KR20120015308A - 표지된 분자 영상화제, 제조 방법 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포의 시스테인/글루타메이트 역수송체의 표지된 기질을 포함하는 영상화제에 관한 것으로써, 그에 따른 사용 방법은 시스테인/글루타메이트 역수송체를 통하여 표지된 제제를 세포로 도입한 다음, 그것을 표지된 시스테인으로 환원시키고, 이어서 세포에서 검출하는 것을 포함한다.

Description

표지된 분자 영상화제, 제조 방법 및 사용 방법{LABELED MOLECULAR IMAGING AGENTS, METHODS OF MAKING AND METHODS OF USE}
본 발명은 일반적으로는 표지된 분자 영상화제에 관한 것이며, 더 구체적으로는 시스틴/글루타메이트 수송체를 통하여 세포에 의해 흡수되는 영상화제에 관한 것이다.
시스틴/글루타메이트 수송체는 대부분의 조직에서 통상적으로 발현되지 않거나 극히 적게 발현되지만, 산화성 스트레스에 노출된 세포에서는 상향조절된다. 2개의 디술피드-결합된 시스테인 아미노산을 포함하는 시스틴이 이 수송체의 천연 기질이다. 상기 시스틴/글루타메이트 역수송체(antiporter) (xc- 시스템)는 수 종류 수송 시스템의 공통 소단위인 4F2hc/CD98과 시스틴/글루타메이트 교환체(exchanger)에 고유한 xCT의 2개 단백질 소단위로 이루어지는 아미노산 수송체 (SLC7A11로 지칭됨)이다. 수송체 상향조절의 효과는 시스틴 흡수의 증가로써; 이후 그것은 세포 내부에서 시스테인으로 환원된다. 세포내 시스테인은 글루타치온 합성의 속도 제한 기질이다. 글루타치온은 산화성 스트레스에 대항하여 방어하는 세포의 1차적인 산화방지제이다. 세포내 시스테인은 글루타치온 합성 또는 단백질 합성의 2개 경로 중 하나로 도입된다.
시스틴의 양 아민 기에 결합된 형광 표지를 포함하는 형광-표지 시스틴 화합물이 업계에 알려져 있다. 일례는 시그마(Sigma) 사로부터 시중에서 구입가능한 N,N'-디단실(Didansyl)-L-시스틴 (DDC) (카탈로그 #D0625)로써, 그것은 하기의 구조를 가진다.
Figure pct00001
또 다른 예인 디보디파이(DiBodipy) L-시스틴 (DBC)은 인비트로겐(Invitrogen) 사의 시중에서 구입가능한 제품으로써 (카탈로그 #B20340), 그것은 산성 조건에서의 디술피드 교환 반응을 통한 뉴클레오티드, 단백질 및 세포의 가역적인 티올 표지를 목적으로 판매되고 있다. DBC는 하기에 나타낸 구조를 가진다.
Figure pct00002
시스틴의 방사성표지된 버젼 역시 업계에 알려져 있다. 예를 들면, 99 mTc로 표지된 시스틴이 알려져 있다. 문헌 [Tubis and Endow (1968 Int J Appl Rad Isotop; 19: 835-840)]은 시스테인의 99 mTcO4 -와의 직접 반응에 대해 개시하고 있는데, 여기에서는 시스테인의 -SH 기가 99 mTcO4 -를 환원시키면서 동시에 시스틴으로 산화된다. 또한, 35S로 표지된 시스틴이 알려져 있으며, 하기의 구조를 가진다.
Figure pct00003
35S는 예를 들면 동물 방사성추적자 연구에 사용된 바 있다 (예컨대 문헌 [Hwang et al 1980 J Neurochem; 35: 417-424] 참조).
분자 영상화의 개념은 병리 분자 신호의 특이적 조영 강화를 보장하며, 소정의 병리적 징후에서 특이적으로 조절되는 표적화가능한 바이오마커를 필요로 한다. 그와 같은 특이적 분자 조영제는 질병을 영상화 및 진단하는 데에 커다란 효용을 가진 수 있지만; 정말로 특이적인 바이오마커의 확인은 매우 어려운 것으로 입증되어 있다. 그와 같은 특이적 바이오마커에 대한 제제가 개발된다 할지라도, 해당 제제에 대한 시장은 해당 징후의 이환으로 제한될 것이다. 따라서, 다양한 병리적 징후를 영상화하는 데에 이용될 수 있는 분자 조영제의 개발에 관한 커다란 관심이 존재한다. 대부분의 영상화제는 특정 조직 또는 세포 유형, 또는 특정 요법을 표적으로 하거나, 시간이 지나면서 빠르게 분해된다. 더 넓은 적용분야를 목표로 하는 제제의 한가지 예는 글루코스 수송체를 사용하는 18-F-플루오로데옥시글루코스 (FDG)이다. 18F-FDG는 글루코스에 대하여 증가된 요구도를 가진 세포에 의해 우선적으로 흡수된 다음, 세포 내부에 포획된다. FDG는 많은 암의 진단, 단계화(staging) 및 모니터링은 물론, 심장 및 뇌에서의 대사 모니터링에 임상적으로 사용될 수 있다. 18F-FDG는 (그의 신장 재흡수를 방지하고 제거를 강화하는) 신장 세관에서 발견되는 나트륨-의존성 글루코스 수송체의 기질은 아니다.
생체내 산화성 스트레스는 세포 스트레스의 징후로 인식된다. 이와 같은 스트레스를 영상화하기 위한 노력에는 전자 상자성 공명 (EPR)을 사용한 동물의 영상화가 포함되어 있다. EPR은 산화성 스트레스에서 자유 라디칼의 생성과 함께 발생하게 될 것인 짝이 없는 전자를 검출하기 위한 기술이다. 필수적으로, 산화성 스트레스의 척도로서의 장기 항산화 활성에 민감한 EPR 프로브인 것으로 여겨지는 제제가 사용된다.
다른 이들은 생체내 종양 화학요법 치료의 동물 모델에서 글리신 흡수 및 글루타치온으로의 전환을 검출하기 위하여 13-C-글리신 화학 이동 MRI를 사용하는 것에도 관심을 두어 왔다. 또 다른 이들은 화학요법 치료를 모니터링하기 위하여, 생체 내에서 아폽토시스성 세포를 검출하는 영상화제, 예를 들면 꽤 큰 단백질인 표지된 아넥신(Annexin) V, 특이적으로 아폽토시스성 세포로만 들어가는 것으로 보고되어 있는 소형 분자 계열인 뉴로서바이벌 테크놀로지스(Neurosurvival Technologies) 사의 아포센스(Aposense)를 개발하였다.
발명의 개요
본 발명의 영상화제 및 방법은 세포 산화성 스트레스의 조건하에서 활성화되는 세포 아미노산 수용체 (시스틴/글루타메이트 역수송체, xc-)를 이용한다. 본 발명의 표지된 분자 영상화제 및 방법은 비제한적으로 매우 다양한 진단 및 치료적 모니터링 적용분야에서의 그의 용도를 포함한 몇 가지 장점을 제공하는 바; 그것은 소형 분자로써 신체에서 발견되는 천연 화합물의 표지된 변종을 포함하며, 독성 반응을 생성시키는 것보다 충분히 낮은 생리학적 농도를 가진 미량 수준으로 투여됨으로써, 독성/면역 반응이 낮을 것으로 기대되고; 영상화제가 수송체 기질로 작용하므로, 영상화제의 신호가 세포 표면 항원결정인자의 화학량론적 결합으로 제한되는 다른 분자 바인더들과는 달리 분자 영상화제가 일단 세포 내부로 포획되기 때문에, 제제가 신호 증폭의 혜택을 본다. 시스틴/글루타메이트 수송체를 위한 본 발명의 표지된 기질은 치료 목적으로 표적에 화합물을 도입하는 데에 사용될 수도 있다.
시스틴/글루타메이트 수송체의 표지된 기질로서, 본 영상화제는 증가된 산화성 스트레스와 관련된 임의의 질병 또는 이상에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 영상화제는 생체내에서 아폽토시스성 세포를 영상화하는 데에 사용될 수 있다. 아폽토시스성 세포 사멸의 그와 같은 비침습성 모니터링은 비제한적으로 예를 들면 화학요법 유효성, 허혈/뇌졸중으로 인한 조직 손상, 외상성 손상, 및 이식 거부를 모니터링하는 데에 유용하다. 산화성 스트레스의 영상화는 또한 염증성 질병, 또는 산화성 스트레스 또는 조직 손상을 포함하는 임의의 병리학적 징후를 진단 및 모니터링하는 데에 유용하다.
