BR112015000732B1

BR112015000732B1 - Composição farmacêutica compreendendo uma mistura de isoformas de cd95-fc, método para a produção da mesma e formulação

Info

Publication number: BR112015000732B1
Application number: BR112015000732-5A
Authority: BR
Inventors: Oliver Hill; Christian Gieffers; Meinolf Thiemann
Original assignee: Apogenix Ag
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2023-01-10
Also published as: EP2875045A1; RU2648146C2; AU2013291982B2; KR20150048120A; JP2015524403A; AU2013291982A1; BR112015000732A2; CA2878992A1; DK2875045T3; EP3406630A1; CA2877989A1; HK1207096A1; US9657083B2; US20160362471A1; CA2877989C; MX371430B; RU2015105330A; JP2015528006A; US9315570B2; AU2013291984B2

Abstract

COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UMA MISTURA DE ISOFORMAS DE CD95-FC. A presente invenção refere- se a uma composição compreendendo uma mistura de isoformas de proteínas de fusão, cada proteína de fusão compreendendo um domínio CD95 extracelular ou um fragmento funcional do mesmo ou um domínio Fc ou fragmento funcional do mesmo, formulações proporcionando a referida composição em uma forma estável bem como um método para a produção de uma composiçãosimilar.

Description

DESCRIÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a uma composição compreendendo uma mistura de isoformas de proteínas de fusão, cada proteína de fusão compreendendo um domínio CD95 extracelular ou um fragmento funcional do mesmo ou um domínio Fc ou fragmento funcional do mesmo, formulações proporcionando a referida composição em uma forma estável bem como um método para a produção de uma composição similar.

[0002] Proteínas de fusão compreendendo o domínio extracellular do receptor de apoptose CD95 (Apo-1; Fas) fundido a um domínio Fc de imunoglobulina são descritas no documento de patente No. PCT/EP04/03239. No entanto, foi verificado ser difícil proporcionar as referidas proteínas de fusão em quantidades suficientes com uma estabilidade suficiente.

[0003] Com a presente invenção é possível pela primeira vez proporcionar os referidos métodos ou composições.

[0004] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição compreendendo uma mistura de isoformas de proteínas de fusão, cada proteína de fusão compreendendo no mínimo um domínio CD95 extracelular (APO-1; Fas) ou um fragmento funcional do mesmo e no mínimo um segundo domínio sendo um domínio Fc ou um fragmento funcional do mesmo se distribuindo dentro de uma faixa de pI de cerca de 4,0 até cerca de 8,5. Por conseguinte, o domínio CD95 extracelular conforme usado aqui, neste pedido de patente, também pode ser denominado “primeiro domínio”, enquanto o domínio Fc pode ser denominado “segundo domínio”.

[0005] A proteína do primeiro domínio é um domínio CD95 extracelular, preferencialmente um domínio extracelular de mamífero, em particular uma proteína humana, isto é, um domínio CD95 extracelular humano. O primeiro domínio, isto é, o domínio CD95 extracelular, da proteína de fusão preferencialmente compreende a sequência de aminoácidos até o aminoácido 170, 171, 172 ou 173 de CD95 humano (SEQ ID NO. 1). Um peptídeo sinal (por exemplo, posição 1-25 de SEQ ID NO: 1) pode estar presente ou não.

[0006] Particularmente para fins terapêuticos, é preferencial o uso de uma proteína humana.

[0007] A proteína de fusão pode compreender um ou mais primeiros domínios os quais podem ser os mesmos ou diferentes. No entanto, é preferencial um primeiro domínio, isto é, uma proteína de fusão compreendendo um domínio CD95 extracelular.

[0008] De acordo com uma modalidade preferencial, o domínio Fc ou fragmento funcional do mesmo, isto é, o segundo domínio da proteína de fusão de acordo com a invenção, compreende o domínio CH2 e/ou CH3, e opcionalmente no mínimo uma parte do domínio da região de articulação ou um domínio imunoglobulina modificado derivado a partir do mesmo. O domínio imunoglobulina pode ser um domínio imunoglobulina IgG, IgM, IgD, ou IgE ou um domínio imunoglobulina modificado derivado, a partir dos mesmos. Preferencialmente, o segundo domínio compreende no mínimo uma porção de um domínio imunoglobulina IgG constante. O domínio imunoglobulina IgG pode ser selecionado entre domínios IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 ou entre domínios modificados a partir dos mesmos. Preferencialmente, o segundo domínio é um domínio Fc humano, tal como um domínio Fc de IgG, por exemplo, um domínio Fc de IgG1 humana.

[0009] A proteína de fusão pode compreender um ou mais segundos domínios os quais podem ser os mesmos ou diferentes. No entanto, é preferencial um segundo domínio, isto é, uma proteína de fusão compreendendo um domínio Fc.

[0010] Adicionalmente, tanto o primeiro quanto os segundos domínios são preferencialmente da mesma espécie.

[0011] O primeiro domínio, isto é, o domínio CD95 extracelular ou o fragmento funcional do mesmo pode estar localizado no N- ou C- terminal. O segundo domínio, isto é, o domínio Fc ou fragmento funcional também pode estar localizado no C- ou N-terminal da proteína de fusão. No entanto, é preferencial o domínio CD95 extracelular no N- terminal da proteína de fusão.

[0012] De acordo com uma modalidade preferencial adicional, a proteína de fusão é APG101 (CD95-Fc, posição 26-400 na SEQ ID NO: 1). Conforme definido pela SEQ ID NO: 1 APG101 pode ser uma proteína de fusão compreendendo um domínio CD95 extracelular humano (aminoácidos 26-172) e um domínio Fc de IgG1 humana (aminoácidos 172-400), além disso opcionalmente compreendendo uma sequência de sinal N-terminal (por exemplo, aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1). A presença do peptídeo sinal indica a forma imatura de APG101. Durante maturação, o peptídeo sinal é clivado. De acordo com uma modalidade especialmente preferencial a sequência de sinal é clivada. APG101 com a sequência de sinal também é compreendida pelo termo “APG101 não modificada”. Em uma modalidade adicional, a proteína de fusão é um polipeptídeo tendo no mínimo 70% de identidade, mais preferencialmente 75% de identidade, 80% de identidade, 85% de identidade, 90% de identidade, 95% de identidade, 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade, 99% de identidade com APG101. De acordo com o presente requerimento o termo “identidade” se refere à extensão na qual duas sequências de aminoácidos sendo comparadas são invariantes, em outras palavras, compartilham os mesmos aminoácidos na mesma posição.

[0013] O termo “APG101” descreve uma proteína de fusão da posição 26-400 da SEQ ID NO: 1, com e/ou sem um peptídeo sinal. O termo “APG101” também inclui proteínas de fusão contendo formas truncadas em seu N-terminal do domínio CD95 extracelular.

[0014] Em outra modalidade preferencial a proteína de fusão de acordo com a invenção é um fragmento funcional de APG101. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo “fragmento” geralmente designa um “fragmento funcional”, isto é, um fragmento ou porção de uma proteína selvagem ou de comprimento total a qual tem essencialmente a mesma atividade biológica e/ou propriedades que a proteína selvagem ou de comprimento total correspondente tem.

[0015] Uma pessoa versada na arte está ciente de métodos para projetar e produzir proteínas de fusão de acordo com a presente invenção. A mistura de isoformas de proteínas de fusão, em particular isoformas de APG101, no entanto, é obtida pelo método descrito nas partes que se seguem. Os métodos referidos são descritos, por exemplo, na publicação de patente PCT/EP04/03239. De acordo com uma modalidade preferencial projetar uma proteína de fusão da presente invenção compreende uma seleção do um ou mais aminoácidos terminais do primeiro domínio e do segundo domínio de modo a criar no mínimo uma sobreposição de aminoácidos entre ambos os domínios. A sobreposição entre o primeiro e o segundo domínio ou entre os dois primeiros domínios tem uma extensão de preferencialmente 1, 2 ou 3 aminoácidos. Mais preferencialmente, a sobreposição tem uma extensão de um aminoácido. Exemplos para aminoácidos de sobreposição são S, E, K, H, T, P, e D.

