JP2023107932A - Xtenを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】VWFリンカーを介して異種部分に融合されるVWFタンパク質を含むキメラ分子を提供すること。【解決手段】本発明は、トロンビンの存在下で切断され得る効率的なVWFリンカーを提供する。本キメラ分子は、FVIIIタンパク質及び第2の異種部分を含むポリペプチド鎖をさらに含むことができ、VWFタンパク質を含む鎖とFVIIIタンパク質を含む鎖とが互いに会合する。本方法はまた、ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、キメラタンパク質の使用方法も含む。【選択図】なし
Description
血友病Aは、凝固第VIII因子(FVIII)をコードする遺伝子の欠損によって引き起こされる出血性疾患であり、男児出生1万人のうち1~2人に発症する。Graw et al.,Nat.Rev.Genet.6(6):488-501(2005)。血友病Aに罹患した患者は、精製または組替え産生されたFVIIIの点滴で治療することができる。しかしながら、すべての市販のFVIII製品は、約8~12時間の半減期を有し、患者への頻繁な静脈内投与を必要とすることが公知である。Weiner M.A.and Cairo,M.S.,Pediatric Hematology Secrets,Lee,M.T.,12.Disorders of Coagulation,Elsevier Health Sciences,2001;Lillicrap,D.Thromb.Res.122 Suppl 4:S2-8(2008)を参照。加えて、FVIII半減期を延長するために、数々のアプローチが試されてきた。例えば、凝固因子の半減期を延長するための開発におけるアプローチとしては、PEG化、糖PEG化(glycopegylation)、及びアルブミンとの共役が挙げられる。Dumont et al.,Blood.119(13):3024-3030(2012年1月13日、オンラインで発行)を参照。しかしながら、使用されるタンパク質工学にかかわらず、現在開発中の長時間作用型FVIII製品は半減期を改善しているが、半減期は、前臨床動物モデルでは約1.5~2倍の改善のみに制限されることが報告されている。(同文献を参照。)一貫した結果がヒトにおいて論証されており、例えば、rFVIIIFcは、血友病A患者において、半減期をADVATE(登録商標)と比較して最大約1.7倍まで改善することが報告された。(同文献を参照。)それゆえに、半減期増加は、小さな改善にもかかわらず、他のt1/2制限因子の存在を示し得る。
頻繁な投与及びその投与計画によって引き起こされる不便さに起因して、より少ない頻度の投与を要するFVIII製品、すなわち、1.5~2倍の半減期制限よりも長い半減期を有するFVIII製品を開発する必要性が依然としてある。
頻繁な投与及びその投与計画によって引き起こされる不便さに起因して、より少ない頻度の投与を要するFVIII製品、すなわち、1.5~2倍の半減期制限よりも長い半減期を有するFVIII製品を開発する必要性が依然としてある。
Graw et al.,Nat.Rev.Genet.6(6):488-501(2005)
Weiner M.A.and Cairo,M.S.,Pediatric Hematology Secrets,Lee,M.T.,12.Disorders of Coagulation,Elsevier Health Sciences,2001
Lillicrap,D.Thromb.Res.122 Suppl 4:S2-8(2008)
Dumont et al.,Blood.119(13):3024-3030(2012年1月13日)
本発明は、フォンヴィレブランド因子(VWF)タンパク質、異種部分(H1)、XTEN配列、及びVWFタンパク質を異種部分と接続するVWFリンカーを含むキメラ分子を対象とし、該VWFリンカーは、(i)第VIII因子(FVIII)からのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせから
選択されるポリペプチドを含み、該XTEN配列は、VWFタンパク質、異種部分(H1)、VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される。一実施形態において、XTEN配列は、VWFタンパク質をVWFリンカーと、またはVWFリンカーを異種部分と接続する。別の実施形態において、本キメラ分子は、FVIIIタンパク質を含む第2のポリペプチド鎖をさらに含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖とが互いに会合する。他の実施形態において、キメラ分子内のFVIIIタンパク質は、追加のXTEN配列をさらに含む。追加のXTEN配列は、FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に結合され得るか、または互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され得る。依然として他の実施形態において、第2のポリペプチド鎖は、第2の異種部分(H2)をさらに含む。
選択されるポリペプチドを含み、該XTEN配列は、VWFタンパク質、異種部分(H1)、VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される。一実施形態において、XTEN配列は、VWFタンパク質をVWFリンカーと、またはVWFリンカーを異種部分と接続する。別の実施形態において、本キメラ分子は、FVIIIタンパク質を含む第2のポリペプチド鎖をさらに含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖とが互いに会合する。他の実施形態において、キメラ分子内のFVIIIタンパク質は、追加のXTEN配列をさらに含む。追加のXTEN配列は、FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に結合され得るか、または互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され得る。依然として他の実施形態において、第2のポリペプチド鎖は、第2の異種部分(H2)をさらに含む。
本開示はまた、VWFタンパク質、異種部分(H1)、及びVWFタンパク質と異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含む第1のポリペプチド鎖と、FVIIIタンパク質及びXTEN配列を含む第2のポリペプチド鎖とを含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド鎖内のVWFリンカーが、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖が互いに会合する、キメラ分子も含む。一実施形態において、XTEN配列は、FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に接続されるか、または互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入される。別の実施形態において、本キメラ分子は、VWFタンパク質、異種部分、VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される追加のXTEN配列をさらに含む。他の実施形態において、本キメラ分子は第2の異種部分(H2)をさらに含む。依然として他の実施形態において、第2の異種部分は、FVIIIタンパク質、XTEN配列、または双方に接続される。
本開示のキメラ分子では、VWFタンパク質、VWFリンカー、FVIIIタンパク質、またはキメラ分子内の他の任意の構成要素のいずれかに接続されるXTEN配列は、約42個のアミノ酸、約72個のアミノ酸、約108個のアミノ酸、約144個のアミノ酸、約180個のアミノ酸、約216個のアミノ酸、約252個のアミノ酸、約288個のアミノ酸、約324個のアミノ酸、約360個のアミノ酸、約396個のアミノ酸、約432個のアミノ酸、約468個のアミノ酸、約504個のアミノ酸、約540個のアミノ酸、約576個のアミノ酸、約612個のアミノ酸、約624個のアミノ酸、約648個のアミノ酸、約684個のアミノ酸、約720個のアミノ酸、約756個のアミノ酸、約792個のアミノ酸、約828個のアミノ酸、約836個のアミノ酸、約864個のアミノ酸、約875個のアミノ酸、約912個のアミノ酸、約923個のアミノ酸、約948個のアミノ酸、約1044個のアミノ酸、約1140個のアミノ酸、約1236個のアミノ酸、約1318個のアミノ酸、約1332個のアミノ酸、約1428個のアミノ酸、約1524個のアミノ酸、約1620個のアミノ酸、約1716個のアミノ酸、約1812個のアミノ酸、約1908個のアミノ酸、または約2004個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、XTENポリペプチドは、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される。他の実施形態において、XTENポリペプチドは、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号44、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される。
他の態様において、キメラ分子内の追加のXTEN配列は、約42個のアミノ酸、約72個のアミノ酸、約108個のアミノ酸、約144個のアミノ酸、約180個のアミノ酸、約216個のアミノ酸、約252個のアミノ酸、約288個のアミノ酸、約324個の
アミノ酸、約360個のアミノ酸、約396個のアミノ酸、約432個のアミノ酸、約468個のアミノ酸、約504個のアミノ酸、約540個のアミノ酸、約576個のアミノ酸、約612個のアミノ酸、約624個のアミノ酸、約648個のアミノ酸、約684個のアミノ酸、約720個のアミノ酸、約756個のアミノ酸、約792個のアミノ酸、約828個のアミノ酸、約836個のアミノ酸、約864個のアミノ酸、約875個のアミノ酸、約912個のアミノ酸、約923個のアミノ酸、約948個のアミノ酸、約1044個のアミノ酸、約1140個のアミノ酸、約1236個のアミノ酸、約1318個のアミノ酸、約1332個のアミノ酸、約1428個のアミノ酸、約1524個のアミノ酸、約1620個のアミノ酸、約1716個のアミノ酸、約1812個のアミノ酸、約1908個のアミノ酸、または約2004個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、追加のXTENポリペプチドは、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される。ある実施形態において、追加のXTENポリペプチドは、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号43、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される。
アミノ酸、約360個のアミノ酸、約396個のアミノ酸、約432個のアミノ酸、約468個のアミノ酸、約504個のアミノ酸、約540個のアミノ酸、約576個のアミノ酸、約612個のアミノ酸、約624個のアミノ酸、約648個のアミノ酸、約684個のアミノ酸、約720個のアミノ酸、約756個のアミノ酸、約792個のアミノ酸、約828個のアミノ酸、約836個のアミノ酸、約864個のアミノ酸、約875個のアミノ酸、約912個のアミノ酸、約923個のアミノ酸、約948個のアミノ酸、約1044個のアミノ酸、約1140個のアミノ酸、約1236個のアミノ酸、約1318個のアミノ酸、約1332個のアミノ酸、約1428個のアミノ酸、約1524個のアミノ酸、約1620個のアミノ酸、約1716個のアミノ酸、約1812個のアミノ酸、約1908個のアミノ酸、または約2004個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、追加のXTENポリペプチドは、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される。ある実施形態において、追加のXTENポリペプチドは、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号43、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される。
一実施形態において、キメラ分子内のVWFタンパク質と異種部分とを接続するのに有用なVWFリンカーは、全長FVIIIに相当するGlu720~Arg740と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa2領域を含み、a2領域はトロンビンによって切断されることが可能である。特定の実施形態において、a2領域は、ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(配列番号4)を含む。別の実施形態において、VWFタンパク質と異種部分とを接続するのに有用なVWFリンカーは、全長FVIIIに相当するMet337~Arg372と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa1領域を含み、a1領域はトロンビンによって切断されることが可能である。いくつかの実施形態において、a1領域は、ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(配列番号5)を含む。
他の実施形態において、VWFタンパク質と異種部分とを接続するのに有用なVWFリンカーは、全長FVIIIに相当するGlu1649~Arg1689と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa3領域を含み、a3領域はトロンビンによって切断されることが可能である。特定の実施形態において、a3領域は、ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ(配列番号6)を含む。
依然として他の実施形態において、VWFタンパク質と異種部分とを接続するのに有用なVWFリンカーは、X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含むトロンビン切断部位を含み、該PAR1非活性部位相互作用モチーフはS-F-L-L-R-N(配列番号7)を含む。一実施形態において、PAR1非活性部位相互作用モチーフは、P、P-N、P-N-D、P-N-D-K(配列番号8)、P-N-D-K-Y(配列番号9)、P-N-D-K-Y-E(配列番号10)、P-N-D-K-Y-E-P(配列番号11)、P-N-D-K-Y-E-P-F(配列番号12)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W(配列番号13)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(配列番号14)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(配列番号20)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(配列番号21)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E(配列番号22)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(配列番号23)、またはそれらの任意の組み合わせから選択される配列をさらに含む。他の実施形態において、脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される。特定の実施形態に
おいて、VWFリンカーは、GGLVPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEES(配列番号24)を含む。
おいて、VWFリンカーは、GGLVPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEES(配列番号24)を含む。
ある特定の実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部位がキメラ分子内のVWFリンカーと置換された場合にトロンビンがトロンビン切断部位を切断するよりも速く、VWFリンカーを切断する。他の実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部位がキメラ分子内のVWFリンカーと置換された場合にトロンビンがトロンビン切断部位を切断するよりも、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍速く、VWFリンカーを切断する。
いくつかの実施形態において、VWFリンカーは、少なくとも約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、または2000アミノ酸の長さを有する1個以上のアミノ酸をさらに含む。一例において、1個以上のアミノ酸は、glyペプチドを含む。別の例において、1個以上のアミノ酸は、GlyGlyを含む。他の例において、1個以上のアミノ酸は、gly/serペプチドを含む。いくつかの例において、gly/serペプチドは、(Gly4Ser)nまたはS(Gly4Ser)nの式を有し、式中、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、または100から選択される正整数である。ある特定の例において、(Gly4Ser)nリンカーは、(Gly4Ser)3(配列番号89)または(Gly4Ser)4(配列番号90)である。
本発明のキメラ分子に有用なVWFタンパク質は、VWFのD’ドメイン及びD3ドメインを含むことができ、そのD’ドメイン及びD3ドメインはFVIIIタンパク質に結合することが可能である。一実施形態において、VWFタンパク質のD’ドメインは、配列番号2のアミノ酸764~866と少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、VWFタンパク質のD3ドメインは、配列番号2のアミノ酸867~1240と少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、VWFタンパク質は、配列番号2の残基1099、残基1142、または残基1099及び1142の双方に相当する残基において、少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する。依然として他の実施形態において、VWFタンパク質の配列内で、システイン以外のアミノ酸が、配列番号2の残基1099、残基1142、または残基1099と1142の双方に相当する残基と置換される。さらに他の実施形態において、VWFタンパク質の配列は、配列番号2のアミノ酸764~1240を含む。ある特定の実施形態において、VWFタンパク質は、VWFのD1ドメイン、D2ドメイン、またはD1及びD2ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、VWFタンパク質は、A1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D4ドメイン、B1ドメイン、B2ドメイン、B3ドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、CKドメイン、それらの1つ以上の断片、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるVWFドメインをさらに含む。他の実施形態において、VWFタンパク質は、(1)VWFのD’及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(2)VWFのD1、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(3)VWFのD2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(4)VWFのD1、D2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、または(5)VWFのD1、D2、D’、D3、及びA1ドメイン、もしくはそれらの断片、から本
質的になる、またはそれらからなる。依然として他の実施形態において、VWFタンパク質は、VWFのシグナルペプチドをさらに含む。さらに他の実施形態において、VWFタンパク質は、PEG化、グリコシル化、HES化、またはポリシアル酸化される。「PEG化される」という用語は、タンパク質上にポリエチレングリコール(PEG)を有すること、「グリコシル化される」という用語は、タンパク質上にグリコシル化を有すること、「HES化される」という用語は、タンパク質上にヒドロキシエチルデンプン(HES)を有すること、「ポリシアル酸化される」という用語は、タンパク質上にポリシアル酸(PSA)を有することを指す。PEG、HES、及びPSAの例は、本明細書の他の箇所に示される。
質的になる、またはそれらからなる。依然として他の実施形態において、VWFタンパク質は、VWFのシグナルペプチドをさらに含む。さらに他の実施形態において、VWFタンパク質は、PEG化、グリコシル化、HES化、またはポリシアル酸化される。「PEG化される」という用語は、タンパク質上にポリエチレングリコール(PEG)を有すること、「グリコシル化される」という用語は、タンパク質上にグリコシル化を有すること、「HES化される」という用語は、タンパク質上にヒドロキシエチルデンプン(HES)を有すること、「ポリシアル酸化される」という用語は、タンパク質上にポリシアル酸(PSA)を有することを指す。PEG、HES、及びPSAの例は、本明細書の他の箇所に示される。
いくつかの態様において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に融合される異種部分(H1)は、キメラ分子の半減期を延長することが可能である。一実施形態において、異種部分(H1)は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、アルブミン結合部分、PAS、HAP、トランスフェリンもしくはその断片、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、PSA、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端ペプチド(CTP)、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態において、異種部分はFcRn結合パートナーを含む。他の実施形態において、異種部分はFc領域を含む。他の実施形態において、異種部分(H1)は、クリアランス受容体またはその断片を含み、該クリアランス受容体はFVIIIタンパク質のFVIIIクリアランス受容体への結合を遮断する。いくつかの実施形態において、クリアランス受容体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1(LRP1)、またはそのFVIII結合断片である。
いくつかの態様において、任意のFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に融合される第2の異種部分は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、PAS、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端ペプチド(CTP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態において、第2の異種部分(H2)は、FVIIIタンパク質の半減期を延長することが可能である。別の実施形態において、第2の異種部分(H2)は、ポリペプチド、非ポリペプチド部分、または双方を含む。他の実施形態において、第2の異種部分(H2)は、免疫グロブリン定常領域またはその一部を含む。依然として他の実施形態において、第2の異種部分はFcRn結合パートナーを含む。さらに他の実施形態において、第2の異種部分は第2のFc領域を含む。
いくつかの実施形態において、XTEN配列が構成要素のうちの任意の1つに融合される、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に融合される第1の異種部分、及び任意のリンカーを介してFVIIIタンパク質に融合される第2の異種部分は、互いに会合する。一実施形態において、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチドとの間の会合は、共有結合である。別の実施形態において、第1の異種部分と第2の異種部分との間の会合は、ジスルフィド結合である。他の実施形態において、第1の異種部分はFcRn結合パートナーであり、第2の異種部分はFcRn結合パートナーである。依然として他の実施形態において、第1の異種部分はFc領域であり、第2の異種部分はFc領域である。
ある特定の実施形態において、FVIIIタンパク質は、FVIIIリンカーによって第2の異種部分に結合される。一実施形態において、第2のリンカーは切断可能リンカーである。別の実施形態において、FVIIIリンカーはVWFリンカーと同一である。他の実施形態において、FVIIIリンカーはVWFリンカーと異なる。
いくつかの態様において、本発明のキメラ分子は、(a)V-L1-X1-H1:H2
-L2-X2-C、(b)V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C、(c)V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C、(d)V-X1-L1-H1:H2-X2-L2-C、(e)V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2)、(f)V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2)、(g)C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V、(h)C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V、(i)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(j)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(k)C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V、または(l)C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-Vから選択される式を含み、式中、VはVWFタンパク質であり、L1はVWFリンカーであり、L2は任意のFVIIIリンカーであり、H1は第1の異種部分であり、H2は第2の異種部分であり、X1はXTEN配列であり、X2は任意のXTEN配列であり、CはFVIIIタンパク質であり、C(X2)はXTEN配列に融合されるFVIIIタンパク質であり、該XTEN配列は互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され、(-)はペプチド結合または1個以上のアミノ酸であり、(:)はH1とH2との間の共有結合である。
-L2-X2-C、(b)V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C、(c)V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C、(d)V-X1-L1-H1:H2-X2-L2-C、(e)V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2)、(f)V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2)、(g)C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V、(h)C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V、(i)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(j)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(k)C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V、または(l)C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-Vから選択される式を含み、式中、VはVWFタンパク質であり、L1はVWFリンカーであり、L2は任意のFVIIIリンカーであり、H1は第1の異種部分であり、H2は第2の異種部分であり、X1はXTEN配列であり、X2は任意のXTEN配列であり、CはFVIIIタンパク質であり、C(X2)はXTEN配列に融合されるFVIIIタンパク質であり、該XTEN配列は互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され、(-)はペプチド結合または1個以上のアミノ酸であり、(:)はH1とH2との間の共有結合である。
他の態様において、キメラ分子は、(a)V-L1-X1-H1:H2-L2-X2-C、(b)V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C、(c)V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C、(d)V-X1-L1-H1:H2-X2-L2-C、(e)V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2)、(f)V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2)、(g)C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V、(h)C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V、(i)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(j)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(k)C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V、または(l)C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-Vから選択される式を含み、式中、VはVWFタンパク質であり、L1はVWFリンカーであり、L2は任意のFVIIIリンカーであり、H1は第1の異種部分であり、H2は第2の異種部分であり、X1は任意のXTEN配列であり、X2はXTEN配列であり、CはFVIIIタンパク質であり、C(X2)はXTEN配列に融合されるFVIIIタンパク質であり、該XTEN配列は互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され、(-)はペプチド結合または1個以上のアミノ酸であり、(:)はH1とH2との間の共有結合である。
本発明のキメラ分子において、VWFタンパク質は、内因性VWFのFVIIIタンパク質への結合を抑制または防止することができる。
ある特定の態様において、本キメラ分子内のFVIIIタンパク質は第3の異種部分(H3)を含むことができる。第3の異種部分(H3)は、XTEN配列であり得る。他の態様において、FVIIIタンパク質は第4の異種部分(H4)を含む。第4の異種部分(H4)は、XTEN配列であり得る。いくつかの態様において、FVIIIタンパク質は第5の異種部分(H5)を含む。第5の異種部分は、XTEN配列であり得る。他の態様において、FVIIIタンパク質は第6の異種部分(H6)を含む。第6の異種部分は、XTEN配列であり得る。ある特定の態様において、第3の異種部分(H3)、第4の異種部分(H4)、第5の異種部分(H5)、及び第6の異種部分(H6)のうちの1つ以上は、キメラ分子の半減期を延長することが可能である。他の態様において、第3の異種部分(H3)、第4の異種部分(H4)、第5の異種部分(H5)、及び第6の異種部分(H6)は、FVIIIのC末端もしくはN末端に結合されるか、またはFVIIIタンパク質の2個のアミノ酸の間に挿入される。依然として他の態様において、第3の異種部分、第4の異種部分、第5の異種部分、及び第6の異種部分のうちの1つ以上は、約42アミノ酸、約72アミノ酸、約108アミノ酸、約144アミノ酸、約180アミノ酸、約216アミノ酸、約252アミノ酸、約288アミノ酸、約324アミノ酸、約360アミノ酸、約396アミノ酸、約432アミノ酸、約468アミノ酸、約504アミノ
酸、約540アミノ酸、約576アミノ酸、約612アミノ酸、約624アミノ酸、約648アミノ酸、約684アミノ酸、約720アミノ酸、約756アミノ酸、約792アミノ酸、約828アミノ酸、約836アミノ酸、約864アミノ酸、約875アミノ酸、約912アミノ酸、約923アミノ酸、約948アミノ酸、約1044アミノ酸、約1140アミノ酸、約1236アミノ酸、約1318アミノ酸、約1332アミノ酸、約1428アミノ酸、約1524アミノ酸、約1620アミノ酸、約1716アミノ酸、約1812アミノ酸、約1908アミノ酸、または約2004アミノ酸のうちの1つ以上から選択される長さを含む。例えば、第3の異種部分、第4の異種部分、第5の異種部分、または第6の異種部分のXTEN配列は、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択され得る。より具体的には、XTEN配列は、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号43、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択され得る。
酸、約540アミノ酸、約576アミノ酸、約612アミノ酸、約624アミノ酸、約648アミノ酸、約684アミノ酸、約720アミノ酸、約756アミノ酸、約792アミノ酸、約828アミノ酸、約836アミノ酸、約864アミノ酸、約875アミノ酸、約912アミノ酸、約923アミノ酸、約948アミノ酸、約1044アミノ酸、約1140アミノ酸、約1236アミノ酸、約1318アミノ酸、約1332アミノ酸、約1428アミノ酸、約1524アミノ酸、約1620アミノ酸、約1716アミノ酸、約1812アミノ酸、約1908アミノ酸、または約2004アミノ酸のうちの1つ以上から選択される長さを含む。例えば、第3の異種部分、第4の異種部分、第5の異種部分、または第6の異種部分のXTEN配列は、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択され得る。より具体的には、XTEN配列は、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号43、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択され得る。
ある特定の実施形態において、本キメラ分子の半減期は、野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される。
本開示はまた、キメラ分子またはその相補配列をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットも提供する。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットは、PC5またはPC7をコードするポリヌクレオチド鎖をさらに含むことができる。
さらに含まれるのは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含むベクターまたはベクターのセット、及びポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットに作動可能に結合された1つ以上のプロモーターである。いくつかの実施形態において、ベクターまたはベクターのセットは、PC5またはPC7をコードする追加のポリヌクレオチド鎖をさらに含むことができる。
本発明はまた、ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、またはベクターもしくはベクターのセットを含む宿主細胞も含む。一実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、HEK293細胞、CHO細胞、またはBHK細胞から選択される。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示されるキメラ分子、キメラ分子をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットを含むベクターもしくはベクターのセット、または本明細書に開示される宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。一実施形態において、該組成物内のキメラ分子は、野生型FVIIIタンパク質と比較して延長された半減期を有する。別の実施形態において、該組成物内のキメラ分子の半減期は、野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される。
さらに含まれるのは、出血発症の頻度または程度の減少を必要とする対象における出血発症の頻度または程度の減少方法であって、有効な量の本明細書に開示されるキメラ分子、該キメラ分子をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、本明細書に開示されるベクターもしくはベクターのセット、本明細書に開示される宿主細胞、
または本明細書に開示される組成物を投与することを含む方法である。本発明はまた、出血発症の発生の予防を必要とする対象における出血発症の発生の予防方法であって、有効な量の本明細書に開示されるキメラ分子、該キメラ分子をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、本明細書に開示されるベクターもしくはベクターのセット、本明細書に開示される宿主細胞、または本明細書に開示される組成物を投与することを含む方法も含む。一実施形態において、出血発症は、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血、またはそれらの任意の組み合わせからである。別の実施形態において、本明細書に開示されるキメラ分子、該キメラ分子をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、本明細書に開示されるベクターもしくはベクターのセット、または本明細書に開示される宿主細胞、または本明細書に開示される組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、経口投与、及びそれらの任意の組み合わせから選択される経路で投与され得る。
または本明細書に開示される組成物を投与することを含む方法である。本発明はまた、出血発症の発生の予防を必要とする対象における出血発症の発生の予防方法であって、有効な量の本明細書に開示されるキメラ分子、該キメラ分子をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、本明細書に開示されるベクターもしくはベクターのセット、本明細書に開示される宿主細胞、または本明細書に開示される組成物を投与することを含む方法も含む。一実施形態において、出血発症は、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血、またはそれらの任意の組み合わせからである。別の実施形態において、本明細書に開示されるキメラ分子、該キメラ分子をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、本明細書に開示されるベクターもしくはベクターのセット、または本明細書に開示される宿主細胞、または本明細書に開示される組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、経口投与、及びそれらの任意の組み合わせから選択される経路で投与され得る。
本開示はまた、キメラ分子の作製方法であって、1つ以上の宿主細胞に、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトすること、及び宿主細胞内にキメラ分子を発現することを含む方法も含む。該方法は、キメラ分子を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ分子のFVIII活性は、aPTTアッセイまたはROTEMアッセイによって測定され得る。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
フォンヴィレブランド因子(VWF)タンパク質と、異種部分(H1)と、XTEN配列と、前記VWFタンパク質を前記異種部分と接続するVWFリンカーとを含むキメラ分子であって、前記VWFリンカーが、
i.第VIII因子(FVIII)からのa2領域、
ii.FVIIIからのa1領域、
iii.FVIIIからのa3領域、
iv.X-V-P-R(配列番号3)とPAR1非活性部位相互作用モチーフとを含むトロンビン切断部位であって、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、v.それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含み、
前記XTEN配列が、前記VWFタンパク質、前記異種部分(H1)、前記VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される、前記キメラ分子。
(項目2)
前記XTEN配列が、前記VWFタンパク質を前記VWFリンカーと、または前記VWFリンカーを前記異種部分と接続する、項目1に記載のキメラ分子。
(項目3)
FVIIIタンパク質を含む第2のポリペプチド鎖をさらに含み、前記第1のポリペプチド鎖と前記第2のポリペプチド鎖とが互いに会合する、項目1または2に記載のキメラ分子。
(項目4)
前記FVIIIタンパク質が追加のXTEN配列をさらに含む、項目3に記載のキメラ分子。
(項目5)
前記追加のXTEN配列が、前記FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に結合されるか、互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入される、項目4に記載のキメラ分子。
(項目6)
前記第2のポリペプチド鎖が、第2の異種部分(H2)をさらに含む、項目3~5のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目7)
VWFタンパク質、異種部分(H1)、及び前記VWFタンパク質と前記異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含む第1のポリペプチド鎖と、FVIIIタンパク質及びXTEN配列を含む第2のポリペプチド鎖と、を含むキメラ分子であって、前記第1のポリペプチド鎖内の前記VWFリンカーが、
i.FVIIIからのa2領域、
ii.FVIIIからのa1領域、
iii.FVIIIからのa3領域、
iv.X-V-P-R(配列番号3)とPAR1非活性部位相互作用モチーフとを含むトロンビン切断部位であって、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、v.それらの任意の組み合わせ、を含み、
前記第1のポリペプチド鎖と前記第2のポリペプチド鎖とが互いに会合する、前記キメラ分子。
(項目8)
前記XTEN配列が、前記FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に接続されるか、互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入される、項目7に記載のキメラ分子。
(項目9)
前記VWFタンパク質、前記異種部分、前記VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される、追加のXTEN配列をさらに含む、項目7または8に記載のキメラ分子。
(項目10)
第2の異種部分(H2)をさらに含む、項目7~9のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目11)
前記第2の異種部分が、前記FVIIIタンパク質、前記XTEN配列、または双方に接続される、項目10に記載のキメラ分子。
(項目12)
前記XTEN配列が、約42個のアミノ酸、約72個のアミノ酸、約108個のアミノ酸、約144個のアミノ酸、約180個のアミノ酸、約216個のアミノ酸、約252個のアミノ酸、約288個のアミノ酸、約324個のアミノ酸、約360個のアミノ酸、約396個のアミノ酸、約432個のアミノ酸、約468個のアミノ酸、約504個のアミノ酸、約540個のアミノ酸、約576個のアミノ酸、約612個のアミノ酸、約624個のアミノ酸、約648個のアミノ酸、約684個のアミノ酸、約720個のアミノ酸、約756個のアミノ酸、約792個のアミノ酸、約828個のアミノ酸、約836個のアミノ酸、約864個のアミノ酸、約875個のアミノ酸、約912個のアミノ酸、約923個のアミノ酸、約948個のアミノ酸、約1044個のアミノ酸、約1140個のアミノ酸、約1236個のアミノ酸、約1318個のアミノ酸、約1332個のアミノ酸、約1428個のアミノ酸、約1524個のアミノ酸、約1620個のアミノ酸、約1716個のアミノ酸、約1812個のアミノ酸、約1908個のアミノ酸、または約2004個のアミノ酸を含む、項目1~11のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目13)
前記XTEN配列が、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される、項目1~12のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目14)
前記XTEN配列が、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号44、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される、項目1~13のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目15)
