KR20240099260A - 변형된 결합 단백질 및 이의 치료적 용도 - Google Patents

변형된 결합 단백질 및 이의 치료적 용도 Download PDF

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KR20240099260A
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스티븐 로버트 데일리
스테파니 그라스
그루타 니콜 라
피루즈 자레이
크리스토퍼 스제토
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모나쉬 유니버시티
퀸스랜드 유니버시티 오브 테크놀로지
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Abstract

본 발명은 다양한 질환 또는 상태, 특히 암 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 변형된 T 세포 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 결합 단백질은 HLA 분자에 결합된 펩티드와 접촉할 수 있는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 도메인을 포함하고, 여기서 CDR5는 HLA 분자에 결합된 펩티드 내의 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 시스테인을 포함하고, 일반적으로 시스테인은 기존 잔기의 돌연변이 또는 변형에 의해 CDR에 도입된다.

Description

변형된 결합 단백질 및 이의 치료적 용도
본 발명은 변형된 결합 단백질, 예를 들면, T 세포 수용체, 및 다양한 질환 또는 상태, 특히 암 및 자가면역 질환(autoimmune disease)의 치료에서 이들의 용도에 관한 것이다.
관련 출원
이 출원은 호주 가출원 AU 2021903279호로부터 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용은 참조에 의해 본원에 통합되어 있다.
T 세포 수용체(TCR)은 T 세포에 의한 특정 항원의 인식을 매개하고, 따라서 면역계의 세포 아암(arm)의 기능에 불가결하다. 천연 TCR은 면역글로불린 수퍼패밀리의 헤테로이량체 세포 표면 단백질이고, 이는 신호 전달의 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 회합한다. TCR은 αβ 및 γδ 형태로 존재하고, 이는 구조적으로 유사하지만, 해부학적 위치와 기능이 매우 상이하다. TCR은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질에 의해 제시된 펩티드의 형태로 항원을 인식한다. MHC 클래스 I 및 클래스 II 리간드는 또한 면역글로불린 수퍼패밀리 단백질이지만 항원 제시에 특화되어 있고, 고도로 다형성의 펩티드 결합 부위를 갖고 있고, 이는 항원 제시 세포(APC)의 표면에 다양한 펩티드 단편의 어레이를 제시한다.
추가로 2개 클래스의 단백질이 TCR 리간드로서 기능할 수 있는 것으로 공지되어 있다. CD1 항원은 고전적 MHC 클래스 I 및 클래스 II와는 상이한 염색체 상에 위치하는 MHC 클래스 I-관련 분자이다. CD1 분자는 종래의 클래스 I 및 클래스 II MHC 펩티드 복합체와 유사한 방식으로 펩티드 및 비-펩티드(예: 지방, 당지질) 모이어티를 T 세포에 제시할 수 있다[참조: 예를 들면, Barclay et al, (1997) The Leucocyte Antigen Factsbook 2nd Edition, Academic Press) and (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373)]. 박테리아 수퍼항원은 클래스 II MHC 분자와 TCR의 서브세트 둘 다에 결합할 수 있는 가용성 독소이다[참조: Fraser (1989) Nature 339 221-223]. 다수의 수퍼항원은 1 또는 2개의 Vbeta 세그먼트에 대하여 특이성을 나타내지만, 다른 수퍼항원은 보다 무차별적 결합을 나타낸다. 어떤 경우에도, 수퍼항원은 폴리클로날 양식으로 T 세포의 서브세트를 자극하는 능력에 의해 면역 반응의 증강을 유발할 수 있다.
천연 헤테로이량체 αβ 및 γδ TCR의 세포외 부분은 각각 막-근위의 불변 도메인 및 막-원위의 가변 도메인(variable domain)을 갖는 2개 폴리펩티드로 구성되어 있다. 불변 및 가변 도메인의 각각에는 쇄내 디설파이드 결합이 포함되어 있고, 각 헤테로이량체의 2개 쇄는 쇄간 디설파이드 결합에 의해 결합되어 있다. 가변 도메인에는 항체의 상보성 결정 영역(CDR)과 유사한 고도 다형성의 루프가 함유되어 있다. αβ TCR의 CDR3은 주로 MHC에 의해 제시된 펩티드와 상호작용하고, αβ TCR의 CDR 1 및 2는 주로 펩티드 및 MHC와 상호작용한다. TCR 가변 도메인 서열의 다양성은 연결 가변(V), 다양성(D) 및 결합(J) 유전자의 체세포 재구성을 통해 생성된다.
T 세포의 활성화는 APC의 표면 상의 MHC 분자에 의해 제시되는 펩티드 항원의 αβ T 세포 항원 수용체(TCR)의 공-인식에 의존한다.
세포 면역요법에서 최근의 진보에는 종양 항원을 효율적으로 인식하는 T 세포의 입양 전달이 수반되어 있다. 이들 T 세포는 종양-침윤 림프구(TIL)로부터 유래하고, 항원-특이적 TCR(TCR-T)로 유전자 변형된 후에 종양 항원을 효율적으로 인식할 수 있는 말초 혈액 T 세포일 수 있다. 입양 T 세포 요법에는 키메라 수용체(CAR) 기반의 CAR-T 요법 및 T 세포 수용체 기반의 TCR-T 요법이 포함된다. 표면에 발현된 단백질을 인식하는 CAR T 세포와는 달리, TCR은 세포의 내부에서 종양-특이적 단백질을 인식할 수 있다.
TCR 유전자 요법의 주요 과제는 T 세포 자극을 유발하기에 충분히 긴 TCR과 펩티드-MHC(pMHC) 사이의 결합 이벤트를 달성하는 것이다. 추가로, 낮은 풍부도 펩티드에서는 T 세포를 자극할 수 없는 가능성이 있기 때문에 현재의 TCR 요법에는 한계가 있다.
암 및 자가면역 질환을 포함하는 다양한 상태의 치료에는 신규 및/또는 개량된 세포-기반 치료, 특히 T 세포-기반 치료 또는 TCR-기반 치료가 요구되고 있다.
본 명세서에서 선행 기술에 대한 언급은 이들 선행 기술이 모든 관할권에서 일반적인 일반 지식의 일부를 형성하거나, 이들 선행 기술이 당업자에 의해 합리적으로 이해되거나, 관련성이 있다고 간주되거나, 다른 선행 기술과 결합될 것으로 예상될 수 있다는 것을 인정하거나 시사하는 것은 아니다.
본 발명자들은 TCR 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)과, 인간 백혈구 항원(HLA) 분자로도 불리우는 MHC 단백질에 결합된 펩티드와의 사이에 공유 결합, 전형적으로 TCR CDR의 시스테인과 MHC 분자에 결합된 펩티드의 시스테인 사이에 형성되는 디설파이드 결합을 형성하는 것이 가능하다는 것을 확인했다.
일 양태에서, 본 발명은 HLA 분자에 결합된 펩티드와 접촉할 수 있는 상보성-결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질을 제공하고, 여기서 상기 CDR은 HLA 분자에 결합된 펩티드 중의 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 시스테인을 포함한다.
본 발명의 임의의 양태에서, 결합 단백질은 항원-결합 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 T 세포 수용체 또는 이의 단편일 수 있다. 일 실시양태에서, T 세포 수용체는 가용성 T 세포 수용체이다. 일 실시양태에서, 항원 결합 단백질 또는 T 세포 수용체는 키메라(chimeric) 또는 융합(fusion) 단백질의 일부일 수 있고, 예를 들면, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부일 수 있다. 일 실시양태에서, 키메라 또는 융합 단백질은 본원에 기재된 본 발명의 가용성 T 세포 수용체를 포함한다.
본 발명의 임의의 양태에서, 결합 단백질이 항체인 경우, 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인일 수 있다. 바람직하게는, CDR은 CDR3이다. 따라서, 시스테인을 포함하는 CDR3은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 존재할 수 있다.
본 발명의 임의의 양태에서, 결합 단백질이 T 세포 수용체인 경우, 가변 도메인은 α 쇄 가변 도메인(Vα) 또는 β 쇄 가변 도메인(Vβ)일 수 있다. 따라서, 시스테인을 함유하는 CDR3은 α 쇄 또는 β 쇄에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 결합 단백질은 α 쇄 가변 도메인 및 β 쇄 가변 도메인 둘 다를 포함하고, 여기서 HLA 분자에 결합된 펩티드 내의 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 시스테인을 포함하는 CDR은 α 쇄 가변 도메인 또는 β 쇄 가변 도메인에 존재하지만, 둘 다에 존재하지는 않는다. 예를 들면, CDR3은 표 3 또는 4에 제시된 바와 같이 시스테인 잔기(residue)가 지시된 위치에 존재하는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다.
일 실시양태에서, TCR은 표 3 또는 4에 제시된 CDR3을 포함하는 α 쇄 가변 도메인 및 표 3 또는 4에 제시된 CDR3을 포함하는 β 쇄 가변 도메인을 갖고, 여기서 Vα CDR3 또는 Vβ CDR3에 표시된 잔기가 시스테인으로 치환된다.
본 발명의 임의의 양태에서, HLA는 세포 표면에 펩티드 항원을 제시할 수 있는 임의의 HLA 분자 또는 임의의 HLA-유사 분자일 수 있다. 임의의 실시양태에서, HLA는 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II일 수 있다. 추가로, HLA는 HLA-E와 같은 HLA-유사 분자일 수 있다. MHC 클래스 I에 대응하는 HLA에는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C이 포함된다. MHC 클래스 II에 대응하는 HLA에는 HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR이 포함된다.
본 발명의 임의의 양태에서, 결합 단백질은 재조합, 합성, 정제 또는 실질적으로 정제된 것일 수 있다.
일반적으로, 시스테인은 기존 잔기의 돌연변이 또는 변형에 의해 CDR에 도입된다.
본 발명의 임의의 양태에서, CDR은 바람직하게는 CDR3이다.
본 발명의 임의의 양태에서, 시스테인은 HLA 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하고, 여기서 펩티드의 시스테인은 위치 P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8 또는 P9 중 하나에 위치하고, MHC 클래스 I의 경우, 펩티드 위치(P2)는 MHC 클래스 I 분자의 B 포켓을 점유하거나 이에 가장 근접한 아미노산이고, MHC 클래스 II의 경우, 펩티드 위치 1은 MHC 클래스 II 분자의 P1 포켓을 점유하거나 이에 가장 근접한 아미노산이다.　
