CN102413844B - 标记的分子成像剂、制备方法及使用方法 - Google Patents

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Abstract

包含细胞的胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体的标记的底物的成像剂，其使用方法包括经由胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体向细胞中引入标记的剂，随后将其还原为标记的半胱氨酸，并随后在细胞中检测。

Description

标记的分子成像剂、制备方法及使用方法
发明背景
本发明总的涉及标记的分子成像剂，更具体地，本发明涉及经由胱氨酸/谷氨酸盐转运体被细胞吸收的成像剂。
胱氨酸/谷氨酸盐转运体在大多数组织中通常不表达或表达极低，但是在暴露于氧化性应激的细胞中上调。胱氨酸(其包含两个二硫化物连接的半胱氨酸氨基酸)为用于该转运体的天然底物。胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体(xc-系统)为由两个蛋白亚单位组成的氨基酸转运体(指定为SLC7A11)：4F2hc/CD98(用于少数类别的转运系统的普通亚单位)和xCT(其对胱氨酸/谷氨酸盐交换剂特异)。转运体上调的影响是胱氨酸吸收增加；随后将其在细胞内还原为半胱氨酸。细胞内半胱氨酸为用于谷胱甘肽合成的速率限制底物。谷胱甘肽为细胞主要抗氧化剂以抵御氧化性应激。将细胞内半胱氨酸并入到两种路径(谷胱甘肽合成或蛋白合成)中的一种。
包含与胱氨酸的两个胺基团连接的荧光标记的荧光-标记的胱氨酸化合物为本领域已知的。一个实例为N，N′-二丹酰基-L-胱氨酸(DDC)，可购自Sigma(目录#D0625)，其具有以下结构：
另一个实例为双氟硼萤(DiBodipy)L-胱氨酸(DBC)，其为Invitrogen的市售产品(目录#B20340)，以在酸性条件下经由二硫化物交换反应，可逆硫醇标记核苷酸、蛋白和细胞的目的而出售。DBC具有如下所示的结构。
胱氨酸的放射性标记的变体也是本领域已知的。例如，用99mTc标记的胱氨酸为已知的。Tubis和Endow(1968Int J Appl Rad Isotop；19：835-840)公开了半胱氨酸与99mTcO4 -的直接反应，其中半胱氨酸的-SH基团还原99mTcO4 -，同时被氧化为胱氨酸。另外，用35S标记的胱氨酸为已知的，并且具有以下结构：
35S用于例如动物放射性示踪剂研究(例如参见Hwang等人，1980J Neurochem；35：417-424)。
分子成像的概念预示病理学的分子签名的特异性对比增强，并且需要在某些病理学指征中特异性调节的可靶向的生物标记。虽然这种特异性分子对比剂可具有大的用于成像和诊断疾病的效用，但是，已证实真正的特异性生物标记的确认非常困难。即使产生对于该特异性生物标记的剂，该剂的市场受限于该指征的流行。因此，对开发可用于使多种病理学指征成像的分子对比剂有大的兴趣。大多数成像剂靶向具体的组织或细胞类型或具体的疗法，或者它们随时间快速降解。指向较宽应用的剂的一个实例为利用葡萄糖转运体的18-F-氟脱氧葡萄糖(FDG)。18F-FDG优先被具有增加的葡萄糖需求的细胞吸收，随后被捕集在该细胞内。FDG在临床上可用于诊断、分级和监测许多癌症以及监测心和脑的代谢。18F-FDG不是在肾管中发现的钠-依赖性葡萄糖转运体的底物，这妨碍其肾再吸收并增强清除率。
体内氧化性应激被认为是细胞应激的指示剂。使该应激成像的努力已涉及使用电子顺磁共振(EPR)使动物成像。EPR为用于检测不成对的电子的技术，在氧化性应激中产生自由基时可出现这些不成对的电子。基本地，使用认为是EPR探测器的剂，其作为氧化性应激的度量对有机抗氧化活性敏感。
其他人也考虑了使用13-C-甘氨酸化学位移MRI来检测甘氨酸吸收和在体内化疗治疗肿瘤的动物模式中转化为谷胱甘肽。再其他人开发了成像剂来检测体内凋亡的细胞，用于监测化疗治疗，例如标记的Annexin V(其为相当大的蛋白)、Aposense by NeurosurvivalTechnologies(其为据报道特异性仅进入凋亡的细胞的小分子族)。
发明概述
本发明的成像剂和方法利用细胞氨基酸转运体(胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体，xc-)，该转运体在细胞氧化性应激条件下被活化。本发明的这些标记的分子成像剂和方法提供了几个益处，包括但不限于它们在多种多样的诊断和治疗监测应用中的用途；它们为小分子并包括在体内发现的天然化合物的标记的变体，并且以远低于产生毒性响应的生理学浓度的示踪剂水平给予，因此，预期毒性/免疫响应低；并且由于成像剂用作转运体底物，该剂受益于信号放大，因为分子成像剂一旦在细胞内就被捕集，这与其中成像剂的信号受限于细胞表面表位的化学计量结合的其他分子结合剂不同。用于胱氨酸/谷氨酸盐转运体的本发明的标记的底物还可用于在靶中引入化合物用于治疗目的。
作为胱氨酸/谷氨酸盐转运体的标记的底物，这些成像剂可用于与增加的氧化性应激相关的任何疾病或病症。例如，可使用该成像剂使凋亡的细胞体内成像。这种凋亡的细胞死亡的非侵入性监测是有用的，例如但不限于用于监测化疗有效性、由于局部缺血/中风引起的组织破坏、外伤性损伤和移植排斥。氧化性应激的成像还用于诊断和监测炎性疾病或包括氧化性应激或组织破坏的任何病理学指征。
