RU2648146C2 - Укороченные варианты cd95-f-c - Google Patents
Укороченные варианты cd95-f-c Download PDFInfo
- Publication number
- RU2648146C2 RU2648146C2 RU2015105330A RU2015105330A RU2648146C2 RU 2648146 C2 RU2648146 C2 RU 2648146C2 RU 2015105330 A RU2015105330 A RU 2015105330A RU 2015105330 A RU2015105330 A RU 2015105330A RU 2648146 C2 RU2648146 C2 RU 2648146C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- domain
- chimeric protein
- chimeric
- apg101
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 125
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 38
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 78
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 19
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 18
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 238000011100 viral filtration Methods 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 6
- 238000010923 batch production Methods 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 125000000129 anionic group Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract 1
- 229950004993 asunercept Drugs 0.000 description 87
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 45
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 34
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 34
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 34
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 230000008569 process Effects 0.000 description 33
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 12
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 5
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 5
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 4
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 description 4
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015212 Fas Ligand Protein Human genes 0.000 description 3
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 3
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 3
- -1 lactyl Chemical group 0.000 description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- GZDRODOYEFEHGG-NUDCOPPTSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-acetamido-3-carboxypropanoyl]amino]-5-[[(2s)-1-[[(2s)-3-carboxy-1-oxo-1-[[2-oxo-4-(trifluoromethyl)chromen-7-yl]amino]propan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound FC(F)(F)C1=CC(=O)OC2=CC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(C)=O)C(C)C)=CC=C21 GZDRODOYEFEHGG-NUDCOPPTSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 2
- 229940079889 pyrrolidonecarboxylic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical class N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 1
- 101100186130 Arabidopsis thaliana NAC052 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012571 GlutaMAX medium Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 101100052669 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) N118 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012915 ThermoFluor method Methods 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004378 air conditioning Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HZVVJJIYJKGMFL-UHFFFAOYSA-N almasilate Chemical compound O.[Mg+2].[Al+3].[Al+3].O[Si](O)=O.O[Si](O)=O HZVVJJIYJKGMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000001609 comparable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000350 glycoloyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 230000006095 glypiation Effects 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006122 isoprenylation Effects 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960003552 other antineoplastic agent in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hematology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам домена CD95, и может быть использовано для ингибирования сигнального пути CD95. Получен химерный белок, содержащий функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95, непосредственно сшитого с Fc-доменом, где функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95 расположен на N-конце Fc-домена или его функционального фрагмента, и где химерный белок лишен дополнительной N-концевой последовательности. Изобретение позволяет получить химерный белок CD95 в стабильной форме и эффективно ингибировать сигнальный путь CD95. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 2 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к выделенному химерному белку, содержащему внеклеточный домен CD95 или его функциональный фрагмент и Fc-домен или его функциональный фрагмент, к композициям, обеспечивающим такой химерный белок в стабильной форме, а также к способу получения такого химерного белка.
Химерные белки, содержащие внеклеточный домен рецептора смерти CD95 (Аро-1; Fas), сшитый с иммуноглобулиновым Fc-доменом, описаны в РСТ/ЕР04/03239. Однако оказалось, что трудно обеспечить такие химерные белки в достаточном количестве с достаточной стабильностью.
С помощью настоящего изобретения в первый раз стало возможно обеспечение таких композиций и способов.
Согласно первому аспекту изобретение относится к композиции, содержащей смесь изоформ химерного белка, причем каждый химерный белок содержит по меньшей меревнеклеточный домен CD95 (АРО-1; Fas) или его функциональный фрагмент и по меньшей меревторой домен, представляющий собой Fc-домен или его функциональный фрагмент, распределенные в интервале pI от около 4 до около 8,5. Соответственно, внеклеточный домен CD95 при использовании в данном документе может также называться «первый домен», в то время как Fc-домен может называться «второй домен».
Первый белковый домен представляет собой внеклеточный домен CD95, предпочтительно внеклеточный домен млекопитающих, конкретно человеческий белок, т.е. человеческий внеклеточный домен CD95. Первый домен, т.е., внеклеточный домен CD95, химерного белка предпочтительно содержит аминокислотную последовательность до аминокислот 170, 171, 172 или 173 человеческого CD95 (SEQ ID NO. 1). Сигнальный пептид (например, положение 1-25 SEQ ID NO: 1) может или присутствовать или отсутствовать.
Конкретно для терапевтических целей использование человеческого белка является предпочтительным.
Химерный белок может включать один или несколько первых доменов, которые могут быть одинаковыми или отличными. Однако один первый домен, содержащий один внеклеточный домен CD95, является предпочтительным.
Согласно предпочтительному воплощению Fc-домен или его функциональный фрагмент, т.е. второй домен химерного белка согласно изобретению содержит СН2- и/или СН3-домен и необязательно по меньшей мере часть шарнирного участка, домен или модифицированный иммуноглоулиновый домен, выделенный из него.
Иммуноглобулиновый домен может представлять собой домен иммуноглобулина IgG, IgM, IgD или IgE или модифицированный иммуноглобулиновый домен, выделенный из них. Предпочтительно, если второй домен содержит по меньшей меречасть константного домена иммуноглобулина IgG. Домен иммуноглобулина IgG может быть выбран из доменов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или из их модифицированных доменов. Предпочтительно, второй домен представляет собой человеческий Fc-домен, такой как IgG Fc-домен, например, человеческий IgGl Fc-домен.
Химерный белок может включать один или несколько вторых доменов, которые могут быть одинаковыми или отличными. Однако один второй домен является предпочтительным, т.е. химерный белок, содержащий один Fc-домен.
Кроме того, предпочтительно, если первый и второй домены будут из одного вида.
Первый домен, т.е. внеклеточный домен CD95 или его функциональный фрагмент может быть локализован на N- или С-конце. Второй домен, т.е. Fc-домен или функциональный фрагмент также может быть локализован на С- или N-конце химерного белка. Однако внеклеточный домен CD95 на N-конце химерного белка является предпочтительным.
Согласно следующему предпочтительному воплощению химерный белок представляет собой APG101 (CD95-Fc, положение 26-400 в SEQ ID NO: 1). Как определено SEQ ID NO: 1 APG101 может быть химерным белком, содержащим человеческий внеклеточный домен CD95 (аминокислоты 26-172) и человеческий IgG1 Fc-домен (аминокислоты 172-400), необязательно дополнительно содержащим N-концевую сигнальную последовательность (например, аминокислоты 1-25 SEQ ID NO: 1). Присутствие сигнального пептида указывает на незрелую форму APG101. В процессе созревания сигнальный пептид отщепляется. Согласно особенно предпочтительному воплощению сигнальная последовательность отщепляется. APG101 с сигнальной последовательностью также охвачен термином «немодифицированный APG101». В следующем воплощении химерный белок представляет собой полипептид, имеющий по меньшей мере70% идентичности, более предпочтительно, 75% идентичности, 80% идентичности, 85% идентичности, 90% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности, 99% идентичности с APG101. Согласно настоящему применению термин «идентичность» относится к степени, при которой две аминокислотные последовательности являются инвариантными, другими словами, имеют одинаковые аминокислоты в одном и том же положении.
Термин «APG101» описывает химерный белок положения 26-400 SEQ ID NO: 1, содержащий или нет сигнальный пептид. Термин «APG101» также включает химерные белки, содержащие укороченные по N-концу формы внеклеточного домена CD95.
В другом предпочтительном воплощении химерный белок согласно изобретению представляет собой функциональный фрагмент APG101. При использовании в данном документе, термин «фрагмент», как правило, обозначает «функциональный фрагмент», т.е. фрагмент или часть белка дикого типа или полноразмерного белка, который имеет по существу такую же биологическую активность и/или свойства как у соответствующего белка дикого типа или полноразмерного белка.
Специалистам в данной области известны способы конструирования и получения химерных белков согласно настоящему изобретению. Смесь изоформ химерных белков, конкретно изоформ APG101, однако, получают способом, описанным в данном документе ниже. Такие способы описаны, например, в PCT/EP04/03239. Согласно предпочтительному воплощению конструкция химерного белка по настоящему изобретению включает селекцию концевой аминокислоты (аминокислот) первого домена и второго домена с целью создания по меньшей мере одного аминокислотного перекрывания между двумя доменами. Перекрывание между первым и вторым доменом или между двумя первыми доменами имеет длину предпочтительно 1, 2 или 3 аминокислоты. Более предпочтительно, перекрывание имеет длину в одну аминокислоту. Примеры перекрывающихся аминокислот представляют собой S, Е, К, Н, Т, Р и D.
Композиция согласно изобретению содержит смесь белковых изоформ. Термин «изоформа» при использовании в данном документе обозначает различные формы одного и того же белка, такие как различные формы APG101, конкретно APG101 без сигнальной последовательности. Такие изоформы могут отличаться, например, по длине белка, по аминокислотам, т.е. по замене или делеции и/или по посттрансляционной модификации при сравнении с соответствующим немодифицированным белком, т.е. с белком, который транслируется и экспрессируется из данной кодирующей последовательности без какой-либо модификации. Различные изоформы могут быть различены, например, с помощью электрофореза, такого как SDS-электрофорез, и/или изоэлектрическое фокусирование, которое предпочтительно согласно настоящему изобретению.
Изоформы, отличающиеся по длине белка, могут быть, например, удлиненными с N-конца и/или С-конца и/или укорочены по сравнению с соответствующим немодифицированным белком. Например, смесь изоформ APG101 согласно изобретению может включать APG101 в немодифицированной форме, а также его варианты, удлиненные и/или укороченные с N-конца и/или С-конца.
Таким образом, согласно предпочтительному воплощению смесь по изобретению содержит варианты APG101, укороченные с N-конца и/или с С-конца.
Таким образом, согласно предпочтительному воплощению смесь по изобретению содержит варианты APG101, укороченные с N-конца и/или с С-конца.
В частности предпочтительна смесь изоформ химерных белков, содержащая химерные белки, укороченные с N-конца.
Укороченные химерные белки могут включать последовательность SEQ ID NO: 1, укороченную с N-конца на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 и/или 50 аминокислот. Предпочтительные укороченные химерные белки имею последовательность SEQ ID NO: 1, укороченную с N-конца на 16,20 или 25 аминокислот.
