CN101575380A - 肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白及其制备方法，涉及一种基因，提供肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白基因的构建、表达、纯化和体内外生物学活性鉴定方法。从GenBank上查得Fas配体cDNA全序列，在其N端通过Linker(YNFPQQMLKCFC)加上Arg－Lys－Arg，获得编码肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白的原始基因序列；根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，将肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白的核苷酸序列进行修改；修改后的融合蛋白序列分成12个长引物片段，引入BamH I和Xho I酶切位点；通过PCR反应获取融合蛋白基因。

Description

肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的体内外活性鉴定等技术，尤其是涉及一种肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)及制备，肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)作为一种抗肿瘤药物，能够靶向特异性作用于肿瘤细胞。

背景技术

1)Fas/FasL系统及其诱导凋亡研究

Fas配体(Fas ligand，FasL)全长278个氨基酸，为II型跨膜糖蛋白，由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成。其N端150个氨基酸为TNF超家族同源区，在胞膜外区有4个N-糖基化位点，胞浆区富含脯氨酸。人体内FasL主要表达于活化的T淋巴细胞和NK细胞，以及免疫豁免区如眼前房、睾丸滋养细胞表面等(Curnis F，GasparriA，Sacchi A，et al.Coupling Tumor Necrosis Factor-αwith αV Integrin Ligands Improves ItsAntineoplastic Activity[J]Cancer Res.2004Jan 15；64(2)：565-571)，其他细胞如B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及胸腺细胞都不表达FasL。Fas也称Apo-1或CD95，是属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)/神经生长因子受体(NGFR)家族的I型跨膜糖蛋白。Fas抗原主要以膜受体形式存在，也可通过在转录水平mRNA的不同拼接使翻译产物缺失跨膜区形成可溶性Fas(sFas)，存在于胞浆和血清中。Fas和FasL相互作用是诱导细胞凋亡的重要途径之一。Fas与FasL结合可触发凋亡，其凋亡信号的传递途径为：FasL以三聚体形式与靶细胞上的Fas结合，诱导Fas三聚化，使Fas胞浆区的死亡结构域(DD)与转接器蛋白的Fas相关死亡域(FADD)结合，形成死亡诱导信号复合体(DISC)，DISC的形成可以诱导FADD N端的死亡效应区(DED)与前半胱天冬氨酸蛋白酶8(procaspase-8)N端的DED相互作用，形成活化的Caspase-8，后者再通过直接或间接途径裂解和活化Caspase家族的其他分子Caspase-1，3，6，7，激活Caspase级联反应，Caspases通过对底物降解可转导凋亡信号或直接作为凋亡的效应分子促进细胞骨架降解和DNA片段化，导致细胞凋亡的发生(Perabo FG，Kam PS，Sehmidt D，et al.Bladder cancer cells aequire competent mechanisms toescape Fas-mediated apoptosis and immune surveillance in the course of malignanttransformation.[J].Br J Cancer，2001，84(10)：1330-1338)。

2)FasL蛋白的应用研究

由于FasL的抗肿瘤作用和多种免疫调节功能，FasL疗法的临床研究已在许多国家开展。动物实验和临床实验均表明，FasL对某些肿瘤具有明显的抑制作用；但是由于副作用较大，为FasL的临床应用造成困难。FasL的副作用包括发热、头痛、恶心、呕吐、全身倦怠和肌肉酸痛等；高剂量时可导致休克和肾功能不全等。建立合理的用药方案及治疗措施，可望降低用量，减轻副作用，达到最佳治疗效果。静脉注射FasL可使部分肿瘤缩小，但是副作用大，人体很难耐受。瘤内注射可在局部出现坏死，且副作用较轻，对某些肿瘤的治疗效果优于静脉注射。已报告的有效病例包括肾癌、胃癌、肝癌等，并使转移性大肠癌腹水减少。鉴于FasL可直接杀伤瘤细胞而有损伤正常细胞，比化疗药物毒性小，可望较其他细胞因子更快地大量应用于临床。单独使用FasL用量大，不容易获得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止用药。将其它具有肿瘤抑制作用的细胞因子(如IL-2等)或某些抗肿瘤药物与FasL联合应用，既可减少各种药物的用量、降低毒副作用，又可提高疗效，不失为肿瘤治疗的一种可行方法(Lamboley C，Bringuier AF，Camus E，et al.Overexpression ofthe mouse Fas gene in human Hep3B hepatoma cells overcomes their resistance to Fas mediatedapoptosis[J].J Hepatol，2002，36(3)：385-394)。FasL与抗癌药物ADM、MMC、DDP联合应用可明显增强抗肿瘤增殖效果(Reiser M，Neumann I，Schmiegel W，et al.Induction of cellproliferation arrest and apoptosis in hepatoma cells through adenoviral mediated transfer of p53gene[J].JHepatol，2000，32(5)：771-782)。此外，对机体加热可明显增强FasL的抗肿瘤作用；但加热在增强其抗肿瘤活性的同时，也增强了FasL对机体的毒性。因此常建议以常温下治疗量的十分之一作为热疗法中的起始剂量，故可能有助于降低FasL用量，增加疗效。

此外，利用基因疗法，将FasL基因转染自体的抗癌效应细胞，如淋巴因子活化的杀伤细胞、肿瘤侵润性淋巴细胞、细胞毒淋巴细胞和巨噬细胞，然后将其回输到体内使之产生FasL；或者转染自体的癌细胞并进一步制备成癌细胞疫苗，从而达到治疗目的。将FasL基因转入TIL并对1例胃癌转移患者，获得了使癌组织缩小并液化的治疗效果。研究表明TIL对肿瘤细胞有高度特异性，是理想的靶向细胞。构建放射线诱导的hFasL逆转录病毒载体并转染小鼠成纤维细胞和黑色素瘤细胞(B16、F10)，从而为临床开展瘤内注射FasL基因载体并使用局部放疗莫定了基础。新近已获得了基因转染胃癌细胞M区N28、BGC823和小鼠成纤维细胞H3T3的阳性克隆，前者对两株胃癌细胞的生长抑制率达70％左右，后者能明显抑制肝癌细胞H22生长(P＜0.05)和提高小鼠存活率(P＜0.025)。

