KR20150048120A

KR20150048120A - CD95-Fc 이소형의 혼합물을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20150048120A
Application number: KR1020157004183A
Authority: KR
Inventors: 올리버 힐; 크리스티안 기퍼스; 마인올프 티만
Original assignee: 아포게닉스 게엠바하
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2015-05-06
Also published as: EP2875045A1; RU2648146C2; AU2013291982B2; JP2015524403A; AU2013291982A1; BR112015000732A2; CA2878992A1; DK2875045T3; EP3406630A1; CA2877989A1; HK1207096A1; US9657083B2; US20160362471A1; CA2877989C; MX371430B; RU2015105330A; JP2015528006A; US9315570B2; AU2013291984B2; CN109897115A

Abstract

본 발명은 융합 단백질 이소형(isoform)의 혼합물을 포함하는 조성물로서, 각 융합 단백질은 세포외 CD95 도메인 또는 그의 기능성 단편 또는 Fc 도메인 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 것인 조성물, 안정한 제형으로 그러한 조성물을 제공하는 제제, 및 그러한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

CD95-Fc 이소형의 혼합물을 포함하는 조성물{Composition comprising a mixture of CD95-Fc isoforms}

본 발명은 융합 단백질 이소형(isoform)의 혼합물을 포함하고, 각 융합 단백질은 세포외 CD95 도메인 또는 그의 기능성 단편 또는 Fc 도메인 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 것인 조성물, 안정한 제형으로 그러한 조성물을 제공하는 제제, 및 그러한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

면역글로불린 Fc 도메인에 융합된 사망 수용체(death receptor) CD95의 세포외 도메인(Apo-1; Fas)을 포함하는 융합 단백질이 PCT/EP04/03239에 기재된다. 그러나, 충분한 안정성을 갖는 충분한 양으로 그러한 융합 단백질을 제공하는 것은 어려운 것으로 확인되었다.

본 발명에 의해, 최초로 그러한 조성물 또는 방법을 제공하는 것이 가능하다.

제 1 양태에 따르면, 본 발명은 약 4.0 내지 약 8.5의 pI 범위 내에 분포하는, 융합 단백질 이소형의 혼합물을 포함하는 조성물로서, 각 융합 단백질은 적어도 세포외 CD95 도메인(APO-1; Fas) 또는 그의 기능성 단편 및 적어도 Fc 도메인 또는 그의 기능성 단편인 제2 도메인을 포함하는 것인 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 세포외 CD95 도메인은 또한 "제1 도메인(first domain)"으로도 지칭될 수 있고, Fc 도메인은 "제2 도메인"으로 지칭될 수 있다.

제1 도메인 단백질은 세포외 CD95 도메인, 바람직하게는, 포유동물 세포외 도메인, 특히, 인간 단백질, 즉, 인간의 세포외 CD95 도메인이다. 융합 단백질의 제1 도메인, 즉, 세포외 CD95 도메인은 바람직하게는 인간 CD95 (서열번호 1)의 아미노산 170, 171, 172 또는 173번 까지의 아미노산 서열을 포함한다. 신호 펩티드(signal peptide)(예를 들면, 서열번호 1의 1번 내지 25번)가 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.

특히 치료 목적을 위해, 인간 단백질의 사용이 바람직하다.

상기 융합 단백질은 동일하거나 상이할 수 있는 하나 또는 그 이상의 제1 도메인을 포함할 수 있다. 그러나, 하나의 제1 도메인, 즉, 하나의 세포외 CD95 도메인을 포함하는 융합 단백질이 바람직하다.

바람직한 구체예에 따르면, Fc 도메인 또는 그의 기능성 단편, 즉, 본 발명에 따른 융합 단백질의 제2 도메인은 CH2 및/또는 CH3 도메인, 및 선택적으로, 힌지(hinge) 영역 도메인의 적어도 일부, 또는 그로부터 유래된 변형된 면역글로불린 도메인을 포함한다. 상기 면역글로불린 도메인은 IgG, IgM, IgD, 또는 IgE 면역글로불린 도메인, 또는 그로부터 유래된 변형된 면역글로불린 도메인이다. 바람직하게는, 상기 제2 도메인은 불변 IgG 면역글로불린 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 IgG 면역글로불린 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 도메인 또는 그로부터 유래된 변형된 도메인으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 도메인은 인간 Fc 도메인, 예를 들면, IgG　Fc 도메인, 예를 들면, 인간 IgG1 Fc 도메인이다.

상기 융합 단백질은 동일하거나 상이할 수 있는 하나 또는 그 이상의 제2 도메인을 포함할 수 있다. 그러나, 하나의 제2 도메인, 즉, 하나의 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질이 바람직하다.

또한, 상기 제1 도메인 및 제2 도메인은 모두 바람직하게는 동일한 종으로부터 유래된다.

상기 제1 도메인, 즉, 세포외 CD95 도메인 또는 그의 기능성 단편은 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 제2 도메인, 즉, Fc 도메인 또는 그의 기능성 단편도 융합 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 위치할 수 있다. 그러나, 융합 단백질의 N-말단에 있는 세포외 CD95 도메인이 바람직하다.

또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 융합 단백질은 APG101 (CD95-Fc, 서열번호 1의 26번 내지 400번)이다. 서열번호 1에 의해 정의된, APG101은 인간 세포외 CD95 도메인(26번 내지 172번 아미노산) 및 인간 IgG1 Fc 도메인(172번 내지 400번 아미노산) 을 포함하고, 선택적으로, N-말단 신호 서열(예를 들면, 서열번호 1의 1번 내지 25번 아미노산)을 더 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 신호 펩티드의 존재는 APG101의 미성숙(immature) 형태를 나타낸다. 성숙 동안, 신호 펩티드가 절단된다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 신호 서열 절단된다. 신호 서열을 갖는 APG101는 또한 용어 "비변형 APG101(unmodified APG101)"에 포함된다. 또 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 APG101과 70% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 75% 동일성, 80% 동일성, 85% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 본 출원에 따르면, 용어 "동일성(identity)"은 비교되는 두 개의 아미노산 서열이 변하지 않는 정도, 다시 말하면, 동일한 위치에 동일한 아미노산을 갖는 정도에 관한 것이다.

용어 "APG101"은 신호 펩티드를 갖고 및/또는 갖지 않는, 서열번호 1의 26번 내지 400번의 융합 단백질을 의미한다. 용어 "APG101"은 또한 CD95 세포외 도메인의 N-말단 절단(truncated) 형태를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 APG101의 기능성 단편이다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "단편(fragment)"은 일반적으로 "기능성 단편(functional fragment)", 즉, 상응하는 야생형 또는 전장(full-length) 단백질이 갖는 것과 본질적으로 동일한 생물학적 활성 및/또는 특성을 갖는, 야생형 또는 전장 단백질의 단편 또는 부분을 의미한다.

당업자는 본 발명에 따른 융합 단백질을 설계하고 제조하는 방법을 알고 있다. 그러나, 융합 단백질 이소형, 특히, APG101 이소형의 혼합물은 하기에 기재된 방법에 의해 수득된다. 이러한 방법은 예를 들면, PCT/EP04/03239에 기재된다. 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 융합 단백질을 설계하는 것은 제1 도메인과 제2 도메인 간 하나 이상의 아미노산 중첩(overlap)을 형성하기 위해, 상기 제1 도메인과 제2 도메인의 말단 아미노산의 선택을 포함한다. 상기 제1 도메인과 제2 도메인 간, 또는 두 개의 제1 도메인 간의 중첩은 바람직하게는 1개, 2개, 또는 3개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 중첩은 하나의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 중첩되는 아미노산의 예는 S, E, K, H, T, P, 및　D이다.

본 발명에 따른 조성물은 단백질 이소형의 혼합물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "이소형(isoform)"은 동일한 단백질의 상이한 형태, 예를 들면, APG101, 구체적으로 신호 서열이 없는 APG101의 상이한 형태를 의미한다. 이러한 이소형은 상응하는 비변형 단백질, 즉, 주어진 코딩 서열로부터 변형 없이 전사되고 발현된 단백질과 비교할 때, 예를 들면, 단백질 길이에 의해, 아미노산에 의해, 즉, 치환 및/또는 결실, 및/또는 번역후 변형(post-translational modification)에 의해 다를 수 있다. 상이한 이소형은 예를 들면, 전기영동에 의해, 예를 들면, SDS-전기영동 및/또는 본 발명에 따라 바람직한, 등전위 포커싱(isoelectric focussing)에 의해 구별될 수 있다.