본 발명의 임의의 양태에서, 시스테인은 HLA 클래스 I 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하고, 여기서 펩티드의 시스테인은 위치 P4, P5, P6, P7, P8 또는 P9 중 하나에 위치하고, MHC 클래스 I의 경우, 펩티드 위치(P2)는 MHC 클래스 I 분자의 B 포켓을 점유하거나 이에 가장 근접한 아미노산이고, MHC 클래스 II의 경우, 펩티드 위치 1은 MHC 클래스 II 분자의 P1 포켓을 점유하거나 이에 가장 근접한 아미노산이다.
본 발명의 임의의 양태에서, 시스테인은 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하고, 여기서 펩티드의 시스테인은 위치 P1, P2, P4, P5, P6, P7 또는 P8 중 하나에 위치하고, MHC 클래스 I의 경우, 펩티드 위치(P2)는 MHC 클래스 I 분자의 B 포켓을 점유하거나 이에 가장 근접한 아미노산이고, MHC 클래스 II의 경우, 펩티드 위치 1은 MHC 클래스 II 분자의 P1 포켓을 점유하거나 이에 가장 근접한 아미노산이다.　
일 실시양태에서, CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 HLA 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하고, 바람직하게는 펩티드 중의 시스테인은 위치 P4, P5 또는 P6 중 하나에 존재한다. 바람직하게는, HLA는 HLA 클래스 I이다. 또 다른 실시양태에서, CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 HLA 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하고, 바람직하게는 펩티드 내의 시스테인은 위치 P4, P5, P6, P7, P8 또는 P9 중 하나에 존재한다. 바람직하게는, HLA는 HLA 클래스 I이다.
일 실시양태에서, CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 HLA 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하고, 여기서 펩티드 내의 시스테인은 위치 P1, P2 또는 P5 중 하나에 존재한다. 바람직하게는, HLA는 HLA 클래스 II이다. 또 다른 실시양태에서, CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 HLA 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하고, 펩티드 내의 시스테인은 위치 P4, P5, P6, P7 또는 P8 중 하나에 존재한다. 바람직하게는, HLA는 HLA 클래스 II이다.
본 발명의 임의의 양태에서, CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 HLA 클래스 I 분자에 결합된 표 2 또는 3에 제시된 바와 같이 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재한다.
본 발명의 임의의 양태에서, CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 HLA 클래스 I 분자에 결합된 표 2 또는 3에 제시된 바와 같이 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재한다.
본 발명의 임의의 양태에서, CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 HLA 클래스 II 분자에 결합된 표 1 또는 4에 제시된 바와 같이 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재한다.
본 발명의 임의의 양태에서, CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 HLA 클래스 II 분자에 결합된 표 1 또는 4에 제시된 바와 같이 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재한다.
본 발명의 임의의 양태에서, 펩티드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 HLA-E로부터 선택된 HLA 클래스 I 분자에 결합될 수 있다.
본 발명의 임의의 양태에서, 펩티드는 HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, HLA-B*44:05, HLA-A*02:01, HLA-B*35:01, HLA-A*01:01, HLA-B*35:08, HLA-B*37:01, HLA-B*08:01, HLA-A*11:01, HLA-B*27:05, HLA-A*24:02, HLA-B*51:01 및 HLA-E*01:03으로부터 선택된 HLA 클래스 I 분자에 결합될 수 있다.
본 발명의 임의의 양태에서, 펩티드는 HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ로부터 선택된 HLA 클래스 II 분자에 결합될 수 있다.
본 발명의 임의의 양태에서, 펩티드는 HLA-DQA1*0508_HLA-DQB1*0201, HLA-DQA1*0501_HLA-DQB1*0201, HLA-DQA1*0301_HLA-DQB1*0302, HLA-DRA*0101_HLA-DBR1*0101, HLA-DRA*0101_HLA-DRB3*0301, HLA-DRA*0101_HLA-DBR5*0101, HLA-DRA*0101_HLA-DBR1*0401, HLA-DPA1*0103_HLA-DPB1*2602, HLA-DQA1*0501_HLA-DQB1*0302, HLA-DRA*0101_HLA-DRB1*1101, HLA-DRA*0101_HLA-DRB1*1502, HLA-DRA*0101_HLA-DRB1*0101, HLA-DQA1*0301_HLA-DQB1*0305, HLA-DQA1*0201_HLA-DQB1*0201로부터 선택된 HLA 클래스 II 분자에 결합될 수 있다.
본 발명의 임의의 양태에서, HLA 분자에 결합된 펩티드 내의 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 시스테인은 CDR의 위치 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 존재하고, 여기서 넘버링(numbering)은 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것이다(즉, CDR의 N-말단의 아미노산은 위치 1이다).
본 발명의 임의의 양태에서, CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 CDR에서 위치 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 존재하고, 여기서 넘버링은 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것이다(즉, CDR의 N-말단의 아미노산은 위치 1이다). 바람직하게는, 시스테인은 HLA 클래스 I 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인, 보다 바람직하게는 위치 P4, P5 또는 P6에 존재하는 시스테인과의 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 한다.
본 발명의 임의의 양태에서, CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 CDR에서 위치 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 존재하고, 여기서 넘버링은 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것이다(즉, CDR의 N-말단의 아미노산은 위치 1이다). 바람직하게는, 시스테인은 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인, 보다 바람직하게는 위치 P4, P5, P6, P7, P8 또는 P9에 존재하는 시스테인과의 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 한다.
본 발명의 임의의 양태에서, CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 CDR에서 위치 5, 6, 7, 8 또는 11에 존재하고, 여기서 넘버링은 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것이다(즉, CDR의 N-말단의 아미노산은 위치 1이다). 바람직하게는, 시스테인은 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인, 보다 바람직하게는 위치 P1, P2 또는 P5에 존재하는 시스테인과의 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 한다.
본 발명의 임의의 양태에서, CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하는 경우, 시스테인은 CDR에서 위치 5, 6, 7, 8 또는 9에 존재하고, 여기서 넘버링은 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것이다(즉, CDR의 N-말단의 아미노산은 위치 1이다). 바람직하게는, 시스테인은 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인, 보다 바람직하게는 위치 P4, P5, P6, P7 또는 P8에 존재하는 시스테인과의 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 한다.
본 발명의 임의의 양태에서, HLA 분자에 결합된 펩티드는 본원에서 언급된 임의의 위치에서 자연적으로 발생하거나 도입된 시스테인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 양태의 결합 단백질을 포함하는 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 양태의 결합 단백질 또는 키메라 또는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는 핵산을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 양태의 핵산, 또는 결합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 본 발명의 임의의 양태의 키메라 또는 융합 단백질을 포함하는 벡터(vector)를 제공한다. 전형적으로, 벡터는 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하여 세포 표면에 결합 단백질이 제시된다. 벡터는 레트로바이러스 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 전형적으로, 벡터는 T 세포, 바람직하게는 T 헬퍼 세포, 예를 들면, CD4+ T 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 한다. CD4+ T 세포는 T 조절 세포(Treg), 바람직하게는 CD4+CD25high T 세포일 수 있다. 또는, T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다.
일 실시양태에서, 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 핵산을 포함한다.　
단일 폴리펩티드 쇄 결합 단백질과 관련된 본 발명의 실시양태에서, 발현 작제물은 해당 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산에 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.
결합 단백질을 형성하는 복수의 폴리펩티드 쇄와 관련된 본 발명의 실시양태에서, 벡터는, 예를 들면, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Vα를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및, 예를 들면, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Vβ를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 예에서, 발현 작제물은 바이시스트론 발현 작제물이고, 예를 들면, 5'으로부터 3' 순서로 하기 작동 가능하게 연결된 구성요소:
(i) 프로모터;
(ii) 제1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;　
(iii) 내부 리보솜 진입 부위, 바람직하게는 피코르나바이러스(Picornoavirus)로부터 유래한 2A 펩티드 절단 모티프; 및
(iv) 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
을 포함하고;
여기서, 제1 폴리펩티드는 Vα를 포함하고, 제2 폴리펩티드는 Vβ를 포함하거나, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 바람직하게는, 벡터는 Vα를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 번역 전에 Vβ를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 번역을 가능하게 한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 Vα를 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 별도의 벡터와 Vβ를 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 또 다른 벡터를 고려한다. 예를 들면, 본 발명은 또한
(i) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Vα를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 작제물; 및
(ii) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Vβ를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 작제물
을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 벡터 또는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 바람직하게는, 세포는 단리된, 실질적으로 정제된 또는 재조합된 것이다. 일예에서, 세포는 본 발명의 벡터를 포함하거나,
(i) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Vα를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 작제물; 및
(ii) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Vβ를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 작제물
을 포함하고;
여기서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 회합하여 본 발명의 결합 단백질을 형성한다. 바람직하게는, 상기 세포는 T 세포, 보다 바람직하게는 T 헬퍼 세포, 예를 들면, CD4+ T 세포이다. CD4+ T 세포는 T 조절 세포(Treg), 바람직하게는 CD4+CD25-high T 세포일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 결합 단백질을 이의 표면에 발현하는 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포는 T 세포, 보다 바람직하게는 CD4+ T 세포이다. CD4+ T 세포는 T 조절 세포(Treg), 바람직하게는 CD4+CD25-high T 세포일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 T 조절 세포의 집단(population)을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
- T 조절 세포의 집단을 제공하는 단계,
- 본 발명의 핵산 또는 벡터를 T 조절 세포의 집단에 도입하는 단계,
- T 조절 세포의 표면에 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하고,
이에 의해, 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 T 조절 세포의 집단을 제조한다. 자가면역 질환은 본원에 기재된 임의의 질환일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이식 거부반응(transplant rejection)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 T 조절 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공하고, 이 방법은
- T 조절 세포의 집단을 제공하는 단계,
- 본 발명의 핵산 또는 벡터를 T 조절 세포 집단에 도입하는 단계,
- T 조절 세포의 표면에 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하고,
이에 의해, 이식 거부반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 T 조절 세포의 집단을 제조한다.　