[0016] A composição de acordo com a invenção compreende uma mistura de isoformas de proteínas. O termo “isoforma” conforme usado aqui, neste pedido de patente, designa diferentes formas da mesma proteína, tais como diferentes formas de APG101, em particular APG101 sem sequência de sinal. As isoformas referidas podem diferir, por exemplo, pelo comprimento da proteína, por aminoácido, isto é, substituição e/ou deleção, e/ou modificação pós-translacional quando comparadas com a proteína não modificada correspondente, isto é, a proteína a qual é traduzida e expressada a partir de uma determinada sequência codificante sem qualquer modificação. Diferentes isoformas podem ser distinguidas, por exemplo, por eletroforese, tal como SDS- eletroforese, e/ou focagem isoelétrica a qual é preferencial de acordo com a presente invenção.

[0017] Isoformas diferindo na extensão da proteína podem ser, por exemplo, estendidas e/ou encurtadas em seu N-terminal e/ou em seu C-terminal quando comparadas com a proteína não modificada correspondente. Por exemplo, uma mistura de isoformas de APG101 de acordo com a invenção pode compreender APG101 em forma não modificada bem como variantes das mesmas estendidas e/ou encurtadas em seu N-terminal e/ou em seu C-terminal.

[0018] Portanto, de acordo com uma modalidade preferencial, a mistura de acordo com a invenção compreende variantes de APG101 encurtadas em seu N-terminal e/ou em seu C-terminal.

[0019] Em particular é preferencial uma mistura de isoformas de proteínas de fusão compreendendo proteínas de fusão encurtadas em seu N-terminal.

[0020] As proteínas de fusão encurtadas podem compreender uma sequência SEQ ID NO: 1 truncada em seu N-terminal por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 e/ou 50 aminoácidos. Proteínas de fusão encurtadas preferenciais têm SEQ ID NO: 1 truncada em seu N-terminal por 16, 20, ou 25 aminoácidos.

[0021] As proteínas de fusão encurtadas em seu N-terminal referidas também podem ser denominadas em termos da presente invenção e compreendem -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, - 13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -35, -40, -45 e/ou -50 variantes de APG101 não modificada encurtadas em seu N-terminal. São particularmente preferenciais -17, - 21 e/ou -26 variantes encurtadas em seu N-terminal. A numeração se refere às proteínas APG101 incluindo sequência de sinal de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o número se refere ao primeiro aminoácido na variante de APG101 truncada em seu N-terminal.

[0022] Isto significa que uma proteína de fusão encurtada tendo SEQ ID NO: 1 truncada em seu N-terminal por 16 aminoácidos corresponde a uma variante de APG101 designada -17 e resulta em uma proteína tendo os aminoácidos 17-400 de SEQ ID NO: 1, truncada em seu N-terminal por 20 aminoácidos corresponde a -21 (aminoácidos 21 - 400 de SEQ ID NO: 1) e truncada em seu N-terminal por 25 aminoácidos corresponde a -26 (aminoácidos 26 - 400 de SEQ ID NO: 1).

[0023] Um exemplo para um encurtamento C-terminal de isoformas de APG101 é Lys-clipagem C-terminal.

[0024] De acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção a mistura de proteínas de fusão da composição de acordo com a presente invenção preferencialmente compreende 50 mol % de APG101 não modificada em relação a isoformas modificadas, mais preferencialmente 40 % em mol de APG101 não modificada, mais preferencialmente 30 % em mol de APG101 não modificada, mais preferencialmente 20, mais preferencialmente 10 % em mol de APG101 não modificada, mais preferencialmente 5 % em mol de APG101 não modificada e ainda mais preferencialmente 3 % em mol de APG101 não modificada e o mais preferencialmente 1 % em mol e/ou menos de APG101 não modificada. A mais preferencial é uma modalidade compreendendo uma mistura de isoformas de proteínas de fusão que não compreende qualquer APG101 não modificada.

[0025] Conforme resumido acima, as isoformas também podem diferir por substituição de aminoácidos, deleção de aminoácidos e/ou adição de aminoácidos. Uma substituição e/ou deleção semelhante pode compreender um ou mais aminoácidos. No entanto, a substituição de um único aminoácido é preferencial de acordo com esta modalidade.

[0026] Isoformas de acordo com a invenção também podem diferir com respeito a modificação pós-translacional. Modificação pós- translacional de acordo com a presente invenção pode envolver, sem ser limitada a isto, a adição de grupamentos hidrofóbicos, em particular para localização de membrana tal como miristoilação, palmitoilação, isoprenilação ou glipiação, A adição de cofatores para atividade enzimática reforçada tal como lipoiação, a adição de grupamentos químicos menores tais como acilação, formilação, alquilação, metilação, amidação no C-terminal, adição de aminoácidos, Y—carboxilação, glicosilação, hidroxilação, oxidação, glicilação, biotinilação e/ou peguilação.

[0027] De acordo com a presente invenção a adição de ácidos siálicos, glicosilação à base de Fc, em particular glicosilação N-terminal à base de Fc, e/ou modificação piro-Glu são modalidades preferenciais de modificação pós-translacional.

[0028] De acordo com uma modalidade preferencial as proteínas de fusão compreendidas pela composição da invenção compreendem altas quantidades de ácidos siálicos. De acordo com a presente invenção o teor de ácido siálico é preferencialmente a partir de cerca de 4,0 até 7,0 mol de NeuAc/mol de APG101, mais preferencialmente a partir de 4,5 até 6,0 mol de NeuAc/mol de APG101 e o mais preferencialmente cerca de 5,0 mol de NeuAc/mol de APG101. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, ácidos siálicos se referem a derivados N- ou O- substituídos de ácido neuramínico. Um ácido siálico preferencial é ácido N-acetilneuramínico (NeuAc). O grupamento amino geralmente tem ou um grupamento acetil ou um grupamento glicolil porém têm sido descritas outras modificações. Os substituintes hidroxila podem variar consideravelmente. Substituintes hidroxila preferenciais são grupamentos acetil, lactil, metil, sulfato e/ou fosfato. A adição de ácido siálico resulta geralmente em proteínas mais aniônicas. A carga negativa resultante dá a esta modificação a capacidade de modificar a carga superficial de uma proteína e a capacidade de ligação. Altas quantidades de ácido siálico levam a melhor estabilidade sérica e, portanto, aprimorada farmacocinética e menor imunogenicidade. O alto grau de sialilação das isoformas de APG101 da presente invenção pode ser explicado pela alta quantidade de estrutura diantenária. Foi considerado como altamente surpreendente que as isoformas de APG101 na composição da invenção obtidas pelo método da invenção apresentam um tal grau elevado de adição de ácido siálico.

[0029] De acordo com a presente invenção, glicosilação designa uma reação na qual um carboidrato é anexado a um grupamento funcional de uma proteína de fusão, fragmento funcional do mesmo conforme definido aqui, neste pedido de patente. Em particular, se refere à adição de um carboidrato a APG101 ou uma isoforma da mesma. O carboidrato pode ser adicionado, por exemplo, por N-ligação ou O-ligação. Carboidratos N-ligados são anexados a um nitrogênio de cadeias laterais de asparagina ou arginina. Carboidratos ligados por O são anexados ao hidróxi oxigênio de cadeias laterais de serina, treonina, tirosina, hidroxilisina ou hidroxiprolina. De acordo com a presente invenção, é preferencial N-ligação, em particular glicosilação N-terminal à base de Fc. Sítios de glicosilação N-ligados particularmente preferenciais estão localizados nas posições N118, N136 e/ou N250 de APG101 (SEQ ID NO: 1).

[0030] Fucosilação de acordo com a presente invenção se refere à adição de unidades de açúcar fucose a uma molécula. Com respeito à presente invenção, uma tal adição de uma unidade de açúcar fucose à proteína de fusão, e em particular a APG101, representa um tipo especialmente preferencial de glicosilação. Uma alta porção de formas fucosiladas leva a uma reduzida citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Portanto, a mistura de isoformas de proteínas de fusão é caracterizada por ADCC reduzida, a qual é benéfica para aplicações farmacêuticas e de diagnóstico.

