子内のＶ
ＷＦリンカーと置換された場合にトロンビンがトロンビン切断部位を切断するよりも速く
、ＶＷＦリンカーを切断する。他の実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部
位がキメラ分子内のＶＷＦリンカーと置換された場合にトロンビンがトロンビン切断部位
を切断するよりも、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少
なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少
なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍速く、ＶＷＦリン
カーを切断する。
いくつかの実施形態において、ＶＷＦリンカーは、少なくとも約５、１０、２０、３０
、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１
５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２
５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７
５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１
８００、または２０００アミノ酸の長さを有する１個以上のアミノ酸をさらに含む。一例
において、１個以上のアミノ酸は、ｇｌｙペプチドを含む。別の例において、１個以上の
アミノ酸は、ＧｌｙＧｌｙを含む。他の例において、１個以上のアミノ酸は、ｇｌｙ／ｓ
ｅｒペプチドを含む。いくつかの例において、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドは、（Ｇｌｙ４Ｓ
ｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎの式を有し、式中、ｎは、１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または１００から選択される正整数である。あ
る特定の例において、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番
号８９）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号９０）である。
本発明のキメラ分子に有用なＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメ
インを含むことができ、そのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインはＦＶＩＩＩタンパク質に結
合することが可能である。一実施形態において、ＶＷＦタンパク質のＤ’ドメインは、配
列番号２のアミノ酸７６４〜８６６と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＶＷ
Ｆタンパク質のＤ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０と少なくとも約
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列
を含む。他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、配列番号２の残基１０９９、残基
１１４２、または残基１０９９及び１１４２の双方に相当する残基において、少なくとも
１つのアミノ酸置換を含有する。依然として他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質の
配列内で、システイン以外のアミノ酸が、配列番号２の残基１０９９、残基１１４２、ま
たは残基１０９９と１１４２の双方に相当する残基と置換される。さらに他の実施形態に
おいて、ＶＷＦタンパク質の配列は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０を含む。あ
る特定の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン
、またはＤ１及びＤ２ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＶＷＦタン
パク質は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、
Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１
つ以上の断片、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるＶＷＦドメインをさらに
含む。他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、（１）ＶＷＦのＤ’及びＤ３ドメイ
ン、もしくはそれらの断片、（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ’、及びＤ３ドメイン、もしくはそ
れらの断片、（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ’、及びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、（
４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、及びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、または（５
）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３、及びＡ１ドメイン、もしくはそれらの断片、から本
質的になる、またはそれらからなる。依然として他の実施形態において、ＶＷＦタンパク
質は、ＶＷＦのシグナルペプチドをさらに含む。さらに他の実施形態において、ＶＷＦタ
ンパク質は、ＰＥＧ化、グリコシル化、ＨＥＳ化、またはポリシアル酸化される。「ＰＥ
Ｇ化される」という用語は、タンパク質上にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有する
こと、「グリコシル化される」という用語は、タンパク質上にグリコシル化を有すること
、「ＨＥＳ化される」という用語は、タンパク質上にヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ
）を有すること、「ポリシアル酸化される」という用語は、タンパク質上にポリシアル酸
（ＰＳＡ）を有することを指す。ＰＥＧ、ＨＥＳ、及びＰＳＡの例は、本明細書の他の箇
所に示される。
いくつかの態様において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に融合される異種
部分（Ｈ１）は、キメラ分子の半減期を延長することが可能である。一実施形態において
、異種部分（Ｈ１）は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、アルブ
ミン結合部分、ＰＡＳ、ＨＡＰ、トランスフェリンもしくはその断片、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ＰＳＡ、ヒト絨毛性ゴナドト
ロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはそれらの任意の組み合わせを
含む。別の実施形態において、異種部分はＦｃＲｎ結合パートナーを含む。他の実施形態
において、異種部分はＦｃ領域を含む。他の実施形態において、異種部分（Ｈ１）は、ク
リアランス受容体またはその断片を含み、該クリアランス受容体はＦＶＩＩＩタンパク質
のＦＶＩＩＩクリアランス受容体への結合を遮断する。いくつかの実施形態において、ク
リアランス受容体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、また
はそのＦＶＩＩＩ結合断片である。
いくつかの態様において、任意のＦＶＩＩＩリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に
融合される第２の異種部分は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、
アルブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末
端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン
（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一実施形
態において、第２の異種部分（Ｈ２）は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長すること
が可能である。別の実施形態において、第２の異種部分（Ｈ２）は、ポリペプチド、非ポ
リペプチド部分、または双方を含む。他の実施形態において、第２の異種部分（Ｈ２）は
、免疫グロブリン定常領域またはその一部を含む。依然として他の実施形態において、第
２の異種部分はＦｃＲｎ結合パートナーを含む。さらに他の実施形態において、第２の異
種部分は第２のＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列が構成要素のうちの任意の１つに融合され
る、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に融合される第１の異種部分、及び任意の
リンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に融合される第２の異種部分は、互いに会合する
。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチドとの間の会合は、共
有結合である。別の実施形態において、第１の異種部分と第２の異種部分との間の会合は
、ジスルフィド結合である。他の実施形態において、第１の異種部分はＦｃＲｎ結合パー
トナーであり、第２の異種部分はＦｃＲｎ結合パートナーである。依然として他の実施形
態において、第１の異種部分はＦｃ領域であり、第２の異種部分はＦｃ領域である。
ある特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩリンカーによって
第２の異種部分に結合される。一実施形態において、第２のリンカーは切断可能リンカー
である。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩリンカーはＶＷＦリンカーと同一である。他
の実施形態において、ＦＶＩＩＩリンカーはＶＷＦリンカーと異なる。
いくつかの態様において、本発明のキメラ分子は、（ａ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２
−Ｌ２−Ｘ２−Ｃ、（ｂ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｃ、（ｃ）Ｖ−Ｌ
１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ２−Ｃ、（ｄ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ
２−Ｃ、（ｅ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、（ｆ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１
−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、（ｇ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｖ
、（ｈ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｉ）Ｃ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：
Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｊ）Ｃ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｋ）Ｃ
（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｖ、または（ｌ）Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：
Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖから選択される式を含み、式中、ＶはＶＷＦタンパク質であり、Ｌ
１はＶＷＦリンカーであり、Ｌ２は任意のＦＶＩＩＩリンカーであり、Ｈ１は第１の異種
部分であり、Ｈ２は第２の異種部分であり、Ｘ１はＸＴＥＮ配列であり、Ｘ２は任意のＸ
ＴＥＮ配列であり、ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり、Ｃ（Ｘ２）はＸＴＥＮ配列に融合
されるＦＶＩＩＩタンパク質であり、該ＸＴＥＮ配列は互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩ
アミノ酸の間に挿入され、（−）はペプチド結合または１個以上のアミノ酸であり、（：
）はＨ１とＨ２との間の共有結合である。
他の態様において、キメラ分子は、（ａ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−
Ｃ、（ｂ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｃ、（ｃ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１
：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ２−Ｃ、（ｄ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ２−Ｃ、（ｅ）
Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、（ｆ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−
Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、（ｇ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｖ、（ｈ）Ｃ−Ｘ
２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｉ）Ｃ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ
１−Ｖ、（ｊ）Ｃ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｋ）Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２
−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｖ、または（ｌ）Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ
１−Ｖから選択される式を含み、式中、ＶはＶＷＦタンパク質であり、Ｌ１はＶＷＦリン
カーであり、Ｌ２は任意のＦＶＩＩＩリンカーであり、Ｈ１は第１の異種部分であり、Ｈ
２は第２の異種部分であり、Ｘ１は任意のＸＴＥＮ配列であり、Ｘ２はＸＴＥＮ配列であ
り、ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり、Ｃ（Ｘ２）はＸＴＥＮ配列に融合されるＦＶＩＩ
Ｉタンパク質であり、該ＸＴＥＮ配列は互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に
挿入され、（−）はペプチド結合または１個以上のアミノ酸であり、（：）はＨ１とＨ２
との間の共有結合である。
本発明のキメラ分子において、ＶＷＦタンパク質は、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパ
ク質への結合を抑制または防止することができる。
ある特定の態様において、本キメラ分子内のＦＶＩＩＩタンパク質は第３の異種部分（
Ｈ３）を含むことができる。第３の異種部分（Ｈ３）は、ＸＴＥＮ配列であり得る。他の
態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は第４の異種部分（Ｈ４）を含む。第４の異種部分
（Ｈ４）は、ＸＴＥＮ配列であり得る。いくつかの態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質
は第５の異種部分（Ｈ５）を含む。第５の異種部分は、ＸＴＥＮ配列であり得る。他の態
様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は第６の異種部分（Ｈ６）を含む。第６の異種部分は
、ＸＴＥＮ配列であり得る。ある特定の態様において、第３の異種部分（Ｈ３）、第４の
異種部分（Ｈ４）、第５の異種部分（Ｈ５）、及び第６の異種部分（Ｈ６）のうちの１つ
以上は、キメラ分子の半減期を延長することが可能である。他の態様において、第３の異
種部分（Ｈ３）、第４の異種部分（Ｈ４）、第５の異種部分（Ｈ５）、及び第６の異種部
分（Ｈ６）は、ＦＶＩＩＩのＣ末端もしくはＮ末端に結合されるか、またはＦＶＩＩＩタ
ンパク質の２個のアミノ酸の間に挿入される。依然として他の態様において、第３の異種
部分、第４の異種部分、第５の異種部分、及び第６の異種部分のうちの１つ以上は、約４
２アミノ酸、約７２アミノ酸、約１０８アミノ酸、約１４４アミノ酸、約１８０アミノ酸
、約２１６アミノ酸、約２５２アミノ酸、約２８８アミノ酸、約３２４アミノ酸、約３６
０アミノ酸、約３９６アミノ酸、約４３２アミノ酸、約４６８アミノ酸、約５０４アミノ
酸、約５４０アミノ酸、約５７６アミノ酸、約６１２アミノ酸、約６２４アミノ酸、約６
４８アミノ酸、約６８４アミノ酸、約７２０アミノ酸、約７５６アミノ酸、約７９２アミ
ノ酸、約８２８アミノ酸、約８３６アミノ酸、約８６４アミノ酸、約８７５アミノ酸、約
９１２アミノ酸、約９２３アミノ酸、約９４８アミノ酸、約１０４４アミノ酸、約１１４
０アミノ酸、約１２３６アミノ酸、約１３１８アミノ酸、約１３３２アミノ酸、約１４２
８アミノ酸、約１５２４アミノ酸、約１６２０アミノ酸、約１７１６アミノ酸、約１８１
２アミノ酸、約１９０８アミノ酸、または約２００４アミノ酸のうちの１つ以上から選択
される長さを含む。例えば、第３の異種部分、第４の異種部分、第５の異種部分、または
第６の異種部分のＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ
２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、またはＡＧ１４４から選択
され得る。より具体的には、ＸＴＥＮ配列は、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４
７、配列番号４５、配列番号４３、配列番号４１、配列番号４８、配列番号４６、配列番
号４４、または配列番号４２から選択され得る。
ある特定の実施形態において、本キメラ分子の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩよりも少な
くとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少な
くとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約
８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも
約１２倍長く延長される。
本開示はまた、キメラ分子またはその相補配列をコードするポリヌクレオチドもしくは
ポリヌクレオチドのセットも提供する。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセッ
トは、ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖をさらに含むことができる。
さらに含まれるのは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含むベクタ
ーまたはベクターのセット、及びポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットに作
動可能に結合された１つ以上のプロモーターである。いくつかの実施形態において、ベク
ターまたはベクターのセットは、ＰＣ５またはＰＣ７をコードする追加のポリヌクレオチ
ド鎖をさらに含むことができる。
本発明はまた、ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、またはベクター
もしくはベクターのセットを含む宿主細胞も含む。一実施形態において、宿主細胞は哺乳
動物細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、
またはＢＨＫ細胞から選択される。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示されるキメラ分子、キメラ分子を
コードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、ポリヌクレオチドもし
くはポリヌクレオチドのセットを含むベクターもしくはベクターのセット、または本明細
書に開示される宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。一実
施形態において、該組成物内のキメラ分子は、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して延
長された半減期を有する。別の実施形態において、該組成物内のキメラ分子の半減期は、
野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５
倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少な
くとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも
約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される。
さらに含まれるのは、出血発症の頻度または程度の減少を必要とする対象における出血
発症の頻度または程度の減少方法であって、有効な量の本明細書に開示されるキメラ分子
、該キメラ分子をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、本明
細書に開示されるベクターもしくはベクターのセット、本明細書に開示される宿主細胞、
または本明細書に開示される組成物を投与することを含む方法である。本発明はまた、出
血発症の発生の予防を必要とする対象における出血発症の発生の予防方法であって、有効
な量の本明細書に開示されるキメラ分子、該キメラ分子をコードするポリヌクレオチドも
しくはポリヌクレオチドのセット、本明細書に開示されるベクターもしくはベクターのセ
ット、本明細書に開示される宿主細胞、または本明細書に開示される組成物を投与するこ
とを含む方法も含む。一実施形態において、出血発症は、出血凝固障害、関節血症、筋肉
出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、
頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血
、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血、またはそれらの任意の組み合わせから
である。別の実施形態において、本明細書に開示されるキメラ分子、該キメラ分子をコー
ドするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、本明細書に開示されるベク
ターもしくはベクターのセット、または本明細書に開示される宿主細胞、または本明細書
に開示される組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、経
口投与、及びそれらの任意の組み合わせから選択される経路で投与され得る。
本開示はまた、キメラ分子の作製方法であって、１つ以上の宿主細胞に、本明細書に開
示されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトする
こと、及び宿主細胞内にキメラ分子を発現することを含む方法も含む。該方法は、キメラ
分子を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ分子のＦＶＩＩ
Ｉ活性は、ａＰＴＴアッセイまたはＲＯＴＥＭアッセイによって測定され得る。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）タンパク質と、異種部分（Ｈ１）と、ＸＴＥＮ配列
と、前記ＶＷＦタンパク質を前記異種部分と接続するＶＷＦリンカーとを含むキメラ分子
であって、前記ＶＷＦリンカーが、
ｉ．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）からのａ２領域、
ｉｉ．ＦＶＩＩＩからのａ１領域、
ｉｉｉ．ＦＶＩＩＩからのａ３領域、
ｉｖ．Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）とＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフとを含むト
ロンビン切断部位であって、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、
ｖ．それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含み、
前記ＸＴＥＮ配列が、前記ＶＷＦタンパク質、前記異種部分（Ｈ１）、前記ＶＷＦリンカ
ー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される、前記キメラ分子。
（項目２）
前記ＸＴＥＮ配列が、前記ＶＷＦタンパク質を前記ＶＷＦリンカーと、または前記ＶＷ
Ｆリンカーを前記異種部分と接続する、項目１に記載のキメラ分子。
（項目３）
ＦＶＩＩＩタンパク質を含む第２のポリペプチド鎖をさらに含み、前記第１のポリペプ
チド鎖と前記第２のポリペプチド鎖とが互いに会合する、項目１または２に記載のキメラ
分子。
（項目４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が追加のＸＴＥＮ配列をさらに含む、項目３に記載のキメラ
分子。
（項目５）
前記追加のＸＴＥＮ配列が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に結合
されるか、互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に挿入される、項目４に記載の
キメラ分子。
（項目６）
前記第２のポリペプチド鎖が、第２の異種部分（Ｈ２）をさらに含む、項目３〜５のい
ずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目７）
ＶＷＦタンパク質、異種部分（Ｈ１）、及び前記ＶＷＦタンパク質と前記異種部分（Ｈ
１）とを接続するＶＷＦリンカーを含む第１のポリペプチド鎖と、ＦＶＩＩＩタンパク質
及びＸＴＥＮ配列を含む第２のポリペプチド鎖と、を含むキメラ分子であって、前記第１
のポリペプチド鎖内の前記ＶＷＦリンカーが、
ｉ．ＦＶＩＩＩからのａ２領域、
ｉｉ．ＦＶＩＩＩからのａ１領域、
ｉｉｉ．ＦＶＩＩＩからのａ３領域、
ｉｖ．Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）とＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフとを含むト
ロンビン切断部位であって、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、
ｖ．それらの任意の組み合わせ、を含み、
前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖とが互いに会合する、前記キメラ
分子。
（項目８）
前記ＸＴＥＮ配列が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に接続される
か、互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に挿入される、項目７に記載のキメラ
分子。
（項目９）
前記ＶＷＦタンパク質、前記異種部分、前記ＶＷＦリンカー、またはそれらの任意の組
み合わせに接続される、追加のＸＴＥＮ配列をさらに含む、項目７または８に記載のキメ
ラ分子。
（項目１０）
第２の異種部分（Ｈ２）をさらに含む、項目７〜９のいずれか一項に記載のキメラ分子
。
（項目１１）
前記第２の異種部分が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質、前記ＸＴＥＮ配列、または双方に
接続される、項目１０に記載のキメラ分子。
（項目１２）
前記ＸＴＥＮ配列が、約４２個のアミノ酸、約７２個のアミノ酸、約１０８個のアミノ
酸、約１４４個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸、約２１６個のアミノ酸、約２５２個
のアミノ酸、約２８８個のアミノ酸、約３２４個のアミノ酸、約３６０個のアミノ酸、約
３９６個のアミノ酸、約４３２個のアミノ酸、約４６８個のアミノ酸、約５０４個のアミ
ノ酸、約５４０個のアミノ酸、約５７６個のアミノ酸、約６１２個のアミノ酸、約６２４
個のアミノ酸、約６４８個のアミノ酸、約６８４個のアミノ酸、約７２０個のアミノ酸、
約７５６個のアミノ酸、約７９２個のアミノ酸、約８２８個のアミノ酸、約８３６個のア
ミノ酸、約８６４個のアミノ酸、約８７５個のアミノ酸、約９１２個のアミノ酸、約９２
３個のアミノ酸、約９４８個のアミノ酸、約１０４４個のアミノ酸、約１１４０個のアミ
ノ酸、約１２３６個のアミノ酸、約１３１８個のアミノ酸、約１３３２個のアミノ酸、約
１４２８個のアミノ酸、約１５２４個のアミノ酸、約１６２０個のアミノ酸、約１７１６
個のアミノ酸、約１８１２個のアミノ酸、約１９０８個のアミノ酸、または約２００４個
のアミノ酸を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目１３）
前記ＸＴＥＮ配列が、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、Ａ
Ｅ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、またはＡＧ１４４から選択される、項
目１〜１２のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目１４）
前記ＸＴＥＮ配列が、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４５、配
列番号４４、配列番号４１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号４４、または配列番
号４２から選択される、項目１〜１３のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目１５）
前記追加のＸＴＥＮ配列が、約４２個のアミノ酸、約７２個のアミノ酸、約１０８個の
アミノ酸、約１４４個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸、約２１６個のアミノ酸、約２
５２個のアミノ酸、約２８８個のアミノ酸、約３２４個のアミノ酸、約３６０個のアミノ
酸、約３９６個のアミノ酸、約４３２個のアミノ酸、約４６８個のアミノ酸、約５０４個
のアミノ酸、約５４０個のアミノ酸、約５７６個のアミノ酸、約６１２個のアミノ酸、約
６２４個のアミノ酸、約６４８個のアミノ酸、約６８４個のアミノ酸、約７２０個のアミ
ノ酸、約７５６個のアミノ酸、約７９２個のアミノ酸、約８２８個のアミノ酸、約８３６
個のアミノ酸、約８６４個のアミノ酸、約８７５個のアミノ酸、約９１２個のアミノ酸、
約９２３個のアミノ酸、約９４８個のアミノ酸、約１０４４個のアミノ酸、約１１４０個
のアミノ酸、約１２３６個のアミノ酸、約１３１８個のアミノ酸、約１３３２個のアミノ
酸、約１４２８個のアミノ酸、約１５２４個のアミノ酸、約１６２０個のアミノ酸、約１
７１６個のアミノ酸、約１８１２個のアミノ酸、約１９０８個のアミノ酸、または約２０
０４個のアミノ酸を含む、項目４〜６及び９〜１１のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目１６）
前記追加のＸＴＥＮ配列が、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８
８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、またはＡＧ１４４から選択され
る、項目４〜６、９〜１１、及び１５のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目１７）
前記追加のＸＴＥＮ配列が、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４
５、配列番号４３、配列番号４１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号４４、または
配列番号４２から選択される、項目４〜６、９〜１１、及び１５〜１６のいずれか一項に
記載のキメラ分子。
（項目１８）
前記ＶＷＦリンカーが、全長ＦＶＩＩＩに相当するＧｌｕ７２０〜Ａｒｇ７４０と少な
くとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を
含む前記ａ２領域を含み、前記ａ２領域がトロンビンによって切断されることが可能であ
る、項目１〜１７のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目１９）
前記ａ２領域が配列番号４を含む、項目１８に記載のキメラ分子。
（項目２０）
前記ＶＷＦリンカーが、全長ＦＶＩＩＩに相当するＭｅｔ３３７〜Ａｒｇ３７２と少な
くとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、また
は１００％同一のアミノ酸配列を含む前記ａ１領域を含み、前記ａ１領域がトロンビンに
よって切断されることが可能である、項目１〜１７のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目２１）
前記ａ１領域が配列番号５を含む、項目２０に記載のキメラ分子。
（項目２２）
前記ＶＷＦリンカーが、全長ＦＶＩＩＩに相当するＧｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９と
少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％同一のアミノ酸配
列を含む前記ａ３領域を含み、前記ａ３領域がトロンビンによって切断されることが可能
である、項目１〜１７のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目２３）
前記ａ３領域が配列番号６を含む、項目２２に記載のキメラ分子。
（項目２４）
前記ＶＷＦリンカーが、Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及び前記ＰＡＲ１非活性部位相
互作用モチーフを含む前記トロンビン切断部位を含み、前記ＰＡＲ１非活性部位相互作用
モチーフがＳ−Ｆ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｎ（配列番号７）を含む、項目１〜１７のいずれか一項
に記載のキメラ分子。
（項目２５）
前記ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフが、Ｐ、Ｐ−Ｎ、Ｐ−Ｎ−Ｄ、Ｐ−Ｎ−Ｄ−
Ｋ（配列番号８）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ（配列番号９）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ（配列
番号１０）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ（配列番号１１）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−
Ｐ−Ｆ（配列番号１２）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ（配列番号１３）、Ｐ−
Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ（配列番号１４）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−
Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ（配列番号２０）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ−Ｅ（
配列番号２１）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ（配列番号２２
）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｓ（配列番号２３）、また
はそれらの任意の組み合わせから選択される配列をさらに含む、項目１〜１７、及び２４
のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目２６）
前記脂肪族アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン
から選択される、項目１〜１７、２４、及び２５のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目２７）
前記ＶＷＦリンカーが、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５）からなる前記トロンビン切断
部位がトロンビンによって切断されるよりも速くトロンビンによって切断される、項目１
〜２６のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目２８）
前記ＶＷＦリンカーが配列番号２４を含む、項目１〜２７のいずれか一項に記載のキメ
ラ分子。
（項目２９）
前記ＶＷＦリンカーが、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５）からなる前記トロンビン切断
部位がトロンビンによって切断されるよりも、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍
、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍
、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約
１００倍速く、トロンビンによって切断される、項目２７に記載のキメラ分子。
（項目３０）
前記ＶＷＦリンカーが１個以上のアミノ酸をさらに含み、前記ＶＷＦリンカーが、少な
くとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１
１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２
１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５
５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、
１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００アミノ酸の長さを有する、項
目１〜２９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目３１）
前記１個以上のアミノ酸がｇｌｙペプチドを含む、項目３０に記載のキメラ分子。
（項目３２）
前記１個以上のアミノ酸がＧｌｙＧｌｙを含む、項目３０または３１に記載のキメラ分
子。
（項目３３）
前記１個以上のアミノ酸がｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含む、項目３０に記載のキメラ分
子。
（項目３４）
前記ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ
の式を有し、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０
、または１００から選択される正整数である、項目３３に記載のキメラ分子。
（項目３５）
前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号８９）または
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号９０）である、項目３４に記載のキメラ分子。
（項目３６）
前記ＶＷＦタンパク質が、ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含み、前記Ｄ’ド
メイン及びＤ３ドメインが、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合することが可能である、項目１
〜３５のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目３７）
前記ＶＷＦタンパク質の前記Ｄ’ドメインが、配列番号２のアミノ酸７６４〜８６６と
少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の
アミノ酸配列を含む、項目３６に記載のキメラ分子。
（項目３８）
前記ＶＷＦタンパク質の前記Ｄ３ドメインが、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０
と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一
のアミノ酸配列を含む、項目３６または３７に記載のキメラ分子。
（項目３９）
前記ＶＷＦタンパク質が、配列番号２の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０
９９と１１４２の双方に相当する残基において少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する
、項目３６〜３８のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目４０）
前記ＶＷＦタンパク質の前記配列内で、システイン以外のアミノ酸が、配列番号２の残
基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と１１４２の双方に相当する残基と置換
される、項目１〜３９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目４１）
前記ＶＷＦタンパク質の前記配列が、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０を含む、
項目１〜３９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目４２）
前記ＶＷＦタンパク質が、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、または前記Ｄ１及び
Ｄ２ドメインをさらに含む、項目３６〜４１のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目４３）
前記ＶＷＦタンパク質が、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン
、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメ
イン、それらの１つ以上の断片、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるＶＷＦ
ドメインをさらに含む、項目３６〜４２のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目４４）
前記ＶＷＦタンパク質が、（１）ＶＷＦの前記Ｄ’及びＤ３ドメイン、もしくはそれら
の断片、（２）ＶＷＦの前記Ｄ１、Ｄ’、及びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、（
３）ＶＷＦの前記Ｄ２、Ｄ’、及びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、（４）ＶＷＦ
の前記Ｄ１、Ｄ２、Ｄ’、及びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、または（５）ＶＷ
Ｆの前記Ｄ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３、及びＡ１ドメイン、もしくはそれらの断片、から本質
的になる、もしくはそれらからなる、項目３６〜４３のいずれか一項に記載のキメラ分子
。
（項目４５）
ＶＷＦのシグナルペプチドをさらに含む、項目１〜４４のいずれか一項に記載のキメラ
分子。
（項目４６）
前記ＶＷＦタンパク質が、ＰＥＧ化、グリコシル化、ＨＥＳ化、またはポリシアル酸化
される、項目１〜４５のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目４７）
前記異種部分（Ｈ１）が、前記キメラ分子の半減期を延長することが可能である、項目
１〜４６のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目４８）
前記異種部分（Ｈ１）が、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、ア
ルブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端
ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（
ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目４７に
記載のキメラ分子。
（項目４９）
前記免疫グロブリン定常領域またはその一部が、ＦｃＲｎ結合パートナーを含む、項目
４８に記載のキメラ分子。
（項目５０）
前記免疫グロブリン定常領域またはその一部が、Ｆｃ領域を含む、項目４８に記載のキ
メラ分子。
（項目５１）
前記異種部分（Ｈ１）が、クリアランス受容体またはその断片を含み、前記クリアラン
ス受容体がＦＶＩＩＩタンパク質のＦＶＩＩＩクリアランス受容体への結合を遮断する、
項目１〜４７のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目５２）
前記クリアランス受容体が、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１
）、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片である、項目５１に記載のキメラ分子。
（項目５３）
前記第２の異種部分が、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、アル
ブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペ
プチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（Ｈ
ＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目６、及び
１０〜５２のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目５４）
前記第２の異種部分（Ｈ２）が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することが
可能である、項目６、及び１０〜５３のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目５５）
前記第２の異種部分（Ｈ２）が、ポリペプチド、非ポリペプチド部分、または双方を含
む、項目５４に記載のキメラ分子。
（項目５６）
前記第２の異種部分（Ｈ２）が、免疫グロブリン定常領域またはその一部を含む、項目
５４または５５に記載のキメラ分子。
（項目５７）
前記第２の異種部分が、ＦｃＲｎ結合パートナーを含む、項目５６に記載のキメラ分子
。
（項目５８）
前記第２の異種部分が第２のＦｃ領域を含む、項目５６に記載のキメラ分子。
（項目５９）
前記第１の異種部分と前記第２の異種部分とが互いに会合する、項目６、及び１０〜５
８のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目６０）
前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチドとの間の会合が共有結合である、
項目５９に記載のキメラ分子。
（項目６１）
前記第１の異種部分と前記第２の異種部分との間の会合が、ジスルフィド結合である、
項目５９に記載のキメラ分子。
（項目６２）
前記第１の異種部分がＦｃＲｎ結合パートナーであり、前記第２の異種部分がＦｃＲｎ
結合パートナーである、項目６、及び１０〜５８のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目６３）
前記第１の異種部分がＦｃ領域であり、前記第２の異種部分がＦｃ領域である、項目６
、及び１０〜５８のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目６４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＦＶＩＩＩリンカーによって前記第２の異種部分に結合
