NO345177B1 - Sammensetninger og fremgangsmåter for modulering av hemostase - Google Patents

Description

FAGOMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår fagområdene medisin og hematologi. Mer spesifikt, tilveiebringer oppfinnelsen nye koagulasjonsfaktor X/Xa-midler og fremgangsmåter for å bruke disse for å modulere koagulasjonskaskaden i pasienter med behov for det.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Flere publikasjoner og patentdokumenter er sitert gjennom hele beskrivelsen for å beskrive siste nytt som angår denne oppfinnelsen.

Koagulasjonsenzymene er trypsin-lignende enzymer som tilhører S1 peptidasefamilien av proteaser som har en kymotrypsin-lignende fold.

Koagulasjonsproteasene inneholder katalytiske domener som er svært homologe til hverandre og til den opprinnelige fordøyelsesserinproteasen. Den strukturelle homologien/identiteten er så stor (>70%) at enhetene i de katalytiske domenene av koagulasjonsenzymene er nummerert i henhold til de korresponderende enhetene i kymotrypsinogen.

Koagulasjonsenzymene sirkulerer i blod som inaktive forløpere, zymogener, som krever proteolytisk spalting for aktivering. Zymogenene besitter ~10,000-fold eller mindre proteolytisk aktivitet i forhold til serinproteasene fremstilt etter aktivering. Initering av koagulasjon på stedet for vaskulær skade fører til en serie av reaksjoner hvor et zymogen konverteres til en protease gjennom spesifikk proteolytisk spalting og former enzymet for den påfølgende reaksjonen. Dette kuliminerer i blodcelleaktivering og konvertering av løselig fibrinogen til uløselig fibrinogen og dermed dannelsen av koagelen. Overskudd proteaser fjernes ved reaksjon med sirkulerende proteaseinhibitorer som virker som ”selvmords”-substrater eller de som gjenkjenner de aktive enzymene. Således er proteolytisk aktivering av koagulasjonszymogenene en viktig regulerende funksjon i koagulasjonskaskaden.

Selv om noen av koagulasjonszymogenene er spaltet på to eller flere steder i deres respektive aktiveringsreaksjoner, krever dannelsen av proteasen spalting på ett enkelt sete. Spalting i dette setet og dets strukturelle konsekvenser vurderes på enkleste måte ved anvendelse av det homologe nummereringssystemet basert på kymotrypsinogen og det omfattende strukturelle arbeidet utført med trypsinogen og trypsin. Omdannelsen av zymogenet til serinprotease krever spalting etter Arg<15 >(typisk bindingen mellom Arg<15 >og Ile<16>) som typisk fjerner et aktiveringspeptid og eksponerer en ny N-terminus i det katalytiske domenet begynnende med Ile<16>. Ett eksempel er omdannelsen av faktor X til faktor Xa (se figurene 1 og 2). I trypsin og faktor Xa begynner den nye N-terminalsekvensen med Ile<16>- Val<17>-Gly<18>-Gly<19>. For andre koaguleringsenzymer er den nye N-terminalsekvensen en variant av samme tema. N-terminalsekvensen foldes så tilbake inn i det katalytiske domenet og settes inn i den N-terminale bindingskløften på en sekvensspesifikk måte som er referert til som ”molekylær seksualitet”. Se figur 2. Følgelig vil varianter med alternative N-terminalsekvenser vil sannsynligvis ikke gjennomgå ”molekylær seksualitet” på en sammenlignbar måte. Innsetting i N-terminalen fører til dannelsen av en saltbro mellom α-NH2-gruppene til Ile<16 >og Asp<194 >i det indre av det katalytiske domenet. Saltbrodannelse er forbundet med mange endringer i katalytisk domenestruktur, inkludert: rearrangering av de såkalte aktiveringsdomenene, vist i figur 3; dannelse av oksianion-hullet nødvendig for katalyse og dannelsen av et substratbindingssete. Disse endringene fører til modningen av den aktive serinproteasen. Hovedbidraget fra seksvensspesifikke interaksjoner av den nye N-terminusen gjennom molekylær seksualitet og saltbrodannelse til modningen av den aktive proteasen er tydelig fra følgende fakta: bakterielle proteaser som ikke krever spalting for aktivering utnytter en annen sidekjede inne i det katalytiske domenet for å danne saltbro med Asp<194>; trypsinogen kan aktiveres til en proteinaselignende konformasjon uten spalting men med ekstrem høy konsentrasjon av et Ile-Val dipeptid som settes inn i kløften, om enn svært inneffektivt; Val-Ile dipeptidet og andre varianter er langt mindre effektive; i tillegg er det to eksempler på bakterielle proteiner som aktiverer koagulasjonszymogener i fravær av spalting ved å bryte ned aktiveringsmekanismen via tilveiebringelse av deres egen N-terminus som settes inn i den N-terminale bindingskløften.

De strukturelle endringene skissert ovenfor fremskaffer en molekylær forklaring for omdannelsen av en zymogenforløper til en aktiv serinprotease. Imidlertid, ulikt trypsin som er fullt aktiv etter spalting ved Arg<15>, fungerer mange av koagulasjonsenzymene svært dårlig på deres proteinsubstrater. Selv om de generelt har fullt funksjonelle aktive seter og kan spalte små peptidylsubstrater, krever effektiv spalting av det biologiske substratet ofte et kofaktorprotein (figur 2). I disse tilfellene, øker kofaktorproteinene hastigheten på proteinsubstratspaltingen med flere tusenfold. Selv om funksjonsmekanismen til kofaktorproteinene gjenstår å bli løst, er det usannsylig at de fungerer ved å gjøre proteasen mer enzymlignende og derfor mer effektiv. Et hovedpoeng er at, med ett unntak, binder kofaktorene selektivt proteasen og ikke det korresponderende zymogenet. For eksempel, faktor Xa binder med høy affinitet til membranbundet FVa, mens zymogen faktorX ikke binder FVa.

Sun YM. Et al (Blood, vol.106, nr.12, sider 3811-3815, 2005) omhandler vitamin K-epoksidreduktase som signifikant forbedrer karboksylering i en cellelinje som overuttrykker faktor X.

Avhengig av pasientens tilstand kan det være ønskelig å utvikle endrede koagulasjonskaskadeproteiner som har økt eller redusert koagulasjonsfunksjon. Det er oppfinnelsens formål å fremskaffe slike proteiner for anvendelse som terapeutika.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Et aspekt omfatter en faktor Xa -variant som modulerer hemostase omfattende aminosyrer 41 til 179 og aminosyrer 235 til 488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5, og omfattende minst én substitusjonsmutasjon. Nevnte minst ene substitusjonsmutasjon inkluderer substitusjonen av Ile i posisjon 235 med en aminosyre valg fra gruppen bestående av Leu, Phe, Asp eller Gly.

Ile i posisjon 235 kan være substituert med Leu. Faktor Xa-varianten kan videre omfatte en substitusjonsmutasjon av Val i posisjon 236 eller Asp i posisjon 418. Val i posisjon 236 kan være Leu, Ala, eller Gly, eller Asp i posisjon 418 kan være Asn eller Glu. Sekvensen til posisjonene 235 til 237 kan være Leu-Val-Gly. Nevnte minst ene substitusjonsmutasjon kan bestå av substitusjonen av Ile i posisjon 235 med en aminosyre valgt fra gruppen bestående av Leu, Phe, Asp og Gly. Faktor Xa-varianten kan ha en lengre plasmahalveringstid enn villtypefaktor Xa. Nevnte villtypefaktor Xa kan bestå av aminosyrer 41 til 179 og 235 til 488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5.

Et annet aspekt omfatter en faktor Xa-variant som modulerer hemostase bestående av aminosyrer 41-179 og aminosyrer 235-488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5 og omfattende minst én substitusjonsmutasjon. Nevnte minst ene substitusjonsmutasjon inkluderer substitusjonen av Ile i posisjon 235 med en aminosyre valgt fra gruppen bestående av Leu, Phe, Asp og Gly.

Et annet aspekt omfatter en faktor Xa-variant bestående av aminosyrer 41-179 og aminosyrer 235-488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5. Ile i posisjon 235 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5 (posisjon 16 i kymotrypsinnummerering) er endret til Leu.

Et annet aspekt omfatter en farmasøytisk sammensetning omfattende faktor Xavarianten ifølge et hvilket som helst av de foregående aspektene i en biologisk kompatibel bærer.

Et annet aspekt omfatter en faktor Xa-variant ifølge et hvilket som helst av de tre første aspektene, hvor substratbinding av det aktive setet til nevnte faktor Xa-variant er lavere sammenliknet med villtypefaktor Xa og øker når nevnte faktor Xa-variant er bundet av faktor Va i protrombinasekomplekset. Nevnte villtypefaktor Xa består av aminosyrer 41 til 179 og 235 til 488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5.

Et annet aspekt omfatter en faktor Xa-variant ifølge et hvilket som helst av de tre første aspektene for anvendelse i behandling av en hemostaserelatert lidelse.

Nevnte lidelse kan være valgt fra gruppen bestående av hemofili A, hemofili B, koagulasjonsfaktormangel, blødning assosiert med skade, traume, trombose, trombocytopeni, slag, koagulopati, og disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC).

Et annet aspekt omfatter et isolert nukleinsyremolekyl omfattende en nukleinsyresekvens som koder for faktor Xa-varianten ifølge et hvilket som helst av de tre første aspektene. Nevnte nukleinsyresekvens også koder for et intracellulært, proteolytisk spaltingssete. Nevnte intracellulære, proteolytiske spaltingssete er mellom posisjoner 234 og 235 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5, eller erstatter aktiveringspeptidet.

Et annet aspekt omfatter et isolert nukleinsyremolekyl omfattende en nukleinsyresekvens som koder for et human faktor X (FX)-polypeptid. Nevnte FX-polypeptid omfatter minst én substitusjonsmutasjon i aminosyrer 41 til 179 og 235 til 488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5. Nevnte minst ene substitusjonsmutasjon inkluderer substitusjon av Ile i posisjon 235 med en aminosyre valgt fra gruppen bestående av Leu, Phe, Asp, og Gly. Nevnte nukleinsyresekvens koder for et intracellulært, proteolytisk spaltingssete. Nevnte intracellulære, proteolytiske spaltingssete er mellom posisjoner 234 og 235 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5, eller erstatter aktiveringspeptidet.

Ile i posisjon 235 kan være substituert med Leu. Nevnte FX-polypeptid kan videre omfatte minst én substitusjonsmutasjon av Val i posisjon 236 eller Asp i posisjon 418 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5. Faktor X-polypeptidet kan videre omfatte minst én modifikasjon valgt fra gruppen bestående av Val i posisjon 236 som kan være Leu, Ala eller Gly, og Asp i posisjon 418 som kan være Asn eller Glu. Nevnte FX-polypeptid kan omfatte en propeptidsekvens. Nevnte intracellulære, proteolytiske spaltingssete kan være et PACE/furin-spaltingssete.

Et annet aspekt omfatter en ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyremolekylet ifølge foregående aspekt operabelt bundet til en regulatorisk sekvens.

Ekspresjonsvektoren kan være valgt fra gruppen bestående av en adenovirusvektor, en andenovirusassosiert vektor, en retrovirusvektor, et plasmid, og en lentivirusvektor.

Et annet aspekt omfatter en vertscelle omfattende nukleinsyremolekylet ifølge dets aspekt operabelt bundet til en regulatorisk sekvens.

Nevnte vertsceller kan være CHO-celler.

