JP2000128802A - 血管平滑筋増殖剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】平滑筋細胞増殖に関わる血管内皮細胞由来の産
物の生理学的機能を明らかにすることにより、血管平滑
筋増殖剤を提供すること。 【解決手段】配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部又
は２３位〜２３５位のアミノ酸配列からなる蛋白質；配
列番号１に記載のアミノ酸配列の全部又は２３位〜２３
５位のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が置
換、欠失、挿入又は付加されている蛋白質；配列番号２
に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコー
ドされる蛋白質；配列番号２に記載の塩基配列におい
て、１個以上の塩基が置換、欠失、挿入又は付加されて
いる塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードさ
れる蛋白質；又は配列番号２に記載の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白
質であって、血管平滑筋細胞に対してマイトジェン活性
を有する蛋白質を有効成分とする血管平滑筋増殖剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は血管平滑筋増殖剤に
関する。

【０００２】

【従来の技術】血管平滑筋細胞の増殖は、動脈硬化や経
皮経管冠状動脈形成術後の再狭窄の病因と密接に関連し
ている（Ross, R. (1993) Nature 362, 801-809 ）。血
管内皮細胞は、種々の機構からなる抗血栓性機能をも
ち、血液の流動性を維持する一方、傷害を受けた場合に
は、速やかに血栓を形成して傷害部位を保護する血栓性
機能ももっている。このような相反する機能をもつ内皮
細胞により、血液の恒常性が維持されており、そのバラ
ンスが動脈硬化等により崩れると、心筋梗塞や脳梗塞等
の種々の循環器疾患が引き起こされると考えられる。内
皮細胞の抗血栓性については、細胞表面に存在するアン
チトロンビンIII やトロンボモジュリンによる抗凝固作
用や、プロスタグランジンＩ₂ （ＰＧＩ₂ ）の産生によ
る抗血小板作用、組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔ−ＰＡ）の産生やプラスミノーゲンの結合による線
溶促進活性等が知られている。

【０００３】最近、抗凝固活性を有する新しいタイプの
インヒビターが血管内皮細胞で産生されることが明らか
となり、注目されるようになった。このインヒビター、
即ち、ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビ
ター(Tissue Facter PathwayInhibitor：ＴＦＰＩ）
（ＴＦＰＩは、ＴＦＰＩ−１と称されることもあり、以
下、ＴＦＰＩ−１と略す）は、血管内皮細胞で合成さ
れ、内皮上または血漿中に存在する（Jesty, J. ら、(1
994) Biochemistry 33, 12686-12694; Sprecher, C. A.
ら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3353-335
7; Peterson, L. C.ら、(1996) Biochemistry 35, 266-
272 ）。ＴＦＰＩ−１は、外因性の凝固経路の初期工程
を阻害し、鬱血を調節する。ＴＦＰＩ−１は、第Ｘａ因
子のインヒビター、または第Ｘａ因子存在下での第ＶII
ａ因子−組織因子（ＴＦ）複合体のインヒビターであ
る。ＴＦＰＩ−１は、３つのタンデムドメインを有する
Kunitz型プロテアーゼインヒビターである。第１の阻害
ドメインは、第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体と相互作用し、
複合体：第Ｘａ因子／ＴＦＰＩ−１／第ＶIIａ因子／Ｔ
Ｆを形成することにより、第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体の
蛋白分解活性を阻害する。第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体
は、第Ｘ因子および第ＩＸ因子を活性な酵素に変換す
る。第２のドメインは、第Ｘａ因子と相互作用し、直接
第Ｘａ因子を阻害する。第３の阻害ドメインの機能は、
ヘパリンとの結合である。第Ｖａ因子とともに第Ｘａ因
子は、プロトロンビンをトロンビンに開裂させ、フィブ
リンクロットの発生に導く。

【０００４】一方、ＴＦＰＩ−２は、ＴＦＰＩ−１と構
造上類似している（Sprecher, C. A. ら、(1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 3353-3357; Peterson, L.
C.ら、(1996) Biochemistry 35, 266-272 ）。ＴＦＰＩ
−２は、短い酸性アミノ末端領域、３つのタンデムKuni
tz型プロテアーゼ阻害ドメインおよび塩基性アミノ酸に
富むカルボキシ末端尾部を有する。ＴＦＰＩ−２は、ト
リプシンのアミド分解活性およびヒト第ＶIIａ因子とＴ
Ｆの複合体の活性を阻害する。ＴＦＰＩ−２は、ＴＦＰ
Ｉ−１と比べて、第Ｘａ因子のアミド分解活性に関して
は弱い阻害活性しか示さない。ＴＦＰＩ−２は、胎盤蛋
白質５、即ち、ＰＰ５と同一の蛋白質である（Miyagi,
Y.ら、(1994) J. Biochem. 116, 939-942 ）。ＴＦＰＩ
−２（ＰＰ５）は、以前に報告された第ＶIIａ因子／Ｔ
Ｆ複合体およびトリプシンを阻害する能力に加え、第Ｘ
Ia因子、プラスミン、血漿カリクレインおよびキモトリ
プシンの強いインヒビターである。

