TW202003556A - 改性抗體及放射性金屬標示抗體 - Google Patents

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波多野正
伊東祐二
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Abstract

本發明係有關於不減低抗體功能、投與病人後在肝臟容易代謝、在肝臟等臟器的放射性核種的蓄積減低的標示技術，提供G型免疫球蛋白抗體《IgG抗體》和含有結合該抗體的G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》的改性抗體。IgG結合胜肽，含有GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH《化學式中，Xaa1係離氨酸殘基（lysine residue）、半胱氨酸殘基（cysteine residue）、天冬氨酸殘基（aspartic acid residue）、谷氨酸殘基（glutamic acid residue）、2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid）、或二氨基丙酸（diaminopropionic acid）》 等的13〜17個胺基酸殘基所做成的胺基酸序列，IgG結合胜肽的N末端，以改性鍵結物為介質，在其離氨酸殘基的位點上，下述化學式(II-1)所表示之化合物連結而成。

Description

改性抗體及放射性金屬標示抗體
本發明係有關於G型免疫球蛋白抗體（IgG antibody；Immunoglobulin G antibody）的改性（modified）及放射性金屬標示（radioactive metal label）。 【技術背景】
由於抗體對其標靶分子的特異性，在各種研究、開發中，被應用於標靶分子的檢測，於醫療領域中，藉由將在癌等患病位置處特異性結合的抗體，用放射性核種（nuclear species）標示，投與至體內，利用單光子發射電腦斷層掃描（single photon emission computed tomography；SPECT）或正子斷層掃描（positron emission tomography；PET），可以進行診斷；又，用放射性核種標示的抗體，作為疾病治療的藥品也受到矚目。
用放射性核種標示抗體的方法，使用的方法有：將抗體與螯合化合物（chelate compound）結合，使該螯合化合物負載有放射性金屬元素的方法《專利文獻1》；相關的螯合化合物的結合，到目前為止，主要是以包含在抗體中的離胺酸（lysine）的氨基或半胱胺酸（cysteine）的硫醇基（thiol group）、和活化的羧基（activated carboxyl group）為介質而進行，但是即使功能基是特異性，由於部位並非特異性，就產生抗體的抗原結合位置的改性等導致抗體的活性降低的問題，或是難以控制結合的化合物的數目等問題。
為了克服像這樣的問題，使用以部位特異性方式引入特定功能基團的抗體，實行抗體的改性。舉例來說，將非天然胺基酸（non-natural amino acid）《非專利文獻2〜4》或游離半胱氨酸（free cysteine）《非專利文獻5〜6》，藉由基因工程（genetic engineering）的改變，導入特定的部位，使在特定部位的改性變為可能；像這樣的部位特異性的抗體改性技術已持續開發，但多數情形，必須在抗體工程（antibody engineering）上的改變抗體本身，考慮到伴隨該改變的抗體機能降低或高開發成本，不一定能說是有利的方法。
此處，作為能夠特異性且簡便地改性抗體的方法，有人提出：在G型免疫球蛋白《IgG》抗體的結晶區段結構域（fragment-crystllizable domain；Fc domain）的特定部位具有結合性的G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》處，連接配體（ligand），使該IgG結合胜肽結合於抗體，藉此就不需要改變抗體分子的序列，因此，伴隨抗體分子的基因改變不會招來功能降低，可以依照放射性金屬核種標示G型免疫球蛋白的方法《專利文獻1和2》。
另一方面，依照放射性金屬核種所標示的低分子多胜肽，投與至生體之際，為了觀察從投與初期經過長時間在腎臟的放射活性，放射性金屬標示抗體投與至生體之際，雖然有腎臟的放射線曝露（exposure）和腎臟損傷之虞，但藉由使用特定的低分子多胜肽，使非特異的腎蓄積減低的放射性標示化合物也有人提出《專利文獻3和4、非專利文獻7和8》。
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2017／217347小冊（pamphlet） [專利文獻2]國際公開第WO2016／186206小冊（pamphlet） [專利文獻3]國際公開第WO2013／081091小冊（pamphlet） [專利文獻4]國際公開第2017／150549小冊（pamphlet） [非專利文獻]
[非專利文獻1]Rodwell, J. D. 等人， Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1986, 83, 頁2632-2636 [非專利文獻2]Axup, J. Y. 等人， Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109, 頁16101-16106 [非專利文獻3]Tian, F. 等人， Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111, 頁1766-1771 [非專利文獻4]Zimmerman, E. S. 等人， Bioconjugate chemistry, 2014, 25, 頁351-361 [非專利文獻5]Shen, B. Q. 等人， Nature biotechnology, 2012, 30, 頁184-189 [非專利文獻6]Bernardes, G. J. 等人，Nature protocols, 2013, 8, 頁2079-2089 [非專利文獻7]Arano, Yasushi, 等人， "Chemical design of radiolabeled antibody fragments for low renal radioactivity levels." Cancer research59.1 (1999)：128-134. [非專利文獻8]Uehara, Tomoya, e等人 "Design, synthesis, and evaluation of [188Re] organorhenium-labeled antibody fragments with renal enzyme-cleavable linkage for low renal radioactivity levels." Bioconjugate chemistry 18.1 (2007)：190-198.
但是，一直以來，放射性金屬標示抗體投與至生體內之際，被認為在肝臟或脾臟等的網狀內皮系統（reticuloendothelial system）發達的臟器有高的蓄積，也令人擔憂對病人的正常臟器也給予不需要的曝露。在專利文獻3和4的技術中，腎臟蓄積雖已降低，但也憂慮靠著結合抗原結合區段（fragment, antigen binding）的抗體的功能減低。
本發明有鑑於前述資訊，決定提供：不會使抗體功能減低、投與病人後在肝臟容易代謝、可以降低在肝臟等臟器的放射性核種的蓄積的標示技術。
本發明的一個樣態，係包含G型免疫球蛋白抗體、和結合了前述G型免疫球蛋白抗體的G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》的改性抗體（modified antibody）。前述IgG結合胜肽，含有下列化學式(I)所表示、含有13〜17個胺基酸殘基（amino acid residue）所形成之胺基酸序列（amino acid sequence），前述IgG結合胜肽的N末端處，以鍵結物為介質，於其離胺酸（lysine）殘基的單點上連結下列化學式(II-1)所表示之化合物而成，提供改性抗體。
(X1-3 )-C-(X2 )-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3 )　　(I) 《化學式(I)中， X係各自獨立、半胱氨酸（cysteine）以外的任意胺基酸殘基（amino acid residue）， C係半胱氨酸殘基（cysteine residue）， H係組胺酸殘基（histidine residue）， Xaa1係離氨酸殘基（lysine residue）、半胱氨酸殘基（cysteine residue）、天冬氨酸殘基（aspartic acid residue）、谷氨酸殘基（glutamic acid residue）、2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid residue）、或二氨基丙酸（diaminopropionic acid）， G係甘氨酸殘基（glycine residue）， Xaa2係谷氨酸殘基（glutamic acid residue）、谷氨醯胺殘基（glutamine residue）、或天冬醯胺殘基（asparagine residue）， L係白胺酸殘基（leucine residue）， V係纈胺酸殘基（valine residue），且 W係色胺酸殘基（tryptophan residue）， 兩個半胱氨酸殘基可以相互以雙硫鍵（disulfide bond）結合或以鍵結物（linker）為介質結合，C末端也可以醯胺化（amidation）》。
Figure 02_image003
化學式(II-1)中，n係0或1。
本發明的其他樣態，係提供放射性金屬配位之前述改性抗體所作成之放射性金屬標示抗體、以及含有該抗體的放射性藥品。
本發明的其他樣態，係提供：含有下列化學式(I)所表示、13〜17個胺基酸殘基（amino acid residue）所形成之胺基酸序列（amino acid sequence）的IgG結合胜肽，和結合於前述IgG結合胜肽的N末端、含有下列化學式(III)所表示的改性鍵結物、的改性IgG結合胜肽、以及結合了該改性IgG結合胜肽的G型免疫球蛋白抗體《IgG抗體》。
L1 -L2 -L3 (III) 化學式(III)中， L1 ，係前述G型免疫球蛋白結合胜肽的N末端處結合的聚乙二醇鍵結物（polyethylene glycol linker）， L2 ，係0以上5以下的胺基酸殘基所形成之胺基酸序列， L3 ，係末端具有二苯環辛基（dibenzocyclooctyl；DBCO）的化學基。
依據此改性IgG結合胜肽、和結合了該改性IgG結合胜肽的G型免疫球蛋白抗體《IgG抗體》，藉由準備好具備了能與二苯環辛基發生點擊反應（click reaction）而結合的疊氮基（azido group）的配體（ligand），該配體藉由點擊反應，可以連結改性IgG結合胜肽或IgG抗體。