另外，胱氨酸/谷氨酸盐转运体的上调还与在一些肿瘤中的化疗抗性有关。因此，具有基础的高胱氨酸吸收的肿瘤非侵入性成像可导致可能耐受某些疗法的肿瘤的鉴定；这可导致治疗方案有效改变。
用于检测细胞中的氧化性应激的本发明方法的一个实例通常包括：将包含标记的胱氨酸的成像剂引入到细胞的胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体中；使得细胞内标记的胱氨酸还原为标记的半胱氨酸；检测细胞中的标记的半胱氨酸。例如，对于一些应用，可在凋亡的细胞中检测标记的胱氨酸。在所述方法的一些非限制性实例中，用于检测氧化性应激的方法的标记的胱氨酸选自下文更具体定义的结构I、II、II和IV之一。
本发明的成像剂的另一个实施方案通常包含胱氨酸/谷氨酸盐转运体(xc-)的标记的小分子底物，例如但不限于下文更具体定义的结构I、II、III、IV、V和VI。
本发明的成像方法的一个非限制性实例通常包括：使用胱氨酸化合物，例如但不限于下文更具体定义的结构I、II、III和IV，其中使用荧光显微术、激光-共焦显微术、交叉偏振显微术、光学成像、核闪烁扫描术、正电子发射层析X射线照相术、单光子发射计算的层析X射线照相术检测该化合物。
附图简述
当参考附图阅读以下详细说明时，可以更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中在全部附图中，相同的字符代表相同的部件，其中：
图1为经由胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体转运至细胞中的本发明的成像剂的一个实施方案的流程图。
图2A为说明具有与非凋亡的Jurkat细胞(深灰)不同粒度的一些晚凋亡的Jurkat细胞(浅灰)的前向散射/侧向散射图。图2B为多象限散射图，其说明代表非凋亡的细胞的在象限D3中的AnnexinV和碘化丙啶(propdium iodide)(PI)阴性细胞；说明代表早凋亡的细胞的在象限D4中的Annexin V-Cy5阳性和碘化丙啶(PI)阴性细胞；以及说明代表晚凋亡的和坏死细胞的在象限D2中的Annexin V阳性细胞。
图3A-D说明，使用和不使用星孢素(STN)来诱导氧化性应激/凋亡，以及使用和不使用柳氮磺吡啶(sasz)来抑制胱氨酸/谷氨酸盐转运体，在Jurkat细胞中DBC吸收的流式细胞计数分析的结果。图3A为说明未经处理的细胞的图，证明DBC分子的一些吸收或非特异性结合。图3B为说明星孢素诱导的细胞具有三个细胞亚种群的图：低强度DBC荧光代表正常细胞、中间强度代表早凋亡的细胞、高强度代表晚凋亡的细胞。图3C为说明暴露于胱氨酸/谷氨酸盐转运体抑制剂柳氮磺吡啶(sasz)的星孢素诱导的细胞具有不同结果的图：具有中等DBC染色的细胞种群代表晚凋亡的细胞，而早凋亡的细胞在低DBC强度种群中。图4D为说明对于正常的、早凋亡的和晚凋亡的细胞，标记的细胞大于基线DBC染色的百分比的柱形图(通过AnnexinV和PI染色来测定)。
图4A说明用STN处理18小时的Jurkat细胞中的DBC的吸收。图4B说明用双氟硼萤(650)胱氨酸(DBC(650))培育的相同的细胞的比较。图5A-C说明使用和不使用柳氮磺吡啶(sasz)来抑制胱氨酸/谷氨酸盐转运体，使用星孢素(STN)来诱导氧化性应激/凋亡，在Jurkat细胞中单氟硼萤胱氨酸(MBC)吸收的流式细胞计分析的结果。图5A为说明星孢素诱导的细胞具有两种细胞亚种群的图，无MBC荧光代表正常细胞，高MBC强度代表早凋亡和晚凋亡的细胞。图5B为说明暴露于胱氨酸/谷氨酸盐转运体抑制剂柳氮磺吡啶(sasz)的星孢素诱导的细胞具有不同的结果的图：具有中等MBC染色的细胞种群代表晚凋亡的细胞，而早凋亡的细胞显示无MBC荧光强度。图5C为说明对于正常的、早凋亡的和晚凋亡的细胞，标记的细胞大于基线MBC染色的的百分比的柱形图(通过AnnexinV和PI染色来测定)。
图6A为说明用五种不同的荧光剂(DBC、DBC(650)、双氟硼萤胱硫醚(DB胱硫醚)、MBC和负对照荧光分子(氟硼萤-FL C5)标记的正常的、早凋亡的和晚凋亡的细胞的百分比的柱形图(通过AnnexinV和PI染色来确定)。图6B为说明用图6A所示的五种剂中的每一种标记的早凋亡的细胞的平均折叠(fold)强度偏移的表格。
图7为说明培养物中的Jurkat和A549细胞中单AO-[18F]-FBA-胱氨酸的吸收的柱形图。
图8A为说明在幼小Balb-c小鼠中生物分布结果的图，单位％ID/器官。图8B为说明示于图8A的相同数据的％ID/g的图。图8C为说明具有A549异种移植肿瘤的裸体小鼠的生物分布结果的图，单位％ID/g。图8D说明在每个时间点肿瘤与血液的比率，并且由8C所示的相同的数据得到。
图9为说明单AO-[18F]-FBA-胱氨酸分子随时间的稳定性的图。
图10为说明在幼小小鼠中，在注射后60分钟时，在PET图像中的18F-AO-FB-胱氨酸的图像。
发明详述
在一方面，本发明提供了包含具有结构I的标记的胱氨酸化合物的成像剂，
其中R和R′中的一个包含选自荧光标记或放射性同位素标记的标记，而R和R′中的另一个为氢。
本文使用的术语“成像剂”旨在包括可使用体外或体内成像技术检测的化合物。
本文使用的术语“荧光标记”包括但不限于荧光成像剂和荧光团，它们是通过暴露于特定波长的光而激发时，在不同的波长下发光的化合物。荧光团可按照它们的发射分布或颜色描述，并且为引起分子发荧光的分子组分。它通常是吸收特定波长或波长范围的能量，并且在不同但同样特定的波长或范围下重新发射能量的官能团。