단백질 길이가 상이한 이소형은 예를 들면, 상응하는 비변형 단백질과 비교할 때, N-말단 및/또는 C-말단 신장 및/또는 단축된 것일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 APG101 이소형의 혼합물은 비변형 형태의 APG101 및 그의 N-말단 및/또는 C-말단 신장 및/또는 단축 변이체(variant)를 포함할 수 있다.

따라서, 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 혼합물은 APG101의 N-말단 및/또는 C-말단 단축 변이체를 포함한다.

N-말단 단축 융합 단백질(N-terminally shortened fusion protein)을 포함하는 융합 단백질 이소형의 혼합물이 특히 바람직하다.

단축 융합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 및/또는 50개의 아미노산이 N-말단 절단된(N-terminally truncated) 서열번호 1의 서열을 포함한다. 바람직한 단축 융합 단백질은 16, 20, 또는 25개의 아미노산이 N-말단 절단된 서열번호 1을 가질 수 있다.

이러한 N-말단 단축 융합 단백질은 본 발명의 측면에서, 또한, 비변형 APG101의 -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -35, -40, -45 및/또는 -50 N-말단 단축 변이체로 지칭되고, 이들을 포함할 수 있다. -17, -21, 및/또는 -26 N-말단 단축 변이체가 특히 바람직하다. 번호(numbering)는 서열번호 1에 따른 신호 서열을 포함하는 APG101 단백질을 의미하고, 숫자는 N-말단 절단 APG 변이체 중 첫번째 아미노산을 지칭한다.

이는 16개의 아미노산이 N-말단 절단된 서열번호 1을 갖는 단축 융합 단백질이 -17로 지정된 AGP101 변이체에 해당하고, 서열번호 1의 17번 내지 400번 아미노산을 갖는 단백질을 가져오고, 20개의 아미노산이 N-말단 절단된 것은 -21(서열번호 1의 21번 내지 400번 아미노산)에 해당하며, 25개의 아미노산이 N-말단 절된된 것은 -26(서열번호 1의 26번 내지 400번 아미노산)에 해당한다는 것을 의미한다.

APG101의 C-말단 단축의 예는 C-말단 Lys-클리핑(clipping)이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물의 융합 단백질의 혼합물은 바람직하게는 변형된 이소형에 대해 50 몰-% 비변형 APG101, 보다 바람직하게는 40 몰-% 비변형 APG101, 보다 바람직하게는 30 몰-% 비변형 APG101, 보다 바람직하게는 20 몰-%, 보다 바람직하게는 10 몰-% 비변형 APG101, 보다 바람직하게는 5 몰-% 비변형 APG101, 및 훨씬 더 바람직하게는 3 몰-% 비변형 APG1-1 및 가장 바라직하게는 1 몰-% 및/또는 그 미만의 비변형 APG101을 포함한다. 비변형 APG101을 포함하지 않는 융합 단백질 이소형의 혼합물을 포함하는 구체예가 가장 바람직하다.

앞서 기술된 바와 같이, 이소형은 또한 아미노산 치환, 아미노산 결실 및/또는 아미노산의 첨가에 의해 상이할 수 있다. 이러한 치환 및/또는 결실은 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, 이 구체예에 따라 단일 아미노산의 치환이 바람직하다.

본 발명에 따른 이소형은 또한 번역-후 변형에 대해 다를 수 있다. 본 발명에 따른 번역-후 변형은 소수성 기의 첨가, 특히, 막 국소화(membrane localisation)를 위한 소수성 기의 첨가, 예를 들면, 미리스토일화(myristoylation), 팔미토일화, 이소프레닐화, 또는 글리피칸화(glypiation), 리포일화(lipoyation)과 같은, 증가된 효소 활성을 위한 보조인자(cofactor)의 첨가, 보다 작은 화학 작용기의 추가, 예를 들면, 아실화, 포르밀화, 알킬화, 메틸화, C-말단에서의 아미드화, 아미노산 첨가, α-카르복실화, 글리코실화, 히드록실화, 산화, 글리실화(glycilation), 비오티닐화 및/또는 페길화를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 시알산의 첨가, Fc-기반 글리코실화, 특히, Fc-기반 N-말단 글리코실화, 및/또는 피로-Glu-변형(pyro-Glu-modification)이 번역-후 변형의 바람직한 구체예이다.

바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함된 융합 단백질은 시알산의 고함량을 포함한다. 본 발명에 따르면, 시알산의 함량은 바람직하게는 약 4.0 내지 7.0 mol NeuAc/mol APG101, 보다 바람직하게는, 4.5 내지 6.0 mol NeuAc/mol APG101 및 가장 바람직하게는 약 5.0 mol NeuAc/mol APG101이다. 본 명세서에서 사용된, 시알산은 뉴라민산의 N- 또는 O-치환 유도체를 의미한다. 바람직한 시알산은 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)이다. 아미노기는 일반적으로 아세틸기 또는 글리콜릴(glycolyl)기를 가지나, 기타 변형도 기술되었다. 히드록실 치환기는 상당히 변할 수 있다. 바람직한 히드록실 치환기는 아세틸, 락틸, 메틸, 술페이트 및/또는 포스페이트기이다. 시알산의 첨가는 일반적으로 보다 음이온성인 단백질을 초래한다. 결과적으로 수득된 음 전하는 이 변형에 단백질의 표면 전하 및 결합 능력을 변화시키는 능력을 부여한다. 고함량의 시알산은 보다 우수한 혈청 안정성, 및 따라서, 개선된 약동학 및 보다 낮은 면역원성을 초래한다. 본 발명의 APG101 이소형의 시알릴화의 높은 수준은 고함량의 이촉각(diantennary) 구조에 의해 설명될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 본 발명의 조성물 중 APG101 이소형이 시알산 첨가의 이와 같이 높은 정도를 보인다는 것은 매우 놀라운 것으로 간주되어야 한다.

본 발명에 따르면, 글리코실화는 탄수화물이 본 명세서에서 정의된 융합 단백질, 그의 기능성 단편의 기능성 기(functional group)에 결합되는 것인 반응을 의미한다. 특히, 이는 APG101 또는 그의 이소형으로의 탄수화물의 첨가에 관한 것이다. 탄수화물이 예를 들면, N-결합(N-linkage), 또는 O-결합에 의해 첨가될 수 있다. N-결합 탄수화물이 아스파라긴 또는 아르기닌 곁사슬의 질소에 첨가된다. O-결합 탄수화물은 세린, 쓰레오닌, 티로신, 히드록실라이신 또는 히드록시프롤린 곁사슬의 히드록시 산소에 부착된다. 본 발명에 따르면, N-결합, 특히, Fc-기반 N-말단 글리코실화가 바람직하다. 특히 바람직한 N-결합 글리코실화 부위는 APG101(서열번호 1)의 위치 N118, N136 및/또는 N250에 존재한다.

본 발명에 따른 푸코실화는 분자에 푸코오스 당 유닛을 첨가하는 것에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여, 융합 단백질, 특히, APG101로의 푸코오스 당 유닛의 이러한 첨가는 글리코실화의 특히 바람직한 타입을 나타낸다. 고비율(high portion)의 푸코실화된 형태는 감소된 ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity)를 초래한다. 따라서, 융합 단백질 이소형의 혼합물은 감소된 ADCC를 특징으로 하고, 이는 약학적 및 진단적 적용에 유용하다.

물론, 본 명세서에 정의된 제1 도메인 및 제2 도메인 외에, 본 발명에 따른 융합 단백질은 추가적인 표적화 도메인(targeting domain), 예를 들면, 단쇄 항체 또는 그의 단편 및/또는 신호 도메인(signal domain)과 같은 추가적인 도메인을 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에 따르면, 본 발명에 따라 사용된 융합 단백질은 N-말단 신호 서열을 포함할 수 있고, 이는 재조합 발현 후 숙주 세포로부터의 분비를 가능하게 한다. 신호 서열은 융합 단백질의 제1 도메인에 상동성인 신호 서열일 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 이종(heterologous) 신호 서열일 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 신호 펩티드와 같은 추가적인 N-말단 서열이 없다.

본 발명에 따른 조성물은 프로테아제에 의한 N-말단 분해에 대한 보다 높은 안정성을 제공하는, N-말단 차단 융합 단백질, 및 프로테아제에 의한 N-말단 분해에 대한 보다 높은 안정성을 제공하는 유리 N-말단을 갖는 융합 단백질을 포함할 수 있다.