Et annet aspekt omfatter en fremgangsmåte for å produsere aktivert faktor X (FXa) omfattende å inkubere vertscellen ifølge foregående aspekt og å rense FXa-en produsert derved.

Et annet aspekt omfatter en FXa produsert ifølge fremgangsmåten til foregående aspekt.

Et annet aspekt omfatter en aktivert faktor X (FXa) tilveiebragt ved proteolytisk spalting av faktor X-polypeptidet kodet av nukleinsyresekvensen til nukleinsyremolekylet ifølge dets aspekt.

Det beskrives sammensetninger og fremgangsmåter tilveiebragt for påvirkning av regulatoriske seter i FX-zymogen →protease transisjonsveien, for dermed drive fremstillingen av en mer ”zymogenlignende” FXa-art. Sammensetningene og fremgangsmåtene som beskrevet er effektive for å modulere hemostase i pasienter med behov for det.

Det beskriver å fremskaffe en variant faktor X/faktor Xa- zymogen/protease som modulerer hemostase. Fortrinnsvis, koder SEKV ID NR:2 for variant zymogen/protease, hvori nukleotidene1684-1695 av SEKV ID NR: 2 kan være enhver aminosyre med forbeholdet om at nukleotidene 1684-1686 ikke koder for Val eller Ala. Mer foretrukket, inneholder variant zymogen/proteasen minst en modifikasjon i SEKV ID NR:1 valgt fra gruppen bestående av a) Ile i posisjon 16 er Leu, Phe, Asp eller Gly; b) Val i posisjon 17 er Leu, Ala, eller Gly og c) Asp i posisjon 194 er Asn eller Glu. Nukleinsyrer kodende for variant zymogen/proteasene av oppfinnelsen er også vist, som er fremgangsmåter for anvendelse derav. Slike nukleotider kan fortrinnsvis kode for et intracellulært PACE/furinspaltingssete.

Det beskrives videre å ha en nukleinsyre sekvensen til SEKV ID NR: 2, hvori nukleotidene i posisjon 1684-1695 koder for aminosyrene valgt fra gruppen bestående av Leu-Val-Gly, Gly-Val-Gly, Ile-Ala-Gly, Phe-Val-Gly og Ile-Gly-Gly, omfatter nevnte nukleinsyre fortrinnsvis nukleotider i posisjon 2233-2235 som koder for en aminosyre valgt fra gruppen bestående av Asn eller Glu.

En farmasøytisk sammensetning omfattende faktor Xa-varianten som beskrevet i en biologisk kompatibel bærer er også fremskaffet. Det beskrives også å inkludere fremgangsmåter for behandling av en hemostaserelatert sykdom hos en pasient med behov for det, omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av variant faktor X/Xa-zymogen/proteasen inneholdende farmasøytiske sammensetninger som beskrevet heri. Slike fremgangsmåter skal være effektive i behandling av sykdommer hvor en prokoagulant er nødvendig og inkluderer, uten begrensning, hemofili A og B, hemofili A og B assosiert med inhibitoriske antistoffer, koagulasjonsfaktorrmangel, vitamin K-epoksidreduktase C1-mangel, gammakarboksylasemangel, blødning assosiert med traume, skade, trombose, trombocytopeni, slag, koagulopati, disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC); sykdom ved overantikoagulasjonsbehandling, Bernard Soulier syndrom, Glanzman tromblasteni, og storage pool-mangel.

Visse zymogen/protease-varianter kan være anvendelige i behandling av sykdommer hvor antikoagulasjon kreves. Slike sykdommer inkluderer, uten begrensning, trombose, trombocytopeni, slag og koagulopati.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1. Bearbeiding av faktor X. Faktor X syntetiseres med en signalsekvens og propeptid som fjernes før dets sekresjon. Faktor X er et zymogen og har ingen enzymaktivitet. FX omdannes til faktor Xa etter spalting ved Arg15-Ile16-bindingen og frigjørelse av et aktiveringspeptid (AP).

Figur 2. Omdannelse av zymogen til protease. Zymogen til protease-transisjonen for faktor X og kobling av faktor Xa i protrombinase (FXa, FVa, fosfolipid og kalsiumioner). Dette enzymet omdanner protrombin (II) til trombin (IIa).

Figur 3. Røntgenstrukturen av FXa. Det katalytiske domenet av FXa i standardorientering. Strukturelle regioner er merket sammen med viktige enheter. Hentet fra Brandstetter et al. (1966) J.Biol.Chem. 271:29988-29992.

Figur 4. SDS-PAGE analyse av FX/FXa-varianter. 4-12% SDS-PAGE geler ble kjørt enten under ikke-reduserende eller reduserende betingelser og så farget med Coomassie Blue.

Figur 5. Aminosyre- (SEKV ID NR: 1) og nukleinsyre- (SEKV ID NR:2) sekvenser av faktor Xa. Setene og aminosyreposisjonene for ønskede modifikasjoner i SEKV ID NR:1 er vist med uthevet skrift.

Figur 6. Faktor Xa-aktivitet i hemofili B plasma. Villtype FXa eller FXaI16L (2nM) ble tilsatt til hemofili B plasma og ved bestemte tidsintervaller ble prøvene fortynnet (0,1 nM) og analysert i en aPTT koaguleringsanalyse.

Figur 7. Korreksjon av aPPT. Faktor Xa-I16L (200 µg/kg; n = 7 mus) eller PBS (n = 4 mus) ble injisert i hemofili B mus (C57BL/6) via halevenen. 5 og 30 min etter injeksjon ble blod samlet og en aPPT-analyse utført. Den røde prikkete linjen representerer aPPT-verdien til normale C57Bl/6 dyr.

Figur 8. Hemostatisk vurdering etter haleklipp-analyse i hemofili B mus. Blodtap etter skade måles ved hemoglobininnholdet i saltvannet ved A525. Antall mus (Balb c) er; villtype (n = 7); HB-PBS (n = 6); og HB-FXaI16L (n = 7).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Proteolyse er et essensielt aspekt av blodkoagulasjon og danner basis for mange av mekanismene som regulerer normal hemostase. Prokofaktorer og zymogener kan ikke delta i noen betydelig grad i sine respektive makromolekylære enzymatiske komplekser. Dette indikerer at proteolytisk aktivering må resultere i egnede strukturelle endringer som fører til ekspresjon av seter som gir enzym, substrat og kofaktor bindingsevner. Mens prokofaktor- og zymogenaktivering har vært grundig studert, er sammenhengen mellom proteolyse og ekspresjonen av bindingsseter som gir funksjon ufullstendig forstått. Den foreliggende oppfinnelse fremskaffer modellsammensetninger og systemer som forklarer de molekylære mekanismene som ligger bak ekspresjonen av makromolekylære bindingsinteraksjoner som følger transisjoner fra zymogentilstanden.

Faktor X (FX)<1 >er et vitamin K-avhengig to-kjedet glykoprotein som spiller en sentral rolle i blodkoagulering (figur 1). Dette serinproteasezymogenet er et substrat for både de ytre (vevstromboplastin/FVIIa) og indre (FVIIIa/FIXa) tenaseenzymkompleksene som spalter Arg<15>-Ile<16 >scissilbindingen i FX, frigjør et 52-aminosyre aktiveringspeptid og genererer FXa. Faktor Xa er proteasen ansvarlig for omdannelsen av protrombin til trombin (figur 2). Selv om faktor Xa er en fullt ut kompetent protease og har det katalytiske maskineriet for spalting av protrombin, så er den en svært dårlig katalysator for denne reaksjonen. Dens tette bindingsinteraksjon med kofaktoren, faktor Va, på en membranoverflate øker grundig hastigheten av trombindannelse uten vesentlig å påvirke andre reaksjoner katalysert av faktor Xa. Endringer i N-terminalsekvensen (Ile-Val-Gly) etter Arg 15-spaltingssetet som fører til suboptimal molekylær seksualitet, er antatt å gi et ”zymogenlignende” Xa-derivat som har svekket, eller til og med ingen, proteolytisk aktivitet. Disse derivatene forventes ikke å bli utsatt for inhibering av plasma proteaseinhibitorer som antitrombin III og forventes ikke å interferere med initieringen av koagulasjon etter vaskulær skade, fordi de forventes ikke å binde TFPI særlig godt. Faktor Xa binder faktor Va sterkt, mens zymogen faktor X gjør det ikke. Således, zymogenlignende former av faktor Xa forventes å binde Va svakere, men være helt reddet ved tilstrekkelig høye kofaktorkonsentrasjoner og effektivt katalysere trombindannelse. Zymogenlignende former av faktor Xa med disse egenskapene forventes å virke som langlivede proteaser i sirkulasjon som ellers er døde men beholder evnen til å katalysere trombindannelse etter binding til faktor Va. De har potensiale å fungere som terapeutiske prokoagulanter som omgår mangler på andre koagulasjonsfaktorer i kaskaden, uten de skadelige effektene assosiert med infusjon av fullt funksjonell villtype FXa.

I. Definisjoner:

Flere betegnelser relaterende til de biologiske molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendt heri ovenfor og også i beskrivelsen og kravene.

Uttrykket ”variant zymogen/protease” referer til et modifisert FX-zymogen eller en FXa-protease som har blitt genetisk endret slik at dens proteaseaktivitet, når omdannet til FXa, er redusert eller ”zymogenlignende” i fravær av spesifikke kofaktorer (f.eks. bindingsaffiniteten for det aktive setet er lavere enn observert i villtypemolekylet). Denne affiniteten/aktiviteten er særlig gjenopprettet ved tilstedeværelse av egnede kofaktorer som inkluderer, uten begrensning faktor Va. Foretrukne seter for aminosyreendringer i det opprinnelige FX-molekylet inkluderer substitusjon av isoleucin i posisjon 16, substitusjon av valin i posisjon 17 og susbstitusjon av asparginsyre i posisjon 194, med forbehold om at aminosyren i posisjon 16 ikke er valin eller alanin.

Uttrykket ”hemostaserelaterte sykdommer” referer til blødersykdommer som hemofili A og B, hemofili A og B-pasienter med inhibitoriske antistoffer, mangel på koagulasjonsfaktorer, VII, IX, og X, XI, V, XII, II, von Willebrands faktor, kombinert FV/FVIII-mangel, vitamin K-epoksidreduktase C1-mangel, gammakarboksylasemangel; blødning assosiert med traume, skade, trombose, trombocytopeni, slag, koagulopati, disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC); overantikoagulasjon assoisert med heparin, lavmolekylært heparin, pentasakkarid, warfarin, småmolekylære antitrombotika (dvs. FXainhibitorer); og platesykdommer som Bernard Soulier syndrom, Glanzmanns trombasteni og storage pool- mangel. En hemostaserelatert sykdom kan også inkludere blødning relatert til trombotiske sykdommer som dyp venetrombose, trombose assosiert med kardiovaskulære sykdomstilstander eller maligniteter, trombose resultert fra faste katetre eller andre invasive kirurgiske prosedyrer og tromobose assosiert med autoimmune sykdommer som lupus. Zymogen/protease-variantene kan også fremskaffe nødvendig hemostase for pasienter med disseminert intravaskulær koagulasjon eller ødeleggende koagulopatier som oppstår fra flere sykdomstilstander.

Med referanse til nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen, er iblant betegnelsen ”isolert nukleinsyre” brukt. Denne betegnelsen, når anvendt for DNA, referer til et DNA-molekyl som er separert fra sekvenser som det umiddelbart er kontinuerlig med (i 5 ́- og 3 ́-retningene) i det naturlig forekommende genomet til organismen som det stammer fra. ”Isolert nukleinsyre” kan for eksemple omfatte et DNA eller cDNA-molekyl satt inn i en vektor, som et plasmid eller virusvektor, eller integrert i DNA-et

til en prokayot eller eukaryot.