前記追加のXTEN配列が、約42個のアミノ酸、約72個のアミノ酸、約108個のアミノ酸、約144個のアミノ酸、約180個のアミノ酸、約216個のアミノ酸、約252個のアミノ酸、約288個のアミノ酸、約324個のアミノ酸、約360個のアミノ酸、約396個のアミノ酸、約432個のアミノ酸、約468個のアミノ酸、約504個のアミノ酸、約540個のアミノ酸、約576個のアミノ酸、約612個のアミノ酸、約624個のアミノ酸、約648個のアミノ酸、約684個のアミノ酸、約720個のアミノ酸、約756個のアミノ酸、約792個のアミノ酸、約828個のアミノ酸、約836個のアミノ酸、約864個のアミノ酸、約875個のアミノ酸、約912個のアミノ酸、約923個のアミノ酸、約948個のアミノ酸、約1044個のアミノ酸、約1140個のアミノ酸、約1236個のアミノ酸、約1318個のアミノ酸、約1332個のアミノ酸、約1428個のアミノ酸、約1524個のアミノ酸、約1620個のアミノ酸、約1716個のアミノ酸、約1812個のアミノ酸、約1908個のアミノ酸、または約2004個のアミノ酸を含む、項目4~6及び9~11のいずれか一項に記載のキメラ分子。(項目16)
前記追加のXTEN配列が、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される、項目4~6、9~11、及び15のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目17)
前記追加のXTEN配列が、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号43、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される、項目4~6、9~11、及び15~16のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目18)
前記VWFリンカーが、全長FVIIIに相当するGlu720~Arg740と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む前記a2領域を含み、前記a2領域がトロンビンによって切断されることが可能である、項目1~17のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目19)
前記a2領域が配列番号4を含む、項目18に記載のキメラ分子。
(項目20)
前記VWFリンカーが、全長FVIIIに相当するMet337~Arg372と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む前記a1領域を含み、前記a1領域がトロンビンによって切断されることが可能である、項目1~17のいずれか一項に記載のキメラ分子。(項目21)
前記a1領域が配列番号5を含む、項目20に記載のキメラ分子。
(項目22)
前記VWFリンカーが、全長FVIIIに相当するGlu1649~Arg1689と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む前記a3領域を含み、前記a3領域がトロンビンによって切断されることが可能である、項目1~17のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目23)
前記a3領域が配列番号6を含む、項目22に記載のキメラ分子。
(項目24)
前記VWFリンカーが、X-V-P-R(配列番号3)及び前記PAR1非活性部位相互作用モチーフを含む前記トロンビン切断部位を含み、前記PAR1非活性部位相互作用モチーフがS-F-L-L-R-N(配列番号7)を含む、項目1~17のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目25)
前記PAR1非活性部位相互作用モチーフが、P、P-N、P-N-D、P-N-D-
K(配列番号8)、P-N-D-K-Y(配列番号9)、P-N-D-K-Y-E(配列番号10)、P-N-D-K-Y-E-P(配列番号11)、P-N-D-K-Y-E-P-F(配列番号12)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W(配列番号13)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(配列番号14)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(配列番号20)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(配列番号21)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E(配列番号22)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(配列番号23)、またはそれらの任意の組み合わせから選択される配列をさらに含む、項目1~17、及び24のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目26)
前記脂肪族アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される、項目1~17、24、及び25のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目27)
前記VWFリンカーが、L-V-P-R(配列番号25)からなる前記トロンビン切断部位がトロンビンによって切断されるよりも速くトロンビンによって切断される、項目1~26のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目28)
前記VWFリンカーが配列番号24を含む、項目1~27のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目29)
前記VWFリンカーが、L-V-P-R(配列番号25)からなる前記トロンビン切断部位がトロンビンによって切断されるよりも、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍速く、トロンビンによって切断される、項目27に記載のキメラ分子。
(項目30)
前記VWFリンカーが1個以上のアミノ酸をさらに含み、前記VWFリンカーが、少なくとも約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、または2000アミノ酸の長さを有する、項目1~29のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目31)
前記1個以上のアミノ酸がglyペプチドを含む、項目30に記載のキメラ分子。
(項目32)
前記1個以上のアミノ酸がGlyGlyを含む、項目30または31に記載のキメラ分子。
(項目33)
前記1個以上のアミノ酸がgly/serペプチドを含む、項目30に記載のキメラ分子。
(項目34)
前記gly/serペプチドが、(Gly4Ser)nまたはS(Gly4Ser)nの式を有し、式中、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、または100から選択される正整数である、項目33に記載のキメラ分子。
(項目35)
前記(Gly4Ser)nリンカーが、(Gly4Ser)3(配列番号89)または(Gly4Ser)4(配列番号90)である、項目34に記載のキメラ分子。
(項目36)
前記VWFタンパク質が、VWFのD’ドメイン及びD3ドメインを含み、前記D’ドメイン及びD3ドメインが、FVIIIタンパク質に結合することが可能である、項目1~35のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目37)
前記VWFタンパク質の前記D’ドメインが、配列番号2のアミノ酸764~866と少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、項目36に記載のキメラ分子。
(項目38)
前記VWFタンパク質の前記D3ドメインが、配列番号2のアミノ酸867~1240と少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、項目36または37に記載のキメラ分子。
(項目39)
前記VWFタンパク質が、配列番号2の残基1099、残基1142、または残基1099と1142の双方に相当する残基において少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する、項目36~38のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目40)
前記VWFタンパク質の前記配列内で、システイン以外のアミノ酸が、配列番号2の残基1099、残基1142、または残基1099と1142の双方に相当する残基と置換される、項目1~39のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目41)
前記VWFタンパク質の前記配列が、配列番号2のアミノ酸764~1240を含む、項目1~39のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目42)
前記VWFタンパク質が、VWFのD1ドメイン、D2ドメイン、または前記D1及びD2ドメインをさらに含む、項目36~41のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目43)
前記VWFタンパク質が、A1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D4ドメイン、B1ドメイン、B2ドメイン、B3ドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、CKドメイン、それらの1つ以上の断片、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるVWFドメインをさらに含む、項目36~42のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目44)
前記VWFタンパク質が、(1)VWFの前記D’及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(2)VWFの前記D1、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(3)VWFの前記D2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(4)VWFの前記D1、D2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、または(5)VWFの前記D1、D2、D’、D3、及びA1ドメイン、もしくはそれらの断片、から本質的になる、もしくはそれらからなる、項目36~43のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目45)
VWFのシグナルペプチドをさらに含む、項目1~44のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目46)
前記VWFタンパク質が、PEG化、グリコシル化、HES化、またはポリシアル酸化される、項目1~45のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目47)
前記異種部分(H1)が、前記キメラ分子の半減期を延長することが可能である、項目1~46のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目48)
前記異種部分(H1)が、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、PAS、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端
ペプチド(CTP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目47に記載のキメラ分子。
(項目49)
前記免疫グロブリン定常領域またはその一部が、FcRn結合パートナーを含む、項目48に記載のキメラ分子。
(項目50)
前記免疫グロブリン定常領域またはその一部が、Fc領域を含む、項目48に記載のキメラ分子。
(項目51)
前記異種部分(H1)が、クリアランス受容体またはその断片を含み、前記クリアランス受容体がFVIIIタンパク質のFVIIIクリアランス受容体への結合を遮断する、項目1~47のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目52)
前記クリアランス受容体が、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1(LRP1)、またはそのFVIII結合断片である、項目51に記載のキメラ分子。
(項目53)
前記第2の異種部分が、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、PAS、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端ペプチド(CTP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目6、及び10~52のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目54)
前記第2の異種部分(H2)が、前記FVIIIタンパク質の半減期を延長することが可能である、項目6、及び10~53のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目55)
前記第2の異種部分(H2)が、ポリペプチド、非ポリペプチド部分、または双方を含む、項目54に記載のキメラ分子。
(項目56)
前記第2の異種部分(H2)が、免疫グロブリン定常領域またはその一部を含む、項目54または55に記載のキメラ分子。
(項目57)
前記第2の異種部分が、FcRn結合パートナーを含む、項目56に記載のキメラ分子。
(項目58)
前記第2の異種部分が第2のFc領域を含む、項目56に記載のキメラ分子。
(項目59)
前記第1の異種部分と前記第2の異種部分とが互いに会合する、項目6、及び10~58のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目60)
前記第1のポリペプチド鎖と前記第2のポリペプチドとの間の会合が共有結合である、項目59に記載のキメラ分子。
(項目61)
前記第1の異種部分と前記第2の異種部分との間の会合が、ジスルフィド結合である、項目59に記載のキメラ分子。
(項目62)
前記第1の異種部分がFcRn結合パートナーであり、前記第2の異種部分がFcRn結合パートナーである、項目6、及び10~58のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目63)
前記第1の異種部分がFc領域であり、前記第2の異種部分がFc領域である、項目6
、及び10~58のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目64)
前記FVIIIタンパク質が、FVIIIリンカーによって前記第2の異種部分に結合される、項目6、及び10~58のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目65)
前記FVIIIリンカーが切断可能リンカーである、項目64に記載のキメラ分子。
(項目66)
前記FVIIIリンカーが前記VWFリンカーと同一である、項目64または65に記載のキメラ分子。
(項目67)
前記FVIIIリンカーが前記VWFリンカーと異なる、項目64または65に記載のキメラ分子。
(項目68)
(a)V-L1-X1-H1:H2-L2-X2-C、
(b)V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C、
(c)V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C、
(d)V-X1-L1-H1:H2-X2-L2-C、
(e)V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2)、
(f)V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2)、
(g)C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V、
(h)C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V、
(i)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、
(j)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、
(k)C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V、または
(l)C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-Vから選択される式を含み、
式中、Vが前記VWFタンパク質であり、
L1が前記VWFリンカーであり、
L2が任意のFVIIIリンカーであり、
H1が前記第1の異種部分であり、
H2が前記第2の異種部分であり、
Cが前記FVIIIタンパク質であり、
C(X2)が前記XTEN配列に融合される前記FVIIIタンパク質であり、前記XTEN配列が互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され、
(-)が、ペプチド結合または1個以上のアミノ酸であり、及び
(:)が、前記H1と前記H2との間の共有結合である、項目6、及び10~67のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目69)
前記VWFタンパク質が、内因性VWFの前記FVIIIタンパク質への結合を抑制または防止する、項目6、及び10~68のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目70)
前記FVIIIタンパク質が第3の異種部分(H3)を含む、項目6、及び10~69のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目71)
前記第3の異種部分(H3)がXTEN配列である、項目70に記載のキメラ分子。
(項目72)
前記FVIIIタンパク質が第4の異種部分(H4)を含む、項目70または71に記載のキメラ分子。
(項目73)
前記第4の異種部分(H4)がXTEN配列である、項目72に記載のキメラ分子。
(項目74)
前記FVIIIタンパク質が第5の異種部分(H5)を含む、項目72または73に記載のキメラ分子。
(項目75)
前記第5の異種部分がXTEN配列である、項目74に記載のキメラ分子。
(項目76)
前記FVIIIタンパク質が前記第6の異種部分(H6)を含む、項目74または75に記載のキメラ分子。
(項目77)
前記第6の異種部分がXTEN配列である、項目76に記載のキメラ分子。
(項目78)
前記第3の異種部分(H3)、前記第4の異種部分(H4)、前記第5の異種部分(H5)、及び前記第6の異種部分(H6)のうちの1つ以上が、前記キメラ分子の半減期を延長することが可能である、項目76または77に記載のキメラ分子。
(項目79)
前記第3の異種部分(H3)、前記第4の異種部分(H4)、前記第5の異種部分(H5)、及び前記第6の異種部分(H6)が、FVIIIのC末端もしくはN末端に結合されるか、前記FVIIIタンパク質の2個のアミノ酸の間に挿入される、項目76または77に記載のキメラ分子。
(項目80)
前記XTEN配列の1つ以上が、約42アミノ酸、約72アミノ酸、約108アミノ酸、約144アミノ酸、約180アミノ酸、約216アミノ酸、約252アミノ酸、約288アミノ酸、約324アミノ酸、約360アミノ酸、約396アミノ酸、約432アミノ酸、約468アミノ酸、約504アミノ酸、約540アミノ酸、約576アミノ酸、約612アミノ酸、約624アミノ酸、約648アミノ酸、約684アミノ酸、約720アミノ酸、約756アミノ酸、約792アミノ酸、約828アミノ酸、約836アミノ酸、約864アミノ酸、約875アミノ酸、約912アミノ酸、約923アミノ酸、約948アミノ酸、約1044アミノ酸、約1140アミノ酸、約1236アミノ酸、約1318アミノ酸、約1332アミノ酸、約1428アミノ酸、約1524アミノ酸、約1620アミノ酸、約1716アミノ酸、約1812アミノ酸、約1908アミノ酸、または約2004アミノ酸のうちの1つ以上から選択される長さを含む、項目71、73、75、及び77のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目81)
前記XTEN配列が、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される、項目71、73、75、77、及び80のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目82)
前記XTEN配列が、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号44、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される、項目81に記載のキメラ分子。
(項目83)
前記キメラ分子の半減期が、野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される、項目1~82のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目84)
項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子またはその相補配列をコードする、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
(項目85)
PC5またはPC7をコードするポリヌクレオチド鎖をさらに含む、項目84に記載の
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
(項目86)
項目84または85に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット、及び前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのセットに作動可能に結合された1つ以上のプロモーターを含む、ベクターまたはベクターのセット。
(項目87)
PC5またはPC7をコードする追加のポリヌクレオチド鎖をさらに含む、項目86に記載のベクターまたはベクターのセット。
(項目88)
項目86もしくは87に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または項目86もしくは87に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む、宿主細胞。
(項目89)
哺乳動物細胞である、項目88に記載の宿主細胞。
(項目90)
前記哺乳動物細胞が、HEK293細胞、CHO細胞、またはBHK細胞から選択される、項目89に記載の宿主細胞。
(項目91)
項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、項目86もしくは87に記載のベクターもしくはベクターのセット、または項目88~90のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
(項目92)
前記キメラ分子が、野生型FVIIIタンパク質と比較して延長された半減期を有する、項目91に記載の組成物。
(項目93)
前記キメラ分子の半減期が、野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される、項目91または92に記載の組成物。
(項目94)
出血発症の頻度または程度の減少を必要とする対象における出血発症の頻度または程度の減少方法であって、有効な量の項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチド、項目86もしくは87に記載のベクター、項目88~90のいずれか一項に記載の宿主細胞、または項目91~93のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
(項目95)
出血発症の発生の予防を必要とする対象における出血発症の発生の予防方法であって、有効な量の項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチド、項目86もしくは87に記載のベクター、項目88~90のいずれか一項に記載の宿主細胞、または項目91~93のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
(項目96)
前記出血発症が、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血、またはそれらの任意の組み合わせからである、項目94または95に記載の方法。
(項目97)
項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチド、項目86もしくは87に記載のベクター、項目88~90のいずれか一項に記載の宿主細胞、または項目91~93のいずれか一項に記載の組成物が、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、経口投与、及びそれらの任意の組み合わせから選択される経路で投与される、項目95~96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
キメラ分子の作製方法であって、1つ以上の宿主細胞に項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチド、または項目86もしくは87に記載のベクターをトランスフェクトすること、及び前記宿主細胞内に前記キメラ分子を発現することを含む、前記方法。
(項目99)
前記キメラ分子を単離することをさらに含む、項目98に記載の方法。
(項目100)
VWFタンパク質、異種部分(H1)、及び前記VWFタンパク質と前記異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含むキメラFVIIIタンパク質、ならびにFVIIIタンパク質とXTEN配列とを含む第2のポリペプチド鎖のFVIII活性の改善方法であって、前記第1のポリペプチド鎖内の前記VWFリンカーが、
i.FVIIIからのa2領域、
ii.FVIIIからのa1領域、
iii.FVIIIからのa3領域、
iv.X-V-P-R(配列番号3)とPAR1非活性部位相互作用モチーフとを含むトロンビン切断部位であって、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、v.それらの任意の組み合わせ、を含む、前記方法、
(項目101)
前記FVIII活性が、aPTTアッセイまたはROTEMアッセイによって測定される、項目100に記載の方法。
(項目102)
2つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド配列がFVIII169(配列番号88)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド配列がVWF059(配列番号82)と少なくとも約80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
(項目103)
2つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド配列がFVIII286(配列番号86)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド配列がVWF059(配列番号82)と少なくとも約80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
(項目104)
2つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド配列がFVIII286(配列番号86)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド配列がVWF062(配列番号84)と少なくとも約80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
(項目105)
2つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド配列がFVIII286(配列番号86)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド配列がVWF057(配列番号80)と少なくとも約80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
(項目106)
項目102~105のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードする、ポリヌクレオチド(複数可)。
(項目107)
VWF057(配列番号79)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のヌクレオチド配列をコードする、ポリヌクレオチド。
(項目108)
FVIII169(配列番号87)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一の第2のヌクレオチド配列を含む第2のポリヌクレオチドをさらに含む、項目107に記載のポリヌクレオチド。
(項目109)
FVIII286(配列番号85)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一の第2のヌクレオチド配列を含む第2のポリヌクレオチドをさらに含む、項目107に記載のポリヌクレオチド。
(項目110)
前記第1のポリヌクレオチド及び前記第2のポリヌクレオチドが、同じベクター上にあるか、2つの異なるベクター上にある、項目108または109に記載のポリヌクレオチド。
(項目111)
出血発症の頻度または程度を必要とする対象における出血発症の頻度または程度の方法であって、有効な量の項目102~105のいずれか一項に記載のキメラ分子、または項目106~110のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド(複数可)を投与することを含む、前記方法。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
フォンヴィレブランド因子(VWF)タンパク質と、異種部分(H1)と、XTEN配列と、前記VWFタンパク質を前記異種部分と接続するVWFリンカーとを含むキメラ分子であって、前記VWFリンカーが、
i.第VIII因子(FVIII)からのa2領域、
ii.FVIIIからのa1領域、
iii.FVIIIからのa3領域、
iv.X-V-P-R(配列番号3)とPAR1非活性部位相互作用モチーフとを含むトロンビン切断部位であって、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、v.それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含み、
前記XTEN配列が、前記VWFタンパク質、前記異種部分(H1)、前記VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される、前記キメラ分子。
(項目2)
前記XTEN配列が、前記VWFタンパク質を前記VWFリンカーと、または前記VWFリンカーを前記異種部分と接続する、項目1に記載のキメラ分子。
(項目3)
FVIIIタンパク質を含む第2のポリペプチド鎖をさらに含み、前記第1のポリペプチド鎖と前記第2のポリペプチド鎖とが互いに会合する、項目1または2に記載のキメラ分子。
(項目4)
前記FVIIIタンパク質が追加のXTEN配列をさらに含む、項目3に記載のキメラ分子。
(項目5)
前記追加のXTEN配列が、前記FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に結合されるか、互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入される、項目4に記載のキメラ分子。
(項目6)
前記第2のポリペプチド鎖が、第2の異種部分(H2)をさらに含む、項目3~5のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目7)
VWFタンパク質、異種部分(H1)、及び前記VWFタンパク質と前記異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含む第1のポリペプチド鎖と、FVIIIタンパク質及びXTEN配列を含む第2のポリペプチド鎖と、を含むキメラ分子であって、前記第1のポリペプチド鎖内の前記VWFリンカーが、
i.FVIIIからのa2領域、
ii.FVIIIからのa1領域、
iii.FVIIIからのa3領域、
iv.X-V-P-R(配列番号3)とPAR1非活性部位相互作用モチーフとを含むトロンビン切断部位であって、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、v.それらの任意の組み合わせ、を含み、
前記第1のポリペプチド鎖と前記第2のポリペプチド鎖とが互いに会合する、前記キメラ分子。
(項目8)
前記XTEN配列が、前記FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に接続されるか、互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入される、項目7に記載のキメラ分子。
(項目9)
前記VWFタンパク質、前記異種部分、前記VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される、追加のXTEN配列をさらに含む、項目7または8に記載のキメラ分子。
(項目10)
第2の異種部分(H2)をさらに含む、項目7~9のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目11)
前記第2の異種部分が、前記FVIIIタンパク質、前記XTEN配列、または双方に接続される、項目10に記載のキメラ分子。
(項目12)
前記XTEN配列が、約42個のアミノ酸、約72個のアミノ酸、約108個のアミノ酸、約144個のアミノ酸、約180個のアミノ酸、約216個のアミノ酸、約252個のアミノ酸、約288個のアミノ酸、約324個のアミノ酸、約360個のアミノ酸、約396個のアミノ酸、約432個のアミノ酸、約468個のアミノ酸、約504個のアミノ酸、約540個のアミノ酸、約576個のアミノ酸、約612個のアミノ酸、約624個のアミノ酸、約648個のアミノ酸、約684個のアミノ酸、約720個のアミノ酸、約756個のアミノ酸、約792個のアミノ酸、約828個のアミノ酸、約836個のアミノ酸、約864個のアミノ酸、約875個のアミノ酸、約912個のアミノ酸、約923個のアミノ酸、約948個のアミノ酸、約1044個のアミノ酸、約1140個のアミノ酸、約1236個のアミノ酸、約1318個のアミノ酸、約1332個のアミノ酸、約1428個のアミノ酸、約1524個のアミノ酸、約1620個のアミノ酸、約1716個のアミノ酸、約1812個のアミノ酸、約1908個のアミノ酸、または約2004個のアミノ酸を含む、項目1~11のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目13)
前記XTEN配列が、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される、項目1~12のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目14)
前記XTEN配列が、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号44、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される、項目1~13のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目15)
前記追加のXTEN配列が、約42個のアミノ酸、約72個のアミノ酸、約108個のアミノ酸、約144個のアミノ酸、約180個のアミノ酸、約216個のアミノ酸、約252個のアミノ酸、約288個のアミノ酸、約324個のアミノ酸、約360個のアミノ酸、約396個のアミノ酸、約432個のアミノ酸、約468個のアミノ酸、約504個のアミノ酸、約540個のアミノ酸、約576個のアミノ酸、約612個のアミノ酸、約624個のアミノ酸、約648個のアミノ酸、約684個のアミノ酸、約720個のアミノ酸、約756個のアミノ酸、約792個のアミノ酸、約828個のアミノ酸、約836個のアミノ酸、約864個のアミノ酸、約875個のアミノ酸、約912個のアミノ酸、約923個のアミノ酸、約948個のアミノ酸、約1044個のアミノ酸、約1140個のアミノ酸、約1236個のアミノ酸、約1318個のアミノ酸、約1332個のアミノ酸、約1428個のアミノ酸、約1524個のアミノ酸、約1620個のアミノ酸、約1716個のアミノ酸、約1812個のアミノ酸、約1908個のアミノ酸、または約2004個のアミノ酸を含む、項目4~6及び9~11のいずれか一項に記載のキメラ分子。(項目16)
前記追加のXTEN配列が、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される、項目4~6、9~11、及び15のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目17)
前記追加のXTEN配列が、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号43、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される、項目4~6、9~11、及び15~16のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目18)
前記VWFリンカーが、全長FVIIIに相当するGlu720~Arg740と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む前記a2領域を含み、前記a2領域がトロンビンによって切断されることが可能である、項目1~17のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目19)
前記a2領域が配列番号4を含む、項目18に記載のキメラ分子。
(項目20)
前記VWFリンカーが、全長FVIIIに相当するMet337~Arg372と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む前記a1領域を含み、前記a1領域がトロンビンによって切断されることが可能である、項目1~17のいずれか一項に記載のキメラ分子。(項目21)
前記a1領域が配列番号5を含む、項目20に記載のキメラ分子。
(項目22)
前記VWFリンカーが、全長FVIIIに相当するGlu1649~Arg1689と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む前記a3領域を含み、前記a3領域がトロンビンによって切断されることが可能である、項目1~17のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目23)
前記a3領域が配列番号6を含む、項目22に記載のキメラ分子。
(項目24)
前記VWFリンカーが、X-V-P-R(配列番号3)及び前記PAR1非活性部位相互作用モチーフを含む前記トロンビン切断部位を含み、前記PAR1非活性部位相互作用モチーフがS-F-L-L-R-N(配列番号7)を含む、項目1~17のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目25)
前記PAR1非活性部位相互作用モチーフが、P、P-N、P-N-D、P-N-D-
K(配列番号8)、P-N-D-K-Y(配列番号9)、P-N-D-K-Y-E(配列番号10)、P-N-D-K-Y-E-P(配列番号11)、P-N-D-K-Y-E-P-F(配列番号12)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W(配列番号13)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(配列番号14)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(配列番号20)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(配列番号21)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E(配列番号22)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(配列番号23)、またはそれらの任意の組み合わせから選択される配列をさらに含む、項目1~17、及び24のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目26)
前記脂肪族アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される、項目1~17、24、及び25のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目27)
前記VWFリンカーが、L-V-P-R(配列番号25)からなる前記トロンビン切断部位がトロンビンによって切断されるよりも速くトロンビンによって切断される、項目1~26のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目28)
前記VWFリンカーが配列番号24を含む、項目1~27のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目29)
前記VWFリンカーが、L-V-P-R(配列番号25)からなる前記トロンビン切断部位がトロンビンによって切断されるよりも、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍速く、トロンビンによって切断される、項目27に記載のキメラ分子。
(項目30)
前記VWFリンカーが1個以上のアミノ酸をさらに含み、前記VWFリンカーが、少なくとも約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、または2000アミノ酸の長さを有する、項目1~29のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目31)
前記1個以上のアミノ酸がglyペプチドを含む、項目30に記載のキメラ分子。
(項目32)
前記1個以上のアミノ酸がGlyGlyを含む、項目30または31に記載のキメラ分子。
(項目33)
前記1個以上のアミノ酸がgly/serペプチドを含む、項目30に記載のキメラ分子。
(項目34)
前記gly/serペプチドが、(Gly4Ser)nまたはS(Gly4Ser)nの式を有し、式中、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、または100から選択される正整数である、項目33に記載のキメラ分子。
(項目35)
前記(Gly4Ser)nリンカーが、(Gly4Ser)3(配列番号89)または(Gly4Ser)4(配列番号90)である、項目34に記載のキメラ分子。
(項目36)
前記VWFタンパク質が、VWFのD’ドメイン及びD3ドメインを含み、前記D’ドメイン及びD3ドメインが、FVIIIタンパク質に結合することが可能である、項目1~35のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目37)
前記VWFタンパク質の前記D’ドメインが、配列番号2のアミノ酸764~866と少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、項目36に記載のキメラ分子。
(項目38)
前記VWFタンパク質の前記D3ドメインが、配列番号2のアミノ酸867~1240と少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、項目36または37に記載のキメラ分子。
(項目39)
前記VWFタンパク質が、配列番号2の残基1099、残基1142、または残基1099と1142の双方に相当する残基において少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する、項目36~38のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目40)
前記VWFタンパク質の前記配列内で、システイン以外のアミノ酸が、配列番号2の残基1099、残基1142、または残基1099と1142の双方に相当する残基と置換される、項目1~39のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目41)
前記VWFタンパク質の前記配列が、配列番号2のアミノ酸764~1240を含む、項目1~39のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目42)
前記VWFタンパク質が、VWFのD1ドメイン、D2ドメイン、または前記D1及びD2ドメインをさらに含む、項目36~41のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目43)
前記VWFタンパク質が、A1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D4ドメイン、B1ドメイン、B2ドメイン、B3ドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、CKドメイン、それらの1つ以上の断片、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるVWFドメインをさらに含む、項目36~42のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目44)
