CN105524610A - 多模态白细胞分子探针化合物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多模态白细胞分子探针化合物(式I)的制备方法及应用，多模态影像探针化合物结合多种影像功能于一体，便于临床研究与治疗的方法的交互验证，有利于加快临床应用的转化，拥有非常可观的市场开发前景，它令追踪白细胞的激活时间，转移，和定位的即时评估成为可能。这一项目的成功将开创性地为各种免疫白细胞的研究和临床检测提供一种高特异性，简便易行的多功能影像手段。
Description
技术领域
本发明涉及一系列靶向甲酰肽受体并具有体内白细胞造影示踪及体外病理组织显色的多功能探针化合物。该类分子探针化合物由甲酰肽受体靶向小分子肽、核影像同位素和小分子荧光发光基团三部分组成，集活体核、光显像及组织、血液显色分析功能于一体，可应用于临床上各种无菌和有菌炎症的核显像、荧光显像及病理组织显色、血液分析。本发明涉及该系列化合物、合成方法，并已通过动物的有菌和无菌炎症模型实验进一步验证了其药理作用。
背景技术
目前，白细胞的激活和炎症部位的侵入在临床上进行精确的定量确诊仍是个难题，其中能够及时掌握白细胞的激活原因、炎症病变组织内的侵入及其变化过程在诊断和治疗中起着至关重要的作用如参考文献[1,2]。临床上使用最多的方法是通过各种参数和影像学方法来判断炎症的部位、原因、过程和程度，并进行某一针对性地实施治疗，其中包括核影像方法，如FDG/PET参考文献[3,4]、放射性标记的白血细胞(111In或99mTc-WBC/ECT)参考文献[5]。FDG/PET的缺点是其对炎症的特异性差，仅用于某些特定的病理状态。自上世纪70年代以来，111In/99mTc-WBC依然是炎症影像的金标准参考文献[5]，其标记后的白细胞能自发寻找并汇集于炎症发生部位，但操作复杂，成本高昂，灵敏性低，且目前还没有111In/99mTc-WBC用于无菌炎症显像的报道。
为了更好地进行炎症临床影像的研究，迫切需要一种特异性高、简单易行的多模态分子探针化合物，不仅能运用于体内显像，也可用于体外组织显色、血液分析验证。
参考文献如下：
1.Lazzeri,E.,etal.,RadionuclideImagingofInfectionandInflammation.Vol.XVI.2013:Springer.
2.Kielland,A.andH.Carlsen,Molecularimagingoftranscriptionalregulationduringinflammation.JournalofInflammation,2010.7(1):p.20.
3.FDGPETofInfectionandInflammation.RadioGraphics,2005.25(5):p.1357-1368.
4.Vos,F.J.,F.H.M.Corstens,andW.J.G.Oyen,Imagingofinfectiousdiseasesusing[18F]fluorodeoxyglucosePET.TheQuarterlyJournalofNuclearMedicine&MolecularImaging,2008.52(1):p.17-29.
5.Thakur,M.L.,etal.,Indium-111-labeledautologousleukocytesinman.JournalofNuclearMedicine,1977.18(10):p.1014-21.
发明内容
本发明的目的提供一种模块式排列组合的合成方式，通过一个化学链接基团也就是赖氨酸、半胱氨酸和聚乙二醇，将放射性同位素螯合基团和近红外荧光发光基团，与六肽化合物cFLFLF(cinnamoyl-phenylalanine-(D)leucine-phenylalanine-(D)leucine-phenylalanine)连接，构建一系列靶向FPR的多功能显像、显色试剂，并已通过体外评价实验验证了该系列前体化合物与放射性同位素螯合之后的多模态探针的稳定性、与甲酰肽受体(FPR)的结合强度(KD)、在体外和体内各种条件下针对FPR的特异性及动物炎症模型上的有效性。通过多模态白细胞分子探针化合物与FPR的作用，使用核影像、光学影像、体外组织显色和血液分析等显影显色方法，在体内外追踪白细胞的激活，转移和侵入，这种单一多模态白细胞分子探针示踪化合物有利于各种白细胞示踪方法的相互验证，有利于临床上炎症显像技术的普及。
炎症的即时定量显像显色能为各种疾病的诊断和治疗提供一种重要指标。截至目前，临床上仍缺乏一种特异性好，敏感性高且简便易行的影像方法。已有的FDG/PET和67Ga/ECT方法缺乏针对炎症组织和免疫细胞的特异性，而临床金标准方法，111In/99mTc-WBC/ECT又受限于方法本身的操作复杂(需要体外白细胞分离和标记，然后回注病人体内)，灵敏度低、成本高昂，无法得到广泛普及，且也未见有关111In/99mTc-WBC/ECT在无菌炎症显像应用的报道。另外，目前体外组织和体液中白细胞的检测主要是通过抗体类显色试剂来完成。因为与现有活体白细胞显像试剂不是同一化合物，因而无法相互验证分析结果。通过这项发明，我们开发验证了一系列多功能、多模态FPR靶向探针化合物。该系列探针化合物由一个靶向白细胞FPR受体的小分子肽cFLFLF,cFLFLF与放射性同位素螯合基团及荧光发光基团通过化学链接基团(赖氨酸、半胱氨酸和聚乙二醇)构建组成如图1所示，用于炎症的研究，诊断定位及治疗效果的早期评估。即通过该多模态探针结合PET(正电子发射断层扫描)、SPECT(单光子发射计算机断层成像术)、活体荧光光学显像仪、荧光显微镜、激光扫描共聚焦荧光显微镜或流式细胞仪等技术，诊断炎症病理变化过程中免疫白细胞的激活，转移和侵入。本发明涵盖了这一类化合物的模块式组成、合成方法及其未来在临床上的应用范围。