Такие химерные белки, укороченные с N-конца, также могут быть обозначены в рамках настоящего изобретения и включают укороченные с N-конца варианты немодифицированного APG101, -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -35, -40, -45 и/или -50. Конкретно предпочтительными являются укороченные с N-конца варианты -17, -21 и/или -26. Нумерация относится к белку APG101, содержащему сигнальную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, где номер относится к первой аминокислоте в APG101, укорачиваемом с N-конца.
Это означает, что укороченный химерный белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1, укороченную с N-конца на 16 аминокислот, соответствует варианту APG101, обозначенному -17, который приводит к получению белка, содержащего аминокислоты 17-400 SEQ ID NO: 1, укороченный с N-конца на 20 аминокислот (аминокислоты 21-400 SEQ ID NO: 1) соответствует -21 и укороченный с N-конца на 25 аминокислот соответствует -26 (аминокислоты 26-400 SEQ ID NO: 1).
Пример для С-концевого укорачивания изоформ APG101 представляет собой С-концевое Lys-обрезание.
Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения смесь химерных белков композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит 50 моль % немодифицированного APG101 по отношению к модифицированным изоформам, более предпочтительно 40 мол. % немодифицированного APG101, более предпочтительно 30 мол. % немодифицированного APG101, более предпочтительно 20 мол. % немодифицированного APG101, более предпочтительно 10 мол. % немодифицированного APG101, более предпочтительно 5 мол. % немодифицированного APG101 и еще более предпочтительно 3 мол. % немодифицированного APG101 и наиболее более предпочтительно 1 мол. % и/или менее немодифицированного APG101. Наиболее предпочтительно воплощение, представляющее собой смесь химерных белков, которые не включают немодифицированный APG101.
Как указано выше, изоформы также могут отличаться аминокислотной заменой, аминокислотной делецией и/или вставкой аминокислот. Такая замена и/или деления может включать одну или несколько аминокислот.Однако замена единственной аминокислоты предпочтительна согласно данному воплощению.
Изоформы согласно изобретению также могут отличаться по части посттрансляционной модификации. Посттрансляционная модификация согласно настоящему изобретению может включать, в частности, добавление гидрофобных групп, конкретно для мембранной локализации, как, например, с использованием миристилирования, пальмитилирования, изопренилирования или глипирования (glypiation), добавление кофакторов для повышенной ферментной активности, как, например, с использованием лиопоилирования, добавление более мелких химических групп, например, с помощью ацилирования, формилирования, алкилирования, метилирования, амидирования по С-концу, добавления аминокислоты, γ-карбоксилирования, гликозилирования, гидроксилирования, окисления, глицилирования, биотинилирования и/или ПЭГилирования.
Согласно настоящему изобретению добавление сиаловых кислот, гликозилирование на основе Fc, конкретно N-концевое гликозилирование на основе Fc, и/или Пиро-Глу-модификация представляют собой предпочтительные воплощения посттрансляционной модификации.
Согласно предпочтительному воплощению химерные белки, содержащиеся в композиции по изобретению, включают высокие количества сиаловых кислот. Согласно настоящему изобретению содержание сиаловой кислоты составляет предпочтительно от около 4 до 7 моль NeuAc/моль APG101, более предпочтительно от 4,5 до 6 моль NeuAc/моль APG101 и наиболее предпочтительно около 5 моль NeuAc/моль APG101. При использовании в данном документе сиаловые кислоты относятся к N- или О-замещенным производным нейраминовой кислоты. Предпочтительная сиаловая кислота представляет собой N-ацетилейраминовую кислоту (NeuAc). Аминогруппа, как правило, несет или ацетильную, или гликолильную группу, но другие модификации также описаны. Гидроксильные заместители могут варьировать в значительной степени. Предпочтительные гидроксильные заместители представляют собой ацетильную группу, лактильную, метильную, сульфатную и/или фосфатную группу. Добавление сиаловой кислоты, как правило, приводит к получению более анионных белков. Результирующий отрицательный заряд придает данной модификации способность изменять поверхностный заряд и способность связывания. Большие количества сиаловой кислоты приводят к лучшей стабильности в сыворотке и, таким образом, к улучшенной фармакокинетике и к более низкой иммуногенности. Высокая степень сиалирования изоформ APG101 по настоящему изобретению может объясняться большим количеством двухантенальных структур. Следует рассматривать как очень удивительный факт тот, что изоформы APG101 в композиции изобретения, полученные с помощью способа по изобретению, демонстрируют такую высокую степень добавления сиаловой кислоты.
Согласно настоящему изобретению гликозилирование означает реакцию, в которой углевод присоединяется к функциональной группе химерного белка, его функциональному фрагменту, как определено в данном документе. Конкретно, это относится к добавлению углевода к APG101 или к его изоформе. Углевод может быть добавлен, например, с помощью N-связывания или О-связывания. N-связанные углеводы присоединяются к азоту боковых цепей аспарагина или аргинина. О-связанные углеводы присоединяются к кислороду гидроксильной группы серина, треонина, тирозина, боковых цепей гидроксилизина или гидроксипролина. Согласно настоящему изобретению N-связывание, конкретно, основанное на Fc N-концевое гликозилирование является предпочтительным. Особенно предпочтительные N-связанные сайты гликозилирования локализованы в положениях N118, N136 и/или N250 APG101 (SEQ ID NO: 1).
Фукозилирование согласно настоящему изобретению относится к добавлению фукозных сахарных единиц к молекуле. Что касается настоящего изобретения, то такое добавление фукозной сахарной единицы к химерному белку и конкретно к APG101 представляет собой особенно предпочтительный тип гликозилирования. Высокая доля фукозилированных форм приводит к пониженной антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Таким образом, смесь изоформ химерных белков характеризуется пониженной ADCC, что полезно для фармацевтических и диагностических применений.
Несмотря на то, что первый и второй домен определены в данном документе, химерные белки согласно изобретению могут включать дополнительные домены, такие как дополнительные домены для нацеливания, например, одноцепочечные антитела или их фрагменты и/или сигнальные домены. Согласно следующему воплощению химерный белок, применяемый согласно изобретению, может включать N-концевую сигнальную последовательность, которая определяет возможность секреции из клетки-хозяина после рекомбинантной экспрессии. Сигнальная последовательность может представлять собой сигнальную последовательность, которая гомологична первому домену химерного белка. В ином случае сигнальная последовательность также может быть гетерологичной сигнальной последовательностью. В другом воплощении химерный белок не содержит добавленную N-концевую последовательность, такую как сигнальный пептид.
Композиция согласно настоящему изобретению может включать блокированные по N-концу химерные белки, которые обеспечивают более высокую стабильность в отношении N-концевой деградации протеазами, а также химерные белки, содержащие свободный N-конец, который обеспечивает более высокую стабильность в отношении N-концевой деградации протеазами.
Модификации, блокирующие N-конец белка, известны специалистам в данной области. Однако предпочтительная посттрансляционная модификация согласно настоящему изобретению, блокирующая N-конец, представляет собой Пиро-Глу-модификацию. Пиро-Глу также называют пирролидон карбоновой кислотной. Пиро-Глу-модификация согласно настоящему изобретению относится к модификации N-концевого глутамина путем циклизации глутамина посредством конденсации α-аминогруппы с карбоксильной группой боковой цепи. Модифицированные белки демонстрируют увеличенный период полужизни. Такая модификация также может осуществляться в остатке глутамата. Особенно предпочтительной модификацией является Пиро-Глу-модификация, т.е. пирролидон карбоновая кислота в отношении укороченного белка -26 с N-конца.
В предпочтительном воплощении настоящего применения композиция согласно настоящему изобретению содержит 80-99 мол. % блокированных по N-концу химерных белков и/или 1-20 мол. % химерных белков, содержащих свободный N-конец.
Согласно следующему предпочтительному воплощению композиция содержит 0-5 мол. %, более предпочтительно 0-3 мол. % и еще более предпочтительно 0-1 мол. %, высокомолекулярных форм химерного белка, таких как агрегаты. В предпочтительном воплощении композиция согласно настоящему изобретению не содержит никаких агрегатов изоформ химерного белка, конкретно никаких димеров или агрегатов APG101. Димеры или агрегаты, как правило, нежелательны, так как они оказывают негативное влияние на растворимость.
Функциональная форма APG101 включает два химерных белка, как описано в данном документе, связанных дисульфидными мостиками в шарнирном участке в положениях 179 и/или 182 относительно SEQ ID NO: 1 двух молекул (см. Фигура 7). Дисульфидный мостик также может быть образован в двух молекулах в положении 173 относительно SEQ ID NO: 1, что приводит к повышенной стабильности. Если дисульфидный мостик в положении 173 относительно SEQ ID NO: 1 не требуется, остаток Cys в данном положении может быть замещен другой аминокислотой или может быть удален.
В предпочтительном воплощении смесь согласно изобретению обеспечивается с помощью способа согласно настоящему изобретению, описанному в данном документе.
Согласно изобретению смесь изоформ химерных белков распределена в интервале от около 4 до около 8,5. В следующем воплощении интервал pI смеси изоформ химерных белков, включенных в композицию согласно изобретению, составляет от около 4,5 до около 7,8, более предпочтительно от около 5 до около 7,5.
Изоэлектрическая точка (pi) определяется значением рН, при котором конкретная молекула или поверхность не несет электрического заряда. В зависимости от интервала рН окружающей среды аминокислоты белка могут нести различные положительные или отрицательные заряды. Сумма всех зарядов белка равна нулю в определенном интервале рН, в его изоэлектрической точке, т.е. в его значении pI. Если белковая молекула в электрическом поле достигает точки среды, имеющей данное рН, то его электрофоретическая подвижность ослабевает и она остается в данном месте. Специалисту в данной области знакомы способы определения значения pI данного белка, такие как изоэлектрическое фокусирование. Метод имеет исключительно высокое разрешение. Белки, отличающиеся на один заряд, могут быть разделены и/или фракционированы.
Композиция согласно настоящему изобретению, описанная в данном документе, может использоваться для фармацевтических, диагностических и/или исследовательских применений. Она может применяться в области медицины людей, а также в ветеринарной медицине.
Другой аспект настоящего изобретения относится к составу, содержащему композицию согласно изобретению.