단백질의 N-말단을 차단하는 변형은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, N-말단을 차단하는 본 발명에 따른 번역-후 변형은 Pyro-Glu-변형이다. Pyro-Glu는 또한 피롤리딘 카르복실산으로도 지칭된다. 본 발명에 따른 Pyro-Glu-변형은 α-아미노기의 곁사슬 카스복실기와의 축합(condensation)을 통한 글루타민의 고리화에 의한 N-말단 글루타민의 변형을 의미한다. 변형된 단백질은 증가된 반감기를 보인다. 이러한 변형은 또한 글루타메이트 잔기에서 일어날 수 있다. N-말단 단축 융합 단백질 -26에 대해, pyro-Glu 변형, 즉, 피롤리돈 카르복실산이 특히 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 80-99 몰-% N-말단 차단 융합 단백질 및/또는 1-20 몰-% 유리 N-말단을 갖는 융합 단백질을 포함한다.

추가적인 바람직한 구체예에 따르면, 상기 조성물은 0.0 내지 5.0 몰-%, 보다 바람직하게는 0.0 내지 3.0 몰-% 및 훨씬 더 바람직하게는 0.0 내지 1.0 몰-%의 융합 단백질 고분자량 형태, 예를 들면, 응집체(aggregate)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 융합 단백질 이소형의 응집체, 특히, APG101의 이량체, 또는 응집체를 포함하지 않는다. 이량체 또는 응집체는 용해도에 대해 부정적 효과를 갖기 때문에 일반적으로 바람직하지 않다.

APG101의 기능성 형태는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 두 분자의 서열번호 1의 179번 또는/및 182번에 있는 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 브릿지(disulfide bridge)에 의해 결합된 두 개의 융합 단백질을 포함한다(도 7 참조). 디술피드 브릿지는 또한 두 분자의 서열번호 1의 173번 위치에서 형성되어, 개선된 안정성을 가져올 수 있다. 서열번호 1의 173번 위치에 디술피드 브릿지가 요구되지 않는 경우, 이 위치에 있는 Cys 잔기가 다른 아미노산에 의해 치환되거나 또는 결실될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 혼합물이 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 방법에 의해 제공된다.

본 발명에 따라, 융합 단백질 이소형의 혼합물은 약 4.0 내지 8.5의 pI 범위 내에 분포한다. 추가적인 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 융합 단백질 이소형의 혼합물의 pI 범위는 약 4.5 내지 약 7.8, 보다 바람직하게는 약 5.0 내지 약 7.5이다.

등전점(isoelectric point)(pI)은 특정 분자 또는 표면이 전하를 갖지 않는 pH 값에 의해 정의된다. 주변 매질의 pH 범위에 따라, 단백질의 아미노산은 상이한 양전하 또는 음전하를 가질 수 있다. 하나의 단백질의 모든 전하의 합이 특정 pH 범위, 그의 등전점, 즉, pI 값에서 0이다. 전기장에서 단백질 분자는 이 pH 값을 갖는 매질의 지점에 도달하면, 그의 전기영동 이동도가 감소되고, 이 부위에 남는다. 당업자는 주어진 단백질의 pI 값을 결정하는 방법, 예를 들면, 등전위 포커싱에 익숙하다. 이 기법은 매우 해상도(resolution)를 갖는다. 단일 전하에 의해 차이가 나는 단백질이 분리되고 및/또는 분획될 수 있다.

본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 조성물은 약제학적, 진단적 및/또는 연구 적용을 위해 이용될 수 있다. 이는 인간 의약 및/또는 수의약에 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 제제(formulation)에 관한 것이다.

바람직한 구체예에 따르면, 상기 제제는

(a) 포스페이트, 보다 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 100 mM 포스페이트 완충제, 보다 바람직하게는 약 5 mM 포스페이트 내지 약 85 mM 포스페이트, 보다 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 80 mM 포스페이트, 보다 바람직하게는, 약 30 mM 내지 약 70 mM 포스페이트, 훨씬 더 바람직하게는 약 40 mM 내지 약 60 mM 포스페이트, 가장 바람직하게는 약 50 mM 포스페이트,

(b) 점도 증강제(viscosity enhancing agent), 바람직하게는 약 0.1-10 중량-% 점도 증강제, 보다 바람직하게는 약 1 내지 8 중량-% 점도 증강제, 보다 바람직하게는, 약 3 중량-% 내지 약 7 중량-% 점도 증강제, 훨씬 더 바람직하게는 약 6 중량-% 내지 약 7 중량-% 점도 증강제, 및 가장 바람직하게는 약 5 중량-% 점도 증강제를 포함하고, 및

(c) 4-8 범위의 pH 값을 갖는다.

본 발명에서, 용어 "포스페이트(phosphate)"는 당업자에게 공지된 적합한 포스페이트 완충제이고, 이를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 포스페이트 완충제는 Na-포스페이트이다.

점도 증강제 또는 점도 증가제는 당업자에게 잘 알려져 있고 알긴산, 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트린, 젤라틴, 구아 검, 히드록시에틸 셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 옥시드, 실리콘 디옥시드, 전분, 잔탄 검, 등을 포함한다. 물론 존재할 수 있는 추가적인 부형제는 사카로오스, 소르비톨 및/또는 글리신을 포함한다. 그러나, 본 발명에 따라 특히 바람직한 점도 증강제는 소르비톨이다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 점도 증강제 소르비톨은 약 5 중량-%로 존재한다.

본 발명에 따른 제제의 pH 값은 약 4 내지 8의 범위 내에 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 5 내지 8의 범위 내에, 보다 바람직하게는 6 내지 8, 훨씬 더 바람직하게는 6.5 내지 8의 범위 내에 있다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, pH는 약 6.5, 약 7.0 또는 약 7.5이다.

특히 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 제제는 약 30 mM Na-포스페이트 또는 약 50 mM Na-포스페이트, 약 5 % 소르비톨을 포함하고, 약 6.5의 pH 값을 보인다(도 10의 완충제 5 및 6 참조).

놀랍게도, 이 타입의 제제로 제공된 본 발명의 조성물은 매우 안정하고, 응집체를 형성하는 경향이 없다.

예를 들면, 본 발명의 제제는 또한 APG101의 감소된 단편화를 특징으로 한다. 또한, 안정한 형태로 높은 단백질 농도, 예를 들면, 약 20 mg/ml를 제공할 수 있었다.

본 발명에 따른 조성물 및/또는 제제는 적절한 수단에 의해 특정한 질환의 치료를 위한 충분한 양으로 필요로 하는 개체, 특히, 인간 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 조성물 및/또는 제제는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 아쥬반트와 함께 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. 치료 효능 및 독성은 표준 프로토콜에 따라 결정될 수 있다. 약제학적 조성물은 전신적으로, 예를 들면, 복막내로, 근육내로, 또는 정맥내로, 또는 국소로, 예를 들면, 비강내로, 피하로, 또는 척수강내로 투여될 수 있다. 투여되는 조성물 및/또는 제제의 투여량은 물론, 치료대상 개체 및 개체의 상태, 예를 들면, 개체의 체중, 개체의 연령, 및 치료대상 질병 또는 손상의 종류 및 중증도, 투여의 방식 및 주치의의 판단에 의존적일 것이다. 예를 들면, 0.001 내지 100 mg/kg의 일일 투여량이 적합하다.

본 발명의 또 다른 양태는 약제학적 조성물 또는 상기 조성물을 포함하는 제제, 또는 본 발명에 따른 제제에 관한 것으로서, 이들은 하나 이상의 추가적인 활성제를 포함한다. 사용되는 추가적인 활성제는 치료 대상 적응증에 의존적이다. 예를 들면, 세포독성제(cytotoxic agent), 예를 들면, 독소루비신, 시스플라틴, 또는 카르보플라틴, 사이토카인 또는 기타 항-신생물제(anti-neoplastic agent)가 암의 치료에서 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 제제 및/또는 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 아쥬반트를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "담체(carrier)"는 사용되는 투여량 및 농도에서 그에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 담체, 부형제, 및/또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충된 용액 또는 리포좀이다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예는 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산(그러나, 본 발명의 제제와 관련하여, 포스페이트 완충제가 바람직하다); 아스코르브산, 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드를 포함한 항산화제; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐 피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린, EDTA와 같은 겔화제, 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 알코올을 포함한, 과 같은 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 기타 탄수화물; 소디움과 같은 염-형성 반대이온(counterion); 및/또는 TWEEN, 폴리에틸렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물 및/또는 제제는 CD95 신호전달(signalling) 경로, 특히, CD95L, 즉, CD95 수용체 리간드에 의해 유발되는 외인성 아폽포시스 경로(extrinsic apoptotic pathway)를 억제하기 위해 이용될 수 있다. 특히, 상기 조성물은 자가면역 질환, AIDS, 심장 질환, 예를 들면, 심근경색, 이식편대숙주 질환(graft-versus-host disorder), 이식 거부, 뇌손상, 예를 들면, 뇌졸중, 척수 손상, 패혈증, 간염, 염증과 연관된 질환, 허혈성 재관류 손상 및 신장병으로부터 선택된 질환의 예방 및/또는 치료에서 이용될 수 있다. 물론, 본 명세서에 기재된 조성물 및/또는 제제는 암, 바람직하게는 고형암, 예를 들면, 뇌종양, 예를 들면, 교모세포종의 치료를 위해 이용될 수 있다. 대안적으로, 치료대상 암은 림프 또는 골수 기원의 암일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법은

(a) 세포 수확물(cell harvest)을 제조하는, 유가식(feed batch) 생산 방법에 의해 본 발명에 의해 제공되는 조성물을 제조하는 단계, 및

(b) 상기 세포 수확물로부터 본 발명의 조성물을 단리하는 단계를 포함한다.

