JP2021073176A - システイン操作抗体及びコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

【課題】重鎖又は軽鎖に遊離システインアミノ酸を含む新規な単離システイン操作抗体及びコンジュゲートを提供する。【解決手段】重鎖又は軽鎖に遊離システインアミノ酸を含む、システイン操作抗体は、システイン操作抗体をコードするように、親抗体の核酸配列に変異生成を行い、１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置き換えること、システイン操作抗体を発現させること、及び、システイン操作抗体を単離することによって、調製される。【選択図】なし

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１４年９月１２日に出願された米国仮出願第６２／０５０，０２２号の優先権の利益を主張し、この仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、反応性システイン残基により操作された抗体に関し、より具体的には、治療または診断用途を有する抗体に関する。システイン操作抗体は、化学療法薬、毒素、ビオチンなどの親和性リガンド、及びフルオロフォアなどの検出標識とコンジュゲートすることができる。本発明はまた、インビトロ、インサイツ、及びインビボでの哺乳動物細胞または関連する病態の診断または治療に抗体及び抗体−薬物のコンジュゲート化合物を使用する方法にも関する。
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、強力な細胞毒性薬の標的を抗原発現腫瘍細胞に定め、それによって抗腫瘍活性を高めることによって、抗体と細胞毒性薬の両方の理想的な特性を組み合わせているため、標的が定められた有望な化学療法分子である。所与の標的抗原のためのＡＤＣ開発の成功は、抗体の選択、リンカーの安定性、細胞毒性薬の効力、及びリンカー−薬物を抗体にコンジュゲートする様式を最適化することに依存する。
薬物部分を抗体に結合させる従来の手段、すなわち共有結合にる連結は、一般に、薬物部分が抗体の多くの部位に結合した不均質な分子の混合物をもたらす。例えば、細胞毒性薬は、典型的に、抗体に多数存在するリジン残基を介して抗体にコンジュゲートされており、不均質な抗体−薬物コンジュゲート混合物が生成される。反応条件に応じて、不均質混合物は、通常、０〜約８個、またはそれ以上の薬物部分が結合した抗体が分散して含まれている。加えて、薬物部分と抗体との比が特定の整数比であるコンジュゲートの各サブグループ内には、薬物部分が抗体の様々な部位に結合している不均質である可能性のある混合物がある。コンジュゲーション反応により得られる不均質混合物に含まれる抗体−薬物コンジュゲート種の分子を分類し、特徴付けるには、分析方法及び調製方法は不適切である。抗体は、大型の複雑かつ構造的に多様な生体分子であり、多数の反応性官能基を有することが多い。リンカー試薬及び薬物−リンカー中間体とのそれらの反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度、及び共溶媒などの因子に依存する。更に、複数ステップのコンジュゲーションプロセスは、反応条件の制御ならびに反応物質及び中間体の特徴付けが困難であることから、再現できない可能性がある。
ｐＨ７付近でプロトン化され、求核性が低いほとんどのアミンとは異なり、システインチオールは中性ｐＨで反応する。遊離チオール（ＲＳＨ、スルフヒドリル）基は比較的反応性が高いため、システイン残基を有するタンパク質は、ジスルフィド結合したオリゴマーとしてその酸化形態で存在するか、またはジスルフィド基が内部架橋していることが多い。抗体のシステインチオール基は、一般に、抗体のアミンまたはヒドロキシル基よりも求電子性コンジュゲーション試薬に対する反応性が高い、すなわち、求核性が高い。タンパク質の様々なアミノ酸残基をシステインアミノ酸に変異させることによるシステインチオール基の操作には問題が生じる場合があり、特に、不対（遊離Ｃｙｓ）残基または反応若しくは酸化が比較的起こりやすい残基の場合に問題が生じる場合がある。大腸菌の周辺質中、培養上清中、または部分的若しくは完全に精製されたタンパク質中のいずれにせよ、タンパク質の濃縮溶液中では、タンパク質の表面上の不対Ｃｙｓ残基が対合し、酸化して、分子間ジスルフィドが形成され、それによってタンパク質二量体または多量体が形成される。ジスルフィド二量体の形成により、新たなＣｙｓは、薬物、リガンド、または他の標識に対するコンジュゲーションについて非反応性となる。更に、タンパク質が、酸化により新たに操作されたＣｙｓ残基と既存のＣｙｓ残基との間で分子間ジスルフィドを形成した場合、いずれのＣｙｓ基も、活性部位の関与及び相互作用に利用することができない。更に、このタンパク質は、誤った折り畳みまたは三次構造の喪失により不活性または非特異的となり得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１１：１−９）。
操作システインをコンジュゲーションに利用することができる部位にシステイン置換を有する抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）は、しかしながら、免疫グロブリンの折り畳み及び組み立てを乱すことも抗原の結合及びエフェクター機能を変化させることもない（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２、Ｄｏｒｎａｎ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（１３）：２７２１−２７２９、米国公開第７５２１５４１号、同第７７２３４８５号、国際公開第ＷＯ２００９／０５２２４９号）。これらのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、次いで、操作システインチオール基を通じて細胞毒性薬とコンジュゲートして、均質な化学量論性（例えば、単一の操作システイン部位を有する抗体では、抗体当たり最大２つの薬物）を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体薬物コンジュゲート（ＴＤＣ）を得ることができる。異なる抗原に対する複数の抗体を用いた研究により、ＴＤＣが、異種移植片モデルにおいては従来のＡＤＣと同程度に効力があり、関連する前臨床モデルではより高い用量に耐容することが示された。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、抗体の異なる位置（例えば、軽鎖−Ｆａｂ、重鎖−Ｆａｂ、及び重鎖−Ｆｃ内の特定のアミノ酸位（すなわち、部位））で薬物と結合するように操作されている。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のインビトロ及びインビボでの安定性、有効性、及びＰＫ特性により、それらの均質性及び細胞毒性薬との部位特異的コンジュゲーションに起因して、従来のＡＤＣに勝る固有の利点が得られる。
本出願は、重鎖または軽鎖に遊離システインアミノ酸を含む新規な単離システイン操作抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）の開示を含む。
本発明の一態様は、システイン操作抗体をコードするように、１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置き換えることによって親抗体の核酸配列に変異生成を行い、システイン操作抗体を発現させ、システイン操作抗体を単離することによって、単離システイン操作抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）を調製するためのプロセスである。
本発明の別の態様は、単離システイン操作抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）を捕捉標識、検出標識、薬物部分、または固体支持体に共有結合させた、該抗体のコンジュゲートである。
ある特定の実施形態では、本発明は、表１〜４のいずれかにおいて、好ましくは表１または２のいずれかにおいて特定されるシステイン変異から選択されるシステイン変異を含む、システイン操作抗体である。具体的な実施形態では、システイン変異は、遊離システインアミノ酸である。ある特定の実施形態では、重鎖におけるシステイン変異は、表２または３に特定されるシステイン変異から選択される。ある特定の実施形態では、軽鎖におけるシステイン変異は、表１または４に特定されるシステイン変異から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、ＨＣ−Ｉ１９５Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２０Ｃ、ＨＣ−Ｙ４３２Ｃ、及びＬＣ−Ｇ６４Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、ＨＣ−Ｙ４３２Ｃ及びＬＣ−Ｇ６４Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、重鎖変異であり、かつＹ３３Ｃ、Ｇ１６２Ｃ、Ｖ１８４Ｃ、Ｉ１９５Ｃ、Ｓ４２０Ｃ、Ｙ４３２Ｃ、及びＱ４３４Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、重鎖変異であり、かつＲ１９Ｃ、Ｅ４６Ｃ、Ｔ５７Ｃ、Ｙ５９Ｃ、Ａ６０Ｃ、Ｍ１００ｃＣ、Ｗ１０３Ｃ、Ｇ１６２Ｃ、Ｉ１９５Ｃ、Ｖ２５８Ｃ、Ｓ４２０Ｃ、Ｈ４２５Ｃ、及びＮ４３０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、重鎖変異であり、かつＹ３３Ｃ、Ｇ１６２Ｃ、Ｖ１８４Ｃ、及びＩ１９５Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、重鎖変異であり、Ｒ１９Ｃ、Ｅ４６Ｃ、Ｙ５９Ｃ、Ａ６０Ｃ、Ｍ１００ｃＣ、Ｗ１０３Ｃ、Ｖ２５８Ｃ、Ｈ４２５Ｃ、及びＮ４３０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、システイン変異は、軽鎖変異であり、かつＹ５５Ｃ、Ｇ６４Ｃ、Ｔ８５Ｃ、Ｔ１８０Ｃ、及びＮ４３０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、軽鎖変異であり、かつＴ３１Ｃ、Ｓ５２Ｃ、Ｇ６４Ｃ、Ｒ６６Ｃ、Ａ１９３Ｃ、及びＮ４３０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、軽鎖変異であり、かつＧ６４Ｃ、Ｔ８５Ｃ、Ｔ１８０Ｃ、及びＮ４３０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、システイン変異は、軽鎖変異であり、かつＳ５２Ｃ、Ｇ６４Ｃ、Ｒ６６Ｃ、及びＡ１９３Ｃ、Ｎ４３０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。具体的な実施形態では、軽鎖におけるシステイン変異は、Ｋａｂａｔ番号付けに基づいてＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃを含むシステイン変異の群から選択される（図１ａ、表１を参照されたい）。好ましい実施形態では、軽鎖におけるシステイン変異は、Ｋａｂａｔ番号付けに基づいてＬＣ−Ｋ１４９Ｃである（図１ａを参照されたい）。
表１．例示的な軽鎖システイン変異
Figure 2021073176
好ましい実施形態では、重鎖におけるシステイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｔ１１４Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２４Ｃ、ＨＣ−Ｎ４３４Ｃ、及びＨＣ−Ｑ４３８Ｃを含むシステイン変異の群から選択される（図１ｂ、表２を参照されたい）。好ましい実施形態では、重鎖におけるシステイン変異は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ−Ａ１４３Ｃ（すなわち、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃ）である（図１ｂ及び２１、表２を参照されたい）。好ましい実施形態では、重鎖におけるシステイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１７４Ｃである（図１ｂ及び２１、表２を参照されたい）。
表２．例示的な重鎖システイン変異
Figure 2021073176
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、
（ｉ）システイン操作抗体をコードするように、１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置き換えることによって親抗体の核酸配列に変異生成を行うことと、
（ｉｉ）前記システイン操作抗体を発現させることと、
（ｉｉｉ）システイン操作抗体を単離することと、を含むプロセスによって調製される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）を含む融合タンパク質である。具体的な実施形態では、ＡＢＰは、
ａ）ＣＤＫＴＨＴＧＧＧＳＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号１４４）、
ｂ）ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号１４５）、
ｃ）ＱＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号１４６）、
ｄ）ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ（配列番号１４７）、または
ｅ）ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１４８）から選択される配列を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体から選択される。具体的な実施形態では、抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＭＵＣ１６抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＳＴＥＡＰ１抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＣＤ７９ｂ抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＣＤ２２抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗Ｂ７Ｈ４抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗Ｌｙ６Ｅ抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、以下の受容体（１）〜（５３）のうちの１つ以上に結合する：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）、
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）、
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）、
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来の成長因子）、
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２）、
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）、
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、
（１７）ＨＥＲ２、
（１８）ＮＣＡ、
（１９）ＭＤＰ、
（２０）ＩＬ２０Ｒα、
（２１）ブレビカン、
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ、
（２３）ＡＳＬＧ６５９、
（２４）ＰＳＣＡ、
（２５）ＧＥＤＡ、
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）、
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）、
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質結合型受容体）、
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原）、
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）、
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）、
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２）、
（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）、
（３７）ＰＭＥＬ１７（ｓｉｌｖｅｒ相同体、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）１）、
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ−１）、
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、
（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ相同体２）、
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔ癌原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、
（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、
（５２）ＣＤ３３、ならびに
（５３）ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、捕捉標識、検出標識、薬物部分、または固体支持体に共有結合する。具体的な実施形態では、抗体は、ビオチン捕捉標識に共有結合する。具体的な実施形態では、抗体は、蛍光色素検出標識に共有結合する。具体的な実施形態では、蛍光色素は、フルオロセイン型、ローダミン型、ダンシル、リサミン、シアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド、及びこれらの類似体から選択される。具体的な実施形態では、抗体は、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、及び２１３Ｂｉから選択される放射性核種検出標識に共有結合する。具体的な実施形態では、抗体は、キレートリガンドによって検出標識に共有結合する。具体的な実施形態では、キレートリガンドは、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ、及びＴＥＴＡから選択される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン、エンジイン抗生物質、タキサン、及びアントラサイクリンから選択される薬物部分と共有結合して、式Ｉ（すなわち、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ）を有し、式中、Ａｂが抗体であり、Ｌがリンカーであり、Ｄが薬物部分であり、ｐが１、２、３、または４である、抗体−薬物コンジュゲートを形成する。具体的な実施形態では、抗体−薬物コンジュゲートは、構造
Figure 2021073176
具体的な実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体にコンジュゲートされる式Ｉの薬物（Ｄ）は、次の構造を有するマイタンシノイドであり、
Figure 2021073176
式中、波線は、Ｄの硫黄原子とリンカーとの共有結合を示し、Ｒは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、及び３，３−ジメチル−２−ブチルから選択され、ｍは、１、２、または３である。
具体的な実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体にコンジュゲートされる式Ｉの薬物（Ｄ）は、以下の構造：
Figure 2021073176
から選択される。
具体的な実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体にコンジュゲートされる式Ｉの薬物（Ｄ）は、以下の構造：
Figure 2021073176
を有し、式中、ｎは、０、１、または２である。
具体的な実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体にコンジュゲートされる式Ｉの薬物（Ｄ）は、以下の構造：
Figure 2021073176
を有する、モノメチルオーリスタチン薬物部分ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦである。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、以下の構造：
Figure 2021073176
のうちの１つを有し、式中、Ｖａｌはバリンであり、Ｃｉｔはシトルリンであり、ｐは、１、２、３、または４である。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、以下の構造を有する。
Figure 2021073176
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、本明細書の後の節でより詳細に説明される、次のクラスのうちのいずれかに含まれる薬物にコンジュゲートされる：オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン、エンジイン抗生物質、タキサン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体、及びアントラサイクリン。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体のリンカー（Ｌ）は、チオール反応性物質を含む。具体的な実施形態では、リンカー（Ｌ）は、マレイミド、ヨードアセトアミド、及びピリジルジスルフィドからなる群から選択される。具体的な実施形態では、リンカー（Ｌ）は、ピリジルジスルフィドである。具体的な実施形態では、リンカー（Ｌ）はピリジルジスルフィドであり、薬物（Ｄ）はＭＭＡＥである。
ある特定の実施形態において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法を含み、この方法には、システイン操作抗体（Ａｂ）の少なくとも１つの遊離システインをリンカー−薬物（Ｌ−Ｄ）試薬と反応させて、式（すなわち、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ）を有し、式中、Ａｂはシステイン操作抗体であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物部分であり、ｐは１、２、３、または４である、抗体−薬物コンジュゲートを形成することが含まれ、ここで、システイン操作抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を含み、少なくとも１つの遊離システインアミノ酸は、表１または２のいずれかで特定されるシステイン変異から選択されるか、あるいは表３または４で特定される代替の安定なシステイン変異から選択される。ある特定の実施形態において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法を含み、この方法には、システイン操作抗体（Ａｂ）の少なくとも１つの遊離システインをリンカー−薬物（Ｌ−Ｄ）試薬と反応させて、式（すなわち、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ）を有し、式中、Ａｂはシステイン操作抗体であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物部分であり、ｐは１、２、３、または４である、抗体−薬物コンジュゲートを形成することが含まれ、ここで、システイン操作抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を含み、少なくとも１つの遊離システインアミノ酸は、好ましくは、表１及び２で特定されるシステイン変異から選択されるか、あるいは表３または４で特定される代替の安定なシステイン変異から選択される。
具体的な実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、重鎖にあり、かつ表２または３に特定されているシステイン変異から選択される。具体的な実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、軽鎖にあり、かつ表１及び４に特定されているシステイン変異から選択される。好ましい実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、図２１に特定されているシステイン変異から選択される。他の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、表５に特定されているシステイン変異から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、ＨＣ−Ｉ１９５Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２０Ｃ、ＨＣ−Ｙ４３２Ｃ、及びＬＣ−Ｇ６４Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、ＨＣ−Ｙ４３２Ｃ及びＬＣ−Ｇ６４Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、重鎖変異であり、かつＹ３３Ｃ、Ｇ１６２Ｃ、Ｖ１８４Ｃ、Ｉ１９５Ｃ、Ｓ４２０Ｃ、Ｙ４３２Ｃ、及びＱ４３４Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、重鎖変異であり、かつＲ１９Ｃ、Ｅ４６Ｃ、Ｔ５７Ｃ、Ｙ５９Ｃ、Ａ６０Ｃ、Ｍ１００ｃＣ、Ｗ１０３Ｃ、Ｇ１６２Ｃ、Ｉ１９５Ｃ、Ｖ２５８Ｃ、Ｓ４２０Ｃ、Ｈ４２５Ｃ、及びＮ４３０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、重鎖変異であり、かつＹ３３Ｃ、Ｇ１６２Ｃ、Ｖ１８４Ｃ、及びＩ１９５Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、重鎖変異であり、かつＲ１９Ｃ、Ｅ４６Ｃ、Ｙ５９Ｃ、Ａ６０Ｃ、Ｍ１００ｃＣ、Ｗ１０３Ｃ、Ｖ２５８Ｃ、Ｈ４２５Ｃ、及びＮ４３０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、軽鎖にあり、かつＹ５５Ｃ、Ｇ６４Ｃ、Ｔ８５Ｃ、及びＴ１８０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、軽鎖にあり、かつＴ３１Ｃ、Ｓ５２Ｃ、Ｇ６４Ｃ、Ｒ６６Ｃ、Ａ１９３Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、軽鎖にあり、かつＧ６４Ｃ、Ｔ８５Ｃ、及びＴ１８０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン変異は、軽鎖にあり、かつＳ５２Ｃ、Ｇ６４Ｃ、Ｒ６６Ｃ、及びＡ１９３Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、軽鎖におけるシステイン変異は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃを含むシステイン変異の群から選択される（図１ａ及び２１を参照されたい）。好ましい実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、軽鎖におけるシステイン変異は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｋ１４９Ｃである（図１ａ及び２１ならびに表１を参照されたい）。
好ましい実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、重鎖におけるシステイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｔ１１４Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２４Ｃ、ＨＣ−Ｎ４３４Ｃ、及びＨＣ−Ｑ４３８Ｃを含むシステイン変異からなる群から選択される（図１ｂ及び２１ならびに表２を参照されたい）。好ましい実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、重鎖におけるシステイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃ（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ−Ａ１３６Ｃ）である（図１ｂ及び２１ならびに表２を参照されたい）。好ましい実施形態において、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、重鎖におけるシステイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｌ１７４Ｃである（図１ｂ及び２１ならびに表２を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は、
（ｉ）システイン操作抗体をコードするように、１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置き換えることによって親抗体の核酸配列に変異生成を行うことと、
（ｉｉ）前記システイン操作抗体を発現させることと、
（ｉｉｉ）システイン操作抗体を単離することと、を含むプロセスによって調製される。
ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）を含む融合タンパク質である。具体的な実施形態では、ＡＢＰは、
ａ）ＣＤＫＴＨＴＧＧＧＳＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号１４４）、
ｂ）ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号１４５）、
ｃ）ＱＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号１４６）、
ｄ）ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ（配列番号１４７）、または
ｅ）ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１４８）から選択される配列を含む。
ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体から選択される。具体的な実施形態では、抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである。
ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＭＵＣ１６抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＳＴＥＡＰ１抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＣＤ７９ｂ抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＣＤ２２抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗Ｂ７Ｈ４抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗Ｌｙ６Ｅ抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体である。
ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は受容体（１）〜（５３）のうちの１つ以上に結合する：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）、
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）、
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）、
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来の成長因子）、
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２）、
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）、
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、
（１７）ＨＥＲ２、
（１８）ＮＣＡ、
（１９）ＭＤＰ、
（２０）ＩＬ２０Ｒα、
（２１）ブレビカン、
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ、
（２３）ＡＳＬＧ６５９、
（２４）ＰＳＣＡ、
（２５）ＧＥＤＡ、
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）、
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）、
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質結合型受容体）、
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原）、
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）、
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）、
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２）、
（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）、
（３７）ＰＭＥＬ１７（ｓｉｌｖｅｒ相同体、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）１）、
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ−１）、
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、
（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ相同体２）、
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔ癌原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、
（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、
（５２）ＣＤ３３、ならびに
（５３）ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）。
ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は、捕捉標識、検出標識、薬物部分、または固体支持体に共有結合する。具体的な実施形態では、抗体は、ビオチン捕捉標識に共有結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、蛍光色素検出標識に共有結合する。ある特定の実施形態では、蛍光色素は、フルオロセイン型、ローダミン型、ダンシル、リサミン、シアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド、及びこれらの類似体から選択される。ある特定の実施形態では、抗体は、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、及び２１３Ｂｉから選択される放射性核種検出標識に共有結合する。具体的な実施形態では、抗体は、キレートリガンドによって検出標識に共有結合する。具体的な実施形態では、キレートリガンドは、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ、及びＴＥＴＡから選択される。
ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン、エンジイン抗生物質、タキサン、及びアントラサイクリンから選択される薬物部分と共有結合して、式Ｉ（すなわち、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ）を有し、式中、Ａｂが抗体であり、Ｌがリンカーであり、Ｄが薬物部分であり、ｐが１、２、３、または４である、抗体−薬物コンジュゲートを形成する。
具体的な実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は、構造：
Figure 2021073176
を有する。
具体的な実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体の薬物（Ｄ）は、構造：
Figure 2021073176
を有するマイタンシノイドであり、式中、波線は、Ｄの硫黄原子とリンカーとの共有結合を示し、Ｒは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、及び３，３−ジメチル−２−ブチルから選択され、ｍは、１、２、または３である。
具体的な実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、薬物（Ｄ）は、構造：
Figure 2021073176
から選択される。
具体的な実施形態では、本方法を使用して、構造：
Figure 2021073176
（式中、ｎが０、１、または２である）
または
Figure 2021073176
を有する、システイン操作抗体を作製することができる。
具体的な実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、Ｄは、構造：
Figure 2021073176
を有する、モノメチルオーリスタチン薬物部分ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦである。
具体的な実施形態では、本方法を使用して、構造：
Figure 2021073176
から選択されるシステイン操作抗体を作製することができ、式中、Ｖａｌはバリンであり、Ｃｉｔはシトルリンであり、ｐは、１、２、３、または４である。
具体的な実施形態では、本方法を使用して、次のクラスのうちのいずれかに含まれ、本明細書の後の節でより詳細に説明される薬物にコンジュゲートされたシステイン操作抗体を作製することができる：オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン、エンジイン抗生物質、タキサン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体、及びアントラサイクリン。
具体的な実施形態では、本方法を使用して、システイン操作抗体を作製することができ、ここで、リンカー（Ｌ）は、チオール反応性物質を含む。具体的な実施形態では、リンカー（Ｌ）は、マレイミド、ヨードアセトアミド、及びピリジルジスルフィドからなる群から選択される。具体的な実施形態では、リンカー（Ｌ）は、ピリジルジスルフィドである。具体的な実施形態では、リンカー（Ｌ）はピリジルジスルフィドであり、薬物（Ｄ）はＭＭＡＥである。
ある特定の実施形態では、本方法を使用してシステイン操作抗体を作製することができ、ここで、システイン操作抗体は、単離されたシステイン操作抗体である。ある特定の実施形態では、本方法を使用して単離システイン操作抗体を作製することができ、ここで、この単離システインの軽鎖の変異は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃを含むシステイン変異の群から選択される（図１ａ及び図２１を参照されたい）。ある特定の実施形態において、本方法を使用して単離システイン操作抗体を作製することができ、ここで、この単離システインの軽鎖の変異は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｋ１４９Ｃである（図１ａ及び２１ならびに表１を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本方法を使用して単離システイン操作抗体を作製することができ、ここで、単離システインの重鎖における変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｔ１１４Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２４Ｃ、ＨＣ−Ｎ４３４Ｃ、及びＨＣ−Ｑ４３８Ｃを含むシステイン変異からなる群から選択される（図１ｂ及び２１ならびに表２を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本方法を使用して単離システイン操作抗体を作製することができ、ここで、単離システインの重鎖における変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃ（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ−Ａ１３６Ｃ）である（図１ｂ及び２１ならびに表２を参照されたい）。
好ましい実施形態において、本明細書に記載されるシステイン操作抗体は、次のシステイン変異のうちの１つを有する：Ｋａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｋ１４９Ｃ及びＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃ（表１及び２ならびに図１ａ及び１ｂを参照されたい）。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される任意のシステイン操作抗体は、０．８〜１．０のチオール反応性値を有する。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される任意のシステイン操作抗体は、０．９〜１．０のチオール反応性値を有する。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される任意のシステイン操作抗体は、０．６〜０．９のチオール反応性値を有する。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される任意のシステイン操作抗体は、０．５〜０．７のチオール反応性値を有する。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される任意のシステイン操作抗体は、０．４〜０．６のチオール反応性値を有する。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される任意のシステイン操作抗体は、０．３〜０．５のチオール反応性値を有する。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される任意のシステイン操作抗体は、０．２〜０．４のチオール反応性値を有する。
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される任意のシステイン操作抗体を含む薬学的組成物である。
図１ａは、４Ｄ５の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けスキームを示す。図１ｂは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（中央列）及びＥＵ番号付け（右列）と比較した４Ｄ５抗体の連続番号付けスキーム（左列）をＮ末端から示す。 図１ａは、４Ｄ５の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けスキームを示す。図１ｂは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（中央列）及びＥＵ番号付け（右列）と比較した４Ｄ５抗体の連続番号付けスキーム（左列）をＮ末端から示す。 図１ａは、４Ｄ５の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けスキームを示す。図１ｂは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（中央列）及びＥＵ番号付け（右列）と比較した４Ｄ５抗体の連続番号付けスキーム（左列）をＮ末端から示す。 図１ａは、４Ｄ５の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けスキームを示す。図１ｂは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（中央列）及びＥＵ番号付け（右列）と比較した４Ｄ５抗体の連続番号付けスキーム（左列）をＮ末端から示す。 抗体におけるシステイン変異生成及び薬物コンジュゲーションの例示的な部位を示す。太字かつ下線の残基は、システイン変異生成の例示的な部位である。下線の残基は、システイン変異生成の更なる例示的な部位である。図２Ａは、重鎖におけるシステイン変異生成の例示的な残基及び更なる例示的な残基を示す。図２Ｂは、軽鎖におけるシステイン変異生成の例示的な残基及び更なる例示的な残基を示す。システイン変異生成の好ましい部位は、灰色の網掛けで示されており、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｔ１１４Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２４Ｃ、ＨＣ−Ｎ４３４Ｃ、及びＨＣ−Ｑ４３８Ｃ（図２Ａ）ならびにＫａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃ（図２Ｂ）が含まれる。好ましいＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ−Ａ１３６Ｃ）及びＫａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｋ１４９Ｃが四角で囲まれており、大きなフォントで強調されている。 抗体におけるシステイン変異生成及び薬物コンジュゲーションの例示的な部位を示す。太字かつ下線の残基は、システイン変異生成の例示的な部位である。下線の残基は、システイン変異生成の更なる例示的な部位である。図２Ａは、重鎖におけるシステイン変異生成の例示的な残基及び更なる例示的な残基を示す。図２Ｂは、軽鎖におけるシステイン変異生成の例示的な残基及び更なる例示的な残基を示す。システイン変異生成の好ましい部位は、灰色の網掛けで示されており、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｔ１１４Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２４Ｃ、ＨＣ−Ｎ４３４Ｃ、及びＨＣ−Ｑ４３８Ｃ（図２Ａ）ならびにＫａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃ（図２Ｂ）が含まれる。好ましいＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ−Ａ１３６Ｃ）及びＫａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｋ１４９Ｃが四角で囲まれており、大きなフォントで強調されている。 凝集の分析及び計算に使用した凝集体とモノマーのピークを表すプロットを示す。８〜１０分の大きなピークはモノマーノピ＝クであり、８分の小さなピークは凝集体のピークである。 ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳを示す。図４ａは、ＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳによって検出されたコンジュゲーションのピークを示す。図４ｂは、ＤＡＲ０（ネイキッド抗体）、ＤＡＲ１、及びＤＡＲ２のコンジュゲーションピークを示す。 ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳを示す。図４ａは、ＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳによって検出されたコンジュゲーションのピークを示す。図４ｂは、ＤＡＲ０（ネイキッド抗体）、ＤＡＲ１、及びＤＡＲ２のコンジュゲーションピークを示す。 全抗体システインスクリーニングを行うためのプロトコルを示す。全抗体スクリーニングを、ＰＤＳ−ＭＭＡＥ及びＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥコンジュゲートに行った。そのため、６４８個のＰＤＳ−ＭＭＡＥ及び６４８個のＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（合計１２９６個）のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製し、試験した。 ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ及びＰＤＳ−ＭＭＡＥコンジュゲートの代表的な安定性グラフを示す。図６ａは、０時間、４８時間、及び９６時間におけるＬＣ／ＭＳ分析を用いたＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の代表的な安定性グラフを示す。図６ｂは、０時間、４８時間、及び９６時間におけるＬＣ／ＭＳ分析を用いたＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の代表的な安定性グラフを示す。 ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ及びＰＤＳ−ＭＭＡＥコンジュゲートの代表的な安定性グラフを示す。図６ａは、０時間、４８時間、及び９６時間におけるＬＣ／ＭＳ分析を用いたＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の代表的な安定性グラフを示す。図６ｂは、０時間、４８時間、及び９６時間におけるＬＣ／ＭＳ分析を用いたＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の代表的な安定性グラフを示す。 薬物負荷パーセントにより評価した場合の異なるＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）の安定性のグラフを示す。 薬物負荷パーセントにより評価した場合の異なるＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）の安定性のグラフを示す。 ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、及びＨＣ−Ａ１１４Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗ＨＥＲ２及び抗ＣＤ３３抗体の経時的な平均ＤＡＲのグラフを示す。 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＣＢＩ−ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−マレイミド−ＰＮＵ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−マレイミド−ＰＮＵの構造を示す。 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＣＢＩ−ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−マレイミド−ＰＮＵ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−マレイミド−ＰＮＵの構造を示す。 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＣＢＩ−ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−マレイミド−ＰＮＵ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−マレイミド−ＰＮＵの構造を示す。 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＣＢＩ−ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−マレイミド−ＰＮＵ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−マレイミド−ＰＮＵの構造を示す。 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＣＢＩ−ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ジスルフィド−ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−マレイミド−ＰＮＵ及びチオ−Ｈｅｒ２−ｈｕ７Ｃ２−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−マレイミド−ＰＮＵの構造を示す。 ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の図（正確な縮尺ではない）を示す。 ＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の図（正確な縮尺ではない）を示す。 ＬＣ−Ｋ１４９Ｃシステイン操作抗体にコンジュゲートしたある特定の薬物の酵素修飾の図を示す。修飾は次の通りである：クリプトフィシンはアミド切断を受け、チューブリシン（Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）はアセチル除去（すなわち、脱アセチル化）を受け、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体リンカー−薬物中間体はカルバメート除去を受け、タキソイドは不安定であり複数の酵素切断を示した。 図１４ａは、ＨＣ−Ａ１４０ＣがＬＣ−Ｋ１４９Ｃと比較してチューブリシンのアセチル基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１４ｂ及び１４ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 図１４ａは、ＨＣ−Ａ１４０ＣがＬＣ−Ｋ１４９Ｃと比較してチューブリシンのアセチル基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１４ｂ及び１４ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 図１４ａは、ＨＣ−Ａ１４０ＣがＬＣ−Ｋ１４９Ｃと比較してチューブリシンのアセチル基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１４ｂ及び１４ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 複数回のＷＢアッセイを用いて、ＨＣ−Ａ１４０Ｃではアセチル除去がＬＣ−Ｋ１４９Ｃと比較して劇的に減少したことを示す。ＨＣ−Ａ１４０Ｃがアセチル除去修飾を救済することが確認された。 図１６ａは、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体リンカー−薬物中間体のカルバメート基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１６ａ）。図１６ｂ及び１６ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 図１６ａは、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体リンカー−薬物中間体のカルバメート基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１６ａ）。図１６ｂ及び１６ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 図１６ａは、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体リンカー−薬物中間体のカルバメート基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１６ａ）。図１６ｂ及び１６ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 ＨＣ−Ａ１４０Ｃが、本明細書に記載される新たな全血アッセイを用いて、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 図１８ａは、ＨＣ−Ａ１４０Ｃがタキソイド修飾からの保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１８ｂ及び１８ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 図１８ａは、ＨＣ−Ａ１４０Ｃがタキソイド修飾からの保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１８ｂ及び１８ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 図１８ａは、ＨＣ−Ａ１４０Ｃがタキソイド修飾からの保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１８ｂ及び１８ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。 新たな全血アッセイを用いて、ＨＣ−Ａ１４０ＣがＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも（例えば、タキソイド薬物除去を保護するという点で）安定していたことを示す。 ＨＣ−Ａ１４０Ｃ が、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃと比較して、アミド及びエステル切断からクリプトフィシンを保護することを示す。 抗体の図にマッピングされた、ＰＤＳ及び−ｖｃリンカーにとって好ましいＨＣ及びＬＣシステイン変異を示す。
これより本発明のある特定の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の構造及び式に例示されている。本発明は、列挙される実施形態と併せて説明されるが、それらは、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、全ての代替形、修正形、及び同等物を含めることが意図されており、それらは特許請求の範囲によって定められる本発明の範囲内に含まれ得る。
当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されるものに類似または同等である多数の方法及び材料を理解するであろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されるものではない。
別途定義されない限り、本明細書に使用される技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有し、それらは、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、及びＪａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋと一致する。
定義
別途示されない限り、本明細書に使用される以下の用語及び語句は、以下の意味を有することが意図される。
商標名が本明細書に使用される場合、出願者らは、商標名の製品配合物、ジェネリック医薬品、及び商標名の製品の活性な薬学的成分（複数可）を独立して含むことを意図している。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、特に、所望される生体活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントが含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種に由来するものであってもよい。抗体は、特定の抗原を認識しそれに結合することができる、免疫系によって生成されるタンパク質である。（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。標的抗原は、一般に、複数の抗体のＣＤＲによって認識される多数の結合部位（エピトープとも呼ばれる）を有する。異なるエピトープに特異的に結合するそれぞれの抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、１つを上回る対応する抗体を有し得る。抗体には、全長免疫グロブリン分子、または全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、目的の標的抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれ、そのような標的としては、癌細胞、または自己免疫疾患と関連する自己免疫抗体を産生する細胞が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。しかしながら、一態様では、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、またはウサギ起源のものである。