[0031] Logicamente, além do primeiro e do segundo domínio conforme definido aqui, neste pedido de patente, as proteínas de fusão de acordo com a invenção podem compreender domínios adicionais tais como domínios de direcionamento adicionais, por exemplo, anticorpos de cadeia única ou fragmentos dos mesmos e/ou domínios de sinal. De acordo com uma modalidade adicional, a proteína de fusão usada de acordo com a invenção pode compreender uma sequência de sinal N- terminal, a qual permite secreção a partir de uma célula hospedeira depois de expressão recombinante. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal a qual é homóloga ao primeiro domínio da proteína de fusão. Alternativamente, a sequência de sinal também pode ser uma sequência de sinal heteróloga. Em uma modalidade diferente a proteína de fusão é livre de uma sequência N-terminal adicional, tal como um peptídeo sinal.

[0032] A composição de acordo com a presente invenção pode compreender proteínas de fusão bloqueadas em seu N-terminal, as quais proporcionam uma maior estabilidade com respeito à degradação N-terminal por proteases, bem como proteínas de fusão tendo um N- terminal livre, a qual proporciona uma maior estabilidade com respeito a degradação N-terminal por proteases.

[0033] Modificações bloqueando o N-terminal de proteína são de conhecimento de uma pessoa versada na arte. No entanto, uma modificação pós-translacional preferencial de acordo com a presente invenção bloqueando o N-terminal é a modificação piro-Glu. Piro-Glu também é denominado ácido carboxílico de pirrolidona. Modificação piro-Glu de acordo com a presente invenção se refere à modificação de uma glutamina N-terminal por ciclização da glutamina através de condensação do grupamento α-amino com um grupamento carboxila de cadeia lateral. Proteínas modificadas mostram uma meia-vida aumentada. Uma modificação semelhante também pode ocorrer em um resíduo glutamato. Particularmente preferencial é uma modificação piro- Glu, isto é, um ácido carboxílico de pirrolidona, com respeito à proteína de fusão -26 encurtada em seu N-terminal.

[0034] Em uma modalidade preferencial do presente requerimento a composição de acordo com a presente invenção compreende 80 a 99 % em mol de proteínas de fusão bloqueadas em seu N-terminal e/ou 1 a 20 % em mol de proteínas de fusão tendo um N-terminal livre.

[0035] De acordo com uma modalidade preferencial adicional a composição compreende 0,0 a 5,0 % em mol, mais preferencialmente 0,0 a 3,0 % em mol de e ainda mais preferencialmente 0,0 a 1,0 % em mol, de formas de alto peso molecular de proteínas de fusão tais como agregados. Em uma modalidade preferencial a composição de acordo com a presente invenção não compreende quaisquer agregados de isoformas de proteínas de fusão, em particular não compreendem dímeros ou agregados de APG101. Dímeros ou agregados são geralmente indesejáveis porque têm um efeito negativo sobre a solubilidade.

[0036] A forma funcional de APG101 compreende duas proteínas de fusão, conforme descrito aqui, neste pedido de patente, acopladas por pontes de dissulfeto na região de articulação nas posições 179 ou/e 182 com referência à SEQ ID NO: 1 das duas moléculas (vide a Figura 7) . A ponte de dissulfeto também pode ser formada na posição 173 com referência à SEQ ID NO: 1 das duas moléculas, resultando em uma estabilidade aprimorada. Se a ponte de dissulfeto na posição 173 com referência à SEQ ID NO: 1 não for necessária, o resíduo Cys nesta posição pode ser substituído por outro aminoácido, ou pode ser deletado.

[0037] Em uma modalidade preferencial a mistura de acordo com a presente invenção é proporcionada pelo método de acordo com a presente invenção descrito aqui, neste pedido de patente.

[0038] De acordo com a invenção, a mistura de isoformas de proteínas de fusão se distribui dentro de uma faixa de pI de cerca de 4,0 até cerca de 8,5. Em uma modalidade adicional a faixa de pI da mistura de isoformas de proteínas de fusão compreendida pela composição de acordo com a invenção é de cerca de 4,5 até cerca de 7,8, mais preferencialmente cerca de 5,0 até cerca de 7,5.

[0039] O ponto isoelétrico (pI) é definido pelo valor do pH no qual uma molécula ou superfície em particular não carrega nenhuma carga elétrica. Dependendo da faixa de pH do meio circundante, os aminoácidos de uma proteína podem carregar diferentes cargas positivas ou negativas. A soma de todas as cargas de uma proteína é zero em uma faixa de pH específica, seu ponto isoelétrico, isto é, o valor de pI. Se uma molécula de proteína em um campo elétrico atingir um ponto do meio tendo este valor do pH, sua mobilidade eletroforética diminui e permanece neste sítio. Uma pessoa versada na arte está familiarizada com métodos para a determinação do valor de pI de uma dada proteína, tal como focagem isoelétrica. A técnica é capaz de resolução extremamente elevada. Proteínas diferindo por uma única carga podem ser separadas e/ou fracionadas.

[0040] A composição de acordo com a presente invenção descrita aqui, neste pedido de patente, pode ser usada para aplicações farmacêuticas, de diagnóstico e/ou de pesquisa. Pode ser aplicada em medicina humana bem como em medicina veterinária.

[0041] Outro aspecto da presente invenção se refere a uma formulação compreendendo uma composição de acordo com a invenção.

[0042] De acordo com uma modalidade preferencial a formulação compreende (a) fosfato, mais preferencialmente cerca de 1 mM até cerca de 100 mM de tampão de fosfato, mais preferencialmente cerca de 5 mM de fosfato até cerca de 85 mM de fosfato, mais preferencialmente cerca de 20 mM até cerca de 80 mM de fosfato, mais preferencialmente cerca de 30 mM até cerca de 70 mM de fosfato, ainda mais preferencialmente cerca de 40 mM até cerca de 60 mM de fosfato, o mais preferencialmente cerca de 50 mM de fosfato, (b) um agente de reforço da viscosidade, preferencialmente cerca de 0,1 a 10 % em peso de agente de reforço da viscosidade, mais preferencialmente de 1 a 8 % em peso de agente de reforço da viscosidade, mais preferencialmente cerca de 3 % em peso até cerca de 7 % em peso de agente de reforço da viscosidade, ainda mais preferencialmente cerca de 6 % em peso até cerca de 7 % em peso de agente de reforço da viscosidade, e o mais preferencialmente cerca de 5 % em peso de agente de reforço da viscosidade, e (c) tem um valor do pH na faixa de 4 a 8.

[0043] Nos termos da presente invenção, o termo “fosfato” é compreende qualquer tampão de fosfato adequado conhecido pela pessoa versada na arte. De acordo com uma modalidade especialmente preferencial o tampão de fosfato é fosfato de Na.

[0044] Agentes de reforço ou de aumento da viscosidade são de conhecimento geral de uma pessoa versada na arte e compreendem ácido algínico, carboximetil celulose, dextrina, gelatina, goma guar, hidroxietil celulose, silicato de magnésio e alumínio, álcool polivinílico, óxido de polietileno, dióxido de silício, amido, goma xantano, etc. Excipientes adicionais os quais logicamente podem estar presentes compreendem Sacarose, sorbitol e/ou glicina. No entanto, um agente de reforço da viscosidade o qual é especialmente preferencial de acordo com a presente invenção é sorbitol. De acordo com uma modalidade especialmente preferencial, o agente de reforço da viscosidade sorbitol está presente com cerca de 5 % em peso.

[0045] O valor do pH da formulação de acordo com a presente invenção está dentro da faixa de cerca de 4 a 8. De acordo com uma modalidade preferencial, está dentro da faixa de 5 a 8, mais preferencialmente de 6 a 8 e ainda mais preferencialmente de 6,5 a 8. De acordo com uma modalidade especialmente preferencial, o pH é cerca de 6,5, cerca de 7,0 ou cerca de 7,5.

[0046] De acordo com uma modalidade especialmente preferencial, a formulação de acordo com a presente invenção compreende cerca de 30 mM de fosfato de Na ou cerca de 50 mM de fosfato de Na, cerca de 5 % de sorbitol e apresenta um valor do pH de cerca de 6,5 (cf. os tampões 5 e 6 da Figura 10).

[0047] Surpreendentemente, a composição da invenção proporcionada naquele tipo de formulação é muito estável e não tende a formar agregados. Por exemplo, as formulações da presente invenção são adicionalmente caracterizadas por reduzida fragmentação de APG101. Além disso, foi possível proporcionar altas concentrações de proteínas, por exemplo, cerca de 20 mg/mL em forma estável.