本发明通过以下技术方案解决了上述技术问题：
本发明使用具有甲酰肽受体(FPR，高表达于免疫激活的白细胞表面)特异靶向性的六肽化合物cFLFLF，与核素和荧光基团结合，在血液和炎症病灶组织中与白细胞结合并示踪白细胞在活体体内的分布。该方法避免了病人血液白细胞的分离和标记。探针化合物直接通过静脉注射进入患者体内，探针与体内免疫白细胞的特异性结合，通过活体扫描诊断炎症并发部位和程度。在体外应用方面，该探针化合物能够选择性的与组织切片或体液中的白细胞结合，再通过各种荧光显色仪器(显微镜或流式细胞仪等)达到定量示踪白细胞的目的。该系列多功能探针化合物cFLFLF-Fl-99mTc(式IV),cFLFLF-Fl-68Ga(式VI),andcFLFLF-Fl-Al18F(式VII)已初步进行了一系列体内外评估实验。体内药物评估实验包括：cFLFLF-Fl-99mTc小鼠中脑动脉闭塞实验后，大脑体外的放射性自显影和近红外荧光显像，cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)在主动脉弓和腹主动脉上的摄取分布，cFLFLF-Fl-Al18F小鼠缺血再灌注后，心肌组织体外切片的放射性自显影和近红外荧光显像，以及cFLFLF-Fl-99mTc在流式细胞仪上的应用；体外药物评估实验包括：在血清中的稳定性以及与人体中性粒细胞的结合常数数据。
本发明的另一个优点是所有前体化合物的合成都采用了固相合成方法，此方法简化了中间化合物的分离提纯，降低了化合物合成制备难度以及成本，有利于技术推广和普及。一个方面，本发明提供了FPR靶向多模态白细胞分子探针化合物的前体化合物与放射性同位素络合后生成的多模态白细胞分子探针化合物(式I)：
式I如图8所示。
其中：
cFLFLF代表六肽化合物cinnamoyl-phenylalanine-(D)leucine-phenylalanine-(D)leucine-phenylalanine；
linker代表聚乙二醇PEG、赖氨酸和半胱氨酸；
fluorophore(Fl)代表荧光基团或取代基团：4-((E)-2-((E)-2-(3-((E)-2-(3,3-dimethyl-1-(4-sulfonatobutyl)-3H-indol-1-ium-2-yl)vinyl)cyclohex-2-en-1-ylidene)ethylidene)-3,3-dimethylindolin-1-yl)butane-1-sulfonate或-H；
chelator(Che)代表同位素螯合基团：6-肼基烟酸(HYNIC)或1,4,7-氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)；
radionuclide(RN)代表放射性同位素99mTc、68Ga或Al18F。
另一方面，所述化合物为cFLFLF-Fl-99mTc(式II),cFLFLF-Fl-68Ga(式III),cFLFLF-Fl-Al18F(式IV),cFLFLF-PEG24-99mTc(式V),cFLFLF-PEG24-68Ga(式VI),cFLFLF-PEG24-Al18F(式VII)；
式II，cFLFLF-Fl-99mTc；
式III，cFLFLF-Fl-68Ga；
式IV，cFLFLF-Fl-Al18F:
式V，cFLFLF-PEG24-99mTc；
式VI,cFLFLF-PEG24-68Ga；
式VII,cFLFLF-PEG24-Al18F:
另一方面，本发明提供了上述探针化合物【cFLFLF-Fl-99mTc(式II),cFLFLF-Fl-68Ga(式III)，和cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)的制备方法(见具体实施方法)。
所述多模态白细胞核素探针化合物cFLFLF-Fl-99mTc(式II)、cFLFLF-Fl-68Ga(式III)或cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)前体化合物：使用多肽合成仪，通过标准的氯甲酸芴甲酯(Fmoc)化学，在王树脂(wangresin)上逐步耦联生成化合物1，脱去侧链的保护基团4-甲基三苯甲基(MTT)后，与Fmoc-N-amido-PEG24-Acid耦联生成化合物2，进一步脱去Fmoc保护，与N-(9-芴)-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)耦联生成化合物3，在化合物3的结构上去Fmoc保护后，与2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(叔丁氧基羰基)肼基)烟酸(NHS-HYNIC-Boc)或2,2'，2”-(6-(4-异硫氰酸苯)-1,4-diazonane-1,4,7-三基)三乙酸(p-SCN-Bn-NOTA)耦联，然后在质量浓度为1％的三氟乙酸－二氯甲烷中将wangresin切割和半胱氨酸侧链巯基上的保护基团三苯甲基(Trt)脱掉，生成cFLFLFK-PEG24(SH)-HYNIC(化合物4)或cFLFLFK-PEG24(SH)-NOTA(化合物5)，经高效液相色谱法HPLC纯化之后，化合物4或化合物5上的巯基分别与IR-783耦联生成双标记探针前体化合物cFLFLF-Fl-HYNIC(化合物6)或双标记探针前体化合物cFLFLF-Fl-NOTA(化合物7)。