Согласно предпочтительному воплощению состав содержит
(a) фосфат, предпочтительно от около 20 мМ до около 100 мМ фосфата, более предпочтительно от около 30 мМ до около 70 мМ фосфата, еще более предпочтительно от около 40 мМ до около 60 мМ фосфата, наиболее предпочтительно от около 50 мМ фосфата,
(b) агент, усиливающий вязкость, предпочтительно около 0,1-10 масс. % агента, усиливающего вязкость, более предпочтительно 1-8 масс. % агента, усиливающего вязкость, более предпочтительно от около 3 масс. % до около 7 масс. % агента, усиливающего вязкость, еще более предпочтительно от около 6 масс. % до около 7 масс. % агента, усиливающего вязкость, и наиболее предпочтительно около 5 масс. % агента, усиливающего вязкость, и
(c) имеет значение рН в интервале 4-8.
Агенты, усиливающие вязкость, хорошо известны специалисту в данной области и включают альгиновую кислоту, карбоксиметилцеллюлозу, декстрин, желатин, гуаровую камедь, гидроксиэтилцеллюлозу, алюмосиликат магния, поливиниловый спирт, полиэтиленоксид, диоксид кремния, крахмал, ксантановую камедь и т.д. Однако агент, усиливающий вязкость, который особенно предпочтителен согласно настоящему изобретению, является сорбитом.
Неожиданно оказалось, что композиция по изобретению, предлагаемая в данном типе состава, является очень стабильной и не имеет тенденции к образованию агрегатов. Кроме того, возможно обеспечить высокую концентрацию белка, например, около 20 мг/мл в стабильной форме.
Композиция и состав согласно изобретению может вводиться нуждающемуся в этом объекту, конкретно, пациенту-человеку в дозе, достаточной для лечения определенных патологических состояний с помощью подходящих средств. Например, композиция и/или состав согласно изобретению может быть составлена в виде фармацевтической композиции вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или адъювантами. Терапевтическая эффективность и токсичность может определяться согласно стандартным протоколам. Фармацевтическая композиция может вводиться системно, например, внутрибрюшинно, внутримышечно или внутривенно, или локально, как например, внутриназально, подкожно или внутриболочечно. Доза композиции и/или состава, которая будет вводиться, конечно будет зависеть от объекта, подвергаемого лечению и от патологического состояния объекта, таких как вес объекта, возраст объекта и тип и тяжесть заболевания или нарушения, подвергаемого лечению, способа введения и предписания врача. Например, суточная доза 0,001-100 мг/кг является подходящей.
Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции или составу, содержащему композицию или состав согласно изобретению, которые содержат по меньшей мере один активный дополнительный агент. Этот дополнительный активный агент используется в зависимости от симптома, подвергаемого лечению. Например, цитотоксические агенты, такие как доксорубицин, цисплатин или карбоплатин, цитокины или другие антинеопластические агенты, могут использоваться в лечении злокачественного новообразования.
Состав и/или композиция согласно изобретению могут дополнительно включать фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или адъюванты. Термин «носитель» при использовании в данном документе, включает носители, вспомогательные вещества и/или стабилизаторы, которые не токсичны по отношению к клетке или к млекопитающему, экспонированному их воздействию при применяемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемые носители представлены в водных растворах, содержащих буфер с определенным рН или в липосомах. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфат, цитрат и органические кислоты (однако по отношению к составу по настоящему изобретению фосфатный буфер является предпочтительным); антиоксиданты, содержащие аскорбиновую кислоту, низкомолекулярные (менее чем 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, содержащие глюкозу, маннозу или декстрины, желирующие агенты, такие как EDTA, сахар, спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно активные вещества, такие как TWEEN, полиэтилен или полиэтиленгликоль.
Согласно предпочтительному воплощению композиция и/или состав согласно изобретению может использоваться для ингибирования сигнального пути CD95, конкретно, внешнего апоптотического пути, запускаемого CD95L, т.е. лигандом рецептора CD95. Конкретно, композиция может использоваться в профилактике и/или в лечении расстройств, выбранных из аутоиммунных расстройств, ВИЧ, сердечных расстройств, например инфаркта миокарда, расстройств трансплантат-против-хозяина, отторжения трансплантата, нарушений мозга, например инсульта, поражений спинного мозга, сепсиса, гепатита, расстройств, ассоциированных с воспалением, ишемического реперфузионного повреждения и почечных расстройств. Конечно, композиция и/или состав, описанный в данном документе, может использоваться для лечения злокачественных новообразований, предпочтительно солидных злокачественных опухолей, например, злокачественных новообразований мозга, например, глиобластомы. В ином случае, злокачественное новообразование, подвергаемое лечению, может представлять собой злокачественное новообразование, имеющее лимфоидное или миелоидное происхождение.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения композиции согласно изобретению. Согласно предпочтительному воплощению способ включает стадии:
(a) продуцирования композиции, предлагаемой настоящим изобретением, с помощью периодического процесса с добавлением субстрата, обеспечивающего получение культуры клеток, и
(b) выделения композиции по настоящему изобретению из культуры клеток.
Другое преимущество способа по настоящему изобретению по сравнению со способами, известными в данной области, представляет собой его высокий выход.
Стадия (а), т.е. «способ получения композиции согласно настоящему изобретению с помощью периодического процесса с добавлением субстрата, обеспечивающего получение культуры клеток» также будет обозначаться далее как «начальный процесс (USP)». Способ согласно стадии (а) настоящего изобретения также обозначается как «USP по изобретению». На Фигуре 1 представлена композиция начального процесса согласно данным, известным в данной области, и предпочтительное воплощение начального процесса настоящего изобретения.
Стадия (b), т.е. «выделение композиции по настоящему изобретению из культуры клеток» также будет обозначаться далее как «процесс последующей обработки (DSP)».
Предпочтительно, если стадия (а) включает серии стадий культивирования данного базового клеточного бульона до тех пор, пока не будут достигнуты соответствующие параметры культуры, с последующей седиментацией клеток и фильтрацией надосадочной жидкости, содержащей химерный белок. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения стадии способа начального процесса могут суммироваться как серии, включающие следующие стадии.
Оттаивание,
субкультивирование,
50 л биореактор,
200 л биореактор,
1000 л биореактор,
осаждение,
глубинная фильтрация и
0,2 μм фильтрация.
Конечно, проведение стадий культивирования от субкультивирования до 1000 л биореактора представляет собой только один из путей осуществления изобретения. Например, стадии культивирования могут также проводиться в биореакторах с варьирующимися размерами. Конечно, во время серий стадий субкультивирования специалист в данной области может определить подходящие параметры типа температуры, времени роста, среды и т.д. Критическим фактором является достижение соответствующих параметров клеточной культуры, которые могут представлять собой титр, клеточную плотность, причем титр предпочтительно находится в интервале 0,5 г/л -5 г/л, более предпочтительно 1 г/л - 3 г/л, более предпочтительно 1,5 г/л - 5 г/л и наиболее предпочтительно 1,8 г/л - 2 г/л. Примеры предпочтительных значений клеточной плотности оставляют от около 1×106 до 1×108 клеток/мл, предпочтительно около 1×107 клеток/мл. В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения титр составляет от около 1,8 г/л до около 2 г/л, и клеточная плотность составляет около 1×107 клеток/мл.
Способ согласно настоящему изобретению предпочтительно проводят в пептон-содержащей базальной среде и в среде с определенным химическим составом.
Стадия (b) может включать захватывающую хроматографию, вирусную инактивацию, серии анионной и/или катионной хроматографии, вирусную фильтрацию и/или доведение до конечной искомой концентрации белка.
Процесс последующей обработки предусматривает очистку композиции, содержащей изоформы APG101, полученные с помощью стадии (а) согласно стадии (b), определенной выше, и включает стадии хроматографии, стадию вирусной инактивации, стадию ультрафильтрации, стадию диафильтрации и стадию вирусной фильтрации. Согласно предпочтительному воплощению данный процесс последующей обработки включает три различные хроматографические стадии. Первую хроматографическую стадию проводят со смолой для захвата белка-мишени и/или для удаления ассоциированных с процессом примесей (например, НСР, ДНК) и/или для уменьшения объема фракции, содержащей продукт. Соответствующая смола может быть выбрана специалистом в данной области. Примером смолы является «Mab Select SuRE», которая также представляет собой предпочтительное воплощение согласно изобретению.
После данной первой хроматографической стадии следует стадия вирусной инактивации. Предпочтительно данную стадию вирусной инактивации осуществляют в кислых условиях (например, рН 3,5±0,2) с последующей обработкой пула инактивации или при менее кислых значениях рН 5. Буферный матрикс для вирусной инактивации и последующее доведение до рН 5 может быть основано исключительно на 20 нМ Na-цитратном буфере.
После данной стадии вирусной инактивации проводят стадию ионообменной хроматографии с целью уменьшения ассоциированных с процессом загрязнений, таких как ДНК. Согласно настоящему изобретению осуществляют стадию анионообменной хроматографии (AIEX), в частности проточным способом. Белок-мишень пропускается через колонку AIEX, при этом ДНК связывается со смолой. Предпочтительно, если проточный пул AIEX затем обрабатывается без обработки с использованием дополнительной колоночной стадии. Эта необязательная дополнительная стадия способствует общему снижению вирусной контаминации и остаточных НСР, ДНК и обесцвеченного лиганда белка-А. Согласно предпочтительному воплощению используется колонка, набитая смолой смешанного типа capto-MMC, в режиме связывания/элюирования.
Элюат пропускается через вирусный фильтр (VF) и затем применяется в стадии ультрафильтрации (UF/DF). Согласно изобретению в стадии вирусной фильтрации может быть получена конкретная волюметрическая нагрузка ≤100 л/м2. Предпочтительно используется мембрана с порогом около 30 кДа. Конечно, единственная стадия очистки, описанная выше, может быть заменена на стадии, известные специалистам в данной области, с достижением такого же или сравнимого эффекта.
Наконец, получают ультраконцентрат UF/DF, и концентрацию композиции APG101 согласно настоящему изобретению доводят до желаемой концентрации белка, такой как 20±2 мг/мл.
На Фигуре 2 представлена блок-схема предпочтительного воплощения процесса последующей обработки согласно настоящему изобретению. Как можно понять из Фигуры 3, процесс последующей обработки по изобретению характеризуется рядом преимуществ по отношению к процессам последующей обработки, известным в данной области. Например, после вирусной инактивации не требуется стадия выдержки при нейтральном значении рН. Что касается стадии вирусной фильтрации, то возможна волюметрическая нагрузка ≤100 л/м2 по сравнению с нагрузкой 37 г/м2, известной в данной области. Кроме того, использование буферного состава по настоящему изобретению позволяет достичь высокие белковые концентрации, такие как 20 мг/мл, по сравнению с 10 мг/мл в PBS.
