CN112533950A - 抗CD3e抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了抗CD3e(T细胞表面糖蛋白CD3ε链)抗体、抗原结合片段及其用途。

Description

抗CD3e抗体及其用途
优先权要求
本申请要求2018年6月29日提交的国际申请第PCT/CN2018/093725号的优先权。前述内容的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及抗CD3e(T细胞表面糖蛋白CD3ε链)抗体及其用途。
发明背景
自身免疫过程与免疫耐受性(免疫系统对抗原无反应的状态)缺陷相关。耐受性是通过多种机制维持的，包括缺失、无能，细胞活性调控和诱导免疫耐受性的策略正被开发用于治疗自身免疫。
CD3(分化簇3)是T细胞共受体之一，其参与活化细胞毒性T细胞(CD8+原初T细胞)以及辅助T细胞(CD4+原初T细胞)。根据使用的条件，抗CD3抗体既可以刺激T细胞分裂，也可以抑制免疫效应功能诸如细胞毒性的发展。抗CD3抗体疗法在治疗自身免疫性疾病方面显示出潜力。然而，抗CD3治疗的功效受到体内毒性的限制。一种众所周知的抗CD3抗体OKT3，通常用于移植排斥的临床治疗，但已知其在体内介导了剧烈的细胞因子释放，导致“流感样”综合征。这种效应已被确定为针对OKT3分子的体液反应以及促炎细胞因子诸如TNF-α的释放。这些生理毒性限制了用抗CD3疗法治疗患者的可用剂量方案，同时也限制了抗CD3疗法在自身免疫性疾病领域的总体疗效。目前急需要毒性更低的抗CD3疗法以及更多不同选择的抗CD3疗法。
发明内容
本公开涉及抗CD3e抗体、其抗原结合片段及其用途。
一方面，本公开提供了一种结合CD3e(T细胞表面糖蛋白CD3ε链)的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中VH CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VH CDR2区包含与选定的VHCDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，且VH CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；和包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中VL CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VL CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，且VL CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中选定的VH CDR 1、2和3氨基酸序列和选定的VL CDR 1、2和3氨基酸序列是下述之一：
(1)选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1、2、3，并且选定的VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:4、5、6；
(2)选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7、8、9，并且选定的VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:10、11、12。
在一些实施方案中，VH包含分别具有示于SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列的CDR1、2、3，并且VL包含分别具有示于SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR 1、2、3。在一些实施方案中，VH包含分别具有示于SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且VL包含分别具有示于SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是双特异性抗体。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合人CD3e。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
一方面，本公开还提供了一种包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含：
(1)含有重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区包含氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1、2和3的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中当VH与包含示于SEQ ID NO:25、26、27或36的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时，所述VH与CD3e结合；
(2)含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有示于SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中当VL与包含示于SEQ ID NO:21、22、23、24或35的氨基酸序列的VH配对时，所述VL与CD3e结合；
(3)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区包含分别含有示于SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中当VH与包含示于SEQ IDNO:32、33、34或38的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时，所述VH与CD3e结合；
(4)含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有示于SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中当VL与包含示于SEQ ID NO:28、29、30、31或37的氨基酸序列的VH配对时，所述VL与CD3e结合。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有示于SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有示于SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有示于SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有示于SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，当VH与VL配对时，所述VH特异性结合人CD3e，或者当VL与VH配对时，所述VL特异性结合人CD3e。
在一些实施方案中，免疫球蛋白重链或其片段是人源化免疫球蛋白重链或其片段。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或其片段是人源化免疫球蛋白轻链或其片段。
在一些实施方案中，所述核酸编码双特异性抗体。在一些实施方案中，所述核酸编码单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述核酸是cDNA。
另一方面，本公开还提供了一种包含本文所述的一种或多种核酸的载体。一方面，本公开还涉及包含本文所述的核酸中的两种的载体，其中所述载体编码一起结合CD3e的VL区和VH区。
一方面，本公开还涉及一对载体，其中每个载体包含本文所述的核酸之一，其中该对载体一起编码VL区和VH区，所述VL区和所述VH区在一起时结合CD3e。
一方面，本公开提供了一种包含本文所述的载体或本文所述的载体对的细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包含本文所述的核酸中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞包含本文所述的核酸中的两种。
在一些实施方案中，两种核酸一起编码一起结合CD3e的VL区和VH区。
一方面，本公开提供了产生抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括(a)在足以使细胞产生抗体或抗原结合片段的条件下培养本文所述的细胞；以及(b)收集由细胞产生的抗体或抗原结合片段。
一方面，本公开还提供了一种结合CD3e的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含与选定的VH序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与选定的VL序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中选定的VH序列和选定的VL序列是下述之一：(1)选定的VH序列是SEQ ID NO:21、22、23、24或35，并且选定的VL序列是SEQ ID NO:25、26、27或36；(2)选定的VH序列是SEQ ID NO:28、29、30、31或37，并且选定的VL序列是SEQ ID NO:32、33、34或38。
在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:21的序列，并且VL包含SEQ ID NO:25的序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:28的序列，并且VL包含SEQ ID NO:32的序列。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合人CD3e。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
一方面，本公开还提供了一种抗体-药物缀合物，其包含如本文所述的与治疗剂共价结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
另一方面，本公开还提供了包含本文所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。一方面，本公开还提供了一种包含本文所述的抗体药物缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
一方面，本公开还提供了降低受试者的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中，受试者患有移植物抗宿主病。在一些实施方案中，受试者患有I型糖尿病。在一些实施方案中，受试者患有关节炎、克罗恩病或溃疡性结肠炎。
一方面，本公开涉及治疗受试者的自身免疫性疾病的方法。所述方法涉及向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中，受试者患有I型糖尿病、关节炎、克罗恩病或溃疡性结肠炎。
一方面，本公开涉及治疗患有癌症的受试者的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含本文所述抗体或其抗原结合片段的组合物。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是双特异性抗体，所述双特异性抗体也特异性结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是CD19、CD20、PSA、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、Her2、CD123、Ep-CAM、CD66e、PSMA、CD371或VEGFR2。
在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌或血液恶性肿瘤。
一方面，本公开还涉及降低肿瘤生长速率的方法。所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是双特异性抗体，所述双特异性抗体也特异性结合肿瘤相关抗原。
一方面，本公开还涉及杀死肿瘤细胞的方法。所述方法包括使肿瘤细胞与有效剂量的组合物接触，所述组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是双特异性抗体，所述双特异性抗体也特异性结合肿瘤相关抗原。
如本文中所用，术语“抗体”是指包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任一个或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任一个)并且能够特异性结合表位的任何抗原结合分子。抗体的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可包含人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如由抗体片段形成的双特异性抗体、单链抗体、双抗体、线性抗体和多特异性抗体。
如本文中所用，术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中所述抗体的部分能够特异性结合抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段包含至少一个可变结构域(例如，重链的可变结构域或轻链的可变结构域)。抗体片段的非限制性实例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
如本文中所用，术语“人抗体”是指由存在于人体内的内源性核酸(例如，重排的人免疫球蛋白重链或轻链基因座)编码的抗体。在一些实施方案中，从人收集人抗体或在人细胞培养物(例如，人杂交瘤细胞)中产生人抗体。在一些实施方案中，在非人细胞(例如，小鼠或仓鼠细胞系)中产生人抗体。在一些实施方案中，在细菌或酵母细胞中产生人抗体。在一些实施方案中，在含有未重排或重排的人免疫球蛋白基因座(例如，重链或轻链人免疫球蛋白基因座)的转基因非人动物(例如，牛)中产生人抗体。
如本文中所用，术语“嵌合抗体”是指包含存在于至少两种不同抗体(例如，来自两种不同哺乳动物物种的抗体，诸如人抗体和小鼠抗体)中的序列的抗体。嵌合抗体的非限制性实例是包含非人(例如，小鼠)抗体的可变结构域序列(例如，轻链和/或重链可变结构域序列的全部或部分)和人抗体的恒定结构域的抗体。本文描述了嵌合抗体的其它实例，并且所述其它实例是本领域已知的。
如本文中所用，术语“人源化抗体”是指非人抗体，其包含源自非人(例如，小鼠)免疫球蛋白的最小序列和源自人免疫球蛋白的序列。在非限制性实例中，人源化抗体是人抗体(受体抗体)的高变(例如，CDR)区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人抗体(例如，供体抗体)，例如小鼠、大鼠或兔抗体的高变(例如，CDR)区残基所取代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人(例如，小鼠)免疫球蛋白残基取代。在一些实施方案中，人源化抗体可含有不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。这些修饰可进一步改善抗体的性能。在一些实施方案中，人源化抗体包含基本上所有的至少一个(通常是两个)可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环(CDR)对应于非人类(例如，小鼠)免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的框架区是人类免疫球蛋白的框架区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。人源化抗体可以使用本领域已知的分子生物学方法产生。本文描述了产生人源化抗体的方法的非限制性实例。
如本文中所用，术语“单链抗体”是指包含至少两个免疫球蛋白可变结构域(例如，哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域)的单个多肽，其能够特异性结合抗原。本文描述了单链抗体的非限制性实例。
如本文中所用，术语“多特异性抗体”是指包含四个或更多(例如，六个、八个或十个)免疫球蛋白可变结构域的抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体能够将哺乳动物细胞(例如，肿瘤细胞)表面上的一个靶分子(例如，CD3e)与至少一个第二靶分子(例如，Her2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)交联。
如本文中所用，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，用来描述根据本发明的方法向其提供治疗的人类或非人动物。本发明考虑了兽医和非兽医应用。人患者可以是成人或青少年(例如，18岁以下的人)。除了人以外，患者包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包括例如非人灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔子)、兔形目动物、猪(例如，猪、小型猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛族动物以及其它家养、农场和动物园动物。
如本文中所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞，此类细胞的实例包括具有快速增殖生长特征的异常状态或状况的细胞。所述术语意在包括癌性生长，例如肿瘤；致癌过程、转移组织和恶性转化的细胞、组织或器官，不论组织病理学类型或侵袭性阶段。还包括诸如呼吸、心血管、肾脏、生殖、血液、神经、肝脏、胃肠和内分泌系统的各种器官系统的恶性肿瘤；以及包括恶性肿瘤诸如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌和小肠癌的腺癌。“天然产生的”癌症包括任何不是通过将癌细胞植入受试者而实验性诱导的癌症，包括例如自发产生的癌症、由患者暴露于一种或多种致癌物引起的癌症、由插入转基因癌基因或敲除肿瘤抑制基因引起的癌症、以及由感染例如病毒感染引起的癌症。术语“癌”是本领域公认的，是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤。所述术语还包括癌肉瘤，其包括由癌组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的，是指间充质衍生的恶性肿瘤。术语“造血肿瘤性疾病”包括涉及造血来源的增生性/赘生性细胞的疾病。造血肿瘤性疾病可由骨髓样谱系、淋巴样谱系或红细胞谱系或其前体细胞引起。
如本文中所用，当提及抗体时，短语“特异性结合”和“特异性地结合”意指抗体与其靶分子(例如，CD3e)的相互作用优先于与其它分子的相互作用，因为所述相互作用取决于靶分子上特定结构(即，抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，试剂识别并结合包含特定结构的分子，而不是一般的所有分子。特异性结合靶分子的抗体可被称为靶特异性抗体。例如，特异性结合CD3e分子的抗体可称为CD3e特异性抗体或抗CD3e抗体。
如本文中所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指具有至少两个氨基酸的任意长度的氨基酸聚合物。
如本文中所用，术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中可互换使用，指具有至少两个核苷酸的任意长度的核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体及其修饰。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域已知的其它合适的方法和材料。所述材料、方法和实例仅是说明性的，而不是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献均通过引用以其整体并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
根据下面的详细描述和附图以及权利要求，本发明的其它特征和有利方面将变得显而易见。
附图说明
图1是显示制备抗-hCD3e抗体的示例性方案的第一部分的流程图。
图2是显示制备抗-hCD3e抗体的示例性方案的第二部分的流程图。
图3是显示在人源化CD3e小鼠中在抗CD3e抗体刺激后CD69+T细胞在所有T细胞中的百分比的图表。
图4是显示在人源化CD3e小鼠中在抗CD3e抗体刺激后CD25+T细胞在所有T细胞中的百分比的图表。
图5是显示分析从第一个人受试者收集的抗-hCD3e抗体与人外周血单核细胞(PBMC)的结合的流式细胞术分析结果的一组图表。mIgG是阴性对照。
图6是显示分析从第二个人受试者收集的抗-hCD3e抗体与人PBMC的结合的流式细胞术结果的一组图表。mIgG是阴性对照。
图7是显示分析抗-hCD3e抗体与猴PBMC的结合亲和力的流式细胞术结果的一组图表。mIgG是阴性对照。
图8A-图8B是显示在被不同浓度的不同抗-hCD3e抗体刺激后来自于Jurkat-Luc-NFAT细胞的生物发光的图表。
图9是显示分析几种嵌合抗-hCD3e抗体与人PBMC的结合的流式细胞术结果的一组图表。NC是阴性对照。PC是阳性对照。
图10是显示分析几种嵌合抗-hCD3e抗体与猴PBMC的结合的流式细胞术结果的一组图表。NC是阴性对照。PC是阳性对照。抗hTcRβ-PerCP抗体不与猴TcRβ结合。
图11是显示在用不同抗体处理后具有MC-38肿瘤细胞的C57BL/6小鼠的体重随时间变化的图表。
图12是显示在用不同抗体处理后具有MC-38肿瘤细胞的C57BL/6小鼠的体重随时间的百分比变化的图表。
图13是显示在用不同抗体处理后具有MC-38肿瘤细胞的C57BL/6小鼠中肿瘤体积随时间变化的图表。
图14显示在用不同抗体处理后具有MC-38肿瘤细胞的人源化CD3e小鼠的体重随时间变化的图表。
图15是显示在用不同抗体处理后具有MC-38肿瘤细胞的人源化CD3e小鼠的体重随时间的百分比变化的图表。
图16是显示用不同抗体处理后具有MC-38肿瘤细胞的人源化CD3e小鼠中肿瘤体积随时间变化的图表。
图17A-图17B是显示分析具有不同重链和轻链的人源化10A4抗体与人外周血单核细胞(PBMC)的结合的流式细胞术结果的一组图表。
图18是显示分析具有不同重链和轻链的人源化10A4抗体与猴外周血单核细胞(PBMC)的结合的流式细胞术结果的一组图表。
图19A-图19B是显示分析具有不同重链和轻链的人源化1B1抗体与人外周血单核细胞(PBMC)的结合的流式细胞术结果的一组图表。
图20是显示分析具有不同重链和轻链的人源化1B1抗体与猴外周血单核细胞(PBMC)的结合的流式细胞术结果的一组图表。
图21列出了如由Kabat编号所定义的小鼠抗hCD3e抗体(25-10A4，30-1B1)的CDR序列及其人源化抗hCD3e抗体的CDR序列。
图22列出了如Chothia编号所定义的小鼠抗-hCD3e抗体(25-10A4，30-1B1)的CDR序列及其人源化抗-hCD3e抗体的CDR序列。
图23列出了人CD3e(hCD3e)、小鼠CD3e(mCD3e)、猴CD3e(rmCD3e和mfCD3e)和嵌合CD3e(chiCD3e)的氨基酸序列。
图24列出了基于25-10A04(“10A04”)的人源化抗hCD3e抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图25列出了基于30-1B1(“1B1”)的人源化抗hCD3e抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图26列出了小鼠抗hCD3e抗体25-10A4和30-1B1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