선행 기술로부터 공지된 방법에 비해 본 발명의 방법의 장점은 그의 높은 수율이다.

단계 (a), 즉, "세포 수확물을 제조하는 유가식 제조 방법에 의해 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 단계"는 또한, 하기에서 "상류 공정(upstream process)(USP)"으로 지정될 것이다. 본 발명의 단계 (a)에 따른 방법은 또한 "본 발명의 USP(inventive USP)"로 지칭될 것이다. 도 1은 선행기술에 따른 상류 공정과 본 발명의 상류 공정의 바람직한 구체예의 비교를 보여준다.

단계 (b), 즉, "세포 수확물로부터 본 발명의 조성물을 단리하는 단계"는 또한 하기에서 "하류 공정(downstream process)(DSP)"으로 지정될 것이다.

바람직하게는, 단계 (a)는 관련된 수확 파라미터에 도달할 때까지 주어진 마스터 세포 배치의 일련의 배양 단계 및 뒤이은 융합 단백질, 바람직하게는 융합 단백질을 포함하는 상층액의 침강(sedimentation) 및 여과를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상류 공정의 공정 단계들은 하기 단계를 포함하는 일련의 단계들로 요약될 수 있다.

해동,

계대배양(subcultivation),

50 l 생물반응기(bioreactor),

200 l 생물반응기,

1000 l 생물반응기,

침강,

심층 여과(depth filtration) 및

0.2 ㎛ 여과.

물론, 계대 배양으로부터 1000 l 생물반양기까지의 배양 단계를 수행하는 것이 본 발명을 수행하는 유일한 방법이다. 예를 들면, 배양 단계는 다양한 크기를 갖는 생물반응기에서도 수행될 수 있다. 물론, 일련의 계대 배양 단계 동안, 당업자는 온도, 증식 시간, 배지, 등과 같은 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 중요한 인자는 적절한 수확 파라미터(harvest parameter)를 달성하는 것이고, 이러한 파라미터는 역가(titer), 세포 밀도일 수 있고, 상기 역가는 바람직하게는 0.5　g/l 내지 5 g/l, 보다 바람직하게는, 1 g/l 내지 3 g/l, 보다 바람직하게는 1.5　g/l 내지 5 g/l, 및 가장 바람직하게는 1.8 g/l 내지 2 g/l의 범위에 있다. 세포 밀도의 바람직한 값의 예는 약 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ 세포/ml, 바람직하게는 약 1　x 10⁷ 세포/ml이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 역가는 약 1.8 g/l 내지 약 2 g/l이고, 세포 밀도는 약 1 x 10⁷ 세포/ml이다.

본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 펩톤-함유 기본 배지(basal medium) 및 화학적 한정 배지(chemically defined medium)에서 수행된다.

단계 (b)는 포획(capture) 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 일련의 음이온 및/또는 양이온 크로마토그래피, 바이러스 여과 및/또는 적절한 최종 단백질 농도로의 조정(adjustment)을 포함할 수 있다.

앞서 정의된 단계 (b)에 따라, 단계 (a)에 의해 수득된 APG101 이소형을 포함하는 조성물을 정제하는 하류 공정은 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계, 한외여과 단계, 정용여과 단계 및 바이러스 여과 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에 따르면, 이 하류 공정은 3개의 상이한 크로마토그래피 단계를 포함한다. 제1 크로마토그래피 단계는 표적 단백질을 포획하고 및/또는 공정-관련 불순물(예를 들면, HCP, DNA)을 제거하고, 및/또는 생성물-함유 분획의 부피를 감소시키는 수지를 이용하여 수행된다. 상응하는 수지가 당업자에 의해 선택될 수 있다. 수지의 예는 Mab Select SuRE이고, 이는 또한 본 발명에 따른 바람직한 구체예이다.

이 제1 크로마토그래피 단계 후, 바이러스 불활성화 단계가 이어진다. 바람직하게는, 이 바이러스 불활성화 단계가 산성 조건(예를 들면, pH 3.5±0.2) 하에 수행되고, 뒤이어 불활성화 풀(pool)의 조건화(conditioning)이 또는 pH 5.0과 같은 덜 산성인 pH 값에서 수행된다. 바이러스 불활성화를 위한 완충제 매트릭스(buffer matrix) 및 후속 pH 5.0 조정은 단지 20 nM Na-시트레이트 완충제에 기반할 수 있다.

이 바이러스 불활성화 단계 크로마토그래피 후에, 이온 교환 단계가 DNA와 같은 공정-관련 불순물을 감소시키기 위해 수행된다. 본 발명에 따르면, 음이온 교환 크로마토그래피 (AIEX) 단계가 바람직하고, 특히, 통과(flow-through) 모드에서의 단계가 바람직하다. 표적 단백질은 AIEX 컬럼을 통과하고, 반면에, DNA는 수지에 결합한다. 바람직하게는, AIEX 통과 풀(AIEX flow-through pool)은 뒤이어, 추가적인 컬럼-기반 단계를 이용한 조건화 없이 처리된다. 이러한 선택적 추가 단계는 바이러스 오염 및 잔류 HCP, DNA, 및 표백한(bleached) 단백질-A 리간드의 전체 감소에 기여한다. 바람직한 구체예에 따르면, 결합/용리액(bind/eluate) 모드에서 믹스-모드 수지 capto-MMC 가동 컬럼이 이용된다.

용리액을 바이러스 필터(VF)를 통해 통과시키고 뒤이어 한외-정용여과 단계(UF/DF)에 적용시킨다. 본 발명에 따르면, 바이러스 여과 단계에서 100 l/m² 이하의 비용적 부하(specific volumetric load)를 수득할 수 있다. 바람직하게는, 약 30 kD 컷-오프(cut-off)를 갖는 막이 이용된다. 물론, 전술된 단일 정제 단계를 동일하거나 또는 유사한 효과를 달성하는, 당업자에게 알려진 단계로 대체할 수 있다.

최종적으로, UF/DF 농축물(retentate)을 제제화하고, 본 발명에 따른 APG101 조성물의 농도를 20±2 mg/ml와 같은 원하는 단백질 농도까지 조정한다.

도 2는 본 발명에 따른 하류 공정의 바람직한 구체예의 흐름도(flow schme)를 도시한다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 하류 공정은 선행 기술로부터 공지된 하류 공정 대비 다수의 장점을 특징으로 한다. 예를 들면, 바이러스 불활성화 후, 중성 pH에서의 유지(holding) 단계가 요구되지 않는다. 바이러스 여과 단계에 대해, 선행 기술 공정(prior process)에서 공지된 37 g/m² 대비, 용적 부하 ≤ 100 l/m²가 가능하다. 또한, PBS 중 10 mg/ml 대비, 본 발명의 제제 완충제를 이용하여, 20 mg/ml와 같은 높은 단백질 농도가 달성될 수 있다.

본 명세서에 기재된, 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 방법은 4.0 내지 8.5의 pI 범위에 있는 APG101 이소형을 초래한다. 이 방법으로 제공된 조성물은 이량체 또는 응집체와 같은, 원치 않는 보다 높은 분자량 형태를 매우 소량만 포함한다. 이 방법으로 제공된 APG101 이소형은 고함량의 시알산 및 고함량의 푸코실화 형태를 포함하는 Fc-기반 N-말단 글리코실화를 특징으로 한다.

