MX2012013868A - Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina. - Google Patents

Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.

Info

Publication number
MX2012013868A
MX2012013868A MX2012013868A MX2012013868A MX2012013868A MX 2012013868 A MX2012013868 A MX 2012013868A MX 2012013868 A MX2012013868 A MX 2012013868A MX 2012013868 A MX2012013868 A MX 2012013868A MX 2012013868 A MX2012013868 A MX 2012013868A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
antibody
cysteine
genetically engineered
engineered
drug
Prior art date
Application number
MX2012013868A
Other languages
English (en)
Other versions
MX336540B (es
Inventor
Sunil Bhakta
Jagath R Junutula
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of MX2012013868A publication Critical patent/MX2012013868A/es
Publication of MX336540B publication Critical patent/MX336540B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1051—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from breast, e.g. the antibody being herceptin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

Se describen los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína, que comprenden un aminoácido de cisteína libre en la cadena pesada o cadena ligera, y se preparan al mutagenizar una secuencia nucleoacídica de un anticuerpo parental y al sustituir uno o más residuos aminoacídicos por cisteína y codificar para el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína; la expresión del anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína; y aislamiento del anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína. Ciertos anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína muy reactivos se identificaron mediante el ensayo por PHESELECTOR. Los anticuerpos aislados manipulados genéticamente con cisteína pueden unirse covalentemente a un marcador de captura, un marcador de detección, una porción del fármaco o a un soporte sólido.

Description

CONJUGADOS Y ANTICUERPOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE CON CISTEÍNA REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud no provisional presentada bajo 37 CFR §1. 53 (b), reivindica la ventaja bajo 35 USC § 1 19 (e) de la Solicitud Provisional de E.U. Número de Serie 61/352,728 presentada el 8 de junio de 2010, que se incorpora por referencia en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona generalmente con anticuerpos manipulados genéticamente con residuos de cisteína reactivos y más específicamente con anticuerpos de aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína pueden conjugarse con fármacos quimioterapéuticos, toxinas, ligandos de afinidad como biotina y marcadores de detección como fluoróforos. La invención también se relaciona con métodos para usar anticuerpos y compuestos del conjugado anticuerpo-fármaco para el optimización de selección del anticuerpo, estabilidad ligac or, potencia del fármaco citotóxica y modo de la conjugación del fármaco ligador al anticuerpo.
Los medios convencionales de fijación, es decir la anión a través de enlaces covalentes, una porción del fármaco a un anticuerpo, generalmente da como resultado una mezcla heterogénea de moléculas donde las porciones del fármaco se fijan en varios sitios en el anticuerpo. Por ejemplo, los fármacos citotóxicos se han por lo común conjugado a anticuerpos a través de los a menudo diversos residuos de la Usina de un anticuerpo, generando una mezcla del conjugado anticuerpo-fármaco heterogénea. Según condiciones de reacción, la mezcla heterogénea por lo común contiene una distribución de anticuerpos con de 0 hasta aproximadamente 8, o más, porciones del fármaco unidas. Además, dentro de cada subgrupo de conjugados con una proporción del número entero particular de porciones del fármaco al anticuerpo, es una mezcla potencialrrJente heterogénea donde la porción del fármaco se fija en diversos sitios en el anticuerpo Los métodos analíticos y preparativos son inadecuados para separar y caracterizar las moléculas de especies del conjugado anticuerpo-fármaco dentro de la mezcla heterogénea que resulta a partir de una reacción de la conjugación. Los anticuerpos son las biomoléculas espaciosas, complejas y estructuralmente diversas, a menudo con muchos grupos funcionales reactivos. Sus nuevas actividades con reactivos ligadores y productos intermedios ligadores por el fármaco son dependientes de factores como el pH, concentración, salan concentración y cosolventes. Más aún, el proceso de la conjugación multipaso puede ser no reproducible debido a dificultades en control de las condiciones de reacción y caracterización de reactivos y productos intermedios.
Los tioles de cisteína son el reactivo en el pH neutro, a diferencia de la mayor parte de aminas que son protonadas y menores nucleófilo cerca del pH 7. Tiol ya que libre (RSH, sulfhidrilo) los grupos son relativamente el reactivo, las proteínas! con residuos de cisteína a menudo existen en su forma oxidada como oligómeros unidos al disulfuro o han conectado entre sí internamente sobre grupos del disulfuro. Los grupos del tiol de cisteína del anticuerpo son generalmente más reactivo, es decir más nucleófilo, hacia reactivos de la conjugación del electrófilo que amina del anticuerpo o grupos del hidroxilo. La ingeniería en grupos del tiol de cisteína por la mutación de diversos residuos aminoacídicos de una proteína a aminoácidos de cisteína es potencialmente problemática, particularmente en caso del sin formar pares (Cys libre) residuos o aquellos que son rel ativamente accesibles para reacción u oxidación. En soluciones concentradas de la proteína, si en el periplasma de E. coli, sobrenadantes del cultivo, o parcialmente o proteína completamente purificada, los residuos de Cys sin formar pares en la superficie de la proteína pueden formar pares y oxidarse para formar disulfuros intermoleculares, y por lo tanto dímeros protéicos o multímeros. La formación del dímero del disulfuro hace el nuevo no reactivo de Cys para la conjugación a un fármaco, ligando u otro marcador. Más aún, si la proteína oxidativamente forma un enlace disulfuro intramolecular entre Cys recién manipulado genéticamente y un residuo de Cys existente, tanto los grupos Cys no son disponibles para participación del sitio activo como interacciones. Más aún, la proteína puede volverse inactiva o no específica, por misfolding o pérdida de la estructura terciaria (Zhang y al (2002) Anal. Biochem. 311 :1-9).
Los anticuerpos con substituciones de cisteína (TIOMABS) en sitios donde cisteínas manipuladas genéticamente están disponibles para la conjugación, pero no perturban el plegado de la inmunoglobulina y la unidad o alteran unión del antígeno y funciones efectoras (Junutula, et al., 2008b Naturaleza Biotech., 26 (8):925-932; Doman y al (2009) Sangre 114 (13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; [ O2009/052249). Estos TIOMABS pueden conjugarse luego a fármacos citotóxicos a través de los grupos del tiol de cisteína manipulados genéticamente para obtener Conjugados del fármaco de TioMab (TDC) con la estequiometría uniforme (~2 fármacos por anticuerpo). Los estudios con múltiples anticuerpos dirigidos con especificidad de objetivo en contra de diferentes antígenos han mostrado que TDC son tan eficaces como ADC convencional en modelos del xenoinjerto y se toleran en dosis más elevadas en modelos Dreclínicos relevantes. Los conjugados del fármaco de TioMab se han manipulado genéticamente con la unión del fármaco en diferentes partes del anticuerpo (cadena-ligera- Fab, cadena-pesada-Fab y cadena-pesada-Fc). La estabilidad in vitro & in vivo, la eficacia y las propiedades de la farmacocinética de TDC proporcionan una ventaja exclusiva al convencional ADC debido a su homogeneidad y conjugación específica para el sitio a fármacos citotóxicos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención incluye un anticuerpo aislado manipulado genéticamente con cisteína que comprende un aminoácido de cisteína libre en la cadena pesJda o cadena ligera.
Un aspecto de la invención es un proceso para preparar el anticuerpo aislado manipulado genéticamente con cisteína al mutagenizar una secuencia nucleoacídica de un anticuerpo parental al sustituir uno o más residuos aminoacídicos ; por cisteína para codificar para el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína; la expresión del anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína; y aislamiento del anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína.
Otro aspecto de la invención es un conjugado del anticuerpo aislado manipulado genéticamente con cisteína donde el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de captura, un marcador de detección, una porción del fármaco o un soporte sólido.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1A muestra una representación tridimensional del fragmento de anticuerpo hu4D5Fabv7 derivado por coordenadas de cristal en la radiografía. Las posiciones de la estructura de los residuos de Cys m anipulados genéticamente ejemplificantes de las cadenas pesadas y ligeras se numeran (según un sistema secuencial de numeración).
La Figura IB muestra un esquema de reacción secuencial de numeración (fila superior), que comienza en el extremo N-terminus en comparación con Kabat de numeración el Esquema de Reacción (fila inferior) para 4D5v7faibH. Kabat de numeraciónn inserciones se observan por a, b, c.
Las Figuras 2 A y 2B muestran cuantificaciones de unión con la detección de la absorbancia en 450nm de hu4D5Fabv8 y mutante de Cys hu4D5Fabv8 (TioFab) variantes del fago: (los A) fago-hu4D5Fabv8 no biotinilado y fago-hu4D5Fabv8 biotinilado (B) (B) por el PHESELECTOR realizan ensayos de evaluación para interacciones con el BSA (bar libre), HER2 (bar estriado) o estreptavidina (bar sólido).
Las Figuras 3A y 3B muestran cuantificaciones de unión con la detección de la absorbancia en 450nm de hu4D5Fabv8 (dejado) y mutante de Cys hu4D5Fabv8 (TioFab) variantes: (A) fago-hu4D5Fabv8 no biotinilado y fago-hu4D5Fabv8 biotinilado (B) por el ensayo de PHESELECTOR, para interacciones con: BSA (bar libre), HER2 (bar estriado) y estreptavidina (bar sólido). Las variantes de la cadena ligera están en la izquierda y las variantes de la cadena pesada están en la derecha. Reactividad del tiol = OD450 nm para unión de la estreptavidina = OD4 0 nm para unión de HER2 (anticuerpo).
La Figura 4A muestra valores de Accesibilidad de Superficie Fraccionaria de residuos en hu4D5Fabv8 tipo silvestre. Los sitios de la cadena ligera están a la izquierda y los sitios de la cadena pesada están a la derecha.
La Figura 4B muestra cuantificaciones de unión con la detección de la absorbancia en 450nm de hu4D5Fabv8 biotinilado (dejado) y mutante de Cys hu4D5Fabv8 (TioFab) variantes para interacciones con HER2 (día 2), estreptavidina (SA) (día 2), HER2 (día 4), y SA (día 4). El fago-hu4D5Fabv8 variantes de Cys se aisló y se almacenó en 4 °C. La conjugación de biotina se llevó a cabo en día 2 o en día 4 seguidos por análisis de PHESELECTOR para monitorizar su interacción con Her2 y estreptavidina como se describe en el Ejemplo 2, y sonda la estabilidad de grupos del tiol reactivos en variantes de TioFab manipuladas genéticamente.
La Figura 5 muestra cuantificaciones de unión con la detección de la absorbancia en 450nm de MALEIMIDA-BIOTINA conjugada-hu4D5Fabv8 (A121C) y hu4D5Fabv8 tipo silvestre no biotinilado para la unión a la estreptavidina y HER2. Cada Fab se analizó en 2 ng y 20 ng.
La Figura 6 muestra el análisis del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas con la detección de la absorbancia en 450nm del biotinilado ABP-hu4D5Fabv8 tipo silvestre (peso) y mutantes de cisteína ABP-hu4D5Fabv8 Vl lOC y A121C para la unión con la albúmina del conejo, estreptavidina (SA) y HER2.
La Figura 7 muestra el análisis del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas con la detección de la absorbancia en 450nm de mutantes de cisteína ABP-hu4D5Fabv8 biotinilados (variantes de TioFab): (dejado a derecho) variantes de Cys individuales ABP-Vl 10C, ABP-A121C y dobles variantes de Cys ABP-Vl 10C-A88C y ABP-Vl 10C-A121C para unión con albúmina del conejo, HER2 y estreptavidina (SA), y sondando con Fab-HRP o SA-HRP.
La Figura 8 muestra la unión del fago de TioFab biotinilado y un antifago anticuerpo de HRP a HER2 (parte superior) y Estreptavidina (parje inferior).
La Figura 9A muestra que una descripción del dibujo animado de la unión del anticuerpo biotinilada a HER2 inmovilizado con la unión de HRP marcó el anticuerpo secundario para la detección de la absorbancia.
La Figura 9B muestra que las cuantificaciones de unión con la detección de la absorbancia en 450nm de MALEIMIDA-BIOTINA conjugaron variantes del trastuzumab del tiol y trastuzumab tipo silvestre no biotinilado en la unión a HER2 inmovilizado. De la izquierda a la derecha: Vl lOC (cis individual), A121C (cis individual), V110C/A121C (duplican cis), y el trastuzumab. Cada tiol variante de IgG y trastuzumab se analizó en 1 , 10, y 100 ng.
La Figura 10A muestra una descripción en dibujo d la unión del anticuerpo biotinilada a HER2 inmovilizado con la unión de biotina a anti- gG-HRP para la detección de la absorbancia.
La Figura 10B muestra cuantificaciones de unión con la detección de la absorbancia en 450nm de variantes del trastuzumab del tiol conjugado de MALEIMIDA-BIOTINA y trastuzumab tipo silvestre no biotinilado en la unión a la estreptavidina inmovilizada. De la izquierda a la derecha: Vl lOC (cis individual), A121C (cis individual), V110C/A121C (duplican cis), y el trastuzumab. Cada tiol variante de IgG y trastuzumab se analizó en 1, 10, y 100 ng.
La Figura 11 muestra el proceso general para preparar un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína (TioMab) expresado para del cultivo celular para la conjugación.
DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES EJEMPLIFICANTES Ahora se hará referencia detalladamente a ciertas modalidades de la invención, los ejemplos de que se ilustran en las estructuras acompañantes y sus fórmulas. Aunque la invención se describe junto con las modalidades enumeradas, se entenderá que éstas no se conceptualizan para limitar la invención con aquellas modalidades. Al contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, que puedan incluirse dentro del alcance de la presente invención como se define por las reivindicaciones.
Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, que podría usarse en la práctica de la presente invención. La presente invención de ninguna manera no se limita con los métodos y materiales descritos.
A menos que se defina otra cosa, los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que comúnmente entendido por el experto común en la técnica a la cual esta invención pertenece y es consistente con: Cosa única y al (1994) Diccionario de Microbiología y Biología molecular, 2do editor, J. Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York; y Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, el 5to editor, Garland Publishing, Nueva York.
DEFINICIONES A menos que no se indique otra cosa, los términos y frases que siguen como se utiliza aquí, pretenden tener los siguientes significados: Cuando los nombres comerciales se usen aquí, los solicitantes conceptualizan incluir indistintamente la formulación del producto del nombre comercial, el medicamento genérico y el ingrediente (s) farmacéutico activo del producto delj nombre comercial, El término "anticuerpo" aquí se usa en el sentido más ¡amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclónicos, anticuerpos policlónicos, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos (p.ej, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo, mientras que éstos muestran la actividad biológica deseada (Molinero y al (2003) Jour. de la Inmunología 170:4854-4861). Los anticuerpos pueden ser el murino, el humano, humanizado, quimérico, o derivado de otras especies. Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmunitario que tiene capacidad de reconocimiento y unión a un antígeno específico. (Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, el 5to editor, Garland Publishing, Nueva York). Un antigeno con especificidad de objetivo generalmente tiene diversos sitios de unión, también llamados epítopos, reconocidos por CDR en múltiples anticuerpos. Cada anticueipo que se une de manera específica a un diferente epítopo tiene una diferente estructura. Así, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molécula de la inmunoglobulina de cadena completa o un inmunológicamente la porción activa de una molécula de la inmunoglobulina de cadena completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión al antígeno (parátopo) que inmunoespecíficamente une un antígeno de un objetivo de interés o parte de lo mismo, los objetivos que incluyen entre otros, células cancerígenas o células que producen anticuerpos autoinmunitarios asociados con una enfermedad autoinmunitaria. La inmunoglobulina descrita aquí puede ser de cualquier tipo (p.ej, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (p.ej, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de la molécula de la inmunoglobulina. Las inmunoglob aliñas pueden derivarse de cualquier especie. En un aspecto, sin embargo, la inmunoglobulina es de humano, murino u origen del conejo.
"Los fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de cadena completa, generalmente la unión del antígeno o región variable de lo mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F (ab1) 2, y fragmentos de Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; minicuerpos (Olafsen y al (2004) Eng Protéico. Design & Sel. 17 (4):315-323), fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos (anti-Id) antiidiotipos, CDR (región de determinación complementaria), y fragmentos de unión del epítopo de cualquiera de lo anterior que inmunoespecíficamente se unen con antígenos de células cancerígenas, antígenos virales o antígenos microbianos, moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.
El término "anticuerpo monoclónico" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden a la población son idénticos excepto posibles mutaciones de origen natural que pueden encontrarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclónicos son muy específicos, que se dirige contra un sitio antigénico individual. Más aún, en contraste con preparaciones de anticuerpo policlónicas que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos con especificidad de objetivo contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclónico se dirige contra un determinante individual en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclónicos son ventajosos en que éstos pueden sintetizarse no contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclónico" indica el carácter del anticuerpo como obteniéndose de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe ser interpretado como el requerimiento de la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclónicos para usarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por el método del hibridoma primero descrito por Kohler y al (1975) Naturaleza 256:495, o pueden elaborarse por métodos del ADN recombinante (ver por ejemplo: US 4816567; US 5807715). Los anticuerpos monoclónicos también pueden aislarse de genotecas del anticuerpo del fago al usar los métodos descritos en Clackson y al (1991) Naturaleza, 352:624-628; Marcas y al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597; por ejemplo.
Los anticuerpos monoclónicos aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" donde una porción del pesado y/o cadena ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciendo a una clase del anticuerpo particular o subclase, mientras el resto de la cadena (s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o perteneciendo a otra clase del anticuerpo o subclase, así como fragmentos de los anticuerpos, mientras que éstos muestran la actividad biológica deseada (US 4816567; y Morrison y al (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855). Los anticuerpos quiméricos de interés aquí incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión del antígeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (p.ej, Chango de Viejo Mundo, Mono etc.) y secuencias de la región constante humanas.
Un "anticuerpo intacto" aquí está el que que comprend ee unos dominios del VL y VH, así como un dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia de origen natural (p.ej, dominios constantes de la secuencia de origen natural humanos) o variante de la secuencia aminoacídica de lo mismo. El anticuerpo intacto puede tener uno o más "funciones efectoras" que se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región constante de Fe (una región Fe de la secuencia de origen natural o región Fe variante de la secuencia aminoacídica) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen la unión Clq; complemente la citotoxicidad dependiente; unión al receptor Fe; citotoxicidad regulada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; y abajo regulación de receptores de la superficie celular como receptor del linfocito B y BCR.
Según la secuencia aminoacídica del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases". Hay cinco tipos principales de anticuerpos de la inmunoglobulina intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM y varios de éstos pueden dividirse adicionalmente en "subclases" (isotipos), p.ej, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras subunitarias 1 y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son conocidas. Formas de Ig incluyen modificaciones de la bisagra o formas sin bisagra (Roux y al (1998) J. Immunol. 161 :4083-4090; Lund y al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310).
Un "receptor de ErbB" es una tirosina cinasa de la proteína del receptor que pertenece a la familia del receptor de ErbB cuyos miembros son mediadores importantes de crecimiento celular, diferenciación y supervivencia. La familia del receptor de ErbB incluye a cuatro miembros distintos que incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbBl, HERI), HER2 (ErbB2 o pl85neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2). Un panel de anticuerpos anti-ErbB2 se ha caracterizado al usar la línea de la célula tumoral de pecho humana SKBR3 (Hudziak y al (1989) Mol. Célula. Biol. 9 (3): 1 165-1 172. La inhibición máxima se obtuvo con el anticuerpo llamado 4D5 que inhibió la proliferación celular en el 56%. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular en menor grado en este ensayo. El anticuerpo 4D5 era adicionalmente descubrió para sensibilizar la ErbB2-sobreexpresión de líneas de la célula tumoral de pecho a los efectos .citotóxicos de TNF-a (US 5677171). Mencionan de los anticuerpos anti-ErbB2 en Hudziak et al. se caracterizan adicionalmente en Fendly y al (1990) Investigación de cáncer 50:1550-1558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26 (3):59A; Sarup et al. (1991) la Regulación 1 :72-82 de Crecimiento; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 1 1 (3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Célula. Biol. 11 (2):979-986; Lewis et al. (1993) Cáncer Immunol.
Immunoter. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogén 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Investigación de cáncer 54:5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (20): 14661 -14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14300-5; D'souza et al. Proc. Nati. Acad. Sci. (1994) 91 :7202-7206; Lewis et al. (1996) Investigación de cáncer 56:1457-1465; y Schaefer et al. (1997) Oncogén 15:1385-1394.
El receptor de ErbB comprenderá generalmente un dominio extracelular, que puede unir un ligando de ErbB; un dominio transmembranal lipofílico; un dominio de la tirosina cinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización terminal por el carboxilo que alberga varios residuos de tirosina que pueden fosforilarse. El receptor de ErbB puede ser una "secuencia de origen natural" receptor de ErbB o una "variante de la secuencia aminoacídica" de lo mismo. Preferentemente, el receptor de ErbB es el humano de la secuencia de origen natural receptor de ErbB. En consecuencia, un "miembro de la familia del receptor de ErbB" incluye EGFR (ErbBl), ErbB2, ErbB3, ErbB4.
El término "de la secuencia aminoacídica de la variante" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias aminoacídicas que se diferencian hasta cierto punto de un polipéptido de la secuencia de origen natural. Generalmente, las variantes de la secuencia aminoacídica poseerán al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia con al menos un dominio de unión del receptor de un ligando de ErbB de origen natural o con al menos un dominio de unión al ligando de un receptor de ErbB de origen natural, y preferentemente, éstos serán al menos aproximadamente el 80%, más preferentemente, al menos aproximadamente el 90% homólogos por la secuencia con el receptor o dominios de unión al ligando. Las variantes de la secuencia aminoacídica poseen substituciones, eliminación y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia aminoacídica de la secuencia aminoacídica de origen natural. Los aminoácidos son designados por los nombres convencionales, una letra y códigos de tres letras.
"La identidad de secuencia" se define como el porcentaje de residuos en la variante de la secuencia aminoacídica que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir separaciones, si es necesario, para lograr la identidad de secuencia del por ciento máxima. Los métodos y los programas informáticos para la alineación son conocidos en la técnica. Un el programa informático es "Align 2," publicado por Genentech, Inc., que se presentó con la documentación del usuario en la Oficina de derechos de autor de los Estados Unidos, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991.
"Los anticuerpos de origen natural" son glucoproteínas por lo general heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de la inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulftiro intracatenarios con regularidad separados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante a su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos aminoacídicos particulares forman una interconexión entre la cadena ligera y dominios variables de cadena pesada.
El término "variable" se refiere al hecho que las ciertas porciones de los dominios variables se diferencian exhaustivamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad regularmente no se distribuye durante todo los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamadas regiones hipervariables tanto en la cadena ligera cómo en los dominios variables de cadena pesada. Las porciones más muy conservadas de dominios variables se llaman las regiones base (FRs). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras de origen natural cada uno comprende cuatro FRs, en gran parte adoptando una configuración ß-sheet, conectada por tres regiones hipervariables, que forman la unión de asas, y en algunos casos ser parte de, la estructura ß- sheet. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen conjuntamente en contigüidad por el FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (parátopo) de anticuerpos (ver Kabat y al (1991) Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, 5to Servicio de la Salud pública del editor, Institutos Nacionales de la Salud, Betesda, Mariland). Los dominios constantes no se implican directamente en la unión un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en el dependiente del anticuerpo citotoxicidad celular (ADCC).
El término "región hipervariable" cuando usado aquí se refiere a los residuos aminoacídicos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos aminoacídicos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (p.ej, residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31 -35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al supra) y/o aquellos residuos de una "asa hipervariable" (p.ej, residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chotia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917). "La Región base" o los residuos "de FR" están aquellos residuos del dominio variable además de los residuos de la región hipervariable como aquí definido.
La digestión de la papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", a cada uno con un sitio de unión al antígeno (parátopo) individual y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizarse fácilmente. El tratamiento de la pepsina produce un F (ab') 2 fragmento que tiene dos sitios de unión al antígeno (parátopos) y todavía es capaz de entrecruzar el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento del antígeno completo y sitio de unión al antígeno (parátopo). Esta región comprende un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera en la asociación apretada, no covalente. Está en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno (parátopo) en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren la especificidad de unión por el antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable individual (o mitad de Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el antígeno, aunque en una afinidad inferior que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Fab' fragmentos diferencian de fragmentos Fab mediante la adición de unos residuos en el terminal carboxi de la cadena pesada el dominio de CH1 que incluye uno o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab '-SH está la designación aquí para Fab' donde el residuo (s) de cisteína de los dominios constantes alberga al menos un grupo del tiol libre. F (ab') 2 fragmentos de anticuerpo al principio se produjeron ya que los pares de Fab' fragmentos que tienen cisteínas de la bisagra entre ellos. Otras copulaciones químicas de fragmentos de anticuerpo también son conocidas.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamado kappa (?) y lambda (?), basado en las secuencias aminoacídicas de sus dominios constantes.
"Fv monocatenario" o los fragmentos de anticuerpo "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, donde estos dominios se encuentran en una cadena polipeptídica individual. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende además un ligador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de scFv, ver Plücktun en La Farmacología de Anticuerpos monoclónicos, volumen 1 13, Rosenburg y los editores de Moore, Springer-Verlag, Nueva York, pps 269-315 (1994). El anticuerpo de Anti-ErbB2 y los fragmentos scFv se describen en WO 93/16185; Números de la Patente de E.U. 5571894; y 5587458.
Formas "humanizadas" del no humano (p.ej, roedor) los anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. La humanización es un método de transferir la información de unión del antígeno del murino a un aceptador del anticuerpo humano no inmunogénico y ha dado como, resultado muchos fármacos terapéuticamente útiles. El método de humanización generalmente comienza al transferir seis regiones determinantes de complementariedad del murino (CDR) en un marco del anticuerpo humano (Jones y al, (1986) Naturaleza 321 :522-525). Estos anticuerpos injertados con una región determinante de complementariedad generalmente no mantienen su afinidad original para la unión del antígeno, y de hecho, la afinidad a menudo con severidad se disminuye. Además de las CDR, los residuos del marco del anticuerpo no humanos selectos también deben incorporarse donde se mantienen la conformación de la CDR apropiada (Chotia y al (1989) Naturaleza 342:877). La transferencia de residuos del marco de ratón claves del aceptador humano a fin de apoyar la conformación estructural de las CDR injertadas se ha mostrado para restaurar la unión del antígeno y la afinidad (Riechmann y al (1 92) J. Mol. Biol. 224, 487-499; Foote e Invierno, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; presta, y al (1993) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werter y al (1996) J. Immunol. Métodos 157:4986-4995; y Presta, y al (2001) Thromb. Haemost. 85:379-389). En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) donde los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo del donante) como el ratón, la rata, el conejo o el primate no humano que tienen la especificidad deseada, afinidad y capacidad. En algunos casos, los residuos de la región base (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos Más aún, humanizados pueden comprender residuos que no son descubrió en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se elaboran para retinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo» En términos generales, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo al menos un, y pór lo común dos, dominios variables, donde todos o sustancialmente todas las asas hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fe), por lo común esa de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver US 6407213; Jones y al (1986) Naturaleza, 321 :522-525; Riechmann y al (1988) Naturaleza 332:323-329; y Presta., (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596.
Un "aminoácido de cisteina libre" se refiere a un residuo aminoacídico de cisteina que tiene manipulado genéticamente en un anticuerpo parental, tiene un grupo funcional del tiol (-SH) y no se forma pares como un puente disulfuro intramolecular o intermolecular.
El término "valor de la reactividad del tiol" es una caracterización cuantitativa de la reactividad de aminoácidos de cisteina libres. El valor de la reactividad del tiol es el porcentaje de un aminoácido de cisteina libre en un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteina que reacciona con un reactivo con reactividad al tiol, y convertido a un valor máximo de 1. Por ejemplo, un aminoácido de cisteina libre en un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteina que reacciona en la producción del 100% con un reactivo con reactividad al tiol, como un reactivo de MALEIMIDA-BIOTINA, para formar un anticuerpo marcado con biotina tiene un valor de la reactividad del tiol de 1.0. Otro aminoácido de cisteína manipulado genéticamente en el anticuerpo parental igual o diferente que reacciona en la producción del 80% con un reactivo con reactividad al tiol tiene un valor de la reactividad del tiol de aproximadamente 0.8. Otro aminoácido de cisteína manipulado genéticamente en el anticuerpo parental igual o diferente que deja totalmente de reaccionar con un reactivo con reactividad al tiol tiene un valor de la reactividad del tiol de 0. La determinación del valor de la reactividad del tiol de cisteína particular puede llevarse a cabo por ensayo del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, espectrometría de masas, cromatografía líquida, autoradiografía u otras pruebas analíticas cuantitativas.
Un "anticuerpo parental" es un anticuerpo que comprende una secuencia aminoacídica de la cual los uno o más residuos aminoacídicos son sustituidos por uno o más residuos de cisteína. El anticuerpo parental puede comprender una secuencia de origen natural o tipo silvestre. El anticuerpo parental puede tener modificaciones de la secuencia aminoacídica preexistentes (el como adiciones, eliminación y/o substituciones) con relación a otras formas de origen natural, tipo silvestres, o modificadas de un anticuerpo. Un anticuerpo parental puede dirigirse contra un antígeno con especificidad de objetivo de interés, p.ej un polipéptido biológicamente importante. Anticuerpos dirigidos con especificidad de objetivo contra antígenos no polipeptídicos (el como antígenos del glucolípido tumorales y asociados; ver US 5091178) también son contemplados.
Los anticuerpos parentales ejemplificantes incluyen anticuerpos que tienen la afinidad y la selectividad para superficie celular y receptores transmembranales y antígenos asociados al tumor (TAA).
Un anticuerpo "aislado" es uno que tiene identificado y separado y/o se repuso de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes del. contaminante de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con de diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) al mayor que el 95% en peso del anticuerpo como se determina mediante el método de Lowry, y con mayor preferencia más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna por el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) a la homogeneidad por el SDS-PAGE bajo reducir o no condiciones de reducción al usar Coomassie azul o, preferentemente, mancha de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células del recombinante ya que al menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no se encontrará. Generalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo "que une" un objetivo molecular o un antígeno de interés, p.ej, antígeno de ErbB2, es una capaz de la unión que el antígeno con la afinidad suficiente el que el anticuerpo es útil en la acción selectiva de una célula que expresa para el antígeno. Donde el anticuerpo es el que que une ErbB2, unirá por lo general preferentemente ErbB2 a diferencia de otros receptores de ErbB, y puede ser el que que no reacciona en forma cruzada considerablemente con otras proteínas como EGFR, ErbB3 o ErbB4. En las modalidades, el grado de unión del anticuerpo a estas proteínas non-ErbB2 (p.ej, unión de la superficie celular al receptor endógeno) será menor que el 10% como se determina mediante el análisis del citofluorímetro de flujo (FACS) o radioinmunoprecipitación (radioinmunoensayo). A veces, el anticuerpo anti-ErbB2 no reaccionará en forma cruzada considerablemente con la rata neu la proteína, p.ej, como se describe en Schecter et al. (1984) Naturaleza 312:513 y Drebin y al (1984) Naturaleza 312:545-548.
Los objetivos moleculares para anticuerpos abarcados por la presente invención incluyen proteínas de CD y sus ligandos, el como, entre otros: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79B (CD79a), y CD79p (CD79b); (ii) miembros de la familia del receptor de ErbB como el receptor EGF, HER2, HER3 o receptor HER4; (iii) moléculas de la adherencia celular como LFA-1 , Macl , pl 50,95, VLA-4, ICAM-1 , VCAM y ß-integrina, incluyendo alfa o subunidades de la beta de lo mismo (p.ej anti-CDl l a, anti-CD18 o anticuerpos anti-CDl Ib); (iv) factores de crecimiento como VEGF; IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptor de flk2/flt3; obesidad (OB) receptor; receptor de mpl; CTLA-4; proteína C, BR3, c-met, factor tisular, ß7 etc.; y (v) superficie celular y antígenos asociados al tumor (TAA) transmembranales.