Med respekt for RNA-molekylene ifølge oppfinnelsen, refererer betegnelsen ”isolert nukleinsyre” hovedsaklig til et RNA-molekyl kodet fra et isolert DNA-molekyl som definert ovenfor. Alternativt kan betegnelsen referer til ett RNA-molekyl som er tilstrekkelig separert fra RNA-molekyler som det ville være forbundet med i sin naturlige tilstand (dvs. i celler eller vev), slik at det finnes i en ”vesentlig ren” form (betegnelsen ”vesentlig ren” er definert nedenfor).

Med hensyn til protein, er iblant betegnelsen ”isolert protein” eller ”isolert og renset protein” brukt heri. Denne betegnelsen referer hovedsakelig til proteiner fremstilt ved ekspresjon av et isolert nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan denne betegnelsen referere til et protein som er tilstrekkelig separert fra andre proteiner som det naturlig ville assossiert med, for på den måten å være i ”vesentlig ren” from.

Betegnelsen ”promoterregion” refererer til de transkripsjonelle regulatoriske områdene i et gen, som kan finnes i den 5 ́- eller 3 ́-enden av det kodende området, eller i det kodende området, eller i introner.

Betegnelsen ”vektor” referer til et lite bærer-DNA-molekyl, i hvilket en DNA-sekvens kan settes inn i for overføring til en vertscelle hvor den vil replikeres. En ”ekspresjonsvektor” er en spesialisert vektor som inneholder et gen eller nukleinsyresekvens med de nødvendige regulatoriske områdene for ekspresjon i en vertscelle.

Betegnelsen ”operabelt bundet” betyr at de nødvendige regulatoriske sekvensene for ekspresjon av en kodende sekvens er plassert i DNA-molekylet i de gunstige posisjonene i forhold til den kodende sekvensen for å fremkalle ekspresjon av den kodende sekvensen. Denne samme definisjonen er iblant anvendt for arrangementet av kodende sekvenser og transkripsjonskontrollelementer (f.eks. promotere, enhancere og termineringselementer) i en ekspresjonsvektor. Denne definisjonen er også iblant anvendt for arrangementet av nukleinsyresekvenser av et første og et andret nukleinsyremolekyl hvori et hybrid nukleinsyremolekyl genereres.

Betegnelsen ”vesentlig ren” refererer til et preparat omfattende minst 50-60 vektprosent av den ønskede forbindelsen (f.eks. nukleinsyre, oligonukleotid, protein, etc.). Mer foretrukket omfatter preparatet minst 75 vektprosent, og mest foretrukket 90-99 vektprosent av den ønskede forbindelsen. Renhet er målt ved egnede fremgangsmåter for den ønskede forbindelsen (f.eks. kromatografiske fremgangsmåter, agarose eller polyakrylamid gelelektroforese, HPLC, og lignende).

Uttrykket ”hovedsaklig bestående av” betyr når referert til en spesiell nukleotidsekvens eller aminosyresekvens en sekvens som har egenskapene til en gitt SEKV ID NR:. Når for eksempel anvendt ved referanse til en aminosyresekvens, inkluderer uttrykket sekvensen i seg selv og molekylære modifikasjoner som ikke vil påvirke de grunnleggende og nye kjennetegnene for sekvensen.

Betegnelsen ”oligonukleotid”, som anvendt heri refererer til primere og prober ifølge foreliggende oppfinnelse, og er definert som et nukleinsyremolekyl bestående av to eller flere ribo-eller deoxyribonukleotider, fortrinnsvis mer enn tre. Den eksakte størrelsen av oligonukleotidet vil avhenge av flere faktorer og av den spesielle applikasjonen som oligonukleotidet brukes til.

Betegnelsen ”probe” som anvendt heri referer til et oligonukleotid, polynukleotid eller nukleinsyre, enten RNA eller DNA, enten naturlig forekommende som i en renset restriksjonsenzymreaksjon eller fremstilt syntetisk, som er i stand til å binde til eller spesifikt hybridisere med en nukleinsyre med sekvenser komplementære til proben. En probe kan enten være enkelttrådet eller dobbelttrådet. Den eksakte lengden av proben vil avhenge av mange faktorer, inkludert temperatur, kilde for proben og anvendelsen. For diagnostiske applikasjoner, avhengig av kompleksiteten på målsekvensen, inneholder for eksempel oligonukleotidproben typisk 15-25 eller flere nukleotider, selv om den kan inneholde færre nukleotider.

Probene heri er valgt ut til å være ”vesentlig” komplementære til forskjellige tråder av en spesiell målnukleinsyresekvens. Dette betyr at probene må være tilstrekkelige komplementære for å være i stand til å ”spesifikt hybridisere” eller binde til deres respektive måltråder under et sett predefinerte betingelser. Derfor trenger ikke probesekvensen å gjenspeile den nøyaktige komplementære sekvensen til målet. Et ikkekomplementært nukleotidfragment kan for eksempel bindes til 5 ́- eller 3 ́-enden til proben med resten av probesekvensen som komplementær til målsekvensen. Alternativt kan ikkekomplementære baser eller lengre sekvenser settes inn i proben, forutsatt at probesekvensen har tilstrekkelig komplementaritet med sekvensen til målnukleinsyren for spesifikt å binde til den.

Betegnelsen ”spesifikt hybridisere” referer til assosiasjonen mellom to enkelttrådede nukleinsyremolekyler med tilstrekkelig komplementær sekvens til å tillate slik hybridisering under vanlige predefinerte betingelser i fagmiljøet (iblant betegnet ”vesentlig komplementær”). Betegnelsen refererer særlig til hybridisering av et oligonukleotid med en vesentlig komplementær sekvens inne i et enkelttrådet DNA- eller RNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, til den betydelig utelukkelse av hybridisering til et oligonukleotid med enkelttrådede nukleinsyrer med ikke-komplementær sekvens.

Betegnelsen ”primer” som anvendt heri refererer til et oligonukleotid, enten RNA eller DNA, enten enkelttrådet eller dobbelttrådet, enten hentet fra et biologisk system, generert ved restriksjonsenzymfordøyelse, eller fremstilt syntetisk som, når satt i egnet miljø, er i stand til å fungere som en initiator av templatavhengig nukleinsyresyntese. Når presentert for en egnet nukleinsyretemplat, egnede nukleosidtrifosfatforløpere av nukleinsyrer, en polymerase, egnede kofaktorer og forhold som egnet temperatur og pH, kan primeren forlenges i dens 3 ́-ende ved tilsetting av nukleotider med aktiviteten til en polymerase eller lignende aktivitet og gi et primerekstensjonsprodukt.

Primeren kan variere i lengde avhengig av de enkelte forholdene og kravene for anvendelsen. I diagnostiske anvendelser er for eksempel oligonukleotidprimeren typisk 15-25 eller flere nukleotider lang. Primeren må være tilstrekkelig komplementær til ønsket templat for å forberede syntesen av det ønskede ekstensjonsproduktet, det vil si, være i stand til å binde til ønsket templattråd på en tilstrekkelig måte til å fremskaffe 3 ́-hydroxylhalvdelen av primeren i egnet juxtaposisjon for anvendelse i initieringen av syntese med en polymerase eller lignende enzym. Det kreves ikke at primersekvensen representerer en nøyaktig komplementær av ønsket templat. En ikke-komplementær nukleotidsekvens kan for eksempel bindes til 5 ́-enden av en ellers komplementær primer. Alternativt kan ikke-komplementære baser settes inn innenfor sekvensen til oligonukleotidprimeren, forutsatt at primersekvensen har tilstrekkelig komplementaritet med sekvensen til ønsket templat til funksjonelt å fremskaffe et templat-primerkompleks for syntesen av ekstensjonsproduktet.

Betegnelsen ”prosent identisk” er anvendt heri med referanse til sammenligning mellom nukleinsyre- eller aminosyresekvenser. Nukleinsyre- og aminosyresekvenser sammenlignes ofte med dataprogrammer som stiller opp sekvenser av nuklein- eller aminosyrer og således definerer forskjellene mellom de to sekvensene. Med hensyn til formålene til denne oppfinnelsen er sammeligning av nukleinsyresekvenser utført med GCG Wisconsin Package versjon 9.1, tilgjengelig fra Genetics Computer Group i Madison, Wisconsin. For å sammenligne sekvensidentitet benyttes heri for enkelhets skyld standardparametrene (gap creation penalty = 12, gap extension penalty = 4) spesifisert av progammet for å sammenligne sekvensidentitet. Alternativt kan Blastn 2.0 programmet fra National Center for Biotechnology Information (funnet på world wide web på ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:303-410) med anvendelse av en gap-oppstilling med standardparametre, anvendes for å bestemme graden av identitet og likhet mellom nukleinsyresekvenser og aminosyresekvenser.

II. Fremstilling av variant zymogen-protease kodende nukleinsyremolekyler og polypeptider.

A. Nukleinsyremolekyler

Nukleinsyremolekyler kodende for variant zymogen/proteasene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved bruk av rekombinant DNA-teknologimetoder. Tilgjengeligheten av nukleotidsekvensinformasjon tillater ved en rekke måter fremstilling av isolerte nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen. Nukleinsyresekvenser kodende for et zymogen/protease-polypeptid kan for eksempel isoleres fra egnede biologiske kilder ved bruk av standardprotokoller velkjente i fagmiljøet.

Nukleinsyrer ifølge foreliggende oppfinnelse kan bevares som DNA i enhver egnet kloningsvektor. I en foretrukket utførelsesform er kloner bevart i en plasmid kloning/ekspresjonsvektor, som pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), som formerer seg i en egnet E.coli vertscelle. Alternativt kan nukleinsyrene bevares i en vektor egnet for ekspresjon i mammalske celler. I tilfeller hvor postranlasjonelle modifikasjoner påvirker zymogen/protease-funksjon (f.eks. faktor Xa), er det foretrukket å uttrykke molekylet i mammalske celler.

I en utførelsesform kan nukleinsyrene kodende for faktor X zymogen-varianter videre modifiseres via innsetting av et intracellulært proteolytisk spaltingssete. For å uttrykke ”aktiverte” zymogenlignende FXa-varianter i mammalske celler kan et proteolytisk spaltingssete settes inn mellom posisjonene Arg15 og 16 i variant FX-zymogenet. Slike spaltingsseter inkluderer: Arg-Lys-Arg eller Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg. Disse spaltingssetene gjenkjennes effektivt av protaser (PACE/furinlignende enzymer) inne i cellen og fjernes. Dette resulterer i en prosessert variant FX(a) hvor tungkjeden nå begynner i posisjon 16 i molekylet. Introduksjon av dette spaltingssetet i nevnte posisjon vil tillate den intracellulære omdannelsen av FX til FXa.

I en annen utførelsesform kan hele det 52-aminosyre aktiveringspeptidet fjernes og det intracellulære protease-spaltingssetet introduseres på dets plass, som vil resultere i en variant FXa.

Til sist tillater disse typene av modifikasjoner sekresjon av den ”aktive” prosesserte formen av variant FX fra en celle som uttrykker den modifiserte variant FX. Ved sekresjon av den spaltede faktoren unngåes et behov for proteolytisk spalting under blodkoagulasjon eller etter isolering av proteinet.