前記VWFタンパク質が、(1)VWFの前記D’及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(2)VWFの前記D1、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(3)VWFの前記D2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(4)VWFの前記D1、D2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、または(5)VWFの前記D1、D2、D’、D3、及びA1ドメイン、もしくはそれらの断片、から本質的になる、もしくはそれらからなる、項目36~43のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目45)
VWFのシグナルペプチドをさらに含む、項目1~44のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目46)
前記VWFタンパク質が、PEG化、グリコシル化、HES化、またはポリシアル酸化される、項目1~45のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目47)
前記異種部分(H1)が、前記キメラ分子の半減期を延長することが可能である、項目1~46のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目48)
前記異種部分(H1)が、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、PAS、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端
ペプチド(CTP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目47に記載のキメラ分子。
(項目49)
前記免疫グロブリン定常領域またはその一部が、FcRn結合パートナーを含む、項目48に記載のキメラ分子。
(項目50)
前記免疫グロブリン定常領域またはその一部が、Fc領域を含む、項目48に記載のキメラ分子。
(項目51)
前記異種部分(H1)が、クリアランス受容体またはその断片を含み、前記クリアランス受容体がFVIIIタンパク質のFVIIIクリアランス受容体への結合を遮断する、項目1~47のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目52)
前記クリアランス受容体が、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1(LRP1)、またはそのFVIII結合断片である、項目51に記載のキメラ分子。
(項目53)
前記第2の異種部分が、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、PAS、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端ペプチド(CTP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目6、及び10~52のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目54)
前記第2の異種部分(H2)が、前記FVIIIタンパク質の半減期を延長することが可能である、項目6、及び10~53のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目55)
前記第2の異種部分(H2)が、ポリペプチド、非ポリペプチド部分、または双方を含む、項目54に記載のキメラ分子。
(項目56)
前記第2の異種部分(H2)が、免疫グロブリン定常領域またはその一部を含む、項目54または55に記載のキメラ分子。
(項目57)
前記第2の異種部分が、FcRn結合パートナーを含む、項目56に記載のキメラ分子。
(項目58)
前記第2の異種部分が第2のFc領域を含む、項目56に記載のキメラ分子。
(項目59)
前記第1の異種部分と前記第2の異種部分とが互いに会合する、項目6、及び10~58のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目60)
前記第1のポリペプチド鎖と前記第2のポリペプチドとの間の会合が共有結合である、項目59に記載のキメラ分子。
(項目61)
前記第1の異種部分と前記第2の異種部分との間の会合が、ジスルフィド結合である、項目59に記載のキメラ分子。
(項目62)
前記第1の異種部分がFcRn結合パートナーであり、前記第2の異種部分がFcRn結合パートナーである、項目6、及び10~58のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目63)
前記第1の異種部分がFc領域であり、前記第2の異種部分がFc領域である、項目6
、及び10~58のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目64)
前記FVIIIタンパク質が、FVIIIリンカーによって前記第2の異種部分に結合される、項目6、及び10~58のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目65)
前記FVIIIリンカーが切断可能リンカーである、項目64に記載のキメラ分子。
(項目66)
前記FVIIIリンカーが前記VWFリンカーと同一である、項目64または65に記載のキメラ分子。
(項目67)
前記FVIIIリンカーが前記VWFリンカーと異なる、項目64または65に記載のキメラ分子。
(項目68)
(a)V-L1-X1-H1:H2-L2-X2-C、
(b)V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C、
(c)V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C、
(d)V-X1-L1-H1:H2-X2-L2-C、
(e)V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2)、
(f)V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2)、
(g)C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V、
(h)C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V、
(i)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、
(j)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、
(k)C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V、または
(l)C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-Vから選択される式を含み、
式中、Vが前記VWFタンパク質であり、
L1が前記VWFリンカーであり、
L2が任意のFVIIIリンカーであり、
H1が前記第1の異種部分であり、
H2が前記第2の異種部分であり、
Cが前記FVIIIタンパク質であり、
C(X2)が前記XTEN配列に融合される前記FVIIIタンパク質であり、前記XTEN配列が互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され、
(-)が、ペプチド結合または1個以上のアミノ酸であり、及び
(:)が、前記H1と前記H2との間の共有結合である、項目6、及び10~67のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目69)
前記VWFタンパク質が、内因性VWFの前記FVIIIタンパク質への結合を抑制または防止する、項目6、及び10~68のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目70)
前記FVIIIタンパク質が第3の異種部分(H3)を含む、項目6、及び10~69のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目71)
前記第3の異種部分(H3)がXTEN配列である、項目70に記載のキメラ分子。
(項目72)
前記FVIIIタンパク質が第4の異種部分(H4)を含む、項目70または71に記載のキメラ分子。
(項目73)
前記第4の異種部分(H4)がXTEN配列である、項目72に記載のキメラ分子。
(項目74)
前記FVIIIタンパク質が第5の異種部分(H5)を含む、項目72または73に記載のキメラ分子。
(項目75)
前記第5の異種部分がXTEN配列である、項目74に記載のキメラ分子。
(項目76)
前記FVIIIタンパク質が前記第6の異種部分(H6)を含む、項目74または75に記載のキメラ分子。
(項目77)
前記第6の異種部分がXTEN配列である、項目76に記載のキメラ分子。
(項目78)
前記第3の異種部分(H3)、前記第4の異種部分(H4)、前記第5の異種部分(H5)、及び前記第6の異種部分(H6)のうちの1つ以上が、前記キメラ分子の半減期を延長することが可能である、項目76または77に記載のキメラ分子。
(項目79)
前記第3の異種部分(H3)、前記第4の異種部分(H4)、前記第5の異種部分(H5)、及び前記第6の異種部分(H6)が、FVIIIのC末端もしくはN末端に結合されるか、前記FVIIIタンパク質の2個のアミノ酸の間に挿入される、項目76または77に記載のキメラ分子。
(項目80)
前記XTEN配列の1つ以上が、約42アミノ酸、約72アミノ酸、約108アミノ酸、約144アミノ酸、約180アミノ酸、約216アミノ酸、約252アミノ酸、約288アミノ酸、約324アミノ酸、約360アミノ酸、約396アミノ酸、約432アミノ酸、約468アミノ酸、約504アミノ酸、約540アミノ酸、約576アミノ酸、約612アミノ酸、約624アミノ酸、約648アミノ酸、約684アミノ酸、約720アミノ酸、約756アミノ酸、約792アミノ酸、約828アミノ酸、約836アミノ酸、約864アミノ酸、約875アミノ酸、約912アミノ酸、約923アミノ酸、約948アミノ酸、約1044アミノ酸、約1140アミノ酸、約1236アミノ酸、約1318アミノ酸、約1332アミノ酸、約1428アミノ酸、約1524アミノ酸、約1620アミノ酸、約1716アミノ酸、約1812アミノ酸、約1908アミノ酸、または約2004アミノ酸のうちの1つ以上から選択される長さを含む、項目71、73、75、及び77のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目81)
前記XTEN配列が、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、またはAG144から選択される、項目71、73、75、77、及び80のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目82)
前記XTEN配列が、配列番号39、配列番号40、配列番号47、配列番号45、配列番号44、配列番号41、配列番号48、配列番号46、配列番号44、または配列番号42から選択される、項目81に記載のキメラ分子。
(項目83)
前記キメラ分子の半減期が、野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される、項目1~82のいずれか一項に記載のキメラ分子。
(項目84)
項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子またはその相補配列をコードする、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
(項目85)
PC5またはPC7をコードするポリヌクレオチド鎖をさらに含む、項目84に記載の
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
(項目86)
項目84または85に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット、及び前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのセットに作動可能に結合された1つ以上のプロモーターを含む、ベクターまたはベクターのセット。
(項目87)
PC5またはPC7をコードする追加のポリヌクレオチド鎖をさらに含む、項目86に記載のベクターまたはベクターのセット。
(項目88)
項目86もしくは87に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または項目86もしくは87に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む、宿主細胞。
(項目89)
哺乳動物細胞である、項目88に記載の宿主細胞。
(項目90)
前記哺乳動物細胞が、HEK293細胞、CHO細胞、またはBHK細胞から選択される、項目89に記載の宿主細胞。
(項目91)
項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、項目86もしくは87に記載のベクターもしくはベクターのセット、または項目88~90のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
(項目92)
前記キメラ分子が、野生型FVIIIタンパク質と比較して延長された半減期を有する、項目91に記載の組成物。
(項目93)
前記キメラ分子の半減期が、野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される、項目91または92に記載の組成物。
(項目94)
出血発症の頻度または程度の減少を必要とする対象における出血発症の頻度または程度の減少方法であって、有効な量の項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチド、項目86もしくは87に記載のベクター、項目88~90のいずれか一項に記載の宿主細胞、または項目91~93のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
(項目95)
出血発症の発生の予防を必要とする対象における出血発症の発生の予防方法であって、有効な量の項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチド、項目86もしくは87に記載のベクター、項目88~90のいずれか一項に記載の宿主細胞、または項目91~93のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
(項目96)
前記出血発症が、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血、またはそれらの任意の組み合わせからである、項目94または95に記載の方法。
(項目97)
項目1~83のいずれか一項に記載のキメラ分子、項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチド、項目86もしくは87に記載のベクター、項目88~90のいずれか一項に記載の宿主細胞、または項目91~93のいずれか一項に記載の組成物が、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、経口投与、及びそれらの任意の組み合わせから選択される経路で投与される、項目95~96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
キメラ分子の作製方法であって、1つ以上の宿主細胞に項目84もしくは85に記載のポリヌクレオチド、または項目86もしくは87に記載のベクターをトランスフェクトすること、及び前記宿主細胞内に前記キメラ分子を発現することを含む、前記方法。
(項目99)
前記キメラ分子を単離することをさらに含む、項目98に記載の方法。
(項目100)
VWFタンパク質、異種部分(H1)、及び前記VWFタンパク質と前記異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含むキメラFVIIIタンパク質、ならびにFVIIIタンパク質とXTEN配列とを含む第2のポリペプチド鎖のFVIII活性の改善方法であって、前記第1のポリペプチド鎖内の前記VWFリンカーが、
i.FVIIIからのa2領域、
ii.FVIIIからのa1領域、
iii.FVIIIからのa3領域、
iv.X-V-P-R(配列番号3)とPAR1非活性部位相互作用モチーフとを含むトロンビン切断部位であって、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または、v.それらの任意の組み合わせ、を含む、前記方法、
(項目101)
前記FVIII活性が、aPTTアッセイまたはROTEMアッセイによって測定される、項目100に記載の方法。
(項目102)
2つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド配列がFVIII169(配列番号88)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド配列がVWF059(配列番号82)と少なくとも約80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
(項目103)
2つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド配列がFVIII286(配列番号86)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド配列がVWF059(配列番号82)と少なくとも約80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
(項目104)
2つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド配列がFVIII286(配列番号86)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド配列がVWF062(配列番号84)と少なくとも約80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
(項目105)
2つのポリペプチド配列を含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド配列がFVIII286(配列番号86)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド配列がVWF057(配列番号80)と少なくとも約80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
(項目106)
項目102~105のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードする、ポリヌクレオチド(複数可)。
(項目107)
VWF057(配列番号79)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一のヌクレオチド配列をコードする、ポリヌクレオチド。
(項目108)
FVIII169(配列番号87)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一の第2のヌクレオチド配列を含む第2のポリヌクレオチドをさらに含む、項目107に記載のポリヌクレオチド。
(項目109)
FVIII286(配列番号85)と少なくとも約80%、約90%、約95%、または100%同一の第2のヌクレオチド配列を含む第2のポリヌクレオチドをさらに含む、項目107に記載のポリヌクレオチド。
(項目110)
前記第1のポリヌクレオチド及び前記第2のポリヌクレオチドが、同じベクター上にあるか、2つの異なるベクター上にある、項目108または109に記載のポリヌクレオチド。
(項目111)
出血発症の頻度または程度を必要とする対象における出血発症の頻度または程度の方法であって、有効な量の項目102~105のいずれか一項に記載のキメラ分子、または項目106~110のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド(複数可)を投与することを含む、前記方法。
本発明は、XTEN配列、及びVWFタンパク質またはFVIIIタンパク質を異種部分、例えば、半減期延長部分、と接続するトロンビン切断可能リンカーを含むキメラ分子を対象とする。本発明はまた、2つのポリペプチド鎖、異種部分に融合されるVWFタンパク質を含む第1の鎖と、FVIIIタンパク質及び第2の異種部分を含む第2の鎖とを含むキメラ分子も提供し、該キメラ分子は、第1または第2のポリペプチド鎖内にXTEN配列を含み、VWFタンパク質またはFVIIIタンパク質のいずれか(または双方)が、VWFリンカーまたはFVIIIリンカー(または双方)を介して異種部分に融合される。トロンビン切断可能リンカー(VWFリンカーまたはFVIIIリンカー)は、トロンビンを容易に利用可能な損傷部位でトロンビンによって効率的に切断することができる。例となるキメラ分子は、本説明及び図中で例示される。いくつかの実施形態において、本発明は、例えば、図1~7に示される構造を有するキメラ分子に関する。他の実施形態において、本発明は、本明細書内に開示されるキメラ分子構築物をコードするポリヌクレオチドに関する。
本明細書及び特許請求の範囲の明確な理解を提供するために、以下の定義を下に提供する。
I. 定義
「1つ(a)」または「1つ(an)」の実体という用語は、その実体の1つ以上を指すことに留意されたい。例えば、「1つのヌクレオチド配列(a nucleotide
sequence)」は、1つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、「1つ(a)」(または「1つ(an)」)、「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
「1つ(a)」または「1つ(an)」の実体という用語は、その実体の1つ以上を指すことに留意されたい。例えば、「1つのヌクレオチド配列(a nucleotide
sequence)」は、1つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、「1つ(a)」(または「1つ(an)」)、「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
「約」という用語は、本明細書において、およそ、大体、周辺、及びその領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用されるとき、それは、
示される数値の上下の境界を延長することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、本明細書において、10パーセント上方または下方(高いまたは低い)の差異で、述べられた値の上下の数値を修正するために使用される。
示される数値の上下の境界を延長することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、本明細書において、10パーセント上方または下方(高いまたは低い)の差異で、述べられた値の上下の数値を修正するために使用される。
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単一の核酸ならびに複数の核酸を包含するよう意図されており、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)を指す。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、従来型ホスホジエステル結合または非従来型結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるようなアミド結合)を含む。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド内に存在する、任意の1つ以上の核酸セグメント、例えば、DNAまたはRNA断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然環境から除去されている核酸分子、DNAまたはRNAを意図する。例えば、ベクター内に含有される第VIII因子ポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持される、または溶液中の他のポリヌクレオチドから(部分的または実質的に)精製される組み換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたRNA分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写物を含む。本発明に従う単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されるそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、または転写終結シグナルなどの調節要素を含むことができる。
本明細書において使用される場合、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)は、典型的には、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると見なされ得、しかし、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロン等は、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、結果として生じるポリペプチドのアミノ末端をコードする、5’末端の開始コドン、及び結果として生じるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする、3’末端の翻訳終止コドンによって決定される。本発明の2つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、単一のベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、別個の(異なる)ベクター上に存在する。したがって、単一のベクターは、単一のコード領域だけを含有することができるか、または2つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターは、以下に記載されるようなキメラ分子の第1のポリペプチド鎖及び第2のポリペプチド鎖を別個にコードすることができるということになる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明のキメラ分子をコードする核酸に融合される、または融合されない、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊化した要素またはモチーフを制限なしに含む。
哺乳動物細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は、粗面小胞体にわたる成長タンパク質鎖の輸送が開始すると成熟タンパク質から開裂される分泌シグナルペプチドと関連する。当業者は、シグナルペプチドが、一般的にポリペプチドのN末端に融合されること、及び完全または「全長」ポリペプチドから開裂されて、ポリペプチドの分泌型または「成熟」形態を産生することを認識している。ある特定の実施形態において、天然のシグナルペプチド、例えば、FVIIIシグナルペプチドもしくはVWFシグナルペプチド、またはそれと作動可能に会合するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能性誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)もしくはマウスβ-グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはその機能性誘導体が使用され得る。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して3’に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態において、下流ヌクレオチド配列は、翻訳の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、翻訳の開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して5’に位置するヌクレオチド配列を意味する。ある特定の実施形態において、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または翻訳の開始点の5’側に位置する配列に関する。例えば、大半のプロモーターは、翻訳開始部位の上流に位置する。
本明細書において使用される場合、「調節領域」という用語は、コード領域の上流(5’非コード配列)、コード領域内、またはコード領域の下流(3’非コード配列)に位置するヌクレオチド配列を指し、転写、RNAプロセシング、安定性、関連コード領域の翻訳に影響を及ぼす。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、及びステムループ構造体を含み得る。コード領域が真核細胞内の発現を目的とする場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列に対して3’に位置することになる。
遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター及び/または1つ以上のコード領域と作動可能に会合する他の転写もしくは翻訳制御要素を含むことができる。作動可能な会合において、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのためのコード領域は、遺伝子産物の発現を調節領域(複数可)の影響または制御下に置くような方法で1つ以上の調節領域と作動可能に会合する。例えば、コード領域及びプロモーターは、プロモーター機能の導入がコード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及びプロモーターとコード領域との間の結合の性質が、プロモーターが遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害しない、またはDNAテンプレートが転写される能力を妨害しない場合に、「作動可能に会合」する。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルもまた、遺伝子産物発現を指示するためのコード領域と作動可能に会合し得る。
様々な転写制御領域は、当業者に公知である。これらは、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス(イントロン-Aと組み合わせた最初期プロモーター)、シミアンウイルス40(初期プロモーター)、及びレトロウイルス(ラウス肉腫ウイルスなど)からのプロモーター及びエンハンサーセグメントなどの、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域を制限なく含む。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、及びウサギβ-グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞内の遺伝子発現を制御することが可能である他の配列を含む。さらなる好適な転写制御領域としては、組織特異性プロモーター及びエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター)が挙げられる。
同様に、様々な翻訳制御要素は、当業者に公知である。これらは、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、ならびにピコルナウイルス由来の要素(特に、CITE配列とも称される、内部リボソーム進入部位もしくはIRES)を含むがこれらに限定されない。
「発現」という用語は、本明細書内で使用される場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、RNAまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。それは、ポリヌクレオチドのメッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA(tRNA)、小ヘアピンRNA
(shRNA)、小干渉RNA(siRNA)、または任意の他のRNA産物への転写、及びmRNAのポリペプチドへの翻訳を制限なく含む。発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書内で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーRNA、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシング、を受けた核酸、または、翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解切断、を受けたポリペプチドをさらに含む。
(shRNA)、小干渉RNA(siRNA)、または任意の他のRNA産物への転写、及びmRNAのポリペプチドへの翻訳を制限なく含む。発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書内で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーRNA、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシング、を受けた核酸、または、翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解切断、を受けたポリペプチドをさらに含む。
「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローン化及び/または輸送のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、結合されたセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントが結合され得るレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製が可能である、任意の遺伝要素(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス)を指す。「ベクター」という用語は、核酸をインビトロ、エキソビボ、またはインビボで細胞に導入するためのウイルス性及び非ウイルス性双方のビヒクルを含む。例えば、プラスミド、修飾された真核ウイルス、または修飾された細菌ウイルスを含め、多数のベクターが、当該技術分野において公知であり、使用される。ポリヌクレオチドの好適なベクターへの挿入は、相補付着末端を有する選択されたベクターへの適切なポリヌクレオチド断片の連結によって達成され得る。
ベクターは、そのベクターを組み込んだ細胞の選択または同定をもたらす選択可能マーカーまたはレポーターをコードするように操作され得る。選択可能マーカーまたはレポーターの発現は、そのベクター上に含有される他のコード領域を組み込み、発現する宿主細胞の同定及び/または選択を可能にする。当該技術分野において公知であり使用される選択可能マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミド等に対する耐性を提供する遺伝子、及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンテニルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。当該技術分野において公知であり使用されるレポーターの例としては、ルシフェラーゼ(Luc)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、-ガラクトシダーゼ(LacZ)、-グルクロニダーゼ(Gus)等が挙げられる。選択可能マーカーはまた、レポーターであると見なされ得る。
「プラスミド」という用語は、多くの場合細胞の中枢代謝の一部ではない遺伝子を運び、通常、環状二本鎖DNA分子の形態にある、染色体外要素を指す。そのような要素は、任意の源に由来する一本鎖もしくは二本鎖の線状、環状、もしくは超らせんDNAまたはRNAの自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列であり得、多くのヌクレオチド配列が、プロモーター断片及び選択された遺伝子産物のためのDNA配列を適切な3’非翻訳配列と共に細胞へ導入することが可能である独自の構造に結合されているもしくは組み換えられている。
使用され得る真核ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。非ウイルス性ベクターは、プラスミド、リポソーム、荷電脂質(サイトフェクチン)、DNA-タンパク質複合体、及びバイオポリマーを含む。
「クローン化ベクター」は、順次複製する核酸の単位長であり、かつ結合されたセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントが結合され得る、プラスミド、ファージ
、またはコスミドなどの複製起点を含む、「レプリコン」を指す。ある特定のクローン化ベクターは、1つの細胞型、例えば、細菌においては複製が、及び別の細胞型、例えば真核細胞においては発現が可能である。クローン化ベクターは、典型的には、ベクター及び/または目的の核酸配列の挿入のための1つ以上の複数クローン化部位を含む細胞の選択のために使用され得る1つ以上の配列を含む。
、またはコスミドなどの複製起点を含む、「レプリコン」を指す。ある特定のクローン化ベクターは、1つの細胞型、例えば、細菌においては複製が、及び別の細胞型、例えば真核細胞においては発現が可能である。クローン化ベクターは、典型的には、ベクター及び/または目的の核酸配列の挿入のための1つ以上の複数クローン化部位を含む細胞の選択のために使用され得る1つ以上の配列を含む。
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞への挿入の後で、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたビヒクルを指す。挿入された核酸配列は、上に記載されるような調節領域と作動可能に会合して配置される。
ベクターは、当該技術分野において周知の方法、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体によって宿主細胞内へ導入される。
「培養」、「培養する」、及び「培養すること」は、本明細書内で使用される場合、細胞増殖もしくは分裂を可能にするインビトロの条件下で細胞をインキュベートすること、または細胞を生きた状態で維持することを意味する。「培養された細胞」とは、本明細書内で使用される場合、インビトロで繁殖した細胞を意味する。
本明細書内で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含するよう意図されており、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって線状に結合される単量体(アミノ酸)で構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、2個以上のアミノ酸の任意の鎖(複数可)を指し、特定の長さの産生物を指すものではない。そのため、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2個以上のアミノ酸の鎖(複数可)を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらと互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然型アミノ酸による修飾を制限なく含む、ポリペプチドの発現後修飾の産生物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物源または産生された組み換え技術に由来し得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。それは、化学合成を含め、任意の様式で精製され得る。
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、その天然環境にないポリペプチドを指す。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から単に除去されることができる。組み換え産生されたポリペプチド及び宿主細胞内に発現されたタンパク質は、本発明の目的のために、単離されたと見なされ、好適な技術によって分離されている、分画されている、または部分的もしくは実質的に精製されている天然または組み換えポリペプチドも同様である。
本発明にさらに含まれるのは、ポリペプチドの断片または変異体、及びそれらの任意の組み合わせである。「断片」または「変異体」という用語は、ポリペプチド結合ドメインまたは本発明の結合分子を指すとき、参照ポリペプチドの特性(例えば、FcRn結合ドメイン、もしくはFc変異体に対するFcRn結合親和性、FVIII変異体に対する凝固活性、またはVWFタンパク質に対するFVIII結合活性)の少なくともいくつかを保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書の他の箇所で説明される特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片を含むが、天然
型の全長ポリペプチド(または成熟ポリペプチド)を含まない。ポリペプチド結合ドメインまたは本発明の結合分子の変異体は、上に記載されるような断片と、さらにアミノ酸置換、欠失、挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、天然型または非天然型であり得る。非天然型変異体は、当該技術分野において公知の突然変異誘発技術を使用して産生され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、もしくは付加を含み得る。
型の全長ポリペプチド(または成熟ポリペプチド)を含まない。ポリペプチド結合ドメインまたは本発明の結合分子の変異体は、上に記載されるような断片と、さらにアミノ酸置換、欠失、挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、天然型または非天然型であり得る。非天然型変異体は、当該技術分野において公知の突然変異誘発技術を使用して産生され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、もしくは付加を含み得る。
本明細書内で使用される「VWF断片」(複数可)という用語は、FVIIIと相互作用し、かつ通常は全長VWFによってFVIIIに提供される少なくとも1つ以上の特性、例えば、FVIIIaに対する早期活性化を防止すること、早期タンパク質分解を防止すること、早期クリアランスを導く可能性のあるリン脂質膜との会合を防止すること、VWF結合したFVIIIではなく裸のFVIIIを結合することができるFVIIIクリアランス受容体への結合を防止すること、ならびに/またはFVIII重鎖及び軽鎖相互作用を安定させること、を保持する任意のVWF断片を意味する。特定の実施形態において、「VWF断片」は、本明細書内で使用される場合、VWFタンパク質のD’ドメイン及びD3ドメインを含むが、VWFタンパク質のA1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D4ドメイン、B1ドメイン、B2ドメイン、B3ドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、及びCKドメインは含まない。
「半減期制限因子」または「FVIII半減期制限因子」という用語は、本明細書内で使用される場合、FVIIIタンパク質の半減期が野生型FVIIIと比較して1.5倍または2倍より長くなることを防止する因子を示す(例えば、ADVATE(登録商標)またはREFACTO(登録商標))。例えば、全長または成熟VWFは、FVIII及びVWF複合体が1つ以上のVWFクリアランス経路によってシステムから排出されるように誘発することによって、FVIII半減期制限因子としての機能を果たすことができる。一例において、内因性VWFはFVIII半減期制限因子である。別の例において、FVIIIタンパク質に非共有結合的に結合される全長組み換えVWF分子は、FVIII半減期制限因子である。
「内因性VWF」という用語は、本明細書内で使用される場合、血漿内に天然に存在するVWF分子を示す。内因性VWF分子は、多量体であり得るが、単量体または二量体ではあり得ない。血漿中の内因性VWFは、FVIIIに結合し、FVIIIと非共有結合の複合体を形成する。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含め、当該技術分野において定義されている。そのため、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸と置き換わっている場合、その置換は保存的であると見なされる。別の実施形態において、アミノ酸の文字列は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び/または組成において異なる構造的に同様の文字列と保存的に置き換えることができる。
当該技術分野において知られているように、2つのポリペプチド間の「配列同一性」は、1つのポリペプチドのアミノ酸配列を第2のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書において論じられる場合、任意の特定のポリペプチドがもう一方
のポリペプチドと少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%同一であるかどうかは、限定されるものではないが、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for Unix(登録商標)、Genetics Computer Group、University Research Park、575 Science Drive、Madison、WI 53711)などの当該技術分野において公知の方法及びコンピュータプログラム/ソフトウェアを使用することによって決定することができる。BESTFITは、Smith及びWaterman、Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)の局所相同アルゴリズム、を使用して、2つの配列間の相同の最高セグメントを見出す。BESTFITまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、本発明に従う参照配列と、例えば、95%同一であるかどうかを決定するとき、パラメータは、当然ながら、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、及び参照配列内のアミノ酸の合計数の最大5%まで相同性における差異が許容されるように、設定される。