A menos que no indicado otra cosa, el término "4D5 del anticuerpo monoclónico" se refiere a un anticuerpo que tiene residuos de unión del antígeno de, o derivado de, el murino 4D5 anticuerpo (ATCC CRL 10463). Por ejemplo, el anticuerpo monoclónico 4D5 puede ser el anticuerpo monoclónico del murino 4D5 o una variante de lo mismo, tal como un humanizado 4D5. Ejemplificante humanizado 4D5 los anticuerpos incluyen huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (trastuzumab, HERCEPTIN®) como en la Patente de E.U. núm. 5821337.
Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, donde el objeto debe impedir o reducir la velocidad (disminuyen) un cambio fisiológico indeseado o trastorno, como el desarrollo o la diseminación de cáncer. Los resultados clínicos Para propósitos de esta invención, beneficiosos o deseados incluyen, entre otras cosas, el alivio de síntomas, la disminución del grado de la enfermedad, estabilizada (es decir, no empeorándose) el estado de enfermedad, retraso o reduciendo de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad y remisión (o parcial o total), o detectable o no detectable. "El tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia supervivencia en comparación con prevista sin recibir el tratamiento. Aquellos en la necesidad del tratamiento incluyen a aquellos ya con la afección o trastorno así como los propensos para tener la afección o trastorno o aquellos donde la afección o el trastorno son evitarse.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectivo a tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir la cantidad de células cancerígenas; reduzca el tamaño tumoral; la inhibición {es decir, lento hasta cierto punto y preferentemente finalizan) la infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos; la inhibición {es decir, lento hasta cierto punto y preferentemente finalizan) la metástasis tumoral; inhibición, hasta cierto punto, crecimiento tumoral; y/o alivie hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con cáncer. Al grado el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o eliminar células cancerígenas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia puede cuantificarse, por ejemplo, al evaluar el período de tiempo a la progresión de la enfermedad (TTP) y/o al determinar la tasa de respuesta (RR).
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que es por lo común caracterizado por el crecimiento celular no regulado. "tumor" comprende uno o más células cancerosas. Los ejemplos de cáncer incluyen, entre otras cosas, carcinoma, linfoma, blastema, sarcoma, y leucemia o neoplasias malignas linfoides. Más ejemplos particulares de cánceres incluyen cáncer de la célula escamosa {p.ej. Cáncer de la célula escamosa epitelial), cáncer de pulmón que incluye cáncer pulmonar de células pequeñas - cáncer pulmonar de células no pequeñas ("NSCLC"), adenocarcinoma de carcinoma pulmonar y escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, gástrico o cáncer del estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de la vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer del colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de la glándula salival, cáncer renal o renal, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, así como cáncer de la cabeza y cuello.
Una "ErbB-expresión de cáncer" es la que que comprende células que tienen el presente de la proteína de ErbB en su superficie celular. Una "ErbB2-expresión de cáncer" es la que que produce niveles suficientes de ErbB2 en la superficie de células de lo mismo, el que un anticuerpo anti-ErbB2 puede unir al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto a cáncer.
Cáncer que "sobreexpresa para" un receptor antigénico es uno que tiene niveles considerablemente más altos del receptor, como el ErbB2, en la superficie celular de lo mismo, comparado con una célula no cancerosa del mismo tipo tisular. La sobreexpresión puede ser causada por amplificación génica o transcripción aumentada o traducción. La sobreexpresión del receptor puede determinarse en un ensayo de diagnóstico o de pronóstico al evaluar mayores niveles de la proteína del receptor la superficie presente en de una célula (p.ej, vía un ensayo de la inmunohistoquímica; IHC). Alternativamente, o además, uno puede cuantificar niveles del ácido nucleico que codifica para el receptor en la célula, p.ej, vía hibridación in situ fluorescente (FISH; ver WO 98/45479), el ensuciamiento del sur o métodos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como el PCR cuantitativo de tiempo real (RT-PCR).
El término "citotóxico de agente" como se utiliza aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de células. El término pretende incluyen isótopos radiactivos (p.ej, 211At, 1311, 1251, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212BÍ, 32P, 60C, e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos y toxinas como toxinas de la molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas del origen bacteriano, fúngico, vegetal o de animal, incluyendo análogos sintéticos y derivados de lo mismo.
"El despliegue de fagos" es un método por el cual los polipéptidos variantes se muestran como proteínas de fusión a una proteína de la capa en la superficie de fago, p.ej, fago filamentoso, partículas. Una utilidad del despliegue de fagos apoya en el hecho que las genotecas espaciosas de variantes protéicas aleatorizadas pueden rápidamente y eficazmente clasificarse para aquellas secuencias que se unen con una molécula con especificidad de objetivo con la elevada afinidad. La pantalla de genotecas peptídicas y protéicas del fago se ha usado para seleccionar millones de polipéptidos para con propiedades de la unión específica. Los métodos del despliegue de fagos polivalentes se han usado para mostrar pequeños péptidos aleatorios y pequeñas proteínas, por lo común a través de fusiones a pIII o a pVIII del fago filamentoso (Wells y Lowman, (1992) Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362, y referencias citadas en esa parte). En el despliegue de fagos monovalentes, una genoteca protéica o peptídica es fusionada a una proteína de la capa del fago o una porción de lo mismo, y expresada para en bajos niveles en la presencia de la proteína tipo silvestre. Los efectos de la avidez se reducen con relación al fago polivalente de modo que clasificar sea sobre la base de la afinidad del ligando intrínseca, y los vectores del fagómido se usan, que simplifican manipulaciones de DNA. Lowman y Wells, Métodos: Un compañero a Métodos en Enzimología, 3:205-0216 (1991). El despliegue de fagos incluye métodos para producir moléculas parecidas a un anticuerpo (Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, el 5to editor, Garland Publishing, Nueva York, p627-628; Sotavento y al).
Un "fagómido" es un vector plásmido que tiene un origen de replicación bacteriano, p.ej, Col El y una copia de una región intergénica de un bacteriófago. El fagómido se puede usar en cualquier bacteriófago conocido, incluyendo el bacteriófago filamentoso y el bacteriófago lambdoid. El plásmido también contendrá generalmente un marcador seleccionable para la resistencia de antibiótico. Los segmentos de DNA clonado en estos vectores pueden propagarse como plásmidos. Cuando las células que albergan estos vectores se proporcionan con todos los genes necesarios para la producción de partículas del fago, el modo de replicación de los cambios plásmidos en la replicación del círculo rodante para generar copias de una hebra del ADN plásmido y partículas del fago del envase. El fagómido puede formar partículas del fago infecciosas o no infecciosas. Este término incluye fagómidos que contienen el gen protéico de la capa de un fago o el fragmento de lo mismo unido a un gen del polipéptido heterólogo como una fusión génica el que el polipéptido heterólogo se muestra en la superficie de la partícula del fago.
"El ligador", "la Unidad Ligador" o "enlace" significa una porción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente un anticuerpo a una porción del fármaco. En diversas modalidades, un ligador se especifica como L. Los ligadores incluyen a un radical divalente como alquilidilo, un arileno, heteroarileno, porciones el como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades repetidas de alquiloxi (p.ej polietilenoxilo, PEG, polimetileneoxilo) y alquilamino (p.ej polietileneamino); y éster del diácido y amidas que incluyen succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida.
"Marcador" del término significa cualquier porción que pueda unirse covalentemente a un anticuerpo y esto funciona a: (los i) proporcionan una señal detectable; (ii) interactúan con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primer o segundo marcador, p.ej FRET (energía de la resonancia de la fluorescencia se trasladan); (iii) estabilizan interacciones o afinidad de aumento de la unión, con antígeno o ligando; (iv) afectan la movilidad, la movilidad p.ej electroforética o la permeabilidad celular, por carga, hidrofobicidad, forma, u otros parámetros físicos, o (v) proporcionan una porción de captura, para modular la afinidad del ligando, la unión del anticuerpo/antígeno o la formación de complejos iónica.
Las definiciones estereoquímicas y las convenciones usadas aquí generalmente siguen S. P. Parker, editor, Diccionario de McGraw-Hill de Términos Químicos (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Estereoquímica de Compuestos orgánicos (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, éstos tienen la capacidad de hacer girar el plano de la luz polarizada por el plano. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se utilizan denotan la configuración absoluta de la molécula sobre su centro (s) quiral. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de la luz polarizada por el plano por el compuesto, con (-) o 1 significar que el compuesto es levorotatorio. Un compuesto prefijado con (+) o d es dextrorotatorio. Para una estructura química determinada, estos estereoisómeros son idénticos salvo que éstas son imágenes especulares el uno del otro. Un estereoisómero específico también puede referirse como un enantiómero, y una mezcla de los isómeros a menudo es llamada una mezcla enantiomérica. Un 50:50 la mezcla de enantiómeros se refiere como una mezcla racémica o un racemato, que puede ocurrir donde no hubo ninguna estereoselección o estereoespecificidad en una reacción química o proceso. Los términos "racémica de mezcla" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, carentes de la actividad óptica.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable," como se utiliza aquí, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un ADC. Las sales ejemplificantes incluyen, entre otras cosas, a sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinate, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tannate, pantotenato, bitartrate, ascorbato, succinato, maleato, gentisinate, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metansulfonato, etansulfonato, bencensulfonato, p-toluensulfonato y pamoato (es decir, 1 ,1 ' metileno bis - (2 hidroxilo 3 naphtoate)) sales. Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula como un ión de acetato, un ión del succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier porción orgánica o inorgánica que estabilice la carga en el compuesto parental. Más aún, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los casos donde múltiples átomos cargados son la parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraión.
"El solvato farmacéuticamente aceptable" se refiere a una asociación de uno o más moléculas solventes y un ADC. Los ejemplos de solventes que forman solvatos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otras cosas, el agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato etílico, ácido acético y etanolamina.
ANTICUERPOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE CON CISTEÍNA Los compuestos de la invención incluyen anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína donde los uno o más aminoácidos de un anticuerpo natural o parental son sustituidos con un aminoácido de cisteína. Cualquier forma del anticuerpo puede ser tan manipulada genéticamente, es decir mutó. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de Fab parental puede manipularse genéticamente para formar Fab manipulado genéticamente con cisteína, referido a aquí como "TioFab". De forma similar, un anticuerpo monoclónico parental puede manipularse genéticamente para formar un "TioMab". Débase observar que unas producciones de la mutación del sitio individuales un residuo de cisteína manipulado genéticamente individual en TioFab, mientras una mutación del sitio individual produce dos residuos de cisteína manipulados genéticamente en TioMab, debido a la naturaleza dimérica del anticuerpo IgG. Los mutantes con cisteína ("manipulada genéticamente") sustituida (Cys) residuos se evalúan para la reactividad de los grupos del tiol de cisteína recién introducidos, manipulados genéticamente. El valor de la reactividad del tiol es un término relativo, numérico en el intervalo de 0 a 1.0 y puede cuantificarse para cualquier anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína. Los valores de la reactividad del tiol de anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína de la invención están en los intervalos de 0.6 a 1.0; 0.7 a 1.0; o 0.8 a 1.0.
El diseño, la selección y los métodos de preparación de la invención permiten anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína que son el reactivo con la funcionalidad del electrófílo. Estos métodos adicionalmente permiten compuestos del conjugado del anticuerpo como compuestos del conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) con moléculas del fármaco en sitios designados, diseñados, selectivos. Los residuos de cisteína reactivos en una superficie del anticuerpo permiten específicamente conjugar una porción del fármaco a través de un grupo reactivo del tiol como maleimida o haloacetilo. La reactividad nucleófila de la funcionalidad del tiol de un residuo de Cys de un grupo de maleimida es de aproximadamente 1000 veces mayor comparado con cualquier otra funcionalidad aminoacídica en una proteína, como el grupo amino de residuos de la lisina o el grupo amino N-terminal. La funcionalidad específica del tiol en iodoacetilo y reactivos de maleimida puede reaccionar con grupos de la amina, pero el pH más elevado (> 9.0) y tiempos de reacción más largos se requiere (Garman, 1997, Etiquetaje No radiactivo: Un Enfoque Práctico, Edición académica, Londres).
Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína de la invención preferentemente mantienen la capacidad de unión del antígeno de sus ejemplares del anticuerpo tipo silvestres, parentales. Así, los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína tienen capacidad de la unión, preferentemente específicamente, a antígenos. Los antí genos incluyen, por ejemplo, antígenos asociados al tumor (TA A), proteínas del receptor de la superficie celular y otras moléculas de la superficie celular, proteínas transmembranales, proteínas de señales, supervivencia celular factores reguladores, proliferación celular factores reguladores, moléculas asociadas con (para p.ej, conocido o sospechado contribuir funcionalmente a) desarrollo tisular o diferenciación, linfocinas, citocinas, moléculas implicadas en la regulación del ciclo celular, moléculas implicadas en vasculogénesis y moléculas asociadas con (para p.ej, conocido o sospechado contribuir funcionalmente a) angiogénesis. El antígeno asociado al tumor puede ser un factor de diferenciación del conglomerado (es decir, una proteína de CD). Un antígeno al cual un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína tiene capacidad de la unión puede ser un miembro de un subconjunto de una de las categorías anteriormente mencionadas, donde el otro subconjunto (s) de la categoría comprende otras moléculas/antígenos que tienen una característica distinta (con respecto al antígeno de interés).
El anticuerpo parental también puede ser un anticuerpo humanizado seleccionado de huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (Trastuzumab, HERCEPTIN®) como se describe en la Tabla 3 de US 5821337, expresamente incorporado aquí por referencia; humanizado 520C9 (WO 93/21319) y humanizado 2C4 anticuerpos como se describe aquí.
Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína de la invención pueden ser el sitio específicamente y eficazmente copulado con un reactivo con reactividad al tiol. El reactivo con reactividad al tiol puede ser un reactivo ligador multifuncional, una captura, es decir afinidad, reactivo del marcador (p.ej un reactivo ligador por biotina), un marcador de detección (p.ej un reactivo del fluoróforo), un reactivo de la inmovilización en fase sólida (p.ej. SEPHAROSE™, poliestireno o cristal), o un producto intermedio ligador por el fármaco. Un ejemplo de un reactivo con reactividad al tiol es la Maleimida de N-etilo (NEM). En una modalidad ejemplificante, la reacción de TioFab con un reactivo ligador por biotina proporciona TioFab biotinilado por el cual la presencia y la reactividad del residuo de cisteína manipulado genéticamente pueden detectarse y cuantificado. La reacción de TioFab con un reactivo ligador multifuncional provee TioFab de un ligador funcionalizado que puede reaccionarse adicionalmente con un reactivo de la porción del fármaco u otro marcador. La reacción de TioFab con un producto intermedio ligador por el fármaco proporciona un conjugado del fármaco de TioFab.
Los métodos ejemplificantes descritos aquí pueden aplicarse generalmente a la identificación y la producción de anticuerpos, y más generalmente, a otras proteínas a través de la solicitud del diseño y etapas de prueba de detección descritas aquí.
Un enfoque puede aplicarse a la conjugación de otros agentes reactivos del tiol donde el grupo reactivo es, por ejemplo, maleimida, iodoacetamida, un disulfuro de piridilo u otro colaborador de la conjugación reactivo por el tiol (Haugland, 2003, el Libro de instrucciones de Sondas Molecular de Sondas Fluorescentes y Productos químicos de Investigación, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Etiquetaje No radiactivo: Un Enfoque Práctico, Edición académica, Londres; Medios (1990) Bioconjugate Chem. 1 :2; Hermanson, G. en Métodos Bioconjugate (1996) Edición académica, San Diego, pps 40-55, 643-671). El colaborador puede ser un agente citotóxico (p ej. una toxina como doxorubicina o toxina pertussis), un fluoróforo como un tinte fluorescente fluoresceína similar o rodamina, un agente quelante para formación de imágenes o metal radioterapéutico, un peptidilo o marcador del no peptidilo o marcador de detección o un agente que modifica la depuración como diversos isómeros del polietilenglicol, un péptido que se une con un tercer componente, u otro carbohidrato o agente lipofílico.
Los sitios se identificaron en el fragmento de anticuerpo ejemplificante, hu4D5Fabv8, aquí está principalmente en el dominio constante de un anticuerpo que es el pocilio conservado a través de todas las especies de anticuerpos. Estos sitios deberían ser ampliamente aplicables a otros anticuerpos, sin necesidad adicional del diseño estructural o conocimiento de estructuras del anticuerpo específicas, y sin la interferencia en las propiedades de unión del antígeno inherentes a los dominios variables del anticuerpo.
Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína que pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer incluyen, entre otras cosas, anticuerpos dirigidos con especificidad de objetivo en contra de receptores de la superficie celular y antígenos asociados al tumor (TAA). Los anticuerpos se pueden usar como anticuerpos desnudos (no conjugado a un fármaco o porción del marcador) o como conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la Fórmula I. Los antígenos asociados al tumor se conocen en la técnica, y puede preparado a usarlos en la generación de anticuerpos al usar métodos e información que son conocidos en la técnica. En tentativas de descubrir objetivos celulares efectivos para diagnóstico de cáncer y terapia, los investigadores han procurado identificarse transmembranal o polipéptidos otra cosa tumorales y asociados que específicamente se expresan para en la superficie del uno o más tipo (s) particular de células cancerígenas en comparación con en la uno o más célula (s) no cancerosa normal. A menudo, los polipéptidos tumorales y asociados más en abundancia se expresan para en la superficie de las células cancerígenas en comparación con en la superficie de las células no cancerosas. La identificación de los polipéptidos del antígeno de la superficie celular tumorales y asociados ha dado origen a la capacidad de apuntar con especificidad de objetivo específicamente células cancerígenas para la destrucción vía terapias basadas en el anticuerpo.
Los ejemplos de TAA incluyen, entre otras cosas, TAA (1) - (36) enumerado menor a. Para conveniencia, información que se relaciona con estos antígenos, de los cuales todos se conocen en la técnica, se enumera menor a e incluye nombres, nombres alternativos, números de acceso de Genbank y referencia (s) primaria, siguiente ácido nucleico y convenciones de identificación de la secuencia protéicas del' Centro Nacional de la información de la Biotecnología (NCBI). El ácido nucleico y las secuencias protéicas correspondiente a TAA (1) - (36) están disponibles en bases de datos públicas como GenBank. Los antígenos asociados al tumor apuntados con especificidad de objetivo por anticuerpos incluyen todas las variantes de la secuencia aminoacídica e isoformas que poseen al menos aproximadamente el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, o 95% de identidad de secuencia con relación a las secuencias identificadas en las referencias citadas, o que muestran sustancialmente las mismas propiedades biológicas o características que un TAA que tiene una secuencia descubrió en las referencias citadas. Por ejemplo, un TAA que tiene una secuencia variante generalmente es capaz de unirse específicamente un anticuerpo que se une específicamente el TAA con la secuencia correspondiente enumerada. Las secuencias y la descripción en la referencia específicamente mencionada aquí expresamente se incorporan por referencia.
ANTÍGENOS ASOCIADOS AL TUMOR (1) - (36): (1) BMPR1B (receptor protéico morfogenético óseo tipo IB, Número de acceso de Genbank NM 001203) diez Dijke, P., et al Science 264 (5155): 101-104 (1994), Oncogén 14 (11):1377-1382 (1997)); WO2004063362 (la Reivindicación 2); WO2003042661 (la Reivindicación 12); US2003134790-A1 (la Página 38-39); WO2002102235 (la Reivindicación 13; la Página 296); WO2003055443 (la Página 91-92); WO200299122 (Ejemplo 2; la Página 528-530); WO2003029421 (la Reivindicación 6); WO2003024392 (la Reivindicación 2; Figura 112); WO200298358 (la Reivindicación 1 ; la Página 183); WO200254940 (la Página 100-101); WO200259377 (la Página 349-350); WO200230268 (la Reivindicación 27; la Página 376); WO200148204 (Ejemplo; Figura 4); hueso de NP_001 194 receptor proteico morfogenético, tipo IB/pid=NP_001 194.1. Remisiones: MIM:603248; NP_001194.1 ; AY065994 (2) El 6 (LATI, SLC7A5, Número de acceso de Genbank NM 003486) Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Naturaleza 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., y al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16): 1 1267-11273); WO2004048938 (Ejemplo 2); WO2004032842 (Ejemplo IV); WO2003042661 (la Reivindicación 12); WO2003016475 (la Reivindicación 1); WO200278524. (Ejemplo 2); WO200299074 (la Reivindicación 19; la Página 127-129); WO200286443 (la Reivindicación 27; las Páginas 222, 393); WO2003003906 (la Reivindicación 10; la Página 293); WO200264798 (la Reivindicación 33; la Página 93-95); WO200014228 (la Reivindicación 5; la Página 133-136); US2003224454 (Figura 3); WO2003025138 (la Reivindicación 12; la Página 150); familia portadora del soluto de NP 003477 7 (transportador aminoacídico catiónico, y+system), miembro 5/pid=NP_003477.3 - Homo sapiens; remisiones: MIM:600182; NP_003477.3; NM 015923; NM_003486_1 (3) STEAP1 (antígeno epitelial seis transmembranal de próstata, Número de acceso de Genbank NM_012449); Cáncer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., y al (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528); WO2004065577 (la Reivindicación 6); WO2004027049 (Figura 1L); EP 1394274 (Ejemplo 1 1); WO2004016225 (la Reivindicación 2); WO2003042661 (la Reivindicación 12); US2003157089 (Ejemplo 5); US2003185830 (Ejemplo 5); US2003064397 (Figura 2); WO200289747 (Ejemplo 5; la Página 618-619); WO2003022995 (Ejemplo 9; Figura 13 A, Ejemplo 53; la Página 173, Ejemplo 2; Figura 2A); NP 036581 seis antígeno epitelial transmembranal de la próstata Remisiones: MIM:604415; NP_036581.1 ; NM_012449_1 (4) 0772P (CA125, MUC16, Número de acceso de Genbank AF361486); J. Biol.
Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); WO2004045553 (la Reivindicación 14); WO200292836 (la Reivindicación 6; Figura 12); WO200283866 (la Reivindicación 15; la Página 116-121); US2003124140 (Ejemplo 16); remisiones: GI:34501467; AA 74120.3; AF361486_1 (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador megacariocítico, mesotelina, Número de acceso de Genbank NM_005823) Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20): 11531-11536 (1999), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); WO2003101283 (la Reivindicación 14); (WO2002102235 (la Reivindicación 13; la Página 287-288); WO2002101075 (la Reivindicación 4; la Página 308-309); WO200271928 (la Página 320-321); WO9410312 (la Página 52-57); remisiones: MIM:601051 ; NP_005814.2; NM 005823 1 (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia portadora del soluto 34 (fosfato de sodio), miembro 2, transportador de fosfato dependiente de sodio tipo II 3b, Número de acceso de Genbank NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genómica 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., y al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); WO2004022778 (la Reivindicación 2); EP1394274 (Ejemplo 1 1); WO2002102235 (la Reivindicación 13; la Página 326); EP875569 (la Reivindicación 1 ; la Página 17-19); WO200157188 (la Reivindicación 20; la Página 329); WO2004032842 (Ejemplo IV); WO200175177 (la Reivindicación 24; la Página 139-140); remisiones: MIM:604217; NP 006415.1 ; NM_006424_1 (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, sema dominio, siete repeticiones de la trombospondina (de tipo 1 y de tipo 1), dominio transmembranal (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B, Número de acceso de Genbank AB040878); Nagase T., y al (2000) DNA Res. 7 (2): 143-150); WO2004000997 (la Reivindicación 1); WO2003003984 (la Reivindicación 1); WO200206339 (la Reivindicación 1 ; la Página 50); WO200188133 (la Reivindicación 1 ; la Página 41-43, 48-58); WO2003054152 (la Reivindicación 20); WO2003101400 (la Reivindicación 11); Acceso: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC: 10737 (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, ADNc de RIKEN 2700050C12 gen, Número de acceso de Genbank AY358628); Ross y al (2002) Cáncer Res. 62:2546-2553; US2003129192 (la Reivindicación 2); US2004044180 (la Reivindicación 12); US2004044179 (la Reivindicación 11); US2003096961 (la Reivindicación 11); US2003232056 (Ejemplo 5); WO2003105758 (la Reivindicación 12); US2003206918 (Ejemplo 5); EP1347046 (la Reivindicación 1); WO2003025148 (la Reivindicación 20); remisiones: GI:37182378; AAQ88991.1 ; AY358628_1 (9) ETBR (Receptor de endotelina tipo B, Número de acceso de Genbank AY275463); Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991 ; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991 ; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, sl -S4, 1992; Tsutsumi M., y al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C, et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 31 16-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Jineta. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Zumbido. Jineta. 5, 180-185, 1997; Puffenberger p.ej, et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., y al, Zumbido. Mol. Jineta. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Jineta. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Jineta. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., y al Nat. Jineta. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Jineta. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 1 15-124, 2001 ; Pingault V., y al (2002) Zumbido. Jineta. 11 1, 198-206; WO2004045516 (la Reivindicación 1); WO2004048938 (Ejemplo 2); WO2004040000 (la Reivindicación 151); WO2003087768 (la Reivindicación 1); WO2003016475 (la Reivindicación 1); WO2003016475 (la Reivindicación 1); WO200261087 (Figura 1); WO2003016494 (Figura 6); WO2003025138 (la Reivindicación 12; la Página 144); WO200198351 (la Reivindicación 1 ; la Página 124-125); EP522868 (la Reivindicación 8; Figura 2); WO200177172 (la Reivindicación 1 ; la Página 297-299); US2003109676; US6518404 (Figura 3); US5773223 (la Reivindicación la; Cnel 31-34); WO2004001004 (10) MSG783 (RNF124, FLJ20315 protéico hipotético, Número de acceso de Genbank NM 017763); WO2003104275 (la Reivindicación 1); WO2004046342 (Ejemplo 2); WO2003042661 (la Reivindicación 12); WO2003083074 (la Reivindicación 14; la Página 61); WO2003018621 (la Reivindicación 1); WO2003024392 (la Reivindicación 2; Figura 93); WO200166689 (Ejemplo 6); remisiones: LocusID:54894; NP 060233.2; NM_017763_1 (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen asociado al cáncer de próstata 1, proteína asociada al cáncer de próstata 1, antígeno epitelial seis transmembranal de próstata 2, seis proteína de la próstata transmembranal, Número de acceso de Genbank AF455138); Laboratorio. Invertir. 82 (11 ): 1573-1582 (2002)); WO2003087306; US2003064397 (la Reivindicación 1 ; Figura 1); WO200272596 (la Reivindicación 13; la Página 54-55); WO200172962 (la Reivindicación 1 ; Figura 4B); WO2003104270 (la Reivindicación 11); WO2003104270 (la Reivindicación 16); US2004005598 (la Reivindicación 22); WO2003042661 (la Reivindicación 12); US2003060612 (la Reivindicación 12; Figura 10); WO200226822 (la Reivindicación 23; Figura 2); WO200216429 (la Reivindicación 12; Figura 10); remisiones: GI:22655488; AAN04080.1 ; AF455138_1 (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal del catión de potencial del receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4, Número de acceso de Genbank NM 017636); Xu, X.Z., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Célula 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); US2003143557 (la Reivindicación 4); WO200040614 (la Reivindicación 14; la Página 100-103); WO200210382 (la Reivindicación 1 ; Figura 9A); WO2003042661 (la Reivindicación 12); WO200230268 (la Reivindicación 27; la Página 391); US2003219806 (la Reivindicación 4); WO200162794 (la Reivindicación 14; 1A-D de Figura); remisiones: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1 (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGFJ , factor de crecimiento derivado del teratocarcinoma, Número de acceso de Genbank NP_003203 o NM_003212); Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7): 1987-1991 (1989), Am. J. Zumbido. Jineta. 49 (3):555-565 (1991)); US2003224411 (la Reivindicación 1 ); WO2003083041 (Ejemplo 1); WO2003034984 (la Reivindicación 12); WO200288170 (la Reivindicación 2; la Página 52-53); WO2003024392 (la Reivindicación 2; Figura 58); WO200216413 (la Reivindicación 1; la Página 94-95, 105); WO200222808 (la Reivindicación 2; Figura 1); US5854399 (Ejemplo 2; Cnel 17-18); US5792616 (Figura 2); remisiones: MIM: 187395; NP_003203.1 ; NM_003212_1 (14) CD21 (CR2 (Receptor de complemento 2) o C3DR (receptor del virus de C3d/Epstein Barr) o Número de acceso Hs.73792 Genbank M26004); Fujisaku y al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639- 5643, 1986; Sinha S.K., y al (1993) J. Immunol. 150, 531 1-5320; WO2004045520 (Ejemplo 4); US2004005538 (Ejemplo 1); WO2003062401 (la Reivindicación 9); WO2004045520 (Ejemplo 4); W09102536 (Figura 9.1-9.9); WO2004020595 (la Reivindicación 1); Acceso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1. (15) CD79b (CD79B, CD79P, IGb (beta asociada por la inmunoglobulina), B29, Número de acceso de Genbank NM_000626 o 11038674); Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Sangre (2002) 100 (9):3068-3076, Muller y al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); WO2004016225 (la reivindicación 2, Figura 140); WO2003087768, US2004101874 (la reivindicación 1, la página 102); WO2003062401 (la reivindicación 9); WO200278524 (Ejemplo 2); US2002150573 (la reivindicación 5, la página 15); US5644033; WO2003048202 (la reivindicación 1, las páginas 306 y 309); WO 99/558658, US6534482 (la reivindicación 13, Figura 17A/B); WO200055351 (la reivindicación 11, las páginas 1145-1146); remisiones: MIM: 147245; NP_000617.1 ; NM_000626_1 (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (dominio de SH2 que contiene proteína de anclaje a fosfatasa la), SPAP1B, SPAP1C, Número de acceso de Genbank NM_030764, AY358130); Res Genómico. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Sangre 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., y al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; WO2004016225 (la Reivindicación 2); WO2003077836; WO200138490 (la Reivindicación 5; Figura 18D-1-18D-2); WO2003097803 (la Reivindicación 12); WO2003089624 (la Reivindicación 25); remisiones: MIM:606509; NP l 10391.2; NM_030764_1 (17) HER2 (ErbB2, Número de acceso de Genbank MI 1730); Coussens L., et al Science (1985) 230 (4730):1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J.