「抗体フラグメント」には、全長抗体の一部分、一般には、その抗原結合領域または可変領域が含まれる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖抗体；ミニボディ（Ｏｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌ． １７（４）：３１５−３２３）、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原に免疫特異的に結合する上述のもののうちのいずれかのエピトープ結合フラグメント、一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。本明細書に使用される「多重特異性抗体」という用語は、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの分子上の２つ若しくはそれ以上の異なるエピトープに結合することができるか、または２つ若しくはそれ以上の異なる分子上のエピトープに結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を指す。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原結合部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体（二重特異性抗体など）である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、全く同一の分子内の２つのエピトープと結合することができる（分子内結合）。例えば、多重特異性抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、同じ分子上の２つの異なるエピトープに結合することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体が結合する２つの異なるエピトープは、１つの単一特異性抗体、例えば従来的な抗体、または１つの免疫グロブリンの単一の可変ドメインが通常同時に結合することがない、エピトープである。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、２つの異なる分子内に位置するエピトープに結合することができる（分子間結合）。例えば、多重特異性抗体の第１の抗原結合ドメインは、１つの分子上のあるエピトープに結合することができ、一方でその多重特異性抗体の第２の抗原結合ドメインは、異なる分子上の別のエピトープに結合することができ、それによって２つの分子が架橋され得る。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体等）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬユニットを含み、第１のＶＨ／ＶＬユニットは第１のエピトープに結合し、第２のＶＨ／ＶＬユニットは第２のエピトープに結合し、各ＶＨ／ＶＬユニットは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。そのような多重特異性抗体としては、全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディ、共有結合または非共有結合で連結されている抗体フラグメントなど）が挙げられるが、これらに限定されない。重鎖可変領域の少なくとも一部分及び／または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を更に含むＶＨ／ＶＬユニットは、「アーム」または「ヘミマー」または「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、第２のヘミマーとの分子内ジスルフィド結合の形成を可能にするのに十分な重鎖可変領域部分を含む。いくつかの実施形態では、ヘミマーは、例えば、相補的なホール変異若しくはノブ変異を含む第２のヘミマーまたは半抗体とのヘテロ二量体形成を可能にするような、ノブ変異またはホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、以下に更に詳細に考察される。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり得る。本明細書に使用される「二重特異性抗体」という用語は、１つの分子上の２つの異なるエピトープに結合できるか、または２つの異なる分子上のエピトープに結合できる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、「二重の特異性」を有する、または「二重に特異的」であると称される場合もある。例示的な二重特異性抗体は、分子及び任意の他の抗原の両方に結合し得る。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方は、分子に対するものであり、他方は、ＣＤ３に対するものである。例えば、米国特許第５，８２１，３３７号を参照されたい。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、同じ分子の２つの異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの異なる分子上の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、目的の分子を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させるために使用することもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）、国際公開第ＷＯ９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、国際公開第ＷＯ２００９／０８９００４号、米国公開第２００９／０１８２１２７号、同第２０１１／０２８７００９号、Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｉｎ．（２００５）２６（６）：６４９−６５８、及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｉｎ．，２６：１−９を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に使用される「ノブ・イン・ホール」または「ＫｎＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面において一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することにより、インビトロまたはインビボで一緒に対合することを誘導する技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、米国公開第２０１１／０２８７００９号、同第ＵＳ２００７／０１７８５５２号、国際公開第ＷＯ９６／０２７０１１号、同第ＷＯ９８／０５０４３１号、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：７８１−７８８、及びＷＯ２０１２／１０６５８７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＫｎＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖を一緒に対合することが促進される。例えば、Ｆｃ領域内にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインを更に含むことができるか、または同様の若しくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインを更に含むことができる。ＫｎＨ技術はまた、２つの異なる受容体の細胞外ドメインを一緒に対合するか、または異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列（例えば、アフィボディ、ペプチボディ、及び他のＦｃ融合体を含む）を対合するために使用することができる。
本明細書に使用される「ノブ変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、ポリペプチドに隆起（ノブ）を導入する、変異を指す。いくつかの実施形態では、他方のポリペプチドは、ホール変異を有する。
本明細書に使用される「ホール変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、ポリペプチドに空洞（ホール）を導入する、変異を指す。いくつかの実施形態では、他方のポリペプチドは、ノブ変異を有する。簡潔な非限定的考察が、以下に提供される。
「隆起」は、ヘテロ多量体を安定化させ、それにより、例えば、ホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成を優先するように、第１のポリペプチドの界面から突出し、したがって隣接する界面（すなわち、第２のポリペプチドの界面）にある相補的空洞内に位置付けることが可能な、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。隆起は、元々の界面内に存在してもよく、または、合成により（例えば、界面をコードする核酸を変化させることによって）導入してもよい。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸を、隆起をコードするように変化させる。これを達成するために、第１のポリペプチドの界面にある少なくとも１つの「原型」アミノ酸残基をコードする核酸が、原型アミノ酸残基よりも大きな側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸で置換される。１つを上回る原型残基及び対応する移入残基が存在し得ることが、理解されよう。様々なアミノ残基の側鎖体積は、例えば、米国公開第２０１１／０２８７００９号の表１に示されている。「隆起」を導入するための変異は、「ノブ変異」と称される場合がある。
いくつかの実施形態において、隆起の形成のための移入残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される天然のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、移入残基は、トリプトファンまたはチロシンである。ある実施形態では、隆起の形成のための原型残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、スレオニン、またはバリンのように、小さな側鎖体積を有する。
「空洞」は、第２のポリペプチドの界面から凹んでおり、したがって隣接する第１のポリペプチドの界面上の対応する隆起を収容する、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元々の界面内に存在してもよく、または、合成による（例えば、界面をコードする核酸を変化させることによって）導入してもよい。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸を、空洞をコードするように変化させる。これを達成するために、第２のポリペプチドの界面にある少なくとも１つの「原型」アミノ酸残基をコードする核酸が、原型アミノ酸残基よりも小さな側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置換される。１つを上回る原型残基及び対応する移入残基が存在し得ることが、理解されよう。いくつかの実施形態では、空洞の形成のための移入残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される天然のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、移入残基は、セリン、アラニン、またはスレオニンである。いくつかの実施形態では、空洞の形成のための原型残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンのように、大きな側鎖体積を有する。「空洞」を導入するための変異は、「ホール変異」と称される場合がある。
隆起は空洞内に「位置付けることが可能」であり、これは、それぞれ第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの界面上の隆起及び空洞の空間的位置、ならびに隆起及び空洞の大きさが、界面における第１及び第２のポリペプチドの正常な会合を著しく乱すことなく隆起が空洞内に位置し得るようなものであることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐなどの隆起は、典型的には界面の軸から直角に伸びず、好ましい立体構造を有しないため、対応する空洞との隆起のアライメントは、いくつかの事例では、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるものといった三次元構造に基づく隆起／空洞対のモデリングに依存しし得る。これは、当該技術分野で広く許容されている技法を使用して達成することができる。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１定常領域内のノブ変異は、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）から選択される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４定常領域内のノブ変異は、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）から選択される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）を含む。
多重特異性抗体はまた、静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（国際公開第ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体フラグメントを作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、ならびに例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）に記載されるように三重特異性抗体を調製することによって、作製することができる。
「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」または「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、米国公開第２００６／００２５５７６Ａ１号、及びＷｕ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７））を参照されたい。）。本明細書における抗体またはフラグメントにはまた、分子ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」が含まれる（例えば、米国公開第２００８／００６９８２０号を参照されたい）。
本明細書に使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は同一であるが、少量で存在し得る天然の変異の可能性は除く。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して指向されており、高度に特異的である。更に、異なる決定基（エピトープ）に指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向されるものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入することなく合成することができるという点で、有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、いずれの特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるものではない。例えば、本発明による使用対象のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５が初めて述べたハイブリドーマ法によって作製してもよく、または組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号、同第５８０７７１５号を参照されたい）によって作製してもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７に記載される技法を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
本明細書におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種であり、一方で鎖（複数可）の残りが別の種に由来するかまたは別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である、「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントが含まれるが、これは、それらが所望される生物学的活性を呈する限りにおいてである（米国特許第４８１６５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が含まれる。
本明細書において「インタクトな抗体」とは、ＶＬドメイン及びＶＨドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒトの天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異形であり得る。インタクト抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得、この機能は、抗体のＦｃ定常領域（天然配列の配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異形のＦｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシス、ならびにＢ細胞受容体及びＢＣＲなどの細胞表面受容体の下方制御が挙げられる。
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによってＦｃ領域変異形を生成することができる。Ｆｃ領域変異形は、１つ以上のアミノ酸位にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
ある特定の実施形態において、全てではないが一部のエフェクター機能を保有することにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ等）が不必要または有害である用途に望ましい候補となる、抗体変異形が本発明により企図される。インビトロ及び／またはインビボでの細胞毒性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力は保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃ（ＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球はＦｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。代替として、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリー用非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替または追加として、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものといった動物モデルにおいて、評価してもよい。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑと結合できず、よってＣＤＣ活性を欠いていることを確認してもよい。例えば、国際公開第ＷＯ２００６／０２９８７９及び同第ＷＯ２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎの結合及びインビボクリアランス／半減期の判定もまた、当該技術分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、胎児性Ｆｃ受容体へのＩｇＧの結合を増加させるために、１つ以上のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ部分に導入され得る。ある特定の実施形態では、抗体は、ＥＵ番号付けによる３つの変異、すなわちＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含む（「ＹＴＥ変異」）（米国特許第８，６９７，６５０号、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）も参照されたい。ある特定の実施形態では、ＹＴＥ変異は、抗体がその同族抗原に結合する能力に影響を及ぼさない。ある特定の実施形態では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）抗体と比較して、抗体の血清半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）抗体と比較して、抗体の血清半減期を３倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）抗体と比較して、抗体の血清半減期を２倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）抗体と比較して、抗体の血清半減期を４倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）抗体と比較して、抗体の血清半減期を少なくとも５倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）抗体と比較して、抗体の血清半減期を少なくとも１０倍増加させる。例えば、米国特許第８，６９７，６５０号、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）もまた参照されたい。
ある特定の実施形態では、ＹＴＥ変異体は、抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を調節する手段を提供する。ある特定の実施形態では、ＹＴＥＯ変異体は、ヒト抗原指向性のヒト化ＩｇＧ抗体のＡＤＣＣ活性を調節する手段を提供する。例えば、米国特許第８，６９７，６５０号、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）もまた参照されたい。
ある特定の実施形態では、ＹＴＥ変異体は、血清半減期、組織分布、及び抗体活性（例えば、ＩｇＧ抗体のＡＤＣＣ活性）の同時調節を可能にする。例えば、米国特許第８，６９７，６５０号、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）もまた参照されたい。
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、ＥＵ番号付けによるＦｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、ＥＵ番号付けによる残基２６５及び２９７のアラニンへの置換（すなわち、ＥＵ番号付けによるＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ）を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、ＥＵ番号付けによるアミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上における置換を有するＦｃ変異体が含まれる。ある特定の実施形態では、Ｆｃ変異体は、次の２つのアミノ酸置換、すなわちＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ変異体は、次の２つのアミノ酸置換、すなわちＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａからなる。
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＦｃ領域の３２９位（ＥＵ番号付け）におけるプロリン（Ｐ３２９）が、グリシン若しくはアルギニン、または、ＦｃのＰ３２９とＦｃｇＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｗ８７及びＷ１１０との間に形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチを破壊するのに十分に大きなアミノ酸残基で置換される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ ４０６，２６７−２７３（２０ Ｊｕｌｙ ２０００））。更なる実施形態では、Ｆｃ変異形における少なくとも１つの更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、更に、別の実施形態では、該少なくとも１つの更なるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅであり、これらは全てＥＵ番号付けによるものである（米国特許第８，９６９，５２６号、これは参照によりその全体が組み込まれる）。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃ変異形を含み、ここで、このポリペプチドは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＰ３２９がグリシンで置換されており、Ｆｃ変異形は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅに少なくとも２つの更なるアミノ酸置換を含み、これらの残基の番号付けは、ＥＵ番号付けによる（米国特許第８，９６９，５２６号、これは参照によりその全体が組み込まれる）。ある特定の実施形態では、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）の置換を含むポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の低減を示し、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘発されるＡＤＣＣの少なくとも２０％にＡＤＣＣを下方調節し、かつ／またはＡＤＣＰを下方調節する（米国特許第８，９６９，５２６号、これは参照によりその全体が組み込まれる）。
具体的な実施形態では、野生型ヒトＦｃポリペプチドのＦｃ変異形を含むポリペプチドは、三重突然変異、すなわちＥＵ番号付けによるＰｒｏ３２９位におけるアミノ酸置換、Ｌ２３４Ａ変異、及びＬ２３５Ａ変異（Ｐ３２９／ＬＡＬＡ）を含む（米国特許第８，９６９，５２６号、これは参照によりその全体が組み込まれる）。具体的な実施形態では、このポリペプチドは、次のアミノ酸置換、すなわちＥＵ番号付けによるＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを含む。
ＦｃＲへの結合が改善または減少した、ある特定の抗体変異形が記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第ＷＯ２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ９（２）：６５９１−６６０４（２００１））を参照されたい。
ある特定の実施形態では、抗体変異形は、ＡＤＣＣを向上させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（ＥＵ番号付け）に置換を有する、Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第ＷＯ９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、変化した（すなわち、向上か減少のいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす変化が、Ｆｃ領域になされる。
増加した半減期を有し、母体ＩｇＧの胎児への移入を担う（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する向上した結合性を有する抗体が、米国公開第ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合性を向上させる１つ以上の置換を内部に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異形には、ＥＵ番号付けによるＦｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものが含まれる。Ｆｃ領域変異形の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及び国際公開第ＷＯ９４／２９３５１号も参照されたい。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体には、異なる「クラス」が割り当てられ得る。インタクトな免疫グロブリン抗体にはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのうちいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に更に分割され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれている。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は、周知である。Ｉｇの形態には、ヒンジ修飾またはヒンジなしの形態が含まれる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１：４０８３−４０９０、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７：７２４６−７２５６、米国公開第２００５／００４８５７２号、同第２００４／０２２９３１０号）。
「システイン操作抗体」または「システイン操作抗体変異形」は、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている抗体である。システイン操作抗体のチオール基（複数可）を、薬物部分と（例えば、リンカーを介して）コンジュゲートして、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（すなわち、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体薬物コンジュゲート（ＴＤＣ））を形成することができる。特定の実施形態において、置換残基は、抗体の利用しやすい部位において生じる。それらの残基をシステインで置換することで、反応性のチオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に配置され、本明細書に更に記載されるように、この反応性チオール基を使用して、抗体を薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分にコンジュゲートして、免疫コンジュゲートを作り出すことができる。例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、軽鎖におけるシステインではない天然残基のシステインへの単一の変異（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによるＧ６４Ｃ、Ｉ１０６Ｃ、Ｒ１０８Ｃ、Ｋ１４９Ｃ、またはＲ１４２Ｃ）または重鎖におけるもの（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ−Ｄ１０１Ｃ、ＨＣ−Ｖ１８４Ｃ、若しくはＨＣ−Ｔ２０５Ｃ、またはＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｔ１１４Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２４Ｃ、ＨＣ−Ｎ４３４Ｃ、及びＨＣ−Ｑ４３８Ｃ（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ−Ａ１３６Ｃは、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃである）（図１ｂを参照されたい））を有する抗体であり得る。具体的な例では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、重鎖または軽鎖のいずれかに単一のシステイン変異を有し、そのため各全長抗体（すなわち、２つの重鎖と２つの軽鎖を有する抗体）は、２つの操作されたシステイン残基を有することになる。
「ＥｒｂＢ受容体」は、ＥｒｂＢ受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、このファミリーのメンバーは、細胞の成長、分化、及び生存の重要な媒介因子である。ＥｒｂＢ受容体ファミリーには、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含む４つの異なるメンバーが含まれる。抗ＥｒｂＢ２抗体のパネルは、ヒト乳房腫瘍細胞株ＳＫＢＲ３を使用して特徴付けられている（Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９（３）：１１６５−１１７２。４Ｄ５と称される抗体を用いて最大の阻害が達成されており、細胞増殖が５６％阻害された。このパネルの他の抗体は、このアッセイでは細胞増殖を低減させた程度がこれよりも低かった。抗体４Ｄ５は、更に、ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳房腫瘍細胞株をＴＮＦ−αの細胞毒性作用に対して感受性にすることがわかった（米国特許第５６７７１７１号）。Ｈｕｄｚｉａｋらにおいて考察されている抗ＥｒｂＢ２抗体は、更に、Ｆｅｎｄｌｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５５０−１５５８、Ｋｏｔｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ２６（３）：５９Ａ、Ｓａｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９１）Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ １：７２−８２、Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｊ．（１９９１）Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１（３）：１１７−１２７、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１（２）：９７９−９８６、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３７：２５５−２６３、Ｐｉｅｔｒａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：１８２９−１８３８、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４：５３０１−５３０９、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９（２０）：１４６６１−１４６６５、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１４３００−５、Ｄ’ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９４）９１：７２０２−７２０６、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６：１４５７−１４６５、及びＳｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：１３８５−１３９４において特徴付けられている。ＥｒｂＢ受容体は、一般に、ＥｒｂＢリガンドと結合することができる細胞外ドメイン、親油性膜貫通ドメイン、保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化され得る複数のチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含むであろう。ＥｒｂＢ受容体は、「天然配列の」ＥｒｂＢ受容体またはその「アミノ酸配列変異形」であってもよい。好ましくは、ＥｒｂＢ受容体は、天然配列のヒトＥｒｂＢ受容体である。したがって、「ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー」には、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４が含まれる。
「アミノ酸配列変異形」と言う用語は、天然配列のポリペプチドとはある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。アミノ酸配列変異形は、天然のアミノ酸配列のアミノ酸配列内のある特定の位置に、置換、欠失、及び／または挿入を有する。アミノ酸は、従来的な名称、１文字及び３文字のコードで示される。
例えば、ある特定の実施形態では、アミノ酸配列変異形は、天然のＥｒｂＢリガンドの少なくとも１つの受容体結合ドメインまたは天然のＥｒｂＢ受容体の少なくとも１つのリガンド結合ドメインと、少なくとも約７０％の配列同一性を有し、好ましくは、配列がそのような受容体またはリガンド結合ドメインと少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％相同であろう。
「配列同一性」は、配列をアライメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するように必要に応じてギャップを導入した後に同一である、アミノ酸配列変異形の残基の割合として定義される。アライメントの方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。１つのそのようなコンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって開発された「Ａｌｉｇｎ ２」であり、これは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ）Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ ２０５５９に１９９１年１２月１０日に提出されている。
「天然抗体」は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一な軽鎖（Ｌ）と２つの同一な重鎖（Ｈ）から構成される。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に結合されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖によって変化する。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと位置が揃っており、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと位置が揃っている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの境界部を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が抗体によって配列が大幅に異なり、それらが、それぞれの特定の抗体の特定の抗原に対する結合及び特異性に用いられるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖及び重鎖のいずれの可変ドメインにおいても、超可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうちのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれが、主としてβシート構造を取る４つのＦＲを含み、これが３つの超可変領域によって結合され、それによってβシート構造を結合するループ、またいくつかの場合にはその一部を形成するループが形成される。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、その抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与など、様々なエフェクター機能を呈する。
本明細書に使用されるとき、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインでは残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変領域では３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔら（上記））、ならびに／または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメインでは残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインでは２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
抗体のパパイン分解により、「Ｆａｂ」と呼ばれるそれぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一な抗原結合フラグメントと、残りの「Ｆｃ」フラグメントとが得られる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原に架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む、最小の抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインが緊密な非共有結合で結合した二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定めるのは、この構成においてである。集合的に、６つの超可変領域が、抗原結合の特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）ですら、全結合部位よりは親和性は低いとはいえ、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加が、Ｆａｂフラグメントと異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として、産生されたものである。抗体フラグメントの他の化学的結合もまた、既知である。
任意の脊椎動物種に由来する抗体の「軽鎖」には、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型のうちの１つを割り当てることができる。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在している。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、更に、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含んでおり、このリンカーにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を成すことが可能となっている。ｓｃＦｖに関する考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。抗ＥｒｂＢ２抗体ｓｃＦｖフラグメントは、国際公開第ＷＯ９３／１６１８５号、米国特許第５５７１８９４号、及び同第５５８７４５８号に記載されている。
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最小限に含んだキメラ抗体である。ヒト化は、マウスの抗原結合情報を非免疫原性のヒト抗体アクセプターに移入するための方法であり、多数の治療に有用な薬物をもたらしている。ヒト化の方法は、一般に、６つ全てのマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体フレームワークに移入することによって開始する（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５）。これらのＣＤＲがグラフトされた抗体は、一般に、抗原結合に対する元々の親和性を保持することはなく、実際に、親和性は重度に損なわれることが多い。ＣＤＲの他に、選択された非ヒト抗体フレームワーク残基も、適切なＣＤＲ構成を維持するために組み込む必要がある（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７）。グラフトされたＣＤＲの構造配置を支持するために、鍵となるマウスフレームワーク残基をヒトアクセプターに移入することにより、抗原の結合及び親和性が回復されることが示されている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４，４８７−４９９、Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７−４９９、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１，２６２３−２６３２、Ｗｅｒｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５７：４９８６−４９９５、及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ８５：３７９−３８９）。ヒト化抗体は、概ねヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望される特異性、親和性、及び機能性を有するマウス、ラット、ウサギ、若しくは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基で置き換えられている。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含んでもよい。これらの修飾を行って、抗体の性能を更に改良してもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものが含まれるであろう。更なる詳細については、米国特許第６４０７２１３号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９、及びＰｒｅｓｔａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ． Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６を参照されたい。
「遊離システインアミノ酸」とは、親抗体に操作がなされ、チオール官能基（−ＳＨ）を有し、分子内または分子間のジスルフィド架橋として対合していない、システインアミノ酸を指す。
「チオール反応性値」は、遊離システインアミノ酸の反応性の定量的特徴付けである。チオール反応性値は、チオール反応性試薬と反応する遊離システインアミノ酸のシステイン操作抗体中の割合であり、最大値１に変換される。例えば、１００％の収率でビオチン−マレイミド試薬などのチオール反応性試薬と反応する、システイン操作抗体上の遊離システインアミノ酸は、チオール反応性値１．０を有する。９０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．９のチオール反応性値を有する。８０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．８のチオール反応性値を有する。７０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．７のチオール反応性値を有する。６０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．６のチオール反応性値を有する。５０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．５のチオール反応性値を有する。４０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．４のチオール反応性値を有する。３０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．３のチオール反応性値を有する。２０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．２のチオール反応性値を有する。１０％の収率でチオール反応性試薬と反応する、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、約０．１のチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬との反応が全く達成できない、同じかまたは異なる親抗体に操作がなされた別のシステインアミノ酸は、チオール反応性値０を有する。特定のシステインのチオール反応性値の判定は、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析法、液体クロマトグラフィー、オートラジオグラフィー、または他の定量分析試験によって行うことができる。
「親抗体」は、１つ以上のアミノ酸残基が１つ以上のシステイン残基で置き換えられた配列が由来するアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、天然または野生型の配列を含み得る。親抗体は、抗体の他の天然、野生型、または修飾形態に対して、既存のアミノ酸配列修飾（付加、欠失、及び／または置換など）を有する場合がある。親抗体は、目的の標的抗原、例えば生物学的に重要なポリペプチドを対象としたものであり得る。非ポリペプチド抗原（腫瘍関連糖脂質抗原など、米国特許第５０９１１７８号を参照されたい）を対象とする抗体もまた企図される。
例示的な親抗体としては、細胞表面及び膜貫通受容体及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する親和性及び選択性を有する抗体が挙げられる。
「単離」抗体は、その天然環境の構成成分から特定及び分離され、かつ／または回収されているものである。その天然環境の混入成分は、抗体の診断上及び治療上の使用を妨げる材料であり、これらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性若しくは非タンパク質性溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態では、抗体は、次の程度まで精製される（１）ローリー法により判定した場合に抗体の９５重量％を上回り、最も好ましくは９９重量％を上回る、（２）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用してＮ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度、または（３）クーマシーブルー、若しくは好ましくは銀染色を用いて還元若しくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、均質になるまで。単離抗体には、組み換え細胞内でインサイツの抗体が含まれるが、これは、抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在していないためである。しかしながら、通常は、単離抗体は少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。
目的の分子標的または抗原、例えば、ＥｒｂＢ２抗原「と結合する」抗体は、抗体が、抗原を発現する細胞を標的とするのに有用となるような十分な親和性でその抗原に結合することができるものである。抗体がＥｒｂＢ２と結合するものである場合、その抗体は、通常、他のＥｒｂＢ受容体ではなくＥｒｂＢ２と優先的に結合し、かつＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４などの他のタンパク質とは有意に交差反応しないものであり得る。そのような実施形態では、その抗体とこれらの非ＥｒｂＢ２タンパク質との結合（例えば、内在性受容体への細胞表面結合）の程度は、蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって判定した場合に１０％未満であろう。抗ＥｒｂＢ２抗体は、例えばＳｃｈｅｃｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：５１３及びＤｒｅｂｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：５４５−５４８に記載されている、ラットｎｅｕタンパク質とは有意に交差反応しないことがあるだろう。
本発明に包含される抗体の分子標的としては、ＣＤタンパク質及びそれらのリガンドが挙げられ、例えば、限定されないが、（ｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、及びＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、（ｉｉ）ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体などのＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、（ｉｉｉ）細胞接着分子、例えばＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、及びアルファ−ｖ／ベータ−３インテグリン（それらのアルファ若しくはベータサブユニット（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、若しくは抗ＣＤ１１ｂ抗体）のいずれかを含む）、（ｉｖ）ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ−４、タンパク質Ｃ、ＢＲ３、ｃ−ｍｅｔ、組織因子などの成長因子、ならびに（ｖ）細胞表面及び膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などである。
「抗Ｌｙ６Ｅ抗体」及び「Ｌｙ６Ｅに結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＬｙ６Ｅを標的とすることに有用となるような十分な親和性でＬｙ６Ｅと結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非Ｌｙ６Ｅタンパク質への抗Ｌｙ６Ｅ抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＬｙ６Ｅへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、Ｌｙ６Ｅに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗Ｌｙ６Ｅ抗体は、異なる種に由来するＬｙ６Ｅ間で保存されているＬｙ６Ｅのエピトープに結合する。
「抗ＳＴＥＡＰ１抗体」及び「ＳＴＥＡＰ１に結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＳＴＥＡＰ１を標的とすることに有用となるような十分な親和性でＳＴＥＡＰ１と結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＳＴＥＡＰ１タンパク質への抗ＳＴＥＡＰ１抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＳＴＥＡＰ１への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＳＴＥＡＰ１に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＳＴＥＡＰ１抗体は、異なる種に由来するＳＴＥＡＰ１間で保存されているＳＴＥＡＰ１のエピトープに結合する。
「抗ＣＤ７９ｂ抗体」及び「ＣＤ７９ｂに結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＣＤ７９ｂを標的とすることに有用となるような十分な親和性でＣＤ７９ｂと結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＣＤ７９ｂタンパク質への抗ＣＤ７９ｂ抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＣＤ７９ｂへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ７９ｂ抗体は、異なる種に由来するＣＤ７９ｂ間で保存されているＣＤ７９ｂのエピトープに結合する。
「抗ＭＵＣ１６抗体」及び「ＭＵＣ１６に結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＭＵＣ１６を標的とすることに有用となるような十分な親和性でＭＵＣ１６と結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＭＵＣ１６タンパク質への抗ＭＵＣ１６抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＭＵＣ１６への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＭＵＣ１６に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＭＵＣ１６抗体は、異なる種に由来するＭＵＣ１６間で保存されているＭＵＣ１６のエピトープに結合する。
「抗ＨＥＲ２抗体」及び「ＨＥＲ２に結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＨＥＲ２を標的とすることに有用となるような十分な親和性でＨＥＲ２と結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＨＥＲ２タンパク質への抗ＨＥＲ２抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＨＥＲ２への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ２に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、異なる種に由来するＨＥＲ２間で保存されているＨＥＲ２のエピトープに結合する。
「抗ＣＤ２２抗体」及び「ＣＤ２２に結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＣＤ２２を標的とすることに有用となるような十分な親和性でＣＤ２２と結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＣＤ２２タンパク質への抗ＣＤ２２抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＣＤ２２への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＣＤ２２に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ２２抗体は、異なる種に由来するＣＤ２２間で保存されているＣＤ２２のエピトープに結合する。
「抗ＣＤ７９ｂ抗体」及び「ＣＤ７９ｂに結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＣＤ７９ｂを標的とすることに有用となるような十分な親和性でＣＤ７９ｂと結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＣＤ７９ｂタンパク質への抗ＣＤ７９ｂ抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＣＤ７９ｂへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ７９ｂ抗体は、異なる種に由来するＣＤ７９ｂ間で保存されているＣＤ７９ｂのエピトープに結合する。
「抗ＮａＰｉ２ｂ抗体」及び「ＮａＰｉ２ｂに結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＮａＰｉ２ｂを標的とすることに有用となるような十分な親和性でＮａＰｉ２ｂと結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＮａＰｉ２ｂタンパク質への抗ＮａＰｉ２ｂ抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、この抗体のＮａＰｉ２ｂへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＮａＰｉ２ｂに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、異なる種に由来するＮａＰｉ２ｂ間で保存されているＮａＰｉ２ｂのエピトープに結合する。