【０００５】血液凝固系における前記性質に加え、ＴＦ
ＰＩ−１の種々の動脈における内膜または平滑筋細胞に
対する抗増殖作用が報告されている。動脈硬化ウサギの
動脈損傷モデルにおいて、組換えＴＦＰＩ−１での処置
は、血管造影上の再狭窄を低下させ、新生内膜過形成を
減少させた（Jang, Y.ら、(1995) Circulation 92, 304
1-3050）。ミニブタの頸動脈でのバルーン誘導性動脈損
傷後の最初の２４時間における組換えＴＦＰＩ−１投与
によるＴＦ仲介性凝固の阻害は、その後の新生内膜形成
と管腔の狭窄を減少させるのに効果があるように思われ
る（Oltrona, L. ら、(1997) Circulation 96, 646-65
2）。組換えＴＦＰＩ−１は、培養ヒト新生児大動脈平
滑筋細胞に対して増殖阻害活性を示す（Kamikubo, Y.
ら、(1997) FEBS Lett. 407, 116-120）。このように、
ＴＦＰＩ−１は、種々の作用が明らかになり、医薬品へ
の応用研究が活発に行なわれているのに対し、構造上類
似のＴＦＰＩ−２に関してはその生理学的機能はほとん
ど知られていないのが現状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、平滑
筋細胞増殖に関わる血管内皮細胞由来の産物の生理学的
機能を明らかにすることにより、血管平滑筋増殖剤を提
供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】血管平滑筋の細胞増殖に
関する内皮細胞の効果を研究するために、培養ヒト臍帯
静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で覆われた１．０μｍの膜
を有する培養挿入物とウシ大動脈平滑筋細胞で覆われた
マイクロテストプレートを用いて調べたところ、当該内
皮細胞が挿入物中に存在する場合、当該平滑筋細胞の増
殖が見られた。本研究者らは、培養ＨＵＶＥＣのコンデ
ィション培地からマイトジェン活性を有する物質を精製
し、そのＮ末端アミノ酸配列を分析したところ、意外に
も、当該マイトジェン物質は、血管平滑筋細胞に対して
増殖阻害活性を有するＴＦＰＩ−１と構造の類似したＴ
ＦＰＩ−２であることを発見し、本発明を完成するに至
った。

【０００８】即ち、本発明の要旨は、〔１〕 （１）
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全部または配列番
号：１の第２３位〜第２３５位のアミノ酸配列からなる
蛋白質、（２） 配列番号：１に記載のアミノ酸配列の
全部または配列番号：１の第２３位〜第２３５位のアミ
ノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、
挿入または付加されている蛋白質、（３） 配列番号：
２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコ
ードされる蛋白質、（４） 配列番号：２に記載の塩基
配列において、１個以上の塩基が置換、欠失、挿入また
は付加されている塩基配列を有するポリヌクレオチドに
よりコードされる蛋白質、または（５） 配列番号：２
に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドにストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドによりコードされる蛋白質であって、血管平滑筋細胞
に対してマイトジェン活性を有する蛋白質を有効成分と
する血管平滑筋増殖剤、〔２〕 血管の増殖を必要とす
る疾患の治療に使用されるものである前記〔１〕記載の
血管平滑筋増殖剤、〔３〕 該疾患が創傷または床擦れ
である前記〔２〕記載の血管平滑筋増殖剤、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の血管平滑筋増殖剤は、配
列番号：１に記載のアミノ酸配列の全部または配列番
号：１の第２３位〜第２３５位のアミノ酸配列からなる
蛋白質を有効成分とすることが好ましく、この蛋白質
は、ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビタ
ー（ＴＦＰＩ）−２と称されるものと同一のアミノ酸配
列からなり、第２３位〜第２３５位のアミノ酸配列から
なる蛋白質（即ち、シグナルペプチドが除去された蛋白
質）は、３２ｋＤａの分子量を有するものである。本発
明においては、血管平滑筋細胞に対してマイトジェン活
性を有する限り、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の
全部または配列番号：１の第２３位〜第２３５位のアミ
ノ酸配列からなる蛋白質のみばかりでなく、前記アミノ
酸配列において、１個以上（例えば１個もしくは複数
個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されてい
る蛋白質；配列番号：２に記載の塩基配列を有するポリ
ヌクレオチドによりコードされる蛋白質；配列番号：２
に記載の塩基配列において、１個以上（例えば１個もし
くは複数個）の塩基が置換、欠失、挿入または付加され
ている塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコード
される蛋白質；または、配列番号：２に記載の塩基配列
を有するポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードさ
れる蛋白質であってもよく、これらは、天然の蛋白質で
も組換え蛋白質であってもよい。