[0048] A composição e/ou formulação de acordo com a invenção pode ser administrada a um sujeito que necessite da mesma, particularmente um paciente humano, em uma dose suficiente para o tratamento das condições específicas por meios adequados. Por exemplo, a composição e/ou formulação de acordo com a invenção pode ser formulada como uma composição farmacêutica junto com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. A eficácia terapêutica e a toxicidade podem ser determinadas de acordo com protocolos de rotina. A composição farmacêutica pode ser administrada sistemicamente, por exemplo, por via intraperitoneal, por via intramuscular, ou por via intravenosa ou localmente tal como por via intranasal, por via subcutânea ou por via intratecal. A dose da composição e/ou formulação administrada, logicamente, será dependente do sujeito a ser tratado e da condição do sujeito tal como o peso do sujeito, a idade do sujeito e o tipo e a gravidade da doença ou lesão a ser tratada, da maneira de administração e do critério do médico que prescrever. Por exemplo, é adequada uma dose diária de 0,001 a 100 mg/kg.

[0049] Outro aspecto da presente invenção se refere a uma composição farmacêutica ou formulação compreendendo a composição ou formulação de acordo com a invenção, a qual contém no mínimo um agente ativo adicional. Qual agente ativo adicional é usado depende da indicação a ser tratada. Por exemplo, agentes citotóxicos tais como doxorrubicina, cisplatina ou carboplatina, citocinas ou outros agentes antineoplásicos podem ser usados no tratamento de câncer.

[0050] A formulação e/ou composição de acordo com a invenção pode compreender adicionalmente veículos, diluentes, e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. O termo “veículo” quando usado aqui, neste pedido de patente, inclui veículos, excipientes e/ou estabilizantes que são não tóxicos para a célula ou mamífero sendo exposto aos mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente os veículos fisiologicamente aceitáveis são soluções aquosas de pH tamponado ou lipossomas. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos (no entanto, com respeito à formulação da presente invenção, é preferencial um tampão de fosfato); antioxidantes incluindo ácido ascórbico, polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinil pirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas, agentes de gelificação tais como EDTA, açúcar, álcoois tais como manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio; e/ou tensoativos não-iônicos tais como TWEEN, polietileno ou polietileno glicol.

[0051] De acordo com uma modalidade preferencial a composição e/ou formulação de acordo com a invenção pode ser usada para inibir o caminho de sinalização de CD95, em particular o caminho apoptótico extrínseco desencadeado pelo CD95L, isto é, o ligante de receptor de CD95. Em particular, a composição pode ser usada na profilaxia e/ou no tratamento de distúrbios selecionados entre transtornos autoimunes, AIDS, distúrbios do coração, por exemplo, enfarte do miocárdio, transtornos de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, lesão cerebral, por exemplo, derrame, lesões da medula espinhal, septicemia, hepatite, distúrbios associados com inflamação, lesão de reperfusão isquêmica e distúrbios renais. Logicamente, a composição e/ou formulação descrita aqui, neste pedido de patente, pode ser usada para o tratamento de cânceres, preferencialmente cânceres sólidos, por exemplo, cânceres cerebrais, por exemplo, glioblastomas. Alternativamente, o câncer a ser tratado pode ser um câncer de origem linfoide ou mieloide.

[0052] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método para a produção de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com uma modalidade preferencial o método compreende as etapas (a) produção de uma composição conforme proporcionado pela presente invenção por um processo de produção de alimentação descontínua, proporcionando uma colheita de células e (b) isolamento da composição da presente invenção a partir da colheita de células.

[0053] Uma vantagem do método da presente invenção comparado com os métodos conhecidos da arte anterior é sua alta produção.

[0054] A etapa (a), isto é, o “método para a produção de uma composição de acordo com a presente invenção por um processo de produção de alimentação descontínua proporcionando uma colheita de células” também será designada como “processo a montante (USP)” nas partes que se seguem. O método de acordo com a etapa (a) da presente invenção também é referido como “processo a montante da invenção”. A Figura 1 mostra uma comparação do processo a montante de acordo com a arte anterior e uma modalidade preferencial do processo a montante da presente invenção.

[0055] A etapa (b), isto é, “isolamento da composição da presente invenção a partir da colheita de células” também será designado como “processo a jusante (DSP)” nas partes que se seguem.

[0056] Preferencialmente, a etapa (a) compreende uma série de etapas de cultura de um determinado banco de células mestre até serem atingidos parâmetros de colheita relevantes seguidos por sedimentação e filtração de proteína de fusão, preferencialmente contendo sobrenadante. Em uma modalidade preferencial da presente invenção as etapas do processo do processo a montante podem ser resumidas como uma série compreendendo as seguintes etapas. Descongelamento, subcultura, bioreator de 50 L, bioreator de 200 L, bioreator de 1000 L, sedimentação, filtração em profundidade e filtração a 0,2 μm.

[0057] Logicamente, a realização das etapas de cultura a partir de subcultura até o biorreator de 1000 L é somente um modo de realizar a invenção. Por exemplo, as etapas de cultura podem ser realizadas em biorreatores com tamanhos variáveis também. Logicamente, durante a série de etapas de subcultura, a pessoa versada na arte pode determinar parâmetros adequados como temperatura, tempo de crescimento, meio, etc. O fator crucial é obter parâmetros de colheita relevantes, os quais podem ser um título, a densidade celular, com o título estando preferencialmente dentro de uma faixa de 0,5 gL//L a 5 gL//L, mais preferencialmente de 1 gL//L a 3 gL//L, mais preferencialmente de 1,5 gL//L a 5 gL//L e o mais preferencialmente sendo de 1,8 gL//L a 2 gL//L. Exemplos para valores preferenciais de densidade celular são cerca de 1 x 106 a 1 x 108 células/mL, preferencialmente cerca de 1 x 107 células/mL. Em uma modalidade especialmente preferencial da presente invenção o título é cerca de 1,8 gL//L até cerca de 2 gL//L e a densidade celular é cerca de 1 x 107 células/mL.

[0058] O método de acordo com a presente invenção é preferencialmente realizado em um meio basal contendo peptona e em um meio quimicamente definido.

[0059] A etapa (b) pode compreender cromatografia de captura, inativação de vírus, uma série de cromatografia de ânions e/ou cátions, filtração de vírus e/ou ajuste para uma concentração de proteína final desejada.

[0060] O processo a jusante de purificação de uma composição compreendendo as isoformas de APG101 obtidas pela etapa (a) de acordo com a etapa (b) definida acima compreende etapas de cromatografia, uma etapa de inativação de vírus, uma etapa de ultrafiltração, uma etapa de diafiltração e uma etapa de filtração de vírus. De acordo com uma modalidade preferencial, este processo a jusante compreende três etapas cromatográficas diferentes. A primeira etapa de cromatografia é realizada com uma resina para capturar a proteína alvo e/ou para remover impurezas relacionadas com o processo (por exemplo, HCPs, DNA) e ou para reduzir o volume da fração contendo produto. Uma resina correspondente pode ser selecionada pela pessoa versada na arte. Um exemplo de uma resina é Mab Select SuRE, a qual é também uma modalidade preferencial de acordo com a invenção.

[0061] Depois desta primeira etapa de cromatografia, segue-se uma etapa de inativação de vírus. Preferencialmente, esta etapa de inativação de vírus é realizada sob condições acidíferas (por exemplo, pH 3,5 ± 0,2) seguida por um condicionamento do conjunto de inativação ou em um valor do pH menos acidífero tal como pH 5,0. A matriz de tampão para inativação de vírus e subsequente ajuste para pH 5,0 pode ser exclusivamente à base de 20 nM de tampão de citrato de Na.

[0062] Depois desta cromatografia da etapa de inativação de vírus, uma etapa de permuta de íons é realizada de modo a reduzir impurezas relacionadas com o processo tais como DNA. De acordo com a presente invenção uma etapa de permuta de ânions cromatografia (AIEX) é preferencial, em particular em um modo de fluxo de passagem. A proteína alvo passa a coluna de AIEX, ao passo que o DNA liga à resina. Preferencialmente, o conjunto de fluxo de passagem de AIEX é em seguida processado sem qualquer condicionamento usando uma etapa à base de coluna adicional. Esta etapa adicional opcional contribui para a redução global de contaminação viral e HCP residual, DNA e ligante de proteína A descorada. De acordo com uma modalidade preferencial é usada uma coluna operada por resina capto-MMC de modo misto (mix-mode resin capto-MMC operated column) em modo de ligação / elutriado.