別途示されない限り、「モノクローナル抗体４Ｄ５」という用語は、マウス４Ｄ５抗体（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４６３）の抗原結合残基またはそれに由来する抗原結合残基を有する、抗体を指す。例えば、モノクローナル抗体４Ｄ５は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５、またはその変異形、例えばヒト化４Ｄ５であってもよい。例示的なヒト化４Ｄ５抗体には、米国特許第５８２１３３７号にあるように、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））が挙げられる。
別途示されない限り、「モノクローナル抗体７Ｃ２」または「７Ｃ２」という用語は、７Ｃ２．ｖ２．２．ＬＡ抗体の抗原結合残基またはそれに由来する抗原結合残基を有する、抗体を指す。７Ｃ２ 抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。
「ｈｕ７Ｃ２．ｖ．２．２．ＬＡ抗体−薬物コンジュゲート」（ｈｕ７Ｃ２ ＡＤＣ）は、薬物にコンジュゲートされたヒト化７Ｃ２抗体を指す。具体的な実施形態では、操作システイン及びリンカーを介して薬物にコンジュゲートされたヒト化７Ｃ２抗体。具体的な実施形態では、ヒト化７Ｃ２ ＡＤＣ は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、Ｔ−ＤＭ１（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））、及びペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））から選択される１つ以上の追加治療剤と共投与される。いくつかの実施形態では、ｈｕ７Ｃ２ ＡＤＣは、トラスツズマブと共投与される。いくつかの実施形態では、ｈｕ７Ｃ２ ＡＤＣは、Ｔ−ＤＭ１と共投与される。いくつかの実施形態では、ｈｕ７Ｃ２ ＡＤＣは、ペルツズマブと共投与される。いくつかの実施形態では、ｈｕ７Ｃ２ ＡＤＣは、トラスツズマブ及びペルツズマブと共投与される。いくつかの実施形態では、ｈｕ７Ｃ２ ＡＤＣは、Ｔ−ＤＭ１及びペルツズマブと共投与される。
「治療する」及び「治療」という用語は、治療的治療及び予防的または防止処置の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害、例えば、癌の発生または拡がりを予防または遅延（緩和）することである。本発明の目的では、有益または所望の臨床結果としては、検出できるか検出できないかに関係なく、症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の緩和または一時的緩和、及び寛解（部分的若しくは完全なもの）が挙げられるがこれらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていなかった場合に予測される生存と比較して、生存期間を長くすることも意味し得る。治療が必要なものには、状態若しくは障害を既に有するもの、ならびに状態若しくは障害を有する傾向にあるもの、または状態若しくは障害を予防する必要があるものが挙げられる。
「治療有効量」という用語は、哺乳動物における疾患または障害を治療するのに有効な薬物の量を指す。癌の場合、薬物の治療有効量は、癌細胞の数の低減；腫瘍サイズの縮小；癌細胞が末梢器官に浸潤することの阻害（すなわち、ある程度の遅延及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；ならびに／または癌と関連する症状の１つ以上のある程度の緩和を行うことができる。薬物が既存のがん細胞の成長の予防及び／またはそれらの殺滅を行うことができる限り、この薬物は細胞増殖抑制性及び／または細胞毒性であり得る。癌療法に関しては、有効性は、例えば、腫瘍進行に対する時間（ＴＴＰ）の評価及び／または応答速度（ＲＲ）の判定によって、測定することができる。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には制御されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態をさすか、または説明する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病またはリンパ系の悪性病変が挙げられるがこれらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮系扁平上皮細胞癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ））、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
「ＥｒｂＢ発現癌」は、ＥｒｂＢタンパク質が細胞表面に存在する細胞を含むものである。「ＥｒｂＢ２発現癌」は、十分なレベルのＥｒｂＢ２をその細胞表面に産生しており、結果として、抗ＥｒｂＢ２抗体がそこに結合し、癌に対して治療効果を有することができるようなものである。
抗原性受容体を「過剰発現する」癌は、その細胞表面にＥｒｂＢ２などの受容体を、同じ組織型の非癌性細胞と比較して有意に高いレベルで有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子の増幅、または転写若しくは翻訳の増加によって引き起こされ得る。受容体過剰発現は、（例えば、免疫組織化学アッセイ、ＩＨＣにより）細胞の表面に存在する増加した受容体タンパク質のレベルを評価することによって、診断または予後アッセイで判定することができる。代替または追加として、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、国際公開第ＷＯ９８／４５４７９号）、サザンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法、例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、細胞内の受容体をコードする核酸のレベルを測定してもよい。
「化学療法」は、癌の治療に有用な化学療法剤の使用である。
「化学療法剤」は、作用機序に関わらず、癌の治療に有用な化合物であえる。本明細書に使用されるとき、「薬物」または「薬物部分」は、化学療法剤の例である。したがって、本明細書に記載されるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、システイン操作抗体、リンカー、及び薬物を含み、この薬物は、本明細書に記載される化学療法剤のうちの任意のものであってもよい。
化学療法剤のクラスとしては、アルキル化剤、抗代謝剤、紡錘体毒植物アルカロイド、細胞毒性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、光増感剤、及びキナーゼ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。化学療法剤の例としては、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（シス−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、Ａｋｔｉ−１／２、ＨＰＰＤ、ならびにラパマイシンが挙げられる。
化学療法剤の更なる例としては、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メチル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（ＭＥＫ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、国際公開第ＷＯ２００７／０４４５１５号）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、チピファルニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（クレモホール不含）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｍｂｕｃｉｌ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１、Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンホスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；アルキルスルホン酸、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアゾゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、カリケアマイシンガンマ１Ｉ、カリケアマイシンオメガＩ１（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．（１９９４）３３：１８３−１８６）；ダイネミシン、ダイネミシンＡ；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補液（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド、例えば、マイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド（２−ｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ）；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤 ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；ならびに上述のものの任意のものの薬学的に許容される塩、酸、及び誘導体が挙げられる。
本明細書に使用される「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは阻止する、及び／または細胞の破壊を引き起こす、物質を指す。化学療法剤（すなわち、「薬物」または「薬物部分」）は、細胞毒性剤であってもよい。したがって、本明細書に記載されるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、システイン操作抗体、リンカー、及び薬物を含み、この薬物は、本明細書に記載される細胞毒性剤のうちの任意のものであってもよい。この用語は、放射性同位体（例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、６０Ｃ、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、ならびに毒素、例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素（それらの合成類似体及び誘導体を含む）を含むことが意図される。
「ファージディスプレイ」は、変異形ポリペプチドがファージ、例えば繊維状ファージの粒子の表面上のコートタンパク質との融合タンパク質として提示される、技法である。ファージディスプレイの有用性の１つは、無作為なタンパク質変異形の大きなライブラリを、標的分子に高い親和性で結合する配列に関して高速かつ効率的に分類することができるという事実にある。ペプチド及びタンパク質ライブラリのファージへのディスプレイは、特異的な結合特性を有するものに関して、何百万ものポリペプチドをスクリーニングするのに使用されている。多価ファージディスプレイ法は、小さなランダムペプチド及び小さなタンパク質を、特に、繊維状ファージのｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩのいずれかへの融合を通じてディスプレイするために使用されている（Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ，（１９９２）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．，３：３５５−３６２及びそこに引用されている参考文献）。一価ファージディスプレイライブラリを、ファージコートタンパク質またはその一部分に融合させ、野生型タンパク質の存在下で低いレベルで発現される。結合活性作用が多価ファージと比べて低下しているため、分類は本質的なリガンド親和性に基づき、ファージミドベクターが使用され、これによりＤＮＡ操作が単純なものになる。Ｌｏｗｍａｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５−０２１６（１９９１）。ファージディスプレイには、抗体様分子を産生するための技法が含まれる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ６２７−６２８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ）。
「ファージミド」は、細菌複製起点、例えば、Ｃｏ１Ｅ１と、バクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有する、プラスミドベクターである。ファージミドは、繊維状バクテリオファージ及びラムドイドバクテリオファージを含む、任意の既知のバクテリオファージに使用することができる。プラスミドはまた、一般に、抗生物質耐性の選択的マーカーを含むであろう。これらのベクターにクローニングしたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖させることができる。これらのベクターを持つ細胞に、ファージ粒子の産生に必要な全ての遺伝子を提供すると、プラスミドの複製様式がローリングサークル複製に変わり、プラスミドＤＮＡの一本鎖のコピー及びパッケージファージ粒子が生成される。ファージミドは、感染性または非感染性ファージ粒子を形成することができる。この用語には、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面にディスプレイされるように、遺伝子融合として異種ポリペプチド遺伝子に結合したファージコートタンパク質遺伝子またはそのフラグメントを含む、ファージミドが含まれる。
「リンカー」、「リンカー単位」、または「リンク」は、共有結合、または抗体を薬物部分に共有結合する原子の鎖を含む、化学部分を指す。様々な実施形態において、リンカーは、Ｌとして示される。リンカーには、二価ラジカル、例えば、アルキルジイル（ａｌｋｙｌｄｉｙｌ）、アリーレン、ヘテロアリーレン、−（ＣＲ２）ｎＯ（ＣＲ２）ｎ−などの部分、アルキルオキシ（例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）及びアルキルアミノ（例えば、ポリエチレンアミノ、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（商標））の反復単位、ならびにスクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート、及びカプロアミドを含む、二価酸のエステル及びアミドが挙げられる。
「標識」という用語は、抗体に共有結合することができ、（ｉ）検出可能なシグナルの提供、（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１または第２の標識によって提供される検出可能な信号を変化させる、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、（ｉｉｉ）抗原若しくはリガンドとの相互作用若しくはそれらとの結合の親和性の安定化、（ｉｖ）移動性、例えば、電気泳動の移動性、若しくは細胞透過性に、電荷、疎水性、形状、若しくは他の物理的パラメータにより影響を与えること、または（ｖ）リガンド親和性、抗体／抗原結合、若しくはイオン性複合体形成を調節するための捕捉部分の提供を行うように機能する、任意の部分を意味する。
本明細書に使用される立体化学的定義及び慣例は、概して、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＥｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学的に活性な形態で存在する、すなわち、それらは、平面偏光の面を回転させる能力を有する。光学活性化合物について説明する際、接頭辞Ｄ及びＬ、またはＲ及びＳは、そのキラル中心（複数可）を中心とした分子の絶対配置を表すために使用される。接頭辞ｄ及びｌまたは（＋）及び（−）は、化合物による平面偏光の回転の表示を指定するために用いられ、（−）またはｌは、化合物が左旋性であることを意味する。接頭辞が（＋）またはｄの化合物は、右旋性である。所与の化学構造について、これらの立体異性体は、互いに鏡像であることを除き、同一である。特定の立体異性体はまた、エナンチオマーとも称され、そのような異性体の混合物は、エナンチオマー混合物と呼ばれることがある。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と称され、これらは、化学反応またはプロセスにおいて立体選択または立体特異性が存在していない場合に生じ得る。「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」という用語は、光学活性を欠く２つのエナンチオマー種の等モル混合物を指す。
本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容される塩」という用語は、ＡＤＣの薬学的に許容される有機塩または無機塩を指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩酸物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸、パントテン酸、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモン酸塩（即ち、１，１’−メチレン−ビス −（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン、または他の対イオンなど、別の分子の包含を伴い得る。対イオンは、親化合物における電荷を安定させる任意の有機または無機部分であり得る。更に、薬学的に許容される塩は、その構造内に１つを上回る荷電原子を有してもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部となっている場合には、複数の対イオンを有してもよい。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／または１つ以上の対イオンを有し得る。
「薬学的に許容される溶媒和物」は、１つ以上の溶媒分子とＡＤＣとの結合を指す。薬学的に許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが挙げられるがこれらに限定されない。
システイン操作抗体
本発明の化合物は、野生型または親抗体の１つ以上のアミノ酸がシステインアミノ酸（すなわち、「操作システイン」）で置き換えられた（すなわち、「置換された」または「変異された」）、システイン操作抗体を含む。抗体のいずれの形態も、そのように操作、すなわち変異させることができる。例えば、親モノクローナル抗体を、操作して「ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体」を形成することができる。ＴＨＩＯＭＡＢ抗体の１つの例は、操作システインを有する抗体フラグメント（すなわち、Ｆａｂ）である。このＦａｂ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、「ＴｈｉｏＦａｂ」と称され得る。単一の部位の変異により、ＴｈｉｏＦａｂに単一の操作システイン残基が生じるが、単一部位の変異により、ＩｇＧ抗体の二量体性に起因してＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体に２つの操作システイン残基が生じることに留意されたい。操作システイン（Ｃｙｓ）残基を有する変異体に、新たに導入された操作システインチオール基の反応性に関する評価を行った。チオール反応性値は、０〜１．０の範囲の相対的な数値であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．０〜１．０の範囲である。具体的には、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．１〜１．０の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．０〜０．１、０．１〜０．５、０．１〜０．６、０．１〜０．７、０．１〜０．８、０．１〜０．９、または０．１〜１．０の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．２〜１．０、０．３〜１．０、０．４〜１．０、０．５〜１．０、０．６〜１．０、０．７〜１．０、または０．８〜１．０の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．６〜１．０の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．７〜１．０の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．８〜１０の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．５〜０．８の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．５〜０．９の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．５〜０．７の範囲である。ある特定の実施形態では、本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．５〜１．０の範囲である。
本発明の設計、選択、及び調製方法は、求電子性官能基と反応するシステイン操作抗体を可能にする。これらの方法は、更に、指定され設計された選択的な部位に薬物分子を有する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物などの抗体コンジュゲート化合物を可能にする。抗体表面上の反応性システイン残基により、マレイミドまたはハロアセチルなどのチオール反応性基を通じて薬物部分に特異的にコンジュゲートすることが可能となる。マレイミド基に対するＣｙｓ残基のチオール官能基の求核反応性は、リジン残基のアミノ基またはＮ末端アミノ基など、タンパク質中の任意の他のアミノ酸の官能基と比較して、約１０００倍高い。ヨードアセチル及びマレイミド試薬におけるチオール特異的官能基は、アミノ基と反応し得るが、より高いｐＨ（９．０超）及びより長い反応時間を要する（Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
本発明のシステイン操作抗体は、それらの野生型の親抗体対応物の抗原結合能力を保持することが好ましい。したがって、システイン操作抗体は、抗原に、好ましくは特異的に結合することができる。そのような抗原としては、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面受容体タンパク質及び他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存制御因子、細胞増殖制御因子、組織の発達または分化と関連する（例えば、それに機能的に寄与することが知られているか、若しくは想定される）分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞臭気制御に関与する分子、脈管形成似関与する分子、ならびに血管新生に関連する（例えば、それに機能的に寄与することが知られているか、若しくは想定される）分子が挙げられる。腫瘍関連抗原は、クラスター分化因子（すなわち、ＣＤタンパク質）であり得る。システイン操作抗体が結合することができる抗原は、上述の分類のうちの１つのサブセットのメンバーであり得、ここで、当該分類の他のサブセット（複数可）は、（目的の抗原に関して）異なる特徴を有する分子／抗原を含む。
親抗体はまた、米国特許第５８２１３３７号の表３（参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ヒト化５２０Ｃ９（国際公開第ＷＯ９３／２１３１９号）、及び本明細書に記載されるヒト化２Ｃ４抗体から選択される、ヒト化抗体であってもよい。
本発明のシステイン操作抗体は、チオール反応性試薬と部位特異的かつ効率的に結合し得る。チオール反応性試薬は、多官能性リンカー試薬、捕捉すなわち親和性標識試薬（例えば、ビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えば、蛍光試薬）、固相固定化試薬（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ポリスチレン、若しくはガラス）、または薬物−リンカー中間体であり得る。チオール反応性試薬の一例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。例示的な実施形態において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とビオチン−リンカー試薬との反応により、ビオチニル化ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が得られ、これによって、操作システイン残基の存在及び反応性を検出及び測定することができる。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体と多官能性リンカー試薬との反応により、官能化リンカーを有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が得られ、これを更に薬物部分試薬または他の標識と反応させてもよい。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体と薬物−リンカー中間体との反応により、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体薬物コンジュゲートが得られる。ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＴｈｉｏＦａｂである。
本明細書に記載される例示的な方法は、概して、抗体の特定及び産生、ならびにより一般には、本明細書に記載される設計及びスクリーニングステップの適用を通じて他のタンパク質に適用され得る。
そのようなアプローチは、他の反応性物質のコンジュゲーションに適用することができ、ここで、反応性基は、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、または他のチオール反応性コンジュゲーションパートナー（Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ３：２、Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ、Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １：２、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０−５５，６４３−６７１）である。パートナーは、細胞毒性剤（例えば、ドキソルビシン若しくは百日咳毒素）、フルオレセイン若しくはローダミンのような蛍光色素などのフルオロフォア、イメージング及び放射線治療用金属のためのキレート剤、ペプチジル若しくは非ペプチジル標識若しくは検出タグ、またはポリエチレングリコールの様々な同位体などのクリアランス調整剤、第３の成分に結合するペプチド、あるいは別の炭水化物若しくは親油性物質であり得る。
本明細書における例示的な抗体ｈｕ４Ｄ５において特定された部位は、全ての抗体種にわたって十分に保存されている、抗体の定常ドメインに主に存在する。これらの部位は、更なる構造設計も特定の抗体構造の知識も必要とすることなく、また抗体の可変ドメインに固有な抗原結合特性に干渉することなく、他の抗体にも広く適用できるはずである。
癌の治療に有用であり得るシステイン操作抗体としては、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体が挙げられるがこれらに限定されない。そのような抗体は、ネイキッド抗体（薬物若しくは標識部分にコンジュゲートしていない）または式Ｉの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）として使用することができる。腫瘍関連抗原は、当該技術分野で既知であり、当該技術分野で周知の方法及び情報を用いて抗体を生成するのに使用するために調製され得る。癌の診断及び治療のための有効な細胞標的を発見する目的で、研究者らは、１つ以上の正常な非癌性細胞と比較して１つ以上の特定の癌細胞種の表面に特異的に発現する膜貫通ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドを特定しようとした。しばしば、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌性細胞の表面上と比較して、癌細胞の表面上ではより豊富に発現する。そのような腫瘍関連細胞表面の抗原ポリペプチドの特定により、抗体に基づく治療法によって癌細胞を破壊のために特異的に標的とする能力が生じた。
ＴＡＡの例には、以下に列挙されるＴＡＡ（１）〜（５３）が挙げられるがこれらに限定されない。便宜上、これらの抗原（全て当該技術分野で既知である）に関連する情報を以下に列挙し、この情報には、名称、別称、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主な参考文献（複数可）に続き、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質配列を特定する慣例が含まれている。ＴＡＡ（１）〜（５３）に対応する核酸及びタンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースで入手可能である。抗体の標的となる腫瘍関連抗原としては、引用される参考文献において特定されている配列と比べて少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する全てのアミノ酸配列変異形及び同位体、または引用される参考文献中に見出される配列を有するＴＡＡと実質的に同じ生物学的特性若しくは特徴を呈するものが含まれる。例えば、変異形配列を有するＴＡＡは、概して、列挙されている対応する配列を有するＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。本明細書に具体的に引用される参考文献中の配列及び開示は、参照により明示的に組み込まれる。
腫瘍関連抗原（１）〜（５３）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿００１２０３）、ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４（５１５５）：１０１−１０４（１９９４），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４（１１）：１３７７−１３８２（１９９７））、国際公開第ＷＯ２００４０６３３６２号（請求項２）、国際公開第ＷＯ２００３０４２６６１号（請求項１２）、米国公開第２００３１３４７９０−Ａ１号（３８〜３９頁）、国際公開第ＷＯ２００２１０２２３５号（請求項１３、２９６頁）、国際公開第ＷＯ２００３０５５４４３号（９１〜９２頁）、国際公開第ＷＯ２００２９９１２２号（実施例２、５２８〜５３０頁）、国際公開第ＷＯ２００３０２９４２１号（請求項６）、国際公開第ＷＯ２００３０２４３９２号（請求項２、図１１２）、国際公開第ＷＯ２００２９８３５８号（請求項１、１８３頁）、国際公開第ＷＯ２００２５４９４０号（１００〜１０１頁）、国際公開第ＷＯ２００２５９３７７号（３４９〜３５０頁）、国際公開第ＷＯ２００２３０２６８号（請求項２７、３７６頁）、国際公開第ＷＯ２００１４８２０４号（実施例、図４）、ＮＰ＿００１１９４骨形成タンパク質受容体、ＩＢ型、／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１。相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８、ＮＰ＿００１１９４．１、ＡＹ０６５９９４
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿００３４８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２５５（２），２８３−２８８（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ ３９５（６６９９）：２８８−２９１（１９９８）、Ｇａｕｇｉｔｓｃｈ， Ｈ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７（１６）：１１２６７−１１２７３）、国際公開第ＷＯ２００４０４８９３８号（実施例２）、国際公開第ＷＯ２００４０３２８４２号（実施例ＩＶ）、国際公開第ＷＯ２００３０４２６６１号（請求項１２）、国際公開第ＷＯ２００３０１６４７５号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００２７８５２４号（実施例２）、国際公開第ＷＯ２００２９９０７４号（請求項１９、１２７〜１２９頁）、国際公開第ＷＯ２００２８６４４３号（請求項２７、２２２、３９３頁）、国際公開第ＷＯ２００３００３９０６号（請求項１０、２９３頁）、国際公開第ＷＯ２００２６４７９８号（請求項３３、９３〜９５頁）、国際公開第ＷＯ２０００１４２２８号（請求項５、１３３〜１３６頁）、米国公開第２００３２２４４５４号（図３）、国際公開第ＷＯ２００３０２５１３８号（請求項１２、１５０頁）、ＮＰ＿００３４７７溶質輸送体ファミリー７（カチオン性アミノ酸輸送体、ｙ＋システム）、メンバー５ ／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３− Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、相互参照：ＭＩＭ：６００１８２、ＮＰ＿００３４７７．３、ＮＭ＿０１５９２３、ＮＭ＿００３４８６＿１
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿０１２４４９）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１（１５），５８５７−５８６０（２００１）、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２５）：１４５２３−１４５２８）、国際公開第ＷＯ２００４０６５５７７号（請求項６）、同第ＷＯ２００４０２７０４９号（図１Ｌ）、欧州特許第ＥＰ１３９４２７４号（実施例１１）、国際公開第ＷＯ２００４０１６２２５号（請求項２）、同第ＷＯ２００３０４２６６１号（請求項１２）、米国公開第２００３１５７０８９号（実施例５）、同第２００３１８５８３０号（実施例５）、同２００３０６４３９７号（図２）、国際公開第ＷＯ２００２８９７４７号（実施例５、６１８〜６１９頁）、同第ＷＯ２００３０２２９９５号（実施例９、図１３Ａ、実施例５３、１７３頁、実施例２、図２Ａ）、ＮＰ＿０３６５８１前立腺の６回膜貫通上皮抗原
相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５、ＮＰ＿０３６５８１．１、ＮＭ＿０１２４４９＿１
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＦ３６１４８６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（２９）：２７３７１−２７３７５（２００１））、国際公開第ＷＯ２００４０４５５５３号（請求項１４）、同第ＷＯ２００２９２８３６号（請求項６、図１２）、同第ＷＯ２００２８３８６６号（請求項１５、１１６〜１２１頁）、米国公開第２００３１２４１４０号（実施例１６）、相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７、ＡＡＫ７４１２０．３、ＡＦ３６１４８６＿１
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿００５８２３）Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９（２），８０５−８０８（１９９４），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９６ （２０）：１１５３１−１１５３６（１９９９），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９３（１）：１３６−１４０（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０（３７）：２１９８４−２１９９０（１９９５））、国際公開第ＷＯ２００３１０１２８３号（請求項１４）、（国際公開第ＷＯ２００２１０２２３５号（請求項１３、２８７〜２８８頁）、国際公開第ＷＯ２００２１０１０７５号（請求項４、３０８〜３０９頁）、国際公開第ＷＯ２００２７１９２８号（３２０〜３２１頁）、国際公開第ＷＯ９４１０３１２号（５２〜５７頁）、相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１、ＮＰ＿００５８１４．２、ＮＭ＿００５８２３＿１
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿００６４２４）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７（２２）：１９６６５−１９６７２（２００２），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６２（２）：２８１−２８４（１９９９），Ｆｅｉｌｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２５８（３）：５７８−５８２）、国際公開第ＷＯ２００４０２２７７８号（請求項２）、欧州特許第ＥＰ１３９４２７４号（実施例１１）、国際公開第ＷＯ２００２１０２２３５号（請求項１３、３２６頁）、欧州特許第ＥＰ８７５５６９号（請求項１、１７〜１９頁）、国際公開第ＷＯ２００１５７１８８号（請求項２０、３２９頁）、国際公開第ＷＯ２００４０３２８４２号（実施例ＩＶ）、国際公開第ＷＯ２００１７５１７７号（請求項２４、１３９〜１４０頁）、相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７、ＮＰ＿００６４１５．１、ＮＭ＿００６４２４＿１
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＢ０４０８７８）、Ｎａｇａｓｅ Ｔ．，ｅｔ ａｌ（２０００）ＤＮＡ Ｒｅｓ．７（２）：１４３−１５０）、国際公開第ＷＯ２００４０００９９７号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００３００３９８４号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００２０６３３９号（請求項１、５０頁）、国際公開第ＷＯ２００１８８１３３号（請求項１、４１〜４３、４８〜５８頁）、国際公開第ＷＯ２００３０５４１５２号（請求項２０）、国際公開第ＷＯ２００３１０１４００号（請求項１１）、受託：Ｑ９Ｐ２８３、ＥＭＢＬ、ＡＢ０４０８７８、ＢＡＡ９５９６９．１． Ｇｅｎｅｗ、ＨＧＮＣ：１０７３７
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＹ３５８６２８）、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：２５４６−２５５３、米国公開第２００３１２９１９２号（請求項２）、同第２００４０４４１８０号（請求項１２）、同第２００４０４４１７９号（請求項１１）、同第２００３０９６９６１号（請求項１１）、同第２００３２３２０５６号（実施例５）、国際公開第ＷＯ２００３１０５７５８号（請求項１２）、米国公開第２００３２０６９１８号（実施例５）、欧州特許第ＥＰ１３４７０４６号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００３０２５１４８号（請求項２０）、相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８、ＡＡＱ８８９９１．１、ＡＹ３５８６２８＿１
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＹ２７５４６３）、Ｎａｋａｍｕｔａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １７７，３４−３９，１９９１、Ｏｇａｗａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １７８，２４８−２５５，１９９１、Ａｒａｉ Ｈ．，ｅｔ ａｌ Ｊｐｎ． Ｃｉｒｃ． Ｊ．５６，１３０３−１３０７，１９９２、Ａｒａｉ Ｈ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８，３４６３−３４７０，１９９３、Ｓａｋａｍｏｔｏ Ａ．，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １７８，６５６−６６３，１９９１、Ｅｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８，３８７３−３８７９，１９９３、Ｈａｅｎｄｌｅｒ Ｂ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０，ｓ１−Ｓ４，１９９２、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅ ２２８，４３−４９，１９９９、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９−１６９０３，２００２、Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ Ｃ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８２，３１１６−３１２３，１９９７、Ｏｋａｍｏｔｏ Ｙ．，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２，２１５８９−２１５９６，１９９７、Ｖｅｒｈｅｉｊ Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ Ａｍ． Ｊ．Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． １０８，２２３−２２５，２００２、Ｈｏｆｓｔｒａ Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ Ｅｕｒ． Ｊ．Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ５，１８０−１８５，１９９７、Ｐｕｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ ７９，１２５７−１２６６，１９９４、Ａｔｔｉｅ Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ４，２４０７−２４０９，１９９５、Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ Ａ．，ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ５：３５１−３５４，１９９６、Ａｍｉｅｌ Ｊ．，ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ５，３５５−３５７，１９９６、Ｈｏｆｓｔｒａ Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １２，４４５−４４７，１９９６、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． １０３，１４５−１４８，１９９８、Ｆｕｃｈｓ Ｓ．，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７，１１５−１２４，２００１、Ｐｉｎｇａｕｌｔ Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２００２）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． １１１，１９８−２０６、国際公開第ＷＯ２００４０４５５１６号（請求項１）、同第ＷＯ２００４０４８９３８号（実施例２）、同第ＷＯ２００４０４００００号（請求項１５１）、同第ＷＯ２００３０８７７６８号（請求項１）、同第ＷＯ２００３０１６４７５号（請求項１）、同第ＷＯ２００３０１６４７５号（請求項１）、同第ＷＯ２００２６１０８７号（図１）、同第ＷＯ２００３０１６４９４号（図６）、同第ＷＯ２００３０２５１３８号（請求項１２、１４４頁）、同第ＷＯ２００１９８３５１号（請求項１、１２４〜１２５頁）、欧州特許第ＥＰ５２２８６８号（請求項８、図２）、国際公開第ＷＯ２００１７７１７２号（請求項１、２９７〜２９９頁）、米国公開第２００３１０９６７６号、米国特許第６５１８４０４号（図３）、同第５７７３２２３号（請求項１ａ、Ｃｏｌ ３１〜３４）、国際公開第ＷＯ２００４００１００４号
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿０１７７６３）、国際公開第ＷＯ２００３１０４２７５号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００４０４６３４２号（実施例２）、国際公開第ＷＯ２００３０４２６６１号（請求項１２）、国際公開第ＷＯ２００３０８３０７４号（請求項１４、６１頁）、国際公開第ＷＯ２００３０１８６２１号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００３０２４３９２号（請求項２、図９３）、国際公開第ＷＯ２００１６６６８９号（実施例６）、相互参照：ＬｏｃｕｓＩＤ：５４８９４、ＮＰ＿０６０２３３．２、ＮＭ＿０１７７６３＿１
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＦ４５５１３８）、Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８２（１１）：１５７３−１５８２（２００２））、国際公開第ＷＯ２００３０８７３０６号、米国公開第２００３０６４３９７号（請求項１、図１）、国際公開第ＷＯ２００２７２５９６号（請求項１３、５４〜５５頁）、同第ＷＯ２００１７２９６２号（請求項１、図４Ｂ）、同第ＷＯ２００３１０４２７０号（請求項１１）、同第ＷＯ２００３１０４２７０号（請求項１６）、米国公開第２００４００５５９８号（請求項２２）、国際公開第ＷＯ２００３０４２６６１号（請求項１２）、米国公開第２００３０６０６１２号（請求項１２、図１０）、国際公開第ＷＯ２００２２６８２２号（請求項２３、図２）、同第ＷＯ２００２１６４２９号（請求項１２、図１０）、相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８、ＡＡＮ０４０８０．１、ＡＦ４５５１３８＿１
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿０１７６３６）、Ｘｕ，Ｘ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１９）：１０６９２−１０６９７（２００１），Ｃｅｌｌ １０９（３）：３９７−４０７（２００２），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８（３３）：３０８１３−３０８２０（２００３））、米国公開第２００３１４３５５７号（請求項４）、国際公開第ＷＯ２０００４０６１４号（請求項１４、１００〜１０３頁）、同第ＷＯ２００２１０３８２号（請求項１、図９Ａ）、同第ＷＯ２００３０４２６６１号（請求項１２）、同第ＷＯ２００２３０２６８号（請求項２７、３９１頁）、米国公開第２００３２１９８０６号（請求項４）、国際公開第ＷＯ２００１６２７９４号（請求項１４、図１Ａ〜Ｄ）、相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６、ＮＰ＿０６０１０６．２、ＮＭ＿０１７６３６＿１
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来の成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＰ＿００３２０３またはＮＭ＿００３２１２）、Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｊ．８（７）：１９８７−１９９１（１９８９），Ａｍ． Ｊ．Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ４９（３）：５５５−５６５（１９９１））、米国公開第２００３２２４４１１号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００３０８３０４１号（実施例１）、同第ＷＯ２００３０３４９８４号（請求項１２）、同第ＷＯ２００２８８１７０号（請求項２、５２〜５３頁）、同第ＷＯ２００３０２４３９２号（請求項２、図５８）、同第ＷＯ２００２１６４１３号（請求項１、９４〜９５、１０５頁）、同第ＷＯ２００２２２８０８号（請求項２、図１）、米国特許第５８５４３９９号（実施例２、Ｃｏｌ １７〜１８）、米国特許第５７９２６１６号（図２）、相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５、ＮＰ＿００３２０３．１、ＮＭ＿００３２１２＿１
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 Ｍ２６００４）、Ｆｕｊｉｓａｋｕ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４（４）：２１１８−２１２５）、Ｗｅｉｓ Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７，１０４７−１０６６，１９８８、Ｍｏｏｒｅ Ｍ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，９１９４−９１９８，１９８７、Ｂａｒｅｌ Ｍ．，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３５，１０２５−１０３１，１９９８、Ｗｅｉｓ Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，５６３９−５６４３，１９８６、Ｓｉｎｈａ Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０，５３１１−５３２０、国際公開第ＷＯ２００４０４５５２０号（実施例４）、米国公開第２００４００５５３８号（実施例１）、国際公開第ＷＯ２００３０６２４０１号（請求項９）、同第ＷＯ２００４０４５５２０号（実施例４）、同第ＷＯ９１０２５３６号（図９．１〜９．９）、同第ＷＯ２００４０２０５９５号（請求項１）、受託番号：Ｐ２００２３、Ｑ１３８６６、Ｑ１４２１２、ＥＭＢＬ、Ｍ２６００４、ＡＡＡ３５７８６．１。
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿０００６２６または１１０３８６７４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３）１００（７）：４１２６−４１３１，Ｂｌｏｏｄ（２００２）１００（９）：３０６８−３０７６、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２（６）：１６２１−１６２５）、国際公開第ＷＯ２００４０１６２２５号（請求項２、図１４０）、同第ＷＯ２００３０８７７６８号、米国公開第２００４１０１８７４号（請求項１、１０２頁）、国際公開第ＷＯ２００３０６２４０１号（請求項９）、同第ＷＯ２００２７８５２４号（実施例２）、米国公開第２００２１５０５７３号（請求項５、１５頁）、米国特許第５６４４０３３号、国際公開第ＷＯ２００３０４８２０２号（請求項１、３０６及び３０９頁）、同第ＷＯ９９／５５８６５８号、米国特許第６５３４４８２号（請求項１３、図１７Ａ／Ｂ）、国際公開第ＷＯ２０００５５３５１号（請求項１１、１１４５〜１１４６頁）、相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５、ＮＰ＿０００６１７．１、ＮＭ＿０００６２６＿１
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿０３０７６４、ＡＹ３５８１３０）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０（２００３），Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４（２）：８７−９５（２００２），Ｂｌｏｏｄ ９９（８）：２６６２−２６６９（２００２），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１７）：９７７２−９７７７（２００１）、Ｘｕ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２８０（３）：７６８−７７５、国際公開第ＷＯ２００４０１６２２５号（請求項２）、国際公開第ＷＯ２００３０７７８３６号、国際公開第ＷＯ２００１３８４９０号（請求項５、図１８Ｄ−１〜１８Ｄ−２）、国際公開第ＷＯ２００３０９７８０３号（請求項１２）、国際公開第ＷＯ２００３０８９６２４号（請求項２５）、相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９、ＮＰ＿１１０３９１．２、ＮＭ＿０３０７６４＿１
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 Ｍ１１７３０）、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ Ｌ．，ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０（４７３０）：１１３２−１１３９）、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ．，ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ３１９，２３０−２３４，１９８６、Ｓｅｍｂａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，６４９７−６５０１，１９８５、Ｓｗｉｅｒｃｚ Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６５，８６９−８８０，２００４、Ｋｕｈｎｓ Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４，３６４２２−３６４２７，１９９９、Ｃｈｏ Ｈ．−Ｓ．，ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ４２１，７５６−７６０，２００３、Ｅｈｓａｎｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５，４２６−４２９、国際公開第ＷＯ２００４０４８９３８号（実施例２）、同第ＷＯ２００４０２７０４９号（図１Ｉ）、同第ＷＯ２００４００９６２２号、同第ＷＯ２００３０８１２１０号、同第ＷＯ２００３０８９９０４号（請求項９）、同第ＷＯ２００３０１６４７５号（請求項１）、米国公開第２００３１１８５９２号、国際公開第ＷＯ２００３００８５３７号（請求項１）、同第ＷＯ２００３０５５４３９号（請求項２９、図１Ａ〜Ｂ）、同第ＷＯ２００３０２５２２８号（請求項３７、図５Ｃ）、同第ＷＯ２００２２２６３６号（実施例１３、９５〜１０７頁）、同第ＷＯ２００２１２３４１号（請求項６８、図７）、同第ＷＯ２００２１３８４７号（７１〜７４頁）、同第ＷＯ２００２１４５０３号（１１４〜１１７頁）、同第ＷＯ２００１５３４６３号（請求項２、４１〜４６頁）、同第ＷＯ２００１４１７８７号（１５頁）、同第ＷＯ２０００４４８９９号（請求項５２、図７）、同第ＷＯ２０００２０５７９号（請求項３、図２）、米国特許第５８６９４４５号（請求項３、Ｃｏｌ ３１〜３８）、国際公開第ＷＯ９６３０５１４号（請求項２、５６〜６１頁）、欧州特許第ＥＰ１４３９３９３号（請求項７）、国際公開第ＷＯ２００４０４３３６１号（請求項７）、同第ＷＯ２００４０２２７０９号、同第ＷＯ２００１００２４４号（実施例３、図４）、受託番号：Ｐ０４６２６、ＥＭＢＬ、Ｍ１１７６７、ＡＡＡ３５８０８．１． ＥＭＢＬ、Ｍ１１７６１、ＡＡＡ３５８０８．１
（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 Ｍ１８７２８）、Ｂａｒｎｅｔｔ Ｔ．，ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３，５９−６６，１９８８、Ｔａｗａｒａｇｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １５０，８９−９６，１９８８、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１６８９９−１６９０３，２００２、国際公開第ＷＯ２００４０６３７０９号、欧州特許第ＥＰ１４３９３９３号（請求項７）、国際公開第ＷＯ２００４０４４１７８号（実施例４）、国際公開第ＷＯ２００４０３１２３８号、国際公開第ＷＯ２００３０４２６６１号（請求項１２）、国際公開第ＷＯ２００２７８５２４号（実施例２）、国際公開第ＷＯ２００２８６４４３号（請求項２７、４２７頁）、国際公開第ＷＯ２００２６０３１７号（請求項２）、受託番号：Ｐ４０１９９、Ｑ１４９２０、ＥＭＢＬ、Ｍ２９５４１、ＡＡＡ５９９１５．１． ＥＭＢＬ、Ｍ１８７２８
（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＢＣ０１７０２３）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６）：１６８９９−１６９０３（２００２））、国際公開第ＷＯ２００３０１６４７５号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００２６４７９８号（請求項３３、８５〜８７頁）、日本特許第ＪＰ０５００３７９０号（図６〜８）、国際公開第ＷＯ９９４６２８４号（図９）、相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０、ＡＡＨ１７０２３．１、ＢＣ０１７０２３＿１
（２０）ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ、ＺＣＹＴＯＲ７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＦ１８４９７１）、Ｃｌａｒｋ Ｈ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３，２２６５−２２７０， ２００３、Ｍｕｎｇａｌｌ Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ４２５，８０５−８１１，２００３、Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｈ．，ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ １０４，９−１９，２００１、Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７，３５４５−３５４９，２００１、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ Ｊ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７，４７５１７−４７５２３，２００２、Ｐｌｅｔｎｅｖ Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：１２６１７−１２６２４、Ｓｈｅｉｋｈ Ｆ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２，２００６−２０１０、欧州特許第ＥＰ１３９４２７４号（実施例１１）、米国公開第２００４００５３２０号（実施例５）、国際公開第ＷＯ２００３０２９２６２号（７４〜７５頁）、同第ＷＯ２００３００２７１７号（請求項２、６３頁）、同第ＷＯ２００２２２１５３号（４５〜４７頁）、米国公開第２００２０４２３６６号（２０〜２１頁）、国際公開第ＷＯ２００１４６２６１号（５７〜５９頁）、同第ＷＯ２００１４６２３２号（６３〜６５頁）、同第ＷＯ９８３７１９３号（請求項１、５５〜５９頁）、受託番号：Ｑ９ＵＨＦ４、Ｑ６ＵＷＡ９、Ｑ９６ＳＨ８、ＥＭＢＬ、ＡＦ１８４９７１、ＡＡＦ０１３２０．１．