【００１０】前記塩基配列に変異を導入するためには、
例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual第２版
第１−３巻 Sambrook,J.ら著、Cold Spring Harber Lab
olatory Press 出版 New York 1989年に記載の部位特異
的変異誘発やＰＣＲ法などの方法を用いることによって
当業者であれば容易に実施することができる。

【００１１】前記アミノ酸配列に変異を導入した蛋白質
を得るためには、前記塩基配列における変異を導入した
後、適当なベクターおよび宿主系を用いて、例えばMole
cular Cloning: A Laboratory Manual第２版第１−３巻
Sambrook,J.ら著、Cold Spring Harber Labolatory Pr
ess 出版 New York 1989年に記載の方法により、変異を
導入したＤＮＡを遺伝子工学的に発現させればよい。

【００１２】本発明において「マイトジェン活性を有す
る」とは、増殖を停止した血管平滑筋細胞に対して、細
胞分裂を誘起させるように刺激する活性を有することを
いう。ここで、血管平滑筋細胞とは、ヒトを含む哺乳動
物由来の血管平滑筋細胞を意味する。

【００１３】前記マイトジェン活性を測定するには、公
知の方法が用いられる。例えば、実施例２に記載のよう
に、ウシ大動脈平滑筋細胞を培地から血清を枯渇させる
ことによりその増殖を停止させた後、マイトジェン候補
物質を培地に添加することにより、５−ブロモ−２’−
デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を含む市販のキット等を
用いて当該細胞のＤＮＡ合成を吸光度により測定する方
法が挙げられる。

【００１４】本発明の血管平滑筋増殖剤に用いられる蛋
白質を製造する方法としては、例えば、天然のＴＦＰＩ
−２を発現している細胞のコンディション培地から蛋白
質を精製する方法と、ＴＦＰＩ−２をコードするＤＮＡ
を発現ベクターに組み込んで適当な宿主で発現させた後
に発現した組換えＴＦＰＩ−２を精製する方法とが挙げ
られる。

【００１５】天然のＴＦＰＩ−２を精製する方法は、例
えば、製造例１に記載のように、ヒト臍帯静脈内皮細胞
（ＨＵＶＥＣ）のコンディション培地を限外濾過により
濃縮し、ヘパリンアフィニティーカラムを用いてマイト
ジェン活性画分を溶出した後、ProRPC HR 5/10カラム
（Amersham Pharmacia Biotech社製) を用いるＬＣ−６
Ａ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム
（Shimadzu社製) によりマイトジェン活性画分を溶出す
る方法である。

【００１６】組換えＴＦＰＩ−２を精製する方法は、例
えば、製造例２〜４に記載のように、ＴＦＰＩ−２のｃ
ＤＮＡをＰＣＲ等により調製し、哺乳動物発現ベクター
ｐＫ４Ｋにクローニングした発現ベクターを構築した
後、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）ｔｋ^- ｔｓ１３細胞
等にリン酸カルシウム沈殿法等により形質転換し、メト
トレキサート（ＭＴＸ）等による選別の後、コンディシ
ョン培地を回収し、前記天然のＴＦＰＩ−２と同様に精
製する方法である。

【００１７】このようにして得られたマイトジェン活性
を有する蛋白質を血管平滑筋増殖剤として用いる場合に
は、その形状は、溶液状、懸濁状、乳液状、凍結乾燥品
等とすることができる。凍結乾燥品は、使用直前に適当
な溶媒、塩水、緩衝液等に溶解して用いる。