20世纪80年代初出现并逐渐成熟的杂交瘤技术，使单抗介导的向肿瘤组织定向(靶向)运送显像或治疗药物，从而减小全身用药的毒副作用成为可能。有关单抗与核素、化疗药物、毒素、酶以及生长因子等效应剂偶联，并用于动物肿瘤模型及临床试验的报道屡见不鲜。然而，迄今为止距达到“有足够的抗体携带效应剂到达肿瘤部位并持续发挥抗瘤作用而对正常组织无毒副作用”这一目标仍有距离，主要是由于抗体本身存在的问题，如较低的靶向特异性、低穿透力、弱亲和力及抗体的免疫原性等。部分是由于肿瘤带来的障碍，如肿瘤血供的异质性及肿瘤抗原及其分布的多变性、肿瘤组织间质高灌注压、肿瘤特别是实体瘤内结合位，空间位阻，即抗体不易与肿瘤组织内部的瘤细胞结合(抗体进入肿瘤的量与肿瘤大小成反比)。因此在实际应用中，仅有极少量抗体能到达肿瘤并与之结合，通常小于注射总量的1％。近来基因工程技术的进展使新一代基因工程抗体的特异性、亲和力均有提高，加之人们对抗体效应剂复合物的药代动力学的深入了解，以及多种效应剂的联用，高效、特异、低毒性地向肿瘤组织运送治疗或显像药物已成为可能。同时随着噬菌体展示多肽库技术的发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为：(1)含有关健残基的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇；(2)多数情况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通过局部肽段间的相互作用实现的。这类导向性药物，不仅具有结合特异性和高效性，还克服了单抗效应剂分子量较大，穿透能力弱的缺点。目前，基于导向药物中导向分子小型化的发展趋势，利用噬菌体展示多肽库技术筛选出能够与目的分子结合的短肽，在体外合成编码这一短肽的核等酸序列，与弹头分子基因融合，表达出具有导向作用的多肽一弹头分子，由短肽发挥导向作用，弹头分子可以是细菌毒素、细胞因子、化疗药物等，这一药物设计策略已显示出良好的应用前景。

3)肿瘤靶向性研究

鉴于FasL对某些肿瘤具有明显的抑制作用；但是由于副作用较大，为FasL的临床应用造成困难。细胞毒性药物在肿瘤部位浓度的选择性增强不仅影响内皮细胞，也对肿瘤细胞产生影响。通过传统的注射途径使用细胞毒性药物，药物均匀分布在全身循环中，对肿瘤缺乏特异亲和性；药物在到达肿瘤之前，要经过同血浆蛋白结合、代谢、分解等多个步骤，最终只有少量药物到达肿瘤部位。因此有必要将细胞毒性药物制成能有效到达肿瘤部位、提高疗效、降低毒副作用的靶向制剂。

肿瘤靶向治疗是利用具有一定特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。

肿瘤靶向治疗中治疗靶点、靶向载体和效应分子的选择是关键，靶向治疗的主要策略也是从这三方面入手：①寻找新的肿瘤靶点。靶向治疗分为三个层次，器官靶向、细胞靶向和分子靶向。分子靶向是靶向治疗中特异性的最高层次，它是针对肿瘤细胞里面的某一个蛋白质的分子，一个核苷酸的片段，或者一个基因产物进行治疗。随着基因组学和蛋白组学研究的发展，不断涌现出新的分子靶点，为肿瘤靶向治疗提供理论依据。这些靶点包括癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、肿瘤血管生成因子、粘附分子、蛋白激酶及信号传导通路、端粒及端粒酶等。②设计特异性高的靶向载体。以单抗为载体的靶向性抗肿瘤治疗是靶向治疗中的首选策略。随着重组抗体技术和噬菌体抗体库技术的不断发展，人源化抗体、双特异性抗体和单链抗体解决了过去抗体在肿瘤治疗中的诸多弊端，充分发挥了单抗特异性高、结合能力强的优势。此外，能结合肿瘤细胞的多肽、脂质体、纳米微粒、磁性微球也可以作为靶向治疗中的载体。③选择高效的抗肿瘤效应分子。毒素、放射性核素、抗肿瘤药物、前体药物等均可以作为抗肿瘤“弹头”。此外，基因靶向治疗是肿瘤靶向治疗的另一大热点，靶向性主要体现在三个方面：即基因转移的靶向性、基因转录的靶向性、基因表达时间和水平上的靶向性。

RGD肽是一类含有Arg-Lys-Arg 3个氨基酸的小肽，广泛存在于多种生物体内及同一种生物体的各种组织中。自从1984年Pierschbacher和Ruosluherci首次报道纤维蛋白原中所含的RGD序列为细胞识别位点以来，RGD肽就成为各国学者关注与研究的热点之一。随着研究的深入，人们发现RGD序列广泛分布在不同进化层次的生物种类中，即使是在同一种生物体内RGD序列也是大量存在于各种组织的细胞外基质以及血液的多种成分中，甚至有研究发现肿瘤细胞表面也存在RGD序列。RGD这一短短的三肽作为一种重要的细胞识别位点与信号启动分子，在许多生命活动中发挥着重要的调节功能。目前研究较多的是关于RGD肽通过其所含的RGD序列竞争结合到细胞表面的整合素受体上从而产生的一系列生物活性方面，这其中包括RGD肽对血小板功能的影响、RGD肽对破骨细胞功能的影响、RGD肽诱导肿瘤细胞凋亡、RGD肽对肿瘤迁移和肿瘤新血管生成的影响等(Ruoslahti E.The RGD story：apersonal account[J].Matrix Biol，2003，22(6)：459-465)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白及其制备方法。