Biol celular. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., y al (1993) Genómica 15, 426-429; WO2004048938 (Ejemplo 2); WO2004027049 (Figura II); WO2004009622; WO2003081210; WO2003089904 (la Reivindicación 9); WO2003016475 (la Reivindicación 1); US2003118592; WO2003008537 (la Reivindicación 1); WO2003055439 (la Reivindicación 29; 1A-B de Figura); WO2003025228 (la Reivindicación 37; Figura 5C); WO200222636 (Ejemplo 13; la Página 95-107); WO200212341 (la Reivindicación 68; Figura 7); WO200213847 (la Página 71-74); WO200214503 (la Página 114-1 17); WO200153463 (la Reivindicación 2; la Página 41-46); WO200141787 (la Página 15); WO200044899 (la Reivindicación 52; Figura 7); WO200020579 (la Reivindicación 3; Figura 2); US5869445 (la Reivindicación 3; Cnel 31- 38); WO9630514 (la Reivindicación 2; la Página 56-61); EP 1439393 (la Reivindicación 7); WO2004043361 (la Reivindicación 7); WO2004022709; WO200100244 (Ejemplo 3; Figura 4); Acceso: P04626; EMBL; MI 1767; AAA35808.1. EMBL; MI 1761 ; AAA35808.1 (18) NCA (CEACAM6, Número de acceso de Genbank MI 8728); Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002; WO2004063709; EP 1439393 (la Reivindicación 7); WO2004044178 (Ejemplo 4); WO2004031238; WO2003042661 (la Reivindicación 12); WO200278524 (Ejemplo 2); WO200286443 (la Reivindicación 27; la Página 427); WO200260317 (la Reivindicación 2); Acceso: P40199; Q14920; EMBL; M29541 ; AAA59915.1. EMBL; M18728 (19) MDP (DPEP1, Número de acceso de Genbank BC017023); Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899- 16903 (2002)); WO2003016475 (la Reivindicación 1); WO200264798 (la Reivindicación 33; la Página 85-87); JP05003790 (Figura 6-8); W09946284 (Figura 9); remisiones: MIM: 179780; AAH 17023.1; BC017023J (20) IL20Ra (IL20Ra, ZCYTOR7, Número de acceso de Genbank AF 184971); Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001 ; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., y al (2003) Bioquímica 42: 12617-12624; el jeque F., y al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP1394274 (Ejemplo 11); US2004005320 (Ejemplo 5); WO2003029262 (la Página 74-75); WO2003002717 (la Reivindicación 2; la Página 63); WO200222153 (la Página 45-47); US2002042366 (la Página 20-21); WO200146261 (la Página 57-59); WO200146232 (la Página 63-65); W09837193 (la Reivindicación 1 ; la Página 55-59); Acceso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971 ; AAF01320.1. (21) Brevican (BCAN, BEHAB, Número de acceso de Genbank AF229053); Gary S.C., y al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003186372 (la Reivindicación 1 1); US2003186373 (la Reivindicación 11); US2003119131 (la Reivindicación 1 ; Figura 52); US20031 19122 (la Reivindicación 1 ; Figura 52); US20031 19126 (la Reivindicación 1); US20031 19121 (la Reivindicación 1; Figura 52); US2003119129 (la Reivindicación 1); US2003119130 (la Reivindicación 1); US20031 19128 (la Reivindicación 1 ; Figura 52); US2003119125 (la Reivindicación 1); WO2003016475 (la Reivindicación 1); WO200202634 (la Reivindicación 1) (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, Número de acceso de Genbank NM_004442); Chan, J. y Vatio, V.M., Oncogén 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogén 10 (5):897-905 (1995), Annu. El Rev Neurosci. 21 :309-345 (1998), el Rev Internacional Cytol. 196: 177-244 (2000)); WO2003042661 (la Reivindicación 12); WO200053216 (la Reivindicación 1; la Página 41); WO2004065576 (la Reivindicación 1); WO2004020583 (la Reivindicación 9); WO2003004529 (la Página 128-132); WO200053216 (la Reivindicación 1 ; la Página 42); remisiones: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1 (23) ASLG659 (B7h, Número de acceso de Genbank AX092328); US20040101899 (la Reivindicación 2); WO2003104399 (la Reivindicación 1 1); WO2004000221 (Figura 3); US2003165504 (la Reivindicación 1); US2003124140 (Ejemplo 2); US2003065143 (Figura 60); WO2002102235 (la Reivindicación 13; la Página 299); US2003091580 (Ejemplo 2); WO200210187 (la Reivindicación 6; Figura 10); WO200194641 (la Reivindicación 12; Figura 7b); WO200202624 (la Reivindicación 13; 1 A- IB de Figura); US2002034749 (la Reivindicación 54; la Página 45-46); WO200206317 (Ejemplo 2; la Página 320-321, la Reivindicación 34; la Página 321-322); WO200271928 (la Página 468-469); WO200202587 (Ejemplo 1; Figura 1); WO200140269 (Ejemplo 3; las Páginas 190-192); WO200036107 (Ejemplo 2; la Página 205-207); WO2004053079 (la Reivindicación 12); WO2003004989 (la Reivindicación 1); WO200271928 (la Página 233-234, 452-453); WO 0116318 (24) PSCA (Precursor del antígeno de la célula pluripotencial de la próstata, Número de acceso de Genbank AJ297436); Reiter R.E., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275 (3):783-788; WO2004022709; EP1394274 (Ejemplo 1 1); US2004018553 (la Reivindicación 17); WO2003008537 (la Reivindicación 1); WO200281646 (la Reivindicación 1 ; la Página 164); WO2003003906 (la Reivindicación 10; la Página 288); WO200140309 (Ejemplo 1; Figura 17); US2001055751 (Ejemplo 1; Figura Ib); WO200032752 (la Reivindicación 18; Figura 1); WO9851805 (la Reivindicación 17; la Página 97); W09851824 (la Reivindicación 10; la Página 94); WO9840403 (la Reivindicación 2; Figura IB); Acceso: 043653; EMBL; AF043498; AAC39607.1 (25) GEDA (Número de acceso de Genbank AY260763); AAP 14954 lipoma HMGIC fusion-partner-like proteína/pid=AAP 14954.1 - Homo sapiens (humano); WO2003054152 (la Reivindicación 20); WO2003000842 (la Reivindicación 1); WO2003023013 (Ejemplo 3, la Reivindicación 20); US2003194704 (la Reivindicación 45); remisiones: GI:30102449; AAP 14954.1 ; AY260763 1 (26) BAFF-R (linfocito B - activación de receptor del factor, receptor de BLyS 3, BR3, Número de acceso de Genbank AF116456); receptor de BAFF/pid=NP_443177.1 -Homo sapiens: Tompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO2004058309; WO2004011611; WO2003045422 (Ejemplo; la Página 32-33); WO2003014294 (la Reivindicación 35; Figura 6B); WO2003035846 (la Reivindicación 70; la Página 615-616); WO200294852 (Cnel 136-137); WO200238766 (la Reivindicación 3; la Página 133); WO200224909 (Ejemplo 3; Figura 3); remisiones: MIM:606269; P_443177.1; NM_052945_1; AF132600 (27) CD22 (receptor del linfocito B isoforma de CD22-B, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Número de acceso de Genbank AK026467); Wilson y al (1991) J.
Exp. Med. 173:137-146; WO2003072036 (la Reivindicación 1; Figura 1); remisiones: MIM: 107266; NP_001762.1; NM 001771 1 (28) CD79a (CD79A, CD79B, alfa asociada a inmunoglobulina, una proteína específica para el linfocito B que covalentemente interactúa con la beta (CD79B) de Ig y forma un complejo en la superficie con M Ig de moléculas, transforma una señal implicada en la diferenciación del linfocito B), la pi: 4.84, MW: 25028 TM: 2 Cromosoma Génico [P]: 19ql3.2, Número de acceso de Genbank NP_001774.10); WO2003088808, US20030228319; WO2003062401 (la reivindicación 9); US2002150573 (la reivindicación 4, las páginas 13-14); W09958658 (la reivindicación 13, Figura 16); WO9207574 (Figura 1); US5644033; Ah y al (1992) J. Immunol. 148 (5): 1526-1531 ; Mueller y al (1992) Eur. J. Biochem. 22: 1621-1625; Hashimoto y al (1994) Immunogenetics 40 (4):287-295; Preud'homme y al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90 (1): 141-146; Yu y al (1992) J. Immunol. 148 (2) 633-637; Sakaguchi y al (1988) EMBO J. 7 (l l):3457-3464 (29) CXCR5 (el receptor del linfoma de Burkitt 1, un receptor protéico y copulado G que es activado por la quimocina CXCL13, funciona en migración del linfocito y defensa humoral, desempeña un papel en VIH 2 infección y quizás desarrollo de AUXILIARES, linfoma, mieloma y leucemia); 372 aa, pl: 8.54 MW: 41959 TM: 7 Cromosoma Génico [P]: l lq23.3, Número de acceso de Genbank NP_001707.1); WO2004040000; WO2004015426; US2003105292 (Ejemplo 2); US6555339 (Ejemplo 2); WO200261087 (Figura 1); WO200157188 (La reivindicación 20, la página 269); WO200172830 (las páginas 12-13); WO200022129 (Ejemplo 1 , las páginas 152-153, Ejemplo 2, las páginas 254-256); W09928468 (la reivindicación 1, la página 38); US5440021 (Ejemplo 2, Cnel 49-52); W09428931 (las páginas 56-58); W09217497 (la reivindicación 7, Figura 5); Dobner y al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella y al (1995) Biochem. J. 309:773-779 (30) HLA-DOB (Subunidad de la beta de la molécula del Complejo Principal de Histocompatibilidad tipo II (antígeno de la) que une péptidos y los presenta a CD4 + linfocitos T); 273 aa, pl: 6.56, MW: 30820. TM: 1 Cromosoma Génico [P]: 6p21.3, Número de acceso de Genbank NP_0021 11.1); Tonnelle y al (1985) EMBO J. 4 (11):2839-2847; Jonsson y al (1989) Immunogenetics 29 (6):411-413; Cuba de tintura y al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441 ; Strausberg y al (2002) Proc. Nati. Acad. Sci USA 99: 16899-16903; Servenius y al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Cuba de tintura y al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse y al (2002) Antígenos Tisulares 59:512-519; W09958658 (la reivindicación 13, Figura 15); US6153408 (Cnel 35-38); US5976551 (Cnel 168-170); US601 1 146 (Cnel 145-146); Kasahara y al (1989) Immunogenetics 30 (l):66-68; Larhammar y al (1985) J. Biol. Chem. 260 (26): 1411 1-14119. (31) P2X5 (Receptor purinérgico el canal iónico controlado por ligando de P2X 5, un canal del ión seleccionado por ATP extracelular, puede implicarse en la transmisión sináptica y neurogenesis, deficiencia puede contribuir a la patofisiología de la inestabilidad detrusor idiopática); 422 aa), pl: 7.63, MW: 47206 TM: 1 Cromosoma Génico [P]: 17pl3.3, Número de acceso de Genbank NP 002552.2); Le et al (1997) Letón FEBS. 418 (1-2):195-199; WO2004047749; WO2003072035 (la reivindicación 10); Touchman y al (2000) Res Genómico. 10: 165-173; WO200222660 (la reivindicación 20); WO2003093444 (la reivindicación 1 ); WO2003087768 (la reivindicación 1); WO2003029277 (la página 82) (32) CD72 (antígeno de diferenciación del linfocito B CD72, Lyb-2); 359 aa, pl: 8.66, MW: 40225, TM: 1 Cromosoma Génico [P]: 9pl3.3, Número de acceso de Genbank NP_001773.1); WO2004042346 (la reivindicación 65); WO2003026493 (las páginas 51-52, 57-58); WO200075655 (las páginas 105-106); Von Hoegen y al (1990) J. Immunol. 144 (12):4870-4877; Strausberg y al (2002) Proc. Nati. Acad. Sci USA 99: 16899-16903. (33) LY64 (El antígeno del linfocito 64 (RP105), tipo I proteína de la membrana de la familia de la leucina repetición rica (LRR), regula la activación del linfocito B y apoptosis, la pérdida de la función se asocia con la mayor actividad de enfermedad en pacientes con lupus sistémico erytematosis); 661 aa, pl: 6.20, MW: 74147 TM: 1 Cromosoma Génico [P]: 5ql2, Número de acceso de Genbank NP_005573.1); US2002193567; WO9707198 (la reivindicación 11, las páginas 39-42); Miura y al (1996) Genómica 38 (3):299-304; Miura y al (1998) Sangre 92:2815-2822; WO2003083047; W09744452 (la reivindicación 8, las páginas 57-61); WO200012130 (las páginas 24-26) (34) FcRHl (proteína similar al receptor Fe 1, un receptor putativo para el dominio Fe de la inmunoglobulina que contiene el tipo C2 dominios parecidos a Ig e ITAM, puede tener una función en la diferenciación del linfocito B); 429 aa, pl: 5.28, MW: 46925 TM: 1 Cromosoma Génico [P]: Iq21-lq22, Número de acceso de Genbank NP_443170.1); WO2003077836; WO200138490 (la reivindicación 6, Figura 18E-1-18-E-2); Davis y al (2001) Proc. Nati. Acad. Sci USA 98 (17):9772-9777; WO2003089624 (la reivindicación 8); EP 1347046 (la reivindicación 1); WO2003089624 (la reivindicación 7) (35) IRTA2 (Desplazamiento del receptor de la superfamilia de la inmunoglobulina 2 asociados, un inmunoreceptor putativo con posibles funciones en desarrollo del linfocito B y lymphomagenesis; la desregularización del gen por el desplazamiento ocurre en algunas neoplasias malignas del linfocito B); 977 aa, pl: 6.88, MW: 106468, TM: 1 Cromosoma Génico [P]: lq21, Número de acceso de Genbank Human:AF343662; WO2003024392 (la reivindicación 2, Figura 97); Nakayama y al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277 (1): 124-127; WO2003077836; WO200138490 (la reivindicación 3, Figura 18B-1-18B-2) (36) TENB2 (TMEFF2, tomoregulin, TPEF, HPP1, TR, proteoglucano transmembranal putativo, relacionado con la familia EGF/heregulin de factores de crecimiento y follistatin); 374 aa, Acceso de NCBI: AAD55776; SwissProt Q9UIK5; Número de acceso de Genbank AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; WO2004074320; JP2004113151 ; WO2003042661 ; WO2003009814; EP1295944 (las páginas 69-70); WO200230268 (la página 329); WO200190304; US2004249130; US2004022727; WO2004063355; US20041 7325; US2003232350; US2004005563; US2003124579; Horie y al (2000) Genómica 67:146-152; Uchida y al (1999) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang y al (2000) Cáncer Res. 60:4907-12; Glynne- Jones y al (2001) Intervalo J Cáncer. El 15 de octubre; 94 (2):178-84.
El anticuerpo parental también puede ser una proteína de fusión que comprende una secuencia del péptido de unión a la albúmina (ABP) (Dennis et al. (2002) "Unión de la Albúmina Como Una Estrategia General De Mejorar La Farmacocinética De Proteínas" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Los anticuerpos de la invención incluyen proteínas de fusión con secuencias ABP mostradas por: (i) Dermis y al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 en la Tabla III y IV, la página 35038; (ii) US 20040001827 en
[0076]; y (iii) WO 01/45746 en las páginas 12-13, y de los cuales todos se incorporan aquí por referencia.
MUTAGÉNESIS DNA que codifica para una variante de la secuencia aminoacídica del polipéptido inicial se prepara por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, entre otras cosas, la preparación por el dirigido al sitio (o regulado por el oligonucleótido) mutagénesis, mutagénesis del PCR y mutagénesis por inserción de un cásete de un DNA preparado anteriormente que codifica para el polipéptido. Las variantes de anticuerpos recombinantes también pueden construirse por la manipulación del fragmento de restricción o por el PCR de extensión del traslapo con oligonucleótidos sintéticos. Los cebadores mutagénicos codifican para el reemplazo (s) del codón de cisteína. Los métodos de la mutagénesis convencionales pueden emplearse para generar DNA que codifica para los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína del muíante. La orientación general puede enconírarse en Sambrook el al Molecular Cloning, Un Manual de Laboratorio, Prensa del Laboratorio del Puerto de Cold Spring, Puerto de Cold Spring, Nueva York, 1989; y Ausubel eí al Currenl Proíocols en Biología molecular, Greene Publishing y Wiley-interciencia, Nueva York, Nueva York, 1993.
La mutagénesis dirigida al sitio es un método para preparar variantes de substitución, es decir proteínas del muíante. Este método es conocido en la técnica (ver por ejemplo, Cárter (1985) et al Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho y al (1989) Gene (Amst). 77:51-59; y Kunkel y al (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488). Brevemente, en la realización de la mutagénesis dirigida al sitio de DNA, el DNA inicial se altera al hibridar primero un oligonucleótido que codifica para la mutación deseada a una cadena sencilla del DNA inicial. Después de la hibridación, una ADN polimerasa se utiliza sintetizan una segunda hebra completa, al usar el oligonucleótido hibridado como un cebador, y al usar la cadena sencilla del DNA inicial como una plantilla. Así, el oligonucleótido que codifica para la mutación deseada se incorpora en el ADN bicatenario resultante. La mutagénesis dirigida al sitio puede llevarse a cabo dentro del gen que expresa para la proteína para mutagenizarse en un plásmido de la expresión y el plásmido resultante puede ser secuenciado para confirmar la introducción de las mutaciones de reemplazo de cisteína deseadas (Liu y al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260). Dirigido al sitio de protocolos y formatos, incluyendo a los comercialmente disponibles, p.ej. it QuikChange® Multi Site-Directed Mutagénesis (Stratagene, La Jolla, California).
La mutagénesis del PCR también es adecuada para hacer variantes de la secuencia aminoacídica del polipéptido inicial. Ver Higuchi, (1990) en Protocolos del PCR, pp.177-183, Edición académica; Ito y al (1991) Gene 102:67-70; Bernhard y al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; y Vallette y al (1989) Nuc. Ácidos Res. 17:723-733. Brevemente, cuando las pequeñas cantidades de la plantilla DNA se usa como . la materia prima en un PCR, cebadores que diferencian ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en una plantilla DNA poderse usar para generar relativamente grandes cantidades de un fragmento de ADN específico que se diferencia de la secuencia de la plantilla sólo en las posiciones donde los cebadores se diferencian de la plantilla.
Otro método para preparar variantes, mutagénesis por inserción de un cásete, se basa en el método descrito por Wells y al (1985) Gene 34:315-323. La materia prima es el plásmido (u otro vector) que comprende el DNA polipeptídico inicial para mutarse. El codón (ones) en el DNA inicial para mutarse se identifica. Debe haber un sitio de endonucleasa de restricción exclusivo en cada lado del sitio (s) de la mutación identificado. Si no los sitios de restricción existen, éstos pueden generarse al usar el método de la mutagénesis regulado por el oligonucleótido anteriormente descrito de introducirlos en ubicaciones adecuadas en el DNA polipeptídico inicial. El ADN pl smido se corta en estos sitios para linealizarlo. Un oligonucleótido bicatenario que codifica para la secuencia del DNA entre los sitios de restricción pero contiene la mutación (ones) deseada se sintetiza al usar procedimientos ordinarios, donde las dos hebras del oligonucleótido se sintetizan por separado y luego hibridado conjuntamente al usar métodos convencionales. Los oligonucleótidos se preparan por el método de síntesis de la fosforamidita (US 4415732; US 4458066; Beaucage, S. e Iyer, R. (1992) "Avances en la síntesis de oligonucleótidos por el enfoque de la fosforamidita", Tetraedro 48:2223-2311). Esto duplica el oligonucleótido varado se refiere como el cásete. Este cásete se diseña para tener 5' y extremos 3 ' que son compatibles con terminar del plásmido linearizado, el que puede directamente ligarse al plásmido. Este plásmido ahora contiene la secuencia de DNA mutada. El mutante DNA que contiene los reemplazos de cisteína codificados puede confirmarse mediante la secuenciación de DNA.
Las mutaciones individuales también son generadas por la mutagénesis dirigida del oligonucleótido al usar el ADN plásmido bicatenario como la plantilla por el PCR mutagénesis. con base (Sambrook y Russel, (2001) Clonación Molecular: Una edición Manual, 3ra de Laboratorio; Zoller y al (1983) Métodos Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. y Smith, M. (1982) Nucí. Ácidos Res. 10:6487-6500).
En la presente invención, hu4D5Fabv8 mostrado en fago MI 3 (Gerstner y al (2002) "Plasticidad de la Secuencia En El Sitio de unión al antígeno (parátopo) De Un Anticuerpo anti-HER2 Terapéutico", J Mol Biol. El 321 :851-62) se usó para experimentos como un sistema modelo. Las mutaciones de cisteína se introdujeron en el hu4D5Fabv8-fago, hu4D5Fabv8, y constructos de ABP-hu4D5Fabv8. Los hu4D5-TioFab-Phage preps se llevaron a cabo al usar el polietilenglicol (PEG) método de precipitación como se describe anteriormente (Lowman, Henry B. (1998) Métodos en la Biología molecular (Totowa, Nueva Jersey) 87 (Protocolos de la Genoteca Peptídicos Combinatorios) 249-264).
ENSAYO DE PHESELECTOR El PHESELECTOR (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas del fago para la Selección de Tioles Reactivos) ensayo permite la detección de grupos de cisteína reactivos en anticuerpos en un formato del fago del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. El proceso de recubrir la proteína (p.ej anticuerpo) de interés en superficies del pocilio, incubación seguida con partículas del fago y luego anticuerpo secundario marcado de HRP con la detección de la absorbancia se detalla en el Ejemplo 2. Las proteínas del mutante mostradas en el fago pueden seleccionarse en una manera rápida, consistente, y de alto rendimiento. Las genotecas de anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína pueden producirse y sometido a la selección de unión al usar el mismo enfoque para identificar sitios apropiadamente reactivos de la incorporación de Cys libre de genotecas del fago protéico aleatorias de anticuerpos u otras proteínas. Este método incluye proteínas del mutante de cisteína que reaccionan mostradas en el fago con un reactivo de afinidad o grupo indicador que también es el reactivo del tiol. La Figura 8 ilustra el Ensayo de PHESELECTOR por una representación esquemática que representa la unión de Fab o TioFab a HER2 TioFab (superior) y biotinilado a la estreptavidina (parte inferior).
EXPRESIÓN PROTEICA Y PURIFICACIÓN DNA que codifica para los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína fácilmente se aisla y secuenciado al usar procedimientos convencionales (p.ej, al usar sondas del oligonucleótido que tienen capacidad de unirse específicamente genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos del murino). Las células del hibridoma funcionan como una fuente del DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, que son transfectados luego en células hospederas como células de E. coli, células de COS símicas, células del Ovario de hámster chino (CHO) u otras células hospederas de mamífero, como células de la mieloma (US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310) que no producen otra cosa la proteína del anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclónicos en las células hospederas del recombinante. Las producciones de anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína hu4D5Fabv8 eran similares a hu4D5Fabv8 tipo silvestre. Los artículos de la revisión sobre la expresión del recombinante en bacterias de DNA que codifica para el anticuerpo incluyen Skerra y al (1993) Curr. Opinión en Immunol. 5:256-262 y Plücktun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188.
Después de diseño y selección, anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína, p.ej. TioFabs, con residuos de Cys sin formar pares muy reactivos, puede producirse por: (i) expresión en un bacteriano, p.ej E. coli, el sistema o una célula de mamífero cultivan el sistema (WO 01/00245), p.ej células del Ovario de hámster chino (CHO); y (ii) purificación al usar métodos de la purificación proteínica comunes (Lowman y al (1991) J. Biol. Chem. 266 (17): 10982-10988).
TioFabs se expresaron mediante la inducción en 34B8, una cepa de E. coli no supresora (Baca y al (1997) Diario Química Biológica 272 (16): 10678-84). Ver el Ejemplo 3a. El granulado celular recolectado se suspendió de nuevo en el PBS (solución salina amortiguada con fosfato), la lisis celular total se llevó a cabo haciendo pasar a través de un microfluidizador y TioFabs se purificaron por la cromatografía de afinidad con proteína G SEPHAROSE™ (Amersham). TioFabs se conjugaron con biotin-PEO-maleimide como se describe anteriormente y los biotinilados-TioFabs se purificaron mediante adicionalmente Superdex-200™ (Amersham) cromatografía de la filtración del gel, que eliminó biotin- PEO-maleimide libre y la fracción oligomerica de TioFabs.
ANÁLISIS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS La masa de la ionización por electroaspersión de la cromatografía líquida el análisis (LC-ESI-MS) espectrométrico se empleó para la determinación del peso molecular exacta de biotina conjugó Fab (Col rizada, R.B. Espectrometría de masas de Ionización del Aerosol de Electro: Fundamentos, Instrumentación Y Solicitudes. (1997) Wiley, Nueva York). La secuencia aminoacídica de hu4D5Fabv8 biotinilado (A121C) péptido se determinó mediante la digestión tríptica seguida del análisis LC-ESI-Tandem (la Tabla 4, Ejemplo 3b).
El fragmento Fab del anticuerpo hu4D5Fabv8 contiene aproximadamente 445 residuos aminoacídicos, incluyendo 10 residuos de Cys (cinco en la luz y cinco en la cadena pesada). La estructura de alta resolución del humanizado 4D5 el fragmento variable (Fv4D5) se ha establecido, ver: Eigenbrot y al "radiografían Estructuras De Los Dominios de unión al antígeno De Tres Variantes del Anticuerpo Anti-P185her2 Humanizado 4D5 Y Comparación Con el Modelado Molecular" (1993) J Mol Biol. 229:969-995). Todos los residuos de Cys se encuentran en forma de enlaces disulfuro, por lo tanto estos residuos no tienen grupo del tiol reactivo para conjugar con maleimida del fármaco (a menos que no sometido a tratamiento con un agente reductor). Por lo tanto, el residuo de Cys recién manipulado genéticamente, puede permanecer sin formar pares, y capaz de reaccionar con, es decir conjugado a, un reactivo del ligador del dectrófilo o producto intermedio ligador por d fármaco, como rnaleimida dd fármaco. 1A de la Figura muestra una representatión tridimensional dd fragmento de anticuerpo hu4D5Fabv8 derivado por coordenadas de cristal de la radiografía Las posidones de la estructura de los residuos de Cys rnanipulados genéticamente de las cadenas pesadas y ligeras se numeran según un sistema secuendal de numeradón. Este sistema secuendal de numeradón se corrdadona a Kabat d sistema de numeradón ( abat et al, (1991) Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, 5to Servido de la Salud pública dd editor, Institutos Nadonales de la Salud, Betesda, Mariland) para d 4d5v7fabH variante del astuzumab según la Figura IB que muestra el Esquema de Reacción secuencial de numeración (fila superior), que comienza en d extremo N4aminus, se diferencia de Kabat de numeración d Esquema de Reacción (fila inferior) por inserciones observadas por a, b, c. Al usar Kabat sistema de numeración, la secuencia aminoaddica lineal actual puede contener a menos o aminoácidos adidonales oorrespondiente a un acortamiento de, o inserción en, un FRo la CDR dd dominio variable. Los sitios de la variante de la cadena pesada manipulados genéticamente con dsteína se identifican por numerar secuencial y Kabat de numeración Esquemas de Reacción en la carta que sigue: El imitante del fagómido-Cys de MI 3 Fabs (Figuras 3 A y 3B) puede rápidamente seleccionarse comparado con proteínas de Fab. La unión del fagómido-TioFab al antígeno y a la estreptavidina puede analizarse al recubrir HER2 y estreptavidina, respectivamente, en placas del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas seguidas al sondar con anti-Fab-HRP (Peroxidasa del rábano del caballo) como se describe en el Ejemplo 2 y representado en la Figura 8. Este método permitió la monitorización simultánea del efecto en la unión del antígeno y la reactividad del grupo del tiol por la molécula de biotina del residuo/conjugar de Cys manipulada genéticamente. También, el método puede aplicarse para seleccionar los grupos del tiol reactivos para cualquier proteína mostrada en el fago MI 3. El fagómido-TioFabs conjugado o no conjugado se purifica por la precipitación de PEG simple.
El fragmento de unión al antígeno de humanizado 4D5 (hu4D5Fab) es el pocilio expresado para en E. coli y se ha mostrado en el bacteriófago (Garrard y al (1993) Gene 128:103-109). El fragmento Fab del anticuerpo hu4D5Fabv8 se mostró en el fago M13 como un sistema modelo en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ensayo con base a la reactividad del tiol de sonda. La Figura 8 es una representación gráfica del ensayo de PHESELECTOR, representando la unión de un fago de TioFab biotinilado y un antifago anticuerpo de HRP a HER2 (parte superior) y Estreptavidina (parte inferior). Cinco residuos aminoacídicos (L-Ala43, H-Ala40, H-Serl 19, H- Alai 21 y H-Serl22) inicialmente se seleccionaron de la información de la estructura cristalina como remotos de la superficie de unión del antígeno (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995). La estructura cristalina de la radiografía de la Base de datos Protéica se designó como 1FVC. Los residuos de Cys se manipularon genéticamente en estas posiciones por la mutagénesis dirigida del sitio. Las preparaciones del TioFab-fago se aislaron y reaccionaron con el reactivo de la biotinilación.
Biotina variantes conjugadas y no conjugadas se analizó para HER2 y unión de la estreptavidina al usar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ensayo de PHESELECTOR con base (Figura 8, Ejemplo 2) con un HRP (peroxidasa de rábano) -anticuerpo del antifago conjugado. La interacción de fago-hu4D5Fabv8 no biotinilado (Figura 2A) y fago-hu4D5Fabv8 biotinilado (Figura 2B) con BSA (caja abierta), HER2 (caja gris) o estreptavidina (caja rellena) se monitorizó a través del anticuerpo de peroxidasa anti-M13-rábano (HRP) al desarrollar una reacción de HRP convencional y al cuantificar la absorbancia en 450 nm. La absorbancia producida por el recambio de un sustrato colorimétrico se cuantificó en 450 nm. La reactividad de TioFab con HER2 cuantifica la unión del antígeno. La reactividad de TioFab con la estreptavidina cuantifica el grado de biotinilación. La reactividad de TioFab con BSA es un control negativo para la interacción no específica. Como observado en la Figura 2A, todas las variantes del TioFab-fago tienen la unión similar a HER2 comparado con ese del hu4D5Fabv8-fago tipo silvestre. Más aún, la conjugación con biotina no interfirió en la unión de TioFab a HER2 (Figura 2B).
Sorprendentemente y de improviso, las muestras del TioFabs-fago mostraron niveles diversos de la actividad vinculante de la estreptavidina. De todo el fago-TioFabs analizado, el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína A121C mostró la reactividad del tiol máxima. Aunque el hu4D5Fabv8-fago tipo silvestre se incubara con las mismas cantidades de MALEIMIDA-BIOTINA, éstos el fago tiene poca unión de la estreptavidina indicación que los residuos de cisteína preexistentes (implicado en la formación del enlace disulfuro) del hu4D5Fabv8 y proteínas de la capa del fago MI 3 no interfirieron con la conjugación específica para el sitio de MALEIMIDA-BIOTINA. Estos resultados demuestran que el ensayo del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas del fago puede usarse exitosamente para seleccionar grupos del tiol reactivos en la superficie de Fab.
El ensayo de PHESELECTOR permite seleccionar de grupos del tiol reactivos en anticuerpos. La identificación de la variante A121C por este método es ejemplificante. La molécula de Fab completa puede con eficacia buscarse para identificar más variantes de TioFab con grupos del tiol reactivos. Un parámetro, accesibilidad de superficie fraccionaria, se empleó para identificar y cuantificar la accesibilidad de solvente a los residuos aminoacídicos en un polipéptido. La accesibilidad de superficie puede expresarse como el área superficial (A2) que puede ser puesto en contacto por una molécula solvente, p.ej agua. El espacio ocupado de agua se acerca como una 1.4 esfera del radio Á. El software está libremente disponible o licensable (Secretario Tesorero a CCP4, Laboratorio de Daresbury, Warrington, WA4 4AD, el Reino Unido, Fax: (+44) 1925 603825, o por Internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) ya que la Suite CCP4 de programas de la cristalografía que emplean algoritmos para calcular la accesibilidad de superficie de cada aminoácido de una proteína con la cristalografía de la radiografía conocida derivó coordenadas ("La Suite CCP4: Programas para Cristalografía Protéica" (1994) Acta. Cryst. D50:760-763). Dos módulos del software ejemplificantes que llevan a cabo cálculos de accesibilidad de superficie son "AREAIMOL" y "SUPERFICIE", basada en los algoritmos de B.Lee y F.M.Richards (1971) J.Mol. Biol. 55:379-400. AREAIMOL define la superficie accesible solvente de una proteína como el locus del centro de una esfera de sonda (representando una molécula solvente) ya que derriba la superficie de Van der Waals de la proteína. AREAIMOL cuenta el área superficial accesible solvente al generar puntos de superficie en una esfera extendida sobre cada átomo (a una distancia del átomo centran igual a la suma del átomo y radios de sonda), y eliminando a aquellos que apoyan dentro de esferas equivalentes asociadas con átomos circundantes. AREAIMOL descubre el área accesible solvente de átomos en un archivo de la coordenada de PDB y resume el área accesible por el residuo, por la cadena y para la molécula completa. Las áreas accesibles (o diferencias del área) para átomos individuales pueden escribirse a un archivo de la salida de pseudo-PDB. AREAIMOL asume un radio individual para cada elemento, y sólo reconoce un número limitado de diferentes elementos. Los tipos del átomo desconocidos (es decir aquellos no en la base de datos interna del AREAIMOL) se asignarán el radio de la falta de 1.8 Á. La lista de átomos reconocidos es: AREAIMOL y la SUPERFICIE incluyen en un informe accesibilidades absolutas, es decir la cantidad de Angstromes cuadrados (Á). La accesibilidad de superficie fraccionaria se calcula por referencia a un estado convencional relevante para un aminoácido dentro de un polipéptido. El estado de la referencia es el tripéptido Gly-X-Gly, donde X es el aminoácido de interés, y el estado de la referencia debería ser una conformación 'extendida', es decir similar aquellos en hebras de la beta. La conformación extendida maximiza la accesibilidad de X. Un área accesible calculada se divide por el área accesible en un estado de la referencia del tripéptido Gly-X-Gly e incluye en un informe el cociente, que es la accesibilidad fraccionaria. La accesibilidad del por ciento es la accesibilidad fraccionaria multiplicada por 100.
Otro algoritmo ejemplificante para calcular la accesibilidad de superficie se basa en el módulo SOLV del programa xsae (Broger, C, F. Hoffman-LaRoche, Basilea) que calcula la accesibilidad fraccionaria de un residuo aminoacídico a una esfera hídrica basada en las coordenadas de la radiografía del polipéptido.
La accesibilidad de superficie fraccionaria para cada aminoácido en hu4D5Fabv7 se calculó al usar la información de la estructura cristalina (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995; US 7521541). Los dos criterios que siguen se aplicaron para identificar los residuos de hu4D5Fabv8 que puede manipularse genéticamente para sustituir por residuos de Cys: [00150] 1. Los residuos aminoacídicos que completamente se cubren completamente se eliminan, es decir menor que accesibilidad de superficie fraccionaria del 10%. Hay 134 (cadena ligera) y 151 (cadena pesada) residuos de hu4D5Fabv8 que son más del 10% accesibles (accesibilidad de superficie fraccionaria). Diez primeros Ser más accesibles, Alabama y los residuos de Val se seleccionaron debido a su parecido estructural cercano para Cys sobre otros aminoácidos, introduciendo coacciones estructurales sólo mínimas en el anticuerpo por Cys recién manipulado genéticamente. Otros sitios de reemplazo de cisteína también pueden seleccionarse y pueden ser útiles para la conjugación. [00151]2. Los residuos se clasifican basados en su función en interacciones funcionales y estructurales de Fab. Los residuos que no se implican en interacciones del antígeno y distantes de los enlaces disulfuro existentes se seleccionaron adicionalmente. Los residuos de Cys recién manipulados genéticamente deberían ser distintos de y no interferir con, unión del antígeno, ni mispair con cisteínas implicadas en la formación del enlace disulfuro.
La reactividad del tiol puede generalizarse a cualquier anticuerpo de donde la substitución de aminoácidos con aminoácidos de cisteína reactivos puede elaborarse dentro de los intervalos en la cadena ligera seleccionada: L-10 a L-20; L-38 a L-48; L-105 a L-115; L-139 a L-149; L-163 a L-173; y dentro de los intervalos en la cadena pesada seleccionada de: H-35 a H-45; H-83 a H-93; H-114 a H- 127; y H-170 a H-184, y en la región Fe dentro de los intervalos seleccionados de H-268 a H-291 ; H-319 a H-344; H-370 a H-380; y H-395 a H-405.
La reactividad del tiol también puede generalizarse a ciertos dominios de un anticuerpo, como el dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Reemplazos de cisteína dando como resultado la reactividad del tiol valora de aproximadamente 0.8 y mayor puede elaborarse en los dominios constantes de la cadena pesada a, d, e, ?, y µ de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluyendo las subclases de IgG: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.
Es evidente por los datos de la estructura cristalina que los 10 mutantes de Cys seleccionados están lejos del sitio que combina el antígeno, como la interconexión con HER2 en este caso. Estos mutantes pueden analizarse experimentalmente para efectos indirectos en interacciones funcionales. Las nuevas actividades del tiol de todas las variantes de Cys Fab se cuantifícaron y contaron como se describe en Ejemplos 1 y 2, y presentado en la Tabla 1. Los residuos L-V15C, L-V1 10C, H-A88C y H-A121 C tienen grupos del tiol reactivos y estables (Figuras 3A y 3B). Mutantes V15C, V1 10C, A144C, S168C son la cadena ligera variantes de Cys. Mutantes A88C, A121C, A175C, S179C son la cadena pesada variantes de Cys. Era sorprendente e inesperado que los sitios con la elevada accesibilidad de superficie fraccionaria no tenían la reactividad del tiol más elevada como calculado por el ensayo de PHESELECTOR (la Tabla 1). En otras palabras, la accesibilidad de superficie fraccionaria (1A de la Figura) no guardó correlación con la reactividad del tiol (la Tabla 1). De hecho, los residuos de Cys manipulados genéticamente con los sitios con la accesibilidad de superficie moderada del 20% al 80% (Figura 4A), o sitios parcialmente expuestos, residuos de Val o Ala similares, mostraron la mejor reactividad del tiol, es decir> 0.6, (Figura 3B, la Tabla 1) que Cys introducido en residuos de Ser, así requiriendo el uso del ensayo de PHESELECTOR en la prueba de detección de sitios del reactivo del tiol ya que la información de la estructura cristalina por sí solo no es suficiente para seleccionar estos sitios (Figura 3B y 4A).
Los datos de la reactividad del tiol se muestran en Figuras 3A y 3B para residuos aminoacídicos de 4D5 TioFab mutantes de Cys: (3A) no biotinilado (control) y (3B) fago-TioFabs biotinilado. Los grupos del tiol reactivos en la superficie de antibody/Fab se identificaron por análisis del ensayo de PHESELECTOR para la interacción de fago-hu4D5Fabv8 no biotinilado (3 A) y fago-hu4D5Fabv8 biotinilado (3B) con BSA (caja abierta), HER2 (caja gris) o estreptavidina (caja sólida). El ensayo se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 2. Las variantes de la cadena ligera están en la izquierda y las variantes de la cadena pesada están en la derecha. La unión de no biotinilado 4D5 TioFab los mutantes de Cys son bajos como la unión prevista, pero potente a HER2 se mantiene. La proporción de unión a la estreptavidina y a HER2 del biotinilado 4D5 TioFab mutantes de Cys proporciona los valores de la reactividad del tiol en la Tabla 1. La absorbancia de referencia en 450 nm o pequeñas cantidades de la unión protéica no específica del biotinilado 4D5 TioFab mutantes de Cys a BSA también es evidente en la Figura 3B. Los valores de Accesibilidad de Superficie fraccionarios de los residuos aminoacídicos seleccionados que eran sustituidos con un residuo de Cys se muestran en la Figura 4A. La accesibilidad de superficie fraccionaria se calculó de la estructura hu4D5Fabv7 disponible (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995). Los parámetros estructurales del hu4D5Fabv7 y estructuras hu4D5Fabv8 son muy consistentes y permiten la determinación de cualquier correlación entre cálculos de accesibilidad de superficie fraccionarios de hu4D5Fabv7 y reactividad del tiol de mutantes de cisteína hu4D5Fabv8. La reactividad del tiol cuantificada del fago TioFab residuos de Cys introducidos en residuos parcialmente expuestos (Ala o Val) tiene la mejor reactividad del tiol comparado con estos introducidos en residuos de Ser (la Tabla 1). Puede observarse de TioFab mutantes de Cys de la Tabla 1 que hay poca o ninguna correlación entre valores de la reactividad del tiol y accesibilidad de superficie fraccionaria.
Los aminoácidos en posiciones L-15, L-43, L-1 10, L-144, L-168, H-40, H-88, H-1 19, H-121 , H-122, H-175 y H-179 de un anticuerpo pueden generalmente mutarse (sustituidos) por aminoácidos de cisteína libres. Los intervalos dentro de aproximadamente 5 residuos aminoacídicos en cada lado de estas posiciones también pueden ser sustituidos con ácidos de cisteína libres, es decir. L-10 a L-20; L-38 a L-48; L-105 a L-1 15; L-139 a L-149; L-163 a L-173; H-35 a H-45; H-83 a H-93; H-1 14 a H-127; y H- 170 a H-184, así como los intervalos en la región Fe seleccionada de H-268 a H-291 ; H-319 a H-344; H-370 a H-380; y H-395 a H-405, para producir los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína de la invención.
Tabla 1. Reactividad tiol del fago-TioFabs L = cadena ligera, H = cadena pesada, un = alanina, S = serina, V = valina, C = cisteína * la reactividad del Tiol se cuantifica como la proporción de OD450 nm para la unión de la estreptavidina a 0D450 nm para el HER2 (anticuerpo) unión (Ejemplo 2). El valor de la reactividad del tiol de 1 indica la biotinilación completa del tiol de cisteína.
Dos variantes Cys de la cadena ligera (L-V15C y L-V110C) y dos de la cadena pesada (H-A88C y H-A121C) se seleccionaron para el análisis adicional ya que estas variantes mostraron la reactividad del tiol más elevada (la Tabla 1).
A diferencia de la purificación del fago, la preparación de Fab puede requerir 2-3 días, según la escala de la producción. Durante este tiempo, los grupos del tiol pueden perder la reactividad debido a la oxidación. A la sonda la estabilidad de grupos del tiol en el hu4D5Fabv8-fago, la estabilidad de la reactividad del tiol del fago-TIOFABS se cuantificó (Figura 4B). Después de la purificación del TioFab-fago, durante el día 1, día 2 y día 4, todas las muestras se conjugaron con biotin-PEO-maleimide y se sondaron con el ensayo del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas del fago (PHESELECTOR) para analizar la unión de la estreptavidina y HER2. L-V15C, L-V1 10C, H-A88C y H-A121C mantienen cantidades significativas de la reactividad del tiol comparado con otras variantes de TioFab (Figura 4B).
ANTICUERPOS MARCADOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE CON CISTEÍNA Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína de la invención pueden conjugarse con cualquier porción del marcador que pueda unirse covalentemente al anticuerpo a través de un grupo del tiol de cisteína reactivo (Singh y al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. y Lañe, D. (1999) Al usar Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, Prensa del Laboratorio del Puerto de Muelles de Cold, Puerto de Cold Spring, Nueva York; Lundblad R.L. (1991) Reactivos Químicos para Modificación Protéica, 2do editor Prensa de CRC, Boca Ratón, Florida). El marcador unido puede funcionar a: (los i) proporcionan una señal detectable; (ii) interactúan con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primer o segundo marcador, p.ej para proporcionar FRET (energía de la resonancia de la fluorescencia se trasladan); (iii) estabilizan interacciones o afinidad de aumento de la unión, con antígeno o ligando; (iv) afectan la movilidad, p.ej. la movilidad electro forética o la permeabilidad celular, por carga, hidrofobicidad, forma u otros parámetros físicos, o (v) proporcionan una porción de captura, para modular la afinidad del ligando, la unión del anticuerpo/antígeno o la formación de complejos iónica.
Los anticuerpos marcados manipulados genéticamente con cisteína pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico, p.ej, para detectar la expresión de un antígeno de interés en células específicas, tejidos o suero. Para solicitudes de diagnóstico, el anticuerpo por lo común se marcará por una porción detectable. Los diversos marcadores están disponibles que puede generalmente agruparse en las categorías que siguen: (a) Radioisótopos (radionúclidos), tal como 3H, 1 1C, 14C, 18F, 32P, 35, 64Cu, 68Ga, 86Y, 89Zr, 99Tc, 11 1 pulgadas, 1231, 1241, 1251, 1311, 133Xe, 177Lu, 21 1At, o 213Bi. Los anticue os marcados del radioisótopo son útiles en el receptor apuntado con especificidad de objetivo procesando gráficamente experimentos. El anticuerpo puede marcarse por reactivos del ligando que unen, quelato u otra cosa se forman en complejos un metal del radioisótopo donde el reactivo es el reactivo con el tiol de cisteína manipulado genéticamente del anticuerpo, al usar los métodos descritos en Protocolos Actuales en la Inmunología, (1991) los Tomos 1 y 2, Coligen y al, editor. Wiley-interciencia, Nueva York, Nueva York, Piqueras.. Los ligandos quelantes que pueden formarse en complejos un ion metálico incluyen DOTA, DOTP, DOTMA, DTP A y TETA (Macrociclics, Dallas, Texas). Los radionúclidos pueden ser targetted vía formación de complejos con los conjugados anticuerpo-fármaco de la invención (Wu y al (2005) Biotecnología de la Naturaleza 23 (9): 1137-1146). Los reactivos de DOTA-maleimida reaccionan con los aminoácidos de cisteína libres de los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína y proporcionan un ligando de formación de complejos metálico en el anticuerpo (Lewis y al (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Quelar reactivos de etiquetaje del ligador como el DOTA-NHS (l,4,7,10-tetraazaciclododecane-l,4,7,10-tetraacetic ácido mono (éster de N-hidroxisuccinimida) se encuentran comercialmente disponibles (Macrociclics, Dallas, Texas). El objetivo del receptor que procesa gráficamente con los anticuerpos marcados del radionúclido puede proporcionar un marcador de la activación de la vía por detección y cuantificación de la acumulación progresiva de anticuerpos en el tejido tumoral (Albert y al (1998) Bioorg. Med. Chem. Letón. 8: 1207-1210).
Los complejos del quelato metálico adecuados como el anticuerpo marcan para procesar gráficamente experimentos (US 2010/0111856; US 5342606; Hnatowich y al (1983) J. Immunol. Métodos 65:147-157; Meares y al (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh y al (1990) Bioconjugate Chem. 1 :59-65; Meares y al (1990) J. Cancerl990, Suppl. 10:21-26; Izard y al (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula y al (1995) Nucí. Med. Biol. 22:387-90; Cámara y al (1993) Nucí. Med. Biol. 20:955-62; ukis y al (1998) J. Nucí. Med. 39:2105-2110; Verel y al (2003) J. Nucí. Med. 44:1663-1670; Cámara y al (1994) J. Nucí. Med. 21:640-646; Ruegg y al (1990) Cáncer Res. 50:4221-4226; Verel y al (2003) J. Nucí. Med. 44:1663-1670; Sotavento y al (2001) Cáncer Res. 61 :4474-4482; Mitchell, y al (2003) J. Nucí. Med. 44:1105-11 12; obayashi y al (1999) Bioconjugate Chem. 10: 103-111; Miederer y al (2004) J. Nucí. Med. 45:129-137; DeNardo y al (1998) Investigación de cáncer Clínica 4:2483-90; Mezcla y al (2003) Cáncer Bioterapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula y al (1999) J. Nucí. Med. 40:166-76; Kobayashi y al (1998) J. Nucí. Med. 39:829-36; Mardirossian y al (1993) Nucí. Med. Biol. 20:65-74; Roselli y al (1999) Cáncer Bioterapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20). (b) marcadores Fluorescentes como quelatos de tierras raras (quelatos del europio), tipos de fiuoresceína que incluyen FITC, fluoresceína 5-carboxifluorescein, de 6 carboxilos; tipos de rodamina que incluyen TÁMRA; dansil; Lissamine; dañinas; fícoeritrinas; Texas Rojo; y análogos de lo mismo. Los marcadores fluorescentes pueden conjugarse a anticuerpos al usar los métodos descritos en Protocolos Actuales en la Inmunología, supra, por ejemplo. Los tintes fluorescentes y los reactivos del marcador fluorescentes incluyen a aquellos que se encuentran comercialmente disponibles de Sondas Invitrogen/Molecular (Eugene, Oregon) y Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois).
Marcadores de detección como tintes fluorescentes y tintes quimioluminiscentes (Briggs y al (1997) "Síntesis de Tintes Fluorescentes Funcionalizados y Su Copulación a Aminas y Aminoácidos," J. Chem. Soc, Perkin-Trans. El 1 :1051-1058) proporcionan una señal detectable y son generalmente aplicables para marcar anticuerpos, preferentemente con las propiedades que siguen: (i) el anticuerpo marcado debería producir una señal muy elevada con antecedentes bajos de modo que las pequeñas cantidades de anticuerpos puedan susceptiblemente detectarse tanto en ensayos libres de células como en basados en la célula; y (ii) el anticuerpo marcado debería ser fotoestable de modo que la señal fluorescente pueda observarse, monitorizado y registrado sin el blanqueo de la foto significativo. Para solicitudes que implican la unión de la superficie celular del anticuerpo marcado a membranas o superficies celulares, células sobre todo en vivo, los marcadores preferentemente (iii) tienen la solubilidad hídrica adecuada para lograr la sensibilidad de detección y concentración conjugada efectiva y (iv) son no tóxicos a células vivas para no interrumpir los procesos metabólicos normales de las células o causar la muerte celular prematura. (c) Diversos marcadores enzima-sustrato están disponibles o descritos (US 4275149). La enzima generalmente cataliza una modificación química de un sustrato cromogénico que puede cuantificarse al usar diversos métodos. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio cromático de un sustrato, que puede cuantificarse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. Los métodos para cuantificar un cambio de la fluorescencia se describen anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se hace electrónicamente emocionado por una reacción química y puede emitir luego la luz que puede cuantificarse (al usar un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona la energía a un aceptador fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (p.ej, photinus-luciferina-4-monooxigenasa (hidrolizante de ATP) y luciferasa bacteriana; US 4737456), luciferina, 2,3-dihydrophtalazinediones, deshidrogenasa del malato, ureasa, peroxidasa como peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina (AP), ß-galactosidase, glucoamilasa, lisozima, oxidasas del sacárido (p.ej, glucosa oxidasa, oxidasa de galactosa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (el como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y lo similar. Los métodos para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan y al (1981) "Métodos para la Preparación de Conjugados del Anticuerpo Enzimático para el uso en el Inmunoensayo Enzimático", en Métodos en Enzym. (el editor J. Langone & H. Van Vunakis), Edición académica, Nueva York, 73:147-166.
Ejemplos de combinaciones enzima-sustrato (US 4275149; US 4318980) incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRP) con la peroxidasa de hidrógeno como un sustrato, donde la peroxidasa de hidrógeno oxida a un precursor del tinte (p.ej, ortophenilene diamina (OPD) o 3,3', 5,5 clorhidrato de la '-tetrametilbencidina (TMB)); (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de paranitrofenilo como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidase (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (p.ej, p-nitrophenil-ß-D-galactosidase) o sustrato fluorogénico 4-methilumbelliferil-P-D-galactosidase.
Un marcador puede indirectamente conjugarse con un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcadores mencionados anteriormente puede conjugarse con avidina o estreptavidina, o viceversa. Biotina une selectivamente a la estreptavidina y así, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo en esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta del marcador con la variante polipeptídica, la variante polipeptídica se conjuga con un pequeño hapteno (p.ej, digoxina) y uno de los tipos distintos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con una variante del polipéptido del antihapteno (p.ej, anticuerpo de la antidigoxina). Así, la conjugación indirecta del marcador con la variante polipeptídica puede lograrse (Hermanson, G. (1996) en Edición académica de Métodos Bioconjugate, San Diego).
La variante polipeptídica de la presente invención puede emplearse en cualquier método del ensayo conocido, como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunoensayos competitivos, ensayos tipos sándwich directos e indirectos y ensayos de la inmunoprecipitación (Zola, (1987) Anticuerpos monoclónicos: Un Manual de Métodos, pp.147-158, CRC Press, Inc.).
Un marcador de detección puede ser útil para localización, visualización y cuantificar un episodio de reconocimiento o unión. Los anticuerpos marcados de la invención pueden detectar receptores de la superficie celular. Otro uso para anticuerpos detectablemente marcados es un método de immunocapture basado en la perla que comprende la conjugación de una perla con un anticuerpo marcado fluorescente y detección de una señal de la fluorescencia mediante la unión de un ligando. Las metodologías de detección de unión similares utilizan el efecto de la resonancia plasmónica de superficie (SPR) de cuantificar y detectar interacciones del antígeno del anticuerpo.
Los anticuerpos marcados manipulados genéticamente con cisteína de la invención son útiles como formación de imágenes de biomarcadores y sondas por diversos métodos y los métodos de la formación de imágenes biomédica y molecular el como: (i) MRI (representación óptica por resonancia magnética); (ii) MicroCT (tomografía automatizada); (iii) SPECT (la emisión del fotón individual calculó la tomografía); (iv) PET (tomografía por emisión de positrones) Tinianow, J. y al (2010) Medicamento Nuclear y Biología, 37 (3):289-297; Chen y al (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; US 2010/0111856 (v) bioluminiscencia; (vi) fluorescencia; y (vii) ultrasonido. Immunoscintigraphy es un procedimiento de formación de imágenes donde los anticuerpos marcados por sustancias radiactivas se administran a un animal o paciente humano y una fotografía se obtiene de sitios en el cuerpo donde el anticuerpo localiza (US 6528624). Formación de imágenes de biomarcadores puede objetivamente cuantificarse y evaluarse como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. Los biomarcadores pueden ser de varios tipos: el Tipo 0 es marcadores de la historia natural de una enfermedad y guarda correlación longitudinalmente con índices clínicos conocidos, p.ej evaluación de MRI de la inflamación sinovial en la artritis reumatoide; los marcadores Tipo I capturan el efecto de una intervención de acuerdo con un mecanismo de la acción, aunque el mecanismo pueda no asociarse con resultados clínicos; los marcadores Tipo II funcionan como puntos finales sustitutos donde el cambio de, o señal de, el biomarcador pronostica una ventaja clínica para "validar" respuesta apuntada con especificidad de objetivo, tal que se cuantifica la erosión ósea en la artritis reumatoide por CT. Formación de imágenes de biomarcadores así puede proporcionar farmacodinámico (PD) información terapéutica sobre: (i) expresión de una proteína con especificidad de objetivo, (ii) unión de un terapéutico a la proteína con especificidad de objetivo, es decir selectividad, y (iii) depuración y semivida datos farmacocinéticos. Las ventajas de biomarcadores de formación de imágenes in vivo con relación a biomarcadores basados en el laboratorio incluyen: tratamiento no invasivo, evaluación del cuerpo cuantificable, completa, dosificación reiterativa y evaluación, es decir múltiples puntos de tiempo y efectos potencialmente transferibles de preclínico (pequeño animal) a resultados (humanos) clínicos. Para algunas solicitudes, el bioimaging suplanta o minimiza la cantidad de experimentos de animal en preestudios clínicos.
Los métodos de etiquetaje del péptido son conocidos. Ver Haugland, 2003, el Libro de instrucciones de Sondas Molecular de Sondas Fluorescentes y Productos químicos de Investigación, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Etiquetaje No radiactivo: Un Enfoque Práctico, Edición académica, Londres; Medios (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Cristalero y al (1975) Modificación Química de Proteínas. Métodos de laboratorio en Bioquímica y Biología molecular (T. S. Funcione y E. Funcione, Editores) American Elsevier Publishing Co., Nueva York; Lundblad, R. L. y Noyes, C. M. (1984) Reactivos Químicos para Modificación Proteica, Vols. Yo y II, Prensa dé CRC, Nueva York; Pfleiderer, G. (1985) "Modificación química de Proteínas", Métodos Modernos en Química Protéica, H. Tschesche, editor, Walter DeGryter, Berlín y Nueva York; y Wong (1991) Química de Conjugación Protéica y Entrecruzamiento, Prensa de CRC, Boca Ratón, Florida) ; De Leon-Rodriguez y al (2004) Chem. Eur. J. 10:1149-1155; Lewis y al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li y al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier y al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.
Los péptidos y las proteínas marcadas por dos porciones, un indicador fluorescente y Analizador de reacción en la proximidad suficiente experimentan a la energía de la resonancia de la fluorescencia se traslada (F ET). Los grupos indicadores son tintes por lo común fluorescentes que se excitan a la luz de una cierta longitud de onda y transfieren la energía a un aceptador, o el Analizador de reacción, el grupo, con el Desplazamiento de stokes adecuado para la emisión en el brillo máximo. Los tintes fluorescentes incluyen moléculas con la aromaticidad extendida, como fluoresceína y rodamina y sus derivados. El indicador fluorescente puede ser parcialmente o considerablemente inactivado por la porción del Analizador de reacción en un péptido intacto. Mediante la escisión del péptido por una peptidasa o proteasa, un aumento detectable de la fluorescencia puede cuantificarse (caballero, C. (1995) "Ensayos de Fluorimetric de Enzimas proteolíticas", Métodos en el Enzimología, Edición académica, 248:18-34).
Los anticuerpos marcados de la invención también pueden usarse como un agente de purificación de afinidad. En este proceso, el anticuerpo marcado se inmoviliza en una fase sólida una resina de Sephadex o papel de filtro, al usar métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el antígeno para purificarse, y a partir de entonces el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno para purificarse, que se une con la variante polipeptídica inmovilizada. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, como el amortiguador de glicina a pH 5.0 que liberará el antígeno de la variante polipeptídica.
El etiquetaje de reactivos por lo común alberga la funcionalidad reactiva que puede reaccionar (i) directamente con un tiol de cisteína de un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína para formar el anticuerpo marcado, (ii) con un reactivo ligador para formar un producto intermedio del marcador ligador, o (iii) con un anticuerpo ligador para formar el anticuerpo marcado. La funcionalidad reactiva de marcar reactivos incluye: maleimida, haloacetilo, iodoacetamida succinimidil éster (p.ej. NHS, N-hidroxisuccinimida), isotiocianato, cloruro del sulfonilo, 2,6-dichlorotriazinil, éster de pentafiuorofenilo y fosforamidita, aunque también puedan usarse otros grupos funcionales.
CONJUGACIÓN DE MALEIMIDA-BIOTINA A TIOFABS Las propiedades de TioFab anteriormente descritas se establecieron en la presencia de fago porque la fusión de Fab a la proteína de la capa del fago podría alterar potencialmente la accesibilidad del tiol de Cys o la reactividad. Por lo tanto, los constructos de TioFab se clonaron en un vector de expresión bajo el promotor de la fosfatasa alcalina (Chang y al (1987) Gene 55: 189-196) y la expresión de TioFab se indujo al cultivar células de E. coli en el medio sin fosfato. TioFabs se purificaron en Proteína G la columna de SEPHA OSE™ y analizaron en reducir y no reducir geles del SDS-PAGE. Estos análisis permiten la evaluación de si TioFabs mantuvieron su grupo del tiol reactivo o se volvieron inactivos al formar enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares. TioFabs L-V15C, L-V1 10C, H-A88C y H-A121C se expresaron y purificaron mediante Proteína G cromatografía en columna de SEPHAROSE™ (ver secciones de métodos para detalles). 7 Las proteínas purificadas se analizaron en el gel del SDS-PAGE en reducir (con DTT) y no reducir (sin DTT) afecciones. Otros agentes reductores como el BME (beta-mercaptoetanol) pueden usado en el gel para escindir grupos del disulfuro intercatenarios. Es evidente desde el análisis del gel del SDS-PAGE que la fracción (del -90%) principal de TioFab está en forma monomérica, mientras tipo silvestre el hu4D5Fabv8 está esencialmente en forma monomérica (47 kDa).
TioFab (A121C) y hu4D5Fabv8 tipo silvestre se incubaron con 100 exceso veces de MALEIMIDA-????G?? durante 3 horas a temperatura ambiente y Fabs biotinilados se cargaron en una columna de la filtración del gel de Superdex-200™. Esta etapa de purificación era útil en separar Fab monomérico de Fab oligomerico y también de MALEIMIDA-BIOTINA libre excedente (o fármaco citotóxico libre).
La Figura 5 muestra la validación de las propiedades de variantes de TioFab en ausencia del contexto del fago. Las proteínas sin la fusión del fago, hu4D5Fabv8 y hu4D5Fabv8-A121C (TioFab-A121C), se expresaron y purificaron mediante la utilización de perlas de la agarosa de proteína G seguidas de la incubación con 100 exceso molar veces de MALEIMIDA-BIOTINA. La estreptavidina y la unión HER2 de TioFab manipulado genéticamente cis biotinilado y Fab tipo silvestre no biotinilado se compararon. El grado de la conjugación de biotina (interacción con la estreptavidina) y su capacidad de unión a HER2 fue monitorizado por análisis del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Cada Fab se analizó en 2ng y 20ng.
TioFab A121C biotinilado mantuvo la unión HER2 comparable a ese de hu4D5Fabv8 tipo silvestres (Figura 5). Fab tipo silvestre y A121C-TioFab se purificaron por la cromatografía en columna de la filtración del gel. Las dos muestras se analizaron para HER2 y unión de la estreptavidina por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas al usar la cabra anti-Fab-HRP como el anticuerpo secundario. Ambos tipo silvestres (caja abierta) y TioFab (caja punteada) tienen la unión similar a HER2 pero sólo TioFab mantuvo la unión de la estreptavidina. Sólo un nivel de referencia de la interacción con la estreptavidina se observó con hu4D5Fabv8 tipo silvestre no biotinilado (Figura 5). La masa el análisis (LC-ESI-MS) espectral del biotinilado-TioFab (A121C) dio como resultado un pico principal con 48294.5 daltons comparado con hu4D5Fabv8 tipo silvestre (47737 daltons). La 537.5 diferencia daltons entre las dos moléculas exactamente corresponde a MALEIMIDA-BIOTINA individual conjugada a TioFab. La secuenciación de la proteína del detalle de la masa (Análisis del detalle de la masa de LC-ESI-Tandem) resulta adicionalmente confirmada que la molécula de biotina conjugada estaba en el residuo de Cys recién manipulado genéticamente (la Tabla 8, Ejemplo 3b).
SITIO CONJUGACIÓN ESPECÍFICA DE MALEIMIDA-BIOTINA A PÉPTIDO DE UNIÓN A LA ALBÚMINA (ABP)-TIOFABS La unión a proteínas plasmáticas puede ser unos medios efectivos de mejorar las propiedades farmacocinéticas de moléculas efímeras. La albúmina es la proteína más abundante en plasma. Los péptidos de unión de la albúmina sérica (ABP) pueden alterar la farmacodinámica de proteínas del dominio activas fusionadas, incluyendo la modificación de absorción tisular, penetración y difusión. Estos parámetros farmacodinámicos pueden ser modulados por la selección específica de la secuencia del péptido de unión de la albúmina sérica adecuada (US 20040001827). Una serie de péptidos de unión de la albúmina se identificó por la prueba de detección del despliegue de fagos (Dennis et al. (2002) "Unión de la Albúmina Como Una Estrategia General De Mejorar La Farmacocinética De Proteínas" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Los compuestos de la invención incluyen secuencias ABP mostradas por: (i) Dennis y al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 en la Tabla III y IV, la página 35038; (ii) US 20040001827 en
[0076]; y (üi) WO 01/45746 en las páginas 12-13, y de los cuales todos se incorporan aquí por referencia.
La Unión de la albúmina (ABP)-Fabs se manipuló genéticamente al fusionar un péptido de unión de la albúmina al extremo C-terminus de la cadena pesada de Fab en 1 : 1 proporción estequiométrica (1 ABP / 1 Fab). Se mostró que la asociación de estos ABP-Fabs con la albúmina aumentó su vida media en más de 25 vez en conejos y ratones. Los residuos de Cys reactivos anteriormente descritos pueden introducirse por lo tanto en estos ABP-Fabs y usado para la conjugación específica para el sitio con fármacos citotóxicos seguidos de estudios con aminales in vivo.
Las secuencias del péptido de unión de la albúmina ejemplificantes incluyen, entre otras cosas las secuencias aminoacídicas enumeradas en SEQ ID NOS: 1-5: CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: l QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO:2 QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO:3 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO:4 DICLPRWGCLW SEQ ID NO:5 Las secuencias del péptido de unión de la albúmina (ABP) unen la albúmina de múltiples especies (ratón, rata, conejo, bovino, macaco de la India, mandril y humano) con Kd (conejo) = 0.3 µ?. El péptido de unión de la albúmina no compite con ligandos conocidos unir la albúmina y tiene media vida (T½) en el conejo de 2.3 hr. Las proteínas de ABP-TioFab se purificaron en BSA-SEPHAROSE™ seguido de conjugación de MALEIMIDA-BIOTINA y purificación en la cromatografía en columna Superdex-S200 como se describe en secciones anteriores. Las proteínas biotiniladas purificadas eran homogéneas y carentes de cualquier forma oligomerica (Ejemplo 4).