される、項目６、及び１０〜５８のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目６５）
前記ＦＶＩＩＩリンカーが切断可能リンカーである、項目６４に記載のキメラ分子。
（項目６６）
前記ＦＶＩＩＩリンカーが前記ＶＷＦリンカーと同一である、項目６４または６５に記
載のキメラ分子。
（項目６７）
前記ＦＶＩＩＩリンカーが前記ＶＷＦリンカーと異なる、項目６４または６５に記載の
キメラ分子。
（項目６８）
（ａ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｃ、
（ｂ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｃ、
（ｃ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｄ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｅ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、
（ｆ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、
（ｇ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｈ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、
（ｉ）Ｃ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、
（ｊ）Ｃ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、
（ｋ）Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｖ、または
（ｌ）Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖから選択される式を含み、
式中、Ｖが前記ＶＷＦタンパク質であり、
Ｌ１が前記ＶＷＦリンカーであり、
Ｌ２が任意のＦＶＩＩＩリンカーであり、
Ｈ１が前記第１の異種部分であり、
Ｈ２が前記第２の異種部分であり、
Ｃが前記ＦＶＩＩＩタンパク質であり、
Ｃ（Ｘ２）が前記ＸＴＥＮ配列に融合される前記ＦＶＩＩＩタンパク質であり、前記ＸＴ
ＥＮ配列が互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に挿入され、
（−）が、ペプチド結合または１個以上のアミノ酸であり、及び
（：）が、前記Ｈ１と前記Ｈ２との間の共有結合である、項目６、及び１０〜６７のいず
れか一項に記載のキメラ分子。
（項目６９）
前記ＶＷＦタンパク質が、内因性ＶＷＦの前記ＦＶＩＩＩタンパク質への結合を抑制ま
たは防止する、項目６、及び１０〜６８のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目７０）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が第３の異種部分（Ｈ３）を含む、項目６、及び１０〜６９
のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目７１）
前記第３の異種部分（Ｈ３）がＸＴＥＮ配列である、項目７０に記載のキメラ分子。
（項目７２）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が第４の異種部分（Ｈ４）を含む、項目７０または７１に記
載のキメラ分子。
（項目７３）
前記第４の異種部分（Ｈ４）がＸＴＥＮ配列である、項目７２に記載のキメラ分子。
（項目７４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が第５の異種部分（Ｈ５）を含む、項目７２または７３に記
載のキメラ分子。
（項目７５）
前記第５の異種部分がＸＴＥＮ配列である、項目７４に記載のキメラ分子。
（項目７６）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が前記第６の異種部分（Ｈ６）を含む、項目７４または７５
に記載のキメラ分子。
（項目７７）
前記第６の異種部分がＸＴＥＮ配列である、項目７６に記載のキメラ分子。
（項目７８）
前記第３の異種部分（Ｈ３）、前記第４の異種部分（Ｈ４）、前記第５の異種部分（Ｈ
５）、及び前記第６の異種部分（Ｈ６）のうちの１つ以上が、前記キメラ分子の半減期を
延長することが可能である、項目７６または７７に記載のキメラ分子。
（項目７９）
前記第３の異種部分（Ｈ３）、前記第４の異種部分（Ｈ４）、前記第５の異種部分（Ｈ
５）、及び前記第６の異種部分（Ｈ６）が、ＦＶＩＩＩのＣ末端もしくはＮ末端に結合さ
れるか、前記ＦＶＩＩＩタンパク質の２個のアミノ酸の間に挿入される、項目７６または
７７に記載のキメラ分子。
（項目８０）
前記ＸＴＥＮ配列の１つ以上が、約４２アミノ酸、約７２アミノ酸、約１０８アミノ酸
、約１４４アミノ酸、約１８０アミノ酸、約２１６アミノ酸、約２５２アミノ酸、約２８
８アミノ酸、約３２４アミノ酸、約３６０アミノ酸、約３９６アミノ酸、約４３２アミノ
酸、約４６８アミノ酸、約５０４アミノ酸、約５４０アミノ酸、約５７６アミノ酸、約６
１２アミノ酸、約６２４アミノ酸、約６４８アミノ酸、約６８４アミノ酸、約７２０アミ
ノ酸、約７５６アミノ酸、約７９２アミノ酸、約８２８アミノ酸、約８３６アミノ酸、約
８６４アミノ酸、約８７５アミノ酸、約９１２アミノ酸、約９２３アミノ酸、約９４８ア
ミノ酸、約１０４４アミノ酸、約１１４０アミノ酸、約１２３６アミノ酸、約１３１８ア
ミノ酸、約１３３２アミノ酸、約１４２８アミノ酸、約１５２４アミノ酸、約１６２０ア
ミノ酸、約１７１６アミノ酸、約１８１２アミノ酸、約１９０８アミノ酸、または約２０
０４アミノ酸のうちの１つ以上から選択される長さを含む、項目７１、７３、７５、及び
７７のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目８１）
前記ＸＴＥＮ配列が、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、Ａ
Ｅ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、またはＡＧ１４４から選択される、項
目７１、７３、７５、７７、及び８０のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目８２）
前記ＸＴＥＮ配列が、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４５、配
列番号４４、配列番号４１、配列番号４８、配列番号４６、配列番号４４、または配列番
号４２から選択される、項目８１に記載のキメラ分子。
（項目８３）
前記キメラ分子の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくと
も約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約
５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少
なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される、項
目１〜８２のいずれか一項に記載のキメラ分子。
（項目８４）
項目１〜８３のいずれか一項に記載のキメラ分子またはその相補配列をコードする、ポ
リヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
（項目８５）
ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖をさらに含む、項目８４に記載の
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
（項目８６）
項目８４または８５に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット、及び
前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのセットに作動可能に結合された１つ
以上のプロモーターを含む、ベクターまたはベクターのセット。
（項目８７）
ＰＣ５またはＰＣ７をコードする追加のポリヌクレオチド鎖をさらに含む、項目８６に
記載のベクターまたはベクターのセット。
（項目８８）
項目８６もしくは８７に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、
または項目８６もしくは８７に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む、宿主細
胞。
（項目８９）
哺乳動物細胞である、項目８８に記載の宿主細胞。
（項目９０）
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、またはＢＨＫ細胞から選択され
る、項目８９に記載の宿主細胞。
（項目９１）
項目１〜８３のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目８４もしくは８５に記載のポリ
ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、項目８６もしくは８７に記載のベクターもしく
はベクターのセット、または項目８８〜９０のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び薬学
的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
（項目９２）
前記キメラ分子が、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して延長された半減期を有する
、項目９１に記載の組成物。
（項目９３）
前記キメラ分子の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくと
も約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約
５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少
なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される、項
目９１または９２に記載の組成物。
（項目９４）
出血発症の頻度または程度の減少を必要とする対象における出血発症の頻度または程度
の減少方法であって、有効な量の項目１〜８３のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目
８４もしくは８５に記載のポリヌクレオチド、項目８６もしくは８７に記載のベクター、
項目８８〜９０のいずれか一項に記載の宿主細胞、または項目９１〜９３のいずれか一項
に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目９５）
出血発症の発生の予防を必要とする対象における出血発症の発生の予防方法であって、
有効な量の項目１〜８３のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目８４もしくは８５に記
載のポリヌクレオチド、項目８６もしくは８７に記載のベクター、項目８８〜９０のいず
れか一項に記載の宿主細胞、または項目９１〜９３のいずれか一項に記載の組成物を投与
することを含む、前記方法。
（項目９６）
前記出血発症が、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大
出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血
、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘に
おける出血、またはそれらの任意の組み合わせからである、項目９４または９５に記載の
方法。
（項目９７）
項目１〜８３のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目８４もしくは８５に記載のポリ
ヌクレオチド、項目８６もしくは８７に記載のベクター、項目８８〜９０のいずれか一項
に記載の宿主細胞、または項目９１〜９３のいずれか一項に記載の組成物が、局所投与、
眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、経口投与、及びそれらの任意の組み合
わせから選択される経路で投与される、項目９５〜９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
キメラ分子の作製方法であって、１つ以上の宿主細胞に項目８４もしくは８５に記載の
ポリヌクレオチド、または項目８６もしくは８７に記載のベクターをトランスフェクトす
ること、及び前記宿主細胞内に前記キメラ分子を発現することを含む、前記方法。
（項目９９）
前記キメラ分子を単離することをさらに含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
ＶＷＦタンパク質、異種部分（Ｈ１）、及び前記ＶＷＦタンパク質と前記異種部分（Ｈ
１）とを接続するＶＷＦリンカーを含むキメラＦＶＩＩＩタンパク質、ならびにＦＶＩＩ
Ｉタンパク質とＸＴＥＮ配列とを含む第２のポリペプチド鎖のＦＶＩＩＩ活性の改善方法
であって、前記第１のポリペプチド鎖内の前記ＶＷＦリンカーが、
ｉ．ＦＶＩＩＩからのａ２領域、
ｉｉ．ＦＶＩＩＩからのａ１領域、
ｉｉｉ．ＦＶＩＩＩからのａ３領域、
ｉｖ．Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）とＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフとを含むト
ロンビン切断部位であって、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、
ｖ．それらの任意の組み合わせ、を含む、前記方法、
（項目１０１）
前記ＦＶＩＩＩ活性が、ａＰＴＴアッセイまたはＲＯＴＥＭアッセイによって測定され
る、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
２つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第１のポリペプチド配列がＦＶＩ
ＩＩ１６９（配列番号８８）と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、または１００
％同一のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド配列がＶＷＦ０５９（配列番号８２）
と少なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、前
記キメラ分子。
（項目１０３）
２つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第１のポリペプチド配列がＦＶＩ
ＩＩ２８６（配列番号８６）と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、または１００
％同一のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド配列がＶＷＦ０５９（配列番号８２）
と少なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、前
記キメラ分子。
（項目１０４）
２つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第１のポリペプチド配列がＦＶＩ
ＩＩ２８６（配列番号８６）と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、または１００
％同一のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド配列がＶＷＦ０６２（配列番号８４）
と少なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、前
記キメラ分子。
（項目１０５）
２つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第１のポリペプチド配列がＦＶＩ
ＩＩ２８６（配列番号８６）と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、または１００
％同一のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド配列がＶＷＦ０５７（配列番号８０）
と少なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、前
記キメラ分子。
（項目１０６）
項目１０２〜１０５のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードする、ポリヌクレオチ
ド（複数可）。
（項目１０７）
ＶＷＦ０５７（配列番号７９）と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、または１
００％同一のヌクレオチド配列をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目１０８）
ＦＶＩＩＩ１６９（配列番号８７）と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、また
は１００％同一の第２のヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドをさらに含む、
項目１０７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０９）
ＦＶＩＩＩ２８６（配列番号８５）と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、また
は１００％同一の第２のヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドをさらに含む、
項目１０７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１０）
前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、同じベクター上にあ
るか、２つの異なるベクター上にある、項目１０８または１０９に記載のポリヌクレオチ
ド。
（項目１１１）
出血発症の頻度または程度を必要とする対象における出血発症の頻度または程度の方法
であって、有効な量の項目１０２〜１０５のいずれか一項に記載のキメラ分子、または項
目１０６〜１１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド（複数可）を投与することを
含む、前記方法。
２つのポリペプチド鎖を含むキメラ分子（ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／ＶＷＦヘテロ二量体）の例となる図を示し、第１の鎖は、トロンビン切断可能ＶＷＦリンカーを介してＦｃ領域に融合されるＶＷＦタンパク質（例えば、ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメイン）を含み、第２の鎖は、ＦＶＩＩＩリンカーを介して第２のＦｃ領域に融合されるＦＶＩＩＩタンパク質を含む。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの様々なドメイン内に１つ以上のＸＴＥＮを含む。 様々なＶＷＦ構築物を示し、各構築物は、対照（すなわち、ＶＷＦ−０５２）を除き、トロンビン切断可能ＶＷＦリンカーを介してＦｃ領域に融合されるＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含む。ＶＷＦ−０３１は、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５）のトロンビン切断部位を含む４８アミノ酸のリンカーを含む。ＶＷＦ−０３４は、２８８個のアミノ酸を有するＸＴＥＮ配列、及びＬ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５）のトロンビン切断部位を含む３５アミノ酸のリンカーを含む。ＶＷＦ−０３５は、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５）のトロンビン切断部位を含む７３アミノ酸のリンカーを含む。ＶＷＦ−０３６は、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５）のトロンビン切断部位を含む９８アミノ酸のリンカーを含む。ＶＷＦ−０３９は、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５）のトロンビン切断部位及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含む２６アミノ酸のＶＷＦリンカーを含む。ＶＷＦ−０５１は、Ａ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｖ−Ｖ（配列番号２６）のトロンビン切断部位を含む５４アミノ酸のリンカーを含む。ＶＷＦ−０５２は、いかなるトロンビン切断部位も有しない４８アミノ酸のリンカーを含む（対照）。ＶＷＦ−０５４は、ＦＶＩＩＩからのａ１領域を含む４０アミノ酸のＶＷＦリンカーを含む。ＶＷＦ−０５５は、ＦＶＩＩＩからのａ２領域を含む３４アミノ酸のＶＷＦリンカーを含む。ＶＷＦ−０５６は、ＦＶＩＩＩからのａ３領域を含む４６アミノ酸のＶＷＦリンカーを含む。 図３Ａは、ＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物、すなわち、ＶＷＦ−０３１、ＶＷＦ−０３４、ＶＷＦ−０３６、ＶＷＦ−０３９、ＶＷＦ−０５１、及びＶＷＦ−０５２のトロンビン媒介切断速度を、ＲＵの単位での捕捉密度の関数として、１秒当たりの共鳴単位（ＲＵ／秒）の単位で示す。図３Ｂは、ＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物、すなわち、ＶＷＦ−０３１、ＶＷＦ−０３４、ＶＷＦ−０３６、ＶＷＦ−０５１、及びＶＷＦ−０５２のトロンビン媒介切断速度を、ＲＵの単位での捕捉密度の関数として、１秒当たりの共鳴単位（ＲＵ／秒）の単位で示す。これらの実験において、各ＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物を、様々な密度で捕捉し、続いて一定濃度のヒトα−トロンビンに曝露した。図３Ａ及び図３Ｂ内の各曲線の傾斜は、各構築物のトロンビン切断に対する感受性を直接反映する。 図４Ａは、ＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物、すなわち、ＶＷＦ−０５４、ＶＷＦ−０５５、及びＶＷＦ−０５６のトロンビン媒介切断速度を、ＲＵの単位での捕捉密度の関数として、１秒当たりの共鳴単位（ＲＵ／秒）の単位で示す。図４Ｂは、ＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物、すなわち、ＶＷＦ−０３１、ＶＷＦ−０３９、ＶＷＦ−０５４、ＶＷＦ−０５５、及びＶＷＦ−０５６のトロンビン媒介切断速度を、ＲＵの単位での捕捉密度の関数として、１秒当たりの共鳴単位（ＲＵ／秒）の単位で示す。これらの実験において、各ＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物を、様々な密度で捕捉し、続いて一定濃度のヒトα−トロンビンに曝露した。図４Ａ及び図４Ｂ内の各曲線の傾斜は、各構築物のトロンビン切断に対する感受性を直接反映する。 様々なＶＷＦ−Ｆｃ構築物、ＶＷＦ−０３１、ＶＷＦ−０３４、ＶＷＦ−０３６、ＶＷＦ−０３９、ＶＷＦ−０５１、ＶＷＦ−０５２、ＶＷＦ−０５４、ＶＷＦ−０５５、及びＶＷＦ−０５６のトロンビン媒介切断に対する感受性を決定するための線形回帰分析の結果を示す。値は、逆秒（ｉｎｖｅｒｓｅ ｓｅｃｏｎｄｓ）の単位で表され、図３及び図４内に示される曲線の傾斜を反映する。２つの異なる構築物の相対的感受性は、それらのそれぞれの傾斜の商から得られる。傾斜ＶＷＦ−０３９／傾斜ＶＷＦ−０３１は７１であり、ＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物ＶＷＦ−０３９が、ＶＷＦ−０３１よりもトロンビン媒介切断に対して７１倍感受性が強いことを示す。傾斜ＶＷＦ−０５５／傾斜ＶＷＦ −０３１は６５であり、傾斜ＶＷＦ−０５１／傾斜ＶＷＦ−０３１は１．８である。 全血ＲＯＴＥＭアッセイによって測定された、ＨｅｍＡ患者における様々なキメラ分子の凝固時間を示す。ＦＶＩＩ１５５／ＶＷＦ−０３１は、２つのポリペプチド鎖、Ｆｃ領域に融合されるＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含む第１の鎖と、最小のトロンビン切断部位（すなわち、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５））を介してＦｃ領域に融合されるＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含む第２の鎖とを含む。ＦＶＩＩ１５５／ＶＷＦ−０３９は、２つのポリペプチド鎖、Ｆｃ領域に融合されるＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含む第１の鎖と、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号２５）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含むＶＷＦリンカーを介してＦｃ領域に融合されるＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含む第２の鎖とを含む。ＦＶＩＩ１５５／ＶＷＦ−０５５は、２つのポリペプチド鎖、Ｆｃ領域に融合されるＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含む第１の鎖と、ＦＶＩＩＩからのａ２領域を含むＶＷＦリンカーを介してＦｃ領域に融合されるＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含む第２の鎖とを含む。 代表的なＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロ二量体、ならびにＦＶＩＩＩ１６９、ＦＶＩＩＩ２８６、ＶＷＦ０５７、ＶＷＦ０５９、及びＶＷＦ０６２構築物の図を示す。例えば、ＦＶＩＩＩ１６９構築物は、Ｆｃ領域に融合されるＲ１６４８Ａ置換を有するＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＸＴＥＮ配列（例えば、ＡＥ２８８）が成熟全長ＦＶＩＩＩに相当するアミノ酸７４５で挿入される（Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−２８８ＸＴＥＮ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−Ｆｃ）。ＦＶＩＩＩ２８６構築物は、Ｆｃ領域に融合されるＲ１６４８置換を有するＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＸＴＥＮ配列（例えば、ＡＥ２８８）が成熟全長ＦＶＩＩＩに相当するアミノ酸７４５で挿入され、ＦＶＩＩＩとＦｃとの間に追加のａ２領域を有する（Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−２８８ＸＴＥＮ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ａ２−Ｆｃ）。ＶＷＦ０５７は、ＬＶＰＲトロンビン部位（「ＬＶＰＲ」）及びＧＳリンカー（「ＧＳ」）を含むＶＷＦリンカーを介してＦｃ領域に結合されるＶＷＦタンパク質のＤ’Ｄ３ドメイン（Ｄ’Ｄ３ドメイン内に２つのアミノ酸置換、すなわち、Ｃ３３６Ａ及びＣ３７９Ａを有する）を含むＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物であり、ＸＴＥＮ配列（すなわち、１４４ＸＴＥＮ）がＤ’Ｄ３ドメインとＶＷＦリンカーとの間に挿入される（Ｄ’Ｄ３−１４４ＸＴＥＮ−ＧＳ＋ＬＶＰＲ−Ｆｃ）。ＶＷＦ０５９は、ＶＷＦリンカーとして酸性領域２（ａ２）領域を介してＦｃ領域に結合されるＶＷＦタンパク質のＤ’Ｄ３ドメイン（Ｄ’Ｄ３ドメイン内に２つのアミノ酸置換、すなわち、Ｃ３３６Ａ及びＣ３７９Ａを有する）を含むＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物であり、ＸＴＥＮ配列がＤ’Ｄ３ドメインとＶＷＦリンカーとの間に挿入される。ＶＷＦ０６２は、Ｆｃ領域に結合されるＶＷＦタンパク質のＤ’Ｄ３ドメイン（Ｄ’Ｄ３ドメイン内に２つのアミノ酸置換、すなわち、Ｃ３３６Ａ及びＣ３７９Ａを有する）を含むＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物であり、ＸＴＥＮ配列がＤ’Ｄ３ドメインとＦｃ領域との間に挿入される（Ｄ’Ｄ３−１４４ＸＴＥＮ−Ｆｃ）。 ＨｅｍＡマウス尾切断モデルにおける、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（「ＳＱ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ」または「ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ」）またはビヒクル対照と比較した、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３−リンカー−Ｆｃヘテロ二量体（すなわち、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９、及びＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７）の急激な有効性を示す。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩが円形で示される一方、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４は四角形で示され、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９は三角形で示され、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５７は中空円で示され、ビヒクルは逆三角形で示される。ＶＷＦ０３４は、ＬＶＰＲを含むＶＷＦリンカーを介してＦｃ領域に融合されるＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むＶＷＦ−Ｆｃ融合構築物であり、ＸＴＥＮ配列（すなわち、２８８ＸＴＥＮ）がＤ’Ｄ３ドメインとＶＷＦリンカーとの間に挿入される（Ｄ’Ｄ３−２８８ＸＴＥＮ−ＬＶＰＲ−Ｆｃ）。ＦＶＩＩＩ１６９、ＶＷＦ０５９、及びＶＷＦ０５７の構築物の詳細は、本明細書の他の箇所に示される。各治療群における７５ＩＵ／ｋｇの構築物投与後のマウスの失血中央値（ｕＬ）は、横線によって示される。
本発明は、ＸＴＥＮ配列、及びＶＷＦタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質を異種部
分、例えば、半減期延長部分、と接続するトロンビン切断可能リンカーを含むキメラ分子
を対象とする。本発明はまた、２つのポリペプチド鎖、異種部分に融合されるＶＷＦタン
パク質を含む第１の鎖と、ＦＶＩＩＩタンパク質及び第２の異種部分を含む第２の鎖とを
含むキメラ分子も提供し、該キメラ分子は、第１または第２のポリペプチド鎖内にＸＴＥ
Ｎ配列を含み、ＶＷＦタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質のいずれか（または双方）
が、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカー（または双方）を介して異種部分に融合さ
れる。トロンビン切断可能リンカー（ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカー）は、ト
ロンビンを容易に利用可能な損傷部位でトロンビンによって効率的に切断することができ
る。例となるキメラ分子は、本説明及び図中で例示される。いくつかの実施形態において
、本発明は、例えば、図１〜７に示される構造を有するキメラ分子に関する。他の実施形
態において、本発明は、本明細書内に開示されるキメラ分子構築物をコードするポリヌク
レオチドに関する。
本明細書及び特許請求の範囲の明確な理解を提供するために、以下の定義を下に提供す
る。
Ｉ． 定義
「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」の実体という用語は、その実体の１つ以上を指
すことに留意されたい。例えば、「１つのヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがっ
て、「１つ（ａ）」（または「１つ（ａｎ）」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ
」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
「約」という用語は、本明細書において、およそ、大体、周辺、及びその領域内を意味
するために使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用されるとき、それは、
示される数値の上下の境界を延長することによってその範囲を修正する。一般に、「約」
という用語は、本明細書において、１０パーセント上方または下方（高いまたは低い）の
差異で、述べられた値の上下の数値を修正するために使用される。
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単一の核酸ならびに複数
の核酸を包含するよう意図されており、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ある実施形
態において、ポリヌクレオチドは、従来型ホスホジエステル結合または非従来型結合（例
えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含む。「核酸」という用
語は、ポリヌクレオチド内に存在する、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然
環境から除去されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター内
に含有される第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドは、本
発明の目的のために単離されたと見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例
としては、異種宿主細胞内に維持される、または溶液中の他のポリヌクレオチドから（部
分的または実質的に）精製される組み換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲ
ＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む
。本発明に従う単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されるそのよう
な分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハン
サー、リボソーム結合部位、または転写終結シグナルなどの調節要素を含むことができる
。
本明細書において使用される場合、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸
に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、
ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、典型的には、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部
であると見なされ得、しかし、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソ
ーム結合部位、転写終結因子、イントロン等は、コード領域の一部ではない。コード領域
の境界は、典型的には、結果として生じるポリペプチドのアミノ末端をコードする、５’
末端の開始コドン、及び結果として生じるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする
、３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。本発明の２つ以上のコード領域は、単
一のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、単一のベクター上に、または別個のポリヌク
レオチド構築物内に、例えば、別個の（異なる）ベクター上に存在する。したがって、単
一のベクターは、単一のコード領域だけを含有することができるか、または２つ以上のコ
ード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターは、以下に記載されるようなキメラ
分子の第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を別個にコードすることができる
ということになる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発
明のキメラ分子をコードする核酸に融合される、または融合されない、異種コード領域を
コードすることができる。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメ
インなどの特殊化した要素またはモチーフを制限なしに含む。
哺乳動物細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は、粗面小胞体にわたる成長タ
ンパク質鎖の輸送が開始すると成熟タンパク質から開裂される分泌シグナルペプチドと関
連する。当業者は、シグナルペプチドが、一般的にポリペプチドのＮ末端に融合されるこ
と、及び完全または「全長」ポリペプチドから開裂されて、ポリペプチドの分泌型または
「成熟」形態を産生することを認識している。ある特定の実施形態において、天然のシグ
ナルペプチド、例えば、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドもしくはＶＷＦシグナルペプチド、
またはそれと作動可能に会合するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列
の機能性誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド、例えば、ヒト
組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）もしくはマウスβ−グルクロニダーゼシグナ
ルペプチド、またはその機能性誘導体が使用され得る。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配
列を指す。ある特定の実施形態において、下流ヌクレオチド配列は、翻訳の開始点に続く
配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、翻訳の開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配
列を意味する。ある特定の実施形態において、上流ヌクレオチド配列は、コード領域また
は翻訳の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、大半のプロモーターは、翻訳
開始部位の上流に位置する。
本明細書において使用される場合、「調節領域」という用語は、コード領域の上流（５
’非コード配列）、コード領域内、またはコード領域の下流（３’非コード配列）に位置
するヌクレオチド配列を指し、転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、関連コード領域の翻
訳に影響を及ぼす。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリア
デニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、及びステムループ
構造体を含み得る。コード領域が真核細胞内の発現を目的とする場合、ポリアデニル化シ
グナル及び転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に位置することになる。
遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター及
び／または１つ以上のコード領域と作動可能に会合する他の転写もしくは翻訳制御要素を
含むことができる。作動可能な会合において、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのため
のコード領域は、遺伝子産物の発現を調節領域（複数可）の影響または制御下に置くよう
な方法で１つ以上の調節領域と作動可能に会合する。例えば、コード領域及びプロモータ
ーは、プロモーター機能の導入がコード領域によってコードされる遺伝子産物をコードす
るｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及びプロモーターとコード領域との間の結合の性質が
、プロモーターが遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害しない、またはＤＮＡテンプレ
ートが転写される能力を妨害しない場合に、「作動可能に会合」する。プロモーター以外
の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終
結シグナルもまた、遺伝子産物発現を指示するためのコード領域と作動可能に会合し得る
。
様々な転写制御領域は、当業者に公知である。これらは、限定されるものではないが、
サイトメガロウイルス（イントロン−Ａと組み合わせた最初期プロモーター）、シミアン
ウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）か
らのプロモーター及びエンハンサーセグメントなどの、脊椎動物細胞で機能する転写制御
領域を制限なく含む。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長
ホルモン、及びウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核
細胞内の遺伝子発現を制御することが可能である他の配列を含む。さらなる好適な転写制
御領域としては、組織特異性プロモーター及びエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導
性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能な
プロモーター）が挙げられる。
同様に、様々な翻訳制御要素は、当業者に公知である。これらは、リボソーム結合部位
、翻訳開始及び終結コドン、ならびにピコルナウイルス由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列
とも称される、内部リボソーム進入部位もしくはＩＲＥＳ）を含むがこれらに限定されな
い。
「発現」という用語は、本明細書内で使用される場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物
、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。それは、ポリヌクレオ
チドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ
（ｓｈＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への転写、
及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を制限なく含む。発現は、「遺伝子産物」を産生す
る。本明細書内で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって
産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれか
であり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化
もしくはスプライシング、を受けた核酸、または、翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリ
コシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解
切断、を受けたポリペプチドをさらに含む。
「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローン化及び／または輸送のための任意のビヒ
クルを指す。ベクターは、結合されたセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメ
ントが結合され得るレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボ複製の自律的単
位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製が可能である、任意の遺伝要素（
例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」と
いう用語は、核酸をインビトロ、エキソビボ、またはインビボで細胞に導入するためのウ
イルス性及び非ウイルス性双方のビヒクルを含む。例えば、プラスミド、修飾された真核
ウイルス、または修飾された細菌ウイルスを含め、多数のベクターが、当該技術分野にお
いて公知であり、使用される。ポリヌクレオチドの好適なベクターへの挿入は、相補付着
末端を有する選択されたベクターへの適切なポリヌクレオチド断片の連結によって達成さ
れ得る。
ベクターは、そのベクターを組み込んだ細胞の選択または同定をもたらす選択可能マー
カーまたはレポーターをコードするように操作され得る。選択可能マーカーまたはレポー
ターの発現は、そのベクター上に含有される他のコード領域を組み込み、発現する宿主細
胞の同定及び／または選択を可能にする。当該技術分野において公知であり使用される選
択可能マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシ
ン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミド等に対する耐
性を提供する遺伝子、及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシ
アニン調節遺伝子、イソペンテニルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。当該技術
分野において公知であり使用されるレポーターの例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）
、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）、−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が挙げら
れる。選択可能マーカーはまた、レポーターであると見なされ得る。
「プラスミド」という用語は、多くの場合細胞の中枢代謝の一部ではない遺伝子を運び
、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある、染色体外要素を指す。そのような要素は、
任意の源に由来する一本鎖もしくは二本鎖の線状、環状、もしくは超らせんＤＮＡまたは
ＲＮＡの自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列であり
得、多くのヌクレオチド配列が、プロモーター断片及び選択された遺伝子産物のためのＤ
ＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞へ導入することが可能である独自の構造に結
合されているもしくは組み換えられている。
使用され得る真核ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベク
ター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスベ
クター、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターを含むが、これら
に限定されない。非ウイルス性ベクターは、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイト
フェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、及びバイオポリマーを含む。
「クローン化ベクター」は、順次複製する核酸の単位長であり、かつ結合されたセグメ
ントの複製をもたらすように別の核酸セグメントが結合され得る、プラスミド、ファージ
、またはコスミドなどの複製起点を含む、「レプリコン」を指す。ある特定のクローン化
ベクターは、１つの細胞型、例えば、細菌においては複製が、及び別の細胞型、例えば真
核細胞においては発現が可能である。クローン化ベクターは、典型的には、ベクター及び
／または目的の核酸配列の挿入のための１つ以上の複数クローン化部位を含む細胞の選択
のために使用され得る１つ以上の配列を含む。
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞への挿入の後で、挿入された核酸配列の発現