또한, 시스틴/글루타메이트 수송체의 상향조절은 일부 종양에서의 화학요법 내성과 연관되기도 한다. 따라서, 기본적으로 높은 시스틴 흡수율을 갖는 종양의 비-침습성 영상화는 소정 요법에 대하여 내성일 것으로 예상되는 종양의 확인으로 이어질 수 있으며; 이는 치료 처방계획의 효과적인 변화로 이어질 수 있다.
세포에서 산화성 스트레스를 검출하기 위한 본 발명 방법의 일례는 일반적으로 하기를 포함한다: 표지된 시스틴을 포함하는 영상화제를 세포의 시스틴/글루타메이트 역수송체로 도입함; 세포내의 표지된 시스틴이 표지된 시스테인으로 환원되도록 함; 세포 내의 표지된 시스테인을 검출함. 예를 들어, 일부 적용분야에서는, 표지된 시스틴이 아폽토시스성 세포에서 검출될 수 있다. 상기 방법의 일부 비제한적인 예에서, 산화성 스트레스의 검출 방법에 사용되는 표지된 시스틴은 이하에서 더 구체적으로 정의되는 바와 같은 구조 I, II, II 및 IV 중 1종에서 선택된다.
본 발명 영상화제의 또 다른 실시양태는 일반적으로는 비제한적으로 이하에서 더 구체적으로 정의되는 구조 I, II, III, IV, V 및 VI와 같은 시스틴/글루타메이트 수송체 (xc-)의 표지된 소형 분자 기질을 포함한다.
본 발명 영상화 방법의 비제한적인 예는 일반적으로 비제한적으로 이하에서 더 구체적으로 정의되는 바와 같은 구조 I, II, III 및 IV와 같은 시스틴 화합물을 사용하며, 상기 화합물은 형광 현미경법, 레이저-공초점 현미경법, 교차-편광 현미경법, 광학 영상화, 핵 섬광조영법, 양전자 방출 단층촬영법, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영법을 사용하여 검출되는 것을 포함한다.
첨부된 도면 (여기에서 동일한 문자는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부분을 나타냄)을 참조하여 하기의 상세한 설명을 해독하게 되면, 상기를 포함하여 본 발명의 기타 특징, 측면 및 장점들이 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 시스틴/글루타메이트 역수송체를 통하여 세포로 수송되는 본 발명 영상화제 실시양태의 흐름도이다.
도 2a는 비-아폽토시스성 저캇 세포 (더 짙은 회색)와 상이한 입도를 가진 일부 후기 아폽토시스성 저캇 세포 (밝은 회색)를 보여주는 정방향 산란광/측면 산란광(forward scatter/side scatter) 플롯이다. 도 2b는 비-아폽토시스성 세포를 나타내는 아넥신V 및 요오드화 프로피듐 (PI) 음성 세포를 4분면 D3에 보여주고; 초기 아폽토시스성 세포를 나타내는 아넥신 V-Cy5 양성 및 요오드화 프로피듐 (PI) 음성 세포를 4분면 D4에 보여주며; 후기 아폽토시스 및 괴사 세포를 나타내는 아넥신 V 양성 세포를 4분면 D2에 보여주는 다중-4분면 산란광 플롯이다.
도 3a-d는 산화성 스트레스/아폽토시스를 유도하는 스타우로스포린 (STN)이 있거나 없으며, 시스틴/글루타메이트 수송체를 억제하는 술파살라진 (sasz)이 있거나 없는 저캇 세포에서의 DBC 흡수의 유동 세포측정 분석 결과를 보여준다. 도 3a는 DBC 분자의 약간의 흡수 또는 비특이적 결합을 나타내는 비처리 세포를 보여주는 그래프이다. 도 3b는 스타우로스포린 유도된 세포가 3개의 세포 하위군집을 가짐을 보여주는 그래프로써, 낮은 강도의 DBC 형광은 정상 세포를 나타내며, 중간 강도는 초기 아폽토시스성 세포를 나타내고, 높은 강도는 후기 아폽토시스성 세포를 나타낸다. 도 3c는 시스틴/글루타메이트 수송체 억제제인 술파살라진 (sasz)에 노출된 스타우로스포린 유도 세포가 상이한 결과를 가지며; 중간 DBC 염색을 가진 세포 군집은 후기 아폽토시스성 세포를 나타내는 반면, 초기 아폽토시스성 세포는 낮은 DBC 강도의 군집에 존재한다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 4d는 정상, 초기 아폽토시스성 및 후기 아폽토시스성 세포에 있어서의 바탕 DBC 염색에 비해 더 크게 표지된 세포의 백분율 (아넥신V 및 PI 염색에 의해 측정)을 보여주는 막대 차트이다.
도 4a는 STN을 사용하여 18시간 동안 처리된 저캇 세포에서의 DBC의 흡수를 보여준다. 도 4b는 디보디파이(650) 시스틴 (DBC(650))을 사용하여 배양된 동일 세포의 비교를 보여준다. 도 5 A-C는 산화성 스트레스/아폽토시스를 유도하는 스타우로스포린 (STN)이 있으며, 시스틴/글루타메이트 수송체를 억제하는 술파살라진 (sasz)이 있거나 없는 저캇 세포에서의 모노보디파이시스틴 (MBC) 흡수의 유동 세포측정 분석 결과를 보여준다. 도 5a는 스타우로스포린 유도 세포가 2개의 세포 하위군집을 가지고, 정상 세포를 나타내는 MBC 형광은 없으며, 초기 및 후기 아폽토시스성 세포를 나타내는 MBC가 고강도임을 보여주는 그래프이다. 도 5b는 스타우로스포린 유도되고 시스틴/글루타메이트 수송체 억제제인 술파살라진 (sasz)에 노출된 것은 상이한 결과를 가지며; 중간 MBC 염색을 가진 세포의 군집은 후기 아폽토시스성 세포를 나타내는 반면, 초기 아폽토시스성 세포는 MBC 형광 강도를 나타내지 않음을 보여주는 그래프이다. 도 5c는 정상, 초기 아폽토시스성 및 후기 아폽토시스성 세포에 있어서의 바탕 MBC 염색에 비해 더 크게 표지된 세포의 백분율 (아넥신V 및 PI 염색에 의해 측정)을 보여주는 막대 차트이다.
도 6a는 5종의 상이한 형광성 제제인 DBC, DBC(650), 디보티파이시스타치오닌 (DB시스타치오닌), MBC 및 음성 대조 형광 분자 (보디파이-FL C5)를 사용하여 표지된 정상, 초기 아폽토시스성 및 후기 아폽토시스성 세포의 백분율 (아넥신V 및 PI 염색에 의해 측정)을 보여주는 막대 차트이다. 도 6b는 도 6a에 나타낸 5종의 제제 각각을 사용하여 표지된 초기 아폽토시스성 세포에 있어서의 평균 배수 강도 이동을 보여주는 표이다.
도 7은 배양물 중 저캇 및 A549 세포에서의 모노AO-[18F]-FBA-시스틴의 흡수를 보여주는 막대 그래프이다.
도 8a는 %ID/장기로 나타낸 나이브 발브-c 마우스에서의 생체분포 결과를 보여주는 그래프이다. 도 8b는 도 8a에 나타낸 동일 데이터의 %ID/그램을 보여주는 그래프이다. 도 8c는 %ID/그램으로 나타낸 A549 이종이식편 종양을 가진 누드 마우스에서의 생체분포 결과를 보여주는 그래프이다. 도 8d는 각 시점에서의 종양 대 혈액 비를 보여주는 것으로써, 도 8c에 나타낸 동일 데이터로부터 유추하였다.
도 9는 시간 경과에 따른 모노AO-[18F]-FBA-시스틴 분자의 안정성을 보여주는 그래프이다.
도 10은 주입 60분 후 나이브 마우스의 PET 영상에서의 18F-AO-FB-시스틴을 보여주는 영상이다.
발명의 상세한 설명
일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 구조를 가진 표지화 시스틴 화합물을 포함하는 영상화제를 제공한다.
<화학식 I>
Figure pct00004
(상기 식에서, R 및 R' 중 하나는 형광성 표지 또는 방사성동위원소 표지에서 선택되는 표지를 포함하며, R 및 R' 중 다른 하나는 수소임)
본원에서 사용될 때, "영상화제"라는 용어는 시험관내 또는 생체내 중 어느 것에서의 영상화 기술을 사용하여 검출될 수 있는 화합물들을 포괄하고자 하는 것이다.