又，本發明的其他樣態，係提供下列化學式(II)所表示的化合物、或其鹽類。
Figure 02_image005
化學式(II)中，n係0或1；R1 和R2 ，兩者為氫原子、或者一者為氫原子、另一者為CO(CH2 )ｍ N3 〔m係1〜10的整數〕所表示的化學基，或者兩者和氮原子一起形成馬來亞醯胺基（maleimide）或異硫氰酸基（isothiocyanate group）。
前述化學式(II)的化合物，以位在離氨酸（lysine）側鏈末端的NR1 R2 所表示的化學基為介質，可以和IgG抗體、IgG結合胜肽等的蛋白質的功能基結合，因此，可以應用在含有IgG抗體的各種標靶分子的放射性金屬標示。從而，本發明的其他樣態，係提供：使結合標靶分子的多胜肽能結合於前述化學式(II)的化合物的化合物、或其鹽類。
依據本發明，由於抗體的結晶區段（fragment-crystllizable；Fc）範圍具備含有苯丙氨酸（phenylalanine）殘基和離氨酸殘基的排泄促進鍵結物，藉由在肝臟代謝，使放射性金屬從體內的排泄被促進，得到生體內動力學（in vivo kinetics）極優的放射性金屬標示抗體。
＜改性G型免疫球蛋白結合胜肽《改性IgG結合胜肽》＞ 本發明的一個樣態中，改性G型免疫球蛋白結合胜肽，係前述化學式(I)所表示、含有13〜17個胺基酸殘基（amino acid residue）所形成之IgG結合胜肽，且該IgG結合胜肽的N末端處，用前述化學式(III)所表示的二苯環辛基（dibenzocyclooctyl；DBCO）鍵結物加以改性，所做成的改性G型免疫球蛋白結合胜肽。
化學式(I)的IgG結合胜肽，只要是結合在G型免疫球蛋白《IgG》者即可，別的限制，但是WO2017／217347所記載之物是較合於理想的。
關於本發明中所使用的IgG結合胜肽，將於下詳細說明。 本說明書中使用的『G型免疫球蛋白《IgG》』，係指哺乳動物，例如人和黑猩猩（chimpanzee）等的靈長類、大鼠（rat）、小鼠（mouse）、和兔子（rabbit）等的實驗動物、豬（pigs）、牛（cows）、馬（horses）、綿羊（sheep）和山羊（goats）等的家畜動物、還有犬和貓等的寵物動物的IgG，較合於理想的是人的IgG《IgG1、IgG2、IgG3或IgG4》。本說明書中的IgG，更合於理想的是人的IgG1、IgG2、或IgG4，或者是兔子的IgG；特別合於理想的是人的IgG1、IgG2、或IgG4。
本發明中使用的IgG結合胜肽，係前述化學式(I)所表示、含有13〜17個胺基酸殘基（amino acid residue）所做成的氨基酸序列、且可以和人的IgG結合。
前述化學式(I)中，N末端或C末端的X1-3 表示法，意味半胱氨酸（cysteine）《C或Cys》以外的獨立的任意胺基酸殘基（amino acid residue）X，連續1〜3個；構成此者的胺基酸殘基雖然可以是相同的或相異的殘基，但較理想的是3個不相同的殘基的序列所做成。同樣地，X2 也意味半胱氨酸《C或Cys》以外的獨立的任意胺基酸殘基X，連續2個；構成此者的胺基酸殘基雖然可以是相同的或相異的殘基，但較理想的是該2個連續的胺基酸殘基係不相同的殘基的序列所做成。
化學式(I)中的2個半胱氨酸殘基可以雙硫連結（disulfide linkage）形成環狀。通常，化學式(I)的IgG結合胜肽中，《Xaa1是半胱氨酸殘基的情形時，則不是Xaa1》外側的2個半胱氨酸殘基係雙硫連結。或者，化學式(I)的胜肽中，外側的2個半胱氨酸殘基中的硫化物基（sulfide group），也可以藉由以下化學式：
Figure 02_image007
所表示的鍵結物連結起來，前述化學式中的虛線部分意味與硫化物基結合的部分。該鍵結物，比通常的雙硫連結，對於還原反應等是較為安定。因此，該鍵結物，例如使鋯元素（zirconium）等的雙硫連結不安定而得到之放射性金屬核種，在使用之際，可以合於理想地使用。
前述化學式(I)的IgG結合胜肽的氨基酸序列中，如果是做成17個胺基酸殘基的情形時，N末端開始的第1個和第2個以及第16個和第17個的氨基酸殘基X也可以脫失（deletion），像這樣的胜肽由13個胺基酸長度做成。
本說明書中使用的『做成17個胺基酸殘基的情形時』，意指用胺基酸號碼稱呼胜肽的氨基酸殘基之時，關於化學式(I)的IgG結合胜肽，最長的氨基酸長度的17殘基的N末端開始，按順序從第1個到第17個，係用了編號來方便表達的用語。
還有，前述化學式(I)的胜肽的氨基酸序列的半胱氨酸《C》以外的氨基酸殘基，亦即，做成17個胺基酸殘基的情形時的N末端開始，第1〜3、5、6、15〜17的各胺基酸殘基，選自以下者是合於理想的。此處，各大寫字母，係胺基酸的單文字表示法： 第1個胺基酸殘基＝S、G、F、R、或、無 第2個胺基酸殘基＝D、G、A、S、P、同半胱氨酸（homocysteine）、或、無 第3個胺基酸殘基＝S、D、T、N、E、或、R 第5個胺基酸殘基＝A、或、T 第6個胺基酸殘基＝Y、或、W 第15個胺基酸殘基＝S、T、或、D 第16個胺基酸殘基＝H、G、Y、T、N、D、F、同半胱氨酸（homocysteine）、或、無 第17個胺基酸殘基＝Y、F、H、M、或、無
化學式(I)的IgG結合胜肽的理想具體實例，可列舉使用： 1）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（序列號碼1）、 2）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（序列號碼2）、 13）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（序列號碼3）、和 14）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（序列號碼4） 特別合於理想的實例，可列舉2）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（序列號碼2）《化學式中， Xaa1係離氨酸殘基、Xaa2係同半胱氨酸，較理想的是半胱氨酸及／或同半胱氨酸相互形成雙硫連結》。
如同前述，本發明相關之前述化學式(I)的IgG結合胜肽，各胺基酸序列之中至少具有兩個間隔開來的半胱氨酸《C》殘基，該半胱氨酸《C》殘基間可以形成雙硫連結地配置了半胱氨酸殘基，以此為特徵；較合於理想的胜肽，2個半胱氨酸殘基以雙硫連結、形成環狀胜肽，各半胱氨酸殘基的N末端側和C末端側，也可以具有1〜3個半胱氨酸（cysteine）以外的任意胺基酸殘基；各半胱氨酸殘基的N末端側和C末端側具有1〜3個胺基酸殘基的情形時，做成17個胺基酸殘基的情形的N末端開始第1〜2、第16〜17的各胺基酸殘基，係前述之各個例示。
如同前述，本發明所使用的IgG結合胜肽中，Xaa1係離氨酸殘基、半胱氨酸殘基、天冬氨酸殘基（aspartic acid residue）、和谷氨酸殘基（glutamic acid residue）等的蛋白質組成氨基酸、以及二氨基丙酸（diaminopropionic acid）、和2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid residue）等的非蛋白質組成氨基酸，較合於理想的是離氨酸殘基。Xaa1藉由後述的交聯劑（crosslinking agent）可以改性，這是較為理想的。本說明書中所謂『非蛋白質組成氨基酸』，係指在生體內不會用於組成蛋白質的氨基酸。本發明中所使用的IgG結合胜肽，為了提高藉由交聯劑改性之際的部位特異性，本發明中所使用的IgG結合胜肽，其序列中，與Xaa1相同的殘基，全部都沒有、或幾乎沒有《例如，只有1個或2個》，是較合於理想的。舉例來說，Xaa1是離氨酸殘基的情形時，本發明中所使用的IgG結合胜肽，其序列中Xaa1以外的地方，完全沒有、或幾乎沒有離氨酸殘基，是較理想的。
本發明中所使用的IgG結合胜肽，與人G型免疫球蛋白《IgG》的結合親和力，和其他的人免疫球蛋白《IgA、IgE、IgM》比較，約10倍以上，較合於理想的是約50倍以上，更理想的是約200倍以上之高。本發明中所使用的IgG結合胜肽與人G型免疫球蛋白《IgG》的結合的相關離解常數《Kd》（dissociation constant），藉由表面電漿共振（surface plasmon resonance；SPR）頻譜分析（spectrum analysis）《例如，使用生物分子相互作用分析系统（BIACORE system；Biophysical Interaction Analysis system）》，可以決定，舉例來說，1×10-1 M～1×10-3 莫耳（M）以下、較理想的是1×10-4 莫耳（M）以下、更理想的是1×10-5 莫耳（M）以下。
本發明中所使用的IgG結合胜肽，係結合在IgG抗體的結晶區段結構域（fragment-crystllizable domain；Fc domain）。本發明中所使用的IgG結合胜肽，如同WO2017／217347的實施例所示一般，前述Xaa1中，IgG結晶區段《IgG Fc》的特定區域，亦即，人IgG結晶區段中依照歐盟編號（Eu numbering）為Lys248殘基（Lys248 residue）《以下，於本說明書也單獨表記為『Lys248』，相當人IgG CH2 〔序列號碼5〕的第18個殘基》、或Lys246殘基（Lys246 residue）《以下，於本說明書也單獨表記為『Lys246』，相當人IgG CH2 〔序列號碼5〕的第16個殘基》，較理想的是靠近Lys248。
本發明中所使用的IgG結合胜肽，可以藉由WO2017／217347所記載的方法而得到，具體來說，常用的液相合成法（liquid phase synthesis）、固相合成法（solid phase synthesis）等的胜肽合成法；藉由靠自動胜肽合成機的胜肽合成等《Kelley 等人， Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990) 卷12，頁1-19；Stewart 等人，Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.；Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 頁5132；「新生化學實驗講座１ 蛋白質IV」（1992）日本生化學會編，東京化學同人》，可以製造出來。 或者，本發明中所使用的IgG結合胜肽，藉由使用核酸編碼（nucleic acid encoding）的基因重組方法（genetic recombination method）和噬菌體展示方法（phage display method）等，也可以製造胜肽。舉例來說，將本發明中所使用的IgG結合胜肽的編碼氨基酸序列的DNA併入表達載運體（expression vector）中，導入宿主細胞中，經過培養，可以製造目標的胜肽。製造出來的胜肽，使用一般的方法，例如，經由凝膠過濾層析法（gel filtration chromatography）、離子交換管柱層析法（ion exchange column chromatography）、親和層析法（affinity chromatography）、反相柱層析法（reverse phase column chromatography）、高效液相層析法（high performance liquid chromatography ；HPLC）等層析法、硫酸銨分餾法（ammonium sulfate fractionation）、超過濾法（ultrafiltration）、和免疫吸附法（immune adsorption）等，可以回收或精製。