【００１８】本発明の血管平滑筋増殖剤は、血管の増殖
を必要とする疾患の治療に使用することが可能であり、
当該疾患としては、創傷、床擦れ等が挙げられる。

【００１９】本発明の血管平滑筋増殖剤を前記疾患の治
療剤として使用する場合、非経口的に投与することが好
ましい。即ち、液剤、乳剤、懸濁液剤、リポソーム剤等
として静脈内、皮下、筋肉内等に注射することができ、
軟膏、クリーム等として外用することができ、また、坐
剤として直腸投与することもできる。このような剤形
は、医薬として許容される通常の担体、賦形剤、結合
剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等と
前記マイトジェン活性を有する蛋白質とを配合すること
により製造することができる。

【００２０】本発明の血管平滑筋増殖剤の投与量は、治
療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整する
ことができるが、通常１回につき0.0001mg〜1000mg、好
ましくは0.001mg 〜1000mgであり、これを１日当たり１
〜３回程度投与するのが好ましい。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によってなんら限
定されるものではない。

【００２２】製造例１ ＴＦＰＩ−２の精製と同定 ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ワリイシ(War
iishi, S.)ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 216,
729-735 (1995)に記載の方法に従って培養し、そのコン
ディション培地からマイトジェン活性物質を精製した。
８００ｍｌのコンディション培地を、４℃で限外濾過膜
（ＹＭ１０、Amicon社製) により２０ｍｌに濃縮した。
この２０ｍｌの溶液を、予め５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）で平衡化させておいたHiTrap Heparin
アフィニティーカラム（５ｍｌ、Amersham Pharmacia B
iotech社製) にかけた。試料の適用後、当該カラムを５
０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶
液で洗浄した。マイトジェン活性画分は、１Ｍ ＮａＣ
ｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の
２０ｍｌで溶出された。溶出液をCentriprep 10 （Amic
on社製) で０．５ｍｌまで濃縮した。当該濃縮液を、Ｌ
Ｃ−６Ａ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）シス
テム（Shimadzu社製) を用いて、ProRPC HR 5/10カラム
（Amersham Pharmacia Biotech社製) に注入した。流速
は１ｍｌ／分であり、２８０ｎｍでピークをモニターし
た。当該カラムを、１５％アセトニトリル中０．１％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から１００％アセトニトリル
中０．１％ＴＦＡまで形成された勾配で溶出した（図
１）。カラムから溶出したマイトジェン活性画分を凍結
乾燥させた。マイトジェン活性は、後述の実施例１に記
載の方法を用いて測定した。

【００２３】表１に、増殖を停止したウシ大動脈平滑筋
細胞に対する各精製工程におけるマイトジェン画分の活
性を示す。前記一連の精製工程により、ＨＵＶＥＣの濃
縮コンディション培地からマイトジェン活性を有する物
質が約４２０倍に精製されたことが明らかとなった。

【００２４】

【表１】

【００２５】前記最終精製工程後のマイトジェン活性画
分（０．１μｇ）を、Phast System（Amersham Pharmac
ia Biotech社製) を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に付した。泳動後の蛋白質
は、クーマシーブリリアントブルーで染色した。使用し
た分子量マーカーは、Amersham Pharmacia Biotech社製
から入手した。この結果、３２ｋＤａの分子量を有する
蛋白質が精製されたことがわかった（図２、レーン
Ｂ）。

【００２６】精製された蛋白質を、Applied Biosystems
470A 気相シークエンサー(Perkin-Elmer 社製) を用い
る自動エドマン分解により、アミノ酸配列分析を行なっ
た。その結果、当該蛋白質は、Ｎ末端に、ＤＡＡＱＥＰ
ＴＧＮＮＡＥＩ（配列番号：３）のアミノ酸配列を有す
ることが明らかとなった。このＮ末端アミノ酸配列は、
シグナルペプチドの除去された後のＴＦＰＩ−２（ＰＰ
５）と同一のＮ末端アミノ酸配列であった。ＴＦＰＩ−
２の全アミノ酸配列を配列番号：１に示す。

【００２７】製造例２ ＴＦＰＩ−２ｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築 ニイドメ(Niidome, T.) ら、Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 203, 1821-1827 (1994)に記載の方法に従って、
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII の単一の制限部位を含む哺乳
動物発現ベクターｐＫ４Ｋを用いて、ｐＫ４ＫＴ２と命
名した発現ベクターを構築した。即ち、ＴＦＰＩ−２ｃ
ＤＮＡを、ＴＦＰＩ−２のヌクレオチド３９−５４およ
び７６３−７８２にそれぞれ対応するセンスオリゴヌク
レオチド５’−ＡＴＧＧＡＣＣＣＣＧＣＴＣＧＣＣ−
３’（配列番号：４）およびアンチセンスオリゴヌクレ
オチド５’−ＧＣＣＡＴＡＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡ
Ｔ−３’（配列番号：５）を用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）により作製した。鋳型は、ＴＦＰＩ−２
ｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）
(Stratagene 社製) であった。得られたＰＣＲ産物を、
ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ(Takara Biomedical
s 社製) により平滑末端化し、同様に平滑末端化した前
記ｐＫ４Ｋベクターに連結した。当該ＰＣＲ産物の配列
は、自動ＤＮＡシーケンサー３７３Ａ(Applied Biosyst
ems, Perkin-Elmer Corp.)により、配列番号：２に記載
の第３９位〜第７８２位までのヌクレオチドに対応する
塩基配列を有することを確認した。