具体实施方式
本公开提供了结合CD3e(T细胞表面糖蛋白CD3ε链；也称为CD3ε或T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链)的抗体和其抗原结合片段的实例。
CD3和CD3e
分化簇3(CD3)是多聚体蛋白复合物，历史上称为T3复合物，由四条不同的多肽链组成：伊普西隆(ε)、伽马(γ)、德耳塔(δ)和泽塔(ζ)，它们组装成三对二聚体(εγ、εδ、ζζ)并以所述三对二聚体发挥功能。CD3复合物作为T细胞共受体，与T细胞受体(TCR)非共价缔合。CD3蛋白复合物是T细胞谱系的定义性特征，因此抗CD3抗体可以有效地用作T细胞标志物。
TCR/CD3的连接导致与细胞内CD3结构域相关联的src和syk家族PTK的激活，然后激活PLC和Ras依赖性途径。然而，通过TCR复合物的信号传导不是从受体开始到细胞核结束的线性事件。相反，每一步似乎都有复杂的反馈和前馈调节。
因为CD3是T细胞活化所必需的，所以靶向其的药物(通常是单克隆抗体)正被作为移植物抗宿主病和各种自身免疫性疾病(例如，关节炎、1型糖尿病)的免疫抑制疗法(例如，奥特利昔珠单抗(otelixizumab))进行研究。CD3e(或CD3ε)是20kDa的非糖基化多肽链。
治疗性抗CD3e抗体与表征T淋巴细胞的CD3/TCR复合物的ε链结合。已经提出了几种非互斥机制来解释抗CD3e抗体的治疗作用。在CD3复合物经过短持续封闭(capping)后，CD3/T细胞受体复合物通过内化或脱落从细胞表面消失，这一过程称为抗原调变(antigenic modulation)，其使T细胞暂时对其同源抗原视而不见。抗CD3e抗体诱导的信号传导还可优先在活化的T细胞中诱导无反应或凋亡，同时保留Tregs。不同T细胞亚群的TCR表达的异质性可能解释了抗CD3e抗体针对效应细胞对比调节性T细胞或原初T细胞的差异作用。
抗CD3e抗体的耐受性功能不依赖于与抗体的Fc区相关联的效应功能，诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，因为F(ab’)2片段足以诱导耐受性。已经表明，静脉注射抗CD3e抗体后T细胞迅速活化，如注射后不久CD69和CD25的表达以及TGF-β和IFN-γ的血清浓度增加所测量的，即使使用非促分裂型(nonmitogenic)抗CD3e抗体也是如此。抗CD3e抗体对T细胞的直接作用(封闭、抗原调变、凋亡和无效能的诱导)都是短期的，在抗体从循环中清除后这些作用就消失了。然而，由抗CD3E抗体疗法介导的药理学作用可以是持久的，这表明抗CD3e抗体介导的耐受性涉及另外的和更持久的机制。证据表明在抗CD3e抗体诱导的细胞凋亡、巨噬细胞对最终凋亡小体的吞噬以及随后TGF-β的增加之间存在联系。TGF-β在调节免疫反应中起重要作用，而TGF-β的产生对抗CD3e抗体的治疗作用至关重要。TGF-β对适应性免疫具有多效性作用，包括诱导适应性FoxP3+Tregs，抑制T细胞活化和增殖，以及阻断树突细胞成熟，所有这些结果是在抗CD3e抗体介导的耐受诱导后观察到的。事实上，已经证明了抗CD3e抗体疗法增加了TGF-β依赖性Tregs，使效应T细胞更易受TGF-β介导的调节，并赋予树突细胞耐受性表型。
CD3e的详细描述，以及抗CD3e抗体治疗各种疾病的用途，描述于例如Smith-Garvin等人"T cell activation."Annual review of immunology 27(2009):591-619；Kuhn等人"Therapeutic anti-CD3 monoclonal antibodies:from bench to bedside."Immunotherapy 8.8(2016):889-906；US20060275292和US 20070292416中；其每一篇都通过引用以其整体并入。
此外，靶向CD3和肿瘤细胞抗原(例如，CD19、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、Her2)的双特异性抗体可促使T细胞重新检测到肿瘤细胞。因为不管T细胞受体的特异性如何，T细胞都可被重定向至肿瘤细胞，所以这些双特异性抗体被认为是有效的，特别是对于缺乏足够新抗原的免疫原性较低的肿瘤。其临床疗效已被博纳吐单抗(blinatumomab)所例证，所述博纳吐单抗是靶向CD19和CD3的双特异性T细胞衔接子，对血液恶性肿瘤显示出显著的临床反应。
靶向CD3和肿瘤细胞上的抗原的双特异性抗体的详细描述如以下文献中进行了描述：Ishiguro等人"An anti–glypican 3/CD3 bispecific T cell–redirecting antibodyfor treatment of solid tumors."Science translational medicine 9.410(2017)；Gao,Y.等人"Efficient inhibition of multidrug-resistant human tumors with arecombinant bispecific anti-P-glycoprotein×anti-CD3diabody."Leukemia 18.3(2004):513；Topp等人"Safety and activity of blinatumomab for adult patientswith relapsed or refractory B-precursor acute lymphoblastic leukaemia:amulticentre,single-arm,phase 2study."The Lancet Oncology 16.1(2015):57-66；US20160355588；US20170210819，所述文献的每一篇通过引用以其整体并入本文。
本公开提供了几种抗CD3e抗体(包括双特异性抗体)、其抗原结合片段，以及使用这些抗CD3e抗体和抗原结合片段来抑制免疫反应、治疗自身免疫性疾病的方法，以及使用双特异性抗体来抑制肿瘤生长和治疗癌症的方法。
抗体和抗原结合片段
本公开提供了抗CD3e抗体及其抗原结合片段。一般来说，抗体(也称为免疫球蛋白)由两类多肽链(轻链和重链)组成。本公开的非限制性抗体可以是包含两条重链和两条轻链的完整的四链免疫球蛋白抗体。抗体的重链可以是包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD在内的任何同种型，或包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等在内的亚同种型。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可包含两个相同的轻链拷贝和两个相同的重链拷贝。重链各自包含一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)，通过它们恒定区内的二硫键相互结合，形成抗体的“茎”。轻链(各自包含一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区))各自通过二硫键与一条重链结合。每条轻链的可变区与与其结合的重链的可变区对齐。轻链和重链两者的可变区包含三个夹在更加保守的框架区(FR)之间的高变区。
这些高变区被称为互补决定区(CDR)，形成包含抗体的主要抗原结合表面的环。四个框架区主要采用β-折叠构象，所述CDR形成连接β-折叠结构的环，在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR被框架区域保持在非常接近的位置，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗原结合区域的形成。
通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定抗体的CDR区的方法是公知的，并且通常使用许多CDR的定义。Kabat定义基于序列可变性，而Chothia定义基于结构环区域的位置。这些方法和定义描述于，例如，Martin,"Protein sequence and structure analysis ofantibody variable domains,"Antibody engineering,Springer Berlin Heidelberg,2001.422-439；Abhinandan等人."Analysis and improvements to Kabat andstructurally correct numbering of antibody variable domains,"Molecularimmunology 45.14(2008):3832-3839；Wu,T.T.和Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132:211-250；Martin等人，Methods Enzymol.203:121-53(1991)；Morea等人，Biophys Chem.68(1-3):9-16(1997年10月)；Morea等人，J Mol Biol.275(2):269-94(1998年1月)；Chothia等人，Nature 342(6252):877-83(1989年12月)；Ponomarenko和Bourne,BMC StructuralBiology7:64(2007)；所述文献的每一篇通过引用以其整体并入本文。除非在本公开中特别指出，否则Kabat编号在本公开中被用作默认值。
CDR对识别抗原的表位很重要。如本文中所用，“表位”是能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的靶分子的最小部分。表位的最小尺寸可以是约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸，但这些氨基酸不必在抗原一级结构的连续线性序列中，因为表位可能取决于基于抗原二级和三级结构的抗原三维构型。
在一些实施方案中，抗体是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，差异在于它们的恒定区，特别是在于它们的铰链和上部CH2结构域。IgG亚类的序列和差异在本领域中是已知的，并且在例如以下文献中进行了描述：Vidarsson等人，"IgG subclasses andallotypes:from structure to effector functions.”Frontiers in immunology 5(2014)；Irani等人"Molecular properties of human IgG subclasses and theirimplications for designing therapeutic monoclonal antibodies againstinfectious diseases."Molecular immunology 67.2(2015):171-182；Shakib,Farouk,ed.The human IgG subclasses:molecular analysis of structure,function andregulation.Elsevier,2016；所述文献的每一篇通过引用以其整体并入本文。
抗体也可以是源自任何物种(例如，人、啮齿动物、小鼠、骆驼)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体以及包含与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留完整抗体的特异性结合活性的抗体的一部分，即，能够特异性结合完整抗体的靶分子表位的抗体的任何部分。其包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是，例如，由抗体片段形成的scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、多特异性抗体、以及包括为抗体结合结构域或者与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括，例如，完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链、或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。
在一些实施方案中，抗原结合片段可以形成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是如本文所述的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜结构域和内域融合的融合体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含来自各种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含多个信号传导结构域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以增加效力。因此，一方面，本公开还提供了表达本文所述的嵌合抗原受体的细胞(例如，T细胞)。
在一些实施方案中，scFV包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域。在一些实施方案中，scFV包含两个重链可变结构域和两个轻链可变结构域。
抗CD3e抗体和抗原结合片段
本公开提供了特异性结合CD3e的抗体及其抗原结合片段。本文所述的抗体和抗原结合片段能够结合CD3e。本公开提供了例如小鼠抗CD3e抗体25-10A4(“10A4”)、30-1B1(“1B1”)、其嵌合抗体及其人源化抗体。
10A4和10A4衍生抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括如Kabat编号定义的重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:1-3，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:4-6。CDR也可由Chothia系统定义。在Chothia编号下，重链可变结构域的CDR序列示于SEQ ID NO:13、14、3，轻链可变结构域的CDR序列示于SEQ ID NO:4-6。
类似地，1B1和1B1衍生抗体的CDR序列包括如Kabat编号定义的重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:7-9，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:10-12。在Chothia编号下，重链可变结构域的CDR序列示于SEQ ID NO:15、16、9，并且轻链可变结构域的CDR示于SEQ IDNO:10-12。
还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于存在多种不同的小鼠抗体的人源化方法(例如，可以用不同的氨基酸取代进行序列修饰)，抗体的重链和轻链可具有不止一种形式的人源化序列。人源化10A4抗体的重链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:21-24。人源化10A4抗体的轻链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:25-27。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:21-24)中的任一个可以与这些轻链可变区序列(SEQ IDNO:25-27)中的任一个配对。
类似地，人源化1B1抗体的重链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NOs:28-31。人源化1B1抗体的轻链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NOs:32-34。这些重链可变区序列(SEQID NO:28-31)中的任一个可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:32-34)中的任一个配对。
如本文中所用，术语“人源化百分比”指与国际免疫遗传学信息系统(IMGT)数据库中的人抗体序列相比的重链或轻链可变区序列的同一性百分比。最高命中(top hit)指重链或轻链可变区序列与特定物种的接近程度高于与其它物种的接近程度。例如，对人的最高命中指所述序列与人的接近程度高于与其它物种的接近程度。对人和食蟹猴的最高命中意指所述序列与人序列和食蟹猴序列具有相同的百分比同一性，并且与其它物种的序列相比，这些百分比同一性最高。在一些实施方案中，人源化百分比大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。关于如何确定人源化百分比以及如何确定最高命中的详细描述在本领域中是已知的，并且在例如以下文献中进行了描述：Jones等人"The INNs and outs of antibody nonproprietary names."MAbs.第8卷第1期Taylor&Francis,2016，其通过引用以其整体内容并入本文。高人源化百分比通常具有各种有利方面，例如，在人体中更安全和更有效，更可能被人受试者耐受，和/或更不可能有副作用。
此外，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可包含一个、两个或三个重链可变区CDR，所述CDR选自SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:7-9、SEQ ID NO:13、14、3和SEQ ID NO:15、16、9；和/或选自SEQ ID NO:4-6和SEQ ID NO:10-12的一个、两个或三个轻链可变区CDR。
在一些实施方案中，抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH)，其中CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，以及CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，和包含CDR 1、2、3的轻链可变区(VL)，其中CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，以及CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。选定的VH CDR1、2、3氨基酸序列和选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列示于图21(Kabat CDR)和图22(Chothia CDR)中。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，其包含具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:1的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:2的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:3的CDR中的一个、二个或三个。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，其包含具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:7的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:8的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:9的CDR中的一个、二个或三个。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，其包含具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:13的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:14的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代SEQ ID NO:3的CDR中的一个、二个或三个。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，其包含具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:15的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:16的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代SEQ ID NO:9的CDR中的一个、二个或三个。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，其包含具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:4的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:5的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:6的CDR中的一个、二个或三个。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，其包含具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:10的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:11的CDR、具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:12的CDR中的一个、二个或三个。
插入、缺失和取代可以在CDR序列内，或者在CDR序列的一个或两个末端。
本公开还提供了结合CD3e的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含与选定的VH序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述轻链可变区包含与选定的VL序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。在一些实施方案中，选定的VH序列是SEQ ID NO:21、22、23、24或35，并且选定的VL序列是SEQ ID NO:25、26、27或36。在一些实施方案中，选定的VH序列是SEQ ID NO:28、29、30、31或37，并且选定的VL序列是SEQ ID NO:32、33、34或38。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较的目的，对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一氨基酸或核酸序列和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入缺口，以及为了比较的目的，可以忽略非同源序列)。出于比较目的而比对的参考序列的长度至少为参考序列长度的80％，并且在一些实施方案中至少为90％、95％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么在该位置上的分子是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数，这考虑了为了两个序列的最佳比对而需要引入的缺口的数量和每个缺口的长度。出于本公开的目的，序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可使用Blossum 62评分矩阵(利用为12的缺口罚分、为4的缺口延伸罚分和为5的移码缺口罚分(frameshift gappenalty))来完成。