のポリペプチドと少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%同一であるかどうかは、限定されるものではないが、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for Unix(登録商標)、Genetics Computer Group、University Research Park、575 Science Drive、Madison、WI 53711)などの当該技術分野において公知の方法及びコンピュータプログラム/ソフトウェアを使用することによって決定することができる。BESTFITは、Smith及びWaterman、Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)の局所相同アルゴリズム、を使用して、2つの配列間の相同の最高セグメントを見出す。BESTFITまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、本発明に従う参照配列と、例えば、95%同一であるかどうかを決定するとき、パラメータは、当然ながら、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、及び参照配列内のアミノ酸の合計数の最大5%まで相同性における差異が許容されるように、設定される。
本明細書において使用される場合、VWF配列またはFVIIIタンパク質配列内の「~に相当するアミノ酸」または「等価なアミノ酸」は、第1のVWFまたはFVIII配列と第2のVWFまたはFVIII配列との間の同一性または類似性を最大限にするためのアライメントによって識別される。第2のVWFまたはFVIII配列内の等価なアミノ酸を認識するために使用される数字は、第1のVWFまたはFVIII配列内の相当するアミノ酸を識別するために使用される数字に基づく。
「融合」または「キメラ」分子は、天然においては自然に結合されない第2のアミノ酸配列と結合した第1のアミノ酸配列を含む。通常別個のタンパク質内に存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチド内で結合され得るか、または通常同じたんぱく質内に存在するアミノ酸配列が、融合ポリペプチド、例えば、本発明の第VIII因子ドメインと免疫グロブリンFcドメインとの融合内の新しい配置に配置され得る。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作成及び翻訳することによって、作成される。キメラタンパク質は、共有結合、非ペプチド結合、または非共有結合によって第1のアミノ酸配列に会合する第2のアミノ酸配列をさらに含むことができる。
本明細書において使用される場合、「半減期」という用語は、インビボにおける特定のポリペプチド生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与される量の半分が動物内の循環及び/または他の組織から取り除かれるために必要な時間によって表され得る。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が、時間の関数として構造化されるとき、その曲線は、通常、急速なα相とより長いβ相とを有する二相性である。α相は、典型的には、血管内外の空間の間の投与されたポリペプチドの平衡状態を表し、部分的には、ポリペプチドのサイズによって決定される。β相は、典型的には、血管内空間におけるポリペプチドの異化を表す。いくつかの実施形態において、本発明のキメラ分子は単相性であり、そのため、α相は有しないが、単一のβ相のみを有する。それ故に、ある特定の実施形態において、本明細書において使用される場合、半減期という用語は、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおけるヒト抗体の典型的なβ相半減期は21日である。
「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較されている実体の異種とは異なる実体に由来することを意味する。それ故に、VWFタンパク質に結合される異種ポリペプチドは、VWFタンパク質に結合され、かつVWFタンパク質の天然に存在する部分ではない、ポリペプチド鎖を意味する。例えば、異種ポリヌクレオチドまたは抗原は、異なる種
、一個体の異なる細胞型、または別の個体の細胞の同じもしくは異なる型に由来し得る。
、一個体の異なる細胞型、または別の個体の細胞の同じもしくは異なる型に由来し得る。
「結合された(linked)」、「融合された」、または「接続された」という用語は、本明細書において使用される場合、第2のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に結合された(joined)第1のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す(例えば、それぞれペプチド結合、またはホスホジエステル結合を介して)。「共有結合的に結合した」、または「共有結合(covalent linkage)」という用語は、共有結合(covalent bond)、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、または一緒に結合される2つの部分の間の1個以上のアミノ酸、例えば、リンカーを指す。第1のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列は、第2のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列に直接結合され得るか、または代替的に、介在配列が、第1の配列を第2の配列に結合することができる。「結合された」、「融合された」、または「接続された」という用語は、C末端またはN末端での第1のアミノ酸配列の第2のアミノ酸配列への融合を意味するだけでなく、第1のアミノ酸配列(または、第2のアミノ酸配列)全体の、第2のアミノ酸配列(または、第1のアミノ酸配列)内の任意の2個のアミノ酸内への挿入も含む。一実施形態において、第1のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第2のアミノ酸配列に結合され得る。第1のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第2のヌクレオチド配列に結合され得る。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド(ポリペプチド鎖において)、またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖(ヌクレオチド鎖において)、または任意の化学的部分(リペプチド及びポリヌクレオチド鎖の双方において)であり得る。共有結合は、時として、(-)またはハイフンとして示される。
本明細書内において使用される場合、「~と会合する」という用語は、第1のアミノ酸鎖と第2のアミノ酸鎖との間に形成される共有結合または非共有結合を指す。一実施形態において、「~と会合する」という用語は、共有結合、非ペプチド結合、または非共有結合を意味する。いくつかの実施形態において、この会合は、コロン、すなわち、(:)によって示される。別の実施形態において、それは、ペプチド結合以外の共有結合を意味する。他の実施形態において、「共有結合的に会合する」という用語は、本明細書内において使用される場合、共有結合、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、1個以上のアミノ酸(例えば、リンカー)による2つの部分間の会合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することができる、または第2のシステイン残基上のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。大半の天然に存在するIgG分子内で、CH1及びCL領域は、ジスルフィド結合によって会合し、その2つの重鎖は、Kabat番号付けシステムを使用して239及び242(226位または229位、EU番号付けシステム)に相当する位置で2つのジスルフィド結合によって会合する。共有結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ(σ)結合、パイ(π)結合、デルタ(δ)結合、グリコシド結合、不可知論的結合、曲がった結合、双極性結合、パイ背面結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数、または反結合が挙げられるが、これらに限定されない。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合(例えば、カチオン-π結合もしくは塩結合)、金属結合、水素結合(例えば、二水素結合、二水素複合体、低障壁水素結合、もしくは対称的水素結合)、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー的な力、または化学的極性が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「切断部位」または「酵素的切断部位」は、酵素によって認識される部位を指す。一実施形態において、ポリペプチドは、凝固カスケード中に活性化される酵素によって切断される酵素的切断部位を有するため、そのような部位の切断は血栓形成の部位で起こる。別の実施形態において、FVIIIタンパク質及び第2
の異種部分を接続するFVIIIリンカーは、切断部位を含むことができる。例となるそのような部位としては、例えば、トロンビン、第XIa因子、または第Xa因子に認識されるものが挙げられる。例となるFXIa切断部位としては、例えば、TQSFNDFTR(配列番号27)及びSVSQTSKLTR(配列番号28)が挙げられる。例となるトロンビン切断部位としては、例えば、DFLAEGGGVR(配列番号29)、TTKIKPR(配列番号30)、LVPRG(配列番号31)、及びALRPR(配列番号26のアミノ酸1~5)が挙げられる。他の酵素的切断部位は、当該技術分野において公知である。トロンビンによって切断され得る切断部位は、本明細書内では「トロンビン切断部位」と称される。
の異種部分を接続するFVIIIリンカーは、切断部位を含むことができる。例となるそのような部位としては、例えば、トロンビン、第XIa因子、または第Xa因子に認識されるものが挙げられる。例となるFXIa切断部位としては、例えば、TQSFNDFTR(配列番号27)及びSVSQTSKLTR(配列番号28)が挙げられる。例となるトロンビン切断部位としては、例えば、DFLAEGGGVR(配列番号29)、TTKIKPR(配列番号30)、LVPRG(配列番号31)、及びALRPR(配列番号26のアミノ酸1~5)が挙げられる。他の酵素的切断部位は、当該技術分野において公知である。トロンビンによって切断され得る切断部位は、本明細書内では「トロンビン切断部位」と称される。
本明細書において使用される場合、「プロセシング部位」または「細胞内プロセシング部位」という用語は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素の標的であるポリペプチド中の酵素的切断部位の種類を指す。一実施形態において、そのような酵素は、ゴルジルーメンからトランスゴルジ区画への輸送中に機能する。細胞内プロセシング酵素は、細胞からのタンパク質の分泌の前にポリペプチドを切断する。そのようなプロセシング部位の例としては、例えば、エンドペプチダーゼのPACE/フューリン(PACEは、Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme(対の塩基性アミノ酸開裂酵素)の頭字語である)メンバーによって標的とされるものが挙げられる。これらの酵素は、ゴルジ膜へ局在し、配列モチーフArg-[任意の残基]-(LysまたはArg)-Argのカルボキシ末端側上のタンパク質を切断する。本明細書において使用される場合、酵素の「フューリン」ファミリーは、例えば、PCSK1(PC1/Pc3としても知られる)、PCSK2(PC2としても知られる)、PCSK3(フューリンもしくはPACEとしても知られる)、PCSK4(PC4としても知られる)、PCSK5(PC5もしくはPC6としても知られる)、PCSK6(PACE4としても知られる)、またはPCSK7(PC7/LPC、PC8、もしくはSPC7としても知られる)を含む。他のプロセシング部位は当該技術分野において公知である。「プロセス可能なリンカー」という用語は、本明細書においては、細胞内プロセシング部位を含むリンカーを指す。
「フューリン」という用語は、EC番号3.4.21.75.に相当する酵素を指す。フューリンは、PACE(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme(対の塩基性アミノ酸開裂酵素))としても知られる、サブチリシン様プロタンパク質転換酵素である。フューリンは、不活性な前駆体タンパク質の区域を削除し、それらを生物学的に活性なタンパク質に変換する。その細胞内輸送の間に、プロペプチドは、ゴルジ内のフューリン酵素によって成熟VWF分子から切断される。
1つを超えるプロセシングまたは切断部位を含む構築物において、そのような部位は同じかまたは異なり得ることが理解されよう。
止血障害は、本明細書内において使用される場合、フィブリン血栓を形成する能力の障害、またはそれができないことに起因して、自然発症的に、または外傷の結果としてのいずれかでの出血傾向を特徴とする遺伝または獲得された病態を意味する。そのような障害の例としては、血友病が挙げられる。その3つの主な形態は、血友病A(第VIII因子欠乏症)、血友病B(第IX因子欠乏症、または「クリスマス病」)、及び血友病C(第XI因子欠乏症、軽度の出血傾向)である。他の止血障害としては、例えば、フォンヴィレブランド病、第XI欠乏症(PTA欠乏症)、第XII因子欠乏症、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第V因子、第VII因子、第X因子、もしくは第XIII因子の欠乏もしくは構造的異常、GPIbの欠陥もしくは欠乏であるベルナール-スリエ症候群が挙げられる。VWFのための受容体、GPIbは、欠陥があり得、一次血栓形成(一次止血)の欠如及び出血増加傾向)、ならびにGlanzman及びNaegeliの血小板無
力症(Glanzmann血小板無力症)につながり得る。肝不全(急性及び慢性型)においては、肝臓による凝固因子の不十分な産生があり、これが出血のリスクを増加させる場合がある。
力症(Glanzmann血小板無力症)につながり得る。肝不全(急性及び慢性型)においては、肝臓による凝固因子の不十分な産生があり、これが出血のリスクを増加させる場合がある。
本発明のキメラ分子を、予防的に使用することができる。本明細書において使用される場合、「予防的治療」は、出血発症の前の分子の投与を指す。一実施形態において、一般的な止血薬を必要とする対象は、手術を受けている、または手術を受けようとしている。本発明のキメラタンパク質は、手術の前または後に予防薬として投与することができる。本発明のキメラタンパク質は、急性の出血発症を制御するために、手術中または手術後に投与することができる。手術は、肝臓移植、肝臓切除術、歯科処置、または幹細胞移植を含み得るが、これらに限定されない。
本発明のキメラ分子はまた、オンデマンド(「発症時」とも称される)治療にも使用される。「オンデマンド治療」または「発症時治療」という用語は、出血発症の症状に応じた、または出血を引き起こし得る活動の前の、キメラ分子の投与を指す。一態様において、オンデマンド(発症時)治療は、損傷の後などの出血が始まるとき、または手術の前など出血が予想されるときに対象に施すことができる。別の態様において、オンデマンド治療は、コンタクトスポーツなどの出血のリスクが増加する活動の前に施すことができる。
本明細書において使用される場合、「急性出血」という用語は、根本的な原因が何であれ出血発症を指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝的な出血性疾患(例えば、第VII因子欠乏症)血小板障害、凝固因子に対する抗体の発生に起因する耐性を有し得る。
治療する、治療、治療することは、本明細書において使用される場合、例えば、疾患もしくは病態の重症度の減少、疾患経過の存続期間の減少、疾患もしくは病態に関連した1つ以上の症状の緩和、疾患もしくは病態を有する対象に対して、疾患もしくは病態を必ずしも治さずに薬効を提供すること、または疾患もしくは病態と関連した1つ以上の症状の予防を指す。一実施形態において、「治療すること」または「治療」は、本発明のキメラ分子を投与することによって、対象におけるFVIIIトラフベルを少なくとも約1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL、または20IU/dLに維持することを意味する。別の実施形態において、治療することまたは治療は、FVIIIトラフレベルを約1~約20IU/dL、約2~約20IU/dL、約3~約20IU/dL、約4~約20IU/dL、約5~約20IU/dL、約6~約20IU/dL、約7~約20IU/dL、約8~約20IU/dL、約9~約20IU/dL、または約10~約20IU/dLに維持することを意味する。疾患または病態の治療またはそれを治療することはまた、対象におけるFVIII活性を、非血友病対象におけるFVIII活性の少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、または20%に匹敵するレベルに維持することも含む。治療に必要とされる最小トラフレベルは、1つ以上の公知の方法によって測定することができ、各人のために調整(増加または減少)することができる。
II. キメラ分子
本発明のキメラ分子は、VWFタンパク質またはFVIIIタンパク質が融合される別の部分からのVWFタンパク質またはFVIIIタンパク質の放出を改善するために設計される。本発明は、損傷の部位で迅速かつ効果的に切断することができるトロンビン切断可能リンカーを提供する。本発明の一態様において、キメラ分子は、フォンヴィレブラン
ド因子(VWF)タンパク質、異種部分(H1)、XTEN配列、及びVWFタンパク質を異種部分と接続するVWFリンカーを含むことができ、該VWFリンカーは、(i)第VIII因子(FVIII)からのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含み、該XTEN配列は、VWFタンパク質、異種部分(H1)、VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される。本発明の別の態様において、キメラ分子は、VWFタンパク質、異種部分(H1)、及びVWFタンパク質と異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含む第1のポリペプチド鎖と、FVIIIタンパク質及びXTEN配列を含む第2のポリペプチド鎖とを含むことができ、第1のポリペプチド鎖内のVWFリンカーは、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は互いに会合する。
本発明のキメラ分子は、VWFタンパク質またはFVIIIタンパク質が融合される別の部分からのVWFタンパク質またはFVIIIタンパク質の放出を改善するために設計される。本発明は、損傷の部位で迅速かつ効果的に切断することができるトロンビン切断可能リンカーを提供する。本発明の一態様において、キメラ分子は、フォンヴィレブラン
ド因子(VWF)タンパク質、異種部分(H1)、XTEN配列、及びVWFタンパク質を異種部分と接続するVWFリンカーを含むことができ、該VWFリンカーは、(i)第VIII因子(FVIII)からのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含み、該XTEN配列は、VWFタンパク質、異種部分(H1)、VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される。本発明の別の態様において、キメラ分子は、VWFタンパク質、異種部分(H1)、及びVWFタンパク質と異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含む第1のポリペプチド鎖と、FVIIIタンパク質及びXTEN配列を含む第2のポリペプチド鎖とを含むことができ、第1のポリペプチド鎖内のVWFリンカーは、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は互いに会合する。
本発明の他の実施形態において、キメラ分子は、FVIIIリンカーを介して異種部分に融合されるFVIIIタンパク質を含むポリペプチド鎖を含み、該FVIIIリンカーは、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含む。
II.A. VWF、XTEN、VWFリンカーを有するキメラ分子
本発明は、VWFリンカーを介してXTEN配列に融合されるVWFタンパク質を含むキメラ分子を提供し、該VWFリンカーは、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含む。
本発明は、VWFリンカーを介してXTEN配列に融合されるVWFタンパク質を含むキメラ分子を提供し、該VWFリンカーは、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含む。
一実施形態において、キメラ分子は、VWFタンパク質、異種部分(H1)、XTEN配列、及びVWFタンパク質を異種部分と接続するVWFリンカーを含み、該XTEN配列は、VWFタンパク質とVWFリンカーとの間に位置し、該VWFリンカーは、(i)第VIII因子(FVIII)からのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含む。別の実施形態において、キメラ分子は、VWFタンパク質、異種部分(H1)、XTEN配列、及びVWFタンパク質を異種部分と接続するVWFリンカーを含み、該XTEN配列は、VWFリンカーと異種部分との間に位置し、該VWFリンカーは、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含む。
他の実施形態において、本キメラ分子は、FVIIIタンパク質を含むポリペプチド鎖をさらに含み、VWFタンパク質を含む第1の鎖とFVIIIタンパク質を含む第2の鎖とが互いに会合する。一例において、会合は共有結合、例えば、ジスルフィド結合、会合
であり得る。依然として他の実施形態において、FVIIIタンパク質を含むポリペプチド鎖は、追加のXTEN配列をさらに含む。追加のXTEN配列は、FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に結合され得るか、または互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され得る。さらに他の実施形態において、FVIIIタンパク質を含む鎖は、第2の異種部分(H2)をさらに含む。いくつかの実施形態において、FVIIIタンパク質は、FVIIIリンカーを介して第2の異種部分に融合される。ある特定の実施形態において、FVIIIリンカーは、VWFタンパク質と異種部分とを接続するVWFリンカーと同一である。他の実施形態において、FVIIIリンカーは、VWFタンパク質と異種部分とを接続するVWFリンカーと異なる。
であり得る。依然として他の実施形態において、FVIIIタンパク質を含むポリペプチド鎖は、追加のXTEN配列をさらに含む。追加のXTEN配列は、FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に結合され得るか、または互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され得る。さらに他の実施形態において、FVIIIタンパク質を含む鎖は、第2の異種部分(H2)をさらに含む。いくつかの実施形態において、FVIIIタンパク質は、FVIIIリンカーを介して第2の異種部分に融合される。ある特定の実施形態において、FVIIIリンカーは、VWFタンパク質と異種部分とを接続するVWFリンカーと同一である。他の実施形態において、FVIIIリンカーは、VWFタンパク質と異種部分とを接続するVWFリンカーと異なる。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、(i)V-L1-X1-H1:H2-L2-X2-C、(ii)V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C、(iii)V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C、(iv)V-X1-L1-H1:H2-X2-L2-C、(v)V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2)、(vi)V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2)、(vii)C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V、(viii)C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V、(ix)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(x)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(xi)C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V、または(xii)C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-Vから選択される式を含み、式中、VはVWFタンパク質であり、L1はVWFリンカーであり、L2は任意のFVIIIリンカーであり、H1は第1の異種部分であり、H2は第2の異種部分であり、X1はXTEN配列であり、X2は任意のXTEN配列であり、CはFVIIIタンパク質であり、C(X2)はXTEN配列に融合されるFVIIIタンパク質であり、該XTEN配列は互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され、(-)はペプチド結合または1個以上のアミノ酸であり、(:)はH1とH2との間の共有結合である。
いくつかの実施形態において、キメラ分子内のFVIIIタンパク質は、XTEN配列であり得る第3の異種部分(H3)を含む。他の実施形態において、キメラ分子内のFVIIIタンパク質は、XTEN配列であり得る第4の異種部分(H4)を含む。依然として他の実施形態において、キメラ分子内のFVIIIタンパク質は、XTEN配列であり得る第5の異種部分(H5)を含む。さらに他の実施形態において、キメラ分子内のFVIIIタンパク質は、XTEN配列であり得る第6の異種部分(H6)を含む。ある特定の実施形態において、第3の異種部分(H3)、第4の異種部分(H4)、第5の異種部分(H5)、及び第6の異種部分(H6)のうちの1つ以上は、キメラ分子の半減期を延長することが可能である。いくつかの実施形態において、第3の異種部分(H3)、第4の異種部分(H4)、第5の異種部分(H5)、及び第6の異種部分(H6)は、FVIIIのC末端もしくはN末端に結合されるか、またはFVIIIタンパク質の2個のアミノ酸の間に挿入される。
II.B. FVIII、XTEN、VWFタンパク質、VWFリンカーを有するキメラ分子
本発明はまた、VWFタンパク質、異種部分(H1)、及びVWFタンパク質と異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含む第1のポリペプチド鎖と、FVIIIタンパク質及びXTEN配列を含む第2のポリペプチド鎖とを含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド鎖内のVWFリンカーが、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖が互いに会合する、キメラ分子も提供する。一実施形態において、XTEN配列は、FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に接続さ
れるか、または互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入される。別の実施形態において、本キメラ分子は、VWFタンパク質、異種部分、VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される追加のXTEN配列をさらに含む。他の実施形態において、本キメラ分子は第2の異種部分(H2)をさらに含む。他の実施形態において、キメラ分子の第2の異種部分は、FVIIIタンパク質、XTEN配列、または双方に接続される。依然として他の実施形態において、第2の異種部分は、FVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質またはXTEN配列に接続される。さらに他の実施形態において、FVIIIリンカーはVWFリンカーと同一である。いくつかの実施形態において、FVIIIリンカーはVWFリンカーと異なる。
本発明はまた、VWFタンパク質、異種部分(H1)、及びVWFタンパク質と異種部分(H1)とを接続するVWFリンカーを含む第1のポリペプチド鎖と、FVIIIタンパク質及びXTEN配列を含む第2のポリペプチド鎖とを含むキメラ分子であって、第1のポリペプチド鎖内のVWFリンカーが、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖が互いに会合する、キメラ分子も提供する。一実施形態において、XTEN配列は、FVIIIタンパク質のN末端もしくはC末端に接続さ
れるか、または互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入される。別の実施形態において、本キメラ分子は、VWFタンパク質、異種部分、VWFリンカー、またはそれらの任意の組み合わせに接続される追加のXTEN配列をさらに含む。他の実施形態において、本キメラ分子は第2の異種部分(H2)をさらに含む。他の実施形態において、キメラ分子の第2の異種部分は、FVIIIタンパク質、XTEN配列、または双方に接続される。依然として他の実施形態において、第2の異種部分は、FVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質またはXTEN配列に接続される。さらに他の実施形態において、FVIIIリンカーはVWFリンカーと同一である。いくつかの実施形態において、FVIIIリンカーはVWFリンカーと異なる。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、(i)V-L1-X1-H1:H2-L2-X2-C、(ii)V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C、(iii)V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C、(iv)V-X1-L1-H1:H2-X2-L2-C、(v)V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2)、(vi)V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2)、(vii)C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V、(viii)C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V、(ix)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(x)C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V、(xi)C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V、または(xii)C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-Vから選択される式を含み、式中、VはVWFタンパク質であり、L1はVWFリンカーであり、L2は任意のFVIIIリンカーであり、H1は第1の異種部分であり、H2は第2の異種部分であり、X1は任意のXTEN配列であり、X2はXTEN配列であり、CはFVIIIタンパク質であり、C(X2)はXTEN配列に融合されるFVIIIタンパク質であり、該XTEN配列は互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され、(-)はペプチド結合または1個以上のアミノ酸であり、(:)はH1とH2との間の共有結合である。一実施形態において、VWFリンカー及びFVIIIリンカーは同じであり得る。別の実施形態において、VWFリンカー及びFVIIIリンカーは異なる。
ある特定の実施形態において、キメラ分子のFVIIIタンパク質は、XTEN配列であり得る第3の異種部分(H3)を含む。他の実施形態において、キメラ分子のFVIIIタンパク質は、XTEN配列である第4の異種部分(H4)を含む。依然として他の実施形態において、キメラ分子のFVIIIタンパク質は、XTEN配列であり得る第5の異種部分(H5)を含むさらに他の実施形態において、キメラ分子内のFVIIIタンパク質は、XTEN配列であり得る第6の異種部分(H6)を含む。ある特定の実施形態において、第3の異種部分(H3)、第4の異種部分(H4)、第5の異種部分(H5)、及び第6の異種部分(H6)のうちの1つ以上は、キメラ分子の半減期を延長することが可能である。いくつかの実施形態において、第3の異種部分(H3)、第4の異種部分(H4)、第5の異種部分(H5)、及び/または第6の異種部分(H6)は、FVIIIのC末端もしくはN末端に結合されるか、またはFVIIIタンパク質の2個のアミノ酸の間に挿入される。
II.C. FVIII、XTEN、及びFVIIIリンカーを有するキメラ分子
本発明のキメラ分子は、FVIIIタンパク質、XTEN配列、及び(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含むFVIIIリンカーによって融合される異種部分を含むことができる。ある特定の実施形態において、キメラ分子は、2つのポリペプチド鎖、FVIIIリンカーを介して第1のFc領域に融合されるFVIIIタンパク質を含む第1の鎖と、Fc領域に融合されるVWFタンパク質(例えば、VWFのD’ドメイン及びD3ドメイン)を
含む第2の鎖とを含み、第1のポリペプチド鎖内のFVIIIリンカーは、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は互いに会合し、XTEN配列は、第1のポリペプチド(例えば、FVIIIタンパク質、リンカー、もしくは第1のFc領域のN末端もしくはC末端、またはFVIIIタンパク質内)、第2のポリペプチド(例えば、VWFタンパク質もしくはFc領域のN末端もしくはC末端、またはFVIIIタンパク質内)、または双方に結合される。特定の実施形態において、第1のポリペプチド鎖内のリンカーは、FVIIIからのa2領域を含む。
本発明のキメラ分子は、FVIIIタンパク質、XTEN配列、及び(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含むFVIIIリンカーによって融合される異種部分を含むことができる。ある特定の実施形態において、キメラ分子は、2つのポリペプチド鎖、FVIIIリンカーを介して第1のFc領域に融合されるFVIIIタンパク質を含む第1の鎖と、Fc領域に融合されるVWFタンパク質(例えば、VWFのD’ドメイン及びD3ドメイン)を
含む第2の鎖とを含み、第1のポリペプチド鎖内のFVIIIリンカーは、(i)FVIIIからのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位、または(v)それらの任意の組み合わせを含み、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は互いに会合し、XTEN配列は、第1のポリペプチド(例えば、FVIIIタンパク質、リンカー、もしくは第1のFc領域のN末端もしくはC末端、またはFVIIIタンパク質内)、第2のポリペプチド(例えば、VWFタンパク質もしくはFc領域のN末端もしくはC末端、またはFVIIIタンパク質内)、または双方に結合される。特定の実施形態において、第1のポリペプチド鎖内のリンカーは、FVIIIからのa2領域を含む。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、(i)V-L2-X2-H2:H1-L1-X1-C、(ii)V-X2-L2-H2:H1-L1-X1-C、(iii)V-L2-X2-H2:H1-X1-L1-C、(iv)V-X2-L2-H2:H1-X1-L1-C、(v)V-L2-X2-H2:H1-L1-C(X1)、(vi)V-X2-L2-H2:H1-L1-C(X1)、(vii)C-X1-L1-H1:H2-X2-L2-V、(viii)C-X1-L1-H1:H2-L2-X2-V、(ix)C-L1-X1-H1:H2-L2-X2-V、(x)C-L1-X1-H1:H2-L2-X2-V、(xi)C(X1)-L1-H1:H2-X2-L2-V、または(xii)C(X1)-L1-H1:H2-L2-X2-Vから選択される式を含み、式中、VはVWFタンパク質であり、L1はFVIIIリンカーであり、L2は任意のVWFリンカーであり、H1は第1の異種部分であり、H2は第2の異種部分であり、X1は任意のXTEN配列であり、X2は任意のXTEN配列であり、CはFVIIIタンパク質であり、C(X1)はXTEN配列に融合されるFVIIIタンパク質であり、該XTEN配列は互いに隣接する2個のFVIIIアミノ酸の間に挿入され、(-)はペプチド結合または1個以上のアミノ酸であり、(:)はH1とH2との間の共有結合であり、少なくとも1つのXTEN配列がキメラ分子内に存在する。一実施形態において、VWFリンカー及びFVIIIリンカーは同じである。別の実施形態において、VWFリンカー及びFVIIIリンカーは異なる。
II.D. キメラ分子の構成要素
II.C.1. VWFリンカーまたはFVIIIリンカー
本発明のキメラ分子に有用なVWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、VWFタンパク質を異種部分と、またはFVIIIタンパク質を異種部分と融合するトロンビン切断可能リンカーである。一実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、FVIIIのa1領域を含む。別の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、FVIIIのa2領域を含む。他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、FVIIIのa3領域を含む。さらに他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位を含む。
II.C.1. VWFリンカーまたはFVIIIリンカー
本発明のキメラ分子に有用なVWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、VWFタンパク質を異種部分と、またはFVIIIタンパク質を異種部分と融合するトロンビン切断可能リンカーである。一実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、FVIIIのa1領域を含む。別の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、FVIIIのa2領域を含む。他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、FVIIIのa3領域を含む。さらに他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸である、トロンビン切断部位を含む。
一実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、全長成熟FVIIIに相当するMet337~Arg372と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa1領域を含み、該a1領域はトロンビンによって切断されることが可能である。別の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、全長成熟FVIIIに相当するアミノ酸337~374と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa1領域を含み、該a1領域はトロンビンによって切断されることが可能である。
他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、追加のアミノ酸を、例えば、1、2、3、4、5、10個以上、さらに含む。特定の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(配列番号5)を含む。
他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、追加のアミノ酸を、例えば、1、2、3、4、5、10個以上、さらに含む。特定の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(配列番号5)を含む。
いくつかの実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、全長成熟FVIIIに相当するGlu720~Arg740と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa2領域を含み、該a2領域はトロンビンによって切断されることが可能である。他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、全長成熟FVIIIに相当するアミノ酸712~743と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa2領域を含む。依然として他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、追加のアミノ酸を、例えば、1、2、3、4、5、10個以上、さらに含む。特定の実施形態において、VWFリンカーは、ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(配列番号4)を含む。
ある特定の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、全長成熟FVIIIに相当するGlu1649~Arg1689と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa3領域を含み、該a3領域はトロンビンによって切断されることが可能である。いくつかの実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、全長成熟FVIIIに相当するアミノ酸1649~1692と少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むa3領域を含み、該a3領域はトロンビンによって切断されることが可能である。他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、追加のアミノ酸を、例えば、1、2、3、4、5、10個以上、さらに含む。特定の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ(配列番号6)を含む。
他の実施形態において、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、X-V-P-R(配列番号3)とPAR1非活性部位相互作用モチーフとを含むトロンビン切断部位を含み、該PAR1非活性部位相互作用モチーフは、S-F-L-L-R-N(配列番号7)を含む。いくつかの実施形態において、PAR1非活性部位相互作用モチーフは、P、P-N、P-N-D、P-N-D-K(配列番号8)、P-N-D-K-Y(配列番号9)、P-N-D-K-Y-E(配列番号10)、P-N-D-K-Y-E-P(配列番号11)、P-N-D-K-Y-E-P-F(配列番号12)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W(配列番号13)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(配列番号14)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(配列番号20)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(配列番号21)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E(配列番号22)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(配列番号23)、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸配列をさらに含む。他の実施形態において、X-V-P-Rを含むトロンビン切断部位の脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される。特定の実施形態において、トロンビン切断部位は、L-V-P-Rを含む。いくつかの実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部位(L-V-P-R)がVWFリンカーまたはFVIIIリンカーとそれぞれ置換された(すなわち、PAR1非活性部位相互作用モチーフなしの)場合にトロンビンがトロンビン切断部位(例えば、L-V-P-R)を切断するよりも速く、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーを切断する