本发明的技术方案是以整合素αvβ3、死亡受体Fas为肿瘤靶点，RGD肽为靶向载体，FasL蛋白为抗肿瘤效应分子，构建肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)，希望能获得一种既具有FasL抗肿瘤的优点，又具有导向性的新型FasL衍生物，进一步降低rhFasL的临床用药量，提高量效比，以增强FasL的抗肿瘤效果。为实现上述目的，本发明首先利用重组PCR技术将Arg-Lys-Arg(精氨酸-赖氨酸-精氨酸)通过Linker融合至FasL的N端，所应用到的基因克隆方法中目的基因的获得包括：筛选基因文库，RT-PCR方法，DNA的化学合成法等。RGD-rhFasL基因的获得是根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，在不影响氨基酸序列的前提下，将RGD-rhFasL的核苷酸序列进行部分修改，并分成12个引物片段通过化学合成，再经重叠PCR拼接成完整的RGD-rhFasL全基因序列，所得到的基因序列与GenBank上公布的RGD-rhFasLcDNA全序列有多处变动，但翻译的蛋白质没有改变。与pGEX-5X-1构建成RGD-rhFasL重组体，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导进行原核表达，表达量为菌体蛋白的30％，GST柱纯化其纯度高于95％，体内外生物学活性鉴定纯化的蛋白具有一定的抗肿瘤生物学活性。

本发明所述的肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白为：

应用重叠PCR技术，在人Fas配体cDNA全序列N端通过Linker加上Arg-Lys-Arg(精氨酸-赖氨酸-精氨酸)，获得编码肿瘤靶向特异性结合多肽RGD与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的原始基因序列，并在大肠杆菌中获得高效表达。

本发明所述的肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白的制备方法包括以下步骤：

1)设计引物：

从GenBank上查得人Fas配体cDNA全序列，在其N端加上酪氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-甲硫氨酸-亮氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-酪氨酸氨基酸(YNFPQQMLKCFCY)作为Linker，再在其N端加上Arg-Lys-Arg(精氨酸-赖氨酸-精氨酸)，获得编码RGD-rhFas配体融合蛋白的原始基因序列为：

GGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCCCCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGCCAGCTCTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGTGCCCAGAAGGCCTGGTCAAAGGAGGCCACCACCACCACCGCCACCGCCACCACTACCACCTCCGCCGCCGCCGCCACCACTGCCTCCACTACCGCTGCCACCCCTGAAGAAGAGAGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGTGATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCTACAGAAGGAGCTGGCAGAACTCCGAGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATCATCTTTGGAGAAGCAAATAGGCCACCCCAGTCCACCCCCTGAAAAAAAGGAGCTGAGGAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCAAGGTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAAGTATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCTGAGCCACAAGGTCTACATGAGGAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTACTGCACTACTGGGCAGATGTGGGCCCGCAGCAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAATCTTACCAGTGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAG，其中加横线部分代表Linker-RGD序列；

根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，在不影响氨基酸序列的前提下，将RGD-rhFasL的核苷酸序列修改为：

GGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCC_GCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGC_GAGC_AGTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGTGCCC_CG_CCG_TCCTGG_CCA_GCG_TCG_TCCACC_GC_CCCCACCGCC_TCCGCCACCACT_GCCACCTCC_TCC_TCCGCCGCCACC_TCTGCCTCCACT_GCCGCTGCCACCCCTGAAGAAG_CG_TGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGT_TATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCT_GCAGAAGGAGCT_TGCAGAACTCCG_TGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATC_TTCTTTGGAGAAGCAAAT_TGGCCA_TCC_GAGTCCACCCCCTGA_GAAAAAGGA_ACTG_CG_TAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCA_CG_TTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAA_ATATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCT_TAGCCACAAGGTCTACATG_CG_TAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTA_TTGCACTACTGG_CCA_AATGTGGGCCCGCAG_TAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAA_CCT_GACCAGTGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAG；

将修改后的RGD-rhFasL序列分成12个长引物片段，分别命名为F1，R2，F3，R4，F5，R6，F7，R8，F9，R10，F11，R12，每两条引物之间有15个碱基互补，利用引物F1和R12引入BamHI和Xho I酶切位点，加粗碱基是改变后的碱基位点，所述12个长引物片段为：

F1(97nt)：5’CAGCCATGGGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCC_GCAG  3’

R2(89nt)：3’TACCCATATCC_GCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGC_GAGC_AGTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGT  5’

F3(89nt)：5’CTGTCCAACCTCTGTGCCC_CG_CCG_TCCTGG_CCA_GCG_TCGTCCACC_GCC_CCCACCGCC_TCCGCCACCACT_GCCACCTCC_TCC_TCCGCCGC  3’

R4(89nt)：3’CTCC_TCC_TCCGCCGCCACC_TCTGCCTCCACT_GCCGCTGCCACCCCTGAAGAAG_CG_TGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGT_T 5’

F5(89nt)：5’CTGTGTCTCCTTGT_TATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCT_GCAGAAGGA  3’

R6(89nt)：3’CCACCT_GCAGAAGGAGCT_TGCAGAACTCCG_TGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATC_TTCTTTGGAGAAGCAAAT_TGGCCA_TCC_GA  5’

F7(89nt)：5’AAAT_TGGCCA_TCC_GAGTCCACCCCCTGA_GAAAAAGGA_ACTG_CG_TAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCA_CG_TTCCATGCCT  3’

R8(89nt)：3’TCA_CG_TTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAA_ATATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAA  5’

F9(89nt)：5’TGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCT_TAGCC  3’

R10(89nt)：3’ACCTGCCCCT_TAGCCACAAGGTCTACATG_CG_TAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTA_TTGC  5’

F11(89nt)：5’ATGATGAGCTA_TTGCACTACTGG_CCA_AATGTGGGCCCGCAG_TAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAA_CCT_GACCAGTGCTGATCATTTATA  3’