本公开还提供了包含编码包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽的多核苷酸的核酸。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如图21或图22所示的CDR，或者包含如图24或图25所示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，配对的多肽与CD3e(例如，人CD3e)结合。
抗CD3e抗体和抗原结合片段也可以是抗体或抗体片段和多特异性(例如，双特异性)抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)。本文提供的另外的抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性(多聚体，例如双特异性)抗体、人抗体、嵌合抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、单链抗体、细胞内产生的抗体(即，胞内抗体)及其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG抗体或其抗原结合片段。
抗体片段适用于所提供的方法，只要它们保持全长抗体所需的亲和力和特异性。因此，与CD3e结合的抗体片段将保留与CD3e结合的能力。Fv片段是包含完整抗原识别和结合部位的抗体片段。该区域由紧密缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，其本质上可以是共价的，例如在scFv中。在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体的表面上定义了抗原结合部位。总的来说，六个CDR或其亚组赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含三个对抗原特异的CDR的Fv的一半)也可具有识别并结合抗原的能力，尽管通常亲和力低于完整结合部位。
单链Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区域)，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般而言，scFv多肽还包含位于VH与VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。
Fab片段包含轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab’)2抗体片段包含一对Fab片段，所述Fab片段通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在其羧基末端附近共价连接。抗体片段的其它化学偶联也是本领域已知的。
双抗体是具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含与同一多肽链(VH和VL)中的VL连接的VH。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。
线性抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，所述区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
可对本公开的抗体和抗体片段的Fc区进行修饰，以获得期望的效应功能或血清半衰期。
抗体的多聚化可通过抗体的自然聚集或通过本领域已知的化学或重组连接技术来实现。例如，一定百分比的纯化抗体制剂(例如，纯化的IgG1分子)自发地形成含有抗体同二聚体和其它高级抗体多聚体的蛋白质聚集体。
或者，抗体同二聚体可通过本领域已知的化学键联技术形成。例如，异双功能交联剂包括但不限于SMCC(4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)和SATA(S-乙酰基硫代-乙酸N-琥珀酰亚胺酯)可用于形成抗体多聚体。形成抗体同二聚体的示例性方案描述于Ghetie等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:7509-7514,1997)中。抗体同二聚体可通过胃蛋白酶消化转化为Fab’2同二聚体。另一种形成抗体同二聚体的方法是通过使用Zhao等人(J.Immunol.25:396-404,2002)中描述的自亲性(autophilic)T15肽。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体可通过工程改造一对抗体分子之间的界面(以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比)来制备。例如，界面可包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与一个或多个较大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了用于使异二聚体的产率增加超过其它不想要的终产物诸如同二聚体的机制。这种方法描述于例如WO96/27011(其通过引用以其整体并入)中。
双特异性抗体包括交联抗体或“异缀合(heteroconjugate)”抗体。例如，异缀合物中的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体可以与生物素偶联。异缀合抗体也可使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂和交联技术是本领域公知的，并公开于美国专利第4,676,980号中，所述专利通过引用以其整体并入本文。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的方法也是本领域已知的。例如，双特异性抗体可使用化学键联来制备。Brennan等人(Science 229:81,1985)描述了将完整的抗体蛋白水解切割以产生F(ab’)2片段的过程。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在的情况下被还原，以稳定相邻的二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通过用巯基乙胺还原，将Fab’TNB衍生物之一重新转化为Fab’硫醇，并将其与等摩尔量的另一种Fab’TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。
可将本文所述的任何抗体或抗原结合片段与稳定分子(例如，增加抗体或其抗原结合片段在受试者或溶液中的半衰期的分子)缀合。稳定分子的非限制性实例包括：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白质(例如，血清白蛋白，诸如人血清白蛋白)。与稳定分子的结合可在体外(例如，在组织培养中或作为药物组合物储存时)或体内(例如，在人中)延长抗体或抗原结合片段的半衰期或增加其生物活性。
在一些实施方案中，可将本文所述的抗体或抗原结合片段与治疗剂缀合。可将包含抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物与治疗剂共价或非共价结合。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂(例如，细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素、美登木素生物碱诸如DM-1和DM-4、二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺及其类似物)。
抗体特征
本文所述的抗体或其抗原结合片段可结合CD3e。
在一些实施方案中，通过结合CD3e，抗体可抑制CD3信号传导途径。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段是CD3拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是CD3激动剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以下调免疫反应，促进免疫耐受，诱导T细胞受体的内化或脱落，诱导活化的T细胞无反应或凋亡，增加CD69和/或CD25的表达，增加TGF-β的表达，诱导适应性FoxP3+Tregs的诱导，抑制T细胞活化和增殖，或阻断树突细胞成熟。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以上调免疫反应。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可将T细胞的活性或数量降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可将T细胞的免疫反应、活性或数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。
在一些实施方式中，抗体(或其抗原结合片段)以小于0.1s-1、小于0.01s-1、小于0.001s-1、小于0.0001s-1、或小于0.00001s-1的解离速率(koff)特异性结合CD3e(例如人CD3e、猴CD3e、小鼠CD3e和/或嵌合CD3e)。在一些实施方案中，解离速率(koff)大于0.01s-1、大于0.001s-1、大于0.0001s-1、大于0.00001s-1或大于0.000001s-1。
在一些实施方案中，动力学缔合速率(kon)大于1x102/Ms、大于1x103/Ms、大于1x104/Ms、大于1x105/Ms，或大于1x106/Ms。在一些实施方案中，动力学缔合速率(kon)小于1x105/Ms、小于1x106/Ms，或小于1x107/Ms。
亲和力可以从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)中推导出来。在一些实施方案中，KD小于1x10-6M、小于1x10-7M、小于1x10-8M、小于1x10-9M，或小于1x10-10M。在一些实施方案中，KD小于50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一些实施方案中，KD大于1x10-7M、大于1x10-8M、大于1x10-9M、大于1x10-10M、大于1x10-11M或大于1x10-12M。
在一些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)以小于或等于约5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM或0.7nM的KD与人CD3e结合。
用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括，例如，ELISA、RIA和表面等离子共振(SPR)。在一些实施方案中，抗体结合人CD3e(SEQ ID NO:17)、猴CD3e(例如，恒河猴(猕猴)CD3e(SEQ ID NO:19)、或食蟹猴CD3e(SEQ ID NO:39)、嵌合CD3e(SEQ ID NO:20)和/或小鼠CD3e(SEQ ID NO:18)。在一些实施方案中，抗体不结合人CD3e(SEQ ID NO:17)、猴CD3e(例如，恒河猴CD3e(SEQ ID NO:19)、或食蟹猴CD3e(SEQ ID NO:39)、嵌合CD3e(SEQ ID NO:20)和/或小鼠CD3e(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)以KD小于或等于约20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM的KD与猴CD3e结合。
在一些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)与人PBMC、猴PBMC或小鼠PBMC结合。在一些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)不与人PBMC、猴PBMC或小鼠PBMC结合。
在一些实施方案中，抗体具有相对高的表达效率。例如，在相同条件下，本文所述抗体的表达效率可以比参考抗体(例如，小鼠抗体、嵌合抗体或伊匹单抗(Yervoy))高至少10％、20％、30％、40％、50％或100％。在一些实施方案中，来自上清液的抗体浓度(例如，如通过实施例中描述的方法测量的)可以是至少5ug/ml、6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml、9ug/ml、10ug/ml、11ug/ml、12ug/ml、13ug/ml、14ug/ml、15ug/ml、16ug/ml、17ug/ml、18ug/ml、19ug/ml、20ug/ml、25ug/ml、30ug/ml、35ug/ml、40ug/ml、45ug/ml、50ug/ml、55ug/ml、60ug/ml或65ug/ml。在一些实施方案中，来自培养基的抗体浓度(例如，如通过实施例中描述的方法测量的)可以是至少21ug/ml、22ug/ml、23ug/ml、24ug/ml、25ug/ml、26ug/ml、27ug/ml、28ug/ml、29ug/ml、30ug/ml。
在一些实施方案中，检测了热稳定性。本文所述的抗体或抗原结合片段可具有高于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃的Tm(例如，如通过FACS、差示扫描荧光测定法或热荧光分析法所测定的)。
由于IgG可被描述为多结构域蛋白质，因此解链曲线有时显示两个转变，第一变性温度为Tm D1和第二变性温度为Tm D2。这两个峰的出现通常分别表明了Fc结构域(Tm D1)和Fab结构域(Tm D2)的变性。当有两个峰时，Tm通常指Tm D2。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段的Tm D1高于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段的Tm D2高于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。
在一些实施方案中，Tm、Tm D1、Tm D2低于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段是CD3拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段降低了T细胞中的CD3信号传导。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段增加了T细胞中的CD3信号传导。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段具有功能性Fc区。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应功能是吞噬作用。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应功能是ADCC和/或吞噬作用。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如，IgG抗体或双特异性抗体)不具有功能性Fc区。例如，抗体或抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。在一些实施方案中，Fc区具有LALA突变(EU编号中的L234A和L235A突变)，或LALA-PG突变(EU编号中的L234A、L235A、P329G突变)。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可刺激受试者中的T细胞(例如，增加T细胞的总数，激活T细胞以及增加T细胞中CD69或CD25的表达)。可向受试者施用抗体或抗原结合片段，并且收集来自血液或脾脏的细胞。在一些实施方案中，在刺激后，超过10％、20％、30％、40％、50％或60％的T细胞表达CD69。在一些实施方案中，在刺激后，超过2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的T细胞表达CD25。在一些实施方案中，CD69或CD25在T细胞中的表达可以增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍或10倍。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可激活NF-κB途径或NFAT(活化的T细胞的核因子)途径。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可诱导NF-κB途径或NFAT途径增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施方案中，用于刺激T细胞的EC50(例如，如通过实施例中描述的方法测量的)小于0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.3ug/ml、0.4ug/ml、0.5ug/ml、0.6ug/ml、0.7ug/ml、0.8ug/ml、0.9ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml或20ug/ml。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可增加TGF-β和/或IFN-γ的血清浓度。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可诱导TGF-β和/或IFN-γ的血清浓度增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段不会在体内引起显著的细胞因子释放，并且/或者不会在受试者中导致“流感样”综合征。
制备抗CD3e抗体的方法
分离的人CD3e片段可用作免疫原，使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术产生抗体。多克隆抗体可通过多次注射(例如，皮下或腹腔注射)抗原肽或蛋白质在动物体内产生。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可将抗原肽或蛋白质缀合至在待免疫的物种中具有免疫原性的制剂。可用抗原肽或蛋白质注射动物超过一次(例如，两次、三次或四次)。
可使用全长多肽或蛋白质，或者其抗原肽片段作为免疫原。蛋白质的抗原肽包含CD3e氨基酸序列的至少8个(例如，至少10个、15个、20个或30个)氨基酸残基，并且包含蛋白质的表位，使得针对肽产生的抗体与蛋白质形成特异性免疫复合物。如上所述，人CD3e的全长序列是本领域已知的(SEQ ID NO:17)。
免疫原通常用于通过免疫合适的受试者(例如，表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可包含例如重组表达的或化学合成的多肽(例如人CD3e的片段)。所述制剂还可包含佐剂，诸如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。
多克隆抗体可如上所述通过用CD3e多肽或其抗原肽(例如，CD3e的一部分)作为免疫原免疫合适的受试者来制备。可通过标准技术，诸如利用使用固定化CD3e多肽或肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)随时间监测经免疫的受试者中的抗体滴度。如果需要，可从哺乳动物(例如，从血液)中分离抗体分子，并通过公知的技术(诸如蛋白G色谱的蛋白A)进一步纯化，以获得IgG级分。在免疫后的适当时间，例如当特异性抗体滴度最高时，可从受试者获得抗体产生细胞，并通过标准技术，诸如最初由Kohler等人(Nature 256:495-497,1975)描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunol.Today 4:72,1983)、EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96页，1985)或三源杂交瘤技术将其用于制备单克隆抗体。产生杂交瘤的技术是公知的(一般参见Current Protocols in Immunology,1994,Coligan等人(Eds.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞通过例如使用标准ELISA测定法，筛选杂交瘤培养上清液中结合目标多肽或表位的抗体来检测。
本文所述的抗体或抗原结合片段的变体可通过将适当的核苷酸变化引入编码本文所述人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段的DNA中，或通过肽合成来制备。此类变体包括，例如，组成抗体的抗原结合部位或抗原结合结构域的氨基酸序列内的残基的缺失、插入或取代。在此类变体的群体中，一些抗体或抗原结合片段对靶蛋白例如CD3e的亲和力增加。可进行缺失、插入和/或组合的任何组合，以获得对靶标具有增加的结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入抗体或抗原结合片段中的氨基酸变化还可改变抗体或抗原结合片段，或者将新的翻译后修饰引入其中，诸如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量，改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列使得通过细胞中存在的酶附接不同的糖)，或者引入新的糖基化位点。
本文公开的抗体可源自任何动物物种，包括哺乳动物。天然抗体的非限制性实例包括源自人、灵长类动物(例如猴和猿)、牛、猪、马、绵羊、骆驼科动物(例如骆驼和羊驼类)、鸡、山羊和啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠和兔)(包括经基因工程改造产生人抗体的转基因啮齿动物)的抗体。
人和人源化抗体包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(或具有与源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区相同的氨基酸序列)的抗体。人抗体可以例如在CDR中包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。
人源化抗体，通常具有移植了非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸序列。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化基本上可通过例如用啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列来进行。这些方法描述于例如Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988)中；所述文献的每一篇都通过引用以其整体并入。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人V结构域被非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是小鼠抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被人抗体中类似位点的残基取代。
选择用于制备人源化抗体的人VH和VL结构域对于降低免疫原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合(best-fit)”方法，针对已知人结构域序列的整个文库筛选小鼠抗体的V结构域的序列。然后，与小鼠序列最接近的人序列被接受为人源化抗体的人FR(Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901(1987)).