[0063] O elutriado é passado através de um filtro de vírus (VF) e aplicado a uma etapa de ultra-diafiltração (UF/DF) em seguida. De acordo com a invenção uma carga volumétrica específica de < 100 L/m2 pode ser obtida na etapa de filtração de vírus. Preferencialmente, é usada uma membrana com um corte de cerca de um 30 kD. Logicamente, etapas de purificação única descritas acima podem ser substituídas por etapas de conhecimento da pessoa versada na arte obtendo o mesmo efeito ou um efeito comparável.

[0064] Finalmente, o retentado de UF/DF é formulado e a concentração da composição de APG101 de acordo com a presente invenção é ajustada para a concentração de proteína desejada tal como 20 ± 2 mg/mL.

[0065] A Figura 2 ilustra o fluxograma de uma modalidade preferencial de um processo a jusante de acordo com a presente invenção. Conforme pode ser depreendido a partir da Figura 3, o processo a jusante da invenção é caracterizado por uma série de vantagens em relação aos processos a jusante conhecidos da arte anterior. Por exemplo, depois de inativação de vírus, não é necessária nenhuma etapa de retenção em um valor do pH neutro. Com respeito à etapa de filtração de vírus, é possível uma carga volumétrica < 100 L/m2 comparada com 37 g/m2 conhecidos nos processos anteriores. Além disso, usando a formulação tampão da presente invenção, podem ser atingidas altas concentrações de proteínas tais como 20 mg/mL comparadas com 10 mg/mL em PBS.

[0066] O método para a produção de uma composição de acordo com a presente invenção, o qual é descrito aqui, neste pedido de patente, resulta em isoformas de APG101 na faixa de pI de 4,0 a 8,5. Uma composição proporcionada deste modo somente contém quantidades muito pequenas de formas de maior peso molecular indesejáveis tais como dímeros ou agregados. As isoformas de APG101 proporcionadas deste modo são caracterizadas por teor de altas quantidades de ácido siálico bem como glicosilação N-terminal à base de Fc compreendendo altas quantidades de formas fucosiladas.

Figuras

[0067] Figura 1: Comparação do processo a montante da invenção com um processo a montante não da invenção

[0068] Figura 2: Fluxograma mostrando uma modalidade preferencial do processo a jusante da invenção

[0069] Figura 3: Comparação do processo a jusante da invenção com um processo a jusante não da invenção

[0070] Figura 4a: IEF de fração de AEX de uma mistura de APG101 obtida pelo método da invenção.

[0071] Figura 4b: IEF de fração de AEX de uma mistura de APG101 obtida pelo método não da invenção.

[0072] Figura 5: Visão geral esquemática do teste de potência.

[0073] Figura 6: Atividade biológica in vitro (EC50) de misturas de isoformas de APG101 obtidas pelo método da invenção comparadas com APG101 obtida por métodos não da invenção.

[0074] Figura 7: Molécula de APG101 funcional.

[0075] Figura 8: Resultados de teste de termofluorescência de uma comparação de tampão de composição de APG101.

[0076] Figura 9: Resultados de teste de termofluorescência de uma comparação de excipiente de composição de APG101.

[0077] Figura 10: Resultados analíticos de estudo de estabilidade de degradação forçada: Excipientes (+) apresentam boa e (-) apresentam fraca performance do tampão em relação à estabilidade de APG101.

[0078] Figura 11: Teste de Termofluorescência Avaliando a Estabilidade Térmica de Dois Lotes de APG101 da Apogenix em Comparação Direta com Fas/Fc Disponível Comercialmente.

Exemplo 1 Método para a produção de uma composição de acordo com a invenção

[0079] O método para proporcionar uma composição de acordo com a presente invenção compreende um processo a montante e um processo a jusante conforme definido acima.

1. Processo a montante 1.1 Definição de batelada

[0080] A composição compreendendo isoformas de APG101 é produzida em uma cultura em batelada alimentada. Dois frascos do banco de células mestre MCB1AGA são descongelados. A viabilidade da terceira subcultura tem de ser > 90%, a contagem de células viáveis tem de ser >1,5x106 células/mL. Se ambos os frascos satisfizerem estas especificações, a cultura com a maior viabilidade é usada para a quarta subcultura e inoculação do reator de semente. A cultura com menor viabilidade será descartada depois da terceira subcultura. A cultura celular é expandida em frascos de agitação até > 4 L de volume total antes de inocular o primeiro biorreator de semente. Como primeiro biorreator de semente, é usado um biorreator descartável de 50 L Xcellerex (XDR). A cultura celular é cultivada por três dias antes de ser transferida para dentro do segundo reator de semente 200 L XDR. Depois de outros 3 dias de cultura, o reator de 1000 L de produção é inoculado. O procedimento de cultura é iniciado no dia 13 ou anteriormente, se a viabilidade cair abaixo de 61%.

1.2 Linhagem celular

[0081] O banco de células mestre utilizado (MCB, Master Cell Bank) é designado “MCB1AGA”.

1.3 Degelo e subculturas

[0082] Dois cryo frascos do MCB são ressuscitados consecutivamente. O procedimento de descongelamento que se segue é aplicado para cada frasco: Os cryo frascos são descongelados em um béquer com WFI a 36,8 °C (ponto de ajuste) até permanecer um pequeno cristal de gelo. Em seguida as células são transferidas para cerca de 10 mL de meio de crescimento resfriado (a 5 ± 3 °C) (meio no. 3001772, adquirido da PAA), suplementado com 6 mM de L-glutamina (concentração final) e 50 nM de MTX (concentração final). De modo a remover DMSO residual, uma etapa de lavagem em meio resfriado (5 ± 3 °C) é realizada através de centrifugação. O pélete celular é ressuspenso em 50 mL de meio pré-aquecido (36,8±1 °C) depois da etapa de centrifugação. A concentração e a viabilidade celulares são medidas com o contador celular Cedex. Esta cultura Out-of-Freeze é finalmente incubada em uma incubadora com sacudidor com um volume de operação de 50 mL usando frascos de agitação de 250 mL.

[0083] A primeira e a segunda subculturas são divididas por estabilidade realizada com um volume de operação de 120 mL (primeira subcultura) e 150 mL (segundas subculturas) usando frascos de agitação de 500 mL. A terceira e a quarta subculturas são a primeira fase de expansão e realizadas em frascos de agitação de 2000 mL com um volume de operação de 800 mL. Para estas quatro passagens iniciais, o meio de crescimento pré-aquecido (a 36,8 ± 1 °C) (meio no. 3001772, adquirido da PAA), suplementado com 6 mM de L-glutamina e 50 nM de MTX (concentrações finais), é usado como meio de cultura.

[0084] É realizada medição da concentração e da viabilidade celulares antes de cada etapa de cultura usando um contador celular Cedex. A próxima subcultura é preparada dependendo do crescimento celular.

[0085] Na subcultura no. 5, os frascos de agitação são reunidos em uma garrafa de vidro de 5 L. Este conjunto é amostrado para concentração e viabilidade celulares. Dependendo do VCC real, o volume de cultura celular requerido é em seguida transferido para dentro de um biorreator de semente de 50 L.

1.4 Biorreator de Semente (50L)

[0086] O biorreator de semente de 50 L é equipado com um sistema agitador de acionamento magnético montado no fundo e discos de aspersor de 1 mm. Antes da inoculação, o biorreator de 50 L é preenchido com cerca de 20 L de meio de crescimento (meio no. 3001772, adquirido da PAA) suplementado com 6 mM de L-glutamina (concentração final). Estes parâmetros se aplicam ao pré- condicionamento do meio e ao processo de cultura de trem de sementes.