。いくつかの実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部位(例えば、L-V-P-R)がVWFリンカーまたはFVIIIリンカーと置換された場合にトロンビンがトロンビン切断部位(例えば、L-V-P-R)を切断するよりも、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍速く、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーを切断する。
。いくつかの実施形態において、トロンビンは、トロンビン切断部位(例えば、L-V-P-R)がVWFリンカーまたはFVIIIリンカーと置換された場合にトロンビンがトロンビン切断部位(例えば、L-V-P-R)を切断するよりも、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍速く、VWFリンカーまたはFVIIIリンカーを切断する。
いくつかの実施形態において、(i)a1領域、(ii)a2領域、(iii)a3領域、または(iv)トロンビン切断部位X-V-P-R及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含むVWFリンカーまたはFVIIIリンカーは、少なくとも約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、または2000アミノ酸の長さを有する1個以上のアミノ酸をさらに含む。一実施形態において、1個以上のアミノ酸は、glyペプチドを含む。別の実施形態において、1個以上のアミノ酸は、GlyGlyを含む。他の実施形態において、1個以上のアミノ酸は、IleSerを含む。依然として他の実施形態において、1個以上のアミノ酸は、gly/serペプチドを含む。さらに他の実施形態において、1個以上のアミノ酸は、(Gly4Ser)nまたはS(Gly4Ser)nの式を有するgly/serペプチドを含み、式中、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、または100から選択される正整数である。いくつかの実施形態において、1個以上のアミノ酸は、(Gly4Ser)3(配列番号89)または(Gly4Ser)4(配列番号90)を含む。
II.C.2. VWFタンパク質
VWF(F8VWFとしても知られる)は、血漿内に存在する大きな多量体の糖タンパク質であり、内皮細胞(バイベルパラーデ小体内)、巨核球(血小板のα顆粒)、及び内皮下結合組織内で構成的に産生される。基本的なVWF単量体は、2813アミノ酸タンパク質である。すべての単量体は、特定の機能を有する数多くの特定のドメイン、D’/D3ドメイン(第VIII因子に結合する)、A1ドメイン(血小板GPIb受容体、ヘパリン、及び/または恐らくはコラーゲンに結合)、A3ドメイン(コラーゲンに結合)、C1ドメイン(RGDドメインが、血小板インテグリンαIIbβ3に、これが活性化されるときに結合する)、及びタンパク質のC末端の端に「システインノット」ドメイン(VWFは、血小板誘導成長因子(PDGF)、形質転換成長因子-β(TGFβ)、及びβ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン(βHCG)と共有する)を含む。
VWF(F8VWFとしても知られる)は、血漿内に存在する大きな多量体の糖タンパク質であり、内皮細胞(バイベルパラーデ小体内)、巨核球(血小板のα顆粒)、及び内皮下結合組織内で構成的に産生される。基本的なVWF単量体は、2813アミノ酸タンパク質である。すべての単量体は、特定の機能を有する数多くの特定のドメイン、D’/D3ドメイン(第VIII因子に結合する)、A1ドメイン(血小板GPIb受容体、ヘパリン、及び/または恐らくはコラーゲンに結合)、A3ドメイン(コラーゲンに結合)、C1ドメイン(RGDドメインが、血小板インテグリンαIIbβ3に、これが活性化されるときに結合する)、及びタンパク質のC末端の端に「システインノット」ドメイン(VWFは、血小板誘導成長因子(PDGF)、形質転換成長因子-β(TGFβ)、及びβ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン(βHCG)と共有する)を含む。
「VWFタンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、内因性VWFのFVIIIへの結合を抑制することが可能である、D’ドメイン及びD3ドメインを含む全長VWFタンパク質または機能VWF断片を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、VWFタンパク質は、FVIIIに結合する。別の実施形態において、VWFタンパク質は、FVIII上のVWF結合部位を遮断し、それによってFVIIIの内因性VWFとの相互作用を抑制する。他の実施形態において、VWFタンパク質は、VWFクリアランス経路によって取り除かれない。VWFタンパク質は、VWFのこれらの活性を保持する誘導体、変異体、突然変異体、または類似体を含む。
ヒトVWFのための2813単量体アミノ酸配列は、Genbank内の受託番号_NP_000543.2__として報告される。ヒトVWFをコードするヌクレオチド配列
は、Genbank内の受託番号__NM_000552.3_として報告される。ヒトVWFのヌクレオチド配列は、配列番号1として指定される。配列番号2は、配列番号1によってコードされるアミノ酸配列である。VWFの各ドメインを表1に記載する。
は、Genbank内の受託番号__NM_000552.3_として報告される。ヒトVWFのヌクレオチド配列は、配列番号1として指定される。配列番号2は、配列番号1によってコードされるアミノ酸配列である。VWFの各ドメインを表1に記載する。
VWFタンパク質は、本明細書において使用される場合、VWFのD’ドメイン及びD3ドメインを含むことができ、VWFタンパク質は、FVIIIに結合し、内因性VWF(全長VWF)のFVIIIへの結合を抑制する。D’ドメイン及びD3ドメインを含むVWFタンパク質は、A1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D1ドメイン、D2ドメイン、D4ドメイン、B1ドメイン、B2ドメイン、B3ドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、CKドメイン、それらの1つ以上の断片、またはそれらの任意の組み合わ
せから選択されるVWFドメインをさらに含むことができる。一実施形態において、VWFタンパク質は、(1)VWFのD’及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(2)VWFのD1、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(3)VWFのD2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(4)VWFのD1、D2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、または(5)VWFのD1、D2、D’、D3、もしくはA1ドメイン、もしくはそれらの断片、を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。本明細書内に記載されるVWFタンパク質は、VWFクリアランス受容体結合部位を含有しない。本発明のVWFタンパク質は、VWFタンパク質に結合される、または融合される任意の他の配列を含むことができる。例えば、本明細書内に記載されるVWFタンパク質は、シグナルペプチドをさらに含むことができる。
せから選択されるVWFドメインをさらに含むことができる。一実施形態において、VWFタンパク質は、(1)VWFのD’及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(2)VWFのD1、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(3)VWFのD2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、(4)VWFのD1、D2、D’、及びD3ドメイン、もしくはそれらの断片、または(5)VWFのD1、D2、D’、D3、もしくはA1ドメイン、もしくはそれらの断片、を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。本明細書内に記載されるVWFタンパク質は、VWFクリアランス受容体結合部位を含有しない。本発明のVWFタンパク質は、VWFタンパク質に結合される、または融合される任意の他の配列を含むことができる。例えば、本明細書内に記載されるVWFタンパク質は、シグナルペプチドをさらに含むことができる。
一実施形態において、VWFタンパク質は、FVIIIタンパク質に結合する、またはそれと会合する。FVIIIタンパク質に結合する、またはそれと会合することによって、本発明のVWFタンパク質は、FVIIIをプロテアーゼ切断及びFVIII活性化から保護し、FVIIIの重鎖及び軽鎖を安定化し、スカベンジャー受容体によるFVIIIのクリアランスを防止することができる。別の実施形態において、VWFタンパク質はFVIIIタンパク質に結合し、またはそれと会合し、FVIIIタンパク質のリン脂質及び活性化タンパク質Cへの結合を遮断する、または防止する。FVIIIタンパク質の内因性全長VWFとの結合を防止することまたは抑制することによって、本発明のVWFタンパク質は、内因性VWFクリアランス受容体によるFVIIIのクリアランスを減少させ、そのため、FVIIIタンパク質の半減期を延長する。したがって、FVIIIタンパク質の半減期延長は、VWFクリアランス受容体結合部位を欠き、それによって、VWFクリアランス受容体結合部位を含有する内因性VWFからFVIIIタンパク質を守る及び/または保護するVWFタンパク質とのFVIIIタンパク質の会合が原因である。VWFタンパク質に結合されるまたはそれによって保護されるFVIIIタンパク質はまた、FVIIIタンパク質のリサイクルも可能にする。全長VWF分子内のVWFクリアランス経路受容体結合部位を排除することにより、本発明のFVIII/VWFヘテロ二量体は、VWFクリアランス経路から守られ、FVIII半減期をさらに延長する。
一実施形態において、本発明のVWFタンパク質は、VWFのD’ドメイン及びD3ドメインを含み、該D’ドメインは、配列番号2のアミノ酸764~866と少なくとも約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であり、該VWFタンパク質は、内因性VWFのFVIIIへの結合を防止する。別の実施形態において、VWFタンパク質は、VWFのD’ドメイン及びD3ドメインを含み、該D3ドメインは、配列番号2のアミノ酸867~1240と少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であり、該VWFタンパク質は、内因性VWFのFVIIIへの結合を防止する。いくつかの実施形態において、本明細書内に記載されるVWFタンパク質は、配列番号2のアミノ酸764~1240と少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である、VWFのD’ドメイン及びD3ドメインを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなり、該VWFタンパク質は内因性VWFのFVIIIへの結合を防止する。他の実施形態において、VWFタンパク質は、配列番号2のアミノ酸23~1240と少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるD1、D2、D’及びD3ドメインを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなり、該VWFタンパク質は内因性VWFのFVIIIへの結合を防止する。依然として他の実施形態において、VWFタンパク質は、それらに作動可能に結合されるシグナルペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明のVWFタンパク質は、(1)D’D3ドメイン
、D1D’D3ドメイン、D2D’D3ドメイン、またはD1D2D’D3ドメイン、及び(2)最大約10アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1250までの任意の配列)、最大約15アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1255までの任意の配列)、最大約20アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1260までの任意の配列)、最大約25アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1265までの任意の配列)、または最大約30アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1260までの任意の配列)の追加のVWF配列を含む、それらから本質的になる、もしくはそれらからなる。特定の実施形態において、D’ドメイン及びD3ドメインを含む、またはそれらから本質的になるVWFタンパク質は、配列番号2のアミノ酸764~1274でも、全長成熟VWFでもない。いくつかの実施形態において、D1D2ドメインは、D’D3ドメインとトランスに発現される。いくつかの実施形態において、D1D2ドメインは、D’D3ドメインとシスに発現される。
、D1D’D3ドメイン、D2D’D3ドメイン、またはD1D2D’D3ドメイン、及び(2)最大約10アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1250までの任意の配列)、最大約15アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1255までの任意の配列)、最大約20アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1260までの任意の配列)、最大約25アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1265までの任意の配列)、または最大約30アミノ酸(例えば、配列番号2のアミノ酸764~1240から配列番号2のアミノ酸764~1260までの任意の配列)の追加のVWF配列を含む、それらから本質的になる、もしくはそれらからなる。特定の実施形態において、D’ドメイン及びD3ドメインを含む、またはそれらから本質的になるVWFタンパク質は、配列番号2のアミノ酸764~1274でも、全長成熟VWFでもない。いくつかの実施形態において、D1D2ドメインは、D’D3ドメインとトランスに発現される。いくつかの実施形態において、D1D2ドメインは、D’D3ドメインとシスに発現される。
他の実施形態において、D1D2ドメインに結合されるD’D3ドメインを含むVWFタンパク質は、発現時にD’D3ドメインからのD1D2ドメインの切断を可能にする細胞内プロセシング部位、例えば、(PACE(フューリン)またはPC5によるプロセシング部位)をさらに含む。細胞内プロセシング部位の非限定的な例は、本明細書の他の箇所に記載される。
さらに他の実施形態において、VWFタンパク質は、D’ドメイン及びD3ドメインを含むが、(1)配列番号2のアミノ酸1241~2813、(2)配列番号2のアミノ酸1270~アミノ酸2813、(3)配列番号2のアミノ酸1271~アミノ酸2813、(4)配列番号2のアミノ酸1272~アミノ酸2813、(5)配列番号2のアミノ酸1273~アミノ酸2813、(6)配列番号2のアミノ酸1274~アミノ酸2813、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸配列を含まない。
依然として他の実施形態において、本発明のVWFタンパク質は、D’ドメイン、D3ドメイン、及びA1ドメインに相当するアミノ酸配列を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなり、該アミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸764~1479と少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であり、該VWFタンパク質は、内因性VWFのFVIIIへの結合を防止する。特定の実施形態において、VWFタンパク質は、配列番号2のアミノ酸764~1274ではない。
いくつかの実施形態において、本発明のVWFタンパク質は、D’ドメイン及びD3ドメインを含むが、(1)A1ドメイン、(2)A2ドメイン、(3)A3ドメイン、(4)D4ドメイン、(5)B1ドメイン、(6)B2ドメイン、(7)B3ドメイン、(8)C1ドメイン、(9)C2ドメイン、(10)CKドメイン、(11)CKドメイン及びC2ドメイン、(12)CKドメイン、C2ドメイン、及びC1ドメイン、(13)CKドメイン、C2ドメイン、C1ドメイン、B3ドメイン、(14)CKドメイン、C2ドメイン、C1ドメイン、B3ドメイン、B2ドメイン、(15)CKドメイン、C2ドメイン、C1ドメイン、B3ドメイン、B2ドメイン、及びB1ドメイン、(16)CKドメイン、C2ドメイン、C1ドメイン、B3ドメイン、B2ドメイン、B1ドメイン、及びD4ドメイン、(17)CKドメイン、C2ドメイン、C1ドメイン、B3ドメイン、B2ドメイン、B1ドメイン、D4ドメイン、及びA3ドメイン、(18)CKドメイン、C2ドメイン、C1ドメイン、B3ドメイン、B2ドメイン、B1ドメイン、D4ドメイン、A3ドメイン、及びA2ドメイン、(19)CKドメイン、C2ドメイン、C1
ドメイン、B3ドメイン、B2ドメイン、B1ドメイン、D4ドメイン、A3ドメイン、A2ドメイン、及びA1ドメイン、または(20)それらの任意の組み合わせから選択される少なくとも1つのVWFドメインを含まない。
ドメイン、B3ドメイン、B2ドメイン、B1ドメイン、D4ドメイン、A3ドメイン、A2ドメイン、及びA1ドメイン、または(20)それらの任意の組み合わせから選択される少なくとも1つのVWFドメインを含まない。
さらに他の実施形態において、VWFタンパク質は、D’D3ドメイン、及び1つ以上のドメインまたはモジュールを含む。そのようなドメインまたはモジュールの例としては、2012年4月6日オンラインで公開のZhour et al.,Blood、DOI 10.1182/blood-2012-01-405134に開示されるドメイン及びモジュールが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、VWFタンパク質は、D’D3ドメイン、及びA1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D4Nモジュール、VWD4モジュール、C8-4モジュール、TIL-4モジュール、C1モジュール、C2モジュール、C3モジュール、C4モジュール、C5モジュール、C5モジュール、C6モジュール、またはそれらの任意の組み合わせから選択される1つ以上のドメインもしくはモジュールを含むことができる。
ある特定の実施形態において、本発明のVWFタンパク質は、多量体、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、または高次の多量体を形成する。他の実施形態において、VWFタンパク質は、1つのみのVWFタンパク質を有する単量体である。いくつかの実施形態において、本発明のVWFタンパク質は、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、または修飾を有することができる。一実施形態において、VWFタンパク質は、VWFタンパク質がジスルフィド結合を形成すること、または二量体もしくは多量体を形成することができないように、アミノ酸置換、欠失、付加、または修飾を含むことができる。別の実施形態において、アミノ酸置換は、D’ドメイン及びD3ドメイン内にある。特定の実施形態において、本発明のVWFタンパク質は、配列番号2の残基1099、残基1142、または双方の残基1099及び1142に相当する残基において、少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する。少なくとも1つのアミノ酸置換は、野生型VWF内で天然に存在しない任意のアミノ酸であり得る。例えば、アミノ酸置換は、システイン以外の任意のアミノ酸、例えば、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニン、またはヒスチジンであり得る。別の例において、アミノ酸置換は、VWFタンパク質が多量体を形成することを防止する、または抑制する1個以上のアミノ酸を有する。
いくつかの実施形態において、VWFタンパク質は、VWFのD’D3ドメインに相当する残基336(配列番号2の残基1099)におけるシステインからアラニンへのアミノ酸置換、VWFのD’D3ドメインに相当する残基379(配列番号2の残基1142)におけるシステインからアラニンへのアミノ酸置換、または双方を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書内で有用なVWFタンパク質は、FVIIIとのその相互作用を改善するため、例えば、FVIIIに対する結合親和性を改善するために、さらに修飾され得る。非限定的な例として、VWFタンパク質は、配列番号2のアミノ酸764に相当する残基においてセリン残基、及び配列番号2のアミノ酸773に相当する残基においてリジン残基を含む。残基764及び/または773は、VWFタンパク質のFVIIIに対する結合親和性に寄与することができる。他の実施形態において、本発明に有用なVWFたんぱく質は、他の修飾を有することができ、例えば、該タンパク質を、PEG化、グリコシル化、HES化、またはポリシアル酸化することができる。
II.C.3. 異種部分
VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に融合され得る異種部分は、異種ポリペプチドまたは異種非ポリペプチ
ド部分であり得る。ある特定の実施形態において、異種部分は、当該技術分野において公知の半減期延長分子であり、ポリペプチド、非ポリペプチド部分、または双方の組み合わせを含む。異種ポリペプチド部分は、FVIIIタンパク質、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、トランスフェリンもしくはその断片、PAS配列、HAP配列、誘導体もしくはその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端ペプチド(CTP)、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、非ポリペプチド結合部分は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、それそれが同じまたは異なる分子であり得る、1つ、2つ、3つ以上の異種部分が存在し得る。
VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に融合され得る異種部分は、異種ポリペプチドまたは異種非ポリペプチ
ド部分であり得る。ある特定の実施形態において、異種部分は、当該技術分野において公知の半減期延長分子であり、ポリペプチド、非ポリペプチド部分、または双方の組み合わせを含む。異種ポリペプチド部分は、FVIIIタンパク質、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、トランスフェリンもしくはその断片、PAS配列、HAP配列、誘導体もしくはその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端ペプチド(CTP)、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、非ポリペプチド結合部分は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、それそれが同じまたは異なる分子であり得る、1つ、2つ、3つ以上の異種部分が存在し得る。
II.C.3.a 免疫グロブリン定常領域またはその一部
免疫グロブリン定常領域は、CH(定常重)ドメイン(CH1、CH2等)を示すドメインで構成される。アイソタイプ(すなわち、IgG、IgM、IgA IgD、またはIgE)に応じて、定常領域は3つまたは4つのCHドメインで構成され得る。いくつかのアイソタイプ(例えば、IgG)定常領域は、ヒンジ領域も含有する。Janeway
et al.2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Yを参照。
免疫グロブリン定常領域は、CH(定常重)ドメイン(CH1、CH2等)を示すドメインで構成される。アイソタイプ(すなわち、IgG、IgM、IgA IgD、またはIgE)に応じて、定常領域は3つまたは4つのCHドメインで構成され得る。いくつかのアイソタイプ(例えば、IgG)定常領域は、ヒンジ領域も含有する。Janeway
et al.2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Yを参照。
本発明のキメラタンパク質を産生するための免疫グロブリン定常領域またはその一部は、多数の異なる供給源から得ることができる。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ヒト免疫グロブリン由来である。しかしながら、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、以下を含む別の哺乳動物種、例えば、齧歯動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)、または非ヒト霊長類(例えば、チンパンジー、マカク)種の免疫グロブリン由来であり得ることが理解される。さらには、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、IgM、IgG、IgD、IgA、及びIgEを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにIgGl、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。一実施形態において、ヒトアイソタイプIgG1が使用される。
様々な免疫グロブリン定常領域遺伝子配列(例えば、ヒト定常領域遺伝子配列)は、公的にアクセス可能な寄託物の形態で入手可能である。定常領域ドメイン配列は、特定のエフェクター機能を有して(または特定のエフェクター機能を欠いて)、または免疫原性を減少させるための特定の修飾とともに、選択され得る。抗体及び抗体コード遺伝子の多くの配列が公開されており、好適なIg定常領域配列(例えば、ヒンジ、CH2、及び/もしくはCH3配列、またはその一部)は、当該技術分野が認識する技術を使用してこれらの配列に由来され得る。前述の方法のいずれかを使用して得られる遺伝物質は、次いで、本発明のポリペプチドを得るために、改変または合成され得る。本発明の範囲は、定常領域DNA配列の対立遺伝子、変異体、及び突然変異体を包含することがさらに理解されよう。
免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応、及び目的のドメインを増幅するために選択されるプライマーを使用して、クローン作成され得る。抗体から免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列のクローンを作成するために、mRNAは、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離され、DNA、及びPCRによって増幅された抗体遺伝子に逆転写され得る。PCR増幅法は、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、同第4,800,159号、同第4,965,188号内、及び、例えば、“PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications”Innis et al.e
ds.,Academic Press,San Diego,CA(1990);Ho
et al.1989.Gene 77:51;Horton et al.1993.Methods Enzymol.217:270)内に詳細に記載される。
ds.,Academic Press,San Diego,CA(1990);Ho
et al.1989.Gene 77:51;Horton et al.1993.Methods Enzymol.217:270)内に詳細に記載される。
本明細書内で使用される免疫グロブリン定常領域は、すべてのドメイン、及びヒンジ領域、またはその一部を含むことができる。一実施形態において、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及びヒンジ領域、すなわち、Fc領域またはFcRn結合パートナーを含む。
本明細書において使用される場合、「Fc領域」という用語は、天然の免疫グロブリンのFc領域に相当するポリペプチドの部分として、すなわち、二量体のその2つの重鎖のそれぞれのFcドメインの会合によって形成されると、定義される。天然のFc領域は、別のFc領域とホモ二量体を形成する。
一実施形態において、「Fc領域」は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域(すなわち、重鎖定常領域の第1の残基を114であると考え、IgG内の残基216)で始まり、抗体のC末端で終わる、単一の免疫グロブリン重鎖の部分を指す。したがって、完全なFcドメインは、少なくともヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む。
免疫グロブリン定常領域のFc領域は、免疫グロブリンアイソタイプに応じて、CH2、CH3、及びCH4ドメイン、ならびにヒンジ領域を含むことができる。免疫グロブリンのFc領域を含むキメラタンパク質は、増大された安定性、増大された血清半減期(Capon et al.,1989,Nature 337:525を参照)、ならびに新生児Fc受容体(FcRn)(米国特許第6,086,875号、同第6,485,726号、同第6,030,613号、WO03/077834、US2003-0235536A1)などのFc受容体への結合を含む、いくつかの望ましい特性をキメラタンパク質に授け、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
免疫グロブリン定常領域またはその一部は、FcRn結合パートナーであり得る。FcRnは、成人の上皮組織内で活性であり、腸の内腔、肺気道、鼻腔面、膣表面、結腸、及び直腸の表面に発現される(米国特許第6,485,726号)。FcRn結合パートナーは、FcRnに結合する免疫グロブリンの一部である。
FcRn受容体は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒトFcRn、サルFcRn、ラットFcRn、及びマウスFcRnの配列は公知である(Story et al.1994,J.Exp.Med.180:2377)。FcRn受容体は、IgGに比較的低いpHで結合し(しかし、IgA、IgM、IgD、及びIgEなどの他の免疫グロブリンクラスには結合しない)、経細胞的にIgGを管腔から漿膜方向に活発に輸送し、次いで、間質液で見られる比較的高いpHでIgGを放出する。それは、肺及び腸上皮(Israel et al.1997,Immunology 92:69)腎近位尿細管上皮(Kobayashi et al.2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282:F358)、ならびに鼻上皮、膣表面、及び胆管表面を含む、成人の上皮組織(米国特許第6,485,726号、同第6,030,613号、同第6,086,875号、WO03/077834、US2003-0235536A1)内に発現される。
本発明において有用なFcRn結合パートナーは、IgG全体、IgGのFc断片、及びFcRn受容体の完全な結合領域を含む他の断片を含むFcRn受容体によって特異的に結合され得る分子を包含する。FcRn受容体に結合するIgGのFc部分の領域は、
X線結晶解析に基づいて説明されている(Burmeister et al.1994,Nature 372:379)。FcのFcRnとの主要な接触面は、CH2及びCH3ドメインの接合付近である。Fc-FcRn接触は、すべて単一Ig重鎖内にある。FcRn結合パートナーは、IgG全体、IgGのFc断片、及びFcRnの完全な結合領域を含むIgGの他の断片を含む。主要な接触面は、CH2ドメインのアミノ酸残基248、250~257、272、285、288、290~291、308~311、及び314、ならびにCH3ドメインのアミノ酸残基385~387、428、及び433~436を含む。免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片もしくは領域のアミノ酸番号付けに対する言及はすべて、Kabat et al.1991,Sequences
of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Mdに基づく。
X線結晶解析に基づいて説明されている(Burmeister et al.1994,Nature 372:379)。FcのFcRnとの主要な接触面は、CH2及びCH3ドメインの接合付近である。Fc-FcRn接触は、すべて単一Ig重鎖内にある。FcRn結合パートナーは、IgG全体、IgGのFc断片、及びFcRnの完全な結合領域を含むIgGの他の断片を含む。主要な接触面は、CH2ドメインのアミノ酸残基248、250~257、272、285、288、290~291、308~311、及び314、ならびにCH3ドメインのアミノ酸残基385~387、428、及び433~436を含む。免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片もしくは領域のアミノ酸番号付けに対する言及はすべて、Kabat et al.1991,Sequences
of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Mdに基づく。
FcRnに結合されるFc領域またはFcRn結合パートナーは、FcRnによって上皮性関門を効果的に往復輸送され得、このため、所望の治療上の分子を全身的に投与するための非侵襲的手段を提供する。さらに、Fc領域またはFcRn結合パートナーを含む融合タンパク質は、FcRnを発現する細胞によって形質膜陥入される。しかし、分解のためにマークされる代わりに、これらの融合タンパク質は、再び循環へ再利用され、このため、これらのタンパク質のインビボ半減期は増加する。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン定常領域の一部は、典型的には、ジスルフィド結合及び他の非特異性相互作用を介して、別のFc領域または別のFcRn結合パートナーと会合し、二量体及び高次の多量体を形成するFc領域またはFcRn結合パートナーである。
FcRn結合パートナー領域は、FcRn受容体によって特異的に結合され、結果としてFc領域のFcRn受容体による活発な輸送を伴う分子またはその一部である。特異的に結合されるとは、2つの分子が生理学的条件下で比較的安定した複合体を形成することを指す。特異的結合は、低~中程度の能力とともに通常低い親和性を有する非特異的結合と区別して、高い親和性及び低~中程度の能力を特徴とする。典型的には、結合は、親和定数KAが106M-1より高いとき、または108M-1より高いとき、特異的と考えられる。必要であれば、非特異的結合を、結合条件を変化させることによって、特異的結合に実質的に影響を与えることなく減少させることができる。分子の濃度、溶液のイオンの強度、温度、結合に許される時間、遮断剤(例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン)の濃度等などの適切な結合条件は、通例の技術を使用して当業者によって最適化され得る。
無数の突然変異体、断片、変異体、及び誘導体が、例えば、PCT公開番号WO2011/069164 A2、WO2012/006623 A2、WO2012/006635 A2、またはWO2012/006633 A2内に記載されており、そのすべては参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
II.C.3.b. アルブミン、またはその断片もしくは変異体
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に結合される、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、アルブミンまたはその機能的断片である。いくつかの実施形態において、VWFタンパク質に融合されるアルブミンは、FVIIIタンパク質に融合されるアルブミンと共有結合的に会合する。
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に結合される、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、アルブミンまたはその機能的断片である。いくつかの実施形態において、VWFタンパク質に融合されるアルブミンは、FVIIIタンパク質に融合されるアルブミンと共有結合的に会合する。
全長形態において609アミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン(HSA、またはHA)は、血清の浸透圧のかなりの割合の要因であり、内因性及び外因性リガンドの担体としても機能する。「アルブミン」という用語は、本明細書において使用される場合
、全長アルブミン、またはその機能的断片、変異体、誘導体、もしくは類似体を含む。アルブミンまたは、その断片もしくは変異体の例は、米国特許出願公開第2008/0194481A1号、同第2008/0004206 A1号、同第2008/0161243 A1号、同第2008/0261877 A1号、もしくは同第2008/0153751 A1号、またはPCT国際出願公開第2008/033413 A2号、同第2009/058322 A1号、もしくは同第2007/021494 A2号内に開示され、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
、全長アルブミン、またはその機能的断片、変異体、誘導体、もしくは類似体を含む。アルブミンまたは、その断片もしくは変異体の例は、米国特許出願公開第2008/0194481A1号、同第2008/0004206 A1号、同第2008/0161243 A1号、同第2008/0261877 A1号、もしくは同第2008/0153751 A1号、またはPCT国際出願公開第2008/033413 A2号、同第2009/058322 A1号、もしくは同第2007/021494 A2号内に開示され、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
II.C.3.c. アルブミン結合部分
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、アルブミン結合部分であり、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例えば、アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体、またはドメイン抗体を含む抗体断片であり得る(米国特許第6,696,245号を参照)。アルブミン結合タンパク質は、例えば、連鎖球菌タンパク質Gのうちの1つなどの細菌アルブミン結合ドメインであり得る(Konig,T.and Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。共役パートナーとして使用され得るアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cysコンセンサス配列を有するものであり、米国特許出願第2003/0069395号、またはDennis et al.(Dennis et al.(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043)に記載されるように、Xaa1は、Asp、Asn、Ser、Thr、またはTrpであり、Xaa2は、Asn、Gln、H is、Ile、Leu、またはLysであり、Xaa3は、Ala、Asp、Phe、Trp、またはTyrであり、及びXaa4は、Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、またはThrである。
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、アルブミン結合部分であり、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例えば、アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体、またはドメイン抗体を含む抗体断片であり得る(米国特許第6,696,245号を参照)。アルブミン結合タンパク質は、例えば、連鎖球菌タンパク質Gのうちの1つなどの細菌アルブミン結合ドメインであり得る(Konig,T.and Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。共役パートナーとして使用され得るアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cysコンセンサス配列を有するものであり、米国特許出願第2003/0069395号、またはDennis et al.(Dennis et al.(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043)に記載されるように、Xaa1は、Asp、Asn、Ser、Thr、またはTrpであり、Xaa2は、Asn、Gln、H is、Ile、Leu、またはLysであり、Xaa3は、Ala、Asp、Phe、Trp、またはTyrであり、及びXaa4は、Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、またはThrである。
II.C.3.d. PAS配列
他の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、PAS配列である。一実施形態において、キメラ分子は、VWFリンカーを介してPAS配列に融合される、本明細書内に記載されるVWFタンパク質を含む。別の実施形態において、本発明のキメラ分子は、VWFリンカーを介してPAS配列に融合されるVWFタンパク質を含む第1の鎖と、FVIIIタンパク質及び追加の任意のPAS配列を含む第2の鎖とを含み、該PAS配列は、FVIIIタンパク質上のVWF結合部位を守る、または保護し、それによって、FVIIIタンパク質の内因性VWFとの相互作用を抑制または防止する。2つのPAS配列は、互いに共有結合的に会合し得る。
他の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、PAS配列である。一実施形態において、キメラ分子は、VWFリンカーを介してPAS配列に融合される、本明細書内に記載されるVWFタンパク質を含む。別の実施形態において、本発明のキメラ分子は、VWFリンカーを介してPAS配列に融合されるVWFタンパク質を含む第1の鎖と、FVIIIタンパク質及び追加の任意のPAS配列を含む第2の鎖とを含み、該PAS配列は、FVIIIタンパク質上のVWF結合部位を守る、または保護し、それによって、FVIIIタンパク質の内因性VWFとの相互作用を抑制または防止する。2つのPAS配列は、互いに共有結合的に会合し得る。
PAS配列は、本明細書において使用される場合、主にアラニン及びセリン残基を含むか、または主にアラニン、セリン、及びプロリン残基を含むアミノ酸配列を意味し、該アミノ酸配列は、生理学的条件下でランダイムコイル構造を形成する。したがって、PAS配列は、キメラタンパク質内の異種部分の一部として使用され得るアラニン、セリン、及びプロリンを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる構成成分、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。しかし、当業者は、アミノ酸ポリマーもまた、アラニン、セリン、及びプロリン以外の残基が、PAS配列内の微量成分として付加されるとき、ランダイムコイル構造を形成し得ることを認識する。「微量成分」という用語は、本明細書において使用される場合、アラニン、セリン、及びプロリン以外のアミノ酸が、ある程度まで、例えば、最大約12%、すなわち、PAS配列の100個のアミノ酸のうちの約12個、最大約10%、すなわち、PAS配列の100個のアミノ酸のうちの約10個、最大約9%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約9個、最大約8%、すなわ
ち、100個のアミノ酸のうちの約8個、約6%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約6個、約5%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約5個、約4%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約4個、約3%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約3個、約2%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約2個、約1%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約1個、PAS配列内に付加され得ることを意味する。アラニン、セリン、及びプロリンと異なるアミノ酸は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、及びValからなる群より選択され得る。
ち、100個のアミノ酸のうちの約8個、約6%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約6個、約5%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約5個、約4%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約4個、約3%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約3個、約2%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約2個、約1%、すなわち、100個のアミノ酸のうちの約1個、PAS配列内に付加され得ることを意味する。アラニン、セリン、及びプロリンと異なるアミノ酸は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、及びValからなる群より選択され得る。