を可能にするように設計されたビヒクルを指す。挿入された核酸配列は、上に記載される
ような調節領域と作動可能に会合して配置される。
ベクターは、当該技術分野において周知の方法、例えば、トランスフェクション、電気
穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸
カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡ
ベクター輸送体によって宿主細胞内へ導入される。
「培養」、「培養する」、及び「培養すること」は、本明細書内で使用される場合、細
胞増殖もしくは分裂を可能にするインビトロの条件下で細胞をインキュベートすること、
または細胞を生きた状態で維持することを意味する。「培養された細胞」とは、本明細書
内で使用される場合、インビトロで繁殖した細胞を意味する。
本明細書内で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド
」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含するよう意図されており、アミド結合（ペプチ
ド結合としても知られる）によって線状に結合される単量体（アミノ酸）で構成される分
子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（複数可）を
指し、特定の長さの産生物を指すものではない。そのため、ペプチド、ジペプチド、トリ
ペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２個以上のアミノ
酸の鎖（複数可）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内
に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または
それらと互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、ア
セチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分
解切断、または非天然型アミノ酸による修飾を制限なく含む、ポリペプチドの発現後修飾
の産生物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物源または産生された組み換
え技術に由来し得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。それ
は、化学合成を含め、任意の様式で精製され得る。
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、その天然
環境にないポリペプチドを指す。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離さ
れたポリペプチドは、その天然または自然環境から単に除去されることができる。組み換
え産生されたポリペプチド及び宿主細胞内に発現されたタンパク質は、本発明の目的のた
めに、単離されたと見なされ、好適な技術によって分離されている、分画されている、ま
たは部分的もしくは実質的に精製されている天然または組み換えポリペプチドも同様であ
る。
本発明にさらに含まれるのは、ポリペプチドの断片または変異体、及びそれらの任意の
組み合わせである。「断片」または「変異体」という用語は、ポリペプチド結合ドメイン
または本発明の結合分子を指すとき、参照ポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合ド
メイン、もしくはＦｃ変異体に対するＦｃＲｎ結合親和性、ＦＶＩＩＩ変異体に対する凝
固活性、またはＶＷＦタンパク質に対するＦＶＩＩＩ結合活性）の少なくともいくつかを
保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書の他の箇所で説明
される特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片を含むが、天然
型の全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）を含まない。ポリペプチド結合ドメイ
ンまたは本発明の結合分子の変異体は、上に記載されるような断片と、さらにアミノ酸置
換、欠失、挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は
、天然型または非天然型であり得る。非天然型変異体は、当該技術分野において公知の突
然変異誘発技術を使用して産生され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的
アミノ酸置換、欠失、もしくは付加を含み得る。
本明細書内で使用される「ＶＷＦ断片」（複数可）という用語は、ＦＶＩＩＩと相互作
用し、かつ通常は全長ＶＷＦによってＦＶＩＩＩに提供される少なくとも１つ以上の特性
、例えば、ＦＶＩＩＩａに対する早期活性化を防止すること、早期タンパク質分解を防止
すること、早期クリアランスを導く可能性のあるリン脂質膜との会合を防止すること、Ｖ
ＷＦ結合したＦＶＩＩＩではなく裸のＦＶＩＩＩを結合することができるＦＶＩＩＩクリ
アランス受容体への結合を防止すること、ならびに／またはＦＶＩＩＩ重鎖及び軽鎖相互
作用を安定させること、を保持する任意のＶＷＦ断片を意味する。特定の実施形態におい
て、「ＶＷＦ断片」は、本明細書内で使用される場合、ＶＷＦタンパク質のＤ’ドメイン
及びＤ３ドメインを含むが、ＶＷＦタンパク質のＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメ
イン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２
ドメイン、及びＣＫドメインは含まない。
「半減期制限因子」または「ＦＶＩＩＩ半減期制限因子」という用語は、本明細書内で
使用される場合、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が野生型ＦＶＩＩＩと比較して１．５倍
または２倍より長くなることを防止する因子を示す（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）
またはＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標））。例えば、全長または成熟ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩ及
びＶＷＦ複合体が１つ以上のＶＷＦクリアランス経路によってシステムから排出されるよ
うに誘発することによって、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子としての機能を果たすことができ
る。一例において、内因性ＶＷＦはＦＶＩＩＩ半減期制限因子である。別の例において、
ＦＶＩＩＩタンパク質に非共有結合的に結合される全長組み換えＶＷＦ分子は、ＦＶＩＩ
Ｉ半減期制限因子である。
「内因性ＶＷＦ」という用語は、本明細書内で使用される場合、血漿内に天然に存在す
るＶＷＦ分子を示す。内因性ＶＷＦ分子は、多量体であり得るが、単量体または二量体で
はあり得ない。血漿中の内因性ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩに結合し、ＦＶＩＩＩと非共有結合
の複合体を形成する。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換
えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例
えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、ト
レオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン
、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分
岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロ
シン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含め、当該技術分野において
定義されている。そのため、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミ
ノ酸と置き換わっている場合、その置換は保存的であると見なされる。別の実施形態にお
いて、アミノ酸の文字列は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成において異
なる構造的に同様の文字列と保存的に置き換えることができる。
当該技術分野において知られているように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は
、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによっ
て決定される。本明細書において論じられる場合、任意の特定のポリペプチドがもう一方
のポリペプチドと少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０
％、９５％、９９％、または１００％同一であるかどうかは、限定されるものではないが
、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐ
ａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７１１）な
どの当該技術分野において公知の方法及びコンピュータプログラム／ソフトウェアを使用
することによって決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒ
ｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８
２−４８９（１９８１）の局所相同アルゴリズム、を使用して、２つの配列間の相同の最
高セグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを
使用して、特定の配列が、本発明に従う参照配列と、例えば、９５％同一であるかどうか
を決定するとき、パラメータは、当然ながら、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチ
ド配列の全長にわたって計算されるように、及び参照配列内のアミノ酸の合計数の最大５
％まで相同性における差異が許容されるように、設定される。
本明細書において使用される場合、ＶＷＦ配列またはＦＶＩＩＩタンパク質配列内の「
〜に相当するアミノ酸」または「等価なアミノ酸」は、第１のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配
列と第２のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列との間の同一性または類似性を最大限にするため
のアライメントによって識別される。第２のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列内の等価なアミ
ノ酸を認識するために使用される数字は、第１のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列内の相当す
るアミノ酸を識別するために使用される数字に基づく。
「融合」または「キメラ」分子は、天然においては自然に結合されない第２のアミノ酸
配列と結合した第１のアミノ酸配列を含む。通常別個のタンパク質内に存在するアミノ酸
配列は、融合ポリペプチド内で結合され得るか、または通常同じたんぱく質内に存在する
アミノ酸配列が、融合ポリペプチド、例えば、本発明の第ＶＩＩＩ因子ドメインと免疫グ
ロブリンＦｃドメインとの融合内の新しい配置に配置され得る。融合タンパク質は、例え
ば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチ
ドを作成及び翻訳することによって、作成される。キメラタンパク質は、共有結合、非ペ
プチド結合、または非共有結合によって第１のアミノ酸配列に会合する第２のアミノ酸配
列をさらに含むことができる。
本明細書において使用される場合、「半減期」という用語は、インビボにおける特定の
ポリペプチド生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与される量の半分が動物内の循
環及び／または他の組織から取り除かれるために必要な時間によって表され得る。所与の
ポリペプチドのクリアランス曲線が、時間の関数として構造化されるとき、その曲線は、
通常、急速なα相とより長いβ相とを有する二相性である。α相は、典型的には、血管内
外の空間の間の投与されたポリペプチドの平衡状態を表し、部分的には、ポリペプチドの
サイズによって決定される。β相は、典型的には、血管内空間におけるポリペプチドの異
化を表す。いくつかの実施形態において、本発明のキメラ分子は単相性であり、そのため
、α相は有しないが、単一のβ相のみを有する。それ故に、ある特定の実施形態において
、本明細書において使用される場合、半減期という用語は、β相におけるポリペプチドの
半減期を指す。ヒトにおけるヒト抗体の典型的なβ相半減期は２１日である。
「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される場合、その
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較されている実体の異種とは異なる実
体に由来することを意味する。それ故に、ＶＷＦタンパク質に結合される異種ポリペプチ
ドは、ＶＷＦタンパク質に結合され、かつＶＷＦタンパク質の天然に存在する部分ではな
い、ポリペプチド鎖を意味する。例えば、異種ポリヌクレオチドまたは抗原は、異なる種
、一個体の異なる細胞型、または別の個体の細胞の同じもしくは異なる型に由来し得る。
「結合された（ｌｉｎｋｅｄ）」、「融合された」、または「接続された」という用語
は、本明細書において使用される場合、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に結
合された（ｊｏｉｎｅｄ）第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す（例えば、
それぞれペプチド結合、またはホスホジエステル結合を介して）。「共有結合的に結合し
た」、または「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｌｉｎｋａｇｅ）」という用語は、共有結
合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、または
一緒に結合される２つの部分の間の１個以上のアミノ酸、例えば、リンカーを指す。第１
のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列に直
接結合され得るか、または代替的に、介在配列が、第１の配列を第２の配列に結合するこ
とができる。「結合された」、「融合された」、または「接続された」という用語は、Ｃ
末端またはＮ末端での第１のアミノ酸配列の第２のアミノ酸配列への融合を意味するだけ
でなく、第１のアミノ酸配列（または、第２のアミノ酸配列）全体の、第２のアミノ酸配
列（または、第１のアミノ酸配列）内の任意の２個のアミノ酸内への挿入も含む。一実施
形態において、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第２のアミ
ノ酸配列に結合され得る。第１のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリン
カーによって第２のヌクレオチド配列に結合され得る。リンカーは、ペプチドもしくはポ
リペプチド（ポリペプチド鎖において）、またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（
ヌクレオチド鎖において）、または任意の化学的部分（リペプチド及びポリヌクレオチド
鎖の双方において）であり得る。共有結合は、時として、（−）またはハイフンとして示
される。
本明細書内において使用される場合、「〜と会合する」という用語は、第１のアミノ酸
鎖と第２のアミノ酸鎖との間に形成される共有結合または非共有結合を指す。一実施形態
において、「〜と会合する」という用語は、共有結合、非ペプチド結合、または非共有結
合を意味する。いくつかの実施形態において、この会合は、コロン、すなわち、（：）に
よって示される。別の実施形態において、それは、ペプチド結合以外の共有結合を意味す
る。他の実施形態において、「共有結合的に会合する」という用語は、本明細書内におい
て使用される場合、共有結合、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、１個以上のア
ミノ酸（例えば、リンカー）による２つの部分間の会合を意味する。例えば、アミノ酸シ
ステインは、ジスルフィド結合を形成することができる、または第２のシステイン残基上
のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。大半の天然に存在するＩｇＧ分
子内で、ＣＨ１及びＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって会合し、その２つの重鎖は、
Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用して２３９及び２４２（２２６位または２２９位、Ｅ
Ｕ番号付けシステム）に相当する位置で２つのジスルフィド結合によって会合する。共有
結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ（σ
）結合、パイ（π）結合、デルタ（δ）結合、グリコシド結合、不可知論的結合、曲がっ
た結合、双極性結合、パイ背面結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結
合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数、または反結合が挙げられるが、これらに限定さ
れない。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオン−π結合も
しくは塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素複合体、低障壁水素
結合、もしくは対称的水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械結合、
ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー的な力、
または化学的極性が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「切断部位」または「酵素的切断部位」は、酵素に
よって認識される部位を指す。一実施形態において、ポリペプチドは、凝固カスケード中
に活性化される酵素によって切断される酵素的切断部位を有するため、そのような部位の
切断は血栓形成の部位で起こる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質及び第２
の異種部分を接続するＦＶＩＩＩリンカーは、切断部位を含むことができる。例となるそ
のような部位としては、例えば、トロンビン、第ＸＩａ因子、または第Ｘａ因子に認識さ
れるものが挙げられる。例となるＦＸＩａ切断部位としては、例えば、ＴＱＳＦＮＤＦＴ
Ｒ（配列番号２７）及びＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号２８）が挙げられる。例となる
トロンビン切断部位としては、例えば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号２９）、ＴＴＫ
ＩＫＰＲ（配列番号３０）、ＬＶＰＲＧ（配列番号３１）、及びＡＬＲＰＲ（配列番号２
６のアミノ酸１〜５）が挙げられる。他の酵素的切断部位は、当該技術分野において公知
である。トロンビンによって切断され得る切断部位は、本明細書内では「トロンビン切断
部位」と称される。
本明細書において使用される場合、「プロセシング部位」または「細胞内プロセシング
部位」という用語は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素の標的であるポリペプチド中
の酵素的切断部位の種類を指す。一実施形態において、そのような酵素は、ゴルジルーメ
ンからトランスゴルジ区画への輸送中に機能する。細胞内プロセシング酵素は、細胞から
のタンパク質の分泌の前にポリペプチドを切断する。そのようなプロセシング部位の例と
しては、例えば、エンドペプチダーゼのＰＡＣＥ／フューリン（ＰＡＣＥは、Ｐａｉｒｅ
ｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（対の塩基性
アミノ酸開裂酵素）の頭字語である）メンバーによって標的とされるものが挙げられる。
これらの酵素は、ゴルジ膜へ局在し、配列モチーフＡｒｇ−［任意の残基］−（Ｌｙｓま
たはＡｒｇ）−Ａｒｇのカルボキシ末端側上のタンパク質を切断する。本明細書において
使用される場合、酵素の「フューリン」ファミリーは、例えば、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐ
ｃ３としても知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としても知られる）、ＰＣＳＫ３（フュー
リンもしくはＰＡＣＥとしても知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としても知られる）、Ｐ
ＣＳＫ５（ＰＣ５もしくはＰＣ６としても知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としても
知られる）、またはＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、もしくはＳＰＣ７としても知
られる）を含む。他のプロセシング部位は当該技術分野において公知である。「プロセス
可能なリンカー」という用語は、本明細書においては、細胞内プロセシング部位を含むリ
ンカーを指す。
「フューリン」という用語は、ＥＣ番号３．４．２１．７５．に相当する酵素を指す。
フューリンは、ＰＡＣＥ（Ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａ
ｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（対の塩基性アミノ酸開裂酵素））としても知られる、サブチリ
シン様プロタンパク質転換酵素である。フューリンは、不活性な前駆体タンパク質の区域
を削除し、それらを生物学的に活性なタンパク質に変換する。その細胞内輸送の間に、プ
ロペプチドは、ゴルジ内のフューリン酵素によって成熟ＶＷＦ分子から切断される。
１つを超えるプロセシングまたは切断部位を含む構築物において、そのような部位は同
じかまたは異なり得ることが理解されよう。
止血障害は、本明細書内において使用される場合、フィブリン血栓を形成する能力の障
害、またはそれができないことに起因して、自然発症的に、または外傷の結果としてのい
ずれかでの出血傾向を特徴とする遺伝または獲得された病態を意味する。そのような障害
の例としては、血友病が挙げられる。その３つの主な形態は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子
欠乏症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症、または「クリスマス病」）、及び血友病Ｃ（第
ＸＩ因子欠乏症、軽度の出血傾向）である。他の止血障害としては、例えば、フォンヴィ
レブランド病、第ＸＩ欠乏症（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠乏症、フィブリノーゲン
、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、もしくは第ＸＩＩＩ因子の欠乏
もしくは構造的異常、ＧＰＩｂの欠陥もしくは欠乏であるベルナール−スリエ症候群が挙
げられる。ＶＷＦのための受容体、ＧＰＩｂは、欠陥があり得、一次血栓形成（一次止血
）の欠如及び出血増加傾向）、ならびにＧｌａｎｚｍａｎ及びＮａｅｇｅｌｉの血小板無
力症（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ血小板無力症）につながり得る。肝不全（急性及び慢性型）に
おいては、肝臓による凝固因子の不十分な産生があり、これが出血のリスクを増加させる
場合がある。
本発明のキメラ分子を、予防的に使用することができる。本明細書において使用される
場合、「予防的治療」は、出血発症の前の分子の投与を指す。一実施形態において、一般
的な止血薬を必要とする対象は、手術を受けている、または手術を受けようとしている。
本発明のキメラタンパク質は、手術の前または後に予防薬として投与することができる。
本発明のキメラタンパク質は、急性の出血発症を制御するために、手術中または手術後に
投与することができる。手術は、肝臓移植、肝臓切除術、歯科処置、または幹細胞移植を
含み得るが、これらに限定されない。
本発明のキメラ分子はまた、オンデマンド（「発症時」とも称される）治療にも使用さ
れる。「オンデマンド治療」または「発症時治療」という用語は、出血発症の症状に応じ
た、または出血を引き起こし得る活動の前の、キメラ分子の投与を指す。一態様において
、オンデマンド（発症時）治療は、損傷の後などの出血が始まるとき、または手術の前な
ど出血が予想されるときに対象に施すことができる。別の態様において、オンデマンド治
療は、コンタクトスポーツなどの出血のリスクが増加する活動の前に施すことができる。
本明細書において使用される場合、「急性出血」という用語は、根本的な原因が何であ
れ出血発症を指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝的な出血性疾患（例えば、第Ｖ
ＩＩ因子欠乏症）血小板障害、凝固因子に対する抗体の発生に起因する耐性を有し得る。
治療する、治療、治療することは、本明細書において使用される場合、例えば、疾患も
しくは病態の重症度の減少、疾患経過の存続期間の減少、疾患もしくは病態に関連した１
つ以上の症状の緩和、疾患もしくは病態を有する対象に対して、疾患もしくは病態を必ず
しも治さずに薬効を提供すること、または疾患もしくは病態と関連した１つ以上の症状の
予防を指す。一実施形態において、「治療すること」または「治療」は、本発明のキメラ
分子を投与することによって、対象におけるＦＶＩＩＩトラフベルを少なくとも約１ＩＵ
／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７
ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ
／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ
／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味
する。別の実施形態において、治療することまたは治療は、ＦＶＩＩＩトラフレベルを約
１〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約２〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約３〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約４〜約２
０ＩＵ／ｄＬ、約５〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約６〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約７〜約２０ＩＵ／
ｄＬ、約８〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約９〜約２０ＩＵ／ｄＬ、または約１０〜約２０ＩＵ／
ｄＬに維持することを意味する。疾患または病態の治療またはそれを治療することはまた
、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を、非血友病対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約
１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１
３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％に匹敵するレベ
ルに維持することも含む。治療に必要とされる最小トラフレベルは、１つ以上の公知の方
法によって測定することができ、各人のために調整（増加または減少）することができる
。
ＩＩ． キメラ分子
本発明のキメラ分子は、ＶＷＦタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質が融合される別
の部分からのＶＷＦタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質の放出を改善するために設計
される。本発明は、損傷の部位で迅速かつ効果的に切断することができるトロンビン切断
可能リンカーを提供する。本発明の一態様において、キメラ分子は、フォンヴィレブラン
ド因子（ＶＷＦ）タンパク質、異種部分（Ｈ１）、ＸＴＥＮ配列、及びＶＷＦタンパク質
を異種部分と接続するＶＷＦリンカーを含むことができ、該ＶＷＦリンカーは、（ｉ）第
ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）からのａ２領域、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉ
ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１
非活性部位相互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、
または（ｖ）それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含み、該ＸＴＥＮ
配列は、ＶＷＦタンパク質、異種部分（Ｈ１）、ＶＷＦリンカー、またはそれらの任意の
組み合わせに接続される。本発明の別の態様において、キメラ分子は、ＶＷＦタンパク質
、異種部分（Ｈ１）、及びＶＷＦタンパク質と異種部分（Ｈ１）とを接続するＶＷＦリン
カーを含む第１のポリペプチド鎖と、ＦＶＩＩＩタンパク質及びＸＴＥＮ配列を含む第２
のポリペプチド鎖とを含むことができ、第１のポリペプチド鎖内のＶＷＦリンカーは、（
ｉ）ＦＶＩＩＩからのａ２領域、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶＩ
ＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相
互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または（ｖ）
それらの任意の組み合わせを含み、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は互い
に会合する。
本発明の他の実施形態において、キメラ分子は、ＦＶＩＩＩリンカーを介して異種部分
に融合されるＦＶＩＩＩタンパク質を含むポリペプチド鎖を含み、該ＦＶＩＩＩリンカー
は、（ｉ）ＦＶＩＩＩからのａ２領域、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）
ＦＶＩＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性
部位相互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または
（ｖ）それらの任意の組み合わせを含む。
ＩＩ．Ａ． ＶＷＦ、ＸＴＥＮ、ＶＷＦリンカーを有するキメラ分子
本発明は、ＶＷＦリンカーを介してＸＴＥＮ配列に融合されるＶＷＦタンパク質を含む
キメラ分子を提供し、該ＶＷＦリンカーは、（ｉ）ＦＶＩＩＩからのａ２領域、（ｉｉ）
ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ
−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ
酸である、トロンビン切断部位、または（ｖ）それらの任意の組み合わせから選択される
ポリペプチドを含む。
一実施形態において、キメラ分子は、ＶＷＦタンパク質、異種部分（Ｈ１）、ＸＴＥＮ
配列、及びＶＷＦタンパク質を異種部分と接続するＶＷＦリンカーを含み、該ＸＴＥＮ配
列は、ＶＷＦタンパク質とＶＷＦリンカーとの間に位置し、該ＶＷＦリンカーは、（ｉ）
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）からのａ２領域、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（
ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ
１非活性部位相互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位
、または（ｖ）それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含む。別の実施
形態において、キメラ分子は、ＶＷＦタンパク質、異種部分（Ｈ１）、ＸＴＥＮ配列、及
びＶＷＦタンパク質を異種部分と接続するＶＷＦリンカーを含み、該ＸＴＥＮ配列は、Ｖ
ＷＦリンカーと異種部分との間に位置し、該ＶＷＦリンカーは、（ｉ）ＦＶＩＩＩからの
ａ２領域、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ３領域、
（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含み
、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または（ｖ）それらの任意の組み合
わせから選択されるポリペプチドを含む。
他の実施形態において、本キメラ分子は、ＦＶＩＩＩタンパク質を含むポリペプチド鎖
をさらに含み、ＶＷＦタンパク質を含む第１の鎖とＦＶＩＩＩタンパク質を含む第２の鎖
とが互いに会合する。一例において、会合は共有結合、例えば、ジスルフィド結合、会合
であり得る。依然として他の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質を含むポリペプチ
ド鎖は、追加のＸＴＥＮ配列をさらに含む。追加のＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク
質のＮ末端もしくはＣ末端に結合され得るか、または互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩア
ミノ酸の間に挿入され得る。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質を含む
鎖は、第２の異種部分（Ｈ２）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩ
タンパク質は、ＦＶＩＩＩリンカーを介して第２の異種部分に融合される。ある特定の実
施形態において、ＦＶＩＩＩリンカーは、ＶＷＦタンパク質と異種部分とを接続するＶＷ
Ｆリンカーと同一である。他の実施形態において、ＦＶＩＩＩリンカーは、ＶＷＦタンパ
ク質と異種部分とを接続するＶＷＦリンカーと異なる。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、（ｉ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ
２−Ｘ２−Ｃ、（ｉｉ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｃ、（ｉｉｉ）Ｖ−
Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ２−Ｃ、（ｉｖ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２
−Ｌ２−Ｃ、（ｖ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、（ｖｉ）Ｖ−Ｘ１
−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、（ｖｉｉ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１
−Ｌ１−Ｖ、（ｖｉｉｉ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｉｘ）Ｃ−
Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｘ）Ｃ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−
Ｘ１−Ｖ、（ｘｉ）Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｖ、または（ｘｉｉ）
Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖから選択される式を含み、式中、ＶはＶ
ＷＦタンパク質であり、Ｌ１はＶＷＦリンカーであり、Ｌ２は任意のＦＶＩＩＩリンカー
であり、Ｈ１は第１の異種部分であり、Ｈ２は第２の異種部分であり、Ｘ１はＸＴＥＮ配
列であり、Ｘ２は任意のＸＴＥＮ配列であり、ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり、Ｃ（Ｘ
２）はＸＴＥＮ配列に融合されるＦＶＩＩＩタンパク質であり、該ＸＴＥＮ配列は互いに
隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に挿入され、（−）はペプチド結合または１個以
上のアミノ酸であり、（：）はＨ１とＨ２との間の共有結合である。
いくつかの実施形態において、キメラ分子内のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列
であり得る第３の異種部分（Ｈ３）を含む。他の実施形態において、キメラ分子内のＦＶ
ＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列であり得る第４の異種部分（Ｈ４）を含む。依然とし
て他の実施形態において、キメラ分子内のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列であり
得る第５の異種部分（Ｈ５）を含む。さらに他の実施形態において、キメラ分子内のＦＶ
ＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列であり得る第６の異種部分（Ｈ６）を含む。ある特定
の実施形態において、第３の異種部分（Ｈ３）、第４の異種部分（Ｈ４）、第５の異種部
分（Ｈ５）、及び第６の異種部分（Ｈ６）のうちの１つ以上は、キメラ分子の半減期を延
長することが可能である。いくつかの実施形態において、第３の異種部分（Ｈ３）、第４
の異種部分（Ｈ４）、第５の異種部分（Ｈ５）、及び第６の異種部分（Ｈ６）は、ＦＶＩ
ＩＩのＣ末端もしくはＮ末端に結合されるか、またはＦＶＩＩＩタンパク質の２個のアミ
ノ酸の間に挿入される。
ＩＩ．Ｂ． ＦＶＩＩＩ、ＸＴＥＮ、ＶＷＦタンパク質、ＶＷＦリンカーを有するキメラ
分子
本発明はまた、ＶＷＦタンパク質、異種部分（Ｈ１）、及びＶＷＦタンパク質と異種部
分（Ｈ１）とを接続するＶＷＦリンカーを含む第１のポリペプチド鎖と、ＦＶＩＩＩタン
パク質及びＸＴＥＮ配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含むキメラ分子であって、第１
のポリペプチド鎖内のＶＷＦリンカーが、（ｉ）ＦＶＩＩＩからのａ２領域、（ｉｉ）Ｆ
ＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−
Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸
である、トロンビン切断部位、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含み、第１のポ
リペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が互いに会合する、キメラ分子も提供する。一実施
形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に接続さ
れるか、または互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に挿入される。別の実施形
態において、本キメラ分子は、ＶＷＦタンパク質、異種部分、ＶＷＦリンカー、またはそ
れらの任意の組み合わせに接続される追加のＸＴＥＮ配列をさらに含む。他の実施形態に
おいて、本キメラ分子は第２の異種部分（Ｈ２）をさらに含む。他の実施形態において、
キメラ分子の第２の異種部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、または双方に接
続される。依然として他の実施形態において、第２の異種部分は、ＦＶＩＩＩリンカーを
介してＦＶＩＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列に接続される。さらに他の実施形態にお
いて、ＦＶＩＩＩリンカーはＶＷＦリンカーと同一である。いくつかの実施形態において
、ＦＶＩＩＩリンカーはＶＷＦリンカーと異なる。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、（ｉ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ
２−Ｘ２−Ｃ、（ｉｉ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｃ、（ｉｉｉ）Ｖ−
Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ２−Ｃ、（ｉｖ）Ｖ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２
−Ｌ２−Ｃ、（ｖ）Ｖ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、（ｖｉ）Ｖ−Ｘ１
−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ（Ｘ２）、（ｖｉｉ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１
−Ｌ１−Ｖ、（ｖｉｉｉ）Ｃ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｉｘ）Ｃ−
Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖ、（ｘ）Ｃ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−
Ｘ１−Ｖ、（ｘｉ）Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｖ、または（ｘｉｉ）
Ｃ（Ｘ２）−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｖから選択される式を含み、式中、ＶはＶ
ＷＦタンパク質であり、Ｌ１はＶＷＦリンカーであり、Ｌ２は任意のＦＶＩＩＩリンカー
であり、Ｈ１は第１の異種部分であり、Ｈ２は第２の異種部分であり、Ｘ１は任意のＸＴ
ＥＮ配列であり、Ｘ２はＸＴＥＮ配列であり、ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり、Ｃ（Ｘ
２）はＸＴＥＮ配列に融合されるＦＶＩＩＩタンパク質であり、該ＸＴＥＮ配列は互いに
隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に挿入され、（−）はペプチド結合または１個以
上のアミノ酸であり、（：）はＨ１とＨ２との間の共有結合である。一実施形態において
、ＶＷＦリンカー及びＦＶＩＩＩリンカーは同じであり得る。別の実施形態において、Ｖ
ＷＦリンカー及びＦＶＩＩＩリンカーは異なる。
ある特定の実施形態において、キメラ分子のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列で
あり得る第３の異種部分（Ｈ３）を含む。他の実施形態において、キメラ分子のＦＶＩＩ
Ｉタンパク質は、ＸＴＥＮ配列である第４の異種部分（Ｈ４）を含む。依然として他の実
施形態において、キメラ分子のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列であり得る第５の
異種部分（Ｈ５）を含むさらに他の実施形態において、キメラ分子内のＦＶＩＩＩタンパ
ク質は、ＸＴＥＮ配列であり得る第６の異種部分（Ｈ６）を含む。ある特定の実施形態に
おいて、第３の異種部分（Ｈ３）、第４の異種部分（Ｈ４）、第５の異種部分（Ｈ５）、
及び第６の異種部分（Ｈ６）のうちの１つ以上は、キメラ分子の半減期を延長することが
可能である。いくつかの実施形態において、第３の異種部分（Ｈ３）、第４の異種部分（
Ｈ４）、第５の異種部分（Ｈ５）、及び／または第６の異種部分（Ｈ６）は、ＦＶＩＩＩ
のＣ末端もしくはＮ末端に結合されるか、またはＦＶＩＩＩタンパク質の２個のアミノ酸
の間に挿入される。
ＩＩ．Ｃ． ＦＶＩＩＩ、ＸＴＥＮ、及びＦＶＩＩＩリンカーを有するキメラ分子
本発明のキメラ分子は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、及び（ｉ）ＦＶＩＩＩ
からのａ２領域、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ３
領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフ
を含み、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または（ｖ）それらの任意の
組み合わせを含むＦＶＩＩＩリンカーによって融合される異種部分を含むことができる。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、２つのポリペプチド鎖、ＦＶＩＩＩリンカ
ーを介して第１のＦｃ領域に融合されるＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の鎖と、Ｆｃ領
域に融合されるＶＷＦタンパク質（例えば、ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメイン）を
含む第２の鎖とを含み、第１のポリペプチド鎖内のＦＶＩＩＩリンカーは、（ｉ）ＦＶＩ
ＩＩからのａ２領域、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩからの
ａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチ
ーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または（ｖ）それらの任
意の組み合わせを含み、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は互いに会合し、
ＸＴＥＮ配列は、第１のポリペプチド（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質、リンカー、もし
くは第１のＦｃ領域のＮ末端もしくはＣ末端、またはＦＶＩＩＩタンパク質内）、第２の
ポリペプチド（例えば、ＶＷＦタンパク質もしくはＦｃ領域のＮ末端もしくはＣ末端、ま
たはＦＶＩＩＩタンパク質内）、または双方に結合される。特定の実施形態において、第
１のポリペプチド鎖内のリンカーは、ＦＶＩＩＩからのａ２領域を含む。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、（ｉ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ
１−Ｘ１−Ｃ、（ｉｉ）Ｖ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｘ１−Ｃ、（ｉｉｉ）Ｖ−
Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１−Ｌ１−Ｃ、（ｉｖ）Ｖ−Ｘ２−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｘ１
−Ｌ１−Ｃ、（ｖ）Ｖ−Ｌ２−Ｘ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｃ（Ｘ１）、（ｖｉ）Ｖ−Ｘ２
−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｃ（Ｘ１）、（ｖｉｉ）Ｃ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２
−Ｌ２−Ｖ、（ｖｉｉｉ）Ｃ−Ｘ１−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｖ、（ｉｘ）Ｃ−
Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｖ、（ｘ）Ｃ−Ｌ１−Ｘ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−
Ｘ２−Ｖ、（ｘｉ）Ｃ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｘ２−Ｌ２−Ｖ、または（ｘｉｉ）
Ｃ（Ｘ１）−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｘ２−Ｖから選択される式を含み、式中、ＶはＶ
ＷＦタンパク質であり、Ｌ１はＦＶＩＩＩリンカーであり、Ｌ２は任意のＶＷＦリンカー
であり、Ｈ１は第１の異種部分であり、Ｈ２は第２の異種部分であり、Ｘ１は任意のＸＴ
ＥＮ配列であり、Ｘ２は任意のＸＴＥＮ配列であり、ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり、