[0087] Quando os parâmetros do processo são estáveis dentro de suas faixas aceitáveis, é iniciada a transferência do inóculo. Depois da inoculação, o reator é preenchido com meio até um volume de operação final de 25 L. Durante a expansão da massa celular no biorreator de 50 L, nenhuma adição de alimentação é aplicada ao processo. O pH é controlado com CO2 através de aspersor. O nível de oxigênio é controlado por aeração submersa com oxigênio sob demanda. Um fluxo gasoso de sobreposição de ar é aplicado ao espaço superior. É realizada aeração submersa com ar pressurizado com uma taxa de fluxo de 0,1 L/min, a qual pode ser adaptada para ajuste da pCO2. O tempo de cultura esperado no biorreator de semente é 3 dias antes de inoculação de um biorreator de semente de 200 L.

1.5 Biorreator de Semente (200 L)

[0088] O biorreator de semente de 200 L é equipado com um sistema agitador de acionamento magnético montado no fundo e discos de aspersor de 1 mm. Antes da inoculação, o biorreator de 200 L é preenchido com cerca de 100 L de meio de crescimento (meio no. 3001772, adquirido da PAA) suplementado com 6 mM de L-glutamina (concentração final). Estes parâmetros se aplicam ao pré-condicionamento do meio e ao processo de cultura de trem de sementes.

[0089] Quando os parâmetros do processo são estáveis dentro de suas faixas aceitáveis, é iniciada a transferência do inóculo. Depois da inoculação, meio é adicionado a um volume de operação final de 120L. Durante a expansão da massa celular no biorreator de 200 L, nenhuma adição de alimentação é aplicada ao processo. O pH é corrigido com gás CO2. O nível de oxigênio é controlado por aeração submersa com oxigênio sob demanda. Um fluxo gasoso de sobreposição de ar é aplicado ao espaço superior. É realizada aeração submersa com ar pressurizado com uma taxa de fluxo de 0,4 L/min, a qual pode ser adaptada para ajustar o pCO2. O tempo de cultura esperado no biorreator de semente é de 3 dias antes das células serem transferidas para um biorreator de produção de 1000 L.

1.6 Processo de Produção em Batelada Alimentada

[0090] O processo de produção de uma composição compreendendo isoformas de APG101 é uma cultura em batelada alimentada. Um biorreator de 1000 L de produção é equipado com um sistema agitador de acionamento magnético montado no fundo e discos de aspersor de 1 mm. Antes da inoculação, o biorreator de 1000 L é preenchido com cerca de 580 L de meio de crescimento (meio no. 3001829, adquirido da Becton Dickison) e suplementado com 6 mM de L-glutamina (concentração final, calculada sobre o volume de partida final de 720L). Quando os parâmetros do processo estão dentro de suas faixas aceitáveis, é iniciada a transferência de inóculo a partir do biorreator de semente para o biorreator de produção. A concentração de células alvo depois de inoculação no biorreator de produção é de 0,3*106 células viáveis/mL em um volume total de 720L. O volume requerido da cultura celular do biorreator de semente é transferido para o reator de produção, o qual é em seguida preenchido com meio de crescimento (meio no. 3001829, adquirido da Becton Dickison) até ser atingido o volume de partida de 720L. A cultura celular é alimentada com Meio de alimentação A (PM30728) iniciando no dia 3, e Glicose Meio de alimentação B (PM30729).

[0091] Alimentação diária é iniciada com Ração B separadamente, Ração A e Glicose podem ser alimentadas simultaneamente.

- Meio de alimentação B:

[0092] Ração de bolus inicia no dia 3 depois da amostragem.

[0093] Taxa de alimentação dia 3 a 6: 5,184 g/L/d (calculada sobre volume de partida de 720 L)

[0094] Taxa de alimentação dia 7 a 12: 2,592 g/L/d (calculada sobre volume de partida de 720 L)

- Meio de alimentação A:

[0095] Ração de bolus inicia no dia 3 depois da amostragem.

[0096] Taxa de alimentação dia 3 a 5: 43,2 g/L/d (calculada sobre volume de partida de 720 L)

[0097] Taxa de alimentação dia 6 a 12: 21,6 g/L/d (calculada sobre volume de partida de 720 L)

- Ração de D-Glicose:

[0098] Glicose é adicionada quando a concentração de D-glicose real é < 5 g/L iniciando no dia 7. A concentração de D-glicose é ajustada para 5 g/L adicionando as quantidades requeridas de ração de D- Glicose.

[0099] O nível de oxigênio é controlado por aplicação de uma cascata de controlador de oxigênio com 3 prioridades: A prioridade 1 consiste em um fluxo de ar do processo sob demanda até ser atingido um fluxo gasoso de 10 L/min. Em seguida a agitação (prioridade 2) é aumentada continuamente até ser atingida uma velocidade de agitação de 100 rpm. A terceira prioridade consiste em aspersão submersa de O2 sob demanda.

[00100] Um fluxo de cobertura de ar é aplicado no espaço superior.

[00101] O pH é controlado com CO2. Caso necessário, 1 M de Na2CO3 é preparado para ser adicionado caso necessário. A formação de espuma é observada regularmente e antiespuma é adicionado caso necessário.

[00102] O procedimento de colheita é iniciado no dia 13 da cultura, ou mais cedo se a viabilidade cair abaixo de < 61% (Cedex). A primeira etapa do procedimento é a sedimentação de células, onde o caldo celular é resfriado até 10 ± 5 °C. Quando a temperatura está abaixo de 20 °C, são desligados o stirrer, a aeração e o controle de pH. Depois de um mínimo de 12 h de sedimentação, a etapa de clarificação é iniciada. O sobrenadante é clarificado por uma etapa dupla de filtração em profundidade e filtração a 0,2 μm.

1.7 Sedimentação

[00103] O procedimento de colheita é iniciado por uma etapa de sedimentação. O caldo de cultura é resfriado até finalmente 10 ± 5°C. Quando a temperatura é < 20°C, são inativados a agitação, a pO2 e o controle de pH. Depois de um mínimo de 12 h e um máximo de 22 h horas de sedimentação, é iniciada filtração em profundidade.

1.8 Filtração

[00104] A filtração em profundidade é realizada com os Stax™ Disposable Depth Filter Systems from Pall, carga de 7x PDK5 e filtros de profundidade de 2x PDD1. A clarificação é seguida por uma filtração a 0,2 μm. Os filtros de profundidade são jateados com cerca de 900 L de PBS em uma taxa de fluxo de < 100 L/m2/h. O líquido residual é soprado para fora do sistema com ar. O processo de filtração é operado com uma taxa de fluxo de bomba de < 3,5 L/min e uma pressão máxima de 1,0 bar (100 KPa). De modo a aumentar a recuperação do produto, os filtros são enxaguados depois disso com cerca de 60 L de PBS pH 7,25 e soprados com ar pressurizado em uma pressão máxima de 0,8 bar (0,08 KPa). A colheita filtrada é transferida diretamente através do duto da parede para dentro da suite GD, coletada em um Mixtainer de 1000 L e armazenada em temperatura ambiente.

2. Processo a jusante

[00105] Para fins de ilustração, será proporcionada a seguir uma descrição das etapas de purificação individuais durante o processo a jusante.

2.1 Captura de Proteína A (C10)

[00106] O material de filtração do alto foi filtrado em profundidade transferido (0,2 μm) e temperado para 5 ± 3 °C. Antes do processamento, a colheita foi dividida em quatro alíquotas iguais e armazenada em temperatura ambiente de um dia para o outro para atingir uma temperatura do processo final de 21 ± 3 °C. O processamento da colheita foi realizado sem qualquer condicionamento adicional em quatro ciclos.

[00107] A elutriação foi induzida através de uma etapa de baixo pH. Os perfis de UV280 dos quatro ciclos foram altamente congruentes e mostram o formato esperado incluindo o único pico típico dentro da etapa de elutriação.

[00108] As produções das operações da Proteína A variaram entre 94 a 98 %. Portanto, a recuperação do produto das operações da Proteína A foi na faixa esperada. Além disso, todas as recuperações foram comparáveis umas com as outras e confirmaram os dados adquiridos durante transferência do processo e adaptação.