또 다른 양태에서, 본 발명은 암 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 세포독성 T 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
- 세포독성 T 세포의 집단을 제공하는 단계,
- 본 발명의 핵산 또는 벡터를 세포독성 T 세포의 집단에 도입하는 단계,
- 세포독성 T 세포의 표면에 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하고,
이에 의해, 암 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 세포독성 T 세포의 집단을 제조한다. 암 또는 감염성 질환은 본원에 기재된 임의의 것일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 조절 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 생체외 집단을 제조하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은
- 조절 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포 집단을 제공하는 단계;
- 본 발명의 핵산 또는 벡터를 T 세포의 집단에 도입하는 단계로서, 상기 핵산 또는 벡터는 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 코딩하는 단계; 및
- T 세포의 표면에서 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하고;
이에 의해, 조절 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 생체외 집단을 제조한다. 바람직하게는, 조절 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포는 자가면역 질환을 갖는 대상체(subject)로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된다.
본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 조절 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포는 자가면역 질환으로 진단된 대상체 또는 건강한 대상체로부터 선택될 수 있다. T 세포는 조직적합성 기증자로부터 단리될 수 있다.
대안의 실시양태에서, 본 발명은 조절 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 생체외 집단을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
- 종래의 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 임의로, 상기 T 세포의 집단은 T 세포의 혼합 집단인 단계;
- 본 발명의 핵산 또는 벡터를 T 세포의 집단에 도입하는 단계로서, 상기 핵산 또는 벡터는 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 코딩하는 단계;
- T 세포의 표면에서 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계; 및
- T 세포의 집단의 T 조절 세포로의 전환을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하고;
이에 의해, 조절 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 생체외 집단을 제조한다. 바람직하게는, 종래의 T 세포 또는 T 세포의 혼합 집단의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포는 자가면역 질환을 갖는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된다. 또는, T 세포는 조직적합성 기증자로부터 유래될 수 있다.　
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포독성 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 생체외 집단을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
- 세포독성 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 집단을 제공하는 단계;
- 본 발명의 핵산 또는 벡터를 T 세포의 집단에 도입하는 단계로서, 상기 핵산 또는 벡터는 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 코딩하는 단계; 및
- T 세포의 표면에서 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하고;
이에 의해, 세포독성 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 생체외 집단을 제조한다. 바람직하게는, 세포독성 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포는 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체의 생물학적 샘플로부터 유래된다.
본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 세포독성 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포는 암 또는 감염성 질환으로 진단된 대상체 또는 건강한 대상체로부터 선택될 수 있다. T 세포는 조직적합성 기증자로부터 단리될 수 있다.
대안의 실시양태에서, 본 발명은 세포독성 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 생체외 집단을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
- 종래의 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 임의로, 상기 T 세포의 집단은 T 세포의 혼합 집단인 단계;
- 본 발명의 핵산 또는 벡터를 T 세포 집단에 도입하는 단계로서, 상기 핵산 또는 벡터는 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 코딩하는 단계;
- T 세포 표면에서 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계; 및
- T 세포의 집단의 세포독성 T 세포로의 전환을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하고;
이에 의해, 세포독성 T 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포의 생체외 집단을 제조한다. 바람직하게는, 종래의 T 세포 또는 T 세포의 혼합 집단의 적어도 하나의 특성을 나타내는 T 세포는 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된다. 또는, T 세포는 조직적합성 기증자로부터 유래될 수 있다.　
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 20% 초과의 세포가 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 발현하는 T 조절 세포의 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 발현하는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 세포를 추가로 포함한다.　
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 20% 초과의 세포가 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 발현하는 세포독성 T 세포의 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 발현하는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 세포를 추가로 포함한다.　
임의의 양태 또는 실시양태에서, 종래의 T 세포 또는 T 세포의 혼합 집단의 T 조절 세포로의 전환을 가능하게 하는 조건은 종래의 T 세포 또는 T 세포의 혼합 집단을 하나 이상의 제제와 접촉시키거나, 종래의 T 세포의 조절 T 세포로의 전환에 적합한 하나 이상의 인자의 발현을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 제제 또는 인자는 TGF-β, Foxp3 또는 이들의 발현을 증가시키는 제제를 포함할 수 있다.　
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 핵산, 세포 또는 조성물을 투여하고, 이에 의해 대상체의 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.　
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 이식 거부반응을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 핵산, 세포 또는 조성물을 대상체에게 투여하고, 이에 의해 대상체의 이식 거부반응을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.　
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 핵산, 세포 또는 조성물을 투여하고, 이에 의해 대상체의 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 핵산, 세포 또는 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 이식 거부반응을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 핵산, 세포 또는 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 핵산, 세포 또는 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 세포, 핵산 또는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 세포, 핵산 또는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 이식 거부반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 세포, 핵산 또는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시스테인이 해당 잔기 위치에 존재하는 경우, 펩티드/MHC에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 결합 단백질의 CDR3에서 잔기 위치를 동정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
· CDR3과 펩티드 내의 시스테인 잔기 사이에 밀접하게 접촉하는 하나 이상의 잔기에 대해 TCR-펩티드/MHC 계면 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편/MHC 계면을 분석하는 단계;
· 펩티드 내의 시스테인 잔기와 밀접하게 접촉하는 것으로 동정된 CDR3의 잔기를 돌연변이시키는 단계;
· CDR3에 도입된 시스테인 내의 황 원자와 펩티드의 시스테인 내의 황 원자 사이의 원자간 거리가 0.01 내지 3Å(옹스트롬)이고 2개 세트의 S-S-Cβ 원자(S-S 원자는 공통)를 통한 평면 사이의 이면각이 -87° 또는 +97°로부터 30° 미만인 경우에 디설파이드 결합이 형성될 가능성이 있는지를 결정하는 단계를 포함하고,
이에 의해, 시스테인이 해당 잔기 위치에 존재하는 경우, CDR3 또는 펩티드의 구조적 재배열 없이 펩티드/MHC에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 결합 단백질의 CDR3에서 잔기 위치를 동정한다.
이 양태에서, 결합 단백질은 본원에 기재된 임의의 결합 단백질일 수 있다.
이러한 양태에서, TCR-펩티드/MHC 계면 또는 항체 또는 항원-결합 단편/MHC 계면은 공지된 수단, 예를 들면, X-선 결정학 또는 NMR에 의해 결정되거나, 인 실리코에서 상호작용 모델로부터 결정될 수 있다.
이러한 양태에서, 시스테인과 밀접하게 접촉하는 것으로 동정된 CDR3 내의 잔기의 돌연변이는 인 실리코에서 수행할 수 있다.
이 양태에서, 이 방법은 CDR3과 펩티드 사이의 디설파이드 결합의 형성을 확인하는 단계를 추가로 포함하고,
· CDR3을 코딩하는 핵산, 바람직하게는 CDR3을 포함하는 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 단계;　
· 해당 잔기 위치에 시스테인이 존재하는 경우, 펩티드/MHC에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 결합 단백질의 CDR3의 잔기 위치에 시스테인을 도입하는 단계;
· 도입된 시스테인을 갖는 CDR3을 포함하는 결합 단백질을 생성하는 단계;
· 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 조건에서 결합 단백질 및 펩티드/MHC를 제공하는 단계;
· 디설파이드 결합의 형성을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
이러한 양태에서, 도입된 시스테인을 갖는 CDR3을 포함하는 결합 단백질의 생성은 본원에 기재된 방법을 포함하여 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 결합 단백질 또는 키메라 또는 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에 기재된 본 발명의 결합 단백질 또는 키메라 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 본원에 기재된 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 결합 단백질 또는 키메라 또는 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
· CDR3을 코딩하는 핵산, 바람직하게는 CDR3을 포함하는 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 단계;
· 해당 잔기 위치에 시스테인이 존재하는 경우, 펩티드/MHC에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 CDR3의 잔기 위치에 시스테인을 도입하는 단계;
· 도입된 시스테인을 갖는 CDR3을 포함하는 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질을 생성하는 단계를 포함한다.
이러한 양태에서, 도입된 시스테인을 갖는 CDR3을 포함하는 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질의 생성은 본원에 기재된 방법을 포함하여 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 이 방법은 결합 단백질을 정제 또는 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 비돌연변이 TCR(unmutated TCR)과 비교하여 HLA(pHLA)에 결합된 표적 펩티드와의 해리 속도가 저하된 돌연변이 TCR을 동정하는 방법을 제공하고, 이 방법은
- α 쇄 CDR3 서열 및/또는 β 쇄 CDR3 서열에 시스테인 잔기를 도입하는 돌연변이를 갖는 복수의 TCR을 생성하는 단계,　
- 상기 복수의 돌연변이체 TCR의 구성원과 표적 pHLA와의 상호작용을 결정하는 단계, 및　
- 비돌연변이 TCR과 비교하여 표적 pHLA와의 해리 속도가 저하된 하나 이상의 구성원을 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 비돌연변이된 TCR과 비교하여 HLA(pHLA)에 결합된 표적 펩티드와의 해리 속도가 저하된 돌연변이 TCR을 동정하는 방법을 제공하고, 이 방법은
- α 쇄 CDR3 서열 및/또는 β 쇄 CDR3 서열에 시스테인 잔기를 도입하는 돌연변이를 갖는 복수의 TCR을 생성하는 단계,　
- 상기 복수의 돌연변이체 TCR의 구성원과 표적 pHLA와의 상호작용을 결정하는 단계 및　
- 비돌연변이 TCR과 비교하여 표적 pHLA와의 해리 속도가 저하된 하나 이상의 구성원을 선택하는 단계로서, 상기 해리 속도의 저하는 디설파이드 결합의 형성에 의한 것인 단계,　
- 임의로, 도입된 시스테인 잔기와 표적 pHLA 중의 시스테인 사이에 디설파이드 결합의 형성을 확인하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 해리 속도의 저하는 적어도 5배, 10배 또는 20배이다.
일 실시양태에서, TCR(돌연변이 또는 비돌연변이)과 pHLA 사이의 해리 속도는 세포-기반 사량체 해리 검정 및/또는 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 결정된다.
일 실시양태에서, 펩티드는 낮은 풍부도의 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인 잔기의 도입 전의 TCR은 소정 pHLA에 대해 1mM, 100μM, 10μM, 1μM 또는 100nM 이상의 친화성을 갖는다. 시스테인의 도입은 저-친화성 상호작용을 증강시키거나 고-친화성 상호작용을 증강시키기 위해 이 전체 범위에서 바람직할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, "포함하다(comprise)"라는 용어 및 "포함하는(comprising)", "포함한다(comprises)", "포함된(comprised)"과 같은 용어의 변형은 추가의 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것을 의도하는 것은 아니다.