Variant zymogen/protease-kodende nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen inkluderer cDNA, genomisk DNA, RNA og fragmenter derav som kan være enkelt- eller dobbelttrådet. Således fremskaffer denne oppfinnelsen oligonukleotider (sense eller antisense-tråder av DNA eller RNA) med sekvenser i stand til hybridisering med minst en sekvens eller et nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike oligonukleotider er nyttige som prober for å detektere zymogen/protease-ekspresjon.

B. Proteiner

Et fullengde eller variant zymogen/protease-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på en rekke måter, ifølge kjente fremgangsmåter. Proteinet kan renses ved immunaffinitetsrensing fra egnede kilder, f.eks. transformerte bakterielle eller animalske dyrkede celler, eller vev som uttrykker zymogen/protease. Men, dette er ikke en foretrukket fremgangsmåte på grunn av den sannsynligvis lille mengden av protein som er tilstede i en gitt celletype til enhver tid.

Tilgjengeligheten av nukleinsyremolekyler kodende for et variant zymogen/protease-polypeptid tillater fremstilling av zymogen/protease ved anvendelse av in vitro ekspresjonsmetoder kjente i fagmiljøet. Et cDNA eller gen kan for eksempel klones inn i en egnet in vitro transkripsjonsvektor som pSP64 eller pSP65 for in vitro transkripsjon, etterfulgt av cellefri translasjon i et egnet cellefritt translasjonssystem, som hvetekim- eller kanin-retikulocyttlysater. In vitro transkripsjon- og translasjonssystemer er kommersielt tilgjengelige, f.eks. fra Promega Biotech, Madison, Wisconsin eller BRL, Rockville, Maryland.

Alternativt, i følge en foretrukket utførelsesform, kan større mengder av zymogen/protease fremstilles ved ekspresjon i et egnet prokaryot eller eukaryot ekspresjonssystem. Deler eller hele DNA-molekylet kodende for variant faktor Xa kan for eksempel settes inn i en plasmidvektor tilpasset ekspresjon i en bakteriell celle, som E.coli eller en mammalsk celle som CHO eller HeLa celler. Alternativt, i en foretrukket utførelsesform, kan merkede fusjonsproteiner omfattende zymogen/protease fremstilles. Slike zymogen/protease-merkede fusjonsproteiner kodes for av deler av eller et helt DNAmolekyl, ligert i riktig leseramme til en nukleotidsekvens kodende for en del eller allt av et ønsket polypeptidmerke som settes inn i en plasmidvektor tilpasset ekspresjon i bakterielle celler, som E.coli eller en eukaryotisk celle som, men ikke begrenset til, gjær- og mammalske celler. Vektorer som de beskrevet ovenfor omfatter regulatoriske elementer nødvendige for ekspresjon av DNA i vertscellen plassert på en slik måte som tillater ekspresjon av DNA i vertscellen. Slike regulatoriske elementer nødvendige for ekspresjon inkluderer, men er ikke begrenset til, promotersekvenser, transkripsjonsinitieringssekvenser, og enhancersekvenser.

Variant zymogen/protease-proteiner fremstilt ved genekspresjon i et rekombinant prokaryotisk eller eukaryotisk system kan renses ifølge kjente fremgangsmåter på området. I en foretrukket utførelsesform kan et kommersielt tilgjengelig ekspresjons-/sekresjonssytem anvendes, hvorved det rekombinante proteinet utrykkes og deretter utskilles fra vertscellen, for lett å kunne renses fra det omgivende medium. Hvis ekspresjons-/sekresjonsvektorer ikke anvendes, involverer en alternativ fremgangsmåte rensing av det rekombinante proteinet med affinitetsseparasjon, som ved immunologisk interaksjon med antistoffer som binder spesifikt til det rekombinante proteinet eller nikkelkolonner for isolering av rekombinante proteiner merket med 6-8 histidinenheter i deres N-terminus eller C-terminus. Alternative merker kan omfatte FLAG-epitopen, GST eller hemagglutininepitopen. Slike fremgangsmåter blir ofte brukt av fagpersoner.

Zymogen/protease-proteiner fremstilt ved de tidligere nevnte fremgangsmåter, kan analyseres i henhold til standardprosedyrer. Slike proteiner kan for eksempel utsettes for aminosyresekvensanalyse, i henhold til kjente fremgangsmåter.

Som diskutert ovenfor, er en passende måte å fremstille et polypeptid ifølge den foreliggende oppfinnelse å uttrykke nukleinsyrer som koder for det, ved anvendelse av nukleinsyren i et ekspresjonssystem. En rekke nyttige ekspresjonssystemer for fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse er velkjente for fagpersoner.

Følgelig omfatter også den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid (som vist), fremgangsmåten inkluderer ekspresjon fra nukleinsyre kodende for polypeptidet (vanligvis nukleinsyre). Dette kan beleilig oppnås ved dyrking av en vertscelle, inneholdende en slik vektor, under egnede forhold som medfører eller tillater fremstilling av polypeptidet. Polypeptider kan også fremstillen i in vitro systemer, som i retikulocyttlysater.

III. Anvendelser av zymogen/protease-proteiner og zymogen/protease-kodende nukleinsyrer.

Variant zymogen/protease-nukleinsyrer kodende for polypeptider med endrede proteaseaktiviteter kan anvendes ifølge denne oppfinnelsen, som for eksempel terapeutiske og/eller profylaktise agenser (protein eller nukleinsyre) som modulerer blodkoagulasjonskaskaden. De foreliggende oppfinnerne har oppdaget at faktor X/Xa zymogen/protease-molekyler kan øke koagulasjonen og fremskaffe effektiv hemostase.

A. Variant zymogen/protease-polypeptider

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, kan variant zymogen/protease-polypeptider administreres til en pasient via infusjon i en biologisk kompatibel bærer, fortrinnsvis via intravenøs injeksjon. Variant zymogen/proteasene ifølge oppfinnelsen kan fortrinnsvis innkapsles i liposomer eller blandes med andre fosfolipider eller miceller for å øke stabiliteten til molekylet. Zymogen/protease kan administeres alene eller i kombinasjon med andre agenser kjent for å modulere hemostase (f.eks. faktor V, faktor Va eller derivater derav). En egnet sammensetning for å tilføre zymogen/proteasepolypeptider kan bestemmes av en lege etter vurdering av en rekke fysiologiske variable, inkludert, men ikke begrenset til, pasientens form og hemodynamiske tilstand. En rekke sammensetniger velegnet for ulike applikasjoner og adminstrasjonsmåter er velkjente i fagmiljøet og er beskrevet heri nedenfor.

Preparatet med den rensede faktor X/Xa-analogen inneholder en fysiologisk akseptabel matriks og er fortrinnsvis formulert som et farmasøytisk preparat. Preparatet kan formuleres ved anvendelse av stort sett tidligere kjente fagmetoder, det kan blandes med en buffer inneholdende salter, som NaCl, CaCl2, og aminosyrer, som glysin og/eller lysin, og i et pH-område fra 6 til 8. Inntil nødvendig, kan det rensede preparatet med faktor X/Xa-analogen lagres i form av en ferdig løsning eller i en lyofilisert eller dypfrosset form. Preparatet er fortrinnsvis lagret i en lyofilisert form og er oppløst til en visuell klar løsning ved anvendelse av en egnet rekonstitusjonsløsning.

Alternativt kan preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse også gjøres tilgjengelig som et flytende preparat eller som en dypfrosset væske.

Preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse er spesielt stabil, dvs. det kan tillates å være i oppløst form for en lengre periode før applisering.

Preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse som inneholder en faktor X-analog i kombinasjon med faktor XIa eller et derivat derav som er i stand til å aktivere faktor Xanalogen til faktor Xa, eller faktor Xa-analogen kan gjøres tilgjengelig i form av et kombinasjonspreparat inneholdende en container som inneholder faktor XIa som er immobilisert på en matriks, mulig i form av en miniatyrkolonne eller en sprøyte supplert med en protease, og en container inneholdende det farmasøytiske preparatet med faktor X-analogen. For å aktivere faktor X-analogen, kan for eksempel løsningen med faktor X-analogen presses over den immobiliserte proteasen. Under lagring av preparatet er løsningen med faktor X-analogen fortrinnsvis romlig separert fra proteasen. Preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan lagres i samme container som proteasen, men komponentene er romlig separert ved en impermeabel skillevegg som lett kan fjernes før administrasjon av preparatet. Løsningene kan også lagres i separate containere og bringes i kontakt med hverandre kun kort tid før administrasjon.

Faktor X-analogen kan aktiveres til faktor Xa kort tid før umiddelbar bruk, dvs. før administrasjonen til pasienten. Aktiveringen utføres ved å føre en faktor X-analog i kontakt med en immobilisert protease eller ved å blande løsninger inneholdende en protease, på den ene siden, og faktor X-analogen på den andre siden. Således er det mulig opprettholde de to komponentene separat i løsningen og blande dem ved hjelp av en egnet infusjonsinnretning hvor komponentene kommer i kontakt med hverandr når de passerer gjennom innretningen og dermed å medføre en aktivering i faktor Xa eller i faktor Xaanalogen. Pasienter mottar således en blanding av faktor Xa, og i tillegg, en serinprotease som er ansvarlig for aktiveringen. I denne sammenhengen, er det spesielt viktig å nøye følge med doseringen, siden den ekstra administreringen av en serinprotease også aktiverer endogen faktor X, som kan forkorte koagulasjonstiden.

Preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan gjøres tilgjengelig som et farmasøytisk preparat med faktor Xa-aktivitet i form av et enkomponentpreparat eller i kombinasjon med andre faktorer i form av et multikomponentpreparat.

Før fremstilling av det rensede proteinet til et farmasøytisk preparat, underkastes det rensede proteinet konvensjonelle kvalitetskontroller og tilpasses inn i en terapeutisk presentasjonsform. Under den rekombinante fremstillingen, testes det rensede preparatet særlig for fravær av cellulære nukleinsyrer så vel som nukleinsyrer som er utledet fra ekspresjonsvektoren, fortrinnsvis ved anvendelse av en fremgangsmåte som beskrevet i EP 0 714 987.

Et annen trekk ifølge denne oppfinnelsen angår å gjøre tilgjengelig et preparat som inneholder en faktor Xa-analog med en høy stabilitet og strukturell integritet og som, spesielt, er fri for inaktive faktor X/Xa-analogintermediater og autoproteolytiske degraderingsprodukter og som kan fremstilles ved aktivering av en faktor X-analog av typen beskrevet ovenfor og ved å formulere den inn i et egnet preparat.

Det farmasøytiske preparatet kan inneholde doser mellom 10-1000 µg/kg, mer foretrukket mellom cirka 10-250 µg/kg og mest foretrukket mellom 10 og 75 µg/kg, hvor 40 µg/kg av variant faktor X-polypeptid blir særlig foretrukket. Pasienter med en blødning kan behandles øyeblikkelig ved presentasjon på klinikken. Pasienten kan alternativt motta en bolusinfusjon hver time til hver tredje time, eller hvis tilstrekkelig bedring er observert, en daglig infusjon av faktor Xa-varianten beskrevet heri.

B. Zymogen/protease-kodende nukleinsyrer

Zymogen/protease-kodende nukleinsyrer kan anvendes for en rekke formål i henhold til den foreliggende oppfinnelse. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er et hjelpemiddel for levering av nukleinsyre (dvs. en ekspresjonsvektor) fremskaffet for modulering av blodkoagulasjon hvori ekspresjonsvektoren omfatter en nukleinsyresekvens kodende for et variant zymogen/protease-polypeptid, eller et funksjonelt fragment derav som beskrevet heri.