R12(92nt)：3’TGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAGCTCGAGCAGC 5’

2)获取肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)基因：

(1)第1轮PCR反应：将两条引物F1、R2，F3、R4，F5、R6，F7、R8，F9、R10，F11、R12既作为引物，又作为模板，分别生成产物RF1、RF2、RF3、RF4、RF5、RF6；

(2)第2轮PCR反应：以RF1与RF2为模板、引物，合成产物RF7；以RF3与RF4为模板、引物，合成产物RF8；以RF5与RF6为模板、引物合成产物RF9；

(3)第3轮PCR反应：以RF8与RF9为模板引物，合成产物RF11；

(4)第4轮PCR反应：以RF7与RF11为模板、引物，合成产物RF12；用灭菌超纯水补齐，进行PCR扩增，反应结束后，取PCR产物经琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果。

所述在第1轮PCR反应中：反应体积为50μl，反应体系为：10×Buffer(with Mg²⁺)为5μl，pfu酶为0.5μl，dNTP(2.5mmol/L)为4μl，引物(50umol/L)F1，F3，F5，F7，F9，F11为0.5μl，引物(50umol/L)R2，R4，R6，R8，R10，R12为0.5μl。

所述在第1轮PCR反应中，可用灭菌超纯水补齐至50μl，立即进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性35s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min。

所述在第4轮PCR反应中：以RF7与RF11为模板、引物，合成产物RF12；用灭菌超纯水补齐至100μl，立即进行PCR扩增，PCR反应条件均为：95℃变性4min；95℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min，反应结束后，取5μlPCR产物经1.2％琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果。

本发明通过在FasL cDNA序列的N端通过Linker连接上精氨酸-赖氨酸-精氨酸(Arg-Lys-Arg)，利用重叠PCR技术获得完整的RGD-rhFasL cDNA全序列，此序列与GenBank上公布的FasL cDNA全序列有明显差别，但其翻译的氨基酸序列没有改变。RGD-rhFasL蛋白在原核表达菌E.coli BL21(DE3)中高表达，纯化后的蛋白具有与细胞黏附的特性和诱导肿瘤细胞凋亡的活性。这说明改变后的RGD-rhFasL全序列具有全新性，利用此序列构建的重组体可以原核表达并能纯化到高浓度、高纯度、高活性的RGD-rhFasL蛋白。RGD-rhFasL蛋白及其抗体的开发将具有一定的科学研究和经济前景。

附图说明

图1为PCR产物电泳图。在图1中，M：DNA marker；1、RF12(914bp)；2、RF11(610bp)；3、RF7(319bp)；4、RF8(311bp)；5、RF9(314bp)；6、RF1(171bp)；7、RF2/3/4/5(163bp)；8、RF6(166bp)。

图2为重组pGEX-5X-1/RGD-rhFasL质粒的双酶切鉴定。在图2中，M：DNA marker；1：重组pGEX-5X-1/RGD-rhFasL质粒；2：BamH I和Xho I双酶切pGEX-5X-1/RGD-rhFasL质粒。

图3为RGD-rhFasL表达及纯化的SDS-PAGE分析。在图3中，1：空载体未诱导；2：空载体加IPTG诱导；3：重组菌未诱导；4：重组菌加IPTG诱导；5：破碎上清；6：破碎沉淀；7：纯化蛋白；M：marker。

图4为RGD-rhFasL对胶质瘤细胞U138的细胞毒效应。在图4中，横坐标为Concentration(g/ml)，纵坐标为cell death rate(％)；◆为RGD-rhFasL。

图5为不同处理组H22小鼠肿瘤体积和重量比较图。在图5中，横坐标为rhFasL，RGD-rhFasL，ADM，control，纵坐标为The tumor volume(mm³)and weight(mg)；

为tumorweight，□为tumor volue。

图为6不同处理组H22小鼠体重增长比较图。在图6中，横坐标为rhFasL，RGD-rhFasL，ADM，control，纵坐标为The increase of body weight(g)。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

1)设计引物：

从GenBank上查得人Fas配体cDNA全序列，在其N端通过Linker加上精氨酸-赖氨酸-精氨酸(Arg-Lys-Arg)，获得编码肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的原始基因序列：

GGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCCCCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGCCAGCTCTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGTGCCCAGAAGGCCTGGTCAAAGGAGGCCACCACCACCACCGCCACCGCCACCACTACCACCTCCGCCGCCGCCGCCACCACTGCCTCCACTACCGCTGCCACCCCTGAAGAAGAGAGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGTGATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCTACAGAAGGAGCTGGCAGAACTCCGAGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATCATCTTTGGAGAAGCAAATAGGCCACCCCAGTCCACCCCCTGAAAAAAAGGAGCTGAGGAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCAAGGTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAAGTATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCTGAGCCACAAGGTCTACATGAGGAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTACTGCACTACTGGGCAGATGTGGGCCCGCAGCAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAATCTTACCAGTGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAG，其中加横线部分代表肿瘤靶向性特异结合多肽序列；根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，在不影响氨基酸序列的前提下，将肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的核苷酸序列修改为：

GGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCC_GCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGC_GAGC_AGTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGTGCCC_CG_CCG_TCCTGG_CCA_GCG_TCG_TCCACC_GCC_CCCACCGCC_TCCGCCACCACT_GCCACCTCC_TCC_TCCGCCGCCACC_TCTGCCTCCACT_GCCGCTGCCACCCCTGAAGAAG_CG_TGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGT_TATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCT_GCAGAAGGAGCT_TGCAGAACTCCG_TGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATC_TTCTTTGGAGAAGCAAAT_TGGCCA_TCC_GAGTCCACCCCCTGA_GAAAAAGGA_ACTG_CG_TAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCA_CG_TTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAA_ATATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCT_TAGCCACAAGGTCTACATG_CG_TAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTA_TTGCACTACTGG_CCA_AATGTGGGCCCGCAG_TAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAA_CCT_GACCAGTGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAG；