Способ получения композиции согласно настоящему изобретению, который описан в данном документе, приводит к получению изоформ APG101 в интервале pI 4-8,5. Предлагаемая таким образом композиция содержит только очень маленькие количества нежелательных высокомолекулярных форм, таких как димеры или агрегаты. Полученные таким образом изоформы APG101 характеризуются большими количествами сиаловых кислот, а также N-концевым гликозилированием Fc, содержащим высокие количества фукозилированных форм.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой химерный белок, содержащий по меньшей меревнеклеточный домен CD95 или его функциональный фрагмент, и по меньшей мереFc-домен или его функциональный фрагмент.
Внеклеточный домен CD95 может представлять собой человеческий внеклеточный домен CD95. Внеклеточный домен CD95 может включать SEQ ID NO: 7 и последовательности, имеющие по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% идентичности с SEQ ID NO: 7.
В химерном белке согласно настоящему изобретению дисульфидные мостики могут присутствовать в домене CD95 или в его функциональном фрагменте, связывая положения 34 и 48, 38-57, 60 и 76, 79 и 94, 82 и 102, 104 и 118, 110 и 115,121 и 132, и/или 124 и 140 относительно SEQ ID NO: 7. Предпочтительный химерный белок содержит дисульфидный мостик в положении ПО -115 относительно SEQ ID NO: 7. Дисульфидный мостик также может присутствовать в Fc-домене или в его функциональном фрагменте, связывая положение 43 и 103 и/или положение 149 и 207 относительно SEQ ID NO: 8.
Предполагается, что ссылка на конкретное положение в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 включает ссылку на соответствующие положения в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 19, если это применимо. Например, дисульфидный мостик в положении 104 и 118 относительно SEQ ID NO: 7 соответствует дисульфидному мостику в положении 129- 143 относительно SEQ ID NO: 1.
В настоящем изобретении неожиданно обнаружили, что в химерном белке при N-концевом укорачивании внеклеточного домена CD95, содержащего до 33 аминокислот в SEQ ID NO: 7, стабильность не уменьшается по сравнению с полноразмерным APG101. Например, химерные белки SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5, и SEQ ID NO: 6 обеспечивают стабильность, которая по меньшей мересоответствует стабильности полноразмерного белка APG101 (Пример 2). Таким образом, другой аспект настоящего изобретения представляет собой химерный белок, содержащий функциональный фрагмент внеклеточного домена CD95 из SEQ ID NO: 7, укороченного до положения 33. В химерном белке функциональный фрагмент внеклеточного домена CD95 может включать SEQ ГО NO: 7, укороченную вплоть до 33 аминокислот, расположенных на N-конце. В химерном белке настоящего изобретения функциональный фрагмент внеклеточного домена CD95 может включать аминокислотную последовательность, где 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, или 33 N-концевые аминокислоты удалены в SEQ ID NO: 7.
В предпочтительном аспекте во внеклеточном домене CD95 удалены 13 N-концевых аминокислот (SEQ ID NO: 3).
В другом предпочтительном аспекте во внеклеточном домене CD95 удалены 14 N-концевых аминокислот (SEQ ID NO: 4).
Еще в одном предпочтительном аспекте во внеклеточном домене CD95 удалены 29 N-концевых аминокислот (SEQ ID NO: 5).
Еще в одном предпочтительном аспекте во внеклеточном домене CD95 удалены 31 N-концевая аминокислота (SEQ ID NO: 6).
В следующем аспекте химерный белок по настоящему изобретению может включать функциональный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, и последовательностей, имеющих по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% идентичности с SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ГО NO: 11 или SEQ ID NO: 12. Конкретно, химерный белок может включать функциональный фрагмент внеклеточного домена CD95, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12.
В химерном белке согласно настоящему изобретению по меньшей мереFc-домен может представлять собой человеческий Fc-домен. Подходящие Fc-домены и Fc-фрагменты описаны в данном документе. В частности, по меньшей мере Fc-домен может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 и последовательностей, имеющих по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% идентичности с SEQ ID NO: 8.
Химерный белок согласно настоящему изобретению может быть свободен от сигнального пептида, поскольку сигнальный пептид, присутствующий в незрелом продукте экспрессии, будет отщепляться в процессе созревания.
В другом аспекте химерный белок согласно настоящему изобретению может включать локализованный на N-конце сигнальный пептид.
Сигнальный пептид может быть природным сигнальным пептидом CD95, как например, сигнальный пептид, содержащийся в SEQ ID NO: 14. Сигнальный пептид может представлять собой модифицированный природный сигнальный пептид, например сигнальный пептид, содержащийся в SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 13 соответствует положениям 1-25 SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 13 соответствует SEQ ID NO: 14, за исключением положения 2 (Leu в SEQ ID NO: 14, Val в SEQ ID NO: 13).
В предпочтительном аспекте в химерном белке по настоящему изобретению расположенный на N-конце сигнальный пептид представляет собой искусственный сигнальный пептид. Более предпочтительно, если сигнальный пептид содержит SEQ ID NO: 2 или последовательность, имеющую по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 2.
В химерном белке согласно настоящему изобретению внеклеточный домен CD95 или его функциональный фрагмент может быть локализован на N-конце по меньшей мереFc-домена или его функционального фрагмента. Сигнальный пептид, если он есть, может быть непосредственно сшит с внеклеточным доменом CD95 или с его функциональным фрагментом.
В химерном белке согласно настоящему изобретению внеклеточный домен CD95 или его функциональный фрагмент может быть непосредственно сшит с Fc-доменом или с его функциональным фрагментом. Может иметь место перекрывание одной аминокислоты (например, Ser в положении 172 SEQ ID NO: 1 и в соответствующих положениях других последовательностей, раскрытых в данном документе).
В другом аспекте настоящего изобретения химерный белок представляет собой APG101, полипептид, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% идентичности с APG101 и/или с функциональным фрагментом APG101. Химерный белок по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 1 или последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% идентичности с SEQ ID NO:l. Химерный белок по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 15 или последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% идентичности с SEQ ID NO: 15.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения химерный белок может включать последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, и последовательностей, имеющих по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% идентичности с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 3-6 представляют последовательность, содержащую сигнальный пептид SEQ ID NO: 2.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения химерный белок может включать последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, и последовательностей, имеющих по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% идентичности с SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 16-19 не содержат сигнального пептида.
В другом аспекте настоящего изобретения в химерном белке по меньшей мереFc-домен или его функциональный фрагмент может обеспечить pI в интервале 4-8,5, предпочтительно в интервале 4,5-7,8, более предпочтительно 5-7,5, как описано в данном документе в контексте смеси химерных белков.
В одном аспекте настоящего изобретения химерный белок по настоящему изобретению негликозилирован в СН2-домене Fc-домена или его функционального фрагмента. Предпочтительно предотвращать гликозилирование путем замены на серии остатка Asn N250 из SEQ ID NO: 1 (или в соответствующем положении в другой последовательности, раскрытой в данном документе, например, положение 79 из SEQ ID NO: 8).
Еще в одном аспекте настоящего изобретения химерный белок может включать высокое количество сиаловых кислот, как описано в данном документе в контексте смеси химерных белков.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения в химерном белке N-связанное гликозилирование на основе Fc характеризуется высоким количеством фукозилированных форм, как описано в данном документе в контексте смеси химерных белков.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения химерный белок содержит блокированные по N-концу химерные белки, такие как химерные белки, блокированные с помощью Пиро-Глу-модификации, и/или содержащие химерные белки, содержащие свободный N-конец, как описано в данном документе в контексте смеси химерных белков. Химерный белок может включать 80-99 мол. % блокированных по N-концу химерных белков и/или 1-20 мол. % химерных белков, имеющих свободный N-конец, как описано в данном документе в контексте смеси химерных белков.
Химерный белок по настоящему изобретению может представлять собой выделенный химерный белок.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный белок по настоящему изобретению. Указанная нуклеиновая кислота предпочтительно функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии, подходящей для экспрессии в клетке-хозяине, как описано в данном документе. Специалисту в данной области известны подходящие последовательности для контроля экспрессии, например, промоторы, энхансеры, терминаторы и т.д.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой клетку-хозяин, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может быть эукариотической клеткой, конкретно клеткой млекопитающего, более конкретно человеческой клеткой. Предпочтительные клеточные линии включают НЕК293 и СНО. Наиболее предпочтительной является суспензионная клеточная культура СНО, которая может быть предварительно адаптирована к культуральной среде определенного химического состава.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой состав, содержащий химерный белок согласно настоящему изобретению, и/или молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Конкретно, состав представляет собой фармацевтическую композицию, необязательно содержащую носитель, разбавитель и/или вспомогательное вещество, как описано в данном документе. Состав может использоваться в лечении заболевания или патологического состояния, как описано в данном документе.
Состав по настоящему изобретению может дополнительно включать:
(a) фосфат, предпочтительно от около 20 мМ до около 100 мМ фосфата, более предпочтительно около 50 мМ фосфата,
(b) агент, усиливающий вязкость, такой как сорбит, предпочтительно около 0,1-10 масс. % агента, усиливающего вязкость, более предпочтительно около 5 масс. % агента, усиливающего вязкость, и/или
(c) имеет значение рН в интервале 4-8.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения химерного белка согласно настоящему изобретению, включающий рекомбинантную экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный белок, конкретно, в клетке-хозяине, как описано в данном документе. Специалисту в данной области известны подходящие способы. Способ может включать стадии:
(a) получения химерного белка согласно настоящему изобретению с помощью периодического процесса с добавлением субстрата, обеспечивающего получение культуры клеток, и
(b) выделения химерного белка согласно настоящему изобретению из культуры клеток.