Administrasjon av zymogen/protease-kodende ekspresjonsvektorer til en pasient resulterer i ekspresjon av zymogen/protease-polypeptid som tjener til å endre koagulasjonskaskaden. I henhold til den foreliggende oppfinnelse, kan en zymogen/protease-kodende nukleinsyresekvens kode for et zymogen/protease-polypeptid som beskrevet heri hvis ekspresjon øker hemostasen. I en foretrukket utførelsesform, koder en zymogen/proteasenukleinsyresekvens for en human faktor Xa-polypeptidvariant.

Ekspresjonsvektorer omfattende variant X/Xa-zymogen/proteasenukleinsyresekvenser kan administreres alene, eller i kombinasjon med andre molekyler anvendelige for modulering av hemostase. Ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan ekspresjonsvektorene eller kombinasjoner av terapeutiske agenser administreres til pasienten alene eller i en farmasøytisk akseptabel eller biologiske kompatible sammensetninger.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er ekspresjonsvektoren omfattende nukleinsyresekvenser kodende for variant zymogen/protease-variantene en viral vektor. Virale vektorer som kan anvendes i den foreliggende oppfinnelse inkluderer, men er ikke begrenset til, adenovirus-vektorer (med eller uten vevsspesifikke promoterer/enhancere), adenoassosierte virus (AAV)-vektorer av multiple serotyper (f.eks. AAV-2, AAV-5, AAV-7 og AAV8) og hybride AAV-vektorer, lentivirusvektorer og pseudotype lentivirusvektorer [f.eks. Ebolavirus, vesikulær stomatittvirus (VSV) og felin immunodefektvirus (FIV)], herpes simplex virusvektorer, vaccinia virusvektorer og retrovirale vektorer.

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, er fremgangsmåter fremskaffet for adminstrasjonen av en viral vektor omfattende nukleinsyresekvenser kodende for en variant zymogen/protease, eller et funksjonelt fragment derav. Adenovirusvektorer av nytte i fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer fortrinnsvis minst de essensielle delene av adenovirus-vektor DNA. Som beskrevet heri, tjener ekspresjon av et variant zymogen/protease-polypeptid etter administrasjon av en slik adenovirus-vektor til å modulere hemostase. I sammenheng med faktor Xa-varianten beskrevet heri, forsterker slik administrasjon prokoagulasjonsaktiviteten til proteasen.

Rekombinante adenovirus-vektorer har bred nytte for en rekke genterapiapplikasjoner. Deres nytte for slike applikasjoner skyldes hovedsaklig den høye effektiviteten av in vivo genoverføring oppnådd i en rekke organbakgrunner.

Adenovirus-partikler kan bli brukt til å nytte som hjelpemidler for adekvat genoverføring. Slike virioner innehar mange gunstige kjennetegn for slike applikasjoner, inkludert: strukturelle kjennetegn relatert til å være et dobbelttrådet DNA ikke-innpakket virus og biologiske trekk som tropisme for det humane respirasjonssystemet og gastrointestinale traktus. Dessuten er adenovirus kjent for å infisere et bredt spekter av celletyper in vivo og in vitro ved reseptormediert endocytose. Med attestering til den overordnede sikkerheten til adenovirus-vektorer, fører infeksjon med adenovirus i mennesker til en minimal sykdomstilstand omfattende milde forkjølelseslignende symptomer.

På grunn av deres store størrelse (~36 kilobaser), er adenovirus-genomer velegnet for anvendelse som hjelpemidler for genterapi, fordi de kan romme innsettingen av fremmed DNA etter fjerningen av adenovirus-gener essensielle for replikering og ikkeessensielle områder. Slike substitusjoner gjør den virale vektoren svekket med hensyn til replikasjonsfunksjoner og infeksiøsitet. Viktig, adenovirus har vært anvendt som vektorer for genterapi og ekspresjon av heterologe gener.

For en mer detaljert diskusjon av anvendelse av adenovirusvektorer benyttet for genterapi, se Berkner, 1988, Biotechniques 6:616-629 og Trapnell, 1993, Advanced Drug Delivery Reviews 12:185-199.

Det er ønskelig å introdusere en vektor som kan fremskaffe, for eksempel, multiple kopier av et ønsket gen og derfor større mengder av produktet til det genet. Forbedrede adenovirus-vektorer og fremgangsmåter for fremstilling av disse vektorene har vært beskrevet i detalj i mange referanser, patenter, og patentsøknader, inkludert: Mitani og Kubo (2002, Curr Gene Ther.2(2):135-44); Olmsted-Davis et al. (2002, Hum Gene Ther.

13(11):1337-47; Reynolds et al. (2001, Nat Biotechnol. 19(9):838-42); U.S. Patent Nos. 5,998,205 (hvori tumorspesifikke replikeringsvektorer omfattende multiple DNA-kopier er fremskaffet); 6,100,242 (hvori en transgeninnsatt replikasjonsdefekt adenovirusvektor effektivt ble brukt i in vivo genterapi av perifer vaskulær sykdom og hjertesykdom); og International Patent Application Nos. WO 94/17810 og WO 94/23744.

For noen søknader kan en ekspresjonskonstruksjon videre omfatte regulatoriske elementer som tjener til å drive ekspresjonen i en spesiell celle eller vevstype. Slike regulatoriske elementer er kjente for fagpersoner og grundig diskutert i Sambrook et al. (1989) og Ausubel et al. (1992). Inkorporeringen av vevsspesifikke regulatoriske elementer i ekspresjonskonstruksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse fremskaffer i det minste delvis vevstropisme for ekspresjonen av variant zymogen/proteasene eller funksjonelle fragmenter derav. En E1-deletert type 5 adenovirus-vektor omfattende nukleinsyresekvenser kodende for variant zymogen/protease under kontrollen av en cytomegalovirus (CMV)-promoter kan for eksempel med fordel anvendes i fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen.

Eksemplariske fremgangsmåter for fremstilling av adenovirus-vektorer

Adenovirus-vektorer for rekombinant genekspresjon har vært produsert i den humane embryonale nyrecellelinjen 293 (Graham et al., 1977, J.Gen. Virol.36:59-72). Denne cellelinjen er tillatt for dyrking av adenovirus 2 (Ad2) og adenovirus 5- mutanter defekte i E1-funksjon fordi det omfatter den venstre enden av adenovirus 5 genomet og, derfor, uttrykker E1-proteiner. E1-gener integrert i det cellulære genomet til 293 celler uttrykkes på nivåer som letter anvendelsen av disse cellene som et ekspresjonssystem i hvilket å amplifisere virale vektorer hvor disse genene er deletert.293 cellene har i stor grad vært anvendt for isolering og propagering av E1-mutanter, for hjelper-uavhengig kloning, og for ekspresjon av adenovirusvektorer. Ekpresjonssystemer som 293 cellelinjen, fremskaffer derfor essensielle virale funksjoner i trans og muliggjør derved propagering av virale vektorer i hvilke eksogene nukleinsyresekvenser er erstattet av for E1-gener. Se Young et al. i The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York og London (1984), s.125-172.

Andre ekspresjonssystemer velegnet for propagering av adenovirus-vektorer er kjente for fagpersoner (f.eks. HeLa celler) og er anmeldt andre steder.

Inkludert i den foreliggende oppfinnelse er også en fremgangsmåte for å modulere hemostase, omfattende fremskaffelse av celler fra et individ med et hjelpemiddel for nukleinsyreoverføring kodende for et variant zymogen/protease-polypeptid og, tillate cellene å vokse under forhold hvori zymogen/protease-polypeptidet utrykkes.

Fra den foregående diskusjonen, kan det sees at zymogen/protease-polypetider, og zymogen/protease-polypeptider som uttrykker nukleinsyrevektorer kan anvendes i behandlingen av sykdommer assosiert med avvikende blodkoagulasjon.

C. Farmasøytiske sammensetninger

Ekspresjonsvektorene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan inkorporeres i farmasøytiske sammensetninger som kan overføres til et subjekt, for å tillate fremstilling av et biologisk aktivt protein (f.eks. et variant zymogen/protease-polypeptid eller funksjonelt fragment eller derivat derav). I en spesiell utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, kan farmasøytiske sammensetninger omfattende tilstrekkelig genetisk materiale til å sette en mottaker i stand til å fremstille en terapeutisk effektiv mengde av et variant zymogen/protease-polypeptid, påvirke hemostase i subjektet. Alternativt, som diskutert ovenfor, kan en effektiv mengde av variant faktor X-polypeptidet direkte infunderes i en pasient med behov for det. Sammensetningene kan administreres alene eller i kombinasjon med minst ett annet agens, slik som en stabiliserende forbindelse, som kan administreres i enhver steril, biokompatibel farmasøytisk bærer, inkludert, men ikke begrenset til, saltløsning, buffret saltløsning, dekstrose og vann. Sammensetningnene kan administreres alene til en pasient, eller i kombinasjon med andre agenser (f.eks. kofaktorer) som påvirker hemostase.

I foretrukne utførelsesformer, inneholder de farmasøytiske sammensetningene også en farmasøytisk akseptabel tilsetningl. Slike tilsetninger inkluderer enhver farmasøytisk agens som ikke selv induserer en skadelig immunrespons for individet som mottar sammensetningen, og som kan administreres uten upassende toksisitet. Farmasøytiske akseptable tilsetninger inkluderer, men er ikke begrenset til, væsker som vann, saltløsning, glycerol, sukkere og etanol. Farmasøytiske akseptable salter kan også inkluderes deri, for eksempel, mineralsyresalter som hydroklorider, hydrobromider, fosfater, sulfater, og lignende; og salter av organiske syrer som acetater, propionater, malonater, benzoater, og lignende. I tillegg kan tilleggsstoffer, som fuktemiddel eller emulgerende agenser, pH-bufrede substanser, og lignende, presenteres i slike hjelpemidler. En grundig diskusjon av farmasøytiske akseptable tilsetninger er tilgjengelig i Remington ́s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., 18. utgave, Easton, Pa. [ 1990]).

Farmasøytiske formuleringer egnet for parenteral administrasjon kan formuleres i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologiske kompatible buffere som Hanks ́ løsning, Ringers løsning, eller fysiologisk bufret saltløsning. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde substanser som øker viskositeten til suspensjonen, som natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene fremstilles som egnede oljeinjeksjonssuspensjoner. Egnede lipofile løsningsmidler eller hjelpemidler inkluderer fete oljer som sesamolje, eller syntetiske fettsyreestere, som etyloleat eller triglyserider, eller liposomer. Fortrinnsvis kan suspensjonen også inneholde egnede stabilisatorer eller agenser som øker løseligheten av forbindelsene for å tillate fremstillingen av høykonsentrerte løsninger.

Den farmasøytiske sammensetningen kan fremskaffes som et salt og kan formes med mange syrer, inkludert men ikke begrenset til, hydrokloridsyre, svovelsyre, eddiksyre, melkesyre, vinsyre, eplesyre, ravsyre, etc. Salter har tendens til å være mer løselige i vandige eller andre protoniske løsningsmidler enn de korresponderende, frie baseformene. I andre tilfeller, kan det foretrukne preparatet være et lyofilisert pulver som kan inneholde enhver eller alle av de følgende: 1-50 mM histidin, 0,1 % - 2 % sukrose, og 2–7 % mannitol, i et pH-område på 4,5 til 5,5, som er kombinert med buffer før anvendelse.

Etter at farmasøytiske sammensetninger er fremstilt, kan de plasseres i en egnet container og merket for behandlig. For administrasjon av zymogen/protease-innholdene vektorer eller polypeptider, vil slik merking inkludere mengde, frekvens og fremgangsmåte for adminstrasjon.