本文使用的术语“放射性同位素标记”包括但不限于以下放射性同位素，其在化合物中用于在化学或生物学过程中追踪或目测该化合物或化学反应的机理，或追踪或目测生物学物质、有机体和系统。这种标记例如可与成像和检测系统结合使用。
通常，本发明的成像剂包含标记的胱氨酸以及保持为胱氨酸/谷氨酸盐转运体的底物所需的属性的任何胱氨酸类似物。如图1所示，成像剂用作胱氨酸/谷氨酸盐转运体的底物。在游离的胺处标记的胱氨酸为胱氨酸/谷氨酸盐转运体的底物。在转运至细胞中之后，将R-胱氨酸还原为R-半胱氨酸和未标记的半胱氨酸。R-半胱氨酸不被代谢，并且不能经由转运体离开。因此，其保留在细胞中，该细胞响应氧化性应激。
本文使用的术语“胱氨酸/谷氨酸盐转运体”与术语胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体、胱氨酸/谷氨酸盐交换剂、胱氨酸转运体、xc(-)、Xc(-)、系统xc(-)和氨基酸转运系统Xc(-)互换使用并且包括这些术语。转运系统包括两种蛋白的二聚体，并且包括但不限于：蛋白xCT和蛋白CD98(4F2hc、4F2表面抗原的重链、SLC3A2)；蛋白xCT，其为对xc(-)系统具有特异性的亚单位；蛋白CD98，其为具有不同底物的多种转运体共有的亚单位；和蛋白xCT，其还可与rBAT二聚，rBAT为多个转运体共有的另一个亚单位。
本发明的成像剂可通过其发射的信号来检测。化合物的检测方法可包括但不必局限于荧光显微术、激光-共焦显微术、交叉偏振显微术、光学成像、核闪烁扫描术、正电子发射层析X射线照相术和单光子发射计算的层析X射线照相术。
当本发明的成像剂包含含有荧光标记的标记的胱氨酸化合物时，合适的检测方法包括荧光显微术、激光-共焦显微术、交叉偏振显微术和光学成像。荧光标记为能在任何合适的检测方法中直接或间接检测的任何部分。优选的荧光标记包括具有广泛的离域电子系统的基团，例如花青、部花青、吲哚氰、酞菁、萘菁(naphthalocyanine)、三苯基甲川、卟啉、吡喃鎓染料、噻喃鎓染料、方酸内鎓染料、克酮酸鎓染料、薁鎓染料、靛苯胺、苯并吩噁嗪鎓染料、苯并噻吩噻嗪鎓染料、蒽醌、萘醌(napthoquinone)、阴丹士林、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移染料和染料络合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫醇烯)络合物、双(苯-二硫醇盐)络合物、碘苯胺染料、双(S，O-二硫醇烯)络合物。荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)和具有不同的吸收/发射性能的GFP的变体也是有用的。在某些环境(context)中使用某些稀土金属(例如，铕、钐、铽或镝)的络合物，如荧光纳米晶体(量子点)。本发明的一种或多种成像剂包含标记的胱氨酸化合物，其含有荧光标记，其中在胱氨酸的胺基团处发生标记。非限制性实例包括：绿色荧光胱氨酸分子，例如双氟硼萤(FL)-胱氨酸和单氟硼萤(FL)-胱氨酸；红色荧光胱氨酸分子，例如双氟硼萤(650)-胱氨酸和单氟硼萤(650)-胱氨酸。荧光标记(例如氟硼萤荧光染料)可特别适于光学体内成像和细胞氧化性应激的体外检测。
包含荧光标记的具体的标记的胱氨酸化合物具有结构IV：
该化合物在本文中也称为单氟硼萤胱氨酸(MBC)。
通过技术人员公知的合成化学技术可进行荧光标记与胱氨酸的缀合。例如，适于光学成像的包含荧光标记的标记的成像剂及其制备综述于Licha的“Contrast Agents for Optical Imaging”，Optical，Ultrasound，X-Ray and Radiopharmaceutical Imaing，Springer 2002，Krause编辑。
当本发明的成像剂包含含有放射性同位素标记的标记的胱氨酸化合物时，合适的检测方法包括核闪烁扫描术、正电子发射层析X射线照相术和单光子发射层析X射线照相术。用于正电子发射层析X射线照相术的优选的放射性同位素标记包括11C、13N、15O、17F、18F、75Br、76Br或124I。最优选的正电子-发射放射性非金属为11C、13N、18F和124I，特别是11C和18F，最特别是18F。用于单光子发射层析X射线照相术的优选的放射性同位素标记为发射γ的放射性卤素。优选的发射γ的放射性卤素为123I、131I和77Br，特别是123I。本发明的一种或多种成像剂包含辅基(prothstetic group)以能够放射性同位素标记，其中在胱氨酸的胺基团处发生标记。非限制性实例包括：用18F-氟苯甲醛标记的胱氨酸的氨氧基(AO)衍生物。
用于胱氨酸/谷氨酸盐转运体的本发明的标记的底物还可用于向靶向中引入标记的化合物，例如但不限于用131I标记的胱氨酸底物，用于治疗目的。
在一个优选的方面，本发明的成像剂包含具有结构II的标记的胱氨酸化合物：
其中：
R1包含放射性同位素标记；
当虚键为单键时，R2为氢；以及
当虚键为双键时，R2不存在。
结构II的具体的标记的胱氨酸化合物具有更具体的结构III：
该化合物在本文中也称为单AO-[18F]-FBA-胱氨酸。
18F-标记的胱氨酸化合物的其他实例包括但不限于：具有结构V的[18F]氟乙基-胱氨酸或[18F]FE-胱氨酸：