【００２８】製造例３ 形質転換と細胞培養 形質転換されていないベビーハムスター腎（ＢＨＫ）ｔ
ｋ^- ｔｓ１３細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ス
トレプトマイシン（３０μｇ／ｍｌ）およびペニシリン
（３０ユニット／ｍｌ）を補足したDulbeccoの変法Eagl
e 培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｃｅｌｌ Ｐｈｅ
ｃｔ トランスフェクションキット(Amersham Pharmaci
a Biotech 社製) を用いる改変したリン酸カルシウム沈
殿法により、当該ＢＨＫｔｋ^- ｔｓ１３細胞（２×１０
⁵ 細胞）を、製造例２で作製した５μｇのｐＫ４ＫＴ２
ベクターで形質転換した。ＢＨＫＴ２と命名した形質転
換した細胞を、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させ
た。２５０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）による選
別の後、細胞培養上清（コンディション培地）を回収
し、組換えＴＦＰＩ−２（ｒＴＦＰＩ−２）の単離のた
めに用いた。

【００２９】製造例４ 組換えＴＦＰＩ−２（ｒＴＦＰＩ−２）の精製 製造例１に記載と同様の方法を用いて、製造例３で得ら
れたＢＨＫＴ２のコンディション培地（１０００ｍｌ）
からｒＴＦＰＩ−２を精製した。精製されたｒＴＦＰＩ
−２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図２、レーンＣに示す。

【００３０】その結果、天然のＴＦＰＩ−２と同じ分子
量（３２ｋＤａ）を有する蛋白質が精製されたことが明
らかとなった。

【００３１】実施例１ ｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン活性 ウシ大動脈平滑筋細胞は、ロス(Ross)のエクスプラント
技法の改変法により成牛の大動脈の中間層から単離した
(Shirotani, M.ら、J. Pharmacol. Exp. Ther.259, 738
-744 (1990)) 。１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ
／ｍｌ）およびカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補
足したＤＭＥＭ中で、５％のＣＯ₂ を含む空気の加湿環
境下、３７℃でウシ大動脈平滑筋細胞を増殖させた。増
殖させた。培養用培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）を３
日毎に交換し、約７日後にコンフルエント平滑筋細胞単
層を得た。細胞は、第２継代から第６継代まで使用し
た。当該細胞を０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴ
Ａ溶液で回収し、９６ウエルプレート（Ｎｕｎｋ社製）
にウエル当たり３，０００個の細胞密度で播種した。４
８時間後、当該細胞の増殖を０．１％ＦＣＳを含むＤＭ
ＥＭで停止させた。さらに４８時間後、新鮮な培地（Ｄ
ＭＥＭ＋０．１％ＦＣＳ）と種々の濃度の製造例４で精
製されたｒＴＦＰＩ−２（最終濃度：０〜５００ｎＭ）
を、前記増殖停止細胞に同時に添加した。４８時間後、
Premix WST-1 細胞増殖アッセイシステム(Takara Biom
edical社製) を用いて、細胞の増殖アッセイを行なっ
た。前記システムは、テトラゾリウムから産生したホル
マゾンを６００ｎｍの参照波長とともに４２０ｎｍでア
ッセイする。得られた吸光度の値を、標準曲線から細胞
数に変換した（図３）。

【００３２】図３より、ｒＴＦＰＩ−２は、用量応答様
式（１〜５００ｎＭ）で細胞の増殖を増加させることが
わかった。

【００３３】実施例２ ｒＴＦＰＩ−２によるＤＮＡ合成の誘導（１） 実施例１と同様に、ウシ大動脈平滑筋細胞を９６ウエル
プレートに播種し、０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭによ
り細胞増殖を停止させた。４８時間後、新鮮な培地（Ｄ
ＭＥＭ＋０．１％ＦＣＳ）と種々の濃度の製造例４で精
製されたｒＴＦＰＩ−２（最終濃度：０〜５００ｎＭ）
を、前記増殖停止細胞に同時に添加した。２４時間後、
５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添
加し、Biotrak 細胞増殖ＥＬＩＳＡシステム(Amersham
Pharmacia Biotech 社製) を用いて、ＤＮＡ合成中のＢ
ｒｄＵのＤＮＡへの取り込みを１２時間後に測定するこ
とによりＤＮＡ合成の検出を行なった（図４）。