도 1: 본 발명의 상류 공정과 비-본 발명의(non-inventive) 상류 공정의 비교
도 2: 본 발명의 하류 공정의 바람직한 구체예를 보여주는 흐름도(flow scheme)
도 3: 본 발명의 하류 공정과 비-본 발명의(non-inventive) 하류 공정의 비교
도 4a: 본 발명의 방법에 의해 수득된 APG101 혼합물의 AEX 분획의 IEF
도 4b: 비-본 발명의 방법에 의해 수득된 APG101 혼합물의 AEX 분획의 IEF
도 5: 효능 분석법(potency assay)의 개요(schematic overview)
도 6: 비-본 발명의 방법에 의해 수득된 APG101 대비, 본 발명의 방법에 의해 수득된 APG101 이소형 혼합물의 인 비트로 생물학적 활성 (EC₅₀)
도 7: 기능성 APG101 분자
도 8: APG101 조성물 완충제의 열형광 분석(thermofluorescence assay) 결과의 비교
도 9: APG101 조성물 부형제의 열형광 분석 결과의 비교
도 10: 가혹 열화 안정성(forced degradation stability) 연구의 분석 결과: APG101 안정성에 대해 부형제 (+)는 우수 성능을 보이고 (-)는 열등 성능을 보인다.
도 11: 상용 Fas/Fc와의 직접적 비교에서 Apogenix로부터의 2개의 배치의 APG101의 열 안정성을 평가하는 열형광 분석

실시예 1

본 발명에 따른 조성물을 제조하는 방법

본 발명에 따른 조성물을 제조하는 방법은 앞서 정의된 바와 같은 상류 공정 및 하류 공정을 포함한다.

1. 상류 공정

1.1 배치( Batch ) 정의

APG101 이소형을 포함하는 조성물을 유가식 배양(fed-batch cultivation)으로 제조한다. 마스터 세포 뱅크 MCB1AGA의 2개의 바이알을 해동시킨다. 제3 계대배양의 생존력(viability)은 90%보다 높아야 하고, 생존 세포 수는 1.5x10⁶ 세포/mL보다 커야 한다. 두 바이알이 모두 이 규격을 충족시키는 경우, 보다 높은 생존력을 갖는 배양물을 제4 계대배양 및 종균 배양기(seed reactor)의 접종을 위해 이용한다. 보다 낮은 생존력을 갖는 배양물은 제3 계대 배양 후 버려질 것이다. 세포 배양물을 제1 종균 생물반응기에 접종하기 전에 진탕 플라스크(shake flask)에서 4L 이상의 최종 부피까지 확장시킨다. 제1 종균 생물반응기로, 50 L Xcellerex 일회용 생물반응기(XDR)를 사용한다. 세포 배양물을 3일 동안 배양한 후 제2 종균 반응기 200 L XDR로 옮긴다. 또 다시 3일의 배양 후, 1000L 생산 반응기에 접종한다. 수확(harvesting) 절차는 생존력이 61% 미만으로 떨어지면, 13일차 또는 그 이전에 개시한다.

1.2 세포주

이용되는 마스터 세포 뱅크(MCB)를 "MCB1AGA"로 지정한다.

1.3 해동 및 계대배양

MCB의 2개의 동결 바이알(cryo vial)을 연속적으로 소생시킨다. 하기의 해동 절차를 각 바이알에 적용한다: 작은 얼음 결정이 남을 때까지 동결 바이알을 36.8℃ (설정점)에서 WFI를 담은 비이커에서 해동시킨다. 그 후, 세포를 6 mM L-글루타민 (최종 농도) 및 50 nM MTX (최종 농도)로 보충된, 냉각된 (5 ± 3℃) 성장 배지 (media no. 3001772, PAA로부터 구매) 약 10 mL로 옮긴다. 잔류 DMSO를 제거하기 위해, 냉각된(5 ± 3℃) 배지 중 세척 단계를 원심분리를 통해 수행한다. 원심분리 단계 후에, 세포 펠릿을 미리 가온시킨(36.8±1℃) 배지 50 mL에 재현탁시킨다. Cedex 세포 카운터를 이용하여 세포 농도 및 생존력을 측정한다. 이러한 Out-of-Freeze 배양물을 250 ml 진탕 플라스크를 이용하여 50 ml의 작업 용량(working volume)으로 진탕기 인큐베이터(shaker incubator)에서 최종적으로 인큐베이션시킨다.

제1 및 제2 계대 배양물을 500 ml 진탕 플라스크를 이용하여 120 ml(제1 계대 배양물) 및 150 ml(제2 계대 배양물)의 작업 용량으로 안정성 분리(stability split)를 수행한다. 제3 및 제4 계대 배양은 제1 확장기(expansion phase)이고 800 ml의 작업 용량을 갖는 2000 ml 진탕 플라스크에서 수행한다. 이러한 최초 4 계대 동안, 6 mM L-글루타민 및 50 nM MTX (최종 농도)로 보충된, 미리 가온시킨(36.8 ± 1℃) 성장 배지(media no. 3001772, PAA로부터 구매)를 배양 배지로 이용한다.

Cedex 세포 카운터를 이용하여 각 배양 단계 전에, 세포 농도 및 생존력의 측정을 수행한다. 세포 성장에 따라, 다음 계대 배양을 준비한다.

계대 배양 no. 5에, 진탕 플라스크를 5L 유리 병에 합친다. 이 풀(pool)로부터 세포 농도 및 생존력을 위해 시료를 채취한다. 실제 VCC에 따라, 그 후, 원하는 세포 배양 용량을 50L 종균 생물반응기로 옮긴다.

1.4 종균 생물반응기( Seed Bioreactor )(50L)

50 L 종균 생물반응기에는 하부-장착 자기 구동 교반기 시스템(bottom-mounted magnetic drive agitator system) 및 1 mm 스파저 디스크(sparger disc)가 장착되어 있다. 접종 전에, 50 L 생물반응기에 6 mM L-글루타민 (최종 농도)이 보충된 성장 배지 (배지 no. 3001772, PAA로부터 구매함) 약 20 L를 충진시킨다. 이러한 파라미터를 배지 사전-조건화(pre-conditioning) 및 종균 훈련 배양 공정(seed train cultivation process)에 적용한다.

공정 파라미터가 그들의 허용가능한 범위 내에서 안정한 경우, 접종물 이전(inoculum transfer)을 개시한다. 접종 후, 반응기를 25 L의 최종 작업 부피(working volume)까지 충진시킨다. 50 L 생물반응기에서 세포 매스 확장 동안, 공급물 첨가(feed addition)는 공정에 적용되지 않는다. pH는 스파저를 통해 CO₂로 제어한다. 산소 수준은 필요시 산소에 의한 수중 통기(submerse aeration)에 의해 제어한다. 헤드스페이스에 공기의 오버레이 기류(overlay gas flow)가 적용된다. pCO₂를 조정하도록 개조될 수 있는, 0.1 L/분의 유속으로 가압된 공기에 의한 수중 통기가 수행된다. 200 L 종균 생물반응기의 접종 전에 종균 생물반응기에서 예상 배양 시간은 3일이다.

1.5 종균 생물반응기( Seed bioreactor) (200 L)

200 L 종균 생물반응기에는 하부-장착 자기 구동 교반기 시스템 및 1 mm 스파저 디스크가 장착되어 있다. 접종 전에, 200 L 생물반응기에 6 mM L-글루타민 (최종 농도)이 보충된 성장 배지 (배지 no. 3001772, PAA로부터 구매함) 약 100 L를 충진시킨다. 이러한 파라미터가 배지 사전-조건화(pre-conditioning) 및 종균 훈련 배양 공정(seed train cultivation process)에 적용된다.

공정 파라미터가 그들의 허용가능한 범위 내에서 안정한 경우, 접종물 이전을 개시한다. 접종 후, 배지를 120 L의 최종 작업 부피(working volume)까지 첨가한다. 200 L 생물반응기에서 세포 매스 확장 동안, 공급물 첨가(feed addition)는 공정에 적용되지 않는다. pH는 CO₂ 기체로 보정한다. 산소 수준은 필요시 산소에 의한 수중 통기(submerse aeration with oxygen on demand)에 의해 제어된다. 헤드 스페이스에 공기의 오버레이 기류가 적용된다. pCO₂를 조정하도록 개조될 수 있는, 0.4 L/분의 유속으로 가압된 공기에 의한 수중 통기가 수행된다. 1000 L 생산 생물반응기로 세포를 옮기기 전에, 종균 생물반응기에서 예상 배양 시간은 3일이다.

1.6 유가식 생산 공정( Fed - Batch Production Process)

APG101 이소형을 포함하는 조성물을 제조하는 공정은 유가식 배양이다. 1000 L 생산 생물반응기는 하부-장착 자기 구동 교반기 시스템 및 1 mm 스파저 디스크가 장착되어 있다. 접종 전에, 1000 L 생물반응기에 6 mM L-글루타민 (720 L의 최종 개시 부피에 근거하여 계산된, 최종 농도)이 보충된 성장 배지 (배지 no. 3001829, Becton Dickison으로부터 구매함) 약 580 L를 충진시킨다. 공정 파라미터가 그들의 허용가능한 범위 내에서 안정한 경우, 종균 생물반응기로부터 생산 생물반응기로의 접종물 이전을 개시한다. 생산 생물반응기에서 접종 후 표적 세포 농도는 720L의 총 부피 중 0.3*10⁶ 생존 세포/mL이다. 종균 생물반응기 세포 배양물의 요구되는 부피를 생산 반응기로 옮기고, 이를 720L의 개시 부피에 도달할 때까지, 성장 배지(media no. 3001829, Becton Dickison으로부터 구입함)로 채운다. 3일차에 개시하여, 세포 배양물에 공급 배지 A(PM30728)를 공급하고, 글루코오스 및 공급 배지 B (PM30729)를 공급한다.