본 발명의 추가 양태 및 선행 단락에서 기재된 양태의 추가 실시양태는 첨부된 도면을 참조하여 예시적으로 제공되는 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1. TCR 및 펩티드 항원 서열. (A) 6218, 6218αC 및 6218βC TCR의 상세. (B) 도면에 사용된 펩티드 항원의 명칭 및 서열. 이들 펩티드 항원은 마우스 MHC 클래스 I 단백질, H2-Db에 결합한다.　
도 2. X-선 결정학을 사용한 디설파이드 결합 형성의 확인. (A) 6218 TCR-PA/H2-Db 복합체를 핑크색, 6218 TCR-PA4C/H2-Db를　금색 및 6218αC TCR-PA4C/H2-Db를 자주색으로 나타낸 3개 TCR-pMHC 구조의 중첩. (B) 연청색의 펩티드에 PA4C/H2-Db 구조를 추가한 TCR-펩티드 계면의 확대 표시. (C) 패널 (A)에 정렬된 3개 복합체(동일한 색상 코딩)으로부터 TCR의 각 가변 도메인의 질량 중심(구)을 갖는, 백색 카툰의 H2-Db 항원-결합 틈새의 상면도. (D) PA/H2-Db와 복합체를 형성한 6218 TCR의 구조(TCR과 펩티드는 핑크색, 및 H2-Db는 백색). (E) H2-Db(백색)에 의해 제시된 PA4C 펩티드(금색)와 복합체를 형성한 6218 TCR(금색)의 구조. (F) 계면에 형성된 디설파이드 결합을 나타내는 PA4C/H2-Db(청색의 펩티드, 백색의 MHC)와 복합체를 형성한 6218αC TCR(청색)의 구조. (G) (D) 및 (F)와 동일한 배향으로 6218 TCR-PA/H2-Db(핑크색)와 6218αC TCR-PA4C/H2-Db(청색) 복합체의 중첩.　
도 3. 디설파이드 결합 형성은 펩티드 항원에 대한 T-세포 감수성을 증가시킨다.　 CD8αβ 및 6218 TCR 또는 6218αC TCR을 발현하는 5KC T-세포주와 등급화된(graded) 농도의 PA4C 펩티드를 갖는 DC2.4 세포주를 16시간 공-배양한 후의 상청액 IL-2 농도. 대조군 배양물에는 50μM PA4C 펩티드(T 단독)를 갖는 5KC 세포, 펩티드 비함유 5KC 및 2.4 세포(T+DC), 플레이트-결합 항-CD3(α-CD3)를 갖는 5KC 세포가 포함되었다. 기호는 조건당 2개 웰의 범위의 평균 및 에러 바를 나타낸다. 데이터는 3회의 개별 실험의 대표이다.　
도 4. 고정화된 TCR 및 가용성 펩티드/MHC 사이의 디설파이드 결합의 검정. (A) 농도를 증가시켜 연속적으로 주사한(injected) PA4C/H2-Db에 노출된 고정화된 6218(흑색) 또는 6218αC(적색) TCR의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 센서그램. (B) 환원제에 의한 지속적 결합의 폐지. PA4C/H2-Db 단량체를 (A)에서와 같이 SPR 분석 전에 환원제(DTT)에서 밤새 인큐베이팅했다. (C) 시간 경과에 따른 점진적 디설파이드 결합 형성. 고정화된 6218αC TCR을 먼저 음성(비관련 pMHC) 및 양성(PA/H2-Db) 대조군 pMHC 단량체(제시되지 않음)의 1분간 주사에 노출시킨 후, PA4C/H2-Db를 1분, 5분 또는 20분 동안 주사하고, 이어서 완충액을 주사했다. (D) 짧은 수명의 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체의 짧은 반감기. pMHC 단량체 주사로부터 완충액 주사까지 전환되는 12초 간격의 SPR 데이터. -0.5초 내지 0초 사이의 일부 데이터 포인트는 Y축의 한계를 벗어난다. 센서그램은 측정 가능한 해리의 개시가 시간 = 0.1초에서 발생하도록 정렬되어 있다. 에러 바는 6218 TCR-PA/H2-Db에 대한 2회의 실험 범위, 6218 TCR-PA4C/H2-Db에 대한 3회의 실험(DTT 부재하의 2회 및 DTT 존재하의 1회), 및 6218αC TCR-PA4C/H2-Db에 대한 1개의 실험 범위(DTT 존재)를 나타낸다.
도 5. CDR3 내의 노출된 시스테인은 흉선에서 역치 이상의 TCR 신호전달 및 T-세포 내성 유도를 촉진한다. (A) Cys-함유 CDR3에 의한 흉선세포의 발달의 변화. Rag1 -/- 마우스(암컷 7마리 및 수컷 6마리; 37 내지 134일령)로부터 풀링한 골수(BM) 세포에 GFP 및 6218, 6218αC 또는 6218βC TCR을 코딩하는 레트로바이러스를 형질도입하고, 이어서 방사선 조사된 Rag1 -/- 마우스(6218의 경우 암컷 3마리 및 수컷 1마리; 6218αC의 경우 암컷 4마리; 및 6218βC의 경우 수컷 5마리)에 주사하기 전에 수컷 B6 마우스로부터의 T 세포-고갈된 야생형 BM 세포와 1:1 혼합했다. 수득된 TCR-유전자도입 마우스를 BM 이식후 5주간 90 내지 171일령에서 분석했다. 플롯은 표현형 GFP/CCR7(상부 열) 및 GFP/TCRβ(하부 열)을 분석한 살아있는 흉선세포의 형광-활성화 세포 선별(FACS)을 나타내고; GFP+ TCRβ+ 흉선세포의 게이트는 CD4/CD8β(열 3) 및 PD-1/NK1.1(열 4)에 대해 분석되었다. (B) 비장으로부터 림프구의 표현형은 GFP+ TCRβ+ 서브세트의 게이트를 사용하여 GFP/TCRβ(상부 열)에 대해 분석되었고, 이는 CD8α/CD8β 표현형에 대해 분석되었다(하부 열). (C) 소장으로부터의 CD45+ 세포의 표현형은 GFP+ TCRγδ- 서브세트에 대한 게이트를 사용하여 GFP/TCRγδ(상부 열)에 대해 분석되었고, 이는 CD8α/CD8αβ 표현형(하부 열)에 대해 분석되었다. (A), (B) 및 (C)에서, 그래프는 게이트 이벤트의 백분율, 또는 게이트 이벤트의 백분율에 기관당 총 세포 수를 곱하여 결정된 마우스당 게이트 이벤트의 절대 수(#)를 나타낸다. 그래프 내의 각 기호는 1마리 마우스를 나타내고; 원 기호는 6218, 사각형 기호는 6218αC 및 삼각형 기호는 6218βC에 대한 것이다. 통계 분석은 Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석(1-way ANOVA)을 사용했다.　
도 6. CDR3 내의 노출된 시스테인은 흉선에서 발달 T 세포의 풍부도 및 분포에 영향을 미친다. 6218 또는 6218αC TCR을 발현하는 TCR 레트로제닉 마우스로부터의 흉선의 면역형광 조직학. 흉선 절편을 GFP로 염색하고, 사이토케라틴-14(K14) 염색으로 골수 영역을 동정했다. 점선은 피질(C) 및 수질(M)의 경계를 나타낸다. 스케일 바: 200μm. TCR-레트로제닉 마우스를 골수 이식의 5주 후에 생후 99 내지 138일령(6128의 경우 n = 4; 6218αC의 경우 n = 4)에 분석했다. 그래프 요약(하부)은 피질 및 골수 영역에서 GFP+ 세포 밀도(섹션당, 상부 또는 mm2당, 하부의 GFP+ 세포 수)를 나타낸다. 그래프 내의 각 기호는 1마리 마우스를 나타낸다. 통계 분석은 대응하지 않는 양측 스튜던트 t 검정을 사용했다.　
도 7. 시스테인 잔기는 세포-기반 사량체 염색 검정에서 밀접하게 관련된 pMHC 사량체에 결합하는 TCR의 확률에 영향을 미치지 않는다. (A) PA4C 펩티드의 P7에서의 치환은 pMHC 사량체에 의한 TCR 결합을 감소시킨다. 플롯은 표시된 펩티드(상부)와 복합체를 형성하는 항-TCRβ 및 H2-Db 사량체로 염색된 6218 또는 6218αC TCR을 발현하는 TCR 형질감염체의 FACS 표현형을 나타낸다. 플롯의 수치는 6218 TCR-PA/H2-Db 샘플로 정규화한, 사량체 평균 형광 강도(MFI)를 TCRβ MFI로 나눈 값을 나타낸다. (B) 표시된 TCR-펩티드/H2-Db 조합(우측)의 경우, 기호는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정된 K eq의 함수로서 (A)에서와 같이 계산된 평균 사량체 결합을 나타내고, 점선은 동일한 pMHC로부터의 측정치를 연결한다. 에러 바는 2 내지 3회 실험으로부터의 3 내지 6개 샘플 범위(y-축) 또는 조합당 총 4개의 샘플을 사용한 2회 실험 평균의 표준 오차(x-축)를 나타낸다.　
도 8. 펩티드의 P7에서의 치환은 시스테인 잔기의 존재와 관계없이 pMHC 단량체에 결합하는 TCR의 확률에 영향을 미친다. 각 그래프에 주석이 달린 가용성 pMHC 단량체의 점진적으로 증가하는 농도에 노출된 고정화된 6218 TCR(흑색) 또는 6218αC TCR(적색)에 대한 SPR 센서그램. 좌측 패널의 센서그램은 P4-Cys가 없는 PA 펩티드 및 이의 변이체를 나타내고, 우측 패널의 센서그램은 PA4C 펩티드 및 이의 변이체를 나타낸다. 하부 패널은 상기 센서그램으로부터 도출된 K D 값을 갖는 표이다. 핑크색 화살표는 디설파이드 결합 형성을 나타내는 주사 후의 pMHC 체류 수준을 나타낸다.　