和具有结构VI的[18F]氟丙酰胺基-胱氨酸或[18F]FP-胱氨酸：
其中标记的半胱氨酸化合物包含放射性同位素标记的本发明的成像剂适宜由前体化合物制备。“前体化合物”包括标记的胱氨酸化合物的衍生物，设计该衍生物使得与方便的化学形式的放射性同位素标记的化学反应部位-特异性地发生；可在最少数量的步骤中进行(理想地，单一步骤)；并且无需显著的纯化(理想地，不进一步纯化)，以得到期望的标记的半胱氨酸化合物。这种前体为合成的并且可方便地以良好的化学纯度得到。前体化合物可任选包含一个或多个用于某些官能团的保护基团。保护基团为本领域技术人员公知的，并且详细描述于“Protective Groups in Organic Synthesis”，Theorodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，(第四版，John Wiley & Sons，2007)。前体化合物理想地以无菌的不致热的形式提供。因此，前体化合物可用于制备包含成像剂以及适于哺乳动物给药的生物相容的载体的药物组合物。前体化合物还适于作为组分包含在试剂盒中，用于制备该药物组合物。在一个优选的实施方案中，前体化合物在溶液中提供，并且作为设计用于自动合成设备的试剂盒或盒的一部分。
本发明的具体的前体化合物具有结构X：
其中R″和R″′中的一个为前体基团，而R″和R″′中的另一个为氢，并且其中所述前体化合物在一个或多个羟基、羰基和胺官能团上任选包含保护基团。“前体基团”为与方便的化学形式的放射性同位素标记反应以部位-特异性地并入放射性同位素标记的化学基团。现在在具体的放射性同位素标记的上下文中描述合适的这种前体基团。
当成像剂的放射性同位素标记为18F时，由于烷基氟耐体内代谢，放射性氟原子可形成氟烷基或氟烷氧基的一部分。或者，放射性氟原子可经由直接共价键与芳环连接。利用18F-氟化物与包含良好离去基团(例如溴基、甲磺酸基或甲苯磺酸基)的前体基团的反应，可经由直接标记进行放射性氟化。还可通过用[18F]-氟烷基溴，[18F]-氟烷基甲磺酸酯或[18F]-氟烷基甲苯磺酸酯使羟基前体基团O-烷基化，来引入18F。由芳基重氮盐、芳基硝基化合物或芳基季铵盐亲核取代是向芳基-18F衍生物的合适路线。18F-标记技术的全面综述可见于“Chemistry ofFluorine-18 Radiopharmaceuticals”，Snyder和Kilbourn，Handbook ofRadiopharmaceuticals，MJ.Welch和CS.Redvanly编辑(2003，JohnWiley and Sons)。
对于放射性碘化，优选前体化合物包含以下前体基团，也就是：芳基碘或芳基溴(以允许放射性碘交换)；活化的前体化合物芳基环(例如苯酚基团)；有机金属前体化合物(例如三烷基锡、三烷基甲硅烷基或有机硼化合物)；或有机前体化合物，例如三氮烯或亲核取代的良好离去基团如碘鎓盐。向有机分子中引入放射性碘的前体化合物及方法由Bolton(J.Lab.Comp.Radiopharm.2002；45：485-528)描述。合适的硼酸酯有机硼化合物及其制备由Kabalka等人(Nucl.Med.Biol.，2002；29：841-843和2003；30：369-373)描述。合适的有机三氟硼酸盐及其制备由Kabalka等人(Nucl.Med.Biol.，2004；31：935-938)描述。用于放射性碘化的优选的前体化合物包括有机金属前体基团，最优选三烷基锡。
以下给出可连接放射性碘的芳基前体基团的实例：
这两者含有允许在芳环上容易地放射性碘取代的取代基。含有放射性碘的可选的取代基可经由放射性卤素交换，通过直接碘化来合成，例如
可使用上面对放射性碘化的化合物所述的前体化合物来进行放射性溴化。Kabalka和Varma综述了用于合成放射性卤代化合物(包括放射性溴化化合物)的多种方法(Tetrahedron 1989；45(21)：6601-21)。
本发明的11C-标记的成像剂可按直接方式通过使前体化合物(它是成像剂的去甲基化的变体)与11C甲基碘反应而合成。还可如下并入11C：通过使所需的成像剂的具体烃的格氏试剂与[11C]CO2反应得到11C试剂，它与前体化合物中的胺前体基团反应得到感兴趣的11C-标记的成像剂。格氏试剂在放射性标记的所需的部位包含卤化镁前体基团。由于11C的半衰期仅为20.4分钟，重要的是，11C标记中间体具有高的特异性活性，因此，使用尽可能快的反应过程来制备。该11C-标记技术的全面综述可见于Antoni等人“Aspects on the Synthesis of11C-Labelled Compounds”，Handbook of Radiopharmaceuticals，M.J.Welch和C.S.Redvanly编辑(2003，John Wiley and Sons)。
结构I的二硫化物键在细胞内被还原，并不再是xc-转运体的底物，因此该剂不能经由该路线离开细胞。荧光或放射性同位素标记(R)将与胺缀合，使得所得到的还原的细胞内剂不被代谢。因此，所得到的剂进入细胞中并与活化的xc-转运体一起保留在细胞中。单-标记的半胱氨酸化合物在R′位置含有H，但是另外的标记还可在R′位置附加到第二个胺。
使用标记的胱氨酸作为实例，在一个或两个游离胺上标记胱氨酸。当经由转运体进入细胞时，它被还原为标记的半胱氨酸，该标记的半胱氨酸不再是转运体的底物，因此，不能通过相同的进入机理从细胞中排出。由于胺与标记缀合，标记的半胱氨酸不是谷胱甘肽合成或蛋白合成的底物，因此该标记被捕集在细胞中。