Farmasøytiske sammensetninger egnet for anvendelse i oppfinnelsen inkluderer sammensetninger hvori de aktive ingrediensene finnes i en effektiv mengde for å oppnå den ønskede terapeutiske virkningen. Bestemmelse av en terapeutisk effektiv dose er vel innenfor evnen til en erfaren lege ved anvendelse av teknikkene og rettledningen fremskaffet i den foreliggende oppfinnelse. Terapeutiske doser vil avhenge av, blant andre faktorer, alderen og generelle forhold ved subjektet, alvorligheten av den avvikende blodkoagulasjonsfenotypen, og styrken av kontrollsekvensene som regulerer ekspresjonsnivåene av variant zymogen/protease-polypeptidet. Således, vil en terapeutisk effektiv mengde hos mennesker være i et relativt bredt område, som kan bestemmes av en lege basert på responsen til en individuell pasient på vektorbasert zymogen/proteasebehandling.

D. Administrasjon

Variant faktor X-polypeptidene, alene eller i kombinasjon med andre agenser kan infunderes direkte i en pasient i en egnet biologisk bærer som beskrevet heri ovenfor. Ekspresjonsvektorer ifølge den foreliggende oppfinnelse omfattende nukleinsyresekvenser kodende for variant zymogen/protease, eller funksjonelle fragmenter derav, kan administreres til en pasient ved en rekke måter (se under) for å oppnå og opprettholde et profylaktisk og/eller terapeutisk effektivt nivå av zymogen/protease-polypeptidet. En fagperson kan lett bestemme spesifikke protokoller for anvendelse av zymogen/proteasekodende ekspresjonsvektorer ifølge foreliggende oppfinnelse for terapeutisk behandling av en bestemt pasient. Protokoller for fremstillingen av adenovirus-vektorer og administrasjon til pasienter er beskrevet i U.S. Patent Nos.5,998,205; 6,228,646; 6,093,699; 6,100,242; og International Patent Application Nos. WO 94/17810 og WO 94/23744.

Variant zymogen/protease-kodende adenovirus-vektorer ifølge den foreliggende oppfinnelse kan administreres ved enhver kjent måte til en pasient. Direkte overføring av de farmasøytiske sammensetningene in vivo kan generelt utføres via injeksjon ved anvendelse av en konvensjonell sprøyte, selv om andre overføringsmåter som konveksjonsforsterket overføring er medregnet (Se f.eks. U.S. Pat.nr.5,720,720). I denne forbindelsen, kan sammensetningene leveres subkutant, epidermalt, intradermalt, intratekalt, intraorbitalt, intramukøst, intraperitonealt, intravenøst, intraarterielt, oralt, intrahepatisk eller intramuskulært. Andre fremgangsmåter for administrasjon inkluderer oral og pulmonal administrasjon, stikkpiller, og transdermale applikasjoner. En kliniker spesialisert i behandling av pasienter med blodkoagulasjonssykdommer kan bestemme den optimale administrasjonsveien for adenovirus-vektorer omfattende zymogen/proteasenukleinsyresekvenser basert på flere kriterier, inkludert, men ikke begrenset til: tilstanden til pasienten og hensikten med behandlingen (f.eks. forsterket eller redusert blodkoagulasjon).

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også AAV-vektorer omfattende en nukleinsyresekvens kodende for et variant zymogen/protease-polypeptid.

Lentivirus eller pseudotype-lentivirusvektorer omfattende en nukleinsyresekvens kodende for et variant zymogen/protease-polypeptid er også fremskaffet.

Nakent plasmid eller ekspresjonsvektorer omfattende en nukleinsyresekvens kodende for et variant zymogen/protease-polypeptid er også omfattet.

EKSEMPEL 1

VARIANT FAKTOR Xa ZYMOGEN/PROTEASE

Et kjennetegn for blodkoagulasjon er proteolytisk prosessering av forløpere til plasmaproteiner for å påvirke aktivering. Paradigmet til denne type aktiveringsmekanisme er zymogen til protease-transisjonen i den kymotrypsin-lignende serinproteasefamilien. Spalting av binding ved et meget konservert sete (Arg15-Ile16; kymotrypsinnummereringssystem) avdekker en ny N-terminus som fungeres som en intramolekylær ligand for Asp194 (figur 2). Denne nye saltbroen resulterer i eller assosieres med en konformasjonsendring og anordning av det såkalte ”aktiveringsdomenet”, overflatelooper inneholdende S1-spesifisitetslommen, oksianiongropen, autolyseloopen og bindingssetet for natrium (figur 3). Det er veldokumentert i trypsinsystemet at intern Ile16-Asp194 saltbrodannelse er allosterisk bundet til S1-spesifisitetssetet; det vil si at endringer i ett sete påvirker det andre setet og vice versa.

Basisprinsippene for zymogenet til å aktivere enzymtransisjon for serinproteaser på det strukturelle nivået er veldokumenterte, særlig for kymotrypsin og trypsin, og disse eksemplene tjener som paradigmet for serinproteasefamilien. Generelle aspekter kan oppsummeres som følgende (se figur 2): 1) strukturen (~80-85%) av zymogenet er relativt lik proteasen; 2) transisjon er initiert etter frigjøring av en meget konservert N-terminus (for eksempel, Ile16-Val-Gly-Gly19); 3) den nye frie α-aminogruppen (Ile16) blir begravet i et hydrofobt miljø og dets α-aminonitrogen danner en intern saltbro med Asp194; 4) posisjonen til Asp194 endres signifikant ved zymogenaktivering, roterer ~170 °; og 5) denne interne saltbroen resulterer i eller assosieres med en konformasjonsendring i det såkalte ”aktiveringsdomenet”, overflateeksponerte looper inneholdene enhetene 16-19, 142-153, 184-194 og 216-223; og delvis omfattende S1-spesifisitetssetet (nomenklatur av Schechter og Berger (1967) Biochem. Biophys. Res. Comm.43:694-702) og oksianiongropen. Flere studier indikerer at zymogenet og det modne enzymet eksisterer i en likevekt med Keq = ~10<8 >i favør av zymogenet. Bode og kolleger har elegant demonstrert at trypsinogen kan adoptere en aktiv trypsinlignende struktur ved sterk ligandbinding til S1-spesifisitetslommen eller egnede ligander med sterk affinitet til Ile16-kløften. Andre eksempler på denne induksjonen uten spalting av Arg/Lys15-Ile16-bindingen inkluderer bindingen av streptokinase til plasminogen, stafylokoagulase til protrombin, og et nylig beskrevet autoantistoff til protrombin (Madoiwa et al. (2001) Blood 97:3783-3789). Samlet indikerer disse studiene at serinproteaser kan, selv i deres zymogene former, adoptere proteaselignende funksjoner avhenging av ulike miljømessige forhold, dvs. sterk ligandbinding til zymogenet.

Det er velkjent at aktiveringen av FX resultere i vesentlige konformasjonsendringer i serinproteasedomenet som er forbundet med evnen til proteasen til å binde med mye sterkere affinitet til S1-rettede prober og membranbundet FVa (1-6). Den generelle molekylære mekanismen(e) som styrer transisjonen av serinproteaser er generelt antatt å følge det i trypsinsystemet. Dette behøver imidlertid ikke alltid å være tilfellet. Enkelttrådet tPa benytter en annen molekylær strategi for å opprettholde dets zymogenlignende tilstand (8-11). Analyse av zymogen/protease-par involvert i blodkoagulasjon, særlig FVII/FVIIa, indikerer at flere forskjeller eksisterer i denne transisjonen sammenlignet med trypsinsystemet (12). Mens flere strukturelle determinanter på FXa er del av det såkalte aktiveringsdomenet, er det nå uklart om dannelse av disse setene er direkte knyttet til zymogen til protease-transisjonen. En nylig beskrevet modell av zymogen FX foreslår imidlertid at flere at disse elementene kan være i uorden i zymogenet (13). Sammenligning av zymogenmodellen med det aktive enzymet avslører at enheter som utgjør Ca<2+ >(Asp70-Glu80), Na<+ >(Ala183-Asp194;Gly219-Gly226) og autolyselooper (Thr144-Arg150) undergår store endringer i deres faste holdepunkter etter zymogen til protease-transisjonen.

Siden det allerede er veldokumentert, i det minste for trypsinogen/trypsin, at S1-spesifisitetssetet og dannelsen av Ile16-Asp194 er allosterisk bundet, er det rimelig å fremstille en hypotese om at andre elementer av aktiveringsdomenet også er bundet til zymogen til protease-transisjonen. I det foreliggende eksempelet har vi utformet eksperimenter for å teste hypotesen om at destabilisering av den interne Ile16-Asp194 saltbroen ved å gjøre endringer i posisjon 16, 17 eller 194, endrer den aktive setekløften og gjør den resulterende varianten ”zymogenlignende”. Vi fremstilte også en hypotese om at disse endringene allosterisk ville modulere FVa-binding.

Materialer og fremgangsmåter

Ekspresjon av faktor Xa

Selv om det er flere rapporter i litteraturen om ekspresjon av rFX, har de fleste vært avhengige av trunkerte versjoner eller ikke fremskaffet adekvat karakterisering (15-20). Våre initielle forsøk på ekspresjon av rFX i HEK 293 celler resulterte i ekpresjonsnivåer i området 1-2 mg rFX/L i kondisjonert medium; imidlertid var kun 10-40 % av fremstilt materiale fullt γ-karboksylert (21). Det resterende materialet viste ingen γ-karboksylering. Vi utnyttet de ulike bindingsaffinitetene til vitamin K-avhengige polypeptider for karboksylasen og antok at siden protrombinpropeptidet viser den laveste affiniteten for karboksylasen, at bytte av propeptidet til FX (høyest affinitet) med det til protrombin kunne øke γ-karboksylering ved å tillate høyere substratomsetning (22, 23). Ved anvendelse av denne nye vektoren, ble stabile transfektanter av HEK 293 celler selektert, mangfoldigjort, og rFX renset ved immunoaffinitetskromatografi. Fosfatelusjoner fra hydroksyapatitt ble anvendt for å separere karboksylert materiale fra ukarboksylert materiale. Våre resultater, hentet nå fra over 30 stabile cellelinjer indikerer at i gjennomsnitt er ~80-90 % av rFX fullt γ-karboksylert sammenlignet med 10-40% ved anvendelse av det native FX-propeptidet. Disse resultatene er nylig publisert og denne strategien har siden blitt benyttet av minst ett annet laboratorium (24, 25). Således, ved anvendelse av dette nye ekspresjonssystemet fremstiller vi nå milligrammengder (15-25 mg av fullt γ-karboksylert rFX fra ~10 L kondisjonerte medier) av protein for detaljerte struktur-/funksjonsstudier.

Enzymanalyser

Enzymkonsentrasjoner vil bestemmes ved aktiv-setetitrering med ρ-nitrofenyl-ρguanidinobenzoat (IIa) eller fluorescein mono-ρ-guanidinobenzoat (FXa) (26, 27). FXa kromogenisk substrataktivitet, ved tilstedeværelse eller fravær av ulike inhibitorer, vil måles fra initale hydrolysehastigheter av Spectrozyme FXa, S-2222 eller S-2765 som tidligere beskrevet (14). Kinetiske parametre vil bestemmes ved minste kvadraters tilpassing av de initielle hastighetsdataene til egnede ligninger.