生理的条件下で、PAS配列ストレッチはランダイムコイル構造を形成し、それによって、VWF因子または凝固活性のタンパク質に対する増大したインビボ及び/またはインビトロ安定性を媒介することができる。ランダイムコイルドメインは、それ自体で安定した構造体または機能を持たないため、それが融合されるVWFタンパク質またはFVIIIタンパク質によって媒介される生物学的活性が本質的に保たれる。他の実施形態において、ランダイムコイルドメインを形成するPAS配列は、特に血漿におけるタンパク質分解、免疫原性、等電点/静電気的作用、細胞表面受容体への結合、または内部移行に関して、生物学的に不活性であるが、依然として生物分解可能であり、PEGなどの合成ポリマーをしのぐ明白な利点を提供する。
ランダイムコイル構造を形成するPAS配列の非限定的な例は、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(配列番号32)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(配列番号33)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(配列番号34)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(配列番号35)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(配列番号36)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(配列番号37)、及びASAAAPAAASAAASAPSAAA(配列番号38)、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。PAS配列の追加の例は、例えば、米国特許出願公開第2010/0292130 A1号及びPCT出願公開番号WO2008/155134 A1から公知である。
II.C.3.e. HAP配列
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、グリシンに富むホモアミノ酸ポリマー(HAP)である。HAP配列は、少なくとも50アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、120アミノ酸、140アミノ酸、160アミノ酸、180アミノ酸、200アミノ酸、250アミノ酸、300アミノ酸、350アミノ酸、400アミノ酸、450アミノ酸、または500アミノ酸長を有する、グリシンの反復配列を含むことができる。一実施形態において、HAP配列は、HAP配列に融合または結合される部分の半減期を延長することが可能である。HAP配列の非限定的な例としては、(Gly)n、(Gly4Ser)n、またはS(Gly4Ser)nが挙げられるが、これらに限定されず、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である。一実施形態において、nは、20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である。別の実施形態において、nは、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200である。例えば、Schlapschy M et al.,Protein Eng.Design Selection,20:273-284(2007)を参照。
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、グリシンに富むホモアミノ酸ポリマー(HAP)である。HAP配列は、少なくとも50アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、120アミノ酸、140アミノ酸、160アミノ酸、180アミノ酸、200アミノ酸、250アミノ酸、300アミノ酸、350アミノ酸、400アミノ酸、450アミノ酸、または500アミノ酸長を有する、グリシンの反復配列を含むことができる。一実施形態において、HAP配列は、HAP配列に融合または結合される部分の半減期を延長することが可能である。HAP配列の非限定的な例としては、(Gly)n、(Gly4Ser)n、またはS(Gly4Ser)nが挙げられるが、これらに限定されず、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である。一実施形態において、nは、20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である。別の実施形態において、nは、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200である。例えば、Schlapschy M et al.,Protein Eng.Design Selection,20:273-284(2007)を参照。
II.C.3.f. トランスフェリンまたはその断片
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはF
VIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、トランスフェリンまたはその断片である。任意のトランスフェリンが、本発明のキメラ分子を作製するために使用され得る。例として、野生型ヒトTf(Tf)は、およそ75KDa(グリコシル化を含まない)の679アミノ酸タンパク質であり、遺伝子重複に由来すると考えられる2つの主要なドメイン、N(約330アミノ酸)及びC(約340アミノ酸)を有する。GenBank受託番号NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM039847、及びS95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)を参照(これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。トランスフェリンは、2つのドメイン、Nドメイン及びCドメインを含む。Nドメインは、2つのサブドメイン、N1ドメイン及びN2ドメインを含み、Cドメインは、2つのサブドメイン、C1ドメイン及びC2ドメインを含む。
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはF
VIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、トランスフェリンまたはその断片である。任意のトランスフェリンが、本発明のキメラ分子を作製するために使用され得る。例として、野生型ヒトTf(Tf)は、およそ75KDa(グリコシル化を含まない)の679アミノ酸タンパク質であり、遺伝子重複に由来すると考えられる2つの主要なドメイン、N(約330アミノ酸)及びC(約340アミノ酸)を有する。GenBank受託番号NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM039847、及びS95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)を参照(これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。トランスフェリンは、2つのドメイン、Nドメイン及びCドメインを含む。Nドメインは、2つのサブドメイン、N1ドメイン及びN2ドメインを含み、Cドメインは、2つのサブドメイン、C1ドメイン及びC2ドメインを含む。
一実施形態において、キメラ分子のトランスフェリン部分は、トランスフェリンスプライス変異体を含む。一例において、トランスフェリンスプライス変異体は、ヒトトランスフェリンのスプライス変異体、例えば、Genbank受託AAA61140、であり得る。別の実施形態において、キメラ分子のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列の1つ以上のドメイン、例えば、Nドメイン、Cドメイン、N1ドメイン、N2ドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
II.C.3.g. ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)
他の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、またはポリビニルアルコールを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の可溶性ポリマーである。可溶性ポリマーなどの異種部分は、キメラ分子内の任意の位置に結合され得る。
他の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、またはポリビニルアルコールを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の可溶性ポリマーである。可溶性ポリマーなどの異種部分は、キメラ分子内の任意の位置に結合され得る。
ある特定の実施形態において、キメラ分子は、VWFリンカーを介して異種部分(例えば、Fc領域)に融合されるVWFタンパク質を含み、該VWFタンパク質はPEGにさらに結合される。別の実施形態において、キメラ分子は、互いに会合するVWFリンカー及びFVIIIタンパク質を介してFc領域に融合されるVWFタンパク質を含み、該FVIIIタンパク質はPEGに結合される。
本発明によってさらに提供されるのは、増大した溶解性、安定性、及びポリペプチドの循環時間、または減少した免疫原性などの追加の利点を提供し得る本発明のキメラ分子の化学修飾された誘導体である(米国特許第4,179,337号を参照)。修飾のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、またはポリビニルアルコールを含むがこれらに限定されない水溶性ポリマーから選択され得る。キメラ分子は、分子内のランダムな位置で、またはNもしくはC末端で、または分子内の規定の位置で修飾され得、1つ、2つ、3つ以上の結合された化学的部分を含み得る。
ポリマーは、任意の分子量であり得、かつ分岐または非分岐であり得る。ポリエチレングリコールでは、一実施形態において、取り扱い及び製造の容易さのため、分子量は約1kDa~約100kDaの間である。所望のプロファイル(例えば、所望される徐放性の持続時間、効果、もしある場合は生物学的活性、取り扱いやすさ、抗原性の程度または欠如、及びタンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果)に応じて、他のサイズが使用され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、85
00、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、または100,000kDaの平均分子量を有し得る。
00、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、または100,000kDaの平均分子量を有し得る。
いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールは、分岐構造を有し得る。分岐ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第5,643,575号、Morpurgo et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.56:59-72(1996)、Vorobjev et al.,Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750(1999)、及びCaliceti et
al.,Bioconjug.Chem.10:638-646(1999)に記載されており、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
al.,Bioconjug.Chem.10:638-646(1999)に記載されており、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
各キメラ分子に結合されるポリエチレングリコール部分の数(すなわち、置換度)もまた、様々であり得る。例えば、本発明のPEG化されたタンパク質は、平均して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20個以上のポリエチレングリコール分子に結合され得る。同様に、平均的な置換度は、タンパク質分子あたり1~3、2~4、3~5、4~6、5~7、6~8、7~9、8~10、9~11、10~12、11~13、12~14、13~15、14~16、15~17、16~18、17~19、または18~20のポリエチレングリコール部分などの範囲内にある。置換度を決定するための方法は、例えば、Delgado et al.,Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9:249-304(1992)内で論じられる。
他の実施形態において、本明細書内で使用されるFVIIIタンパク質は、1つ以上のポリマーと共役される。ポリマーは、水溶性であり得、共有結合的または非共有結合的に、第VIII因子または第VIII因子に共役される他の部分に結合され得る。ポリマーの非限定的な例は、ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリオキサゾリン、またはポリ(アクリロイルモルホリン)であり得る。ポリマー共役されたFVIIIの追加の種類は、米国特許第7,199,223号に開示される。
II.C.3.h. ヒドロキシエチルデンプン(HES)
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に結合される、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、ポリマー、例えば、ヒドロキシエチルデンプン(HES)またはその誘導体である。
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に結合される、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される異種部分は、ポリマー、例えば、ヒドロキシエチルデンプン(HES)またはその誘導体である。
ヒドロキシエチルデンプン(HES)は、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であり、体内のα-アミラーゼによって分解される。HESは、炭水化物ポリマーアミロペクチンの置換誘導体であり、最大95重量%の濃度でトウモロコシデンプン内に存在する。HESは、有利な生物学的特性を示し、血液量補充剤として、及び診療所における血液希釈療法に使用される(Sommermeyer et al.,Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)、及びWeidler et al.,Arzneim.-Forschung/Drug Res.,41,494-498(1991))。
アミロペクチンは、主鎖内にα-1,4-グリコシド結合が存在し、分岐部位でα-1,6-グリコシド結合が見られるグルコース部分を含有する。この分子の物理化学的特性は、主にグリコシド結合の種類によって決定される。切れ目のあるα-1,4-グリコシド結合に起因して、ターンあたり約6個のグルコース単量体を有するらせん構造体が産生される。ポリマーの物理化学的ならびに生化学的特性は、置換によって修飾することができる。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性のヒドロキシエチル化によって達成することができる。反応条件を適合することによって、ヒドロキシエチル化に関して、非置換グルコース単量体内のそれぞれのヒドロキシル基の異なる反応性を利用することが可能である。この事実から、当業者は、限定的に置換パターンに影響を与えることができる。
HESは、主に、分子量分布及び置換度によって特徴付けられる。DSとして示される置換度は、モル置換に関し、当業者に公知である。上に引用したように、Sommermeyer et al.,Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)、特にp.273を参照。
一実施形態において、ヒドロキシエチルデンプンは、1~300kD、2~200kD、3~100kD、または4~70kDの平均分子量(重量平均)を有する。ヒドロキシエチルデンプンは、0.1~3、好ましくは0.1~2、より好ましくは0.1~0.9、好ましくは0.1~0.8のモル置換度、及びヒドロキシエチル基に関して、2~20の範囲のC2:C6置換間の比率をさらに示し得る。約130kDの平均分子量を有するHESの非限定的な例は、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、または0.8などの0.2~0.8の置換度、好ましくは、0.4、0.5、0.6、または0.7などの0.4~0.7の置換度を有するHESである。特定の実施形態において、約130kDの平均分子量を有するHESは、FreseniusからのVOLUVEN(登録商標)である。VOLUVEN(登録商標)は、例えば、治療のための治療指標、及び血液量減少の治療及び予防における治療適用において、血液量補充療法で用いられる人工コロイドである。VOLUVEN(登録商標)の特徴は、130,000+/-20,000Dの平均分子量、0.4のモル置換、及び約9:1のC2:C6比である。他の実施形態において、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量の範囲は、例えば、4~70kD、または10~70kD、または12~70kD、または18~70kD、または50~70kD、または4~50kD、または10~50kD、または12~50kD、または18~50kD、または4~18kD、または10~18kD、または12~18kD、または4~12kD、または10~12kD、または4~10kDである。依然として他の実施形態において、用いられるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、約10kDなどの4kD超及び70kD未満の範囲、または、9~10kDもしくは10~11kDもしくは9~11kDの範囲、あるいは約12kD、または、11~12kD)もしくは12~13kDもしくは11~13kDの範囲、あるいは約18kD、または、17~18kDもしくは18~19kDもしくは17~19kDの範囲、あるいは約30kD、または、29~30、もしくは30~31kDの範囲、あるいは約50kD、または、49~50kDもしくは50~51kDもしくは49~51kDの範囲である。
ある特定の実施形態において、異種部分は、異なる平均分子量、及び/または異なる置換度、及び/または異なるC2:C6置換比を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物であり得る。したがって、ヒドロキシエチルデンプンの混合物は、異なる平均分子量と、異なる置換度と、異なるC2:C6置換比とを有するか、または異なる平均分子量と、異なる置換度と、同じもしくはほぼ同じC2:C6置換比とを有するか、または異なる平均分子量と、同じもしくはほぼ同じ置換度と、異なるC2:C6置換比とを有するか、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量と、異なる置換度と、異なるC2:C6置換比とを有するか、または異なる平均分子量と、同じもしくはほぼ同じ置換度と、同じもしくはほぼ同じC2:C6置換比とを有するか、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量と、異なる
置換度と、同じもしくはほぼ同じC2:C6置換比とを有するか、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量と、同じもしくはほぼ同じ置換度と、異なるC2:C6置換比とを有するか、またはほぼ同じ平均分子量と、ほぼ同じ置換度と、ほぼ同じC2:C6置換比とを有するかで、用いられ得る。
置換度と、同じもしくはほぼ同じC2:C6置換比とを有するか、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量と、同じもしくはほぼ同じ置換度と、異なるC2:C6置換比とを有するか、またはほぼ同じ平均分子量と、ほぼ同じ置換度と、ほぼ同じC2:C6置換比とを有するかで、用いられ得る。
II.C.3.i. ポリシアル酸(PSA)
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される非ポリペプチド異種部分は、ポリマー、例えば、ポリシアル酸(PSA)またはその誘導体である。ポリシアル酸(PSA)は、ある特定の細菌株によって、及びある特定の細胞において哺乳類で、産生されるシアル酸の天然に存在する非分岐ポリマーである。Roth J.,et al.(1993)in Polysialic Acid:From Microbes to
Man,eds.Roth J.,Rutishauser U.,Troy F.A.(Birkhauser Verlag,Basel,Switzerland),p
p 335-348。それらは、限定酸加水分解によって、またはノイラミニダーゼでの消化によって、またはポリマーの自然な細菌由来形態の分別によって、n=約80以上のシアル酸残基からn=2に至るまで様々な重合度で産生され得る。異なるポリシアル酸の組成物はまた、多様であり、そのため、大腸菌K1株及びB群髄膜炎菌の莢膜多糖を含むホモポリマー形態、すなわち、α-2,8-結合ポリシアル酸も存在し、これはまた、胎児型ニューロン細胞接着分子(N-CAM)で見られる。大腸菌K92株の交互結合型α-2,8 α-2,9ポリシアル酸、及び髄膜炎菌のC群多糖類など、ヘテロポリマー形態もまた存在する。シアル酸もまた、髄膜炎菌のW135群またはY群などのシアル酸以外の単量体を有する交互コポリマー内で発見され得る。ポリシアル酸は、病原細菌による免疫及び補体系の回避、ならびに胎児発生中の未成熟なニューロンの膠細胞接着性の調節(ポリマーが抗接着性機能を有する)Cho and Troy,P.N.A.S.,USA,91(1994)11427-11431を含む、重要な生物学的機能を有するが、哺乳類におけるポリシアル酸のための公知の受容体は存在しない。大腸菌K1株のα-2,8-結合ポリシアル酸はまた、「コロミン酸」としても知られ、本発明を例示するために(様々な長さで)使用される。ポリシアル酸をポリペプチドに結合または共役する様々な方法が説明されている(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,846,951号、WO-A-0187922、及びUS2007/0191597 A1を参照。
ある特定の実施形態において、VWFリンカーを介してVWFタンパク質に、またはFVIIIリンカーを介してFVIIIタンパク質に結合される非ポリペプチド異種部分は、ポリマー、例えば、ポリシアル酸(PSA)またはその誘導体である。ポリシアル酸(PSA)は、ある特定の細菌株によって、及びある特定の細胞において哺乳類で、産生されるシアル酸の天然に存在する非分岐ポリマーである。Roth J.,et al.(1993)in Polysialic Acid:From Microbes to
Man,eds.Roth J.,Rutishauser U.,Troy F.A.(Birkhauser Verlag,Basel,Switzerland),p
p 335-348。それらは、限定酸加水分解によって、またはノイラミニダーゼでの消化によって、またはポリマーの自然な細菌由来形態の分別によって、n=約80以上のシアル酸残基からn=2に至るまで様々な重合度で産生され得る。異なるポリシアル酸の組成物はまた、多様であり、そのため、大腸菌K1株及びB群髄膜炎菌の莢膜多糖を含むホモポリマー形態、すなわち、α-2,8-結合ポリシアル酸も存在し、これはまた、胎児型ニューロン細胞接着分子(N-CAM)で見られる。大腸菌K92株の交互結合型α-2,8 α-2,9ポリシアル酸、及び髄膜炎菌のC群多糖類など、ヘテロポリマー形態もまた存在する。シアル酸もまた、髄膜炎菌のW135群またはY群などのシアル酸以外の単量体を有する交互コポリマー内で発見され得る。ポリシアル酸は、病原細菌による免疫及び補体系の回避、ならびに胎児発生中の未成熟なニューロンの膠細胞接着性の調節(ポリマーが抗接着性機能を有する)Cho and Troy,P.N.A.S.,USA,91(1994)11427-11431を含む、重要な生物学的機能を有するが、哺乳類におけるポリシアル酸のための公知の受容体は存在しない。大腸菌K1株のα-2,8-結合ポリシアル酸はまた、「コロミン酸」としても知られ、本発明を例示するために(様々な長さで)使用される。ポリシアル酸をポリペプチドに結合または共役する様々な方法が説明されている(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,846,951号、WO-A-0187922、及びUS2007/0191597 A1を参照。
II.C.4. XTEN配列。
ここで使用される場合、「XTEN配列」は、主に小さな親水性アミノ酸で構成される、天然に存在しない、実質的に非反復の配列を有する、長さが伸張されたポリペプチドを指し、生理学的条件下で、低次の構造体を有する、または二次構造体もしくは三次構造体を有しない配列を持つ。キメラタンパク質パートナーとして、XTENは、キメラタンパク質を作るために本発明のVWFタンパク質またはFVIIIタンパク質と結合されるときに、ある特定の望ましい薬物動態学的、物理化学的、及び薬学的特性を付与し、担体として機能することができる。そのような望ましい特性としては、高められた薬物動態学的パラメータ及び可溶性性質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、「XTEN」は、特に、一本鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のFc断片などの、抗体または抗体断片を除外する。
ここで使用される場合、「XTEN配列」は、主に小さな親水性アミノ酸で構成される、天然に存在しない、実質的に非反復の配列を有する、長さが伸張されたポリペプチドを指し、生理学的条件下で、低次の構造体を有する、または二次構造体もしくは三次構造体を有しない配列を持つ。キメラタンパク質パートナーとして、XTENは、キメラタンパク質を作るために本発明のVWFタンパク質またはFVIIIタンパク質と結合されるときに、ある特定の望ましい薬物動態学的、物理化学的、及び薬学的特性を付与し、担体として機能することができる。そのような望ましい特性としては、高められた薬物動態学的パラメータ及び可溶性性質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、「XTEN」は、特に、一本鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のFc断片などの、抗体または抗体断片を除外する。
いくつかの実施形態において、本発明のXTEN配列は、約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、または2000個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態におい
て、XTENは、約20超~約3000個のアミノ酸残基、30超~約2500個の残基、40超~約2000個の残基、50超~約1500個の残基、60超~約1000個の残基、70超~約900個の残基、80超~約800個の残基、90超~約700個の残基、100超~約600個の残基、110超~約500個の残基、または120超~約400個の残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。
て、XTENは、約20超~約3000個のアミノ酸残基、30超~約2500個の残基、40超~約2000個の残基、50超~約1500個の残基、60超~約1000個の残基、70超~約900個の残基、80超~約800個の残基、90超~約700個の残基、100超~約600個の残基、110超~約500個の残基、または120超~約400個の残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。
本発明のXTEN配列は、9~14個のアミノ酸残基のうちの1つ以上の配列モチーフ、またはその配列モチーフと少なくとも80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を含むことができ、該モチーフは、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタメート(E)、及びプロリン(P)からなる群より選択される4~6種類のアミノ酸を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。US2010-0239554 A1を参照。
いくつかの実施形態において、XTENは、非重複配列モチーフを含み、該配列の約80%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または約91%、または約92%、または約93%、または約94%、または約95%、または約96%、または約97%、または約98%、または約99%、または約100%は、表2Aから選択される単一のモチーフファミリーから選択される、複数単位の非重複配列からなり、ファミリー配列をもたらす。本明細書において使用される場合、「ファミリー」とは、XTENが、表2Aからの単一のモチーフカテゴリからのみ選択されるモチーフ、すなわち、AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC、またはBD XTENを有すること、及びファミリーモチーフからでないXTEN内の任意の他のアミノ酸が、必要とされる特性、例えばコーディングヌクレオチドによる制限酵素部位の組み込み、切断配列の組み込みを可能にすること、またはFVIIIもしくはVWFへのより良い結合を達成するために選択されることを意味する。XTENファミリーのいくつかの実施形態において、XTEN配列は、ADモチーフファミリーの、またはAEモチーフファミリーの、またはAFモチーフファミリーの、またはAGモチーフファミリーの、またはAMモチーフファミリーの、またはAQモチーフファミリーの、またはBCファミリーの、またはBDファミリーの、複数単位の非重複配列モチーフを含み、結果として生じるXTENは、上記の相同性の範囲を示す。他の実施形態において、XTENは、表2Aのモチーフファミリーのうちの2つ以上から、複数単位のモチーフ配列を含む。これらの配列は、以下により詳しく説明される、正味電荷、親水性、二次構造体の欠如、または反復性の欠如などの特性を含め、モチーフのアミノ酸組成物によって付与される所望の物理的/化学的性質を達成するために選択され得る。この段落で上に記載される実施形態において、XTENに組み込まれるモチーフを、本明細書に記載される方法を使用して選択かつ構築し、約36~約3000個のアミノ酸残基のXTENを達成することができる。
XTENは、FVIIIもしくはVWFまたはキメラ分子の任意の他の構成要素への挿入、またはそれらへの結合によって変化する長さを有し得る。一実施形態において、XTEN配列(複数可)の長さは、融合タンパク質内で達成される特性または機能に基づいて選択される。意図される特性または機能によって、XTENは、短いか、または中間の長さの配列か、または担体として機能できるより長い配列かであり得る。ある特定の実施形態において、XTENは、約6~約99のアミノ酸残基の短いセグメント、約100~約399のアミノ酸残基の中間の長さ、ならびに約400~約1000及び最大約3000のアミノ酸残基のより長い長さを含む。このため、FVIIIもしくはVWFに挿入または結合されるXTENは、約6、約12、約36、約40、約42、約72、約96、約144、約288、約400、約500、約576、約600、約700、約800、約864、約900、約1000、約1500、約2000、約2500、または最大約3000アミノ酸残基長の長さを有することができる。他の実施形態において、XTEN配列は、約6~約50、約50~約100、約100~150、約150~250、約25
0~400、約400~約500、約500~約900、約900~1500、約1500~2000、または約2000~約3000アミノ酸残基長である。FVIIIもしくはVWFに挿入または結合されるXTENの正確な長さは、FVIIIまたはVWFの活性に悪影響を及ぼさずに変化し得る。一実施形態において、本明細書でXTEN使用されるXTENのうちの1つ以上は、36アミノ酸、42アミノ酸、72アミノ酸、144アミノ酸、288アミノ酸、576アミノ酸、または864アミノ酸長を有し、XTENファミリー配列、すなわち、AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC、またはBD、のうちの1つ以上から選択され得る。
0~400、約400~約500、約500~約900、約900~1500、約1500~2000、または約2000~約3000アミノ酸残基長である。FVIIIもしくはVWFに挿入または結合されるXTENの正確な長さは、FVIIIまたはVWFの活性に悪影響を及ぼさずに変化し得る。一実施形態において、本明細書でXTEN使用されるXTENのうちの1つ以上は、36アミノ酸、42アミノ酸、72アミノ酸、144アミノ酸、288アミノ酸、576アミノ酸、または864アミノ酸長を有し、XTENファミリー配列、すなわち、AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC、またはBD、のうちの1つ以上から選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明で使用されるXTEN配列は、AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、及びAG2004からなる群より選択される配列と、少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。US2010-0239554 A1を参照。
一実施形態において、XTEN配列は、AE42、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。別の実施形態において、XTEN配列は、AE42、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態において、XTEN配列はAE288である。本発明のある特定のXTEN配列のアミノ酸配列を、表2Bに示す。
使用されるXTEN構成要素のアミノ酸の100%未満が、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタメート(E)、及びプロリン(P)から選択される4、5、もしくは6種類のアミノ酸からなる、またはその配列の100%未満が表2Aの配列モチーフもしくは表2BのXTEN配列からなるそれらの実施形態において、XTENの他のアミノ酸残基は、他の14個の天然L-アミノ酸のいずれかから選択されるが、XTEN配列が少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%、親水性のアミノ酸を含有するように、親水性アミノ酸から優先的に選択される。グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタメート(E)、及びプロリン(P)でないXTENアミノ酸は、例えば、XTENと他の構成要素、例えば、VWFタンパク質との間にリンカーを作るために、XTEN配列全体に散在させられるか、または配列モチーフ内もしくはその間に位置するか、またはXTEN配列の1つ以上の短いストレッチ内に集中するかのいずれかである。XTEN構成要素が、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタメート(E)、及びプロリン(P)以外のアミノ酸を含む場合は、本明細書に開示される方法によって決定されるように、結果として生じる配列が、一般的に二次構造体を欠く、例えば、2%を超えるαへリックスまたは2%を超えるβシートを有しないように、アミノ酸の約2%未満または約1%未満が疎水性残基であることが好ましい。XTENの構造においてあまり好まれない疎水性残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンを含む。さらに、以下のアミノ酸を5%未満、もしくは4%未満、もしくは3%未満、もしくは2%未満、もしくは1%未満含有する、または全く含有しないようにXTEN配列を設計することができる:システイン(ジスフィルド形成及び酸化を回避するため)、メ
チオニン(酸化を回避するため)、アスパラギン、及びグルタミン(脱アミド化を回避するため)。このため、いくつかの実施形態において、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタメート(E)、及びプロリン(P)に加えて他のアミノ酸を含むXTENは、チョウファスマンアルゴリズムによって測定される、αへリックス及びβシートに寄与する残基を5%未満有する配列を有し、かつGORアルゴリズムによって測定される、少なくとも90%、または少なくとも約95%以上のランダイムコイル形成を有する。
チオニン(酸化を回避するため)、アスパラギン、及びグルタミン(脱アミド化を回避するため)。このため、いくつかの実施形態において、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタメート(E)、及びプロリン(P)に加えて他のアミノ酸を含むXTENは、チョウファスマンアルゴリズムによって測定される、αへリックス及びβシートに寄与する残基を5%未満有する配列を有し、かつGORアルゴリズムによって測定される、少なくとも90%、または少なくとも約95%以上のランダイムコイル形成を有する。
さらなる実施形態において、本発明で使用されるXTEN配列は、本発明のキメラタンパク質の物理的または化学的特性、例えば、薬物動態学的特性に影響を与える。本発明で使用されるXTEN配列は、以下の有利な特性のうちの1つ以上を示すことができる:構造的な柔軟性、高められた水溶性、高度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳動物受容体に対する低い結合性、または改善された流体力学(もしくはストークス)半径。特定の実施形態において、本発明においてFVIIIタンパク質に結合されるXTEN配列は、より長い末端半減期、または増加した曲線下面積(AUC)などの薬物動態学的特性を増大させ、それによって、本明細書に記載されるキメラタンパク質は、野生型FVIIIと比較して、より長い間、インビボに留まる。さらなる実施形態において、本明細書において使用されるXTEN配列は、より長い末端半減期、または増加した曲線下面積(AUC)などの薬物動態学的を増大させ、それによって、FVIIIタンパク質は、野生型FVIIIと比較して、より長い間、インビボに留まる。
様々な方法及びアッセイを用いて、XTEN配列を含むタンパク質の物理的/化学的特性を決定することができる。そのような方法は、分析用遠心法、EPR、イオン交換HPLC、サイズ排除HPLC、逆相HPLC、光散乱、キャピラリー電気泳動、円二色性、示差走査熱量測定、蛍光、イオン交換HPLC、サイズ排除HPLC、IR、NMR、ラマン分光法、屈折率測定、及び紫外線/可視分光法を含むが、これらに限定されない。追加の方法は、Amau et al.,Prot Expr and Purif 48,1-13(2006)に開示される。
本発明に従って使用され得るXTEN配列の追加の例は、米国特許公開第2010/0239554 A1号、同第2010/0323956 A1号、同第2011/0046060 A1号、同第2011/0046061 A1号、同第2011/0077199 A1号、もしくは同第2011/0172146 A1号、または国際特許公開番号WO2010091122 A1、WO2010144502 A2、WO2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1、WO 2011028344 A2、もしくはWO2013123457 A1、または国際出願番号PCT/US2013/049989に開示される。
II.C.5. FVIIIタンパク質
本明細書において使用される場合、「FVIIIタンパク質」は、別途指定のない限り、凝固でのその通常の役割において機能的なFVIIIポリペプチドを意味する。FVIIIタンパク質という用語は、凝固経路において全長野生型第VIII因子の機能を保持するその機能的断片、変異体、類似体、誘導体を含む。「FVIIIタンパク質」は、FVIIIポリペプチド(もしくはタンパク質)またはFVIIIと互換的に使用される。FVIII機能の例としては、凝固を活性化する能力、第IX因子のための補因子として機能する能力、Ca2+及びリン脂質の存在下で第IX因子を有するテナーゼ複合体を形成し、次いで第X因子を活性化形態Xaに変換する能力を含むが、これらに限定されない。FVIIIタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスFVIIIタンパク質であり得る。加えて、ヒト及び他の種からのFVIII間の比較は、機能に必要とされる可能性のある保存残基が識別されている(Cameron et al.,Thro
mb.Haemost.79:317-22(1998);US6,251,632)。
本明細書において使用される場合、「FVIIIタンパク質」は、別途指定のない限り、凝固でのその通常の役割において機能的なFVIIIポリペプチドを意味する。FVIIIタンパク質という用語は、凝固経路において全長野生型第VIII因子の機能を保持するその機能的断片、変異体、類似体、誘導体を含む。「FVIIIタンパク質」は、FVIIIポリペプチド(もしくはタンパク質)またはFVIIIと互換的に使用される。FVIII機能の例としては、凝固を活性化する能力、第IX因子のための補因子として機能する能力、Ca2+及びリン脂質の存在下で第IX因子を有するテナーゼ複合体を形成し、次いで第X因子を活性化形態Xaに変換する能力を含むが、これらに限定されない。FVIIIタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスFVIIIタンパク質であり得る。加えて、ヒト及び他の種からのFVIII間の比較は、機能に必要とされる可能性のある保存残基が識別されている(Cameron et al.,Thro
mb.Haemost.79:317-22(1998);US6,251,632)。
凝固系の機能を分析するために多くの試験が利用可能である:活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)試験、色素産生アッセイ、ROTEMアッセイ、プロトロンビン時間(PT)試験(INRを決定するためにも使用される)、フィブリノーゲンテスト(多くの場合Clauss法による)、血小板算定、血小板機能テスト(多くの場合PFA-100による)、TCT、出血時間、混合試験(患者の血漿を正常な血漿と混合した場合に、異常が補正されるかどうか)、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、D-二量体、遺伝子検査(例えば、第V因子ライデン、プロトロンビン突然変異G20210A)、希釈ラッセル蛇毒時間(dRVVT)、種々の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィ(TEGまたはSonoclot)、トロンボエラストメトリ(TEM(登録商標)、例えば、ROTEM(登録商標))、またはユーグロブリン溶解時間(ELT)。
aPTT試験は、「内在性」凝固経路(接触活性化経路とも称される)及び共通凝固経路の双方の有効性を測定する性能指標である。この試験は、市販の組み換え凝固因子、例えば、FVIIIまたはFIXの凝固活性を測定するために広く使用される。それは、外因性経路を測定するプロトロンビン時間(PT)と組み合わせて使用される。
ROTEM分析は、止血の全動態に関する情報:凝固時間、血栓形成、血栓安定性、及び溶解を提供する。トロンボエラストメトリ内の異なるパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、フィブリン溶解、またはこれらの相互作用に影響を与える多くの因子次第である。このアッセイは、二次止血の全体像を提供することができる。
FVIIIポリペプチド及びポリヌクレオチド配列は公知であり、多くの機能的断片、突然変異体、及び修飾されたバージョンも公知である。ヒトFVIII配列(全長)の例は、配列番号16または18内のサブシーケンスとして示される。
FVIIIポリペプチドは、全長FVIII、N末端にMetのない全長FVIII、成熟FVIII(シグナル配列のない)、N末端に追加のMetを有する成熟FVIII、及び/またはBドメインの完全もしくは部分的欠失を有するFVIIIを含む。ある特定の実施形態において、FVIII変異体は、部分的欠失にせよ完全欠失にせよ、Bドメイン欠失を含む。
ヒトFVIII遺伝子は、哺乳動物細胞内で単離及び発現された(Toole,J.J.,et al.,Nature 312:342-347(1984)、Gitschier,J.,et al.,Nature 312:326-330(1984)、Wood,W.I.,et al.,Nature 312:330-337(1984)、Vehar,G.A.,et al.,Nature 312:337-342(19
84)、WO87/04187、WO88/08035、WO88/03558、及び米国特許第4,757,006号)。FVIIIアミノ酸配列は、米国特許第4,965,199号に示されるようにcDNAから推定された。加えて、部分的または完全なB-ドメイン欠失FVIIIは、米国特許第4,994,371号及び同第4,868,112号に示される。いくつかの実施形態において、米国特許第5,004,803号に示されるように、ヒトFVIII B-ドメインは、ヒト第V因子B-ドメインと置き換えられる。ヒト第VIII因子をコードするcDNA配列、及びアミノ酸配列は、米国特許第7,211,559号のそれぞれ配列番号1及び2に示される。
84)、WO87/04187、WO88/08035、WO88/03558、及び米国特許第4,757,006号)。FVIIIアミノ酸配列は、米国特許第4,965,199号に示されるようにcDNAから推定された。加えて、部分的または完全なB-ドメイン欠失FVIIIは、米国特許第4,994,371号及び同第4,868,112号に示される。いくつかの実施形態において、米国特許第5,004,803号に示されるように、ヒトFVIII B-ドメインは、ヒト第V因子B-ドメインと置き換えられる。ヒト第VIII因子をコードするcDNA配列、及びアミノ酸配列は、米国特許第7,211,559号のそれぞれ配列番号1及び2に示される。