일일 공급은 공급 B로 개시하고, 공급 A 및 글루코오스를 동시에 공급할 수 있다.

- 공급 배지( Feedmedium ) B:

볼루스 공급(bolus feed)은 시료채취 후 3일 차에 개시한다.

공급 속도 3 내지 6일차: 5.184 g/L/d (720 L의 개시 부피 기준 계산)

공급 속도 7 내지 12일차: 2.592 g/L/d (720 L의 개시 부피 기준 계산)

- 공급 배지( Feedmedium) A:

볼루스 공급은 시료채취 후 3일 차에 개시한다.

공급 속도 3 내지 5일차: 43.2 g/L/d (720 L의 개시 부피 기준 계산)

공급 속도 6 내지 12일차: 21.6 g/L/d (720 L의 개시 부피 기준 계산)

- D-글루코오스 공급: 실제 D-글루코오스 농도가 7일 차에 개시 농도 5 g/L 미만인 경우 글루코오스를 첨가한다. D-글루코오스 공급의 요구되는 양을 첨가하는 것에 의해 D-글루코오스의 농도를 5 g/L로 조정한다.

산소 수준은 3개의 우선순위(priority)를 갖는 산소 컨트롤러 캐스캐이드(cascade)의 적용에 의해 산소 수준을 조절한다: 우선순위 1은 10 L/분의 기체 흐름에 도달할 때까지 주문형 공정 공기의 흐름(flow of process air demand)으로 구성된다. 그 후, 100 rpm의 교반 속도에 도달할 때까지 교반 (우선순위 2)을 지속적으로 증가시킨다. 제3 우선순위는 필요시 O₂를 수중 스파징하는 것으로 구성된다.

공기 오버레이 흐름(air overlay flow)를 헤드스페이스에 적용한다.

pH는 CO₂로 제어한다. 필요한 경우, 1 M Na₂CO₃를 첨가할 수 있다. 거품(foam)의 형성을 규칙적으로 관찰하고, 필요한 경우, 거품억제제(antifoam)를 첨가한다.

배양 13일 차, 또는 생존력(viability)가 61% (Cedex) 미만으로 떨어지면 그보다 빨리 수확(harvesting) 절차를 개시한다. 이 절차의 제1 단계는 세포의 침강이고, 이때, 세포 배양액(cell broth)을 10 ± 5℃까지 냉각시킨다. 온도가 20℃ 미만인 경우, 교반기, 통기 및 pH 조절을 중지한다(switched off). 최소한 12시간의 침강(sedimentation) 후, 정제(clarification) 단계를 개시한다. 상층액을 심층 여과(depth filtration) 및 0.2 ㎛ 여과의 두 단계에 의해 정제한다.

1.7 침강

수확 절차를 침강 단계에 의해 개시한다. 배양액(culture broth)을 최종적으로 10 ± 5℃까지 냉각시킨다. 온도가 20℃ 미만인 경우, 교반, pO₂ 및 pH-제어를 불활성화시킨다. 최소 12시간 및 최대 22시간의 침강 후, 심층 여과를 개시한다.

1.8 여과

Pall 사의 Stax™ Disposable Depth Filter Systems, 7x PDK5 로딩, 및 2x PDD1 심층여과 필터(depth filter)로 심층 여과를 수행한다. 정제는 0.2 ㎛ 여과로 이어진다. 심층여과 필터를 100 L/m²/h 이하(≤)의 유속(flux rate)으로 약 900 L의 PBS로 플러싱한다. 잔류 액체를 공기로 시스템으로부터 날려보낸다. 여과 공정은 3,5 L/분 이하의 펌프 유속 및 1.0 바(bar)의 최대 압력으로 수행한다. 생성물 회수율을 증가시키기 위해, 그 후, 필터를 약 60L PBS pH 7,25로 세정하고 0.8 바의 최대 압력에서 가압 공기로 날려보낸다. 여과된 수확물을 직접 월 덕트(wall duct)를 통해 GD 스위트(suite)로 직접 이동시키고, 1000L Mixtainer에 수집하고 실온에서 보관한다.

2. 하류 공정

예시 목적으로, 하류 공정 동안 개별적인 정제 단계의 기술이 하기에 제시될 것이다.

2.1 단백질 A 포획( Protein A capture )( C10 )

전술된 여과 물질(filtration material)을 옮겨서 심층 여과하고 (0.2 ㎛) 5 ± 3℃로 조절(temper)했다. 처리 전에, 수확물을 4개의 동일한 분획으로 나누고 밤새 실온에서 보관하여 21 ± 3℃의 최종 공정 온도를 달성했다. 4회의 사이클에서 추가적인 조건화 없이, 수확의 처리를 수행했다.

낮은 pH 단계(low pH step)를 통해 용리를 유도했다. 4회의 사이클의 UV280 프로파일은 고도로 일치했고 용리 단계 내에서 전형적인 단일 피크를 포함한 예상되는 형태를 보인다.

단백질 A 전개(run)의 수율은 94 내지 98%로 변화했다. 따라서, 단백질 A 전재의 생성물 회수율은 예상 범위 내에 있었다. 또한, 모든 회수율은 상호 간에 비슷했고 공정 이전 및 적응(adaptation) 과정 동안 수득된 데이터를 확인했다.

2.2 바이러스 불활성화 ( V10 )

단백질 A 용리액을 회수한 직후, 외피 보유 바이러스(enveloped virus)를 불활성화시키기 위해, 20 mM 시트르산으로 고정된 용량 첨가(규격: pH 3.5±0.2)를 수행했다. 수득된 바이러스 불활성화 용액을 별개로 실온(21±3℃)에서 75±15 분 동안 인큐베이션했다. 최종적으로, 바이러스 불활성화를 중단시키기 위해 고정된 부피의 20 mM Na₃-시트레이트의 첨가를 통해 불활성화 용액의 pH를 pH 5.0 ±0.2까지 조정했다. 전체 조건화 계획(scheme)은 하기와 같았다:

뒤이어, 잠재적으로 형성된 침전물을 분리하고 공정 용액(process solution) 중 미생물 증식을 억제하기 위해, 조건화 바이러스 불활성화 용액(conditioned virus inactivation solution)을 0.22 ㎛ 필터 (Sartobran P)를 통해 여과시켰다. AIEX (C20) 단계를 통한 처리 전에, 각 조건화 바이러스 불활성화 배치를 21 ± 3℃에서 보관하고 최종적으로 합쳤다(pooled).

2.3 AIEX ( C20 ) -컬럼

바이러스 불활성화, pH 조정 및 여과 후에, 조건화 바이러스 불활성화 풀을 2회의 사이클로 FT 모드로 Capto Q 컬럼에서 처리했다. 방법은 제자리 세정(cleaning in place) 단계 1 (완충액 0.5 M NaOH), 평형화 단계 (20 mM Na-시트레이트, pH 5), 조건화 바이러스 불활성화 용액의 로딩 단계, 세척 단계 (20 mM Na-시트레이트, pH 5.0), 재생 단계 (20 mM Na-시트레이트, 1 M Na-Cl, pH 5.5), 제자리 세정 단계 2 (0.5 M NaOH) 및 보관 단계 (0.01 M NaOH)를 포함한다.

2회 사이클의 UV280 프로파일은 동일하고 조건화 단백질 A 용리액의 적용 동안 UV280 흡수 프로파일의 예상되는 증가를 보인다.

미생물 부하(bioburden) 감소를 해소하기 위해, 각각 수득된 통과(flow through) 분획을 최종적으로 0.22 ㎛ 여과시켰다(Sartobran P). 그 후, 별개의 분획을 합치고 MMC 단계 (C30)를 통한 추가적인 처리까지 21 ± 3℃에서 보관했다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 APG101 이소형의 혼합물과 IEF에 의한, 비-본 발명의 방법(non-inventive method)에 의해 수득된 APG101의 AIEX 분획의 비교가 도 4a 및 4b에 도시된다.

AIEX 전개(run)의 수율은 약 100%였다.