2.2 Inativação de vírus (V10)

[00109] Imediatamente depois de coletar o elutriado de Proteína A, foi executada uma adição de volume fixo (especificação: pH 3,5 ± 0,2) com 20 mM de ácido cítrico dentro de 5 min para inativar vírus envelopados. As soluções de inativação de vírus obtidas foram incubadas separadamente por 75 ± 15 min em temperatura ambiente (21 ± 3 °C). Finalmente, o pH das soluções de inativação foi ajustado para pH 5,0 ± 0,2 através da adição de um volume fixo de 20 mM de Na3-Citrato para parar a inativação de vírus. Os esquemas de condicionamento inteiros foram como se segue:

[00110] Em seguida, as soluções de inativação de vírus condicionada foram filtradas através de um filtro de 0,22 μm (Sartobran P) para separar precipitados potencialmente formados e para inibir crescimento microbiano na solução do processo. Cada lote de inativação de vírus condicionada foi armazenado a 21 ± 3 °C e finalmente reunido antes da etapa de processamento através de AIEX (C20).

2.3 Coluna de AIEX (C20)

[00111] Em seguida à inativação de vírus, ajuste de pH e filtração do conjunto de inativação de vírus condicionado foi processado sobre uma coluna Capto Q em modo FT em dois ciclos. O método compreende a etapa 1 de limpeza no local (tampão 0,5 M de NaOH), uma etapa de equilibração (20 mM de citrato de Na, pH 5), uma etapa de carga de solução de inativação de vírus condicionado, uma etapa de lavagem (20 mM de citrato de Na, pH 5,0), uma etapa de regeneração (20 mM de citrato de Na, 1 M de Na-Cl, pH 5,5), uma etapa 2 de limpeza no local (0,5 M de NaOH) e uma etapa de armazenamento (0,01 M de NaOH).

[00112] Os perfis de UV280 dos dois ciclos são congruentes e apresentam o aumento esperado do perfil de absorção de UV280 durante aplicação do elutriado de Proteína A condicionado.

[00113] Cada fração de fluxo de passagem obtido foi finalmente 0,22 μm filtrado (Sartobran P) de modo a tratar a redução de carga biológica. Depois disso, as frações separadas foram reunidas e armazenadas a 21 ± 3 °C até processamento posterior através da etapa de MMC (C30). Uma comparação de frações de AIEX de uma mistura de isoformas de APG101 obtidas pelo método da invenção e de APG101 obtida por um método não da invenção por IEF é mostrada nas Figuras 4a e 4b.

[00114] As produções das operações de AIEX foram em torno de 100 %.

2.4 Coluna de MMC (C30)

[00115] Depois da etapa C20, o conjunto do produto de AIEX foi processado sobre uma coluna Capto MMC em três ciclos. O método compreendia uma etapa de limpeza no local (tampão 0,5 M de NaOH), uma etapa de equilibração (20 mM de citrato de Na, pH 5,0), uma etapa de carga usando o produto AIEX / lavagem, uma etapa de lavagem (20 mM de citrato de Na, pH 5,0), uma etapa de elutriação (50 mM de fosfato de Na, 105 mM de NaCl, pH 7,4), uma etapa de regeneração (3 M de NaCl, pH 11), uma etapa de limpeza no local (0,5 M de NaOH), uma etapa de condicionamento (50 mM de fosfato de Na, 105 mM de NaCl, pH 7,4) e uma etapa de armazenamento (20 mM de fosfato de Na, 20% de etanol, pH 7,5).

[00116] A elutriação foi induzida através de um aumento do pH. Os perfis de UV280 dos três ciclos são altamente congruentes e apresentam o formato esperado incluindo o pico único típico dentro da etapa de elutriação.

[00117] Em seguida, as frações de elutriado foram cada uma filtrada sobre um filtro de 0,22 μm (Sartobran P) e armazenadas a 21 ± 3 °C. Antes de processamento adicional através da etapa de filtração de vírus, as frações de elutriado Capto MMC particulares foram reunidas.

[00118] As produções das operações de MMC variam em torno de 100 %.

2.5 Filtração de vírus (I10)

[00119] Em seguida à etapa C30, o conjunto de elutriado Capto MMC (1181 mL) foi passado sobre um filtro Durapore de 0,1 μm (Millipak 20) antes da filtração de vírus. A filtração de vírus foi executada aplicando uma alíquota do filtrado de 0,1 μm (887 mL) sobre um filtro de virus Planova 15N (100 cm2) equilibrado com 50 mM de PBS, pH 7,4 (tampão de elutriação Capto MMC) em uma pressão de operação de 0,8 ± 0,1 bar. O volume pós-lavagem foi de 0,5 mL/cm2 usando tampão de equilibração. Foi realizado teste de filtro antes de uso de filtro baseado em detecção de borbulhamento de ar pressurizado. O fluxo do filtrado permaneceu constante durante o processamento (cerca de 22 L/m2*h).

[00120] A filtração de vírus resultou em 99 % de produção.

[00121] Em seguida, o filtrado de 0,1 μm residual e a fração de filtrado da filtração de vírus foram reunidos e armazenados a 5 ± 3 °C até processamento adicional através de etapa de UF/DF subsequente.

2.6 Ultrafiltração/Diafiltração (I20)

[00122] Antes da diafiltração o filtrado I10 foi concentrado sobre um sistema ÃKTA Crossflow até uma concentração de proteína de 25,0 ± 2,0 mgAPG101/mL usando dois cassetes de 30 kDa Pellicon 3. Depois disso, foi executada uma diafiltração para modificar o sistema tampão para o tampão seguinte: 50 mM de Fosfato de Na, 5 % de Sorbitol, pH 6,5

[00123] O material foi ultrafiltrado até a concentração mencionada acima e diafiltrado por fator 7,0 ± 0,5. Os parâmetros para a ultradiafiltração e diafiltração foram: Fluxo de retentado: 450 L/(m2*h) TMP: 1,2 ± 0,1 bar

[00124] A UF/DF produziu em 97 % de recuperação de produto.

2.7 Ajuste da concentração da substância do fármaco

[00125] Para ajuste da concentração final, um volume definido (107 mL) do tampão da formulação (50 mM de Fosfato de Na, 5 % de Sorbitol, pH 6,5) foi adicionado ao conjunto do retentado de UF/DF. A concentração da substância do fármaco final obtida por A280 foi de 20,4 mg/mL. Finalmente, a substância do fármaco foi filtrada a 0,22 μm (Sartobran P). Em seguida, alíquotas da substância do fármaco com um volume de 200 μL foram engarrafadas em frascos de 500 μL.

2.8 Produção total

[00126] A etapa e as produções totais obtidas a partir de análise por ProA-HPLC e A280 estão listadas na Tabela 1. A amostragem da molécula alvo não foi levada em conta para o cálculo das produções.Tabela 1: Visão geral da etapa de produção

no. 1 Carga determinada através do método de colheita ProA- HPLC, Elutriar através de ProA-HPLC. no. 2 Carga determinada através do método de colheita ProA- HPLC, Elutriar através de A280.

[00127] A identidade da mistura de isoformas de APG101 foi confirmada através de SDS Page não redutor e IEF. O padrão de isoformas apresentou bandas básicas adicionais comparadas com o material de referência e uma ligeira permuta na distribuição de isoformas em direção a pI acidífero.

[00128] Isto é mostrado, por exemplo, por uma comparação de um gel IEF de frações AX obtidas pelo método da presente invenção e uma mistura de APG101 obtida pelo método não da invenção de acordo com a Figura 1.

[00129] A mistura de isoformas de APG101 da presente invenção difere adicionalmente na presença de carboidratos (ácido siálico de N- glicanos).

Carboidratos (antenaridade/N-glicanos)

[00130] Na Tabela 2 é resumida a análise da estrutura de carboidratos. Apesar de uma estrutura de carboidratos comparável entre o material de referência e a composição da invenção, a distribuição de estruturas de carboidrato difere.Tabela 2: Resultado da análise de N-glicanos (carboidratos)

Carboidratos (ácidos siálicos)

[00131] A análise da quantidade de ácido siálico por mol de APG101 da composição da invenção é resumida na Tabela 3.Tabela 3: Análise do ácido siálico (carboidrato)

[00132] O material de referência sempre se refere a uma mistura de APG101 a qual não foi produzida pelo método da presente invenção.Finalmente, foi realizado um teste para medir a bioatividade da mistura de acordo com a presente invenção compreendendo isoformas de APG101.

3. Método para a determinação da potência in vitro de isoformas de APG101

[00133] Um teste celular com uma linhagem de células T Jurkat A3 permanente é usado para a determinação da atividade biológica da APG101. Esta potência é mostrada esquematicamente na Figura 5.Com este teste de apoptose empregando células Jurkat A3, são determinados valores de EC50 para a inibição de apoptose induzida APG293 (=CD95L-T4; 250 ng/mL) por APG101.