胜肽合成，例如，各胺基酸《不問是天然的或非天然的》、準備預備結合的α-氨基和α-羧基（α-carboxyl）以外的功能基已被保護的胺基酸類，在各個胺基酸的α-氨基和α-羧基之間進行胜肽鍵形成反應（peptide bond formation reaction）；通常，位在胜肽的C末端的的氨基酸殘基的羧基，以間隔物（spacer）或鍵結物（linker）為介質，結合到固相，像這樣所得到的胜肽的氨基末端的保護基，選擇性地除去，與下一個胺基酸的α-羧基之間形成胜肽鍵（peptide bond）；連續實行像這樣的操作，製造側基（side group）被保護的胜肽，最後，除去全部的保護基，從固相分離。保護基的種類或保護方法、胜肽結合法的詳細內容，前述文獻中已有詳細記載。
經由基因重組法（gene recombination method）的製造，例如，包含：將編碼本發明胜肽的脱氧核醣核酸（deoxyribonucleic acid）《DNA》插入適當的表達載運體（expression vector）中，將表達載運體導入適當的宿主細胞內，培養細胞，從細胞內或細胞外液收回目標胜肽的方法，就可以得到。表達載運體，並無限制，例如，是質體（plasmid）、噬菌體（phage）、黏質體（cosmid）、噬菌粒（phagemid）、和病毒（virus）等的表達載運體。 作為質體載運體（plasmid vector），雖然沒有限定，但可列舉使用的有：來自大腸桿菌（Escherichia coli）的質體《例如：pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等》、來自枯草桿菌（Bacillus subtilis）的質體《例如：pUB110、pTP5等》、和來自酵母（yeast）的質體《例如：YEp13、YCp50等》。作為噬菌體載運體（phage vector）雖然沒有限定，但可列舉使用的有：T7噬菌體展示載運體（T7 phage display vector）《T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等〔Novagen公司〕》、和λ噬菌體載運體（lambda phage vector）《Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等》。 作為病毒載運體（virus vector），雖然沒有限定，例如：反轉錄病毒（retrovirus ）、腺病毒（adenovirus）、腺相關病毒（adeno-associated virus）、痘苗病毒（vaccinia virus）、和仙台病毒（Sendai virus）等的動物病毒，和桿狀病毒（baculovirus）等的昆蟲病毒等，可列舉使用。作為黏質體載運體（cosmid vector），雖然沒有限定，但可列舉使用的有：Lorist 6、Charomid9-20、和Charomid9-42等。作為噬菌粒載運體（phagemid vector），雖然沒有限定，例如：pSKAN、pBluescript、pBK、和pComb3H等係已知的。 在載運體（phagemid vector），可以包含：能夠表達目標DNA的調控序列（regulatory sequence）、或用來篩選含有目標DNA的載運體的篩選標記（selectable marker），用來插入目標DNA的多克隆位點（multicloning site）。像這樣的調控序列中，包含啟動子（promoter）、增強子（enhancer）、終止子（terminator）、夏因-達爾加諾序列《S-D序列》（Shine‐Dalgarno sequence；S-D sequence）或核糖體結合位點（ribosome binding site）、複製起點（replication origin）、和多腺苷酸化位點（polyadenylation site；polyA site）等。又，在篩選標記（selectable marker），可以包含例如：氨芐青黴素抗性基因（Ampicillin resistance gene）、新黴素抗性基因（neomycin resistance gene）、卡那黴素抗性基因（kanamycin resistance gene）、和二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolate reductase gene）等。 用來導入載運體的宿主細胞，係大腸桿菌或估草桿菌等的細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞《例如，哺乳類動物細胞》、和植物細胞等，這些細胞的轉化（transformation）或轉染（transfection），例如，包含磷酸鈣共沉澱法（Calcium phosphate coprecipitation）、電脈衝穿孔法（electroporation method）、脂質轉染法（lipofection method）、基因槍法（particle gun method）、和聚乙二醇法《PEG法》（polyethylene glycol method）等。 轉化細胞的培養，依照用於培養宿主生物的通常方法實施，舉例來說，大腸桿菌或酵母細胞等的微生物培養液，含有可被宿主微生物同化（assimilate）的碳源、氮源和無機鹽。因為本發明所使用的IgG結合胜肽的回收很容易實行，藉由表達而生成的胜肽使其分泌至細胞外是較理想的，此係從該細胞能夠胜肽分泌的胜肽序列的DNA做編碼、結合在編碼為目標胜肽的DNA的5’末端側，就可以進行。轉移至細胞膜的融合胜肽（fusion peptide）藉著訊息肽酶（signal peptidase）被切斷，目標胜肽被分泌釋出至培養基中；或者，細胞內蓄積的目標胜肽也可以回收，此種情形，細胞被物理的或化學的破壞，利用蛋白質精製技術，回收目標胜肽。
因此，本發明又進一步，係有關於編碼本發明所使用的胜肽的核酸（nucleic acid）。此處，核酸包含去氧核糖核酸《DNA（deoxyribonucleic acid）》或核糖核酸《RNA（ribonucleic acid）》《例如，傳訊核糖核酸（mRNA；messenger RNA）》。
使本發明所用的IgG結合胜肽與其他蛋白質融合的情形時，可以將IgG結合胜肽和其他蛋白質分別調製以後，因應需求使用鍵結物，使IgG結合胜肽與其他蛋白質融合；也可以藉由基因重組法，因應需求，加入適當的鍵結物，製作成融合蛋白質，這種情形，理想的狀態是本發明的IgG結合胜肽製作成無損與G型免疫球蛋白《IgG》的結合性的融合蛋白質。
本發明所用前述IgG結合胜肽，較合於理想的是靠著交聯劑來改性。如同前述，本發明所用IgG結合胜肽，如同後述實施例中所示，前述Xaa1中，G型免疫球蛋白結晶區段《IgG Fc》的特定範圍、亦即人的G型免疫球蛋白結晶區段中依照歐盟編號的Lys248或Lys246，較合於理想的是接近Lys248。因此，本發明所用IgG結合胜肽的Xaa1用交聯劑改性，藉著與IgG發生交聯反應，IgG結合胜肽的Xaa1和G型免疫球蛋白結晶區段《IgG Fc》的Lys248或Lys246、較理想的是Lys248、之間，可以形成位點特異性的交聯結構。如上所述，本發明所用IgG結合胜肽的Xaa1用交聯劑和各種化合物做改性，藉著與IgG發生交聯反應，各種化合物，可以特異性地且簡單地導入IgG內。 又，依據本發明，因為以IgG結合胜肽為介質可以導入前述化學式(I)的化合物或其他化合物中，因次可以將各種構造的化合物導入IgG。再者，本發明，所得到的產物的產量高，由於抗體本身沒有被改變，存在的優點是抗體功能減低的可能性很低。
本發明所用IgG結合胜肽，也可以使用人以外的動物，較理想的是使用哺乳動物的IgG，於此情形，本發明所用IgG結合胜肽，結合的IgG中的部位，只要是閱讀本說明書的本領域技術人員的話，例如，藉由排比（alignment）人的IgG序列和其他動物的IgG序列，就可以輕易地識別。
本發明中，所謂『交聯劑（crosslinking agent）』，係使本發明所用IgG結合胜肽、和G型免疫球蛋白結晶區段《IgG Fc》，經由共價鍵（covalent bond）而連接的化學物質。本發明的交聯劑，本領域技術人員能夠適當地選擇，可以獲得具有至少兩個能夠結合所需胺基酸《例如：離氨酸殘基（lysine residue）、半胱氨酸殘基（cysteine residue）、天冬氨酸殘基（aspartic acid residue）、谷氨酸殘基（glutamic acid residue）、2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid residue）、或二氨基丙酸（diaminopropionic acid）、及精氨酸（arginine）》的位點的化合物。 作為這種實例，沒有限定之物，可列舉使用的有：最好含有2個以上的雙琥珀醯亞胺戊二酸酯《DSG》（disuccinimidyl glutarate）、雙琥珀醯亞胺辛二酸酯《DSS》（disuccinimidyl suberate）等的琥珀醯亞胺基（Succinimidyl group）的交聯劑；最好含有2個以上的二甲基己二醯亞胺二鹽酸鹽《DMA》（dimethyl adipimidate・2HCl）、二甲基庚二亞胺酸鹽二鹽酸鹽《DMP》（dimethyl pimelimidate・2HCl）、和二甲基亞碸酸酯二鹽酸鹽《DMS》（dimethyl suberimidate・2HCl）等的亞胺酸（imidic acid）部分的交聯劑；以及含有3,3ˊ-二硫代丙亞氨酸二甲酯二鹽酸鹽《DTBP》（dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate・2HCl）和3,3’-二硫代二丙酸雙(N-羥基琥珀醯亞胺酯) 《DSP》（dithiobis (succinimidyl propionate)）等地雙硫結合的交聯劑。
藉由本發明之交聯劑而被改性的IgG結合胜肽，可以經由WO2017／217437所記載的方法製造而得。
又，本發明所用的IgG結合胜肽，為了提高其安定性，也可以藉由C末端的醯胺化（amidation）等來改性。
本發明所用的IgG結合胜肽，在N末端導入改性鍵結物。作為改性鍵結物，例如，可以列舉前述化學式(III)所表示之化合物。
L1 的聚乙二醇《PEG》（polyethylene glycol）鍵結物的聚乙二醇的分子數並沒有特別的限制，例如，可以是1〜50個分子、1〜20個分子、2〜10個分子、2〜6個分子。
L2 係0〜5個以下的胺基酸殘基形成的胺基酸序列，但較合於理想的是至少含有一個半胱氨酸（cysteine）。