Fremstilling av FXa-varianter

FX-mutantene ble fremstilt ved anvendelse av Quick-change site-directed mutagenesis kit (Stratagene) og hele FX cDNA ble sekvensert for å bekrefte identiteten til produktet. De ulike plasmidene ble transient transfektert i HEK 293 celler ved anvendelse av Lipofektamin-2000.48 t etter tansfeksjon ble media samlet og FX-antigennivåer bestemt ved anvendelse av en FX-spesifikk ELISA og FXa-aktivitet vurdert ved kromogenanalyse før aktivering med RVV-X eller vevsfaktor FVIIa.

RESULTATER

Fremstilling av FXa-typer fordelt langs zymogen-protease-transisjonsveien er skissert i tabell 1. Resultatene av transient transfeksjonen indikerer at vi har fremstilt en serie av FXa-varianter med variable grader av aktivitet, fra ~25% til <1%. Vi antar at disse forskjellene i aktivitet sannsynlig reflekterer FX-varianter som er endret i varierende grader under zymogen til protease-transisjonen. Angitt annerledes, er den interne Ile16-Asp194 saltbroen stabilisert i varierende grad avhengig av aminosyrene i posisjonene 16, 17 eller 194. Vi har valgt tre av disse variantene (rFXaI16L, FXaI16G, FXaV17A) for videre karakterisering.

Tabell 1: Aktivering av ulike rFX-varianter med RVV-X pg TF-FVIIa

a Antigennivåene er beregnet fra en FX-spesifikk ELISA og uttrykt i nM FX

b FXa-aktivitetsnivåer er basert på hastigheten til peptidylsubstrathydrolyse etter aktivering av RVV-X eller TF-FVIIa av en gitt FX-variant og initielle hydrolysehastigher er sammenlignet med en FXa-standardkurve. c % vt-verdier er basert på sammenligning med vt-FXa-aktivitetsnivåer. Verdiene er justert for antigennivåene.

Stabile cellelinjer i HEK 293 celler ble etablert og hvert av zymgenene ble renset fra 10 L kondisjonerte medier (14, 24). Variantene ble aktivert med RVV-X og deretter renset med gelfiltreringskromatografi (14, 24). SDS-PAGE av variantene før og etter aktivering (reduserende og ikke-reduserende) er vist i figur 4.

Vi fokuserte først på å vurdere endringene i omgivelsene i det aktive setet for hver av variantene ved anvendelse av spesifikke prober som binder til denne regionen av FXa. Kinetiske studier med anvendelse av peptidylsubstrater og prober rettet mot det aktive setet avslørte at FXaI16L og FXaV17A har en svekket evne til å binde disse probene (15 til 25-fold økning i Km eller Ki) mens katalysehastigheten (kcat) ble redusert 3-fold sammenlignet med villtype FXa (plasmaderivert og rekombinant) (tabell 2 og 3). Faktor Xa I16G ble ikke inhibert av noen av de undersøkte probene og dets kromogene aktivitet var meget svekket (500 til 1000-fold) og utelukket beregning av kinetiske parametre. Disse dataene er i samsvar med idéen at destabilisering av intern saltbrodannelse (Ile16-Asp194), påvirker bindingen i S1-spesifisitetssetet. I motsetning til disse resultatene, gjenopprettet koblingen av FXaI16L og FxaV17A i protrombinase nesten fullstendig Km for peptidylsybstrater mens kcat fremdeles var 3-fold redusert, og indikerer at FVa-binding kan redde binding i det aktive setet (tabell 2 og 3). Overraskende var selv Km-verdien for I16G nesten fullstendig gjenopprettet (3-fold økning sammenlignet med villtype-FXa) når montert i protrombinase; mens en 60-fold reduksjon i kcat ble funnet.

Tabell 2: Kinetiske konstanter for kromogen substratspalting

For eksperimenter hvor fri faktor Xa ble benyttet, ble 2,0 nM villtype eller 6,0 nM mutant faktor Xa inkubert med økende konsentrasjoner av Spectrozyme FXa og for eksperimenter hvor protrombinase ble brukt ble 5,0 nM villtype eller mutant faktor Xa inkubert med 30 nM faktor Va, 50 µM PCPS og økende konsentrasjoner av substrat (10 til 500 µM).

Kromogenaktivitet ble analysert ved monitorering av økningen i absorbance ved 405 nm over tid. Feilene i de tilpassede konstantene representerer 95% konfidensintervall.

I samsvar med disse dataene, avslørte kinetiske studier med anvendelse av protrombin at Km-verdiene oppnådd for hver av disse variantene montert i protrombinase hovedsakelig var ekvivalent til villtypeenzymet, mens kcat-verdiene var reduserte i tilsvarende grad som de kromogene substratene (tabell 4). Sett samlet, indikerer våre resulter at zymogen til protease-transisjonen for FX ikke bare påvirker dannelsen av S1-setet, men også bidrar på en vesentlig måte til dannelsen av et FVa-bindingssete. Siden direkte binding av disse FXa-variantene til FVa redder bindingen i S1-setet, eksisterer sannsynligvis allosterisk binding mellom disse setene. Kollektivt har disse studiene illustrert en unik måte å modifisere zymogen til protease-transisjonsveien og har avslørt en mulig måte å utvikle zymogenlignende former av enzymer som ”aktiveres” etter sterk ligandbinding slik som kofaktorproteiner.

Tabell 3: Kinetiske konstanter for inhibering av FXa og protrombinase

Tabell 4: Kinetiske konstanter for protrombinspalting

Resultatene oppnådd med det kromogene substratet og de aktivt sete-rettede inhibitorene, indikerer at de zymogenlignende FXa-variantene binder med redusert affinitet til aktivt sete-prober. Likevel, koblingen av disse variantene i protrombinase forbedrer signifikant affiniteten for aktivt sete-prober, og antyder at FVa-binding kan redde binding i det aktive setet. Videre undersøkte vi om det motsatte også stemte, det vil si at okkupering av det zymgoenlignende aktive setet påvirker binding til Fva. For å vurdere denne hypotesen målte vi bindingskonstantene mellom FVa og FXaI16L og FXaV17A. For å oppnå dette inkuberte vi FVa med et fluorescentderivat av inaktiv vtFXa ved tilstedeværelse av syntetiske fosfolipidvesikler og Ca<2+>-ioner. Dannelsen av komplekset resulterer i økningen av fluorescentsignalet i forhold til fluorescerende FXa alene. Vi tilsatte så økende konsentrasjoner av en ikke-fluorescent FXa som, hvis det binder FVa, vil flytte fluorescent FXa, og resultere i en reduksjon i fluorescentsignalet. Som en kontroll tilsatte vi S195A FXa som en konkurrent. Denne mutanten er inaktiv fordi den mangler Ser i den katalytiske triaden, men har høy affinitet for FVa (tabell 5). Når vi derimot tilsatte enten FXaI16L eller FxaV17A ble affiniteten til disse zymogenlignende variantene for FXa signifikant redusert sammenlignet med FXaS195A (tabell 5). Videre undersøkte vi om kovalent okkupasjon av det aktive setet i FXaI16L kunne gjenopprette bindingen til FVa. For å gjøre dette modifiserte vi det aktive setet til villtype FXa og FXaI16L med en irreversibel inhibitor (EGR-klorometylketone) og repeterte så eksperimentet. Dataene viser at det aktive setet blokkerte FXaI16L-bundet FVa-membraner med samme affinitet som villtype aktivt sete blokkerte FXa. Dette indikerer at okkupering av det zymogenlignende FXa-aktive setet har en direkte påvirkning av bindingen til FVa.

Tabell 5: Ekvilibriumbindingskonstanter for

protrombinase-montering

Basert på observasjonen at de zymogenlignende FXa-derivatene har svak reaktivitet med aktivt-sete-rettede prober og inhibitorer i fravær av FVa, men tilsynelatende tilnærmet normal aktivitet når variantene er montert i protrombinase, vurderte vi videre aktiviteten til FXaI16L i et plasmamiljø. Hemofili A (data ikke vist) eller B plasma ble tilsatt villtype FXa for å korrigere koaguleringstiden (aPTT) til disse plasmaene; 0,1 nM ga en koagulasjonstid på ~32 sek. Tilsetningen av samme konsentrasjonen av FXaI16L ga koagulasjonstid på ~42 sek som er ~50-70 % av aktiviteten i forhold til vtFXa, og tyder på at denne zymogenlignende varianten har tilnærmet normal koagulasjonsaktivitet i plasma. Vi målte så halveringstiden til villtype FXa og FXaI16L i hemofili B plasma. Proteinene ble tilsatt HB plasma og ved ulike tidspunkter ble en alikvot av blandingen tatt ut og analysert i en PTT-basert analyse.

Resultatene med HB plasma viste at den relative restaktiviteten til villtype FXa meget raskt ble inhibert (< 2 min) (figur 6). Derimot vedvarte aktiviteten til FXaI16L i en mye lengre tid med en estimert halveringstid > 2 timer. Lignende resulter ble funnet i hemofili A plasma. Disse resultatene tyder på at det er mulig å modulere egenskapene til et enzym så det har en lang halveringstid i plasma og kan korrigere koagulasjonstiden i hemofilisk plasma.

Vi evaluerte så evnen til zymogenlignende FXaI16L å modulere hemostase i en musemodell for hemofili (Schlachterman, et.al., 2005, J.Thromb.Haemost., 3, 2730-2737). aPTT-verdien til hemofili B mus (C57BL/6) er tilnærmet 50-55 sek. Faktor XaI16L (200µg/kg; n = 7) eller PBS (n = 4) ble injisert via halevenen til hemofili B mus. Ved utvalgte tidspunkter (5 og 30 min) ble blod samlet og en aPTT utført på alle prøvene. Som vist i figur 7, resulterte infusjonen av FXaI16L i fullstendig korreksjon av aPTT-nivåene i normale dyr. Denne effekten vedvarte minst 30 min og indikerte at molekylet har en relativ lang halveringstid in vivo. Infusjon av PBS hadde kun en marignal effekt. Disse dataene er i samsvar med in vitro plasmaforsøkene ovenfor og indikerer faktisk at FXaI16L og muligens andre zymogenlignende FXa-varianter effektivt kan modulere hemostase in vivo.

For videre å teste effektiviteten av FXaI16L in vivo, undersøkte vi om dette molekylet kunne korrigere blødningstiden til hemofili B-mus etter skade i halen (Schlachterman, et al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730-2737). Blodtap ble målt under en 10min-periode etter avkutting av den distale delen av halen. I denne type analyse, er blodtapet etter skade av halen minimalt i normale villtype Balb-c mus (n = 7) og ganske betydelig i PBS-injiserte (n = 6) hemofili B mus (Balb c) (figur 8). Derimot reduserte injeksjon av 450 µg/kg FXaI16L signifikant den totale mengden av blodtap etter haleskade (n = 7). Samlet fremskaffer disse dataene bevis på at FXaI16L har evnen til å forbedre hemostase i hemofili A eller B pasienter.

REFERANSER

1. Furie, B. Og Furie, B. C. (1976) Spectral changes in bovine factor X associated with activation by the venom coagulant protein Vipera russelli. J.Biol.Chem.251, 6807-6814.

2. Robison, D., Furie, B., Furie, B. C., og Bing, D. H. (1980) Active site of bovine factor X. Characterization using substituted benzamidines as competitive inhibitors and affinity-labeling reagents. J.Biol.Chem.255, 2014-2021.

3. Keyt, B., Furie, B. C., og Furie, B. (1982) Structural transitions in bovine factor X associated with metal binding and zymogen activation. Studies using conformational-specific antibodies. J.Biol.Chem.257, 8687-8695.