（２１）Ｂｒｅｖｉｃａｎ（ＢＣＡＮ、ＢＥＨＡＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＦ２２９０５３）、Ｇａｒｙ Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅ ２５６，１３９−１４７，２０００、Ｃｌａｒｋ Ｈ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３，２２６５−２２７０，２００３、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９−１６９０３，２００２、米国公開第２００３１８６３７２号（請求項１１）、同第２００３１８６３７３号（請求項１１）、同第２００３１１９１３１号（請求項１、図５２）、同第２００３１１９１２２号（請求項１、図５２）、同第２００３１１９１２６号（請求項１）、同第２００３１１９１２１号（請求項１、図５２）、同第２００３１１９１２９号（請求項１）、同第２００３１１９１３０号（請求項１）、同第２００３１１９１２８号（請求項１、図５２）、同第２００３１１９１２５号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００３０１６４７５号（請求項１）、同第ＷＯ２００２０２６３４号（請求項１）
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ、ＥＲＫ、Ｈｅｋ５、ＥＰＨＴ３、Ｔｙｒｏ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿００４４４２）、Ｃｈａｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｗａｔｔ，Ｖ．Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６（６），１０５７−１０６１（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０（５）：８９７−９０５（１９９５），Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２１：３０９−３４５（１９９８），Ｉｎｔ． Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ． １９６：１７７−２４４（２０００））、国際公開第ＷＯ２００３０４２６６１号（請求項１２）、同第ＷＯ２０００５３２１６号（請求項１、４１頁）、同第ＷＯ２００４０６５５７６号（請求項１）、同第ＷＯ２００４０２０５８３号（請求項９）、同第ＷＯ２００３００４５２９号（１２８〜１３２頁）、同第ＷＯ２０００５３２１６号（請求項１、４２頁）、相互参照：ＭＩＭ：６００９９７、ＮＰ＿００４４３３．２、ＮＭ＿００４４４２＿１
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＸ０９２３２８）、米国公開第２００４０１０１８９９号（請求項２）、国際公開第ＷＯ２００３１０４３９９号（請求項１１）、同第ＷＯ２００４０００２２１号（図３）、米国公開第２００３１６５５０４号（請求項１）、同第２００３１２４１４０号（実施例２）、同第２００３０６５１４３号（図６０）、国際公開第ＷＯ２００２１０２２３５号（請求項１３、２９９頁）、米国公開第２００３０９１５８０号（実施例２）、国際公開第ＷＯ２００２１０１８７号（請求項６、図１０）、同第ＷＯ２００１９４６４１号（請求項１２、図７ｂ）、同第ＷＯ２００２０２６２４号（請求項１３、図１Ａ〜１Ｂ）、米国公開第２００２０３４７４９号（請求項５４、４５〜４６頁）、国際公開第ＷＯ２００２０６３１７号（実施例２、３２０〜３２１頁、請求項３４、３２１〜３２２頁）、同第ＷＯ２００２７１９２８号（４６８〜４６９頁）、同第ＷＯ２００２０２５８７号（実施例１、図１）、同第ＷＯ２００１４０２６９号（実施例３、１９０〜１９２頁）、同第ＷＯ２０００３６１０７号（実施例２、２０５〜２０７頁）、同第ＷＯ２００４０５３０７９号（請求項１２）、同第ＷＯ２００３００４９８９号（請求項１）、同第ＷＯ２００２７１９２８号（２３３〜２３４頁、４５２〜４５３頁）、同第ＷＯ０１１６３１８号
（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＪ２９７４３６）、Ｒｅｉｔｅｒ Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１７３５−１７４０，１９９８、Ｇｕ Ｚ．，ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９，１２８８−１２９６，２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． （２０００）２７５（３）：７８３−７８８、国際公開第ＷＯ２００４０２２７０９、欧州特許第ＥＰ１３９４２７４号（実施例１１）、米国公開第２００４０１８５５３号（請求項１７）、国際公開第ＷＯ２００３００８５３７号（請求項１）、同第ＷＯ２００２８１６４６号（請求項１、１６４頁）、同第ＷＯ２００３００３９０６号（請求項１０、２８８頁）、同第ＷＯ２００１４０３０９号（実施例１、図１７）、米国公開第２００１０５５７５１号（実施例１、図１ｂ）、国際公開第ＷＯ２０００３２７５２号（請求項１８、図１）、同第ＷＯ９８５１８０５号（請求項１７、９７頁）、同第ＷＯ９８５１８２４号（請求項１０、９４頁）、同第ＷＯ９８４０４０３号（請求項２、図１Ｂ）、受託番号：Ｏ４３６５３、ＥＭＢＬ、ＡＦ０４３４９８、ＡＡＣ３９６０７．１
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＹ２６０７６３）、ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１−ホモサピエンス（ヒト）、国際公開第ＷＯ２００３０５４１５２号（請求項２０）、同第ＷＯ２００３０００８４２号（請求項１）、同第ＷＯ２００３０２３０１３号（実施例３、請求項２０）、米国公開第２００３１９４７０４号（請求項４５）、相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９、ＡＡＰ１４９５４．１、ＡＹ２６０７６３＿１
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＦ１１６４５６）、ＢＡＦＦ受容体／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１−ホモサピエンス：Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３（５５３７），２１０８−２１１１（２００１）、国際公開第ＷＯ２００４０５８３０９号、国際公開第ＷＯ２００４０１１６１１号、国際公開第ＷＯ２００３０４５４２２号（実施例、３２〜３３頁）、国際公開第ＷＯ２００３０１４２９４号（請求項３５、図６Ｂ）、国際公開第ＷＯ２００３０３５８４６号（請求項７０、６１５〜６１６頁）、国際公開第ＷＯ２００２９４８５２号（Ｃｏｌ １３６−１３７）、国際公開第ＷＯ２００２３８７６６号（請求項３、１３３頁）、国際公開第ＷＯ２００２２４９０９号（実施例３、図３）、相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９、ＮＰ＿４４３１７７．１、ＮＭ＿０５２９４５＿１、ＡＦ１３２６００
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム、ＢＬ−ＣＡＭ、Ｌｙｂ−８、Ｌｙｂ８、ＳＩＧＬＥＣ−２、ＦＬＪ２２８１４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＫ０２６４６７）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１３７−１４６、国際公開第ＷＯ２００３０７２０３６号（請求項１、図１）、相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６、ＮＰ＿００１７６２．１、ＮＭ＿００１７７１＿１
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合により相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質）、ｐＩ：４．８４、分子量：２５０２８ ＴＭ：２［Ｐ］Ｇｅｎｅ 染色体：１９ｑ１３．２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＰ＿００１７７４．１０）、国際公開第ＷＯ２００３０８８８０８号、米国公開第２００３０２２８３１９号、国際公開第ＷＯ２００３０６２４０１号（請求項９）、米国公開第２００２１５０５７３号（請求項４、１３〜１４頁）、国際公開第ＷＯ９９５８６５８号（請求項１３、図１６）、同第ＷＯ９２０７５７４号（図１）、米国特許第５６４４０３３号、Ｈａ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５２６−１５３１、Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２：１６２１−１６２５、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４０（４）：２８７−２９５、Ｐｒｅｕｄ’ｈｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９０（１）：１４１−１４６、Ｙｕ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（２）６３３−６３７、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７（１１）：３４５７−３４６４
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走及び液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染ならびにおそらくはＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Ｇタンパク質結合型受容体）、３７２アミノ酸、ｐＩ：８．５４ 分子量：４１９５９ ＴＭ：７［Ｐ］Ｇｅｎｅ 染色体：１１ｑ２３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＰ＿００１７０７．１）、国際公開第ＷＯ２００４０４００００号、同第ＷＯ２００４０１５４２６号、米国公開第２００３１０５２９２号（実施例２）、米国特許第６５５５３３９号（実施例２）、国際公開第ＷＯ２００２６１０８７号（図１）、同第ＷＯ２００１５７１８８号（請求項２０、２６９頁）、同第ＷＯ２００１７２８３０号（１２〜１３頁）、同第ＷＯ２０００２２１２９号（実施例１、１５２〜１５３頁、実施例２、２５４〜２５６頁）、同第ＷＯ９９２８４６８号（請求項１、３８頁）、米国特許第５４４００２１号（実施例２、ｃｏｌ ４９〜５２）、国際公開第ＷＯ９４２８９３１号（５６〜５８頁）、同第ＷＯ９２１７４９７号（請求項７、図５）、Ｄｏｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２：２７９５−２７９９、Ｂａｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．３０９：７７３−７７９
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球にそれらを提示する、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、２７３アミノ酸、ｐＩ：６．５６、分子量：３０８２０．ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ 染色体：６ｐ２１．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＰ＿００２１１１．１）、Ｔｏｎｎｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４（１１）：２８３９−２８４７、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２９（６）：４１１−４１３、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２８：４３３−４４１、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１６８９９−１６９０３、Ｓｅｒｖｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：８７５９−８７６６、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５５：１−１３、Ｎａｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ５９：５１２−５１９、国際公開第ＷＯ９９５８６５８号（請求項１３、図１５）、米国特許第６１５３４０８号（Ｃｏｌ ３５〜３８）、同第５９７６５５１号（ｃｏｌ １６８〜１７０）、同第６０１１１４６号（ｃｏｌ １４５〜１４６）、Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０（１）：６６−６８、Ｌａｒｈａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０（２６）：１４１１１−１４１１９
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５、シナプス伝達及び神経発生に関与し得る、細胞外ＡＴＰによって開閉されるイオンチャネル、不足すると突発性排尿筋不安定の病態生理に寄与し得る）、４２２アミノ酸）、ｐＩ：７．６３、分子量：４７２０６ ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ 染色体：１７ｐ１３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＰ＿００２５５２．２）、Ｌｅ ｅｔ ａｌ（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１８（１−２）：１９５−１９９、国際公開第ＷＯ２００４０４７７４９号、同第ＷＯ２００３０７２０３５号（請求項１０）、Ｔｏｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：１６５−１７３、国際公開第ＷＯ２００２２２６６０号（請求項２０）、同第ＷＯ２００３０９３４４４号（請求項１）、同第ＷＯ２００３０８７７６８号（請求項１）、同第ＷＯ２００３０２９２７７号（８２頁）
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）、３５９アミノ酸、ｐＩ：８．６６、分子量：４０２２５、ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ 染色体：９ｐ１３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＰ＿００１７７３．１）、国際公開第ＷＯ２００４０４２３４６号（請求項６５）、同第ＷＯ２００３０２６４９３号（５１〜５２頁、５７〜５８頁）、同第ＷＯ２０００７５６５５号（１０５〜１０６頁）、Ｖｏｎ Ｈｏｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４（１２）：４８７０−４８７７、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１６８９９−１６９０３。
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能消失は、全身性エリテマトーデスを有する患者において疾患活性の増加と関連付けられている）、６６１アミノ酸、ｐＩ：６．２０、分子量：７４１４７ ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ 染色体：５ｑ１２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＰ＿００５５７３．１）、米国公開第２００２１９３５６７号、国際公開第ＷＯ９７０７１９８号（請求項１１、３９〜４２頁）、Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８（３）：２９９−３０４、Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２：２８１５−２８２２、国際公開第ＷＯ２００３０８３０４７号、同第ＷＯ９７４４４５２号（請求項８、５７〜６１頁）、同第ＷＯ２０００１２１３０号（２４〜２６頁）
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１、Ｃ２型Ｉｇ様及びＩＴＡＭドメインを含有する免疫グロブリンＦｃドメインの推定上の受容体、Ｂ−リンパ球分化において役割を有し得る）、４２９アミノ酸、ｐＩ：５．２８、分子量：４６９２５ ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ 染色体：１ｑ２１−１ｑ２２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＰ＿４４３１７０．１）、国際公開第ＷＯ２００３０７７８３６号、同第ＷＯ２００１３８４９０号（請求項６、図１８Ｅ−１〜１８−Ｅ−２）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８（１７）：９７７２−９７７７、国際公開第ＷＯ２００３０８９６２４号（請求項８）、欧州特許第ＥＰ１３４７０４６号（請求項１）、国際公開第ＷＯ２００３０８９６２４号（請求項７）
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２、Ｂ細胞の成長及びリンパ腫形成に潜在的な役割を有する推定上の免疫受容体、転座による遺伝子の制御解除が一部のＢ細胞悪性腫瘍で生じる）、９７７アミノ酸、ｐＩ：６．８８、分子量：１０６４６８、ＴＭ：１［Ｐ］Ｇｅｎｅ 染色体：１ｑ２１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ヒト：ＡＦ３４３６６２、ＡＦ３４３６６３、ＡＦ３４３６６４、ＡＦ３４３６６５、ＡＦ３６９７９４、ＡＦ３９７４５３、ＡＫ０９０４２３、ＡＫ０９０４７５、ＡＬ８３４１８７、ＡＹ３５８０８５、マウス：ＡＫ０８９７５６、ＡＹ１５８０９０、ＡＹ５０６５５８、ＮＰ＿１１２５７１．１、国際公開第ＷＯ２００３０２４３９２号（請求項２、図９７）、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２７７（１）：１２４−１２７、国際公開第ＷＯ２００３０７７８３６号、同第ＷＯ２００１３８４９０号（請求項３、図１８Ｂ−１〜１８Ｂ−２）
（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２、トモレグリン、ＴＰＥＦ、ＨＰＰ１、ＴＲ、推定上の膜貫通プロテオグリカン、成長因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチン関連）、３７４アミノ酸、ＮＣＢＩ受託番号：ＡＡＤ５５７７６、ＡＡＦ９１３９７、ＡＡＧ４９４５１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５７２７６、ＮＣＢＩ遺伝子：２３６７１、ＯＭＩＭ：６０５７３４、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＵＩＫ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＡＦ１７９２７４、ＡＹ３５８９０７、ＣＡＦ８５７２３、ＣＱ７８２４３６、国際公開第ＷＯ２００４０７４３２０号、日本第ＪＰ２００４１１３１５１号、国際公開第ＷＯ２００３０４２６６１号、同第ＷＯ２００３００９８１４号、欧州特許第ＥＰ１２９５９４４号（６９〜７０頁）、国際公開第ＷＯ２００２３０２６８号（３２９頁）、同第ＷＯ２００１９０３０４号、米国公開第２００４２４９１３０号、同第２００４０２２７２７号、国際公開第ＷＯ２００４０６３３５５号、米国公開第２００４１９７３２５号、同第２００３２３２３５０号、同第２００４００５５６３号、同第２００３１２４５７９号、Ｈｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６７：１４６−１５２、Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２６６：５９３−６０２、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：４９０７−１２、Ｇｌｙｎｎｅ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． Ｏｃｔ １５；９４（２）：１７８−８４．（３７）ＰＭＥＬ１７（ｓｉｌｖｅｒ相同体、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、ＭＥ２０、ｇｐ１００）ＢＣ００１４１４、ＢＴ００７２０２、Ｍ３２２９５、Ｍ７７３４８、ＮＭ＿００６９２８、ＭｃＧｌｉｎｃｈｅｙ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６（３３），１３７３１−１３７３６、Ｋｕｍｍｅｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４（４），２２９６−２３０６；
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン１）、Ｈ７３６５、Ｃ９ｏｒｆ２、Ｃ９ＯＲＦ２、Ｕ１９８７８、Ｘ８３９６１、ＮＭ＿０８０６５５、ＮＭ＿００３６９２、Ｈａｒｍｓ，Ｐ．Ｗ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １７（２１），２６２４−２６２９、Ｇｅｒｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２（１８）：２７２３−２７２７；
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１）、Ｕ９５８４７、ＢＣ０１４９６２、ＮＭ＿１４５７９３ ＮＭ＿００５２６４、Ｋｉｍ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２９（８），２２６４−２２７７、Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８２（６５８６）：８０−８３；
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、ＮＰ＿００２３３７．１、ＮＭ＿００２３４６．２、ｄｅ Ｎｏｏｉｊ−ｖａｎ Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｉｎｔ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０３（６），７６８−７７４、Ｚａｍｍｉｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２２ （３）：９４６−９５２；
（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ相同体２（アフリカツメガエル）、ＳＨＩＳＡ２）、ＮＰ＿００１００７５３９．１、ＮＭ＿００１００７５３８．１、Ｆｕｒｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（２００７）Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ３０６（２），４８０−４９２、Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０；
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、ＮＰ＿０６７０７９．２、ＮＭ＿０２１２４６．２、Ｍａｌｌｙａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８０（１）：１１３−１２３、Ｒｉｂａｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３（１）：２７８−２８７；
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、ＮＰ＿００３６５８．１、ＮＭ＿００３６６７．２、Ｓａｌａｎｔｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ａｍ． Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． １７０（５）：５３７−５４５、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３７（３）：５２８−５３３；
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔ癌原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、ＮＰ＿０６６１２４．１、ＮＭ＿０２０９７５．４、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． １００（１０）：１８９５−１９０１、Ｎａｒｉｔａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２８（３４）：３０５８−３０６８；
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、ＮＰ＿０５９９９７．３、ＮＭ＿０１７５２７．３、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６７（２４）：１１６０１−１１６１１、ｄｅ Ｎｏｏｉｊ−ｖａｎ Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｉｎｔ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０３（６）：７６８−７７４；
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、ＮＰ＿００６１３４．１、ＮＭ＿００６１４３．２、Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔ，Ａ．ａｎｄ Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｄ．（１９９９）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． １０５（１−２）：１６２−１６４、Ｏ’Ｄｏｗｄ，Ｂ．Ｆ．ｅｔ ａｌ（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３９４（３）：３２５−３２９；
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、ＮＰ＿１１５９４０．２、ＮＭ＿０３２５５１．４、Ｎａｖｅｎｏｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ７５（６）：１３００−１３０６、Ｈａｔａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２９（２）：６１７−６２３；
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、ＮＰ＿８５９０６９．２、ＮＭ＿１８１７１８．３、Ｇｅｒｈａｒｄ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４（１０Ｂ）：２１２１−２１２７；
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、ＮＰ＿０００３６３．１、ＮＭ＿０００３７２．４、Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ４１（８）：９２０−９２５、Ｎａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｉｎｔ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２５（４）：９０９−９１７；
（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、ＮＰ＿００１１０３３７３．１、ＮＭ＿００１１０９９０３．１、Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０、Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４０（７０８２）：３４６−３５１
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、ＮＰ＿０７８８０７．１、ＮＭ＿０２４５３１．３、Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１１）：６７５９−６７６４、Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２００２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５２０（１−３）：９７−１０１。
（５２）ＣＤ３３、シアル酸に結合する免疫グロブリン様レクチンファミリーのメンバー、６７ｋＤａのグリコシル化膜貫通タンパク質。ＣＤ３３は、決定済みの（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）髄単球性前駆体細胞及び赤血球前駆体細胞に加えて、ほとんどの骨髄性白血病細胞及び単球性白血病細胞に発現する。これは、最も初期の多能性幹細胞、成熟顆粒球、リンパ系細胞、または非造血系細胞には見られない（Ｓａｂｂａｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７５：７５６−５６、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｌｏｏｄ ６８：１０３０−５）。ＣＤ３３は、その細胞質尾部に２つのチロシン残基を含み、これらのそれぞれに、多くの阻害性受容体に見られる免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に類似の疎水性残基が続いている。
（５３）ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）、Ｃ型レクチン／Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）スーパーファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、タンパク質の折り畳みが共通しており、接着、細胞間シグナル伝達、糖タンパク質代謝回転、ならびに炎症及び免疫応答に於ける役割など、多様な機能を有する。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、顆粒球及び単球の機能の負の調節因子である。この遺伝子のいくつかの代替的なスプライス転写物変異形について説明されているが、これらの変異形のうちの一部については全長の性質がわかっていない。この遺伝子は、染色体１２ｐ１３におけるナチュラルキラー遺伝子複合体領域内の他のＣＴＬ／ＣＴＬＤスーパーファミリーメンバーと緊密に関連している（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ（１９９９）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ９（５）：５８５−９０、ｖａｎ Ｒｈｅｎｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ １１０（７）：２６５９−６６、Ｃｈｅｎ ＣＨ，ｅｔ ａｌ． （２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７（４）：１４５９−６７、Ｍａｒｓｈａｌｌ ＡＳ，ｅｔ ａｌ． （２００６）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６（８）：２１５９−６９、Ｂａｋｋｅｒ ＡＢ，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４（２２）：８４４３−５０、Ｍａｒｓｈａｌｌ ＡＳ，，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（１５）：１４７９２−８０２）。ＣＬＬ−１は、単一のＣ型レクチン様ドメイン（カルシウムまたは糖のいずれにも結合することが予測されていない）、ｓｔａｌｋ領域、膜貫通ドメイン、及びＩＴＩＭモチーフを含む短い細胞質尾部を含む、ＩＩ型膜貫通受容体であることが示されている。
親抗体はまた、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）配列を含む融合タンパク質であり得る（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （２００２）“Ａｌｂｕｍｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓ Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７：３５０３５−３５０４３、国際公開第ＷＯ０１／４５７４６号）。本発明の抗体には、（ｉ）Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７：３５０３５−３５０４３ ａｔ Ｔａｂｌｅｓ ＩＩＩ ａｎｄ ＩＶ，ｐａｇｅ ３５０３８、（ｉｉ）米国公開第２００４０００１８２７号［００７６］、ならびに（ｉｉｉ）国際公開第ＷＯ０１／４５７４６号（１２〜１３頁）に教示されるＡＢＰ配列との融合タンパク質を含み、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
変異生成
開始ポリペプチドのアミノ酸配列変異形をコードするＤＮＡは、当該技術分野で既知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、部位指向性（またはオリゴヌクレオチド媒介型）変異生成、ＰＣＲ変異生成、及び事前に調製したポリペプチドをコードするＤＮＡのカセット変異生成による調製が挙げられるがこれらに限定されない。組み換え抗体の変異形は、制限フラグメント操作または合成オリゴヌクレオチドとのオーバーラップ伸長ＰＣＲによっても構築することができる。変異生成プライマーは、システインコドン置き換え（複数可）をコードする。標準的な変異生成技法を用いて、そのような変異型システイン操作抗体をコードするＤＮＡを生成することができる。一般的な指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３に見出すことができる。
部位指向性変異生成は、置換変異形、すなわち変異体タンパク質を調製するための１つの方法である。この技法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ（１９８５）ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３、Ｈｏ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）７７：５１−５９及びＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８２：４８８を参照されたい）。簡単に言うと、ＤＮＡの部位指向性変異生成の実行時に、開始ＤＮＡを、所望される変異をコードするオリゴヌクレオチドをそのような開始ＤＮＡの一本鎖にハイブリダイズさせることによって、まず改変させる。ハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレアーゼをプライマーとして使用し、開始ＤＮＡの一本鎖を鋳型として用いて、ＤＮＡポリメラーゼにより第２の鎖全体を合成する。したがって、所望される変異をコードするオリゴヌクレオチドが、結果として得られる二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。部位指向性変異生成は、発現プラスミドにおいて変異生成を受けるタンパク質を発現する遺伝子内において行うことができ、結果として得られるプラスミドに配列決定を行って、所望のシステイン置き換え変異の導入を確認することができる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２０２５２−２０２６０）。市販入手可能な、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含む部位指向性のプロトコル及び形式。
ＰＣＲ変異生成はまた、開始ポリペプチドのアミノ酸配列変異形を作製するのにも好適である。Ｈｉｇｕｃｈｉ，（１９９０）ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｇｅｎｅ １０２：６７−７０、Ｂｅｒｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：１２６−１３２、及びＶａｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３を参照されたい。簡単にいうと、少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲにおいて出発物質として使用する場合、鋳型ＤＮＡの対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーを使用して、プライマーが鋳型と異なっている位置のみが鋳型配列とは異なる、比較的大量の特異的ＤＮＡフラグメントを生成することができる。
変異形を調製するための別の方法であるカセット変異生成は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３によって説明される技法に基づく。出発物質は、変異生成を受ける出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異生成を受ける出発ＤＮＡ内のコドン（複数）が特定される。特定された変異部位（複数可）の両側には固有の制限エンドヌクレアーゼが必要である。そのような制限部位が存在しない場合は、出発ポリペプチドＤＮＡの適切な位置で上述のオリゴヌクレオチド媒介型変異生成法を用いて生成することができる。プラスミドＤＮＡは、これらの位置で切断され、直線状となる。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードする所望される変異（複数可）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準的な手順を用いて合成され、ここで、オリゴヌクレオチドの２つの鎖は、別個に合成された後、標準的な技法を用いて一緒にハイブリダイズされる。オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト合成方法（米国特許第４４１５７３２号、同第４４５８０６６号、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３−２３１１）によって調製される。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと称される。このカセットは、直鎖型プラスミドの末端と適合性があり、そのためプラスミドに直接ライゲーションすることができる、５’末端及び３’末端を有するように設計される。このプラスミドは、ここで、変異ＤＮＡ配列を含んでいる。コードされたシステイン置き換えを含む変異体ＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
単一の変異は、オリゴヌクレオチド指向性変異生成によって、二本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲに基づく変異生成（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００：４６８−５００、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８２）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００）によって生成される。
本発明では、Ｍ１３ファージ上に提示されたｈｕ４Ｄ５（Ｇｅｒｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｏｆ Ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３２１：８５１−６２）を、モデル系として実験に使用した。システイン変異を、ｈｕ４Ｄ５−ファージ、ｈｕ４Ｄ５、及びＡＢＰ−ｈｕ４Ｄ５構築物に導入した。ｈｕ４Ｄ５−ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の調製は、前述のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈｅｎｒｙ Ｂ．（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）８７（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）２４９−２６４）を用いて行った。
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイ
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ（反応性チオールの選択のためのファージＥＬＩＳＡ）アッセイにより、ＥＬＩＳＡファージ形成において抗体中の反応性システイン基の検出が可能となる。米国特許第 ７，５２１，５４１号及び米国特許公開第 ２０１１０３０１３３４号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が組み込まれる。具体的には、ＰＨＥＳＥＳＬＥＣＴＯＲアッセイには、目的のタンパク質（例えば、抗体）をウェル表面にコーティングし、それに続いてファージ粒子と共にインキュベーションした後、ＨＲＰ標識した二次抗体と共にインキュベーションし吸光を検出するプロセスが含まれる。ファージに提示された変異体タンパク質は、迅速、強固、かつ高スループットな様式でスクリーニングすることができる。システイン操作抗体のライブラリを生成し、同じアプローチを使用して結合選択に供し、抗体または他のタンパク質のランダムなタンパク質−ファージライブラリから遊離システイン組み込みの適した反応性部位を特定することができる。この技法は、ファージに提示されたシステイン変異体タンパク質を親和性試薬またはレポーター基（これもチオール反応性である）と反応させることを含む。
ある特定の実施形態では、ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイは、次のステップを含む：１）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、標的タンパク質の一部または全体（例えば、ｅｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＨＥＲ２））、及びストレプトアビジン（２μｇ／ｍｌを１００μｌ）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートに別個にコーティングする、２）０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ中）でブロッキングした後、ビオチニル化及び非ビオチニル化ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体−ファージ（２×１０１０ファージ粒子）を１時間室温でインキュベートする（例えば、標的タンパク質がｅｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＨＥＲ２）である場合、ｈｕ４Ｄ５−ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体−ファージ）、３）ファージとともにインキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体とともにインキュベートする（抗Ｍ１３ファージコーティングタンパク質、ｐＶＩＩＩタンパク質抗体）、４）標準的なＨＲＰ反応を行い、吸収を４５０ｎｍで測定する、５）チオール反応性値１がシステインチオールの完全なビオチニル化を示すように、ストレプトアビジンのＯＤ４５０／標的タンパク質（例えば、ＨＥＲ２）のＯＤ４５０を計算することによってチオール反応性を測定する。
タンパク質の発現及び精製
システイン操作抗体をコードするＤＮＡは、従来的な手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源として機能する。単離した後、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、これを通常は抗体タンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、または他の哺乳動物宿主細胞、例えば、骨髄腫細胞（米国特許第５８０７７１５号、米国公開第２００５／００４８５７２号、同第２００４／０２２９３１０号）にトランスフェクトして、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が達成される。多くの場合、システイン操作抗体の収率は、野生型抗体と同様であった。細菌における抗体をコードするＤＮＡの組み換え発現に関する考察記事としては、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：２５６−２６２及びＰｌuｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖｓ． １３０：１５１−１８８が挙げられる。
設計及び選択の後、反応性の高い不対Ｃｙｓ残基を有するシステイン操作抗体、例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、（ｉ）細菌系、例えば、大腸菌系または哺乳動物細胞培養系（国際公開第ＷＯ０１／００２４５号）、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞若しくはＨＥＫ２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）における発現、ならびに（ｉｉ）一般的な精製技法を用いた精製（Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６（１７）：１０９８２−１０９８８）によって産生され得る。本発明の具体的な実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標抗体）を、哺乳動物細胞発現系において発現させた。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞系は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、抗体内にジスルフィド結合を形成する天然のシステイン残基を含む全長抗体である。したがって、これらの天然のシステイン残基は、薬物−マレイミドとコンジュゲートするいずれの反応性チオール基も有さない（還元剤で処理されない限り）。したがって、新たに操作されたＣｙｓ残基は、対合しないままとなり得、また求電子性リンカー試薬または薬物−リンカー中間体、例えば薬物−マレイミドと反応することができる、すなわち、コンジュゲートすることができる。
重鎖及び軽鎖の操作Ｃｙｓ残基の構造位置は、連続番号付けシステムに従って番号付けされる。この連続番号付けシステムは、４Ｄ５抗体に関してＫａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）と相関性がある。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いると、の実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそこへの挿入に対応して、より少ないかまたは追加のアミノ酸を含有し得る。システイン操作重鎖変異形部位及び軽鎖変異形部位は、図１Ａ及び１Ｂの連続番号付け及びＫａｂａｔ番号付けによって特定される。
チオール反応性はまた、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）ならびに重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３といった、抗体のある特定のドメインに対して一般化され得る。約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、及び０．９５以上のチオール反応性値をもたらすシステイン置き換えは、それぞれ、インタクトな抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ（ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２を含めて）の重鎖定常ドメインα、δ、ε、γ、及びμになされ得る。
標識化されたシステイン操作抗体
本発明のシステイン操作抗体は、反応性システインチオール基を介して抗体に共有結合され得る任意の標識部分とコンジュゲートすることができる（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ（２００２）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０４：１４７−１５、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ｌｕｎｄｂｌａｄ Ｒ．Ｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。結合した標識は、（ｉ）検出可能なシグナルの提供、（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１または第２の標識によって提供される検出可能な信号を変化させる、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を行う、（ｉｉｉ）抗原若しくはリガンドとの相互作用若しくはそれらとの結合の親和性の安定化、（ｉｖ）移動性、例えば、電気泳動の移動性、若しくは細胞透過性に、電荷、疎水性、形状、若しくは他の物理的パラメータにより影響を与えること、または（ｖ）リガンド親和性、抗体／抗原結合、若しくはイオン性複合体形成を調節するための捕捉部分の提供を行うように機能し得る。
標識化されたシステイン操作抗体は、診断アッセイにおいて、例えば特定の細胞、組織、または血清における目的の抗原の発現を検出するのに有用であり得る。診断用途では、抗体は、典型的に、検出可能な部分で標識されるであろう。多数の標識が利用可能であり、これらは、概して、以下のカテゴリーに分類することができる：
（ａ）放射性同位体（放射性核種）、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または ２１３Ｂｉ。放射性同位体標識化抗体は、受容体を標的とするイメージング実験において有用である。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９１）Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，Ｃｏｌｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｐｕｂｓ．に記載される技法を用いて、抗体を放射性同位体金属に結合するか、それをキレートするか、またはそうでなければそれと錯体を形成するリガンド試薬（この試薬は抗体の操作システインチオールと反応する）で標識化することができる。金属イオンと錯体を形成するキレートリガンドとしては、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ、及びＴＥＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）が挙げられる。放射性核種は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートとの複合体形成を介して標的化することができる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１３７−１１４６）。ＤＯＴＡ−マレイミド試薬は、システイン操作抗体の遊離システインアミノ酸と反応し、抗体上でリガンドと錯体を形成した金属をもたらす（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ９：７２−８６）。ＤＯＴＡ−ＮＨＳ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）などのキレートリンカー標識試薬が、市販されている（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）。放射性核種標識抗体を用いた受容体標的イメージングにより、腫瘍組織での抗体の進行性蓄積の検出及び定量化によって経路活性化のマーカーを得ることができる（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８：１２０７−１２１０）。
イメージング実験の抗体標識として好適な金属−キレート錯体（米国公開第２０１０／０１１１８５６号、米国特許第５３４２６０６号、同第５４２８１５５号、同第５３１６７５７号、同第５４８０９９０号、同第５４６２７２５号、同第５４２８１３９号、同第５３８５８９３号、同第５７３９２９４号、同第５７５０６６０号、同第５８３４４５６号、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：１４７−１５７、Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４２：６８−７８、Ｍｉｒｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １：５９−６５、Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９９０，Ｓｕｐｐｌ． １０：２１−２６、Ｉｚａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ３：３４６−３５０、Ｎｉｋｕｌａ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２２：３８７−９０、Ｃａｍｅｒａ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２０：９５５−６２、Ｋｕｋｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３９：２１０５−２１１０、Ｖｅｒｅｌ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４４：１６６３−１６７０、Ｃａｍｅｒａ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｊ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２１：６４０−６４６、Ｒｕｅｇｇ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：４２２１−４２２６、Ｖｅｒｅｌ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４４：１６６３−１６７０、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４４７４−４４８２、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４４：１１０５−１１１２、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １０：１０３−１１１、Ｍｉｅｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４５：１２９−１３７、ＤｅＮａｒｄｏ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４：２４８３−９０、Ｂｌｅｎｄ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １８：３５５−３６３、Ｎｉｋｕｌａ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４０：１６６−７６、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３９：８２９−３６、Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２０：６５−７４、Ｒｏｓｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１４：２０９−２０）。
（ｂ）蛍光標識、例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオロセイン、６−カルボキシフルオロセインを含むフルオレセイン種；ＴＡＭＲＡを含むローダミン種；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；及びこれらの類似体。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上述）に開示されている技法を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光色素及び蛍光標識試薬には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）及びＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から市販されているものが含まれる。
蛍光色素及び化学発光色素などの検出標識（Ｂｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ（１９９７）”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ． １：１０５１−１０５８）は、検出可能なシグナルを提供し、一般に、抗体を標識するのに適用可能であり、以下の特性を有するものが好ましい：（ｉ）少量の抗体を細胞不含アッセイ及び細胞に基づくアッセイの両方において高い感受性で検出することができるように、標識化された抗体は、バックグラウンドの低い、非常に高いシグナルを生成すべきである、ならびに（ｉｉ）蛍光シグナルを、著しい光退色を伴うことなく観察、監視、及び記録することができるように、標識化された抗体、光安定性である必要がある。標識化抗体の膜または細胞表面、特に生細胞への細胞表面結合を伴う用途については、標識は、（ｉｉｉ）有効なコンジュゲーション濃度及び検出感受性を達成するために良好な水溶性を有すること、ならびに（ｉｖ）細胞の正常な代謝プロセスを攪乱することも未熟な細胞死をもたらすこともないように、生細胞に対して毒性でないことが、好ましい。
（ｃ）様々な酵素−基質標識が、入手可能であるか、開示されている（米国特許第ＵＳ４２７５１４９号）。酵素は、一般に、様々な技法を用いて測定することができる発色基質の化学的改変を触媒する。例えば、酵素は、基質における色の変化を触媒し得、これは、分光光度法により測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量化するための技法は、上に記載されている。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起されるようになり、次いで光を放出し得、（例えば、化学発光計を用いて）それを測定してもよく、またはそれが蛍光アクセプターにエネルギーを与える。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ、米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートするための技法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ（１９８１）“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（ｅｄ Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ＆Ｈ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６に記載されている。
酵素−基質の組み合わせ（米国特許第４，２７５，１４９号及び同第４，３１８，９８０号）の例としては、例えば、次のものがある。
（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と基質として水素ペルオキシダーゼ（水素ペルオキシダーゼが、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化させる）、
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と発色基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェート、ならびに
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ。