将修改后的肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)序列分成12个长引物片段，分别命名为F1，R2，F3，R4，F5，R6，F7，R8，F9，R10，F11，R12，每两条引物之间有15个碱基互补，利用引物F1和R12引入BamH I和Xho I酶切位点，加粗碱基是改变后的碱基位点，所述12个长引物片段为：

F1(97nt)：5’CAGCCATGGGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCC_GCAG  3’

R2(89nt)：3’TACCCATATCC_GCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGC_GAGC_AGTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGT  5’

F3(89nt)：5’CTGTCCAACCTCTGTGCCC_CG_CCGTCCTGG_CCA_GCG_TCGTCCACC_GCC_CCCACCGCC_TCCGCCACCACT_GCCACCTCC_TCC_TCCGCCGC  3’

R4(89nt)：3’CTCC_TCC_TCCGCCGCCACC_TCTGCCTCCACT_GCCGCTGCCACCCCTGAAGAAG_CG_TGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGT_T  5’

F5(89nt)：5’CTGTGTCTCCTTGT_TATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCT_GCAGAAGGA  3’

R6(89nt)：3’CCACCT_GCAGAAGGAGCT_TGCAGAACTCCG_TGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATC_TTCTTTGGAGAAGCAAAT_TGGCCA_TCC_GA  5’

F7(89nt)：5’AAAT_TGGCCA_TCC_GAGTCCACCCCCTGA_GAAAAAGGA_ACTG_CG_TAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCA_CG_TTCCATGCCT  3’

R8(89nt)：3’TCA_CG_TTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAA_ATATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAA  5’

F9(89nt)：5’TGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCT_TAGCC  3’

R10(89nt)：3’ACCTGCCCCT_TAGCCACAAGGTCTACATG_CG_TAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTA_TTGC  5’

F11(89nt)：5’ATGATGAGCTA_TTGCACTACTGG_CCA_AATGTGGGCCCGCAG_TAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAA_CCT_GACCAGTGCTGATCATTTATA  3’

R12(92nt)：3’TGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAGCTCGAGCAGC  5’

2)肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)基因的获得：

(1)第1轮PCR反应：将两条引物F1、R2，F3、R4，F5、R6，F7、R8，F9、R10，F11、R12既作为引物，又作为模板，分别生成产物RF1、RF2、RF3、RF4、RF5、RF6；反应体积为50μl，反应体系为：10×Buffer(with Mg²⁺)为5μl，pfu酶为0.5μl，dNTP(2.5mmol/L)为4μl，引物(50umol/L)F1，F3，F5，F7，F9，F11为0.5μl，引物(50umol/L)R2，R4，R6，R8，R10，R12为0.5μl；用灭菌超纯水补齐至50μl，立即进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性35s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min；

(2)第2轮PCR反应：以RF1与RF2为模板、引物，合成产物RF7；以RF3与RF4为模板、引物，合成产物RF8；以RF5与RF6为模板、引物合成产物RF9；

(3)第3轮PCR反应：以RF8与RF9为模板引物，合成产物RF11；

(4)第4轮PCR反应：以RF7与RF11为模板、引物，合成产物RF12；用灭菌超纯水补齐至100μl，立即进行PCR扩增，PCR反应条件均为：95℃变性4min；95℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min，反应结束后，取5μlPCR产物经1.2％琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果(参见图1)。

以下通过重组体的构建、表达、纯化和体内外生物学活性检测以证实RGD-rhFasL基因序列的有效性。

3)构建肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)重组体：

(1)PCR产物的纯化回收：参照Agaose Gel DNA Extraction Kit说明进行；

(2)PCR产物与pGEX-5X-1载体的酶切回收：将pGEX-5X-1载体和已纯化回收的PCR产物分别用BamH I和Xho I酶切，酶切体积为50μl，于37℃酶切6h，得到酶切产物；

(3)酶切产物的纯化回收：参照Agaose Gel DNA Extraction Kit说明进行；

(4)连接目的基因与载体：连接反应按T4DNA连接酶的说明书进行，反应体积为10μl，于16℃连接过夜，得到重组体。

4)肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的表达：

(1)转化肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)重组体：

a.按常规方法制备感受态细胞；

b.按常规方法重组体转化E.coli BL21(DE3)菌。

(2)阳性重组质粒的表达鉴定：

a.菌落PCR的初步鉴定：挑单菌落到含有20μl超纯水的离心管中，于水浴锅中煮沸10min后，离心，取上清做模板，以pGEX-5X-1载体的通用引物进行菌落PCR初步鉴定，反应体积为50μl，反应程序为：95℃预变性4min；95℃变性40s，56℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸10min，反应结束后，取5μl PCR产物经1.2％琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果，若通用引物和特异引物为阳性，则进入下一步骤，若通用引物和特异引物为阴性，则重新鉴定；

b.质粒的小量提取：经菌落PCR初筛后，阳性克隆再提质粒，质粒的小量提取参照Plasmid Mini Kit说明进行；

c.重组质粒的酶切鉴定：用限制性内切酶BamH I和Xho I分别对所提取的质粒进行单酶切和双酶切鉴定，酶切反应体系参照上述酶切产物的纯化回收步骤操作方法进行，将酶切后的产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测分析(参见图2)；

d.序列测定：将经菌落PCR初筛和酶切鉴定的阳性重组质粒测序，测定结果用DNAstar软件进行基因序列分析，若测序结果正确，则进入下一步骤，若测序结果不正确，则重复阳性重组质粒的鉴定。