[00134] Em resumo, células Jurkat A3 são cultivadas em frascos com meio RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) suplementado com 10 % de FBS, 100 unidades/mL de Penicilina e 100 μg/mL de Estreptomicina. 100.000 células são semeadas por cavidade dentro de uma placa de microtítulo de 96 cavidades. CD95L-T4 (APG293) em uma concentração constante de 250 ng/mL é incubado em uma placa de microtítulo de 96 cavidades separada por 30 minutos a 37°C com diferentes concentrações de APG101. A adição da mistura APG101/CD95L-T4 às células é seguida por 3 horas de incubação a 37°C. As células são lisadas adicionando tampão de lise (250 mM de HEPES, 50 mM de MgCl2, 10 mM de EGTA, 5 % de Triton-X-100, 100 mM de DTT, 10 mM de AEBSF, pH 7,5) e as placas são portas sobre gelo por 30 minutos até 2 horas. A apoptose é igualada por uma atividade aumentada de Caspases (por exemplo, caspases 3 e 7). Portanto, a clivagem do substrato de Caspase Ac- DEVD-AFC é usada para determinar a extensão da apoptose. De fato, a atividade de caspase se correlaciona com a percentagem de células apoptóticas determinada morfologicamente depois de tintura das células com iodeto de propídio e Hoechst-33342.

[00135] Para o teste de atividade de caspase, 20 μl do lisado celular é transferido para uma placa de microtítulo de 96 cavidades pretas. Depois da adição de 80 μl de tampão contendo 50 mM de HEPES, 1 % de Sacarose, 0,1 % de CHAPS, 50 μM de Ac-DEVD-AFC, e 25 mM de DTT, pH 7,5, a placa é transferida para uma leitora de placas de microtítulo Tecan e é monitorado o aumento na intensidade de fluorescência durante um dado frame de tempo (comprimento de onda de excitação de 400 nm, comprimento de onda de emissão de 505 nm).Empregando o software GraphPad Prism, são calculados valores de EC50 para APG101 (isto é, redução da indução de apoptose da dada concentração de CD95L por 50%).

[00136] A determinação da atividade biológica de APG101 empregando o teste de potência permite: • uma alta especificidade. Através de sua interação com CD95, CD95L-T4 induz apoptose sobre células Jurkat A3. A interação CD95/CD95L-T4 é especificamente bloqueada pela adição de APG101. • o uso de um sistema celular relevante; a indução de apoptose é uma característica fisiológica importante da sinalização CD95/CD95L e pode ser monitorada na linhagem de células T humanas Jurkat A3 bem caracterizada. • uma alta produtividade da amostra devido à aplicação de placas de microtítulo de 96 cavidades e tempos de incubação curtos.

[00137] A Figura 6 mostra a atividade biológica (EC50) de misturas de isoformas de APG101 obtidas pelo método inativo (amostras da invenção) comparadas com APG101 obtidas por métodos não da invenção. A atividade é comparável.

4. Testes de termofluorescência de formulação de APG101

[00138] A estabilidade das formulações de acordo com a presente invenção foi confirmada por testes de termofluorescência (cf. as Figuras 8 e 9).

[00139] A determinação de pontos de transição térmica de APG101 foi realizada através de testes de termofluorescência (TF). Deste modo o corante fluorescente liga a fragmentos hidrofóbicos da proteína. Durante o aumento da temperatura, a proteína desdobra e mais corante pode ligar o que resulta em um aumento do sinal fluorescente. Portanto pontos de transição térmica superior (temperaturas de fusão, Tm) indicam condições mais estáveis para APG101. A configuração do teste é mostrada na Tabela 2. Tabela 2: Configuração do teste de termofluorescência

[00140] O ponto de transição térmica foi definido como sendo o ponto de inflexão do aumento do sinal fluorescente durante aumento da temperatura. Foi testada a estabilidade de APG101 em diferentes sistemas tampão (Figura 8).

[00141] Através de testes de termofluorescência foram determinados os pontos de transição térmica de APG101 com material de partida 3 referente a diferentes excipientes, a saber açúcar, poli-álcool, aminoácidos e poliglicol. A abordagem experimental foi idêntica à descrita acima. Os resultados são mostrados na Figura 9. Os valores da Tm foram aumentados com concentrações crescentes de sacarose, sorbitol e glicina. Adição de glicilglicina (Gly-Gly) ou PEG não apresentou efeitos estabilizantes positivos.

[00142] Adicionalmente, foi realizado um teste de termofluorescência, para comparar alguns lotes de APG101 preparados de acordo com a invenção com amostra Fas/Fc disponível comercialmente. Foi empregada uma concentração de amostra (APG101 ou Fas/Fc) de 50 μg/mL.

[00143] O teste de termofluorescência claramente revela a superioridade dos dois lotes de APG101 da invenção (lote F10176 e lote 1011626) comparados com Fas/Fc disponível comercialmente da Sigma com respeito a estabilidade térmica (Figura 11).

Claims

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura de isoformas de APG101, em que APG101 não modificada é representada pela SEQ ID NO: 1, a referida mistura compreende variantes de APG101 consistindo das porções referentes aos resíduos 17-400, 21-400 ou 26-400 da SEQ ID NO:1 e menos de 1% em mol de APG101 não modificada de acordo com a SEQ ID NO: 1 e distribuidas dentro de uma faixa de pI de 4,0 a 8,5, e compreendendo uma quantidade de ácidos siálicos de 4,5 a 6,0 mol de NeuAc/mol APG101, em que a referida mistura de isoformas de APG101 pode ser obtida por um método que compreende as etapas de (a) produzir uma mistura de isoformas de APG101 por um processo de produção em batelada alimentada fornecendo uma colheita de células usando um meio basal contendo peptona, e (b) isolar a mistura de isoformas de APG101 da colheita de células, em que a etapa (a) compreende uma série de etapas de cultivo de um determinado banco de células mestre até que os parâmetros de colheita relevantes sejam alcançados, seguido por sedimentação de células e filtração de proteína de fusão contendo sobrenadante, em que os parâmetros de colheita relevantes são um título de APG101 dentro de uma faixa de 0,5 g/L - 5 g/L e uma densidade celular de 1 x 106 - 1 x 108 células/mL, e a etapa (b) compreende cromatografia de captura, inativação de vírus, uma série de cromatografia de ânions e/ou cátions, filtração de vírus e ajuste para uma concentração de proteína final desejada.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende 0,0 a 5,0 % em mol de formas de alto peso molecular de APG101, tais como dímeros e/ou agregados.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende variantes de APG101 bloqueadas em seu N-terminal, tais como variantes de APG101 bloqueadas por modificação piro-Glu e/ou compreendendo variantes de APG101 apresentando um N-terminal livre.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende 80 a 99 % em mol de variantes de APG101 bloqueadas em seu N-terminal e/ou 1 a 20 % em mol de variantes de APG101 apresentando um N-terminal livre.

5. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Formulação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda (a) fosfato, preferencialmente 20 mM a 100 mM de fosfato, mais preferencialmente 50 mM de fosfato, (b) um agente de reforço da viscosidade, tal como sorbitol, preferencialmente 0,1 a 10 % em peso de agente de reforço da viscosidade, mais preferencialmente 5 % em peso de agente de reforço da viscosidade, e/ou (c) tendo um valor do pH na faixa de 4 a 8.

7. Método para a produção de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas (a) produção de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 por um processo de produção em batelada alimentada proporcionando uma colheita de células, e (b) isolamento da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 a partir da colheita de células, em que a etapa (a) compreende uma série de etapas de cultura de um determinado lote de células mestre até serem atingidos parâmetros de colheita relevantes, seguida por sedimentação celular e filtração de sobrenadante contendo proteínas de fusão, em que os parâmetros de colheita relevantes são uma titulação dentro de uma faixa de 0,5 g /L - 5 g /L e uma densidade celular de 1 x 106 a 1 x 108 células/mL e a etapa (b) compreende cromatografia de captura, inativação de vírus, uma série de cromatografia de ânions e/ou cátions, filtração de vírus e ajuste para uma concentração de proteína final desejada.