【００３４】図４より、ＢｒｄＵは、ｒＴＦＰＩ−２刺
激により用量依存的にＤＮＡに取り込まれることがわか
った。

【００３５】実施例３ ｒＴＦＰＩ−２によるＤＮＡ合成の誘導（２） 実施例２において、０．１％ＦＣＳの代わりに１０ｎｇ
／ｍｌの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、Upstate 社
製) を使用すること以外は実施例２と同様に、ｒＴＦＰ
Ｉ−２によるＤＮＡ合成の誘導を行なった（図５）。

【００３６】図５より、０．１％ＦＣＳの代わりに１０
ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを使用した場合でも、ＢｒｄＵ
は、ｒＴＦＰＩ−２の用量依存的にＤＮＡに取り込まれ
ることがわかった。

【００３７】実施例４ マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の
リン酸化 実施例１で得られたウシ大動脈平滑筋細胞を、２４ウエ
ルプレート中で実施例１と同様に血清を枯渇させた後、
無血清ＤＭＥＭ培地中１００ｎＭの製造例４で得られた
ｒＴＦＰＩ−２に曝露させた。１５〜１２０分間のイン
キュベーションの後、上清を除去した。１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、２．５
％ ＳＤＳおよび５％メルカプトエタノールを含む溶液
の１００μｌを各ウエルに添加した。溶解した細胞画分
を、Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いるＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動により、８〜２５％のゲル上で
分離した。次いで、当該蛋白質を、Ｐｈａｓｔ Ｔｒａ
ｎｓｆｅｒ(Amersham Pharmacia Biotech 社製) を用い
るセミドライ電気ブロッティング法により、ニトロセル
ロース膜(Hoefer Scientific Instruments社製) に３０
分間ブロットした。当該ブロットを、Ｔｒｉｓ緩衝化生
理食塩水（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）
および１３７ｍＭ ＮａＣｌ）中１０％ウシ血清アルブ
ミンで１時間ブロックした。次いで、ブロックされたブ
ロットを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む前記Ｔｒ
ｉｓ緩衝化生理食塩水で５回洗浄した。この洗浄工程
は、その後の工程それぞれの間で行なった。洗浄したブ
ロットを、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水で希釈したリン酸
化ＭＡＰＫに対するモノクローナル抗体（２５ｎｇ／ｍ
ｌ）( 非リン酸化ＭＡＰＫとは交差反応を示さない；Pr
omega Inc.) で１時間、ビオチン化Ｆ（ａｂ’）₂ ラビ
ット抗マウスイムノグロブリンＧ(Serotec Ltd.)で１時
間、およびストレプトアビジン−アルカリホスファター
ゼコンジュゲートで１時間、連続してインキュベートし
た。最後に、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ−ト
ルイジン塩を添加して、特異的蛋白質を検出し、蒸留水
で洗浄することにより反応を停止させた（図６）。

【００３８】図６より、ｒＴＦＰＩ−２により誘導され
た血管平滑筋細胞増殖において、ＭＡＰＫのリン酸化が
二元に起こることが示され（４２ｋＤａと４４ｋＤ
ａ）、迅速かつ一過性のリン酸化が、ｒＴＦＰＩ−２に
よる刺激の後に起こることがわかった。なお、ＭＡＰＫ
は、多くの型の細胞表面の受容体をマイトジェン活性物
質を開始剤とする核の事象と連結するシグナル伝達経路
において重要な中間体である。