L3 若是至少含有二苯環辛基《DBCO》（dibenzocyclooctyl）的化學基則可，可以選擇市售的各種二苯環辛基試劑《例如，二苯基環辛炔-C6-羧酸（DBCO-C6-Acid）、二苯基環辛炔-氨（Dibenzylcyclooctyne-Amine）、二苯基環辛炔-馬來醯亞胺（Dibenzylcyclooctyne-Maleimide）、二苯基環辛炔-聚乙二醇-羧酸（DBCO-PEG acid）、二苯基環辛炔-聚乙二醇-琥珀醯亞胺-酯（DBCO-PEG-NHS ester）、二苯基環辛炔-聚乙二醇-醇（DBCO-PEG-Alcohol）、二苯基環辛炔-聚乙二醇-氨（DBCO-PEG-amine）、二苯基環辛炔-聚乙二醇-亞胺基-叔丁氧羰基（DBCO-PEG-NH-Boc）、羧基羅丹明-聚乙二醇-二苯基環辛炔（Carboxyrhodamine-PEG-DBCO）、磺醯羅丹明-聚乙二醇-二苯基環辛炔（Sulforhodamine-PEG-DBCO）、四甲基羅丹明-聚乙二醇-二苯基環辛炔（TAMRA-PEG-DBCO）、二苯基環辛炔-聚乙二醇-生物素（DBCO-PEG-Biotin）、二苯基環辛炔-聚乙二醇-二苯基環辛炔（DBCO-PEG-DBCO）、二苯基環辛炔-聚乙二醇-馬來醯亞胺（DBCO-PEG-Maleimide）、反式環辛烯-聚乙二醇-二苯基環辛炔（TCO-PEG-DBCO）、二苯基環辛炔-甲氧基聚乙二醇（DBCO-mPEG）等》與L1 或L2 結合形成的化合物，作為一個實例，可列舉的有：前述化學式(IV)所表示的二苯基環辛炔-馬來醯亞胺（Dibenzylcyclooctyne-Maleimide），與L2 的半胱氨酸殘基反應所形成的化合物。
化學式(III)的改性鍵結物，因為具備了變成點擊反應基質（substrate）的二苯環辛基《DBCO》，可以藉由點擊反應與具備了疊氮基（azido group）的配體結合。點擊反應，雖可以應用一般已知的條件，但在反應溶劑中，維持溫度在25～50℃、時間20～40分鐘的話，即可。作為反應溶劑，可以使用磷酸緩衝液、托立斯緩衝液《三羥甲基氨基甲烷緩衝液》（Tris buffer solution；Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer solution）、醋酸緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液（citrate buffer solution）等的緩衝液之外，可以使用二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide）等有機溶劑少量混合於緩衝液中的混合溶劑。
＜G型免疫球蛋白抗體《IgG抗體》＞ 於一個樣態中，本發明係有關於結合了本發明的改性IgG結合胜肽的G型免疫球蛋白抗體《IgG抗體》。該IgG抗體，將改性IgG結合胜肽和IgG抗體混合，藉由改性IgG結合胜肽和IgG之間發生交聯反應，可以形成IgG抗體。交聯反應，較合於理想的是，前述化學式(I)所表示的IgG結合胜肽的前述Xaa1之胺基酸殘基和G型免疫球蛋白結晶區段《IgG Fc》的Lys248或Lys246，較理想的是，與Lys248在特定位點發生，此交聯反應，可以依照WO2017／217437所記載的方法實行。 適用於本發明的IgG抗體沒有特別限制，只要其含有至少一條重鏈（heavy chain）即可。重鏈的分子量約50千道爾頓（103 dalton；kDa），至少含有抗原結合區段（fragment, antigen binding；Fab）範圍和結晶區段（fragment, crystallizable；Fc）範圍。關於重鏈，也可以是分子量約25千道爾頓的輕鏈以雙硫鍵（disulfide bond）為介質結合而成。本發明的IgG抗體的分子量，只要能符合前述組成即可，並無特別限制，但較合於理想的是約100〜170千道爾頓程度，更合於理想的是約120〜170千道爾頓。 本發明中，所謂『約』，係表示±10%的數值範圍。
本發明的IgG抗體，因為是藉由在Fc範圍內的特異性交聯反應而形成，該交聯反應，對IgG的活性（activity）給與負面影響（negative impact）的可能性恨少。又，藉由改性IgG結合胜肽連結IgG，可以在IgG附加新的功能性，作為IgG，也可以應用在各種抗體藥品。
＜配體（ligand）＞ 於本發明的其他樣態中，提供前述化學式(II)所表示的胜肽類配體。 前述化學式(II)的化合物，以離氨酸（lysine）的側鏈末端的NR1 R2 所表的化學基為介質，因為可以結合與IgG結合胜肽、改性IgG結合胜肽、IgG抗體、抗體片段（antibody fragment）等的多胜肽、其他標靶分子結合的配體等的標靶分子單元（target molecular element），因此可以應用於各種標靶分子單元的放射性金屬標示。又，前述化學式(II)的化合物，具備含有苯丙氨酸（phenylalanine）殘基和離氨酸（lysine）殘基的胜肽鏈為主鏈，因為該主鏈係在肝臟代謝，放射性金屬在肝臟的蓄積受到抑制，尿中排泄被促進，其體內動力學很好，因此，不只是半衰期短的放射性金屬核種可以使用，也可以應用於採用了射出細胞殺傷性的α射線或β射線的放射性金屬核種的放射性治療劑；又，放射性影像診斷時，成為腹部背景（background）的放射能很少，使腹部的病灶部位的發現（detection）．診斷變成容易。
於前述化學式(II)，R1 和R2 結合、與氮原子一起形成馬來亞醯胺基（maleimide）的情形時，可以結合在半胱氨酸（cysteine）的SH基，R1 和R2 的一者是氫原子而另一者是CO(CH2 )4 N3 所表示的化學基的情形時，可以和二苯環辛基等的炔類（alkyne）發生點擊反應而結合；因此，使用前述化學式(III)所表示之改性配體，並且，憑藉使用下述化學式(II-2)所表示之化合物作為配體，可以使前述改性IgG結合胜肽、或其結合的IgG抗體，與下述化學式(II-2)所表示之配體結合。
Figure 02_image009
《化學式(II-2)中，n係0或1。》
本發明之配體，也可以做成藥劑學上所容許的鹽類；作為鹽類，可列舉使用的有：酸加成鹽（acid addition salt）、鹼加成鹽（base addition salt）。 作為酸加成鹽，可以是無機酸鹽、有機酸鹽的任一者。 作為無機酸鹽，例如，可列舉使用的有：鹽酸鹽（hydrochloride）、氫溴酸鹽（hydrobromide）、硫酸鹽（sulfate）、氫碘酸鹽（hydroiodide）、硝酸鹽（nitrate）、磷酸鹽（phosphate）等。 作為有機酸鹽，例如，可列舉使用的有：檸檬酸鹽（citrate）、草酸鹽（oxalate）、乙酸鹽（acetate）、甲酸鹽（formate）、丙酸鹽（propionate）、苯甲酸鹽（benzoate）、三氟乙酸鹽（trifluoroacetate）、馬來酸鹽（maleate）、酒石酸鹽（tartrate）、甲磺酸鹽（methanesulfonate）、苯磺酸鹽（benzenesulfonate）、對甲苯磺酸鹽（paratoluenesulfonate）等。 作為鹼加成鹽，可以是無機鹼鹽、有機鹼鹽的任一者。 作為無機鹼鹽，例如，可列舉使用的有：鈉鹽（sodium salt）、鉀鹽（potassium salt）、鈣鹽（calcium salt）、鎂鹽（magnesium salt）、銨鹽（ammonium salt）等。 作為有機鹼鹽，例如，可列舉使用的有：三乙銨鹽（triethylammonium salt）、三乙醇銨鹽（triethanolammonium salt）、吡啶鹽（pyridinium salt）、二異丙基銨鹽（diisopropylammonium salt）等。
＜改性抗體（modified antibody）＞ 於本發明的其他樣態中，係包含IgG抗體、和結合了前述IgG抗體的IgG結合胜肽的改性抗體。該IgG結合胜肽，由前述化學式(I)來表示，含有13〜17個胺基酸殘基所形成的胺基酸序列，該IgG結合胜肽的N末端處，以改性鍵結物為介質，前述化學式(II-1)所表示之化合物，在其離氨酸殘基的位點連接，本發明提供如此做成的改性抗體。
本發明的改性抗體，較理想的是，前述化學式(II-1)所表示之化合物的離氨酸殘基和改性鍵結物的結合位置係二苯環辛基和疊氮基（azido group）經由點擊反應而做成；更理想的是，前述化學式(II-1)所表示之化合物的離氨酸殘基處，可以使用導入碳數1〜10的烷基叠氮基（alkyl azide group）之化合物；又更理想的是，使用前述化學式(II-2)所表示之化合物。又，此際，改性鍵結物，較理想的是，係前述化學式(III)所表示之化合物。點擊反應，雖然可以使用一般已知的條件，但最好是反應溶劑中溫度在25～50℃維持20～40分鐘時間。作為反應溶劑，可以使用磷酸緩衝液、托立斯緩衝液《三羥甲基氨基甲烷緩衝液》（Tris buffer solution；Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer solution）、醋酸緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液（citrate buffer solution）等的緩衝液之外，可以使用二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide）等有機溶劑少量混合於緩衝液中的混合溶劑。
＜放射性金屬標示抗體＞ 於本發明的其他樣態中，係提供：在前述改性抗體上配置了放射性金屬之放射性金屬標示抗體。
放射性金屬核種的實例，可列舉使用的有：銦《111 In》（indium）、鋯《89 Zr》（zirconium）、鎵《67/68 Ga》（gallium）、銅《64 Cu》（copper）、釔《90 Y》（yttrium）、鉍《213 Bi》（bismuth）、錒《225 Ac》（actinium）、鎦《177 Lu》（lutetium）等。與IgG結合胜肽結合的放射性金屬核種，可以配合本發明之放射性金屬表域抗體的用途而選擇，舉例來說，在癌的發現．診斷方面，可以使用銦《111 In》、鋯《89 Zr》、銅《64 Cu》和鎵《67/68 Ga》；又例如，在正子斷層掃描（PET；Positron Emission Tomography）方面，可以使用鋯《89 Zr》和銅《64 Cu》，而單光子發射電腦斷層掃描儀（SPECT；Single Photon Emission Computed Tomography）方面，可以使用銦《111 In》。作為治療用，可以使用錒《225 Ac》和鎦《177 Lu》。
本發明之改性抗體上，因為配置了放射性金屬，例如，在反應溶劑中，將二者在溫度25～120℃、能維持30～180分鐘時間，則可。作為反應溶劑，可以使用磷酸緩衝液、托立斯緩衝液《三羥甲基氨基甲烷緩衝液》（Tris buffer solution；Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer solution）、醋酸緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液（citrate buffer solution）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES；4-(2-Hydroyethyl)Piperazine-1-Ethane Sulfonic acid）緩衝液等。