標識は、システイン操作抗体と間接的にコンジュゲートすることができる。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートすることができ、上述の広範なカテゴリーの標識のいずれかを、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートさせてもよく、逆もまた同様である。ビオチンはストレプトアビジンに選択的に結合するため、この標識は、この間接的な様式で抗体にコンジュゲートすることができる。あるいは、標識とポリペプチド変異形との間接的なコンジュゲートを達成するために、ポリペプチド変異形を、低分子ハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートさせ、上述の様々な種類の標識のうちのいずれかを、抗ハプテンポリペプチド変異形（例えば、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。このようにして、標識とポリペプチド変異形との間接的なコンジュゲーションが達成され得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．（１９９６）ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。
本発明のポリペプチド変異形は、ＥＬＩＳＡ、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイといった、任意の既知のアッセイ方法に用いることができる（Ｚｏｌａ，（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
検出標識は、結合または認識事象の局在化、可視化、及び定量化に有用であり得る。本発明の標識化抗体により、細胞表面受容体を検出することができる。検出可能に標識した抗体の別の用途としては、ビーズを蛍光標識抗体とコンジュゲートさせ、リガンドの結合時に蛍光シグナルを検出することを含む、ビーズに基づく免疫捕捉の方法がある。同様の結合検出手法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）作用を用いて、抗体−抗原の相互作用を測定し、検出する。
本発明の標識化システイン操作抗体は、（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）、（ｉｉ）ＭｉｃｒｏＣＴ（コンピュータ断層撮影法）、（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）、（ｉｖ）ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影法）Ｔｉｎｉａｎｏｗ，Ｊ．ｅｔ ａｌ （２０１０）Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３７（３）：２８９−２９７、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１５：４１−４９、米国特許出願第ＵＳ２０１０／０１１１８５６号、（ｖ）生物発光、（ｖｉ）蛍光、及び（ｖｉｉ）超音波といった、生物医学及び分子の様々なイメージング方法及び技法による、イメージングバイオマーカー及びプローブとして有用である。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識した抗体を動物またはヒト患者に投与し、抗体が局在化する体内の部位で画像を取得する、イメージング手順である（米国特許第ＵＳ６５２８６２４号）。イメージングバイオマーカーを客観的に測定し、正常な生物学的プロセス、病態プロセス、または治療介入に対する薬理学的応答の指標として評価することができる。バイオマーカーは、複数の種類のものであり得る：０型は、疾患の自然経過のマーカーであり、既知の臨床指標、例えば、リウマチ性関節炎における滑膜炎症のＭＲＩ評価と長期にわたって相関性があり、Ｉ型マーカーは、作用機序が臨床予後と関連付けられない場合があるが、作用機序に従って介入の作用を捕捉し、ＩＩ型マーカーは、代理エンドポイントとして機能し、バイオマーカーにおける変化またはバイオマーカーからのシグナルにより、ＣＴによって測定されるリウマチ性関節炎における骨びらんなど、標的とされる応答を「検証する」ための臨床的利点を予測する。したがって、イメージングバイオマーカーにより、（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）標的タンパク質への治療剤の結合、すなわち選択性、ならびに（ｉｉｉ）クリアランス及び薬物動態データに関する薬力学的（ＰＤ）治療情報を提供することができる。研究室ベースのバイオマーカーと比べて、インビボイメージングバイオマーカーの利点には、非侵襲的処置、定量可能、全身評価、反復投与及び評価（すなわち、複数時点）、ならびに前臨床結果（小動物）から臨床結果（ヒト）への効果移行の可能性が挙げられる。いくつかの用途については、生体イメージングにより、前臨床研究における動物実験が回避されるか、または動物実験の数が最小限に抑えられる。
ペプチド標識化方法は、周知である。Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ３：２、Ｇａｒｍａｎ，（１９９７）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ、Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １：２、Ｇｌａｚｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７５）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔ．Ｓ．Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｅ．Ｗｏｒｋ，Ｅｄｓ．） Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｎｏｙｅｓ，Ｃ．Ｍ．（１９８４）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ． Ｉ ａｎｄ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｇ．（１９８５）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈ．Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ，Ｅｄ．，Ｗａｌｔｅｒ ＤｅＧｒｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＷｏｎｇ（１９９１）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）、Ｄｅ Ｌｅｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ． Ｊ．１０：１１４９−１１５５、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １２：３２０−３２４、Ｌｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １３：１１０−１１５、Ｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １６：２４０−２３７を参照されたい。
十分な近接性で蛍光レポーター及びクエンチャーという２つの部分により標識化されたペプチド及びタンパク質を蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に供する。レポーター基は、典型的に、ある特定の波長の光によって励起され、エネルギーをアクセプターまたはクエンチャー基に移動させ、最大輝度での発光に適したストークスシフトを有する蛍光色素である。蛍光色素には、フルオレセイン及びローダミンなど、芳香族性が高まった分子、及びそれらの誘導体が含まれる。蛍光レポーターは、インタクトなペプチド中のクエンチャーによって部分的または大幅にクエンチされ得る。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによるペプチドの切断により、検出可能な蛍光の増加が測定され得る（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．（１９９５）“Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２４８：１８−３４）。
本発明の標識化抗体はまた、親和性精製剤としても使用され得る。このプロセスでは、標識化抗体は、当該技術分野で周知の方法を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙などの固相に固定される。固定された抗体は、精製すべき抗原を含有する試料と接触され、その後で支持体を好適な溶媒で洗浄することにより、固定されたポリペプチド変異形に結合している精製すべき抗原を除き、試料中の実質的に全ての材料が除去される。最後に、支持体を、ｐＨ５．０のグリシン緩衝液などの別の好適な溶媒で洗浄し、それにより抗原がポリペプチド変異形から分離する。
標識試薬は、典型的に、（ｉ）システイン操作抗体のシステインチオールと直接的に反応して標識化抗体を形成し得るか、（ｉｉ）リンカー試薬と反応してリンカー−標識中間体を形成し得るか、または（ｉｉｉ）リンカー抗体と反応して標識化抗体を形成し得る、反応性官能基を有する。標識試薬の反応性官能基としては、マレイミド、ハロアセチルヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、及びホスホラミダイトが挙げられるが、他の官能基も使用することができる。
リンカー薬物のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体へのコンジュゲーション
重鎖及び軽鎖内の各部位における操作システインのコンジュゲーション効率を示すために、本明細書に記載されるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、２つの異なるリンカー薬物にコンジュゲートさせた。
システイン残基を、代表的な抗体Ｈｕ抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５（「４Ｄ５抗体」）の各位置で操作して、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を生成した。各ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、２つのリンカー薬物（ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びＰＤＳ−ＭＭＡＥ）に別個にコンジュゲートした。コンジュゲーションは、９６ウェルフィルタプレート（ＥＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの容積２ｍｌのポリプロピレン製０．４５ｕｍフィルタ）において行った。プレートは、５００ｘｇで２分間遠心分離したときにのみ緩衝水溶液が流れる。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）４５０μｌを２０％エタノール中の５０％スラリーとして各ウェルに添加した。樹脂を３回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）において平衡化した。
各ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（１．５ｍｇ）を各ウェルに添加し、室温で３０分間、６００ＲＰＭのプレート振盪機上で樹脂に結合させた。３０分後にプレートを遠心分離して過剰な緩衝液を除去した。０．９ｍｌの２ｍＭジチオスレイトール（緩衝液Ａ中）の存在下で一晩室温で撹拌しながらＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を還元させた。還元剤及び任意のシステインまたはグルタチオンブロックを、緩衝液Ａで２回洗浄することによって精製除去した。１ｍｌの１ｍＭデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）（緩衝液Ａ中）でプレートを３回洗浄して、プレートを酸化剤で飽和させた。０．９ｍｌの１ｍＭ ＤＨＡＡ（緩衝液Ａ中）を最後に添加した後、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を室温で３時間プレート振盪機上で再び酸化させた。
酸化剤を遠心分離によって除去した。１０％ＤＭＡ（緩衝液Ａ中）に溶解させた２倍モル過剰（利用できるチオール基に対して）のリンカー薬物（ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＰＤＳ−ＭＭＡＥ）を各ウェルに添加し、室温で２時間プレート振盪機上でＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とともにインキュベートした。プレートを平衡緩衝液で６回洗浄することによって過剰なリンカー薬物を精製除去した。コンジュゲートしたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、室温で３０分間プレート振盪機上で０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．７で溶出させた。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、即座に１５％の０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。ｍＡｂつ当たりのコンジュゲートした薬物の数をＬＣ／ＭＳ分析によって定量化した。コンジュゲートの凝集をサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。
質量分析法による分析
コンジュゲートしたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の正確な分子量の判定に、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）による分析を用いた（Ｃｏｌｅ，Ｒ．Ｂ．Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． （１９９７）Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
ＬＣ／ＭＳ分析を、６２２４ Ｍａｓｓ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ）ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。８０℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓカラム、１０００Å、８μｍ（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で試料をクロマトグラフィーに供した。０．７ｍｌ／分の流速で３分間で３４〜４２％のＢという線形勾配（溶媒Ａ、０．０５％ＴＦＡ（水中）、溶媒Ｂ、０．０４％ＴＦＡ（アセトニトリル中））を使用し、溶離液をエレクトロスプレー源を用いて直接イオン化させた。データを収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ定性分析ソフトウェアを用いてデコンボリューションした。ＬＣ／ＭＳクロマトグラムに存在するデコンボリューションした多数のピークを用いて、薬物と抗体との比（ＤＡＲ）を計算した。
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の凝集分析
サイズ排除クロマトグラフィーを、１１００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０２．５カラムにおいて試料にクロマトグラフィーを行った。０．７５ｍｌ／分で１５分間、０．２Ｍリン酸カリウム、０．２５塩化カリウム、ｐＨ６．２の移動相を用いたイソクラティック法を使用して、コンジュゲートを溶離させた。ＵＶ２８０ｎｍのクロマトグラムから凝集及びモノマーピークの積分面積から、凝集パーセントを計算した。
トラスツズマブのチオＩｇＧ変異形の操作
全長モノクローナル抗体トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）の重鎖及び軽鎖の各残基 全てにシステインを導入した（配列番号１（４Ｄ５重鎖）及び配列番号２（４Ｄ５軽鎖）の各天然の非システイン残基をシステインに変異させた）。代表的な４Ｄ５抗体の重鎖は、１２個のシステイン残基及び４３８個の非システイン残基の４５０個のアミノ酸を有する。代表的な４Ｄ５抗体の軽鎖は、６個のシステイン残基及び２０８個の非システイン残基の２１４個のアミノ酸を有する。具体的には、単一の残基を、その天然のアミノ酸からシステインに変異させ、それによって２つのシステイン残基が操作された全長抗体を得た。各システイン変異を、ＰＤＳ−ＭＭＡＥ及びＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥにコンジュゲートさせた。これにより、合計６４８個のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体：６４８個のＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体及び６４８個のＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が得られた。これらのシステイン操作抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）を、培地中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させた。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号18
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号19
好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表２のＫａｂａｔ番号付けによる重鎖変異のうちの１つ以上を含む。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、４Ｄ５配列による表２に列挙されるものと同等の位置に操作システインを含む。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体に含まれる表２に特定される操作システインまたは位置が同等の操作システインは、遊離システインである。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けによる位置ＨＣ−Ａ１３６Ｃ（すなわち、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃ）に操作システインを含む（実施例１１を参照されたい）。
好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、図２１のＥＵ番号付けによる重鎖変異のうちの１つ以上を含む。具体的には、システイン操作抗体における重鎖システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｔ１１０Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ−Ｓ２４２Ｃ、ＨＣ−Ｎ４３４Ｃ、及びＱ４３８Ｃからなる部位の群から選択される。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ−Ｓ４２４Ｃ、及びＨＣ−Ｑ４３８Ｃからなる群から選択される操作システインにおいてＰＤＳリンカーによって薬物部分にコンジュゲートされたシステイン操作抗体を含む。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＨＣ−Ｔ１１０Ｃ、ＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、及びＨＣ−Ｎ４３４Ｃからなる群から選択される操作システインにおいてｖｃ−（すなわち、マレイミド）リンカーによって薬物部分にコンジュゲートされたシステイン操作抗体を含む。
ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表３のＫａｂａｔ番号付けによる重鎖変異のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、４Ｄ５配列による表３に列挙されるものと同等の位置に操作システインを含む。例えば、抗体が、その重鎖にＫａｂａｔ番号付けによる５位に天然のアラニン（Ａ）を含む場合（４Ｄ５における天然のバリン（Ｖ）と比較して）、このアラニンをシステインに変異させて、ＨＣ−Ａ５Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を得ることができる。ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体中の表３に特定される操作システインまたは位置が同等な操作システインは、遊離システインである。
表３．Ｋａｂａｔ番号付けによる重鎖システイン変異。
Figure 2021073176
Figure 2021073176
ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表３に列挙される配列を含む。ある特定の実施形態では、表３に列挙される変異及び／または配列を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＰＤＳリンカーを含む。ある特定の実施形態では、表３に列挙される変異及び／または配列を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、マレイミド（例えば、−ｖｃ）リンカーを含む。具体的な実施形態では、以下の群から選択される重鎖の部位（Ｋａｂａｔ番号付けによる）をシステインに変異させて、システイン操作抗体を形成し、ＰＤＳリンカーを用いて薬物に結合させる：Ｖ２Ｃ、Ｔ２９Ｃ、Ｙ３０Ｃ、Ａ３７Ｃ、Ｅ４３Ｃ、Ｙ７７Ｃ、Ｗ９６Ｃ、Ｇ９７Ｃ、Ｄ１０５Ｃ、Ｔ１３９Ｃ、Ｎ１５９Ｃ、Ａ１６２Ｃ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１７８Ｃ、Ｌ１７９Ｃ、Ｖ１８８Ｃ、Ｉ１９９Ｃ、Ｎ２０３Ｃ、Ｓ２０７Ｃ、Ｅ３８８Ｃ、Ｋ４１４Ｃ、Ｑ４１８Ｃ、Ｓ２４２Ｃ、Ｙ４３６Ｃ、Ｔ４３７Ｃ、Ｑ４３８Ｃ、Ｌ４４３Ｃ、及びＭ１０４Ｃ。具体的な実施形態では、以下の群から選択される重鎖の部位（Ｋａｂａｔ番号付けによる）をシステインに変異させて、システイン操作抗体を形成し、−ｖｃ（すなわち、マレイミド）リンカーを用いて薬物に結合させる：Ｖ２Ｃ、Ｌ１Ｃ、Ｖ２Ｃ、Ｌ８Ｃ、Ｒ１６Ｃ、Ｆ２４Ｃ、Ｉ２６Ｃ、Ｙ３０Ｃ、Ｑ３６Ｃ、Ａ３７Ｃ、Ｋ４０Ｃ、Ｌ４２Ｃ、Ｅ４３Ｃ、Ｔ５１Ｃ、Ｇ５３Ｃ、Ｔ５５Ｃ、Ｒ５６Ｃ、Ｙ５７Ｃ、Ａ５８Ｃ、Ｔ６６Ｃ、Ｎ７４Ｃ、Ｑ７９Ｃ、Ｗ１０７Ｃ、Ｔ１２０Ｃ、Ｋ１２１Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１７８Ｃ、Ｔ１８７Ｃ、Ｉ１９９Ｃ、Ｔ２０９Ｃ、Ｆ２４３Ｃ、Ｍ２５２Ｃ、Ｅ２５８Ｃ、Ｖ２６２Ｃ、Ｎ２７６Ｃ、Ｖ２８２Ｃ、Ｌ３０９Ｃ、Ｔ３３５Ｃ、Ｓ３３７Ｃ、Ｒ３４４Ｃ、Ｑ３４７Ｃ、Ｋ３６０Ｃ、Ｇ３７１Ｃ、Ｅ３８２Ｃ、Ｐ３８７Ｃ、Ｅ３８８Ｃ、Ｓ４０３Ｃ、Ｋ４１４Ｃ、Ｑ４１８Ｃ、Ｇ４２０Ｃ、Ｎ４２１Ｃ、Ｓ４２４Ｃ、Ｎ４３４Ｃ、Ｙ４３６Ｃ、Ｔ４３７Ｃ、Ｑ４３８Ｃ、Ｋ４３９Ｃ、Ｓ４４２Ｃ、Ｌ４４３Ｃ、Ｍ１０４Ｃ、及びＮ８１Ｃ。
具体的な実施形態では、表２に列挙される変異から選択される重鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、本明細書に記載されるＡｆｆｉｎｉｔｙ−Ｃａｐｔｕｒｅ ＬＣ−ＭＳ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（実施例１２及び１３を参照されたい）を用いて、１．０〜２．０の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表２に列挙される変異から選択される重鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、１．１〜１．３の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表２に列挙される変異から選択される重鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、１．３〜１．５の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表１の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、１．５〜１．８の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表２に列挙される変異から選択される重鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、１．８〜２．０の平均ＤＡＲを有する。
好ましい実施形態では、システイン操作抗体は、表２のＫａｂａｔ番号付けによる重鎖変異のうちの１つ以上を含む。好ましい実施形態では、システイン操作抗体は、４Ｄ５配列による表２に列挙されるものと同等の位置に操作システインを含む。例えば、抗体が、その重鎖にＫａｂａｔ番号付けによる１９位に天然のリジン（Ｋ）を含む場合（４Ｄ５における天然のアルギニン（Ｒ）と比較して）、このリジンをシステインに変異させて、Ｋ１９Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を得ることができる。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体に含まれる表２に特定される操作システインまたは位置が同等の操作システインは、遊離システインである。
表４．Ｋａｂａｔ番号付けによる軽鎖システイン変異。
Figure 2021073176
Figure 2021073176
好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表１のＫａｂａｔ番号付けによる軽鎖変異のうちの１つ以上を含む。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、４Ｄ５配列による表１に列挙されるものと同等の位置に操作システインを含む。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体に含まれる表１に特定される操作システインまたは位置が同等の操作システインは、遊離システインである。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けによる位置ＬＣ−Ｋ１４９Ｃに操作システインを含む（実施例２及び７を参照されたい）。好ましい実施形態では、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ抗体は、ＰＤＳリンカーを介して薬物部分にコンジュゲートされる。好ましい実施形態では、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ抗体は、−ｖｃ（すなわち、マレイミド）リンカーを介して薬物部分にコンジュゲートされる。
ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、図２１のＫａｂａｔ番号付けによる軽鎖変異のうちの１つ以上を含む。具体的には、システイン操作抗体における軽鎖システイン変異は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｔ２２Ｃ、ＬＣ−Ｋ３９Ｃ、ＬＣ−Ｙ４９Ｃ、ＬＣ−Ｙ５５Ｃ、ＬＣ−Ｔ８５Ｃ、ＬＣ−Ｔ９７Ｃ、ＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ、及びＬＣ−Ｖ２０５Ｃから選択される。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、及びＬＣ−Ｖ２０５Ｃからなる群から選択される操作システインにおいてＰＤＳリンカーによって薬物部分にコンジュゲートされたシステイン操作抗体を含む。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＬＣ−Ｔ２２Ｃ、ＬＣ−Ｋ３９Ｃ、ＬＣ−Ｙ４９Ｃ、ＬＣ−Ｙ５５Ｃ、ＬＣ−Ｔ８５Ｃ、ＬＣ−Ｔ９７Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃからなる群から選択される操作システインにおいてｖｃ−（すなわち、マレイミド）リンカーによって薬物部分にコンジュゲートされたシステイン操作抗体を含む。
具体的な実施形態では、表１に列挙される変異から選択される軽鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、本明細書に記載されるＡｆｆｉｎｉｔｙ−Ｃａｐｔｕｒｅ ＬＣ−ＭＳ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（実施例１２及び１３を参照されたい）を用いて、１．０〜２．０の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表１に列挙される変異から選択される軽鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、１．１〜１．３の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表１に列挙される変異から選択される軽鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、１．３〜１．５の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表１の一覧から選択されるシステイン変異を有するシステイン操作抗体は、１．５〜１．８の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表１に列挙される変異から選択される重鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、１．８〜２．０の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表１に列挙される変異から選択される重鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、０．８〜１．４の平均ＤＡＲを有する。
好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表１に列挙される配列を含む。好ましい実施形態では、表１に列挙される変異及び／または配列を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＰＤＳリンカーを含む。好ましい実施形態では、表１に列挙される変異及び／または配列を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、−ｖｃリンカーを含む。
ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表４に列挙される配列を含む。ある特定の実施形態では、表４に列挙される変異及び／または配列を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＰＤＳリンカーを含む。ある特定の実施形態では、表４に列挙される変異及び／または配列を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、−ｖｃリンカーを含む。
ある特定の実施形態では、表４に列挙される変異から選択される軽鎖システイン変異を含むシステイン操作抗体は、本明細書に記載されるＡｆｆｉｎｉｔｙ−Ｃａｐｔｕｒｅ ＬＣ−ＭＳ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（実施例１２及び１３を参照されたい）を用いて、１．０〜２．０の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表４の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、１．３〜１．９の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表４の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、１．３〜１．８の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表４の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、１．５〜１．９の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表４の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、０．８〜１．０の平均ＤＡＲを有する。
好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、図２１のＥＵ番号付けによる軽鎖変異のうちの１つ以上を含む。具体的には、システイン操作抗体における軽鎖システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＬＣ−Ｔ２２Ｃ、ＬＣ−Ｋ３９Ｃ、ＬＣ−Ｙ４９Ｃ、ＬＣ−Ｙ５５Ｃ、ＬＣ−Ｔ８５Ｃ、ＬＣ−Ｔ９７Ｃ、ＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ、及びＬＣ−Ｖ２０５Ｃからなる部位の群から選択される。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＥＵ番号付けによるＬＣ−Ｔ２２Ｃ、ＬＣ−Ｋ３９Ｃ、ＬＣ−Ｙ４９Ｃ、ＬＣ−Ｙ５５Ｃ、ＬＣ−Ｔ８５Ｃ、ＬＣ−Ｔ９７Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃからなる群から選択される操作システインにおいてＰＤＳリンカーによって薬物部分にコンジュゲートされたシステイン操作抗体を含む。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、及びＬＣ−Ｖ２０５Ｃからなる群から選択される操作システインにおいてｖｃ−（すなわち、マレイミド）リンカーによって薬物部分にコンジュゲートされたシステイン操作抗体を含む。
ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表５に列挙される配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、４Ｄ５配列による表５に列挙されるものと同等の位置に操作システインを含む。例えば、抗体が、その重鎖にＫａｂａｔ番号付けによる４０位に天然のセリン（Ｓ）を含む場合（４Ｄ５における天然のアラニン（Ａ）と比較して）、このセリンをシステインに変異させて、Ｓ４０Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を得ることができる。ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体に含まれる表５に特定される操作システインまたは位置が同等の操作システインは、遊離システインである。
表５．Ｋａｂａｔ番号付けによる重鎖及び軽鎖システイン変異。
Figure 2021073176
ある特定の実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表５に列挙される配列を含む。ある特定の実施形態では、表５に列挙される変異及び／または配列を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、−ｖｃまたはＰＤＳリンカーを含む。
具体的な実施形態では、表５の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、１．０〜２．０の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表５の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、１．３〜１．９の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表５の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、１．３〜１．８の平均ＤＡＲを有する。具体的な実施形態では、表５の一覧から選択されるシステイン変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、１．５〜１．９の平均ＤＡＲを有する。
別の実施形態によると、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表１〜５のいずれか１つに特定される操作システインを含む。好ましい実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表１及び２のいずれか１つに特定される操作システインを含む。別の実施形態によると、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、任意の標的抗原のために設計され得る。
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の設計及び操作
抗ＨＥＲ２ ｈｕ４Ｄ５抗体の重鎖及び軽鎖のそれぞれの位置に単一のシステイン置換を導入した（すなわち、ＰＤＳリンカーを有する合計６４８個の抗体と−ｖｃリンカーを有する合計６４８個の抗体を作製した）（実施例１）。抗ＣＤ３３抗体、抗ＳＴＥＡＰ１抗体、抗ＭＵＣ１６抗体、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体、抗Ｌｙ６Ｅ抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ７９ｂ抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、及び追加の抗ＨＥＲ２抗体の選択位置にも、単一のシステイン置換を導入した。重鎖変異体及び軽鎖変異体は全て、本明細書に記載される方法に従って調製した。Kabat numbering system.重鎖及び軽鎖の配列は、Ｋａｂａｔ付番系に従って番号付けを行った。それぞれのＫａｂａｔ位置の連続番号付け及びＥＵ番号付けによる位置同等物を、図１Ａ及び１Ｂに示す。軽鎖では、Ｋａｂａｔ、連続、及びＥＵ番号付けは、同じ番号を示す。
重鎖及び軽鎖４Ｄ５ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、ＰＤＳまたはｖｃリンカーを介して薬物にコンジュゲートした（すなわち、ＰＤＳリンカーを有する合計６４８個の抗体と−ｖｃリンカーを有する合計６４８個の抗体を作製した）。各ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、平均薬物−抗体比（ＤＡＲ）、濃度（ｍｇ／ｍＬ）、凝集（合計％）、及び安定性に関してスクリーニングした（実施例２）。それに応じて、各ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＰＤＳ及びｖｃコンジュゲートのＤＡＲ、濃度、凝集、及び安定性の測定値を有した。ＰＤＳコンジュゲート及び測定値は本明細書に提供される表に示されており、ｖｃコンジュゲート及び測定値は本明細書に提供される表に示されている。
表６．ＰＤＳ−リンカーとコンジュゲートした表３及び４のシステイン操作抗体の平均ＤＡＲ、濃度、凝集、及び安定性（ＥＬＩＳＡラット血漿安定性）
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
表７．ＰＤＳ−リンカーとコンジュゲートした表３及び４のシステイン操作抗体の平均ＤＡＲ、濃度、凝集、及び安定性（質量分析ラット血漿安定性）
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
表８．−ｖｃリンカーとコンジュゲートした表３及び４のシステイン操作抗体の平均ＤＡＲ、濃度、凝集、及び安定性（ＥＬＩＳＡラット血漿安定性）
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
表９．−ｖｃリンカーとコンジュゲートした表３及び４のシステイン操作抗体の平均ＤＡＲ／安定性（質量分析ラット血漿安定性）
Figure 2021073176
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表６及び７で特定されるＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、原料物質（すなわち、ＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）の開始濃度１ｍｇ／ｍＬ以上で分析した。表６及び７で特定されるＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＤＡＲ計算値は、全てＤＡＲ１以上であった。表６及び７で特定されるＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は全て、５０％以下の凝集、再酸化を有した。表６で特定されるＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＥＬＩＳＡの繰り返しに対して、経時的に、ラットマトリクスにおいて少なくとも７７％以上の安定性を呈した。表６で分析した同じ試料を表７で行った実験に用いた。表７は、表６のＥＬＩＳＡ安定性の結果のＬＣＳＭによる確認を示す。
表８及び９に特定されるＭＣ−ＶＣ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、原料物質（すなわち、ＭＣ−ＶＣ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）の開始濃度１ｍｇ／ｍＬ以上で分析した。表８及び９に特定されるＭＣ−ＶＣ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＤＡＲ計算値は、全てＤＡＲ１以上であった。表８及び９で特定されるＭＣ−ＶＣ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は全て、５０％以下の凝集、再酸化を有した。表８に特定されるＭＣ−ＶＣ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＥＬＩＳＡの繰り返しについて、経時的に、ラットマトリクスにおいて少なくとも７７％以上の安定性を呈した。表９は、表８のＥＬＩＳＡ安定性の結果のＬＣＳＭによる確認を示す。
表１０．表１及び２の好ましいシステイン操作抗体の平均ＤＡＲ、濃度、及び凝集（表１１及び１２に示されるものと同じ試料）
Figure 2021073176
Figure 2021073176
表１１．表１及び２の好ましいシステイン操作抗体のＥＬＩＳＡ及びＭＳ安定性の結果（表１０及び１２に示されるものと同じ試料）
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
表12.表1及び2の好ましいシステイン操作抗体のシステイン還元アッセイの結果(表10及び11に示されるものと同じ試料)
Figure 2021073176
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表８〜１０に特定されるＰＤＳ−ＭＭＡＥ及び−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＤＡＲ計算値は、すべてＤＡＲ０を上回った。表８に特定されるＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、２回のＥＬＩＳＡの繰り返しのうちの少なくとも１つに関して、ラットマトリクスにおいて少なくとも８０％以上の安定性を呈した。
興味深いことに、ＤＡＲ、濃度、凝集、及び安定性は、ｖｃ−コンジュゲートしたシステイン操作抗体（すなわち、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）とＰＤＳ−コンジュゲートしたものとで、同じではなかった。例えば、表６及び７の好ましいシステイン操作抗体（ＰＤＳリンカー）と、表８及び９のもの（ｖｃリンカー）とは同一ではなかった。例えば、ＰＤＳリンカーによる薬物部分へのコンジュゲーションに好ましい上位安定性部位は、ＬＣ−Ｔ２２Ｃ、ＬＣ−Ｋ３９Ｃ、ＬＣ−Ｙ４９Ｃ、ＬＣ−Ｙ５５Ｃ、ＬＣ−Ｔ８５Ｃ、ＬＣ−Ｔ９７Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｙ３７３Ｃ、及びＨＣ−Ｓ４２４Ｃであり、一方で−ｖｃリンカーによる薬物部分へのコンジュゲーションに好ましい上位安定性部位は、ＬＣ−Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、ＨＣ−Ｔ１１０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ−Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ−Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ−Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ−Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ−Ｎ４３４Ｃ（図２１を参照されたい）である。よって、このスクリーニングでは、ＰＤＳ及び−ｖｃの上位部位はＨＣ−Ｇ３７１Ｃのみであった。したがって、ＰＤＳまたは−ｖｃリンカーのいずれかを用いて薬物部分をシステイン操作抗体にコンジュゲートする際に、どの部位が安定性に関して最適に作用するかの決定は、予測することができず、詳細な実験を要した。
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のちオール反応性
全長ＩｇＧシステイン操作抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）のチオール反応性は、米国特許第７，５２１，５４１号（参照によりその全体が組み込まれる）に記載されるように、ビオチニル化及びストレプトアビジン結合によって測定することができる。具体的には、ビオチン−マレイミドと特異的にコンジュゲートしたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体をスクリーニングするように、ウエスタンブロットアッセイを構築することができる。このアッセイにおいて、抗体は還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することができ、ビオチンの存在は、ストレプトアビジン−ＨＲＰとともにインキュベートすることによって、特異的にプローブされる。ストレプトアビジン−ＨＲＰの相互作用は、操作ｃｙｓ変異形がどこに用いられているかに応じて重鎖または軽鎖のいずれかに観察され得、この結合を、操作システインを有さない野生型ＩｇＧのビオチン−ストレプトアビジンの相互作用と比較し、それによって、どのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が野生型抗体の任意のバックグラウンド結合と比較して特異的にビオチンにコンジュゲートするかを示すことができる。
抗体−薬物コンジュゲート
本発明のシステイン操作抗体は、任意の治療剤、すなわち、薬物部分とコンジュゲートすることができ、これは、反応性システインチオール基を介して抗体に共有結合され得る。例示目的で、本明細書に提供される表に開示されるシステイン操作抗体を、マイタンシノイド薬物、具体的にはＭＭＡＥにコンジュゲートさせた。
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物の例示的な実施形態は、システイン操作抗体（Ａｂ）及び薬物部分（Ｄ）を含み、ここで、この抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を有し、抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を通じてリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され、この組成物は、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ Ｉ
を有し、式中、ｐは、１、２、３、または４である。チオール反応性リンカー部分を介して抗体分子にコンジュゲートされ得る薬物部分の数は、本明細書に記載される方法によって導入されるシステイン残基の数によって制限される。したがって、式Ｉの例示的なＡＤＣは、１、２、３、または４つの操作システインアミノ酸を有する抗体を含む。
抗体−薬物コンジュゲート化合物（ＡＤＣ）の別の例示的な実施形態は、システイン操作抗体（Ａｂ）、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）、及び薬物部分（Ｄ）を含み、ここで、この抗体は、リンカー部分（Ｌ）によって薬物部分に結合され、また抗体は、アミド結合または第２のリンカー部分によってアルブミン結合ペプチドに結合され、この組成物は、式Ｉａ：
ＡＢＰ−Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ Ｉａ
を有し、式中、ｐは、１、２、３、または４である。
本発明のＡＤＣ化合物には、抗癌活性に関する有用性を有するものが含まれる。具体的には、本化合物は、リンカーによって薬物部分、すなわち毒素にコンジュゲート、すなわち共有結合した、システイン操作抗体を含む。薬物部分が抗体にコンジュゲートされていないとき、その薬物は、細胞毒性作用または細胞増殖抑制作用を有する。薬物部分の生物学的活性は、したがって、抗体へのコンジュゲーションによって調節される。本発明の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、有効容量の細胞毒性剤を腫瘍組織に選択的に送達し、それによってより高い選択性、すなわちより低い有効用量を達成することができる。
薬物部分
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）には、細胞毒性作用または細胞増殖抑制作用を有する任意の化合物、部分、または基が含まれる。薬物部分としては、（ｉ）化学療法剤（マイクロチューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡインターカレーターとして機能し得る）、（ｉｉ）タンパク質毒素（酵素的に機能し得る）、及び（ｉｉｉ）放射性同位体が挙げられる。
例示的な薬物部分としては、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン、及び他のエンジイン抗生物質、タキサン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体、アントラサイクリン、ならびにそれらの立体異性体、同配体、類似体、または誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
マイタンシノイド薬物部分として用いるのに好適なマイタンシノイド化合物は、当該技術分野で周知であり、既知の方法によって天然源から単離するか、遺伝子組み換え技法を用いて産生してもよく（Ｙｕ ｅｔ ａｌ（２００２）ＰＲＯＣ． ＮＡＴ． ＡＣＡＤ． ＳＣＩ． （ＵＳＡ）９９：７９６８−７９７３）、またはマイタンシノール及びマイタンシノール類似体を既知の方法に従って合成により調製してもよい。
例示的なマイタンシノイド薬物部分には、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４２５６７４６号）（アンサマイトシン（ａｎｓａｍｙｔｏｃｉｎ）Ｐ２の水素化アルミニウムリチウムの還元により調製される）、Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第 ４３６１６５０号及び同第４３０７０１６号）（ストレプトマイセス若しくはアクチノマイセスを用いた脱メチル化またはＬＡＨを用いた脱塩素反応により調製される）、ならびにＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アチルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第 ４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化により調製される）などの修飾された芳香環を有するもの、ならびに他の位置に修飾を有するものが挙げられるがこれらに限定されない。
また、例示的なマイタンシノイド薬物部分としては、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４４２４２１９号）（マイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応により調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号）（ノルカジアから調製される）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４３６４８６６号）（ストレプトマイセスによるマイタンシノールの変換により調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第 ４３１３９４６号及び同第４３１５９２９号）（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａから単離される）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第 ４３６２６６３号及び同第４３２２３４８号）（ストレプトマイセスによるマイタンシノールの脱メチル化により調製される）；ならびに４，５−デオキシ（米国特許第４３７１５３３号）（マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）などの修飾を有するものが挙げられる。マイタンシン化合物上の多数の位置が、結合の種類に応じて、結合位置として有用であることが知られている。例えば、エステル結合の形成には、、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾したＣ−１４、ヒドロキシル基で修飾したＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位が、全て好適である。
式Ｉの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）には、構造：
Figure 2021073176
を有するマイタンシノイドが含まれ、式中、波線は、Ｄの硫黄原子と抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のリンカー（Ｌ）との共有結合を示す。Ｒは、独立して、Ｈ、またはメチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、及び３，３−ジメチル−２−ブチルから選択されるＣ１−Ｃ６アルキルであり得る。アミド基を硫黄原子に結合するアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、またはプロピルであり得る、すなわち、ｍは１、２、または３である。
マイタンシン化合物は、微小管タンパク質であるチューブリンの重合の阻害を通じて有糸分裂中の微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９７５）Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２−１００５）。マイタンシン及びマイタンシノイドは、細胞毒性が高いが、癌療法におけるそれらの臨床的使用は、主に腫瘍に対する選択性が低いことに起因する重度の全身副作用のため、大幅に制限されてきた。マイタンシンの臨床試験は、中枢神経系及び胃腸系への重篤な副作用のため、中止されている（Ｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｃａｎ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｒｅｖ．５：１９９−２０７）。
マイタンシノイド薬物部分は、抗体−薬物コンジュゲートにおける有望な薬物部分であるが、これは、それらが：（ｉ）発酵または発酵産物の化学修飾、誘導体化による調製が比較的容易であり、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを通じた抗体へのコンジュゲーションに好適な官能基を用いた誘導体化に適しており、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、（ｉｖ）多様な腫瘍細胞株に対して有効であるためである（米国公開第２００５／０１６９９３３号、国際公開第ＷＯ２００５／０３７９９２号、米国特許第５２０８０２０号）。
他の薬物部分と同様に、マイタンシノイド薬物のあらゆる立体異性体、すなわち、Ｄのキラル炭素におけるＲ配置とＳ配置の任意の組み合わせが、本発明の化合物に企図される。一実施形態において、マイタンシノイド薬物部分（Ｄ）は、以下の立体化学を有するであろう。
Figure 2021073176
マイタンシノイド薬物部分の例示的な実施形態としては、次のものが挙げられれ：ＤＭ１、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２；ＤＭ３、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）；及びＤＭ４、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２、それらは、以下の構造を有する。
Figure 2021073176
結合の種類に応じて、リンカーが様々な位置でマイタンシノイド分子に結合され得る。例えば、従来のカップリング技法を使用したヒドロキシル基との反応によって、エステル結合を形成してもよい。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾したＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾したＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じ得る。好ましい実施形態では、結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノール類似体のＣ−３位に形成される。
式Ｉの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）にはまた、ドラスタチンならびにそれらのペプチド類似体及び誘導体であるオーリスタチンが含まれる（米国特許第５６３５４８３号、同第５７８０５８８号）。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核及び細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。様々な形態のドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分が、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に共有結合し得る（国際公開第ＷＯ０２／０８８１７２号、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（７）：７７８−７８４、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２（４）：１４５８−１４６５）。
薬物部分には、ドラスタチン、オーリスタチン（米国特許第５６３５４８３号、同第５７８０５８８号、同第５７６７２３７号、同第６１２４４３１号）、ならびにそれらの類似体及び誘導体が含まれる。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核及び細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を通じて抗体に結合することができる（国際公開第ＷＯ０２／０８８１７２号）。
例示的なオーリスタチンの実施形態としては、米国特許第７４９８２９８号及び同第７６５９２４１号に開示されているＮ末端結合型モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦが挙げられ、これらの特許のそれぞれの開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
式Ｉの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）には、Ｎ末端を通じて抗体に結合するモノメチルオーリスタチン薬物部分ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦが含まれ、これらは、以下の構造を有する。
Figure 2021073176
例示的なＭＭＡＥ ＡＤＣを、図１１及び１２に示す。
典型的に、ペプチドベースの薬物部分は、２つ以上のアミノ酸及び／またはペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知の液相合成法（例えば、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌuｂｋｅ，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に従って調製することができる。