【００３９】実施例５ ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡのノーザンブロ
ット分析 実施例４と同様にして、血清を枯渇させたウシ大動脈平
滑筋細胞を調製した。ｒＴＦＰＩ−２による刺激後３０
〜２４０分間の前記細胞（１０⁸ 細胞）由来の全細胞Ｒ
ＮＡを、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ−II ＲＮＡ単離システム
(Biotecx Laboratories, Inc.)を用いて単離した。全Ｒ
ＮＡ（２０μｇ／レーン）を、１８％ホルムアルデヒド
を含む１％アガロースゲル上で、電気泳動によりサイズ
分画した。Ｎ⁺ ナイロン(Amersham Pharmacia Biotech
社製) へのキャピラリートランスファーを一晩行なっ
た。プレハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイ
ゼーション緩衝液（４×ＳＳＣ、１％ＳＤＳおよび１×
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液）中、４２℃で４時間行なっ
た。ハイブリダイゼーションは、２×１０⁶ ｃｐｍ／ｍ
ｌの³²Ｐ（[ α−³²Ｐ] ｄＣＴＰ、Amersham Pharmacia
Biotech社製) 標識ｃＤＮＡプローブを含むハイブリダ
イゼーション緩衝液（４×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ溶液、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ精
子ＤＮＡ）中、４２℃で１８時間行なった。プローブと
して、ｃ−ｆｏｓＤＮＡ、ｃ−ｍｙｃＤＮＡ(Takara Bi
omedicals 社製) およびグリセルアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼＤＮＡ（Ｇ３ＰＤ、Clontech
社製) を、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＤＮＡ標識キット
(Amersham Pharmacia Biotech 社製) により標識した。
洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中４２℃、２×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５５℃および最後に、０．５×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５５℃で行なった。Ｇ３ＰＤ
は、各レーンに負荷した等量をチェックするためのコン
トロールとして使用し、前記と同様の条件で洗浄した。
オートラジオグラムは、ＢＡＳ２５００システム(Fuji
Film社製) を用いて得られた（図７）。

【００４０】図７より、ｒＴＦＰＩ−２による刺激の
後、プロトオンコジーンｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃ
ｍＲＮＡの迅速な発現増加が３０分で見出された。１時
間後、ｃ−ｆｏｓ発現は見出されなくなったが、ｃ−ｍ
ｙｃ発現は、ｒＴＦＰＩ−２による刺激の後４時間まで
持続した。血管平滑筋において、ＴＦＰＩ−２によるｃ
−ｆｏｓとｃ−ｍｙｃの迅速かつ一過性の発現は、活性
化ＭＡＰＫを介しているように思われる。

【００４１】これらの点から、ｒＴＦＰＩ−１は、その
抗増殖作用によりＰＴＣＡ後の再狭窄を予防するための
医薬として有用であると期待されるのに対して、構造上
類似のｒＴＦＰＩ−２は、血管平滑筋細胞に対するマイ
トジェン活性を有する蛋白質であることがわかった。

【００４２】

【発明の効果】本発明により血管平滑筋増殖剤が提供さ
れ、創傷、床擦れ等の血管の増殖を必要とする疾患の治
療に有用である。

【００４３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SHIONOGI & CO., LTD. <120> Proliferative Agents of Blood Smooth Muscle Cells <130> SG-10-003 <160> 5

【００４４】 <210> 1 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(22) <400> 1 Met Asp Pro Ala Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Leu Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Glu Ile Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu 35 40 45 Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe 50 55 60 Leu Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu 65 70 75 80 Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys 85 90 95 Arg Leu Gln Val Ser Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys 100 105 110 Tyr Phe Phe Asn Leu Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly 115 120 125 Gly Cys His Arg Asn Arg Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr 130 135 140 Cys Met Gly Phe Cys Ala Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Lys Asp Glu Gly Leu Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe 165 170 175 Asn Pro Arg Tyr Arg Thr Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly 180 185 190 Gly Asn Asp Asn Asn Phe Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys 195 200 205 Ala Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala 210 215 220 Ser Arg Ile Arg Lys Ile Arg Lys Lys Gln Phe 225 230 235

【００４５】 <210> 2 <211> 979 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (39)...(743) <400> 2 ggacgccttg cccagcgggc cgcccgaccc cctgcaccat ggaccccgct cgccccctgg 60 ggctgtcgat tctgctgctt ttcctgacgg aggctgcact gggcgatgct gctcaggagc 120 caacaggaaa taacgcggag atctgtctcc tgcccctaga ctacggaccc tgccgggccc 180 tacttctccg ttactactac gacaggtaca cgcagagctg ccgccagttc ctgtacgggg 240 gctgcgaggg caacgccaac aatttctaca cctgggaggc ttgcgacgat gcttgctgga 300 ggatagaaaa agttcccaaa gtttgccggc tgcaagtgag tgtggacgac cagtgtgagg 360 ggtccacaga aaagtatttc tttaatctaa gttccatgac atgtgaaaaa ttcttttccg 420 gtgggtgtca ccggaaccgg attgagaaca ggtttccaga tgaagctact tgtatgggct 480 tctgcgcacc aaagaaaatt ccatcatttt gctacagtcc aaaagatgag ggactgtgct 540 ctgccaatgt gactcgctat tattttaatc caagatacag aacctgtgat gctttcacct 600 atactggctg tggagggaat gacaataact ttgttagcag ggaggattgc aaacgtgcat 660 gtgcaaaagc tttgaaaaag aaaaagaaga tgccaaagct tcgctttgcc agtagaatcc 720 ggaaaattcg gaagaagcaa ttttaaacat tcttaatatg tcatcttgtt tgtctttatg 780 gcttatttgc ctttatggtt gtatctgaag aataatatga cagcatgagg aaacaaatca 840 ttggtgattt attcaccagt ttttattaat acaagtcact ttttcaaaaa tttggatttt 900 tttatatata actagctgct attcaaatgt gagtctacca tttttaattt atggttcaac 960 tgtttgtgag actgaattc 979