＜放射性藥品＞ 於本發明的其他樣態中，係提供：含有前述放射性金屬標示抗體的放射性藥品。
本發明之放射性藥品，例如，可以做為核子醫學影像診斷劑或癌的診斷劑來使用，於此情形時，IgG抗體，可以根據癌症的類型而適當地選擇，舉例來說，如果是乳癌，可以使用曲妥珠單抗（trastuzumab），如果是大腸癌，可以使用西妥昔單抗（cetuximab）。核子醫學影像診斷劑或癌的診斷劑，可以依照通常的方法製劑化即可《參照Remington's Pharmaceutical Science， latest edition， Mark Publishing Company, Easton, 美國》。 【實施例】
以下，記載了實施例，更進一步詳細說明本發明，但本發明並未侷限於這些內容。
實施例1：含有二苯環辛基的IgG抗體的製作 依照以下記載所示，製作已結合二苯環辛基《DBCO》改性G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》的IgG抗體。
Figure 02_image011
1) 二苯環辛基改性IgG結合胜肽的製作 N末端的氨基用乙醯基（acetyl group）改性後的氨基5聚乙二醇化IgG結合胜肽（amino-PEG5-IgG binding peptide）GPDCAYHKGELVWCTFH《序列編號2，分子內的2個半胱氨酸（Cys）以二氯丙酮（Dichloroacetone）交聯，C末端醯胺化（amidation）》，藉由芴甲氧羰基固相合成法（Fmoc [9-fluorenylmethyloxycarbonyl group] solid phase synthesis），依照通常的方法合成。去保護後，已精製的IgG結合胜肽9.1毫克溶解於含有0.5%吡啶（pyridine）的二甲基亞碸（DMSO；Dimethyl sulfoxide）100微升（μL）中《33.3毫莫耳（mM）》，然後加入含100毫莫耳二苯並環辛炔-馬來醯亞胺（DBCO-maleimide；Dibenzocyclooctyne-maleimide）的含有0.5%吡啶（pyridine）的二甲基亞碸（DMSO；Dimethyl sulfoxide）50微升《胜肽的莫耳比為1.5倍量》，在室溫使其進行反應30分鐘。 其次，此胜肽溶液中加入已溶解雙琥珀醯亞胺戊二酸酯（DSG； disuccinimidyl glutarate）《500毫莫耳》的乙腈（acetonitrile）200微升《最終濃度286毫莫耳，相對於胜肽微30倍莫耳當量》，在50℃，使其進行反應3小時。將全體數量《350微升》分成2份，稀釋在含0.1%三氟乙酸（Trifluoroacetic acid；TFA）的10%乙腈5毫升（mL）中，離心後的上清液注射至Inert Sustain《註冊商標》C18管柱《7.6毫米 1×250毫米，GL Science公司》，用從含0.1%三氟乙酸的10%乙腈開始、到含0.1%三氟乙酸的60%乙腈的梯度（gradient），將其溶出。進行溶出物的質譜測量（mass spectrometry），目標產物二苯環辛基改性IgG結合胜肽回收後，除去有機溶劑，然後冷凍乾燥之。
2) 含有二苯環辛基IgG抗體的製造 前述1)中調製的改性IgG結合胜肽以4毫莫耳的濃度溶解於二甲基亞碸（DMSO；Dimethyl sulfoxide）中所成的溶液25.2微升、和10毫莫耳醋酸緩衝液《酸鹼值5.5》中溶解了20微莫耳的抗人類表皮生長因子受體2人類抗體（Anti-HER2[human epidermal growth factor receptor 2] human antibody）《Trastuzumab》《中外製藥公司》16.8毫升混合，在37℃使其進行反應3小時《胜肽和抗體的莫耳比＝3：1》。像這樣調製成的含二苯環辛基抗體，放入陽離子交換管柱CIM multus SO3-8《8毫升，BIA separation公司》中，10毫莫耳醋酸緩衝液中從0至0.35莫耳氯化鈉的梯度，用來將其溶出，加以精製。除了未反應的抗體，確認一個胜肽結合單價抗體和二個胜肽結合二價抗體。此處，分離單價抗體峰後，在超過濾濃縮管Vivaspin《10000道爾頓 截斷，GE Healthcare公司》上，藉由3000克離心，進行脫鹽濃縮（desalination and concentration）。
實施例2：DO3ABn- 苯丙胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH （DO3ABn-Phe-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）的合成 DO3ABn-Phe-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH《化學式(II-2)中，n是0的化合物》，藉由以下的圖解流程《但，步驟(a)的生成物係化合物(4b)，步驟(b)的生成物係化合物(5b)》，可以合成。又，核磁共振氫譜（1 H-NMR；Proton Nuclear Magnetic. Resonance）的分析，使用JEOL ECS-400光譜儀（JEOL ECS-400 spectrometer）《日本電子公司》；電噴霧離子化-質譜（ESI-MS；electrospray ionization- mass spectrometry）分析，使用高效液相層析1200系列-6130四極 液相／質譜 質譜儀（HPLC1200 series-6130 quadrupole LC/MS mass spectrometer）《Agilent．Technology公司》。
Figure 02_image013
5- 叠氮基戊酸乙酯（Ethyl 5-azidovalerate）《化合物(1)》的合成 將乙基5-溴戊酸酯（Ethyl 5-bromovalerate）《1公克，4.78毫莫耳》溶解於N,N-二甲基甲醯胺（N,N-dimethylformamide；DMF）《3毫升》中，加入疊氮化鈉（NaN3 ）《0.5公克，7.7毫莫耳》，在85℃攪拌整夜。懸浮液用水《40毫升》稀釋，用二乙醚（diethyl ether）《40毫升×3》抽取，減壓濃縮溶液，將該減壓濃縮後的溶液依其狀態應用於下一個反應。
5- 叠氮基戊酸（5-Azidovaleric acid）《化合物(2)》的合成 化合物(1)的溶液中加入1當量（N）氫氧化鈉（NaOH）水溶液《8.2毫升》後，將混合液便成均一狀態，然後加入甲醇（methanol），在室溫攪拌4小時以後，將反應液減壓濃縮，所得到的水溶液用二乙基醚《5毫升》洗淨；接著，加入5%檸檬酸水溶液，使溶液成酸性後，用二乙基醚《5毫升×3》抽取。在有機層裡加入硫酸鈉（Na2 SO4 ）乾燥後，減壓餾除溶劑，得到化合物(2)。 核磁共振氫譜（1 H NMR）《氘代氯仿（CDCl3 ；Deuterated chloroform；Trichloro(2 H)methane）》：δ 1.62-1.77 (4H, m, CH2 )、2.39-2.43 (2H, t, CH2 )、3.29-3.33 (2H, t, CH2 )。
2,3,5,6- 四氟苯基 5-叠氮基戊酸酯(2,3,5,6-tetrafluorophenyl 5-azidovalerate)《化合物(3)》的合成 將化合物(2)《17.9毫克，0.125微莫耳》、2,3,5,6-四氟苯酚（2,3,5,6-tetrafluorophenol）《44.0毫克，0.250微莫耳》、N,N-二異丙基乙基胺（N,N-diisopropylethylamine；DIEA）《53.2微升，0.312微莫耳》溶解於二氯甲烷（CH2 Cl2 ；Dichloromethane）《2.0毫升》後，於冰冷卻下（below freezing），加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺．鹽酸鹽（EDC；1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）《48.0毫克，0.250微莫耳》；將溶液回到室溫，攪拌1.5小時以後，加入醋酸乙酯（ethyl acetate）《10毫升》，用飽和氯化銨溶液《3毫升×3》洗淨。在有機層裡加入硫酸鈉（Na2 SO4 ）乾燥後，減壓餾除溶劑，得到化合物(3) 《39.9毫克》。所得到的粗生成物含有2,3,5,6-四氟苯酚（2,3,5,6-tetrafluorophenol），依原樣使用於下一個反應。
DO3ABn- 苯丙胺酸- 離氨酸-OH（DO3ABn-Phe-Lys-OH）《化合物(4b)》的合成 經由胜肽延伸反應（peptide elongation reaction）使苯丙胺酸-離氨酸（Phe-Lys）與Cl-Trt(2-Cl)-Resin《渡邊化學工業公司，產品編號：A00187》結合，相對(t Bu)3 DO3ABn-COOH《16-20毫克》，加入1.3當量的苯丙胺酸-離氨酸（Phe-Lys）結合的樹脂、O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲;O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HATU；O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-Tetramethyluronium Hexafluorophosphate）《2.5當量》、1-羥基-7-氮雜苯並三唑（HOAt；1- Hydroxy-7-azabenzotriazole）《2.5當量》、N,N-二異丙基乙基胺（DIEA；N,N-diisopropylethylamine）《5.0當量》，在二甲基甲醯胺（DMF；dimethyl formamide）《200微升》中、於室溫攪拌整夜。用二甲基甲醯胺8次、然後用二氯甲烷4次洗淨後，將樹脂減壓乾燥。乾燥後的樹脂，加入三氟乙酸（TFA；trifluoroacetic acid）／三異丙基矽烷（triisopropylsilane）／水＝95／2.5／2.5的混合液，於室溫攪拌3小時；減壓餾除溶劑後，加入二乙基醚（diethyl ether）《5毫升》，藉此使其結晶化；過濾取得結晶，用二乙基醚洗淨後，減壓乾燥，得到白色結晶的化合物(4b)的三氟乙酸鹽7.7毫克《產率：25.7%》。