(2)cFLFLF-Fl-99mTc(式II)：取50μgcFLFLF-Fl-HYNIC(6)，称取6.7mg的甘氨酸(tricine)放入微量离心管(eppendorf)中，加入200μL生理盐水溶解，再加入200μL浓度为5mg/mL三(3-磺酸苯基)-膦，钠盐(TPPTS)水溶液，最后加入20μL1mg/mL氯化亚锡盐酸溶液，其中盐酸溶液摩尔浓度为1mol/l，然后马上加入0.4mL浓度为20mCi[99mTc]pertechnetate([99mTc]锝)，60℃反应10分钟，室温下静置10分钟，使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，再加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-99mTc(6)。
或(2)cFLFLF-Fl-68Ga(式III):在一个含有400μL氯化铵水溶液的eppendorf小管中依次加入0.4mL浓度为20mCi[68Ga]GaCl3的盐酸淋洗液和200μL含有50μgcFLFLF-Fl-NOTA(7)的甲醇溶液；其中氯化铵水溶液当量浓度为0.1N、pH5.5，在40℃的水浴箱中孵育40分钟，使用氮气将甲醇吹除，然后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-68Ga(式III)。
或(2)cFLFLF-Fl-Al18F(式IV):一个装有200μL含有浓度为20mCi[18F]F-的醋酸钠水溶液的eppendorf管中，依次加入50μL含有氯化铝的醋酸钠水溶液，和100μL二甲基亚砜(DMSO)，其中氯化铝的摩尔浓度为20mmol/l，在室温下静置5分钟后，加入100μL含有50μgcFLFLF-Fl-NOTA(7)的醋酸钠水溶液，加盖，继续在沸水狱中加热15分钟，醋酸钠水溶液的摩尔浓度为0.5mol/l，pH4.1；加入0.8mL含体积浓度为0.05％三氟乙酸的水溶液，最后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分和有机溶剂分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)。
所述白细胞核素探针化合物cFLFLF-PEG24-99mTc(式V)、cFLFLF-PEG24-68Ga(式VI)或cFLFLF-PEG24-Al18F(式VII)的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)前体化合物：使用多肽合成仪，通过标准的Fmoc化学，在wangresin上逐步耦联生成化合物物2，进一步脱去Fmoc保护后，与NHS-HYNIC-Boc或p-SCN-Bn-NOTA耦联生成化合物8或9，然后在质量浓度为1％的三氟乙酸－二氯甲烷中将wangresin切除，分别生成探针核素前体化合物cFLFLF-PEG24-HYNIC(10)或cFLFLF-PEG24-NOTA(11)，经HPLC纯化，冷冻干燥后得到目标化合物cFLFLF-PEG24-HYNIC(10)或cFLFLF-PEG24-NOTA(11)。
(2)cFLFLF-PEG24-99mTc(式V):取50μgcFLFLF-PEG24-HYNIC(10)，称取6.7mg的tricine放入eppendorf小瓶中，加入200μL生理盐水溶解，再加入200μL浓度为5mg/mLTPPTS水溶液，最后加入20μL浓度为1mg/mL氯化亚锡盐酸溶液，其中盐酸溶液摩尔浓度为1mol/l，再加入0.4mL浓度为20mCi[99mTc]pertechnetate，60℃反应10分钟，室温静置10分钟，使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL甲醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-99mTc(式V)。
或(2)cFLFLF-PEG24-68Ga(式VI):在一个含有400μL氯化铵水溶液的eppendorf小管中依次加入0.4ml浓度为20mCi[68Ga]GaCl3的盐酸淋洗液和200μL含有50μgcFLFLF-PEG24-NOTA(11)的甲醇溶液，其中氯化铵水溶液的当量浓度为0.1N，pH5.5；在40℃的水浴箱中孵育40分钟，使用氮气将甲醇吹除，然后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-68Ga(式VI)。