【００４６】 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile 5 10

【００４７】 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artifical Sequence <400> 4 atggaccccg ctcgcc 16

【００４８】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artifical Sequence <400> 5 gccataaaga caaacaagat 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ProRPC HR 5/10カラムを用いた逆相高
速液体クロマトグラフィーの結果を示す。図中、点線
は、１５％アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）から１００％アセトニトリル中０．１％ＴＦ
Ａまでの勾配を示し、黒塗りのピークは、増殖を停止さ
せたウシ大動脈平滑筋細胞に対する細胞増殖活性を示
す。

【図２】図２は、精製した天然のＴＦＰＩ−２（レーン
Ｂ）およびｒＴＦＰＩ−２（レーンＣ）のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す電気泳動の写真である。レーンＡは、
分子量マーカーを示し、各バンドは、上から、ホスホリ
ラーゼｂ：９４ｋＤａ；ウシ血清アルブミン：６７ｋＤ
ａ；オブアルブミン：４３ｋＤａ；カルボニックアンヒ
ドラーゼｂ：３０ｋＤａ；ダイズトリプシンインヒビタ
ー：２０．１ｋＤａ；α−ラクトアルブミン：１４．４
ｋＤａである。

【図３】図３は、ウシ大動脈平滑筋細胞に対する種々の
濃度（０〜５００ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェ
ン活性を示すグラフである。グラフの各点は、６回の平
均を示し、縦線は、標準偏差を示す。

【図４】図４は、低濃度の血清により増殖を停止させた
ウシ大動脈平滑筋細胞に対する種々の濃度（０〜５００
ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン活性をＢｒＤＵ
の取り込みによって測定したグラフである。グラフの各
点は、６回の平均を示し、縦線は、標準偏差を示す。

【図５】図５は、ＰＤＧＦ添加のＤＭＥＭにより増殖を
停止させたウシ大動脈平滑筋細胞に対する種々の濃度
（０〜５００ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン活
性をＢｒＤＵの取り込みによって測定したグラフであ
る。グラフの各点は、６回の平均を示し、縦線は、標準
偏差を示す。

【図６】図６は、増殖を停止させたウシ大動脈平滑筋細
胞において、ｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン刺激により
活性化されたプロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸
化を示す電気泳動の写真である。

【図７】図７は、増殖を停止させたウシ大動脈平滑筋細
胞において、ｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン刺激により
誘導されたｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの発
現を示す電気泳動の写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ53 QR32 QR50 QR56 QS34 QS36 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 CA25 CA53 DC32 MA01 NA14 ZA362 ZA402 ZA452 ZA542 ZA892 ZA962 ZB222 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA20 EA28 FA72 FA74

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１） 配列番号：１に記載のアミノ酸
   配列の全部または配列番号：１の第２３位〜第２３５位
   のアミノ酸配列からなる蛋白質、（２） 配列番号：１
   に記載のアミノ酸配列の全部または配列番号：１の第２
   ３位〜第２３５位のアミノ酸配列において、１個以上の
   アミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されている蛋白
   質、（３） 配列番号：２に記載の塩基配列を有するポ
   リヌクレオチドによりコードされる蛋白質、（４） 配
   列番号：２に記載の塩基配列において、１個以上の塩基
   が置換、欠失、挿入または付加されている塩基配列を有
   するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、また
   は（５） 配列番号：２に記載の塩基配列を有するポリ
   ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダ
   イズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質で
   あって、血管平滑筋細胞に対してマイトジェン活性を有
   する蛋白質を有効成分とする血管平滑筋増殖剤。
2. 【請求項２】 血管の増殖を必要とする疾患の治療に使
   用されるものである請求項１記載の血管平滑筋増殖剤。
3. 【請求項３】 該疾患が創傷または床擦れである請求項
   ２記載の血管平滑筋増殖剤。