DO3ABn- 苯丙胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Phe-Lys((CH2 )4 -N3 )s-OH）《化合物(5b)》的合成 將化合物(4b)溶解於二甲基甲醯胺（DMF）《0.5毫升》中，加入化合物(3) 《7.5當量》、N,N-二異丙基乙基胺（DIEA；N,N-diisopropylethylamine）《4.0當量》，在室溫攪拌3小時。減壓餾除溶劑後，再溶解於水《5毫升》中。所得到的水溶液用三氯甲烷（CHCl3 ）《3毫升×3》洗淨後，減壓濃縮之，在分離用高效液相層析（HPLC；high performance liquid chromatography）中精製，得到白色結晶的化合物(5b)的三氟乙酸鹽1.7毫克《產率：20.0%》。電噴霧離子化-質譜（ESI-MS；electrospray ionization- mass spectrometry）(M+H)+ 分析：m/z 881，結果：881。 又，經由分離用高效液相層析的精製，作為管柱（column），係使用Imtakt Cadenza C18《20毫米Ï150毫米》，A相使用0.1%三氟乙酸／水，B相使用0.1%三氟乙酸／甲醇（methanol），靠著從0〜45分鐘B相10〜50%、到45〜55分鐘B相50〜100%的上升梯度系統（gradient system），在流速5毫升／分鐘，進行滯留時間38.0分鐘的峰點（peak）的分離。 又，質量分析法，作為管柱，係使用Imtakt US-C18《4.6毫米Ï150毫米》，A相使用0.1%三氟乙酸／水，B相使用0.1%三氟乙酸／乙腈（acetonitrile），靠著從0〜30分鐘B相0〜45%、到30〜40分鐘B相45〜100%的上升梯渡系統（gradient system），在流速1毫升／分鐘，進行滯留時間25.0分鐘的峰點（peak）的分析。
實施例3：DO3ABn- 苯丙胺酸-甘胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Phe-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）的合成 DO3ABn-苯丙胺酸-離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Phe-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）《化學式(II-2)中。n係1的化合物》，藉由實施例2中所示的圖解流程《但，步驟(a)的生成物係化合物(4c)，步驟(b)的生成物係化合物(5c)》，加以合成。
DO3ABn- 苯丙胺酸-甘胺酸- 離氨酸-OH（DO3ABn-Phe-Gly-Lys-OH）《化合物(4c)》的合成 使用苯丙胺酸-甘胺酸-離氨酸（Phe-Gly-Lys）代替苯丙胺酸-離氨酸（Phe-Lys）結合的樹脂以外，進行與實施例2的化合物(4b)相同的操作，得到白色結晶的化合物(4c)的三氟乙酸鹽30.0毫克《產率：76.8%》。
DO3ABn- 苯丙胺酸-甘胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH （DO3ABn-Phe-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）《化合物(5c)》的合成 使用化合物(4c)代替化合物(4b)以外，進行與實施例2的化合物(5b)相同的操作，得到白色結晶的化合物(5c)的三氟乙酸鹽4.6毫克《產率：14%》。電噴霧離子化-質譜（ESI-MS；electrospray ionization- mass spectrometry）(M+H)+ 分析：m/z 938，結果：938。 又，經由高效液相層析的精製，與實施例2相異，作為管柱（column），係使用Imtakt Cadenza C18《20毫米Ï150毫米》，A相使用0.1%三氟乙酸／水，B相使用0.1%三氟乙酸／乙腈（acetonitrile），靠著從0〜45分鐘B相10〜50%、到45〜55分鐘B相50〜100%的上升梯度系統（gradient system），在流速5毫升／分鐘，進行滯留時間33.9分鐘的峰點（peak）的分離。 又，質量分析的條件與實施例相同，但滯留時間係24.7分鐘。
比較例1：DO3ABn- 甘胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）的合成 DO3ABn-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH《化學式(II-2)中。n係1、沒有苯基（phenyl）殘基的化合物》，藉由實施例2中所示的圖解流程《但，步驟(a)的生成物係化合物(4a)，步驟(b)的生成物係化合物(5a)》，加以合成。
DO3ABn- 甘胺酸- 離氨酸-OH（DO3ABn-Gly-Lys-OH）《化合物(4a)》的合成 代替苯丙胺酸-離氨酸（Phe-Lys），使用甘胺酸-離氨酸（Gly-Lys）結合的樹脂以外，進行與實施例2的化合物(4b)相同的操作，得到白色結晶的化合物(4a)的三氟乙酸鹽8.3毫克《產率：25.3%》。
DO3ABn- 甘胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）《化合物(5a)》的合成 使用化合物(4a)代替化合物(4b)以外，進行與實施例2的化合物(5b)相同的操作，得到白色結晶的化合物(5a)的三氟乙酸鹽1.5毫克《產率：16.3%》。電噴霧離子化-質譜（ESI-MS；electrospray ionization- mass spectrometry）(M+H)+ 分析：m/z 791，結果：791。 但是，高效液相層析的精製的滯留時間是22.6分鐘，質量分析的滯留時間是19.3分鐘。
製造例1：二苯並環辛炔-半乳糖結合白蛋白（DBCO-NGA）的調製 應用與『Journal of Medicinal Chemistry 1997, 40, 頁2643-2652』相同的方法，藉由2-亞氨基硫烷（2-iminothiolane），調製導入了巰基（thiol group）的NGA溶液10毫克／毫升。於本溶液100微升中，相對於半乳糖結合白蛋白（NGA；galactose-bound albumin），加入溶解了50當量的二苯並環辛炔-馬來醯亞胺（DBCO-maleimide；Dibenzocyclooctyne-maleimide）《購自奥德里公司（Aldrich社）》的二甲基亞碸（DMSO；Dimethyl sulfoxide）溶液2微升，在37℃進行反應1.5小時。反應結束後，將溶液經由以杜氏磷酸鹽緩衝液（D-PBS(-)；Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）平衡化的葡聚糖凝膠G-50（sephadex G-50）為撐體（support）的核酸純化管柱（spin column）加以精製，製作二苯並環辛炔《DBCO》的平均結合數2.1的二苯並環辛炔-半乳糖結合白蛋白《DBCO-NGA》。
製造例2：111 In-DO3ABn- 苯丙胺酸- 離氨酸-半乳糖結合白蛋白（111 In-DO3ABn-Phe-Lys-NGA）的製作 DO3ABn-苯丙胺酸-離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Phe-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）的111 In標示、以及與二苯並環辛炔-半乳糖結合白蛋白《DBCO-NGA》的點擊反應，係依照下述的圖解流程《但，步驟(a)的生成物係化合物(6b)，步驟(b)的生成物係化合物(7b)》而合成。
Figure 02_image015
111 In-DO3ABn- 苯丙胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（111 In-DO3ABn-Phe-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）《化合物(6b)》的製作 在氯化銦（111 InCl3 ）溶液《1.48百萬貝克（MBq）／60微升》中，加入1莫耳（M）醋酸緩衝液《酸鹼值（pH）5.5，20微升》，在室溫靜置5分鐘以後，加入以5×10-4 莫耳的濃度溶解於0.1莫耳醋酸緩衝液《酸鹼值5.5，20微升》中的化合物(5b)，讓溶液在95℃反應5分鐘後，回到室溫，加入0.2莫耳二乙烯三胺五乙酸（DTPA；diethylene triamine penta-acetic acid）溶液10微升，在室溫靜置5分鐘。反應液經由分析用高效液相層析精製，含有目標物的部份經由Sep-pak用甲醇取代溶劑所得到的溶液，加入杜氏磷酸鹽緩衝液（D-PBS(-)；Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）30微升，減壓濃縮溶劑。A相使用0.05莫耳醋酸緩衝液《酸鹼值5.5》、B相使用甲醇（methanol），利用在0〜30分鐘B相以20〜60%、在30〜35分鐘60〜100%上升梯度系統，以流速1毫升／分鐘，分取滯留時間20.2分鐘時的峰值精製，得到化合物(6b)，放射化學的產率為＞99%。
111 In-DO3ABn- 苯丙胺酸- 離氨酸-半乳糖結合白蛋白（111 In-DO3ABn-Phe-Lys-NGA）《(7b)》的製作 化合物(6b)的杜氏磷酸鹽緩衝液（D-PBS(-)；Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）溶液30微升加入到二苯並環辛炔-半乳糖結合白蛋白《DBCO-NGA》溶液10微升中，在室溫，進行反應14小時。反應後的溶液，經由以杜氏磷酸鹽緩衝液（D-PBS(-)）平衡化的葡聚糖凝膠G-50（sephadex G-50）為撐體（support）的核酸純化管柱（spin column）加以精製，得到做為目標的111 In標示半乳糖結合白蛋白（111 In label NGA）《化合物(7b)》，放射化學的產率為43.0%。
製造例3：111 In-DO3ABn- 苯丙胺酸-甘胺酸 - 離氨酸-半乳糖結合白蛋白（111 In-DO3ABn-Phe-Gly-Lys-NGA）的製作 DO3ABn-苯丙胺酸-甘胺酸-離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Phe-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）的111 In標示、以及、與二苯並環辛炔-半乳糖結合白蛋白《DBCO-NGA》的點擊反應，係依照製造例2所示的圖解流程《但，步驟(a)的生成物係化合物(6c)，步驟(b)的生成物係化合物(7c)》而合成。
111 In-DO3ABn- 苯丙胺酸-甘胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（111 In-DO3ABn-Phe-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）《化合物(6c)》的製作 使用化合物(5c)代替化合物(5b)以外，進行與製造例2的化合物(6b)相同的操作，得到化合物(6c)，放射化學的產率為98.7%。 但，高效液相層析精製的滯留時間（retention time）係18.7分鐘。
111 In-DO3ABn- 苯丙胺酸-甘胺酸- 離氨酸-半乳糖結合白蛋白（111 In-DO3ABn-Phe-Gly-Lys-NGA）《(7c)》的製作 使用化合物(6c)代替化合物(6b)以外，進行與製造例2的化合物(6b)相同的操作，得到化合物(7c)，放射化學的產率為50.0%。