Ｃ（Ｘ１）はＸＴＥＮ配列に融合されるＦＶＩＩＩタンパク質であり、該ＸＴＥＮ配列は
互いに隣接する２個のＦＶＩＩＩアミノ酸の間に挿入され、（−）はペプチド結合または
１個以上のアミノ酸であり、（：）はＨ１とＨ２との間の共有結合であり、少なくとも１
つのＸＴＥＮ配列がキメラ分子内に存在する。一実施形態において、ＶＷＦリンカー及び
ＦＶＩＩＩリンカーは同じである。別の実施形態において、ＶＷＦリンカー及びＦＶＩＩ
Ｉリンカーは異なる。
ＩＩ．Ｄ． キメラ分子の構成要素
ＩＩ．Ｃ．１． ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカー
本発明のキメラ分子に有用なＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、ＶＷＦタン
パク質を異種部分と、またはＦＶＩＩＩタンパク質を異種部分と融合するトロンビン切断
可能リンカーである。一実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは
、ＦＶＩＩＩのａ１領域を含む。別の実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩ
Ｉリンカーは、ＦＶＩＩＩのａ２領域を含む。他の実施形態において、ＶＷＦリンカーま
たはＦＶＩＩＩリンカーは、ＦＶＩＩＩのａ３領域を含む。さらに他の実施形態において
、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡ
Ｒ１非活性部位相互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部
位を含む。
一実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、全長成熟ＦＶＩＩ
Ｉに相当するＭｅｔ３３７〜Ａｒｇ３７２と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、
約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一のアミノ酸配
列を含むａ１領域を含み、該ａ１領域はトロンビンによって切断されることが可能である
。別の実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、全長成熟ＦＶＩ
ＩＩに相当するアミノ酸３３７〜３７４と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約
９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一のアミノ酸配列
を含むａ１領域を含み、該ａ１領域はトロンビンによって切断されることが可能である。
他の実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、追加のアミノ酸を
、例えば、１、２、３、４、５、１０個以上、さらに含む。特定の実施形態において、Ｖ
ＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、ＩＳＭＫＮＮＥＥＡＥＤＹＤＤＤＬＴＤＳＥ
ＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶ（配列番号５）を含む。
いくつかの実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、全長成熟
ＦＶＩＩＩに相当するＧｌｕ７２０〜Ａｒｇ７４０と少なくとも約８０％、約８５％、約
９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一のア
ミノ酸配列を含むａ２領域を含み、該ａ２領域はトロンビンによって切断されることが可
能である。他の実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、全長成
熟ＦＶＩＩＩに相当するアミノ酸７１２〜７４３と少なくとも約８０％、約８５％、約９
０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一のアミ
ノ酸配列を含むａ２領域を含む。依然として他の実施形態において、ＶＷＦリンカーまた
はＦＶＩＩＩリンカーは、追加のアミノ酸を、例えば、１、２、３、４、５、１０個以上
、さらに含む。特定の実施形態において、ＶＷＦリンカーは、ＩＳＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤ
ＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳ（配列番号４）を含む。
ある特定の実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、全長成熟
ＦＶＩＩＩに相当するＧｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９と少なくとも約８０％、約８５％
、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一
のアミノ酸配列を含むａ３領域を含み、該ａ３領域はトロンビンによって切断されること
が可能である。いくつかの実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカー
は、全長成熟ＦＶＩＩＩに相当するアミノ酸１６４９〜１６９２と少なくとも約８０％、
約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１０
０％同一のアミノ酸配列を含むａ３領域を含み、該ａ３領域はトロンビンによって切断さ
れることが可能である。他の実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカ
ーは、追加のアミノ酸を、例えば、１、２、３、４、５、１０個以上、さらに含む。特定
の実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、ＩＳＥＩＴＲＴＴＬ
ＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱ（配列
番号６）を含む。
他の実施形態において、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ
（配列番号３）とＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフとを含むトロンビン切断部位を含
み、該ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフは、Ｓ−Ｆ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｎ（配列番号７）
を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフは、Ｐ、Ｐ
−Ｎ、Ｐ−Ｎ−Ｄ、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ（配列番号８）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ（配列番号９）
、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ（配列番号１０）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ（配列番号１
１）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ（配列番号１２）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ
−Ｆ−Ｗ（配列番号１３）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ（配列番号１４）
、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ（配列番号２０）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ
−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ−Ｅ（配列番号２１）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ
−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ（配列番号２２）、Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｐ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｄ−Ｅ
−Ｅ−Ｓ（配列番号２３）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸配
列をさらに含む。他の実施形態において、Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒを含むトロンビン切断部位の脂
肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択
される。特定の実施形態において、トロンビン切断部位は、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒを含む。いく
つかの実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部位（Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ）がＶＷ
ＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーとそれぞれ置換された（すなわち、ＰＡＲ１非活性
部位相互作用モチーフなしの）場合にトロンビンがトロンビン切断部位（例えば、Ｌ−Ｖ
−Ｐ−Ｒ）を切断するよりも速く、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーを切断する
。いくつかの実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部位（例えば、Ｌ−Ｖ−
Ｐ−Ｒ）がＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーと置換された場合にトロンビンがト
ロンビン切断部位（例えば、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ）を切断するよりも、少なくとも約１０倍、
少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、
少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、
または少なくとも約１００倍速く、ＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーを切断する
。
いくつかの実施形態において、（ｉ）ａ１領域、（ｉｉ）ａ２領域、（ｉｉｉ）ａ３領
域、または（ｉｖ）トロンビン切断部位Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ及びＰＡＲ１非活性部位相互作用
モチーフを含むＶＷＦリンカーまたはＦＶＩＩＩリンカーは、少なくとも約２、５、１０
、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０
、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０
、２４０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０
、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、
１６００、１８００、または２０００アミノ酸の長さを有する１個以上のアミノ酸をさら
に含む。一実施形態において、１個以上のアミノ酸は、ｇｌｙペプチドを含む。別の実施
形態において、１個以上のアミノ酸は、ＧｌｙＧｌｙを含む。他の実施形態において、１
個以上のアミノ酸は、ＩｌｅＳｅｒを含む。依然として他の実施形態において、１個以上
のアミノ酸は、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含む。さらに他の実施形態において、１個以上
のアミノ酸は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎの式を有するｇｌｙ
／ｓｅｒペプチドを含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０
、７０、８０、または１００から選択される正整数である。いくつかの実施形態において
、１個以上のアミノ酸は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号８９）または（Ｇｌｙ４Ｓｅ
ｒ）４（配列番号９０）を含む。
ＩＩ．Ｃ．２． ＶＷＦタンパク質
ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしても知られる）は、血漿内に存在する大きな多量体の糖タンパ
ク質であり、内皮細胞（バイベルパラーデ小体内）、巨核球（血小板のα顆粒）、及び内
皮下結合組織内で構成的に産生される。基本的なＶＷＦ単量体は、２８１３アミノ酸タン
パク質である。すべての単量体は、特定の機能を有する数多くの特定のドメイン、Ｄ’／
Ｄ３ドメイン（第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂ受容体、ヘ
パリン、及び／または恐らくはコラーゲンに結合）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合）
、Ｃ１ドメイン（ＲＧＤドメインが、血小板インテグリンαＩＩｂβ３に、これが活性化
されるときに結合する）、及びタンパク質のＣ末端の端に「システインノット」ドメイン
（ＶＷＦは、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）、及
びβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）を含む。
「ＶＷＦタンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、内因性ＶＷＦ
のＦＶＩＩＩへの結合を抑制することが可能である、Ｄ’ドメイン及びＤ３ドメインを含
む全長ＶＷＦタンパク質または機能ＶＷＦ断片を含むが、これらに限定されない。一実施
形態において、ＶＷＦタンパク質は、ＦＶＩＩＩに結合する。別の実施形態において、Ｖ
ＷＦタンパク質は、ＦＶＩＩＩ上のＶＷＦ結合部位を遮断し、それによってＦＶＩＩＩの
内因性ＶＷＦとの相互作用を抑制する。他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、Ｖ
ＷＦクリアランス経路によって取り除かれない。ＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦのこれらの
活性を保持する誘導体、変異体、突然変異体、または類似体を含む。
ヒトＶＷＦのための２８１３単量体アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ内の受託番号＿Ｎ
Ｐ＿０００５４３．２＿＿として報告される。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列
は、Ｇｅｎｂａｎｋ内の受託番号＿＿ＮＭ＿０００５５２．３＿として報告される。ヒト
ＶＷＦのヌクレオチド配列は、配列番号１として指定される。配列番号２は、配列番号１
によってコードされるアミノ酸配列である。ＶＷＦの各ドメインを表１に記載する。
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853
ＶＷＦタンパク質は、本明細書において使用される場合、ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ
３ドメインを含むことができ、ＶＷＦタンパク質は、ＦＶＩＩＩに結合し、内因性ＶＷＦ
（全長ＶＷＦ）のＦＶＩＩＩへの結合を抑制する。Ｄ’ドメイン及びＤ３ドメインを含む
ＶＷＦタンパク質は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２
ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、
Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１つ以上の断片、またはそれらの任意の組み合わ
せから選択されるＶＷＦドメインをさらに含むことができる。一実施形態において、ＶＷ
Ｆタンパク質は、（１）ＶＷＦのＤ’及びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、（２）
ＶＷＦのＤ１、Ｄ’、及びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、（３）ＶＷＦのＤ２、
Ｄ’、及びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、及
びＤ３ドメイン、もしくはそれらの断片、または（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３
、もしくはＡ１ドメイン、もしくはそれらの断片、を含む、それらから本質的になる、ま
たはそれらからなる。本明細書内に記載されるＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦクリアランス
受容体結合部位を含有しない。本発明のＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦタンパク質に結合さ
れる、または融合される任意の他の配列を含むことができる。例えば、本明細書内に記載
されるＶＷＦタンパク質は、シグナルペプチドをさらに含むことができる。
一実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合する、または
それと会合する。ＦＶＩＩＩタンパク質に結合する、またはそれと会合することによって
、本発明のＶＷＦタンパク質は、ＦＶＩＩＩをプロテアーゼ切断及びＦＶＩＩＩ活性化か
ら保護し、ＦＶＩＩＩの重鎖及び軽鎖を安定化し、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩ
Ｉのクリアランスを防止することができる。別の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は
ＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、またはそれと会合し、ＦＶＩＩＩタンパク質のリン脂質
及び活性化タンパク質Ｃへの結合を遮断する、または防止する。ＦＶＩＩＩタンパク質の
内因性全長ＶＷＦとの結合を防止することまたは抑制することによって、本発明のＶＷＦ
タンパク質は、内因性ＶＷＦクリアランス受容体によるＦＶＩＩＩのクリアランスを減少
させ、そのため、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する。したがって、ＦＶＩＩＩタ
ンパク質の半減期延長は、ＶＷＦクリアランス受容体結合部位を欠き、それによって、Ｖ
ＷＦクリアランス受容体結合部位を含有する内因性ＶＷＦからＦＶＩＩＩタンパク質を守
る及び／または保護するＶＷＦタンパク質とのＦＶＩＩＩタンパク質の会合が原因である
。ＶＷＦタンパク質に結合されるまたはそれによって保護されるＦＶＩＩＩタンパク質は
また、ＦＶＩＩＩタンパク質のリサイクルも可能にする。全長ＶＷＦ分子内のＶＷＦクリ
アランス経路受容体結合部位を排除することにより、本発明のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ
二量体は、ＶＷＦクリアランス経路から守られ、ＦＶＩＩＩ半減期をさらに延長する。
一実施形態において、本発明のＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ド
メインを含み、該Ｄ’ドメインは、配列番号２のアミノ酸７６４〜８６６と少なくとも約
６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、
または１００％同一であり、該ＶＷＦタンパク質は、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合
を防止する。別の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ
３ドメインを含み、該Ｄ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０と少なく
とも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９
％、または１００％同一であり、該ＶＷＦタンパク質は、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの
結合を防止する。いくつかの実施形態において、本明細書内に記載されるＶＷＦタンパク
質は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、
ＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含む、それらから本質的になる、またはそれら
からなり、該ＶＷＦタンパク質は内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を防止する。他の実
施形態において、ＶＷＦタンパク質は、配列番号２のアミノ酸２３〜１２４０と少なくと
も６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
、または１００％同一であるＤ１、Ｄ２、Ｄ’及びＤ３ドメインを含む、それらから本質
的になる、またはそれらからなり、該ＶＷＦタンパク質は内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの
結合を防止する。依然として他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、それらに作動
可能に結合されるシグナルペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明のＶＷＦタンパク質は、（１）Ｄ’Ｄ３ドメイン
、Ｄ１Ｄ’Ｄ３ドメイン、Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメイン、またはＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメイン、及
び（２）最大約１０アミノ酸（例えば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から配列
番号２のアミノ酸７６４〜１２５０までの任意の配列）、最大約１５アミノ酸（例えば、
配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２５５まで
の任意の配列）、最大約２０アミノ酸（例えば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０
から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６０までの任意の配列）、最大約２５アミノ酸（
例えば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２
６５までの任意の配列）、または最大約３０アミノ酸（例えば、配列番号２のアミノ酸７
６４〜１２４０から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６０までの任意の配列）の追加の
ＶＷＦ配列を含む、それらから本質的になる、もしくはそれらからなる。特定の実施形態
において、Ｄ’ドメイン及びＤ３ドメインを含む、またはそれらから本質的になるＶＷＦ
タンパク質は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４でも、全長成熟ＶＷＦでもない。
いくつかの実施形態において、Ｄ１Ｄ２ドメインは、Ｄ’Ｄ３ドメインとトランスに発現
される。いくつかの実施形態において、Ｄ１Ｄ２ドメインは、Ｄ’Ｄ３ドメインとシスに
発現される。
他の実施形態において、Ｄ１Ｄ２ドメインに結合されるＤ’Ｄ３ドメインを含むＶＷＦ
タンパク質は、発現時にＤ’Ｄ３ドメインからのＤ１Ｄ２ドメインの切断を可能にする細
胞内プロセシング部位、例えば、（ＰＡＣＥ（フューリン）またはＰＣ５によるプロセシ
ング部位）をさらに含む。細胞内プロセシング部位の非限定的な例は、本明細書の他の箇
所に記載される。
さらに他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、Ｄ’ドメイン及びＤ３ドメインを
含むが、（１）配列番号２のアミノ酸１２４１〜２８１３、（２）配列番号２のアミノ酸
１２７０〜アミノ酸２８１３、（３）配列番号２のアミノ酸１２７１〜アミノ酸２８１３
、（４）配列番号２のアミノ酸１２７２〜アミノ酸２８１３、（５）配列番号２のアミノ
酸１２７３〜アミノ酸２８１３、（６）配列番号２のアミノ酸１２７４〜アミノ酸２８１
３、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸配列を含まない。
依然として他の実施形態において、本発明のＶＷＦタンパク質は、Ｄ’ドメイン、Ｄ３
ドメイン、及びＡ１ドメインに相当するアミノ酸配列を含む、それらから本質的になる、
またはそれらからなり、該アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１４７９と少
なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％、または１００％同一であり、該ＶＷＦタンパク質は、内因性ＶＷＦのＦ
ＶＩＩＩへの結合を防止する。特定の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、配列番号
２のアミノ酸７６４〜１２７４ではない。
いくつかの実施形態において、本発明のＶＷＦタンパク質は、Ｄ’ドメイン及びＤ３ド
メインを含むが、（１）Ａ１ドメイン、（２）Ａ２ドメイン、（３）Ａ３ドメイン、（４
）Ｄ４ドメイン、（５）Ｂ１ドメイン、（６）Ｂ２ドメイン、（７）Ｂ３ドメイン、（８
）Ｃ１ドメイン、（９）Ｃ２ドメイン、（１０）ＣＫドメイン、（１１）ＣＫドメイン及
びＣ２ドメイン、（１２）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、及びＣ１ドメイン、（１３）Ｃ
Ｋドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、（１４）ＣＫドメイン、Ｃ２
ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、（１５）ＣＫドメイン、Ｃ２ド
メイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、及びＢ１ドメイン、（１６）ＣＫ
ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、
及びＤ４ドメイン、（１７）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン
、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、及びＡ３ドメイン、（１８）ＣＫドメイ
ン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ド
メイン、Ａ３ドメイン、及びＡ２ドメイン、（１９）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１
ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ａ３ドメイン、
Ａ２ドメイン、及びＡ１ドメイン、または（２０）それらの任意の組み合わせから選択さ
れる少なくとも１つのＶＷＦドメインを含まない。
さらに他の実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、Ｄ’Ｄ３ドメイン、及び１つ以上
のドメインまたはモジュールを含む。そのようなドメインまたはモジュールの例としては
、２０１２年４月６日オンラインで公開のＺｈｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ、ＤＯ
Ｉ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１２−０１−４０５１３４に開示されるドメイン
及びモジュールが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＶＷＦタンパク質は、
Ｄ’Ｄ３ドメイン、及びＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４Ｎモジュール
、ＶＷＤ４モジュール、Ｃ８−４モジュール、ＴＩＬ−４モジュール、Ｃ１モジュール、
Ｃ２モジュール、Ｃ３モジュール、Ｃ４モジュール、Ｃ５モジュール、Ｃ５モジュール、
Ｃ６モジュール、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上のドメインも
しくはモジュールを含むことができる。
ある特定の実施形態において、本発明のＶＷＦタンパク質は、多量体、例えば、二量体
、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、または高次の多量体を形成する。他の実施
形態において、ＶＷＦタンパク質は、１つのみのＶＷＦタンパク質を有する単量体である
。いくつかの実施形態において、本発明のＶＷＦタンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換
、欠失、付加、または修飾を有することができる。一実施形態において、ＶＷＦタンパク
質は、ＶＷＦタンパク質がジスルフィド結合を形成すること、または二量体もしくは多量
体を形成することができないように、アミノ酸置換、欠失、付加、または修飾を含むこと
ができる。別の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｄ’ドメイン及びＤ３ドメイン内に
ある。特定の実施形態において、本発明のＶＷＦタンパク質は、配列番号２の残基１０９
９、残基１１４２、または双方の残基１０９９及び１１４２に相当する残基において、少
なくとも１つのアミノ酸置換を含有する。少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型ＶＷ
Ｆ内で天然に存在しない任意のアミノ酸であり得る。例えば、アミノ酸置換は、システイ
ン以外の任意のアミノ酸、例えば、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、
リジン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、
グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギ
ニン、またはヒスチジンであり得る。別の例において、アミノ酸置換は、ＶＷＦタンパク
質が多量体を形成することを防止する、または抑制する１個以上のアミノ酸を有する。
いくつかの実施形態において、ＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインに相当
する残基３３６（配列番号２の残基１０９９）におけるシステインからアラニンへのアミ
ノ酸置換、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインに相当する残基３７９（配列番号２の残基１１４２
）におけるシステインからアラニンへのアミノ酸置換、または双方を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書内で有用なＶＷＦタンパク質は、ＦＶＩＩＩと
のその相互作用を改善するため、例えば、ＦＶＩＩＩに対する結合親和性を改善するため
に、さらに修飾され得る。非限定的な例として、ＶＷＦタンパク質は、配列番号２のアミ
ノ酸７６４に相当する残基においてセリン残基、及び配列番号２のアミノ酸７７３に相当
する残基においてリジン残基を含む。残基７６４及び／または７７３は、ＶＷＦタンパク
質のＦＶＩＩＩに対する結合親和性に寄与することができる。他の実施形態において、本
発明に有用なＶＷＦたんぱく質は、他の修飾を有することができ、例えば、該タンパク質
を、ＰＥＧ化、グリコシル化、ＨＥＳ化、またはポリシアル酸化することができる。
ＩＩ．Ｃ．３． 異種部分
ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に、またはＦＶＩＩＩリンカーを介してＦＶ
ＩＩＩタンパク質に融合され得る異種部分は、異種ポリペプチドまたは異種非ポリペプチ
ド部分であり得る。ある特定の実施形態において、異種部分は、当該技術分野において公
知の半減期延長分子であり、ポリペプチド、非ポリペプチド部分、または双方の組み合わ
せを含む。異種ポリペプチド部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質、免疫グロブリン定常領域も
しくはその一部、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、トランスフェリン
もしくはその断片、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、誘導体もしくはその変異体、ヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはそれらの任意の組み合
わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、非ポリペプチド結合部分は、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）
、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態におい
て、それそれが同じまたは異なる分子であり得る、１つ、２つ、３つ以上の異種部分が存
在し得る。
ＩＩ．Ｃ．３．ａ 免疫グロブリン定常領域またはその一部
免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ（定常重）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２等）を示すドメ
インで構成される。アイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＤ、または
ＩｇＥ）に応じて、定常領域は３つまたは４つのＣＨドメインで構成され得る。いくつか
のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ）定常領域は、ヒンジ領域も含有する。Ｊａｎｅｗａｙ
ｅｔ ａｌ．２００１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙを参照。
本発明のキメラタンパク質を産生するための免疫グロブリン定常領域またはその一部は
、多数の異なる供給源から得ることができる。いくつかの実施形態において、免疫グロブ
リン定常領域またはその一部は、ヒト免疫グロブリン由来である。しかしながら、免疫グ
ロブリン定常領域またはその一部は、以下を含む別の哺乳動物種、例えば、齧歯動物（例
えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、または非ヒト霊長類（例えば、チンパン
ジー、マカク）種の免疫グロブリン由来であり得ることが理解される。さらには、免疫グ
ロブリン定常領域またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含
む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４
を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。一実施形態において、ヒトア
イソタイプＩｇＧ１が使用される。
様々な免疫グロブリン定常領域遺伝子配列（例えば、ヒト定常領域遺伝子配列）は、公
的にアクセス可能な寄託物の形態で入手可能である。定常領域ドメイン配列は、特定のエ
フェクター機能を有して（または特定のエフェクター機能を欠いて）、または免疫原性を
減少させるための特定の修飾とともに、選択され得る。抗体及び抗体コード遺伝子の多く
の配列が公開されており、好適なＩｇ定常領域配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、及び／も
しくはＣＨ３配列、またはその一部）は、当該技術分野が認識する技術を使用してこれら
の配列に由来され得る。前述の方法のいずれかを使用して得られる遺伝物質は、次いで、
本発明のポリペプチドを得るために、改変または合成され得る。本発明の範囲は、定常領
域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、変異体、及び突然変異体を包含することがさらに理解されよ
う。
免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応、及び
目的のドメインを増幅するために選択されるプライマーを使用して、クローン作成され得
る。抗体から免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列のクローンを作成するために
、ｍＲＮＡは、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離され、ＤＮＡ、及びＰ
ＣＲによって増幅された抗体遺伝子に逆転写され得る。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，
６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９
６５，１８８号内、及び、例えば、“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔ
ｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅ
ｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｈｏ
ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ ７７：５１；Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９３
．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０）内に詳細に記載される。
本明細書内で使用される免疫グロブリン定常領域は、すべてのドメイン、及びヒンジ領
域、またはその一部を含むことができる。一実施形態において、免疫グロブリン定常領域
またはその一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ
領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む。
本明細書において使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、天然の免疫グロブリン
のＦｃ領域に相当するポリペプチドの部分として、すなわち、二量体のその２つの重鎖の
それぞれのＦｃドメインの会合によって形成されると、定義される。天然のＦｃ領域は、
別のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。
一実施形態において、「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域（す
なわち、重鎖定常領域の第１の残基を１１４であると考え、ＩｇＧ内の残基２１６）で始
まり、抗体のＣ末端で終わる、単一の免疫グロブリン重鎖の部分を指す。したがって、完
全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン
を含む。
免疫グロブリン定常領域のＦｃ領域は、免疫グロブリンアイソタイプに応じて、ＣＨ２
、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン、ならびにヒンジ領域を含むことができる。免疫グロブリ
ンのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、増大された安定性、増大された血清半減期（Ｃ
ａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５を参照）、ならびに
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（米国特許第６，０８６，８７５号、同第６，４８５，７
２６号、同第６，０３０，６１３号、ＷＯ０３／０７７８３４、ＵＳ２００３−０２３５
５３６Ａ１）などのＦｃ受容体への結合を含む、いくつかの望ましい特性をキメラタンパ
ク質に授け、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＦｃＲｎ結合パートナーであり得る。Ｆｃ
Ｒｎは、成人の上皮組織内で活性であり、腸の内腔、肺気道、鼻腔面、膣表面、結腸、及
び直腸の表面に発現される（米国特許第６，４８５，７２６号）。ＦｃＲｎ結合パートナ
ーは、ＦｃＲｎに結合する免疫グロブリンの一部である。
ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒトＦｃＲ
ｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、及びマウスＦｃＲｎの配列は公知である（Ｓｔｏｒ
ｙ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７）。ＦｃＲｎ受容体
は、ＩｇＧに比較的低いｐＨで結合し（しかし、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥな
どの他の免疫グロブリンクラスには結合しない）、経細胞的にＩｇＧを管腔から漿膜方向
に活発に輸送し、次いで、間質液で見られる比較的高いｐＨでＩｇＧを放出する。それは
、肺及び腸上皮（Ｉｓｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９２：
６９）腎近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２００２，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８）、ならびに鼻上皮、膣表
面、及び胆管表面を含む、成人の上皮組織（米国特許第６，４８５，７２６号、同第６，
０３０，６１３号、同第６，０８６，８７５号、ＷＯ０３／０７７８３４、ＵＳ２００３
−０２３５５３６Ａ１）内に発現される。
本発明において有用なＦｃＲｎ結合パートナーは、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、及
びＦｃＲｎ受容体の完全な結合領域を含む他の断片を含むＦｃＲｎ受容体によって特異的
に結合され得る分子を包含する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、
Ｘ線結晶解析に基づいて説明されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９４
，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９）。ＦｃのＦｃＲｎとの主要な接触面は、ＣＨ２及びＣ
Ｈ３ドメインの接合付近である。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触は、すべて単一Ｉｇ重鎖内にある。
ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、及びＦｃＲｎの完全な結合
領域を含むＩｇＧの他の断片を含む。主要な接触面は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２
４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、及
び３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、及び４３３
〜４３６を含む。免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片もしくは領域のアミノ酸番
号付けに対する言及はすべて、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ
．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，
Ｍｄに基づく。
ＦｃＲｎに結合されるＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎによって上
皮性関門を効果的に往復輸送され得、このため、所望の治療上の分子を全身的に投与する
ための非侵襲的手段を提供する。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む
融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現する細胞によって形質膜陥入される。しかし、分解の
ためにマークされる代わりに、これらの融合タンパク質は、再び循環へ再利用され、この
ため、これらのタンパク質のインビボ半減期は増加する。ある特定の実施形態において、
免疫グロブリン定常領域の一部は、典型的には、ジスルフィド結合及び他の非特異性相互
作用を介して、別のＦｃ領域または別のＦｃＲｎ結合パートナーと会合し、二量体及び高
次の多量体を形成するＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーである。
ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、ＦｃＲｎ受容体によって特異的に結合され、結果とし
てＦｃ領域のＦｃＲｎ受容体による活発な輸送を伴う分子またはその一部である。特異的
に結合されるとは、２つの分子が生理学的条件下で比較的安定した複合体を形成すること
を指す。特異的結合は、低〜中程度の能力とともに通常低い親和性を有する非特異的結合
と区別して、高い親和性及び低〜中程度の能力を特徴とする。典型的には、結合は、親和
定数ＫＡが１０６Ｍ−１より高いとき、または１０８Ｍ−１より高いとき、特異的と考え
られる。必要であれば、非特異的結合を、結合条件を変化させることによって、特異的結
合に実質的に影響を与えることなく減少させることができる。分子の濃度、溶液のイオン
の強度、温度、結合に許される時間、遮断剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン
）の濃度等などの適切な結合条件は、通例の技術を使用して当業者によって最適化され得
る。
無数の突然変異体、断片、変異体、及び誘導体が、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１
１／０６９１６４ Ａ２、ＷＯ２０１２／００６６２３ Ａ２、ＷＯ２０１２／００６６
３５ Ａ２、またはＷＯ２０１２／００６６３３ Ａ２内に記載されており、そのすべて
は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
ＩＩ．Ｃ．３．ｂ． アルブミン、またはその断片もしくは変異体
ある特定の実施形態において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に結合される
、またはＦＶＩＩＩリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に結合される異種部分は、ア
ルブミンまたはその機能的断片である。いくつかの実施形態において、ＶＷＦタンパク質
に融合されるアルブミンは、ＦＶＩＩＩタンパク質に融合されるアルブミンと共有結合的
に会合する。
全長形態において６０９アミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、ま
たはＨＡ）は、血清の浸透圧のかなりの割合の要因であり、内因性及び外因性リガンドの
担体としても機能する。「アルブミン」という用語は、本明細書において使用される場合
、全長アルブミン、またはその機能的断片、変異体、誘導体、もしくは類似体を含む。ア
ルブミンまたは、その断片もしくは変異体の例は、米国特許出願公開第２００８／０１９
４４８１Ａ１号、同第２００８／０００４２０６ Ａ１号、同第２００８／０１６１２４
３ Ａ１号、同第２００８／０２６１８７７ Ａ１号、もしくは同第２００８／０１５３
７５１ Ａ１号、またはＰＣＴ国際出願公開第２００８／０３３４１３ Ａ２号、同第２
００９／０５８３２２ Ａ１号、もしくは同第２００７／０２１４９４ Ａ２号内に開示
され、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＩＩ．Ｃ．３．ｃ． アルブミン結合部分
ある特定の実施形態において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に、またはＦ
ＶＩＩＩリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に結合される異種部分は、アルブミン結
合部分であり、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合
抗体断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例えば、アルブミン結合タンパク質