4. Persson, E., Valvarce, C., og Stenflo, J. (1991) The γ-carboxyglutamic acid and epidermal growth factor-like domains of factor X. Effect of isolated domains on prothrombin activation and endothelial cell binding of factor X. J.Biol.Chem.266, 2458.

5. Persson, E., Hogg, P. J., og Stenflo, J. (1993) Effects of Ca<2+ >binding on the protease module of factor Xa and its interaction with factor Va: evidence for two Gla-independent Ca<2+ >binding sites in factor Xa. J.Biol.Chem.268, 22531-22539.

6. Dahlbäck, B. og Stenflo, J. (1978) Binding of bovine coagulation factor Xa to platelets. Biochemistry 17, 4938-4945.

7. Miletich, J. P., Jackson, C. M., og Majerus, P. W. (1978) Properties of the factor Xa binding site on human platelets. J.Biol.Chem. 253, 6908-6916.

8. Madison, E., Kobe, A., Gething, M., Sambrook, J. F., og Goldsmith, E. (1993) Converting tissue plasminogen activator to a zymogen: A regulatory triad of Asp-His-Ser. Science 262, 419-421.

9. Tachias, K. og Madison, E. (1996) Converting tissue-type plasminogen activator into a zymogen. J.Biol.Chem.271, 28749-28752.

10. Tachias, K. og Madison, E. (1997) Converting tissue type plasminogen activator into a zymogen. Important role of Lys156. J.Biol.Chem. 272, 28-31.

11. Renatus, M., Engh, R. A., Stubbs, M. T., Huber, R., Fischer, S., Kohnert, U., og Bode, W. (1997) Lysine 156 promotes the anomalous proenzyme activity of tPA: X-ray crystal structure of single-chain human tPA. EMBO J 16, 4797-4805.

12. Eigenbrot, C., Kirchhofer, D., Dennis, M. S., Santell, L., Lazarus, R. A., Stamos, J., og Ultsch MH (2001) The factor VII zymogen structure reveals reregistration of beta strands during activation. Structure 9, 627-636.

13. Venkateswarlu, D., Perera, L., Darden, T., og Pedersen, L. G. (2002) Structure and dynamics of zymogen human blood coagulation factor X. Biophys.J.82, 1190-1206.

14. Camire, R. M. Prothrombinase assembly and S1 site occupation restore the catalytic activity of FXa impaired by mutation at the sodium-binding site. (2002) J.Biol.Chem. 277, 37863-37870.

15. Rezaie, A. R., Neuenschwander, P. F., Morrissey, J. H., og Esmon, C. T. (1993) Analysis of the functions of the first epidermal growth factor-like domain of factor X. J.Biol.Chem.268, 8176-8180.

16. Rezaie, A. R. og Esmon, C. T. (1994) Asp-70 to Lys mutant of factor X lacks high affinity Ca<2+ >binding site yet retains function. J.Biol.Chem. 269, 21495-21499. 17. Rezaie, A. R. og Esmon, C. T. (1995) Contribution of residue 192 in factor Xa to enzyme specificity and function. J.Biol.Chem.270, 16176-16181.

18. Rezaie, A. R. (1996) Role of residue 99 at the S2 subsite of factor Xa and activated protein C in enzyme specificity. J.Biol.Chem.271, 23807-23814.

19. Rezaie, A. R. (2000) Identification of basic residues in the heparin-binding exosite of factor Xa critical for heparin and factor Va binding. J.Biol.Chem.275, 3320-3327.

20. Rezaie, A. R. og He, X. (2000) Sodium binding site of factor Xa: Role of sodium in the prothrombinase complex. Biochemistry 39, 1817-1825.

21. Larson, P. J., Camire, R. M., Wong, D., Fasano, N. C., Monroe, D. M., Tracy, P. B., og High, K. A. (1998) Structure/function analyses of recombinant variants of human factor Xa: Factor Xa incorporation into prothrombinase on the activated platelet surface is not mimicked by synthetic phospholipid vesicles. Biochemistry 37, 5029-5038.

22. Stanley, T. B., Jin, D. Y., Lin, P., og Stafford, D. W. (1999) The propeptides of the vitamin K-dependent proteins possess different affinities for the vitamin K-dependent carboxylase. J.Biol.Chem.274, 16940-16944.

23. Stanley, T. B., Humphries, J,, High, K. A., og Stafford, D. W. (1999) Amino acids responsible for the reduced affinities of vitamin K-dependent propeptides for the carboxylase. Biochemistry 38, 15681-15687.

24. Camire, R. M., Larson, P. J., Stafford, D. W., og High, K. A. (2000) Enhanced γcarboxylation of recombinant factor X using a chimeric construct containing the prothrombin propeptide. Biochemistry 36, 14322-14329.

25. Zhong, D., Bajaj, M. S., Schmidt, A. E., og Bajaj, S. P. (2001) The N-terminal EGF-like domain in factor IX and factor X represents an important recognition motif for binding to tissue factor. J.Biol.Chem.277, 3622-3631.

26. Chase, T. og Shaw, E. (1969) Comparison of the esterase activities of trypsin, plasmin, and thrombin on guanidinobenzoate esters. Titration of the enzymes. Biochemistry 8, 2212-2224.

27. Block, P. E., Craig, P. A., Olson, S. T., og Singh, P. (1989) Isolation of human blood coagulation α-factor Xa by soybean-trypsin inhibitor-Sepharose chromatography and its active-site titration with fluorescein mono-γguanidinobenzoate. Arch.Bioch.Biophys. 273, 375-388.

Mens noen av de foretrukne utførelsesformene ifølge den foreliggende oppfinnelse

er beskrevet og spesifikt eksemplifisert ovenfor, er det ikke ment at oppfinnelsen skal

begrenses til slike utførelsesformer.

Claims (27)

PATENTKRAV

1. Faktor Xa -variant som modulerer hemostase omfattende aminosyrer 41 til 179 og aminosyrer 235 til 488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5, og omfattende minst én substitusjonsmutasjon, hvor nevnte minst ene substitusjonsmutasjon inkluderer substitusjonen av Ile i posisjon 235 med en aminosyre valg fra gruppen bestående av Leu, Phe, Asp eller Gly.

2. Faktor Xa-variant ifølge krav 1, hvor Ile i posisjon 235 er substituert med Leu.

3. Faktor Xa-variant ifølge krav 1, videre omfattende en substitusjonsmutasjon av Val i posisjon 236 eller Asp i posisjon 418.

4. Faktor Xa-variant ifølge krav 3, hvor

a) Val i posisjon 236 er Leu, Ala, eller Gly; eller

b) Asp i posisjon 418 er Asn eller Glu.

5. Faktor Xa-variant ifølge krav 1, hvor sekvensen til posisjonene 235 til 237 er Leu-Val-Gly.

6. Faktor Xa-variant ifølge krav 1, hvor nevnte minst ene substitusjonsmutasjon består av substitusjonen av Ile i posisjon 235 med en aminosyre valgt fra gruppen bestående av Leu, Phe, Asp og Gly.

7. Faktor Xa-variant ifølge krav 1, hvor faktor Xa-varianten har en lengre plasmahalveringstid enn villtypefaktor Xa, hvor nevnte villtypefaktor Xa består av aminosyrer 41 til 179 og 235 til 488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5.

8. Faktor Xa-variant som modulerer hemostase bestående av aminosyrer 41-179 og aminosyrer 235-488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5 og omfattende minst én substitusjonsmutasjon, hvor nevnte minst ene substitusjonsmutasjon inkluderer substitusjonen av Ile i posisjon 235 med en aminosyre valgt fra gruppen bestående av Leu, Phe, Asp og Gly.

9. Faktor Xa-variant bestående av aminosyrer 41-179 og aminosyrer 235-488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5, hvor Ile i posisjon 235 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5 (posisjon 16 i kymotrypsinnummerering) er endret til Leu.

10. Farmasøytisk sammensetning omfattende faktor Xa-varianten ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 i en biologisk kompatibel bærer.

11. Faktor Xa-variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9, hvor substratbinding av det aktive setet til nevnte faktor Xa-variant er lavere sammenliknet med villtypefaktor Xa og øker når nevnte faktor Xa-variant er bundet av faktor Va i protrombinasekomplekset, hvor nevnte villtypefaktor Xa består av aminosyrer 41 til 179 og 235 til 488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5.

12. Faktor Xa-variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9 for anvendelse i behandling av en hemostaserelatert lidelse.

13. Faktor Xa-variant for anvendelse ifølge krav 12, hvor nevnte lidelse er valgt fra gruppen bestående av hemofili A, hemofili B, koagulasjonsfaktormangel, blødning assosiert med skade, traume, trombose, trombocytopeni, slag, koagulopati, og disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC).

14. Isolert nukleinsyremolekyl omfattende en nukleinsyresekvens som koder for faktor Xa-varianten ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, hvor nevnte nukleinsyresekvens også koder for et intracellulært, proteolytisk spaltingssete, hvor nevnte intracellulære, proteolytiske spaltingssete er mellom posisjoner 234 og 235 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5, eller erstatter aktiveringspeptidet.

15. Isolert nukleinsyremolekyl omfattende en nukleinsyresekvens som koder for et human faktor X (FX)-polypeptid, hvor nevnte FX-polypeptid omfatter minst én substitusjonsmutasjon i aminosyrer 41 til 179 og 235 til 488 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5, nevnte minst ene substitusjonsmutasjon inkluderer substitusjon av Ile i posisjon 235 med en aminosyre valgt fra gruppen bestående av Leu, Phe, Asp, og Gly, og hvor nevnte nukleinsyresekvens koder for et intracellulært, proteolytisk spaltingssete, hvor nevnte intracellulære, proteolytiske spaltingssete er mellom posisjoner 234 og 235 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5, eller erstatter aktiveringspeptidet.

16. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 15, hvor Ile i posisjon 235 er substituert med Leu.

17. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 15, hvor nevnte FX-polypeptid videre omfatter minst én substitusjonsmutasjon av Val i posisjon 236 eller Asp i posisjon 418 av aminosyresekvensen tilveiebragt i figur 5.

18. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 17, hvor faktor X-polypeptidet videre omfatter minst én modifikasjon valgt fra gruppen bestående av:

a) Val i posisjon 236 er Leu, Ala eller Gly; og

b) Asp i posisjon 418 er Asn eller Glu.

19. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 15, hvor nevnte FX-polypeptid omfatter en propeptidsekvens.

20. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 14 eller 15, hvor nevnte intracellulære, proteolytiske spaltingssete er et PACE/furin-spaltingssete.

21. Ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyremolekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 20 operabelt bundet til en regulatorisk sekvens.

22. Ekspresjonsvektor ifølge krav 21, valgt fra gruppen bestående av en adenovirusvektor, en andenovirusassosiert vektor, en retrovirusvektor, et plasmid, og en lentivirusvektor.

23. Vertscelle omfattende nukleinsyremolekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 20 operabelt bundet til en regulatorisk sekvens.

24. Vertscelle ifølge krav 23, hvor nevnte vertsceller er CHO-celler.

25. Fremgangsmåte for å produsere aktivert faktor X (FXa) omfattende å inkubere vertscellen ifølge krav 23 eller 24 og å rense FXa-en produsert derved.

26. FXa produsert ifølge fremgangsmåten ifølge krav 25.

27. Aktivert faktor X (FXa) tilveiebragt ved proteolytisk spalting av faktor X-polypeptidet kodet av nukleinsyresekvensen til nukleinsyremolekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 20.