在检验的多种多样的人组织和细胞中，xc-转运体在脑中占主导地表达，但是也在胰和培养的细胞系中表达。xc-转运体表达在大多数组织中非常低，但是在氧化性应激条件下和当细胞在培养物中生长时可上调。xc-转运体在许多条件下诱导，包括凋亡的刺激、氧化性应激、炎症、胱氨酸丧失和化疗抗性。
上面适宜并优选定义的本发明的成像剂优选作为药物组合物提供，所述组合物包含成像剂以及适于哺乳动物给药形式的生物相容的载体。药物组合物形成本发明的一个单独的方面。
“生物相容的载体”为流体，特别是液体，成像剂在其中悬浮或溶解，使得药物组合物在生理学上是可耐受的，即，可给予哺乳动物体，而没有毒性或过度不适。生物相容的载体适宜为可注射的载体液体，例如用于注射的无菌的无热原的水；含水溶液，例如盐水(其可有利地被平衡，使得用于注射的最终产品为等渗的或非低渗的)；一种或多种以下物质的含水溶液：张力-调节物质(例如含有生物相容的反离子的血浆阳离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露醇)、二醇(例如甘油)或其他非离子多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇等)。生物相容的载体还可包含生物相容的有机溶剂，例如乙醇。这种有机溶剂可用于使较亲脂的化合物或制剂增溶。优选生物相容的载体为用于注射的无热原的水、等渗的盐水或含水乙醇溶液。用于静脉内注射的生物相容的载体的pH适宜在4.0-10.5范围。
经由胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体(xc-转运体系统)被吸收至细胞中的这些剂可用于使体内细胞氧化性应激成像，包括但不限于使包括细胞氧化性应激的病理或病症成像。受益于这些剂的成像应用包括但不限于化疗治疗监测、局部缺血/中风、炎症、外伤性脑损伤和器官移植监测。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种使具有胱氨酸/谷氨酸盐转运体的生物学样品成像的方法，所述方法包括：
经由胱氨酸/谷氨酸盐转运体向所述生物学样品中引入权利要求1限定的成像剂；以及
使用荧光显微术、激光-共焦显微术、交叉偏振显微术、光学成像、核闪烁扫描术、正电子发射层析X射线照相术或单光子发射计算的层析X射线照相术检测所述成像剂。
优选生物学样品为体外细胞培养物。在这种情况下，如下进行引入本发明的成像剂的步骤：向体外细胞培养物中加入悬浮于合适的缓冲剂中的成像剂，接着培育限定的时间，优选在生理温度下培育。随后使用技术人员公知的荧光显微术、激光-共焦显微术、交叉偏振显微术技术进行检测步骤。例如参见“Principles of FluorescenceMicroscopy”，第三版，2006，Lakowitz编辑。
或者优选地，生物学样品为完整的哺乳动物受试者。当生物学样品为完整的哺乳动物受试者时，成像剂优选作为本发明的药物组合物给予。优选肠胃外进行对所述受试者的给予，最优选静脉内给予。静脉内路线代表将成像剂递送至整个受试者体内的最有效的方式。静脉内给予不代表实质的身体干预或实质的健康风险。优选本发明的成像剂作为本文所定义的本发明的药物组合物给予。
当生物学样品为完整的哺乳动物受试者时，优选使用正电子发射层析X射线照相术或单光子发射层析X射线照相术进行成像方法的检测步骤，优选其中所述成像剂包含如上所定义的结构II或III的半胱氨酸化合物。对于正电子发射层析X射线照相术，优选所述成像剂包含如上所定义的结构III的标记的胱氨酸化合物。
在另一方面，本发明提供了一种检测细胞中的氧化性应激的方法，所述方法包括：
向细胞的胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体中引入权利要求1限定的成像剂；
使得细胞内标记的半胱氨酸化合物还原为标记的半胱氨酸；以及
检测细胞中的标记的半胱氨酸。
优选对于所述成像方法和所述检测氧化性应激的方法，所述检测在凋亡的细胞中进行。
以下为用于举例说明成像剂及使用方法的多种实施方案的非限制性实例。
实施例1
在凋亡细胞的体外试验中，使用或不使用1uM星孢素，将人Jurkat细胞培养16小时，并用碘化丙啶(PI)和Cy5-AnnexinV(Annexin)染色。发现，通常～30-50％的细胞在凋亡或坏死的某一阶段。使用流式细胞计数器来鉴别定义为正常的(PI和Annexin阴性)、早凋亡的(PI阴性，Annexin阳性)以及晚凋亡和坏死(PI和Annexin阳性)的细胞种群。结果示于图2A和2B。图2A为说明具有与非凋亡的细胞(深灰)不同粒度的一些晚凋亡的细胞(浅灰)的前向散射/侧向散射图。在图2B中，AnnexinV和PI阴性细胞示于象限D3中并代表非凋亡的细胞。象限D4中的细胞表示对于AnnexinV染色阳性而对于PI染色阴性的早凋亡的细胞。象限D2中的细胞表示AnnexinV和PI染色两者阳性的晚凋亡的和坏死的细胞。
实施例2
使用(图3B)和不使用(图3A)1μM星孢素(STN)，将Jurkat细胞培育16-18小时，用Annexin V-Cy5和碘化丙啶染色，并用DBC培育30分钟。DBC为Invitrogen的市售产品(目录#B20340)，其以在酸性条件下，经由二硫化物交换反应，可逆硫醇标记核苷酸、蛋白和细胞的目的而出售。DBC具有如下所示的结构。
在图3A中，未经处理的细胞说明对应于DBC分子的吸收或非特异性结合的一些低强度荧光。在图3B中，星孢素诱导的细胞具有高强度DBC染色的细胞亚种群，并且这主要与晚凋亡/坏死的细胞(+AnnexinV，+PI)相关。还出现了具有中间DBC染色的细胞种群，其与早凋亡的细胞(+AnnexinV，-PI)良好相关。为了能更具体地解决xc-转运体在该凋亡细胞标记试验中的作用，还用柳氮磺吡啶培育Jurkat细胞，柳氮磺吡啶为xc-转运体的有效的特异性抑制剂。将细胞如图2B所示进行处理，不同之处在于，与DBC同时加入胱氨酸/谷氨酸盐转运体的特异性抑制剂(柳氮磺吡啶，sasz)(图3C)。在图3C中，发现具有中间DBC染色的细胞种群，其仅与晚凋亡的细胞(+AnnexinV，+PI)良好相关。在图3D中，像实施例1那样，将细胞分类为正常的、早凋亡的或晚凋亡的，并且记录每一类的具有增大的DBC染色的细胞的百分比。早凋亡和晚凋亡的细胞用DBC标记，但这仅在早凋亡的细胞中受到sasz的抑制。因此，DBC确实经由胱氨酸-谷氨酸盐转运体的活性标记了早凋亡的细胞，并用作转运体底物，即使它经由胱氨酸的胺与两个荧光团缀合。该数据说明，用DBC在早凋亡的细胞中看到的吸收依赖于xc-转运体，而不是一些其他机理。
实施例3
DBC的凋亡的Jurkat细胞吸收说明，不仅xc-转运体在经历氧化性应激的细胞(在这种情况下，凋亡)中被活化，而且xc-转运体还足够混杂地允许含有胺附加的绿色荧光团(氟硼萤FL)的该底物(胱氨酸)进入细胞中。用红色荧光团(氟硼萤650)合成标记的胱氨酸化合物，来进一步确定转运体的混杂性。在与氟硼萤FL标记的胱氨酸的并列比较中，DBC-650看起来标记凋亡的细胞不比标记正常的细胞多，如图4A和4B所示，这说明一些标记不足以保持xc-转运体底物状况。在该实施例中，氟硼萤-650荧光团和相关的连接基比DBC的大(图4A)，因此，尺寸代表了在保持通过转运体的能力的同时什么基团附加于胺的一个限制。
实施例4
由前述实施例，重要的是保持标记的尺寸小。较小的标记的胱氨酸化合物比较大的标记的胱氨酸化合物(例如DBC-650和DBC)更适合用作底物。因此，用仅在一个胺上的荧光标记氟硼萤合成较小的荧光胱氨酸化合物，单氟硼萤胱氨酸(MBC)。使用市售胱氨酸和氟硼萤-FL琥珀酰亚氨基酯(Invitrogen，D2184)产生该分子，通过反相HPLC纯化，并通过质谱分析，来证实正确的产品。MBC具有如下所示的结构。
使用1μM STN将Jurkat细胞培育16-18小时，用Annexin V-Cy5和碘化丙啶染色，并用MBC培育30分钟，不加入(图5A)和加入(图5B)胱氨酸/谷氨酸盐抑制剂(sasz)。在图5A中，目测MBC标记为具有高强度荧光偏移的细胞亚种群，其与早凋亡和晚凋亡的细胞两者良好对应(图5C)。没有明显的中间种群，这表明MBC标记的早凋亡的细胞具有比DBC更大的强度。在图5B中，加入柳氮磺吡啶导致较少的标记的细胞，并且荧光强度偏移较小。该种群与晚凋亡的细胞良好相关，并且不与早凋亡的细胞良好相关(图5C)。在该实施例中，MBC比DBC小(仅具有一个标记)并且更接近地类似于天然转运体底物胱氨酸；产生具有改进的标记早凋亡的细胞的性能的剂。使用MBC，在正常细胞中存在较少的背景吸收，没有牺牲凋亡的细胞的荧光强度的增加数量，即使每个胱氨酸化合物存在一个较少的荧光团。
实施例5
含有可还原的二硫化物键的剂应在细胞内隔室内部被还原，因此，不是通过胱氨酸/谷氨酸盐转运体流出的底物，并且导致将标记捕集在细胞内部。为了说明这种作用，配制具有以下结构的双氟硼萤胱硫醚(DB胱硫醚)剂。
也用作负对照物的是氟硼萤-FL C5，其购自Invitrogen，具有以下结构。
图6A说明使用DBC、DBC(650)、DB胱硫醚、MBC和负对照物(氟硼萤-FL C5)的正常的、早凋亡的和晚凋亡的Jurkat细胞的氟硼萤染色的比较。DBC、DB胱硫醚和MBC染色早凋亡的细胞，DBC(650)仅染色晚凋亡的细胞，并且负对照物对于凋亡的细胞不显示任何荧光偏移。由该数据，对于凋亡的细胞，DBC、DB胱硫醚和MBC为完全等同的标记。然而，在图6B中，对于每一种剂，将早凋亡的细胞的荧光强度的折叠偏移与正常细胞相比较。清楚地，MBC提供了比其他所用的荧光剂更强烈的染色。
实施例6
由前述实施例，明显地，具有单个小标记是有益的。较小的标记的胱氨酸化合物比较大的标记的胱氨酸化合物(例如DBC-650)更适合用作底物。因此，合成单个胺与[18F]氨氧基-氟苯甲醛缀合的标记的胱氨酸化合物(单AO-[18F]-FBA-胱氨酸)，并且可用于PET成像应用。首先合成具有以下结构的氨氧基-胱氨酸前体(单AO-胱氨酸)。
总的来说，单AO-胱氨酸随后与[18F]氟苯甲醛缀合，得到具有以下结构的单AO-[18F]-FBA-胱氨酸。
如下提供合成单AO-[18F]-FBA-胱氨酸的方法的更具体的非限制性实例。
所有的反应在氮气气氛下或在用氮气吹扫的卷曲顶部密封瓶中进行。购买Kryptofix 222(Aldrich)和K2CO3(EMD Science)，并原样使用。OptimaTM-级乙腈用作HPLC溶剂和反应溶剂两者。
由IBA Molecular(Albany，NY)或PETNET Solutions(Albany，NY)得到[18F]KF(在纯化水中40mCi.mL-1(1480MBq.mL-1))，并原样使用。首先将[18F]氟化物固定在Chromafix 30-PS-HCO3阴离子交换筒(ABX，Radeberg，Germany)上，随后使用1mL含有Kryptofix K222(376g.mol-1，8mg，2.13×10-5mol)和碳酸钾(138.2g.mol-1，2.1mg，1.52×10-5mol)的乙腈∶蒸馏的去离子水(ddH2O)的4∶1混合物，将其洗脱至干燥的容器中。在部分真空和氮气流下以温和加热(～45℃)除去溶剂(～15分钟)。随后用0.5mL含有K222(8mg)的乙腈洗涤源瓶和阴离子交换筒，将反应混合物再次在部分真空和温和加热下干燥(～10分钟)。将反应容器用氮气再加压，并用另外的0.5mL乙腈将共沸干燥重复两次。将4-甲酰基-N，N，N-三甲基三氟甲磺酸苯铵(313.30g.mol-1，3.1mg，9.89×10-6mol)溶解于0.35mL无水DMSO(Acros)中，并直接加入到含有[18F]KF.K222、K2CO3的反应容器中。将反应混合物加热至90℃15分钟，并立即冷却，用3mL蒸馏的去离子水(ddH2O)淬灭。随后将该混合物通过阳离子交换筒(Waters SepPak Light Accel Plus CM)，用ddH2O稀释至10mL，并负载于反相C18SepPak(Waters SepPak PlusC18)。用10mL ddH2O冲洗SepPak，随后用30mL空气吹扫。将[18F]4-氟苯甲醛([18F]FBA)在1.0mL甲醇中洗脱。
单独地，将高回收率瓶(2mL，National Scientific)装入单-氨氧基胱氨酸(386.27g.mol-1，2.7mg，6.99×10-6mol)。将固体悬浮于250μLddH2O和8μL三氟乙酸中。将500μL甲醇中的[18F]FBA(参见上面)转移至反应瓶中。将容器加盖，卷曲，放置在加热区中(在反应开始时的活性为4.66mCi/172MBq)，并在60℃下保持15分钟；此时移除小的等分试样(＜5μL)用于分析式HPLC分析。使用250μL含有0.1％TFA的ddH2O将溶液稀释至约1000μL，得到1∶1的ddH2O∶MeOH的最终组合物，为半制备式HPLC纯化作准备。将[18F]FB-胱氨酸分离，并通过半制备式HPLC纯化。将含有产品(0.409mCi/15.1MBq)的HPLC馏分用ddH2O 5∶1稀释，随后固定于tC18 Plus Sep Pak(Waters)。首先用5mL ddH2O冲洗SepPak，随后用30mL空气冲洗。通过首先洗脱空隙体积(约0.5mL)，接着在单独的烧瓶中收集250-300μL洗脱液，将[18F]FB-Cys(0.17mCi，6.3MBq)分离到最小量的DMSO中。为了确定放射性化学和化学纯度，对已分离的产品进行RP-HPLC分析。通常，注射10μL 0.1μCi/μL溶液用于制剂后分析。分离的放射性化学品产率为3.6％(由加入[18F]FBA校正的6.6％衰退)，并且放射性化学品纯度为96.8％。
分析式HPLC条件：在HP Agilent 1100上进行分析，该HP Agilent1100含有G1311A QuatPump，具有100μL注射器和2.0mL底(seat)毛细管的G1313A自动注射器，Phenomenex Gemini C18柱(4.6mm×150mm)，5μ，(S/N 420477-10)，G1316A柱加热器，G1315A DAD和Ramon Star-GABIγ-检测器。95∶5的ddH2O∶CH3CN，含有0.05％TFA，溶剂B：CH3CN，含有0.05％TFA。梯度洗脱：0分钟0％B，1分钟15％B，10分钟31％B，10.5分钟100％B，13.5分钟100％B，14分钟0％B，17分钟0％B。(TR～7.1分钟)
半制备式HPLC条件：在Jasco LC上进行纯化，该Jasco LC含有DG-2080-544线脱气器，MX-2080-32动态混合器和两个PU-2086 PlusPrep泵，安装了大体积注射试剂盒的AS-2055 Plus Intelligent自动注射器，Phenomenex 5μ.Luna C18(2)250×10mm，具有防护装置的5μ柱(S/N 295860-1，P/N 00G-4252-N0)，MD-2055 PDA和与固态SiPIN光电二极管γ检测器连接的Carroll & Ramsey AssociatesModel 105S模拟测速计。梯度洗脱：0分钟0％B，3分钟20％B，42分钟70％B，42.5分钟100％B，46分钟100％B，50分钟0％B，溶剂A：ddH2O∶CH3CN，含有0.05％TFA，溶剂B：CH3CN，含有0.05％TFA。(TR～14.7分钟)
在体外细胞吸收试验中使用单AO-[18F]-FBA-胱氨酸，其中将单AO-[18F]-FBA-胱氨酸和培养的细胞培育30分钟，并用盐水洗涤两次，随后用1N NaOH溶解细胞，并收集用于在γ计数器中分析。图7说明单AO-[18F]-FBA-胱氨酸在两种不同的细胞系中的吸收，说明胱氨酸/谷氨酸盐转运体在Jurkat和A549细胞系中的差示基础表达和活性。
在正常的小鼠中建立该分子(它配制于盐水中的7％乙醇中)的药物动力学分布，并示于图8A和8B。将幼小的Balb/c小鼠注射～15uCi18F-胱氨酸，并在注射后5、30、120分钟取时间点。图8A说明幼小的Balb-c小鼠中的生物分布结果，％注射剂量(％ID)。从身体的清除主要是由于肾排泄，如肾、膀胱和尿的分布图所示。图8B说明示于图8A的相同数据的％ID/g。在两只小鼠中，在注射放射性示踪剂之前两小时，通过注射抗-Fas抗体来诱导凋亡。研究在单AO-[18F]-FBA-胱氨酸注射之前2小时接受抗-Fas抗体注射以在肝中诱导凋亡的两只动物。虽然如此深入研究的动物的数量低，但两者显示肝吸收超过对照动物。