도 9. 디설파이드 결합 형성은 펩티드/MHC로부터 TCR의 해리를 방지한다. (A) 시간 경과에 따른 점진적 디설파이드 결합 형성. SPR 센서그램은 20분 동안 주사한 PA4C(적색), PA4C7K(청색) 또는 PA4C7A(회색), 또는 50분 동안 주사하고, 이어서 완충액을 주사한 PA4C7L(흑색)과 복합체를 형성한 H2-Db 단량체(100μM)에 의한 6218αC TCR에 대한 결합을 나타낸다. (B) 디설파이드 결합 형성은 사량체 해리를 억제한다. 도 7에서와 같이 pMHC 사량체로 염색된 6218 또는 6218αC를 발현하는 TCR 형질감염체를 세척하고, 25μg/mL 항-H2-Db/Kb를 함유한 완충액에 재현탁하여 10분, 30분 또는 60분 동안 사량체 재결합을 방지한 후, FACS 분석을 수행했다. 그래프는 시간 = 0분에서 항-H2-Db/Kb를 갖지 않는 대응 샘플의 백분율로서 사량체+ 세포 빈도를 나타낸다. 기호는 2회의 실험으로부터 수집된 조건당 4개 샘플 범위의 평균 및 에러 바를 나타낸다.　
도 10. 디설파이드 결합 형성은 비공유 항원 인식과 비교하여 펩티드 항원에 대한 T-세포 감수성을 증가시키고 펩티드 항원의 식별을 감소시킨다. (A) CD8αβ, 및 6218 TCR 또는 6218αC TCR을 발현하는 5KC T 세포를 표시된 펩티드의 등급화된 농도를 갖는 DC2.4 세포와 공배양한 후의 상청액 IL-2 농도(각 그래프의 좌측 상부에 표시). 대조군 배양물에는 50μM 펩티드(T 단독)을 갖는 5KC 세포, 펩티드를 갖지 않는 5KC 및 DC2.4 세포(T + DC), 및 플레이트-결합 항-CD3(α-CD3)을 갖는 5KC 세포가 포함되었다. 기호는 적어도 2회의 실험을 대표하는 1개 실험으로부터 조건당 2개 웰의 평균을 나타내고, 에러 바는 범위를 나타낸다. 힐슬로프(h) 값은 비선형 회귀를 사용하여 결정되었다. 플라토에 도달하지 않은 곡선의 경우, 보고된 EC50 값은 EC50의 최소 추정치를 제공한다. 데이터는 도 3에서와 같이 제시되어 있고, 2회의 개별 실험을 대표한다. (B) 각 TCR/펩티드 조합의 경우, 그래프는 EC50(좌측) 또는 h(우측) 값에 대해 플롯된 상대적 사량체 결합(x-축)을 나타내고, 이는 적어도 2회의 실험에서 분석된 펩티드당 총 적어도 4개의 희석 시리즈로부터 결정되었다. 에러 바는 EC50 및 h의 95% 신뢰 구간을 나타내고, 점선은 동일한 pMHC로부터의 측정치를 연결한다.
도 11. TCR-펩티드/MHCI 복합체에서 조작 가능한 디설파이드 결합의 분포. 이 패널은 표 3에 제시된 TCR-펩티드/MHCI 복합체의 분석을 요약한 것이고, 각 그래프가 펩티드에서 소정 위치(그래프 상에 표시)를 나타내는 TCRα 쇄(x-축 상부) 또는 TCRβ 쇄(x-축 하부)를 수반하는 고신뢰성 조작 가능한 TCR-펩티드 결합의 총 수를 나타낸다.　　　
도 12. TCR-펩티드/MHCII 복합체에서 조작 가능한 디설파이드 결합의 분포. 이 패널은 표 4에 제시된 TCR-펩티드/MHCII 복합체의 분석을 요약한 것이고, 각 그래프가 펩티드에서 소정 위치(그래프 상에 표시)를 나타내는 TCRα 쇄(x-축 상부) 또는 TCRβ 쇄(x-축 하부)를 수반하는 고신뢰성 조작 가능한 TCR-펩티드 결합의 총 수를 나타낸다.　　　
도 13. 시스테인-연결 T 세포 운명 왜곡에서 Zap70 및 MHC의 역할. (A) TCR 신호전달의 감쇠는 T 세포 운명에 대한 Cys-함유 CDR3의 효과를 방해한다. Zap70mrd/mrt 마우스(암컷 11마리 및 수컷 9마리; 33 내지 60일령)로부터 풀링한 골수(BM) 세포에 GFP 및 6218, 6218αC 또는 6218βC TCR을 코딩하는 레트로바이러스를 형질도입하고, 이어서 방사선 조사한 수컷 Zap70mrd/mrt 　마우스에 주사했다. TCR-레트로제닉 마우스로부터의 비장세포는 GFP+ TCRβ+ 　세포용 게이트를 사용하여 GFP/TCRβ 표현형에 대해 분석했다. 그래프는 GFP+ TCRβ+ 　비장세포의 절대 수를 나타내고, 각 기호는 1마리 마우스를 나타낸다: 6218(원 기호), 6218αC(사각형 기호), 6218βC(삼각형 기호). (B) 폴리클로날 T 세포 서브세트에서 차등적 Cys-함유 CDR3 발현은 pMHC 리간드에 대한 반응으로 강력한 TCR 신호전달이 필요하다. 선별된 사전-선택 흉선세포, 소장 CD8αα IEL, 비장 CD4+ T-conv 및 비장 CD8+ T-conv 집단을 TCR 서열분석에 의해 분석했다. 그래프는 중앙 CDR3 아미노산(시스테인 지수)의 2 위치 내에 Cys를 갖는 고유한 TCRα(원) 또는 TCRβ(십자) 서열의 비율을 나타내고, 각 기호는 1마리 마우스로부터의 샘플을 나타낸다: 좌측 패널, 야생형(n=11; 암컷 6마리 및 수컷 5마리, 45 내지 133일령); 중앙 패널, Zap70mrd/mrt 마우스(n=3; 37 내지 74일령); 우측 패널, B2m -/- H2-A -/- 마우스(n= 암컷 1마리 및 수컷 4마리, 98 내지 140일령). 좌측 패널의 p 값은 Sidak의 다중 비교 검정을 사용한 이원 배치 분산 분석(2-Way ANOVA)을 사용하여 결정되었다.　
도 14: TCR-pMHC 결합의 Cys의 상황-의존적 효과. 마우스 CD3, GFP 및 6218, 6218αC 또는 6218βC TCR을 발현하는 TCR 형질감염체를 항-TCRβ 및 표시된 PA 또는 PA4C 펩티드를 제시하는 H2-Db의 사량체와 함께 인큐베이팅했다(좌측). FACS 플롯은 살아있는 GFP+ TCRβ+ 세포에서 사량체 염색 대 TCRβ 발현을 나타낸다. 데이터는 6218 TCR 또는 6218αC TCR을 발현하는 세포에 대한 6회 실험 및 6218βC TCR을 발현하는 세포에 대한 1회 실험의 대표이다.　
도 15: α3/DR15-APC 사량체에 의한 염색으로 입증된 바와 같이, α3/DR15 항원에 결합하는 CD4 + T 세포 하이브리도마의 생성. FACS 플롯은 하이브리도마 세포에서 사량체 염색 대 CD4+ 발현을 나타낸다.
도 16: LS1 하이브리도마를 사용한 T 세포 활성화 검정에 의해 TCR-노출 위치에서 시스테인 치환을 갖는 α3 펩티드의 변이체에 대한 반응성이 동정된다 .
(A) 히스토그램은 나이브 DR15-유전자도입 마우스로부터의 셀트레이스(CellTrace) 바이올렛(CTV)-표지 비장세포와 함께 16시간 동안 배양한 LS1 하이브리도마 세포의 플루오레세인 신호를 나타낸다. 각 히스토그램 상부에 명명된 펩티드(50μg/mL)의 부재 또는 존재하에 Fcgr2b -/- 마우스. (B) FACS 도트 플롯은 나이브 DR15-유전자도입 마우스로부터의 CTV-표지 골수-유래 수지상 세포와 함께 16시간 동안 인큐베이팅한 LS1 하이브리도마 세포에서 플루오레세인(x-축) 대 측면 산란(y-축)을 나타낸다. 각 히스토그램 상부에 명명된 펩티드(50μg/mL)의 부재 또는 존재하에 Fcgr2b -/- 　마우스.
도 17: LS1 T 세포 하이브리도마에 의해 발현되는 TCRα 및 TCRβ 쇄의 가변(TRAV/TRBV) 및 접합(TRAJ/TRBJ) 유전자 세그먼트 및 CDR3 아미노산 서열의 상세.
본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 본 명세서 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 2개 이상의 개별 특징의 모든 대안적 조합으로 확장된다는 것이 이해될 것이다. 이러한 모든 상이한 조합은 본 발명의 다양한 대안적 양태를 구성한다.
본 발명의 추가 양태 및 전기 단락에서 기재한 양태의 추가 실시양태는 첨부된 도면을 참조하여 예시적으로 제공되는 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
이제, 본 발명의 특정 실시양태를 상세히 참조할 것이다. 본 발명은 실시양태와 함께 기재될 것이지만, 본 발명을 이들 실시양태로 한정하려는 의도는 아니라는 것이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 균등물을 커버하도록 의도된다.
T 세포 활성화는 항원-제시 세포(APC)의 표면 상의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시된 펩티드 항원의 T 세포 항원 수용체(TCR)의 공-인식에 의존한다. 본 발명자(들)는 TCR-펩티드 디설파이드 결합이 TCR과 이의 펩티드/MHC 리간드 사이의 상호작용을 안정화시킨다는 사실을 발견했다. 본 발명자(들)는 세포-결합된 TCR 및 가용성 TCR 모두에서 이를 입증했다. TCR이 pMHC에 결합할 확률이 높지만 디설파이드 결합을 형성하는 능력에 의해 구별되는 2개 상호작용을 고려할 때, 디설파이드 결합 형성을 허용하는 상호작용은 디설파이드 결합 형성을 허용하지 않는 상호작용보다 낮은 농도의 펩티드에서 T 세포 활성화를 촉진할 수 있다. 추가로, TCR이 pMHC에 결합할 확률은 낮지만 디설파이드 결합을 형성하는 능력에 의해 구별되는 2개 상호작용을 고려할 때, 디설파이드 결합 형성을 허용하는 상호작용은 T 세포 활성화를 촉진할 수 있는 반면, 디설파이드 결합을 허용하지 않는 상호작용은 T 세포 활성화를 촉진할 수 없다.