或(2)cFLFLF-PEG24-Al18F(式VII)：在一个装有200μL含有浓度为20mCi[18F]F-的醋酸钠水溶液的eppendorf管中，依次加入50μL含有氯化铝的醋酸钠水溶液和100μLDMSO，氯化铝浓度为的20mmol/l，室温下静置5分钟后，加入100μL含有cFLFLF-PEG24-NOTA(7)的醋酸钠水溶液，其中醋酸钠水溶液浓度为0.5mol/l，pH4.1,加盖，继续在沸水狱中加热15分钟，加入0.8mL含体积浓度为0.05％三氟乙酸的水溶液，最后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分和有机溶剂分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-Al18F(式VII)。
利用所述的多模态白细胞分子探针化合物制作靶向探针化合物的药物制剂。
利用根据所述的多模态白细胞分子探针化合物制作用于在有菌或无菌炎症诊断定位显像方面的药物制剂。
利用所述的多模态白细胞分子探针化合物制作用于在体外组织细胞染色方面的药物制剂。
在其他方面，本发明提供了包含上述FPR靶向探针化合物的药物制剂。
在其他方面，本发明还提供了上述多模态白细胞分子探针化合物制作用于在有菌或无菌炎症诊断定位显像方面的药物制剂，FPR靶向探针化合物在有菌或无菌炎症诊断定位显像方面的用途(见附图说明)。
在其他方面，本发明还提供了上述多模态白细胞分子探针化合物制作用于在有菌或无菌炎症诊断定位显像方面的药物制剂，FPR靶向探针化合物在体外组织细胞染色方面的用途(见附图说明)。
多模态白细胞分子探针化合物结合多种影像功能于一体，便于临床研究与治疗的方法的交互验证，有利于加快临床应用的转化，拥有非常可观的市场开发前景，它令追踪白细胞的激活时间，转移，和定位的即时评估成为可能。这一项目的成功将开创性地为各种免疫白细胞的研究和临床检测提供一种高特异性，简便易行的多功能影像手段。
附图说明
图1是本发明多模态白细胞分子探针化合物的结构示意图；
图2a是本发明的cFLFLF-Fl-99mTc(式II)在血清中的稳定性示意图
图2b是本发明的cFLFLF-Fl-68Ga(式III)在血清中的稳定性示意图
图2c是本发明的cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)在血清中的稳定性示意图
图3a是本发明的cFLFLF-Fl-99mTc(式II)与人体中性粒细胞的结合常数数据图。
图3b是本发明的cFLFLF-Fl-68Ga(式III)与人体中性粒细胞的结合常数数据图。
图3c是本发明的cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)与人体中性粒细胞的结合常数数据图。
图4a是本发明的注射cFLFLF-Fl-99mTc(式II)小鼠中脑动脉闭塞实验后，大脑体外的放射性自显影图。
图4b是本发明的注射cFLFLF-Fl-99mTc(式II)小鼠中脑动脉闭塞实验后，大脑体外的相应的近红外荧光显像图。
图5是本发明的cFLFLF-Fl-68Ga(式III)在主动脉弓和腹主动脉上的摄取分布图。
图6a是本发明的注射cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)小鼠缺血再灌注后，心肌组织体外切片的放射性自显影图。
图6b是本发明的注射cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)小鼠缺血再灌注后，心肌组织体外切片的相对应的近红外荧光显像图。
图7是本发明的使用cFLFLF-Fl-HYNIC(6)和流式细胞仪定量白细胞数量数据图。其中A：脊髓组织细胞裂解后的分离过程；B：正常(uninjured)和受创(injured)组织细胞裂解液中各种表达FPR的免疫白细胞的数量对比。
图8为本发明的多模态白细胞分子探针化合物结构图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步例示本发明，但所述实施例不是对本发明的限制。
各种试剂来源：各种D－型和L－型氨基酸购自AnaSpec,Inc.；6-Boc-hydrazinonicotinicacid(Boc-HYNIC-NHS)购自SoluLink,Inc.；p-SCN-Bn-NOTA购自Macrocyclics,Inc.；Fmoc-N-amido-PEG24-Acid(BP22036)购自BroadPharm,Inc.；IR－783和其它化学试剂购自Sigma-Aldrich。
放射性同位素来源：[99mTc]pertechnetate发生器和[111In]InCl3来自原子高科股份有限公司；[68Ga]GaCl3发生器购自Echert&Ziegler；[18F]KF由厦门第一人民医院加速器(GEMinitrace)生产。
通用合成、分离提纯、分析鉴定方法:固相多肽合成使用CSBioCo公司的CS136XT自动多肽合成仪完成；分子量的质谱鉴定通过厦门大学化工学院的MALDI-TOF(型号Microflex)完成；前体化合物和标记化合物的提纯鉴定使用了半制备反相高压液相色谱仪(色谱柱：ApolloC18反相柱，5u,250×10mm)，流动相条件为60％的溶剂A(0.1％的三氟乙酸水溶液)、40％的溶剂B(0.1％的三氟乙酸在80％乙腈水溶液)。30分钟后，流动相变为100％的溶剂B；流速为3mL/min，柱温35℃。
动物来源：Sprague-Dawley大鼠以及ApoE-/-和正常小鼠由厦门大学动物中心提供。
显影仪器：放射性自显影使用PerkinElmer'B431200'CyclonePhosphorImagerquantitativefilmlessautoradiographysystem；近红外荧光显像使用XenogenIVISSpectrum；SPECT使用双探头InfiniaHawkeye4；microPET使用Focus-120。
实施例1：使用固相化学方法合成双标记探针前体化合物cFLFLF-Fl-HYNIC(式III)和cFLFLF-Fl-NOTA(式V)，如方案1：
使用多肽合成仪，通过标准的Fmoc化学，在wangresin上逐步耦联生成化合物1，脱去侧链的保护基团MTT后，与Fmoc-N-amido-PEG24-Acid耦联生成化合物2，进一步脱去Fmoc保护，与Fmoc-Cys(Trt)-OH耦联生成化合物3，在化合物3的结构上去Fmoc保护后，分别与NHS-HYNIC-Boc或p-SCN-Bn-NOTA耦联，然后在质量浓度为1％的三氟乙酸－二氯甲烷中将wangresin切割和半胱氨酸侧链巯基上的保护基团Trt脱掉，分别生成化合物4(cFLFLFK-PEG24(SH)-HYNIC)和化合物5(cFLFLFK-PEG24(SH)-NOTA)。HPLC纯化之后，化合物4和化合物5上的巯基分别与IR-783耦联生成双标记探针前体化合物cFLFLF-Fl-HYNIC(式III)和cFLFLF-Fl-NOTA(式V)(如方案1所示)，经HPLC纯化，冷冻干燥得到目标化合物。该化合物通过使用MULDI-TOF质谱仪鉴定分子量。cFLFLF-Fl-HYNIC(式III)的计算分子量和实验分子量分别为3,139和3,138；cFLFLF-Fl-NOTA(式V)的计算分子量和实验分子量分别为3,436和3,436。
方案1的化学合成路线：
实施例2，使用固相化学方法合成ECT探针前体化合物cFLFLF-PEG24-HYNIC(式VIII)，PET探针前体化合物cFLFLF-PEG24-NOTA(式X)如方案2：
使用多肽合成仪，通过标准的Fmoc化学，在wangresin上逐步耦联生成化合物物2，进一步脱去Fmoc保护后，分别与NHS-HYNIC-Boc或p-SCN-Bn-NOTA耦联生成化合物6和化合物7，然后在质量浓度为1％的三氟乙酸－二氯甲烷中将wangresin切除，分别生成ECT探针前体化合物cFLFLF-PEG24-HYNIC(式VIII)和PET探针前体化合物cFLFLF-PEG24-NOTA(式X)(如方案2所示)，经HPLC纯化，冷冻干燥后得到目标化合物。该化合物通过使用MULDI-TOF质谱仪鉴定分子量。cFLFLF-PEG24-HYNIC(式VIII)的计算分子量和实验分子量分别为2,405和2,404；cFLFLF-PEG24-NOTA(式X)的计算分子量和实验分子量分别为2,620和2,619。
方案2化学合成路线：
实施例3，合成多模态白细胞分子探针化合物cFLFLF-Fl-99mTc(式IV)，如方案3：
取50μgcFLFLF-Fl-HYNIC(式III)，称取6.7mg的tricine放入eppendorf小瓶中，加入200μL生理盐水溶解，再加入200μLTPPTS(5mg/mL水溶液)，最后加入20μL1mg/mL氯化亚锡盐酸溶液(1M盐酸溶液)，然后马上加入0.4mL[99mTc]pertechnetate(20mCi)，60℃反应10分钟，室温下静置10分钟，使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，再加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-99mTc(式IV)。
方案3化学合成路线：
实施例4，合成多模态白细胞分子探针化合物cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)和cFLFLF-Fl-Al18F(式VII)，如方案4：
A)在一个含有400μL氯化铵水溶液(0.1N，pH5.5)的eppendorf小管中依次加入20mCi[68Ga]GaCl3的盐酸淋洗液和200μL含有50μgcFLFLF-Fl-NOTA(式V)的甲醇溶液。在40℃的水浴箱中孵育40分钟。使用氮气将甲醇吹除，然后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)。
B)一个装有200μL含有20mCi[18F]F-的醋酸钠水溶液的eppendorf管中，依次加入50μL含有氯化铝(20mM)的醋酸钠水溶液(0.5M，pH4.1)和100μLDMSO。在室温下静置5分钟后，加入100μL含有50μgcFLFLF-Fl-NOTA(式V)的醋酸钠水溶液(0.5M，pH4.1)，加盖，继续在沸水狱中加热15分钟。加入0.8mL含0.05％(v/v)三氟乙酸的水溶液，最后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分和有机溶剂分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-Al18F(式VII)。
方案4化学合成路线：
实施例5，合成ECT探针化合物cFLFLF-PEG24-99mTc(式IX)，如方案5：
取50μgcFLFLF-PEG24-HYNIC(式VIII)，称取6.7mg的tricine放入eppendorf小瓶中，加入200μL生理盐水溶解，再加入200μLTPPTS(5mg/mL水溶液)，最后加入20μL1mg/mL氯化亚锡盐酸溶液(1M盐酸溶液)，再迅速加入0.4mL[99mTc]pertechnetate(20mCi)，60℃反应10分钟，室温静置10分钟，使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL甲醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-99mTc(式IX)。
方案5化学合成路线：
实施例6，合成PET探针化合物cFLFLF-PEG24-68Ga(式XI)和cFLFLF-PEG24-Al18F(式XII)，如方案6：
A)在一个含有400μL氯化铵水溶液(0.1N，pH5.5)的eppendorf小管中依次加入20mCi[68Ga]GaCl3的盐酸淋洗液和200μL含有50μgcFLFLF-PEG24-NOTA(式X)的甲醇溶液。在40℃的水浴箱中孵育40分钟，使用氮气将甲醇吹除，然后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-68Ga(式XI)。
B)在一个装有200μL含有20mCi[18F]F-的醋酸钠水溶液的eppendorf管中，依次加入50μL含有氯化铝(20mM)的醋酸钠水溶液(0.5M，pH4.1)和100μLDMSO。室温下静置5分钟后，加入100μL含有cFLFLF-PEG24-NOTA(式X)的醋酸钠水溶液(0.5M，pH4.1)，加盖，继续在沸水狱中加热15分钟。加入0.8mL含0.05％(v/v)三氟乙酸的水溶液，最后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分和有机溶剂分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-Al18F(式XII)。
方案6化学合成路线：
实施例7，测定多模态探针化合物cFLFLF-Fl-99mTc(式IV),cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)和cFLFLF-Fl-Al18F(式VII)在血清中的稳定性如图2所示。
分别将探针化合物cFLFLF-Fl-99mTc(式IV),cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)和cFLFLF-Fl-Al18F(式VII)(各0.1-0.2mCi)加入含有0.5mL小牛血清的eppendorf管中，在37℃的水浴箱中孵育8小时，每隔1小时取出50μL的混合液，使用带有紫外和伽马双检测器的反相高压液相色谱仪检测稳定性，至迟于8小时內，各探针化合物未见有明显的紫外和放射性降解产物(如图2所示)。
实施例8，测定多模态探针化合物cFLFLF-Fl-99mTc(式IV),cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)和cFLFLF-Fl-Al18F(式VII)与人体中性粒细胞的结合常数数据如图3所示。
将人血中新鲜分离的中性粒细胞悬浮于肝动脉缓冲溶液(hepaticarterialbuffer)中(4X106细胞/mL)，取其中均匀悬浮液0.5mL，加入5单位的TNF－alpha孵育20分钟，再将均匀的悬浮液滴入底部可过滤的96孔板中(2x105细胞/孔)，将八个不同浓度的cFLFLF-Fl-99mTc(式IV)(0.001-100nM，比活度：2Ci/mmol)分别滴入不同的孔中，在室温条件下孵育90分钟。将缓冲溶液抽滤，然后使用冷冻的Tris-Mg缓冲液淋洗三遍(-5℃,10mM,每次150μL/孔)除去游离的放射性化合物，最后将还有中性粒细胞的过滤膜按序使用伽马计数器计数。使用PRISM4.0(GraphPad)软件计算结合常数(Kd和Bmax，见图3)。
cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)和cFLFLF-Fl-Al18F(式VII)的结合常数使用同样的上述方法。
实施例9，小鼠中脑动脉闭塞实验后，cFLFLF-Fl-99mTc(式IV)如图.4所示。
将C57/B6小鼠分成三组(每组6只)，分别将大脑中动脉结扎(tMCAO)0、15、30分钟，各组实验小鼠再灌注之前，每只小鼠通过尾静脉注射200-250uCicFLFLF-Fl-99mTc，随后完成大脑中动脉再灌注手术。经深度麻醉取出大脑组织解剖取出，进行大脑体外的放射性自显影和相对应的近红外荧光显像。图4显示了cFLFLF-Fl-99mTc在不同实验组小鼠大脑中的不同摄取量，中间为动脉结扎0分钟(对照组)后的脑组织，右侧为动脉结扎15分钟后血流再灌注的小鼠大脑，左侧为动脉结扎30分钟后血流再灌注的小鼠大脑。
实施例10，使用放射性自显影成像技术，显示cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)在动脉粥样硬化斑块组织中的摄取分布，如图5所示。
给50周龄的ApoE基因缺陷(ApoE基因-/-)小鼠和基因正常(ApoE基因+/+)小鼠(对比组)喂食高脂食物5周后，静脉注射200uCicFLFLF-Fl-68Ga(式VI)，3小时后，经深度麻醉取出主动脉弓和腹主动脉，随后经离体放射自显影显示了cFLFLF-Fl-68Ga在动脉粥样硬化斑块组织中的摄取分布，如图6所示。
实施例11，cFLFLF-Fl-Al18F(式VII)在小鼠冠状动脉缺血再灌注后，在心肌组织体外切片上的分布，如图6所示。
雄性C57/B6小鼠左降冠状动脉结扎30分钟之后，再灌注的同时，通过颈静脉注入100uCicFLFLF-Fl-Al18F(式VII)。30分钟之后，深度麻醉后将心脏解剖取出，沿着垂直于轴线方向横切为三段：底片(左)，中片(中)，心尖(右)，首先放射性自显影后，然后进行相对应的近红外荧光显像(745/820nm)。
实施例12，使用流式细胞仪和cFLFLF-Fl-HYNIC(式III)，精确定量对比小鼠脊髓创伤3天后各类免疫白细胞数量如图7所示。
使用InfiniteHorizonsimpactor仪器(PrecisionSystemsandInstrumentation)设定为50kdyn，在C57/Bl6小鼠T9脊柱纵向挫伤试验(Arnold,S.A.andT.Hagg(2011)."Anti-InflammatoryTreatmentsduringtheChronicPhaseofSpinalCordInjuryImproveLocomotorFunctioninAdultMice."JournalofNeurotrauma28(9):1995-2002)。然后将伤口缝合并敷施杆菌肽软膏(bacitracinointment)在伤口区域，同时皮下注射0.1mL庆大霉素(20μg/mL)。每日两次，每次皮下注射0.1mLbuprenorphin(15μg/mL)镇痛。小鼠脊髓创伤3天后，将其深度麻醉取出受创脊髓组织，细胞裂解，使用cFLFLF-Fl-HYNIC(式III)孵育染色，最后使用流式细胞仪分离提纯后，精确对比定量正常和受创脊髓中各类免疫白细胞数量。A.脊髓组织细胞裂解后的分离过程；B.正常(uninjured)和受创(injured)组织细胞裂解液中各种表达FPR的免疫白细胞的数量对比。
Claims (8)
1.多模态白细胞核素探针化合物，其特征在于：结构式为式I：
cFLFLF代表六肽化合物cinnamoyl-phenylalanine-(D)leucine-phenylalanine-(D)leucine-phenylalanine；
linker代表聚乙二烯、赖氨酸和半胱氨酸；
fluorophore(Fl)代表荧光基团或取代基团：4-((E)-2-((E)-2-(3-((E)-2-(3,3-dimethyl-1-(4-sulfonatobutyl)-3H-indol-1-ium-2-yl)vinyl)cyclohex-2-en-1-ylidene)ethylidene)-3,3-dimethylindolin-1-yl)butane-1-sulfonate或-H；
chelator(Che)代表同位素螯合基团：6-肼基烟酸(HYNIC)或1,4,7-氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)；
radionuclide(RN)代表放射性同位素99mTc、68Ga或Al18F。
2.根据权利要求1所述的多模态白细胞分子探针化合物，其特征在于结构式为下列之一：
3.根据权利要求1所述的多模态白细胞分子探针化合物，其特征在于结构式为为下列之一：
4.根据权利要求1所述多模态白细胞核素探针化合物cFLFLF-Fl-99mTc(式II)、cFLFLF-Fl-68Ga(式III)或cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)前体化合物：使用多肽合成仪，通过标准的氯甲酸芴甲酯(Fmoc)化学，在王树脂(wangresin)上逐步耦联生成化合物1，脱去侧链的保护基团4-甲基三苯甲基(MTT)后，与Fmoc-N-amido-PEG24-Acid耦联生成化合物2，进一步脱去Fmoc保护，与N-(9-芴)-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)耦联生成化合物3，在化合物3的结构上去Fmoc保护后，与2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(叔丁氧基羰基)肼基)烟酸(NHS-HYNIC-Boc)或2,2'，2”-(6-(4-异硫氰酸苯)-1,4-diazonane-1,4,7-三基)三乙酸(p-SCN-Bn-NOTA)耦联，然后在质量浓度为1％的三氟乙酸－二氯甲烷中将wangresin切割和半胱氨酸侧链巯基上的保护基团三苯甲基(Trt)脱掉，生成cFLFLFK-PEG24(SH)-HYNIC(化合物4)或cFLFLFK-PEG24(SH)-NOTA(化合物5)，经高效液相色谱法HPLC纯化之后，化合物4或化合物5上的巯基分别与IR-783耦联生成双标记探针前体化合物cFLFLF-Fl-HYNIC(化合物6)或双标记探针前体化合物cFLFLF-Fl-NOTA(化合物7)；
(2)cFLFLF-Fl-99mTc(式II)：取50μgcFLFLF-Fl-HYNIC(6)，称取6.7mg的甘氨酸(tricine)放入微量离心管(eppendorftube)中，加入200μL生理盐水溶解，再加入200μL浓度为5mg/mL三(3-磺酸苯基)-膦，钠盐(TPPTS)水溶液，最后加入20μL1mg/mL氯化亚锡盐酸溶液，其中盐酸溶液摩尔浓度为1mol/l，然后马上加入0.4mL浓度为20mCi[99mTc]pertechnetate([99mTc]锝)，60℃反应10分钟，室温下静置10分钟，使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，再加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-99mTc(6)；
或(2)cFLFLF-Fl-68Ga(式III):在一个含有400μL氯化铵水溶液的eppendorf小管中依次加入0.4mL浓度为20mCi[68Ga]GaCl3的盐酸淋洗液和200μL含有50μgcFLFLF-Fl-NOTA(7)的甲醇溶液；其中氯化铵水溶液当量浓度为0.1N、pH5.5，在40℃的水浴箱中孵育40分钟，使用氮气将甲醇吹除，然后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-68Ga(式III)；
或(2)cFLFLF-Fl-Al18F(式IV):一个装有200μL含有浓度为20mCi[18F]F-的醋酸钠水溶液的eppendorf管中，依次加入50μL含有氯化铝的醋酸钠水溶液，和100μL二甲基亚砜(DMSO)，其中氯化铝的摩尔浓度为20mmol/l，在室温下静置5分钟后，加入100μL含有50μgcFLFLF-Fl-NOTA(7)的醋酸钠水溶液，加盖，继续在沸水狱中加热15分钟，醋酸钠水溶液的摩尔浓度为0.5mol/l，pH4.1；加入0.8mL含体积浓度为0.05％三氟乙酸的水溶液，最后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分和有机溶剂分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-Fl-Al18F(式IV)。
5.根据权利要求1所述白细胞核素探针化合物cFLFLF-PEG24-99mTc(式V)、cFLFLF-PEG24-68Ga(式VI)或cFLFLF-PEG24-Al18F(式VII)的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)前体化合物：使用多肽合成仪，通过标准的Fmoc化学，在wangresin上逐步耦联生成化合物物2，进一步脱去Fmoc保护后，与NHS-HYNIC-Boc或p-SCN-Bn-NOTA耦联生成化合物8或9，然后在质量浓度为1％的三氟乙酸－二氯甲烷中将wangresin切除，分别生成探针核素前体化合物cFLFLF-PEG24-HYNIC(10)或cFLFLF-PEG24-NOTA(11)，经HPLC纯化，冷冻干燥后得到目标化合物cFLFLF-PEG24-HYNIC(10)或cFLFLF-PEG24-NOTA(11)；
(2)cFLFLF-PEG24-99mTc(式V):取50μgcFLFLF-PEG24-HYNIC(10)，称取6.7mg的tricine放入eppendorf小瓶中，加入200μL生理盐水溶解，再加入200μL浓度为5mg/mLTPPTS水溶液，最后加入20μL浓度为1mg/mL氯化亚锡盐酸溶液，其中盐酸溶液摩尔浓度为1mol/l，再加入0.4mL浓度为20mCi[99mTc]pertechnetate，60℃反应10分钟，室温静置10分钟，使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL甲醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-99mTc(式V)；
或(2)cFLFLF-PEG24-68Ga(式VI):在一个含有400μL氯化铵水溶液的eppendorf小管中依次加入0.4ml浓度为20mCi[68Ga]GaCl3的盐酸淋洗液和200μL含有50μgcFLFLF-PEG24-NOTA(11)的甲醇溶液，其中氯化铵水溶液的当量浓度为0.1N，pH5.5；在40℃的水浴箱中孵育40分钟，使用氮气将甲醇吹除，然后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-68Ga(式VI)；
或(2)cFLFLF-PEG24-Al18F(式VII)：在一个装有200μL含有浓度为20mCi[18F]F-的醋酸钠水溶液的eppendorf管中，依次加入50μL含有氯化铝的醋酸钠水溶液和100μLDMSO，氯化铝浓度为的20mmol/l，室温下静置5分钟后，加入100μL含有cFLFLF-PEG24-NOTA(7)的醋酸钠水溶液，其中醋酸钠水溶液浓度为0.5mol/l，pH4.1,加盖，继续在沸水狱中加热15分钟，加入0.8mL含体积浓度为0.05％三氟乙酸的水溶液，最后使用C18分离柱(Sep-Paklightcartridge)将反应混合液中的盐分和有机溶剂分离，最后用1mL乙醇将标记化合物洗脱，加入1mL生理盐水混匀得到待注射的cFLFLF-PEG24-Al18F(式VII)。
6.利用根据权利要求2或3所述的多模态白细胞分子探针化合物制作靶向探针化合物的药物制剂。
7.利用根据权利要求2或3所述的多模态白细胞分子探针化合物制作用于在有菌或无菌炎症诊断定位显像方面的药物制剂。
8.利用根据权利要求2或3所述的多模态白细胞分子探针化合物制作用于在体外组织细胞染色方面的药物制剂。
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