图8C说明来自用A549肿瘤异种移植在裸体小鼠中完成的研究的类似生物分布结果，单位％ID/g。在120分钟和240分钟时间点，放射性示踪剂已足够清楚，以在肿瘤中检测到比在血液或其他组织(肾和膀胱除外)中更多的％ID/g。在图8D中，显示在每个时间点的肿瘤与血液的比率。这些结果说明，放射性标记的胱氨酸化合物可用于检测体内胱氨酸/谷氨酸盐转运体活性。
图9说明单AO-[18F]-FBA-胱氨酸分子在盐水中随时间的稳定性。如所示的，在4小时时期内，γ-示踪分布不存在任何变化。
图10说明在幼小的小鼠中，在注射后60分钟时，在PET图像中的单AO-[18F]-FBA-胱氨酸，说明清除主要通过肾和膀胱。
作为另一个非限制性实例，胱氨酸可用123I-碘苯甲醛标记，与氟苯甲醛类似，123I-碘苯甲醛可通过首先向高回收率瓶(2mL，NationalScientific)，装有AO-Cys，2.5mg)中加入[123I]4-碘苯甲醛([123I]IBA)来制备。通过将多肽溶解于0.5mL ddH2O中并加入8μL三氟乙酸，接着加入0.5mL甲醇中的[123I]IBA而开始反应。将容器加盖，卷曲，放置在加热区中，并在60℃下保持15分钟；移除小的等分试样(＜5μL)用于分析式HPLC分析，以评价反应状态。将[123I]IB-胱氨酸分离，并通过半制备式HPLC纯化。将含有产品的HPLC馏分用ddH2O进一步稀释(5∶1)，并随后将产品固定于tC18 Plus Sep Pak(Waters)。该SepPak首先用5mL ddH2O冲洗，随后用30mL空气冲洗，通过首先洗脱空隙体积(约0.5mL)，接着在单独的烧瓶中收集250-300μL洗脱液，得到最小量乙醇中的[123I]IB-胱氨酸。随后对分离的产品进行RP-HPLC分析，以确定放射性化学和化学纯度。
虽然本文说明和描述了本发明的仅仅某些特征，但是本领域技术人员可以想到许多修改和变化。因此，应理解的是，权利要求旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这些修改和变化。

Claims (15)

1.一种成像剂，其为具有结构I的胱氨酸/谷氨酸盐转运体的标记的小分子底物：
其中R和R′中的一个包含选自荧光标记或放射性同位素标记的标记，而R和R′中的另一个为氢。
2.权利要求1限定的成像剂，其中所述标记的小分子底物具有结构II：
其中：
虚键代表单键或双键；
R1包含放射性同位素标记；
当虚键为单键时，R2为氢；以及
当虚键为双键时，R2不存在。
3.权利要求1或权利要求2限定的成像剂，其中所述放射性同位素标记选自11C、13N、15O、17F、18F、75Br、76Br、124I、123I、131I和77Br。
4.权利要求3限定的成像剂，其中所述放射性同位素标记为18F，并且其中所述标记的小分子底物选自结构III、V或VI的化合物：
5.权利要求1限定的成像剂，其中所述标记的小分子底物包含荧光标记并且具有结构IV：
6.权利要求1限定的成像剂在制备用于通过经由胱氨酸/谷氨酸盐转运体向具有胱氨酸/谷氨酸盐转运体的生物学样品中引入权利要求1限定的成像剂，以及使用荧光显微术、激光-共焦显微术、交叉偏振显微术、光学成像、核闪烁扫描术、正电子发射层析X射线照相术或单光子发射计算的层析X射线照相术检测所述成像剂，而使所述生物学样品成像的组合物中的用途。
7.权利要求6限定的用途，其中所述生物学样品为体外细胞培养物。
8.权利要求7限定的用途，其中使用荧光显微术、激光-共焦显微术或交叉偏振显微术进行所述检测步骤。
9.权利要求6限定的用途，其中所述生物学样品为完整的哺乳动物受试者。
10.权利要求9限定的用途，其中所述成像剂如权利要求2或权利要求3限定，并且其中使用正电子发射层析X射线照相术或单光子发射层析X射线照相术进行所述检测步骤。
11.权利要求10限定的用途，其中所述成像剂包含权利要求4限定的标记的小分子底物，并且其中使用正电子发射层析X射线照相术进行所述检测步骤。
12.权利要求1-5中任一项限定的成像剂在制备用于通过向细胞的胱氨酸/谷氨酸盐反向转运体中引入权利要求1-5中任一项限定的成像剂，使细胞内标记的小分子底物还原为标记的半胱氨酸，以及检测细胞中的标记的半胱氨酸，而检测细胞中氧化性应激的组合物中的用途。
13.权利要求12限定的用途，其中所述细胞为凋亡的细胞。
14.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1-5中任一项限定的成像剂以及适于哺乳动物给药的形式的生物相容载体。
15.用于合成权利要求1限定的成像剂的前体化合物，其中R和R′中的一个包含放射性同位素标记，而R和R′中的另一个为氢，其中所述前体化合物具有结构X：
其中：
R″和R′″中的一个为前体基团，而R″和R′″中的另一个为氢，其中所述前体基团为与方便的化学形式的放射性同位素标记反应以部位-特异性地并入放射性同位素标记的化学基团；以及，
所述前体化合物在一个或多个羟基、羰基和胺官能团上任选包含保护基团。
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