TCR 유전자 요법은 원하는 TCR을 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 환자에게 제공한다. 자연적으로 발현되는 펩티드와 디설파이드 결합을 형성하는 유전자 조작된 TCR을 사용하면, 암(1)에 대한 종래 T 세포의 TCR 유전자 요법(TCR-T 세포 요법) 및 자가면역 질환(2)에 대한 T-조절 세포의 TCR 유전자 요법(TCR Treg 요법)이 증강될 수 있다. 이는 TCR과 펩티드/MHC 사이의 상호작용 수명이 더 이상 TCR 유전자 요법의 제한 인자로 되지 않을 것이기 때문이다. 추가로, 저농도 펩티드의 신규 분야가 TCR 유전자 요법의 접근 가능한 표적으로 될 것이다.
TCR-펩티드 디설파이드 결합의 주요 이점은 TCR-펩티드/MHC 상호작용의 반감기가 길다는 것이다. 이에 의해 TCR 유전자 요법의 주요 과제, 즉 T 세포 활성화를 유도하기 위한 TCR/펩티드-MHC 인식 단위의 충분한 지속성을 달성하는 과제가 극복된다. 중요한 결과는 디설파이드-허용성 T 세포가 발현 수준이 낮은 디설파이드-허용성 펩티드에 의해 활성화되어, T 세포 인식에 대한 신규 펩티드 분야를 열었다는 것이다.
시스테인-조작된 TCR은 이전에 TCR-T 세포 요법에 의해 표적화할 수 없었던 항원, 예를 들면, MHC에 의한 T 세포로의 발현 또는 제시가 낮은 항원, 비고전적 MHC(예: HLA-E, HLA-F)에 의해 제시되는 펩티드의 T-세포 인식을 가능하게 할 수 있다.　
TCR 유전자 요법은 원하는 αβ TCR을 발현하도록 유전적으로 조작된 자가 T 세포를 환자에게 제공한다. TCR 유전자 요법은 암 치료에 사용될 수 있다. T-조절 세포의 TCR 유전자 요법은 자가면역 질환의 치료제로서의 잠재력을 갖고 있다. 디설파이드-허용성 TCR을 사용하는 TCR 유전자 치료는 저-풍부도 펩티드로는 T 세포를 자극하지 못하는 T 세포 자극을 가능하게 할 것으로 예상된다.
일반
본 명세서 전체에서, 특별히 달리 명시되거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질 조성의 그룹에 대한 언급은 이들 단계, 물질 조성, 단계 그룹 또는 물질 조성의 그룹 중 하나 및 복수(즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.　 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수의 양태를 포함하고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.　 예를 들면, "a"에 대한 언급에는 단수뿐만 아니라 2개 이상이 포함되고; "an"에 대한 언급에는 단수뿐만 아니라 2개 이상이 포함되며; "the"에 대한 언급에는 단수뿐만 아니라 2개 이상 등이 포함된다.
당업자들은 본 발명이 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변형 및 수정을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징의 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상의 조합을 포함한다.　
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 다수의 방법 및 재료를 인식할 것이다. 본 발명은 기재된 방법 및 재료에 한정되지 않는다.　
본원에 언급된 모든 특허 및 간행물은 그 전체가 참조에 의해 통합되어 있다.
본 발명은 예시의 목적으로만 의도되는 본원에 기재된 특정 실시예에 의해 범위가 한정되어서는 안 된다. 기능적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 명백하게 본 발명의 범위 내에 있다.
본원에 기재된 본 발명의 임의의 예 또는 실시양태는, 특별히 달리 기재되지 않는 한, 본 발명의 임의의 다른 예 또는 실시양태에 준용하여 적용되는 것으로 간주된다.
달리 특별히 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자(예: 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학 분야)에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주한다.　
달리 명시되지 않는 한, 본 개시에서 이용된 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술은 당업자에게 널리 공지된 표준 절차이다. 이러한 기술들은 문헌 전체의 정보원에 기재 및 설명되어 있다[참조: J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present)].
본원에 기재된 가변 영역 및 이의 일부, T 세포 수용체 및 이의 단편에 대한 설명 및 정의는 문헌[참조: Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 and/or or Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997]에서의 논의에 의해 추가로 명백해질 것이다.
"및/또는"(예: "X 및/또는 Y")라는 용어는 "X와 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 양쪽 의미 또는 어느 한쪽 의미를 명시적으로 서포트하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유래된"이라는 용어는 특정 정수가 반드시 해당 공급원으로부터 직접 수득되는 것은 아니지만, 특정 공급원으로부터 수득될 수 있음을 나타내는 것으로 간주한다.
본원에서, 예를 들면, 잔기의 범위에 대한 언급은 포괄적인 것으로 이해될 것이다.　 예를 들면, "아미노산 1 내지 15를 포함하는 영역"에 대한 언급은 포괄적 방식으로 이해될 것이고, 즉 해당 영역은 특정 순서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 넘버링된 아미노산 서열을 포함한다.
"본질적으로 이로 이루어진"이라는 용어는 특허청구의 범위를 특정된 재료 또는 단계 또는 청구된 발명의 기본 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 한정한다. 예를 들면, 단백질 도메인, 영역 또는 모듈(예: 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈) 또는 단백질(이는 하나 이상의 도메인, 영역 또는 모듈을 가질 수 있음)은 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질의 아미노산 서열이 확장, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 경우에 특정 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어지고", 이는 조합하여 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질 길이의 최대 20%(예: 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고, 도메인(들), 영역(들), 모듈(들) 또는 단백질의 활성(예: 결합 단백질의 표적 결합 친화성)에 영향을 미치지 않는다(즉, 활성을 50% 이상 감소시키지 않음, 예컨대, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 이하).
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자"는, 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 시험관내 번역에 의해 생성된 임의의 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오티드, 단편, 및 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 또는 엑소뉴클레아제 작용 중 어느 하나에 의해 생성된 단편을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 핵산은 PCR에 의해 생성된다. 핵산은 자연 발생 뉴클레오티드(예: 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드), 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체(예: 자연-발생 뉴클레오티드의 a-에난티오머 형태) 또는 양쪽의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티 또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티의 변형 또는 치환을 가질 수 있다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 결합의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사체에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등이 포함된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
"단리"라는 용어는 물질이 이의 원래의 환경(예: 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)으로부터 제거되는 것을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 핵산 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩티드는 단리된다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물(예: 세포 용해물)의 일부일 수 있지만, 이러한 벡터 또는 조성물이 핵산 또는 폴리펩티드의 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된다. "유전자"라는 용어는 폴리펩티드 쇄의 생성에 관여하는 DNA의 세그먼트를 의미하고, 여기에는 코딩 영역 "리더 및 트레일러"의 전후 영역, 및 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합"이라는 용어는 인간의 개입에 의해 유전적으로 조작된, 즉 외인성 또는 이종성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 세포, 미생물, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭하거나, 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 조절, 탈조절 또는 구성되도록 변경된 세포 또는 미생물을 지칭한다. 예를 들면, 인간 생성된 유전자 변경에는 하나 이상의 단백질 또는 효소를 코딩하는 핵산 분자(이는 프로모터와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있음)를 도입하는 변형, 또는 세포의 유전 물질에 대한 기타 핵산 분자의 부가, 결실, 치환 또는 기타 기능 장애 또는 부가를 도입하는 변형이 포함될 수 있다. 예시적 변형에는 참조 또는 모체 분자로부터 이종 또는 상동 폴리펩티드의 코딩 영역 또는 이의 기능적 단편의 변형이 포함된다.
"보존적 치환"은 당해 기술분야에서 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것으로 인식된다. 예시적 보존적 치환은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, WO 97/09433 at page 10; Lehninger, Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc. NY, NY, pp.71-77, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, p. 8, 1990].
결합 단백질
본원에서 사용되는 "결합 단백질"은 표적(예: 단백질, 펩티드 또는 이의 단편, 펩티드-MHC 복합체)과 특이적 및 비공유적으로 회합, 결합 또는 조합하는 능력을 갖는 단백질성 분자 또는 이의 일부(예: 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질)를 지칭한다. 결합 단백질은 정제, 실질적으로 정제, 합성 또는 재조합될 수 있다. 예시적 결합 단백질에는 일본쇄 면역글로불린 가변 영역(예: scTCR, scFv)이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 임의의 결합 단백질은 각각 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원-결합 단편이며, 이들 중 임의의 것이 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다. 임의의 실시양태에서, 결합 단백질은 키메라 또는 융합 단백질일 수 있다. 추가의 실시양태에서, TCR의 항원-결합 단편은 일본쇄 TCR(scTCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 단백질은 TCR이다.
"T 세포 수용체"(TCR)는 MHC 수용체에 결합된 항원 펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원(가변 결합 도메인, 불변 도메인, 막관통 영역 및 짧은 세포질 테일을 가짐, 예를 들면, 문헌[참조: Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997])을 지칭한다. TCR은 세포 표면 또는 가용성 형태(soluble form)로 발견될 수 있고, 일반적으로 α(알파) 및 β(베타) 쇄(각각 TCRα 및 TCRβ로서 공지됨) 또는 γ 및 δ 쇄(각각 TCRγ 및 TCRδ로서 공지됨)를 갖는 헤테로이량체로 구성된다. 면역글로불린과 마찬가지로, TCR 쇄의 세포외 부분(예: α-쇄, β-쇄)은 2개의 면역글로불린 도메인, 즉 N-말단에 가변 도메인(예: α-쇄 도메인 또는 Vα, β-쇄 도메인 또는 Vβ; 전형적으로 카바트 넘버링[참조: Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.]에 기반하는 아미노산 1 내지 116) 및 세포 막에 인접하는 1개의 불변 도메인(예: α-쇄 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 카바트에 기반하는 아미노산 117 내지 259, β-쇄 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 카바트에 기반한 아미노산 117 내지 295)을 함유한다. 또한, 면역글로불린과 마찬가지로, 가변 도메인은 프레임워크 영역(FR)으로 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다[참조: 예를 들면, Jores et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 57:9138, 1990; Chothia et al, EMBO J. 7:3745, 1988; see also Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003]. 특정 실시양태에서, TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견되고, CD3 복합체와 회합한다. 본 개시에서 사용되는 TCR의 공급원은 인간, 마우스, 랫트, 래빗 또는 기타 포유동물과 같은 다양한 동물 종으로부터 유래할 수 있다. 본원에서 언급되는 TCR은 세포 결합 TCR 또는 가용성 TCR일 수 있다. 세포 결합 TCR 또는 가용성 TCR은 키메라 또는 융합 단백질의 일부일 수 있다.