は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体、またはドメイン抗体を含む抗体断片であり得
る（米国特許第６，６９６，２４５号を参照）。アルブミン結合タンパク質は、例えば、
連鎖球菌タンパク質Ｇのうちの１つなどの細菌アルブミン結合ドメインであり得る（Ｋｏ
ｎｉｇ，Ｔ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ２１８，７３−８３）。共役パートナーとして使用され得るアルブミン結合ペプチ
ドの他の例は、例えば、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓコン
センサス配列を有するものであり、米国特許出願第２００３／００６９３９５号、または
Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７７，３５０３５−３５０４３）に記載されるように、Ｘａａ１は、Ａｓｐ
、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈ ｉ
ｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒ
ｐ、またはＴｙｒであり、及びＸａａ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、
またはＴｈｒである。
ＩＩ．Ｃ．３．ｄ． ＰＡＳ配列
他の実施形態において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に、またはＦＶＩＩ
Ｉリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に結合される異種部分は、ＰＡＳ配列である。
一実施形態において、キメラ分子は、ＶＷＦリンカーを介してＰＡＳ配列に融合される、
本明細書内に記載されるＶＷＦタンパク質を含む。別の実施形態において、本発明のキメ
ラ分子は、ＶＷＦリンカーを介してＰＡＳ配列に融合されるＶＷＦタンパク質を含む第１
の鎖と、ＦＶＩＩＩタンパク質及び追加の任意のＰＡＳ配列を含む第２の鎖とを含み、該
ＰＡＳ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を守る、または保護し、それに
よって、ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用を抑制または防止する。２つ
のＰＡＳ配列は、互いに共有結合的に会合し得る。
ＰＡＳ配列は、本明細書において使用される場合、主にアラニン及びセリン残基を含む
か、または主にアラニン、セリン、及びプロリン残基を含むアミノ酸配列を意味し、該ア
ミノ酸配列は、生理学的条件下でランダイムコイル構造を形成する。したがって、ＰＡＳ
配列は、キメラタンパク質内の異種部分の一部として使用され得るアラニン、セリン、及
びプロリンを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる構成成分、アミノ酸
ポリマー、または配列カセットである。しかし、当業者は、アミノ酸ポリマーもまた、ア
ラニン、セリン、及びプロリン以外の残基が、ＰＡＳ配列内の微量成分として付加される
とき、ランダイムコイル構造を形成し得ることを認識する。「微量成分」という用語は、
本明細書において使用される場合、アラニン、セリン、及びプロリン以外のアミノ酸が、
ある程度まで、例えば、最大約１２％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のう
ちの約１２個、最大約１０％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１
０個、最大約９％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約９個、最大約８％、すなわ
ち、１００個のアミノ酸のうちの約８個、約６％、すなわち、１００個のアミノ酸のうち
の約６個、約５％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約５個、約４％、すなわち、
１００個のアミノ酸のうちの約４個、約３％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約
３個、約２％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約２個、約１％、すなわち、１０
０個のアミノ酸のうちの約１個、ＰＡＳ配列内に付加され得ることを意味する。アラニン
、セリン、及びプロリンと異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ
、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ
、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択され得る。
生理的条件下で、ＰＡＳ配列ストレッチはランダイムコイル構造を形成し、それによっ
て、ＶＷＦ因子または凝固活性のタンパク質に対する増大したインビボ及び／またはイン
ビトロ安定性を媒介することができる。ランダイムコイルドメインは、それ自体で安定し
た構造体または機能を持たないため、それが融合されるＶＷＦタンパク質またはＦＶＩＩ
Ｉタンパク質によって媒介される生物学的活性が本質的に保たれる。他の実施形態におい
て、ランダイムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は、特に血漿におけるタンパク質分
解、免疫原性、等電点／静電気的作用、細胞表面受容体への結合、または内部移行に関し
て、生物学的に不活性であるが、依然として生物分解可能であり、ＰＥＧなどの合成ポリ
マーをしのぐ明白な利点を提供する。
ランダイムコイル構造を形成するＰＡＳ配列の非限定的な例は、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳ
ＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号３２）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（
配列番号３３）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号３４）、ＡＰＳ
ＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号３５）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳ
ＰＳＳＰＡ（配列番号３６）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配
列番号３７）、及びＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号３８）、また
はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ＰＡＳ配列
の追加の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０ Ａ１号及びＰＣ
Ｔ出願公開番号ＷＯ２００８／１５５１３４ Ａ１から公知である。
ＩＩ．Ｃ．３．ｅ． ＨＡＰ配列
ある特定の実施形態において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に、またはＦ
ＶＩＩＩリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に結合される異種部分は、グリシンに富
むホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。ＨＡＰ配列は、少なくとも５０アミノ酸、少
なくとも１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０ア
ミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００ア
ミノ酸、４５０アミノ酸、または５００アミノ酸長を有する、グリシンの反復配列を含む
ことができる。一実施形態において、ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合または結合される
部分の半減期を延長することが可能である。ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、（Ｇｌ
ｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、またはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられるが、これら
に限定されず、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。一実施形態において、ｎは、
２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３
３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態において、
ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５
０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃ
ｈｙ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
，２０：２７３−２８４（２００７）を参照。
ＩＩ．Ｃ．３．ｆ． トランスフェリンまたはその断片
ある特定の実施形態において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に、またはＦ
ＶＩＩＩリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に結合される異種部分は、トランスフェ
リンまたはその断片である。任意のトランスフェリンが、本発明のキメラ分子を作製する
ために使用され得る。例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、およそ７５ＫＤａ（グリコ
シル化を含まない）の６７９アミノ酸タンパク質であり、遺伝子重複に由来すると考えら
れる２つの主要なドメイン、Ｎ（約３３０アミノ酸）及びＣ（約３４０アミノ酸）を有す
る。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ
０３９８４５、ＸＭ０３９８４７、及びＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／）を参照（これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）
。トランスフェリンは、２つのドメイン、Ｎドメイン及びＣドメインを含む。Ｎドメイン
は、２つのサブドメイン、Ｎ１ドメイン及びＮ２ドメインを含み、Ｃドメインは、２つの
サブドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む。
一実施形態において、キメラ分子のトランスフェリン部分は、トランスフェリンスプラ
イス変異体を含む。一例において、トランスフェリンスプライス変異体は、ヒトトランス
フェリンのスプライス変異体、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＡＡ６１１４０、であり得
る。別の実施形態において、キメラ分子のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配
列の１つ以上のドメイン、例えば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイ
ン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
ＩＩ．Ｃ．３．ｇ． ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
他の実施形態において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に、またはＦＶＩＩ
Ｉリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に結合される異種部分は、ポリエチレングリコ
ール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロ
ース、デキストラン、またはポリビニルアルコールを含むがこれらに限定されない、当該
技術分野において公知の可溶性ポリマーである。可溶性ポリマーなどの異種部分は、キメ
ラ分子内の任意の位置に結合され得る。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、ＶＷＦリンカーを介して異種部分（例え
ば、Ｆｃ領域）に融合されるＶＷＦタンパク質を含み、該ＶＷＦタンパク質はＰＥＧにさ
らに結合される。別の実施形態において、キメラ分子は、互いに会合するＶＷＦリンカー
及びＦＶＩＩＩタンパク質を介してＦｃ領域に融合されるＶＷＦタンパク質を含み、該Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質はＰＥＧに結合される。
本発明によってさらに提供されるのは、増大した溶解性、安定性、及びポリペプチドの
循環時間、または減少した免疫原性などの追加の利点を提供し得る本発明のキメラ分子の
化学修飾された誘導体である（米国特許第４，１７９，３３７号を参照）。修飾のための
化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコ
ポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、またはポリビニルアルコールを
含むがこれらに限定されない水溶性ポリマーから選択され得る。キメラ分子は、分子内の
ランダムな位置で、またはＮもしくはＣ末端で、または分子内の規定の位置で修飾され得
、１つ、２つ、３つ以上の結合された化学的部分を含み得る。
ポリマーは、任意の分子量であり得、かつ分岐または非分岐であり得る。ポリエチレン
グリコールでは、一実施形態において、取り扱い及び製造の容易さのため、分子量は約１
ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間である。所望のプロファイル（例えば、所望される徐放性の
持続時間、効果、もしある場合は生物学的活性、取り扱いやすさ、抗原性の程度または欠
如、及びタンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に
応じて、他のサイズが使用され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５
００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５
００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５
００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００
、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５
００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７
，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、
２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，００
０、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，
０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平
均分子量を有し得る。
いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールは、分岐構造を有し得る。分岐
ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号、Ｍｏｒｐｕｒｇ
ｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７
２（１９９６）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）、及びＣａｌｉｃｅｔｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載さ
れており、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
各キメラ分子に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換度）もま
た、様々であり得る。例えば、本発明のＰＥＧ化されたタンパク質は、平均して１、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０個以上のポリエチレングリ
コール分子に結合され得る。同様に、平均的な置換度は、タンパク質分子あたり１〜３、
２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、
１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１
９、または１８〜２０のポリエチレングリコール部分などの範囲内にある。置換度を決定
するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅ
ｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）内で論じら
れる。
他の実施形態において、本明細書内で使用されるＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の
ポリマーと共役される。ポリマーは、水溶性であり得、共有結合的または非共有結合的に
、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子に共役される他の部分に結合され得る。ポリマー
の非限定的な例は、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビ
ニルアルコール）、ポリオキサゾリン、またはポリ（アクリロイルモルホリン）であり得
る。ポリマー共役されたＦＶＩＩＩの追加の種類は、米国特許第７，１９９，２２３号に
開示される。
ＩＩ．Ｃ．３．ｈ． ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）
ある特定の実施形態において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に結合される
、またはＦＶＩＩＩリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に結合される異種部分は、ポ
リマー、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）またはその誘導体である。
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であ
り、体内のα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、炭水化物ポリマーアミロペク
チンの置換誘導体であり、最大９５重量％の濃度でトウモロコシデンプン内に存在する。
ＨＥＳは、有利な生物学的特性を示し、血液量補充剤として、及び診療所における血液希
釈療法に使用される（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓ
ｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８（１９８７）、及びＷｅｉｄｌｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，４１，４９
４−４９８（１９９１））。
アミロペクチンは、主鎖内にα−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐部位でα−１
，６−グリコシド結合が見られるグルコース部分を含有する。この分子の物理化学的特性
は、主にグリコシド結合の種類によって決定される。切れ目のあるα−１，４−グリコシ
ド結合に起因して、ターンあたり約６個のグルコース単量体を有するらせん構造体が産生
される。ポリマーの物理化学的ならびに生化学的特性は、置換によって修飾することがで
きる。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性のヒドロキシエチル化によって達成する
ことができる。反応条件を適合することによって、ヒドロキシエチル化に関して、非置換
グルコース単量体内のそれぞれのヒドロキシル基の異なる反応性を利用することが可能で
ある。この事実から、当業者は、限定的に置換パターンに影響を与えることができる。
ＨＥＳは、主に、分子量分布及び置換度によって特徴付けられる。ＤＳとして示される
置換度は、モル置換に関し、当業者に公知である。上に引用したように、Ｓｏｍｍｅｒｍ
ｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７
１−２７８（１９８７）、特にｐ．２７３を参照。
一実施形態において、ヒドロキシエチルデンプンは、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ
、３〜１００ｋＤ、または４〜７０ｋＤの平均分子量（重量平均）を有する。ヒドロキシ
エチルデンプンは、０．１〜３、好ましくは０．１〜２、より好ましくは０．１〜０．９
、好ましくは０．１〜０．８のモル置換度、及びヒドロキシエチル基に関して、２〜２０
の範囲のＣ２：Ｃ６置換間の比率をさらに示し得る。約１３０ｋＤの平均分子量を有する
ＨＥＳの非限定的な例は、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、または０
．８などの０．２〜０．８の置換度、好ましくは、０．４、０．５、０．６、または０．
７などの０．４〜０．７の置換度を有するＨＥＳである。特定の実施形態において、約１
３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳは、ＦｒｅｓｅｎｉｕｓからのＶＯＬＵＶＥＮ（登
録商標）である。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は、例えば、治療のための治療指標、及び
血液量減少の治療及び予防における治療適用において、血液量補充療法で用いられる人工
コロイドである。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）の特徴は、１３０，０００＋／−２０，０
００Ｄの平均分子量、０．４のモル置換、及び約９：１のＣ２：Ｃ６比である。他の実施
形態において、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量の範囲は、例えば、４〜７０ｋＤ
、または１０〜７０ｋＤ、または１２〜７０ｋＤ、または１８〜７０ｋＤ、または５０〜
７０ｋＤ、または４〜５０ｋＤ、または１０〜５０ｋＤ、または１２〜５０ｋＤ、または
１８〜５０ｋＤ、または４〜１８ｋＤ、または１０〜１８ｋＤ、または１２〜１８ｋＤ、
または４〜１２ｋＤ、または１０〜１２ｋＤ、または４〜１０ｋＤである。依然として他
の実施形態において、用いられるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、約１０ｋＤ
などの４ｋＤ超及び７０ｋＤ未満の範囲、または、９〜１０ｋＤもしくは１０〜１１ｋＤ
もしくは９〜１１ｋＤの範囲、あるいは約１２ｋＤ、または、１１〜１２ｋＤ）もしくは
１２〜１３ｋＤもしくは１１〜１３ｋＤの範囲、あるいは約１８ｋＤ、または、１７〜１
８ｋＤもしくは１８〜１９ｋＤもしくは１７〜１９ｋＤの範囲、あるいは約３０ｋＤ、ま
たは、２９〜３０、もしくは３０〜３１ｋＤの範囲、あるいは約５０ｋＤ、または、４９
〜５０ｋＤもしくは５０〜５１ｋＤもしくは４９〜５１ｋＤの範囲である。
ある特定の実施形態において、異種部分は、異なる平均分子量、及び／または異なる置
換度、及び／または異なるＣ２：Ｃ６置換比を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物
であり得る。したがって、ヒドロキシエチルデンプンの混合物は、異なる平均分子量と、
異なる置換度と、異なるＣ２：Ｃ６置換比とを有するか、または異なる平均分子量と、異
なる置換度と、同じもしくはほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比とを有するか、または異なる平均
分子量と、同じもしくはほぼ同じ置換度と、異なるＣ２：Ｃ６置換比とを有するか、また
は同じもしくはほぼ同じ平均分子量と、異なる置換度と、異なるＣ２：Ｃ６置換比とを有
するか、または異なる平均分子量と、同じもしくはほぼ同じ置換度と、同じもしくはほぼ
同じＣ２：Ｃ６置換比とを有するか、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量と、異なる
置換度と、同じもしくはほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比とを有するか、または同じもしくはほ
ぼ同じ平均分子量と、同じもしくはほぼ同じ置換度と、異なるＣ２：Ｃ６置換比とを有す
るか、またはほぼ同じ平均分子量と、ほぼ同じ置換度と、ほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比とを
有するかで、用いられ得る。
ＩＩ．Ｃ．３．ｉ． ポリシアル酸（ＰＳＡ）
ある特定の実施形態において、ＶＷＦリンカーを介してＶＷＦタンパク質に、またはＦ
ＶＩＩＩリンカーを介してＦＶＩＩＩタンパク質に結合される非ポリペプチド異種部分は
、ポリマー、例えば、ポリシアル酸（ＰＳＡ）またはその誘導体である。ポリシアル酸（
ＰＳＡ）は、ある特定の細菌株によって、及びある特定の細胞において哺乳類で、産生さ
れるシアル酸の天然に存在する非分岐ポリマーである。Ｒｏｔｈ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（
１９９３）ｉｎ Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ：Ｆｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｔｏ
Ｍａｎ，ｅｄｓ．Ｒｏｔｈ Ｊ．，Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ Ｕ．，Ｔｒｏｙ Ｆ．Ａ
．（Ｂｉｒｋｈaｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），ｐ
ｐ ３３５−３４８。それらは、限定酸加水分解によって、またはノイラミニダーゼでの
消化によって、またはポリマーの自然な細菌由来形態の分別によって、ｎ＝約８０以上の
シアル酸残基からｎ＝２に至るまで様々な重合度で産生され得る。異なるポリシアル酸の
組成物はまた、多様であり、そのため、大腸菌Ｋ１株及びＢ群髄膜炎菌の莢膜多糖を含む
ホモポリマー形態、すなわち、α−２，８−結合ポリシアル酸も存在し、これはまた、胎
児型ニューロン細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）で見られる。大腸菌Ｋ９２株の交互結合型α
−２，８ α−２，９ポリシアル酸、及び髄膜炎菌のＣ群多糖類など、ヘテロポリマー形
態もまた存在する。シアル酸もまた、髄膜炎菌のＷ１３５群またはＹ群などのシアル酸以
外の単量体を有する交互コポリマー内で発見され得る。ポリシアル酸は、病原細菌による
免疫及び補体系の回避、ならびに胎児発生中の未成熟なニューロンの膠細胞接着性の調節
（ポリマーが抗接着性機能を有する）Ｃｈｏ ａｎｄ Ｔｒｏｙ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，Ｕ
ＳＡ，９１（１９９４）１１４２７−１１４３１を含む、重要な生物学的機能を有するが
、哺乳類におけるポリシアル酸のための公知の受容体は存在しない。大腸菌Ｋ１株のα−
２，８−結合ポリシアル酸はまた、「コロミン酸」としても知られ、本発明を例示するた
めに（様々な長さで）使用される。ポリシアル酸をポリペプチドに結合または共役する様
々な方法が説明されている（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米
国特許第５，８４６，９５１号、ＷＯ−Ａ−０１８７９２２、及びＵＳ２００７／０１９
１５９７ Ａ１を参照。
ＩＩ．Ｃ．４． ＸＴＥＮ配列。
ここで使用される場合、「ＸＴＥＮ配列」は、主に小さな親水性アミノ酸で構成される
、天然に存在しない、実質的に非反復の配列を有する、長さが伸張されたポリペプチドを
指し、生理学的条件下で、低次の構造体を有する、または二次構造体もしくは三次構造体
を有しない配列を持つ。キメラタンパク質パートナーとして、ＸＴＥＮは、キメラタンパ
ク質を作るために本発明のＶＷＦタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質と結合されると
きに、ある特定の望ましい薬物動態学的、物理化学的、及び薬学的特性を付与し、担体と
して機能することができる。そのような望ましい特性としては、高められた薬物動態学的
パラメータ及び可溶性性質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使
用される場合、「ＸＴＥＮ」は、特に、一本鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のＦｃ断片な
どの、抗体または抗体断片を除外する。
いくつかの実施形態において、本発明のＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、
６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、
４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、
９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００個を超え
るアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態におい
て、ＸＴＥＮは、約２０超〜約３０００個のアミノ酸残基、３０超〜約２５００個の残基
、４０超〜約２０００個の残基、５０超〜約１５００個の残基、６０超〜約１０００個の
残基、７０超〜約９００個の残基、８０超〜約８００個の残基、９０超〜約７００個の残
基、１００超〜約６００個の残基、１１０超〜約５００個の残基、または１２０超〜約４
００個の残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。
本発明のＸＴＥＮ配列は、９〜１４個のアミノ酸残基のうちの１つ以上の配列モチーフ
、またはその配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むことがで
き、該モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）
、グルタメート（Ｅ）、及びプロリン（Ｐ）からなる群より選択される４〜６種類のアミ
ノ酸を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。ＵＳ２０１０−０２３９
５５４ Ａ１を参照。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、非重複配列モチーフを含み、該配列の約８
０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または
約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または
約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％は、表２Ａから選択され
る単一のモチーフファミリーから選択される、複数単位の非重複配列からなり、ファミリ
ー配列をもたらす。本明細書において使用される場合、「ファミリー」とは、ＸＴＥＮが
、表２Ａからの単一のモチーフカテゴリからのみ選択されるモチーフ、すなわち、ＡＤ、
ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤ ＸＴＥＮを有すること、及びファミ
リーモチーフからでないＸＴＥＮ内の任意の他のアミノ酸が、必要とされる特性、例えば
コーディングヌクレオチドによる制限酵素部位の組み込み、切断配列の組み込みを可能に
すること、またはＦＶＩＩＩもしくはＶＷＦへのより良い結合を達成するために選択され
ることを意味する。ＸＴＥＮファミリーのいくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は
、ＡＤモチーフファミリーの、またはＡＥモチーフファミリーの、またはＡＦモチーフフ
ァミリーの、またはＡＧモチーフファミリーの、またはＡＭモチーフファミリーの、また
はＡＱモチーフファミリーの、またはＢＣファミリーの、またはＢＤファミリーの、複数
単位の非重複配列モチーフを含み、結果として生じるＸＴＥＮは、上記の相同性の範囲を
示す。他の実施形態において、ＸＴＥＮは、表２Ａのモチーフファミリーのうちの２つ以
上から、複数単位のモチーフ配列を含む。これらの配列は、以下により詳しく説明される
、正味電荷、親水性、二次構造体の欠如、または反復性の欠如などの特性を含め、モチー
フのアミノ酸組成物によって付与される所望の物理的／化学的性質を達成するために選択
され得る。この段落で上に記載される実施形態において、ＸＴＥＮに組み込まれるモチー
フを、本明細書に記載される方法を使用して選択かつ構築し、約３６〜約３０００個のア
ミノ酸残基のＸＴＥＮを達成することができる。
Figure 2021072853
ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩもしくはＶＷＦまたはキメラ分子の任意の他の構成要素への挿
入、またはそれらへの結合によって変化する長さを有し得る。一実施形態において、ＸＴ
ＥＮ配列（複数可）の長さは、融合タンパク質内で達成される特性または機能に基づいて
選択される。意図される特性または機能によって、ＸＴＥＮは、短いか、または中間の長
さの配列か、または担体として機能できるより長い配列かであり得る。ある特定の実施形
態において、ＸＴＥＮは、約６〜約９９のアミノ酸残基の短いセグメント、約１００〜約
３９９のアミノ酸残基の中間の長さ、ならびに約４００〜約１０００及び最大約３０００
のアミノ酸残基のより長い長さを含む。このため、ＦＶＩＩＩもしくはＶＷＦに挿入また
は結合されるＸＴＥＮは、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約
１４４、約２８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約
８６４、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、または最大約３
０００アミノ酸残基長の長さを有することができる。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配
列は、約６〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５
０〜４００、約４００〜約５００、約５００〜約９００、約９００〜１５００、約１５０
０〜２０００、または約２０００〜約３０００アミノ酸残基長である。ＦＶＩＩＩもしく
はＶＷＦに挿入または結合されるＸＴＥＮの正確な長さは、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦの活
性に悪影響を及ぼさずに変化し得る。一実施形態において、本明細書でＸＴＥＮ使用され
るＸＴＥＮのうちの１つ以上は、３６アミノ酸、４２アミノ酸、７２アミノ酸、１４４ア
ミノ酸、２８８アミノ酸、５７６アミノ酸、または８６４アミノ酸長を有し、ＸＴＥＮフ
ァミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤ、の
うちの１つ以上から選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明で使用されるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４
２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、
ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５
２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ
３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、
ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７
６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ
６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、
ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６
４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、Ｂ
Ｄ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、Ａ
Ｅ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８
、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３
３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ
１９０８、及びＡＧ２００４からなる群より選択される配列と、少なくとも６０％、７０
％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％、または１００％同一である。ＵＳ２０１０−０２３９５５４ Ａ１
を参照。
一実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８
８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、及びそれらの任意
の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、７０％、８
０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
別の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８
８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、及びそれらの任意
の組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態において、ＸＴＥＮ配列はＡＥ
２８８である。本発明のある特定のＸＴＥＮ配列のアミノ酸配列を、表２Ｂに示す。
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853
使用されるＸＴＥＮ構成要素のアミノ酸の１００％未満が、グリシン（Ｇ）、アラニン
（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、及びプロリン（Ｐ）か
ら選択される４、５、もしくは６種類のアミノ酸からなる、またはその配列の１００％未
満が表２Ａの配列モチーフもしくは表２ＢのＸＴＥＮ配列からなるそれらの実施形態にお
いて、ＸＴＥＮの他のアミノ酸残基は、他の１４個の天然Ｌ−アミノ酸のいずれかから選
択されるが、ＸＴＥＮ配列が少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％、親水性のアミノ酸を含有す
るように、親水性アミノ酸から優先的に選択される。グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、
セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、及びプロリン（Ｐ）でないＸＴ
ＥＮアミノ酸は、例えば、ＸＴＥＮと他の構成要素、例えば、ＶＷＦタンパク質との間に
リンカーを作るために、ＸＴＥＮ配列全体に散在させられるか、または配列モチーフ内も
しくはその間に位置するか、またはＸＴＥＮ配列の１つ以上の短いストレッチ内に集中す
るかのいずれかである。ＸＴＥＮ構成要素が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン
（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、及びプロリン（Ｐ）以外のアミノ酸を
含む場合は、本明細書に開示される方法によって決定されるように、結果として生じる配
列が、一般的に二次構造体を欠く、例えば、２％を超えるαへリックスまたは２％を超え
るβシートを有しないように、アミノ酸の約２％未満または約１％未満が疎水性残基であ
ることが好ましい。ＸＴＥＮの構造においてあまり好まれない疎水性残基は、トリプトフ
ァン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニン
を含む。さらに、以下のアミノ酸を５％未満、もしくは４％未満、もしくは３％未満、も
しくは２％未満、もしくは１％未満含有する、または全く含有しないようにＸＴＥＮ配列
を設計することができる：システイン（ジスフィルド形成及び酸化を回避するため）、メ
チオニン（酸化を回避するため）、アスパラギン、及びグルタミン（脱アミド化を回避す
るため）。このため、いくつかの実施形態において、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、
セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、及びプロリン（Ｐ）に加えて他
のアミノ酸を含むＸＴＥＮは、チョウファスマンアルゴリズムによって測定される、αへ
リックス及びβシートに寄与する残基を５％未満有する配列を有し、かつＧＯＲアルゴリ
ズムによって測定される、少なくとも９０％、または少なくとも約９５％以上のランダイ
ムコイル形成を有する。
さらなる実施形態において、本発明で使用されるＸＴＥＮ配列は、本発明のキメラタン
パク質の物理的または化学的特性、例えば、薬物動態学的特性に影響を与える。本発明で
使用されるＸＴＥＮ配列は、以下の有利な特性のうちの１つ以上を示すことができる：構
造的な柔軟性、高められた水溶性、高度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳動物受
容体に対する低い結合性、または改善された流体力学（もしくはストークス）半径。特定
の実施形態において、本発明においてＦＶＩＩＩタンパク質に結合されるＸＴＥＮ配列は
、より長い末端半減期、または増加した曲線下面積（ＡＵＣ）などの薬物動態学的特性を
増大させ、それによって、本明細書に記載されるキメラタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩ
と比較して、より長い間、インビボに留まる。さらなる実施形態において、本明細書にお
いて使用されるＸＴＥＮ配列は、より長い末端半減期、または増加した曲線下面積（ＡＵ
Ｃ）などの薬物動態学的を増大させ、それによって、ＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型Ｆ
ＶＩＩＩと比較して、より長い間、インビボに留まる。
様々な方法及びアッセイを用いて、ＸＴＥＮ配列を含むタンパク質の物理的／化学的特
性を決定することができる。そのような方法は、分析用遠心法、ＥＰＲ、イオン交換ＨＰ
ＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、光散乱、キャピラリー電気泳動、円二色性、
示差走査熱量測定、蛍光、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、ラ
マン分光法、屈折率測定、及び紫外線／可視分光法を含むが、これらに限定されない。追
加の方法は、Ａｍａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ ４８
，１−１３（２００６）に開示される。
本発明に従って使用され得るＸＴＥＮ配列の追加の例は、米国特許公開第２０１０／０
２３９５５４ Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６ Ａ１号、同第２０１１／００４
６０６０ Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１ Ａ１号、同第２０１１／００７７１
９９ Ａ１号、もしくは同第２０１１／０１７２１４６ Ａ１号、または国際特許公開番
号ＷＯ２０１００９１１２２ Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２ Ａ２、ＷＯ２０１０１
４４５０８ Ａ１、ＷＯ ２０１１０２８２２８ Ａ１、ＷＯ ２０１１０２８２２９
Ａ１、ＷＯ ２０１１０２８３４４ Ａ２、もしくはＷＯ２０１３１２３４５７ Ａ１、
または国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４９９８９に開示される。
ＩＩ．Ｃ．５． ＦＶＩＩＩタンパク質
本明細書において使用される場合、「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、別途指定のない限り
、凝固でのその通常の役割において機能的なＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。ＦＶＩ
ＩＩタンパク質という用語は、凝固経路において全長野生型第ＶＩＩＩ因子の機能を保持
するその機能的断片、変異体、類似体、誘導体を含む。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、Ｆ
ＶＩＩＩポリペプチド（もしくはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと互換的に使用される。
ＦＶＩＩＩ機能の例としては、凝固を活性化する能力、第ＩＸ因子のための補因子として
機能する能力、Ｃａ２＋及びリン脂質の存在下で第ＩＸ因子を有するテナーゼ複合体を形
成し、次いで第Ｘ因子を活性化形態Ｘａに変換する能力を含むが、これらに限定されない
。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスＦＶＩＩＩタンパ
ク質であり得る。加えて、ヒト及び他の種からのＦＶＩＩＩ間の比較は、機能に必要とさ
れる可能性のある保存残基が識別されている（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏ
ｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７−２２（１９９８）；ＵＳ６，２５１，６３２）。
凝固系の機能を分析するために多くの試験が利用可能である：活性化部分トロンボプラ
スチン時間（ａＰＴＴ）試験、色素産生アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン
時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲを決定するためにも使用される）、フィブリノーゲンテスト（
多くの場合Ｃｌａｕｓｓ法による）、血小板算定、血小板機能テスト（多くの場合ＰＦＡ
−１００による）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿を正常な血漿と混合した場
合に、異常が補正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ−二量体、
遺伝子検査（例えば、第Ｖ因子ライデン、プロトロンビン突然変異Ｇ２０２１０Ａ）、希
釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、種々の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィ
（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリ（ＴＥＭ（登録商標）、例
えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはユーグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。
ａＰＴＴ試験は、「内在性」凝固経路（接触活性化経路とも称される）及び共通凝固経
路の双方の有効性を測定する性能指標である。この試験は、市販の組み換え凝固因子、例
えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固活性を測定するために広く使用される。それは、外
因性経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と組み合わせて使用される。
ＲＯＴＥＭ分析は、止血の全動態に関する情報：凝固時間、血栓形成、血栓安定性、及
び溶解を提供する。トロンボエラストメトリ内の異なるパラメータは、血漿凝固系の活性
、血小板機能、フィブリン溶解、またはこれらの相互作用に影響を与える多くの因子次第
である。このアッセイは、二次止血の全体像を提供することができる。
ＦＶＩＩＩポリペプチド及びポリヌクレオチド配列は公知であり、多くの機能的断片、
突然変異体、及び修飾されたバージョンも公知である。ヒトＦＶＩＩＩ配列（全長）の例
は、配列番号１６または１８内のサブシーケンスとして示される。
Figure 2021072853