La Figura 6 muestra las propiedades de PÉPTIDO DE UNIÓN A LA ALBÚMINA (ABP) variantes de-TioFab. Los análisis del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas se llevaron a cabo para analizar la capacidad de unión de ABP-hu4D5Fabv8-wt, ABP-hu4D5Fabv8-V110C y ABP-hu4D5Fabv8-A121C con albúmina del conejo, estreptavidina y HER2. ABP-TioFabs biotinilados tienen capacidad de la unión a la albúmina y HER2 con la afinidad similar a ese de ABP-hu4D5Fabv8 tipo silvestres como confirmados por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Figura 6) y análisis de la cinética de unión BIAcore (la Tabla 2). Una placa del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas se recubrió con la albúmina, HER2 y SA como se describe. La unión de ABP-TioFabs biotinilado a la albúmina, HER2 y SA se hibridó para producir una sonda con anti-Fab HRP. ABP-TioFabs biotinilados tuvieron capacidad de la unión a la estreptavidina comparado con no control biotinilado ABP-hu4D5Fabv8-wt indicación que ABP-TioFabs se conjugaron con MALEIMIDA-BIOTINA TioFabs similar con un sitio manera específica ya que los mismos mutantes de Cys se usaron para ambos las variantes (Figura 6).
Tabla 2. análisis cinético BIAcore para HER2 y unión de la albúmina de conejo a ABP-biotinilado hu4D5Fabv8 tipo silvestre y TioFabs ABP = péptido de unión de la albúmina Alternativamente, un péptido de unión a la albúmina puede unirse al anticuerpo por la unión covalente a través de una porción ligador.
INGENIERÍA DE ABP-TIOFABS CON DOS GRUPOS TIOL LIBRES POR FAB Los resultados anteriores indican que todos los cuatro (L-V15C, L-Vl 10C, H-A88C y H-A121C) tioFab (anticuerpos de Fab manipulados genéticamente con cisteína) las variantes tienen grupos del tiol reactivos que pueden usarse para el sitio la conjugación específica con un reactivo del marcador, reactivo ligador o producto intermedio ligador por el fármaco. L-V15C puede expresarse y purificado, pero con producciones relativamente bajas. Sin embargo la expresión y las producciones de purificación de L-Vl 10C, H-A88C y variantes H-A121C eran similares a ese de hu4D5Fabv8. Por lo tanto estos mutantes pueden usarse para el análisis adicional y recombinado para obtener más de un grupo del tiol por Fab. Hacia este objetivo, un grupo del tiol en la luz y un en la cadena pesada se construyó para obtener dos grupos del tiol por molécula de Fab (L-V110C/H-A88C y L-VI 10C/H-A121C). Estas dos dobles variantes de Cys se expresaron en un sistema de expresión de E. coli y purificaron. La homogeneidad de ABP-TioFabs biotinilado purificado se encontró similar a esa de variantes de Cys individuales.
Los efectos de ingeniería dos residuos de Cys reactivos por Fab se investigaron (Figura 7). La presencia de segunda biotina se analizó al sondar la unión de ABP-TioFab biotinilado a SA al usar la estreptavidina-HRP (Figura 7). Para el análisis HER2/Fab, una placa del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas se recubrió con HER2 y sondó con anti-Fab HRP. Para el análisis SA/Fab, una placa del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas se recubrió con SA y sondó con anti-Fab HRP. Para el análisis SA/SA, una placa del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas se recubrió con SA y sondó con SA-HRP. Figura 7. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas analiza para la interacción de ABP-hu4D5Fabv8 biotinilado cis variantes con HER2, estreptavidina (SA). HER2/Fab, SA/Fab y SA/SA indican que sus interacciones fueron monitorizadas por anti-Fab-HRP, SA-HRP, respectivamente. SA/Fab monitoriza la presencia de biotina individual por Fab y más de una biotina por Fab es monitorizada por el análisis SA/SA. La unión de HER2 con dobles mutantes cis es similar a esa de variantes de Cys individuales (Figura 7). Sin embargo el grado de biotinilación en dobles mutantes de Cys era más elevado comparado con variantes de Cys individuales debido a más de un grupo del tiol libre por molécula de Fab (Figura 7). TIOL DE OF TÉCNICO IgG VARIANTS TRASTUZUMAB DE OF Cisteína se introdujo en el anticuerpo monoclónico de cadena completa, trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech Inc.) en ciertos residuos. Los mutantes cis individuales H-A88C, H-Al 21 C y L-Vl 1 OC del trastuzumab y dobles mutantes cis VI 10C-A121C y V110C-A121C del trastuzumab se expresaron en el CHO (Ovario de hámster chino) células por la fermentación transitoria en medios que contienen cisteína de 1 mm. La secuencia de la cadena pesada del muíante A88C (450 aa) es SEQ ID NO:6. La secuencia de la cadena pesada del muíante A121C (450 aa) es SEQ ID NO:7. La secuencia de la cadena ligera del muíante V 11 OC (214 aa) es SEQ ID NO: 8.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARI YPTNGYTRY ADSVKGRFTISADTSKNTAILQMNSLRCEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSS GLYS LS S WTVP S S S LGTQTYICN VNHKP SNTKVDKKVEP S CDKTHTCPPC PAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPG GLEWVARI YPTNGYTRY ADSVKGRFTISADTS NTAILQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDY WGQGTLVTVSS CSTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV FNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTCAAP SVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKAD YEKHKVY ACE VTHQGLS SP VT SFNRGEC SEQ ID NO:8 Según una modalidad, los anticuerpos del trastuzumab del tiol manipulados genéticamente con cisteína comprenden uno o más de lo siguiente secuencias de la cadena pesada de la región variable con un aminoácido de cisteína libre (SEQ ID NOS: 9-16).
Según otra modalidad, los anticuerpos del trastuzumab del tiol manipulados genéticamente con cisteína comprenden uno o más de lo siguiente secuencias de la cadena ligera de la región variable con un aminoácido de cisteína libre (SEQ ID NOS: 17-27).
El trastuzumab dd tiol, de cadena completa resultante variantes de IgG se analizó mediante ensayos para reactividad dd tiol y actividad vinculante HER2. La Figura 1 OA muestra una descripción dd dibujo animado de la unión dd anticuerpo biotinilada a HER2 inmovilizado y HRP marcó d anticuerpo secundario para la detecdón de la absorbanda La Figura 10B muestra ajaríificadones de unión a HER2 inmovilizado con la detecdón de la absorbanda en 450 nm de (dejado al derecho): trastuzumab tipo silvestre no biotinilado (Peso), MALEM1DA- BIOTINA conjugó variantes del trastuzumab del tiol VI 10C (cis individual), A121C (cis individual), y VI 10C-A121C (doble cis). Cada liol variante de IgG y trastuzumab se analizó en 1, 10, y 100 ng. Las cuantificaciones muestran que TIOMABS anti-HER2 biotinilados mantiena la actividad vinculante HER2.
La Figura 11 A muestra una áescripción del dibujo animado de una unión del anticuerpo biotinilada a HER2 inmovilizado con la unión de biotina a anti-IgG-HRP para la detección de la absorbanda. La Figura 14B muestra que las cuantificaáones de urrión con la detecdón de la absorbanda en 450 nm de MALEIMIDA-BIOTINA conjugaron variantes dd trastuzumab dd tiol y trastuzumab tipo silvestre no biotinilado en la unión a la estreptavidina De la izquierda a la derecha- V110C (cis individual), A121C (cis individual), V110GA121C (duplican cis), y d trastuzumab. Cada tiol variante dd trastuzumab de IgG y trastuzumab parental se analizó en 1 , 10, y 100 ng. Las cuantificadones muestran que TIOMABS HER2 tienen la devada reactividad dd tiol.
Cisterna se introdujo en d de cadena completa 2H9 aná-EphB2R anticuerpo en datos residuos. H muíante ds individual H-A121C de 2H9 se expresó en d CHO (Ovario de hámster chino) células por la fermentadón transitoria en medios que contienen dsttína de 1 m FJ A121C 2H9 secuencia de la cadena pesada dd muíante (450 aa) es SEQ IDN028.
EVQL\^SGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTT^ TDY SS CSTKGPSVFT'LAPSSKSTSGGTA^ GL YS LS S VVTVP S S S LGTQTYICN VNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVD SRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:28 Los anticuerpos del tiol-2H9 manipulados genéticamente con cisteína comprenden las secuencias de la cadena pesada de la región constante de Fe que siguen con un aminoácido de cisteína libre (SEQ ID NOS: 29-38).
Cisteína se introdujo en el de cadena completa 3A5 anti-MUC16 anticuerpo en ciertos residuos. El mutante cis individual H-A121 C de 3A5 se expresó en el CHO (Ovario de hámster chino) células por la fermentación transitoria en medios que contienen cisteína de 1 mm. El A121 C 3A5 secuencia de la cadena pesada del mutante (446 aa) comprende SEQ ID NO:39.
DVQLQESGPGLVNPSQSLSLTCTVTGYSITNDYAWNWIRQFPGNKLEWMG YINYSGYTTY NPSLKSRISITRDTSKNQFFLHLNSVTTEDTATYYCARWDGGLTYWGQGTL VTVSACSTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT VDK VEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVF LFPP P DTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEV FNWYVDGVEVHNA T P REEQY STYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA GQPREPQVYTLP PSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:39 El tiol-3A5 manipulado genéticamente con cisteína anti-MUC16 anticuerpos comprende las secuencias de la cadena pesada de la región variable que siguen con un aminoácido de cisteína libre (SEQ ID NOS: 40-44).
El tiol-3A5 manipulado genéticamente con cisteína anti-MUC16 anticuerpos comprende las secuencias de la cadena ligera de la región variable que siguen con un aminoácido de cisteína libre (SEQ ID NOS: 45-49).
INGENIERÍA Y REACTIVIDAD DEL TIOL DE 4D5 ANTI-HER2 TIOFABS Cisteína se introdujo en cada posición de la cadena pesada y cadena ligera del anti-HER2 hu4D5Fabv8 el anticuerpo del fragmento Fab. Todos los 440 de los mutantes de la cadena pesada y mutantes de la cadena ligera se prepararon según los métodos descritos aquí. La reactividad del tiol se cuantificó según el ensayo de PHESELECTOR. Las secuencias de la cadena pesada son numeradas por el sistema Secuencial de numeración. Las secuencias de la cadena ligera siguen Kabat sistema de numeración. En la cadena ligera, tanto Kabat como Sequential numerar denotan mismas cantidades.
La cadena pesada hu4D5Fabv8 mutantes se seleccionó para la unión eficiente a la proteína del receptor HER2 (Figuras 2 y 3) y reactividad del tiol con el reactivo de la biotinilación, Biotin-PEO-maleimide (Ejemplos 1 y 2). Los ciertos mutantes de la cadena pesada tienen limitado o comprometieron la unión a HER2 ECD porque esto es un residuo importante para la unión del antígeno (HER2), ubicado en CDR en la región variable del anticuerpo-Fab. Algunos residuos ubicados en el dominio constante de Fabs también dieron como resultado la baja unión HER2 porque estos residuos pueden contribuir a estructura y plegado de Fab, así dando como resultado baja demostración de 4D5-Fab en la M13-página (Junutula, IR. et al. (2008) J. Métodos de Immunol, 332:41-52). La cadena pesada hu4D5Fabv8 mutantes con bajo HER2 ECD unión incluyó mutaciones de cisteína en poáciones 1, 21, 31, 33-36, 38, 48-50, 59, 87, 95, 101, 104, 129, 131, 132, 136, 153, 155, 159, 166, 169, 170, 172, 197, 198, 202, 215, 219. Las variantes de cisteína tipo silvestres 22, 96, 147, 203, 223 se cuantificaron. Otros mutantes de la cadena pesada tienen la reactividad del tiol limitada con el reactivo de la biotiralación. El residuo aminoacídico de cisteína libre está en el centro con flanquear residuos en las secuencias en la columna intermedia de la Tabla 3. El aminoácido sustituido y la posición en la cadena pesada se designan en la columna izquierda. Cadena pesada hu4D5Fabv8 mutantes SEQ ID NOS: 50-98 de la Tabla 3 han mantenido la unión HER2 y la reactividad del tiol valora de aproximadamente 0.8 o mayor, excluyendo variantes de cisteína tipo silvestres. Anticuerpos con SEQ ID NOS: 50-98 (la Tabla 3) han demostrado la reactividad del tiol y puede ser útil para formar uniones covalentes con un marcador de captura, un marcador de detección, una porción del fármaco o un soporte sólido. Los mutantes de la cadena pesada de la Tabla 3 pueden conjugarse como TioFabs o TIOMABS por ejemplo como conjugados anticueroo-fármaco.
Tabla 3 mutantes hu4D5Fabv8 de unión Eficiente, cadena pesada reactiva por tiol La cadena ligaa hu4D5Fabv8 mutantes se sdecdonó para la unión eficiente a la proteína del receptor HER2(Figuras2y3) yieactividaddel tiol con d reactivo de la bictinilad^ 1 y 2). Lee dertee mutantes de k cadena residuo importante para la unión dd antígeno (HER2), ubicado en CDR en la región variable dd anticuerpo-Fab. Algunos residuos ubicados en d dominio constante de Fab también dieron como resultado la baja unión HER2 porque estos residuos pueden ccrrtribuir a estructura y plegado de Fab, así dando como resultado baja demostradón de 4D5-Fab en la M13-página (Junutda, IR. d al (2008) J. Métodos de Immunol, 332:41-52). La cadena ligera hu4D5Fabv8 mutantes con la baja unión a HER2 incluyó a mutantes de ásteína en posidones 4, 29-32, 35, 36, 50, 82, 86, 89-91, 113, 115, 117, 120, 126, 128, 139, 141, 146, 148, 179, 186, 192, 202 Las variantes de cisterna tipo silvestres 23, 134, 194, 214 secuantificaron Otros mutantes dek con d reactivo de la biotiniladón H residuo atriirioaddico de cisterna libre está en d centro con flanquear residuos en las secuencias en la columna intermedia de la Tabla 4. El aminoácido sustituido y la posidón en la cadena ligera se designan en la columna izquierda. Cadena ligera hu4D5Fabv8 mutantes SEQ ID NOS: 99-147 de la Tabla 4 han mantenido la unión HER2 y la reactividad dd tiol valora de aproximadamente 0.8 o mayor, excluyendo variantes de cisterna tipo silvestres. Anticuerpos con SEQ ID NOS: 99-147 (la Tabla 4) han demostrado la reactividad dd tiol y puede ser útil para formar uniones covalentes con un marcador de captura, un marcador de detecdón, una porción dd fármaco o un soporte sólido. Los mutantes de la cadena ligera de la Tabla 4 pueden conjugarse como TioFabs o TIOMABS por ejemplo como conjugados ariticuerpc-firmaco.
Tabla 4 mutantes hu4D5Fabv8 de unión eficiente, cadena ligera reactiva por tiol REACTIVIDAD TIOL DE TIOMABS La reactividad del tiol del de cadena completa, los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína de IgG (TIOMABS) se cuantificaron por biotinilación y unión de la estreptavidina (US 7521541). Un ensayo del western blot (transferencia western) se configuró hasta el tamiz Tio ab que específicamente se conjuga con MALEIMIDA-BIOTINA. En este ensayo, los anticuerpos se analizan en reducir el SDS-PAGE y la presencia de Biotina específicamente se sonda al incubar con la estreptavidina-HRP. Como observado de la figura 18, la interacción de la estreptavidina-HRP o se observa en cadena pesada o cadena ligera según la cual la variante cis manipulada genéticamente se usa y ninguna interacción se observa con el tipo silvestre, indicando que las variantes de TioMab específicamente conjugaron biotina en el residuo de Cys manipulado genéticamente. La Figura 18 muestra el análisis del gel que desnaturaliza de variantes del Tiol-IgG reducidas, biotiniladas después de la captura en anti-lgG-HRP inmovilizado (gel superior) y estreptavidina-HRP (gel de la parte inferior). División 1 : 3A5 H-A121C. División 2: 3A5 L-Vl lOC. División 3: 2H9 H-A121C. División 4: 2H9 L-Vl lOC. División 5: anti-EphB2R 2H9 parental, tipo silvestre. Cada mutante (divisiones 1-4) fue capturado por anti-IgG con la detección HRP indicación (superior) que se mantuvieron la selectividad y la afinidad. Captura por estreptavidina inmovilizada con detección HRP (parte inferior) confirmada la ubicación de biotina en cadenas pesadas y ligeras. La ubicación de la mutación de cisteína en los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína en divisiones 1 y 3 es la cadena pesada. La ubicación de la mutación de cisteína en los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína en divisiones 2 y 4 es la cadena ligera. El sitio de la mutación de cisteína experimenta a la conjugación con el reactivo de MALEIMIDA-BIOTINA.
El análisis de los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína de TioMab de la Figura 18 y un 2H9 variante de VI 5C por LC/MS proporcionó la indicación cuantitativa de la reactividad del tiol (la Tabla 5).
Tabla 5 cuantificación de LC/MS de biotinilación de TIOMABS - reactividad del La ingeniería de cisteína se llevó a cabo en el dominio constante, es decir Región Fe, de anticuerpos IgG. Una variedad de sitios aminoacídicos se convirtió a sitios de cisteína y los imitantes expresados para, es decir los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína, se evaluaron para su reactividad del tiol. Biotinilado 2H9 TioMab las variantes de Fe se evaluaron para la reactividad del tiol por la cuantificación HRP por la captura en la estreptavidina inmovilizada en un ensayo del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Figura 19). Un ensayo del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas se estableció para seleccionar rápidamente los residuos de Cys con grupos del Tiol reactivos, como se representa en la Figura 19 diagrama esquemático, la interacción de biotina de la estreptavidina se monitoriza al sondar con anti-IgG-HRP seguido al cuantificar la absorbancia en 450 nm. Estos resultados variantes 2H9-TioFc confirmadas V282C, A287C, A339C, S375C y S400C tienen moderado a la reactividad del Tiol más elevada. El grado de la conjugación de biotina de 2H9 TioMab las variantes de Fe fueron cuantificadas por el análisis LS/MS como incluyó en un informe en la Tabla 6. El análisis LS/MS confirmado que el A282C, S375C y las variantes S400C tienen la conjugación de biotina del 100% y V284C y A339C tiene la conjugación del 50%, indicando la presencia de un grupo del tiol de cisteína reactivo. Las otras variantes de TioFc, y el parental, tipo silvestre 2H9, tienen muy poca biotinilación o ninguno.
Tabla 6 cuantificación de LC/MS de biotinilación de 2H9 Fe TIOMAB S REACTIVIDAD DEL TIOL DE TIOL-4D5 VARIANTES DE LA CADENA LIGERA DE FAB La prueba de detección de una variedad de la variante de la cadena ligera manipulada genéticamente con cisteína que Fabs del anticuerpo antiErbB2 4D5 proporcionó a varias variantes con un valor de la reactividad del tiol de 0.6 y mayor (la Tabla 7), como se cuantifica por el ensayo de PHESELECTOR de la Figura 8. Los valores de la reactividad del tiol de la Tabla 7 se normalizan a la cadena pesada 4D5 variante de TioFab (HC-A121C) que se configura en el 100%, asumiendo la biotinilación completa de la variante HC-A121C, y representado según capacidades adquisitivas del centavo.
Tabla 7 Valores del porcentaje de reactividad del Tiol de variantes 4D5 TioFab de cadena ligera CONJUGADOS ANTICUERPO-FÁRMACO Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína de la invención pueden conjugarse con cualquier agente terapéutico, es decir porción del fármaco, que puede unirse covalentemente al anticuerpo a través de un grupo del tiol de cisteína reactivo.
Una modalidad ejemplificante de un compuesto del conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína (Ab) y una porción del fármaco (D) donde el anticuerpo tiene uno o más aminoácidos de cisteína libres, y el anticuerpo se fija a través de uno o más aminoácidos de cisteína libres por una porción ligador (L) a D; la composición que tiene la Fórmula I: Ab-(L-D) p I donde p es 1, 2, 3, o 4. La cantidad de porciones del fármaco que pueden conjugarse vía un reactivo del tiol porción ligador a una molécula de anticuerpo es limitada por la cantidad de residuos de cisteína que se introducen por los métodos descritos aquí. ADC 9 ejemplificantes de la Fórmula I por lo tanto comprenden anticuerpos que tienen 1, 2, 3, o 4 aminoácidos de cisteína manipulados genéticamente.
Otra modalidad ejemplificante de un compuesto del conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína (Ab), un péptido de unión a la albúmina (ABP) y una porción del fármaco (D) donde el anticuerpo se fija a la porción del fármaco por una porción ligador (L) y el anticuerpo se fija al péptido de unión a la albúmina por una unión de la amida o una segunda porción ligador; la composición que tiene la Fórmula la: ABP-Ab-(L-D) p Ia donde p es 1 , 2, 3, o 4.
Los compuestos ADC de la invención incluyen a aquellos con la utilidad para la actividad contra el cáncer. En términos particulares, los compuestos incluyen un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína conjugado, es decir unido covalentemente por un ligador, a una porción del fármaco, es decir toxina. Cuando el fármaco no se conjuga a un anticuerpo, el fármaco tiene un efecto citotóxico o citostático. La actividad biológica de la porción del fármaco es así modulada por la conjugación a un anticuerpo. Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención selectivamente administran una dosis efectiva de un agente citotóxico al tejido tumoral por lo cual puede lograrse la mayor selectividad, es decir una dosis eficaz inferior.
PORCIONES DEL FÁRMACO La porción del fármaco (D) de los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) incluye cualquier compuesto, la porción o el grupo que tienen un efecto citotóxico o citostático. Las porciones del fármaco incluyen: (i) agentes quimioterapéuticos, que pueden funcionar como inhibidores de la microtubulina, inhibidores de mitósis, inhibidores de la topoisomerasa o intercaladores de DNA; (ii) toxinas protéicas, que pueden funcionar enzimáticamente; y (iii) radioisótopos.
Las porciones del fármaco ejemplificantes incluyen, entre otras cosas, maitansinoide, auristatina, dolastatina, tricoteceno, CC1065, una caliqueamicina y otros antibióticos de eneidina, un taxano, antraciclina, y estereoisómeros, isosteres, análogos o derivados de lo mismo.
Los compuestos de Maytansine adecuados para el uso como porciones del fármaco de maitansinoide son conocidos en la técnica y pueden aislarse de fuentes naturales según métodos conocidos, producidos al usar métodos de la ingeniería genética (ver a Yu y al (2002) PROC. NAT. ACAD. SCI. (USA) 99:7968-7973), o maytansinol y análogos maytansinol preparados sintéticamente según métodos conocidos.
Las porciones del fármaco de maitansinoide ejemplificantes incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, el como: C-19-dechloro (US 4256746) (preparado por reducción del hidruro de aluminio de litio de ansamytocin P2); C-20-hydroxi (o C-20-demethil) +/-C-19-dechloro (US Fácil. Núm. 4361650 y 4307016) (preparado por demethilation al usar Streptomyces o Actinomyces o dechlorination al usar LAH); y C-20-demetoxi, C-20-aciloxi (OCOR), +/-dechloro (Patente Estadounidense Número 4,294,757) (preparado por acilación al usar cloruros del acilo). y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones Las porciones del fármaco de maitansinoide ejemplificantes también incluyen aquellos que tienen modificaciones el como: C-9-SH (US 4424219) (preparado por la reacción de maytansinol con H2S o P2S5); C-14-alkoximethil (demetoxi/CH2 OR) (US 4331598); C-14-hydroximethil o aciloximethil (CH20H o CH20Ac) (US 4450254) (preparado de Nocardia); C-15-hydroxi/aciloxi (US 4364866) (preparado por la conversión de maytansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (US Fácil. Núm. 4313946 y 4315929) (aislado de Trewia nudlflora); C-18-N-demethil (US Fácil. Núm. 4362663 y 4322348) (preparado por el demethilation de maytansinol por Streptomyces); y 4,5-deoxi (US 4371533) (preparado por el titanio trichloride/LAH reducción de maytansinol). Muchas posiciones en compuestos maytansine se conocen para ser útiles como la posición de enlace, según el tipo del enlace. Por ejemplo, formando un enlace de éster, la posición c-3 tiene un grupo del hidroxilo, la posición C-14 modificada con el hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo del hidroxilo y la posición C-20 tiene un grupo del hidroxilo son todos adecuados.
La porción del fármaco (D) de los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de Fórmula I incluye maitansinoides que tienen la estructura: donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre de D a un ligador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). El R puede ser indistintamente H o alquilo C1-C6 seleccionado de metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilos, 1 -butilo, 2-metil-l -propilo, 2-butilo, 2-metil-2-propilo, 1-pentüo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-l -butilo, 2-metil-l-butilo, 1-hexil, 2-hexil, 3-hexil, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metü-2-pentilo, 3-menl-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo y 3,3-dimetil-2-butilo. La cadena de alquileno que une el grupo de la amida al átomo de azufre puede ser metanil, etanil, o propilo, es decir m es 1 , 2, o 3.
Los compuestos de Maytansine inhiben proliferación celular al inhibir la formación de microtúbulos durante mitósis a través de la inhibición de la polimerización de la proteína de la microtubulina, tubulin (Remillard y al (1975) Ciencia 189:1002-1005). Maytansine y maitansinoides son muy citotóxicos pero su uso clínico en la terapia contra el cáncer ha sido enormemente limitado por sus efectos secundarios sistémicos graves principalmente atribuidos a su baja selectividad para tumores. Los ensayos clínicos con maytansine tienen sido descontinuó debido a reacciones adversas serias en el sistema nervioso central y sistema gastrointestinal (Issel y al (1978) Puede. Tratamiento. Rev 5:199-207).
Las porciones del fármaco de maitansinoide son porciones del fármaco atrayentes en conjugados anticuerpo-fármaco porque éstos son: (i) relativamente accesible para preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de la fermentación, (ii) dispuesto a derivatización con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de los ligadores del no disulftiro a anticuerpos, (iii) cuadra en plasma, y (iv) efectivo contra una variedad de líneas de la célula tumoral (US 2005/0169933; WO 2005/037992; US 5208020).
Como con otras porciones del fármaco, todos los estéreo isómeros de la porción del fármaco de maitansinoide se contemplan para los compuestos de la invención, es decir cualquier combinación de R y configuraciones S en carbonos quirales de D. En una modalidad, la porción del fármaco de maitansinoide (D) tendrá la estereoquímica que sigue: Las modalidades ejemplificantes de porciones del fármaco de maitansinoide incluyen: DM1, (CR2) m = CH2CH2; DM3, (CR2)m = CH2CH2CH (CH3); y DM4, (CR2)m = CH2CH2C (CH3)2, que tienen las estructuras: El ligador puede fijarse a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, según el tipo del enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede formarse por la reacción con un grupo del hidroxilo al usar métodos de la copulación convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición c-3 que tiene un grupo del hidroxilo, la posición C-14 modificada con el hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo del hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo del hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición c-3 de maytansinol o un análogo maytansinol.
La porción del fármaco (D) de los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de Fórmula I también incluye dolastatinas y sus análogos peptídicos y derivados, auristatinas (Números de la Patente de E.U. 5635483; 5780588). Dolastatinas y auristatinas se han mostrado para interferir con dinámica del microtúbulo, hidrólisis de GTP y división nuclear y celular (Woyke y al (2001) Antimicrob. Agents y Chemoter. 45 (12):3580-3584) y tienen contra el cáncer (US 5663149) y actividad antifungica (Pettit y al (1998) Antimicrob. Los agentes Chemoter. 42:2961-2965). Diversas formas de dolastatina o porción del fármaco de auristatina pueden unirse covalentemente a un anticuerpo a través del N (amino) término o el C (carboxilo) el término de la porción del fármaco peptídica (WO 02/088172; Doronina y al (2003) Biotecnología de la Naturaleza 21 (7):778-784; Francisco y al (2003) Sangre 102 (4):1458-1465).
Las porciones del fármaco incluyen dolastatinas, auristatinas (US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431), y análogos y derivados de lo mismo. Dolastatinas y auristatinas se han mostrado para interferir con dinámica del microtúbulo, hidrólisis de GTP y división nuclear y celular (Woyke y al (2001) Antimicrob. Agents y Chemoter. 45 (12):3580-3584) y tienen contra el cáncer (US 5663149) y actividad antifúngica (Pettit y al (1998) Antimicrob. Los agentes Chemoter. 42:2961-2965). Dolastatina o la porción del fármaco de auristatina pueden fijarse al anticuerpo a través del N (amino) término o él C (carboxilo) el término de la porción del fármaco peptídica (WO 02/088172).
Las modalidades de auristatina ejemplificantes incluyen las porciones del fármaco de monometilauristatina unidas del extremo N-terminus DE y DF, descrito en US 7498298 y US 7659241, la descripción de cada uno que expresamente se incorpora por referencia en su totalidad.
La porción del fármaco (D) de los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de Fórmula I incluye las porciones del fármaco de monometilauristatina MMAE y MMAF unido a través del extremo N-terminus al anticuerpo, y que tiene las estructuras: Por lo común, las porciones del fármaco basadas en el péptido pueden prepararse al formar un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Los enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, según el método de síntesis de la fase líquida (ver E. Schróder y K. Lübke, "Los Péptidos", el tomo 1, pps 76-136, 1965, Edición académica) que es conocido en el campo de la química peptídica.
La porción del fármaco incluye caliqueamicina, y análogos y derivados de lo mismo. La familia de la caliqueamicina de antibióticos tiene capacidad de producir brotes del ADN bicatenario en concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, ver US 5712374; US 5714586; US 5739116; US 5767285; US 5770701, US 5770710; US 5773001; US 5877296. Los análogos estructurales de la caliqueamicina que se puede usar incluyen, entre otras cosas, ?11, 021 , a3', N-acetil-?? PSAG y en (Hinman et al Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al Cáncer Research 58:2925-2928 (1998).
Las toxinas protéicas incluyen: difteria Una cadena, fragmentos activos no obligatorios de toxina de la difteria, cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A (Vitetta y al (1987) Ciencia, 238: 1098), abrin Una cadena, modeccin Una cadena, alfa-sarcin, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAPS), momordica charantia inhibidor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibidor, gelonina, mitogellin, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos (WO 93/21232).
Los radioisótopos terapéuticos incluyen: 32P, 33P, 90Y, 1251, 1311, 131 pulgadas, 153Sm, 186Re, 188Re, 21 lAt, 212BÍ, 212Pb, e isótopos radiactivos de Lu.
El radioisótopo u otros marcadores pueden incorporarse en el conjugado de modos conocidos (Fraker y al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Anticuerpos monoclónicos en Immunoscintigraphy" Chatal, Prensa de CRC 1989). El carbón- 14-labeled l-isotiocianatobenzil-3-methildiethilene ácido triaminpentacético (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplificante para la conjugación de un radionúclido al anticuerpo (WO 94/1 1026).
LIGADORES Un "Ligador" (L) es una porción bifimcional o multifuncional que poderse usar para unir uno o más porciones del Fármaco (D) y una unidad del anticuerpo (Ab) para formar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la Fórmula I. Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) pueden convenientemente prepararse al usar un Ligador que tiene la funcionalidad reactiva para la unión al Fármaco y al Anticuerpo. Un tiol de cisteína de un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional de un reactivo ligador, una porción del fármaco o producto intermedio ligador por el fármaco.
En un aspecto, un Ligador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo del electrófilo que es el reactivo a cisteína nucleófila presente sobre en un anticuerpo. El tiol de cisteína del anticuerpo es el reactivo con un grupo del electrófilo en un Ligador y forma un enlace covalente a un Ligador. Los grupos del electrófilo útiles incluyen, entre otras cosas, maleimida y grupos de haloacetamida.