更重要的是，抗体被人源化的同时保持对抗原的高特异性和亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，可通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产品的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。说明和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可用的。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。利用这种方法，可从受体序列和输入序列选择并组合FR残基，使得达到所需的抗体特征，诸如一种或多种目标抗原的亲和力增加。
通常，人抗体、人源化抗体或嵌合抗CD3e抗体的氨基酸序列变体将包含与原始抗体的轻链或重链中存在的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％百分比同一性的氨基酸序列。
相对于原始序列的同一性或同源性通常是在比对序列和引入缺口(如果需要)以获得最大的序列同一性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中存在的与人抗CD3e抗体、人源化抗CD3e抗体或嵌合抗CD3e抗体或片段中存在的序列相同的氨基酸残基的百分比。
可对抗CD3e抗体或抗原结合片段进行额外的修饰。例如，可将一个或多个半胱氨酸残基引入Fc区，从而在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可在体外和/或体内具有任何延长的半衰期。还可使用例如Wolff等人(Cancer Res.53:2560-2565,1993)中描述的异双功能交联接头来制备体外和/或体内半衰期延长的同二聚体抗体。或者，可工程改造具有双Fc区的抗体(参见，例如，Stevenson等人，Anti-CancerDrug Design 3:219-230,1989)。
在一些实施方案中，可对抗CD3e抗体或其抗原结合片段进行共价修饰。这些共价修饰可以通过化学或酶促合成，或者通过酶促或化学裂解来进行。通过使抗体或片段的目标氨基酸残基与能够与选定的侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体或抗体片段的其它类型的共价修饰引入分子。
在一些实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺乏与Fc区附接(直接或间接)的岩藻糖。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。例如，如WO 2008/077546中所述，通过计算相对于附接至Asn297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖结构)的总和(如通过MALDI-TOF质谱术测量的)的Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量。Asn297是指位于Fc区中的大致第297位(Fc区残基的Eu编号；或Kabat编号中的第314位)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中微小的序列变异，Asn297也可位于第297位上游或下游约3个氨基酸处，即第294位与第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。在一些实施方案中，为了减少聚糖异质性，可对抗体的Fc区进一步工程改造，以丙氨酸替换第297位的天冬酰胺(N297A)。
在一些实施方案中，为了通过避免Fab臂交换来提高生产效率，对抗体的Fc区进一步工程改造，以用脯氨酸替换IgG4的第228位(EU编号)的丝氨酸(S228P)。例如，在Silva等人中描述了关于S228突变的详细描述。“S228P突变可防止体内和体外IgG4 Fab臂交换，这一点已通过新型定量免疫测定和生理基质制备的结合得到证明。”Journal of BiologicalChemistry 290.9(2015):5462-5469，其通过引用以其整体并入。
重组载体
本公开还提供了包含本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如，表达载体)、向其中引入所述重组载体(即，使得宿主细胞包含所述多核苷酸和/或含有所述多核苷酸的载体)的宿主细胞，以及通过重组技术进行的重组抗体多肽或其片段的产生。
如本文中所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时，能够将一种或多种目标多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够递送一种或多种目标多核苷酸并在已引入了所述表达载体的宿主细胞中将所述目标多核苷酸表达为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，在感兴趣的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。
可过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染(例如，DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如，利用重组病毒)将载体引入宿主细胞。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体和与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。
在一些实施方式中，使用病毒表达系统(例如，痘苗病毒或其它痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入本文公开的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，这可能涉及使用非致病性(缺陷型)、复制型病毒，或者可使用复制缺陷型病毒。在后一种情况下，病毒繁殖通常将只在互补病毒包装细胞中发生。合适的系统公开于例如Fisher-Hoch等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321；Flexner等人，1989,Ann.N.Y.Acad Sci.569:86-103；Flexner等人，1990,Vaccine,8:17-21；美国专利第4,603,112号、第4,769,330号和第5,017,487号；WO 89/01973；美国专利第4,777,127号；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO91/02805；Berkner-Biotechniques,6:616-627,1988；Rosenfeld等人，1991,Science,252:431-434；Kolls等人，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:215-219；Kass-Eisler等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11498-11502；Guzman等人，1993,Circulation,88:2838-2848；以及Guzman等人，1993,Cir.Res.,73:1202-1207中。用于将DNA整合到此类表达系统中的技术是本领域普通技术人员熟知的。DNA也可以是“裸的”，如例如在Ulmer等人，1993,Science,259:1745-1749和Cohen,1993,Science,259:1691-1692中所描述的。裸DNA的摄取可通过将DNA包被在可生物降解的珠粒上来增加，所述珠粒可被有效地运输到细胞中。
为了表达，可将包含本文公开的编码抗体或编码多肽的多核苷酸的DNA插入序列可操作地连接至合适的启动子(例如，异源启动子)，举例来说，诸如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌(E.coli)lac、trp和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。其它合适的启动子是本领域技术人员已知的。表达构建体还可包含转录起始和终止位点，以及在转录区域中包含用于翻译的核糖体结合位点。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择性标记。此类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因，以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞；昆虫细胞，诸如果蝇S2细胞和甜菜夜蛾Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、Bowes黑色素瘤和HK 293细胞；和植物细胞。本文所述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。
用于细菌的非限制性载体包括可从Qiagen获得的pQE70、pQE60和pQE-9；可从Stratagene获得的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；和可从Pharmacia获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。非限制性真核载体包括可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG以及可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合适的载体对技术人员来说是显而易见的。
适合使用的非限制性细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子以及trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子，诸如劳斯肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及金属硫蛋白启动子，诸如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
在酿酒酵母中，可使用许多含有组成型或诱导型启动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。关于综述，参见Ausubel等人(1989)Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,N.Y，以及Grant等人Methods Enzymol.,153:516-544(1997)。
可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法将构建体引入宿主细胞。此类方法描述于许多标准实验室手册，诸如Davis等人Basic Methods In Molecular Biology(1986)中，其通过引用以其整体并入本文。
高等真核生物对编码本公开的抗体的DNA的转录可通过在载体中插入增强子序列来增加。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约为10-300bP，用于在给定的宿主细胞类型中增强启动子的转录活性。增强子的实例包括SV40增强子，其位于复制起点后侧的碱基对100-270处，巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧上的多瘤增强子，和腺病毒增强子。
为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、周质空间或细胞外环境中，可将适当的分泌信号整合到表达的多肽中。信号对于多肽可以是内源性的，或者它们可以是异源信号。
多肽(例如，抗体)可以以修饰的形式(诸如融合蛋白(例如，GST-融合蛋白)或组氨酸标签)表达，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括另外的异源功能区。例如，在纯化过程中，或者在随后的处理和储存过程中，可在多肽的N末端添加额外氨基酸(特别是带电荷的氨基酸)的区域，以提高宿主细胞中的稳定性和持久性。此外，还可将肽部分添加到多肽中以促进纯化。此类区域可在多肽的最终制备之前除去。向多肽中添加肽部分以产生分泌或排泄、提高稳定性和促进纯化等是本领域中熟悉和常规的技术。
治疗方法
本公开的抗体或其抗原结合片段可用于各种治疗目的。
一方面，本公开提供了例如通过影响循环CD3+T细胞的功能特性(例如，降低其增殖能力)或通过诱导调节细胞，治疗、预防与异常或不想要的免疫反应相关的病症(例如，自身免疫性疾病)或降低其发生的风险的方法。这些自身免疫性疾病包括但不限于斑秃、狼疮、强直性脊柱炎、美尼尔氏病、抗磷脂综合征、混合结缔组织病、自身免疫性Addison病、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力、自身免疫性肝炎、寻常天疱疮、白塞氏病、恶性贫血、大疱性类天疱疮、结节性多关节炎、心肌病、多软骨炎、乳糜泻皮炎(celiacsprue-dermatitis)、多腺体综合征、慢性疲劳综合征(CFIDS)、风湿性多肌痛、慢性炎性脱髓鞘、多发性肌炎和皮肌炎、慢性炎症性多发性神经病、原发性无丙种球蛋白血症、Churg-Strauss综合征、原发性胆汁性肝硬化、瘢痕类天疱疮、银屑病、CREST综合征、雷诺现象(Raynaud's phenomenon)、冷凝集素病、雷特氏综合征、克罗恩病、风湿热、盘状狼疮、类风湿性关节炎、冷球蛋白血症、结节病、纤维肌痛、硬皮病、格雷夫斯病、
Figure BDA0002865554920000281
综合征、格林-巴利综合征、僵人综合征、桥本甲状腺炎、大动脉炎(Takayasu arteritis)、特发性肺纤维化、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、溃疡性结肠炎、IgA肾病、葡萄膜炎、糖尿病(例如，I型)、血管炎、扁平苔藓和白癜风。还可向受试者施用抗CD3e抗体或其抗原结合片段，以治疗、预防与细胞、组织或器官移植(例如，肾、肝和心脏移植)有关的异常或不想要的免疫反应相关联的病症，例如移植物抗宿主病(GVHD)或降低发生所述疾病的风险，或者预防同种异体移植排斥。在一些实施方案中，受试者患有克罗恩病、溃疡性结肠炎或1型糖尿病。
在一些实施方案中，治疗可将T细胞增殖减少至少约20％。在一些实施方案中，T细胞增殖相对于治疗前水平降低了至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。另外，可以例如，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)或基于细胞的测定法诸如FACS扫描在外周血中测量IL-10和/或TGF-β的浓度，或分泌这些细胞因子的细胞水平，以监测耐受性的诱导。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可使外周血中测量的分泌IL-10和/或TGF-β的细胞水平增加约20％或更多。在一些实施方案中，在外周血中测量的分泌IL-10和/或TGF-β的细胞水平增加了至少约60％、70％、80％、90％或100％，例如加倍。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可使调节性T细胞的总数例如增加约50％、100％、200％、300％或更多。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可使调节性T细胞的活性，例如增加约50％、100％、200％、300％或更多。
此外，因为双特异性抗体可以结合CD3和肿瘤相关抗原，并将活化分子CD3桥接到肿瘤相关抗原，绕过了正常的T细胞-受体/MHC相互作用，并且细胞毒性由双特异性抗体特异性决定(双特异性抗体介导的T淋巴细胞再靶向)。因此，细胞毒性的发生与T细胞受体特异性无关，也与肿瘤细胞的MHC表达/肽呈递的程度无关。因此，双特异性抗体也可用于治疗肿瘤。如本文中所用，术语“肿瘤相关抗原”是指在癌细胞表面表达的抗原。这些抗原可用于标识肿瘤细胞。正常细胞很少表达肿瘤相关抗原或仅以非常低的水平表达它们。一些示例性肿瘤相关抗原包括例如CD19、CD20、PSA、Her2、CD123、Ep-CAM、CD66e、PSMA、CD371和VEGFR2。PSA主要表达于前列腺癌细胞上表达，Her2主要在乳腺癌细胞上表达。
因此，一方面，本公开提供了用于治疗受试者的癌症的方法、降低受试者体内肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低受试者体内发生转移风险的方法、或者降低受试者体内发生额外转移风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减缓、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，所述治疗可导致受试者中一种或多种癌症症状的数量、严重程度和/或持续时间的减少。
一方面，本公开表征了方法，所述方法包括将向有此需要的受试者(例如，患有或被鉴定或诊断为患有癌症的受试者)施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体)，所述癌症是例如乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液恶性肿瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、白血病)。在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤、乳腺癌或前列腺癌。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。癌症患者可用本领域已知的各种方法进行鉴定。
在一些实施方案中，抗体具有大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)。在一些实施方案中，抗体具有小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的肿瘤生长抑制百分比。可在例如治疗开始后3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天，或治疗开始后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月测定TGI％。如本文中所用，肿瘤生长抑制百分比(TGI％)使用以下公式计算：
TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
Ti是治疗组在第i天的平均肿瘤体积。T0是治疗组在第0天的平均肿瘤体积。Vi是对照组在第i天的平均肿瘤体积，V0是对照组在第0天的平均肿瘤体积。
在一些实施方案中，抗体可诱导免疫耐受性，从而促进肿瘤生长。因此，动物模型中的肿瘤生长可用作免疫耐受性的有效指标。
如本文中所用，“有效量”是指足以实现有益或期望的结果(包括停止、减缓、延缓或抑制疾病(例如自身免疫性疾病或癌症)的进展)的量或剂量。有效量将根据例如将向其施用抗体、抗原结合片段、编码抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和/或其组合物的受试者的年龄和体重、症状的严重程度和施用途径而变化，因此可以基于个体来确定施用。