본원에서 사용될 때, "형광성 표지"라는 용어에는 특정 파장의 광에의 노출에 의해 여기될 경우 상이한 파장의 광을 방출하는 화합물인 형광성 영상화제 및 형광단(fluorophore)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 형광단은 그의 방출 프로필 또는 색상 면에서 기술될 수 있으며, 분자가 형광성이 되도록 하는 분자의 구성요소이다. 그것은 통상적으로 특정 파장 또는 파장 범위의 에너지를 흡수하여, 상이하지만 역시 고유한 파장 또는 범위에서 에너지를 재방출하는 관능기이다.
본원에서 사용될 때, "방사성동위원소 표지"라는 용어에는 화합물, 또는 화학적 또는 생물학적 과정에서의 화학 반응의 기작, 또는 생물학적 물질, 생물체 및 시스템을 추적 또는 가시화하기 위하여 화합물에 사용되는 방사성동위원소가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그와 같은 표지는 예를 들면 영상화 및 검출 시스템과 관련하여 유용하다.
일반적으로, 본 발명의 영상화제에는 표지된 시스틴, 및 시스틴/글루타메이트 수송체의 기질이 되는 데에 필요한 속성을 유지하는 소정 시스틴 유사체가 포함된다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 영상화제는 시스틴/글루타메이트 수송체의 기질로서 기능한다. 자유 아민에서 표지된 시스틴이 시스틴/글루타메이트 수송체의 기질이다. 세포로의 수송 후, R-시스틴은 R-시스테인 및 비표지 시스테인으로 환원된다. R-시스테인은 대사되지 않으며, 수송체를 통하여 유출될 수 없다. 따라서, 그것은 산화성 스트레스에 대하여 반응중인 세포 내에서 유지된다.
본원에서 사용될 때, "시스틴/글루타메이트 수송체"라는 용어는 시스틴/글루타메이트 역수송체, 시스틴/글루타메이트 교환체, 시스틴 수송체, xc(-), Xc(-), 시스템 xc(-), 및 아미노산 수송 시스템 Xc(-)라는 용어들을 포함하여 호환적으로 사용된다. 상기 수송 시스템은 2개 단백질의 이량체를 포함하며, 비제한적으로 하기를 포함한다: 단백질 xCT 및 단백질 CD98 (4F2 표면 항원 SLC3A2의 중사슬 4F2hc); xc(-) 시스템 고유의 소단위인 단백질 xCT; 상이한 기질을 갖는 수많은 수송체들에서 공통적인 소단위인 단백질 CD98; 및 다수의 수송체에서 공통적인 또 다른 소단위인 rBAT와 이량체화될 수도 있는 단백질 xCT.
본 발명의 영상화제는 그의 방출 신호에 의해 검출될 수 있다. 화합물의 검출 방법에는 형광 현미경법, 레이저-공초점 현미경법, 교차-편광 현미경법, 광학 영상화, 핵 섬광조영법, 양전자 방출 단층촬영법, 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영법이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 영상화제가 형광성 표지를 포함하는 표지화 시스틴 화합물을 포함하는 경우, 적합한 검출 방법에는 형광 현미경법, 레이저-공초점 현미경법, 교차-편광 현미경법, 및 광학 영상화가 포함된다. 형광성 표지는 소정의 적합한 검출 방법에서 직접 또는 간접적인 것 중 어느 것으로 검출될 수 있는 소정 잔기이다. 바람직한 형광성 표지에는 광범위한 비편재화(delocalized) 전자 시스템을 갖는 기, 예를 들면 시아닌, 메로시아닌, 인도시아닌, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 트리페닐메틴, 포르피린, 피릴륨 염료, 티아피릴륨 염료, 스쿠아릴륨 염료, 크로코늄 염료, 아줄레늄 염료, 인도아닐린, 벤조페녹사지늄 염료, 벤조티아페노티아지늄 염료, 안트라퀴논, 나프토퀴논, 인다트렌, 프탈로일아크리돈, 트리스페노퀴논, 아조 염료, 분자내 및 분자간 전하-전달 염료 및 염료 착물, 트로폰, 테트라진, 비스(디티올렌) 착물, 비스(벤젠-디티올레이트) 착물, 요오도아닐린 염료, 비스(S,O-디티올렌) 착물이 포함된다. 녹색 형광성 단백질 (GFP), 및 상이한 흡수/방출 특성을 가진 GFP의 변형체와 같은 형광성 단백질들 역시 유용하다. 소정 희토류 금속 (예컨대 유로퓸, 사마륨, 테르븀 또는 디스프로슘)의 착물은 소정 맥락에서 형광성 나노결정 (양자점(quantum dot))과 마찬가지로 사용된다. 1종 이상의 본 발명 영상화제는 형광성 표지를 포함하는 표지화 시스틴 화합물을 포함하며, 여기서 표지화는 시스틴의 아민 기에서 이루어진다. 비제한적인 예에는 하기가 포함된다: 녹색 형광성 시스틴 분자 예컨대 디보디파이(FL)-시스틴 및 모노보디파이(MonoBodipy)(FL)-시스틴; 적색 형광성 시스틴 분자 예컨대 디보디파이(650)-시스틴 및 모노보디파이(650)-시스틴. 형광성 표지, 예컨대 보디파이 형광성 염료는 세포 산화성 스트레스의 광학적 생체내 영상화 및 시험관내 검출에 특히 적합할 수 있다.
형광성 표지를 포함하는 특정 표지화 시스틴 화합물은 하기 화학식 IV의 구조를 가진다.
<화학식 IV>
Figure pct00005
상기 화합물은 본원에서 모노보디파이시스테인 (MBC)로 지칭되기도 한다.
시스틴에의 형광성 표지의 결합은 숙련자에게 잘 알려져 있는 합성 화학 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 광학 영상화에 적합한 형광성 표지를 포함하는 표지화 영상화제 및 그의 제조에 대해서는 리차(Licha)에 의해 문헌 ["Contrast Agents for Optical Imaging" in Optical, Ultrasound, X-Ray and Radiopharmaceutical Imaing, Springer 2002, Krause Ed.]에서 고찰되어 있다.
본 발명의 영상화제가 방사성동위원소 표지를 포함하는 표지화 시스틴 화합물을 포함하는 경우, 적합한 검출 방법에는 핵 섬광조영법, 양전자 방출 단층촬영법 및 단일 광자 방출 단층촬영법이 포함된다. 양전자 방출 단층촬영법을 위한 바람직한 방사성동위원소 표지에는 11C, 13N, 15O, 17F, 18F, 75Br, 76Br 또는 124I가 포함된다. 가장 바람직한 양전자-방출 방사성 비금속은 11C, 13N, 18F 및 124I, 특히 11C 및 18F, 가장 특히는 18F이다. 단일 광자 방출 단층촬영법을 위한 바람직한 방사성동위원소 표지는 감마-방출 방사성 할로겐이다. 바람직한 감마-방출 방사성 할로겐은 123I, 131I 및 77Br, 특히 123I이다. 1종 이상의 본 발명 영상화제는 방사성동위원소 표지화를 가능케 하는 보결 기를 포함하며, 여기서 표지화는 시스틴의 아민 기에서 이루어진다. 비제한적인 예에는 하기가 포함된다: 18F-플루오로벤즈알데히드로 표지된 시스틴의 아민옥시(AO) 유도체.
치료를 목적으로, 시스틴/글루타메이트 수송체를 위한 본 발명의 표지화 기질은 비제한적으로 131I에 의해 표지된 시스틴 기질과 같은 표지화 화합물을 표적으로 도입하는 데에 사용될 수도 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 영상화제는 하기 화학식 II의 구조를 갖는 표지화 시스틴 화합물을 포함한다.
<화학식 II>
Figure pct00006
(상기 식에서,
R1은 방사성동위원소 표지를 포함하며;
R2는 점선 결합이 단일 결합인 경우 수소이고;
R2는 점선 결합이 이중 결합인 경우 부재함)
화학식 II 구조의 특정 표지화 시스틴 화합물은 하기 화학식 III의 더욱 구체적인 구조를 가진다.
<화학식 III>
Figure pct00007
이와 같은 화합물은 본원에서 모노AO-[18F]-FBA-시스틴으로도 지칭된다.