Figure 2021072853


表４．全長ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）＊
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853


＊下線付きの核酸はシグナルペプチドをコードする。
ＦＶＩＩＩポリペプチドは、全長ＦＶＩＩＩ、Ｎ末端にＭｅｔのない全長ＦＶＩＩＩ、
成熟ＦＶＩＩＩ（シグナル配列のない）、Ｎ末端に追加のＭｅｔを有する成熟ＦＶＩＩＩ
、及び／またはＢドメインの完全もしくは部分的欠失を有するＦＶＩＩＩを含む。ある特
定の実施形態において、ＦＶＩＩＩ変異体は、部分的欠失にせよ完全欠失にせよ、Ｂドメ
イン欠失を含む。
ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子は、哺乳動物細胞内で単離及び発現された（Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ
．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３４２−３４７（１９８４）、Ｇｉｔｓｃｈ
ｉｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３２６−３３０（１９８４）、Ｗ
ｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３０−３３７（１９８４）
、Ｖｅｈａｒ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３７−３４２（１９
８４）、ＷＯ８７／０４１８７、ＷＯ８８／０８０３５、ＷＯ８８／０３５５８、及び米
国特許第４，７５７，００６号）。ＦＶＩＩＩアミノ酸配列は、米国特許第４，９６５，
１９９号に示されるようにｃＤＮＡから推定された。加えて、部分的または完全なＢ−ド
メイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第４，９９４，３７１号及び同第４，８６８，１１２
号に示される。いくつかの実施形態において、米国特許第５，００４，８０３号に示され
るように、ヒトＦＶＩＩＩ Ｂ−ドメインは、ヒト第Ｖ因子Ｂ−ドメインと置き換えられ
る。ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするｃＤＮＡ配列、及びアミノ酸配列は、米国特許第７
，２１１，５５９号のそれぞれ配列番号１及び２に示される。
ブタＦＶＩＩＩ配列は、Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５９３９−５９４２（１９８６）に公開される。さら
に、ブタ（ｐｉｇ）脾臓ｃＤＮＡライブラリーからのＦＶＩＩＩ配列のＰＣＲ増幅から得
られる完全ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）ｃＤＮＡ配列は、Ｈｅａｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８８：４２０９−４２１４（１９９６）に報告されている。すべての
ドメイン、すべてのサブユニット、及び特定のアミノ酸配列の置換を有するヒト／ブタハ
イブリッドＦＶＩＩＩは、Ｌｏｌｌａｒ及びＲｕｎｇｅによる米国特許第５，３６４，７
７１号、ならびにＷＯ９３／２００９３に開示された。より最近では、ブタＦＶＩＩＩの
Ａ１及びＡ２ドメインのヌクレオチド及び相当するアミノ酸配列、ならびに相当するヒト
ドメインと置換されるブタＡ１及び／またはＡ２ドメインを有するキメラＦＶＩＩＩが、
ＷＯ９４／１１５０３に報告された。米国特許第５，８５９，２０４号、Ｌｏｌｌａｒ，
Ｊ．Ｓ．もまた、ブタｃＤＮＡ及び推定したアミノ酸配列を開示する。米国特許第６，４
５８，５６３号は、Ｂ−ドメイン欠失ブタＦＶＩＩＩを開示する。
Ｌｏｌｌａｒ，Ｊ．Ｓ．に対する米国特許第５，８５９，２０４号は、減少した抗原性
及び減少した免疫反応性を有するＦＶＩＩＩの機能的突然変異体を報告する。Ｌｏｌｌａ
ｒ，Ｊ．Ｓ．に対する米国特許第６，３７６，４６３号はまた、減少した免疫反応性を有
するＦＶＩＩＩの突然変異体も報告する。Ｓａｅｎｋｏらに対する米国出願公開第２００
５／０１００９９０号は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインにおける機能的突然変異を報告する
。
一実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質（またはキメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部
分）は、配列番号１８のアミノ酸１〜１４３８、または配列番号１６のアミノ酸１〜２３
３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得（シグナル配列
なし）、該ＦＶＩＩＩは、凝固活性を有し、例えば、補因子としての第ＩＸ因子を活性化
して、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子に変換する。ＦＶＩＩＩ（またはキメラタンパク質のＦ
ＶＩＩＩ部分）は、配列番号１８のアミノ酸１〜１４３８、または配列番号１６のアミノ
酸１〜２３３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列と同一であり得る（シグナル配列なし）。ＦＶ
ＩＩＩタンパク質は、シグナル配列をさらに含み得る。
ＦＶＩＩＩの「Ｂ−ドメイン」は、本明細書において使用される場合、内部アミノ酸配
列同一性、及びタンパク質分解切断の部位、例えば、全長ヒトＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ７
４１〜Ａｒｇ１６４８、によって定義される当該技術分野において公知のＢ−ドメインと
同じである。他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、以下のアミノ酸残基によって定義される：
Ａ１、残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；Ａ３、残
基Ｓｅｒ１６９０〜Ａｓｎ２０１９；Ｃ１、残基Ｌｙｓ２０２０〜Ａｓｎ２１７２；Ｃ２
、残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０
〜Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列、残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９は、通常、
ａ３酸性領域と称される。ブタ、マウス、及びイヌＦＶＩＩＩのための、Ｂ−ドメインを
含むドメインのすべての境界の位置もまた、当該技術分野において公知である。一実施形
態において、ＦＶＩＩＩのＢドメインは、削除される（「Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因
子」または「ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤ ＦＶＩＩＩの一例は、表５内の配列の第
ＶＩＩＩ因子部分と同じ配列を有する、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組み換えＢＤＤ
ＦＶＩＩＩ）である。（ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ重鎖は二重下線付き、Ｂドメインはイタリッ
ク、及びＢＤＤ ＦＶＩＩＩ軽鎖はプレーンテキストである）。
表５．ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（配列番号１８）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