可以一次或多次施用有效量。举例来说，抗体或抗原结合片段的有效量是足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减缓和/或延迟患者的自身免疫性疾病或癌症进展的量，或者是足以改善、停止、稳定、逆转、减缓和/或延迟细胞(例如，活检细胞、本文所述的任何癌细胞，或细胞系(例如，癌细胞系))体外增殖的量。如本领域所理解的，抗体或抗原结合片段的有效量可以变化，这尤其取决于患者病史以及其它因素，诸如所用抗体的类型(和/或剂量)。
施用本文公开的抗体、抗体编码多核苷酸和/或组合物的有效量和方案可以凭经验确定，并且进行此类确定在本领域的技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将根据例如将接受本文公开的抗体、抗体编码多核苷酸和/或组合物的哺乳动物、所用的本文公开的施用途径、特定类型的抗体、抗体编码多核苷酸、抗原结合片段和/或组合物以及给哺乳动物施用的其它药物而变化。为抗体或抗原结合片段选择合适剂量的指南可见于关于抗体和抗原结合片段的治疗用途的文献中，例如，Handbook of MonoclonalAntibodies,Ferrone等人，eds.，Noges Publications,Park Ridge,N.J.,1985,ch.22和第303-357页；Smith等人，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等人，eds.，Raven Press,New York,1977，第365-389页。
抗体有效量的典型日剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg.在一些实施方案中，剂量约为10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。
在本文所述的任何方法中，可以每周至少一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每日一次、每日两次或每日三次)向受试者施用至少一种抗体、其抗原结合片段或药物组合物(例如，本文所述的抗体、抗原结合片段或药物组合物中的任一种)和任选的至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，在同一组合物(例如，液体组合物)中施用至少两种不同的抗体和/或抗原结合片段。在一些实施方案中，在同一组合物(例如，液体组合物)中施用至少一种抗体或抗原结合片段和至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，在两种不同的组合物(例如，含有至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物和含有至少一种另外的治疗剂的固体口服组合物)中施用至少一种抗体或抗原结合片段和至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，以丸剂、片剂或胶囊的形式施用至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，以缓释口服制剂的形式施用至少一种另外的治疗剂。
在一些实施方案中，可在施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物中的任一种)之前或之后，向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种另外的治疗剂和至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物中的任一种)，使得一种或多种另外的治疗剂和至少一种抗体或抗原结合片段(例如，本文所述的抗体或抗原结合片段中的任一种)在所述受试者中存在生物活性期重叠。
在一些实施方案中，可以在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间段内)向受试者施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物中的任一种)。熟练的医学专业人员可使用本文描述的用于诊断或跟踪治疗效果的任何方法(例如，癌症的至少一种症状的观察)来确定治疗期的长度。如本文中所述，熟练的医学专业人员还可改变向受试者施用的抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或多种另外的治疗剂)的身份和数量(例如，增加或减少)，并且还可基于对治疗效果的评估(例如，使用本文所述和本领域已知的任何方法)来调整(例如，增加或减少)向受试者施用至少一种抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或多种另外的治疗剂)的剂量或频率。
在一些实施方案中，可向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂可包含选自由以下组成的组的一种或多种抑制剂：B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、双PI3K/mTOR抑制剂、Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂和异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)抑制剂和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)的抑制剂(例如依帕司他(epacadostat))。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可包含选自由以下组成的组的一种或多种抑制剂：HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、活化的hedgehog信号传导途径的抑制剂和选择性降解雌激素受体的试剂。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可包含选自由以下组成的组的一种或多种治疗剂：曲贝替定、纳布紫杉醇(nab-paclitaxel)、曲巴尼布(Trebananib)、帕唑帕尼、西地尼布(cediranib)、帕博西尼(Palbociclib)、依维莫司、氟嘧啶、IFL、瑞格非尼、Reolysin、力比泰(Alimta)、Zykadia、舒尼替尼(Sutent)、替西罗莫司(temsirolimus)、阿西替尼、依维莫司、索拉非尼、Votrient、帕唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺、IL-2、IFNa、长春碱、Thalomid、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、氮杂胞苷、来那度胺、硼替佐米、氨柔比星、卡非佐米、普拉曲沙和恩扎妥林(enzastaurin)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可包含选自由以下组成的组的一种或多种治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择素激动剂。
在一些实施方案中，向受试者施用卡铂、纳布紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX或FOLFIRI。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗OX40抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体或抗GITR抗体。
药物组合物和施用途径
本文还提供了包含至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)本文所述抗体或抗原结合片段的药物组合物。两种或多种(例如，两种、三种或四种)本文所述的任何抗体或抗原结合片段可以以任意组合存在于药物组合物中。药物组合物可以以本领域已知的任何方式配制。
将药物组合物配制成与其预期施用途径(例如，口服、静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹腔)相适用。所述组合物可包括无菌稀释剂(例如，无菌水或盐水)、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂、抗菌剂或抗真菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等、抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂，诸如乙二胺四乙酸、缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及等渗剂，诸如糖(例如,葡萄糖)、多元醇(例如,甘露醇或山梨醇)或盐(例如,氯化钠)或其任意组合。脂质体混悬液也可以用作药学上可接受的载体(参见，例如，美国专利第4,522,811号)。可配制组合物的制剂，并将其封装在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。如果需要(例如在可注射制剂中)，可通过例如使用包衣(诸如卵磷脂)或表面活性剂来保持适当的流动性。抗体或其抗原结合片段的吸收可通过包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长。或者，可通过植入物和微囊递送系统实现受控释放，所述系统可包括可生物降解的、生物相容性聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸；Alza Corporation和Nova Pharmaceutical,Inc.)。
含有一种或多种本文所述的任何抗体或抗原结合片段的组合物可被配制用于以剂量单位形式(即，含有预定量的活性化合物的物理离散单位，以便于易于施用和剂量均一)肠胃外(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)施用。
可以在细胞培养物或实验动物(例如，猴子)中通过标准药学方法测定组合物的毒性和治疗效果。例如，可测定LD50(对群体的50％致死的剂量)或ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比率。显示高治疗指数的试剂是优选的。当试剂表现出不期望的副作用时，应注意将潜在损害降至最低(即，减少不想要的副作用)。毒性和治疗效果可通过其它标准药学方法测定。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于受试者(例如，人)的适当剂量的任何给定的剂。一种或多种(例如，一种、两种、三种或四种)抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)的治疗有效量将是治疗受试者(例如，被鉴定为患有癌症的人受试者)或被鉴定为有发展疾病风险的受试者(例如，以前患过癌症但现在已经治愈的受试者)的疾病(例如，杀伤癌细胞)，降低受试者(例如，人)的疾病的一种或多种症状的严重性、频率和/或持续时间的量。本文所述的任何抗体或抗原结合片段的有效性和给药可由卫生保健专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法，以及通过观察受试者(例如，人)的疾病的一种或多种症状来确定。某些因素(例如，疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及其它疾病的存在)可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排。
示例性剂量包括本文所述的任何抗体或抗原结合片段的毫克或微克量/千克受试者体重(例如，约1μg/kg至约500mg/kg、约100μg/kg至约500mg/kg、约100μg/kg至约50mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg至约0.5mg/kg或约1μg/kg至约50μg/kg)。虽然这些剂量涵盖了广泛的范围，但本领域普通技术人员将理解，治疗剂，包括抗体及其抗原结合片段，其效力各不相同，并且有效量可通过本领域已知的方法来确定。通常，首先施用相对低的剂量，随后主治保健专业人员或兽医专业人员(在治疗性应用的情况下)或研究人员(当仍处于开发阶段时)可以逐渐增加剂量，直到获得适当的反应。另外，应当理解，用于任何特定受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率以及抗体或抗体片段在体内的半衰期。
可将药物组合物与施用说明一起包含在容器、包装或分配器中。本公开还提供了制造用于本文所述各种用途的抗体或其抗原结合片段的方法。
实施例
在以下实施例中进一步描述了本发明，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例1.产生小鼠抗hCD3e抗体
为了产生抗人CD3e(hCD3e；SEQ ID NO:17)鼠抗体，用人CD3e免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。通过如下文中所述和图1和图2所示的方法收集抗hCD3e抗体。
小鼠免疫
用浓度为100μg/ml的His标记的人CD3e蛋白以20μg/小鼠免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。用佐剂乳化His标记的人CD3e蛋白并将其注射到小鼠背部的四个位置。对于第一次皮下(s.c.)注射，用等体积的完全弗氏佐剂(CFA)乳化稀释的抗原。在随后的皮下注射中，用等体积的不完全弗氏佐剂(IFA)乳化蛋白质。第三次注射或加强免疫后三天，收集血液(血清)并使用ELISA分析其抗体滴度。
在另一个实验中，通过向小鼠注射编码人CD3e的表达质粒来免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。通过使用基因枪，以60μg/小鼠将浓度为1000μg/ul的编码抗原的质粒注射入小鼠的胫骨前肌(肌内注射；i.m.注射)。至少进行了四次注射，两次注射之间间隔至少14天。在最后一次免疫后7天收集血液(血清)，并通过ELISA检测血清的抗体滴度。
在先前免疫后至少14天还进行加强免疫的程序(通过注射质粒或通过注射蛋白质)。将Jurkat细胞通过尾静脉内注射到小鼠体内。然后在注射后四天收集脾脏。
SP2/0细胞与脾细胞的融合
研磨脾脏组织。首先通过CD3e微珠和抗小鼠IgM微珠筛选脾细胞，然后将其与SP2/0细胞融合。然后将细胞涂铺在含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基的96孔板中。
杂交瘤的初步筛选
按照标准程序，使用荧光激活细胞分选术(FACS)对96孔板中的杂交瘤上清液进行初步筛选。在筛选之前，将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞加入96孔板(2×104个细胞/孔)。使用50μl上清液。实验中使用的抗体是
(1)缀合有荧光素(FITC)的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性的，和
(2)缀合有
Figure BDA0002865554920000351
的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性的。
亚克隆
使用ClonePix2进行亚克隆。简言之，将在初步筛选期间鉴定的阳性孔转移到半固体培养基中，并鉴定和测试IgG阳性克隆。使用FITC抗小鼠IgG Fc抗体。
腹水抗体
将1×106个阳性杂交瘤细胞腹腔注射到
Figure BDA0002865554920000352
小鼠(Beijing Biocytogen,Beijing,China；目录号：B-CM-002)中。单克隆抗体是通过在小鼠腹腔内培养杂交瘤细胞而产生的。杂交瘤细胞繁殖并在小鼠腹部产生腹水。所述液体含有高浓度的抗体，所述抗体可被收集起以供后用。
抗体的纯化
使用通用GE AKTA蛋白质色谱(GE Healthcare,Chicago,Illinois,UnitedStates)纯化腹水中的抗体。通过上述方法产生的小鼠抗体中有25-10A4(“10A4”)和30-1B1(“1B1”)、16-3G3、18-1H11、18-2F3、16-2D4、18-2F4、30-1F11、26-2E3、30-2E7、30-3D7、30-3H6、34-5B8、34-6A9、34-6D8、26-6E5、30-10F1以及几种其它抗体。
确定了一些抗体的VH、VL和CDR区。10A4的重链CDR1、CDR2、CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示于SEQ ID NO:1-6(Kabat编号)或SEQ ID NO:13、14、3、4、5、6(Chothia编号)。
1B1的重链CDR1、CDR2、CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示于SEQ ID NO:7-12(Kabat编号)或SEQ ID NO:15、16、9、10、11、12(Chothia编号)。
实施例2.小鼠抗体的人源化
人源化的起点是小鼠抗体(例如，10A4和1B1)。测定了这些小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
构建10A4的四种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:21-24)和三种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:25-27)，其包含不同的修饰或取代。
构建1B1的四种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:28-31)和三种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:32-34)，其包含不同的修饰或取代。
可将这些人源化重链可变区变体与基于同一小鼠抗体的任何轻链可变区变体组合。例如，可将10A4-H1(SEQ ID NO:21)与基于同一小鼠抗体10A4(例如，10A4-K3(SEQ IDNO:27))的任何人源化轻链可变区变体组合，并且相应地标记抗体(例如，10A4-H1K3)。
还制备了基于10A4和1B1的嵌合抗体。其中，C3E-25-10A4-mHvKv-IgG1-LALA(“25-10A4-mHvKv-IgG1-LALA”)具有来自10A4的重链可变区(SEQ ID NO:35)、来自从10A4(SEQID NO:36)的轻链可变区，以及具有LALA(L234A/L235A)突变的人IgG1恒定区。类似地，C3E-30-1B1-mHvKv-IgG1-LALA(“30-1B1-mHvKv-IgG1-LALA”)具有来自1B1的重链可变区(SEQID NO:37)、来自1B1的轻链可变区(SEQ ID NO:38)以及具有LALA(L234A/L235A)突变的人IgG1恒定区。
实施例3.抗hCD3e抗体的体内测试
进行实验以测试抗hCD3e抗体在体内的功效。
产生了人源化的CD3e小鼠模型。人源化CD3e小鼠模型被工程改造成表达嵌合CD3e蛋白(SEQ ID NO:20)，其中小鼠CD3e蛋白的一部分细胞外区被相应的人CD3e细胞外区替换。该嵌合CD3e的氨基酸残基1-126(SEQ ID NO:20)来自人CD3e(SEQ ID NO:17)。人源化小鼠模型(B-hCD3e)通过显著减少人与表达小鼠CD3e的普通小鼠中的临床结果之间的差异，为在临床环境中测试新的治疗性治疗提供了新的工具。
向小鼠腹腔注射1μg或5μg抗mCD3抗体。将等体积的盐水注射到小鼠中作为阴性对照，并将替利珠单抗注射到小鼠中用于比较目的。注射后24小时收集脾脏，研磨脾脏样品。然后将样品通过70μm的细胞筛网(cell mesh)。将过滤的细胞悬浮液离心，并弃去上清液。向样品中加入红细胞裂解液，将其裂解5分钟，并用PBS溶液中和。将溶液再次离心，弃去上清液。用PBS洗涤细胞，并用PE标记的抗mCD25抗体(mCD25 PE)、APC标记的抗mCD69抗体(mCD69 APC)和PerCP/Cy5.5抗小鼠TCRβ链(mTcRβPerCP)染色。