MHCI의 경우, 포켓 A-F는 문헌[참조: Young et al., FASEB J (1995): 9, 26-36]에 정의되어 있다. MHCII의 경우, MHCII 중의 포켓 1 내지 9는 이들이 함유하는 펩티드의 잔기 이후에 명명된다[참조: 예를 들면, Rammensee et al. Curr Opin Immunol (1995): 7: 85-96].
예를 들면, 재조합적으로 생산된 가용성 TCR(키메라 또는 융합 단백질의 일부인 경우에도)의 단리 및 정제에 유용한 방법에는 재조합 가용성 TCR을 배양 배지로 분비하는 적합한 숙주 세포/벡터 시스템으로부터 상청액을 수득하고, 이어서 상업적으로 이용 가능한 필터를 사용하여 배지를 농축하는 것이 포함될 수 있다. 농축 후, 농축물은 단일 적합한 정제 매트릭스, 또는 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 일련의 적합한 매트릭스에 적용될 수 있다. 하나 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제할 수 있다. 이들 정제 방법은 이의 자연 환경으로부터 면역원을 단리할 때에도 사용할 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 단리/재조합 가용성 TCR을 대규모로 생산하는 방법에는 적절한 배양 조건을 유지하기 위해 모니터링 및 조절되는 배치 세포 배양이 포함된다. 가용성 TCR의 정제는 본원에 기재된 방법 및 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질 또는 도메인은, T 세포 결합, 활성화 또는 유도의 결정 및 항원 특이적인 T 세포 반응의 결정을 포함하여, T 세포 활성을 검정하기 위한 허용되는 다수의 방법론에 따라 기능적으로 특성화될 수 있다. 예로서는 T 세포 증식, T 세포 사이토카인 방출, 항원 특이적 T 세포 자극, MHC 제한된 T 세포 자극, CTL 활성(예: 사전-로딩된 표적 세포로부터 Cr 방출의 검출에 의해), T 세포 표현형 마커 발현의 변화 및 기타 T-세포 기능의 측정이 포함된다. 이러한 검정 및 유사한 검정을 수행하는 절차는, 예를 들면, 문헌[참조: Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998). See, also, Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281 :1309 (1998) 및 그 중에서 인용된 참고문헌]에서 발견할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, MHC와 HLA는 호환적으로 사용되고, 모든 HLA의 예는 MHC로 치환될 수 있다. 마우스 MHC는 H2라고도 한다.
임의의 양태 또는 실시양태에서, 시스테인은 기존 잔기의 돌연변이 또는 변형에 의해 CDR(예를 들면, 결합 단백질의 가변 도메인 또는 키메라 또는 융합 단백질)에 도입된다. 즉, 특정 위치의 천연 아미노산은 시스테인이 아닐 수 있지만, 천연 아미노산은 시스테인 잔기로 돌연변이되거나 당해 잔기가 HLA 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있도록 임의의 방식으로 변형된다. 예시적 방법은 시스테인 잔기를 코딩하기 위해 관련 위치에서 결합 단백질 또는 키메라 또는 융합 단백질의 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시키는 것을 기재하는 실시예를 포함하여 본원에 기재되어 있다. 예를 들면, 돌연변이 또는 변형에 의해 시스테인이 도입된 경우, 시스테인은 비-천연 시스테인으로 지칭될 수 있고, 도입된 시스테인을 함유하는 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질은 비-천연 시스테인을 포함하는 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질로 지칭될 수 있다.
단백질 디설파이드 결합은 2개 시스테인 잔기의 티올 그룹(-SH)의 황 원자 사이의 공유 결합이다. 디설파이드(S-S 결합, 디설파이드 가교 또는 가교결합이라고도 함)은 2개 티올의 산화시에 형성되고, 따라서 2개 시스테인과 각각의 주요 펩티드 쇄를 공유 디설파이드 결합에 의해 연결한다.
결합 단백질은 임의의 아미노산 서열, 예를 들면, 실시예 및 도 17을 포함하여 본원에 기재된 바와 같이, Vα 및/또는 Vβ의 임의의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결합 단백질은 기존 잔기의 돌연변이 또는 변형에 의해 CDR에 도입된 시스테인 잔기를 포함한다.
입양 세포 요법/조작된 세포
본 발명은 입양 세포 요법을 위한 세포의 제조 방법, 이러한 세포 및 세포 자체를 갖는 대상체에서 본원에 기재된 바와 같이 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 키메라 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 입양 전달 요법에 사용하기 위해 숙주 세포(예: CD8+ T 세포, Treg 세포)를 형질감염/형질도입하기 위해 사용된다.　
대안의 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 펩티드는 펩티드에 대한 특이성을 갖는 T 세포(예를 들면, CD8+ T 세포, Treg 세포)를 생성하기 위해 T 세포의 집단의 활성화 및/또는 확장에 사용된다.
TCR 서열분석의 발전이 기재되어 있고[참조: Robins et al, Blood 114:4099, 2009; Robins etal, Sci. Translat. Med. 2:47ra64, 2010; Robins et al, (Sept. 10) J. 1mm. Meth. Epub ahead of print, 2011; Warren et al, Genome Res. 2 1:790, 2011], 본 개시에 따른 실시양태를 실시하는 과정에서 사용될 수 있다. 유사하게는, 원하는 핵산을 갖는 T 세포를 형질감염/형질도입하는 방법은 원하는 항원-특이성을 갖는 T 세포를 사용하는 입양 전달 절차(예를 들면, 미국 특허출원공개번호 US 2004/0087025)와 마찬가지로 기재되어 있고[참조: Schmitt et al, Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett etal, Mol. Ther. 77:742, 2009; Till et al, Blood 772:2261, 2008; Wang et al, Hum. Gene Ther. 75:712, 2007; Kuball et al, Blood 709:2331, 2007; US 201 1/0243972; US 201 1/0189141; e n et al, Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007], 따라서 본 발명의 결합 단백질에 관한 것을 포함하여 본원의 교시에 기초하여 본원에 개시된 실시양태에 이러한 방법론을 적용하는 것이 고려될 수 있다.
T 세포는 종양 침윤 림프구, 말초 혈액 림프구, T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 조작된 것, γδ T 세포, 혼합 림프구 종양 세포 배양물(MLTC)로 농후화되거나 자가 항원 제시 세포 및 종양 유래 펩티드를 사용하여 클로닝된 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 림프구는 조직 적합성 기증자 또는 대상체로부터 단리할 수 있다.　
CD8+ T 세포는 T 세포 표면 마커에 기초하여 T 세포를 식별하고 분리하는 일상적 세포 선별 기술을 사용하여 수득할 수 있고, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 CD8+ T 세포의 단리된 집단을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 혈액 및/또는 말초 혈액 림프구를 포함하는 생물학적 샘플을 개체로부터 수득하고, 상업적으로 이용 가능한 장치 및 시약을 사용하여 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리하여 CD8+ T 세포의 단리된 집단을 수득할 수 있다.　
인간 CD8+ T-세포 유형 및/또는 집단은 표현형 세포-표면 마커 CD62L, CCR7, CD27, CD28 및 CD45RA 또는 CD45RO를 사용하여 동정할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, CD8+ T 세포 유형 및/또는 집단은 하기와 같은 특징 또는 세포 표면 마커의 발현 패턴을 갖는다: 나이브 T 세포는 CD45RA+, CD27+, CD28+, CD62L+ 및 CCR7+로서 특징지어지고; CD45RO+ 중앙 기억 T 세포는 CD45RA-, CD27+, CD28+, CD62L+ 및 CCR7+이고; CD45RO+ 이펙터 기억 T 세포는 이들 5개 마커(CD45RA-, CD27-, CD28-, CD62L- 및 CCR7-)의 발현의 결여에 의해 정의되고; 최종 분화 이펙터 기억 CD45RA+ T 세포는 CD45RA+, CCR7-, CD27-, CD28-, CD62L-로 특징지워진다. 최종 분화된 이펙터 기억 세포는 CD57, KLRG1, CX3CR1과 같은 마커를 추가로 상향-조절하고, 높은 수준의 그랜자임 A 및 B, 퍼포린 및 IFNγ를 생성하는 능력에 의해 특성화된 강력한 세포독성 특성을 나타낸다. 따라서, 이들 마커의 발현 또는 발현 결여에 기초하여 다양한 T 세포 집단을 다른 세포 및/또는 서로로부터 분리할 수 있다.
상이한 CD8+ T 세포 유형은 또한, 예를 들면, IFN-γ의 분비; IL-2의 분비; 그랜자임 B의 생성; FasL의 발현 및 CD 107의 발현을 포함한 특정 기능을 나타낼 수 있다. 그러나, 세포 표면 마커의 발현 패턴은 본원에 기재된 바와 같이 각 특정 CD8+ T 세포 유형 및/또는 집단의 진단으로 간주되지만, 각 세포 유형 및/또는 집단의 기능적 특성은 세포가 받았거나 받은 자극의 양에 따라 달라질 수 있다.　
세포독성 또는 조절 T(Treg) 세포를 포함하는 세포 집단은 말초 혈액, 흉선, 림프절, 비장, 골수와 같은 세포독성 또는 Treg 세포가 존재하는 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다.　
Treg 세포를 포함하는 세포 집단은 혼합된 T 세포 집단 또는 종래의 T 세포 집단으로부터 유래될 수도 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 혼합된 집단 또는 종래의 T 세포는 T 세포의 항원 특이성을 농후화하기 위해 원하는 펩티드/MHC 리간드와 접촉시킬 수 있다. 대안적으로, 혼합 집단 또는 종래의 T 세포는 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질도입될 수 있다. 이어서, T 세포는 당업자에게 공지된 Treg 세포 생성에 대한 표준 기술을 사용하여 Treg 세포로 전환될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포의 혼합 집단 또는 종래의 T 세포는 TGF-베타 및 Foxp3의 발현 증가를 가능하게 하는 조건에서 배양된다. 여기에는 항-CD3/항-CD28 항체, CDK8/19의 억제, 고용량의 IL-2, TGF-베타 및 라파마이신으로 세포를 배양하는 것이 포함된다. 다른 실시양태에서, 전환 또는 농후화된 Treg 세포 집단은 안정화된다(예를 들면, 세포를 비타민 C 또는 Treg를 안정화시키는 기타 제제와 접촉시킴으로써).　