В способе получения химерного белка стадия (а) может включать серии стадий культивирования данного базового клеточного бульона до тех пор, пока не будут достигнуты соответствующие параметры культуры, с последующей седиментацией клеток и фильтрацией надосадочной жидкости, содержащей химерный белок, и/или стадия (b) может включать хроматографию с захватом, вирусную инактивацию, серии анионной и/или катионной хроматографии, вирусную фильтрацию и/или доведение до желаемой конечной белковой концентрации.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой полипептид, представляющий собой SEQ ID NO: 2 или последовательность, имеющую по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 описывает искусственный сигнальный пептид, способный транспортировать пептид или белок, экспрессированный в эукариотической клетке-хозяине, на клеточную поверхность. Предпочтительно, сигнальный пептид состоит из SEQ ID NO: 2. Неожиданно было обнаружено, что при экспрессии белка или полипептида, содержащего Lys, Thr, Asp или Gin в первом положении зрелого полипептида, сигнальный пептид, представляющий собой SEQ ID NO: 2, приводит в результате к получению зрелого пептида в результате точного расщепления между сигнальным пептидом и первой аминокислотой зрелого пептида. Напротив, сигнальная последовательность, как например, в положениях 1-25 в SEQ ID NO: 1, обеспечивает вариабельное расщепление за положением 16, 20 или 25, так что получается смесь продуктов расщепления. В данном случае могут быть получены химерные белки, имеющие первую аминокислоту, представляющую собой Arg17, Lys21 или Пиро-Глу26 по отношению к SEQ ID NO: 1. Любой пептид или белок может экспрессироваться в эукариотической клетке с помощью сигнального пептида, представляющего собой SEQ ID NO: 2 или последовательность, имеющую по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 2. В частности, полипептид, экспрессируемый с помощью сигнального пептида, представляющего собой SEQ ID NO: 2, или последовательности, имеющей по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 2, может представлять собой химерный белок, описанный в данном документе, например, химерный белок любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, и SEQ ID NO: 19.
Еще один аспект представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, представляющий собой SEQ ID NO: 2, или последовательность, имеющую по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 2.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к укороченным внеклеточным доменам CD95, как описано в данном документе. Предпочтительным является укороченный внеклеточный домен CD95, содержащий SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12. Следующие аспекты относятся к нуклеиновым кислотам, кодирующим укороченные внеклеточные домены CD95, как описано в данном документе.
SEQ ID NO: 1 представляет APG101, содержащий сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 2 представляет искусственный сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 3 представляет укороченную форму APG101, обозначенную APG130, содержащую искусственный сигнальный пептид SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 4 представляет укороченную форму APG101, обозначенную APG131, содержащую искусственный сигнальный пептид SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 5 представляет укороченную форму APG101, обозначенную APG132, содержащую искусственный сигнальный пептид SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 6 представляет укороченную форму APG101, обозначенную APG133, содержащую искусственный сигнальный пептид SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 7 представляет человеческий внеклеточный домен CD95 (положения 26-172 SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 8 представляет человеческий Fc-домен (положения 172-400 SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 9 представляет укороченную форму внеклеточного домена человеческого CD95 (положения 21-154 SEQ ID NO: 3).
SEQ ID NO: 10 представляет укороченную форму внеклеточного домена человеческого CD95 (положения 21-153 SEQ ID NO: 4).
SEQ ID NO: 11 представляет укороченную форму внеклеточного домена человеческого CD95 (положения 21-138 SEQ ID NO: 5).
SEQ ID NO: 12 представляет укороченную форму внеклеточного домена человеческого CD95 (положения 21-136 SEQ ID NO: 6).
SEQ ID NO: 13 представляет модифицированный сигнальный пептид человеческого CD95 (положение 1-25 SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 14 представляет сигнальный пептид человеческого CD95.
SEQ ID NO: 15 представляет зрелую форму APG101 (положение 26-400 SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 16 представляет зрелую форму APG101 (положение 21-382 SEQ ID NO: 3).
SEQ ID NO: 17 представляет зрелую форму APG101 (положение 21-381 SEQ ID NO: 4).
SEQ ID NO: 18 представляет т зрелую форму APG101 (положение 21-366 SEQ ID NO: 5).
SEQ ID NO: 19 представляет зрелую форму APG101 (положение 21-364 SEQ ID NO: 6).
Чертежи
Фигура 1. Сравнение начального процесса по изобретению с неоригинальным начальным процессом.
Фигура 2. Блок-схема, демонстрирующая предпочтительное воплощение процесса последующей обработки по изобретению.
Фигура 3. Сравнение процесса последующей обработки по изобретению с неоригинальным процессом последующей обработки.
Фигура 4а. IEF АЕХ-фракции смеси APG101, полученной способом по изобретению.
Фигура 4b. IEF АЕХ-фракции смеси APG101, полученной неоригинальным способом.
Фигура 5. Схематический обзор анализа эффективности.
Фигура 6. In vitro-биологическая активность (ЕС50) смесей изоформ APG101, полученных способом по изобретению, по сравнению с APG101, полученным неоригинальным способом.
Фигура 7. Функциональная молекула APG101.
Фигура 8. Сдвиговый анализ на термостабильность APG101 (CD95-Fc) и зрелых, т.е. укороченных форм CD95-Fc (APG130, APG131, APG132 и APG133), в котором в качестве флуорофора использовали «Sypro Orange». «Sypro Orange» использовали с разведением 1:1000. Рассчитали точки плавления белков, которые представлены в Таблице 4.
Пример 1
Способ получения композиции по изобретению
Способ получения композиции согласно настоящему изобретению включает начальный процесс и процесс последующей обработки, как определено выше.
1. Начальный процесс
1.1. Определение партии
Композицию, содержащую изоформы APG101, получали посредством периодического процесса культивирования с подпиткой. Размораживали две пробирки маточного банка клеток MCB1AGA. Жизнеспособность культуры третьего субкультивирования должна быть >90%, количество жизнеспособных клеток должно составлять >1,5×106 клеток/мл. Если обе пробирки удовлетворяют этим требованиям, то для четвертого субкультивирования и инокуляции посевного материала в реактор использовали культуру с более высокой жизнеспособностью. Культуру с более низкой жизнеспособностью выбрасывали после третьего субкультивирования. Клеточную культуру наращивали во встряхиваемых флаконах с суммарным объемом до ≥4 л перед инокуляцией первого биореактора для выращивания посевного материала. В качестве первого биореактора для выращивания посевного материала использовали 50 л одноразовый биореактор «ХсеПегех» (XDR). Клеточную культуру культивировали в течение трех дней перед ее переносом во второй реактор для выращивания посевного материала на 200 л, «XDR». После еще трех дней культивирования инокулировали производственный реактор на 1000 л. Процедуру сбора клеток начинали на 13 день или ранее, если жизнеспособность падала ниже 61%.
1.2. Клеточная линия
Используемый маточный банк клеток (МСВ) был обозначен как «MCB1AGA».
1.3. Оттаивание и субкультивирование
Последовательно восстанавливали две криопробирки МСВ. Для каждой пробирки применяли следующую процедуру оттаивания: Криопробирки размораживали в лабораторном стакане с использованием WFI при 36,8°С (заданное значение) до тех пор, пока не останутся маленькие кристаллы льда. Затем клетки переносили приблизительно в 10 мл охлажденной (5±3°С) ростовой среды (среда no. 3001772, полученной от РАА), с добавлением 6 мМ L-глутамина (конечная концентрация) и 50 нМ МТХ (конечная концентрация). Для удаления остаточного DMSO осуществляли стадию промывки в охлажденной среде (5±3°С) посредством центрифугирования. Клеточный осадок ресуспендировали в 50 мл предварительно нагретой среды (36,8±1°С) после стадии центрифугирования. Клеточную концентрацию и жизнеспособность измеряли с помощью счетчика клеток «Cedex». В конце данную размороженную культуру инкубировали в инкубаторе со встряхиванием с рабочим объемом 50 мл с использованием 250 мл встряхиваемых колб.
Первая и вторая субкультуры представляют собой стабильные разделения, осуществленные с использованием рабочего объема 120 мл (первая субкультура) и 150 мл (вторая субкультура) в 500 мл встряхиваемых колбах. Третья и четвертая субкультуры представляют собой первую фазу наращивания, которую осуществляли в 2000 мл встряхиваемых колбах с рабочим объемом 800 мл. Для этих четырех исходных пассажей предварительно нагретую (36,8±1°С) ростовую среду (среда по. 3001772, приобретенная у РАА), с добавлением 6 мМ L-глутамина и 50 нМ МТХ (конечные концентрации), использовали в качестве культуральной среды.
Измерение клеточной концентрации и жизнеспособности осуществляли перед каждой стадией культивирования с помощью счетчика клеток «Cedex». Следующую субкультуру готовили в зависимости от клеточного роста.
На 5-ой субкультуре встряхиваемые колбы объединяли в 5 л стеклянной колбе. Из этого пула брали образец для измерения клеточной концентрации и жизнеспособности. Затем в зависимости от фактического VCC переносили в 50 л биореактор для выращивания посевного материала требуемый объем клеточной культуры.
1.4. Биореактор для выращивания посевного материала (50 л)
50 л биореактор для выращивания посевного материала оборудован донной магнитной системой перемешивания и 1 мм оросительными дисками. Перед инокуляцией 50 л биореактор заполняли приблизительно 20 л ростовой среды (среда по. 3001772, приобретенная у РАА) с добавлением 6 мМ L-глутамина (конечная концентрация). Эти параметры применяли к среде предварительного кондиционирования и к процессу культивирования в системе посевных ферментеров.
Когда параметры процесса стабилизировались в пределах приемлемых диапазонов, начинали перенос инокулята. После инокуляции реактор заполняли средой до конечного рабочего объема 25 л. В процессе наращивания клеточной массы в 50 л биореакторе не применяли добавление подпитки. рН контролировали с помощью CO2 посредством распылителя. Уровень кислорода контролировали глубинной аэрацией кислородом по мере необходимости. Верхний газовый поток подавали в свободное пространство. Проводили глубинную аэрацию сжатым воздухом со скоростью потока 0,1 л/мин, которая может быть адаптирована для регуляции pCO2. Ожидаемое время культивирования в посевном биореакторе составляет 3 дня перед инокуляцией 200 л биореактора для выращивания посевного материала.
1.5. Биореактор для выращивания посевного материала (200 л)
200 л биореактор для выращивания посевного материала оборудован донной магнитной системой перемешивания и 1 мм оросительными дисками. Перед инокуляцией 200 л - биореактор заполняли приблизительно 100 л ростовой среды (среда по. 3001772, приобретенная у РАА) с добавлением 6 мМ L-глутамина (конечная концентрация). Эти параметры применяли к среде предварительного кондиционирования и к процессу культивирования в системе посевных ферментеров.