表６．ＢＤＤ ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）＊
Figure 2021072853

Figure 2021072853

＊下線付きの核酸はシグナルペプチドをコードする。
「Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、米国特許第６，３１６，２２６号、同第６，３４
６，５１３号、同第７，０４１，６３５号、同第５，７８９，２０３号、同第６，０６０
，４４７号、同第５，５９５，８８６号、同第６，２２８，６２０号、同第５，９７２，
８８５号、同第６，０４８，７２０号、同第５，５４３，５０２号、同第５，６１０，２
７８号、同第５，１７１，８４４号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８６８，１１
２号、及び同第６，４５８，５６３号に開示される完全または部分的欠失を有し得る。い
くつかの実施形態において、本発明のＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６
，３１６，２２６号（ＵＳ６，３４６，５１３内でも）の第４列第４行、第５列第２８行
、及び実施例１〜５に開示される欠失のいずれか１つを含む。別の実施形態において、Ｂ
−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ
因子（ＳＱ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）（例えば、アミノ酸７４４〜アミノ酸１６３７の欠失
を有する第ＶＩＩＩ因子、例えば、配列番号１６のアミノ酸１〜７４３及びアミノ酸１６
３８〜２３３２、を有する第ＶＩＩＩ因子、すなわち、配列番号１８）である。いくつか
の実施形態において、本発明のＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，
２０３号（さらにＵＳ６，０６０，４４７、ＵＳ５，５９５，８８６、及びＵＳ６，２２
８，６２０）の第２列第２６〜５１行、及び実施例５〜８に開示される欠失を有する。い
くつかの実施形態において、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２
，８８５号の第１列第２５行〜第２列第４０行、米国特許第６，０４８，７２０号の第６
列第１〜２２行及び実施例１、米国特許第５，５４３，５０２号の第２列第１７〜４６行
、米国特許第５，１７１，８４４号の第４列第２２行〜第５列第３６行、米国特許第５，
１１２，９５０号の第２列第５５〜６８行、図２、及び実施例１、米国特許第４，８６８
，１１２号の第２列第２行〜第１９列第２１行、及び表２、米国特許第７，０４１，６３
５号の第２列第１行〜第３列第１９行、第３列４０行〜第４列第６７行、第７列第４３行
〜第８列第２６行、及び第１１列第５行〜第１３列第３９行、または米国特許第６，４５
８，５６３号の第４列第２５〜５３行に記載される欠失を有する。
いくつかの実施形態において、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインの大部分の
欠失を有するが、ＷＯ９１／０９１２２に開示されるように、一次翻訳産物の２つのポリ
ペプチド鎖へのインビボでのタンパク質分解処理に必須であるＢドメインのアミノ末端配
列を依然として含有する。いくつかの実施形態において、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩは
、アミノ酸７４７〜１６３８の欠失、すなわち、事実上、Ｂドメインの完全欠失によって
構築される。Ｈｏｅｂｅｎ Ｒ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（
１３）：７３１８−７３２３（１９９０）。Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子はまた、Ｆ
ＶＩＩＩのアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２の欠失も含有し得
る。Ｍｅｕｌｉｅｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２（４）：３０１−
６（１９８８）。本発明の一部である追加のＢドメイン欠失は、アミノ酸９８２〜１５６
２もしくは７６０〜１６３９（Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）８３，５９３９−５９４２））、７９７〜１５６
２（Ｅａｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：８３４３−
８３４７））、７４１〜１６４６（Ｋａｕｆｍａｎ（ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ８７／０４
１８７））、７４７〜１５６０（Ｓａｒｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ（１９８７）６：
５５３−５６４））、７４１〜１６４８（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ出願番号８８／００８３１
））、または８１６〜１５９８もしくは７４１〜１６４８（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎ
ｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ ８２：１６−２５，ＥＰ ２９５５９７）
）の欠失を含む。他の実施形態において、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、１つ以上のＮ−結合グ
リコシル化部位、例えば、全長ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸配列に相当する残基７５７、７
８４、８２８、９００、９６３、または任意に９４３、を保持するＢ−ドメインの断片を
含むＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。Ｂ−ドメイン断片の例としては、Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ
．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３（ａ）：３４１２−３４１９（２００４）、Ｋａ
ｓｕｄａ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６：１３５２−１３
５９（２００８）、及びＰｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅ
ｍｏｓｔ．９：２２３５−２２４２（２０１１）に開示されるようなＢ−ドメインの２２
６アミノ酸または１６３アミノ酸が挙げられる（すなわち、Ｂドメインの最初の２２６ア
ミノ酸または１６３アミノ酸は保持される）。いくつかの実施形態において、部分的Ｂ−
ドメインを有するＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩ１９８である。ＦＶＩＩＩ１９８は、一本鎖
ＦＶＩＩＩＦｃ分子−２２６Ｎ６を含む部分的Ｂ−ドメインである。２２６は、ＦＶＩＩ
Ｉ Ｂ−ドメインのＮ末端２２６アミノ酸を表し、Ｎ６は、Ｂ−ドメイン内の６つのＮ−
グリコシル化部位を表す。依然として他の実施形態において、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、Ｂ
ＤＤ ＦＶＩＩＩタンパクの発現を改善するために、残基３０９（Ｐｈｅ〜Ｓｅｒ）に点
突然変異をさらに含む。Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３（ａ）
：３４１２−３４１９（２００４）を参照。依然として他の実施形態において、ＢＤＤ
ＦＶＩＩＩは、Ｂ−ドメインの一部を含有するが１つ以上のフューリン切断部位（例えば
、Ａｒｇ１３１３及びＡｒｇ１６４８）を含有しない、ＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。
Ｐｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５
−２２４２（２０１１）を参照。前述の欠失の各々は、任意のＦＶＩＩＩ配列内で作製さ
れ得る。
本発明において有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ凝固活性に影響を与えない
、１つ以上の追加の異種配列、または化学的もしくは物理的修飾をその中に有するＦＶＩ
ＩＩを含むことができる。そのような異種配列、または化学的もしくは物理的修飾は、Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質のＣ末端もしくはＮ末端に融合され得るか、またはＦＶＩＩＩタンパ
ク質内の２つのアミノ酸残基のうちの１つ以上の間に挿入され得る。ＦＶＩＩＩタンパク
質内におけるそのような挿入は、ＦＶＩＩＩ凝固活性またはＦＶＩＩＩ機能に影響を与え
ない。一実施形態において、該挿入は、ＦＶＩＩＩタンパク質の薬物動態学的特性（例え
ば、半減期）を改善する。別の実施形態において、該挿入は、２、３、４、５、または６
つを超える部位であり得る。
一実施形態において、ＦＶＩＩＩは、アミノ酸１６４８（全長第ＶＩＩＩ因子もしくは
配列番号１６内）、アミノ酸７５４（Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩ
Ｉ因子もしくは配列番号１６内）、または相当するアルギニン残基（他の変異体内）でア
ルギニンの直後を切断され、それによって重鎖及び軽鎖をもたらす。別の実施形態におい
て、ＦＶＩＩＩは、金属イオン媒介非共有結合によって結合される、または会合する重鎖
及び軽鎖を含む。
他の実施形態において、ＦＶＩＩＩは、アミノ酸１６４８（全長ＦＶＩＩＩもしくは配
列番号１６内）、アミノ酸７５４（Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ
もしくは配列番号１８内）、または相当するアルギニン残基（他の変異体内）でアルギニ
ンの直後を切断されていない一本鎖ＦＶＩＩＩである。一本鎖ＦＶＩＩＩは、１つ以上の
アミノ酸置換を含み得る。一実施形態において、アミノ酸置換は、残基１６４８、残基１
６４５、もしくは全長成熟第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号１６）の双方、または
残基７５４、残基７５１、もしくはＳＱ ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（配列番号１８）の双方
に相当する残基にある。アミノ酸置換は、アルギニン以外の任意のアミノ酸、例えば、イ
ソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプト
ファン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸
、グルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン
、オルニチン、ピロリジン、またはタウリンであり得る。
ＦＶＩＩＩは、トロンビンによってさらに切断され、次いでＦＶＩＩＩａとして活性化
され得、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）のための補因子として機能する。そして、活性化
ＦＩＸは活性化ＦＶＩＩＩと一緒になってＸａｓｅ複合体を形成し、第Ｘ因子を活性化第
Ｘ因子（ＦＸａ）に変換する。活性化のため、ＦＶＩＩＩは、アミノ酸３７２、７４０、
及び１６８９（Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列内のアミノ酸３７２、７４０、及び７９
５に相当する）で、３つのアルギニン残基の後をトロンビンによって切断され、その切断
が、５０ｋＤａ Ａ１、４３ｋＤａ Ａ２、及び７３ｋＤａ Ａ３−Ｃ１−Ｃ２鎖を有す
るＦＶＩＩＩａを生成する。一実施形態において、本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質
は、非活性ＦＶＩＩＩである。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質は活性化Ｆ
ＶＩＩＩである。
ＶＷＦタンパク質に結合される、またはそれと会合するＦＶＩＩＩポリペプチドを有す
るタンパク質は、配列番号１６もしくは１８と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含
むことができ、該配列は、ＦＶＩＩＩ凝固活性、例えば、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子（Ｆ
Ｘａ）に変換するために補因子として第ＩＸ因子を活性化すること、を有する。
いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末
端もしくはＮ末端に融合される、またはＦＶＩＩＩタンパク質内の２個の隣接するアミノ
酸の間に挿入される１つ以上の異種部分をさらに含む。他の実施形態において、異種部分
は、少なくとも約５０個のアミノ酸、少なくとも約１００個のアミノ酸、少なくとも約１
５０個のアミノ酸、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約２５０個のアミノ酸
、少なくとも約３００個のアミノ酸、少なくとも約３５０個のアミノ酸、少なくとも約４
００個のアミノ酸、少なくとも約４５０個のアミノ酸、少なくとも約５００個のアミノ酸
、少なくとも約５５０個のアミノ酸、少なくとも約６００個のアミノ酸、少なくとも約６
５０個のアミノ酸、少なくとも約７００個のアミノ酸、少なくとも約７５０個のアミノ酸
、少なくとも約８００個のアミノ酸、少なくとも約８５０個のアミノ酸、少なくとも約９
００個のアミノ酸、少なくとも約９５０個のアミノ酸、または少なくとも約１０００個の
アミノ酸のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラ分子の半減期は、
野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５
倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少な
くとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも
約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長される。
他の例となるＦＶＩＩＩ変異体はまた、２０１３年１月１７日公開の米国公開第ＵＳ２
０１３／００１７９９７号、２０１３年８月２２日公開の国際公開番号ＷＯ２０１３／１
２２６１７、または２０１４年１月１６日公開の国際公開番号ＷＯ２０１４／０１１８１
９、または国際公開番号ＷＯ２０１３１２３４５７ Ａ１、または国際出願番号ＰＣＴ／
ＵＳ２０１３／０４９９８９にも開示される。
ＩＩＩ． ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び作製方法
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書内に記載されるキメラ分子をコード
するポリヌクレオチドである。ＶＷＦタンパク質が、ＶＷＦリンカーを介して異種部分に
、及び単一ポリペプチド鎖としてキメラタンパク質内でＦＶＩＩＩタンパク質及びＸＴＥ
Ｎ配列に結合されるとき、本発明は、単一ポリペプチド鎖をコードする単一ポリヌクレオ
チドに注目する。キメラタンパク質が、第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポ
リペプチド鎖が、ＶＷＦタンパク質、ＸＴＥＮ配列、及びＶＷＦリンカーを介して第１の
異種部分（例えば、第１のＦｃ領域）を含み、第２のポリペプチド鎖が、ＦＶＩＩＩタン
パク質及び第２の異種部分（例えば、第２のＦｃ領域）を含むとき、ポリヌクレオチドは
、第１のヌクレオチド領域及び第２のヌクレオチド領域を含むことができる。一実施形態
において、第１のヌクレオチド領域及び第２のヌクレオチド領域は、同じポリヌクレオチ
ド上にある。別の実施形態において、第１のヌクレオチド領域及び第２のヌクレオチド領
域は、２つの異なるポリヌクレオチド（例えば、異なるベクター）上にある。ある特定の
実施形態において、本発明は、第１のヌクレオチド鎖及び第２のヌクレオチド鎖を含み、
第１のヌクレオチド鎖がＶＷＦタンパク質、ＸＴＥＮ配列、ＶＷＦリンカー、及びキメラ
タンパク質の異種部分をコードし、かつ第２のヌクレオチド鎖が、ＦＶＩＩＩタンパク質
及び第２の異種部分をコードする、ポリヌクレオチドのセットを対象とする。いくつかの
実施形態において、本発明は、第１のヌクレオチド鎖及び第２のヌクレオチド鎖を含み、
第１のヌクレオチド鎖がＶＷＦタンパク質、及びキメラタンパク質の異種部分をコードし
、かつ第２のヌクレオチド鎖が、ＦＶＩＩＩリンカーを介して第２の異種部分に融合され
るＦＶＩＩＩタンパク質をコードし、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列がキメラタンパク質
に融合される、ポリヌクレオチドのセットを対象とする。他の実施形態において、本発明
は、第１のヌクレオチド鎖及び第２のヌクレオチド鎖を含み、第１のヌクレオチド鎖がＶ
ＷＦタンパク質、ＶＷＦリンカー、及びキメラタンパク質の異種部分をコードし、かつ第
２のヌクレオチド鎖が、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩＩリンカー、及び第２の異種部
分をコードし、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列がキメラタンパク質に融合される、ポリヌ
クレオチドのセットを対象とする。
他の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、タンパク質転換酵素をコードす
る追加のヌクレオチド鎖（例えば、キメラポリペプチドが単一ポリヌクレオチド鎖によっ
てコードされるときは第２のヌクレオチド鎖、キメラタンパク質が２つのポリヌクレオチ
ド鎖にコードされるときは第３のヌクレオチド鎖）をさらに含む。タンパク質転換酵素は
、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン５型（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、プ
ロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋ
ｅｘ ２、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン３型（ＰＡＣＥまたはＰＣＳ
Ｋ３）、またはそれらの２つ以上の組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態に
おいて、タンパク質転換酵素は、ＰＡＣＥ、ＰＣ５、またはＰＣ７である。特定の実施形
態において、タンパク質転換酵素は、ＰＣ５またはＰＣ７である。参照により本明細書に
組み込まれる、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６８を参照。別の実施形態
において、タンパク質転換酵素は、ＰＡＣＥ／フューリンである。
ある特定の実施形態において、本発明は、ＶＷＦリンカーを介して第１の異種部分に融
合されるＶＷＦのＤ’ドメイン及びＤ３ドメインを含むＶＷＦタンパク質をコードする第
１のヌクレオチド配列、ＦＶＩＩＩタンパク質及び第２の異種部分をコードする第２のヌ
クレオチド配列、ならびにＶＷＦのＤ１ドメイン及びＤ２ドメインをコードする第３のヌ
クレオチド配列を含み、ＸＴＥＮ配列が第１の鎖または第２の鎖のいずれかの中に存在す
る、ポリヌクレオチドのセットを含む。この実施形態において、Ｄ１ドメイン及びＤ２ド
メインは、適切なジスルフィド結合形成及びＤ’Ｄ３ドメインの折畳みのために、別々に
発現される（ＶＷＦタンパク質のＤ’Ｄ３ドメインに結合されない）。Ｄ１Ｄ２ドメイン
発現は、シスまたはトランスのいずれかであり得る。
本明細書において使用される場合、発現ベクターは、挿入されたコード配列の転写及び
翻訳に必要な要素、またはＲＮＡウイルスベクターの場合は、適切な宿主細胞に導入され
るときに複製及び翻訳に必要な要素を含む、任意の核酸構築物を指す。発現ベクターは、
プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びそれらの誘導体を含むことができる。
本発明の発現ベクターは、キメラ分子をコードするポリヌクレオチドを含むことになる
。
一実施形態において、キメラ分子のためのコード配列は、発現制御配列に作動可能に結
合される。本明細書において使用される場合、２つの核酸配列は、それらが、各構成要素
核酸配列がその機能性を保持することを可能にするような方法で共有結合的に結合される
とき、作動可能に結合される。コード配列及び遺伝子発現制御配列は、それらが、遺伝子
発現制御配列の影響もしくは制御下で発現またはコード配列の転写及び／もしくは翻訳を
配置するような方法で共有結合的に結合されるとき、作動的に結合されると言われる。２
つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列内のプロモーターの導入がコード配列の転写をも
たらす場合、及び２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト変異の導入を
もたらさない、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力を妨害しない
、または（３）相当するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合、
作動的に結合されると言われる。このため、遺伝子発現配列がコード核酸配列に作動的に
結合されるのは、遺伝子発現配列がその核酸配列の転写に作用することができるために、
結果として生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される場合である
。
本明細書で使用される場合、遺伝子発現制御配列は、作動的に結合されるコード核酸の
効率的な転写及び翻訳を促進する、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサー
の組み合わせなどの任意の調節ヌクレオチド配列である。遺伝子発現制御配列は、例えば
、構成的または誘導性プロモーターなどの、哺乳動物またはウイルスプロモーターであり
得る。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子のためのプロモーターが挙げ
られるが、これらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（
ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンプロモーター
、及び他の構成的プロモーター。真核細胞内で構成的に機能する例となるウイルスプロモ
ーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスからのプロモーター（ＣＭＶ）、シミア
ンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイ
ルス及び他のレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびに単純ヘルペスウイ
ルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者
に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモ
ーターも含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチ
オネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で転写及び翻訳を促進するよう
に誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
一般に、遺伝子発現制御配列は、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、Ｃ
ＡＡＴ配列等など、転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写及び５’非翻訳配
列を含むものとする。特に、そのような５’非転写配列は、作動可能に結合されたコード
核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むことになる。遺
伝子発現配列は、所望であれば、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を任意
に含む。
ウイルスベクターは、以下のウイルスからの核酸配列を含むが、これらに限定されない
：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、
及びラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、
ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタインバーウイルス、パピローマウイ
ルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、及びレトロウイルスな
どのＲＮＡウイルス。当該技術分野で周知の他のベクターを容易に用いることができる。
ある特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子と置き換えられている非細
胞変性真核ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスはレトロウイルスを含み、その生活環
はゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、その後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス
組み込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に認可されている。最も有用な
のは、複製欠損である（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することは可能である
が、感染粒子を製造することは不可能である）レトロウイルスである。そのような遺伝子
改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおける遺伝子の高効率形質導入に
一般有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準プロトコル（外因性
遺伝物質のプラスミドへの組み込み、パッケージング細胞株へのプラスミドのトランスフ
ェクション、パッケージング細胞株による組み換えレトロウイルスの産生、組織培地から
のウイルス粒子の収集、及び標的細胞のウイルス粒子への感染の工程を含む）は、Ｋｒｉ
ｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９９０）、及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆ
ｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）内に提供される。
一実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスである
。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作され得、かつ幅広い細胞型及び種に
感染することが可能である。それは、熱及び脂肪族溶媒安定性、造血細胞を含む多様な系
統の細胞における高い形質導入頻度、ならびに重感染阻害がなく、したがって、複数回の
形質導入が可能になるなどの利点をさらに有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを
、部位特異的様態でヒト細胞ＤＮＡに組み込むことができ、それによって挿入突然変異誘
発の可能性、及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入された遺伝子発現の変動性を最小限
にすることができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧がない場合には
１００回超の継代で、組織培養中で行われており、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込み
が比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の様
式でも機能することができる。
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当
該技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照。過去数年において、プラスミドベ
クターは、宿主ゲノム内で複製すること、及び宿主ゲノム内に統合することができないた
めに、インビボにおいて遺伝子を細胞に送達するのに特に有利であることが発見されてい
る。しかしながら、宿主細胞と互換性があるプロモーターを有するこれらのプラスミドは
、プラスミド内で作動可能にコードされる遺伝子からペプチドを発現することができる。
商業用供給業者から入手可能ないくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢ
Ｒ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、様々なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、様
々なｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。特定
のプラスミドの追加の例としては、すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃ
Ａ．）より、カタログ番号Ｖ７９０２０のｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ８７０２０
のｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８６３２０のｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−
Ｈｉｓ、及びカタログ番号Ｖ５３２２０のｐＢｕｄＣＥ４．１が挙げられる。他のプラス
ミドは、当業者に周知である。さらに、プラスミドは、ＤＮＡの特定の断片を除去及び／
または付加するために、標準分子生物学技術を用いてカスタム設計され得る。
本発明のタンパク質を産生するために使用され得る１つの昆虫発現系において、キンウ
ワバ科核多角体病（ｐｏｌｙｈｉｄｒｏｓｉｓ）ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子
を発現するためにベクターとして使用される。該ウイルスは、スポドプテラフルギペルダ
細胞内で増殖する。コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、多角体遺伝子）内に
クローン化され、ＡＣＮＰＶプロモーター（例えば、多角体プロモーター）の制御下に置
かれる。コード配列の挿入の成功は、多角体遺伝子の不活性化、及び非閉塞性組み換えウ
イルス（すなわち、多角体遺伝子でコードされるタンパク質性コートを欠くウイルス）の
産生をもたらすことになる。これらの組み換えウイルスは、次いで、挿入された遺伝子が
発現されるスポドプテラフルギペルダ細胞を感染させるために使用される。（例えば、Ｓ
ｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４、米国特許第４，２
１５，０５１号を参照。）この発現系のさらなる例は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，
ｅｄｓ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆Ｗｉｌ
ｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ内に見出され得る。
本発明のタンパク質を発現するために使用され得る別の系は、「ＧＳ発現系」（Ｌｏｎ
ｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＰＬＣ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ ＵＫ）とも称される、グルタ
ミンシンテターゼ遺伝子発現系である。この発現系は、米国特許第５，９８１，２１６号
に詳細に記載される。
哺乳動物宿主細胞において、数多くのウイルスベース発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして使用される場合において、コード配列は、アデノウイルス転
写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リー
ダー配列に連結され得る。このキメラ遺伝子は、次いで、インビトロまたはインビボ組み
換えによってアデノウイルスゲノム内に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例
えば、領域Ｅ１またはＥ３）内への挿入は、感染した宿主内で生存でき、かつペプチドを
発現することが可能である組み換えウイルスもたらすことになる。例えば、Ｌｏｇａｎ
＆Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３６
５５）を参照。代替的に、ワクシニア７．５Ｋプロモーターが使用され得る。例えば、Ｍ
ａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ７９：７４１５、Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４９
：８５７、Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：４９２７を参照。
産生の効率を高めるために、ポリヌクレオチドは、酵素的切断部位によって分離される
本発明のタンパク質の複数単位をコードするように設計され得る。結果として生じるポリ
ペプチドは、ポリペプチド単位を回収するために、（例えば、適切な酵素で処理すること
によって）切断され得る。これによって、単一のプロモーターによって引き起こされるポ
リペプチドの収量を増加させることができる。適切なウイルス発現系において使用される
とき、ｍＲＮＡによってコードされる各ポリペプチドの翻訳は、例えば、内部リボソーム
進入部位、ＩＲＥＳによって、転写物内で内的に指示される。このため、多シストロン性
構築物は、単一の大きな多シストロン性ｍＲＮＡの転写を指示し、代わりにそれが複数の
個々のポリペプチドの翻訳を指示する。このアプローチは、ポリタンパク質の産生及び酵
素的処理を排除し、単一のプロモーターによって引き起こされるポリペプチドの収量を著
しく増加させ得る。
形質転換に使用されるベクターは、通常、形質転換体を識別するために使用される選択
可能マーカーを含有することになる。細菌系において、これは、アンピシリンまたはカナ
マイシンなどの抗生物質耐性遺伝子を含むことができる。培養された哺乳動物細胞内での
使用のための選択可能マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキサ
ートなどの、薬物に対する耐性を付与する遺伝子を含む。選択可能マーカーは、増幅可能
な選択可能マーカーであり得る。１つの増幅可能な選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子である。Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｃ Ｃ ｅｔ ａｌ．（１９
８３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２４９５−９。選択可能
マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（１９８６）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓ
．によって概説され、選択可能マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である
。
選択可能マーカーは、目的の遺伝子と同じ時に別個のプラスミド上で細胞内に導入され
得るか、またはそれらは同じプラスミド上で挿入され得る。同じプラスミド上の場合、選
択可能マーカー及び目的の遺伝子は、異なるプロモーターまたは同じプロモーターの制御
下にあり得、後者の配置は、ジシストロン性メッセージ（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｍｅ
ｓｓａｇｅ）を産生する。このタイプの構築物は、当該技術分野において公知である（例
えば、米国特許第４，７１３，３３９号）。
発現ベクターは、組み換え産出されたタンパク質の容易な精製を可能にするタグをコー
ドすることができる。例としては、タグ付けされた融合タンパク質が産生されるように、
発現されるタンパク質のためのコード配列が、ｌａｃＺコード領域を有するフレーム内の
ベクターに連結され得る、ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８
３）ＥＭＢＯ Ｊ ２：１７９１）が挙げられるがこれに限定されず、ｐＧＥＸベクター
が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグとともに本発明のタンパク質を
発現するために使用され得る。これらのタンパク質は、通常、可溶性であり、かつグルタ
チオン−アガロースビーズへの吸着に続く遊離グルタチオン存在下での溶離によって細胞
から容易に精製されることができる。ベクターは、精製後のタグの容易な除去のために切
断部位（トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ、またはＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ
ＰＲＯＴＥＡＳＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｅａｐａｃｋ、Ｎ．Ｊ．））を含む
。
発現ベクターまたはベクターは、次いで、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞内に
トランスフェクト、またはコトランスフェクトされる。当該技術分野において公知のトラ
ンスフェクション技術は、リン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７
８）Ｃｅｌｌ １４：７２５）、電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）
ＥＭＢＯ Ｊ １：８４１）、及びリポソームベースの試薬が挙げられるが、これらに限
定されない。様々な宿主発現ベクター系が、原核細胞及び真核細胞の双方を含む、本明細
書に記載されるタンパク質を発現するために利用され得る。これらは、適切なコード配列
を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形
質転換された細菌などの微生物（例えば、大腸菌）、適切なコード配列を含有する組み換
え酵母または菌発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌、適切なコード配列を含
有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞
系、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバ
コモザイクウイルス）に感染した、または適切なコード配列を含有する組み換えプラスミ
ド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、哺乳動物細胞
（例えば、ＨＥＫ ２９３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ、ＨＫＢ１１、及びＢＨＫ細胞）
を含む動物細胞系を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。本明細書において使用される場合、
真核細胞とは、決定的な核を有する任意の動物または植物細胞を指す。動物の真核細胞は
、脊椎動物、例えば、哺乳類の細胞、及び無脊椎動物、例えば、昆虫の細胞を含む。植物
の真核細胞は、具体的には、酵母細胞を含むことができるが、これに限定されない。真核
細胞は、原核細胞、例えば、細菌とは異なる。
ある特定の実施形態において、真核細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、哺乳
類由来の任意の細胞である。哺乳動物細胞は、具体的には、哺乳動物細胞株を含むが、こ
れに限定されない。一実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。別の実施形態
において、哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎臓細胞株であるＨＥＫ ２９３細胞である。ＨＥ
Ｋ ２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡよりＣＲＬ−１５３３として、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（
Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）よりカタログ番号１１６３１−０１７の２９３−Ｆ細
胞、またはカタログ番号１１６２５−０１９の２９３−Ｆ細胞として入手可能である。い
くつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、網膜由来のヒト細胞であるＰＥＲ．Ｃ６（
登録商標）細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、Ｃｒｕｃｅｌｌ（Ｌｅｉｄｅ
ｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より入手可能である。他の実施形態において、哺
乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞は、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、
ＶＡより入手可能である。（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＣＬ−６１）。依然として他の実
施形態において、哺乳動物細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。ＢＨＫ
細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎ
ａｓｓａｓ、Ｖａより入手可能である。（例えば、ＣＲＬ−１６３２）。いくつかの実施
形態において、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びヒトＢ細胞株のハイブリッド細胞
株であるＨＫＢ１１細胞である。Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．３４（２）：１６５−７８（２００６）。
一実施形態において、ＶＷＦタンパク質、ＶＷＦリンカー、異種部分、または本発明の
キメラタンパク質をコードするプラスミドは、選択可能マーカー、例えば、ゼオシン耐性
、をさらに含み、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ ２９３細胞内にトランスフ
ェクトされる。
依然として他の実施形態において、トランスフェクトされる細胞は、安定してトランス
フェクトされる。これらの細胞は、当業者に公知の従来技術を使用して、安定した細胞株
として選択及び維持され得る。
該タンパク質のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞を、適切な増殖培地内で増殖させる。
本明細書内において使用される場合、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖のた
めに必要とされる栄養素を含有する培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養素は、
炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及び成長因子を含み得る。任意に
、培地は、１つ以上の選択因子を含有することができる。任意に、培地は、ウシ胎児（ｂ
ｏｖｉｎｅ ｃａｌｆ）血清またはウシ胎児（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ）血清（ＦＣＳ）を
含有することができる。一実施形態において、培地は、実質的にＩｇＧを含有しない。増
殖培地は、一般的に、ＤＮＡ構築物を含有する細胞のために、例えば、薬物選択、または
ＤＮＡ構築物上で選択可能マーカーによって補足される、もしくはＤＮＡ構築物でコトラ
ンスフェクトされる必須栄養素の欠乏によって選択する。培養された哺乳動物細胞は、一
般的に、市販の血清含有または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１
２）内で増殖させる。一実施形態において、培地は、ＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）である。別の実施形態において、培地は、ＣＤ１７（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）である。使用される特定の細胞株に適切
な培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。
本明細書に記載されるようなキメラ分子の２つのポリペプチド鎖（ｅｃｈａｉｎｓ）を
同時発現するために、宿主細胞は、双方の鎖の発現を可能にする条件下で培養される。本
明細書において使用される場合、培養することは、生きた細胞を少なくとも一定時間イン
ビトロで維持することを指す。維持することは、生きた細胞の数の増加を含むことができ
るが、それを含むことを必要としない。例えば、培養内に維持される細胞は、数において
静的であり得るが、依然として生存し、かつ所望の産物、例えば、組み換えタンパク質ま
たは組み換え融合タンパク質を産生することが可能である。真核細胞を培養するための好
適な条件は、当該技術分野において周知であり、培地の適切な選択、培地補足物、温度、
ｐＨ、酸素飽和度等を含む。商業目的のため、培養することは、振とうフラスコ、ローラ
ボトル、中空糸バイオリアクター、撹はん槽バイオリアクター、エアリフトバイオリアク
ター、Ｗａｖｅバイオリアクター等を含む、様々なタイプのスケールアップシステムのう
ちのいずれかの使用を含むことができる。
細胞培養条件はまた、キメラ分子内の第１の鎖と第２の鎖との会合を可能にするように
選択される。キメラ分子の発現を可能にする条件は、ビタミンＫ源の存在を含み得る。例
えば、一実施形態において、安定してトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞は、４
ｍＭのグルタミンで補足されたＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ、ＣＡ）またはＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ
）内で培養される。
一態様において、本発明は、ａ）宿主細胞にキメラ分子をコードするポリヌクレオチド
をトランスフェクトすること、及びｂ）宿主細胞を、キメラ分子を発現するために好適な
条件下で、キメラ分子が発現される培養培地内で培養することを含む、キメラタンパク質
の発現、作製、または産生方法を対象とする。
さらなる実施形態において、本キメラ分子を含有するタンパク質産物は、培地内に分泌
される。培地を、細胞から分離し、濃縮し、濾過し、次いで２つまたは３つの親和性カラ
ム、例えば、タンパク質Ａカラム及び１つまたは２つの陰イオン交換カラムに通過させる
。
ある特定の態様において、本発明は、本明細書に記載される方法によって産生されるキ
メラポリペプチドに関する。
インビトロ産生は、本発明の所望の改変ポリペプチドを大量に得るためのスケールアッ
プを可能にする。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）のた
めの技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、エアリフトリアクターもしくは
連続撹拌リアクター内での、均質懸濁液培養、または、例えば、中空糸、マイクロカプセ
ル内、アガロースマイクロビーズもしくは磁器カートリッジ上での、固定化もしくは封入
細胞培養を含む。必要な場合、及び／または所望の場合、ポリペプチドの溶液は、慣例の
クロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー、ま
たは親和性クロマトグラフィー、によって精製され得る。
本発明はまた、第１の異種部分に融合されるＶＷＦタンパク質と、第２の異種部分に融
合されるＸＴＥＮ配列及びＦＶＩＩＩタンパク質とを含むキメラＦＶＩＩＩタンパク質の
ＦＶＩＩＩ活性を改善する方法も含み、該方法は、ＶＷＦリンカーをＶＷＦタンパク質と
第１の異種部分との間に挿入することを含み、該ＶＷＦリンカーは、（ｉ）第ＶＩＩＩ因
子（ＦＶＩＩＩ）からのａ２領域、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩからのａ１領域、（ｉｉｉ）ＦＶ
ＩＩＩからのａ３領域、（ｉｖ）Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｒ（配列番号３）及びＰＡＲ１非活性部位
相互作用モチーフを含み、Ｘが脂肪族アミノ酸であるトロンビン切断部位、（ｖ）それら
の任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、
ＦＶＩＩＩ活性は、ａＰＴＴアッセイまたはＲＯＴＥＭアッセイによって測定される。
ＩＶ． 薬学的組成物
本発明のキメラ分子を含有する組成物は、好適な薬学的に許容される担体を含有し得る
。例えば、それらは、作用部位に送達するように設計された調製物への活性化合物の処理
を促進する賦形剤及び／または助剤を含有し得る。
該薬学的組成物を、大量注射による非経口投与（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉
内）のために製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル内
、または添加保存料とともに複数回投与容器内に存在し得る。該組成物は、油性もしくは
水性ビヒクル内の懸濁液、溶液、または乳濁液としてそのような形態をとることができ、
かつ懸濁化剤、安定剤、及び／または分散剤などの調合剤を含有することができる。代替
的に、活性成分は、好適なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない水を用いた構成のため
に粉末形態であり得る。
非経口投与のための好適な製剤はまた、水溶性形態にある活性化合物、例えば、水溶性
の塩、の水溶液も含む。加えて、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投
与してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合
成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性注射懸
濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及びデキスト
ランを含む、懸濁液の粘性を増加させる物質を含有してもよい。任意に、該懸濁液はまた
、安定剤を含有してもよい。リポソームもまた、細胞または間質空間への送達のために本
発明の分子をカプセル化するために使用され得る。例となる薬学的に許容される担体は、
生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収
遅延剤、水、生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノ
ール等である。いくつかの実施形態において、該組成物は、等張剤、例えば、糖、マンニ
トールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含む。他の実施形
態において、該組成物は、保存可能期間もしくは活性成分の有効性を高める、湿潤剤など
の薬学的に許容される物質、または湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤もしくは緩衝剤などの
少量の補助物質を含む。
本発明の組成物は、例えば、液体（例えば、注射用かつ注入可能溶液）、分散液、懸濁
液、半固体及び固体剤形を含む、様々な形態にあってもよい。好ましい形態は、投与及び
治療適用の様式に依存する。
該組成物は、溶液、ミクロ乳濁液、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な
他の秩序構造として製剤化され得る。滅菌注射用溶液は、適切な溶媒内で必要とされる量
の活性成分を、必要であれば上に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに組み込み
、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性成分を、塩
基性分散媒、及び上に列挙したものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに
組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ま
しい調製方法は、活性成分の粉末に加えて前もって滅菌濾過した溶液からの任意の追加の
所望の成分を産する真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシ
チンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によ
って、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続吸収は
、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを該組成物内に含む
ことによってもたらすことができる。
活性成分を、徐放性製剤または装置を用いて製剤化することができる。そのような製剤
または装置の例としては、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系が
挙げられる。生物分解可能な、生物的適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポ
リアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を
使用することができる。そのような製剤及び装置の調製のための方法は、当該技術分野に
おいて公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅ
ｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ
，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照
。
注射デポ製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生物分解可能ポリマー中で薬物
のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作成することができる。薬物
のポリマーに対する比率、及び用いられるポリマーの性質に応じて、薬物放出率を制御す
ることができる。他の例となる生物分解可能ポリマーは、ポリオルトエステル及びポリア
ンヒドリドである。デポ注射用製剤はまた、リポソームまたはミクロ乳濁液中に薬物を封
入することによって調製することができる。
補足的活性化合物を該組成物に組み込むことができる。一実施形態において、本発明の
キメラ分子は、別の凝固因子、またはその変異体、断片、類似体、もしくは誘導体を用い
て製剤化される。例えば、凝固因子としては、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子
、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン
、フィブリノーゲン、フォンヴィレブランド因子、もしくは組み換え可溶性組織因子（ｒ
ｓＴＦ）、または前述のいずれかの活性化形態が挙げられるが、これらに限定されない。
止血薬の凝固因子はまた、抗繊維素溶解薬、例えば、イプロシン−アミノ−カプロン酸、
トラネキサム酸も含むことができる。
投薬計画を、最適な所望の反応を提供するために調整してもよい。例えば、単一の丸薬
を投与してもよく、いくつかに分割された投与量を、時間をかけて投与してもよく、また
は投与量を治療状況の要求によって示されるように比例的に減少または増加させてもよい
。投与の容易性及び投薬量の均一性のために単位剤形で非経口組成物を製剤化することは
有利である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９８０）を参照。
活性化合物に加え、液体剤形は、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベ
ンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコ
ール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、
ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステルなどの不活性成分を含有して
もよい。
好適な薬学的担体の非限定的な例はまた、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎにも記載される。賦形剤
のいくつかの例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽
、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレ
ート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水
、エタノール等が挙げられる。該組成物はまた、ｐＨ緩衝試薬、及び湿潤剤または乳化剤
を含有することもできる。
経口投与のために、該薬学的組成物は、従来の手法によって調製された錠剤またはカプ
セル剤の形態をとることができる。該組成物はまた、液体、例えば、シロップまたは懸濁
液として調製することもできる。該液体は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、
セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性
ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画した植
物油）、及び保存剤（例えば、メチル、またはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸もしく
はソルビン酸）を含むことができる。該調製物はまた、香味剤、着色剤、及び甘味剤も含
むことができる。代替的に、該組成物は、水または別の好適なビヒクルを用いた構成のた
めの乾燥製品として存在し得る。
口腔投与のため、該組成物は、従来のプロトコルに従う錠剤または舐剤の形態をとって
もよい。
吸入による投与のため、本発明に従って使用するための化合物は、賦形剤を伴ってもし
くは伴わずに噴霧されるエアロゾルの形態で、または任意に噴射剤、例えば、ジクロロジ
フルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭
素もしくは他の好適なガスを伴う加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形
態で、簡便に送達される。加圧されるエアロゾルの場合には、投薬単位は、計量された量
を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器での
使用のための、例えば、ゼラチン、のカプセル剤及びカートリッジは、該化合物の粉末混
合物、及びラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースを含有して製剤化され得る
。
該薬学的組成物はまた、例えば、ココアバターまたはグリセリドなどの他の従来の坐薬
ベースを含んで、坐薬または停留浣腸として直腸投与するために製剤化され得る。
Ｖ．遺伝子療法
本発明のキメラ分子は、哺乳類、例えば、ヒト患者内で、インビボで産生され得、出血
凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷
、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出
血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、または腸腰筋鞘における出血から選
択される出血性疾患もしくは障害の治療に対する遺伝子療法アプローチを使用することは
、治療に有益である。一実施形態において、出血性疾患または障害は、血友病である。別
の実施形態において、出血性疾患または障害は、血友病Ａである。これは、好適な発現制
御配列に作動可能に結合される好適なキメラ分子コード核酸の投与に関与する。ある特定
の実施形態において、これらの配列は、ウイルスベクター内に組み込まれる。そのような
遺伝子療法のために好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチ
ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パ
ポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、
及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠
損ウイルスベクターであり得る。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、そ
のＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子内に欠失を有する。アデノウイルスベクターが使用される
とき、哺乳類は、選択可能マーカー遺伝子をコードする核酸に曝露されない場合がある。
他の実施形態において、該配列は、当業者に公知の非ウイルス性ベクター内に組み込まれ
る。
ＶＩ． キメラタンパク質の使用方法
本発明は、本発明のキメラ分子を使用した、出血発症の頻度または程度の減少を必要と
する対象における出血発症の頻度または程度の減少方法をさらに提供する。例となる方法
は、治療有効量の本発明のキメラ分子を、それを必要とする対象に投与することを含む。
他の態様において、本発明は、本発明のキメラ分子を使用した、出血発症の発生の予防を
必要とする対象における出血発症の発生の予防方法を含む。他の態様において、本発明の
組み換えタンパク質をコードするＤＮＡを含む組成物を、それを必要とする対象に投与す
ることができる。本発明のある特定の態様において、本発明のキメラ分子を発現する細胞
を、それを必要とする対象に投与することができる。本発明のある特定の態様において、
薬学的組成物は、（ｉ）キメラ分子、（ｉｉ）キメラ分子をコードする単離された核酸、
（ｉｉｉ）キメラ分子をコードする核酸を含むベクター、（ｉｖ）キメラ分子をコードす
る単離された核酸を含む細胞、及び／もしくはキメラ分子をコードする核を含むベクター
、または（ｖ）それらの組み合わせを含み、該薬学的組成物は許容される賦形剤もしくは
担体をさらに含む。
出血発症は、血液凝固障害によって引き起こされる、またはそれに由来し得る。血液凝
固障害は、凝血異常とも称され得る。一例において、本開示の薬学的組成物を用いて治療
することができる血液凝固障害は、血友病またはフォンヴィレブランド病（ｖＷＤ）であ
る。別の例において、本開示の薬学的組成物を用いて治療することができる血液凝固障害
は、血友病Ａである。
いくつかの実施形態において、出血病態に関連した出血の種類は、関節血症、筋肉出血
、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋
内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹
膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血、またはそれらの任意の組み合わせから選択
される。
他の実施形態において、出血病態を患う患者は、例えば、外科的予防または週術期管理
を含む、手術のための治療を必要としている。一例において、手術は、小手術または大手
術から選択される。例となる外科的手技としては、抜歯、扁桃摘出術、鼠径ヘルニア切開
術、滑膜切除術、開頭、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、関
節置換手術（例えば、全膝置換、股関節置換等）、心臓手術、及び帝王切開術が挙げられ
る。
別の例において、対象は、第ＩＸ因子を用いて併用治療される。本発明の化合物は、Ｆ
ＩＸａを活性化することが可能であるため、ＦＩＸａを対象に投与する前にＦＩＸａポリ
ペプチドを予備活性化するために使用することができる。
本発明の方法は、予防的治療またはオンデマンド治療を必要とする対象において実施さ
れ得る。
本発明のキメラ分子を含む薬学的組成物は、例えば、局所（例えば、経皮もしくは眼）
、経口、頬側、鼻腔、膣、直腸、または非経口投与を含む、投与の任意の適切な様式用に
製剤化され得る。
非経口という用語は、本明細書において使用される場合、皮下、皮内、血管内（例えば
、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、関節滑液嚢内、及
び腹腔内注射、ならびに任意の同様の注射または注入技術を含む。該組成物はまた、例え
ば、懸濁液、乳濁液、徐放性製剤、クリーム、ゲル、または粉末でもあり得る。該組成物
は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて、坐薬として製剤化され得る。
ここまで本発明を詳細に説明してきたが、例示の目的のみために本明細書に包含され、
本発明を限定するようには意図されていない、以下の実施例を参照することによって同じ
ことがより明確に理解されるであろう。本明細書内で言及されるすべての特許及び刊行物
は、参照により明白に組み込まれる。
別途明記されない限り、本実施例を通して、以下の材料及び方法を使用した。
材料及び方法
一般に、本発明の実施は、別途示されない限り、化学、生物物理学、分子生物学、組み
換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）の従来技術、及び電気泳動における
標準技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，
Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ＣＳ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９
）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（
１９９２）を参照。
実施例１．様々なＶＷＦ構築物のトロンビン媒介Ｄ’Ｄ３放出の評価
この実施例は、図２に記載された様々なＶＷＦ構築物の３７℃でのトロンビン媒介Ｄ’
Ｄ３放出の動態を評価する。Ｂｉｏｃｏｒｅ実験を、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインとＦｃと
の間に異なるトロンビン切断可能リンカーを含有するＶＷＦ−Ｆｃ構築物を用いて行った
。最終目標は、ＶＷＦ−Ｆｃトロンビン消化から収集した情報を本明細書に記載されるよ
うなＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロ二量体に適用することである。すべてのＶＷＦ−Ｄ’Ｄ３
構築物をチップ上で泳動させ、１００〜７００ＲＵの範囲のタンパク質の捕捉密度を達成
した。ＶＷＦ構築物をチップ上で捕捉した後、５Ｕ／ｍｌのトロンビンを５分間表面にわ
たって注射した。切断可能構築物内のＤ’Ｄ３が放出される一方、Ｆｃはチップに結合し
たままである。速度（ＲＵ／秒）と捕捉密度（ＲＵ）の対比を、図３及び４に示されるよ
うにプロットした。切断速度は、開始捕捉密度に比例し、一方、傾斜は、各構築物のトロ
ンビン切断に対する感受性の尺度を提供した。
図３は、ＶＷＦ−０５２（リンカー領域内にトロンビン切断部位を有しない）が、予測
どおりに、トロンビンによって切断されないことを示す。ＶＷＦ−０３９（ＰＡＲ１部位
を有するＬＶＰＲ）の速度は、ＦＶＩＩＩ切断速度（データは示されない）に匹敵する。
このため、ＶＷＦ−０３９は、Ｆｃからの完全なＤ’Ｄ３放出のためのベンチマークとし
て機能した。ＶＷＦ−０３９に関して、様々なＶＷＦ−Ｆｃ構築物の傾斜の比率が、トロ
ンビン切断の効率を決定するために使用された。ＶＷＦ−０３９（ＰＡＲ１部位を有する
ＬＶＰＲ）は、ＶＷＦ−０３１（ＬＶＰＲ）よりもおよそ７０〜８０倍速くトロンビンで
切断される。ＶＷＦ−５１（ＡＬＲＰＲＶＶ）は、ＶＷＦ−０３１（ＬＶＰＲ）よりも１
．８倍速く切断される。ＬＶＰＲ部位に沿って２８８ＸＴＥＮを含有するＶＷＦ−０３４
は、ＶＷＦ−０３１と比較して遅い切断を示した。
ＶＷＦ−Ｆｃ構築物をまた、リンカー領域内のＦＶＩＩＩタンパク質の異なる酸性領域
（ａ１、ａ２、及びａ３）を導入することによって作製した。Ｄ’Ｄ３とＦｃ領域との間
にａ２領域を含有するＶＷＦ−０５５は、ＶＷＦ−０３９構築物と同様のトロンビン切断
を示した。図４に示されるように、ＶＷＦ−０５４（ａ１領域）及びＶＷＦ−０５６（ａ
３領域）は、約５分の１減少したトロンビン切断を示した。
図５は、異なるＶＷＦ構築物のトロンビン切断曲線の傾斜値を示す。これらの結果から
、ＦＶＩＩＩの酸性領域２（ａ２）は、高効率のトロンビン切断部位であると思われ、本
明細書に記載されるようにＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロ二量体に組み込んだ。
実施例２．ＨｅｍＡ患者全血ＲＯＴＥＭアッセイを用いたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦＤ’Ｄ３ヘ
テロ二量体の止血能力の評価
異なるトロンビン切断可能リンカーを含むＦＶＩＩＩ／ＶＷＦＤ’Ｄ３ヘテロ二量体を
、止血に関する能力のためのＨｅｍＡドナー全血ＲＯＴＥＭ（回転トロンボエラストメト
リ）アッセイ内で評価した。全血試料を、抗凝血剤としてクエン酸ナトリウムを用いて、
重度血友病Ａ出血性疾患を有するドナーから収集した。血液試料収集の４０分後、異なる
トロンビン切断可能リンカー、ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３１（４８ａａ、ＬＶＰＲ部
位）、ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３９（２６ａａ、ＬＶＰＲ＋ＰＡＲ１部位）、ＦＶＩ
ＩＩ１５５／ＶＷＦ０５５（３４ａａ、ＦＶＩＩＩからのａ２）を含有するＦＶＩＩＩ／
ＶＷＦＤ’Ｄ３ヘテロ二量体変異体を、ＦＶＩＩＩ色素産生アッセイによって測定される
通常の１００％、３０％、１０％、及び３％の最終濃度まで全血試料中に希釈した。ＦＶ
ＩＩＩ／ＶＷＦＤ’Ｄ３ヘテロ二量体の添加直後、ＣａＣｌ２の添加によって、ＲＯＴＥ
Ｍ反応を開始した。凝固時間（試験の始めから２ｍｍの振幅に達するまでの時間）を、装
置によって記録し、試料中のＦＶＩＩＩ濃度に対してプロットした（図６）。より能力の
高いＦＶＩＩＩ／ＶＷＦＤ’Ｄ３ヘテロ二量体ほどより速い凝固プロセスを誘導するため
、より能力の低いＦＶＩＩＩ／ＶＷＦＤ’Ｄ３ヘテロ二量体と比較してより短い凝固時間
をもたらすという仮説を立てた。図６に示されるように、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ０３９ヘテ
ロ二量体を添加した試料は、試験されたすべての濃度において最も短い凝固時間を有し、
ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ０３１ヘテロ二量体を添加した試料は、すべての濃度において最も長
い凝固時間を有した。ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０５５ヘテロ二量体を添加した試料の凝
固時間は、中間であった。したがって、止血能力のランクは、ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ
０３９＞ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０５５＞ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３１である。３
つの分子間の唯一の違いは、ＶＷＦタンパク質とＦｃ領域との間のトロンビン切断可能リ
ンカーであるため、この結果は、ＬＶＰＲ部位、及びＰＡＲ１非活性部位相互作用モチー
フ、及びＦＶＩＩＩのａ２領域を含むリンカーが、ＬＶＰＲ部位のみよりも良好に機能す
ることを示す。
実施例３．ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ二量体の活性の評価
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ／ＶＷＦヘテロ二量体構築物を、３つのプラスミド、第１の発現
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ、第２の発現ＶＷＦ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ、及び第３の発現ＰＡ
ＣＥ、を使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクション
には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）標準プロトコルを使用し、トランスフェクションの
５日後、組織培地を採取した。ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロ二量体の様々な組み合わせを、
培地から精製した。精製したタンパク質の活性を、標準プロトコルを使用して、色素産生
（二段階）及びａＰＴＴ（一段階）の双方の凝固アッセイで試験した。ＦＶＩＩＩとＦｃ
との間、またはＤ’Ｄ３とＦｃとの間へのＦＶＩＩＩの酸性領域２（ａ２）の導入（表７
Ａ及び図７に示される）が、表７Ｃに示されるように、ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロ二量体
のａＰＴＴ活性を改善した。例えば、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９ヘテロ二量体は、
Ｄ’Ｄ３−Ｆｃリンカー領域内にａ２トロンビン切断部位を有し、表７Ｃに示されるよう
にＤ’Ｄ３Ｆｃリンカー内にＬＶＰＲトロンビン部位を含有するＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷ
Ｆ０５７よりも良好なａＰＴＴ活性を有する。
同様に、ＦＶＩＩＩとＦｃとの間へのａ２領域の組み込みは、表７Ｂに示されるように
、改善されたＦＶＩＩＩ２８６／ＶＷＦ０５９及びＦＶＩＩＩ２８６／ＶＷＦ０６２の色
素産生とａＰＴＴの比によって明らかなように、ヘテロ二量体の一段階凝固活性を増加さ
せた。
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853
実施例４：ＨｅｍＡマウス尾切断出血モデルにおけるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ−Ｆｃ／Ｄ’
Ｄ３−ＸＴＥＮ−Ｆｃヘテロ二量体の急性効果
異なるトロンビン切断可能リンカーを含有するヘテロ二量体の急性効果を、ＨｅｍＡマ
ウス尾切断出血モデルを使用して評価した。
８〜１２週齢のオスのＨｅｍＡマウスを、５つの治療群に無作為に分け、それぞれＳＱ
ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷ
Ｆ０５７、ｒＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０５９、またはビヒクル溶液の一回の静脈内投与
で治療した。ＦＶＩＩＩの発症時治療を模倣するために（正常なＦＶＩＩＩ血漿レベルの
５０〜１００％を再構成するため）、選択したＦＶＩＩＩ治療用量は、ＦＶＩＩＩ ａＰ
ＴＴ活性によって測定される、７５ＩＵ／ｋｇである。この用量レベルでは、すべての試
験ＦＶＩＩＩ変異体は、投与後５分で正常なマウス血漿ＦＶＩＩＩ活性の約７０％を再構
成することになる。
この尾切断手順は以下のように行った。簡単に言うと、尾損傷の前にマウスに５０ｍｇ
／ｋｇのケタミン／０．５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジンの混合物で麻酔をかけ、体温
の維持を助けるために３７℃の加熱パッド上に置いた。次いで、マウスの尾を３７℃の生
理的食塩水に１０分間浸漬し、支脈を拡張させた。血管拡張後、ＦＶＩＩＩ変異体または
ビヒクル溶液を、尾の血管を介して注射し、次いで、投与後５分で直刃１１番の外科用メ
スを使用して尾の末端５ｍｍを切断した。流血を、１３ｍｌの３７℃生理的食塩水中に３
０分間収集し、失血量を採血管の重量変化により決定した：失血量＝（収集管最終重量−
開始重量＋０．１０）ｍｌ。統計分析を、ｔ検定（コルモゴロフ−スミルノフ検定）、及
び一元配置ＡＮＯＶＡ（クラスカル−ウォリス検定、事後検定：Ｄｕｎｎｓ多重比較検定
）を使用して行った。
本研究における各個々の動物からの失血量を図８にプロットした。失血量の著しい減少
は、ビヒクル処理された動物（ｐ＜０．０５、表８）と比較してすべてのＦＶＩＩＩ治療
群で観測された。同様の失血減少が、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ治療（ｐ＞０．５、表８）と比
較してすべてのヘテロ二量体治療群から観測され、ヘテロ二量体分子がオンデマンド治療
にＳＱ ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと同じだけ有効である可能性を提示した。
Figure 2021072853
ｐＳＹＮ ＶＷＦ０５７ヌクレオチド配列（リンカー内にＬＶＰＲトロンビン部位を有す
るＶＷＦ Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ）（配列番号７９）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