薬物部分には、カリケアマイシンならびにその類似体及び誘導体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモルを下回る濃度で二本鎖ＤＮＡの切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同第５７１４５８６号、同第５７３９１１６号、同第５７６７２８５号、同第５７７０７０１号、同第５７７０７１０号、同第５７７３００１号、同第５８７７２９６号を参照されたい。使用することができるカリケアマイシンの構造類似体としては、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθＩ １（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８）が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＢ二量体は、特定のＤＮＡ配列を認識し、それに結合する。ＰＢＤである天然産物アントラマイシンは、１９６５年に初めて報告された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，８７：５７９３−５７９５、Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，８７：５７９１−５７９３）。それ以来、天然及び類似体の両方として、三環式ＰＢＤ足場の二量体（米国特許第６８８４７９９号、同第７０４９３１１号、同第７０６７５１１号、同第７２６５１０５号、同第７５１１０３２号、同第７５２８１２６号、同第７５５７０９９号）を含む、多数のＰＢＤが報告されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９４，４３３−４６５。いずれの特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、二量体の構造により、Ｂ型ＤＮＡの副溝との等螺旋性（ｉｓｏｈｅｌｉｃｉｔｙ）に適した三次元形状が得られ、結合部位でぴったり合うようになると考えられている（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＩＩＩ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３−１１（１９７５）、Ｈｕｒｌｅｙ ａｎｄ Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，（１９８６）Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．，１９：２３０−２３７）。Ｃ２アリール置換基を有する二量体ＰＢＤ化合物は、細胞毒性剤として有用であることが示されている（Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０（１７）：６８４９−６８５８、Ａｎｔｏｎｏｗ（２０１０）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ５３（７）：２９２７−２９４１、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １９（２２）：６４６３−６４６６）。
いくつかの実施形態では、ＰＢＤ化合物は、インビボで除去可能な窒素保護基によりそれらをＮ１０位で保護することによって、プロドラッグとして用いることができる（国際公開第ＷＯ００／１２５０７号、同第ＷＯ２００５／０２３８１４号）。
いくつかの実施形態では、本免疫コンジュゲートは、１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートした抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリー及びその類似体は、ピコモルを下回る濃度で二本鎖ＤＮＡの切断をもたらすことができる（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２、Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８）。カリケアマイシンは、細胞内作用部位を有するが、ある特定の事例では、細胞膜の通過は容易ではない。したがって、抗体を媒介とする内部移行を通じたこれらの薬剤の細胞内取り込みにより、いくつかの実施形態では、それらの細胞毒性作用をおおきく向上させることができる。カリケアマイシン薬物部分を用いた抗体−薬物コンジュゲートの非限定的な例示的調製方法は、例えば、米国特許第５７１２３７４号、同第５７１４５８６号、同第５７３９１１６号、及び同第５７６７２８５号に記載されている。
いくつかの実施形態では、抗体にコンジュゲートされるカリケアマイシン薬物部分は、式：
Figure 2021073176
を有し、式中、ＸはＢｒまたはＩであり、
Ｌはリンカーであり、Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１−６アルキルであり、Ｒａは、水素またはＣ１−６アルキルである。
いくつかの実施形態では、ＸはＢｒであり、Ｒａは水素であり、Ｒはイソプロピルである。
他の実施形態では、ＸはＢｒであり、Ｒａは水素であり、Ｒはエチルである。
他の実施形態では、ＸはＩであり、Ｒａは水素であり、Ｒはイソプロピルである。
他の実施形態では、ＸはＩであり、Ｒａは水素であり、Ｒはエチルである。
いくつかの実施形態では、ＸはＢｒであり、Ｒａは水素であり、Ｒは−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３である。
他の実施形態では、ＸはＩであり、Ｒａは水素であり、Ｒは−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３である。
他の実施形態では、ＸはＩであり、Ｒａはエチルであり、Ｒは−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３である。
他の実施形態では、ＸはＢｒであり、Ｒａはエチルであり、Ｒは−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３である。
ＰＢＤ二量体は、抗体にコンジュゲートされており、結果として得られるＡＤＣは、抗癌特性を有することが示されている（米国公開第２０１０／０２０３００７号）。ＰＢＤ二量体の非限定的な例示的結合部位としては、５員ピロロ環、ＰＢＤ単位間のテザー、及びＮ１０−Ｃ１１イミン基が挙げられる（国際公開第ＷＯ２００９／０１６５１６号、米国公開第２００９／３０４７１０号、同第２０１０／０４７２５７号、同第２００９／０３６４３１号、同第２０１１／０２５６１５７号、国際公開第ＷＯ２０１１／１３０５９８号）。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＢ二量体は、特定のＤＮＡ配列を認識し、それに結合する。ＰＢＤである天然産物アントラマイシンは、１９６５年に初めて報告された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，８７：５７９３−５７９５、Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，８７：５７９１−５７９３）。それ以来、天然及び類似体の両方として、三環式ＰＢＤ足場の二量体（米国特許第６８８４７９９号、同第７０４９３１１号、同第７０６７５１１号、同第７２６５１０５号、同第７５１１０３２号、同第７５２８１２６号、同第７５５７０９９号）を含む、多数のＰＢＤが報告されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９４，４３３−４６５。いずれの特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、二量体の構造により、Ｂ型ＤＮＡの副溝との等螺旋性（ｉｓｏｈｅｌｉｃｉｔｙ）に適した三次元形状が得られ、結合部位でぴったり合うようになると考えられている（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＩＩＩ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３−１１（１９７５）、Ｈｕｒｌｅｙ ａｎｄ Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，（１９８６）Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．，１９：２３０−２３７）。Ｃ２アリール置換基を有する二量体ＰＢＤ化合物は、細胞毒性剤として有用であることが示されている（Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０（１７）：６８４９−６８５８、Ａｎｔｏｎｏｗ（２０１０）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ５３（７）：２９２７−２９４１、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １９（２２）：６４６３−６４６６）。
いくつかの実施形態では、ＰＢＤ化合物は、インビボで除去可能な窒素保護基によりそれらをＮ１０位で保護することによって、プロドラッグとして用いることができる（国際公開第ＷＯ００／１２５０７号、同第ＷＯ２００５／０２３８１４号）。
ＰＢＤ二量体は、抗体にコンジュゲートされており、結果として得られるＡＤＣは、抗癌特性を有することが示されている（米国公開第２０１０／０２０３００７号）。ＰＢＤ二量体の非限定的な例示的結合部位としては、５員ピロロ環、ＰＢＤ単位間のテザー、及びＮ１０−Ｃ１１イミン基が挙げられる（国際公開第ＷＯ２００９／０１６５１６号、米国公開第２００９／３０４７１０号、同第２０１０／０４７２５７号、同第２００９／０３６４３１号、同第２０１１／０２５６１５７号、国際公開第ＷＯ２０１１／１３０５９８号）。
ＡＤＣの非限定的な例示的ＰＢＤ二量体構成要素は、式Ａ：
Figure 2021073176
のもの、ならびにその塩及び溶媒和物であり、式中、
波線は、リンカーへの共有結合部分を示し、
点線は、Ｃ１とＣ２またはＣ２とＣ３の間の二重結合の任意の存在を示し、
Ｒ２は、独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、及びＣＯＲから選択され、場合によっては、更にハロまたはジハロから選択され、式中、ＲＤは、独立して、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、及びハロから選択され、
Ｒ６及びＲ９は、独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、及びハロから選択され、
Ｒ７は、独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、及びハロから選択され、
Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、及びＮＨから選択され、
Ｒ１１は、Ｈ若しくはＲであるか、またはＱがＯである場合、ＳＯ３Ｍであるかのいずれかであり、式中、Ｍは金属カチオンであり、
Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−８アルキル、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクリル、Ｃ３−２０複素環、及びＣ５−２０アリール基から選択され、場合によってはＮＲＲ’基との関連で、Ｒ及びＲ’は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、任意に置換された４員、５員、６員、または７員の複素環式環を形成し、
Ｒ１２、Ｒ１６、Ｒ１９、及びＲ１７は、それぞれ、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ７に関して定義される通りであり、
Ｒ″は、Ｃ３−１２アルキレン基であり、その鎖は、１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、及び／または芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって分断されてもよく、これらの環は、任意に置換されており、
Ｘ及びＸ’は、独立して、Ｏ、Ｓ、及びＮ（Ｈ）から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−１２アルキル、Ｃ３−２０複素環、及びＣ５−２０アリール基から選択され、場合によっては、ＮＲＲ’基と関連して、Ｒ及びＲ’は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、任意に置換された４員、５員、６員、または７員の複素環式環を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｒ９及びＲ１９は、Ｈである。
いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ１６は、Ｈである。
いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ１７は、いずれもＯＲ７Ａであり、式中、Ｒ７Ａは、任意に置換されたＣ１−４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ７Ａは、Ｍｅである。いくつかの実施形態では、Ｒ７Ａは、Ｃｈ２Ｐｈであり、式中、Ｐｈは、フェニル基である。
いくつかの実施形態では、ＸはＯである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１１はＨである。
いくつかの実施形態では、各単量体単位においてＣ２とＣ３との間に二重結合が存在する。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、独立して、Ｈ及びＲから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、独立して、Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、独立して、任意に置換されたＣ５−２０アリールまたはＣ５−７アリールまたはＣ８−１０アリールである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、独立して、任意に置換されたフェンリウ、チエニル、ナフチル、ピリジル、キノリニル、またはイソキノリニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、独立して、＝Ｏ、＝ＣＨ２、＝ＣＨ−ＲＤ、及び＝Ｃ（ＲＤ）２から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、それぞれ、＝ＣＨ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、それぞれ、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、それぞれ、＝Ｏである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２は、それぞれ、＝ＣＦ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ１２は、独立して、＝Ｃ（ＲＤ）２である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ１２は、独立して、＝ＣＨ−ＲＤである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ１２が＝ＣＨ−ＲＤであるとき、それぞれの基は、独立して、以下に示される立体配置のいずれかを有する。
Figure 2021073176
いくつかの実施形態では、＝ＣＨ−ＲＤは、立体配置（Ｉ）をしている。
いくつかの実施形態では、Ｒ″は、Ｃ３アルキレン基またはＣ５アルキレン基である。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的なＰＢＤ二量体構成要素は、式Ａ（Ｉ）：
Figure 2021073176
の構造を有し、式中、ｎは０または１である。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的なＰＢＤ二量体構成要素は、式Ａ（ＩＩ）：
Figure 2021073176
の構造を有し、式中、ｎは０または１である。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的なＰＢＤ二量体構成要素は、式Ａ（ＩＩＩ）：
Figure 2021073176
の構造を有し、式中、ＲＥ及びＲＥ”は、それぞれ独立して、ＨまたはＲＤから選択され、式中、ＲＤは、上記の通り定義され、
式中、ｎは０または１である。
いくつかの実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。いくつかの実施形態では、ＲＥ及び／またはＲＥ”は、Ｈである。いくつかの実施形態では、ＲＥ及びＲＥ”は、Ｈである。いくつかの実施形態では、ＲＥ及び／またはＲＥ”は、ＲＤであり、式中、ＲＤは、任意に置換されたＣ１−１２アルキルである。いくつかの実施形態では、ＲＥ及び／またはＲＥ”は、ＲＤであり、式中、ＲＤは、メチルである。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的なＰＢＤ二量体構成要素は、式Ａ（ＩＶ）：
Figure 2021073176
の構造を有し、式中、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ５−２０アリールであり、式中、Ａｒ１及びＡｒ２は、同じであっても異なってもよく、
式中、ｎは０または１である。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的なＰＢＤ二量体構成要素は、式Ａ（Ｖ）：
Figure 2021073176
の構造を有し、式中、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ５−２０アリールであり、式中、Ａｒ１及びＡｒ２は、同じであっても異なってもよく、
の構造を有し、式中、ｎは０または１である。
いくつかの実施形態では、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立して、任意に置換されたフェニル、フラニル、チオフェンリウ、及びピリジルから選択される。いくつかの実施形態では、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立して、任意に置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立して、任意に置換されたチエン−２−イルまたはチエン−３−イルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立して、任意に置換されたキノリニルまたはイソキノリニルである。キノリニルまたはイソキノリニル基は、任意の利用可能な環位を通じてＰＢＤコアに結合され得る。例えば、キノリニルは、キノリン−２−イル、キノリン−３−イル、キノリン−４イル、キノリン−５−イル、キノリン−６−イル、キノリン−７−イル、及びキノリン−８−イルであり得る。いくつかの実施形態では、キノリニルは、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イルから選択される。イソキノリニルは、イソキノリン−１−イル、イソキノリン−３−イル、イソキノリン−４イル、イソキノリン−５−イル、イソキノリン−６−イル、イソキノリン−７−イル、及びイソキノリン−８−イルであり得る。いくつかの実施形態では、イソキノリニルは、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イルから選択される。
ＡＤＣの更なる非限定的な例示的ＰＢＤ二量体構成要素は、式Ｂ：
Figure 2021073176
のもの、ならびにその塩及び溶媒和物であり、式中、
波線は、リンカーへの共有結合部分を示し、
ＯＨに繋がった波線は、ＳまたはＲ立体配置を示し、
ＲＶ１及びＲＶ２は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、及びフェニル（このフェニルは、特に４位で、フルオロで任意に置換されてもよい）、ならびにＣ５−６ヘテロシクリルから選択され、式中、ＲＶ１及びＲＶ２は、同じであってもことなってもよく、
ｎは、０または１である。
一部に実施形態では、ＲＶ１及びＲＶ２は、独立して、Ｈ、フェニル、及び４−フルオロフェニルから選択される。
いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｂ環のＮ１０イミン、Ｃ環のＣ−２エンド／エキソ位、またはＡ環を結合しているテザー単位を含む、ＰＢＤ二量体薬物部分の様々な部位のうちの１つに結合し得る（以下の構造Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）を参照されたい）。
ＡＤＣの非限定的な例示的ＰＢＤ二量体構成要素には、次の式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）が含まれる。
Figure 2021073176
式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）は、それらのＮ１０−Ｃ１１イミン形態で示されている。例示的なＰＢＤ薬物部分にはまた、以下の表に示される、カルビノールアミン及び保護カルビノールアミン形態も同様に含まれ、
Figure 2021073176
式中、
Ｘは、ＣＨ２（ｎ＝１〜５）、Ｎ、またはＯであり、
Ｚ及びＺ’は、独立して、ＯＲ及びＮＲ２から選択され、式中、Ｒは、１〜５個の炭素原子を含む第一級、第二級、または第三級アルキル鎖であり、
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２、及びＲ’２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ５−２０アリール（置換アリールを含む）、Ｃ５−２０ヘテロアリール基、−ＮＨ２、−ＮＨＭｅ、−ＯＨ、及び−ＳＨから選択され、いくつかの実施形態では、アルキル、アルケニル、及びアルキニル鎖は、最大５個の炭素原子を含み、
Ｒ３及びＲ’３は、独立して、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、及びＮＲ２から選択され、式中、Ｒは、１〜５個の炭素原子を含む第一級、第二級、または第三級アルキル鎖であり、
Ｒ４及びＲ’４は、独立して、Ｈ、Ｍｅ、及びＯＭｅから選択され、
Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ５−２０アリール（ハロ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アルキル、ヘテロシクリルで置換されたアリールを含む）、及びＣ５−２０ヘテロアリール基から選択され、いくつかの実施形態では、アルキル、アルケニル、及びアルキニル鎖は、最大５個の炭素原子を含み、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または保護基（アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、またはバリン−シトルリン−ＰＡＢなどの自壊性単位を含む部分など）であり、
Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または保護基であり、
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ５、またはＲ１２のうちの１つにおける水素、またはＡ環の間の−ＯＣＨ２ＣＨ２（Ｘ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｏ−スペーサーにおける水素は、ＡＤＣのリンカー繋がる結合で置き換えられる。
ＡＤＣの例示的なＰＤＢ二量体部分としては、次のものが挙げられるがこれに限定されない（波線は、リンカーへの共有結合部位を示す）。
Figure 2021073176
ＰＢＤ二量体を含むＡＤＣの非限定的な例示的実施形態は、以下の構造を有し、
Figure 2021073176
式中、
ｎは、０〜１２である。いくつかの実施形態では、ｎは２〜１０である。いくつかの実施形態では、ｎは４〜８である。いくつかの実施形態では、ｎは、４、５、６、７、及び８から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＢＤ二量体を含むＡＤＣは、ピリジン脱離基を含むリンカー−薬物中間体を硫黄原子を介して抗体のシステインチオールにコンジュゲートしてジスルフィド結合を形成することによって、作製することができる。更に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＢＤ二量体を含むＡＤＣは、チオピリジル脱離基を含むリンカー−薬物中間体をコンジュゲートすることによって作製することができ、ここで、ピリジン基は、１つ以上のニトロ基で置換される。いくつかの実施形態では、ピリジル環は、−ＮＯ２で一置換される。いくつかの実施形態では、−ＮＯ２一置換は、ジスルフィドに対してパラ位である。いくつかの実施形態では、ＰＢＤ二量体は、Ｎ１０位を介して結合される。例えば、ＰＢＤ二量体を含む非限定的な例示的ＡＤＣは、Ｎ１０結合型ＰＢＤリンカー中間体であるモノメチルエチルピリジルジスルフィド（以下に示される）を抗体にコンジュゲートすることによって作製することができる。
Figure 2021073176
ＰＢＤ二量体−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−Ａｂ及びＰＢＤ二量体−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢ−Ａｂのリンカーは、プロテアーゼで切断することができるが、ＰＢＤ二量体−マレイミド−アセタールは、酸不安定性である。
ＰＢＤ二量体及びＰＢＤ二量体を含むＡＤＣは、当該技術分野で既知の方法に従って調製することができる。例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０１６５１６号、米国公開第２００９／３０４７１０号、同第２０１０／０４７２５７号、同第２００９／０３６４３１号、同第２０１１／０２５６１５７号、国際公開第ＷＯ２０１１／１３０５９８号、同第ＷＯ２０１３／０５５９８７号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、アントラサイクリンを含むＡＤＣ。アントラサイクリンは、細胞毒活性を呈する抗菌性化合物である。いずれの特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、アントラサイクリンは、１）薬物分子の細胞のＤＮＡへのインターカレーションによる、ＤＮＡ依存性の核酸合成の阻害、２）細胞巨大分子と反応して細胞を損傷させるフリーラジカルの薬物の生成、及び／または３）薬物分子と細胞膜との相互作用を含む、いくつかの異なる機序によって細胞を殺滅するように作用し得ることが、研究により示されている（例えば、Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ”ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎ．Ｒ．Ｂａｃｈｕｒ，“Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｄａｍａｇｅ”ｉｄ．ａｔ ｐｐ．９７−１０２を参照されたい）。アントラサイクリンは、その細胞毒性の可能性から、白血病、乳癌、肺癌、卵巣腺癌、及び肉腫といった、多数の癌の治療に使用されてきた（例えば、Ｐ．Ｈ−Ｗｉｅｒｎｉｋ，ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ Ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｐ１１を参照されたい）。
非限定的な例示的アントラサイクリンとしては、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、ネモルビシン、及びこれらの誘導体が挙げられる。ダウノルビシン及びドキソルビシンの免疫コンジュゲート及びプロドラッグが調製され、研究されている（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １３：４７７−５２３、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８−３６２、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． １６：７１７−７２１、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：８２９−８３４、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｏｒｇ． ＆Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９−１５３２、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４５：４３３６−４３４３、欧州公開第ＥＰ０３２８１４７号、米国特許第６６３０５７９号）。抗体−薬物コンジュゲートであるＢＲ９６−ドキソルビシンは、腫瘍関連抗原Ｌｅｗｉｓ−Ｙと特異的に反応し、第Ｉ相及び第ＩＩ相研究において評価がなされている（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ （２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １８：２２８２−２２９２、Ａｊａｎｉ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ． ６：７８−８１、Ｔｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １７：４７８−４８４）。
ＰＮＵ−１５９６８２は、ネモルビシンの強力な代謝産物（または誘導体）である（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ，ｅｔ ａｌ． （２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（４）：１６０８−１６１７）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノに２−メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成類似体であり、肝細胞癌腫の第ＩＩ／ＩＩＩ相治験を含め、臨床評価がなされている（Ｇｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ． Ｒｅｖ．１７：１３３、Ｒｉｐａｍｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｂｒｉｔ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６５：７０３）（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２，Ａｂｓ１４４８、Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：１ｓｔ Ｅｄ，Ａｂｓ ４６４９、Ｐａｃｃｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊｏｕｒ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２４：１４１１６）。
ネモルビシンまたはネモルビシン誘導体を含む非限定的な例示的ＡＤＣは、式Ｉａ：
Figure 2021073176
で示され、式中、Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシ、またはメトキシ基であり、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基、またはその薬学的に許容される塩であり、
Ｌ１及びＺは、一緒に、本明細書に記載されるリンカー（Ｌ）であり、
Ｔは、本明細書に記載される抗体（Ａｂ）であり、
ｍは、１〜約２０である。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜４である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、いずれもメトキシ（−ＯＭｅ）である。
ネモルビシンまたはネモルビシン誘導体を含む更なる非限定的な例示的ＡＤＣは、式Ｉｂ
Figure 2021073176
で示され、式中、Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシ、またはメトキシ基であり、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基、またはその薬学的に許容される塩であり、
Ｌ２及びＺは、一緒に、本明細書に記載されるリンカー（Ｌ）であり、
Ｔは、本明細書に記載される抗体（Ａｂ）であり、
ｍは、１〜約２０である。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜４である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、いずれもメトキシ（−ＯＭｅ）である。
いくつかの実施形態では、ネモルビシン含有ＡＤＣのネモルビシン構成要素は、ＰＮＵ−１５９６８２である。一部のそのような実施形態では、ＡＤＣの薬物部分は、以下の構造：
Figure 2021073176
のうちの１つを有し得、式中、波線は、リンカー（Ｌ）への結合を示す。
ＰＮＵ−１５９６８２を含めアントラサイクリンは、複数の結合部位及び様々なリンカー（本明細書に記載されるリンカーを含む）を介して抗体にコンジュゲートすることができる（米国公開第２０１１／００７６２８７号、国際公開第ＷＯ２００９／０９９７４１号、米国公開第２０１０／００３４８３７号、国際公開第ＷＯ２０１０／００９１２４号）。
ネモルビシンを含む例示的なＡＤＣには、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：
Figure 2021073176
Figure 2021073176
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される）、ならびに
Figure 2021073176
ＰＮＵ−１５９６８２マレイミド−Ａｂのリンカーは、酸不安定性であるが、ＰＮＵ−１５９６８２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−Ａｂ、ＰＮＵ−１５９６８２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−スペーサー−Ａｂ、及びＰＮＵ−１５９６８２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−スペーサー（Ｒ１Ｒ２）−Ａｂのリンカーは、プロテアーゼで切断することができる。
例示的なＰＮＵ ＡＤＣを、図１０Ｄ及び１０Ｅに示す。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）を含む。５−アミノ−１−（クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール（アミノＣＢＩ）クラスのＤＮＡ副溝アルキル化剤は、強力な細胞毒素であり（Ａｔｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，４２：３４００）、癌療法用に設計されたいくつかのクラスのプロドラッグにおいて、エフェクター単位として用いられている。これらには、抗体コンジュゲート（Ｊｅｆｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ． （２００５）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，４８：１３４４）、カルバミン酸ニトロベンジルに基づく遺伝子療法用のプロドラッグ（Ｈａｙ，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４６：２４５６）、及び低酸素活性化プロドラッグなどの対応するニトロ−ＣＢＩ誘導体（Ｔｅｒｃｅｌ，ｅｔ ａｌ（２０１１）Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ． Ｅｄ．，５０：２６０６−２６０９）が含まれている。ＣＢＩ及びピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）のファーマコフォアは、アルキル鎖によって一緒に結合されている（Ｔｅｒｃｅｌ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ ４６：２１３２−２１５１）。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体を含む（国際公開第ＷＯ２０１５／０２３３５５号）。
例示的なＣＢＩ二量体ＡＤＣを、図１０Ｂに示す。
一部のそのような実施形態では、この二量体は、二量体の半分がＣＢＩ部分であり、二量体のもう半分がＰＢＤ部分である、ヘテロ二量体である。
例示的なＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体ＡＤＣを、図１０Ｃに示す。
いくつかの実施形態では、ＣＢＩ二量体は、式：
Figure 2021073176
を有し、式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、またはリンカー（Ｌ）への結合から選択され、Ｒ２は、Ｈ、Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、またはリンカー（Ｌ）への結合から選択され、
Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ、及び１つ以上のＦで任意に置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルから選択されるか、またはＲａ及びＲｂは、５員若しくは６員のヘテロシクリル基を形成し、
Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン、Ｙ、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）、（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）、及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり、
式中、Ｙは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから選択され、
アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、かつ、Ｆ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２、及びＣ１−Ｃ６アルキル（アルキルは、１つ以上のＦで置換されていてもよい）で置換されていてもよく、
またはアルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、かつ、Ｌへの結合で置換されていてもよく、
Ｄ’は、
Figure 2021073176
から選択される薬物部分であり、式中、波線は、Ｔへの結合部位を示し、Ｘ１及びＸ２は、独立して、Ｏ及びＮＲ３から選択され、式中、Ｒ３は、Ｈ、及び１つ以上のＦで置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ４は、Ｈ、ＣＯ２Ｒ、またはリンカー（Ｌ）への結合から選択され、式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジルであり、Ｒ５は、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つ以上のアマトキシン分子にコンジュゲートした抗体を含む。アマトキシンは、８つのアミノ酸から構成される環状ペプチドである。それらは、タマゴテングダケというキノコから単離することもでき、または合成で調製することもできる。アマトキシンは、哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それによって、患部細胞の転写及びタンパク質生合成も特異的に阻害する。細胞での転写を阻害することにより、成長及び増殖の停止を引き起こす。例えば、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． ＪＮＣＩ １０４：１−１３ （２０１２）、国際公開第ＷＯ２０１０１１５６２９号、同第ＷＯ２０１２０４１５０４号、同第ＷＯ２０１２１１９７８７号、同第ＷＯ２０１４０４３４０３号、同第ＷＯ２０１４１３５２８２号、及び同第ＷＯ２０１２１１９７８７号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアマトキシン分子は、１つ以上のα−アマニチン分子である。
他の薬物分子としては、タンパク質毒素、例えば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーザ由来）、リシンＡ鎖（Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８）、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サポアオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）（国際公開第ＷＯ９３／２１２３２号）が挙げられる。
１つを上回る求核性基が、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応する場合、結果として得られる生成物は、１つを上回る薬物部分が分散して抗体に結合したＡＤＣ化合物の混合物である。抗体１つ当たりの平均薬物数（ＤＡＲ）は、この混合物から、抗体に特異的であり薬物に特異的である二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって、計算することができる。個々のＡＤＣ分子は、質量分析法によって混合物中で特定され、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離することができる（例えば、ＭｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇｒ． Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １９（７）：２９９−３０７、Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ． “Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，”Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ｍａｒｃｈ ２００４、Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ． “Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ｍａｒｃｈ ２００４を参照されたい）。ある特定の実施形態では、単一の負荷値を有する同種のＡＤＣを、電気泳動またはクロマトグラフィーによってコンジュゲーション混合物から単離してもよい。
表１８の抗体薬物コンジュゲート５１〜５８（実施例１６を参照されたい）は、薬物部分をリンカー試薬とカップリングさせ、国際公開第ＷＯ２０１３／０５５９８７号、同第ＷＯ２０１５／０２３３５５号、同第ＷＯ２０１０／００９１２４号、同第ＷＯ２０１５／０９５２２７号の手順に従って、本明細書に記載されるシステイン操作抗体を含む抗体のいずれかとコンジュゲートすることによって、調製することができる。具体的な抗体−薬物コンジュゲートを、表１９に列挙する（実施例１６を参照されたい）。
薬物部分には、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）も含まれる。
治療用放射性同位体としては、３２Ｐ、３３Ｐ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。
放射性同位体または他の標識は、既知の手法でコンジュゲートに組み込むことができる（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ８０：４９−５７、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である（国際公開第ＷＯ９４／１１０２６号）。
更なるＡＤＣの具体的な例は、実施例１６に提示される。
リンカー
「リンカー」（Ｌ）は、１つ以上の薬物部分（Ｄ）を抗体（Ａｂ）に結合して式Ｉの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために使用することができる、二官能性または多官能性部分である。いくつかの実施形態では、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物と抗体とに共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを用いて調製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカーまたは薬物−リンカー中間体の反応性官能基と結合を形成して、ＡＤＣを形成することができる。
一態様では、リンカーは、抗体に存在する遊離システインと反応して共有結合を形成することができる、官能基を有する。そのような反応性官能基の非限定的な例としては、マレイミド、ハロアセトアミド、α−ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられる。例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５（４）：７６５−７７３の７６６頁のコンジュゲーション法、及び本明細書の実施例を参照されたい。
いくつかの実施形態において、リンカーは、抗体に存在する求電子性基と反応することができる官能性を有する。そのような求電子性基の例としては、アルデヒド及びケトンカルボニル基が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子は、抗体の求電子性基と反応し、抗体単位との共有結合を形成することができる。非限定的な例示のそのような反応性官能基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるがこれらに限定されない。
リンカーは、１つ以上のリンカー構成要素を含み得る。例示的なリンカー構成要素としては、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＭＣＣ」）が挙げられる。様々なリンカー構成要素が当該技術分野で既知であり、その一部を以下に記載する。
リンカーは、薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。非限定的な例示の切断可能なリンカーとしては、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンを含む）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光分解性リンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５２０８０２０号）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、リンカーは、以下の式ＩＩ：
Figure 2021073176
を有し、式中、Ａは「ストレッチャー単位」であり、ａは０〜１の整数であり、Ｗは「アミノ酸単位」であり、ｗは０〜１２の整数であり、Ｙは「スペーサー単位」であり、ｙは０、１、または２であり、Ａｂ、Ｄ、及びｐは、式Ｉに関して上記の通り定義されている。そのようなリンカーの例示的な実施形態は、米国特許第７，４９８，２９８号に記載されており、これは、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、リンカー構成要素は、抗体を別のリンカー構成要素または薬物部分に結合させる、「ストレッチャー単位」を含む。非限定的な例示的ストレッチャー単位を、以下に示す（ここで、波線は、抗体、薬物、または追加のリンカー構成要素への共有結合の部位を示す）：
Figure 2021073176
いくつかの実施形態では、リンカーは、国際公開第ＷＯ２０１５／０９５２２７号、同第ＷＯ２０１５／０９５１２４号、または同第ＷＯ２０１５／０９５２２３号に記載されるものといった、ペプチド模倣リンカーであってもよく、これらの文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一態様では、リンカーには、抗体に存在する求核性システインに対して反応する求電子性基を有する反応部位がある。抗体のシステインチオールは、リンカーの求電子性基と反応し、リンカーと共有結合を形成する。有用な求電子性基としては、マレイミド及びハロアセトアミド基が挙げられるがこれらに限定されない。
システイン操作抗体は、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５（４）：７６５−７７３の７６６頁のコンジュゲーション法及び実施例４のプロトコルによると、リンカー試薬または薬物−リンカー中間体、マレイミド若しくはα−ハロカルボニルなどの求電子性官能基と反応する。
更に別の実施形態では、リンカー試薬または薬物−リンカー中間体の反応性基は、抗体の遊離システインチオールと結合を形成することができる、チオール反応性官能基を含有する。チオール反応性官能基の例としては、マレイミド、α−ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられるがこれらに限定されない。
別の実施形態では、リンカーは、分岐した多官能性リンカー部分を介して１つを上回る薬物部分を抗体に共有結合させるための、樹状型リンカーであってもよい（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：２２１３−２２１５、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：１７６１−１７６８、Ｋｉｎｇ（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３：１９８７−１９９０）。樹状リンカーは、薬物対抗体のモル比、すなわち負荷を増大させることができ、これは、ＡＤＣの効力と関連する。したがって、システイン操作抗体が１つの反応性システインチオール基しか有さない場合、樹状リンカーを介して多数の薬物部分を結合することができる。
リンカーは、本発明のシステイン操作抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗体（Ａｂ）と薬物部分（Ｄ）とを結合する複数のアミノ酸残基を含み得る。これらのアミノ酸残基は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド、またはドデカペプチド単位を形成し得る。アミノ酸残基には、天然に生じるもの、ならびに微量アミノ酸及び天然に生じないアミノ酸類似体、例えばシトルリンが含まれる。
有用なアミノ酸残基単位は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼによって酵素切断され、活性薬物部分を遊離させるように設計し、選択性を最適化することができる。一実施形態では、バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）などのアミノ酸残基単位は、その切断がカテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、またはプラスミンプロテアーゼによって触媒されるものである。
リンカー単位は、ｐ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）単位など、自壊型のものであってもよく、ここで、ＡＤＣは、例示的な構造：
Figure 2021073176
を有し、式中、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ、または−シアノであり、ｍは、０〜４の範囲の整数であり、ｐは、１〜４の範囲である。
自壊性スペーサーの他の例としては、ＰＡＢ基に電子的に類似する芳香族化合物、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（米国特許第７３７５０７８号、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ９：２２３７）及び他のオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールが挙げられるがこれらに限定されない。置換及び非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ｊ．Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９４：５８１５）、及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５５：５８６７）など、アミド結合加水分解により環化されるスペーサーが用いられ得る。グリシンが置換されるアミン含有薬物の排除（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２７：１４４７）もまた、ＡＤＣに有用な自壊性スペーサーの例である。
別の実施形態では、リンカーＬは、分岐した多官能性リンカー部分を介して１つを上回る薬物部分を抗体に共有結合させるための、樹状型リンカーであってもよい（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：２２１３−２２１５、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：１７６１−１７６８）。樹状リンカーは、薬物対抗体のモル比、すなわち負荷を増大させることができ、これは、ＡＤＣの効力と関連する。したがって、システイン操作抗体が１つの反応性チオール基しか有さない場合、樹状リンカーを介して多数の薬物部分を結合することができる（国際公開第ＷＯ２００４／０１９９３号、Ｓｚａｌａｉ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２５：１５６８８−１５６８９、Ｓｈａｍｉｓ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２６：１７２６−１７３１、Ａｍｉｒ ｅｔ ａｌ（２００３）Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ４２：４４９４−４４９９）。
式Ｉａの抗体−薬物コンジュゲート化合物の実施形態は、（ｖａｌ−ｃｉｔ）、（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ）、及び（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ）を含む。
Figure 2021073176
式Ｉａの抗体−薬物コンジュゲート化合物の他の例示的な実施形態は、構造：
Figure 2021073176
を含み、式中、Ｘは、
Figure 2021073176
Ｒは、独立して、ＨまたはＣ１-Ｃ６アルキルであり、ｎは１〜１２である。
別の実施形態では、リンカーには、抗体に存在する求電子性基と反応する求核性基を有する、反応性官能基がある。抗体上の有用な求電子性基としては、アルデヒド及びケトンカルボニル基が挙げられるがこれらに限定されない。リンカーの求核性基のヘテロ原子は、抗体の求電子性基と反応し、抗体単位との共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核性基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸塩、及びアリールヒドラジドが挙げられるがこれらに限定されない。抗体の求電子性基は、リンカーとの結合に好都合な部位を提供する。
典型的に、ペプチド型リンカーは、２つ以上のアミノ酸及び／またはペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知の液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌuｂｋｅ（１９６５）“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ７６−１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に従って調製することができる。
別の実施形態では、リンカーは、溶解度または反応性が調節された基で置換され得る。例えば、スルホネート（−ＳＯ３ −）またはアンモニウムなどの荷電した置換基は、リンカー試薬の水溶性を向上させ、リンカー試薬と抗体若しくは薬物部分とのカップリング反応を促すか、またはＡＤＣの調製に用いる合成経路に応じてＡｂ−Ｌ（抗体−リンカー中間体）とＤとのカップリング反応若しくはＤ−Ｌ（薬物−リンカー中間体）とＡｂとのカップリング反応を促すことができる。
本発明の化合物は、リンカー試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて調製されたＡＤＣ、ならびにビス−マレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、及びＢＭ（ＰＥＯ）４を含めて調製されたＡＤＣを明示的に企図するがこれらに限定されず、これらは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｃｕｓｔｏｍｅｒ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １１７，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ． ６１１０５ Ｕ．Ｓ．Ａ，１−８００−８７４−３７２３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＋８１５−９６８−０７４７から市販されている。２００３−２００４ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇの４６７〜４９８頁を参照されたい。ビス−マレイミド試薬により、連続または同時の様式で、システイン操作抗体のチオール基をチオール含有薬物部分、標識、またはリンカー中間体に結合することが可能となる。システイン操作抗体のチオール基、薬物部分、標識、または中間体と反応するマレイミド以外の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられる。
Figure 2021073176
有用なリンカー試薬はまた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）などの他の商業的供給源から得るか、またはＴｏｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６７：１８６６−１８７２、Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６０：５３５２−５３５５、Ｆｒｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ７：１８０−１８６、米国特許第６２１４３４５号、国際公開第ＷＯ０２／０８８１７２号、米国公開第２００３１３０１８９号、同第２００３０９６７４３号、国際公開第ＷＯ０３／０２６５７７号、同第ＷＯ０３／０４３５８３号、及び同第ＷＯ０４／０３２８２８号に記載される手順に従って合成することができる。
マレイミドストレッチャー及びパラ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）自壊性スペーサーを有する例示的なバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔまたはｖｃ）ジペプチドリンカー試薬は、構造：
Figure 2021073176
を有し、式中、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ、または−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数である。
マレイミドストレッチャー単位及びｐ−アミノベンジル自壊性スペーサー単位を有する例示的なｐｈｅ−ｌｙｓ（Ｍｔｒ）ジペプチドリンカー試薬は、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ ａｌ． （１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０に従って調製することができ、このリンカー試薬は、構造：
Figure 2021073176
を有し、式中、Ｍｔｒは、モノ−４−メトキシトリチルであり、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ、または−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数である。
本発明の例示的な抗体−薬物コンジュゲート化合物には、次のものが含まれ、
Figure 2021073176
式中、Ｖａｌはバリンであり、Ｃｉｔはシトルリンであり、ｐは、１、２、３、または４であり、Ａｂはシステイン操作抗体である。マイタンシノイド薬物部分ＤＭ１がＢＭＰＥＯリンカーを介してトラスツズマブのチオール基に結合した、他の例示的な抗体−薬物コンジュゲートは、構造：
Figure 2021073176
を有し、式中、Ａｂはシステイン操作抗体であり、ｎは、０、１、または２であり、ｐは、１、２、３、または４である。
抗体−薬物コンジュゲートの調製
式ＩのＡＤＣは、当業者に既知の有機化学反応、条件、及び試薬を用いて、以下を含む複数の経路により調製することができる：（１）システイン操作抗体のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合により抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成した後、活性化薬物部分Ｄと反応させること、及び（２）薬物部分の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合により薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成した後、システイン操作抗体のシステイン基と反応させること。コンジュゲーション方法（１）及び（２）を、様々なシステイン操作抗体、薬物部分、及びリンカーを用いて行って、式Ｉの抗体−薬物コンジュゲートを調製することができる。
抗体のシステインチオール基は、求核性であり、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸、及び酸ハロゲン化物、（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基、ならびに（ｉｖ）スルフィド交換による、ピリジルジスルフィドを含むジスルフィドを含む、リンカー試薬及び薬物−リンカー中間体の求電子性基と反応して、共有結合を形成することができる。薬物部分の求核性基としては、リンカー部分及びリンカー試薬の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が挙げられるがこれらに限定されない。
マイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳＣＨ３に変換され得、これが、遊離チオールＭａｙ−ＳＨに還元され、修飾抗体（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１）と反応して、ジスルフィドリンカーを有するマイタンシノイド−抗体免疫コンジュゲートが生成され得る。ジスルフィドリンカーを有する抗体−マイタンシノイドコンジュゲートが報告されている（国際公開第ＷＯ０４／０１６８０１号、米国特許第６８８４８７４号、米国公開第２００４／０３９１７６Ａ１号、国際公開第ＷＯ０３／０６８１４４号、米国公開第２００４／００１８３８Ａ１号、米国特許第６４４１１６３号、同第５２０８０２０号、同第５４１６０６４号、国際公開第ＷＯ０１／０２４７６３号）。ジスルフィドリンカーＳＰＰは、リンカー試薬Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエートで構成されている。
ある特定の条件下において、システイン操作抗体は、ＤＴＴ（クリーランド試薬、ジチオスレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、Ｇｅｔｚ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ ２７３：７３−８０、Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの還元剤で処理することによって、リンカー試薬とコンジュゲートするように反応性にすることができる。ＣＨＯ細胞に発現される全長システイン操作モノクローナル抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）を、新たに導入したシステイン残基と培養培地に存在するシステインとの間に形成され得るジスルフィド結合を還元するように、３７℃で３時間、約５０倍過剰のＴＣＥＰにより還元した。還元されたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を希釈して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５でＨｉＴｒａｐ Ｓカラムに充填し、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含有するＰＢＳで溶出させた。希釈（２００ｎＭ）硫酸銅水溶液（ＣｕＳＯ４）に室温で一晩置くことにより、親Ｍａｂに存在するシステイン残基間のジスルフィド結合が再構築された。当該技術分野で既知の他の酸化体、すなわち、酸化剤、及び酸化条件を使用してもよい。周囲の空気による酸化もまた有効である。この軽度の部分的酸化ステップにより、高い忠実性で鎖内ジスルフィドが効率的に形成される。およそ１０倍過剰の薬物−リンカー中間体、例えば、ＢＭ（ＰＥＯ）４−ＤＭ１を添加し、混合し、約１時間室温で静置して、コンジュゲーションを達成し、抗体−薬物コンジュゲート（すなわち、コンジュゲートしたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）を形成した。コンジュゲーション混合物にゲル濾過を行い、ＨｉＴｒａｐ Ｓカラムを通して溶出して、過剰な薬物−リンカー中間体及び他の不純物を除去した。
例えば、米国特許公開第２０１１０３０１３３４号（参照によりその全体が組み込まれる）には、コンジュゲーションのために細胞培養物から発現されたシステイン操作抗体を調製するための一般的なプロセスが示されている。システイン付加物は、おそらくは様々な鎖間ジスルフィド結合とともに、還元により切断されて、抗体の還元型が得られる。対合したシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合は、周囲空気への曝露など、部分的な酸化条件下で再形成される。新たに導入された、操作された不対システイン残基は、リンカー試薬または薬物−リンカー中間体と反応して、本発明の抗体コンジュゲートを形成するのに利用できる状態に留まる。哺乳動物細胞株に発現されるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、−Ｓ−Ｓ−結合の形成を通じて操作Ｃｙｓに外部からコンジュゲートしたＣｙｓ付加物をもたらす。したがって、反応性ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を得るには、精製したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を還元及び酸化手順により処理しなければならない。これらのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を用いて、細胞毒性薬、フルオロフォア、及び他の標識を含有するマレイミドとコンジュゲートさせる。
例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体コンジュゲートが調製されており、それらは、本明細書に示される表において見出され得る。
インビトロ細胞増殖アッセイ
一般に、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞毒性または細胞増殖抑制性活性は、受容体タンパク質、例えばＨＥＲ２を有する哺乳動物細胞を、細胞培養培地中でＡＤＣの抗体に曝露し、細胞を約６時間〜約５日間の期間培養し、細胞生存率を測定することによって、測定される。細胞に基づくインビトロアッセイを用いて、本発明のＡＤＣの生存率（増殖）、細胞毒性、及びアポトーシス（カスパーゼ活性化）の誘導を測定した。
抗体−薬物コンジュゲートのインビトロでの効力は、細胞増殖アッセイによって測定することができる。例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙは、市販利用可能な（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、甲虫目ルシフェラーゼの組み換え発現に基づく同種アッセイ方法である（米国特許第５５８３０２４号、同第５６７４７１３号、及び同第５７００６７０号）。この細胞増殖アッセイは、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量に基づいて、培養物中の生存細胞の数を判定する（Ｃｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １６０：８１−８８、米国公開第６６０２６７７号）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、９６ウェル形式で行われるため、自動化高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適している（Ｃｒｅｅ ｅｔ ａｌ（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ６：３９８−４０４）。同種アッセイ手順は、単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を、血清補充培地で培養した細胞に直接添加することを伴う。細胞の洗浄、培地の除去、及び複数回のピペッティングは必要ない。この系は、３８４ウェル形式で、試薬の添加及び混合の後、１０分間で１ウェル当たり１５個ほどの少量の細胞を検出する。細胞をＡＤＣで継続的に処理してもよく、または処理してＡＤＣから分離してもよい。一般に、短時間、すなわち３時間処理した細胞は、継続的に処理した細胞と同じ効力の作用を示す。
この同種「添加−混合−測定」形式により、細胞溶解がもたらされ、存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルの生成が起こる。ＡＴＰの量は、培養物中に存在する細胞数に正比例する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイにより、ルシフェラーゼ反応により生成される「グロー型」発光シグナルが生じ、これは、用いる細胞の種類及び培地に応じて半減期が通常５時間を超える。生存細胞は、相対発光単位（ＲＬＵ）で反映される。甲虫ルシフェリンという基質は、組み換えホタルルシフェラーゼによって酸化的にカルボキシル基が除去され、同時にＡＴＰからＡＭＰへの変換と光子の生成が起こる。
インビボでの有効性
本明細書に記載されるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のインビボでの有効性は、高発現トランスジェニック外植マウスモデルによって測定することができる（例えば、抗ＨＥＲ２ ４Ｄ５抗体から作成された、本明細書に提供される表のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、高発現ＨＥＲ２トランスジェニック外植マウスモデルにより測定することができる）。同種移植片を、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法に応答しないか、応答しにくい、Ｆｏ５ ｍｍｔｖトランスジェニックマウスから繁殖させてもよい。対象には、抗ＨＥＲ２ ４Ｄ５ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体及びプラセボＰＢＳ緩衝対照液（ビヒクル）で１回処置が行われ得、対象を３週間にわたって監視して、腫瘍倍増、ログ細胞殺滅、及び腫瘍縮小までの時間を測定することができる。
抗体−薬物コンジュゲートの投与
本発明の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、処置すべき状態に適した任意の経路で投与され得る。ＡＤＣは、典型的には、非経口、すなわち、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、及び硬膜外で投与されるであろう。
薬学的配合物
本発明の治療用抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬学的配合物は、典型的に、非経口投与、すなわち、ボーラス、静脈内、腫瘍内注射のために、薬学的に許容される非経口ビヒクルと共に、注射用単位剤形で調製される。所望される度合いの純度を有する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、任意選択で、凍結乾燥配合物または水溶液の形態で、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．）と混合される。
本明細書に記載されるシステイン操作抗体の薬学的配合物は、凍結乾燥配合物または水溶液の形態で、所望される度合いの純度を有するそのような抗体（すなわち、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）を、１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントにとって毒性ではなく、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド：塩化ヘキサメトニウム：塩化ベンザルコニウム：塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、例えば、介在性（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）が更に含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥抗体及び免疫コンジュゲート配合物は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。水溶性抗体または免疫コンジュゲートの配合物には、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第ＷＯ２００６／０４４９０８号（いずれも全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものが含まれ、後者の配合物には、ヒスチジン−酢酸緩衝液が含まれる。
本明細書の配合物はまた、治療されている特定の適応症の必要に応じて、１つを上回る活性成分、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有する成分を含有してもよい。
活性成分は、例えばコアセルベーション技法若しくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に封入され得る。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ． （１９８０）に開示されている。
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例としては、抗体または免疫コンジュゲートを含有する疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に使用されることになる配合物は、一般に、滅菌されている。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過によって、容易に達成することができる。
抗体−薬物コンジュゲート治療の方法及び組成物
本発明の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、様々な疾患または障害、例えば、腫瘍抗原の過剰発現を特徴とするものを治療するために用いることができる。例示的な状態は、良性または悪性の腫瘍、及び白血病、及びリンパ系悪性病変を含む、過剰増殖性障害である。その他のものとしては、神経性、神経膠性、星状性、視床下部性、腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胚盤胞性、炎症性、血管形成性、及び自己免疫性を含む免疫性の障害が挙げられる。
一般に、治療されるべき疾患または障害は、癌などの過剰増殖性疾患である。本明細書における治療されるべき癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病またはリンパ系の悪性病変が挙げられるがこれらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮系扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
ＡＤＣ化合物を治療に使用することができる自己免疫疾患としては、リウマチ性障害（例えば、リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥ及びループス腎炎などのループス、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬性関節炎など）、骨関節炎、自己免疫性胃腸及び肝障害（例えば、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及びセリアック病など）、脈管炎（例えば、チャーグ・ストラウス脈管炎、ウェゲナー肉芽腫、及び多発性動脈炎を含む、ＡＮＣＡ関連脈管炎など）、自己免疫性神経障害（例えば、多発性硬化症、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫性多発性ニューロパチーなど）、腎障害（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルジェ病など）、自己免疫性皮膚障害（例えば、乾癬、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、蕁麻疹（ｈｉｖｅｓ）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、及び皮膚エリテマトーデスなど）、血液障害（例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑症、及び自己免疫性溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴力疾患（例えば、内耳疾患及び難聴など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、ならびに自己免疫性内分泌障害（例えば、インスリン依存型真性糖尿病（ＩＤＤＭ）などの糖尿病関連自己免疫疾患、アジソン病、及び自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス病及び甲状腺炎）など）が挙げられる。より好ましいそのような疾患としては、例えば、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連脈管炎、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎、及び糸球体腎炎が挙げられる。
疾患の予防または治療に関して、ＡＤＣの適切な投薬量は、上述のような治療すべき疾患の種類、疾患の重症度及び経過、本分子が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への反応、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。本分子は、好適には、１回、または一連の治療にわたり、患者に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、１回以上の別個の投与に、または連続注入によって、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の分子が、患者に投与するための初回候補投薬量である。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲に及び得る。患者に投与すべきＡＤＣの例示的な投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１〜約１０ｍｇの範囲内である。
数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が継続される。例示的な投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量を投与した後、約２ｍｇ／ｋｇの抗ＥｒｂＢ２抗体の維持量を毎週投与することを含む。他の投薬レジメンが有用な場合がある。この治療の経過は、従来的な技法及びアッセイによって容易に監視される。
一態様では、本明細書に提供されるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、細胞増殖の阻害方法において使用され得る。例えば、抗ＨＥＲ２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を使用して、ＨＥＲ２陽性細胞の細胞増殖を阻害することができる。第２の例として、抗ＣＤ３３ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を使用して、ＣＤ３３陽性細胞の細胞増殖を阻害することができる。したがって、抗体は、腫瘍細胞に発現する任意のポリペプチドに対抗するように作製されてもよく、この抗体は、薬物コンジュゲーションのために非天然のシステインを含むように操作されていてもよい（すなわち、抗体が操作されＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体となっていてもよい）。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が作製されると、細胞増殖の阻害方法は、細胞をＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（例えば、抗ＨＥＲ２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）に、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が細胞の表面上の標的（例えば、ＨＥＲ２）に結合するのを許容する条件下で曝露し、それによって細胞の増殖を阻害することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、インビトロ法またはインビボ法である。
インビトロでの細胞増殖の阻害は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されているＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いてアッセイすることができる。このアッセイは、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量化に基づいて培養物中の生存細胞の数を判定する。Ｃｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １６０：８１−８８、米国特許第 ６６０２６７７号を参照されたい。このアッセイは、９６ウェルまたは３８４ウェルの形式で行うことができるため、自動化高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適している。Ｃｒｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ６：３９８−４０４を参照されたい。アッセイ手順は、単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を培養細胞に直接添加することを伴う。これにより、細胞溶解がもたらされ、ルシフェラーゼ反応によって発生する発光シグナルの生成が起こる。発光シグナルは、存在するＡＴＰの量に比例し、これは、培養物中に存在する生存細胞の数に正比例する。データは、ルミノメーターまたはＣＣＤカメライメージングデバイスによって記録することができる。発光出力は、相対発光単位（ＲＬＵ）で表される。
別の態様において、医薬品として使用するためのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が提供される（例えば、抗ＨＥＲ２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。更なる態様では、治療法において使用するためのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が提供される。非限定的な実施形態では、ＨＥＲ２陽性癌を治療するのに使用するための抗ＨＥＲ２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が提供される。ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２陽性癌を有する個体を治療する方法において使用するための抗ＨＥＲ２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を提供し、この方法は、有効量の抗ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を個体に投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。非限定的な実施形態では、ＣＤ３３陽性癌を治療するのに使用するための抗ＣＤ３３ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が提供される。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３３陽性癌を有する個体を治療する方法において使用するための抗ＣＤ３３ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を提供し、この方法は、有効量の抗ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を個体に投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製における、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の使用を提供する（例えば、抗ＨＥＲ２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。例えば、抗ＨＥＲ２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体医薬品は、ＨＥＲ２陽性癌を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、ＨＥＲ２陽性癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製におけるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の使用を提供する（例えば、抗ＭＵＣ１６ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。例えば、抗ＭＵＣ１６ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体医薬品は、ＭＵＣ１６陽性癌を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、ＭＵＣ１６陽性癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製におけるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の使用を提供する（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。例えば、抗ＳＴＥＡＰ１ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体医薬品は、ＳＴＥＡＰ１陽性癌を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、ＳＴＥＡＰ１陽性癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製におけるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の使用を提供する（例えば、抗ＮＡＰＩ２Ｂ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。例えば、抗ＮＡＰＩ２Ｂ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体医薬品は、ＮＡＰＩ２Ｂ陽性癌を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、ＮＡＰＩ２Ｂ陽性癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製におけるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の使用を提供する（例えば、抗ＬＹ６Ｅ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。例えば、抗ＬＹ６Ｅ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体医薬品は、ＬＹ６Ｅ陽性癌を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、ＬＹ６Ｅ陽性癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製におけるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の使用を提供する（例えば、抗Ｂ７Ｈ４ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。例えば、抗Ｂ７Ｈ４ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体医薬品は、Ｂ７Ｈ４陽性癌を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、Ｂ７Ｈ４陽性癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製におけるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の使用を提供する（例えば、抗ＣＤ７９Ｂ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。例えば、抗ＣＤ７９Ｂ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体医薬品は、ＣＤ７９Ｂ陽性癌を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、ＣＤ７９Ｂ陽性癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製におけるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の使用を提供する（例えば、抗ＣＤ２２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）。例えば、抗ＣＤ２２ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体医薬品は、ＣＤ２２陽性癌を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、ＣＤ２２陽性癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様において、本発明は、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体またはその医薬品を投与することによる癌のための方法を提供する。具体的な実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体またはその医薬品は、癌細胞の増殖を防止する。具体的な実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体またはその医薬品は、癌細胞のアポトーシスを促進する。具体的な実施形態では、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体またはその医薬品は、癌細胞の腫瘍体積を縮小させる。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
本発明のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、治療法において、単独でか、または他の薬剤と組み合わせてのいずれかで使用することができる。例えば、本発明の抗体または免疫コンジュゲートは、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。例えば、追加の治療剤は、第２のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体であってもよく、または本明細書に定義される化学療法剤であってもよい。
上で述べたそのような併用療法には、組み合わせ投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別個の配合物中に含まれる）及び別個の投与が含まれ、別個の投与の場合、本発明の抗体または免疫コンジュゲートの投与は、追加の治療剤及び／またはアジュバントの投与の前、それと同時、及び／またはその後に行うことができる。本発明の抗体または免疫コンジュゲートはまた、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
本発明のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所処置に所望される場合は病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射によるものであってもよい。単回または様々な時点に渡わたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。
本発明のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、良好な医療行為と一致した様式で、配合、投薬、及び投与が行われるであろう。この文脈における考慮の要因には、治療されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理、及び医療従事者に知られている他の要因が含まれる。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、必須ではないが、場合によっては、問題の障害の予防または治療に現在使用されている１つ以上の薬剤とともに配合される。そのような他の薬剤の有効量は、配合物中中に存在する抗体または免疫コンジュゲートの量、障害または治療の種類、及び上で考察された他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量で、本明細書に記載される投与経路により、または本明細書に記載される投薬量の約１〜９９％、または経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路によって、使用される。
疾患の予防または治療のために、本発明のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の適切な投薬量は（単独または１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）、治療すべき疾患の種類、抗体または免疫コンジュゲートの種類、疾患の重症度及び経過、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の病歴及びＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体への反応、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、好適には、１回、または一連の治療にわたり、患者に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、１回以上の別個の投与または連続注入によって、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が、患者に投与するための初回候補投薬量であり得る。１つの典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲に及び得る。数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が継続されることが一般的であろう。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（若しくはこれらの任意の組み合わせ）の１回以上の用量が患者に投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間毎（例えば、患者が約２〜約２０回、または例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。より高い初回負荷用量を投与し、続いてより低い用量が１回以上投与されてもよい。しかしながら、他の投薬レジメンも有用な場合がある。この治療の経過は、従来的な技法及びアッセイによって容易に監視される。
上述のいずれの配合物または治療方法も、本発明のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体及び本明細書に定義される第２の化学療法剤の療法を用いて行われてもよいことが理解される。
標識化抗体のイメージング方法
本発明の別の実施形態では、システイン操作抗体を、システインチオールを通じて放射性核種、蛍光色素、生体発光をトリガする基質部分、化学発光をトリガする基質部分、酵素、ならびに診断、薬力学、及び治療の用途のイメージング実験のための他の検出標識で標識化することができる。一般に、標識化されたシステイン操作抗体、すなわち、「バイオマーカー」または「プローブ」は、注射、灌流、または経口摂取によって、生物、例えばヒト、齧歯類、若しくは他の小動物、灌流器官、または組織試料に投与される。プローブの分布は、経時的に検出され、画像で表される。
製品
本発明の別の実施形態では、上述の障害の治療に有用な物質を含有する製品また「キット」が提供される。製品には、容器と、容器の上または容器と関連したラベルまたは添付文書とが含まれる。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装などが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成され得る。容器は、状態を治療するのに有効な本発明のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静注溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤は、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体である。ラベルまたは添付文書は、癌など、選定された状態を治療するために組成物が使用されることを示す。代替または追加として、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液といった、薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）の容器を更に含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的立場及びユーザの立場から望ましい他の物質を更に含んでもよい。
実施例１−ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の調製
ｈｕ４Ｄ５プラスミドを二本鎖ＤＮＡ鋳型として用いてＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を生成した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬキットを用いて、ＰＣＲに基づく部位指向性変異生成を行った。
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製するための部位指向性変異生成に使用した方法は次の通りであった：１）Ｈｕ４Ｄ５プラスミドＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）を使用し、２） 所望の変異を含む順方向及び逆方向プライマー（１μＭずつ）を使用し、３）ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ）及びＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を２５μｌの反応混合物に添加し、４）試料を、初回変性（９４℃で４分間）させるためにサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でインキュベートし、その後、０．５分間の変性（９４℃）、０．５分間のアニーリング（５２℃）、及び１０分間の鎖伸長（６８℃）のサイクルを２０回行い、５）ＰＣＲ増幅したＤＮＡ試料を、３７℃で４時間ＤｐｎＩ制限酵素とともにインキュベートし、６）コンピテントセル（Ｎｏｖａｂｌｕｅ Ｓｉｎｇｌｅｓ、５０μｌ）にＤｐｎＩ処置ＰＣＲ試料（２μｌ）を形質転換し、７）形質転換したプレートから単一のコロニーを取り、カルベニシリンを含有する５ｍｌの２ＹＴ培地（５０ｕｇ／ｍｌ）で成長させ、８）プラスミドＤＮＡを精製し、得られたクローンをＤＮＡ配列決定によってスクリーニングして、抗体配列の軽鎖及び重鎖領域中のシステイン置換及び非特異的変異の不在を特定した。
タンパク質産生のために、システイン操作ｈｕ４Ｄ５プラスミドを哺乳動物細胞株に安定にトランスフェクトした。この研究に使用した２９３Ｔ細胞株は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原を安定にトランスフェクトした懸濁適合性ＨＥＫ２９３細胞株であった。一過性トランスフェクションの前に、湿度８０％のインキュベータにおいて３７℃、５％ＣＯ２、及びスロー径（ｔｈｒｏｗ ｄｉａｍｅｔｅｒ）２５ｍｍで１５０ｒｐｍの撹拌速度という条件下で、細胞を振盪フラスコにおいてシードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）として培養した。１％超低ＩｇＧ血清（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＧｉｂｃｏ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を、シードトレイン及び産生培地として使用した。別途指定されない限り、全ての一過性トランスフェクションは、５０ｍＬのチューブスピン（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）において実行し、３０ｍＬの最終作業体積で、９６のバッチで処理した。効率性の目的で、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸＰ液体ハンドリングロボットを用いて９６個のチューブスピンに細胞をバルク分注した。トランスフェクション後に、湿度８０％のＫｕｈｎｅｒ ＩＳＦ１−Ｘインキュベータにおいて３７℃、５％ＣＯ２、及び５０ｍｍのスロー径で２２５ｒｐｍの撹拌速度において、細胞を７日間培養した。
トランスフェクションのために、１．０ｅ６細胞／ｍＬで細胞を播種し、トランスフェクションの前に２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。播種時に、７５ｍＭの濃度でバルプロ酸を産生培養物に添加した。選択したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）ｈｕ ＩｇＧ１抗体をコードするプラスミドＤＮＡをｍａｘｉ ｐｒｅｐスケール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で精製した。標準的な一過性トランスフェクションプロセスを用いて、３０ｕｇのＤＮＡをＤＭＥＭ系培地において３ｍＬの最終体積に希釈した。次いで、６０ｕｌの７．５ｍＭ ２５ｋＤａの直鎖ＰＥＩをＤＮＡ溶液に添加し、混合し、室温で１０分間インキュベートした後、細胞に添加した。
実施例２−ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のコンジュゲーション
実施例１に従って作製した各システイン操作抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）を、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びＰＤＳ−ＭＭＡＥという２つのリンカー薬物に別個にコンジュゲートした。例えば、４Ｄ５ ＬＣ−Ｋ１４９Ｃシステイン操作抗体から２つの異なるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製した：１）４Ｄ５ ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及び２）４Ｄ５ ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ− ＰＤＳ−ＭＭＡＥ。好ましいコンジュゲーションの更なる例は、表１及び２、ならびに本明細書の説明に見出すことができ、ＥＵ番号付けによる４Ｄ５ ＨＣ−Ａ１４０Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及び４Ｄ５ ＨＣ−Ａ１４０Ｃ−ＰＤＳ−ＭＭＡＥ、ならびにＥＵ番号付けによる４Ｄ５ ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及び４Ｄ５ ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ−ＰＤＳ−ＭＭＡＥが挙げられるがこれらに限定されない。全抗体スクリーニングで特定された上位の安定なコンジュゲートの他の例は、表３及び４に見出すことができる。−ｖｃ及びＰＤＳコンジュゲーションに好適な部位については、図２１を参照されたい。
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のコンジュゲーションは、９６ウェルフィルタプレート（ＥＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの容積２ｍｌのポリプロピレン製０．４５ｕｍフィルタ）において行った。プレートは、５００ｘｇで２分間遠心分離したときにのみ緩衝水溶液が流れた。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）４５０μｌを２０％エタノール中の５０％スラリーの形態で各ウェルに添加した。樹脂を３回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）において平衡化した。各ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（１．５ｍｇ）を各ウェルに添加し、室温で３０分間、６００ＲＰＭのプレート振盪機上で樹脂に結合させた。３０分後にプレートを遠心分離して過剰な緩衝液を除去した。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、次いで、０．９ｍｌの２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（緩衝液Ａ中）の存在下で一晩室温で撹拌しながら還元させた。還元剤（すなわち、ＤＴＴ）及び任意のシステインまたはグルタチオンブロックを、緩衝液Ａで２回洗浄することによって除去した。
次いで、１ｍｌの１ｍＭデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）（緩衝液Ａ中）でプレートを３回洗浄して、プレートを酸化剤で飽和させた。０．９ｍｌの１ｍＭ ＤＨＡＡ（緩衝液Ａ中）を最後に添加した後、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を室温で３時間プレート振盪機上で再び酸化させた。酸化剤を遠心分離によって除去した。
１０％ＤＭＡ（緩衝液Ａ中）に溶解させた２倍モル過剰（利用できるチオール基に対して）のリンカー薬物（ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＰＤＳ−ＭＭＡＥ）を添加し、室温で２時間プレート振盪機上でＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とともにインキュベートした。プレートを平衡緩衝液（緩衝液Ａ）で６回洗浄することによって過剰なリンカー薬物を除去した。
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、室温で３０分間プレート振盪機上で０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．７で溶出させた。次いで、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、即座に１５％の０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体１つ当たりのコンジュゲートした薬物の数をＬＣ／ＭＳ分析によって定量した。コンジュゲートの凝集をサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。
実施例３−ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の質量分析による分析
質量分析による分析（ぅなわち、ＬＣ／ＭＳ分析）を用いて、各ＴＨＩＯＭＡＢ抗体の薬物−抗体比（ＤＡＲ）を判定した。
ＬＣ／ＭＳ分析を、６２２４ Ｍａｓｓ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ）ＬＣ／ＭＳ機（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。８０℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓカラム、１０００Å、８μｍ（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で試料をクロマトグラフィーに供した。０．７ｍｌ／分の流速で３分間で３４〜４２％のＢという線形勾配（溶媒Ａ、０．０５％ＴＦＡ（水中）、溶媒Ｂ、０．０４％ＴＦＡ（アセトニトリル中））を使用し、溶離液をエレクトロスプレー源を用いて直接イオン化させた。データを収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ定性分析ソフトウェアを用いてデコンボリューションした。ＬＣ／ＭＳクロマトグラムに存在していたデコンボリューションした多数のピークを用いて、薬物ＤＡＲを計算した。ＤＡＲ計算値は、例えば、上述の表６〜１２に見出すことができる。
更に、抗体の各位置に単一のシステイン変異を含む４Ｄ５システイン操作抗体に、ＬＣ／ＭＳ分析を行った。表１３〜１６の空欄は、０ＤＡＲではなく、不確定な実験を表す。
表１３．重鎖システイン置換を有するＰＤＳ結合したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＤＡＲ。
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表１４．軽鎖システイン置換を有するＰＤＳ結合したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＤＡＲ。
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表１５．重鎖システイン置換を有する−ｖｃ結合したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＤＡＲ。
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表１６．軽鎖システイン置換を有する−ｖｃ結合したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＤＡＲ。
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実施例４−ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ及びＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の凝集分析
表６〜１０に示したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のそれぞれに、サイズ排除アッセイにより凝集分析を行った。
サイズ排除クロマトグラフィーを、１１００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０２．５カラムにおいて試料にクロマトグラフィーを行った。０．７５ｍＬ／分で１５分間、０．２Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６．２の移動相を用いたイソクラティック法を使用して、コンジュゲートを溶離させた。ＵＶ２８０ｎｍのクロマトグラムから凝集及びモノマーピークの積分面積から、凝集パーセントを計算した。図３は、凝集の分析及び計算に使用した凝集体とモノマーのピークを表すプロットを示す。
実施例５−ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のコンジュゲーション分析。
液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳまたはＬＣＭＳ）を用いて、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のコンジュゲーション分析を行った。図４Ａ及び４Ｂに示されるように、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳクロマトグラフにより、ＤＡＲ０（ネイキッド抗体）、ＤＡＲ１、及びＤＡＲ２コンジュゲーションを示す。全抗体システインスクリーニングの最も安定な部位に関するＬＣＭＳ結果（抗体内の各位置に単一のシステイン変異を有する４Ｄ５抗体を作製して、リンカー−薬物を結合させてＡＤＣを作製する目的で抗体内の予測不可能な最も安定な部位を判定した）を、表７及び９に示す。
実施例６−ＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ及びＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性分析。
ＰＤＳ−ＭＭＡＥ及びＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性試料を、ラット血漿の３つの時点（０時間、４８時間、及び９６時間）ならびに緩衝液（０時間）の両方で二連に生成した。安定性スクリーニングの実験手順のフローチャートを、図５に示す。安定性試料を作製するために、９μＬの各ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（すなわち、原料物質）を、３５１μＬのラット血漿または緩衝液（１倍ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１５ＰＰＭ Ｐｒｏｃｌｉｎ）に添加した後、十分に混合した。原料物質の濃度（Ｃｏｎｃ．）を、例えば、表６、８、及び１０に示す。混合した後、１２０μＬのラット血漿安定性試料を、３つの異なる時点で３つの別個のチューブセットにアリコートした。０時間の時点のラット血漿及び緩衝液を、−８０℃のフリーザーに入れ、４８時間及び９６時間の時点のラット血漿は、３７℃のインキュベータの振盪機上に置いた。所与の時点に達したときに、４８時間及び９６時間の試料も−８０℃のフリーザーに入れた。０時間、４８時間、及び９６時間で質量分析を用いたＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ及びＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性を示す代表的なグラフを、図６ａ及び６ｂに示す。
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＰＤＳ−ＭＭＡＥ及びＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性を判定した。ヒトｅｒｂ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を捕捉抗体として使用し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を検出抗体として使用して、ＥＬＩＳＡによってラット血漿中の全抗体濃度（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体にコンジュゲートしたもの及びコンジュゲートしてないもの）を判定した。このアッセイは、最小希釈８００倍で０．５ｍｇ／ｍＬの検出限界（ＬＯＤ）を有した。
抗薬物モノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを検出抗体として使用して、ＥＬＩＳＡによってラット血漿中のコンジュゲートしたＰＤＳ−ＭＭＡＥ及びＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の濃度を判定した。このアッセイは、最小希釈８００倍で０．５ｍｇ／ｍＬの検出限界（ＬＯＤ）を有した。
特定のシステイン操作部位でのコンジュゲーションに基づいて、薬物負荷安定性を計算した。０時間時点でのコンジュゲート抗体濃度と０時間での全抗体濃度との比（ＥＬＩＳＡにより判定）を使用して、全抗体に対して正規化した０時間でのコンジュゲート抗体濃度を、［Ｃ０］／［Ｔ０］＝ｎＣ０となるように計算した。４８時間時点でのコンジュゲート抗体濃度と４８時間での全抗体濃度との比（ＥＬＩＳＡにより判定）を使用して、全抗体に対して正規化した４８時間でのコンジュゲート抗体濃度を、［Ｃ４８］／［Ｔ４８］＝ｎＣ４８となるように計算した。
４８時間でのコンジュゲート抗体と０時間でのコンジュゲート抗体との比（ＥＬＩＳＡにより判定）を計算することで安定性パーセントを判定することによって、薬物負荷安定性を、ｎＣ４８／ｎＣ０＝薬物負荷安定性パーセントとなるように計算した。
図７は、４８時間の時点で測定した、好ましいＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性のグラフを示す。図８は、４８時間の時点で測定した、好ましいＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性のグラフを示す。スクリーニングした全てのＰＤＳ−ＭＭＡＥ及びＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性は、本明細書に示される表に見出すことができる。
実施例７−ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、及びＨＣ−Ａ１１４Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の調製
抗ＣＤ３３及び抗ＨＥＲ２抗体を用いてＬＣ−Ｋ１４９Ｃ、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、及びＨＣ−Ａ１１４Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製し、これらのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性を、平均ＤＡＲに基づいて評価した（図９）。抗ＨＥＲ２ ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、ＨＣ−Ａ１１４Ｃ及びＬＣ−Ｖ２０５Ｃと比較して、抗ＨＥＲ２抗体において驚くべき安定性を示した。具体的には、抗ＨＥＲ２ ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の薬物コンジュゲーションは安定であり、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、コンジュゲーション後６日間、ＤＡＲ２を維持した。同様に、抗ＣＤ３３ ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体もまた、ＤＡＲ２を６日間維持した。対照的に、抗ＨＥＲ２ ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ及びＨＣ−Ａ１１４Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体。
実施例８−コンジュゲーション後４８時間及び９６時間のＰＤＳ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性。
抗体のシステインスクリーニングを行って、結果として得られたどのＰＤＳ−ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が、１以上のＤＡＲ、１ｍｇ／ｍＬ以上の原料ストック濃度、５０％以下の凝集、再酸化、ラット血漿においてＥＬＩＳＡに基づいて４８時間を上回るＶＣ変異形薬物負荷に対する８０％以上の安定性（いずれも二連）、ラット血漿においてＥＬＩＳＡに基づいて４８時間を上回るＰＤＳ変異形薬物負荷に対する７０％以上の安定性（いずれも二連）、及び信頼性のあるＭＳスペクトルによって確認した最大９６時間の安定性を有していたかを判定した。具体的には、例示目的で４Ｄ５抗体を使用したが、当業者であれば任意の抗体を４Ｄ５抗体の代わりに用いてもよいことを理解するであろう。