2.4 MMC ( C30 ) 컬럼

C20 단계 후에, 3회의 사이클로 Capto MMC 컬럼 상에서 AIEX 생성물 풀을 처리했다. 방법은 제자리 세정 단계 1 (완충액 0.5 M NaOH), 평형화 단계 (20 mM Na-시트레이트, pH 5), AIEX 생성물/세정을 이용한 로딩 단계, 세척 단계 (20 mM Na-시트레이트, pH 5.0), 용리 단계 (50 mM Na-포스페이트, 105 mM NaCl, pH 7.4), 재생 단계 (3 M NaCl, pH 11), 제자리 세정 단계 (0.5 M NaOH), 조건화(conditioning) 단계 (50 mM Na-포스페이트, 105 mM NaCl, pH 7.4) 및 보관 단계 (20 mM Na-포스페이트, 20% 에탄올, pH 7.5)를 포함했다.

pH의 증가를 통해 용리를 유도했다. 3회 사이클의 UV280 프로파일은 고도로 일치하고 용리 단계 내에서 전형적인 단일 피크를 포함하는 예상되는 형태를 보인다.

그 후, 용리액 분획을 각각 0.22 ㎛ 필터 (Sartobran P) 상에서 여과하고 21±3℃에서 보관했다. 바이러스 여과 단계를 통한 추가적인 처리 전에, 특정한 Capto MMC 용리액 분획을 합쳤다.

MMC 전개의 수율은 약 100%였다.

2.5 바이러스 여과 ( I10 )

C30 단계 후에, Capto MMC 용리액 풀(1181 mL)을 바이러스 여과 전에 Durapore 0.1 ㎛ 필터 (Millipak 20)를 통해 통과시켰다. 0.1 ㎕ 여과액 (887 mL)의 분량을 0.8±0.1 바의 작업 압력(working pressure)에서 50 mM PBS, pH 7.4 (Capto MMC 용리 완충액)로 평형화시킨 Planova 15N 바이러스 필터(100 cm²) 상에 적용시켜 바이러스 여과를 수행했다. 세척-후 부피(post-wash volume)는 평형화 완충액을 이용한 0.5 mL/cm²였다. 필터 사용 전에, 가압 공기 버블링(bubbling)의 검출에 근거하여 필터 테스트를 수행했다. 여과액 흐름(filtrate flux)은 처리 동안 일정하게 유지되었다 (ca. 22 L/m²*h).

바이러스 여과는 99% 수율을 가져왔다.

뒤이어, 잔류 0.1 ㎕ 여과액 및 바이러스 여과의 여과액 분획을 합치고 후속 UF/DF 단계를 통한 추가적인 처리까지 5±3℃에서 보관했다.

2.6 한외여과 / 정용여과 ( I20 )

정용 여과 전에, I10 여과액을 2개의 Pellicon 3 30 kDa 카세트를 이용하여 AKTA Crossflow 시스템 상에서 25.0 ±2.0 mg_APG101/mL의 단백질 농도까지 농축했다. 그 후, 완충액 시스템을 하기 완충액으로 변경하기 위해 정용여과를 수행했다:

50 mM Na-포스페이트, 5 % 소르비톨, pH 6.5

물질을 전술된 농도까지 한외여과하고 7.0 ±0.5배(factor)로 정용여과했다. 한외- 및 정용여과를 위한 파라미터는 하기와 같았다:

농축물 흐름(retentate flow): 450 L/(m²*h)

TMP: 1.2 ±0.1 bar

UF/DF는 97% 생성물 회수율을 가져왔다.

2.7 약물 물질 농도 조정

최종 농도 조정을 위해, 정해진 부피 (107 mL)의 제제화 완충액(formulation buffer) (50 mM Na-포스페이트, 5 % 소르비톨, pH 6.5)을 UF/DF 농축물(retentate) 풀에 첨가했다. A280에 의해 수득된 최종 약물 물질 농도는 20.4 mg/mL이었다. 최종적으로, 약물 물질을 0.22 ㎛ 여과했다(Sartobran P). 뒤이어, 200 ㎕의 부피를 갖는 약물 물질의 분량(aliquot)을 500 ㎕ 바이알에 담았다.

2.8 총 수율

ProA-HPLC 및 A280 분석에 의해 수득된 단계 수율 및 총 수율이 표 1에 열거된다. 표적 분자의 시료채취는 수율의 계산에 고려되지 않았다.

표 1: 단계 수율의 개요

시료	총 수율 (%)
단백질 A 포획 (C10)	96^#1	101^#2
바이러스 불활성화 (V10)	90	94
AIEX (C20)	90	94
MMC (C30)	90	94
바이러스 여과 (I10)	89	93
UF/DF (I20)	86	90
제제화 (I30)	86	90

#1 ProA-HPLC 수확 방법, ProA-HPLC를 통한 용리액을 통해 결정된 로드(load)

#2 ProA-HPLC 수확 방법, A280을 통한 용리액을 통해 결정된 로드

APG101 이소형의 혼합물의 정체(identity)를 비-환원성 SDS Page 및 IEF를 통해 확인했다. 이소형 패턴은 기준 물질(reference material) 대비 추가적인 염기성(basic) 밴드 및 산성 pI로의 이소형 분포의 경미한 이동(shift)을 보였다.

이는 예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 수득된 AX 분획과 도 1에 따른 비-본 발명의 방법에 의해 수득된 APG101 혼합물의 IEF 겔의 비교에 의해 알 수 있다.

본 발명의 APG101 이소형 혼합물은 또한, 탄수화물(N-글리칸 시알산)의 존재가 다르다.

탄수화물 (촉각( antennarity )/N- 글리칸 )

표 2에, 탄수화물 구소의 분석이 요약된다. 기준 물질과 본 발명의 조성물의 유사한 탄수화물 구조에도 불구하고, 탄수화물 구조의 분포(distribution) 상이하다.

표 2: N- 글리칸 (탄수화물) 분석 결과

피크/시료	기준 물질 (몰-%)	본 발명의 조성물 (몰-%)
cF1GN2	34.1	18.2
cF1GN2G1	19.2	17.8
cF1GN2G3	30.1	51.5
cF1GN2G3	9.1	7.6
기타	7.6	4.9

탄수화물 (시알산)

본 발명의 조성물의 APG101의 몰당 시알산 양의 분석이 표 3에 요약된다.

표 3: 시알산(탄수화물) 분석

시료	시알산 함량 ( mol NeuAc / mol APG101 )
본 발명의 조성물	5.1
기준 물질(Reference material)	3.9

기준 물질은 항상 본 발명의 방법에 의해 제조되지 않는 APG101 혼합물이다.

최종적으로, APG101 이소형을 포함하는, 본 발명에 따른 혼합물의 생물활성(bioactivity)를 측정하는 분석을 수행했다.

3. APG101 이소형의 인 비트로 효능의 결정 방법

APG101의 생물학적 활성의 결정을 위해 Jurkat A3 영구 T-세포 주를 이용한 세포 분석을 이용한다. 이 효능을 도 5에 도식적으로 도시한다.

Jurkat A3 세포를 이용한 아폽토시스 분석으로, APG101에 의한 APG293 (=CD95L-T4; 250 ng/ml) 유도 아폽토시스의 억제에 대한 EC50 값을 결정한다.

요약하면, Jurkat A3 세포를 10 % FBS, 100 유닛/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640-배지 + GlutaMAX (GibCo)를 담은 플라스크에서 배양한다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 각 웰 당 100,000개의 세포를 접종한다. 별개의 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 고정된 농도 250 ng/ml의 CD95L-T4(APG293)를 상이한 농도의 APG101과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. APG101/CD95L-T4 혼합물을 세포에 첨가한 후, 뒤이어 37℃에서 3시간 인큐베이션한다. 용해 완충액 (250 mM HEPES, 50 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, 5 % Triton-X-100, 100 mM DTT, 10 mM AEBSF, pH 7.5)을 첨가하여 세포를 용해시키고, 플레이트를 30분 내지 2시간 동안 얼음 위에 둔다. 카스파아제(예를 들면, 카스파아제 3 및 7)의 증가된 활성에 의한 아폽토시스가 수반(parallel)된다. 따라서, 아폽토시스의 정도를 결정하기 위해 카스파아제 기질 Ac-DEVD-AFC의 절단을 이용한다. 실제로, 카스파아제 활성은 세포를 프로포디움 요오디드(propidium iodide) 및 Hoechst-33342로 염색한 후 형태학적으로 결정된 아폽토시스된 세포(apoptotic cell)의 비율과 상관된다.