Когда параметры процесса стабилизировались в пределах приемлемых диапазонов, начинали инокуляцию. После инокуляции добавляли среду до конечного рабочего объема 120 л. В процессе наращивания клеточной массы в 200 л биореакторе не применяли добавление подпитки. рН корректировали с использованием газа СО2. Уровень кислорода контролировали с помощью глубинной аэрации с кислородом по мере необходимости. Верхний газовый поток подавали в свободное пространство. Проводили глубинную аэрацию сжатым воздухом со скоростью потока 0,4 л/мин, которая может быть адаптирована для регуляции рСО2. Ожидаемое время культивирования в биореакторе для выращивания посевного материала перед переносом клеток в 1000 л производственный биореактор составляет 3 дня.
1.6. Производственный процесс периодического действия с подпиткой
Способ получения композиции, содержащей изоформы APG101, является подпитываемым культивированием. 1000 л производственный биореактор оборудован донной магнитной системой перемешивания и 1 мм оросительными дисками. Перед инокуляцией 1000 л биореактор заполняли приблизительно 580 л ростовой среды (среда no. 3001829, приобретенная у «Becton Dickison») с добавлением 6 мМ L-глутамина (конечная концентрация, рассчитанная на конечный исходный объем 720 л). Когда параметры процесса стабилизировались в пределах приемлемых диапазонов, начинали перенос инокулята из посевного биореактора в производственный биореактор. Концентрация клетки- мишени после инокуляции в производственном биореакторе составляла 0,3*106 жизнеспособных клеток/мл в суммарном объеме 720 л. Требуемый объем клеточной культуры посевного биореактора переносили в производственный биореактор, который затем заполняли ростовой средой (среда no. 3001829, приобретенная у «Becton Dickison») до достижения исходного объема 720 л. Клеточную культуру подпитывали «Feedmedium А» (РМ30728), начиная с 3 дня, и «Glucose Feedmedium В» (РМ30729).
Ежедневную подпитку начинали с отдельного внесения «Feed В», «Feed А» и глюкозу можно добавлять одновременно.
- Feedmedium В:
Болюсная подпитка начинается на 3 день после начала отбора образцов.
Степень подпитки в день 3-6: 5,184 г/л/день (рассчитано на исходный объем 720 л)
Степень подпитки в день 7-12: 2,592 г/л/день (рассчитано на исходный объем 720 л)
- Feedmedium А:
Болюсная подпитка начинается на 3 день после начала отбора образцов.
Степень подпитки в день 3-5: 43,2 г/л/день (рассчитано на исходный объем 720 л)
Степень подпитки в день 6-12: 21,6 г/л/день (рассчитано на исходный объем 720 л)
- Подпитка D-Глюкозой: Глюкозу добавляли, когда фактическая концентрация D-глюкозы составляла <5 г/л, начиная с 7 дня. Концентрацию D-глюкозы доводили до 5 г/л путем добавления требуемых количеств подпитки в виде D-глюкозы.
Уровень кислорода контролировали путем применения каскада контроллеров кислорода с использованием 3 приоритетов: Приоритет 1 содержит поток рабочего воздуха по необходимости до тех пор, пока не будет достигнут поток газа 10 л/мин. Затем непрерывно увеличивали перемешивание (приоритет 2) до достижения скорости перемешивания 100 об/мин. Третий приоритет содержит глубинное распыление O2 по необходимости.
Верхний поток воздуха подавали в свободное пространство.
рН контролировали с помощью СО2. Готовили 1 М Na2CO3 для добавления при необходимости. Регулярно отслеживали образование пенки и по необходимости добавляли противовспениватель.
Процедуру сбора клеточной культуры начинали на 13 день культивирования или ранее, если жизнеспособность падала ниже <61% («Cedex»). Первая стадия процедуры представляла собой седиментацию клеток, при которой клеточный бульон охлаждали до 10±5°C. Когда температура становилась ниже 20°С, то выключали мешалку, аэрацию и контроллер рН. Минимум через 12 ч седиментации начинали стадию осветления. Надосадочную жидкость осветляли с помощью двухстадийной объемной фильтрации и с использованием фильтра 0,2 им.
1.7. Седиментация
Процедуру сбора клеточной культуры начинали после стадии седиментации. Культуральный бульон охлаждали до конечной температуры 10±5°С. Когда температура <20°С, то отключали перемешивание, pO2- и рН-контроль. Минимум через 12 часов и максимум через 22 часа после начала седиментации осуществляли объемную фильтрацию.
1.8. Фильтрация
Глубинную фильтрацию осуществляли с использованием одноразовой системы объемных фильтров «Stax™» от «Раll», загруженных объемными фильтрами 7×PDK5 и 2×PDD1. Осветление следовало за 0,2 μм - фильтрацией. Объемные фильтры промывали приблизительно 900 л PBS со скоростью потока <100 л/м2⋅ч. Остаточную жидкость выдували из системы воздухом. Процесс фильтрации проводили при производительности насоса <3,5 л/мин и с максимальным давлением 1 бар. Для увеличения степени извлечения продукта, фильтры затем промывали с использованием приблизительно 60 л PBS рН 7,25 и выдували с помощью сжатого воздуха при максимальном давлении 0,8 бар. Отфильтрованную культуру клеток переносили непосредственно через канал в стенке в GD-модуль, и собирали в 1000 л «Mixtainer» и хранили при комнатной температуре.
2. Процесс последующей обработки
В иллюстративных целях ниже будет дано описание индивидуальных стадий очистки в процессе последующей обработки.
2.1. Захват на Белке А (С10)
Фильтрационный материал, описанный выше, переносили, подвергали глубинной фильтрации (0,2 μм) и доводили температуру до 5±3°С. Перед обработкой собранную клеточную культуру разбивали на четыре равные части и хранили при комнатной температуре в течение ночи до достижения конечной температуры процесса 21±3°С. Обработку клеточной культуры проводили без какого-либо кондиционирования в четыре цикла.
Элюцию индуцировали стадией низкого рН. Профили UV280 четырех циклов были весьма конгруэнтными и демонстрировали ожидаемую форму, содержащую типичный одиночный пик в стадии элюции.
Выход прогонов на белке А варьировал от 94 до 98%. Следовательно, коэффициент извлечения продукта прогонов на белке А проходился в ожидаемом диапазоне. Кроме того, все коэффициенты извлечения были сравнимы друг с другом и подтверждали данные, полученные в процессе переноса и адаптации.
2.2. Вирусная инактивация (V10)
Сразу после сбора к элюату с белка А добавляли фиксированный объем (условия: рН 3.5±0.2) 20 мМ лимонной кислоты в течение 5 мин для инактивации оболочечных вирусов. Полученные растворы с инактивированным вирусом инкубировали отдельно в течение 75±15 мин при комнатной температуре (21±3°С). Наконец, рН инактивированых растворов доводили до рН 5±0,2 путем добавления фиксированного объема 20 мМ Na3-цитрата для остановки вирусной инактивации. Полные схемы кондиционирования представлены ниже:
Затем, кондиционированные растворы с инактивированным вирусом фильтровали через 0,22 μм - фильтр (Sartobran Р) для отделения потенциально образующихся осадков и для ингибирования микробного роста в обрабатываемом растворе. Каждую кондиционированную партию с инактивированным вирусом хранили при 21±3°С и в конце объединяли для обработки на стадии AIEX (С20).
2.3. AIEX (С20) - Колонка
После вирусной инактивации доводили рН и проводили фильтрацию кондиционированного пула инактивированного вируса на колонке «Capto Q» в режиме FT в два цикла. Способ включает стадию 1 очистки без разборки (буфер 0,5 М NaOH), стадию уравновешивания (20 мМ Na-цитрат, рН 5), стадию загрузки кондиционированного раствора инактивированного вируса, стадию промывки (20 мМ Na-цитрат, рН 5), стадию регенерации (20 мМ Na-цитрат, 1 М Na-Cl, рН 5,5), стадию 2 очистки без разборки (0,5 М NaOH) и стадию хранения (0,01 М NaOH).
Профили УФ280 двух циклов конгруэнтны и демонстрировали ожидаемое увеличение профиля поглощения УФ280 во время нанесения кондиционированного элюата с Белоком А.
Каждую полученную проточную фракцию в конце фильтровали на 0,22 им фильтре (Sartobran Р) с целью уменьшения микробной флоры. Затем отдельные фракции объединяли и хранили при 21±3°С до момента дальнейшей обработке на стадии ММС (С30). Сравнение AIEX-фракций смеси изоформ APG101, полученной способом по изобретению, и APG101, полученной неоригинальным способом с помощью IEF представлено на Фигурах 4а и 4b.
Выходы фракций AIEX составили около 100%.
2.4. ММС (С30) - Колонка
После С20-стадии пул AIEX-продуктов обрабатывали на колонке «Сарто ММС» в три цикла. Способ включал стадию очистки без разборки (буфер 0,5 М NaOH), стадию уравновешивания (20 мМ Na-цитрат, рН 5), стадию загрузки с использованием AIEX продукта/промывки, стадию промывки (20 мМ Na-цитрат, рН 5), стадию элюции (50 мМ Na-фосфат, 105 мМ NaCl, рН 7,4), стадию регенерации (3 М NaCl, рН 11), стадию мойки без разборки (0,5 М NaOH), стадию кондиционирования (50 мМ Na-фосфат, 105 мМ NaCl, рН 7,4) и стадию хранения (20 мМ Na-фосфат, 20% этанол, рН 7,5).
Элюцию индуцировали повышением рН. Профили УФ280 трех циклов были высококонгруэнтными и демонстрировали ожидаемую форму, включающую типичный одиночный пик в стадии элюции.
Затем, элюированные фракции фильтровали через 0,22 μм - фильтр (Sartobran Р) и хранили при 21±3°С. Перед следующей обработкой на стадии вирусной фильтрации после «Capto ММС» объединяли конкретные фракции элюатов.
Выходы фракций ММС находятся в диапазоне около 100%.
2.5. Вирусная фильтрация (I10)
После стадии С30 перед вирусной фильтрацией пул элюатов «Capto ММС» (1181 мл) пропускали через фильтр «Durapore» 0,1 μм («Мillipak 20»). Вирусную фильтрацию осуществляли нанесением аликвот фильтрата 0,1 μм (887 мл) на вирусный фильтр «Planova 15N» (100 см2), уравновешенный 50 мМ PBS, рН 7,4 (элюирующий буфер «Сарто ММС») с рабочим давлением 0,8±0,1 бар. Объем после промывки составил 0,5 мл/см2 с использованием уравновешивающего буфера. Тестирование фильтра осуществляли перед применением фильтра на основе детекции пузырьков сжатого воздуха. Поток фильтрата во время обработки оставался постоянным (са. 22 л/м2*ч). Вирусная фильтрация имела выход 99%.