ブタFVIII配列は、Toole,J.J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5939-5942(1986)に公開される。さらに、ブタ(pig)脾臓cDNAライブラリーからのFVIII配列のPCR増幅から得られる完全ブタ(porcine)cDNA配列は、Healey,J.F.,et al.,Blood 88:4209-4214(1996)に報告されている。すべてのドメイン、すべてのサブユニット、及び特定のアミノ酸配列の置換を有するヒト/ブタハイブリッドFVIIIは、Lollar及びRungeによる米国特許第5,364,771号、ならびにWO93/20093に開示された。より最近では、ブタFVIIIのA1及びA2ドメインのヌクレオチド及び相当するアミノ酸配列、ならびに相当するヒトドメインと置換されるブタA1及び/またはA2ドメインを有するキメラFVIIIが、WO94/11503に報告された。米国特許第5,859,204号、Lollar,J.S.もまた、ブタcDNA及び推定したアミノ酸配列を開示する。米国特許第6,458,563号は、B-ドメイン欠失ブタFVIIIを開示する。
Lollar,J.S.に対する米国特許第5,859,204号は、減少した抗原性及び減少した免疫反応性を有するFVIIIの機能的突然変異体を報告する。Lollar,J.S.に対する米国特許第6,376,463号はまた、減少した免疫反応性を有するFVIIIの突然変異体も報告する。Saenkoらに対する米国出願公開第2005/0100990号は、FVIIIのA2ドメインにおける機能的突然変異を報告する。
一実施形態において、FVIIIタンパク質(またはキメラタンパク質のFVIII部分)は、配列番号18のアミノ酸1~1438、または配列番号16のアミノ酸1~2332のFVIIIアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であり得(シグナル配列なし)、該FVIIIは、凝固活性を有し、例えば、補因子としての第IX因子を活性化して、第X因子を活性化第X因子に変換する。FVIII(またはキメラタンパク質のFVIII部分)は、配列番号18のアミノ酸1~1438、または配列番号16のアミノ酸1~2332のFVIIIアミノ酸配列と同一であり得る(シグナル配列なし)。FVIIIタンパク質は、シグナル配列をさらに含み得る。
FVIIIの「B-ドメイン」は、本明細書において使用される場合、内部アミノ酸配列同一性、及びタンパク質分解切断の部位、例えば、全長ヒトFVIIIの残基Ser741~Arg1648、によって定義される当該技術分野において公知のB-ドメインと同じである。他のヒトFVIIIドメインは、以下のアミノ酸残基によって定義される:A1、残基Ala1~Arg372;A2、残基Ser373~Arg740;A3、残基Ser1690~Asn2019;C1、残基Lys2020~Asn2172;C2、残基Ser2173~Tyr2332。A3-C1-C2配列は、残基Ser1690~Tyr2332を含む。残りの配列、残基Glu1649~Arg1689は、通常、a3酸性領域と称される。ブタ、マウス、及びイヌFVIIIのための、B-ドメインを含むドメインのすべての境界の位置もまた、当該技術分野において公知である。一実施形
態において、FVIIIのBドメインは、削除される(「B-ドメイン欠失第VIII因子」または「BDD FVIII」)。BDD FVIIIの一例は、表5内の配列の第VIII因子部分と同じ配列を有する、REFACTO(登録商標)(組み換えBDD FVIII)である。(BDD FVIII重鎖は二重下線付き、Bドメインはイタリック、及びBDD FVIII軽鎖はプレーンテキストである)。
表5.BDD FVIII(配列番号18)
表6.BDD FVIIIをコードするヌクレオチド配列(配列番号19)*
*下線付きの核酸はシグナルペプチドをコードする。
態において、FVIIIのBドメインは、削除される(「B-ドメイン欠失第VIII因子」または「BDD FVIII」)。BDD FVIIIの一例は、表5内の配列の第VIII因子部分と同じ配列を有する、REFACTO(登録商標)(組み換えBDD FVIII)である。(BDD FVIII重鎖は二重下線付き、Bドメインはイタリック、及びBDD FVIII軽鎖はプレーンテキストである)。
表5.BDD FVIII(配列番号18)
表6.BDD FVIIIをコードするヌクレオチド配列(配列番号19)*
*下線付きの核酸はシグナルペプチドをコードする。
「B-ドメイン欠失FVIII」は、米国特許第6,316,226号、同第6,346,513号、同第7,041,635号、同第5,789,203号、同第6,060,447号、同第5,595,886号、同第6,228,620号、同第5,972,885号、同第6,048,720号、同第5,543,502号、同第5,610,278号、同第5,171,844号、同第5,112,950号、同第4,868,112号、及び同第6,458,563号に開示される完全または部分的欠失を有し得る。いくつかの実施形態において、本発明のB-ドメイン欠失FVIII配列は、米国特許第6,316,226号(US6,346,513内でも)の第4列第4行、第5列第28行、及び実施例1~5に開示される欠失のいずれか1つを含む。別の実施形態において、B-ドメイン欠失第VIII因子は、S743/Q1638 B-ドメイン欠失第VIII因子(SQ BDD FVIII)(例えば、アミノ酸744~アミノ酸1637の欠失を有する第VIII因子、例えば、配列番号16のアミノ酸1~743及びアミノ酸1638~2332、を有する第VIII因子、すなわち、配列番号18)である。いくつかの実施形態において、本発明のB-ドメイン欠失FVIIIは、米国特許第5,789,203号(さらにUS6,060,447、US5,595,886、及びUS6,228,620)の第2列第26~51行、及び実施例5~8に開示される欠失を有する。いくつかの実施形態において、B-ドメイン欠失第VIII因子は、米国特許第5,972,885号の第1列第25行~第2列第40行、米国特許第6,048,720号の第6列第1~22行及び実施例1、米国特許第5,543,502号の第2列第17~46行、米国特許第5,171,844号の第4列第22行~第5列第36行、米国特許第5,112,950号の第2列第55~68行、図2、及び実施例1、米国特許第4,868,112号の第2列第2行~第19列第21行、及び表2、米国特許第7,041,635号の第2列第1行~第3列第19行、第3列40行~第4列第67行、第7列第43行~第8列第26行、及び第11列第5行~第13列第39行、または米国特許第6,458,563号の第4列第25~53行に記載される欠失を有する。
いくつかの実施形態において、B-ドメイン欠失FVIIIは、Bドメインの大部分の欠失を有するが、WO91/09122に開示されるように、一次翻訳産物の2つのポリ
ペプチド鎖へのインビボでのタンパク質分解処理に必須であるBドメインのアミノ末端配列を依然として含有する。いくつかの実施形態において、B-ドメイン欠失FVIIIは、アミノ酸747~1638の欠失、すなわち、事実上、Bドメインの完全欠失によって構築される。Hoeben R.C.,et al.J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)。B-ドメイン欠失第VIII因子はまた、FVIIIのアミノ酸771~1666またはアミノ酸868~1562の欠失も含有し得る。Meulien P.,et al.Protein Eng.2(4):301-6(1988)。本発明の一部である追加のBドメイン欠失は、アミノ酸982~1562もしくは760~1639(Toole et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797~1562(Eaton,et al.Biochemistry(1986)25:8343-8347))、741~1646(Kaufman(PCT公開出願番号WO87/04187))、747~1560(Sarver,et al.,DNA(1987)6:553-564))、741~1648(Pasek(PCT出願番号88/00831))、または816~1598もしくは741~1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82:16-25,EP 295597))の欠失を含む。他の実施形態において、BDD FVIIIは、1つ以上のN-結合グリコシル化部位、例えば、全長FVIII配列のアミノ酸配列に相当する残基757、784、828、900、963、または任意に943、を保持するB-ドメインの断片を含むFVIIIポリペプチドを含む。B-ドメイン断片の例としては、Miao,H.Z.,et al.,Blood 103(a):3412-3419(2004)、Kasuda,A,et al.,J.Thromb.Haemost.6:1352-1359(2008)、及びPipe,S.W.,et al.,J.Thromb.Haemost.9:2235-2242(2011)に開示されるようなB-ドメインの226アミノ酸または163アミノ酸が挙げられる(すなわち、Bドメインの最初の226アミノ酸または163アミノ酸は保持される)。いくつかの実施形態において、部分的B-ドメインを有するFVIIIは、FVIII198である。FVIII198は、一本鎖FVIIIFc分子-226N6を含む部分的B-ドメインである。226は、FVIII B-ドメインのN末端226アミノ酸を表し、N6は、B-ドメイン内の6つのN-グリコシル化部位を表す。依然として他の実施形態において、BDD FVIIIは、BDD FVIIIタンパクの発現を改善するために、残基309(Phe~Ser)に点突然変異をさらに含む。Miao,H.Z.,et al.,Blood 103(a):3412-3419(2004)を参照。依然として他の実施形態において、BDD FVIIIは、B-ドメインの一部を含有するが1つ以上のフューリン切断部位(例えば、Arg1313及びArg1648)を含有しない、FVIIIポリペプチドを含む。Pipe,S.W.,et al.,J.Thromb.Haemost.9:2235-2242(2011)を参照。前述の欠失の各々は、任意のFVIII配列内で作製され得る。
ペプチド鎖へのインビボでのタンパク質分解処理に必須であるBドメインのアミノ末端配列を依然として含有する。いくつかの実施形態において、B-ドメイン欠失FVIIIは、アミノ酸747~1638の欠失、すなわち、事実上、Bドメインの完全欠失によって構築される。Hoeben R.C.,et al.J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)。B-ドメイン欠失第VIII因子はまた、FVIIIのアミノ酸771~1666またはアミノ酸868~1562の欠失も含有し得る。Meulien P.,et al.Protein Eng.2(4):301-6(1988)。本発明の一部である追加のBドメイン欠失は、アミノ酸982~1562もしくは760~1639(Toole et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797~1562(Eaton,et al.Biochemistry(1986)25:8343-8347))、741~1646(Kaufman(PCT公開出願番号WO87/04187))、747~1560(Sarver,et al.,DNA(1987)6:553-564))、741~1648(Pasek(PCT出願番号88/00831))、または816~1598もしくは741~1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82:16-25,EP 295597))の欠失を含む。他の実施形態において、BDD FVIIIは、1つ以上のN-結合グリコシル化部位、例えば、全長FVIII配列のアミノ酸配列に相当する残基757、784、828、900、963、または任意に943、を保持するB-ドメインの断片を含むFVIIIポリペプチドを含む。B-ドメイン断片の例としては、Miao,H.Z.,et al.,Blood 103(a):3412-3419(2004)、Kasuda,A,et al.,J.Thromb.Haemost.6:1352-1359(2008)、及びPipe,S.W.,et al.,J.Thromb.Haemost.9:2235-2242(2011)に開示されるようなB-ドメインの226アミノ酸または163アミノ酸が挙げられる(すなわち、Bドメインの最初の226アミノ酸または163アミノ酸は保持される)。いくつかの実施形態において、部分的B-ドメインを有するFVIIIは、FVIII198である。FVIII198は、一本鎖FVIIIFc分子-226N6を含む部分的B-ドメインである。226は、FVIII B-ドメインのN末端226アミノ酸を表し、N6は、B-ドメイン内の6つのN-グリコシル化部位を表す。依然として他の実施形態において、BDD FVIIIは、BDD FVIIIタンパクの発現を改善するために、残基309(Phe~Ser)に点突然変異をさらに含む。Miao,H.Z.,et al.,Blood 103(a):3412-3419(2004)を参照。依然として他の実施形態において、BDD FVIIIは、B-ドメインの一部を含有するが1つ以上のフューリン切断部位(例えば、Arg1313及びArg1648)を含有しない、FVIIIポリペプチドを含む。Pipe,S.W.,et al.,J.Thromb.Haemost.9:2235-2242(2011)を参照。前述の欠失の各々は、任意のFVIII配列内で作製され得る。
本発明において有用なFVIIIタンパク質は、FVIII凝固活性に影響を与えない、1つ以上の追加の異種配列、または化学的もしくは物理的修飾をその中に有するFVIIIを含むことができる。そのような異種配列、または化学的もしくは物理的修飾は、FVIIIタンパク質のC末端もしくはN末端に融合され得るか、またはFVIIIタンパク質内の2つのアミノ酸残基のうちの1つ以上の間に挿入され得る。FVIIIタンパク質内におけるそのような挿入は、FVIII凝固活性またはFVIII機能に影響を与えない。一実施形態において、該挿入は、FVIIIタンパク質の薬物動態学的特性(例えば、半減期)を改善する。別の実施形態において、該挿入は、2、3、4、5、または6つを超える部位であり得る。
一実施形態において、FVIIIは、アミノ酸1648(全長第VIII因子もしくは
配列番号16内)、アミノ酸754(S743/Q1638 B-ドメイン欠失第VIII因子もしくは配列番号16内)、または相当するアルギニン残基(他の変異体内)でアルギニンの直後を切断され、それによって重鎖及び軽鎖をもたらす。別の実施形態において、FVIIIは、金属イオン媒介非共有結合によって結合される、または会合する重鎖及び軽鎖を含む。
配列番号16内)、アミノ酸754(S743/Q1638 B-ドメイン欠失第VIII因子もしくは配列番号16内)、または相当するアルギニン残基(他の変異体内)でアルギニンの直後を切断され、それによって重鎖及び軽鎖をもたらす。別の実施形態において、FVIIIは、金属イオン媒介非共有結合によって結合される、または会合する重鎖及び軽鎖を含む。
他の実施形態において、FVIIIは、アミノ酸1648(全長FVIIIもしくは配列番号16内)、アミノ酸754(S743/Q1638 B-ドメイン欠失FVIIIもしくは配列番号18内)、または相当するアルギニン残基(他の変異体内)でアルギニンの直後を切断されていない一本鎖FVIIIである。一本鎖FVIIIは、1つ以上のアミノ酸置換を含み得る。一実施形態において、アミノ酸置換は、残基1648、残基1645、もしくは全長成熟第VIII因子ポリペプチド(配列番号16)の双方、または残基754、残基751、もしくはSQ BDD第VIII因子(配列番号18)の双方に相当する残基にある。アミノ酸置換は、アルギニン以外の任意のアミノ酸、例えば、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、オルニチン、ピロリジン、またはタウリンであり得る。
FVIIIは、トロンビンによってさらに切断され、次いでFVIIIaとして活性化され得、活性化第IX因子(FIXa)のための補因子として機能する。そして、活性化FIXは活性化FVIIIと一緒になってXase複合体を形成し、第X因子を活性化第X因子(FXa)に変換する。活性化のため、FVIIIは、アミノ酸372、740、及び1689(B-ドメイン欠失FVIII配列内のアミノ酸372、740、及び795に相当する)で、3つのアルギニン残基の後をトロンビンによって切断され、その切断が、50kDa A1、43kDa A2、及び73kDa A3-C1-C2鎖を有するFVIIIaを生成する。一実施形態において、本発明に有用なFVIIIタンパク質は、非活性FVIIIである。別の実施形態において、FVIIIタンパク質は活性化FVIIIである。
VWFタンパク質に結合される、またはそれと会合するFVIIIポリペプチドを有するタンパク質は、配列番号16もしくは18と少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一の配列を含むことができ、該配列は、FVIII凝固活性、例えば、第X因子を活性化第X因子(FXa)に変換するために補因子として第IX因子を活性化すること、を有する。
いくつかの実施形態において、FVIIIタンパク質は、FVIIIタンパク質のC末端もしくはN末端に融合される、またはFVIIIタンパク質内の2個の隣接するアミノ酸の間に挿入される1つ以上の異種部分をさらに含む。他の実施形態において、異種部分は、少なくとも約50個のアミノ酸、少なくとも約100個のアミノ酸、少なくとも約150個のアミノ酸、少なくとも約200個のアミノ酸、少なくとも約250個のアミノ酸、少なくとも約300個のアミノ酸、少なくとも約350個のアミノ酸、少なくとも約400個のアミノ酸、少なくとも約450個のアミノ酸、少なくとも約500個のアミノ酸、少なくとも約550個のアミノ酸、少なくとも約600個のアミノ酸、少なくとも約650個のアミノ酸、少なくとも約700個のアミノ酸、少なくとも約750個のアミノ酸、少なくとも約800個のアミノ酸、少なくとも約850個のアミノ酸、少なくとも約900個のアミノ酸、少なくとも約950個のアミノ酸、または少なくとも約1000個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラ分子の半減期は、野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少な
くとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される。
くとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される。
他の例となるFVIII変異体はまた、2013年1月17日公開の米国公開第US2013/0017997号、2013年8月22日公開の国際公開番号WO2013/122617、または2014年1月16日公開の国際公開番号WO2014/011819、または国際公開番号WO2013123457 A1、または国際出願番号PCT/US2013/049989にも開示される。
III. ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び作製方法
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書内に記載されるキメラ分子をコードするポリヌクレオチドである。VWFタンパク質が、VWFリンカーを介して異種部分に、及び単一ポリペプチド鎖としてキメラタンパク質内でFVIIIタンパク質及びXTEN配列に結合されるとき、本発明は、単一ポリペプチド鎖をコードする単一ポリヌクレオチドに注目する。キメラタンパク質が、第1及び第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖が、VWFタンパク質、XTEN配列、及びVWFリンカーを介して第1の異種部分(例えば、第1のFc領域)を含み、第2のポリペプチド鎖が、FVIIIタンパク質及び第2の異種部分(例えば、第2のFc領域)を含むとき、ポリヌクレオチドは、第1のヌクレオチド領域及び第2のヌクレオチド領域を含むことができる。一実施形態において、第1のヌクレオチド領域及び第2のヌクレオチド領域は、同じポリヌクレオチド上にある。別の実施形態において、第1のヌクレオチド領域及び第2のヌクレオチド領域は、2つの異なるポリヌクレオチド(例えば、異なるベクター)上にある。ある特定の実施形態において、本発明は、第1のヌクレオチド鎖及び第2のヌクレオチド鎖を含み、第1のヌクレオチド鎖がVWFタンパク質、XTEN配列、VWFリンカー、及びキメラタンパク質の異種部分をコードし、かつ第2のヌクレオチド鎖が、FVIIIタンパク質及び第2の異種部分をコードする、ポリヌクレオチドのセットを対象とする。いくつかの実施形態において、本発明は、第1のヌクレオチド鎖及び第2のヌクレオチド鎖を含み、第1のヌクレオチド鎖がVWFタンパク質、及びキメラタンパク質の異種部分をコードし、かつ第2のヌクレオチド鎖が、FVIIIリンカーを介して第2の異種部分に融合されるFVIIIタンパク質をコードし、少なくとも1つのXTEN配列がキメラタンパク質に融合される、ポリヌクレオチドのセットを対象とする。他の実施形態において、本発明は、第1のヌクレオチド鎖及び第2のヌクレオチド鎖を含み、第1のヌクレオチド鎖がVWFタンパク質、VWFリンカー、及びキメラタンパク質の異種部分をコードし、かつ第2のヌクレオチド鎖が、FVIIIタンパク質、FVIIIリンカー、及び第2の異種部分をコードし、少なくとも1つのXTEN配列がキメラタンパク質に融合される、ポリヌクレオチドのセットを対象とする。
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書内に記載されるキメラ分子をコードするポリヌクレオチドである。VWFタンパク質が、VWFリンカーを介して異種部分に、及び単一ポリペプチド鎖としてキメラタンパク質内でFVIIIタンパク質及びXTEN配列に結合されるとき、本発明は、単一ポリペプチド鎖をコードする単一ポリヌクレオチドに注目する。キメラタンパク質が、第1及び第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖が、VWFタンパク質、XTEN配列、及びVWFリンカーを介して第1の異種部分(例えば、第1のFc領域)を含み、第2のポリペプチド鎖が、FVIIIタンパク質及び第2の異種部分(例えば、第2のFc領域)を含むとき、ポリヌクレオチドは、第1のヌクレオチド領域及び第2のヌクレオチド領域を含むことができる。一実施形態において、第1のヌクレオチド領域及び第2のヌクレオチド領域は、同じポリヌクレオチド上にある。別の実施形態において、第1のヌクレオチド領域及び第2のヌクレオチド領域は、2つの異なるポリヌクレオチド(例えば、異なるベクター)上にある。ある特定の実施形態において、本発明は、第1のヌクレオチド鎖及び第2のヌクレオチド鎖を含み、第1のヌクレオチド鎖がVWFタンパク質、XTEN配列、VWFリンカー、及びキメラタンパク質の異種部分をコードし、かつ第2のヌクレオチド鎖が、FVIIIタンパク質及び第2の異種部分をコードする、ポリヌクレオチドのセットを対象とする。いくつかの実施形態において、本発明は、第1のヌクレオチド鎖及び第2のヌクレオチド鎖を含み、第1のヌクレオチド鎖がVWFタンパク質、及びキメラタンパク質の異種部分をコードし、かつ第2のヌクレオチド鎖が、FVIIIリンカーを介して第2の異種部分に融合されるFVIIIタンパク質をコードし、少なくとも1つのXTEN配列がキメラタンパク質に融合される、ポリヌクレオチドのセットを対象とする。他の実施形態において、本発明は、第1のヌクレオチド鎖及び第2のヌクレオチド鎖を含み、第1のヌクレオチド鎖がVWFタンパク質、VWFリンカー、及びキメラタンパク質の異種部分をコードし、かつ第2のヌクレオチド鎖が、FVIIIタンパク質、FVIIIリンカー、及び第2の異種部分をコードし、少なくとも1つのXTEN配列がキメラタンパク質に融合される、ポリヌクレオチドのセットを対象とする。
他の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、タンパク質転換酵素をコードする追加のヌクレオチド鎖(例えば、キメラポリペプチドが単一ポリヌクレオチド鎖によってコードされるときは第2のヌクレオチド鎖、キメラタンパク質が2つのポリヌクレオチド鎖にコードされるときは第3のヌクレオチド鎖)をさらに含む。タンパク質転換酵素は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン5型(PCSK5またはPC5)、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン7型(PCSK7またはPC5)、酵母Kex 2、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン3型(PACEまたはPCSK3)、またはそれらの2つ以上の組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質転換酵素は、PACE、PC5、またはPC7である。特定の実施形態において、タンパク質転換酵素は、PC5またはPC7である。参照により本明細書に組み込まれる、国際出願番号PCT/US2011/043568を参照。別の実施形態において、タンパク質転換酵素は、PACE/フューリンである。
ある特定の実施形態において、本発明は、VWFリンカーを介して第1の異種部分に融合されるVWFのD’ドメイン及びD3ドメインを含むVWFタンパク質をコードする第1のヌクレオチド配列、FVIIIタンパク質及び第2の異種部分をコードする第2のヌクレオチド配列、ならびにVWFのD1ドメイン及びD2ドメインをコードする第3のヌクレオチド配列を含み、XTEN配列が第1の鎖または第2の鎖のいずれかの中に存在する、ポリヌクレオチドのセットを含む。この実施形態において、D1ドメイン及びD2ドメインは、適切なジスルフィド結合形成及びD’D3ドメインの折畳みのために、別々に発現される(VWFタンパク質のD’D3ドメインに結合されない)。D1D2ドメイン発現は、シスまたはトランスのいずれかであり得る。
本明細書において使用される場合、発現ベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な要素、またはRNAウイルスベクターの場合は、適切な宿主細胞に導入されるときに複製及び翻訳に必要な要素を含む、任意の核酸構築物を指す。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びそれらの誘導体を含むことができる。
本発明の発現ベクターは、キメラ分子をコードするポリヌクレオチドを含むことになる。
一実施形態において、キメラ分子のためのコード配列は、発現制御配列に作動可能に結合される。本明細書において使用される場合、2つの核酸配列は、それらが、各構成要素核酸配列がその機能性を保持することを可能にするような方法で共有結合的に結合されるとき、作動可能に結合される。コード配列及び遺伝子発現制御配列は、それらが、遺伝子発現制御配列の影響もしくは制御下で発現またはコード配列の転写及び/もしくは翻訳を配置するような方法で共有結合的に結合されるとき、作動的に結合されると言われる。2つのDNA配列は、5’遺伝子発現配列内のプロモーターの導入がコード配列の転写をもたらす場合、及び2つのDNA配列間の結合の性質が(1)フレームシフト変異の導入をもたらさない、(2)プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力を妨害しない、または(3)相当するRNA転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合、作動的に結合されると言われる。このため、遺伝子発現配列がコード核酸配列に作動的に結合されるのは、遺伝子発現配列がその核酸配列の転写に作用することができるために、結果として生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される場合である。
本明細書で使用される場合、遺伝子発現制御配列は、作動的に結合されるコード核酸の効率的な転写及び翻訳を促進する、プロモーター配列またはプロモーター-エンハンサーの組み合わせなどの任意の調節ヌクレオチド配列である。遺伝子発現制御配列は、例えば、構成的または誘導性プロモーターなどの、哺乳動物またはウイルスプロモーターであり得る。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子のためのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない:ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β-アクチンプロモーター、及び他の構成的プロモーター。真核細胞内で構成的に機能する例となるウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスからのプロモーター(CMV)、シミアンウイルス(例えば、SV40)、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長い末端反復配列(LTR)、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモーターも含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で転写及び翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
一般に、遺伝子発現制御配列は、必要に応じて、TATAボックス、キャップ配列、CAAT配列等など、転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する5’非転写及び5’非翻訳配列を含むものとする。特に、そのような5’非転写配列は、作動可能に結合されたコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むことになる。遺伝子発現配列は、所望であれば、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を任意に含む。
ウイルスベクターは、以下のウイルスからの核酸配列を含むが、これらに限定されない:モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタインバーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、及びレトロウイルスなどのRNAウイルス。当該技術分野で周知の他のベクターを容易に用いることができる。ある特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子と置き換えられている非細胞変性真核ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスはレトロウイルスを含み、その生活環はゲノムウイルスRNAのDNAへの逆転写、その後の宿主細胞DNAへのプロウイルス組み込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に認可されている。最も有用なのは、複製欠損である(すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することは可能であるが、感染粒子を製造することは不可能である)レトロウイルスである。そのような遺伝子改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおける遺伝子の高効率形質導入に一般有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準プロトコル(外因性遺伝物質のプラスミドへの組み込み、パッケージング細胞株へのプラスミドのトランスフェクション、パッケージング細胞株による組み換えレトロウイルスの産生、組織培地からのウイルス粒子の収集、及び標的細胞のウイルス粒子への感染の工程を含む)は、Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman Co.,New York(1990)、及びMurry,E.J.,Methods in Molecular Biology,Vol.7,Humanaa Press,Inc.,Cliffton,N.J.(1991)内に提供される。
一実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二本鎖DNAウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作され得、かつ幅広い細胞型及び種に感染することが可能である。それは、熱及び脂肪族溶媒安定性、造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い形質導入頻度、ならびに重感染阻害がなく、したがって、複数回の形質導入が可能になるなどの利点をさらに有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを、部位特異的様態でヒト細胞DNAに組み込むことができ、それによって挿入突然変異誘発の可能性、及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入された遺伝子発現の変動性を最小限にすることができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧がない場合には100回超の継代で、組織培養中で行われており、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の様式でも機能することができる。
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当該技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989を参照。過去数年において、プラスミドベクターは、宿主ゲノム内で複製すること、及び宿主ゲノム内に統合することができないために、インビボにおいて遺伝子を細胞に送達するのに特に有利であることが発見されてい
る。しかしながら、宿主細胞と互換性があるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされる遺伝子からペプチドを発現することができる。商業用供給業者から入手可能ないくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、pBR322、pUC18、pUC19、様々なpcDNAプラスミド、pRC/CMV、様々なpCMVプラスミド、pSV40、及びpBlueScriptが挙げられる。特定のプラスミドの追加の例としては、すべてInvitrogen(Carlsbad、CA.)より、カタログ番号V79020のpcDNA3.1、カタログ番号V87020のpcDNA3.1/hygro、カタログ番号V86320のpcDNA4/myc-His、及びカタログ番号V53220のpBudCE4.1が挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、プラスミドは、DNAの特定の断片を除去及び/または付加するために、標準分子生物学技術を用いてカスタム設計され得る。
る。しかしながら、宿主細胞と互換性があるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされる遺伝子からペプチドを発現することができる。商業用供給業者から入手可能ないくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、pBR322、pUC18、pUC19、様々なpcDNAプラスミド、pRC/CMV、様々なpCMVプラスミド、pSV40、及びpBlueScriptが挙げられる。特定のプラスミドの追加の例としては、すべてInvitrogen(Carlsbad、CA.)より、カタログ番号V79020のpcDNA3.1、カタログ番号V87020のpcDNA3.1/hygro、カタログ番号V86320のpcDNA4/myc-His、及びカタログ番号V53220のpBudCE4.1が挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、プラスミドは、DNAの特定の断片を除去及び/または付加するために、標準分子生物学技術を用いてカスタム設計され得る。
本発明のタンパク質を産生するために使用され得る1つの昆虫発現系において、キンウワバ科核多角体病(polyhidrosis)ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現するためにベクターとして使用される。該ウイルスは、スポドプテラフルギペルダ細胞内で増殖する。コード配列は、ウイルスの非必須領域(例えば、多角体遺伝子)内にクローン化され、ACNPVプロモーター(例えば、多角体プロモーター)の制御下に置かれる。コード配列の挿入の成功は、多角体遺伝子の不活性化、及び非閉塞性組み換えウイルス(すなわち、多角体遺伝子でコードされるタンパク質性コートを欠くウイルス)の産生をもたらすことになる。これらの組み換えウイルスは、次いで、挿入された遺伝子が発現されるスポドプテラフルギペルダ細胞を感染させるために使用される。(例えば、Smith et al.(1983)J Virol 46:584、米国特許第4,215,051号を参照。)この発現系のさらなる例は、Ausubel et al.,eds.(1989)Current Protocols in Molecular
Biology,Vol.2,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience内に見出され得る。
Biology,Vol.2,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience内に見出され得る。
本発明のタンパク質を発現するために使用され得る別の系は、「GS発現系」(Lonza Biologics PLC,Berkshire UK)とも称される、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系である。この発現系は、米国特許第5,981,216号に詳細に記載される。
哺乳動物宿主細胞において、数多くのウイルスベース発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、コード配列は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部(tripartite)リーダー配列に連結され得る。このキメラ遺伝子は、次いで、インビトロまたはインビボ組み換えによってアデノウイルスゲノム内に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)内への挿入は、感染した宿主内で生存でき、かつペプチドを発現することが可能である組み換えウイルスもたらすことになる。例えば、Logan &Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:3655)を参照。代替的に、ワクシニア7.5Kプロモーターが使用され得る。例えば、Mackett et al.(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79:7415、Mackett et al.(1984)J Virol 49:857、Panicali et al.(1982)Proc Natl Acad
Sci USA 79:4927を参照。
Sci USA 79:4927を参照。
産生の効率を高めるために、ポリヌクレオチドは、酵素的切断部位によって分離される本発明のタンパク質の複数単位をコードするように設計され得る。結果として生じるポリペプチドは、ポリペプチド単位を回収するために、(例えば、適切な酵素で処理することによって)切断され得る。これによって、単一のプロモーターによって引き起こされるポ
リペプチドの収量を増加させることができる。適切なウイルス発現系において使用されるとき、mRNAによってコードされる各ポリペプチドの翻訳は、例えば、内部リボソーム進入部位、IRESによって、転写物内で内的に指示される。このため、多シストロン性構築物は、単一の大きな多シストロン性mRNAの転写を指示し、代わりにそれが複数の個々のポリペプチドの翻訳を指示する。このアプローチは、ポリタンパク質の産生及び酵素的処理を排除し、単一のプロモーターによって引き起こされるポリペプチドの収量を著しく増加させ得る。
リペプチドの収量を増加させることができる。適切なウイルス発現系において使用されるとき、mRNAによってコードされる各ポリペプチドの翻訳は、例えば、内部リボソーム進入部位、IRESによって、転写物内で内的に指示される。このため、多シストロン性構築物は、単一の大きな多シストロン性mRNAの転写を指示し、代わりにそれが複数の個々のポリペプチドの翻訳を指示する。このアプローチは、ポリタンパク質の産生及び酵素的処理を排除し、単一のプロモーターによって引き起こされるポリペプチドの収量を著しく増加させ得る。
形質転換に使用されるベクターは、通常、形質転換体を識別するために使用される選択可能マーカーを含有することになる。細菌系において、これは、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子を含むことができる。培養された哺乳動物細胞内での使用のための選択可能マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキサートなどの、薬物に対する耐性を付与する遺伝子を含む。選択可能マーカーは、増幅可能な選択可能マーカーであり得る。1つの増幅可能な選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子である。Simonsen C C et al.(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9。選択可能マーカーは、Thilly(1986)Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.によって概説され、選択可能マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
選択可能マーカーは、目的の遺伝子と同じ時に別個のプラスミド上で細胞内に導入され得るか、またはそれらは同じプラスミド上で挿入され得る。同じプラスミド上の場合、選択可能マーカー及び目的の遺伝子は、異なるプロモーターまたは同じプロモーターの制御下にあり得、後者の配置は、ジシストロン性メッセージ(dicistronic message)を産生する。このタイプの構築物は、当該技術分野において公知である(例えば、米国特許第4,713,339号)。
発現ベクターは、組み換え産出されたタンパク質の容易な精製を可能にするタグをコードすることができる。例としては、タグ付けされた融合タンパク質が産生されるように、発現されるタンパク質のためのコード配列が、lacZコード領域を有するフレーム内のベクターに連結され得る、ベクターpUR278(Ruther et al.(1983)EMBO J 2:1791)が挙げられるがこれに限定されず、pGEXベクターが、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグとともに本発明のタンパク質を発現するために使用され得る。これらのタンパク質は、通常、可溶性であり、かつグルタチオン-アガロースビーズへの吸着に続く遊離グルタチオン存在下での溶離によって細胞から容易に精製されることができる。ベクターは、精製後のタグの容易な除去のために切断部位(トロンビン、または第Xa因子プロテアーゼ、またはPRESCISSION PROTEASE(商標)(Pharmacia、Peapack、N.J.))を含む。
発現ベクターまたはベクターは、次いで、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞内にトランスフェクト、またはコトランスフェクトされる。当該技術分野において公知のトランスフェクション技術は、リン酸カルシウム沈殿(Wigler et al.(1978)Cell 14:725)、電気穿孔(Neumann et al.(1982)EMBO J 1:841)、及びリポソームベースの試薬が挙げられるが、これらに限定されない。様々な宿主発現ベクター系が、原核細胞及び真核細胞の双方を含む、本明細書に記載されるタンパク質を発現するために利用され得る。これらは、適切なコード配列を含有する組み換えバクテリオファージDNAまたはプラスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物(例えば、大腸菌)、適切なコード配列を含有する組み換
え酵母または菌発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌、適切なコード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系、組み換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス)に感染した、または適切なコード配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系、哺乳動物細胞(例えば、HEK 293、CHO、Cos、HeLa、HKB11、及びBHK細胞)を含む動物細胞系を含むが、これらに限定されない。
え酵母または菌発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌、適切なコード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系、組み換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス)に感染した、または適切なコード配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系、哺乳動物細胞(例えば、HEK 293、CHO、Cos、HeLa、HKB11、及びBHK細胞)を含む動物細胞系を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。本明細書において使用される場合、真核細胞とは、決定的な核を有する任意の動物または植物細胞を指す。動物の真核細胞は、脊椎動物、例えば、哺乳類の細胞、及び無脊椎動物、例えば、昆虫の細胞を含む。植物の真核細胞は、具体的には、酵母細胞を含むことができるが、これに限定されない。真核細胞は、原核細胞、例えば、細菌とは異なる。
ある特定の実施形態において、真核細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、哺乳類由来の任意の細胞である。哺乳動物細胞は、具体的には、哺乳動物細胞株を含むが、これに限定されない。一実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。別の実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎臓細胞株であるHEK 293細胞である。HEK 293細胞は、American Type Culture Collection、Manassas、VAよりCRL-1533として、及びInvitrogen(Carlsbad、Calif.)よりカタログ番号11631-017の293-F細胞、またはカタログ番号11625-019の293-F細胞として入手可能である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、網膜由来のヒト細胞であるPER.C6(登録商標)細胞である。PER.C6(登録商標)細胞は、Crucell(Leiden、The Netherlands)より入手可能である。他の実施形態において、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。CHO細胞は、American Type Culture Collection、Manassas、VAより入手可能である。(例えば、CHO-K1、CCL-61)。依然として他の実施形態において、哺乳動物細胞は、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞である。BHK細胞は、American Type Culture Collection、Manassas、Vaより入手可能である。(例えば、CRL-1632)。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、HEK293細胞及びヒトB細胞株のハイブリッド細胞株であるHKB11細胞である。Mei et al.,Mol.Biotechnol.34(2):165-78(2006)。
一実施形態において、VWFタンパク質、VWFリンカー、異種部分、または本発明のキメラタンパク質をコードするプラスミドは、選択可能マーカー、例えば、ゼオシン耐性、をさらに含み、キメラタンパク質の産生のために、HEK 293細胞内にトランスフェクトされる。
依然として他の実施形態において、トランスフェクトされる細胞は、安定してトランスフェクトされる。これらの細胞は、当業者に公知の従来技術を使用して、安定した細胞株として選択及び維持され得る。
該タンパク質のDNA構築物を含有する宿主細胞を、適切な増殖培地内で増殖させる。本明細書内において使用される場合、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖のために必要とされる栄養素を含有する培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養素は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及び成長因子を含み得る。任意に、培地は、1つ以上の選択因子を含有することができる。任意に、培地は、ウシ胎児(bovine calf)血清またはウシ胎児(fetal calf)血清(FCS)を
含有することができる。一実施形態において、培地は、実質的にIgGを含有しない。増殖培地は、一般的に、DNA構築物を含有する細胞のために、例えば、薬物選択、またはDNA構築物上で選択可能マーカーによって補足される、もしくはDNA構築物でコトランスフェクトされる必須栄養素の欠乏によって選択する。培養された哺乳動物細胞は、一般的に、市販の血清含有または無血清培地(例えば、MEM、DMEM、DMEM/F12)内で増殖させる。一実施形態において、培地は、CD293(Invitrogen、Carlsbad、CA.)である。別の実施形態において、培地は、CD17(Invitrogen、Carlsbad、CA.)である。使用される特定の細胞株に適切な培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。
含有することができる。一実施形態において、培地は、実質的にIgGを含有しない。増殖培地は、一般的に、DNA構築物を含有する細胞のために、例えば、薬物選択、またはDNA構築物上で選択可能マーカーによって補足される、もしくはDNA構築物でコトランスフェクトされる必須栄養素の欠乏によって選択する。培養された哺乳動物細胞は、一般的に、市販の血清含有または無血清培地(例えば、MEM、DMEM、DMEM/F12)内で増殖させる。一実施形態において、培地は、CD293(Invitrogen、Carlsbad、CA.)である。別の実施形態において、培地は、CD17(Invitrogen、Carlsbad、CA.)である。使用される特定の細胞株に適切な培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。
本明細書に記載されるようなキメラ分子の2つのポリペプチド鎖(echains)を同時発現するために、宿主細胞は、双方の鎖の発現を可能にする条件下で培養される。本明細書において使用される場合、培養することは、生きた細胞を少なくとも一定時間インビトロで維持することを指す。維持することは、生きた細胞の数の増加を含むことができるが、それを含むことを必要としない。例えば、培養内に維持される細胞は、数において静的であり得るが、依然として生存し、かつ所望の産物、例えば、組み換えタンパク質または組み換え融合タンパク質を産生することが可能である。真核細胞を培養するための好適な条件は、当該技術分野において周知であり、培地の適切な選択、培地補足物、温度、pH、酸素飽和度等を含む。商業目的のため、培養することは、振とうフラスコ、ローラボトル、中空糸バイオリアクター、撹はん槽バイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、Waveバイオリアクター等を含む、様々なタイプのスケールアップシステムのうちのいずれかの使用を含むことができる。
細胞培養条件はまた、キメラ分子内の第1の鎖と第2の鎖との会合を可能にするように選択される。キメラ分子の発現を可能にする条件は、ビタミンK源の存在を含み得る。例えば、一実施形態において、安定してトランスフェクトされたHEK 293細胞は、4mMのグルタミンで補足されたCD293培地(Invitrogen、Carlsbad、CA)またはOptiCHO培地(Invitrogen、Carlsbad、CA)内で培養される。
一態様において、本発明は、a)宿主細胞にキメラ分子をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトすること、及びb)宿主細胞を、キメラ分子を発現するために好適な条件下で、キメラ分子が発現される培養培地内で培養することを含む、キメラタンパク質の発現、作製、または産生方法を対象とする。
さらなる実施形態において、本キメラ分子を含有するタンパク質産物は、培地内に分泌される。培地を、細胞から分離し、濃縮し、濾過し、次いで2つまたは3つの親和性カラム、例えば、タンパク質Aカラム及び1つまたは2つの陰イオン交換カラムに通過させる。
ある特定の態様において、本発明は、本明細書に記載される方法によって産生されるキメラポリペプチドに関する。
インビトロ産生は、本発明の所望の改変ポリペプチドを大量に得るためのスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養(cultivation)のための技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、エアリフトリアクターもしくは連続撹拌リアクター内での、均質懸濁液培養、または、例えば、中空糸、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズもしくは磁器カートリッジ上での、固定化もしくは封入細胞培養を含む。必要な場合、及び/または所望の場合、ポリペプチドの溶液は、慣例のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー(HIC、DEAE-セルロース上でのクロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィー、によって精製され得る。
作用クロマトグラフィー(HIC、DEAE-セルロース上でのクロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィー、によって精製され得る。
本発明はまた、第1の異種部分に融合されるVWFタンパク質と、第2の異種部分に融合されるXTEN配列及びFVIIIタンパク質とを含むキメラFVIIIタンパク質のFVIII活性を改善する方法も含み、該方法は、VWFリンカーをVWFタンパク質と第1の異種部分との間に挿入することを含み、該VWFリンカーは、(i)第VIII因子(FVIII)からのa2領域、(ii)FVIIIからのa1領域、(iii)FVIIIからのa3領域、(iv)X-V-P-R(配列番号3)及びPAR1非活性部位相互作用モチーフを含み、Xが脂肪族アミノ酸であるトロンビン切断部位、(v)それらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、FVIII活性は、aPTTアッセイまたはROTEMアッセイによって測定される。
IV. 薬学的組成物
本発明のキメラ分子を含有する組成物は、好適な薬学的に許容される担体を含有し得る。例えば、それらは、作用部位に送達するように設計された調製物への活性化合物の処理を促進する賦形剤及び/または助剤を含有し得る。
本発明のキメラ分子を含有する組成物は、好適な薬学的に許容される担体を含有し得る。例えば、それらは、作用部位に送達するように設計された調製物への活性化合物の処理を促進する賦形剤及び/または助剤を含有し得る。
該薬学的組成物を、大量注射による非経口投与(すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内)のために製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル内、または添加保存料とともに複数回投与容器内に存在し得る。該組成物は、油性もしくは水性ビヒクル内の懸濁液、溶液、または乳濁液としてそのような形態をとることができ、かつ懸濁化剤、安定剤、及び/または分散剤などの調合剤を含有することができる。代替的に、活性成分は、好適なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない水を用いた構成のために粉末形態であり得る。
非経口投与のための好適な製剤はまた、水溶性形態にある活性化合物、例えば、水溶性の塩、の水溶液も含む。加えて、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性注射懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及びデキストランを含む、懸濁液の粘性を増加させる物質を含有してもよい。任意に、該懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。リポソームもまた、細胞または間質空間への送達のために本発明の分子をカプセル化するために使用され得る。例となる薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、水、生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等である。いくつかの実施形態において、該組成物は、等張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含む。他の実施形態において、該組成物は、保存可能期間もしくは活性成分の有効性を高める、湿潤剤などの薬学的に許容される物質、または湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤もしくは緩衝剤などの少量の補助物質を含む。
本発明の組成物は、例えば、液体(例えば、注射用かつ注入可能溶液)、分散液、懸濁液、半固体及び固体剤形を含む、様々な形態にあってもよい。好ましい形態は、投与及び治療適用の様式に依存する。
該組成物は、溶液、ミクロ乳濁液、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。滅菌注射用溶液は、適切な溶媒内で必要とされる量の活性成分を、必要であれば上に列挙した成分の1つまたは組み合わせとともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性成分を、塩
基性分散媒、及び上に列挙したものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて前もって滅菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分を産する真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを該組成物内に含むことによってもたらすことができる。
基性分散媒、及び上に列挙したものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて前もって滅菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分を産する真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを該組成物内に含むことによってもたらすことができる。
活性成分を、徐放性製剤または装置を用いて製剤化することができる。そのような製剤または装置の例としては、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系が挙げられる。生物分解可能な、生物的適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤及び装置の調製のための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978を参照。
注射デポ製剤は、ポリラクチド-ポリグリコリドなどの生物分解可能ポリマー中で薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作成することができる。薬物のポリマーに対する比率、及び用いられるポリマーの性質に応じて、薬物放出率を制御することができる。他の例となる生物分解可能ポリマーは、ポリオルトエステル及びポリアンヒドリドである。デポ注射用製剤はまた、リポソームまたはミクロ乳濁液中に薬物を封入することによって調製することができる。
補足的活性化合物を該組成物に組み込むことができる。一実施形態において、本発明のキメラ分子は、別の凝固因子、またはその変異体、断片、類似体、もしくは誘導体を用いて製剤化される。例えば、凝固因子としては、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子、第XIII因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フォンヴィレブランド因子、もしくは組み換え可溶性組織因子(rsTF)、または前述のいずれかの活性化形態が挙げられるが、これらに限定されない。止血薬の凝固因子はまた、抗繊維素溶解薬、例えば、イプロシン-アミノ-カプロン酸、トラネキサム酸も含むことができる。
投薬計画を、最適な所望の反応を提供するために調整してもよい。例えば、単一の丸薬を投与してもよく、いくつかに分割された投与量を、時間をかけて投与してもよく、または投与量を治療状況の要求によって示されるように比例的に減少または増加させてもよい。投与の容易性及び投薬量の均一性のために単位剤形で非経口組成物を製剤化することは有利である。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.1980)を参照。
活性化合物に加え、液体剤形は、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステルなどの不活性成分を含有してもよい。
好適な薬学的担体の非限定的な例はまた、Remington’s Pharmaceutical Sciences by E.W.Martinにも記載される。賦形剤
のいくつかの例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。該組成物はまた、pH緩衝試薬、及び湿潤剤または乳化剤を含有することもできる。
のいくつかの例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。該組成物はまた、pH緩衝試薬、及び湿潤剤または乳化剤を含有することもできる。
経口投与のために、該薬学的組成物は、従来の手法によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。該組成物はまた、液体、例えば、シロップまたは懸濁液として調製することもできる。該液体は、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂)、乳化剤(レシチンまたはアカシア)、非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画した植物油)、及び保存剤(例えば、メチル、またはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸もしくはソルビン酸)を含むことができる。該調製物はまた、香味剤、着色剤、及び甘味剤も含むことができる。代替的に、該組成物は、水または別の好適なビヒクルを用いた構成のための乾燥製品として存在し得る。
口腔投与のため、該組成物は、従来のプロトコルに従う錠剤または舐剤の形態をとってもよい。
吸入による投与のため、本発明に従って使用するための化合物は、賦形剤を伴ってもしくは伴わずに噴霧されるエアロゾルの形態で、または任意に噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素もしくは他の好適なガスを伴う加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で、簡便に送達される。加圧されるエアロゾルの場合には、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のための、例えば、ゼラチン、のカプセル剤及びカートリッジは、該化合物の粉末混合物、及びラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースを含有して製剤化され得る。
該薬学的組成物はまた、例えば、ココアバターまたはグリセリドなどの他の従来の坐薬ベースを含んで、坐薬または停留浣腸として直腸投与するために製剤化され得る。
V.遺伝子療法
本発明のキメラ分子は、哺乳類、例えば、ヒト患者内で、インビボで産生され得、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、または腸腰筋鞘における出血から選択される出血性疾患もしくは障害の治療に対する遺伝子療法アプローチを使用することは、治療に有益である。一実施形態において、出血性疾患または障害は、血友病である。別の実施形態において、出血性疾患または障害は、血友病Aである。これは、好適な発現制御配列に作動可能に結合される好適なキメラ分子コード核酸の投与に関与する。ある特定の実施形態において、これらの配列は、ウイルスベクター内に組み込まれる。そのような遺伝子療法のために好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターであり得る。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、そのE1遺伝子またはE3遺伝子内に欠失を有する。アデノウイルスベクターが使用されるとき、哺乳類は、選択可能マーカー遺伝子をコードする核酸に曝露されない場合がある。他の実施形態において、該配列は、当業者に公知の非ウイルス性ベクター内に組み込まれ
る。
本発明のキメラ分子は、哺乳類、例えば、ヒト患者内で、インビボで産生され得、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、または腸腰筋鞘における出血から選択される出血性疾患もしくは障害の治療に対する遺伝子療法アプローチを使用することは、治療に有益である。一実施形態において、出血性疾患または障害は、血友病である。別の実施形態において、出血性疾患または障害は、血友病Aである。これは、好適な発現制御配列に作動可能に結合される好適なキメラ分子コード核酸の投与に関与する。ある特定の実施形態において、これらの配列は、ウイルスベクター内に組み込まれる。そのような遺伝子療法のために好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターであり得る。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、そのE1遺伝子またはE3遺伝子内に欠失を有する。アデノウイルスベクターが使用されるとき、哺乳類は、選択可能マーカー遺伝子をコードする核酸に曝露されない場合がある。他の実施形態において、該配列は、当業者に公知の非ウイルス性ベクター内に組み込まれ
る。
VI. キメラタンパク質の使用方法
本発明は、本発明のキメラ分子を使用した、出血発症の頻度または程度の減少を必要とする対象における出血発症の頻度または程度の減少方法をさらに提供する。例となる方法は、治療有効量の本発明のキメラ分子を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の態様において、本発明は、本発明のキメラ分子を使用した、出血発症の発生の予防を必要とする対象における出血発症の発生の予防方法を含む。他の態様において、本発明の組み換えタンパク質をコードするDNAを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することができる。本発明のある特定の態様において、本発明のキメラ分子を発現する細胞を、それを必要とする対象に投与することができる。本発明のある特定の態様において、薬学的組成物は、(i)キメラ分子、(ii)キメラ分子をコードする単離された核酸、(iii)キメラ分子をコードする核酸を含むベクター、(iv)キメラ分子をコードする単離された核酸を含む細胞、及び/もしくはキメラ分子をコードする核を含むベクター、または(v)それらの組み合わせを含み、該薬学的組成物は許容される賦形剤もしくは担体をさらに含む。
本発明は、本発明のキメラ分子を使用した、出血発症の頻度または程度の減少を必要とする対象における出血発症の頻度または程度の減少方法をさらに提供する。例となる方法は、治療有効量の本発明のキメラ分子を、それを必要とする対象に投与することを含む。他の態様において、本発明は、本発明のキメラ分子を使用した、出血発症の発生の予防を必要とする対象における出血発症の発生の予防方法を含む。他の態様において、本発明の組み換えタンパク質をコードするDNAを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することができる。本発明のある特定の態様において、本発明のキメラ分子を発現する細胞を、それを必要とする対象に投与することができる。本発明のある特定の態様において、薬学的組成物は、(i)キメラ分子、(ii)キメラ分子をコードする単離された核酸、(iii)キメラ分子をコードする核酸を含むベクター、(iv)キメラ分子をコードする単離された核酸を含む細胞、及び/もしくはキメラ分子をコードする核を含むベクター、または(v)それらの組み合わせを含み、該薬学的組成物は許容される賦形剤もしくは担体をさらに含む。
出血発症は、血液凝固障害によって引き起こされる、またはそれに由来し得る。血液凝固障害は、凝血異常とも称され得る。一例において、本開示の薬学的組成物を用いて治療することができる血液凝固障害は、血友病またはフォンヴィレブランド病(vWD)である。別の例において、本開示の薬学的組成物を用いて治療することができる血液凝固障害は、血友病Aである。
いくつかの実施形態において、出血病態に関連した出血の種類は、関節血症、筋肉出血、口内出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
他の実施形態において、出血病態を患う患者は、例えば、外科的予防または週術期管理を含む、手術のための治療を必要としている。一例において、手術は、小手術または大手術から選択される。例となる外科的手技としては、抜歯、扁桃摘出術、鼠径ヘルニア切開術、滑膜切除術、開頭、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、関節置換手術(例えば、全膝置換、股関節置換等)、心臓手術、及び帝王切開術が挙げられる。
別の例において、対象は、第IX因子を用いて併用治療される。本発明の化合物は、FIXaを活性化することが可能であるため、FIXaを対象に投与する前にFIXaポリペプチドを予備活性化するために使用することができる。
本発明の方法は、予防的治療またはオンデマンド治療を必要とする対象において実施され得る。
本発明のキメラ分子を含む薬学的組成物は、例えば、局所(例えば、経皮もしくは眼)、経口、頬側、鼻腔、膣、直腸、または非経口投与を含む、投与の任意の適切な様式用に製剤化され得る。
非経口という用語は、本明細書において使用される場合、皮下、皮内、血管内(例えば、静脈内)、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、関節滑液嚢内、及び腹腔内注射、ならびに任意の同様の注射または注入技術を含む。該組成物はまた、例え
ば、懸濁液、乳濁液、徐放性製剤、クリーム、ゲル、または粉末でもあり得る。該組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて、坐薬として製剤化され得る。
ば、懸濁液、乳濁液、徐放性製剤、クリーム、ゲル、または粉末でもあり得る。該組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて、坐薬として製剤化され得る。
ここまで本発明を詳細に説明してきたが、例示の目的のみために本明細書に包含され、本発明を限定するようには意図されていない、以下の実施例を参照することによって同じことがより明確に理解されるであろう。本明細書内で言及されるすべての特許及び刊行物は、参照により明白に組み込まれる。
別途明記されない限り、本実施例を通して、以下の材料及び方法を使用した。
材料及び方法
一般に、本発明の実施は、別途示されない限り、化学、生物物理学、分子生物学、組み換えDNA技術、免疫学(特に、例えば、抗体技術)の従来技術、及び電気泳動における標準技術を用いる。例えば、Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)、Antibody
Engineering:A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty,Ed.,Irl Pr(1996)、Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow et al.,CS.H.L.Press,Pub.(1999)、及びCurrent Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubel et al.,John Wiley & Sons(1992)を参照。
一般に、本発明の実施は、別途示されない限り、化学、生物物理学、分子生物学、組み換えDNA技術、免疫学(特に、例えば、抗体技術)の従来技術、及び電気泳動における標準技術を用いる。例えば、Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)、Antibody
Engineering:A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty,Ed.,Irl Pr(1996)、Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow et al.,CS.H.L.Press,Pub.(1999)、及びCurrent Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubel et al.,John Wiley & Sons(1992)を参照。
実施例1.様々なVWF構築物のトロンビン媒介D’D3放出の評価
この実施例は、図2に記載された様々なVWF構築物の37℃でのトロンビン媒介D’D3放出の動態を評価する。Biocore実験を、VWFのD’D3ドメインとFcとの間に異なるトロンビン切断可能リンカーを含有するVWF-Fc構築物を用いて行った。最終目標は、VWF-Fcトロンビン消化から収集した情報を本明細書に記載されるようなFVIII-VWFヘテロ二量体に適用することである。すべてのVWF-D’D3構築物をチップ上で泳動させ、100~700RUの範囲のタンパク質の捕捉密度を達成した。VWF構築物をチップ上で捕捉した後、5U/mlのトロンビンを5分間表面にわたって注射した。切断可能構築物内のD’D3が放出される一方、Fcはチップに結合したままである。速度(RU/秒)と捕捉密度(RU)の対比を、図3及び4に示されるようにプロットした。切断速度は、開始捕捉密度に比例し、一方、傾斜は、各構築物のトロンビン切断に対する感受性の尺度を提供した。
この実施例は、図2に記載された様々なVWF構築物の37℃でのトロンビン媒介D’D3放出の動態を評価する。Biocore実験を、VWFのD’D3ドメインとFcとの間に異なるトロンビン切断可能リンカーを含有するVWF-Fc構築物を用いて行った。最終目標は、VWF-Fcトロンビン消化から収集した情報を本明細書に記載されるようなFVIII-VWFヘテロ二量体に適用することである。すべてのVWF-D’D3構築物をチップ上で泳動させ、100~700RUの範囲のタンパク質の捕捉密度を達成した。VWF構築物をチップ上で捕捉した後、5U/mlのトロンビンを5分間表面にわたって注射した。切断可能構築物内のD’D3が放出される一方、Fcはチップに結合したままである。速度(RU/秒)と捕捉密度(RU)の対比を、図3及び4に示されるようにプロットした。切断速度は、開始捕捉密度に比例し、一方、傾斜は、各構築物のトロンビン切断に対する感受性の尺度を提供した。
図3は、VWF-052(リンカー領域内にトロンビン切断部位を有しない)が、予測どおりに、トロンビンによって切断されないことを示す。VWF-039(PAR1部位を有するLVPR)の速度は、FVIII切断速度(データは示されない)に匹敵する。このため、VWF-039は、Fcからの完全なD’D3放出のためのベンチマークとして機能した。VWF-039に関して、様々なVWF-Fc構築物の傾斜の比率が、トロンビン切断の効率を決定するために使用された。VWF-039(PAR1部位を有するLVPR)は、VWF-031(LVPR)よりもおよそ70~80倍速くトロンビンで切断される。VWF-51(ALRPRVV)は、VWF-031(LVPR)よりも1.8倍速く切断される。LVPR部位に沿って288XTENを含有するVWF-034は、VWF-031と比較して遅い切断を示した。
VWF-Fc構築物をまた、リンカー領域内のFVIIIタンパク質の異なる酸性領域(a1、a2、及びa3)を導入することによって作製した。D’D3とFc領域との間にa2領域を含有するVWF-055は、VWF-039構築物と同様のトロンビン切断を示した。図4に示されるように、VWF-054(a1領域)及びVWF-056(a3領域)は、約5分の1減少したトロンビン切断を示した。
図5は、異なるVWF構築物のトロンビン切断曲線の傾斜値を示す。これらの結果から、FVIIIの酸性領域2(a2)は、高効率のトロンビン切断部位であると思われ、本明細書に記載されるようにFVIII-VWFヘテロ二量体に組み込んだ。
実施例2.HemA患者全血ROTEMアッセイを用いたFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体の止血能力の評価
異なるトロンビン切断可能リンカーを含むFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体を、止血に関する能力のためのHemAドナー全血ROTEM(回転トロンボエラストメトリ)アッセイ内で評価した。全血試料を、抗凝血剤としてクエン酸ナトリウムを用いて、重度血友病A出血性疾患を有するドナーから収集した。血液試料収集の40分後、異なるトロンビン切断可能リンカー、FVIII155/VWF031(48aa、LVPR部位)、FVIII155/VWF039(26aa、LVPR+PAR1部位)、FVIII155/VWF055(34aa、FVIIIからのa2)を含有するFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体変異体を、FVIII色素産生アッセイによって測定される通常の100%、30%、10%、及び3%の最終濃度まで全血試料中に希釈した。FVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体の添加直後、CaCl2の添加によって、ROTEM反応を開始した。凝固時間(試験の始めから2mmの振幅に達するまでの時間)を、装置によって記録し、試料中のFVIII濃度に対してプロットした(図6)。より能力の高いFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体ほどより速い凝固プロセスを誘導するため、より能力の低いFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体と比較してより短い凝固時間をもたらすという仮説を立てた。図6に示されるように、FVIII/VWF039ヘテロ二量体を添加した試料は、試験されたすべての濃度において最も短い凝固時間を有し、FVIII/VWF031ヘテロ二量体を添加した試料は、すべての濃度において最も長い凝固時間を有した。FVIII155/VWF055ヘテロ二量体を添加した試料の凝固時間は、中間であった。したがって、止血能力のランクは、FVIII155/VWF039>FVIII155/VWF055>FVIII155/VWF031である。3つの分子間の唯一の違いは、VWFタンパク質とFc領域との間のトロンビン切断可能リンカーであるため、この結果は、LVPR部位、及びPAR1非活性部位相互作用モチーフ、及びFVIIIのa2領域を含むリンカーが、LVPR部位のみよりも良好に機能することを示す。
異なるトロンビン切断可能リンカーを含むFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体を、止血に関する能力のためのHemAドナー全血ROTEM(回転トロンボエラストメトリ)アッセイ内で評価した。全血試料を、抗凝血剤としてクエン酸ナトリウムを用いて、重度血友病A出血性疾患を有するドナーから収集した。血液試料収集の40分後、異なるトロンビン切断可能リンカー、FVIII155/VWF031(48aa、LVPR部位)、FVIII155/VWF039(26aa、LVPR+PAR1部位)、FVIII155/VWF055(34aa、FVIIIからのa2)を含有するFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体変異体を、FVIII色素産生アッセイによって測定される通常の100%、30%、10%、及び3%の最終濃度まで全血試料中に希釈した。FVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体の添加直後、CaCl2の添加によって、ROTEM反応を開始した。凝固時間(試験の始めから2mmの振幅に達するまでの時間)を、装置によって記録し、試料中のFVIII濃度に対してプロットした(図6)。より能力の高いFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体ほどより速い凝固プロセスを誘導するため、より能力の低いFVIII/VWFD’D3ヘテロ二量体と比較してより短い凝固時間をもたらすという仮説を立てた。図6に示されるように、FVIII/VWF039ヘテロ二量体を添加した試料は、試験されたすべての濃度において最も短い凝固時間を有し、FVIII/VWF031ヘテロ二量体を添加した試料は、すべての濃度において最も長い凝固時間を有した。FVIII155/VWF055ヘテロ二量体を添加した試料の凝固時間は、中間であった。したがって、止血能力のランクは、FVIII155/VWF039>FVIII155/VWF055>FVIII155/VWF031である。3つの分子間の唯一の違いは、VWFタンパク質とFc領域との間のトロンビン切断可能リンカーであるため、この結果は、LVPR部位、及びPAR1非活性部位相互作用モチーフ、及びFVIIIのa2領域を含むリンカーが、LVPR部位のみよりも良好に機能することを示す。
実施例3.FVIII/VWFヘテロ二量体の活性の評価
FVIII-XTEN/VWFヘテロ二量体構築物を、3つのプラスミド、第1の発現FVIII-XTEN-Fc、第2の発現VWF-XTEN-Fc、及び第3の発現PACE、を使用してHEK293F細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションには、ポリエチレンイミン(PEI)標準プロトコルを使用し、トランスフェクションの5日後、組織培地を採取した。FVIII-VWFヘテロ二量体の様々な組み合わせを、培地から精製した。精製したタンパク質の活性を、標準プロトコルを使用して、色素産生(二段階)及びaPTT(一段階)の双方の凝固アッセイで試験した。FVIIIとFcとの間、またはD’D3とFcとの間へのFVIIIの酸性領域2(a2)の導入(表7A及び図7に示される)が、表7Cに示されるように、FVIII-VWFヘテロ二量体のaPTT活性を改善した。例えば、FVIII169/VWF059ヘテロ二量体は、D’D3-Fcリンカー領域内にa2トロンビン切断部位を有し、表7Cに示されるよう
にD’D3Fcリンカー内にLVPRトロンビン部位を含有するFVIII169/VWF057よりも良好なaPTT活性を有する。
FVIII-XTEN/VWFヘテロ二量体構築物を、3つのプラスミド、第1の発現FVIII-XTEN-Fc、第2の発現VWF-XTEN-Fc、及び第3の発現PACE、を使用してHEK293F細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションには、ポリエチレンイミン(PEI)標準プロトコルを使用し、トランスフェクションの5日後、組織培地を採取した。FVIII-VWFヘテロ二量体の様々な組み合わせを、培地から精製した。精製したタンパク質の活性を、標準プロトコルを使用して、色素産生(二段階)及びaPTT(一段階)の双方の凝固アッセイで試験した。FVIIIとFcとの間、またはD’D3とFcとの間へのFVIIIの酸性領域2(a2)の導入(表7A及び図7に示される)が、表7Cに示されるように、FVIII-VWFヘテロ二量体のaPTT活性を改善した。例えば、FVIII169/VWF059ヘテロ二量体は、D’D3-Fcリンカー領域内にa2トロンビン切断部位を有し、表7Cに示されるよう
にD’D3Fcリンカー内にLVPRトロンビン部位を含有するFVIII169/VWF057よりも良好なaPTT活性を有する。
同様に、FVIIIとFcとの間へのa2領域の組み込みは、表7Bに示されるように、改善されたFVIII286/VWF059及びFVIII286/VWF062の色素産生とaPTTの比によって明らかなように、ヘテロ二量体の一段階凝固活性を増加させた。
実施例4:HemAマウス尾切断出血モデルにおけるFVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fcヘテロ二量体の急性効果
異なるトロンビン切断可能リンカーを含有するヘテロ二量体の急性効果を、HemAマウス尾切断出血モデルを使用して評価した。
異なるトロンビン切断可能リンカーを含有するヘテロ二量体の急性効果を、HemAマウス尾切断出血モデルを使用して評価した。
8~12週齢のオスのHemAマウスを、5つの治療群に無作為に分け、それぞれSQ
BDD-FVIII、rFVIII169/VWF034、rFVIII169/VWF057、rFVIII169/VWF059、またはビヒクル溶液の一回の静脈内投与で治療した。FVIIIの発症時治療を模倣するために(正常なFVIII血漿レベルの50~100%を再構成するため)、選択したFVIII治療用量は、FVIII aP
TT活性によって測定される、75IU/kgである。この用量レベルでは、すべての試験FVIII変異体は、投与後5分で正常なマウス血漿FVIII活性の約70%を再構成することになる。
BDD-FVIII、rFVIII169/VWF034、rFVIII169/VWF057、rFVIII169/VWF059、またはビヒクル溶液の一回の静脈内投与で治療した。FVIIIの発症時治療を模倣するために(正常なFVIII血漿レベルの50~100%を再構成するため)、選択したFVIII治療用量は、FVIII aP
TT活性によって測定される、75IU/kgである。この用量レベルでは、すべての試験FVIII変異体は、投与後5分で正常なマウス血漿FVIII活性の約70%を再構成することになる。
この尾切断手順は以下のように行った。簡単に言うと、尾損傷の前にマウスに50mg/kgのケタミン/0.5mg/kgのデクスメデトミジンの混合物で麻酔をかけ、体温の維持を助けるために37℃の加熱パッド上に置いた。次いで、マウスの尾を37℃の生理的食塩水に10分間浸漬し、支脈を拡張させた。血管拡張後、FVIII変異体またはビヒクル溶液を、尾の血管を介して注射し、次いで、投与後5分で直刃11番の外科用メスを使用して尾の末端5mmを切断した。流血を、13mlの37℃生理的食塩水中に30分間収集し、失血量を採血管の重量変化により決定した:失血量=(収集管最終重量-開始重量+0.10)ml。統計分析を、t検定(コルモゴロフ-スミルノフ検定)、及び一元配置ANOVA(クラスカル-ウォリス検定、事後検定:Dunns多重比較検定)を使用して行った。
本研究における各個々の動物からの失血量を図8にプロットした。失血量の著しい減少は、ビヒクル処理された動物(p<0.05、表8)と比較してすべてのFVIII治療群で観測された。同様の失血減少が、BDD-FVIII治療(p>0.5、表8)と比較してすべてのヘテロ二量体治療群から観測され、ヘテロ二量体分子がオンデマンド治療にSQ BDD-FVIIIと同じだけ有効である可能性を提示した。
pSYN VWF057ヌクレオチド配列(リンカー内にLVPRトロンビン部位を有するVWF D’D3-Fc)(配列番号79)
pSYN VWF057タンパク質配列(リンカー内にLVPRトロンビン部位を有するVWF D’D3-Fc):太字下線の部分は、リンカー領域を含有するトロンビン切断可能LVPRを示す(配列番号80)
pSYN VWF059ヌクレオチド配列(リンカー内に酸性領域2(a2)トロンビン部位を有するVWF D’D3-Fc)(配列番号81)
pSYN VWF059タンパク質配列(リンカー内にLVPRトロンビン部位を有するVWF D’D3-Fc)-太字下線部分は、a2領域を示す(配列番号82)
pSYN VWF062ヌクレオチド配列(リンカー内にトロンビン部位を有しないVWF D’D3-Fc)(配列番号83)
pSYN VWF062タンパク質配列(リンカー内にトロンビン部位を有しないVWF
D’D3-Fc)(配列番号84)
pSYN FVIII 286ヌクレオチド配列(FVIIIとFcとの間に追加のa2領域を有するFVIII-Fc)(配列番号85)
pSYN FVIII286タンパク質配列(FVIIIとFcとの間に追加のa2領域を有するFVIII-Fc、太字及び下線で示される)(配列番号86)
FVIII169ヌクレオチド配列(配列番号87)
FVIII169タンパク質配列(配列番号88)
VWF034ヌクレオチド配列(配列番号91)
VWF034タンパク質配列(配列番号92)
pSYN VWF057タンパク質配列(リンカー内にLVPRトロンビン部位を有するVWF D’D3-Fc):太字下線の部分は、リンカー領域を含有するトロンビン切断可能LVPRを示す(配列番号80)
pSYN VWF059ヌクレオチド配列(リンカー内に酸性領域2(a2)トロンビン部位を有するVWF D’D3-Fc)(配列番号81)
pSYN VWF059タンパク質配列(リンカー内にLVPRトロンビン部位を有するVWF D’D3-Fc)-太字下線部分は、a2領域を示す(配列番号82)
pSYN VWF062ヌクレオチド配列(リンカー内にトロンビン部位を有しないVWF D’D3-Fc)(配列番号83)
pSYN VWF062タンパク質配列(リンカー内にトロンビン部位を有しないVWF
D’D3-Fc)(配列番号84)
pSYN FVIII 286ヌクレオチド配列(FVIIIとFcとの間に追加のa2領域を有するFVIII-Fc)(配列番号85)
pSYN FVIII286タンパク質配列(FVIIIとFcとの間に追加のa2領域を有するFVIII-Fc、太字及び下線で示される)(配列番号86)
FVIII169ヌクレオチド配列(配列番号87)
FVIII169タンパク質配列(配列番号88)
VWF034ヌクレオチド配列(配列番号91)
VWF034タンパク質配列(配列番号92)
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的性質を完全に明らかにするものであるため、当該技術分野内の知識を適用することによって、当業者は、不要な実験をすることなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、容易に、そのような特定の実施形態を修正する及び/または様々な用途に適合させることができる。したがって、そのような適用及び修正は、本明細書に提示される教示及び指導に基づき、開示される実施形態の同等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書内の語法または用語は制限ではなく説明を目的としているため、本明細書の用語または語法は、教示及び指導に照らして当業者によって解釈されることを理解されたい。
本発明の他の実施形態は、本明細書の考察及び本明細書に開示される本発明の実施から、当業者に明らかとなろう。本明細書及び実施例は、例示的なものにすぎないと見なされることが意図され、本発明の真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。
本明細書内で引用されるすべての特許及び刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2013年6月28日出願の米国仮特許出願第61/840,872号の優先権の利益を主張するものである。上記出願の内容は、参照によってその全体が本明細書内に組み込まれる。
Claims (1)
- 本明細書の一部に記載の組成物、キメラ分子または方法。
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