18F-표지화 시스틴 화합물의 다른 예로는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다:
하기 화학식 V의 구조를 갖는 [18F]플루오로에틸-시스틴 또는 [18F]FE-시스틴:
<화학식 V>
및
하기 화학식 VI의 구조를 갖는 [18F]플루오로프로판아미도-시스틴 또는 [18F]FP-시스틴:
<화학식 VI>
Figure pct00009
.
표지된 시스테인 화합물이 방사성동위원소 표지를 포함하는 본 발명의 영상화제는 적합하게는 전구체 화합물로부터 제조된다. "전구체 화합물"에는 편리한 화학적 형태의 방사성동위원소 표지와의 화학 반응이 부위-특이적으로 이루어지고; 최소한의 단계 수 (이상적으로는 단일 단계)로; 상당한 정제의 필요성이 없이 (이상적으로는 추가 정제 없이) 수행됨으로써, 원하는 표지화 시스테인 화합물을 생성시킬 수 있도록 설계된 표지화 시스틴 화합물의 유도체가 포함된다. 그와 같은 전구체는 합성의 것으로써, 우수한 화학적 순도로 편리하게 수득될 수 있다. 전구체 화합물은 임의로 소정 관능기를 위한 1개 이상의 보호 기를 포함할 수 있다. 보호 기에 대해서는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 ['Protective Groups in Organic Synthesis', Theorodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, (Fouth Edition, John Wiley & Sons, 2007)]에 상세하게 기술되어 있다. 전구체 화합물은 이상적으로는 멸균된 비발열성(apyrogenic) 형태로 제공된다. 따라서, 전구체 화합물은 포유동물 투여에 적합한 생체적합성 담체와 함께 영상화제를 포함하는 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 전구체 화합물은 또한 그와 같은 약제학적 조성물의 제조를 위한 키트의 구성요소로서의 포함물에 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 전구체 화합물은 용액으로, 그리고 자동화 합성 장치에서 사용하도록 설계된 키트 또는 카세트(cassette)의 일부로서 제공된다.
본 발명의 특정 전구체 화합물은 하기 화학식 X의 구조를 가진다.
<화학식 X>
Figure pct00010
(상기 식에서, R" 및 R'" 중 하나는 전구체 기이고, R" 및 R'" 중 다른 하나는 수소이며, 상기 전구체 화합물은 임의로 히드록시, 카르보닐 및 아민 관능기 중 1개 이상에서 보호 기를 포함함). "전구체 기"는 편리한 화학적 형태의 방사성동위원소 표지와 반응하여 방사성동위원소 표지를 부위-특이적으로 도입하는 화학 기이다. 지금부터 구체적인 방사성동위원소 표지 맥락에서 그와 같은 적합한 전구체 기에 대해 기술한다.
영상화제의 방사성동위원소 표지가 18F인 경우, 플루오르화 알킬이 생체내 대사에 대하여 내성이기 때문에, 방사성플루오르 원자는 플루오로알킬 또는 플루오로알콕시 기의 일부를 형성할 수 있다. 다르게는, 방사성플루오르 원자는 직접 공유 결합을 통하여 방향족 고리에 결합될 수 있다. 방사성플루오르화는 18F-플루오르화물의 브롬화물, 메실레이트 또는 토실레이트와 같은 우수한 이탈 기를 포함하는 전구체 기와의 반응을 사용한 직접 표지화를 통하여 수행될 수 있다. 18F는 또한 히드록실 전구체 기의 [18F]-플루오로알킬 브롬화물, [18F]-플루오로알킬 메실레이트 또는 [18F]-플루오로알킬 토실레이트와의 O-알킬화에 의해 도입될 수도 있다. 아릴 디아조늄염, 아릴 니트로 화합물 또는 아릴 4차 암모늄염으로부터의 친핵성 치환은 아릴-18F 유도체로의 적합한 경로이다. 18F-표지화 기술에 대한 철저한 고찰을 문헌 ["Chemistry of Fluorine-18 Radiopharmaceuticals" by Snyder and Kilbourn in Handbook of Radiopharmaceuticals, Ed. M.J. Welch and C.S. Redvanly (2003, John Wiley and Sons)]에서 찾아볼 수 있다.
방사성요오드화의 경우, 전구체 화합물은 바람직하게는 하기의 전구체 기를 포함한다: 아릴 요오드화물 또는 브롬화물 (방사성요오드 교환을 가능케 함); 활성화 전구체 화합물 아릴 고리 (예컨대 페놀 기); 유기금속 전구체 화합물 (예컨대 트리알킬주석, 트리알킬실릴 또는 유기붕소 화합물); 또는 유기 전구체 화합물 예컨대 트리아젠 또는 요오도늄염과 같이 친핵성 치환을 위한 우수한 이탈 기. 전구체 화합물 및 유기 분자에의 방사성요오드의 도입 방법에 대해서는 문헌 [Bolton (J. Lab. Comp. Radiopharm. 2002; 45: 485-528)]에 기술되어 있다. 적합한 보로네이트 에스테르 유기붕소 화합물 및 그의 제조에 대해서는 문헌 [Kabalka et al (Nucl. Med. Biol., 2002; 29: 841-843 and 2003; 30: 369-373)]에 기술되어 있다. 적합한 유기트리플루오로보레이트 및 그의 제조에 대해서는 문헌 [Kabalka et al (Nucl. Med. Biol., 2004; 31 : 935-938)]에 기술되어 있다. 방사성요오드화를 위한 바람직한 전구체 화합물은 유기금속 전구체 기, 가장 바람직하게는 트리알킬주석을 포함한다.
방사성 요오드가 결합될 수 있는 아릴 전구체 기의 예를 하기에 제시한다.
Figure pct00011
모두 방향족 고리상에 용이한 방사성요오드 치환을 가능케 하는 치환체를 함유하고 있다. 방사성할로겐 교환을 통한 직접적인 요오드화에 의해 방사성 요오드를 함유하는 대안적인 치환체가 합성될 수 있는데, 예를 들면 하기이다.
Figure pct00012
방사성브롬화는 방사성요오드화된 화합물에 대하여 상기한 전구체 화합물들을 사용하여 수행될 수 있다. 카발카(Kabalka) 및 바르마(Varma)가 방사성브롬화 화합물을 포함한 방사성할로겐화 화합물의 합성을 위한 다양한 방법들에 대하여 고찰하였다 (문헌 [Tetrahedron 1989; 45(21): 6601-21]).
11C-표지된 본 발명의 영상화제는 영상화제의 데스메틸화된 버젼인 전구체 화합물을 11C 메틸 요오드화물과 반응시키는 것에 의해 직접적인 방식으로 합성될 수 있다. 원하는 영상화제의 특정 탄화수소의 그리그나드(Grignard) 시약을 [11C]CO2와 반응시켜 11C-표지된 관심 영상화제로 이어지는 전구체 화합물의 아민 전구체 기와 반응하는 11C 시약을 수득함으로써 11C를 도입하는 것 역시 가능하다. 그리그나드 시약은 원하는 방사성표지화 부위에 마그네슘 할로겐화물 전구체 기를 포함한다. 11C의 반감기는 겨우 20.4분이므로, 11C 표지화 중간물이 고도의 비활성을 가지고, 그에 따라 가능한 한 빠른 반응 공정을 사용하여 그것이 제조되는 것이 중요하다. 그와 같은 11C-표지화 기술에 대한 철저한 고찰을 문헌 [Antoni et al "Aspects on the Synthesis of 11C-Labelled Compounds" in Handbook of Radiopharmaceuticals, Ed. M.J. Welch and C.S. Redvanly (2003, John Wiley and Sons)]에서 찾아볼 수 있다.
화학식 I 구조의 디술피드 결합은 세포 내부에서 환원되며, 더 이상 xc- 수송체의 기질이 아니게 됨으로써 그 경로를 통해서는 제제가 세포를 이탈할 수 없다. 형광성 또는 방사성동위원소 표지 (R)가 아민에 결합하게 됨으로써, 생성되는 환원된 세포내 제제는 대사되지 않게 된다. 따라서, 생성되는 제제는 활성화된 xc- 수송체를 가진 세포 내에 진입하여 유지된다. 단일 표지된 시스테인 화합물은 R' 위치에 H를 가지나, 추가적인 표지가 제2 아민의 R' 위치에 첨부될 수도 있다.
표지된 시스틴을 예로 들면, 시스틴은 1개 또는 2개의 자유 아민에서 표지된다. 수송체를 통하여 세포로 도일될 때, 그것은 표지된 시스테인으로 환원되게 되며, 그것은 더 이상 수송체의 기질이 아니고, 그에 따라 동일한 진입 기작에 의해서는 세포로부터 방출될 수 없다. 아민이 표지에 결합되기 때문에, 표지된 시스테인은 글루타치온 합성 또는 단백질 합성의 기질이 아니게 되며, 표지는 세포 내에 포획되게 된다.
조사된 매우 다양한 인간 조직 및 세포에서, xc- 수송체는 주로 뇌는 물론, 췌장 및 배양된 세포주에서도 발현된다. xc- 수송체 발현은 대부분의 조직에서 매우 저조하나, 산화성 스트레스의 조건하에서, 그리고 세포가 배양물에서 생장되는 경우에 상향조절될 수 있다. xc- 수송체는 아폽토시스성 자극, 산화성 스트레스, 염증, 시스틴 유도 및 화학요법 내성을 포함한 수많은 조건하에서 유도된다.
상기에 적합하고 바람직하게 정의된 바와 같은 본 발명의 영상화제는 바람직하게는 포유동물 투여에 적합한 형태의 생체적합성 담체와 함께 영상화제를 포함하는 약제학적 조성물로서 제공된다. 약제학적 조성물은 본 발명의 별도의 측면을 형성한다.
상기 "생체적합성 담체"는 약제학적 조성물이 생리학적으로 허용가능하도록, 즉 독성 또는 과도한 불편 없이 포유동물 신체에 투여될 수 있도록 영상화제가 현탁 또는 용해되는 유체, 특히 액체이다. 생체적합성 담체는 적합하게는 주입용의 멸균된 무발열원수와 같은 주입가능 담체 유체; 식염수와 같은 수용액 (이것은 유리하게는 최종 주입용 생성물이 등장성 또는 비저장성 중 어느 것이 되도록 조절될 수 있음); 1종 이상 장성-조정 물질 (예컨대 생체적합성 상대이온을 포함하는 혈장 양이온의 염), 당 (예컨대 글루코스 또는 슈크로스), 당 알콜 (예컨대 소르비톨 또는 만니톨), 글리콜 (예컨대 글리세롤), 또는 기타 비-이온성 폴리올 물질 (예컨대 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 등)의 수용액이다. 생체적합성 담체는 에탄올과 같은 생체적합성 유기 용매를 포함할 수도 있다. 그와 같은 유기 용매는 더 많은 친지질성 화합물 또는 배합물을 가용화하는 데에 유용하다. 바람직하게는, 생체적합성 담체는 주입용 무발열원수, 등장 식염수 또는 에탄올 수용액이다. 정맥내 주입을 위한 생체적합성 담체의 pH는 적합하게는 4.0 내지 10.5의 범위이다.
시스틴/글루타메이트 역수송체 (xc- 수송체 시스템)를 통하여 세포에 흡수되는 이러한 제제는 비제한적으로 세포 산화성 스트레스를 동반하는 병리 또는 이상의 영상화를 포함하여, 생체내에서 세포의 산화성 스트레스를 영상화하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 제제의 혜택을 보게 될 영상화 적용분야에는 화학요법 치료 모니터링, 허혈/뇌졸중, 염증, 외상성 뇌 손상 및 장기 이식 모니터링이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은
시스틴/글루타메이트 수송체를 통하여 상기 생물학적 샘플에 청구항 제1항에 정의된 바와 같은 영상화제를 도입하고;
형광 현미경법, 레이저-공초점 현미경법, 교차-편광 현미경법, 광학 영상화, 핵 섬광조영법, 양전자 방출 단층촬영법, 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영법을 사용하여 상기 영상화제를 검출하는
것을 포함하는, 시스틴/글루타메이트 수송체를 가진 생물학적 샘플의 영상화 방법에 관한 것이다.
상기 생물학적 샘플은 바람직하게는 시험관내 세포 배양물이다. 이와 같은 경우, 본 발명의 영상화제를 도입하는 단계는 적합한 버퍼에 현탁된 영상화제를 시험관내 세포 배양물에 첨가한 후, 이어서 바람직하게는 생리학적 온도에서 정해진 시간 기간 동안 배양하는 것에 의해 수행된다. 이후, 검출 단계는 숙련자에게 잘 알려져 있는 형광 현미경법, 레이저-공초점 현미경법, 교차-편광 현미경법 기술을 사용하여 수행된다. 예를 들면 문헌 ["Principles of Fluorescence Microscopy" Third Edition 2006, Lakowitz, Ed.]을 참조하라.
다른 바람직한 것으로써, 생물학적 샘플은 포유동물 대상 자체이다. 생물학적 샘플이 포유동물 대상 자체인 경우, 영상화제는 바람직하게는 본 발명의 약제학적 조성물로서 투여된다. 바람직하게는, 상기 대상에의 투여는 비경구로, 가장 바람직하게는 정맥내로 수행된다. 정맥내 경로는 대상의 신체 전체에 걸쳐 영상화제를 전달하는 가장 효율적인 방식을 대표한다. 정맥내 투여는 실질적인 물리적 방해 또는 실질적인 건강상의 위험을 나타내지 않는다. 본 발명의 영상화제는 바람직하게는 본원에 정의되는 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물로서 투여된다.
생물학적 샘플이 포유동물 대상 자체인 경우, 영상화 방법의 검출 단계는 바람직하게는 양전자 방출 단층촬영법 또는 단일 광자 방출 단층촬영법을 사용하여 수행되며, 바람직하게는 여기서 상기 영상화제는 상기 정의된 바와 같은 화학식 II 또는 III 구조의 시스테인 화합물을 포함한다. 양전자 방출 단층촬영법의 경우, 상기 영상화제는 상기 정의된 바와 같은 화학식 III 구조의 표지화 시스틴 화합물을 포함하는 것이 바람직하다.
다른 측면에서, 본 발명은
청구항 제1항에 정의된 바와 같은 영상화제를 세포의 시스틴/글루타메이트 역수송체에 도입하고;
세포내 표지화 시스테인 화합물이 표지된 시스테인으로 환원되도록 하고;
세포에서 표지된 시스테인을 검출하는
것을 포함하는, 세포에서의 산화성 스트레스의 검출 방법을 제공한다.
바람직하게는, 산화성 스트레스의 상기 영상화 방법 및 상기 검출 방법에 있어서, 상기 검출은 아폽토시스성 세포에서 수행된다.
[ 실시예 ]
하기는 상기 영상화제 및 사용 방법의 다양한 실시양태들을 예시하기 위하여 사용된 비제한적인 실시예이다.
실시예 1
1 μM의 스타우로스포린을 사용하거나 그것 없이 아폽토시스성 세포의 시험관내 분석에서 16시간 동안 인간 저캇(Jurkat) 세포를 배양하고, 요오드화 프로피듐 (PI) 및 Cy5-아넥신(Annexin)V (아넥신)을 사용하여 염색하였다. 통상 ~30-50 %의 세포가 아폽토시스 또는 괴사의 소정 단계인 것으로 밝혀졌다. 유동 세포측정법을 사용하여 정상 (PI 및 아넥신 음성), 초기 아폽토시스성 (PI 음성, 아넥신 양성), 및 후기 아폽토시스 및 괴사 (PI 및 아넥신 양성)로 정의되는 세포의 개체수를 확인하였다. 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다. 도 2a는 비-아폽토시스성 세포 (더 짙은 회색)와 상이한 입도를 가진 일부 후기 아폽토시스성 세포 (밝은 회색)를 보여주는 정방향 산란광/측면 산란광 플롯이다. 도 2b에서, 아넥신V 및 PI 음성 세포는 4분면 D3에서 보여지며, 비-아폽토시스성 세포를 나타낸다. 4분면 D4의 세포는 아넥신V 염색에 대하여 양성이나 PI 염색에 대해서는 음성인 초기 아폽토시스성 세포를 나타낸다. 4분면 D2의 세포는 아넥신V 및 PI 염색 모두에서 양성인 후기 아폽토시스성 및 괴사 세포를 나타낸다.
실시예 2
1 μM의 스타우로스포린 (STN)을 사용하거나 (도 3b) 그것 없이 (도 3a) 저캇 세포를 16-18시간 동안 배양하고, 아넥신 V-Cy5 및 요오드화 프로피듐을 사용하여 염색한 후, DBC를 사용하여 30분 동안 배양하였다. DBC는 인비트로겐 사의 시중에서 구입가능한 제품으로써 (카탈로그 #B20340), 산성 조건에서의 디술피드 교환 반응을 통한 뉴클레오티드, 단백질 및 세포의 가역적 티올 표지화를 목적으로 판매되고 있다. DBC는 하기에 나타낸 구조를 가진다.
Figure pct00013
도 3a에서, 비처리 세포는 DBC 분자의 흡수 또는 비특이적 결합에 해당하는 약간 낮은 강도의 형광을 나타낸다. 도 3b에서, 스타우로스포린 유도 세포는 높은 강도의 DBC 염색도를 가진 세포의 하위군을 가지는데, 이는 주로 후기 아폽토시스/괴사 세포 (+아넥신V, +PI)와 관련된다. 중간 DBC 염색도를 가진 세포의 군집 역시 보이는데, 이는 거의 초기 아폽토시스성 세포 (+아넥신V, -PI)와 관련된다. 이와 같은 아폽토시스성 세포 표지화 분석에서의 xc- 수송체의 역할을 더 상세하게 제기하기 위하여, 저캇 세포를 또한 xc- 수송체의 강력한 특이적 억제제인 술파살라진과 함께 배양하였다. DBC와 동일한 시간에 시스틴/글루타메이트 수송체의 특이적 억제제 (술파살라진, sasz)를 첨가한 것 이외에는 도 2b에서와 같이 세포를 처리하였다 (도 3c). 도 3c에서는, 중간 DBC 염색도를 가진 세포의 군집이 발견되었는데, 이는 거의 후기 아폽토시스성 세포 (+아넥신V, +PI)와만 관련된다. 도 3d에서는, 세포들을 실시예 1에서와 같이 정상, 초기 아폽토시스, 또는 후기 아폽토시스로 범주화하고, 각 범주에 대하여 증가된 DBC 염색도를 가진 세포의 백분율을 기록하였다. 초기 및 후기 아폽토시스성 세포를 DBC로 표지하였으나, 그들은 초기 아폽토시스성 세포에서만 sasz에 의해 억제되었다. 그와 같이 DBC는, 그것이 시스틴의 아민을 통하여 2개의 형광단에 결합된다 할지라도, 시스틴-글루타메이트 수송체의 활성을 통하여 초기 아폽토시스성 세포를 표지하고, 수송체 기질로서 작용한다. 이와 같은 데이터는 DBC를 가진 초기 아폽토시스성 세포에서 나타난 흡수가 소정의 다른 기작이라기 보다는 xc- 수송체에 의존한다는 것을 보여준다.
실시예 3
DBC의 아폽토시스성 저캇 세포 흡수는 xc- 수송체가 산화성 스트레스 (및 이 경우 아폽토시스)를 겪고 있는 세포에서 활성화된다는 것 뿐만 아니라, xc- 수송체가 녹색 형광단 (보디파이FL)이 첨부된 아민을 가진 해당 기질 (시스틴)을 세포로 도입하기에 충분하게 범용적(promiscuous)이라는 것 역시 보여준다. 수송체의 범용성을 추가 확인하기 위하여, 적색 형광단 (보디파이650)을 사용하여 표지된 시스틴 화합물을 합성하였다. 보디파이FL 표지된 시스틴과의 병행 비교에서, DBC-650은 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 정상 세포에 비해 아폽토시스성 세포를 조금도 더 많이 표지하지 않는 것으로 나타남으로써, 일부 표지는 xc- 수송체 기질 상태를 유지하기에 충분하지 않음을 보여주었다. 본 실시예에서, 보디파이-650 형광단 및 관련 링커(linker)는 DBC의 그것에 비해 더 컸으며 (도 4a), 그에 따라 크기가 어떤 기가 아민에 첨부되면서 수송체를 통과하는 능력을 유지하는지에 대한 한 가지 제한임을 표시하였다.
실시예 4
전기한 실시예에서, 표지의 크기를 작게 유지하는 것이 중요하였다. 더 작게 표지된 시스틴 화합물이 DBC-650 및 DBC와 같은 더 크게 표지된 시스틴 화합물에 비해 더 적절한 기질로서 기능하였다. 이에 따라, 하나의 아민에만 형광 표지 보디파이를 가진 더 작은 형광 시스틴 화합물인 모노보디파이시스틴 (MBC)을 합성하였다. 이와 같은 분자는 시중에서 구입가능한 시스틴 및 보디파이-FL 숙신이미딜 에스테르 (인비트로겐 사, D2184)를 사용하여 생성시켰으며, 역상-HPLC에 의해 정제하고, 질량 분광법에 의해 분석함으로써 올바를 생성물인지를 확인하였다. MBC는 하기에 나타낸 구조를 가진다.
Figure pct00014
1 μM STN을 사용하여 16-18시간 동안 저캇 세포를 배양하고, 아넥신 V-Cy5 및 요오드화 프로피듐을 사용하여 염색한 후, 시스틴/글루타메이트 억제제 (sasz)의 첨가 없이 (도 5a), 그리고 그것을 첨가하여 (도 5b) MBC와 함께 30분 동안 배양하였다. 도 5a에서는, 높은 강도의 형광 이동을 가진 세포의 하위군으로서 MBC 표지화를 가시화하였는데, 거의 초기 및 후기 아폽토시스성 세포 양자와 관련되었다 (도 5c). 중간 군집은 확실하지 않았는데, MBC가 DBC에 비해 더 큰 강도로 초기 아폽토시스성 세포를 표지함을 암시하였다. 도 5b에서, 술파살라진의 첨가는 더 적은 표지화 세포를 초래하였으며, 형광 강도에서 더 적은 이동을 가졌다. 이화 같은 군집은 거의 후기 아폽토시스성 세포와 관련되었으며, 초기 아폽토시스성 세포와는 거의 관련되지 않았다 (도 5c). 본 실시예에서, MBC는 DBC에 비해 더 작았으며 (하나의 표지만을 가짐), 천연 수송체 기질인 시스틴에 더 밀접하게 닮아서; 향상된 초기 아폽토시스성 세포 표지화 성능을 가진 제제로 이어졌다. MBC의 경우, 시스틴 화합물 당 하나 더 적은 형광단이 존재함에도 불구하고, 아폽토시스성 세포에서의 형광 강도 증가 크기를 희생하지 않으면서도 정상 세포에서의 바탕 흡수가 더 적었다.
실시예 5
환원가능 디술피드 결합을 함유하는 제제는 반드시 세포내 구획 내부에서 환원되며, 그에 따라 시스틴/글루타메이트 수송체에 의한 유출의 기질이 아니게 됨으로써, 세포 내부에서의 표지의 포획을 초래하게 된다. 이와 같은 작용을 보여주기 위하여, 하기의 구조를 갖는 디보디파이 시스타치오닌 (DB시스타치오닌) 제제를 제제화하였다.
Figure pct00015
음성 대조로서, 보디파이-FL C5도 사용하였는데, 그것은 인비트로겐 사로부터 시중에서 구입가능하였으며, 하기의 구조를 가졌다.
Figure pct00016
도 6a는 DBC, DBC(650), DB시스타치오닌, MBC 및 음성 대조 (보디파이-FL C5)를 가진 정상, 초기 아폽토시스성 및 후기 아폽토시스성 저캇 세포의 보디파이 염색 비교를 보여준다. DBC, DB시스타치온, 및 MBC는 초기 아폽토시스성 세포를 염색하였으며, DBC(650)은 후기 아폽토시스성 세포만을 염색하였고, 음성 대조는 아폽토시스성 세포에서 어떠한 형광 이동도 나타내지 않았다. 이와 같은 데이터로 볼 때, DBC, DB시스타치오닌, 및 MBC는 모두 동등한 아폽토시스성 세포용 표지이다. 그러나, 도 6b에서, 각 제제에 대하여 초기 아폽토시스성 세포의 형광 강도 배수 이동을 정상 세포와 비교하였다. 사용된 다른 형광제들에 비해 MBC가 더욱 강력한 염색을 제공한다는 것이 명백하였다.
실시예 6
전기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 하나의 작은 표지를 갖는 것이 유리하다. 더 작게 표지된 시스틴 화합물은 DBC-650과 같이 더 크게 표지된 시스틴 화합물에 비해 더 적절한 기질로서 기능한다. 이에 따라, 하나의 아민이 [18F]아민옥시-플루오로벤즈알데히드에 결합된 표지화 시스틴 화합물 (모노AO-[18F]-FBA-시스틴)을 합성하였으며, PET 영상화 적용분야에 사용될 수 있었다. 먼저, 하기의 구조를 갖는 아민옥시-시스틴 전구체 (모노AO-시스틴)을 합성하였다.
Figure pct00017
일반적으로, 이어서 상기 모노AO-시스틴을 [18F]플루오로벤즈알데히드에 결합시켜 하기의 구조를 갖는 모노AO-[18F]-FBA-시스틴을 산출하였다.
Figure pct00018
모노AO-[18F]-FBA-시스틴 합성 방법의 더 구체적이고 비제한적인 예를 하기와 같이 제공한다.
모든 반응은 질소 분위기하, 또는 질소로 퍼징되는 크림프-탑(crimp-top) 밀봉 바이알 중 어느 것에서 수행하였다. 크립토픽스(Kryptofix) 222 (알드리치(Aldrich) 사) 및 K2CO3 (EMD 사이언스(Science) 사)를 구입하여 입수된 그대로 사용하였다. HPLC 및 반응 용매 모두로, 옵티마(Optima)™-등급 아세토니트릴을 사용하였다.
IBA 몰레큘라(Molecular) 사 (뉴욕 알바니 소재) 또는 페트네트 솔루션즈(PETNET Solutions) 사 (뉴욕 알바니 소재) 중 어느 곳으로부터 [18F]KF (정제수 중 40 mCi.mL-1 (1480 MBq.mL-1))를 입수하여, 입수된 그대로 사용하였다. 상기 [18F]플루오르화물을 먼저 크로마픽스(Chromafix) 30-PS-HCO3 음이온 교환 카트리지 (ABX 사, 독일 라데베르크 소재)에 고정한 다음, 크립토픽스 K222 (376 g.mol-1, 8 mg, 2.13×10-5 mol) 및 탄산 칼륨 (138.2 g.mol-1, 2.1 mg, 1.52×10-5 mol)을 함유하는 1 mL의 아세토니트릴:증류탈염수 (ddH2O) 4:1 혼합물을 사용하여 습기제거 용기(drydown vessel)로 용리하였다. 약하게 가열하면서 (~45 ℃) (~15분) 부분적 진공 및 질소 흐름하에서 용매를 제거하였다. 다음에, 원료 바이알 및 음이온 교환 카트리지를 K222 (8 mg)를 함유하는 0.5 mL의 아세토니트릴로 세척하고, 반응 혼합물을 다시 부분적 진공 및 약한 가열 (~10분)하의 건조에 적용하였다. 질소를 사용하여 반응 용기를 가압하고, 추가 0.5 mL의 아세토니트릴을 사용하여 공비 습기제거를 2회 반복하였다. 4-포르밀-N,N,N-트리메틸아닐리늄 트리플레이트 (313.30 g.mol-1, 3.1 mg, 9.89×10-6 mol)를 0.35 mL의 무수 DMSO (아크로스(Acros) 사)에 용해시키고, 바로 [18F]KF.K222, K2CO3를 함유하는 반응 용기에 첨가하였다. 반응 혼합물을 90 ℃로 15분 동안 가열하고, 즉시 냉각한 후, 3 mL의 증류 탈염 H2O (ddH2O)로 급랭하였다. 이어서, 이와 같은 혼합물을 양이온 교환 카트리지 (워터스(Waters) 사의 셉팍 라이트 어셀 플러스(SepPak Light Accell Plus) CM)로 통과시키고, ddH2O를 사용하여 10 mL로 희석한 후, 역상 C18 셉팍 (워터스 사의 셉팍 플러스 C18)에 적재하였다. 상기 셉팍을 10 mL의 ddH2O로 플러싱한 다음, 30 mL의 공기로 퍼징하였다. [18F]4-플루오로벤즈알데히드 ([18F]FBA)를 1.0 mL의 메탄올 중에서 용리하였다.
별개로, 고회수(high recovery) 바이알 (2 mL, 내쇼날 사이언티픽(National Scientific) 사)에 모노-아민옥시 시스틴 (386.27 g.mol-1, 2.7 mg, 6.99×10-6 mol)을 충전하였다. 상기 고체를 250 μL의 ddH2O 및 8 μL의 트리플루오로아세트산에 현탁시켰다. 500 μL의 메탄올 중 [18F]FBA (상기 참조)를 반응 용기로 이동시켰다. 용기를 캡핑하고, 크림핑한 다음, 가열 블록 (반응 개시시 활성 4.66 mCi/172 MBq)에 위치시키고, 60 ℃에서 15분 동안 유지한 후; 그 시점에 분석용 HPLC 분석을 위하여 소량 분취량 (< 5 μL)을 분리하였다. 0.1 %의 TFA를 포함하는 250 μL의 ddH2O를 사용하여 대략 1000 μL로 용액을 희석함으로써, 준-정제용 HPLC 정제를 위한 조제물로 1:1 ddH2O:MeOH의 최종 조성물을 산출하였다. [18F]FB-시스틴을 단리하고, 준-정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 (0.409 mCi/15.1 MBq)을 함유하는 HPLC 분획을 ddH2O를 사용하여 5:1로 희석하고, 이어서 tC18 플러스 셉 팍 (워터스 사)에 고정하였다. 상기 셉팍을 먼저 5 mL의 ddH2O로, 다음에 30 mL의 공기로 플러싱하였다. 먼저 공극 부피 (대략 0.5 mL)를 용리하고 이어서 별도의 플라스크에 250 내지 300 μL의 용리액을 수집함으로써, 최소량의 DMSO 중에 [18F]FB-Cys (0.17 mCi, 6.3 MBq)를 단리하였다. 방사성화학 및 화학적 순도를 확정하기 위하여, 단리된 생성물에서 RP-HPLC 분석을 수행하였다. 통상적으로, 10 μL의 0.1 μCi/μL 용액을 제제화 후 분석용으로 주입하였다. 단리된 방사성화학적 수율은 3.6 % ([18F]FBA의 첨가로부터 6.6 % 붕괴 보정)이었으며, 방사성화학적 순도는 96.8 %이었다.
분석용 HPLC 조건: G1311A 쿼트펌프(QuatPump), 100μL 주사기 및 2.0 mL 시트 모세관이 구비된 G1313A 자동주입기, 페노메넥스 제미니(Phenomenex Gemini) C18 컬럼 (4.6 mm × 150 mm), 5 μ, 100 Å (S/N 420477-10), G1316A 컬럼 히터, G1315A DAD 및 라몬 스타(Ramon Star) GABI 감마-검출기. 0.05 % TFA를 포함하는 95:5 ddH2O:CH3CN, 용매 B: 0.05 % TFA를 포함하는 CH3CN을 사용하는 HP 아길렌트(Agilent) 1100에서 분석을 수행하였다. 구배 용리: 0분 0 % B, 1분 15 % B, 10분 31 % B, 10.5분 100 % B, 13.5분 100 % B, 14분 0 % B, 17분 0 % B. (TR ~ 7.1분).
준정제용 HPLC 조건: DG-2080-54 4-라인 디개서(Degasser), MX-2080-32 다이나믹 믹서 및 2개의 PU-2086 플러스 프레프(Plus Prep) 펌프, 대형 부피의 주입 키트가 설치되어 있는 AS-2055 플러스 인텔리전트(Plus Intelligent) 자동주입기, 페노메넥스 5 μ. 루나(Luna) C18(2) 100 Å, 250 × 10 mm, 가드가 구비된 5 μ 컬럼 (S/N 295860-1, P/N 00G-4252-N0), 고체-상태 SiPIN 광다이오드 감마 검출기에 결합된 MD-2055 PDA 및 캐롤 & 램지 어소시에이츠 모델(Carroll & Ramsey Associates Model) 105S 아날로그 레이트미터(Analogue Ratemeter)를 사용하는 자스코(Jasco) LC에서 정제를 수행하였다. 구배 용리: 0분 0 % B, 3분 20 % B, 42분 70 % B, 42.5분 100 % B, 46분 100 % B, 50분 0 % B, 용매 A. 0.05% TFA를 포함하는 ddH2O:CH3CN, 용매 B: 0.05% TFA를 포함하는 CH3CN (TR ~ 14.7분).
상기 모노AO-[18F]-FBA-시스틴을 시험관내 세포 흡수 분석에 사용하였는데, 여기에서는 모노AO-[18F]-FBA-시스틴을 배양된 세포와 함께 30분 동안 배양하고, 식염수로 2회 세척한 후, 1 N NaOH를 사용하여 세포를 용해시키고, 분석을 위하여 감마 계수기에 수집하였다. 도 7은 2종의 상이한 세포주에서의 모노AO-[18F]-FBA-시스틴의 흡수를 보여주며, 저캇 및 A549 세포주에서의 시스틴/글루타메이트 수송체의 바탕 발현 및 활성 차이를 나타낸다.
식염수 중 7 % 에탄올에 배합된 이와 같은 분자의 약동학적 프로필을 정상 마우스에서 확립하고, 도 8a 및 8b에 나타내었다. 나이브 발브(naive Balb)/c 마우스에 ~15 uCi까지의 18F-시스틴을 주입하고, 주입 후 5, 30, 120분으로 시점을 나누었다. 도 8a는 나이브 발브-c 마우스에서의 주입된 투여량 중 % (%ID)로 나타낸 생체분포 결과를 보여준다. 신체로부터의 제거는 신장, 방광 및 소변의 프로필에 나타난 바와 같이, 신장 배설에 크게 의존한다. 도 8b는 도 8a에 나타낸 동일 데이터의 %ID/그램을 보여준다. 2마리의 마우스에서, 항-Fas 항체의 주입에 의해 아폽토시스를 유도하고, 2시간 후에 방사성추적자를 주입하였다. 항-Fas 항체를 주입받은 2마리의 동물을 조사하고, 2시간 후에 모노AO-[18F]-FBA-시스틴을 주입하여 간에서 아폽토시스를 유도하였다. 지금까지 조사된 동물의 수는 적지만, 모두 대조 동물을 상회하는 간 흡수를 나타내었다.
도 8c는 A549 종양 이종이식편을 가진 누드 마우스에서 수행된 연구로부터의 %ID/그램으로 나타낸 유사한 생체분포 결과를 보여준다. 120분 및 240분 시점에, 혈액 또는 기타 조직 (신장 및 방광 제외)에서에 비해 종양에서 더 많은 %ID/그램을 검출하기에 충분할 정도로 방사성추적자가 제거되었다. 각 시점에서의 종양 대 혈액 비를 도 8d에 나타내었다. 이러한 결과는 방사성표지된 시스틴 화합물이 생체내에서의 시스틴/글루타메이트 수송체 활성의 검출에 사용될 수 있다는 것을 암시한다.
도 9는 식염수 중에서의 시간 경과에 따른 모노AO-[18F]-FBA-시스틴 분자의 안정성을 보여준다. 나타난 바와 같이, 4-시간의 기간 동안 감마-추적 프로필에 어떠한 변화도 존재하지 않았다.
도 10은 주입 60분 후 나이브 마우스의 PET 영상에서의 모노AO-[18F]-FBA-시스틴을 보여주는데, 주로 신장 및 방광을 통한 제거를 나타낸다.
또 다른 비제한적인 예로써, 시스틴은 123I-요오도벤즈알데히드를 사용하여 표지될 수 있는데, 플루오로벤즈알데히드와 유사하게 먼저 [123I]4-요오도벤즈알데히드 ([123I]IBA)를 AO-Cys 2.5 mg을 함유하는 고회수 바이알 (2 mL, 내쇼날 사이언티픽 사)에 첨가하는 것에 의해 제조될 수 있다. 0.5 mL의 ddH2O에 폴리펩티드를 용해시키는 것에 의해 반응을 개시하고, 8 μL의 트리플루오로아세트산을 첨가한 후, 이어서 메탄올 0.5 mL 중 [123I]IBA를 첨가한다. 용기를 캡핑하고, 크림핑한 후, 가열 블록에 위치시키고, 60 ℃에서 15분 동안 유지한 후; 반응의 상태를 평가하기 위하여 분석용 HPLC 분석을 위한 소량 분취량 (< 5 μL)의 분리를 수행한다. [123I]IB-시스틴을 단리하여, 준-정제용 HPLC에 의해 정제한다. 생성물을 함유하는 HPLC 분획을 ddH2O로 추가 희석하고 (5:1), 이어서 생성물을 tC18 플러스 셉 팍 (워터스 사)에 고정시킨다. 먼저 5 mL의 ddH2O를, 다음에는 30 mL의 공기를 사용하여 셉팍을 플러싱하고, 먼저 공극 부피 (대략 0.5 mL)를 용리한 후, 이어서 별도의 플라스크에 250 내지 300 μL의 용리액을 수집하는 것에 의해, 최소량의 에탄올 중 [123I]IB-시스틴을 생성시킨다. 다음에, 단리된 생성물에서 RP-HPLC 분석을 수행하여 방사성화학 및 화학적 순도를 확정한다.
본원에서는 본 발명의 특정 특징들만을 예시 및 기술하였지만, 업계 숙련자라면, 많은 변형 및 변경들을 이루게 될 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 그와 같은 모든 변형 및 변경들을 본 발명의 진정한 기술사상에 속하는 것으로 포괄하고자 한다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 I의 구조를 갖는 표지화 시스틴 화합물을 포함하는 영상화제.
    <화학식 I>
    Figure pct00019

    (상기 식에서, R 및 R' 중 하나는 형광성 표지 또는 방사성동위원소 표지에서 선택되는 표지를 포함하며, R 및 R' 중 다른 하나는 수소임)
  2. 제1항에 있어서, 표지화 시스틴 화합물이 하기 화학식 II의 구조를 갖는 영상화제.
    <화학식 II>
    Figure pct00020

    (상기 식에서,
    점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합 중 어느 것을 나타내며;
    R1은 방사성동위원소 표지를 포함하고;
    R2는 점선 결합이 단일 결합인 경우 수소이며;
    R2는 점선 결합이 이중 결합인 경우 부재함)
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방사성동위원소 표지가 11C, 13N, 15O, 17F, 18F, 75Br, 76Br, 124I, 123I, 131I 및 77Br에서 선택되는 것인 영상화제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 방사성동위원소 표지가 18F이며, 상기 표지화 시스틴 화합물이 하기 화학식 II, V 또는 VI 구조의 화합물에서 선택되는 것인 영상화제.
    <화학식 III>
    Figure pct00021

    <화학식 V>
    Figure pct00022
    및
    <화학식 VI>
    Figure pct00023
  5. 제1항에 있어서, 표지화 시스틴 화합물이 형광성 표지를 포함하며, 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 것인 영상화제.
    <화학식 IV>
    Figure pct00024
  6. 시스틴/글루타메이트 수송체를 통하여 상기 생물학적 샘플에 제1항에 정의된 영상화제를 도입하고;
    형광 현미경법, 레이저-공초점 현미경법, 교차-편광 현미경법, 광학 영상화, 핵 섬광조영법, 양전자 방출 단층촬영법, 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영법을 사용하여 상기 영상화제를 검출하는
    것을 포함하는, 시스틴/글루타메이트 수송체를 가진 생물학적 샘플의 영상화 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 시험관내 세포 배양물인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출 단계가 형광 현미경법, 레이저-공초점 현미경법, 또는 교차-편광 현미경법을 사용하여 수행되는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 포유동물 대상 자체인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 영상화제가 제2항 또는 제3항에 정의된 바와 같고, 상기 검출 단계가 양전자 방출 단층촬영법 또는 단일 광자 방출 단층촬영법을 사용하여 수행되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 영상화제가 제4항에 정의된 표지화 시스틴 화합물을 포함하며, 상기 검출 단계가 양전자 방출 단층촬영법을 사용하여 수행되는 방법.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 영상화제를 세포의 시스틴/글루타메이트 역수송체에 도입하고;
    세포내 표지화 시스테인 화합물이 표지된 시스테인으로 환원되도록 하고;
    세포에서 표지된 시스테인을 검출하는
    것을 포함하는, 세포에서의 산화성 스트레스의 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포가 아폽토시스성 세포인 방법.
  14. 포유동물 투여에 적합한 형태의 생체적합성 담체와 함께 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 영상화제를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 하기 화학식 X의 구조를 갖는, R 및 R' 중 하나가 방사성동위원소 표지를 포함하며 R 및 R' 중 다른 하나는 수소인 제1항에 정의된 영상화제의 합성을 위한 전구체 화합물.
    <화학식 X>
    Figure pct00025

    (상기 식에서,
    R" 및 R'" 중 하나는 전구체 기이고, R" 및 R'" 중 다른 하나는 수소이며, 상기 전구체 기는 편리한 화학적 형태의 방사성동위원소 표지와 반응하여 방사성동위원소 표지를 부위-특이적으로 도입하는 화학 기이고;
    상기 전구체 화합물은 임의로 히드록시, 카르보닐 및 아민 관능기 중 1개 이상에서 보호 기를 포함함)
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