ｐＳＹＮ ＶＷＦ０５７タンパク質配列（リンカー内にＬＶＰＲトロンビン部位を有する
ＶＷＦ Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ）：太字下線の部分は、リンカー領域を含有するトロンビン切断
可能ＬＶＰＲを示す（配列番号８０）
Figure 2021072853

ｐＳＹＮ ＶＷＦ０５９ヌクレオチド配列（リンカー内に酸性領域２（ａ２）トロンビン
部位を有するＶＷＦ Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ）（配列番号８１）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

ｐＳＹＮ ＶＷＦ０５９タンパク質配列（リンカー内にＬＶＰＲトロンビン部位を有する
ＶＷＦ Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ）−太字下線部分は、ａ２領域を示す（配列番号８２）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

ｐＳＹＮ ＶＷＦ０６２ヌクレオチド配列（リンカー内にトロンビン部位を有しないＶＷ
Ｆ Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ）（配列番号８３）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

ｐＳＹＮ ＶＷＦ０６２タンパク質配列（リンカー内にトロンビン部位を有しないＶＷＦ
Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ）（配列番号８４）
Figure 2021072853

Figure 2021072853


ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ ２８６ヌクレオチド配列（ＦＶＩＩＩとＦｃとの間に追加のａ２
領域を有するＦＶＩＩＩ−Ｆｃ）（配列番号８５）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ２８６タンパク質配列（ＦＶＩＩＩとＦｃとの間に追加のａ２領域
を有するＦＶＩＩＩ−Ｆｃ、太字及び下線で示される）（配列番号８６）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

ＦＶＩＩＩ１６９ヌクレオチド配列（配列番号８７）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

ＦＶＩＩＩ１６９タンパク質配列（配列番号８８）
Figure 2021072853

ＶＷＦ０３４ヌクレオチド配列（配列番号９１）
Figure 2021072853

Figure 2021072853

Figure 2021072853

ＶＷＦ０３４タンパク質配列（配列番号９２）
Figure 2021072853

Figure 2021072853
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的性質を完全に明らかにするものである
ため、当該技術分野内の知識を適用することによって、当業者は、不要な実験をすること
なく、本発明の一般概念から逸脱することなく、容易に、そのような特定の実施形態を修
正する及び／または様々な用途に適合させることができる。したがって、そのような適用
及び修正は、本明細書に提示される教示及び指導に基づき、開示される実施形態の同等物
の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書内の語法または用語は制限ではなく
説明を目的としているため、本明細書の用語または語法は、教示及び指導に照らして当業
者によって解釈されることを理解されたい。
本発明の他の実施形態は、本明細書の考察及び本明細書に開示される本発明の実施から
、当業者に明らかとなろう。本明細書及び実施例は、例示的なものにすぎないと見なされ
ることが意図され、本発明の真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される
。
本明細書内で引用されるすべての特許及び刊行物は、参照によりその全体が本明細書に
組み込まれる。
本出願は、２０１３年６月２８日出願の米国仮特許出願第６１／８４０，８７２号の優
先権の利益を主張するものである。上記出願の内容は、参照によってその全体が本明細書
内に組み込まれる。

Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。
JP2021018123A 2013-06-28 2021-02-08 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用 Active JP7005800B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021163956A JP7297837B2 (ja) 2013-06-28 2021-10-05 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361840872P 2013-06-28 2013-06-28
US61/840,872 2013-06-28

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018195860A Division JP2019010124A (ja) 2013-06-28 2018-10-17 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021163956A Division JP7297837B2 (ja) 2013-06-28 2021-10-05 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021072853A true JP2021072853A (ja) 2021-05-13
JP7005800B2 JP7005800B2 (ja) 2022-02-10

Family

ID=52142742

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016524268A Pending JP2016523919A (ja) 2013-06-28 2014-06-27 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用
JP2018195860A Pending JP2019010124A (ja) 2013-06-28 2018-10-17 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用
JP2021018123A Active JP7005800B2 (ja) 2013-06-28 2021-02-08 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用
JP2021163956A Active JP7297837B2 (ja) 2013-06-28 2021-10-05 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用
JP2023097660A Pending JP2023107932A (ja) 2013-06-28 2023-06-14 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016524268A Pending JP2016523919A (ja) 2013-06-28 2014-06-27 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用
JP2018195860A Pending JP2019010124A (ja) 2013-06-28 2018-10-17 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021163956A Active JP7297837B2 (ja) 2013-06-28 2021-10-05 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用
JP2023097660A Pending JP2023107932A (ja) 2013-06-28 2023-06-14 Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用

Country Status (17)

Country Link
US (3) US20160251408A1 (ja)
EP (2) EP4368194A2 (ja)
JP (5) JP2016523919A (ja)
KR (3) KR20240023705A (ja)
CN (3) CN113831415A (ja)
AU (3) AU2014302100B2 (ja)
CA (1) CA2913078A1 (ja)
CL (1) CL2015003710A1 (ja)
EA (1) EA201592022A1 (ja)
HK (1) HK1223302A1 (ja)
IL (3) IL297611A (ja)
MX (1) MX2015016567A (ja)
NZ (1) NZ713904A (ja)
PH (1) PH12015502614A1 (ja)
SG (3) SG11201509313PA (ja)
TW (3) TW202313672A (ja)
WO (1) WO2014210558A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8716448B2 (en) 2009-02-03 2014-05-06 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
NZ626945A (en) 2012-01-12 2016-10-28 Biogen Ma Inc Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof
KR20190094480A (ko) 2012-02-15 2019-08-13 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 재조합 인자 viii 단백질
CN111548418A (zh) 2012-02-15 2020-08-18 比奥贝拉蒂治疗公司 因子viii组合物及其制备和使用方法
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
PT2882450T (pt) 2012-07-11 2020-02-19 Bioverativ Therapeutics Inc Complexo de fator viii com xten e a proteína fator de von willebrand, e utilizações do mesmo
TW202003554A (zh) 2013-08-14 2020-01-16 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
SI3091997T1 (sl) * 2014-01-10 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc. Himerni proteini faktorja VIII in njihova uporaba
KR20170125942A (ko) * 2015-03-06 2017-11-15 체에스엘 베링 리컴비넌트 퍼실리티 아게 폰 빌레브란트 인자의 반감기 개선용 화합물
JP6909203B2 (ja) 2015-08-03 2021-07-28 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 第ｉｘ因子融合タンパク質及びそれらの製造方法及び使用方法
JP6877469B2 (ja) * 2016-06-24 2021-05-26 モガム・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチＭｏｇａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｖｉｉｉおよびｖｗｆ因子を含むキメラタンパク質、ならびにそれらの使用
KR20190085021A (ko) * 2016-11-11 2019-07-17 체에스엘 베링 렝나우 아게 혈우병을 치료하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드
WO2019222682A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia a

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076484A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 National Research Council Of Canada Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants
US20080146782A1 (en) * 2006-10-04 2008-06-19 Neose Technologies, Inc. Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides
JP2009505964A (ja) * 2005-08-04 2009-02-12 ヘモスタティクス リミテッド 人工血小板
WO2011069164A2 (en) * 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
JP2011525363A (ja) * 2008-06-24 2011-09-22 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー 延長されたインビボ半減期を有する第ｖｉｉｉ因子、フォン・ヴィレブランド因子又はそれらの複合体
US20130017997A1 (en) * 2010-08-19 2013-01-17 Amunix Operating Inc. Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same
JP2013510581A (ja) * 2009-11-13 2013-03-28 グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツド フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）含有調製品並びにこれに関連する方法、キット及び使用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
JP2003526625A (ja) * 1999-07-23 2003-09-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 血小板の活性化の調節
US7846445B2 (en) * 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
AU2008323768A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Baxter Healthcare S.A. Modified recombinant Factor VIII and von Willebrand Factor and methods of use
EP2368124A4 (en) * 2008-11-24 2012-09-19 Bayer Healthcare Llc METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF A PEGYLATED BLOOD GENERATION FACTOR IN A SILICON-BASED ACTIVATED PART THROMBOPLASTINE TIME ASSAY
CN102348715B (zh) * 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
US8716448B2 (en) * 2009-02-03 2014-05-06 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
US20120142593A1 (en) * 2009-03-24 2012-06-07 Bayer Healthcare Llc Factor VIII Variants and Methods of Use
JP5544219B2 (ja) * 2009-09-24 2014-07-09 富士フイルム株式会社 内視鏡システム
US20110312881A1 (en) * 2009-12-21 2011-12-22 Amunix, Inc. Bifunctional polypeptide compositions and methods for treatment of metabolic and cardiovascular diseases
EP3508573A1 (en) * 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
NZ626945A (en) * 2012-01-12 2016-10-28 Biogen Ma Inc Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof
CN111548418A (zh) * 2012-02-15 2020-08-18 比奥贝拉蒂治疗公司 因子viii组合物及其制备和使用方法
US20150080309A1 (en) * 2012-04-24 2015-03-19 Nova Nordisk A/S Compounds Suitable for Treatment of Haemophilia
PT2882450T (pt) * 2012-07-11 2020-02-19 Bioverativ Therapeutics Inc Complexo de fator viii com xten e a proteína fator de von willebrand, e utilizações do mesmo
EP2796145B1 (en) * 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
US20160229903A1 (en) * 2013-06-28 2016-08-11 Biogen Ma Inc. Thrombin cleavable linker
SI3091997T1 (sl) * 2014-01-10 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc. Himerni proteini faktorja VIII in njihova uporaba

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076484A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 National Research Council Of Canada Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants
JP2009505964A (ja) * 2005-08-04 2009-02-12 ヘモスタティクス リミテッド 人工血小板
US20080146782A1 (en) * 2006-10-04 2008-06-19 Neose Technologies, Inc. Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides
JP2011525363A (ja) * 2008-06-24 2011-09-22 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー 延長されたインビボ半減期を有する第ｖｉｉｉ因子、フォン・ヴィレブランド因子又はそれらの複合体
JP2013510581A (ja) * 2009-11-13 2013-03-28 グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツド フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）含有調製品並びにこれに関連する方法、キット及び使用
WO2011069164A2 (en) * 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
JP2013512678A (ja) * 2009-12-06 2013-04-18 バイオジェン アイデック ヘモフィリア インコーポレイテッド 第ＶＩＩＩ−Ｆｃ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
US20130017997A1 (en) * 2010-08-19 2013-01-17 Amunix Operating Inc. Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
血栓止血誌, vol. 23, JPN7018001583, 2012, pages 47 - 50, ISSN: 0004481192 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220106383A1 (en) 2022-04-07
BR112015031194A2 (pt) 2017-09-19
NZ713904A (en) 2022-02-25
SG10201913738YA (en) 2020-03-30
JP2019010124A (ja) 2019-01-24
EP4368194A2 (en) 2024-05-15
PH12015502614A1 (en) 2016-02-29
IL297611A (en) 2022-12-01
TW201514204A (zh) 2015-04-16
AU2023219840A1 (en) 2023-09-14
EP3013358A4 (en) 2017-03-22
JP2016523919A (ja) 2016-08-12
AU2014302100A1 (en) 2015-11-26
CA2913078A1 (en) 2014-12-31
IL266462B (en) 2022-12-01
SG11201509313PA (en) 2016-01-28
US20240083975A1 (en) 2024-03-14
CN105392495A (zh) 2016-03-09
US20160251408A1 (en) 2016-09-01
KR20230007555A (ko) 2023-01-12
TW202045535A (zh) 2020-12-16
WO2014210558A1 (en) 2014-12-31
IL266462A (en) 2019-06-30
EP3013358A1 (en) 2016-05-04
CL2015003710A1 (es) 2016-08-26
AU2020203063A1 (en) 2020-05-28
SG10201710616XA (en) 2018-02-27
KR20240023705A (ko) 2024-02-22
KR20160023654A (ko) 2016-03-03
IL242436B (en) 2019-05-30
TW202313672A (zh) 2023-04-01
EA201592022A1 (ru) 2016-05-31
JP7297837B2 (ja) 2023-06-26
HK1223302A1 (zh) 2017-07-28
JP7005800B2 (ja) 2022-02-10
AU2020203063B2 (en) 2023-05-25
IL266462B2 (en) 2023-04-01
AU2014302100B2 (en) 2020-02-13
MX2015016567A (es) 2016-03-31
TWI770467B (zh) 2022-07-11
CN113817069A (zh) 2021-12-21
CN113831415A (zh) 2021-12-24
JP2023107932A (ja) 2023-08-03
JP2022000053A (ja) 2022-01-04
TWI716340B (zh) 2021-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7005800B2 (ja) Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用
JP6906882B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子キメラタンパク質及びその使用
JP7022165B2 (ja) ＸＴＥＮおよびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子タンパク質を有する第ＶＩＩＩ因子の複合体、および、その使用
KR102659212B1 (ko) 인자 ix 융합 단백질 및 이의 제조 방법 및 사용 방법
TWI826778B (zh) 嵌合因子 viii 多肽及其用途
JP7217630B2 (ja) 最適化第ｖｉｉｉ因子遺伝子
TWI667255B (zh) 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
TW201542596A (zh) 凝血酶可裂解連接子
CN110831613A (zh) 因子ix融合蛋白及其制备和使用方法
BR112015031194B1 (pt) Molécula quimérica, composição farmacêutica, e uso dos anteriores

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210310

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210310

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20210310

A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20210323

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210405

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210702

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210903

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211005

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20211206

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220105

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7005800

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150