製造例4：111 In-DO3ABn- 甘胺酸 - 離氨酸-半乳糖結合白蛋白（111 In-DO3ABn-Gly-Lys-NGA）的製作 DO3ABn-甘胺酸-離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）的111 In標示、以及、與二苯並環辛炔-半乳糖結合白蛋白《DBCO-NGA》的點擊反應，係依照製造例2所示的圖解流程《但，步驟(a)的生成物係化合物(6a)，步驟(b)的生成物係化合物(7a)》而合成。
111 In-DO3ABn- 甘胺酸- 離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（111 In-DO3ABn-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）《化合物(6a)》的製作 使用化合物(5a)代替化合物(5b)以外，進行與製造例2的化合物(6b)相同的操作，得到化合物(6a)，放射化學的產率為93.2%。 但，在分析用高效液相層析的精製中，使用Imtakt US-C18《4.6毫米Ï150毫米》，A相使用0.05莫耳醋酸緩衝液《酸鹼值5.5》、B相使用甲醇（methanol），利用在0〜30分鐘B相以0〜40%、在30〜35分鐘40〜100%的上升梯度系統，以流速1毫升／分鐘，分取滯留時間19.1分鐘時的峰值，加以精製。
使用化合物(6a)代替化合物(6b)以外，進行與製造例2的化合物(6b)相同的操作，得到化合物(7a)，放射化學的產率為38.0%。
製造例5：CHX-A’’-DTPA-NGA的製作 將半乳糖結合白蛋白《NGA》溶解於0.1莫耳的硼酸緩衝液《酸鹼值8.5》中，調製成半乳糖結合白蛋白溶液（NGA溶液）《250微克（μg）／50微升》。又，將p-SCN-CHX-A’’-DTPA《(R)-2-氨基-3-(4-異硫氰酸苯酯)丙基-反式-(S,S)-環己烷-1,2-二氨-五醋酸（(R)-2-Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)propyl]-trans-(S,S)-cyclohexane-1,2-diamine-pentaacetic acid），購自奥德里公司（Aldrich社）》溶解於0.1莫耳的硼酸緩衝液《酸鹼值8.5》中《6毫克／毫升》，加入0.1當量氫氧化鈉，將酸鹼值調整為8〜9以後，用0.1莫耳的硼酸緩衝液《酸鹼值8.5》稀釋，調製成p-SCN-CHX-A’’-DTPA溶液《5毫克／毫升》。20當量的p-SCN-CHX-A’’-DTPA溶液中加入半乳糖結合白蛋白溶液，在室溫進行反應整夜。 反應結束後，將溶液經由以0.25莫耳醋酸緩衝液平衡化的葡聚糖凝膠G-50（sephadex G-50）為撐體（support）的核酸純化管柱（spin column）加以精製，得到目標的CHX-A’’-DTPA-NGA溶液。
製造例6：111 In-CHX-A’’-DTPA-NGA的製作 在氯化銦（111 InCl3 ）溶液《1.48百萬貝克（MBq）／20微升》中，加入1莫耳（M）醋酸緩衝液《酸鹼值（pH）5.5，5微升》，在室溫靜置5分鐘以後，加入CHX-A’’-DTPA-NGA溶液《30微克／15微升》，讓溶液在37℃反應1.5小時後，回到室溫，加入0.2莫耳二乙烯三胺五乙酸（DTPA；diethylene triamine penta-acetic acid）溶液10微升，在室溫靜置5分鐘。反應後的溶液，藉由以杜氏磷酸鹽緩衝液（D-PBS(-)）平衡化的葡聚糖凝膠G-50（sephadex G-50）為撐體（support）的核酸純化管柱（spin column）加以精製，得到目標的111 In-CHX-A’’-DTPA-NGA。
實施例4：放射性金屬標示IgG抗體[111 In]H-FGK-DOTA的製作 將實施例1所得到之含有二苯環辛基的IgG抗體1.4毫克《1.5毫微莫耳（nmol）》和實施例3所得到之DO3ABn-苯丙胺酸-甘胺酸-離氨酸((CH2 )4 -N3 )-OH（DO3ABn-Phe-Gly-Lys((CH2 )4 -N3 )-OH）0.1毫克《75毫微莫耳（nmol）》在10毫莫耳醋酸緩衝液167.5微升中，於室溫下進行點擊反應。反應結束後，藉由超過濾作用（ultrafiltration）進行精製，以二苯環辛基《DBCO》改性G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》為介質，製作DOTA-FGK結合在曲妥珠單抗（trastuzumab）的改性抗體《以下，稱為『H-FGK-DOTA』》。 所得到的H-FGK-DOTA在氯化銦（111 InCl3 ）溶液200微升《19.7百萬貝克（MBq），酸鹼值6.5》和100毫莫耳4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩衝液50微升中混合；又，相對於銦《111 In》的H-FGK-DOTA的莫耳數是20〜100倍調製。此混合液在45℃反應2小時，使其進行錯合物生成反應（complex forming reaction），錯合物生成後，藉由超過濾作用進行精製。用放射性同位素劑量校正器（radioisotope dose calibrator）測定放射能量的結果，所得到的[111 In]H-FGK-DOTA的放射能量係2.33百萬貝克，衰減校正（attenuation correction）算出的放射化學產率為14.0%。 又，將[111 In]H-FGK-DOTA滴下濾紙後，用100毫莫耳檸檬酸鈉緩衝液展開；展開結束後，用薄層層析掃描儀（TLC scanner；thin-layer chromatography scanner）《Gita Star，raytest公司》測定的結果，放射化學純度為97.1%。
實施例5：放射性金屬標示IgG抗體[111 In]H-DOTA的製作 實施例1所得到的含有二苯環辛基的IgG抗體和1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三個(乙酸)-10-(叠氮基丙基 乙基乙醯胺) （1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7-tris(acetic acid)-10-(azidopropyl ethylacetamide)）《Azide-mono-amide-DOTA，Macrocyclics公司》0.04毫克《75毫微莫耳（nmol）》放入醋酸緩衝液167.5微升中，在室溫下進行點擊反應。反應結束後，藉由超過濾作用（ultrafiltration）進行精製，以二苯環辛基《DBCO》改性G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》為介質，製作DOTA結合在曲妥珠單抗（trastuzumab）的IgG抗體《以下，稱為『H-DOTA』》。 所得到的H-DOTA在氯化銦（111 InCl3 ）溶液200微升《21.3百萬貝克（MBq），酸鹼值6.5》和100毫莫耳4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩衝液50微升中混合，使其進行錯合物生成反應（complex forming reaction），錯合物生成後，藉由超過濾作用進行精製。得到的[111 In]H-DOTA係2.99百萬貝克，與實施例3相同方法算出放射化學產率和放射化學純度，放射化學產率為14.0%，放射化學純度係99.6%。
評價1：動物實驗(1) 製造例2〜4和6所得到的各111 In標示半乳糖結合白蛋白《NGA》溶液用杜氏磷酸鹽緩衝液（D-PBS(-)）稀釋．調整，使濃度成為11.1百萬貝克／8微克／蛋白質／100微升／小鼠，對6週大、ddY品系的雄性小鼠（mouse）從它的尾靜脈投與。投與後5分鐘、或1小時後，殺死1群5隻小鼠，回收血液和關注臟器，測定臟器重量後，藉由自動井型伽瑪計數器（automatic gamma counter）測定放射能。
表1
Figure 02_image017
表2
Figure 02_image019
表1中顯示投與5分鐘後的各臟器放射能《%ID》；表2中顯示投與1小時後的各臟器放射能《%ID》。Gly-Lys表示製造例4中製作的111 In-DO3ABn-Gly-Lys-NGA投與後的結果；Phe-Lys表示製造例2中製作的111 In-DO3ABn-Phe-Lys-NGA投與後的結果；Phe-Gly-Lys表示製造例3中製作的111 In-DO3ABn-Phe-Gly-Lys-NGA投與後的結果；SCN表示製造例6中製作的111 In-CHX-A’’-DTPA-NGA投與後的結果。 如表1所示，投與5分鐘時，確認肝臟中放射能蓄積，但包含Phe-Lys和Phe-Gly-Lys的胺基酸序列，也確認從肝臟的排泄。
評價2：動物實驗(2) 使用實施例4所得到的[111 In]H-FGK-DOTA和實施例5所得到的[111 In]H-DOTA，以調查FGK序列的有效性為目標，進行生體內（in vivo）實驗。 將溶劑用磷酸緩衝生理食鹽水（PBS；phosphate buffered saline）取代的[111 In]H-FGK-DOTA和[111 In]H-DOTA調整為100微升相當200百萬貝克後，異氟醚（isoflurane）麻醉下，對於6週大的雄性小鼠《ddY品系》3隻，每隻從尾靜脈投與100微升。投與後，在第1小時、6小時、24小時，經由放血（exsanguination）死亡，將其殺死，摘出臟器《心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、胃、小腸、大腸、下肢骨、肌肉、膀胱》，測量血液、尿、糞、殘餘身體的總重量以後，測定放射能量。各十點的放射能分布《%注射劑量（%%injected dose(ID)）》的平均值和標準差顯示在圖1。又，圖2係顯示矚目臟器的體內動力學《%ID》。統計分析採用學生t檢驗（Student’s t-test）進行；又，顯著差異（significant difference）的判定係P＜0.05。
圖1A係顯示投與後1小時的結果的圖，圖1B係顯示投與後6小時的結果的圖，圖1C係顯示投與後24小時的結果的圖。 圖2A係顯示肝臟中的放射能分布《%ID》的隨時間變化圖；圖2B係顯示腎臟中的放射能分布《%ID》的隨時間變化圖。圖2C中，『腎臟泌尿系統（renal urinary system）』係表示腎臟、膀胱和尿中的放射能分布《%ID》的合計的隨時間變化圖；『肝膽系統（hepatobiliary system）』係表示肝臟、小腸、大腸和糞便中的放射能分布《%ID》的合計的隨時間變化圖。 投與後，在6小時的時點，[111 In]H-DOTA和[111 In]H-FGK-DOTA在肝臟的攝入有差異的時點，及，投與後24小時，[111 In]H-FGK-DOTA排泄到尿中顯著地上升的時點，從該兩個時點，顯示藉由FGK序列，促進放射性核種的排泄，成功地使肝臟的蓄積可以減低。