安定なＡＤＣを生成するためのシステイン操作及びリンカー−薬物結合のための、軽鎖及び重鎖内の好ましい候補（表１及び２を参照されたい）ならびに追加の安定な部位（表３及び４を参照されたい）が、このスクリーニングにより特定された。実験の結果を表６〜１２に示す。
実施例９−コンジュゲーション後４８時間及び９６時間のＭＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の安定性
抗体のシステインスクリーニングを行って、結果として得られたどのＭＣ−ｖｃ−ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体が、１以上のＤＡＲ、１ｍｇ／ｍＬ以上の原料ストック濃度、５０％以下の凝集、再酸化、ラット血漿においてＥＬＩＳＡに基づいて４８時間を上回るＶＣ変異形薬物負荷に対する８０％以上の安定性（いずれも二連）、ラット血漿においてＥＬＩＳＡに基づいて４８時間を上回るＰＤＳ変異形薬物負荷に対する７０％以上の安定性（いずれも二連）、及び信頼性のあるＭＳスペクトルによって確認した最大９６時間の安定性を有していたかを判定した。具体的には、例示目的で４Ｄ５抗体を使用したが、当業者であれば任意の抗体を４Ｄ５抗体の代わりに用いてもよいことを理解するであろう。
安定なＡＤＣを生成するためのシステイン操作及びリンカー−薬物結合のための、軽鎖及び重鎖内の好ましい候補（表１及び２を参照されたい）ならびに追加の安定な部位（表３及び４を参照されたい）が、このスクリーニングにより特定された。実験の結果を表６〜１２に示す。
実施例１０−インビトロでの細胞増殖アッセイ
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の有効性は、以下のプロトコルを用いて細胞増殖アッセイによって測定することができる（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２８８、Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：５４８５−５４８８）：
１．培地中の約１０４個の細胞（ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＭＣＦ７、またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を含有する１００μｌの細胞培養物のアリコートを、９６ウェルの不透明ウェルプレートの各ウェルに入れることができる。
２．培地を含有するが細胞を含まない対照ウェルを調製することができる。
３．ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を実験ウェルに添加し、３〜５日間インキュベーすることができる。
４．プレートは、およそ３０分間室温で平衡化することができる。
５．各ウェルに存在する細胞培養培地の量と等しい量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを添加することができる。
６．オービタルシェーカーで内容物を２分間混合して、細胞溶解を誘導することができる。
７．プレートを室温で１０分間インクベートして、発光シグナルを安定させることができる。
８．発光は、ＲＬＵ＝相対発光単位としてグラフで記録し、報告することができる。
ある特定の細胞を、１０００〜２０００／ウェル（ＰＣ３株）または２０００〜３０００／ウェル（ＯＶＣＡＲ−３）で９６ウェルプレートに、５０ｕＬ／ウェルで播種することができる。１日後（ＰＣ３）または２日後（ＯＶＣＡＲ−３）に、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を５０μＬの量で添加して最終濃度９０００、３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２．４、４．１、または１．４ｎｇ／ｍＬにし、「ＡＤＣなし」の対照ウェルには培地のみを入れた。３日後（ＰＣ３）または４〜５日後（ＯＶＣＡＲ−３）に条件を２連または３連にし、１００μＬ／ウェルのＣｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ＩＩを添加し（ルシフェラーゼに基づくアッセイ、増殖をＡＴＰレベルにより測定）、ルミノメーターを用いて細胞数を判定することができる。データは、例えば、各繰り返しセットの発光の平均として、標準偏差誤差範囲を伴ってプロットすることができる。あるいは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＰｒｏｍｅｇａのプロトコルに従って行ってもよい：
１．１０００細胞／ウェルのＰＣ３／Ｍｕｃ１６、ＰＣ３／ｎｅｏ（５０μＬ／ウェル）を培地に播種する。Ｏｖｃａｒ３細胞は、２０００細胞／ウェル（５０μＬ中）で播種すべきである（ＰＣ３／ｎｅｏ及びＰＣ３／ＭＵＣ１６は、５０／５０／１０％ＦＢＳ／グルタミン／２５０μｇ／ｍＬのＧ−４１８で成長し、ＯＶＣＡＲ−３はＲＰＭＩ／２０％ＦＢＳ／グルタミンで成長する）。一晩、細胞を付着させる。
２．ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を１８μｇ／ｍｌの作用濃度から初めて１：３で連続希釈する（これにより、最終濃度が９μｇ／ｍｌとなる）。既にウェルに入っている５０μＬの細胞及び培地に、５０μＬの希釈ＡＤＣを添加する。
３．７２〜９６時間インキュベートする（７２時間が標準であるが、０ｕｇ／ｍＬ濃度を監視して細胞が８５〜９５％コンフルエントになったときにアッセイを停止させる）。
４．１００μＬ／ウェルのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を添加し、３分間振盪し、ルミノメーターで読み取る。
実施例１１−ＨＥＲ２を高く発現するトランスジェニック外植マウスにおける腫瘍成長阻害のインビボ効果
トランスジェニック実験に好適な動物は、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）などの標準的な商業的供給源から入手することができる。多くの株が好適であるが、雌性ＦＶＢマウスが、腫瘍形成に対する感受性が高いため、好ましい。雄性ＦＶＢは、交配のために用い、精管切除ＣＤであった。１匹の雄を用いて偽妊娠を促した。精管切除マウスは、任意の市販供給業者から入手することができる。ファウンダーをＦＶＢマウスまたは１２９／ＢＬ６×ＦＶＢ ｐ５３ヘテロ接合性マウスと交配させた。ｐ５３アレルにヘテロ接合性を有するマウスを用いて、腫瘍形成を強く高めた。しかしながら、これは不要であったことがわかった。したがって、一部のＦ１腫瘍は、混合系統のものである。ファウンダーの腫瘍は、ＦＶＢのみである。同腹仔なしで、いくつかが腫瘍を有する６匹のファウンダーを得た。
腫瘍（Ｆｏ５ ｍｍｔｖトランスジェニックマウスから繁殖させた同種移植片）を有する動物を、ＡＤＣの静脈内注射により単回または複数回投与で処置した。注射後の様々な時点で、腫瘍体積を評価した。
腫瘍は、ＨＥＲ２のラット相同体であるｎｅｕの変異活性形態を発現するトランスジェニックマウスにおいて容易に生じるが、ヒト乳癌において過剰発現するＨＥＲ２は変異しておらず、腫瘍形成は、非変異ＨＥＲ２を過剰発現するトランスジェニックマウスでは大幅に低い（Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ５：６９−７６）。
非変異ＨＥＲ２での腫瘍形成を強化するために、上流ＡＴＧコドンでの翻訳の開始を防止するためにそのような上流ＡＴＧを欠失させたＨＥＲ２ ｃＤＮＡプラスミドを用いてトランスジェニックマウスを生成したが、この欠失により、下流のＨＥＲ２の天然の開始コドンからの翻訳開始は、防止されないとしても頻度は減少するであろう（例えば、Ｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２４３３５−２４３４１を参照されたい）。加えて、キメライントロンを５’末端に付加したが、これにより、前述の発現レベルが上昇するはずである（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：６７１３、Ｂｕｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（１９８８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４３９５、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８３６）。キメライントロンは、ＰｒｏｍｅｇａのベクターであるＰｃｉ−ｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（ｂｐ８９０〜１０２２）に由来する。ｃＤＮＡの３’末端には、ヒト成長ホルモンエクソン４及び５、ならびにポリアデニル化配列が隣接している。更に、ＦＶＢマウスを、この株の腫瘍成長に対する感受性が高いという理由で用いた。乳腺における組織特異的ＨＥＲ２発現を確実にするために、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ由来のプロモーターを用いた。腫瘍形成に対する感受性を高めるために、動物にはＡＩＮ ７６Ａ食を与えた（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ４５：１４９−１５８）。
更なる腫瘍種のために同様のインビボモデルを作製し、試験を行うことができる。例えば、ＣＤ３３を発現するモデルを用いて抗ＣＤ３３ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の効力を試験するためのインビボモデルを作製することができる。
実施例１２−リンカー−薬物の不安定性を救済するためのＨＣ−Ａ１４０Ｃの使用
本明細書に考察されるように、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによる）は、リンカー薬物を保持する際の安定性のため（すなわち、リンカー−薬物が、操作ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ位置で抗体に結合したままとなる）、システイン置換の好ましい部位であることがわかった。しかしながら、リンカーがＬＣ−Ｋ１４９Ｃでシステイン操作抗体に結合したままであったが、ある特定の薬物は、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃでシステイン操作抗体に結合すると酵素修飾を受けたことが予想外に発見された。具体的には、リンカーを介してＬＣ−Ｋ１４９Ｃに結合したある特定の薬物が、カルバメート基除去、アセチル除去（すなわち、脱アセチル化）、リン酸除去、糖除去、及びエーテル切断などの酵素修飾を受けたことは、予想外であった。
ＬＣ−Ｋ１４９Ｃでシステイン操作抗体に結合した場合のある特定の薬物（クリプトフィシン、チューブリシンＭ、タキソイド薬物、及びＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体リンカー−薬物中間体を含むがこれらに限定されない）の修飾を観察した後に、表１〜４からの追加の部位（ＨＣ−Ａ１１８Ｃ、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、ＨＣ−Ｓ１２１Ｃ、及びＨＣ−Ａ１４０Ｃ）を試験して、それらの部位が薬物修飾を減少及び／または排除し得るかを確認した。具体的には、リンカーを介してシステイン操作抗体のＬＣ−Ｋ１４９Ｃにコンジュゲートしたときに、クリプトフィシンはアミド切断を受け、チューブリシンはアセチル除去（すなわち、脱アセチル化）を受け、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体リンカー−薬物中間体はカルバメート消失を受け、タキソイドは不安定であり切断を示したことが観察された（図１３を参照されたい）。
ＨＣ−Ａ１４０Ｃが、チューブリシンのアセチル基の保護を提供することが予想外にも発見された（図１４ａ〜１４ｃを参照されたい）。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１４ａ）。新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃがより安定であることも同様に示された。
新たな全血（ＷＢ）アッセイ（本明細書で初述）のため、マウス（ＣＢ１７ ＳＣＩＤ）、ラット（スプラーグドーリー）、カニクイザル及び／またはヒトの全血血漿ならびに緩衝液中の試料を生成した（０時間及び２４時間）。血液はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎにより採取し、次いで一晩冷却輸送され、全血の到着後即座に試料を作成した。安定性試料を作製するために、全ての分子が１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、原料物質の緩衝液（１倍ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１５ＰＰＭ Ｐｒｏｃｌｉｎ）中への初回希釈物を作製した。次いで、１：１０倍希釈（３６ｕＬの１ｍｇ／ｍＬ初回希釈物＋３２４ｕＬの血液若しくは緩衝液）を行って、１００ｕｇ／ｍＬの最終濃度で安定性試料を生成した。混合した後、１５０μＬの全血／緩衝液の安定性試料を、２つの異なる時点で２つの別個のチューブセットにアリコートした。次いで、０時間時点のものを、−８０℃に置いた。
ＨＣ−Ａ１４０Ｃ及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃでのアセチル除去を、３回のＷＢアッセイで確認した。ＨＣ−Ａ１４０Ｃがアセチル除去修飾を回復させることが確認された（図１５）。
ＨＣ−Ａ１４０Ｃが、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体リンカー−薬物中間体のカルバメート基の保護を提供することが予想外にも発見された（図１６ａ〜１６ｃを参照されたい）。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１６ａ）。新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃがより安定であることも同様に示された（図１７）。
ＨＣ−Ａ１４０Ｃが、タキソイド修飾からの保護を提供することもまた、予想外に発見された（図１８ａ〜１８ｃを参照されたい）。具体的には、ＨＣ−Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ−Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１８ａ）。新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ−Ａ１４０Ｃがより安定であること（例えば、タキソイド薬物除去を保護するという点で）も同様に示された（図１９）。
薬物をＬＣ−Ｋ１４９ＣではなくＨＣ−Ａ１４０Ｃに結合させることによって、チューブリシン、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体リンカー−薬物中間体、及びタキソイド薬物に予想外の保護が観察されたのと同様に、ＨＣ−Ａ１４０Ｃはアミド及びエステル切断からクリプトフィシンを保護することも発見された（図２０を参照されたい）。
ＰＤＳ及び／またはマレイミド（すなわち、ｖｃ−）リンカーを用いて抗ＨＥＲ２抗体（特に４Ｄ５）及び／または抗ＣＤ２２抗体に実験を行った。
実施例１３−ＰＤＳリンカーの最も安定な部位の特定
Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｃａｐｔｕｒｅ ＬＣ−ＭＳ Ａｓｓａｙを用いて０時間、４８時間、及び９６時間の血漿安定性試料を分析することによって、ＥＬＩＳＡスクリーニングからの上位の安定な変異形を更に評価した。まず、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で２回洗浄し，次いで、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてヒトｅｒｂ２のビオチニル化細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と混合し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。２時間後に、ＳＡビーズ／ビオチンＥＣＤの複合体をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で２回洗浄し、希釈した血漿安定性試料と混合し、次いで穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。２時間後に、ＳＡビーズ／ビオチンＥＣＤ／試料の複合体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で２回洗浄した後、水で２回洗浄し（Ｏｐｔｉｍａ Ｈ２Ｏ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、最後に１０％アセトニトリルで１回洗浄した。次いで、溶出のためにビーズを３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸に入れ、穏やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートした後、ビーズを回収した。溶出した試料を、次いで、分析のためにＬＣ−ＭＳ（Ｓｙｎａｐｔ−Ｇ２Ｓ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に装填した。
上位の安定なＰＤＳ−ＭＭＡＥ変異形もまた、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎアッセイを用いて評価し、ここで、試料を、水で１００ｕｇ／ｍＬに希釈し、１００ｕＭのシステイン及び１００ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液と１：１混合して、最終濃度５０ｕＭのシステイン及び５０ｍＭの重炭酸アンモニウムにした。次いで、試料を暗所で一晩、室温で１８時間インキュベートした後、６０％アセトニトリル／０．２％ギ酸を同量添加して、反応停止処理を行った。次いで、分析のために試料をＬＣ−ＭＳ（Ｓｙｎａｐｔ−Ｇ２Ｓ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に装填した。
好ましい安定なＰＤＳ−ＭＭＡＥ変異形は表１及び２）に特定されており、更なる安定な変異形は表３及び４に特定されている。具体的には、上位のＰＤＳ−ＭＭＡＥ変異形は、図２１及び実施例２に明示的に特定されている。
実施例１４−−ｖｃ（すなわち、マレイミド）結合のための最も安定な部位の特定
Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｃａｐｔｕｒｅ ＬＣ−ＭＳ Ａｓｓａｙを用いて０時間、４８時間、及び９６時間の血漿安定性試料を分析することによって、ＥＬＩＳＡスクリーニングからの上位の安定な変異形を更に評価した。まず、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で２回洗浄し，次いで、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてヒトｅｒｂ２のビオチニル化細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と混合し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。２時間後に、ＳＡビーズ／ビオチンＥＣＤの複合体をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で２回洗浄し、希釈した血漿安定性試料と混合し、次いで穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。２時間後に、ＳＡビーズ／ビオチンＥＣＤ／試料の複合体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で２回洗浄した後、水で２回洗浄し（Ｏｐｔｉｍａ Ｈ２Ｏ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、最後に１０％アセトニトリルで１回洗浄した。次いで、溶出のためにビーズを３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸に入れ、穏やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートした後、ビーズを回収した。溶出した試料を、次いで、分析のためにＬＣ−ＭＳ（Ｓｙｎａｐｔ−Ｇ２Ｓ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に装填した。
好ましい安定なｖｃ−ＭＭＡＥ変異形は表１及び２）に特定されており、更なる安定な変異形は表３及び４に特定されている。具体的には、上位のｖｃ−ＭＭＡＥ変異形は、図２１及び実施例２に明示的に特定されている。
実施例１５−単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作され得る例示的な抗体
任意の抗体を、単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作することができる。本明細書に記載される方法を用いて単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作されている例示的な抗体としては、以下の抗原に対する抗体が含まれるがこれらに限定されない：ＨＥＲ２、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ１、ＮａＰｉ２ｂ、ＣＤ２２、Ｌｙ６Ｅ、ＣＬＬ−１、Ｂ７Ｈ４、及びＣＤ７９。
システイン操作を受けているある特定の抗ＨＥＲ２抗体としては、４Ｄ５及び７Ｃ２が挙げられる（本明細書の実施例及び図面を参照されたい）。同様に、単一のシステイン変異は、抗ＣＤ３３、抗ＭＵＣ１６、抗ＳＴＥＡＰ１、抗Ｌｙ６Ｅ、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＣＤ２２、及び抗ＣＤ７９ｂ抗体になされている。
単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作されている抗ＭＵＣ１６抗体の例としては、以下の配列を有する抗体が挙げられる：
Figure 2021073176
単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作されている抗ＳＴＥＡＰ１抗体の例としては、以下の配列を有する抗体が挙げられる:
Figure 2021073176
単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作されている抗ＮａＰｉ２ｂ抗体の例としては、以下の配列を有する抗体が挙げられる:
Figure 2021073176
単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作されている抗Ｌｙ６Ｅ抗体の例としては、以下の配列を有する抗体が挙げられる:
Figure 2021073176
Figure 2021073176
単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作されている抗ＣＤ７９ｂ抗体の例としては、以下の配列を有する抗体が挙げられる:
Figure 2021073176
単一のシステイン変異（すなわち、抗体１つ当たり２つのシステイン）を有するように操作されている抗ＣＤ２２抗体の例としては、以下の配列を有する抗体が挙げられる:
Figure 2021073176
ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ変異を有するように操作した上述の抗Ｌｙ６Ｅ抗体に、実験を行った。ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ変異を有するように操作した上述の抗ＮａＰｉ２抗体に、実験を行った。同様に、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ変異を有するように操作した上述の抗ＣＤ２２抗体に、実験を行った。
更に、本明細書に記載される抗ＣＤ２２抗体は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｌ１７４Ｃ変異を有するようにも操作した。
ＨＣ−Ａ１４０Ｃ変異（ＥＵ番号付けによる）を有するように操作した上述の抗ＣＤ２２抗体に、実験を行った。ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ変異（ＥＵ番号付けによる）を有するように操作した上述の抗ＣＤ２２抗体に、実験を行った。
ある特定の抗ＣＬＬ１抗体は、表１または２の好適な部位のうちの１つを含むようにシステイン操作されており、表３及び４に開示される安定な部位のうちの１つで操作され得る。具体的には、抗ＣＬＬ１抗体を、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃシステイン変異を含むようにシステイン操作した。
ある特定の抗Ｂ７Ｈ４抗体は、表１または２の好適な部位のうちの１つを含むようにシステイン操作することができ、表３及び４に開示される安定な部位のうちの１つで操作され得る。
本明細書に記載される実験に加えて、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかを、システイン操作抗体（すなわち、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）が作製されるように、表１または２に記載される好ましい操作システイン部位のうちのいずれかを有するように操作してもよい。更に、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかを、システイン操作抗体（すなわち、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）が作製されるように、表３または４に記載される安定な操作システイン部位のうちのいずれかを有するように操作してもよい。具体的には、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかを、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ（ＥＵ番号付けによる）、またはＨＣ−Ｌ１７４Ｃ（ＥＵ番号付けによる）を有するように操作してもよく、かつＰＤＳまたは−ｖｃリンカーを用いて本明細書に記載される薬物のうちのいずれかにコンジュゲートしてもよい。
実施例１６−例示的なＡＤＣ
本明細書に記載される抗体のうちのいずれかを、薬物を操作子ステイン残基に結合させるリンカーを使用して、本明細書に記載される薬物クラスのいずれかにコンジュゲートすることができる。そのようなＡＤＣの例は、薬物部分をリンカー試薬と結合させ、国際公開第ＷＯ２０１３／０５５９８７号、同第ＷＯ２０１５／０２３３５５号、同第ＷＯ２０１０／００９１２４号、同第ＷＯ２０１５／０９５２２７号に従って、本明細書に記載されるシステイン操作抗体のいずれかとコンジュゲートすることによって調製することができる。
以下の表では次の用語及び略語が使用されている：ＤＡＲ＝薬物／抗体の平均比、Ａ１１８Ｃ（重鎖、ＥＵ番号付け）（ＧＮＥの連続番号付け（図１ｂを参照）による別称Ａ１２１Ｃ、及びＫａｂａｔ番号付けによる別称Ａ１１４Ｃ）、Ｋ１４９Ｃ（軽鎖、Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖野生型（「ＷＴ」）のＡ１４０Ｃ（ＥＵ番号付け）、システイン操作変異抗体（「ｔｈｉｏ」）、軽鎖（「ＬＣ」）、重鎖（「ＨＣ」）、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジル（「ＰＡＢ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢＣ」）、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（「ＣＢＩ」）、ピロロベンゾジアゼピン（「ＰＢＤ」）、及びモノメチルオーリスタチン（「ＭＭＡＥ」）。
追加のそのようなＡＤＣの例としては、以下の表１７に示されるものが含まれるがこれらに限定されない。
表１７．例示的な抗体薬物コンジュゲート番号５１〜６９の構造
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
簡略化のため、上述の構造及びＡＤＣ５１〜６３の構造は、抗体に結合した１つのリンカー−薬物基を示すに過ぎないことに留意されたい。上述のように、１つを上回る薬物−リンカー基が抗体に結合してもよい。
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
作製したＡＤＣの具体的な例は、表１８及び１９に示される。表１８には、作製したＡＤＣの例が示されており、式中、Ｌ−Ｄは、システイン操作部位ＬＣ−Ｋ１４９Ｃで抗体に結合している。表１９には、作製したＡＤＣの例が示されており、式中、Ｌ−Ｄは、システイン操作部位ＨＣ−Ａ１４０Ｃで抗体に結合している。
表１８．作製したＡＤＣの例（Ｌ−Ｄは、システイン操作部位ＬＣ−Ｋ１４９Ｃで抗体に結合している）
Figure 2021073176
Figure 2021073176
Figure 2021073176
表１９．作製したＡＤＣの例（Ｌ−Ｄは、システイン操作部位ＨＣ−Ａ１４０Ｃで抗体に結合している）
Figure 2021073176
表１８及び１９のいずれにおいても、ＤＡＲは、緩衝食塩水中で計算されている。
本発明は、実施例に開示される特定の実施形態によって範囲が制限されるものではなく、これらの実施形態は、本発明のいくつかの態様を例示することを意図するものであり、機能的に同等であるあらゆる実施形態が本発明の範囲内に含まれる。実際に、本明細書に示され説明されているものに加えて、本発明の様々な修正形が当業者には明らかであり、これらの修正形は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
本明細書を通じて引用されている全ての特許、特許出願、及び参考文献は、参照によりその全体が、あらゆる目的で明示的に組み込まれる。

Claims (66)

  1. ＥＵ番号付けによるＴ１１４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ｌ１７４Ｃ、Ｌ１７９Ｃ、Ｔ１８７Ｃ、Ｔ２０９Ｃ、Ｖ２６２Ｃ、Ｇ３７１Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｅ３８２Ｃ、Ｓ４２４Ｃ、Ｎ４３４Ｃ、及びＱ４３８Ｃからなる群から選択される重鎖のシステインアミノ酸、またはＫａｂａｔ番号付けによるＩ１０６Ｃ、Ｒ１０８Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、及びＫ１４９Ｃからなる群から選択される軽鎖のシステインアミノ酸を含む、システイン操作抗体。
  2. 前記システイン操作抗体は、
    Figure 2021073176
  3. 前記重鎖の前記システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＬ１７４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、及びＹ３７３Ｃからなる群から選択される、請求項１または２に記載のシステイン操作抗体。
  4. 前記重鎖の前記システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＡ１４０Ｃである、請求項１または２に記載のシステイン操作抗体。
  5. 前記重鎖の前記システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＬ１７４Ｃである、請求項１または２に記載のシステイン操作抗体。
  6. 前記重鎖の前記システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＹ３７３Ｃである、請求項１または２に記載のシステイン操作抗体。
  7. 前記軽鎖の前記システイン変異は、Ｋ１４９Ｃである、請求項１または２に記載のシステイン操作抗体。
  8. （ｉ）前記システイン操作抗体をコードするように、１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置き換えることによって親抗体の核酸配列に変異生成を行うことと、
    （ｉｉ）前記システイン操作抗体を発現させることと、
    （ｉｉｉ）前記システイン操作抗体を単離することと、を含むプロセスによって調製される、請求項１〜７のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  9. 前記変異生成は、部位指向性変異生成を含む、請求項８に記載のシステイン操作抗体。
  10. 前記システインは、遊離システインであり、前記プロセスは、
    （ｉ）前記システイン操作抗体の前記遊離システインを、チオール反応性親和性試薬と反応させて、前記遊離システインに共有結合した前記親和性試薬を含む、親和性標識化システイン操作抗体を生成することと、
    （ｉｉ）前記親和性標識化システイン操作抗体と捕捉媒体との結合を測定することと、を更に含む、請求項８に記載のシステイン操作抗体。
  11. 前記チオール反応性試薬は、マレイミド部分を含む、請求項１０に記載のシステイン操作抗体。
  12. 前記チオール反応性試薬は、ビオチン部分を含み、前記捕捉媒体は、ストレプトアビジンを含む、請求項１０に記載のシステイン操作抗体。
  13. 前記システイン操作抗体は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体から選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  14. 前記抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである、請求項１〜１３のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  15. 前記システイン操作抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である、請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン抗体。
  16. 前記抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである、請求項１５に記載のシステイン操作抗体。
  17. 前記システイン操作抗体は、抗Ｌｙ６Ｅ抗体である、請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  18. 前記抗Ｌｙ６Ｅ抗体は、
    （ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
    （ｉｉ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１７に記載のシステイン操作抗体。
  19. 前記システイン操作抗体は、抗ＣＤ７９ｂ抗体である、請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  20. 前記抗ＣＤ７９ｂ抗体は、
    （ｉ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、及び配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
    （ｉｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１９に記載のシステイン操作抗体。
  21. 前記システイン操作抗体は、抗ＭＵＣ１６抗体である、請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  22. 前記抗ＭＵＣ１６抗体は、
    （ｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号１５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
    （ｉｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載のシステイン操作抗体。
  23. 前記システイン操作抗体は、抗ＳＴＥＡＰ１抗体である、請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  24. 前記抗ＳＴＥＡＰ１抗体は、
    （ｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
    （ｉｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２３に記載のシステイン操作抗体。
  25. 前記システイン操作抗体は、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体である、請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  26. 前記抗ＳＴＥＡＰ１抗体は、
    （ｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、及び配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
    （ｉｉ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２５に記載のシステイン操作抗体。
  27. 前記システイン操作抗体は、抗ＣＤ２２抗体である、請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  28. 前記抗ＣＤ２２抗体は、
    （ｉ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、及び配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項２５に記載のシステイン操作抗体。
  29. 前記システイン操作抗体は、受容体（１）〜（５３）：
    （１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）、
    （２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、
    （３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、
    （４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）、
    （５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、
    （６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂ、ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、
    （７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、
    （８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、
    （９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、
    （１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）、
    （１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、
    （１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、
    （１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来の成長因子）、
    （１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２）、
    （１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）、
    （１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、
    （１７）ＨＥＲ２、
    （１８）ＮＣＡ、
    （１９）ＭＤＰ、
    （２０）ＩＬ２０Ｒα、
    （２１）ブレビカン、
    （２２）ＥｐｈＢ２Ｒ、
    （２３）ＡＳＬＧ６５９、
    （２４）ＰＳＣＡ、
    （２５）ＧＥＤＡ、
    （２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、
    （２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）、
    （２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）、
    （２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質結合型受容体）、
    （３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原）、
    （３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）、
    （３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）、
    （３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、
    （３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、
    （３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２）、
    （３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）、
    （３７）ＰＭＥＬ１７（ｓｉｌｖｅｒ相同体、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、
    （３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）１）、
    （３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ−１）、
    （４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、
    （４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ相同体２）、
    （４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、
    （４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、
    （４４）ＲＥＴ（ｒｅｔ癌原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、
    （４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、
    （４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、
    （４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、
    （４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、
    （４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、
    （５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、
    （５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、
    （５２）ＣＤ３３、ならびに
    （５３）ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）のうちの１つ以上と結合する、請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  30. 前記抗体は、捕捉標識、検出標識、薬物部分、または固体支持体に共有結合する、請求項１〜２９のいずれかに記載のシステイン操作抗体。
  31. 前記抗体は、ビオチン捕捉標識に共有結合する、請求項３０に記載のシステイン操作抗体。
  32. 前記抗体は、蛍光色素検出標識に共有結合する、請求項３０に記載のシステイン操作抗体。
  33. 前記蛍光色素は、フルオロセイン型、ローダミン型、ダンシル、リサミン、シアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド、及びこれらの類似体から選択される、請求項３０に記載のシステイン操作抗体。
  34. 前記抗体は、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、及び２１３Ｂｉから選択される放射性核種検出標識に共有結合する、請求項３０に記載のシステイン操作抗体。
  35. 前記抗体は、キレートリガンドによって検出標識に共有結合する、請求項３０に記載のシステイン操作抗体。
  36. 前記キレートリガンドは、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ、及びＴＥＴＡから選択される、請求項３５に記載のシステイン操作抗体。
  37. 前記抗体は、薬物部分に共有結合して、式Ｉ
    Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ Ｉ
    を有する抗体−薬物コンジュゲートを形成し、式中、Ａｂが前記抗体であり、Ｌがリンカーであり、Ｄが前記薬物部分であり、ｐが１、２、３、または４であり、前記薬物部分は、請求項１または２に記載の操作システインアミノ酸にコンジュゲートされる、請求項１〜３６に記載のシステイン操作抗体。
  38. Ｌは、６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ（−ｖｃ））、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）、及びｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）から選択される基を含む、請求項３７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  39. Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、４−（２−ピリジルジチオ）酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＢ）、及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）から選択されるリンカー試薬から調製される、請求項３７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  40. マレイミド、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、またはジスルフィドを含むリンカー試薬から調製される、請求項３７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  41. Ｌは、ジスルフィドリンカーを形成する、請求項３７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  42. 前記リンカー試薬は、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）を含む、請求項４０に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  43. Ｌは、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ（−ｖｃ））を含む、請求項３７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  44. 前記薬物部分（Ｄ）は、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン、エンジイン抗生物質、タキサン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体、またはアントラサイクリンである、請求項３７〜４３のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  45. Ｄは、構造：
    Figure 2021073176
    を有するモノメチルオーリスタチン薬物部分ＭＭＡＥであり、式中、波線は前記リンカーへの前記共有結合部位を示す、請求項４４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  46. 前記抗体−薬物コンジュゲートは、構造：
    Figure 2021073176
    から選択され、式中、Ｖａｌはバリンであり、Ｃｉｔはシトルリンであり、ｐは、１、２、３、または４である、請求項４４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  47. Ｄは、構造：
    Figure 2021073176
    を有するＰＢＤ二量体薬物、ならびにその塩及び溶媒和物であり、
    波線は、リンカーへの共有結合部分を示し、
    点線は、Ｃ１とＣ２またはＣ２とＣ３の間の二重結合の任意の存在を示し、
    Ｒ２は、独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、及びＣＯＲから選択され、任意にハロまたはジヒドロから更に選択され、式中、ＲＤ は、独立して、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、及びハロから選択され、
    Ｒ６及びＲ９は、独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、及びハロから選択され、
    Ｒ７は、独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、及びハロから選択され、
    Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、及びＮＨから選択され、
    Ｒ１１は、Ｈ若しくはＲであるか、またはＱがＯである場合にはＳＯ３Ｍであるかのいずれかであり、式中、Ｍは金属カチオンであり、
    Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−８アルキル、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクリル、Ｃ３−２０複素環、及びＣ５−２０アリール基から選択され、任意に基ＮＲＲ’との関連で、Ｒ及びＲ’は、それらが結合する窒素と一緒に、任意に置換された４、５、６、または７員の複素環式環を形成し、
    Ｒ１２、Ｒ１６、Ｒ１９、及びＲ１７は、それぞれＲ２、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ７に関して定義される通りであり、
    Ｒ″は、Ｃ３−１２アルキレン基であり、その鎖は、１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、及び／または芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって分断されてもよく、これらの環は、任意に置換されており、
    Ｘ及びＸ’は、独立して、Ｏ、Ｓ、及びＮ（Ｈ）から選択される、請求項４４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  48. 前記ＰＢＤ二量体の構造は、
    Figure 2021073176
    であり、その塩及び溶媒和物が含まれ、波線は、前記リンカーへの前記共有結合部位を示し、ＯＨに繋がった波線は、ＳまたはＲ立体配置を示し、ＲＶ１及びＲＶ２は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、及びフェニル（このフェニルは、特に４位においてフルオロで任意に置換されてもよい）、ならびにＣ５−６ヘテロシクリルから選択され、ＲＶ１及びＲＶ２ は、同じかまたは異なってもよく、ｎは、０または１である、請求項４７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  49. Figure 2021073176
    から選択される、請求項４７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  50. Ｄは、構造：
    Figure 2021073176
    を有するＣＢＩ二量体であり、式中、
    Ｒ１は、Ｈ、Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、またはリンカー（Ｌ）への結合から選択され、
    Ｒ２は、Ｈ、Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、またはリンカー（Ｌ）への結合から選択され、
    Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ、及び１つ以上の抗体Ｆで任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択されるか、またはＲａ及びＲｂ は、５若しくは６員のヘテロシクリル基を形成し、
    Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン、Ｙ、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）、（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）、及び（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）から選択される、連結基であり、
    式中、Ｙは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから選択され、
    アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、かつ任意に、Ｆ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２、及びＣ１−Ｃ６アルキルで置換され、アルキルは、１つ以上のＦで任意に置換されるか、
    またはアルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、かつ任意に、Ｌへの結合で置換され、
    Ｄ’は、
    Figure 2021073176
    から選択される薬物部分であり、式中、波線は、Ｔへの結合部位を示し、
    Ｘ１及びＸ２は、独立して、Ｏ及びＮＲ３から選択され、Ｒ３は、Ｈ、及び１つ以上の任意Ｆで任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され、
    Ｒ４は、Ｈ、ＣＯ２Ｒ、またはリンカー（Ｌ）への結合であり、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジルであり、
    Ｒ５は、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項４４に記載のシステイン操作抗体。
  51. Figure 2021073176
    Figure 2021073176
    Figure 2021073176
    から選択される、請求項５０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  52. システイン操作抗体（Ａｂ）の少なくとも１つのシステインを、リンカー−薬物中間体と反応させて、式Ｉを有する抗体−薬物コンジュゲートを形成することを含み、
    Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ Ｉ
    式中、Ａｂは、請求項１〜５０のいずれかに記載のシステイン操作抗体であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物部分であり、ｐは１、２、３、または４であり、前記システイン操作抗体は、１つ以上のシステインアミノ酸を含む、抗体−薬物コンジュゲートの調製方法。
  53. 前記システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ−Ａ１４０Ｃ、及びＨＣ−Ｙ３７３Ｃからなる群から選択される、請求項５２に記載の抗体−薬物コンジュゲートの調製方法。
  54. 前記システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ１４０Ｃである、請求項５２に記載の抗体−薬物コンジュゲートの調製方法。
  55. 前記システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ｌ１７４Ｃである、請求項５２に記載の抗体−薬物コンジュゲートの調製方法。
  56. 前記システイン変異は、ＥＵ番号付けによるＨＣ−Ａ３７３Ｃである、請求項５２に記載の抗体−薬物コンジュゲートの調製方法。
  57. 前記システイン変異は、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃである、請求項５２に記載の抗体−薬物コンジュゲートの調製方法。
  58. 前記システイン操作抗体は、ＥＵ番号付けによるＡ１４０Ｃの重鎖変異を有し、Ｌは、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）を含み、Ｄは、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体、クリプトフィシン、タキソイド、及びチューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）Ｍからなる群から選択される、請求項３７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  59. 前記システイン操作抗体は、ＥＵ番号付けによるＡ１４０Ｃの重鎖変異を有し、Ｌは、−ｖｃリンカーを含み、Ｄは、ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体、クリプトフィシン、タキソイド、及びチューブリシンＭからなる群から選択される、請求項３７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  60. Ｄは、前記ＣＢＩ−ＰＢＤヘテロ二量体：
    Figure 2021073176
    である、請求項５９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  61. 前記システイン操作抗体は、ＥＵ番号付けによるＲ１４２Ｃ及びＫ１４９Ｃからなる群から選択される軽鎖変異を有し、Ｌは、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）を含む、請求項３７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  62. 前記システイン操作抗体は、ＥＵ番号付けによるＡ１４０Ｃ、Ｌ１７４Ｃ、Ｌ１７９Ｃ、Ｇ３７１Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、及びＳ４２４Ｃからなる群から選択される重鎖変異を有し、Ｌは、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）を含む、請求項３７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  63. 前記システイン操作抗体は、ＥＵ番号付けによるＬ１０６Ｃ及びＲ１０８Ｃからなる群から選択される軽鎖変異を有し、Ｌは−ｖｃリンカーである、請求項３７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  64. 前記システイン操作抗体は、ＥＵ番号付けによるＴ１１４Ｃ、Ｔ１８７Ｃ、Ｔ２０９Ｃ、Ｖ２６２Ｃ、Ｇ３７１Ｃ、Ｅ３８２Ｃ、及びＮ４３４Ｃからなる群から選択される重鎖変異を有し、Ｌは−ｖｃリンカーである、請求項３７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  65. 前記抗体薬物コンジュゲートは、表１８または表１９に列挙される抗体薬物コンジュゲートのうちの１つから選択される、抗体薬物コンジュゲート。
  66. 請求項１〜６５のいずれかに記載のシステイン操作抗体または抗体薬物コンジュゲートを含む、薬学的組成物。
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