(3)肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的原核表达：

a.重组蛋白的诱导表达：挑选测序正确的重组质粒pGEX-5X-1/RGD-rhFasL的E.coliBL21(DE3)单菌落，30℃250rpm/min振荡培养过夜，1∶100放大培养到A₆₀₀值0.6～0.8时，加入IPTG进行诱导表达，并且用不同IPTG浓度、不同的诱导时间进行诱导，筛选出高表达的阳性克隆。IPTG终浓度为0.7mmol/L时，诱导12h表达量最高，以相同条件下不加IPTG诱导的菌株和IPTG诱导含空载体的菌株作为对照；

b.表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定：将诱导后的菌样10000r/min离心1min，弃上清，沉淀用1/10菌液体积的TE溶液(50mM Tris、2mM EDTA，pH8.3)重悬，加入1×SDS凝胶上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟，离心取上清留样备用。表达量高的阳性克隆菌，培养，收集菌体，进行超声波破碎，上清和沉淀分别取50μl进行SDS-PAGE电泳，其它4℃备用。经考马斯亮蓝染色，观察结果(参见图3)；

5)GST柱的装配及重组蛋白的纯化：

(1)将溶于乙醇的树脂重新悬浮；

(2)吸取2ml装于配套的纯化柱中，静置至树脂沉积；

(3)打开柱阀门，待柱中液体流干后，用10倍柱体积的4℃PBS洗涤，除去乙醇；

(4)用4℃PBS稀释上清中的融合蛋白，将样品过柱；

(5)加入20倍柱体积的4℃PBS洗涤；

(6)10-15倍柱体积的新鲜10mM谷胱苷肽Elution Buffer(0.154g还原型谷胱苷肽溶解在50ml 50mM Tris-HCl，pH8.0)将目的蛋白洗脱，收集各管进行12％的SDS-PAGE电泳；

(7)10倍柱体积的4℃PBS洗涤。

6)重组蛋白的体外生物学活性检测

本发明所述的肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的体外生物学活性检测按经典的MTT法进行，其步骤为：

(1)U138细胞用加有10％小牛血清的DMEM培养基培养，用胰酶消化细胞后，在显微镜下计数，调整细胞浓度为1.0×10⁵细胞/ml，并将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl(1.0×10⁵细胞/孔)，37℃，5％CO₂培养过夜至细胞贴满板壁80％以上；

(2)肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)每个剂量各测两个孔，每孔加0.1ml，以后各孔用含3％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液做倍比稀释，即融合蛋白起始浓度为50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml，1.56μg/ml，37℃，5％CO₂培养12h；

(3)加入20μlMTT(7.5g/L)继续培养4h，加100μL异丙醇，于波长570nm测定吸光度(A)值，并计算抑制率(％)。实验重复3次，取其平均值。(参见图4)

抑制率＝(1-实验组的A值/对照组的A值)×100％。

7)重组蛋白的体内生物学活性检测

本发明所述的肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的体内生物学活性检测按进行，其步骤为：

(1)从移植鼠源性肝癌细胞H22的小白鼠腹腔，用一次性注射器取出肝癌细胞H22，显微镜下用计数板计数，计算细胞浓度，并用0.01mol/L PBS pH7.2稀释至约1×10⁷个细胞/mL，取4-6周龄的BALB/C小鼠(平均体重20±2g)40只，右前腋部皮下注射H22细胞0.1mL；

(2)每天观察小鼠肿瘤的大小，待皮下肿瘤生长至3天左右时，将动物随机分成以下4组(每组10只)进行体内实验：①生理盐水对照组(100μL/只)；②rhFasL对照组(2mg/kg)；③RGD-rhFasL治疗组(2mg/kg)；④阿霉素(ADM)阳性对照组(100mg/kg)。通过皮下注射给药，每天一次，连续治疗7天。

(3)末次给药后24小时，再次称量体重，然后用颈推脱臼法处死动物，迅速分离出肿瘤组织称其湿重，根据公式计算出肿瘤生长抑制率，并进行统计分析。自第一天给药开始每天观察肿瘤生长及小鼠状况，并用游标卡尺每天按时测一次肿瘤大小(长和宽)，利用公式V＝长×宽×宽×0.52.计算肿瘤大小。

肿瘤生长抑制率可按下列公式计算：

抑制率＝(对照组瘤重均值一治疗组瘤重均值)/对照组瘤重均值×100％(参见图5)

同时计算小鼠治疗前后体重变化，作为衡量治疗药物毒副作用的指标：

体重变化率＝(治疗后体重均值-治疗前体重均值)/治疗前体重均值×100％(参见图6)

经实验证明，本发明效果如下：

1)通过重叠PCR法，获得RGD-rhFasL cDNA全序列。连接至表达载体pGEX-5X-1，DNA测序结果显示，重组表达载体序列与理论序列完全吻合。

2)通过优化表达条件，实现RGD-rhFasL在大肠杆菌中的高效表达，含重组质粒pGEX-5X-1/RGD-rhFasL的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达后，通过不同的诱导时间和诱导剂浓度对重组菌进行诱导表达，确定其最适表达条件为IPTG终浓度为0.7mmol/L、30℃诱导12h。目的蛋白主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％以上。洗涤并溶解包涵体，离心取上清过GST柱纯化。经SDS-PAGE分析在Mr62000附近有一特异条带，符合目的蛋白理论推算值(Mr约62000)，扫描分析显示其纯度达95％以上(见图3)。

3)体外活性实验显示RGD-rhFasL融合蛋白对胶质瘤细胞U138有明显的杀伤活性，通过MTT法实验发现，纯化后得到的蛋白可以诱导胶质瘤细胞U138发生细胞凋亡，并呈现处剂量依赖性。在浓度为1.562μg/ml时，抑制率为24％；在浓度为50.0μg/ml时，抑制率为65％，表明我们纯化的融合蛋白具有一定的生物学活性(参见图4)。

4)体内实验显示：RGD-rhFasL对小鼠移植瘤H22的生长具有明显的抑制作用。RGD-rhFasL肿瘤抑制率为62.5％，与相同剂量的rhFasL(肿瘤抑制率为51.3％)相比，疗效有差异(P＜0.05)(参见图5)。在相同饲养条件下，各实验组体重增加与对照组相比差异异常显著(P＜0.01)，其中ADM治疗组体重增加最少，其毒性可能对小鼠生长有影响，与RGD-rhFasL组及FasL组相比，组间差异显著(P＜0.05)(参见图6)；RGD-rhFasL组体重增加比rhFasL组略高，组间差异不显著(P＞0.05)；但是RGD-rhFasL的抑瘤率比rhFasL明显提高，所以可以推断RGD-rhFasL的毒副作用比FasL有较轻趋势。

序列表

编码RGD-rhFas配体融合蛋白的原始基因序列为：

GGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCCCCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGCCAGCTCTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGTGCCCAGAAGGCCTGGTCAAAGGAGGCCACCACCACCACCGCCACCGCCACCACTACCACCTCCGCCGCCGCCGCCACCACTGCCTCCACTACCGCTGCCACCCCTGAAGAAGAGAGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGTGATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCTACAGAAGGAGCTGGCAGAACTCCGAGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATCATCTTTGGAGAAGCAAATAGGCCACCCCAGTCCACCCCCTGAAAAAAAGGAGCTGAGGAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCAAGGTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAAGTATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCTGAGCCACAAGGTCTACATGAGGAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTACTGCACTACTGGGCAGATGTGGGCCCGCAGCAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAATCTTACCAGTGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAG。

RGD-rhFasL的核苷酸序列为：

GGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCC_GCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGC_GAGC_AGTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGTGCCC_CG_CCG_TCCTGG_CCA_GCG_TCG_TCCACC_GCC_CCCACCGCC_TCCGCCACCACT_GCCACCTCC_TCC_TCCGCCGCCACC_TCTGCCTCCACT_GCCGCTGCCACCCCTGAAGAAG_CG_TGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGT_TATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCT_GCAGAAGGAGCT_TGCAGAACTCCG_TGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATC_TTCTTTGGAGAAGCAAAT_TGGCCA_TCC_GAGTCCACCCCCTGA_GAAAAAGGA_ACTG_CG_TAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCA_CG_TTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAA_ATATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCT_TAGCCACAAGGTCTACATG_CG_TAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTA_TTGCACTACTGG_CCA_AATGTGGGCCCGCAG_TAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAA_CCT_GACCAGTGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAG；

RGD-rhFasL序列的12个长引物片段为：

F1(97nt)：5’CAGCCATGGGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCC_GCAG  3’

R2(89nt)：3’TACCCATATCC_GCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGC_GAGC_AGTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGT  5’

F3(89nt)：5’CTGTCCAACCTCTGTGCCC_CG_CCG_TCCTGG_CCA_GCG_TCG_TCCACC_GCC_CCCACCGCC_TCCGCCACCACT_GCCACCTCC_TCC_TCCGCCGC  3’

R4(89nt)：3’CTCC_TCC_TCCGCCGCCACC_TCTGCCTCCACT_GCCGCTGCCACCCCTGAAGAAG_CG_TGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGT_T 5’

F5(89nt)：5’CTGTGTCTCCTTGT_TATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCT_GCAGAAGGA  3’

R6(89nt)：3’CCACCT_GCAGAAGGAGCT_TGCAGAACTCCG_TGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATC_TTCTTTGGAGAAGCAAAT_TGGCCA_TCC_GA  5’

F7(89nt)：5’AAAT_TGGCCA_TCC_GAGTCCACCCCCTGA_GAAAAAGGA_ACTG_CG_TAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCA_CG_TTCCATGCCT  3’

R8(89nt)：3’TCA_CG_TTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAA_ATATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAA  5’

F9(89nt)：5’TGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCT_TAGCC  3’

R10(89nt)：3’ACCTGCCCCT_TAGCCACAAGGTCTACATG_CG_TAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTA_TTGC  5’

F11(89nt)：5’ATGATGAGCTA_TTGCACTACTGG_CCA_AATGTGGGCCCGCAG_TAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAA_CCT_GACCAGTGCTGATCATTTATA  3’

R12(92nt)：3’TGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAGCTCGAGCAGC  5’

Claims (5)

1.肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白，其特征在于为：

应用重叠PCR技术，在人Fas配体cDNA全序列N端通过Linker加上精氨酸-赖氨酸-精氨酸，获得编码肿瘤靶向特异性结合多肽RGD与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)的原始基因序列，并在大肠杆菌中获得高效表达。

2.如权利要求1所述的肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计引物：

从GenBank上查得人Fas配体cDNA全序列，在其N端加上酪氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-甲硫氨酸-亮氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-酪氨酸氨基酸作为Linker，再在其N端加上精氨酸-赖氨酸-精氨酸，获得编码RGD-rhFas配体融合蛋白的原始基因序列为：

GGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCCCCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGCCAGCTCTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGTGCCCAGAAGGCCTGGTCAAAGGAGGCCACCACCACCACCGCCACCGCCACCACTACCACCTCCGCCGCCGCCGCCACCACTGCCTCCACTACCGCTGCCACCCCTGAAGAAGAGAGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGTGATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCTACAGAAGGAGCTGGCAGAACTCCGAGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATCATCTTTGGAGAAGCAAATAGGCCACCCCAGTCCACCCCCTGAAAAAAAGGAGCTGAGGAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCAAGGTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAAGTATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCTGAGCCACAAGGTCTACATGAGGAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTACTGCACTACTGGGCAGATGTGGGCCCGCAGCAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAATCTTACCAGTGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAG，其中加横线部分代表Linker-RGD序列；

根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，在不影响氨基酸序列的前提下，将RGD-rhFasL的核苷酸序列修改为：

GGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCC_GCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGC_GAGC_AGTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGTGCCC_CG_CCG_TCCTGG_CCA_GCG_TCG_TCCACC_GCC_CCCACCGCC_TCCGCCACCACT_GCCACCTCC_TCC_TCCGCCGCCACC_TCTGCCTCCACT_GCCGCTGCCACCCCTGAAGAAG_CG_TGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGT_TATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCT_GCAGAAGGAGCT_TGCAGAACTCCG_TGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATC_TTCTTTGGAGAAGCAAAT_TGGCCA_TCC_GAGTCCACCCCCTGA_GAAAAAGGA_ACTG_CG_TAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCACGTTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAAAT_ATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCT_TAGCCACAAGGTCTACATG_CG_TAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTA_TTGCACTACTGG_CCA_AATGTGGGCCCGCAGTAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAA_CCT_GACCAGTGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAG；

将修改后的RGD-rhFasL序列分成12个长引物片段，分别命名为F1，R2，F3，R4，F5，R6，F7，R8，F9，R10，F11，R12，每两条引物之间有15个碱基互补，利用引物F1和R12引入BamH I和Xho I酶切位点，加粗碱基是改变后的碱基位点，所述12个长引物片段为：

F1(97nt)：5’CAGCCATGGGCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCAAGCTTATGCAGCAGCCCTTCAATTACCCCAGCAGCCCTTCAATTACCCATATCC_GCAG 3’；

R2(89nt)：3’TACCCATATCC_GCAGATCTACTGGGTGGACAGCAGTGC_GAGC_AGTCCCTGGGCCCCTCCAGGCACAGTTCTTCCCTGTCCAACCTCTGT 5’；

F3(89nt)：5’CTGTCCAACCTCTGTGCCC_CG_CCG_TCCTGG_CCA_GCG_TCG_TCCACC_GCC_CCCACCGCC_TCCGCCACCACT_GCCACCTCC_TCC_TCCGCCGC 3’；

R4(89nt)：3’CTCC_TCC_TCCGCCGCCACC_TCTGCCTCCACT_GCCGCTGCCACCCCTGAAGAAG_CG_TGGGAACCACAGCACAGGCCTGTGTCTCCTTGT_T 5’；

F5(89nt)：5’CTGTGTCTCCTTGT_TATGTTTTTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAGGATTGGGCCTGGGGATGTTTCAGCTCTTCCACCT_GCAGAAGGA 3’；

R6(89nt)：3’CCACCT_GCAGAAGGAGCT_TGCAGAACTCCG_TGAGTCTACCAGCCAGATGCACACAGCATC_TTCTTTGGAGAAGCAAAT_TGGCCA_TCC_GA 5’；

F7(89nt)：5’AAAT_TGGCCA_TCC_GAGTCCACCCCCTGA_GAAAAAGGA_ACTG_CG_TAAAGTGGCCCATTTAACAGGCAAGTCCAACTCA_CG_TTCCATGCCT 3’；

R8(89nt)：3’TC_ACG_TTCCATGCCTCTGGAATGGGAAGACACCTATGGAATTGTCCTGCTTTCTGGAGTGAA_ATATAAGAAGGGTGGCCTTGTGATCAA 5’；

F9(89nt)：5’TGGCCTTGTGATCAATGAAACTGGGCTGTACTTTGTATATTCCAAAGTATACTTCCGGGGTCAATCTTGCAACAACCTGCCCCT_TAGCC 3’；

R10(89nt)：3’ACC_TGCCCCTTAGCCACAAGGTCTACATG_CG_TAACTCTAAGTATCCCCAGGATCTGGTGATGATGGAGGGGAAGATGATGAGCTA_TTGC 5’；

F11(89nt)：5’ATGATGAGCTA_TTGCACTACTGG_CCA_AATGTGGGCCCGCAG_TAGCTACCTGGGGGCAGTGTTCAA_CCT_GACCAGTGCTGATCATTTATA 3’；

R12(92nt)：3’TGCTGATCATTTATATGTCAACGTATCTGAGCTCTCTCTGGTCAATTTTGAGGAATCTCAGACGTTTTTCGGCTTATATAAGCTCGAGCAGC 5’；

2)获取肿瘤靶向特异性结合多肽与重组人Fas配体融合蛋白(RGD-rhFasL)基因：

(1)第1轮PCR反应：将两条引物F1、R2，F3、R4，F5、R6，F7、R8，F9、R10，F11、R12既作为引物，又作为模板，分别生成产物RF1、RF2、RF3、RF4、RF5、RF6；

(2)第2轮PCR反应：以RF1与RF2为模板、引物，合成产物RF7；以RF3与RF4为模板、引物，合成产物RF8；以RF5与RF6为模板、引物合成产物RF9；

(3)第3轮PCR反应：以RF8与RF9为模板引物，合成产物RF11；

(4)第4轮PCR反应：以RF7与RF11为模板、引物，合成产物RF12；用灭菌超纯水补齐，进行PCR扩增，反应结束后，取PCR产物经琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果。

3.如权利要求2所述的肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白的制备方法，其特征在于所述在第1轮PCR反应中：反应体积为50μl，反应体系为：10×Buffer(with Mg²⁺)为5μl，pfu酶为0.5μl，摩尔浓度2.5mmol/L的dNTP为4μl，摩尔浓度50umol/L的引物F1，F3，F5，F7，F9，F11为0.5μl，摩尔浓度50umol/L的引物R2，R4，R6，R8，R10，R12为0.5μl。

4.如权利要求2所述的肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白的制备方法，其特征在于所述在第1轮PCR反应中，用灭菌超纯水补齐至50μl，立即进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性35s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min。

5.如权利要求2所述的肿瘤靶向性与重组人Fas配体融合蛋白的制备方法，其特征在于所述在第4轮PCR反应中：以RF7与RF11为模板、引物，合成产物RF12；用灭菌超纯水补齐至100μl，立即进行PCR扩增，PCR反应条件均为：95℃变性4min；95℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min，反应结束后，取5μlPCR产物经1.2％琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果。

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