После этого оставшийся 0,1 им фильтрат и фракцию фильтрата вирусной фильтрации объединяли и хранили при 5±3°С до дальнейшей обработки на последующей стадии UF7DF.
2.6. Улътрафильтрация/Диафильтрация (I20)
Перед диафильтрацией 110 фильтрат концентрировали в системе «ÄКТА» до получения концентрации белка 25±2 мгAPG101/мл с использованием двух кассет «Pellicon 3» 30 кДа. После чего осуществляли диафильтрацию для замены буферной системы на следующий буфер:
50 мМ Na-Фосфат, 5% Сорбит, рН 6,5
Материал подвергали ультрафильтрации до выше указанной концентрации и подвергали диафильтрации до фактора 7±0,5. Параметры для ультра- и диафильтрации следующие:
Поток ультраконцентрата: 450 л/(м2*ч)
ТМР: 1,2±0,1 бар
UF/DF имела выход 97% извлеченного продукта.
2.7. Коррекция концентрации активного вещества
Для конечной коррекции концентрации к пулу ультраконцентрата UF/DF добавляли определенный объем (107 мл) буферной смеси (50 мМ Na-Фосфат, 5% Сорбит, рН 6,5). Конечная концентрация активного вещества, полученная с помощью А280, составила 20,4 мг/мл. Наконец, активное вещество фильтровали на 0,22 μм фильтре (Sartobran Р). Затем аликвоты активного вещества объемом по 200 мл добавляли в 500 мл флаконы.
2.8. Суммарный выход
Стадийные и суммарный выходы, полученные как результат анализа ProA-HPLC и А280, перечислены в Таблице 1. Отбор образцов молекул-мишеней не принимали во внимание при расчете выхода.
#1 Загрузку определяли с помощью метода сбора ProA-HPLC, Элюата - с помощью ProA-HPLC.
#2 Загрузку определяли с помощью метода сбора ProA-HPLC, Элюата - с помощью А280.
Идентификацию смеси изоформ APG101 проводил с помощью невосстанавливающего ДСН-ПААГ и D2F. Паттерн изоформ демонстрировал дополнительные основные полосы по сравнению с эталонным материалом и легкий сдвиг в распределении изоформ к кислому pI.
Это показано, например, сравнением IEF-геля АХ-фракций, полученных способом по настоящему изобретению, и смеси APG101, полученной неоригинальным способом, согласно Фигуре 1.
Смесь изоформ APG101 по настоящему изобретению имеет дополнительные различия в присутствии углеводов (N-гликанов сиаловые кислоты).
Углеводы (антенальность/N-гликаны)
В Таблице 2 суммирован анализ углеводных структур. Несмотря на сравнимую углеводную структуру между эталонным материалом и композицией по изобретению, распределение углеводных структур различается.
Углеводы (сиаловые кислоты)
Анализ количества сиаловой кислоты на моль APG101 композиции по изобретению суммирован в Таблице 3.
Эталонный материал всегда относится к смеси APG101, которая не была получена способом по настоящему изобретению.
Наконец, проводили анализ для измерения биоактивности смеси по настоящему изобретению, содержащей изоформы APG101.
3. Метод определения эффективности изоформ APG101 in vitro
Клеточный анализ с использованием стабильной Т-клеточной линии Jurkat A3 использовали для определения биологической активности APG101. Эффективность схематично представлена на Фигуре 5.
С помощью данного анализа апоптоза, в котором используются клетки Jurkat A3, определяли значения ЕС50 для ингибирования с помощью APG101 апоптоза, индуцированного APG293 (=CD95L-T4; 250 нг/мл).
Вкратце, клетки Jurkat A3 растили во флаконах со средой RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) с добавлением 10% FBS, 100 ед./мл Пенициллина и 100 μг/мл Стрептомицина. 100000 клеток высевали на лунку в 96-луночный микропланшет.CD95L-T4 (APG293) в постоянной концентрации 250 нг/мл инкубировали в отдельном 96-луночном микропланшете в течение 30 минут при 37°С с различными концентрациями APG101. После добавления к клеткам смеси APG101/CD95L-T4 проводили 3-часовое инкубирование при 37°С. Клетки лизировали добавлением лизирующего буфера (250 мМ HEPES, 50 мМ MgCl2, 10 мМ EGTA, 5% Triton-X-100, 100 мМ DTT, 10 мМ AEBSF, рН 7,5), и помещали планшеты на лед на срок от 30 минут до 2 часов. Апоптоз сопровождался повышением активности Каспаз (например, каспаз 3 и 7). Следовательно, расщепление субстрата каспазы Ac-DEVD-AFC использовали для определения степени апоптоза. Фактически, активность каспаз коррелировала с процентом апоптотических клеток, определенных морфологически после окрашивания клеток пропидиум иодидом и Hoechst-33342.
Для анализа каспазной активности 20 μл клеточного лизата переносили в черный 96-луночный планшет. После добавления 80 μл буфера, содержащего 50 мМ HEPES, 1% Сахарозу, 0.1% CHAPS, 50 μМ Ac-DEVD-AFC, и 25 мМ DTT, рН 7,5, планшет переносили в микропланшетный ридер «Тесап» и отслеживали повышение интенсивности флуоресценции в течение данного интервала времени (длина волны возбуждения 400 нм, длина волны испускания 505 нм). С помощью программного обеспечения «GraphPad Prism», рассчитывали значения ЕС50 для APG101 (т.е. снижение индукции апоптоза при данной концентрации CD95L на 50%).
Исследование биологической активности APG101 с применением анализа эффективности позволяет:
- определить высокую специфичность. При взаимодействии с CD95 CD95L-T4 индуцирует апоптоз клеток Jurkat A3. Взаимодействие CD95/CD95L-T4 специфично блокируется добавлением APG101;
- использовать соответствующую клеточную систему; индукция апоптоза представляет собой один из важных физиологических признаков сигнального пути CD95/CD95L и может отслеживаться в хорошо охарактеризованной человеческой Т-клеточной линии Jurkat A3;
- обеспечить высокую скорость обработки образца благодаря применению 96-луночных микропланшетов и короткого времени инкубирования.
На Фигуре 6 представлена биологическая активность (ЕС50) смесей изоформ APG101, полученных способом по изобретению (образцы по изобретению), по сравнению с APG101, полученным неоригинальными способами. Активность сравнима.
Пример 2
Уровень техники
Красители, чувствительные к окружающей среде, такие как «Sypro Orange», применяли для обнаружения разворачивания белка при анализе термического сдвига с помощью процедуры, которая называется метод «Thermofluor». В данной процедуре красители взаимодействуют с экспонированными гидрофобными участками, полученными путем частичного или полного разворачивания белков.
Процедура метода
Исследуемые белки и «Sypro Orange» наносили на полоски бумаги «Flat Сар» (BioRad, cat. № TCS0803) в 48-луночном планшете (матовый, BioRad, cat. № MLL4851). В конечном объеме 25 цл концентрация исследуемых белков составила 500 μг/мл (разведенных PBS, рН 7,4), a «Sypro Orange» - 1:1000 (Invitrogen, cat. № S6650). Циклер (BioRad MiniOpticon) запускали следующим образом: 2 минуты при 25°С, затем считывание планшета; от 25°С до 95°С с шагом 1°С каждые 10 секунд со считыванием планшета при каждом возрастании на 1°С.
Результаты
Как видно на Фигуре 8, укороченная форма CD95-Fc (APG101) имеет сравнимую стабильность с CD95-Fc, что выражено в одинаковой точке плавления Tm (Таблица 4).
Claims (19)
1. Химерный белок для ингибирования сигнального пути CD95, содержащий функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95, непосредственно сшитого с Fc-доменом, где функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95 состоит из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и указанный Fc-домен представляет собой человеческий Fc-домен, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8, где функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95 расположен на N-конце по меньшей мере Fc-домена или его функционального фрагмента, и где химерный белок лишен дополнительной N-концевой последовательности.
2. Химерный белок по п. 1, состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6.
3. Химерный белок по любому одному из предшествующих пунктов, где по меньшей мере Fc-домен или его функциональный фрагмент обеспечивает pI в диапазоне 4,0-8,5.
4. Химерный белок по п. 3, где pI находится в диапазоне 4,5-7,8, предпочтительно 5,0-7,5.
5. Смесь химерных белков по любому одному из предшествующих пунктов для ингибирования сигнального пути CD95, причем указанные химерные белки необязательно блокированы по N-концу.
6. Смесь химерных белков по п. 5, содержащая блокированные по N-концу химерные белки, например химерные белки, блокированные модификацией Пиро-Глу, и/или содержащая химерные белки, имеющие свободный N-конец.
7. Смесь химерных белков по п. 6, содержащая 80-99 мол. % блокированных по N-концу химерных белков и/или 1-20 мол. % химерных белков, имеющих свободный N-конец.
8. Химерный белок по любому одному из пп. 1-4, который не гликозилирован в СН2-домене по меньшей мере Fc-домена или его функционального фрагмента.
9. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный белок по любому из пп. 1-4.
10. Клетка-хозяин для экспрессии слитого белка, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты по п. 9, где клетка-хозяин содержит указанную молекулу нуклеиновой кислоты в функциональной связи с последовательностью, контролирующей экспрессию.
11. Композиция для ингибирования сигнального пути CD95, содержащая химерный белок по любому из пп. 1-4 и 8 и/или смесь химерных белков по любому одному из пп. 5-7, а также фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или адъюванты, которые необязательно включают фосфат и/или агент, усиливающий вязкость.
12. Композиция по п. 11, дополнительно содержащая
(a) фосфат, предпочтительно от около 20 мМ до около 100 мМ фосфата, более предпочтительно около 50 мМ фосфата,
(b) агент, усиливающий вязкость, такой как сорбит, предпочтительно около 0,1-10 масс. % агента, усиливающего вязкость, более предпочтительно около 5 масс. % агента, усиливающего вязкость, и/или
(c) имеющая значение рН в интервале 4-8.