카스파아제 활성 분석을 위해, 20 ㎕의 세포 용해물을 블랙 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮긴다. 50 mM HEPES, 1 % 수크로오스, 0.1 % CHAPS, 50 μM Ac-DEVD-AFC, 및 25 mM DTT, pH 7.5를 포함하는 80 ㎕ 완충액의 첨가 후에, 플레이트를 Tecan 마이크로타이터 플레이트 판독기로 옮기고, 주어진 시간 프레임 동안 형광 강도의 증가를 모니터링한다(여기 파장 400 nm, 방출 파장 505 nm). GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여, APG101에 대한 EC50 값 (즉, 주어진 CD95L 농도의 아폽토시스 유도의 50% 감소)을 계산한다.

효능 분석을 이용한 APG101의 생물학적 활성의 결정은 하기를 가능하게 한다:

- 높은 특이성. CD95와의 상호작용을 통해, CD95L-T4는 Jurkat A3 세포에 아폽토시스를 유도한다. CD95/CD95L-T4 상호작용을 APG101의 첨가에 의해 특이적으로 차단한다.

- 적절한 세포 시스템의 이용; 아폽토시스의 유도는 CD95/CD95L 신호전달의 중요한 생리학적 특징이고 잘 규명된 인간 T-세포주 Jurkat A3에서 모티터링될 수 있다.

- 96 웰 마이크로타이터 플레이트 및 짧은 인큐베이션 시간의 적용에 의한 높은 샘플 처리효율(throughput).

도 6은 비-본 발명의 방법(non-inventive step)에 의해 수득된 APG101 대비, 본 발명의 방법에 의해 수득된 APG101 이소형 혼합물(본 발명의 시료)의 생물학적 활성(EC50)을 나타낸다. 활성은 비슷하다.

4. APG101 제제의 열형광(thermofluorescence) 분석

본 발명에 따른 제제의 안정성을 열형광 분석법에 의해 확인하였다(도 8 및 9 참조).

APG101의 열 전이점(thermal transition point)의 결정을 열형광(TF) 분석을 통해 수행했다. 그에 의해, 형광 염료가 단백질의 소수성 패치에 결합한다. 온도 증가 동안, 단백질은 언폴딩되고(unfold), 보다 많은 염료가 결합할 수 있고, 형광 신호의 증가를 초래한다. 따라서, 보다 높은 열 전이점(융해 온도, Tm)은 APG101의 보다 안정한 상태를 나타낸다. 분석 셋업이 표 2에 도시된다.

표 2: 열형광 분석(thermofluorescence assay) 셋업

파라미터	값
염료(Dye)	Sypro Orange (Sigma)
염료 농도	1:1000
시료 부피	50 ㎕
시료 농도	100 μM/mL
온도 구배	35℃ 내지 95℃
온도 단계(step)	0.2℃ 내지 0.5℃
유지 시간(Holding time)	10 s

열 전이점은 온도의 증가 동안 형광 신호 증가의 변곡점(inflection point)으로 정의되었다. 상이한 완충 시스템에서 테스트했다 (도 8).

열형광 분석을 통해, APG101의 열 전이점을 상이한 부형제, 즉, 당, 폴리-알코올, 아미노산 및 폴리글리콜에 대해 출발 물질 3으로 결정했다. 실험 방법은 전술된 바와 동일했다. 결과가 도 9에 도시된다. Tm 값은 사카로오스, 소르비톨, 및 글리신 농도 증가에 따라 증가했다. 글리신글리신(Gly-Gly) 또는 PEG의 첨가는 양성 안정화 효과를 보이지 않았다.

또한, 본 발명에 따라 제조된 APG101 배치를 상용 Fas/Fc 시료와 비교하기 위해, 열형광 분석을 수행했다. 50 ㎍/ml의 시료 농도(APG101 또는 Fas/Fc)를 이용했다.

열형광 분석은 열 안정성에 대해, Sigma로부터의 상용 Fas/Fc 대비 2개의 배치의 본 발명의 APG101의 두 개의 배치(배치 F10176 및 배치 1011626)의 탁월성을 명확하게 밝혔다 (도 11).

<110> Apogenix GmbH <120> Composition comprising a mixture of CD95-Fc isoforms <130> 53445P WO <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant fusion protein consisting of human CD95 extracellular domain with human IgG1 FC-part to its C-terminus <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(16) <223> Variable cleavage sites <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <223> Variable cleavage sites <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(25) <223> Variable cleavage sites <220> <221> DOMAIN <222> (26)..(172) <223> Human CD95 extracellular domain <220> <221> MOD_RES <222> (26) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <220> <221> DISULFID <222> (59)..(73) <220> <221> DISULFID <222> (63)..(82) <220> <221> DISULFID <222> (85)..(101) <220> <221> DISULFID <222> (104)..(119) <220> <221> DISULFID <222> (107)..(127) <220> <221> CARBOHYD <222> (118) <223> N-linked Glycosylation at Position N118 <220> <221> DISULFID <222> (129)..(143) <220> <221> DISULFID <222> (135)..(140) <220> <221> CARBOHYD <222> (136) <223> N-linked Glycosylation at Position N136 <220> <221> DISULFID <222> (146)..(157) <220> <221> DISULFID <222> (149)..(165) <220> <221> DOMAIN <222> (172)..(400) <223> Human IgG1-FC domain <220> <221> DISULFID <222> (173) <223> Interchain cystine forming residue of the APG101 homodimer. <220> <221> DISULFID <222> (179) <223> Interchain cystine forming residue of the APG101 homodimer. <220> <221> DISULFID <222> (182) <223> Interchain cystine forming residue of the APG101 homodimer. <220> <221> DISULFID <222> (214)..(274) <220> <221> CARBOHYD <222> (250) <223> N-linked Glycosylation at Position N250 <220> <221> DISULFID <222> (320)..(378) <400> 1 Met Val Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn 35 40 45 Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro 65 70 75 80 Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His 85 90 95 Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly 100 105 110 Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg 115 120 125 Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp 130 135 140 Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr 145 150 155 160 Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Cys Asp Lys Thr 165 170 175 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 180 185 190 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 195 200 205 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 210 215 220 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 225 230 235 240 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 245 250 255 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 260 265 270 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 275 280 285 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 290 295 300 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 305 310 315 320 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 325 330 335 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 340 345 350 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 355 360 365 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 370 375 380 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395 400

Claims

4.0 내지 8.5의 pI 범위 내에 분포하는, 융합 단백질 이소형의 혼합물을 포함하는 조성물로서, 각 융합 단백질은 적어도 세포외 CD95 도메인 또는 그의 기능성 단편 및 적어도 Fc 도메인 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인인 것인 조성물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 융합 단백질은 APG101, APG101에 70% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드 및/또는 APG101의 기능성 단편인 것인 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pI 범위는 4.5 내지 7.8, 바람직하게는 5.0 내지 7.5인 것인 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 0.0 내지 5.0 몰-%의 융합 단백질 고분자량 형태, 예를 들면, 이량체 및/또는 응집체(aggregate)를 포함하는 것인 조성물.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 고 함량의 시알산을 포함하는 것인 조성물.
청구항 3 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 단축(shortened) 융합 단백질, 예를 들면, -17 융합 단백질, -21 융합 단백질 및/또는 -26 융합 단백질을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인 또는 그의 기능성 단편은 N-결합 글리코실화되고(N-linked glycosylated), 특히, 고 함량의 푸코실화 형태를 특징으로 하는 것인 조성물.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 차단(blocked) 융합 단백질, 예를 들면, pyro-Glu 변형에 의해 차단된 융합 단백질을 포함하고, 및/또는 유리 N-말단을 갖는 융합 단백질을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 80 내지 99 몰-%의 N-말단 차단 융합 단백질 및/또는 1 내지 20 몰-%의 유리 N-말단을 갖는 융합 단백질을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 제제(formulation).
청구항 11에 있어서,
(a) 포스페이트, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 100 mM 포스페이트, 보다 바람직하게는, 약 50 mM 포스페이트,
(b) 점도 증강제, 예를 들면, 소르비톨, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 중량-%의 점도 증강제, 보다 바람직하게는 약 5 중량-%의 점도 증강제를 더 포함하고, 및/또는
(c) 4 내지 8 범위의 pH 값을 갖는 것인 제제.
청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하는 방법.
청구항 13에 있어서,
(a) 세포 수확물(cell harvest)을 제공하는 유가식(fed-batch) 생산 과정에 의해 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하는 단계, 및
(b) 상기 세포 수확물로부터 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 조성물을 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 13 또는 14에 있어서,
단계 (a)는 관련된 수확 파라미터에 도달할 때까지 주어진 마스터 세포 배치의 일련의 배양 단계, 뒤이은 세포 침강 및 융합 단백질 함유 상층액의 여과를 포함하고, 및/또는
단계 (b)는 포획(capture) 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 일련의 음이온 및/또는 양이온 크로마토그래피, 바이러스 여과 및/또는 원하는 최종 단백질 농도로의 조정을 포함하는 것인 방법.