本專利申請案，以2018年4月16日申請的日本申請特願2018-78487號為基礎，主張優先權，該揭示內容亦併入於此。 （序列表） 序列表（SEQUENCE LISTING） >110> 日本醫療-物理公司（NIHON MEDI-PHYSICS CO., LTD.） >120> 改性抗體（Modified antibody）和放射性金屬標示抗體（radioactive metal labelled antibody） >130> IDP-1377 >160> 5 >170> 專利3.5版（PatentIn version 3.5） >210> 1 >211> 13 >212> PRT >213> 人造（Artificial） >220> >223> G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》（IgG-binding peptide） >220> >221> 雜項特徵（misc_feature） >222> (6)..(6) >223> Xaa係離氨酸（lysine）、半胱氨酸（cysteine）、天冬氨酸（aspartic acid）、谷氨酸（glutamic acid）、2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid）、或二氨基丙酸（diaminopropionic acid） >400> 1 Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 >210> 2 >211> 17 >212> PRT >213> 人造（Artificial） >220> >223> G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》（IgG-binding peptide） >220> >221> 雜項特徵（misc_feature） >222> (8)..(8) >223> Xaa係離氨酸（lysine）、半胱氨酸（cysteine）、天冬氨酸（aspartic acid）、谷氨酸（glutamic acid）、2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid）、或二氨基丙酸（diaminopropionic acid） >400> 2 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His >210> 3 >211> 17 >212> PRT >213> 人造（Artificial） >220> >223> G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》（IgG-binding peptide） >220> >221> 雜項特徵（misc_feature） >222> (8)..(8) >223> Xaa係離氨酸（lysine）、半胱氨酸（cysteine）、天冬氨酸（aspartic acid）、谷氨酸（glutamic acid）、2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid）、或二氨基丙酸（diaminopropionic acid） >400> 3 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His >210> 4 >211> 17 >212> PRT >213> 人造（Artificial） >220> >223> G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》（IgG-binding peptide） >220> >221> 雜項特徵（misc_feature） >222> (2)..(2) >223> Xaa 係 同半胱胺酸（homocysteine） >220> >221> 雜項特徵（misc_feature） >222> (8)..(8) >223> Xaa 係離氨酸（lysine）、半胱氨酸（cysteine）、天冬氨酸（aspartic acid）、谷氨酸（glutamic acid）、2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid）、或二氨基丙酸（diaminopropionic acid） >220> >221> 雜項特徵（misc_feature） >222> (16)..(16) >223> Xaa 係 同半胱胺酸（homocysteine） >400> 4 Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa 1 5 10 15 His >210> 5 >211> 110 >212> PRT >213> 智慧人（Homo Sapiens） >400> 5 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 【1】
【圖1A】係顯示[111 In]H-FGK-DOTA和[111 In]H-DOTA投與後1小時的時點的放射能分佈《%注射劑量（%injected dose；%ID）》的平均值及標準差的圖。 【圖1B】係顯示[111 In]H-FGK-DOTA和[111 In]H-DOTA投與後6小時的時點的放射能分佈《%注射劑量（%injected dose；%ID）》的平均值及標準差的圖。 【圖1C】係顯示[111 In]H-FGK-DOTA和[111 In]H-DOTA投與後24小時的時點的放射能分佈《%注射劑量（%injected dose；%ID）》的平均值及標準差的圖。 【圖2A】係顯示[111 In]H-FGK-DOTA和[111 In]H-DOTA在肝臟的放射能分佈《%注射劑量（%injected dose；%ID）》的經時變化的圖。 【圖2B】係顯示[111 In]H-FGK-DOTA和[111 In]H-DOTA在腎臟的放射能分佈《%注射劑量（%injected dose；%ID）》的經時變化的圖。 【圖2C】係顯示[111 In]H-FGK-DOTA和[111 In]H-DOTA在排泄系統的放射能分佈《%注射劑量（%injected dose；%ID）》的經時變化的圖。
Figure 108113118-A0101-11-0001-1

Claims (5)

  1. 一種改性抗體， 係包含G型免疫球蛋白抗體《IgG抗體》（IgG antibody；Immunoglobulin G antibody）、和結合前述G型免疫球蛋白抗體《IgG抗體》的G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》（IgG binding peptide）的改性抗體（modified antibody）， 前述G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》，以下列化學式(I)表示： (X1-3 )-C-(X2 )-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3 )　　(I) 《化學式(I)中， X係各自獨立、半胱氨酸（cysteine）以外的任意胺基酸殘基（amino acid residue）， C係半胱氨酸殘基（cysteine residue）， H係組胺酸殘基（histidine residue）， Xaa1係離氨酸殘基（lysine residue）、半胱氨酸殘基（cysteine residue）、天冬氨酸殘基（aspartic acid residue）、谷氨酸殘基（glutamic acid residue）、2-氨基辛二酸（2-aminosuberic acid）、或二氨基丙酸（diaminopropionic acid）， G係甘氨酸殘基（glycine residue）， Xaa2係谷氨酸殘基（glutamic acid residue）、谷氨醯胺殘基（glutamine residue）、或天冬醯胺殘基（asparagine residue）， L係白胺酸殘基（leucine residue）， V係纈胺酸殘基（valine residue），且 W係色胺酸殘基（tryptophan residue）， 兩個半胱氨酸殘基可以相互以雙硫鍵（disulfide bond）結合或以鍵結物（linker）為介質結合，C末端也可以醯胺化（amidation）》 含有13〜17胺基酸殘基所形成之胺基酸序列（amino acid sequence）， 前述G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》的N末端處，以改性鍵結物（modified linker）為介質，在其離氨酸殘基（lysine residue）的單點上連接下列化學式(II-1)所表示之化合物：
    Figure 03_image021
    《化學式(II-I)中，n係0或1》 而做成之改性抗體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之改性抗體，其中前述化學式(II-1)所表示之化合物的離氨酸殘基和前述改性鍵結物的結合部位，係二苯環辛基（dibenzocyclooctyl；DBCO）和疊氮基（azido group）經由點擊反應（click reaction）所做成。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之改性抗體，其中 前述改性鍵結物，係下列化學式(III)所表示之化合物： L1 -L2 -L3 （III） 《L1 係前述G型免疫球蛋白結合胜肽的N末端處結合的聚乙二醇鍵結物（polyethylene glycol linker）， L2 係0以上5以下的胺基酸殘基所形成之胺基酸序列， L3 係末端具有二苯環辛基（dibenzocyclooctyl；DBCO）的化學基》 在前述化學式(III)所表示之化合物的離氨酸殘基（lysine residue）處，藉由導入碳數1〜10的烷基叠氮基（alkyl azide group），前述離氨酸殘基和前述改性鍵結物的結合部位經由點擊反應而形成。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項之任一項所述之改性抗體，其中 前述化學式(I)所表示之G型免疫球蛋白結合胜肽《IgG結合胜肽》，係由下列胺基酸序列做成： GPDCAYHKGELVWCTFH 《序列號碼2》 《前述胺基酸序列中，兩個半胱氨酸殘基可以相互以雙硫鍵結合，C末端也可以醯胺化》。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之改性抗體，其中 前述化學式(III)中，L2 具有半胱氨酸殘基（cysteine residue），L3 係下列化學式(IV)所表示之二苯環辛基-馬來亞醯胺（dibenzocyclooctyl maleimide；DBCO- maleimide）、
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