13. Способ получения химерного белка по любому из пп. 1-4 и 8, включающий рекомбинантную экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты по п. 9, включающий стадии:
(a) продуцирования химерного белка по любому из пп. 1-4 и 8 с помощью периодического процесса с добавлением субстрата, обеспечивающего сбор клеток, и
(b) выделения химерного белка по любому из п.п.1-4 и 8 из культуры клеток, где стадия (а) включает серии стадий культивирования данного базового клеточного бульона до тех пор, пока не будут достигнуты соответствующие параметры культуры, с последующей седиментацией клеток и фильтрацией надосадочной жидкости, содержащей химерный белок, и/или
стадия (b) включает захватывающую хроматографию, вирусную инактивацию, серии анионной и/или катионной хроматографии, вирусную фильтрацию и/или коррекцию до конечной искомой концентрации белка.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12176980 | 2012-07-18 | ||
EP12176978 | 2012-07-18 | ||
EP12176978.0 | 2012-07-18 | ||
EP12176980.6 | 2012-07-18 | ||
PCT/EP2013/065248 WO2014013037A1 (en) | 2012-07-18 | 2013-07-18 | Shortened cd95-fc variants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015105330A RU2015105330A (ru) | 2016-09-10 |
RU2648146C2 true RU2648146C2 (ru) | 2018-03-22 |
Family
ID=48794121
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015105330A RU2648146C2 (ru) | 2012-07-18 | 2013-07-18 | Укороченные варианты cd95-f-c |
RU2015105328A RU2648157C2 (ru) | 2012-07-18 | 2013-07-18 | КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ СМЕСЬ ИЗОФОРМ CD95-Fc |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015105328A RU2648157C2 (ru) | 2012-07-18 | 2013-07-18 | КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ СМЕСЬ ИЗОФОРМ CD95-Fc |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US9315570B2 (ru) |
EP (4) | EP2875044B1 (ru) |
JP (2) | JP6231562B2 (ru) |
KR (1) | KR102201694B1 (ru) |
CN (3) | CN109897115A (ru) |
AU (2) | AU2013291982B2 (ru) |
BR (1) | BR112015000732B1 (ru) |
CA (2) | CA2878992C (ru) |
DK (2) | DK2875045T3 (ru) |
ES (2) | ES2924109T3 (ru) |
HK (2) | HK1207095A1 (ru) |
IL (1) | IL236659A (ru) |
MX (1) | MX371430B (ru) |
NZ (1) | NZ703546A (ru) |
RU (2) | RU2648146C2 (ru) |
SG (1) | SG11201500134QA (ru) |
UA (1) | UA116889C2 (ru) |
WO (2) | WO2014013037A1 (ru) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2875045T3 (en) * | 2012-07-18 | 2018-07-02 | Apogenix Ag | COMPOSITION comprising a mixture of CD95-FC ISOFORMs |
CN105393121B (zh) * | 2013-04-29 | 2018-04-24 | 阿珀吉尼科斯股份公司 | 诊断癌症的方法 |
NO2776305T3 (ru) * | 2014-04-23 | 2018-01-27 | ||
WO2015165973A1 (en) | 2014-04-29 | 2015-11-05 | Apogenix Gmbh | Diagnostic anti-cd95l antibody |
US9587215B2 (en) | 2014-08-07 | 2017-03-07 | General Electric Company | Devices, systems and methods for automated transfer of a sample |
US20160176921A1 (en) * | 2014-12-22 | 2016-06-23 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of purifying recombinant proteins |
WO2020205662A1 (en) | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Myst Therapeutics, Inc. | Ex vivo methods for producing a t cell therapeutic and related compositions and methods |
JP2023504042A (ja) | 2019-11-27 | 2023-02-01 | ミスト セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー | 調節物質を使用した腫瘍反応性t細胞組成物の生成方法 |
WO2021119404A1 (en) * | 2019-12-12 | 2021-06-17 | Emd Millipore Corporation | Intensified virus filtration using diafiltration buffer |
WO2021174208A1 (en) | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Myst Therapeutics, Llc | Methods for ex vivo enrichment and expansion of tumor reactive t cells and related compositions thereof |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6306395B1 (en) * | 1996-05-02 | 2001-10-23 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Fas antigen derivatives |
WO2004085478A2 (en) * | 2003-03-26 | 2004-10-07 | Apogenix Gmbh | Improved fc fusion proteins |
WO2008080623A2 (en) * | 2006-12-28 | 2008-07-10 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Neutralization of cd95 activity blocks invasion of glioblastoma cells in vivo |
RU2420537C2 (ru) * | 2001-01-17 | 2011-06-10 | Трабьон Фармасьютикалз Инк. | Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998018487A1 (fr) * | 1996-10-31 | 1998-05-07 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Agent prophylactique/therapeutique |
KR20000075749A (ko) * | 1997-02-27 | 2000-12-26 | 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 | 신규의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호하는 dna 및 그용도 |
US6905684B1 (en) * | 1997-11-10 | 2005-06-14 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Preventives and remedies for diffuse lung diseases |
EP1273297A1 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Vitamin E for the treatment of diseases in which the binding of the transcription factor NF-KB and/or AP-1 to promoter target sites has a beneficial effect (eg AIDS, cardiac infarction) |
US20100215637A1 (en) * | 2006-03-28 | 2010-08-26 | Biopharmica Ltd | Agent for the Treatment of Hormone-Dependent Disorders and Uses Thereof |
DK2041576T3 (da) * | 2006-06-21 | 2011-12-05 | Apogenix Gmbh | Differentiel cytokinekspression i humane cancere |
WO2008101671A2 (en) * | 2007-02-19 | 2008-08-28 | Apogenix Gmbh | Il-4 fc fusion proteins |
EP2009022A1 (en) * | 2007-06-26 | 2008-12-31 | Apogenix GmbH | Trimeric death ligands with enhanced activity (tenascin) |
EP2540740B1 (en) | 2008-06-17 | 2014-09-10 | Apogenix GmbH | Multimeric TNF receptors |
EP2829550B1 (en) * | 2009-01-09 | 2016-11-16 | Apogenix AG | Fusion proteins forming trimers |
JP5754740B2 (ja) * | 2009-07-21 | 2015-07-29 | クイーン メアリー アンド ウェストフィールド カレッジQueen Mary and Westfield College | 細胞内薬物送達のためのfas(アポ−1,cd95)標的化プラットフォーム |
CN102770458A (zh) * | 2009-12-02 | 2012-11-07 | 阿塞勒隆制药公司 | 用于增加Fc融合蛋白的血清半寿期的组合物和方法 |
DK2875045T3 (en) * | 2012-07-18 | 2018-07-02 | Apogenix Ag | COMPOSITION comprising a mixture of CD95-FC ISOFORMs |
CN105393121B (zh) * | 2013-04-29 | 2018-04-24 | 阿珀吉尼科斯股份公司 | 诊断癌症的方法 |
-
2013
- 2013-07-18 DK DK13742412.3T patent/DK2875045T3/en active
- 2013-07-18 CN CN201910254827.8A patent/CN109897115A/zh active Pending
- 2013-07-18 MX MX2015000731A patent/MX371430B/es active IP Right Grant
- 2013-07-18 EP EP13737631.5A patent/EP2875044B1/en not_active Not-in-force
- 2013-07-18 ES ES18164139T patent/ES2924109T3/es active Active
- 2013-07-18 NZ NZ703546A patent/NZ703546A/en unknown
- 2013-07-18 EP EP18164139.0A patent/EP3409686B1/en active Active
- 2013-07-18 UA UAA201500254A patent/UA116889C2/uk unknown
- 2013-07-18 SG SG11201500134QA patent/SG11201500134QA/en unknown
- 2013-07-18 EP EP18166228.9A patent/EP3406630B1/en active Active
- 2013-07-18 JP JP2015522107A patent/JP6231562B2/ja active Active
- 2013-07-18 EP EP13742412.3A patent/EP2875045B1/en active Active
- 2013-07-18 WO PCT/EP2013/065248 patent/WO2014013037A1/en active Application Filing
- 2013-07-18 CA CA2878992A patent/CA2878992C/en active Active
- 2013-07-18 CN CN201380038208.6A patent/CN104662039B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-07-18 RU RU2015105330A patent/RU2648146C2/ru active
- 2013-07-18 JP JP2015522106A patent/JP6317739B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-07-18 ES ES13742412.3T patent/ES2674662T3/es active Active
- 2013-07-18 AU AU2013291982A patent/AU2013291982B2/en not_active Ceased
- 2013-07-18 WO PCT/EP2013/065250 patent/WO2014013039A1/en active Application Filing
- 2013-07-18 US US14/415,866 patent/US9315570B2/en active Active
- 2013-07-18 CA CA2877989A patent/CA2877989C/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-07-18 BR BR112015000732-5A patent/BR112015000732B1/pt active IP Right Grant
- 2013-07-18 US US14/415,871 patent/US9434783B2/en active Active
- 2013-07-18 RU RU2015105328A patent/RU2648157C2/ru active
- 2013-07-18 CN CN201380043661.6A patent/CN104640876A/zh active Pending
- 2013-07-18 DK DK18164139.0T patent/DK3409686T3/da active
- 2013-07-18 KR KR1020157004183A patent/KR102201694B1/ko active IP Right Grant
- 2013-07-18 AU AU2013291984A patent/AU2013291984B2/en active Active
-
2015
- 2015-01-11 IL IL236659A patent/IL236659A/en active IP Right Grant
- 2015-08-11 HK HK15107778.6A patent/HK1207095A1/xx unknown
- 2015-08-11 HK HK15107780.2A patent/HK1207096A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-04-18 US US15/131,219 patent/US9657083B2/en active Active
- 2016-08-17 US US15/239,127 patent/US9908928B2/en active Active
-
2018
- 2018-02-22 US US15/902,175 patent/US10370441B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6306395B1 (en) * | 1996-05-02 | 2001-10-23 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Fas antigen derivatives |
RU2420537C2 (ru) * | 2001-01-17 | 2011-06-10 | Трабьон Фармасьютикалз Инк. | Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин |
WO2004085478A2 (en) * | 2003-03-26 | 2004-10-07 | Apogenix Gmbh | Improved fc fusion proteins |
WO2008080623A2 (en) * | 2006-12-28 | 2008-07-10 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Neutralization of cd95 activity blocks invasion of glioblastoma cells in vivo |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2648146C2 (ru) | Укороченные варианты cd95-f-c | |
JP6055615B2 (ja) | Dachyp組成物および方法 | |
KR20170135818A (ko) | 선택적 il-6-트랜스-신호전달 억제제 조성물 | |
JP6906497B2 (ja) | 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |