CN104672330A - 用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C，包括(a)重链恒定区CH1的氨基酸序列、重链恒定区CH2的氨基酸序列和通过突变改造过得到的重链恒定区CH3的氨基酸序列；(b)所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；(c)所述轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；(d)所述轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。本发明在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，对抗体表面进行定点突变，既可控制连接活性小分子的数目这个问题，又可搭载稳定数量的小分子、毒素或核素。

Description

用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C。

背景技术

现代生物学证明癌症有很强的多样性，并且选择性不好的药物会对正常细胞产生很大的负作用。目前癌症新药研发局面缓慢，仍然有大量的癌症没有比较好的治疗办法。肝癌、肺癌、胰腺癌的五年存活率都在15％以下。当前癌症新药研发的平台大致分为单克隆抗体大分子生物药和小分子化学药，小分子化学药选择性差，会对正常细胞产生难以预期的毒性。单克隆抗体，简称单抗，对某一类细胞的选择性高，并可以在体内自然代谢，所以安全性相对较高，但单克隆抗体通常只能作用于细胞表面的靶点，因而经常只能起到抑制作用而并不能真正杀死癌细胞。

理想的药物就是把优异临床疗效的靶向特异性抗体和小分子药物药代动力学结合起来，这就是抗体－药物偶联物ADC。抗体-药物偶联物ADC是把具有细胞内吞作用的靶向特异性抗体和具有特定药理学特性，如细胞强毒作用的小分子化合物结合起来。即利用单克隆抗体把具有强烈毒副作用的毒素小分子化药靶向到肿瘤细胞，以期达到提高疗效，减少毒副作用。这项技术既克服了单抗药靶点可选性少，杀伤力差等缺点；同时又解决了小分子毒性高，代谢不稳定的问题。抗体-药物偶联物ADC因在血液中相对稳定，能有效地降低小分子细胞毒素化药本身对循环系统以及健康组织的毒性，是目前抗肿瘤领域的研究热点之一。

抗体-药物偶联物ADC在抗癌领域拥有广泛的发展空间，成为近年来抗肿瘤药物领域中最受关注的靶向药物，成功应用于临床的例子有治疗乳癌的曲妥珠单抗，治疗非霍奇金淋巴瘤的利妥昔单抗等。抗体－药物偶联物ADC药物的抗体部分为单链抗体，效应分子通常由放射性核素、药物或毒素片段等组成，以抗体为载体的免疫偶联物将效应分子带到肿瘤区域的靶细胞，进而以效应分子对靶细胞的选择性杀伤作用来治疗癌症，因而抗体-药物偶联物ADC药物被称为治疗恶性肿瘤的“生物导弹”。抗体－药物偶联物ADC药物中单克隆抗体部分的靶向作用和抗体所连接的效应分子对靶细胞的杀伤作用两者都是至关重要的。

在单抗新药的研发和改造中，分子影像学成为当今及其重要的研究手段，正电子发射断层显像immunopositron emission tomography，以下简称ImmunoPET。为近年来发展的新兴分子影像学技术，借助于其PET的高灵敏性和抗体高特意性的结合，可用于寻找和量化单抗，从而提供了一种量化分子靶标的方法，成为在疾病诊断中广泛使用的发展设计技术。

当前，抗体-药物偶联物ADC研发比较领先的公司主要有ImmunoGen和SeattleGenetics。ImmunoGen的主要技术是依靠抗体表面的Lysine将活性小分子和抗体连接起来制成ADC。这个技术的最大问题在于抗体表面有大量可以连接小分子的赖氨酸，这样就使得每次产生的ADC上一个抗体连接的活性小分子数量不能保持稳定。有的抗体搭载多达8个小分子，有的却很少，甚至没有。过多承载小分子的抗体会失去抗体本身的特性，而搭载不足的抗体又不能在癌细胞内部产生足够的致死浓度。Seattle Genetics的主要技术是依靠还原抗体配对的S-S键，然后依靠还原后的SH基团与连接物上的还原态的硫形成新的S-S键，从而将活性小分子和抗体连接起来制成ADC。他们的技术问题在于破坏了抗体原有的配对S-S键，使得抗体的稳定性大大降低，而且每次还原的抗体配对的S-S键数量不恒定，使得他们和ImmunoGen有同样的问题，每次产生的抗体-药物偶联物ADC上一个抗体连接的活性小分子数量不能保持一致。ADC药物中单克隆抗体部分的靶向作用和抗体所连接的效应分子对靶细胞的杀伤作用两者都是至关重要的。

目前缺乏一种在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，突变改造的突变点不影响抗体可变区与抗原结合的活性；维持可结晶片段区的构象和功能；点突变位于抗体分子表面；突变在温和条件下即可连接链接物的抗体。

发明内容

本发明的目的是在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，通过对抗体表面进行定点突变，从而控制连接活性小分子，突变在温和条件下即可连接连接物的用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C。

为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案为：一种用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C，包括

(a)重链恒定区，包括重链恒定区CH1的氨基酸序列、重链恒定区CH2的氨基酸序列和通过突变改造过得到的重链恒定区CH3的氨基酸序列；所述重链恒定区CH1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述重链恒定区CH2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述重链恒定区CH3的氨基酸序列是SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；

(b)重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(c)轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(d)轻链恒定区，所述轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

进一步地，制备所述的用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C的方法。

进一步地，用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C的搭载小分子、毒素或核素的方法。

更进一步地，本发明的一种分离的核酸，包括所述的重链恒定区的核苷酸序列、重链可变区的核苷酸序列、轻链恒定区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列；

所述重链恒定区的核苷酸序列包括所述重链恒定区CH1的核苷酸序列、重链恒定区CH2的核苷酸序列和重链恒定区CH3的核苷酸序列；

所述重链恒定区CH1的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述重链恒定区CH2的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述重链恒定区CH3的核苷酸序列是SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；

所述重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述轻链恒定区的核苷酸序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

进一步地，上述改造抗体IgG1-CH-N267C用于治疗和诊断工具以检测表达腱生蛋白的疾病的用途。

进一步地，所述疾病为恶性肿瘤或系统性自身免疫病或新生血管类疾病。

更进一步地，所述恶性肿瘤选自囊性脑肿瘤、神经胶质瘤、鼻咽癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢恶性肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、白血病或甲状腺癌。

进一步地，所述系统性自身免疫病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病或溃疡性结肠炎。

更进一步地，所述新生血管类疾病选自黄斑水肿、脉络膜新生血管性疾病、新生血管青光眼、视网膜静脉阻塞或视网膜新生血管性疾病。

有益效果：本发明在单抗体表面进行定点突变。选用IgG1的骨架，在可结晶片段Fc端进行半胱氨酸Cys突变，通过可结晶片段Fc端的突变点进行定向的化学偶联形成特定的抗体偶联物。本发明具有如下优点：

(1)本发明在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，通过对抗体表面进行定点突变，从而解决控制连接活性小分子的数目这个问题。通过控制突变基团的数目来控制连接活性小分子的数目，从而克服抗体-药物偶联物ADC上一个抗体连接的活性小分子数量不能保持一致的关键性技术障碍。

(2)经过半胱氨酸Cys替换改造的抗体骨架，除去重链可变区和轻链可变区的IgG1人抗体部分，维持了正常的抗体空间构象和可结晶片段Fc功能，用基因工程的方法构建不同的抗体以达到多种靶向和结合多种抗原的功能。

(3)经过突变的单抗体既保持了抗体的选择性和稳定性，又能搭载稳定数量的小分子、毒素或核素。通过替换新增半胱氨酸Cys位点的巯基与恰当的连接物结合后，可以与小分子毒素、化疗药物、放射性同位素、亲和配体连接，连接复合物应用于多种类型的抗肿瘤治疗和体外体内病理诊断等各个方面。

说明书附图

图1为Herceptin单克隆抗体的重链可变区DNA序列PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2为Herceptin单克隆抗体的轻链可变区DNA序列PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3为重链可变区和轻链可变区克隆结果PCR鉴定图；

图4为轻链可变区质粒抽提电泳图；

图5为重链可变区质粒抽提电泳图；

图6为Herceptin重链恒定区330位点突变后电泳图；

图7为Herceptin重链恒定区330位点突变后质粒抽提电泳图；

图8为重链恒定区330位点突变后表达的蛋白SDS-PAGE图；

图9为抗体结构简图；

图10为本发明的突变抗体搭载核素的策略示意图；

图11为本发明的突变抗体搭载小分子的策略示意图；

图12为本发明的突变抗体搭载毒素的策略示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。实施本发明，除具体实施例中所涉及的物料和精馏操作条件外，本领域技术人员还可以根据不同的分离目的对其进行等同或等效变换。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。

本发明的主要创新点在于：按照以下的标准进行突变设计(1)在不影响抗体结构的前提下对抗体氨基酸进行突变。(2)突变位点的设计不会引入疏水基团。(3)位于溶剂裸露区。(4)空间位阻大，不易形成二聚体。(5)对抗体的domain之间的相互作用无影响。(6)总体的Dstability降低。(7)不影响Fc的功能。

IgG1重链恒定区267位的Asn周围的残基为疏水性氨基酸，将Asn突变为Cys不仅可以提高其水溶性，而且减小疏水基团聚集区，增加了抗体的稳定性。同时IgG1重链恒定区267位的空间位阻较大不易形成二聚体，可以更加有效的与小分子进行偶联。

为了得到抗HER2抗体人源化结构，我们把抗体蛋白序列(氨基酸序列在下面已列出)载入到分子操作平台(MOE)的同源建模软件中。在蛋白质结构数据库中选用1HZH的晶体结构作为抗HER2抗体的建模模板。抗HER2抗体初始几何序列部分是从一个或多个1HZH链的区域模板中复制的。在抗HER2抗体和1HZH序列中保守的残基部分，所有重原子被复制到抗HER2抗体，否则仅复制骨架部分。模板链中可以形成二硫键的半胱氨酸与抗HER2抗体序列的半胱氨酸的位置相对应时，将二硫键复制到模型中。在确定了主干段和侧链构象的中间模型后，按照化合价的要求完成加氢原子，模型进行一系列的能量最小化设计以排除严重的空间位阻，最后对模型进行评分。然后将数据写入到输出数据库，并进行质量评估测量标记任何严重的几何问题。最终的模型为评分最佳的中间模型。同源建模阶段完成后，为了确认模型的立体化学与晶体结构典型值一致，使用MOE的蛋白质的几何立体化学质量检测工具来检验最终的抗HER2抗体模型。将抗HER2抗体和1HZH的模型结构叠加，两者的均方偏根差(RMSD)不大于则被视为好的模型。RMSD是两个结构之间匹配原子的距离的平方的均值的平方根。RMSD＝SQRT[{SUM(d_ii)²}/N]，dii是两个结构中相匹配原子的距离。N是两个结构的匹配的原子数。RMSD的值为0时则是相同的结构，值越大则二者的结构差异越大。RMSD值是评价二者结构变化的可靠指标。

下一步我们将设计抗HER2抗体模型结构表面的半胱氨酸的突变。改造恒定区以避免其干扰可变区与抗原的结合。抗体表面半胱氨酸的改造考虑到不同的标准。例如，从抗体域突变，突变点的裸露，氨基酸的取代等多方面考虑。开发高通量的筛选方法来确定适合半胱氨酸突变和偶联的位点。然而，还没有普遍的方法来预测抗体中半胱氨酸的突变能否稳定和高效的偶联，目前存在半胱氨酸突变点位于CL，CH1和CH3区域中。我们找到了一种新的半胱氨酸突变设计方法，通过这种方法开发了1个人源IgG1的半胱氨酸突变。为了避免专利冲突，我们仅专注于抗体的Fc区的改造而不是CH1。我们选择所有抗HER2抗体的Fc区裸露的残基作为半胱氨酸的突变目标。设计算法的第一步，通过完全切断突变位点的连接α与β碳的键来划分系统。分区后，形成一系列的与特定的残基不相交的原子集(侧链)。每个原子集连接一个或多个突变点和旋转异构体，这些旋转异构体从旋转异构体文库中读取。旋转异构体和突变体中骨架原子叠加到突变残基的骨架原子中。由于旋转异构体文库中不包含任何骨架原子，主干骨架中羰基氧的应变能加到侧链中。周边的残基被添加到空间构象的搜索中。在生成半胱氨酸突变体后，有利于对突变的结构进行能量最小化。如果结构有严重的冲突，在使用保守的方法之前先使用一种特别的改良的方法来修饰。这种改良的方法允许原子在突变的残基自由移动，移动范围控制相邻原子在以内，重量和偏差范围内，其他原子固定。严重结构冲突的改良方法包括应用和偏差到所有原子，同时禁用静电。应用范德华缩放因子从0.1增加到1进行多次能量最小化。HER2的Fc区域半胱氨酸的突变的精确模型同时考虑突变体空间结构改变以及野生型到半胱氨酸突变型之间稳定性的改变。突变体稳定性的变化通过测定突变型(Mut)和野生型(WT)折叠自由能的不同来衡量。我们预测稳定性(s)的差异变化是通过HER2抗体结构在折叠(f)和展开(u)状态下的野生型和突变型之间进行的。

ΔΔGs＝ΔGfMut-ΔGfWT＝ΔGsWT→Mut-ΔGsWT→Mut

使用上述公式，我们在线性相互作用能(LIE)的基础上创建模型。根据LIE，从野生型到突变型残基的环境相互作用能量的改变通过ΔG表示，相互作用的能量是在蛋白的能量与不含相关残基的蛋白能量之间的改变。设计的应用程序将所有的突变写到数据库中，在表1中描述。设计的应用程序自动对所有的野生型蛋白进行半胱氨酸突变同时计算稳定性的相对变化以及其它可预测性能。如表1所示，为突变设计输出数据。

表1

在表1中我们重点注意三列，一列是突变列(mutation)，一列是稳定性(stability)或稳定性变化(Dstability)列和最后一列是溶剂裸露区(solvent exposed surface area)。突变的定义如下面1:Y256C，1代表链数，Y代表野生型残基的单字母的名称，256代表残基的UID和插入代码，C代表突变成半胱氨酸单字母名称。稳定性列是突变体的绝对热稳定性。当生成一个聚集体，稳定性是聚集体的稳定性的玻耳兹曼的平均值。越负的值表示一个越稳定的突变。稳定性变化是从野生型蛋白到突变体的相对热稳定性。当生成一个聚集体，稳定性变化是聚集体的相对稳定性的玻耳兹曼的平均值。越负的值表示一个越稳定的突变。为了特定位点的偶联我们在CH3区域设计了1个IgG1的半胱氨酸的突变。我们的想法是将分布在抗体表面Fc区域里的氨基酸突变。我们倾向替代裸露在抗体表面的极性氨基酸(丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸)和带电氨基酸(赖氨酸，谷氨酸)，替代极性氨基酸，半胱氨酸不会造成抗体表面电荷的巨大变化和蛋白结构的变化。IgG1重链恒定区267位的Asn周围的残基为疏水性氨基酸，将Asn突变为Cys不仅可以提高其水溶性，而且增大了空间位阻不易形成二聚体，可以更加有效的与小分子进行偶联。

实施例2

以抗HER2单克隆抗体Herceptin为例对该抗体进行重链恒定区CH3氨基酸位点突变

(1)Herceptin单克隆抗体的轻、重链可变区的合成

采用PCR方法，分别以Herceptin单克隆抗体的轻链可变区、重链可变区DNA序列为模板合成Herceptin单克隆抗体的轻链可变区DNA和重链可变区DNA。

合成轻、重链可变区的引物：

Herceptin重链上游引物：accagggtgctgagcgaggtgcagctggtggagagcgg

Herceptin重链下游引物：gcccttggtgctagcgctgctcacggtcaccagggtg

Herceptin轻链上游引物：ataatgagtaggggagacatccagatgacccagag

Herceptin轻链下游引物：gtgcagccaccgtacgcttgatctccaccttggtgc

PCR反应体系

PCR反应条件

预变性，95℃，3分钟，1个循环

变性，95℃，1分钟

退火，56℃，0.5分钟 30个循环

延伸，72℃ 1.5分钟

最后延伸，72℃，10分钟

PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，如图1和图2，确认Herceptin单克隆抗体的重链可变区DNA序列PCR产物琼脂糖凝胶电泳图和Herceptin单克隆抗体的轻链可变区DNA序列PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

(2)轻、重链可变区克隆至表达载体

采用Seamless Cloning and Assembly(lifetechnologies Cat#A13288)无缝克隆上述Herceptin单克隆抗体的轻、重链可变区的PCR产物到表达载体，轻、重链可变区的反应体系一致。体系中的插入片段分别是Herceptin单克隆抗体的轻链可变区的PCR产物和Herceptin单克隆抗体的重链可变区的PCR产物。

将上述反应体系混合，室温孵育30分钟，然后将混合物置于冰上立即进行下一步纯化操作。

如图3所示，为重链可变区和轻链可变区克隆图；PCR鉴定通过PCR方法确定载体是否与轻、重链可变区正确连接，然后将相应的质粒转化至DH5α感受态细胞中，37℃，200rpm培养16小时，常规质粒柱抽提方法进行质粒抽提。如图4所示，为轻链可变区质粒抽提电泳图。如图5所示，为重链可变区质粒抽提电泳图。

(3)重链恒定区的位点突变

采用PCR方法对连接在表达载体的重链恒定区267位点的Asn突变为Cys。

突变引物：

上游引物:cgtggagtgggagagctgtgggcagccg

下游引物:cagctctcccactccacggcgatgtcgc

PCR反应体系

PCR反应条件

预变性，95℃，3分钟，1个循环

变性，95℃，1分钟

退火，62℃，0.5分钟 30个循环

延伸，72℃，1.5分钟

最后延伸，72℃，10分钟

DpnI酶切PCR产物去除模板，10ul酶切产物加入到50ul DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养，每个平皿得到50个克隆。挑取单菌落扩大培养，抽提质粒。如图6所示，为Herceptin重链恒定区267位点突变后电泳图；如图7所示，为Herceptin重链恒定区267位点突变后质粒抽提电泳图；

实施例3

转染及抗体表达纯化

采用过柱法纯化Herceptin可变区轻、重链质粒和突变的重链恒定区质粒。将合成并纯化好的Herceptin可变区轻、重链质粒和突变的重链恒定区质粒及轻链恒定区质粒转染至哺乳动物细胞中表达。

在8L灭菌的细胞培养瓶中接入3L的0.5×10⁶cells/mL的HEK293细胞，37℃150转/分钟培养至活细胞浓度达到1.5-2.0×10⁶cells/mL，加入4.5L无血清的化学成分确定的培养基稀释细胞培养液。

每10⁶细胞中加入2ul Freestyle Max transfection reagent(Invitrogen)，每10⁶细胞中加入1ug的DNA。按照Invitrogen的说明书进行转染混合液的配制。转染24小时后以5：100的比例加入Feed X(ACRO)至培养液中，在转染24小时后和96小时后加入葡萄糖和谷氨酰胺溶液。163小时后细胞培养液大约达到8.4L。

向培养液中加入1mM的PMSF灭活蛋白酶，在4℃离心机中3500rpm离心45分钟以分离细胞和杂质，通过0.6/0.2micron ULTA HC Capsules(GE Healthcare Life Sciences)过滤后获得上清进行层析纯化。HEK293细胞的上清载入MabSelect Sure层析柱(GE Healthcare LifeSciences)，洗脱峰合并浓缩、采用Viva-spin 20ml，10k MWCO超滤、0.2um滤膜无菌过滤得到无菌的蛋白原液。如图8所示，为重链恒定区267位点突变后表达的蛋白SDS-PAGE图。

实施例4

通过ELISA方法在体外检测突变前后抗体结合抗原HER2的效应

为确定突变的抗体与HER2结合的特异性，针对HER2和对照蛋白进行了ELISA。用包被缓冲液将HER2蛋白稀释至1～10μg/ml，每孔加100ul，4℃过夜进行包被。次日洗涤3次。分别在相应的已包被的反应孔中加一定稀释的Herceptin样品及突变抗体0.1ml，置37℃孵育1小时，洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD450值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD450值，若大于规定的阴性对照OD450值的2.1倍，即为阳性。表2为ELISA检测重链恒定区267位点突变前后抗体活性变化。

表2

由表2可知，抗体的重链恒定区267位点的氨基酸突变不会对抗体的活性造成影响。

实施例5

突变抗体与核素偶联方法

对核素的选择方面，主要通过对半衰期、精确度和代谢途径等方面的综合评估。Zr⁸⁹的半衰期约为3.3天与抗体在体内的半衰期接近，I¹²⁴的半衰期约为4.2天与Zr⁸⁹相近。但是I¹²⁴(β⁺max.1.5和2.1MeV)的正电子衰变灵敏度比较低。而Zr⁸⁹(β⁺max.902keV)的正电子衰变具有很高的灵敏度，可以与F¹⁸和C¹¹相媲美。I¹²⁴在代谢过程中通过蛋白水解作用，很快的经过酶催化反应去碘，被细胞代谢掉，PET技术不能准确的表现出抗体的作用。而在Zr⁸⁹-mAbs的代谢过程中，通过细胞内在化作用，Zr⁸⁹-mAbs进入细胞内溶酶体中，进一步加强了抗体的PET成像作用。本发明中用射正电子的标记物Zr⁸⁹标记抗体，通过电子发射断层照相技术(PET)对肿瘤进行诊断以及对个体化用药提供指导。

通过螯合剂络合的方式可以把Zr⁸⁹标记到抗体表面。螯合作用是具有两个或两个以上配位原子的多齿配体与同一个金属离子形成螯合环的化学反应。具有多齿配体的化合物称为螯合剂。螯合剂中配位原子的数目除了二齿、三齿外，还有四齿、五齿、六齿等。金属离子和螯合配体生成的螯合物，比它和单齿配体生成的类似配合物有较高的稳定性。这是由于要同时断开螯合剂配位于金属上的两个键是困难的，如果已断开了一个键，则在第二个键未断开以前，它又可重新成键。

在螯合剂的选择方面，我们主要从螯合力、螯合剂稳定性以及水溶性等方面评估。多齿螯合剂可以为我们提供稳定的Zr⁸⁹螯合产物。主要常用的螯合剂有二乙撑三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)以及去铁敏B(desferrioxamine B，简称Df)等。我们采用与Zr络合比较强的去铁敏B(Df)。去铁敏B(Df)是双功能螯合剂，在螯合的同时还保持着反应活性位点，可以用于与抗体的偶联反应之中。

在抗体核素偶联物的linker设计方面，抗体表面有40个Lys和8个双链结合的Cys可以偶联，偶联的产物是不同位点以及不同linker和抗体比例的混合物。我们对抗体表面进行定点Cys突变，通过抗体表面自由的巯基链接核素可以产生位点单一，比例精准的偶联产物。抗体核素偶联物的linker的稳定性是至关重要的。因此在linker方面选择非解离的硫醚链接，最大程度上保证linker的稳定性。在确保linker稳定性的同时，linker的水溶性也将影响到最终抗体核素偶联物的作用。避免过多的引入疏水基团，可以有效地提高抗体核素偶联物的水溶性，降低疏水基团聚集而引起的沉降的可能性。

如图9至图12所示，本发明是从细胞株表达出来的抗体，其表面突变的Cys上的巯基被其他附着物所占据。通过还原-氧化的方法可以剔除附着物，使巯基自由出来，为后面的偶联做准备，通过连接物与一种螯合剂去铁敏desferrioxamine，简称Df相连接，达到与放射性核素的螯合。放射免疫显影是用放射性核素标记抗体、激素等生物制品作为亲肿瘤药物的阳性显像剂，借助于抗原与抗体，配基与受体的作用，达到定位诊断肿瘤的目的。从而生产出来的抗体可以用于个体化医疗分子成像诊断。通过与In¹¹¹，Tc^99m或I¹³¹标记可用于平面扫描或单光子发射计算机断层照相技术SPECT。通过发射正电子的标记物，例如Zr⁸⁹可用于正电子发射断层照相技术PET。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C，其特征在于：包括

(a)重链恒定区，包括重链恒定区CH1的氨基酸序列、重链恒定区CH2的氨基酸序列和通过突变改造过得到的重链恒定区CH3的氨基酸序列；所述重链恒定区CH1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述重链恒定区CH2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述重链恒定区CH3的氨基酸序列是SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；

(b)重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(c)轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(d)轻链恒定区，所述轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

2.制备权利要求1所述的用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C的方法。

3.权利要求1的用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C的搭载小分子、毒素或核素的方法。

4.一种分离的核酸，包括编码权利要求1或2中所述的重链恒定区的核苷酸序列、重链可变区的核苷酸序列、轻链恒定区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列；

所述重链恒定区的核苷酸序列包括所述重链恒定区CH1的核苷酸序列、重链恒定区CH2的核苷酸序列和重链恒定区CH3的核苷酸序列；

所述重链恒定区CH1的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述重链恒定区CH2的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述重链恒定区CH3的核苷酸序列是SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；

所述重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述轻链恒定区的核苷酸序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

5.权利要求1用于治疗和诊断工具以检测表达腱生蛋白的疾病的用途。

6.权利要求5所述的用途，其中所述疾病为恶性肿瘤或系统性自身免疫病或新生血管类疾病。

7.权利要求6所述的用途，其中所述恶性肿瘤选自囊性脑肿瘤、神经胶质瘤、鼻咽癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢恶性肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、白血病或甲状腺癌。

8.权利要求6所述的用途，其中所述系统性自身免疫病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病或溃疡性结肠炎。

9.权利要求6所述的用途，其中所述新生血管类疾病选自黄斑水肿、脉络膜新生血管性疾病、新生血管青光眼、视网膜静脉阻塞或视网膜新生血管性疾病。