进行流式细胞术。CD25和CD69的表达表明T细胞的活化。结果如图3和图4所示。图3显示了CD69+T细胞在所有T细胞中的百分比。图4显示了CD25+T细胞在所有T细胞中的百分比。
结果表明，10A4在刺激T细胞方面具有比16-3G3、18-1H11、18-2F3和16-2D4更好的效果。对于CD69在T细胞中的表达，10A4的效果与替利珠单抗相当。关于CD25在T细胞中的表达，10A4比替利珠单抗更有效。
实施例4.与人外周血单核细胞(PBMC)结合
进行实验以确定抗hCD3e抗体是否能与人PBMC结合。
收集了来自两个不同人受试者的PBMC细胞，并将其标记为PBMC-1和PBMC-2。解冻后，将细胞培养3-4小时。然后丢弃培养基，将细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。然后将细胞浓度调整至2x106/25μl PBS。
制备96孔板。向每个孔中加入25ul细胞悬浮液。将抗hCD3抗体16-2D4、16-3G3、18-1H11、18-2F3、25-10A4、18-2F4在PBS中稀释至20ug/ml(2X)，并将其加入96孔板。对于对照组，添加25ul PBS。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。离心后，弃去残余物。再次清洗样品。然后向每个孔中加25ul的PBS以重新悬浮细胞。
然后向每个孔中加入AF647-抗-mIgG。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。离心后，弃去残余物。再次清洗样品。然后向每个孔中加入25ul PBS以重新悬浮细胞。
将14ul PerCP抗-hTcRβ(Biolegend，目录号306724)和14ul FITC抗-hCD19(Biolegend，目录号302206)加入350ul PBS中，并混合。然后向每个孔中加入25ul混合物。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。离心后，弃去残余物。再次用PBS洗涤样品。然后向每个孔中加入300ul PBS以重新悬浮细胞。
进行FACS。按照下表处理样品。
表1
Figure BDA0002865554920000371
Figure BDA0002865554920000381
结果如图5和图6所示。如图所示，并非所有的抗体都能与人PBMC细胞结合。在这些测试的抗体中，16-2D4、16-3G3和25-10A4可以结合人PBMC细胞。18-1H11和18-2F3与人PBMC细胞的结合亲和力相对较弱，18-2F4不能与人PBMC细胞结合。两个PBMC样品的结果基本相同。另外，只有25-10A4的信号显示与来自PerCP抗hTcRβ的信号呈线性关系，这表明25-10A4具有优异的特异性。
实施例5.与猴外周血单核细胞(PBMC)的结合
进行实验以确定抗hCD3e抗体是否能与猴PBMC结合。
采集来自食蟹猴的PBMC细胞。解冻后，将细胞培养几个小时，并悬浮在培养基中。然后弃去培养基，将细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
制备96孔板。向每个孔中加入25ul细胞悬浮液。将抗hCD3抗体25-10A4和替利珠单抗在PBS中稀释至20ug/ml(2X)。向96孔板中加25ul 25-10A4和25ul替利珠单抗。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。在以2000rpm离心5分钟后，丢弃培养基。再次洗涤样品。然后加入25ul PBS以重新悬浮细胞。
将AF647-抗-mIgG或AF647-抗-hIgG加入适当的孔中。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。离心后，弃去残余物。再次洗涤样品。然后加入25ulPBS以重新悬浮细胞。
然后向每个孔中加入200ul PBS。进行FACS。所有样品按照下表进行处理。
表2
样品 靶标 染色 浓度 体积
1号样品 mIgG AF647-抗mIgG 1:400 50ul
2号样品 25-10A4 AF647-抗-mIgG 10ug/ml 50ul
3号样品 hIgG AF647-抗-HiG 1:400 50ul
4号样品 替利珠单抗 AF647-抗-hIgG 10ug/ml 50ul
结果如图7所示。如图所示，10A4可与猴子PBMC结合，替利珠单抗不能有效地与猴子PBMC结合。这表明10A4可与猴子CD3e结合，来自猴子的结果可以用来预测人受试者中的效果。
实施例6.与Jurkat细胞结合
进行结合测定以确定抗hCD3e抗体是否能与Jurkat细胞(人T细胞的永生化细胞系)结合。
从小鼠腹水液中收集抗hCD3e抗体，并通过色谱法纯化。将25μl Jurkat和Raji细胞(1:1)加入96孔板的孔中。将纯化的抗体滴定至终浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml和0.001μg/ml。在4℃下，将滴定的抗体以25μl/孔添加到每个孔中，并孵育30分钟。
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后，向每个孔中加入50μl抗小鼠IgG Fc-FITC(以1:100稀释的)。将具有抗体的细胞在4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术测定FITC的信号。
结果表明，16-3G3、18-1H11、18-2F3和16-2D4在10μg/ml下能有效地与Jurkat细胞结合。但在1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml和0.001μg/ml，这些抗体没有明确的结合信号。另外，在任何测试浓度下，18-2F4都不能与Jurkat细胞结合。抗小鼠IgG Fc-FITC结合阳性的细胞百分比如下所示，百分比越高，表明抗hCD3e抗体与Jurkat细胞的结合越有效。
表3
抗体 10μg/ml 1μg/ml 0.1μg/ml 0.01μg/ml 0.001μg/ml
对照 0.247％ / / / /
16-3G3 36.1％ 2.76％ 0.794％ 1.93％ 1.14％
18-1H11 29.7％ 8.19％ 0.743％ 0.745％ 0.410％
16-2D4 41.2％ 5.55％ 0.579％ 0.777％ 0.442％
18-2F3 22.6％ 0.446％ 0.385％ 0.580％ 0.424％
18-2F4 0.849％ 0.503％ 0.333％ 0.501％ 0.291％
25-10A4 93.4％ 29.2％ 5.24％ 0.550％ 0.989％
结果表明，与16-3G3、18-1H11、18-2F3、16-2D4和18-2F4相比，25-10A4与Jurkat细胞具有更强的结合亲和力。
实施例7.抗hCD3e抗体的体外活性
进行实验以确定抗hCD3e抗体是否能在体外活化Jurkat-GFP细胞(SBI-SystemBiosciences,目录号TR850A-1)。GFP在这些细胞中的表达(比背景高达30倍)仅在存在活性NF-κB信号时发生。
从小鼠腹水液中收集抗hCD3e抗体，并通过色谱法纯化。将纯化的抗体滴定至终浓度为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml。将200μl不同浓度的抗hCD3e抗体加入96孔板的孔中。
向每个孔中加入3x104个Jurkat-GFP细胞。在37℃孵育24小时后，将细胞转移到新的96孔板中。用PBS洗涤后，通过流式细胞术分析GFP信号。
结果表明，25-10A4和替利珠单抗在活化Jurkat细胞方面具有比16-2D4、16-3G3、18-2F3和18-1H11更强的效果。下表列出了测试的抗体。
表4
Figure BDA0002865554920000401
Figure BDA0002865554920000411
实施例8.抗hCD3e抗体的体外活性
进行实验以确定抗hCD3e抗体是否能在体外活化Jurkat-Luc-NFAT细胞(Promega，目录号J1601)。
从小鼠腹水液中收集抗hCD3e抗体，并通过色谱法纯化。将纯化的抗体滴定至适当的浓度。
将4x104个CHO-FcγRIIB细胞加入孔中，并在37℃孵育过夜。将96孔板离心，弃去上清液。
然后将50μl Jurkat-Luc-NFAT细胞加入96孔板(5x104个细胞/孔)。还将25μl不同浓度的抗-hCD3e抗体加入96孔板的孔中。在37℃孵育6小时后，加入75μl荧光素酶测定试剂并孵育5-10分钟。测量荧光信号。
结果如图8A-图8B所示。结果表明，25-1A4在活化Jurkat细胞方面优于其它抗体。在本实验中，25-10A4的EC50为0.4206μg/ml，30-1B1的EC50为2.9810μg/ml。
实施例9.嵌合抗hCD3e抗体与人PBMC的结合
进行实验以确定嵌合抗hCD3e抗体是否能与人PBMC结合。
收集了人受试者的PBMC细胞。解冻后，将细胞悬浮在PBS中。向96孔板中的每个孔中加入50ul细胞悬浮液。
从CHO-S细胞中收集抗人hCD3抗体。下表列出了测试的抗体。
表5
Figure BDA0002865554920000412
Figure BDA0002865554920000421
然后将抗体加入96孔板，并在4℃孵育30分钟。加入100ul PBS，以2000rpm离心平板7分钟。
加入50μL抗hTcRβ-PerCP抗体(1:70)和抗人IgG Fc-Alexa Fluor 647(1:500)，并在4℃孵育30分钟。
向每个孔中加入150μL的PBS，然后以2000rpm离心平板7分钟。然后除去上清液。然后将细胞重悬于200μL PBS中，并通过流式细胞术进行分析。
结果表明，并非所有的嵌合抗hCD3e抗体都能有效地与人PMBC结合(图9)。其中，30-1B1-mHvKv-IgG1-LALA和25-10A4-mHvKv-IgG1-LALA与人PBMC具有相对高的结合亲和力。
实施例10.嵌合抗hCD3e抗体与猴PBMC的结合
进行实验以确定嵌合抗hCD3e抗体是否能与猴PBMC结合。
将食蟹猴的PBMC细胞解冻，将细胞悬浮于1ml PBS中。向96孔板中的每个孔中加入50ul细胞悬浮液。
将抗hCD3抗体加入到96孔板中，并在4℃孵育30分钟。加入100ul PBS，以2000rpm离心平板7分钟。
加入50μL抗hTcRβ-PerCP抗体(1:70)和抗人IgG Fc-Alexa Fluor 647(1:500)，并在4℃孵育30分钟。
向每个孔中加入150μL的PBS，然后以2000rpm离心平板7分钟。然后除去上清液。然后将细胞重悬于200μL PBS中，并通过流式细胞术进行分析。
结果表明，并非所有的嵌合抗hCD3e抗体都能有效地与猴PMBC结合(图10)。其中，30-1B1-mHvKv-IgG1-LALA和25-10A4-mHvKv-IgG1-LALA与猴PBMC具有相对高的结合亲和力。
结果概述如下。
表6
抗体 与猴PBMC结合 与人PBMC结合
30-1B1-mHvKv-IgG1-LALA 是 是
30-1F11-mHvKv-IgG1-LALA 否 否
26-2E3-mHvKv-IgG1-LALA 否 是
30-2E7-mHvKv-IgG1-LALA 否 是
30-3D7-mHvKv-IgG1-LALA 否 是
30-3H6-mHvKv-IgG1-LALA 是 是
34-5B8mHvKv-IgG1-LALA 否 否
30-6A9-mHvKv-IgG1-LALA 否 是
30-6D8-mHvKv-IgG1-LALA 否 是
26-6E5-mHvKv-IgG1-LALA 否 否
25-10A4-mHvKv-IgG1-LALA 是 是
30-10F1-mHvKv-IgG1-LALA 否 是
实施例11.抗hCD3e抗体的结合亲和力
使用Biacore(Biacore,INC,Piscataway N.J.)，利用表面等离子共振(SPR)测量抗hCD3e抗体的结合亲和力。T200生物传感器配有预固定化蛋白A传感器芯(ProteinA(批号：10260138)-5)。
从CHO-S细胞中收集抗hCD3e抗体。将抗体(1:20)以10μL/分钟的速度注入BiacoreT200生物传感器中，持续35秒，以达到所需的蛋白质密度。然后将不同浓度(100nM～0.390625nM)的组氨酸标记的人CD3e蛋白(hCD3e-His)以30μL/分钟的速度注射到系统中，持续150秒。监测解离600秒。最后一次注射利用甘氨酸的每次滴定(pH 2.0,30μL/分钟，持续5秒)后，芯片再生。
通过将数据与1:1的朗缪尔结合模型全局拟合，同时获得动力学缔合率(kon)和解离速率(koff)。从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导出亲和力。
表7
Figure BDA0002865554920000441
还进行了实验来测试与rCD3e(猕猴，或恒河猴)的结合亲和力。将抗hCD3e抗体(1:20)以10μL/分钟的速度注射到Biacore T200生物传感器中，持续30秒，以达到所需的蛋白质密度。然后将不同浓度(100nM～0.390625nM)的组氨酸标记的rCD3e蛋白(rCD3e-His)以30μL/分钟的速度注射到系统中，持续150秒。监测解离450秒。最后一次注射利用甘氨酸的每次滴定(pH 2.0,30μL/分钟，持续12秒)后，芯片再生。
通过将数据与1:1的朗缪尔结合模型全局拟合，同时获得动力学缔合率(kon)和解离速率(koff)。从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导出亲和力。
表8
Figure BDA0002865554920000442
实施例13.在C57BL/6小鼠中体内测试抗CD3e抗体
为了在体内测试抗CD3e抗体并预测这些抗体的效果，在结肠癌模型中测试了抗CD3e抗体在体内对肿瘤生长的效果。将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射入C57BL/6小鼠。当小鼠体内肿瘤体积达到100～150mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同组(每组5只小鼠)。
然后通过腹腔施用给小鼠注射生理盐水(PS)(G1)、抗mPD-1抗体(RMP1-14)(10mg/kg)(G2)、25-10A4(2mg/kg)(G3)、替利珠单抗(2mg/kg)(G4)和抗mCD3e抗体(BioXcell，目录号BE0001-1)(2mg/kg)(G5)。在每周的第一天和第四天给予抗体，持续3周(共6次注射)。
测量肿瘤的长轴和短轴长度，将肿瘤体积计算为0.5×(长轴)×(短轴)2。在注射前，在将小鼠分成不同的组(在第一次抗体注射之前)时，在抗体注射期间每周两次，以及在安乐死之前，也测量小鼠的重量。
肿瘤生长抑制百分比(TGI％)使用以下公式计算：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100.Ti是治疗组在第i天的平均肿瘤体积。T0是治疗组在第0天的平均肿瘤体积。Vi是对照组在第i天的平均肿瘤体积，V0是对照组在第0天的平均肿瘤体积。
实验结束时，不同组中的小鼠体重相似(图11和图12)。
G2组(抗mPD-1抗体)中的肿瘤体积没有增加。G1组、G3组(25-10A4)、G4组(替利珠单抗)中的肿瘤体积继续增加。结果表明，与对照组相比，抗hCD3e抗体对肿瘤体积无明显影响。然而，在G5(抗mCD3e)组中，肿瘤体积实际上大于对照组中的肿瘤体积。结果表明，25-10A4和替利珠单抗在野生型小鼠中无明显效果，抗mCD3e抗体可诱导免疫耐受性。
表9
Figure BDA0002865554920000451
实施例13.在人源化CD3e小鼠中体内测试抗hCD3e抗体
为了在体内测试抗hCD3e抗体并预测这些抗体在人体中的效果，产生了人源化CD3e小鼠模型。人源化CD3e小鼠模型被工程改造成表达嵌合CD3e蛋白(SEQ ID NO:20)，其中小鼠CD3e蛋白的一部分细胞外区被相应的人CD3e细胞外区替换。该嵌合CD3e的氨基酸残基1-126(SEQ ID NO:20)来自人CD3e(SEQ ID NO:17)。
在结肠癌模型中测试抗hCD3e抗体在体内对肿瘤生长的影响。将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射入B-hCD3e小鼠。当小鼠体内肿瘤体积达到100～150mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同组(每组5只小鼠)。
然后通过腹腔注射施用给小鼠注射生理盐水(PS)(G1)、抗mPD-1抗体(RMP1-14)(10mg/kg)(G2)、25-10A4(2mg/kg)(G3)和替利珠单抗(2mg/kg)(G4)。在每周的第一天和第四天给予抗体，持续3周(共6次注射)。
测量肿瘤的长轴和短轴长度，将肿瘤体积计算为0.5×(长轴)×(短轴)2。在注射前，在将小鼠分成不同的组(在第一次抗体注射之前)，在抗体注射期间每周两次，以及在安乐死前，也测量小鼠的重量。
在整个治疗期间监测小鼠的体重。不同组中的小鼠体重相似(图14和图15)。结果表明，10A4耐受性良好，对小鼠无明显毒性。
G2组(抗mPD-1抗体)中的肿瘤体积没有增加。G1组中的肿瘤体积持续增大。然而，在G3(25-10A4)和G4(替利珠单抗)组中，肿瘤体积实际上大于对照组中的肿瘤体积。结果表明，25-10A4和替利珠单抗有效地抑制了人源化CD3e小鼠的免疫反应。肿瘤生长情况可以表明免疫耐受性的程度。
表10
Figure BDA0002865554920000461
实施例14.人源化10A4抗体的表征
进行实验以表征具有不同的人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:21-24)和人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:25-27)的组合的人源化10A4抗体。
表达效率
在用编码人源化抗体的重链和轻链的载体培养CHO-S细胞3天后，从24孔板中收集人源化抗hCD3抗体。测量培养板中抗体的总量。下表显示了培养细胞上清液中抗体的总量(μg/ml)。人源化重链变体和人源化轻链变体下的百分比表示人源化百分比。结果表明，H3K1、H3K2、H3K3、H4K2和H4K3具有相对较高的表达效率。其中H3K2的表达效率最高。
表11
Figure BDA0002865554920000471
*：对人的最高命中
还从烧瓶中的250ml培养基中收集抗-hCD3抗体。在培养转染的CHO-S细胞3天后测量抗体的总量。下表显示了收集的抗体总量(μg/ml)。结果表明，H1K1、H1K2、H1K3、H3K1、H3K2、H3K3、H4K1、H4K2和H4K3具有相对较高的表达效率。其中H3K3的表达效率最高。为了进行比较，还测试了抗CTLA4抗体Yervoy。在相同条件下，Yervoy的量为20～50μg/ml。
表12
Figure BDA0002865554920000472
Figure BDA0002865554920000481
*：对人的最高命中
与人CD3e的结合活性
进行实验以确定人源化抗hCD3e抗体是否能与人PBMC结合。
从人受试者收集PBMC细胞。解冻后，将细胞培养3-4小时。然后弃去培养基，将细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。然后将细胞浓度调整至2x106/25μl PBS。
准备96孔板。向每个孔中加入25ul细胞悬浮液。将具有不同的人源化10A4重链变体和人源化10A4轻链变体的组合的抗hCD3e抗体在PBS中稀释至20ug/ml(2X)，并加入到96孔板中。孵育细胞和抗体。离心后，弃去残余物。再次洗涤样品。然后向每个孔中加25ul的PBS以重新悬浮细胞。
然后向每个孔中加入抗人IgG Fc-Alexa Fluror 647(1:500)和抗hTcRβPerCP(1:30)。将细胞和抗体孵育，然后用PBS再次洗涤细胞。然后向每个孔中加入300ul PBS以重新悬浮细胞。进行FACS。结果如图17A-图17B所示。结果表明，具有不同的人源化10A4重链变体和人源化10A4轻链变体的组合的人源化10A4抗体均可有效地与人PBMC结合。
通过实施例中描述的方法，使用Biacore(Biacore,INC,Piscataway N.J.)，利用表面等离子体共振(SPR)进一步测量抗hCD3e抗体对人CD3e的结合亲和力。结果概述如下：
表13
Figure BDA0002865554920000482
Figure BDA0002865554920000491
结果表明，这些具有不同的人源化10A4重链变体和人源化10A4轻链变体的组合的人源化10A4抗体与人CD3e具有高结合亲和力。
与猴CD3e的结合活性
进行实验以确定人源化抗hCD3e抗体是否能与猴PBMC结合。
采集来自食蟹猴的PBMC细胞。解冻后，将细胞培养几个小时，并悬浮在培养基中。然后弃去培养基，将细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
制备96孔板。向每个孔中加入25ul细胞悬浮液。将抗hCD3抗体加入到96孔板中。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。以2000rpm离心5分钟后，弃去培养基。再次洗涤样品。然后加入25ul PBS以重新悬浮细胞。
然后向每个孔中加入抗人IgG Fc-Alexa Fluror 647(1:500)和抗hTcRβPerCP(1:30)。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。离心后，弃去残余物。再次洗涤样品。然后加入25ul PBS以重新悬浮细胞。结果表明，具有不同的人源化10A4重链变体和人源化10A4轻链变体的组合的人源化10A4抗体均可有效地与猴PBMC结合(图18)。相比之下，抗hTcRβPerCP不能与猴PBMC结合。
抗hCD3e抗体与猴CD3e(食蟹猴CD3ε蛋白(SEQ ID NO:39AA Gln 22-Asp 117),His标签，Acrobiosystems，目录号CDE-C5226)的结合亲和力也通过实施例中描述的方法，使用Biacore(Biacore,INC,Piscataway N.J.)，利用表面等离子共振(SPR)进行了测量。结果概述如下：
表14
样品 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
10A4-H1K1-IgG1-LALA 4.52E+04 5.97E-04 1.32E-08
10A4-H1K2-IgG1-LALA 5.75E+04 2.98E-04 5.18E-09
10A4-H1K3-IgG1-LALA 4.31E+04 5.08E-04 1.18E-08
10A4-H2K1-IgG1-LALA 5.59E+04 2.61E-04 4.66E-09
10A4-H2K2-IgG1-LALA 5.01E+04 4.11E-04 8.21E-09
10A4-H2K3-IgG1-LALA 5.45E+04 4.97E-04 9.12E-09
10A4-mHvKv-IgG1-LALA 5.00E+04 4.53E-04 9.05E-09
结果表明，这些具有不同的人源化10A4重链变体和人源化10A4轻链变体的组合的人源化10A4抗体与猴CD3e具有高结合亲和力。结合亲和力与嵌合抗体相似。
热稳定性
将抗体在60℃孵育，然后冷却至室温。用表达人CD3e的细胞进行FACS。结果表明，如通过FACS所分析的，这些被测抗体仍能与这些细胞结合。因此，结果表明这些抗体的Tm高于60℃。
热荧光测定也使用Protein Thermal ShiftTM Dye试剂盒(Thermo FisherScientific)和QuantStudioTM 5实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)来进行。这项测定使用荧光染料来测量热稳定性，所述染料与蛋白质去折叠时暴露的疏水斑块结合。施加约1.6℃/s的温度变化率(temperature ramp)，直至温度达到25℃，然后施加约0.05℃/s的温度变化率，直至温度达到99℃。记录Tm。一些测试抗体有两个Tm。这是因为IgG具有多结构域结构。在有两个Tm的情况下，记录第二个Tm(Fab的Tm)。实验是按照制造商的方案进行。
下表概述了几种人源化抗CD3e抗体的从FACS获得的Tm和从Protein ThermalShiftTM Dye试剂盒获得的Tm。结果表明，具有不同的人源化10A4重链变体和人源化10A4轻链变体的组合的人源化10A4抗体具有相似的Tm，如通过FACS或Protein Thermal ShiftTMDye试剂盒测量的。
表15
抗体 Tm(FACS) Tm(试剂盒)
10A4-H1K1-IgG1-LALA Tm>60℃ 66.83℃
10A4-H1K2-IgG1-LALA Tm>60℃ 68.16℃
10A4-H1K3-IgG1-LALA Tm>60℃ 67.87℃
10A4-H2K1-IgG1-LALA Tm>60℃ 66.75℃
10A4-H2K2-IgG1-LALA Tm>60℃ 67.12℃
10A4-H2K3-IgG1-LALA Tm>60℃ 67.27℃
10A4-H3K1-IgG1-LALA Tm>60℃ /
10A4-H3K2-IgG1-LALA Tm>60℃ /
10A4-H3K3-IgG1-LALA Tm>60℃ /
10A4-H4K1-IgG1-LALA Tm>60℃ /
10A4-H4K2-IgG1-LALA Tm>60℃ /
10A4-H4K3-IgG1-LALA Tm>60℃ /
体外活性
进行实验以确定抗hCD3e抗体是否能在体外活化Jurkat-Luc-NFAT细胞(Promega，目录号J1601)。
从(1)培养板上培养的CHO细胞上清液或(2)培养基中的CHO细胞中收集抗hCD3e抗体。将从培养基中收集的抗hCD3e抗体进一步纯化。然后将纯化的抗体滴定至合适的浓度。
将4x104个CHO-FcγRIIB细胞加入孔中，并在37℃孵育过夜。将96孔板离心，弃去上清液。
然后将50μl Jurkat-Luc-NFAT细胞加入96孔板(5x104个细胞/孔)。还将25μl不同浓度的抗-hCD3e抗体加入96孔板的孔中。在37℃孵育6小时后，加入75μl荧光素酶测定试剂并孵育5-10分钟。测量荧光信号。结果如下表所示。
表16
抗体 EC50(ug/mL) R<sup>2</sup> 来源 体外活性
替利珠单抗 0.1490 0.9966 纯化的 是
10A4-H1K1-IgG1-LALA 0.5242 0.9961 纯化的 是
10A4-H2K1-IgG1-LALA 0.3129 0.9989 纯化的 是
10A4-H1K2-IgG1-LALA 0.7258 0.9985 纯化的 是
10A4-H2K2-IgG1-LALA 0.2627 0.9969 纯化的 是
10A4-H1K3-IgG1-LALA 0.5834 0.9960 纯化的 是
10A4-H2K3-IgG1-LALA 0.4716 0.9925 纯化的 是
10A4-H1K1-IgG1-LALA 0.2939 0.9919 上清液 是
10A4-H2K1-IgG1-LALA 0.2661 0.9959 上清液 是
10A4-H3K1-IgG1-LALA 0.1979 0.9788 上清液 是
10A4-H4K1-IgG1-LALA 0.2341 0.9940 上清液 是
10A4-H1K2-IgG1-LALA 0.2722 0.9903 上清液 是
10A4-H2K2-IgG1-LALA 0.2466 0.9938 上清液 是
10A4-H3K2-IgG1-LALA 0.2049 0.9874 上清液 是
10A4-H4K2-IgG1-LALA 0.2532 0.9955 上清液 是
10A4-H1K3-IgG1-LALA 0.3925 0.9949 上清液 是
10A4-H2K3-IgG1-LALA 0.4159 0.9982 上清液 是
10A4-H3K3-IgG1-LALA 0.4755 0.9947 上清液 是
10A4-H4K3-IgG1-LALA 0.4766 0.9992 上清液 是
结果表明，这些具有不同的重链变体和轻链变体的组合的人源化10A4均具有体外生物活性，并能活化Jurkat细胞。
总之，本实施例中的结果表明，这些具有不同的重链变体和轻链变体的组合的人源化10A4抗体具有相对高的结合亲和力和热稳定性。具有H2重链的抗体具有相对较低的表达效率。因为H1、H2、K1、K2和K3具有相对高的人源化百分比，所以H1K1、H1K2、H1K3、H2K1、H2K2和H2K3是在临床试验中用于进一步测试的良好候选物。
实施例15.人源化1B1抗体的特性
进行实验以表征具有不同的人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:28-31)和人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:32-34)的组合的各种人源化1B1抗体。
表达效率
在用编码人源化抗体的重链和轻链的载体培养CHO-S细胞3天后，从24孔板收集人源化抗-hCD3抗体。测量培养板中抗体的总量。下表显示了培养细胞上清液中抗体的总量(μg/ml)。人源化重链变体和人源化轻链变体下的百分比表示人源化百分比。结果表明，H1K2、H2K2、H3K2、H4K2、H1K3、H2K3、H3K3和H4K3具有相对较高的表达效率。其中，H1K2的表达效率最高。为了进行比较，还测试了抗CTLA4抗体Yervoy。在相同条件下，表达的Yervoy的量为28.86μg/ml。
表17
Figure BDA0002865554920000531
*：对人的最高命中
与人CD3e的结合活性
进行实验以确定人源化抗hCD3e抗体是否能与人PBMC结合。
从人受试者收集PBMC细胞。解冻后，将细胞培养3-4小时。然后弃去培养基，将细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。然后将细胞浓度调整至2x106/25μl PBS。
准备96孔板。向每个孔中加入25ul细胞悬浮液。将具有不同的人源化1B1重链变体和人源化1B1轻链变体组合的抗hCD3e抗体在PBS中稀释至20ug/ml(2X)，并加入到96孔板中。孵育细胞和抗体。离心后，弃去残余物。再次洗涤样品。然后向每个孔中加25ul的PBS以重新悬浮细胞。
然后向每个孔中加入抗人IgG Fc-Alexa Fluror 647(1:500)和抗hTcRβPerCP(1:30)。将细胞和抗体孵育，然后用PBS再次洗涤细胞。然后向每个孔中加入300ul PBS以重新悬浮细胞。进行FACS。结果如图19A-图19B所示。结果表明，具有不同的人源化1B1重链变体和人源化1B1轻链变体的组合的人源化1B1抗体均可有效地与人PBMC结合。
通过实施例中描述的方法，使用Biacore(Biacore,INC,Piscataway N.J.)，利用表面等离子体共振(SPR)进一步测量抗hCD3e抗体与人CD3e的结合亲和力。结果概述如下：
表18
Figure BDA0002865554920000541
结果表明，这些具有不同的人源化1B1重链变体和人源化1B1轻链变体的组合的人源化1B1抗体与人CD3e具有高结合亲和力。
与猴CD3e的结合活性
进行实验以确定人源化抗hCD3e抗体是否能与猴PBMC结合。
采集来自食蟹猴的PBMC细胞。解冻后，将细胞培养几个小时，并悬浮在培养基中。然后弃去培养基，将细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
准备96孔板。向每个孔中加入25ul细胞悬浮液。将抗hCD3抗体加入到96孔板中。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。以2000rpm离心5分钟后，弃去培养基。再次洗涤样品。然后加入25ul PBS以重新悬浮细胞。
然后向每个孔中加入抗人IgG Fc-Alexa Fluror 647(1:500)和抗hTcRβPerCP(1:30)。将细胞和抗体在4℃孵育15分钟。然后向每个孔中加入185ul PBS。离心后，弃去残余物。再次洗涤样品。然后加入25ul PBS以重新悬浮细胞。结果表明，具有不同的人源化1B1重链变体和人源化1B1轻链变体的组合的人源化1B1抗体均可有效地与猴PBMC结合(图20)。相比之下，抗hTcRβPerCP不能与猴PBMC结合。
抗hCD3e抗体与猴CD3e(食蟹猴CD3ε蛋白(SEQ ID NO:39AA Gln 22-Asp 117)，His标签，Acrobiosystems，目录号CDE-C5226)也通过实施例中描述的方法，使用Biacore(Biacore,INC,Piscataway N.J.)，利用表面等离子共振(SPR)进行了测量。结果概述如下：
表19
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1B1-H1K1-IgG1-LALA 9.14E+04 8.69E-04 9.51E-09
1B1-H1K2-IgG1-LALA 9.49E+04 7.20E-04 7.59E-09
1B1-H1K3-IgG1-LALA 1.69E+05 7.39E-04 4.39E-09
1B1-H2K1-IgG1-LALA 1.42E+05 9.99E-04 7.03E-09
1B1-H2K2-IgG1-LALA 9.98E+04 6.65E-04 6.66E-09
1B1-H2K3-IgG1-LALA 1.10E+05 5.91E-04 5.39E-09
1B1-mHvKv-IgG1-LALA 1.08E+05 4.90E-04 4.54E-09
结果表明，这些具有不同的人源化1B1重链变体和人源化1B1轻链变体的组合的人源化1B1抗体与猴CD3e具有高结合亲和力。所述结合亲和力与嵌合抗体相似。
热稳定性
将抗体在70℃孵育，然后冷却至室温。用表达人CD3e的细胞进行FACS。结果表明，如通过FACS所分析的，这些被测抗体仍能与这些细胞结合。因此，结果表明这些抗体的Tm高于70℃。
热荧光测定也使用Protein Thermal ShiftTM Dye试剂盒(Thermo FisherScientific)和QuantStudioTM 5实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)来进行。这项测定使用荧光染料来测量热稳定性，所述染料与蛋白质去折叠时暴露的疏水斑块结合。施加约1.6℃/s的温度变化率(temperature ramp)，直至温度达到25℃，然后施加约0.05℃/s的温度变化率，直至温度达到99℃。记录Tm。一些测试抗体有两个Tm。这是因为IgG具有多结构域结构。在有两个Tm的情况下，记录第二个Tm(Fab的Tm)。实验是按照制造商的方案进行。
下表概述了几种人源化抗CD3e抗体的从FACS获得的Tm和从Protein ThermalShiftTM Dye试剂盒获得的Tm。结果显示，具有不同的人源化1B1重链变体和人源化1B1轻链变体的组合的人源化1B1抗体具有相似的Tm，如通过FACS或Protein Thermal ShiftTM Dye试剂盒所测定的。
表20
Figure BDA0002865554920000561
Figure BDA0002865554920000571
体外活性
进行实验以确定抗hCD3e抗体是否能在体外活化Jurkat-Luc-NFAT细胞(Promega，目录号J1601)。
从(1)培养板上培养的CHO细胞上清液或(2)培养基中的CHO细胞中收集抗hCD3e抗体。将从培养基中收集的抗hCD3e抗体进一步纯化。然后将纯化的抗体滴定至适当的浓度。
将4x104个CHO-FcγRIIB细胞加入孔中，并在37℃孵育过夜。将96孔板离心，弃去上清液。
然后将50μl Jurkat-Luc-NFAT细胞加入96孔板(5x104个细胞/孔)。还将25μl不同浓度的抗-hCD3e抗体加入96孔板的孔中。在37℃孵育6小时后，加入75μl荧光素酶测定试剂并孵育5-10分钟。测量荧光信号。结果如下表所示。
表21
Figure BDA0002865554920000572
Figure BDA0002865554920000581
结果表明，这些具有不同的重链变体和轻链变体的组合的人源化1B1均具有体外生物活性，并能不同程度地活化Jurkat细胞。其中，1B1-H1K1-IgG1-LALA和1B1-H4K1-IgG1-LALA的活化效率较高。
总之，本实施例中的结果表明，这些具有不同的重链变体和轻链变体的组合的人源化1B1抗体具有相对高的结合亲和力和热稳定性。具有H3重链的抗体和具有K1轻链的抗体具有相对较低的表达效率。因为H1、H2、K1、K2和K3具有相对高的人源化百分比，所以H1K1、H1K2、H1K3、H2K1、H2K2和H2K3是用于在人中进一步测试的良好候选物。
其它实施方案
应当理解，虽然已经结合详细描述说明了本发明，但前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、有利方面和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 抗CD3e抗体及其用途
<130> 1
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Ala Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
Lys Gly Gly Asn Tyr Asp
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
Asp Thr Ser Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
Val Gln Ser Phe Ser Leu Arg Ala
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
Tyr Pro Gly Asn Val Asn
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
Tyr Pro Asp Ser Gly Thr
1 5
<210> 17
<211> 207
<212> PRT
<213> 人
<400> 17
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 18
<211> 189
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 18
Met Arg Trp Asn Thr Phe Trp Gly Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Ala
1 5 10 15
Val Gly Thr Cys Gln Asp Asp Ala Glu Asn Ile Glu Tyr Lys Val Ser
20 25 30
Ile Ser Gly Thr Ser Val Glu Leu Thr Cys Pro Leu Asp Ser Asp Glu
35 40 45
Asn Leu Lys Trp Glu Lys Asn Gly Gln Glu Leu Pro Gln Lys His Asp
50 55 60
Lys His Leu Val Leu Gln Asp Phe Ser Glu Val Glu Asp Ser Gly Tyr
65 70 75 80
Tyr Val Cys Tyr Thr Pro Ala Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu Tyr Leu
85 90 95
Lys Ala Arg Val Cys Glu Tyr Cys Val Glu Val Asp Leu Thr Ala Val
100 105 110
Ala Ile Ile Ile Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Met
115 120 125
Val Ile Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val
130 135 140
Thr Arg Gly Thr Gly Ala Gly Ser Arg Pro Arg Gly Gln Asn Lys Glu
145 150 155 160
Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly
165 170 175
Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Ala Val
180 185
<210> 19
<211> 198
<212> PRT
<213> 猴
<400> 19
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr His Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Val Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
<210> 20
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 20
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Leu Thr
115 120 125
Ala Val Ala Ile Ile Ile Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu
130 135 140
Leu Met Val Ile Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Thr Gly Ala Gly Ser Arg Pro Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Ala Val
195 200 205
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Phe Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Ala Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Lys Gly Gly Asn Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Phe Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Ala Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Lys Gly Gly Asn Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Phe Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Ala Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ile Lys Gly Gly Asn Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Phe Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Ala Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ile Lys Gly Gly Asn Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 25
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 26
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 27
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Ser Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Ser Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Ser Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Ser Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Val Gln
85 90 95
Ser Phe Ser Leu Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Val Gln
85 90 95
Ser Phe Ser Leu Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 34
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Val Gln
85 90 95
Ser Phe Ser Leu Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 35
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Phe Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Ala Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ile Lys Gly Gly Asn Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 36
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Ser Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 38
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Val Gln
85 90 95
Ser Phe Ser Leu Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 198
<212> PRT
<213> 猴
<400> 39
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195

Claims (51)

1.一种结合CD3e(T细胞表面糖蛋白CD3ε链)的抗体或其抗原结合片段，其包含：
含有互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中所述VH CDR1区包含与选定的VHCDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述VH CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，且所述VH CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；和
包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中所述VL CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述VL CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述VL CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，
其中所述选定的VH CDR 1、2和3氨基酸序列和所述选定的VL CDR 1、2和3氨基酸序列是下述之一：
(1)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1、2、3，并且所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:4、5、6；
(2)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7、8、9，并且所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:10、11、12。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有示于SEQID NO:1、2和3的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有示于SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有示于SEQID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有示于SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双特异性抗体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合人CD3e。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
8.一种包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含：
(1)含有重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区包含氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1、2和3的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中当所述VH与包含示于SEQ ID NO:25、26、27或36的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时，所述VH与CD3e结合；
(2)含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有示于SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中当所述VL与包含示于SEQ ID NO:21、22、23、24或35的氨基酸序列的VH配对时，所述VL与CD3e结合；
(3)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区包含分别含有示于SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中当所述VH与包含示于SEQ IDNO:32、33、34或38的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时，所述VH与CD3e结合；
(4)含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有示于SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中当所述VL与包含示于SEQ ID NO:28、29、30、31或37的氨基酸序列的VH配对时，所述VL与CD3e结合。
9.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有示于SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
10.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有示于SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
11.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有示于SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
12.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有示于SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的核酸，其中当所述VH与VL配对时，所述VH特异性结合人CD3e，或者当所述VL与VH配对时，所述VL特异性结合人CD3e。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的核酸，其中所述免疫球蛋白重链或其片段是人源化免疫球蛋白重链或其片段。
15.根据权利要求8-13中任一项所述的核酸，其中所述免疫球蛋白轻链或其片段是人源化免疫球蛋白轻链或其片段。
16.根据权利要求8-15中任一项所述的核酸，其中所述核酸编码双特异性抗体。
17.根据权利要求8-15中任一项所述的核酸，其中所述核酸编码单链可变片段(scFv)。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的核酸，其中所述核酸是cDNA。
19.一种载体，其包含如权利要求8-18中任一项所述的核酸中的一种或多种核酸。
20.一种载体，其包含如权利要求8-18中任一项所述的核酸中的两种核酸，其中所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和所述VH区在一起时结合CD3e。
21.一对载体，其中每个载体包含如权利要求8-18中任一项所述的核酸之一，其中所述载体对一起编码VL区和VH区，所述VL区和所述VH区在一起时结合CD3e。
22.一种细胞，其包含如权利要求19或20所述的载体，或如权利要求21所述的载体对。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
24.一种细胞，其包含如权利要求8-18中任一项所述的核酸中的一种或多种核酸。
25.一种细胞，其包含如权利要求8-18中任一项所述的核酸中的两种核酸。
26.根据权利要求25所述的细胞，其中所述两种核酸一起编码VL区和VH区，所述VL区和所述VH区在一起时结合CD3e。
27.一种生产抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
(a)在足以使所述细胞产生所述抗体或所述抗原结合片段的条件下培养权利要求22-26中任一项所述的细胞；以及
(b)收集所述细胞产生的所述抗体或所述抗原结合片段。
28.一种结合CD3e的抗体或其抗原结合片段，其包含
重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含与选定的VH序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与选定的VL序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列是下述之一：
(1)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:21、22、23、24或35，并且所述选定的VL序列是SEQID NO:25、26、27或36；
(2)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:28、29、30、31或37，并且所述选定的VL序列是SEQID NO:32、33、34或38。
29.根据权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:21的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:25的序列。
30.根据权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:28的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:32的序列。
31.根据权利要求28-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合人CD3e。
32.根据权利要求28-32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
33.根据权利要求28-30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
34.一种抗体-药物缀合物，其包含如权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与治疗剂共价结合。
35.根据权利要求34所述的抗体药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
36.一种药物组合物，其包含如权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
37.一种药物组合物，其包含如权利要求34或35所述的抗体药物缀合物，和药学上可接受的载体。
38.一种降低受试者的免疫反应的方法，所述方法包括
向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含如权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者患有移植物抗宿主病。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者患有I型糖尿病。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者患有关节炎、克罗恩病或溃疡性结肠炎。
42.一种治疗受试者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括
向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含如权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者患有I型糖尿病、关节炎、克罗恩病，或溃疡性结肠炎。
44.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的组合物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是双特异性抗体，并且所述双特异性抗体还特异性结合肿瘤相关抗原。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CD20、PSA、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、Her2、CD123、Ep-CAM、CD66e、PSMA、CD371，或VEGFR2。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、前列腺癌或血液恶性肿瘤。
48.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含如权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是双特异性抗体，并且所述双特异性抗体还特异性结合肿瘤相关抗原。
50.一种杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是双特异性抗体，并且所述双特异性抗体还特异性结合肿瘤相关抗原。
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