Los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína reaccionan con reactivos ligadores o productos intermedios ligadores por el fármaco, con grupos funcionales del electrófilo como maleimida o carbonilo a-halo, según el método de la conjugación en la página 766 de Klussman, y al (2004), Química de Bioconjugate 15 (4):765-773, y según el protocolo del Ejemplo 4.
En aún otra modalidad, el grupo reactivo de un reactivo ligador o producto intermedio ligador por el fármaco contiene un grupo funcional reactivo por el tiol que puede formar un enlace con un tiol de cisteína libre de un anticuerpo. Los ejemplos de grupos funcionales de reacción del tiol incluyen, entre otras cosas, maleimida, a-haloacetil, ésteres activados como ésteres de succinimida, 4 ésteres de nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros ácidos, cloruros del sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos.
En otra modalidad, el ligador puede ser un ligador del tipo dendrítico para la unión covalente de más de una porción del fármaco a través de una ramificación, porción ligador multifuncional a un anticuerpo (Sol y al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sol y al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 1 1 :1761-1768; Rey (2002) Letras del Tetraedro 43:1987-1990). Los ligadores dendríticos pueden aumentar la proporción molar de fármaco al anticuerpo, es decir carga, que se relaciona con la potencia del ADC. Así, donde un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína alberga sólo un grupo del tiol de cisteína reactivo, las porciones del fármaco múltiples pueden fijarse a través de un ligador dendrítico.
El ligador puede comprender residuos aminoacídicos que une el anticuerpo (Ab) a la porción del fármaco (D) del conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) manipulado genéticamente con cisteína de la invención. Los residuos aminoacídicos pueden formar un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o unidad de dodecapéptido. Los residuos aminoacídicos incluyen a los que ocurren naturalmente, así como aminoácidos menores y análogos aminoacídicos que ocurren artificialmente, como citrulina.
Las unidades del residuo aminoacídico útiles pueden diseñarse y optimizadas en su selectividad para la escisión enzimática por unas enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa tumoral y asociada para liberar una porción del fármaco activa. En una modalidad, una unidad del residuo aminoacídico, como citrulina de la valina (ve o val-cit), es esto cuya escisión es catalizada por catepsina B, C y D o una proteasa de la plasmina.
Una unidad ligador puede ser del tipo auto-destructivo como un p-aminobenzilcarbamoil (PAB) la unidad donde el ADC tiene la estructura ejemplificante: donde el Q es el alquilo Cl-C8,-0-(alquilo de C1-C8), - halógeno, - nitro o - ciano; m es un número entero que abarca desde 0-4; y p abarca desde 1 a 4.
Otros ejemplos de separadores auto-destructivos incluyen, entre otras cosas, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (US 7375078; Heno et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Letón. 9:2237) y orto o para-aminobenzilacetals. Los separadores pueden usarse lo que experimenta a la ciclación mediante hidrólisis de la unión de la amida, como amidas ácidas 4-aminobutíricas sustituidas y no sustituidas (Rodrigues y al (1995) Biología de la Química 2:223), biciclo apropiadamente sustituido [2.2.1] y biciclo[2.2.2] sistemas del anillo (Tormenta y al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas ácidas 2-aminophenilpropionic (Amsberry, y al (1990) J. Org. Chem. 55:5867). La eliminación de fármacos que contienen la amina que son sustituidos en glicina ( ingsbury y al (1984) J. Med. Chem. 27:1447) también son ejemplos del separador auto-destructivo útil en ADCs.
En otra modalidad, el ligador L puede ser un ligador del tipo dendrítico para la unión covalente de más de una porción del fármaco a través de una ramificación, porción ligador multifuncional a un anticuerpo (Sol y al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sol y al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11 : 1761-1768). Los ligadores dendríticos pueden aumentar la proporción molar de fármaco al anticuerpo, es decir carga, que se relaciona con la potencia del ADC. Así, donde un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína alberga sólo un grupo del tiol de cisteína reactivo, las porciones del fármaco múltiples pueden fijarse a través de un ligador dendrítico (WO 2004/01993; Szalai y al (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis y al (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731 ; Amir y al (2003) Angew. Chem. Editor Internacional 42:4494-4499).
Las modalidades de la Fórmula compuestos del conjugado anticuerpo-fármaco de la incluyen (val-cit), (MC-val-cit), y (MC-val-cit-PAB): Otras modalidades ejemplificantes de la Fórmula compuestos del conjugado anticuerpo-fármaco de la incluyen las estructuras: y R es indistintamente H o alquilo C1-C6; y n es 1 a 12.
En otra modalidad, un Ligador tiene un grupo funcional reactivo que tiene un grupo nucleófilo que es el reactivo a un grupo del electrofilo presente sobre en un anticuerpo. Los grupos del electrofilo útiles en un anticuerpo incluyen, entre otras cosas, aldehido y grupos de carbonilo de la cetona. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un Ligador puede reaccionar con un grupo del electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente a una unidad del anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un Ligador incluyen, entre otras cosas, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. El grupo del electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente a la unión de un Ligador.
Por lo común, los Ligadores del tipo peptídico pueden prepararse al formar un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Los enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, según el método de síntesis de la fase líquida (E. Schroder y K. Lübke (1965) "Los Péptidos", el tomo 1, pps 76-136, Edición académica) que es conocido en el campo de la química peptídica.
En otra modalidad, el Ligador puede ser sustituido con grupos que modularon la solubilidad o la reactividad. Por ejemplo, un sustituto cargado como sulfonato (-S03-) o amonio, puede aumentar la solubilidad hídrica del reactivo y facilitar la reacción de adición del reactivo ligador con el anticuerpo o la porción del fármaco, o facilitar la reacción de adición de Ab-L (producto intermedio ligador por el anticuerpo) con D o D-L (producto intermedio ligador por el fármaco) con Ab, según la vía de síntesis empleada para preparar el ADC.
Los compuestos de la invención expresamente contemplan, entre otras cosas, ADC preparado con reactivos ligadores: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-benzoato (4-vinilsulfone)), e incluir reactivos de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM (PEO) 3 y BM (PEO) 4, que se encuentran comercialmente disponibles de Pierce Biotechnology, Inc., Departamento de Atención al cliente, g.p. Ponga en una caja 117, Rockford, Illinois 61105 U.S.A, 1-800-874-3723, +815-968-0747 Internacionales. Ver Libro de instrucciones de Solicitudes de páginas 467-498, 2003-2004 y Catálogo. Los reactivos de bis-maleimida permiten la unión del grupo del tiol de un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína a una porción del fármaco que contiene el tiol, marcador o producto intermedio ligador, de una forma secuencial o concomitante. Otros grupos funcionales además de maleimida, que son el reactivo con un grupo del tiol de un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína, porción del fármaco, marcador o producto intermedio ligador incluyen iodoacetamida, bromoacetamide, piridina vinílica, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato.
Los reactivos ligadores útiles también pueden obtenerse vía otras fuentes comerciales, como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), o sintetizado de acuerdo con procedimientos descritos en Toki y al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; el Paseante, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch y al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
Citrulina de la valina ejemplificante (val-cit o ve) el reactivo del ligador del dipéptido que tiene un Ensanchador de maleimida y un para-aminobenzilcarbamoil (PAB) Separador auto-destructivo tiene la estructura: donde Q es el alquilo Cl-C8,-0-( alquilo de C1-C8), - halógeno, - nitro o - ciano; y m es un número entero que abarca desde 0-4.
Phe-lys ejemplificante (Mtr) reactivo del ligador del dipéptido que tiene una unidad del Ensanchador de maleimida y una Unidad de separación auto-destructiva p-aminobenzil puede prepararse según Dubowchik, et al. (1997) Letras del Tetraedro, 38:5257-60, y tiene la estructura: donde Mtr es mono-4-metoxitritil, el Q es el alquilo C l -C8,-0-(alquilo de C 1 -C8), - halógeno, - nitro o - ciano; y m es un número entero que abarca desde 0-4.
Los compuestos del conjugado anticuerpo-fármaco ej emplificantes de la invención incluyen: donde Val es la valina; Cit es citrulina; el p es 1 , 2, 3, o 4; y Ab es un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína. Otros conjugados anticuerpo-fármaco ejemplificantes donde porción del fármaco de maitansinoide DM1 se une a través de un ligador BMPEO a un grupo del tiol de trastuzumab tienen la estructura: donde Ab es un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína; n es 0, 1, o 2; y p es 1, 2, 3, o 4.
PREPARACIÓN DE CONJUGADOS ANTICUERPO-FÁRMACO El ADC de Fórmula I puede prepararse por varias rutas, empleando reacciones de la química orgánica, afecciones, y reactivos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo: (1) reacción de un grupo de cisteína de un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína con un reactivo ligador, para formar Ab-L intermedio ligador por el anticuerpo, vía un enlace covalente, seguido de la reacción con una porción del fármaco activada D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de una porción del fármaco con un reactivo ligador, para formar el ligador del fármaco intermedian D-L, vía un enlace covalente, seguido de la reacción con un grupo de cisteína de un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína. Los métodos de la conjugación (1) y (2) pueden emplearse con una variedad de anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína, porciones del fármaco y ligadores para preparar los conjugados anticuerpo-fármaco de la Fórmula I.
Los grupos del tiol de cisteína del anticuerpo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos del electrófilo en reactivos ligadores y productos intermedios ligadores por el fármaco incluyendo: (i) esteres activos como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformates, y haluros ácidos; (ii) alquilo y haluros del bencilo, como haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos de maleimida; y (iv) disulfuros, incluyendo disulfuros de piridilo, vía intercambio del sulfito. Los grupos nucleófilos en una porción del fármaco incluyen, entre otras cosas: amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y grupos de arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos del electrófilo en porciones ligadores y reactivos ligadores.
Maytansine puede convertirse, por ejemplo, hasta mayo - SSCH3, que puede reducirse al tiol libre, mayo - SH, y reaccionó con un anticuerpo modificado (Chari y al (1992) Investigación de cáncer 52:127-131) para generar un inmunoconjugado del anticuerpo de maitansinoide con un ligador del disulfuro. Los conjugados de maitansinoide del anticuerpo con ligadores del disulfuro se han reportado (WO 04/016801; US 6884874; US 2004/039176 Al; WO 03/068144; US 2004/001838 Al ; Patente de E.U. Núm. 6441163, 5208020, 5416064; WO 01/024763). El ligador del disulfuro SPP se construye con el reactivo ligador N-succinimidil 4-pentanoate (2-pyridiltio).
En ciertas afecciones, los anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína pueden elaborarse el reactivo para la conjugación con reactivos ligadores por el tratamiento con un agente reductor como el DTT (el reactivo de Cleland, ditiothreitol) o TCEP (tris clorhidrato del fosfino (2-carboxiethil); Getz y al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Empresas de Soltec, Beverly, Massachusetts). Los anticuerpos monoclónicos de cadena completa, manipulados genéticamente con cisteína (TIOMABS) expresado para en células CHO se redujeron con aproximadamente un 50 exceso veces de TCEP para 3 horas en 37 °C para reducir enlaces disulfuro que pueden formar entre los residuos de cisteína recién introducidos y el presente de cisteína en los medios de cultivo. TioMab reducido se diluyó y cargó en HiTrap S la columna en acetato de sodio de 10 mm, pH 5, y eluyó con PBS que contiene 0.3M cloruro de sodio. Los enlaces disulfuro se restablecieron entre el presente de residuos de cisteína en el progenitor Mab con diluyen (200 nM) sulfato de cobre acuoso (CuS04) a temperatura ambiente, durante la noche. Otros oxidantes, es decir agentes oxidantes, y afecciones que se oxidan, que se conocen en la técnica se pueden usar. La oxidación en aire ambiental también es efectiva. Esta etapa de la nueva oxidación leve, parcial forma disulfuros intracatenarios eficazmente con la alta fidelidad. Un 10 exceso veces aproximado de producto intermedio ligador por el fármaco, p.ej. El BM (PEO) 4-DM1 se agregó, mezclado, y deje representan aproximadamente una hora a temperatura ambiente para efectuar la conjugación y formar el conjugado anticuerpo-fármaco de TioMab. La mezcla de la conjugación era el gel filtrado y cargado y eluido a través de HiTrap S columna para eliminar impurezas intermedias y otras ligadores por el fármaco excedentes.
La Figura 11 muestra el proceso general para preparar un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína expresado para del cultivo celular para la conjugación. Los aductos de cisteína, probablemente junto con diversos enlaces disulfuro intercatenarios, reductivamente se escinden para proporcionar forma reducida del anticuerpo. Los enlaces disulfuro intercatenarios entre residuos de cisteína formados pares se reforman en afecciones de la oxidación parciales, como la exposición al oxígeno ambiental. Los residuos de cisteína recién introducidos, manipulados genéticamente, y sin formar pares permanecen disponibles para la reacción con reactivos ligadores o productos intermedios ligadores por el fármaco para formar los conjugados del anticuerpo de la invención. TIOMABS expresados para en líneas de la célula de mamífero dan como resultado externamente conjugó el aducto de Cys a Cys manipulado genéticamente a través de-S-S-formación de la unión. Por lo tanto TIOMABS purificados tienen que someterse a tratamiento con reducción y procedimientos de la oxidación como se describe en el Ejemplo 11 para producir TIOMABS reactivo. Estos TIOMABS se utilizan el conjugado con maleimida que contiene fármacos citotóxicos, fluoróforos y otros marcadores.
Una variedad de conjugados anticuerpo-fármaco de TioMab y TioFab se preparó (Ejemplos 4-8). El mutante de cisteína hu4D5Fabv8 (VI 10C) se conjugó con la porción del fármaco de maitansinoide DM1 con un reactivo bis-maleimido ligador BMPEO para formar el hu4D5Fabv8 (Vl lOC)-bmpeo-dml (Ejemplo 8).
ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR IN VITRO En términos generales, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) se cuantifica por: las células de mamífero que exponen que tienen proteínas del receptor, p.ej. HER2, al anticuerpo del ADC en un medio de cultivo celular; cultivar las células durante un período de aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 5 días; y viabilidad de la celda de cuantificación. Los ensayos in vitro basados en la célula se utilizaron la viabilidad de la medida (proliferación), citotoxicidad e inducción de apoptosis (activación de la caspasa) del ADC de la invención.
La potencia in vitro de conjugados anticuerpo-fármaco se cuantificó por un ensayo de proliferación celular (Figuras 10 y 11, Ejemplo 9). CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay está un comercialmente disponible (Promega Corp., Madison, Wisconsin), método del ensayo homogéneo basado en la expresión del recombinante de la luciferasa de Coleóptera (Números de la Patente de E.U. 5583024; 5674713 y 5700670). Este ensayo de proliferación celular determina la cantidad de células viables en el cultivo basado en la cuantificación del presente de ATP, un indicador de células metabólicamente activas (Inclinación y al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; US 6602677). CellTiter-Glo® Assay se llevó a cabo en 96 formato del pocilio, haciéndolo dispuesto a la detección de alto rendimiento (HTS) automatizada (Cree y al (1995) Fármacos anticancerígenos 6:398-404). El procedimiento del ensayo homogéneo implica adicionar el reactivo individual (CellTiter-Glo® Reagent) directamente a células cultivadas en el medio complementado por el suero. Lavado celular, la eliminación de etapas medias y múltiples que transfieren con pipeta no requiere. El sistema detecta tan sólo 15 células/pocilio en un formato de 384 pocilios en 10 minutos después de adicionar el reactivo y mezclado. Las células pueden someterse a tratamiento continuamente con ADC, o éstos pueden someterse a tratamiento y separado de ADC. En términos generales, las células tratadas brevemente, es decir 3 horas, mostraron los mismos efectos de la potencia que células continuamente tratadas.
El formato "de add-mix-measure" homogéneo da como resultado' la lisis celular y la generación de una señal luminiscente proporcional a la cantidad de presente de ATP. La cantidad de ATP es directamente proporcional a la cantidad del presente de células en el cultivo. CellTiter-Glo® Assay genera un "tipo del brillo" la señal luminiscente, producida por la reacción de la luciferasa, que tiene una semivida generalmente mayor que cinco horas, según tipo celular y medio usado. Las células viables se reflejan en unidades de la luminescencia relativa (RLU). El sustrato, Luciferina del Escarabajo, es oxidativamente descarboxilado por la photinus-luciferina-4-monooxigenasa (hidrolizante de ATP) del recombinante con la conversión concomitante de ATP a AMP y generación de fotones.
EFICACIA IN VIVO La eficacia in vivo de dos péptido-de-unión-DMl de la albúmina (maitansinoide) -conjugados del fármaco del anticuerpo (ADC) de la invención se cuantifica por una elevada expresión HER2 modelo, de ratón exvegetal transgénico (Figura 12, Ejemplo 10). Un aloinjerto se propaga del ratón transgénico de Fo5 mmtv que no responde a o responde mal a, terapia de HERCEPTIN®. Los pacientes se sometieron a tratamiento una vez con el ABP-rhuFab4D5-cis (cadena ligera)-DMl; ABP-rhuFab4D5-cis (cadena pesada)-DMl ; y el placebo control del amortiguador de PBS (Vehículo) y monitorizado más de 3 semanas para cuantificar el período de tiempo a duplicar tumoral, registre la eliminación por muerte celular y el encogimiento tumoral.
ADMINISTRACIÓN DE CONJUGADOS ANTICUERPO-FÁRMACO Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención pueden administrarse por cualquier ruta adecuada para la afección de someterse a tratamiento. El ADC se administrará por lo común parenteralmente, es decir infusión, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural.
FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Las formulaciones farmacéuticas de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) terapéuticos de la invención por lo común se preparan para administración parenteral, es decir bolo, inyección intravenosa, intratumoral con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable y en una dosis unitaria forma inyectable. Un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) que tiene el nivel deseado de la pureza opcionalmente se mezcla con diluyentes farmacéuticamente aceptables, portadores, excipientes o estabilizadores (las Ciencias Farmacéuticas de Remington (1980) 16ta edición, Osol, A. Editor), en forma de una formulación liofilizada o una solución acuosa.
TRATAMIENTOS DEL CONJUGADO ANTICUERPO-FÁRMACO Se contempla que los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la presente invención se pueden usar para tratar diversas enfermedades o trastornos, p.ej caracterizadas por la sobreexpresión de un antígeno tumoral. Las afecciones ejemplificantes o los trastornos hiperproliferativos incluyen tumores benignos o de neoplasia maligna; leucemia y neoplasias malignas linfoides. Los otros incluyen neuronal, glial, astrocítico, hipotalámico, glandular, macrofágico, epitelial, del estroma, blastocélico, inflamatorio, angiogénico e immunologic, incluyendo autoinmunitario, trastornos.
En términos generales, la enfermedad o trastorno para someterse a tratamiento es una enfermedad hiperproliferativa como cáncer. Los ejemplos de cáncer para someterse a tratamiento aquí incluyen, entre otras cosas, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o neoplasias malignas linfoides. Más ejemplos particulares de cánceres incluyen cáncer de la célula escamosa (p.ej. cáncer de la célula escamosa epitelial), cáncer de pulmón que incluye cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma de carcinoma pulmonar y escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, gástrico o cáncer del estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de la vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer del colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de la glándula salival, cáncer renal o renal, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, así como cáncer de la cabeza y cuello.
Las enfermedades autoinmunitarias para las cuales los compuestos ADC se pueden usar en el tratamiento incluyen trastornos reumatológicos (el como, por ejemplo, artritis reumatoide, síndrome de Sjógren, escleroderma, lupus como SLE y nefritis lupus, polimiositis/dermatomiositis, crioglobulinemia, síndrome del anticuerpo del antifosfolípido y artritis psoriatica), osteoartritis, trastornos gastrointestinales y hepáticos autoinmunitarios (el como, por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino (p.ej. Colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn), gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y enfermedad celiaca), vasculitis (el como, por ejemplo, vasculitis ANCA-asociada, incluyendo vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener y polyarteriitis), trastornos neurológicos autoinmunitarios (el como, por ejemplo, esclerosis múltiple, opsoclonus síndrome de mioclonia, miastenia grave, neuromyelitis óptica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y polineuropatía autoinmunitaria), trastornos renales (el como, por ejemplo, glomerulonefritis, el síndrome de Goodpasture y la enfermedad de Berger), trastornos dermatológicos autoinmunitarios (el como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, urticaria, pénfigo vulgar, penfigoide hulloso y lupus eritematoso cutáneo), trastornos hematológicos (el como, por ejemplo, purpura trombocitopénico, purpura trombocitopénico trombótico, posttransfusión purpura y anemia hemolítica autoinmunitaria), aterosclerosis, uveitis, enfermedades de la audiencia autoinmunitarias (el como, por ejemplo, enfermedad del oído interna y audiencia de pérdida), la enfermedad de Behcet, el síndrome de Raynaud, trasplante orgánico y trastornos endocrinos autoinmunitarios (el como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias relacionadas por los diabéticos como diabetes insulinodependiente mellitus (IDDM), la enfermedad de Addison, y enfermedad de la tiroides autoinmunitaria (p.ej, la enfermedad de las Tumbas y tiroiditis)). Más preferido las enfermedades incluyen, por ejemplo, la artritis reumatoide, la colitis ulcerativa, vasculitis ANCA-asociada, lupus, el esclerosis múltiple, el síndrome de Sjogren, la enfermedad de las Tumbas, IDDM, la anemia perniciosa, la tiroiditis y la glomerulonefritis.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un ADC dependerá del tipo de enfermedad para someterse a tratamiento, como se define mayor a, la gravedad y el curso de la enfermedad, si la molécula se administra con objetivos preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo y la discreción del médico que atiende. La molécula apropiadamente se administra al paciente en algún momento o sobre una serie de tratamientos. Según el tipo y la gravedad.de la enfermedad, aproximadamente 1 µg kg a 15 mg./kg (p.ej 0.1-20 mg./kg) de la molécula es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, si, por ejemplo, por uno o más administraciones separadas, o por la infusión continua. Una dosis diaria común podría abarcar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg./kg o más, según los factores mencionados anteriormente. Una dosis ejemplificante de ADC para administrarse a un paciente está en el intervalo aproximado 0.1 hasta aproximadamente 10 mg./kg del peso del paciente.
Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más largo, según la afección, el tratamiento se mantiene hasta que ocurra una supresión deseada de síntomas de enfermedad. Un programa de dosificación ejemplificante comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg./kg, seguidos de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg./kg de un anticuerpo anti-ErbB2. Otros esquemas de administración de la dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia es fácilmente monitorizado por métodos convencionales y ensayos.
MÉTODOS DE FORMACIÓN DE IMÁGENES DE ANTICUERPOS MARCADOS En otra modalidad de la invención, los anticuerpos manipulados genéticamente con cisterna pueden marcarse a través del tiol de cisteína con radionúclidos, tintes fluorescentes, porciones del sustrato que activan la biolurniniscencia, porciones del sustrato que activan la quirnioluminiscencia, enzimas y otros marcadores de detección para procesar gráficamente experimentos con solicitudes de diagnóstico, farmacodinámicas, y terapéuticas. En términos generales, el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína marcado, es decir "biomarcador" o "sonda", se administra por inyección, perfusión o ingestión oral a un organismo vivo, p.ej humano, roedor, u otro pequeño animal, un órgano perfundido o muestra tisular. La distribución de la sonda se detecta sobre un curso del periodo de tiempo y representado por una imagen.
ARTÍCULOS FABRICADOS En otra modalidad de la invención, un artículo fabricado o "kit", conteniendo materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente se proporciona El artículo fabricado comprende un recipiente y un marcador o inserto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, envase tipo blister, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tal como de cristal o plástico. El recipiente mantiene una composición del conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) que es efectiva para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón pierceable por una aguja de inyección hipodémiica). Al menos un agente activo en la composición es un ADC. El inserto del envase o el marcador indica que la composición se usa para tratar la afección de opción, como cáncer. Alternativamente, o además, el artículo fabricado puede comprender además un segundo (o tercero) recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostático para inyección (BWFI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución dextrosa. Puede incluir adidonalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y punto de vista del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
EJEMPLOS Ejemplo 1 - Preparadón de Fago TioFab Biotinilado El TioFab-fago (5 x 1012 partículas del fago) se reacdonó con 150 exceso veces de biotin-PEO-maleimide ((+) -biotinil-3-maleiniidopropionamidil-3,6-dioxaoctamea Oda y al (2001) Biotecnología de la Naturaleza 19:379-382, Pierce Biotechnology, Inc.) durante 3 horas a temperatura ambiente. El exceso biotin-PEO-maleimide se eliminó del fago conjugado por biotina por predpitadones de PEG repetidas (3-4 veces). Otros reactivos de la biotiniladón comerdalmente disponibles con grupos del electrófilo que son el reactivo con grupos del tiol de cisteína se pueden usar, incluyendo Biotina-BMCC, Biotina de PEO-iodoacetilo, Iodoacetil-LC-Biotin y Biotina-HPDP (Pierce Biotechnology, Inc.) y N - (3-maleimidilpropionil) biocitin (MPB, Sondas Moleculares, Eugene, Oregon). Otras fuentes comerciales para la biotinilación, los reactivos ligadores bifuncionales y multifuncionales incluyen Sondas Moleculares, Eugene, Oregon, y Sigma, San Luis, Misuri.
Biotin-PEO-maleimida Ejemplo 2 - Ensayo de PHESELECTOR Albúmina sérica de bovino (BSA), erbB2 dominio extracelular (HER2) y estreptavidina (100 µ? de 2 µg/ml) por separado se recubrió en placas de 96 pocilios de Maxisorp. Después de obstruirse con Tween-20 del 0.5% (en PBS), hu4D5Fabv8-TioFab-Phage biotinilados y no biotinilados (2xl01° partículas del fago) se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente seguida de la incubación con la peroxidasa de rábano el anticuerpo secundario marcado (de HRP) (anti-M13 proteína de la capa del fago, pVIII anticuerpo protéico). La Figura 8 ilustra el Ensayo de PHESELECTOR por una representación esquemática que representa la unión de Fab o TioFab a HER2 TioFab (superior) y biotinilado a la estreptavidina (parte inferior).
La reacción de HRP convencional se llevó a cabo y la absorbancia se cuantificó en 450 nm. La reactividad del tiol se cuantificó al calcular la proporción entre OD450 para la estreptavidina / OD450 para HER2. Un valor de la reactividad del tiol de 1 indica la biotinilación completa del tiol de cisteína. En caso de cuantifícaciones de unión protéicas Fab, hu4D5Fabv8 (2-20 ng) se usó seguido de la incubación con la cabra marcada de HRP anticuerpos anti-Fab policlónicos.
Ejemplo 3a - Expresión y Purificación de TioFabs TioFabs se expresaron mediante la inducción en 34B8, una cepa de E. coli no supresora (Baca y al (1997) Diario Química Biológica 272 (16): 10678-84). El granulado celular recolectado se suspendió de nuevo en el PBS (solución salina amortiguada con fosfato), la lisis celular total se llevó a cabo haciendo pasar a través de un microfluidizador y TioFabs se purificaron por la cromatografía de afinidad con proteína G SEPHAROSE™ (Amersham).
TioFabs L-V15C, L-V1 10C, H-A88C y H-A121 C se expresaron y purificaron mediante Proteína G cromatografía en columna de SEPHAROSE™. Oligomerico-Fab se encontró en fracciones 26 a 30, y la mayor parte de forma monomérica estaba en fracciones 31 -34. Las fracciones que comprenden forma monomérica se combinaron y analizadas por el SDS-PAGE junto con hu4D5Fabv8and tipo silvestre analizado en el gel del SDS-PAGE en reducir (con DTT o BME) y no reducir (sin DTT o BME) afecciones. Las fracciones de la filtración del gel de A121 C-TioFab se analizaron en no reducir el SDS-PAGE.
TioFabs se conjugaron con biotin-PEO-maleimide como se describe anteriormente y los biotinilados-TioFabs se purificaron mediante adicionalmente Superdex-200™ (Amersham) cromatografía de la filtración del gel, que eliminó biotin-PEO-maleimide libre y la fracción oligomerica de TioFabs. Hu4D5Fabv8 tipo silvestre y hu4D5Fabv8 A121 C-TioFab (0.5 mg. en la cantidad) eran cada uno y por separado incubaron con 100 exceso molar veces de biotin-PEO-maleimide durante 3 horas a temperatura ambiente y cargaron en una columna de la filtración del gel de Superdex-200 para separar biotina libre así como Fabs oligomerico de forma monomérica.
Ejemplo 3b - Análisis de TioFabs Los fragmentos del producto metabolizado enzimáticos de hu4D5Fabv8 biotinilado (A121 C) TioFab y hu4D5Fabv8 tipo silvestre se analizaron por la espectrometría de masas de la ionización por electroaspersión de la cromatografía líquida (LS-ESI-MS) La diferencia entre la 48294.5 masa primaria de hu4D5Fabv8 biotinilado (A121 C) y la 47737.0 masa primaria de hu4D5Fabv8 tipo silvestre era 557.5 unidades de masas. Este fragmento indica la presencia de una porción biotin-PEO-maleimide individual (C23H36N507S2). La Tabla 8 muestra la asignación de los valores de fragmentación que confirma la secuencia.
Tabla 8. Análisis del detalle de la masa de LC-ESI mediante TioFab hu4D5Fabv8 A121C biotinilado después de una digestión tríptica Antes y después de la filtración del gel de Superdex-200, los análisis del gel del SDS-PAGE, con y sin la reducción por DTT o BME, de ABP-biotinilado hu4D5Fabv8-A121C, ABP-biotinilado hu4D5Fabv8-V110C, doble Cys ABP-hu4D5Fabv8-biotinilado (V110C-A88C) y doble Cys ABP-hu4D5Fabv8-biotinilado (V1 10C-A121C) se llevaron a cabo.
Análisis de la espectrometría de masas (MS/MS) de hu4D5Fabv8-(Vl 10C)-BMPEO-DM1 (después de que purificación de la filtración del gel de Superdex-200): Fab+1 51607.5, Fab 50515.5. Estos datos muestran la conjugación del 91.2%. MS/ANÁLISIS DEL ESPECTRO DE MASA del hu4d5fabv8-(Vl 10Q-BMPEO-DM1 (redujo): LC 23447.2, LC+1 24537.3, HC (Fab) 27072.5. Estos datos muestran que toda la conjugación DM1 está en la cadena ligera de Fab.
Ejemplo 4 - Preparación de aBP-hu4D5Fabv8-(Vl 1QQ-MC-MMAE por conjugación de aBP-hu4D5Fabv8-(Vl 10C) y MC-MMAE El reactivo del ligador del fármaco, auristatina de maleimidocaproil-monometilo E (MMAE), es decir. MC-MMAE, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua en la concentración conocida, y adicionó a aBP-hu4D5Fabv8-enfríado (V110C) TioFab en la solución salina amortiguada con fosfato (PBS) según US 7521541, US 7659241 y US 7498298. Después de aproximadamente una hora, un exceso de maleimida se agrega para inactivar la reacción y tapa cualquier grupo del tiol del anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra por la ultrafiltración centrífuga y el abp-hu4d5fabv8-(Vl 10C)-MC-MMAE se purifica y desalado por la elución a través de resina de G25 en PBS, filtrado a través de 0.2 filtros de µp? en afecciones estériles, y congelado para el almacenamiento.
Ejemplo 5 - Preparación de aBP-hu4D5Fabv8-(LC VI 10O-MC-MMAF por conjugación de aBP-hu4D5Fabv8-(LC VI 10Q v MC-MMAF El abp-hu4d5fabv8-(LC VI 10C)-MC-MMAF se prepara por la conjugación de aBP-hu4D5Fabv8-(LC V1 10C) TioFab y MC-MMAF siguiente el procedimiento de Ejemplo 4.
Ejemplo 6 - Preparación de A121C-TioFab-mc-ABP-HC val-cit-PAB-MMAE por conjugación de ABP-HC A121C-TioFab v MC-val-cit-PAB-MMAE El abp-hu4d5fabv8-(HC A121C)-MC-val-cit-PAB-MMAE se prepara por la conjugación de aBP-hu4D5Fabv8-(HC A121C) y MC-val-cit-PAB-MMAE siguiente el procedimiento de Ejemplo 4.
Ejemplo 7 - Preparación de A121C-TioFab-mc-ABP-HC val-cit-PAB-MMAF por conjugación de ABP-HC A121C-TioFab v MC-val-cit-PAB-MMAF El abp-hu4d5fabv8-(HC A121C)-MC-val-cit-PAB-MMAF se prepara por la conjugación de aBP-hu4D5Fabv8-(HC A121C) y MC-val-cit-PAB-MMAF siguiente el procedimiento de Ejemplo 4.
MC-val-cit-PAB-MMAF Ejemplo 8 - Preparación de hu4D5Fabv8-(LC VI 1 C) TioFab-BMPEO-DM 1 Cisteína libre en hu4D5Fabv8-(Vl 10C) TioFab se modificó por el bis-maleimido reactivo BM (PEO) 3 (Perfore Químico), dejando un grupo maleimido sin reaccionar en la superficie del anticuerpo. Esto se llevó a cabo al disolverse BM (PEO) 4 en una mezcla de etanol/agua del 50% a una concentración de 10 mM y al adicionar un exceso molar décuplo de BM (PEO) 3 a una solución que contiene hu4D5Fabv8-(V1 10C) TioFab en la solución salina amortiguada con fosfato en una concentración de aproximadamente 1.6 mg/ml (10 micromolares) y lo permite reaccionar durante 1 hora. El exceso BM (PEO) 3 se eliminó por la filtración del gel (columna de HiTrap, Pharmacia) en el citrato de 30 mm, pH 6 con el amortiguador de NaCl de 150 mm. Unos 10 aproximados se doblan DM1 excedente molar disuelto en la acetamida del dimetilo (DMA) se agregó al hu4D5Fabv8-(LC VI 10C) el producto intermedio de TioFab-BMPEO. La dimetilformamida (DMF) también puede emplearse para disolver el reactivo de la porción del fármaco. La mezcla de reacción se dejó reaccionan durante la noche antes de filtración del gel o diálisis en PBS para eliminar el fármaco sin reaccionar. La filtración del gel en columnas S200 en PBS se utilizó eliminan agregados de elevado peso molecular y proporcionan hu4D5Fabv8-purificado (LC VI 10C) TioFab-BMPEO-DM 1.
Por el mismo protocolo, hu4D5Fabv8 (HC A121C) TioFab-BMPEO-DM 1 se preparó.
Ejemplo 9 - ensayo de proliferación celular In vitro La eficacia de ADC se cuantificó por un ensayo de proliferación celular que emplea el protocolo que sigue (CellTiter Ensayo de Viabilidad de la Célula de Glo Luminiscent, Promega Corp. Boletín Técnico TB288; Mendoza y al (2002) Cáncer Res. 62:5485-5488): 1. Una parte alícuota de 100 µ? del cultivo celular que contiene aproximadamente 104 células (SKBR-3, BT474, MCF7 o MDA-MB-468) en el medio se depositó en cada pocilio de una placa de 96 pocilios, amurallada del modo opaco. 2. Los pocilios de control se prepararon conteniendo el medio y sin células. 3. ADC se agregó a los pocilios experimentales e incubó durante 3-5 días. 4. Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. 5. Un volumen del Reactivo CellTiter-Glo igual al volumen del presente del medio de. cultivo celular en cada pocilio se agregó. 6. Los contenidos se mezclaron durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular. 7. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal de la luminescencia. 8. La luminescencia se registró e incluyó en un informe en gráficos como RLU = unidades de la luminescencia relativas.
Las ciertas células se siembran en 1000-2000/well (líneas de PC3) o 2000-3000/well (OVCAR-3) en una placa de 96 pocilios, 50 uL/well. Después de un (PC3) o dos días (OVCAR-3), ADC se agregan en 50 volúmenes a la concentración final de 9000, 3000, 1000, 333, 1 1 1 , 37, 12.4, 4.1, o 1.4 ng/mL, con "ningún ADC" pocilios de control que reciben el medio por sí solo. Las afecciones son por duplicado o triplicado Después 3 (PC3) o 4-5 días (OVCAR-3), 100 Célula µ?^? TiterGlo II se agrega (ensayo basado en la luciferasa; la proliferación cuantificada por niveles ATP) y las cuentas celulares se determinan mediante la utilización de un luminómetro. Los datos se grafican ya que la media de luminescencia para cada conjunto de se replica, con bares de error de la desviación estándar. El protocoló es una modificación de CellTiter Ensayo de Viabilidad de la Célula de Glo Luminiscent (Prosúper): 1. Placa 1000 células / pocilio de PC3/Mucl6, pC3/neo-(én 50 µ?/??e??) de medios. Las células de Ovcar3 deberían sembrarse en placa en 2000 células / pocilio (en 50 µ?) de sus medios, (recetas menor a) Permiten que células unan durante la noche. 2. ADC se diluye en serie 1 :3 en medios que comienzan en en la concentración activa 18 µ§/t?\ (esto da como resultado una concentración final de 9 µ§/p?). 50 µ?. de ADC diluido se agregan a 50 µL de células y medios ya en el pocilio. 3. Incube 72-96 horas (la norma es 72 horas, pero mire la 0 concentración ug/mL para finalizar el ensayo cuando las células sean el 85-95% confluentes). 4. Adicione 100 µ???ß?? de la Titulación Celular Prosúper reactivo de Glo, agite 3 minutos y lea en el luminómetro Medios: el pc3/neo-y PC3/MUC16 crecen en 50/50/10%FBS/glutamine/250 µ p?? G-418 OVCAR-3 crecen en RPMI/20%FBS/glutamine Ejemplo 10 - inhibición de crecimiento Tumoral, eficacia, in vivo en elevada expresión HER2 ratones exyegetales transgénicos Los animales adecuados para experimentos transgénicos pueden obtenerse de fuentes comerciales convencionales como Taconic (Germantown, Nueva York). Muchas cepas son adecuadas, pero los ratones hembra FVB se prefieren debido a su susceptibilidad más elevada a la formación tumoral. Los hombres de FVB se usaron para el apareamiento y los pernos CD.l vasectomizados se utilizaron estimulan el pseudoembarazo. Los ratones vasectomizados pueden obtenerse de cualquier proveedor comercial. Los fundadores se reprodujeron con ratones FVB o con 129/BL6 x FVB p53 ratones heterócigos. Los ratones con la heterozigocidad en el alelo p53 se utilizaron potencialmente la formación de tumor de aumento. Sin embargo, esto ha resultado innecesario. Por lo tanto, algunos tumores Fl son de la cepa mixta. Tumores del fundador son FVB sólo. Seis fundadores se obtuvieron con algunos tumores en vías de desarrollo sin tener carnadas.
Los animales que tienen tumores (aloinjerto propagado de ratones transgénicos de Fo5 mmtv) se sometieron a tratamiento con una dosis en forma individual o múltiple por IV inyección de ADC. El volumen tumoral se evaluó en diversos puntos de tiempo después de la inyección.
Tumores surgen fácilmente en ratones transgénicos que expresan para forma mutacionalmente activada de neu, el gen homólogo de la rata de HER2, pero el HER2 que se sobreexpresa para en cánceres de mama humanos no se muta y la formación tumoral es mucho menor consistente en ratones transgénicos que sobreexpresan para no mutó HER2 (Webster y al (1994) Semin. Cáncer Biol. 5:69-76).
Para mejorar la formación tumoral con HER2 no mutado, los ratones transgénicos se produjeron al usar un plásmido del ADNc HER2 donde un en dirección 5 ' ATG se suprimió a fin de prevenir la iniciación de la traducción en el en dirección 5 ' codones de ATG, que reducirían otra cosa la frecuencia de la iniciación de la traducción del codón de iniciación auténtico en dirección 3' de HER2 (por ejemplo, ver al Niño y al (1999) J. Biol. Chem. 274: 24335-24341). Además, un intrón quimérico se agregó al extremo 5 que también debería potenciar el nivel de expresión como incluyó en un informe anteriormente (Neuberger y Williams (1988) Ácidos nucleicos Res. 16:6713; Buchman y Berg (1988) Mol. Célula. Biol. 8:4395; Brinster y al (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:836). El intrón quimérico se derivó de un vector Prosúper, vector de expresión Pci-neo-de mamífero (pares de bases 890-1022). El extremo 3 ' del ADNc es flanqueado de exones de la hormona del crecimiento humanos 4 y 5, y secuencias de la poliadenilación. Más aún, los ratones de FVB se usaron porque esta cepa es más susceptible al desarrollo tumoral. El promotor de MMTV-LTR se utilizó aseguran la expresión HER2 específica para tejido en la glándula mamaria. Los animales se alimentaron el AIN 76A la dieta en el orden que aumenta la susceptibilidad a la formación tumoral (Rao y al (1997) Cáncer de mama Res. y Tratamiento 45 : 149- 158) .
E emplo 11 - Reducción/Oxidación de TIOMABS para Conjugación Los anticuerpos monoclónicos de cadena completa, manipulados genéticamente con cisteína (TIOMABS) expresado para en células CHO se redujeron con aproximadamente un 50 exceso veces de TCEP (tris clorhidrato del fosfino (2-carboxiethil); Getz y al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Empresas de Soltec, Beverly, Massachusetts) para 3 horas en 37 °C. TioMab reducido (Figura 11) se diluyó y cargó en HiTrap S la columna en acetato de sodio de 10 mm, pH 5, y eluyó con PBS que contiene 0.3M cloruro de sodio. TioMab reducido eluido se sometió a tratamiento con 200 sulfato de cobre acuoso nM (CuS04) a temperatura ambiente, durante la noche. El ácido de Dehydroascorbic (DHAA) y la oxidación en aire ambiental también son oxidantes efectivos.
Ejemplo 12 - Conjugación de TIOMABS TIOMABS oxidados de nuevo del Ejemplo 11, incluyendo el trastuzumab del tiol (HC A121C), tiol-2H9 (A121C) y tiol-3A5 (A121C), se combinaron con un 10 exceso veces del producto intermedio ligador por el fármaco, BM (PEO) 3-DM1, mezclado, y dejaron representan aproximadamente una hora a temperatura ambiente para efectuar la conjugación y formar los conjugados anticuerpo-fármaco de TioMab, incluyendo el trastuzumab del tiol (HC A121Q-BMPEO-DM1, tiol-2H9 (HC A121C)-BMPEO-DMl y tiol-3A5 (HC A121C)-BMPEO-DMl . La mezcla de la conjugación era el gel filtrado, o cargó y eluyó a través de HiTrap S columna para eliminar impurezas intermedias y otras ligadores por el fármaco excedentes.
La presente invención no debe ser limitada en el alcance por las modalidades específicas descritas en los ejemplos que se conceptualizan como ilustraciones de unos aspectos de la invención y cualquier modalidad que sea funcionalmente equivalente se incluyen dentro del alcance de esta invención. En efecto, diversas modificaciones de la invención además de los mostrados y descritos aquí se harán evidentes a los expertos en la técnica y pretenden se incluyen dentro el alcance de las reivindicaciones anexadas.
Todas las patentes, las solicitudes de patente y las referencias citadas durante toda la especificación expresamente se incorporan por referencia en su totalidad y con todos los objetivos.

Claims (28)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado manipulado genéticamente con cisteína que comprende un aminoácido de cisteína libre y una secuencia en la cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOS 50-98 o una secuencia en la cadena ligera seleccionada de SEQ ID NOS 99-147, donde una cisteína en la secuencia es el aminoácido de cisteína libre.
2. El anticuerpo aislado manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 1, preparado mediante un proceso que comprende: (i) mutagenizar una secuencia nucleoacídica de un anticuerpo parental al sustituir uno o más residuos aminoacídicos por cisteína para codificar el anticuerpo manipulado o genéticamente con cisteína; (ii) expresar para el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína; y (iii) aislar el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína.
3. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 2, donde mutagenizar comprende la mutagénesis dirigida al sitio.
4. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 2, donde el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína se expresa en una partícula viral seleccionada a partir de un fago o una partícula del fagómido.
5. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 2, que comprende además: 0 (i) hacer reaccionar el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína, con un reactivo de afinidad reactiva al tiol para generar un anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína de afinidad marcada; y (ii) cuantificar la unión del anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína, de afinidad marcada, a unos medios de captura. 5
6. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 5, donde el reactivo de afinidad reactiva al tiol comprende una porción de biotina.
7. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 5, donde el reactivo con reactividad al tiol comprende una porción de maleimida.
8. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 5, donde los medios de captura comprenden la estreptavidina.
9. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 1, donde el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína es una proteína de fusión que comprende el péptido de unión a la albúmina (ABP).
10. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 9, donde el ABP comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO:5.
11. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 1, donde el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína se selecciona a partir de un anticuerpo monoclónico, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado.
12. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 11, donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.
13. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 11, donde el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína es un anticuerpo anti-HER2.
14. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 1, donde el anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína se une con uno o más de los receptores (1) - (36): (1) BMPR1B (receptor protéico morfogenético óseo tipo IB); (2) E16 (LAT1, SLC7A5); (3) STEAP1 (antígeno epitelial seis transmembranal de próstata); (4) 0772P (CA125, MUC16); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador megacariocítico, mesotelina); (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia portadora del soluto, 34 (fosfato de sodio), miembro 2, transportador de fosfato dependiente de sodio tipo II, 3b); (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, sema dominio, siete repeticiones de la trombospondina (de tipo 1 y de tipo 1), dominio transmembranal (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B); (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, ADNc de RIKEN 2700050C12 gen); (9) ETBR (Receptor de endotelina tipo B); (10) MSG783 (RNF124, FLJ20315 protéico hipotético); (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen asociado al cáncer de próstata, 1, proteína asociada al cáncer de próstata, 1, antígeno epitelial seis transmembranal de próstata 2, seis proteína de la próstata transmembranal); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal del catión de potencial del receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4); (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado del teratocarcinoma); (14) CD21 (CR2 (Receptor de complemento 2) o C3DR (receptor del virus de C3d/Epstein Barr) o Hs.73792); (15) CD79b (CD79B, CD79P, IGb (beta asociada por la inmunoglobulina), B29); (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (dominio de SH2 que contiene proteína de anclaje a fosfatasa la), SPAP1B, SPAP1C); (17) HER2; (18) NCA; (19) MDP; (20) IL20Ra; (21) Brevican; (22) EphB2R; (23) ASLG659; (24) PSCA; (25) GEDA; (26) BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor de BLyS 3, BR3; (27) CD22 (receptor del linfocito B isoforma de CD22-B); (28) CD79a (CD79A, CD79B, alfa asociada a inmunoglobulina, proteína específica a células aB); (29) CXCR5 (el receptor del linfoma de Burkitt 1 , un receptor copulado a proteina G); (30) HLA-DOB (Subunidad de la beta de molécula del Complejo Principal de Histocompatibilidad tipo II (antígeno de la); (31) P2X5 (Receptor purinérgico canal iónico controlado por ligando de P2X 5); (32) CD72 (antígeno de diferenciación del linfocito B CD72, Lyb-2); (33) LY64 (Antígeno del linfocito 64 (RP105), tipo I proteína de la membrana de la familia de la leucina repetición rica (LRR)); (34) FcRHl (proteína 1 similar al receptor Fe); (35) IRTA2 (Desplazamiento del receptor de la superfamilia de la inmunoglobulina 2 asociada); y (36) TENB2 (proteoglucano transmembranal putativo).
15. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 1, donde el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de captura, un marcador de detección, una porción del fármaco o a un soporte sólido.
16. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 15, donde el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de captura de biotina.
17. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 15, donde el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de detección de tinte fluorescente.
18. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 17, donde el tinte fluorescente se selecciona a partir de un tipo de fluoresceína, un tipo de rodamina, dansil, Lisamina, cianina, una ficoeritrina, Rojo Texas y un análogo de lo mismo.
19. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 15, donde el anticuerpo se une covalentemente a un marcador para detección del radionúclido seleccionado de 3H, nC, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 89Zr, 99Tc, i nIn, 123I, 1241, 125I, 13 ,I, 133Xe, 177Lu, 21 1At, y 2l3Bi.
20. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 15, donde el anticuerpo es unido covalentemente a un marcador de detección mediante un ligando quelante.
21. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 20, donde el ligando quelante se selecciona a partir de DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA y TETA.
22. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 15, donde el anticuerpo se une covalentemente a una porción del fármaco seleccionada de maitansinoide, auristatina, dolastatina, tricoteceno, CC1065, una caliqueamicina, antibióticos de eneidina, un taxano, y antraciclina para formar un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I: Ab-(L-D) p I donde Ab es el anticuerpo, L es un ligador, D es la porción del fármaco, y p es 1, 2, 3 o 4.
23. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 22, donde el conjugado anticuerpo-fármaco tiene la estructura:
24. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 22, donde D es maitansinoide que tiene la estructura: donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre de D al ligador; R es indistintamente seleccionado de H, metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-metil-l-propilo, 2-butilo, 2-metil-2-propilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3 -metil-1 -butilo, 2-metil-l -butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, ,3-dimetil-2-butilo y 3,3-dimetil-2-butilo; y m es 1, 2, o 3.
25. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 4, donde D se selecciona a partir de las estructuras:
26. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 25, que tiene la estructura: donde n es 0, 1, o 2.
27. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación 22, donde D es una porción del fármaco de monometilauristatina MMAE o MMAF que tienen las estructuras:
28. El anticuerpo manipulado genéticamente con cisteína según la reivindicación , donde el conjugado anticue o-fármaco se selecciona a partir de las estructuras: Ab-MC-MMAF donde Val es valina; Cit es citrulina; y p es 1, 2, 3 o 4.
MX2012013868A 2010-06-08 2011-06-07 Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina. MX336540B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35272810P 2010-06-08 2010-06-08
PCT/US2011/039386 WO2011156328A1 (en) 2010-06-08 2011-06-07 Cysteine engineered antibodies and conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2012013868A true MX2012013868A (es) 2013-01-24
MX336540B MX336540B (es) 2016-01-22

Family

ID=44627136

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2012013868A MX336540B (es) 2010-06-08 2011-06-07 Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.
MX2022006074A MX2022006074A (es) 2010-06-08 2012-11-29 Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2022006074A MX2022006074A (es) 2010-06-08 2012-11-29 Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.

Country Status (12)

Country Link
US (4) US9000130B2 (es)
EP (1) EP2579897A1 (es)
JP (2) JP2013534520A (es)
KR (1) KR101839163B1 (es)
CN (3) CN103068406B (es)
AU (2) AU2011265054B2 (es)
BR (1) BR112012030311A2 (es)
CA (2) CA3220104A1 (es)
MX (2) MX336540B (es)
RU (2) RU2755066C2 (es)
SG (2) SG185428A1 (es)
WO (1) WO2011156328A1 (es)

Families Citing this family (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130004579A (ko) 2010-02-23 2013-01-11 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
EP2554669B1 (en) 2010-03-26 2018-09-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Novel antibody having modification site introduced therein, and antibody fragment
MX336540B (es) 2010-06-08 2016-01-22 Genentech Inc Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.
UA115641C2 (uk) 2010-12-20 2017-11-27 Дженентек, Інк. Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить
HUE037811T2 (hu) 2011-10-28 2018-09-28 Prothena Biosciences Ltd Alfa-szinukleint felismerõ humanizált antitestek
WO2013093809A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
EP2807188B1 (en) * 2012-01-27 2019-09-11 Prothena Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
US9814782B2 (en) * 2012-02-24 2017-11-14 Alteogen Inc. Modified antibody in which motif comprising cysteine residue is bound, modified antibody-drug conjugate comprising the modified antibody, and production method for same
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
CN104470544B (zh) 2012-05-01 2018-01-12 基因泰克公司 抗pmel17抗体和免疫缀合物
WO2013173393A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Concortis Biosystems, Corp Drug-conjugates, conjugation methods, and uses thereof
JP6192022B2 (ja) 2012-05-21 2017-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｌｙ６Ｅ抗体及びイムノコンジュゲート並びに使用方法
WO2014006124A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked antigen-antibody conjugates
CA2879665A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Genentech, Inc. Anti-etbr antibodies and immunoconjugates
KR20150032886A (ko) 2012-08-02 2015-03-30 제넨테크, 인크. 항-etbr 항체 및 면역접합체
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US9393327B2 (en) 2012-12-19 2016-07-19 Genentech, Inc. Methods and compositions for radiohalogen protein labeling
CN104650113A (zh) * 2012-12-21 2015-05-27 百奥泰生物科技(广州)有限公司 类美登素衍生物及其制备方法和用途
CN103333246B (zh) * 2012-12-21 2015-09-16 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种抗egfr受体的肿瘤生长抑制剂及其制备方法和用途
CN105102455B (zh) 2012-12-21 2018-05-25 荷商台医(有限合伙)公司 亲水性自消耗连接子及其缀合物
CN103933575B (zh) 2013-01-23 2017-09-29 上海新理念生物医药科技有限公司 一种三齿型连接子及其应用
EA201591465A1 (ru) * 2013-02-08 2015-12-30 АйАрЭм ЭлЭлСи Специфичные участки для модификации антител для получения иммуноконъюгатов
EP2961435B1 (en) * 2013-02-28 2019-05-01 ImmunoGen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
KR20160015286A (ko) 2013-05-31 2016-02-12 제넨테크, 인크. 항-세포벽 테이코산 항체 및 접합체
US9803002B2 (en) 2013-05-31 2017-10-31 Genentench, Inc. Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
KR20160015227A (ko) 2013-05-31 2016-02-12 제넨테크, 인크. 항-세포벽 테이코산 항체 및 접합체
US10457741B2 (en) 2013-07-03 2019-10-29 Seoul National University R&Db Foundation Chicken antibody transformed into cysteine and site-specific conjugation using same
BR112016004242A8 (pt) * 2013-08-28 2018-06-12 Stemcentrx Inc Métodos para conjugação sítio-específica de anticorpos e composições
JP2016538318A (ja) 2013-08-28 2016-12-08 ステムセントリックス， インコーポレイテッド 新規ｓｅｚ６モジュレーターおよび使用方法
AR097685A1 (es) 2013-09-17 2016-04-06 Genentech Inc Métodos de uso de anticuerpos anti-lgr5
CN106132431A (zh) 2013-10-15 2016-11-16 索伦托治疗有限公司 具有靶向分子和两种不同药物的药物偶联物
CN105658237B (zh) 2013-10-21 2021-03-09 基因泰克公司 抗Ly6E抗体及使用方法
KR20160070191A (ko) 2013-11-06 2016-06-17 스템센트알엑스 인코포레이티드 신규한 항-클라우딘 항체 및 사용 방법
BR112016013048A2 (pt) 2013-12-12 2017-09-26 Stemcentrx Inc anticorpos anti-dpep3 e métodos de uso
KR20160098328A (ko) 2013-12-13 2016-08-18 제넨테크, 인크. 항-cd33 항체 및 면역접합체
CN105848685B (zh) 2013-12-16 2020-09-22 健泰科生物技术公司 拟肽化合物及其抗体药物偶联物
CN105828840B (zh) 2013-12-16 2020-08-04 基因泰克公司 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法
CA2933557A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
CA2930046A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
BR112016013849A2 (pt) 2014-01-03 2017-10-10 Hoffmann La Roche conjugados de anticorpos biespecíficos antihapteno/antirreceptores da barreira hematoencefálica, seus usos, e formulação farmacêutica
US10308721B2 (en) 2014-02-21 2019-06-04 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
CN104788566A (zh) * 2014-03-11 2015-07-22 南京任诺药业有限公司 用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-V280C
CN104672330A (zh) * 2014-03-11 2015-06-03 南京任诺药业有限公司 用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C
CN104650233A (zh) * 2014-03-11 2015-05-27 南京任诺药业有限公司 用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-K330C
BR112016027222A2 (pt) 2014-05-22 2018-01-30 Genentech Inc anticorpos isolados, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, métodos de tratamento de um indivíduo com um câncer, de inibição da proliferação de uma célula, de detecção de gpc3 humano e de detecção de um câncer
CN107073121A (zh) 2014-06-13 2017-08-18 基因泰克公司 治疗及预防癌症药物抗性的方法
US9950077B2 (en) 2014-06-20 2018-04-24 Bioalliance C.V. Anti-folate receptor alpha (FRA) antibody-drug conjugates and methods of using thereof
SG11201610624WA (en) * 2014-06-20 2017-01-27 Bioalliance Cv Anti-cd22 antibody-drug conjugates and methods of using thereof
RU2705299C2 (ru) 2014-06-26 2019-11-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела против 5-бром-2'-дезоксиуридина и способы применения
ES2785551T3 (es) 2014-06-30 2020-10-07 Glykos Finland Oy Derivado de sacárido de una carga útil tóxica y sus conjugados con anticuerpos
TW201617368A (zh) 2014-09-05 2016-05-16 史坦森特瑞斯公司 新穎抗ｍｆｉ２抗體及使用方法
EP3191521A2 (en) * 2014-09-12 2017-07-19 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
SI3191135T1 (sl) 2014-09-12 2021-01-29 Genentech, Inc. Anti-HER2 protitelesa in imunokonjugati
CA2958479A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
PE20170905A1 (es) 2014-09-17 2017-07-12 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de anticuerpo-disulfuro de las mismas
BR112017004953A2 (pt) 2014-09-17 2017-12-05 Genentech Inc imunoconjugado, formulação farmacêutica, método de tratamento e método de inibição da proliferação de uma célula
AU2015329625B2 (en) * 2014-10-10 2018-04-05 Pfizer Inc. Synergistic auristatin combinations
BR112017011325A2 (pt) 2014-12-03 2020-07-21 Genentech, Inc. ?composto de conjugado anticorpo?antibiótico, composição, método de tratamento de uma infecção, método para matar staph aureus, processo para produzir o conjugado, kit para o tratamento de uma infecção, intermediários antibiótico-ligante e ligante-droga?
JP6871858B2 (ja) 2015-01-28 2021-05-19 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 抗体薬物コンジュゲート
TW201709934A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 建南德克公司 抗體及免疫結合物
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
ES2829251T3 (es) 2015-06-19 2021-05-31 Eisai R&D Man Co Ltd Inmunoglobulinas conjugadas por la cys80
PL3313884T3 (pl) * 2015-06-29 2021-05-31 Immunogen, Inc. Przeciwciała anty-cd123 oraz ich koniugaty i pochodne
CA2938333A1 (en) 2015-08-12 2017-02-12 Pfizer Inc. Capped and uncapped antibody cysteines, and their use in antibody-drug conjugation
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
TWI727380B (zh) 2015-11-30 2021-05-11 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
WO2017107817A1 (zh) * 2015-12-21 2017-06-29 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗体药物偶联物的制备方法
BR112018013912A2 (pt) 2016-01-08 2018-12-18 Bioalliance C.V. anticorpos tetravalentes anti-psgl-1 e usos dos mesmos
SG11201807537RA (en) 2016-03-04 2018-09-27 Genentech Inc Process for the preparation of an antibody-rifamycin conjugate
EP3433281A1 (en) 2016-03-21 2019-01-30 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
KR102438354B1 (ko) 2016-04-15 2022-08-31 베크만 컬터, 인코포레이티드 광활성 거대분자 및 그의 용도
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
JP7043425B2 (ja) 2016-06-06 2022-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド シルベストロール抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
WO2018009916A1 (en) 2016-07-07 2018-01-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antibody adjuvant conjugates
JP2019524706A (ja) 2016-07-08 2019-09-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｍｕｃ１６陽性癌治療の応答性を評価するためのヒト精巣上体タンパク質４（ｈｅ４）の使用
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
EP4015532A1 (en) 2016-11-21 2022-06-22 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
CN110290810A (zh) 2016-12-13 2019-09-27 博尔特生物治疗药物有限公司 抗体佐剂缀合物
JP7244987B2 (ja) 2016-12-14 2023-03-23 シージェン インコーポレイテッド 多剤抗体薬物コンジュゲート
US10864279B2 (en) 2016-12-16 2020-12-15 Industrial Technology Research Institute Linker-drug and antibody-drug conjugate (ADC) employing the same
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
JP7227151B2 (ja) 2017-03-22 2023-02-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 眼障害の治療のために最適化された抗体組成物
JP7247101B2 (ja) 2017-04-03 2023-03-28 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｓｔｅａｐ－１に結合する抗体
DK3609540T3 (da) 2017-04-14 2023-03-06 Bolt Biotherapeutics Inc Fremgangsmåde til immunkonjugatsyntese
US20210246227A1 (en) 2017-05-31 2021-08-12 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
EP3665202A1 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Massachusetts Institute Of Technology Albumin binding peptide conjugates and methods thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US11364303B2 (en) 2017-09-29 2022-06-21 Pfizer Inc. Cysteine engineered antibody drug conjugates
AU2018390881A1 (en) 2017-12-21 2020-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to HLA-A2/WT1
WO2019129679A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
CN112020519A (zh) 2018-03-13 2020-12-01 酵活有限公司 抗her2双互补位抗体-药物偶联物及使用方法
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
MX2020010028A (es) 2018-03-29 2020-10-14 Genentech Inc Actividad lactogenica modulada en celulas de mamifero.
CN108743966B (zh) * 2018-04-24 2021-10-19 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
CN110386986B (zh) * 2018-06-22 2024-01-26 深圳琅技生命科技有限公司 人工改造蛋白质及其构建方法与应用
WO2020010079A2 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Amgen Inc. Anti-steap1 antigen-binding protein
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
JP2020080784A (ja) * 2018-11-29 2020-06-04 シスメックス株式会社 融合ポリペプチド、融合ポリペプチドの製造方法、及び融合ポリペプチドをコードするｄｎａ
BR102019025989A2 (pt) 2018-12-14 2020-06-23 Beckman Coulter, Inc. Modificação de corantes poliméricos e aplicações
JP2022514290A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変抗体ｆｃおよび使用方法
SG11202102859TA (en) 2018-12-21 2021-04-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
TW202039552A (zh) 2018-12-21 2020-11-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合至VEGF及IL-1β之抗體及使用方法
US11666658B2 (en) 2018-12-21 2023-06-06 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. Rifamycin analogs and antibody-drug conjugates thereof
JP2022515424A (ja) 2018-12-24 2022-02-18 サノフイ 突然変異ｆａｂドメインを有する多重特異性結合タンパク質
EP3857237B1 (en) * 2019-01-16 2023-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing disulfide bonds
AU2020226904A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
SG11202109056TA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN114026122A (zh) 2019-02-21 2022-02-08 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
JP2022521937A (ja) 2019-02-21 2022-04-13 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ＮＫｐ３０に結合する抗体分子およびその使用
CN114127112A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 与t细胞结合的多功能分子及其治疗自身免疫性病症的用途
WO2020181846A1 (zh) * 2019-03-11 2020-09-17 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
CN114174338A (zh) 2019-07-31 2022-03-11 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
EP4003526A2 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to gprc5d
EP3797796A4 (en) * 2019-08-07 2021-10-27 MabPlex International Co., Ltd. ANTIBODY INGREDIENT CONJUGATES AND USES THEREOF
AU2020349509A1 (en) 2019-09-18 2022-03-31 Genentech, Inc. Anti-KLK7 antibodies, anti-KLK5 antibodies, multispecific anti-KLK5/KLK7 antibodies, and methods of use
KR20220100963A (ko) 2019-12-18 2022-07-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 Hla-a2/mage-a4에 결합하는 항체
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
JP2023518841A (ja) 2020-03-26 2023-05-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 宿主細胞タンパク質が減少した修飾哺乳動物細胞
WO2021198034A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf and pdgf-b and methods of use
JP2023520930A (ja) 2020-04-10 2023-05-22 シージェン インコーポレイテッド 電荷多様性リンカー
WO2021217085A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
JP2023527918A (ja) 2020-06-08 2023-06-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｈｂｖ抗体及び使用方法
JP2023538716A (ja) 2020-06-19 2023-09-11 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３及びｃｄ１９に結合する抗体
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
KR20230025665A (ko) 2020-06-19 2023-02-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 Cd3에 결합하는 항체
BR112022025809A2 (pt) 2020-06-19 2023-01-10 Hoffmann La Roche Anticorpos, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, uso do anticorpo, método para tratar uma doença e invenção
IL299161A (en) 2020-06-24 2023-02-01 Genentech Inc Cell lines resistant to apoptosis
PE20231300A1 (es) 2020-07-17 2023-08-24 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 y metodos de uso
WO2022046922A2 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
EP4204458A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
WO2022046920A2 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CA3192344A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Genentech, Inc. Crispr/cas9 multiplex knockout of host cell proteins
PE20230986A1 (es) 2020-09-04 2023-06-21 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a y ang2, y metodos de uso
US20230331867A1 (en) 2020-09-04 2023-10-19 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Nectin-4 antibodies and uses thereof
TW202233671A (zh) 2020-10-20 2022-09-01 美商建南德克公司 Ｐｅｇ結合抗ｍｅｒｔｋ抗體及其使用方法
CA3207893A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 Seagen Inc. Immunomodulatory antibody-drug conjugates
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
JP2024506300A (ja) 2021-02-03 2024-02-13 シージェン インコーポレイテッド 免疫刺激化合物及びコンジュゲート体
JP2024512377A (ja) 2021-03-12 2024-03-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｋｌｋ７抗体、抗ｋｌｋ５抗体、多重特異性抗ｋｌｋ５／ｋｌｋ７抗体、及び使用方法
US20240197899A1 (en) 2021-03-26 2024-06-20 Bolt Biotherapeutics, Inc. 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
CA3212926A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Gary Brandt 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
KR20240004462A (ko) 2021-04-08 2024-01-11 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
AU2022253902A1 (en) 2021-04-10 2023-11-02 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
KR20230173164A (ko) 2021-04-19 2023-12-26 제넨테크, 인크. 변형된 포유류 세포
CA3216459A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
JP2024519523A (ja) 2021-04-26 2024-05-15 スアンズ バイオファーマシューティカル カンパニー，リミテッド 二重特異性抗体薬物コンジュゲート
WO2022246259A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
JP2024520562A (ja) 2021-05-28 2024-05-24 シージェン インコーポレイテッド アントラサイクリン抗体コンジュゲート
US20230048743A1 (en) 2021-07-12 2023-02-16 Genentech Inc. Structures for Reducing Antibody-Lipase Binding
WO2023288241A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Genentech, Inc. Anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies and methods of use
WO2023001884A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
CN117794953A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗体及使用方法
WO2023076599A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
WO2023092099A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Ardeagen Corporation Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
TW202340251A (zh) 2022-01-19 2023-10-16 美商建南德克公司 抗ｎｏｔｃｈ２抗體及結合物及其使用方法
WO2023215740A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Seagen Inc. Immunomodulatory antibody-drug conjugates
TW202402810A (zh) 2022-05-11 2024-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｖｅｇｆ—ａ及ｉｌ６結合之抗體及其使用方法
WO2024030577A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Seagen Inc. Immunostimulatory anti-pd-l1-drug conjugates
WO2024074762A1 (en) * 2022-10-03 2024-04-11 Turun Yliopisto Ultrastable antibody fragments with a novel disuldide bridge
WO2024077239A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3
CN117198390B (zh) * 2023-09-08 2024-03-12 中国科学院广州生物医药与健康研究院 通过设计和改造二硫键交联位点的slc膜蛋白复合物的制备方法

Family Cites Families (349)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6098584A (ja) 1983-11-02 1985-06-01 Canon Inc カメラ―体形ｖｔｒ
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
CA2023779A1 (en) 1989-08-23 1991-02-24 Margaret D. Moore Compositions and methods for detection and treatment of epstein-barr virus infection and immune disorders
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
AU9016591A (en) 1990-10-25 1992-05-26 Tanox Biosystems, Inc. Glycoproteins associated with membrane-bound immunoglobulins as antibody targets on B cells
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69231223T3 (de) 1991-03-29 2008-01-17 Genentech, Inc., South San Francisco Menschliche pf4a rezeptoren und ihre verwendung
US5440021A (en) 1991-03-29 1995-08-08 Chuntharapai; Anan Antibodies to human IL-8 type B receptor
US5543503A (en) 1991-03-29 1996-08-06 Genentech Inc. Antibodies to human IL-8 type A receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
JP3050424B2 (ja) 1991-07-12 2000-06-12 塩野義製薬株式会社 ヒトエンドセリンリセプター
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US6153408A (en) 1991-11-15 2000-11-28 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US6011146A (en) 1991-11-15 2000-01-04 Institut Pasteur Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
AU4924893A (en) 1992-09-16 1994-04-12 Galagen, Inc. Antibody treatment of (helicobacter pylori)
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5644033A (en) 1992-12-22 1997-07-01 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B cell antigen receptor complex and methods of using same for diagnosis and treatment
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
CA2173150C (en) 1993-10-01 2004-11-30 Kyoichi Sakakibara Novel peptide derivatives
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5750370A (en) 1995-06-06 1998-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5707829A (en) 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
US20020193567A1 (en) 1995-08-11 2002-12-19 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
AU7240096A (en) 1995-09-18 1997-04-09 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Neutralizing monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
JP3646191B2 (ja) 1996-03-19 2005-05-11 大塚製薬株式会社 ヒト遺伝子
AU722499B2 (en) 1996-05-17 2000-08-03 Schering Corporation Human B-cell antigens, related reagents
US5945511A (en) 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US7033827B2 (en) 1997-02-25 2006-04-25 Corixa Corporation Prostate-specific polynucleotide compositions
US20030185830A1 (en) 1997-02-25 2003-10-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
WO1998040403A1 (en) 1997-03-10 1998-09-17 The Regents Of The University Of California Psca: prostate stem cell antigen
US6261791B1 (en) 1997-03-10 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing cancer using specific PSCA antibodies
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
US6555339B1 (en) 1997-04-14 2003-04-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors
US6319688B1 (en) 1997-04-28 2001-11-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1)
WO1998051824A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract
US6890749B2 (en) 1997-05-15 2005-05-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6753165B1 (en) 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US6248564B1 (en) 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US20030060612A1 (en) 1997-10-28 2003-03-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20020034749A1 (en) 1997-11-18 2002-03-21 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6110695A (en) 1997-12-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1
US7005504B2 (en) 1998-01-22 2006-02-28 Genentech, Inc. Antibody fragment-peg conjugates
DE69939527D1 (de) 1998-03-13 2008-10-23 Burnham Inst Zielsuchende verbindungen für verschiedene organe und gewebe
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP1078092B1 (en) 1998-05-13 2011-08-03 Epimmune Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US20030064397A1 (en) 1998-05-22 2003-04-03 Incyte Genomics, Inc. Transmembrane protein differentially expressed in prostate and lung tumors
US20020187472A1 (en) 2001-03-09 2002-12-12 Preeti Lal Steap-related protein
WO2000012130A1 (en) 1998-08-27 2000-03-09 Smithkline Beecham Corporation Rp105 agonists and antagonists
JP4689781B2 (ja) 1998-09-03 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子
AU5963699A (en) 1998-10-02 2000-04-26 Mcmaster University Spliced form of (erb)b-2/neu oncogene
WO2001057188A2 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US6962980B2 (en) 1999-09-24 2005-11-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6858710B2 (en) 1998-12-17 2005-02-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20020119158A1 (en) 1998-12-17 2002-08-29 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030091580A1 (en) 2001-06-18 2003-05-15 Mitcham Jennifer L. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6468546B1 (en) 1998-12-17 2002-10-22 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
AU776672B2 (en) 1998-12-30 2004-09-16 Beth Israel Deaconess Medical Center Characterization of a calcium channel family
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DE60044665D1 (de) 1999-01-29 2010-08-26 Corixa Corp Her2/neu fusionsproteine
GB9905124D0 (en) 1999-03-05 1999-04-28 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US7109292B2 (en) 1999-03-08 2006-09-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US7312303B2 (en) 1999-05-11 2007-12-25 Genentech, Inc. Anti-PRO4980 antibodies
AU4952600A (en) 1999-06-03 2000-12-28 Takeda Chemical Industries Ltd. Screening method with the use of cd100
DK2283866T3 (en) 1999-06-25 2015-05-18 Genentech Inc METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ERBB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
EP2112167A3 (en) 1999-06-25 2010-12-22 Genentech, Inc. Humanized ANTI-ERBB2 antibodies and treatment with ANTI-ERBB2 antibodies
US20030119113A1 (en) 1999-07-20 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7297770B2 (en) 1999-08-10 2007-11-20 Genentech, Inc. PRO6496 polypeptides
US7294696B2 (en) 1999-08-17 2007-11-13 Genentech Inc. PRO7168 polypeptides
EP1208202A2 (en) 1999-09-01 2002-05-29 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030232056A1 (en) 1999-09-10 2003-12-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030206918A1 (en) 1999-09-10 2003-11-06 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030129192A1 (en) 1999-09-10 2003-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
EP2289549A3 (en) 1999-10-01 2011-06-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer
ES2309012T3 (es) 1999-10-29 2008-12-16 Genentech, Inc. Composiciones del anticuerpo anti-psca y a sus procedimientos contra celulas cancerigenas que expresen psca.
ES2586850T3 (es) 1999-11-29 2016-10-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma
EP1248800A2 (en) 1999-11-30 2002-10-16 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
CA2393738A1 (en) 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
ATE407950T1 (de) 1999-12-23 2008-09-15 Zymogenetics Inc Löslicher interleukin-20 rezeptor
DE60030769T2 (de) 1999-12-23 2007-10-25 Zymogenetics, Inc., Seattle Verfahren zur behandlung von entzündungen
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
NZ502058A (en) 1999-12-23 2003-11-28 Ovita Ltd Isolated mutated nucleic acid molecule for regulation of ovulation rate
US7608681B2 (en) 1999-12-24 2009-10-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US7294695B2 (en) 2000-01-20 2007-11-13 Genentech, Inc. PRO10268 polypeptides
US20030224379A1 (en) 2000-01-21 2003-12-04 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001053463A2 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Corixa Corporation COMPOUNDS AND METHODS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HER-2/neu ASSOCIATED MALIGNANCIES
US20030104562A1 (en) 2000-02-11 2003-06-05 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
AU2001238596A1 (en) 2000-02-22 2001-09-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18607, a novel human calcium channel
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
WO2001066689A2 (en) 2000-03-07 2001-09-13 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
JP2004521602A (ja) 2000-03-24 2004-07-22 ファハリ サッチオグリュ 前立腺特異的または精巣特異的な新規の核酸分子、ポリペプチド、ならびに診断法および治療法
JP2003530325A (ja) 2000-03-31 2003-10-14 イーペーエフ ファルマシューティカルス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 好ましくは特異的ケモカインレセプター分析、及びケモカインレセプター／リガンド相互作用の助けによる、腫瘍及び炎症細胞の細胞表面プロテオームの調査、並びに腫瘍疾患及び炎症性疾患の治療のための診断薬及び薬剤
US7279294B2 (en) 2000-04-03 2007-10-09 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services, Nih Tumor markers in ovarian cancer
CN1420929A (zh) 2000-04-07 2003-05-28 阿瑞那制药公司 非内源性组成型活化的已知g蛋白偶联受体
WO2001088133A2 (en) 2000-05-18 2001-11-22 Lexicon Genetics Incorporated Human semaphorin homologs and polynucleotides encoding the same
AU2001274888A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001275437A1 (en) 2000-06-09 2001-12-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of ovarian carcinomas
JP2004523203A (ja) 2000-06-16 2004-08-05 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド Ｇタンパク質結合受容体
AU2001273151A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Incyte Genomics, Inc. Human extracellular matrix and cell adhesion polypeptides
MXPA02012749A (es) 2000-06-30 2003-10-06 Amgen Inc Moleculas semejantes a b7 y sus usos.
CA2406649A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
WO2002006339A2 (en) 2000-07-03 2002-01-24 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20040044179A1 (en) 2000-07-25 2004-03-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2001283507A1 (en) 2000-07-27 2002-02-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h3 and b7-h4, novel immunoregulatory molecules
ATE396266T1 (de) 2000-07-28 2008-06-15 Ulrich Wissenbach Trp8 krebsmarker
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
WO2002013847A2 (en) 2000-08-14 2002-02-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
CN1537164A (zh) 2000-08-14 2004-10-13 治疗和诊断Her-2/neu相关恶性肿瘤的组合物和方法
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1311674A2 (en) 2000-08-24 2003-05-21 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1346040A2 (en) 2000-09-11 2003-09-24 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
US6613567B1 (en) 2000-09-15 2003-09-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of Her-2 expression
DE60141546D1 (de) 2000-09-15 2010-04-22 Zymogenetics Inc Polypeptide enthaltend extrazellulären Domäne von IL-20RA und/oderr IL-20RB
US20030119121A1 (en) 2000-09-15 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU9272401A (en) 2000-09-18 2002-03-26 Biogen Inc Cripto mutant and uses thereof
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
AU2002215345A1 (en) 2000-10-13 2002-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of prostate cancer, compositions and methods of screening for modulators of prostate cancer
EP1407017B1 (en) 2000-11-07 2009-06-03 ZymoGenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
US20020150573A1 (en) 2000-11-10 2002-10-17 The Rockefeller University Anti-Igalpha-Igbeta antibody for lymphoma therapy
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
WO2002054940A2 (en) 2001-01-12 2002-07-18 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer
US20030119125A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030119133A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002059377A2 (en) 2001-01-24 2002-08-01 Protein Design Labs Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
WO2002060317A2 (en) 2001-01-30 2002-08-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
WO2002064798A1 (en) 2001-02-12 2002-08-22 Bionomics Limited Dna sequences differentially expressed in tumour cell lines
US20030087250A1 (en) 2001-03-14 2003-05-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
AU2002311787A1 (en) 2001-03-28 2002-10-15 Zycos Inc. Translational profiling
WO2003008537A2 (en) 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
US6820011B2 (en) 2001-04-11 2004-11-16 The Regents Of The University Of Colorado Three-dimensional structure of complement receptor type 2 and uses thereof
JP5232350B2 (ja) 2001-04-17 2013-07-10 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー Ｃａ１２５遺伝子のリピート配列並びに診断および治療的介入のためのその使用
AU2002309583A1 (en) 2001-04-18 2002-11-05 Protein Desing Labs, Inc. Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
PT1390389E (pt) 2001-04-26 2009-04-03 Biogen Idec Inc Anticorpos que bloqueiam o cripto e as utilizações dos mesmos
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
EP1515982A4 (en) 2001-05-09 2005-10-26 Corixa Corp METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE THERAPY AND DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER
US20030078399A1 (en) 2001-05-11 2003-04-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, CA125, and uses thereof
SI2116259T1 (sl) 2001-05-24 2012-11-30 Zymogenetics Inc Taci imunoglobulin fuzijski proteini
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US7157558B2 (en) 2001-06-01 2007-01-02 Genentech, Inc. Polypeptide encoded by a polynucleotide overexpresses in tumors
AU2002314901A1 (en) 2001-06-04 2002-12-16 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
WO2003000842A2 (en) 2001-06-04 2003-01-03 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
CA2449275A1 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis, Inc. Dgks as modifiers of the p53 pathway and methods of use
EP1456650B1 (en) 2001-06-05 2010-10-06 Exelixis, Inc. Gfats as modifiers of the p53 pathway and methods of use
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7125663B2 (en) 2001-06-13 2006-10-24 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
JP2005508144A (ja) 2001-06-18 2005-03-31 イオス バイオテクノロジー，インコーポレイティド 卵巣癌の診断方法、卵巣癌のモジュレーターをスクリーニングする組成物及び方法
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
WO2003004989A2 (en) 2001-06-21 2003-01-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
US20030108958A1 (en) 2001-06-28 2003-06-12 Rene De Waal Malefyt Biological activity of AK155
AU2002314433A1 (en) 2001-07-02 2003-01-21 Licentia Ltd. Ephrin-tie receptor materials and methods
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
WO2003003984A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
WO2003055439A2 (en) 2001-07-18 2003-07-10 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
US20030108963A1 (en) 2001-07-25 2003-06-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kit, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of prostate cancer
MXPA04001050A (es) 2001-08-03 2004-07-08 Genentech Inc Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos.
CA2457819A1 (en) 2001-08-14 2003-02-27 The General Hospital Corporation Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
US20030092013A1 (en) 2001-08-16 2003-05-15 Vitivity, Inc. Diagnosis and treatment of vascular disease
WO2003018621A2 (en) 2001-08-23 2003-03-06 Oxford Biomedica (Uk) Limited Genes
AU2002357643A1 (en) 2001-08-29 2003-04-14 Vanderbilt University The human mob-5 (il-24) receptors and uses thereof
US20040235068A1 (en) 2001-09-05 2004-11-25 Levinson Arthur D. Methods for the identification of polypeptide antigens associated with disorders involving aberrant cell proliferation and compositions useful for the treatment of such disorders
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
ES2532757T3 (es) 2001-09-06 2015-03-31 Agensys, Inc. Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
WO2003025138A2 (en) 2001-09-17 2003-03-27 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer
KR101008758B1 (ko) 2001-09-18 2011-01-14 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물
US20050004017A1 (en) 2001-09-18 2005-01-06 Yuval Reiss Methods and compositions for treating hcap associated diseases
CA2460621A1 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026493A2 (en) 2001-09-28 2003-04-03 Bing Yang Diagnosis and treatment of diseases caused by mutations in cd72
WO2003029277A2 (en) 2001-10-03 2003-04-10 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Modulators of lymphocyte activation and migration
US20040249144A1 (en) 2001-10-03 2004-12-09 Zairen Sun Regulated breast cancer genes
US20040241703A1 (en) 2002-08-19 2004-12-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20050089957A1 (en) 2001-10-19 2005-04-28 Audrey Goddard Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders
US7825089B2 (en) 2001-10-24 2010-11-02 National Jewish Health Three-dimensional structures of TALL-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
ATE349554T1 (de) 2001-10-31 2007-01-15 Alcon Inc Knochen-morphogene proteine (bmp), bmp-rezeptoren und bmp-bindungsproteine und ihre verwendung bei der diagnose und behandlung des glaukoms
US20030232350A1 (en) 2001-11-13 2003-12-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20050123536A1 (en) 2001-11-20 2005-06-09 Che-Leung Law Treatment of immunological disorders using anti-dc30 antibodies
EP1448226A1 (en) 2001-11-29 2004-08-25 Genset S.A. Agonists and antagonists of prolixin for the treatment of metabolic disorders
AU2002349784A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Asahi Kasei Pharma Corporation Nf-kappab activating genes
EP1504099A4 (en) 2001-12-10 2006-05-10 Nuvelo Inc NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES
WO2003049704A2 (en) 2001-12-11 2003-06-19 University Of Massachusetts Antibodies to treat cancer
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US7261890B2 (en) 2001-12-21 2007-08-28 Idexx Laboratories, Inc. Methods for using canine immunoglobulin variable domains and caninized antibodies
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
US7452675B2 (en) 2002-01-25 2008-11-18 The Queen's Medical Center Methods of screening for TRPM4b modulators
EP1476120B1 (en) 2002-02-21 2010-09-29 Duke University Treatment methods using anti-cd22 antibodies
CA2476518A1 (en) 2002-02-22 2003-09-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2003074674A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Exelixis, Inc. MSRAs AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
WO2003101400A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
EP2258712A3 (en) 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
CA2486490A1 (en) 2002-03-19 2003-12-31 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
EP1579186A4 (en) 2002-03-21 2008-10-08 Sunesis Pharmaceuticals Inc IDENTIFICATION OF KINASE INHIBITORS
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
JP2005520566A (ja) 2002-03-22 2005-07-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体
AU2003245239A1 (en) 2002-03-25 2003-11-03 Uab Research Foundation FC receptor homolog, reagents, and uses thereof
AU2003222103A1 (en) 2002-03-28 2003-10-13 Idec Pharmaceuticals Corporation Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of colon carcinomas
US20030194704A1 (en) 2002-04-03 2003-10-16 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two
WO2003087306A2 (en) 2002-04-05 2003-10-23 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 98p4b6 useful in treatment and detection of cancer
WO2003087768A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Mitokor Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
EP2011886A3 (en) 2002-04-16 2009-02-11 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003089904A2 (en) 2002-04-17 2003-10-30 Baylor College Of Medicine Aib1 as a prognostic marker and predictor of resistance to encocrine therapy
AU2003228869A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Incyte Corporation Transporters and ion channels
EP1572925A4 (en) 2002-05-15 2007-08-15 Avalon Pharmaceuticals CANCER-RELATED GENE AS A TARGET FOR CHEMOTHERAPY
AU2003232453A1 (en) 2002-05-30 2003-12-19 David K. Bol Human solute carrier family 7 member 11 (hslc7a11)
AU2003240495A1 (en) 2002-06-04 2003-12-19 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
WO2003104270A2 (en) 2002-06-06 2003-12-18 Ingenium Pharmaceuticals Ag Dudulin 2 genes, expression products, non-human animal model: uses in human hematological disease
SG145559A1 (en) 2002-06-06 2008-09-29 Oncotherapy Science Inc Genes and polypeptides relating to human colon cancers
AU2003249691A1 (en) 2002-06-07 2003-12-22 Avalon Pharmaceuticals, Inc Cancer-linked gene as target for chemotherapy
WO2003105758A2 (en) 2002-06-12 2003-12-24 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
CA2487809A1 (en) 2002-06-18 2003-12-24 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US20040249130A1 (en) 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
CA2489792C (en) 2002-06-20 2012-05-15 Snaptrack Incorporated Reducing cross-interference in a combined gps receiver and communication system
WO2004000221A2 (en) 2002-06-20 2003-12-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
EP1534331B1 (en) 2002-06-21 2014-10-29 Johns Hopkins University School of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
AU2003253048A1 (en) 2002-07-09 2004-01-23 Morphochem Aktiengellschaft Fur Kombinatorische Chemie Tubulysin conjugates
AU2003281515A1 (en) 2002-07-19 2004-02-09 Cellzome Ag Protein complexes of cellular networks underlying the development of cancer and other diseases
MXPA05000940A (es) 2002-07-25 2005-05-16 Genentech Inc Anticuerpos taci y su uso.
AU2003294210A1 (en) 2002-07-31 2004-05-04 Seattle Genetics, Inc Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
ES2556641T3 (es) 2002-07-31 2016-01-19 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
AU2003251471A1 (en) 2002-08-06 2004-02-25 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
DE60336149D1 (de) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
US7504211B2 (en) 2002-08-27 2009-03-17 Bristol-Myers Squibb Company Methods of using EPHA2 for predicting activity of compounds that interact with and/or modulate protein tyrosine kinases and/or protein tyrosine kinase pathways in breast cells
WO2004020595A2 (en) 2002-08-29 2004-03-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel human polypeptides encoded by polynucleotides
AU2002951346A0 (en) 2002-09-05 2002-09-26 Garvan Institute Of Medical Research Diagnosis of ovarian cancer
MXPA05002455A (es) 2002-09-06 2005-06-03 Mannkind Corp Secuencias de epitopes.
EP1581648A2 (en) 2002-09-09 2005-10-05 Nura, Inc. G protein coupled receptors and uses thereof
JP2004113151A (ja) 2002-09-27 2004-04-15 Sankyo Co Ltd 癌遺伝子及びその用途
AU2003278002A1 (en) 2002-10-03 2004-04-23 Mcgill Univeristy Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics
WO2004032842A2 (en) 2002-10-04 2004-04-22 Van Andel Research Institute Molecular sub-classification of kidney tumors and the discovery of new diagnostic markers
EP1578447A4 (en) 2002-10-31 2009-06-03 Genentech Inc METHODS AND COMPOSITIONS THAT CAN INCREASE ANTIBODY PRODUCTION
EP2364716A3 (en) 2002-11-08 2012-01-11 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of natural killer cell related diseases
US20040146907A1 (en) 2002-11-13 2004-07-29 Genentech, Inc. Methods and compositions for detecting dysplasia
AU2003294355A1 (en) 2002-11-15 2004-06-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions
CA2505601C (en) 2002-11-15 2014-10-28 Musc Foundation For Research Development Complement receptor 2 targeted complement modulators
US20080213166A1 (en) 2002-11-20 2008-09-04 Biogen Idec Inc. Novel Gene Targets and Ligands that Bind Thereto for Treatment and Diagnosis of Colon Carcinomas
EP1624753B1 (en) 2002-11-21 2012-01-25 The University of Utah Research Foundation Purinergic modulation of smell
AU2003298786A1 (en) 2002-11-26 2004-06-18 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
US20060051359A1 (en) 2002-12-02 2006-03-09 Ira Pastan Recombinant immunotoxin and use in treating tumors
EP1581641A4 (en) 2002-12-06 2006-11-15 Diadexus Inc COMPOSITIONS, SPREADING VARIATIONS AND METHODS RELATED TO OVARAL SPECIFIC GENES AND PROTEINS
US20040157278A1 (en) 2002-12-13 2004-08-12 Bayer Corporation Detection methods using TIMP 1
JP4898120B2 (ja) 2002-12-20 2012-03-14 アボット バイオセラピューティクス コーポレイション Ｇｐｒ６４に対する抗体とその利用法
US20050249671A9 (en) 2002-12-23 2005-11-10 David Parmelee Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof
JP2007520995A (ja) 2003-01-08 2007-08-02 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 上皮増殖因子受容体モデュレーターに対する感受性を決定するためのバイオマーカーおよび方法
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
US20050227301A1 (en) 2003-01-10 2005-10-13 Polgen Cell cycle progression proteins
WO2004065577A2 (en) 2003-01-14 2004-08-05 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides and polypeptides associated with the nf-kb pathway
WO2004065576A2 (en) 2003-01-15 2004-08-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of urological disorder using differential expressed polypeptides
EP1585768A2 (en) 2003-01-23 2005-10-19 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
JP2009520459A (ja) 2003-02-14 2009-05-28 サイグレス ディスカバリー， インコーポレイテッド 癌における治療標的
US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
KR101438983B1 (ko) 2003-11-06 2014-09-05 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
US8354507B2 (en) * 2003-12-15 2013-01-15 Dendreon Corporation HLA-DR specific antibodies, compositions and methods
US7375078B2 (en) 2004-02-23 2008-05-20 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
CA2561264A1 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
AU2005249490B2 (en) 2004-06-01 2010-07-29 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
PL1791565T3 (pl) * 2004-09-23 2016-10-31 Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty
EP1797127B1 (en) 2004-09-24 2017-06-14 Amgen Inc. Modified fc molecules
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
WO2008020827A2 (en) 2005-08-01 2008-02-21 Biogen Idec Ma Inc. Altered polypeptides, immunoconjugates thereof, and methods related thereto
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
CN101037475B (zh) * 2006-03-15 2012-08-15 上海中信国健药业股份有限公司 一种嵌合受体及其制备方法和用途
MX2008015132A (es) 2006-05-30 2008-12-10 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados y sus usos.
EP1894941A1 (en) * 2006-09-01 2008-03-05 Institut Pasteur Treatment of cervical carcinoma with a recombinant adenylate cyclase carrying HPV antigens
GB0619291D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Ucb Sa Altered antibodies
EP2609932B1 (en) 2006-12-01 2022-02-02 Seagen Inc. Variant target binding agents and uses thereof
CA2676766A1 (en) 2007-02-09 2008-08-21 Genentech, Inc. Anti-robo4 antibodies and uses therefor
CA2683568A1 (en) 2007-05-08 2008-11-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
JP2010533495A (ja) 2007-07-16 2010-10-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化ＣＤ７９ｂ抗体およびイムノコンジュゲートならびにそれらの使用
PT2176296E (pt) 2007-07-16 2012-05-14 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados anti-cd79b e métodos de utilização
BRPI0818780A2 (pt) * 2007-10-19 2015-04-22 Genentech Inc Anticorpo anti-tenb2 planejados por cisteína e conjugados de medicamento com anticorpos
US20110033378A1 (en) 2008-01-18 2011-02-10 Medlmmune, Llc. Cysteine Engineered Antibodies For Site-Specific Conjugation
TWI450725B (zh) * 2008-07-18 2014-09-01 必治妥美雅史谷比公司 結合ｃｄ２８之單價組合物及其使用方法
CN104127880A (zh) 2009-03-27 2014-11-05 葛兰素集团有限公司 药用融合体和缀合物
PL2896404T3 (pl) 2009-06-04 2017-12-29 Novartis Ag Sposoby identyfikacji miejsc koniugacji IgG
EP2445520A4 (en) 2009-06-22 2013-03-06 Medimmune Llc MANIPULATED FC REGIONS FOR LOCAL SPECIFIC CONJUGATION
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
MX336540B (es) 2010-06-08 2016-01-22 Genentech Inc Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.
US8979373B2 (en) 2010-07-15 2015-03-17 Thomson Industries, Inc. Linear motion bearing with interlock structure
CA2816426A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
WO2013093809A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
SG11201500087VA (en) 2012-07-09 2015-02-27 Genentech Inc Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
CA2879665A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Genentech, Inc. Anti-etbr antibodies and immunoconjugates
EA201690195A1 (ru) 2013-08-12 2016-05-31 Дженентек, Инк. Конъюгатные соединения антитело-лекарство на основе димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1h-бензо[e]индола и способы применения и лечения
AU2015208814B2 (en) 2014-01-27 2018-11-01 Pfizer Inc. Bifunctional cytotoxic agents
AU2015315007C1 (en) 2014-09-11 2021-06-03 Seagen Inc. Targeted delivery of tertiary amine-containing drug substances
SI3191135T1 (sl) * 2014-09-12 2021-01-29 Genentech, Inc. Anti-HER2 protitelesa in imunokonjugati
TW201709934A (zh) * 2015-06-15 2017-03-16 建南德克公司 抗體及免疫結合物
MA43345A (fr) * 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
CN114246952A (zh) 2022-03-29
CN103068406B (zh) 2017-06-30
US10604557B2 (en) 2020-03-31
US11873330B2 (en) 2024-01-16
SG10201600791TA (en) 2016-03-30
JP2013534520A (ja) 2013-09-05
CA3220104A1 (en) 2011-12-15
BR112012030311A2 (pt) 2017-01-24
RU2626537C2 (ru) 2017-07-28
MX336540B (es) 2016-01-22
RU2017124859A3 (es) 2020-12-25
KR20130087382A (ko) 2013-08-06
CA2799540A1 (en) 2011-12-15
CN103068406A (zh) 2013-04-24
JP2018027932A (ja) 2018-02-22
AU2011265054A1 (en) 2012-11-15
AU2011265054B2 (en) 2016-09-15
EP2579897A1 (en) 2013-04-17
SG185428A1 (en) 2012-12-28
MX2022006074A (es) 2022-06-14
US20110301334A1 (en) 2011-12-08
CN107335062B (zh) 2021-09-24
AU2016256788B2 (en) 2019-01-03
CN107335062A (zh) 2017-11-10
AU2016256788A1 (en) 2016-12-01
KR101839163B1 (ko) 2018-03-15
US20140288280A1 (en) 2014-09-25
US20170260253A1 (en) 2017-09-14
WO2011156328A1 (en) 2011-12-15
US9000130B2 (en) 2015-04-07
RU2017124859A (ru) 2019-01-31
RU2755066C2 (ru) 2021-09-13
US20200339664A1 (en) 2020-10-29
RU2012156248A (ru) 2014-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11873330B2 (en) Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP3088004B1 (en) Cysteine engineered antibodies and conjugates
JP2021073176A (ja) システイン操作抗体及びコンジュゲート
MX2007003404A (es) Anticuerpos y conjugados diseñados de cisteina