주입(infusion)에 사용되는 Treg 세포(또는 실제로 Treg의 생성에 사용되는 Tconv 또는 혼합 T 세포 집단)는 동종 기증자, 바람직하게는 HLA가 일치하는 기증자 또는 자가 단백질에 대한 이상, 원치 않거나 부적절한 면역 반응과 관련된 상태로 진단받은 대상체로부터 단리할 수 있다.
T 세포는 또한 유도 만능 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포, 바람직하게는 배아 줄기 세포주의 분화로부터 생성될 수 있다. 당업자는 iPSC를 포함하여 줄기 세포로부터 Treg 세포를 생성하는 표준 기술에 친숙할 것이다. 이러한 기술의 예는 문헌[참조: Hague et al., (2012) J. Immunol., 189: 2338-36; and Hague et al., (2019) JCI Insight, 4: pii 126471]에 기재되어 있다.
추가로, T 세포의 혼합 집단과 관련하여, 당업자는 CD4+CD25+ T 세포(Treg 세포)인 T 세포의 하위 집단을 단리하는 표준 기술에 친숙할 것이다. 예를 들면, CD4+CD25+ T 세포(Treg 세포)는 음성 및 양성 면역 선택 및 세포 선별에 의해 대상체의 생물학적 샘플로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 임의의 방법에서, 핵산 또는 벡터의 존재하에서 배양된 Treg 세포는 세포가 수득되는 동일한 대상체에 전달될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포는 자가 세포일 수 있고, 즉 의학적 상태가 치료되거나 예방되는 대상체로부터 수득할 수 있다. 대안적으로, 세포는 또 다른 대상체에게 동종이계적으로 전달될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 대상체의 의학적 상태를 치료 또는 예방하는 방법에서 대상체에게 자가이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생체외" 또는 "생체외 요법"이라는 용어는 세포가 환자 또는 적절한 동종 기증자와 같은 적절한 대체 공급원으로부터 수득되고 변형된 세포가 당해 변형된 세포에 의해 생성된 치료 이익에 의해 개선될 질환의 치료에 사용할 수 있도록 변형되는 요법을 지칭한다. 치료에는 변형된 세포를 환자에게 투여 또는 재도입하는 것이 포함된다. 생체외 요법의 이점은 환자를 치료로부터 원치 않는 부수적 효과에 노출시키지 않으면서 치료의 이익을 환자에게 제공할 수 있다는 것이다.
"투여"라는 용어는 각 세포를 포함한 상기 조성물의 치료학적 유효 용량을 개체에게 투여하는 것을 의미한다. "치료학적 유효량"이란 투여되는 효과를 생성하는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 따라 달라지고, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다. 당업자에게 공지되고 상술한 바와 같이, 전신 대 국소 전달, 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 상태의 중증도에 대한 조정이 필요할 수 있고, 당업자의 일상적 실험을 통해 확인할 수 있다.
세포의 "농후화된" 또는 "정제된" 세포 집단은, 예를 들면, 대상체의 신체에서 발견되는 세포와 비교하거나 본 발명의 펩티드, 핵산 또는 벡터에 노출되기 전의 비율과 비교하여 다른 세포에 대한 특정 세포의 비율의 증가이다. 일부 실시양태에서, 농후화 또는 정제된 세포 집단에서, 특정 세포는 전체 세포 집단의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 포함한다. 세포의 집단은 하나 이상의 세포 표면 마커 및/또는 특성에 의해 정의될 수 있다.　
본 발명의 결합 단백질 또는 키메라 또는 융합 단백질을 발현하는 Treg 세포는, 예를 들면, 주사, 주입, 침착, 이식, 경구 섭취 또는 국소 투여 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 방법에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 주사는 정맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내, 바람직하게는 정맥내일 수 있다. 당업자에 의해 과도한 실험 없이 결정할 수 있는 바와 같이, 대상체의 상태, 중증도 및 전반적 건강에 따라 소정 기간에 걸쳐 단일 또는 다중 용량을 투여할 수 있다. 주사는 복수 위치에 제공될 수 있다.　
Treg 세포의 투여는 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 투여할 수 있다. 각 용량에는 약 10×103 CD8+ T 세포, 20×103 세포, 50×103 세포, 100×103 　세포, 200×103 세포, 500×103 세포, 1×106 세포, 2×106 세포, 20×106 　세포, 50×106 세포, 100×106 세포, 200×106, 500×106, 1×109 세포, 2×109 세포, 5×109 세포, 10×109 세포 등이 포함될 수 있다. 투여 빈도는, 예를 들면, 주 1회, 주 2회, 2주 1회, 3주 1회, 4주 1회, 1개월 1회, 2개월 1회, 3개월 1회, 4개월 1회, 5개월 1회, 6개월 1회 등일 수 있다. 투여가 수행되는 총 일수는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일 또는 20일 등일 수 있다. 임의의 소정 투여에는 동일한 날에 2회 이상의 주사가 포함될 수 있음을 이해한다. 투여의 경우, 투여되는 Treg 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%는 Treg 세포의 적어도 하나의 특성을 나타내야 한다.
펩티드
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질은 MHC 분자, 바람직하게는 HLA 분자에 결합하는 펩티드에 결합할 수 있다. 펩티드는 내인성 또는 외인성, 자가 또는 비자가일 수 있다. 펩티드는 시스테인 잔기가 존재하거나 시스테인이 본 발명의 결합 단백질에서 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 특정 위치에 도입되는 본원에 언급된 모든 펩티드를 포함한다.
저풍부도 펩티드는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 T 세포의 수 또는 분화 상태에 검출 가능하게 영향을 미치지 않는 펩티드이다. 펩티드는 내인성 또는 외인성일 수 있다. 내인성 펩티드는 종양 항원을 포함하여 본원에 기재된 임의의 것일 수 있다. T 세포 집단은 "무지"의 저풍부도 펩티드로서 기재될 수 있다. 마우스의 흉선에서, 인식된 저풍부도 펩티드는 EpCAM+ 상피 세포의 0.003% 내지 0.015% 및 수지상 세포의 0.0003% 내지 0.001%에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
MHC 클래스 I 및 II 단백질은 적응 면역계에서 중요하다. 양쪽 클래스의 단백질은 모두 T 세포에 의한 인식을 위해 표면에 펩티드를 제시하는 역할을 공유한다. MHC 클래스 I 펩티드 복합체는 핵화된 세포에 제시되고, 세포독성 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. 이와 대조적으로, MHC 클래스 II 펩티드 복합체는 수지상 세포, 마크로파지 또는 B 세포와 같은 전문 항원-제시 세포의 표면에 존재하고, CD4+ T 세포를 활성화하도록 작용하고, 이는 이펙터 기능의 조정 및 조절을 초래한다.　
주요 조직적합성 복합체 클래스 I 및 클래스 II는 전체적으로 유사한 폴딩을 공유한다. 결합 플랫폼은 MHC 클래스 I의 경우에 단일 중 α-쇄(HC)로부터 유래한 2개의 도메인으로 구성되고, MHC 클래스 II의 경우에 2개의 쇄(α-쇄 및 β-쇄)로부터 유래한 2개의 도메인으로 구성된다. 2개 도메인은 베이스로서 만곡 β-시트를 갖고, 그 상부에 2개의 α-헬릭스를 가지며, 이는 그 사이에 펩티드 쇄를 수용할 수 있을 만큼 충분히 떨어져 있다. 2개의 막-근위 면역글로불린(Ig) 도메인이 펩티드-결합 단위를 서포트한다. 하나의 Ig 도메인은 MHC 클래스 II의 각 쇄에 존재하고, MHC 클래스 I의 제2 Ig-유형 도메인은 불변 경쇄 베타-2 마이크로글로불린(β2m)과 HC의 비공유 결합에 의해 제공된다. 막관통 헬릭스는 MHC 클래스 I의 HC와 MHC 클래스 II의 양쪽 쇄를 막에 고정한다.　
2개 헬릭스 사이의 그루브는 (i) MHC 분자의 측쇄와 펩티드의 주쇄 사이에 일련의 보존된 수소 결합의 형성 및 (ii) 펩티드 측쇄에 의한 정의된 포켓의 점유를 기반으로 펩티드를 수용한다(MHC 클래스 I의 앵커 잔기 P2 또는 P5/6 및 PΩ, 및 MHC 클래스 II의 P1, P4, P6 및 P9). 개별 펩티드 측쇄와 MHC의 상호작용 유형은 결합 그루브의 기하, 전하 분포 및 소수성에 의존한다.　
HLA 클래스 I 분자의 비제한적 예로는 HLA-C*07:01, HLA-A*2402, HLA-A*2, HLA-A*24, HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, HLA-B*44:05, HLA-B*35:01, HLA-A*01:01, HLA-B*37:01, HLA-B*08:01, HLA-A*11:01, HLA-B*08:01, HLA-B*27:05, HLA-B*35:08, HLA-A*24:02, HLA-B*51:01 및 HLA-E*01:03이 포함된다.
HLA 클래스 II 분자의 비제한적 예로는 HLA-DQA1*0508_HLA-DQB1*0201, HLA-DQA1*0501_HLA-DQB1*0201, HLA-DQA1*0301_HLA-DQB1*0302, HLA-DRA*0101_HLA-DBR1*0101, HLA-DRA*0101_HLA-DRB3*0301, HLA-DRA*0101_HLA-DBR5*0101, HLA-DRA*0101_HLA-DBR1*0401, HLA-DPA1*0103_HLA-DPB1*2602, HLA-DQA1*0501_HLA-DQB1*0302, HLA-DRA*0101_HLA-DRB1*1101, HLA-DRA*0101_HLA-DRB1*1502, HLA-DRA*0101_HLA-DRB1*0101, HLA-DQA1*0301_HLA-DQB1*0305, HLA-DQA1*0201_HLA-DQB1*0201이 포함된다.
"펩티드"에 대한 언급에는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 일부에 대한 언급이 포함된다. 펩티드는 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있고/있거나, 아미노산, 지질, 탄수화물 또는 기타 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 같이 단백질에 융합, 연결, 결합 또는 기타 회합된 다양한 기타 분자를 함유할 수 있다.　 이하에서 "펩티드"에 대한 언급은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드뿐만 아니라 아미노산, 지질, 탄수화물 또는 기타 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 다른 분자와 회합된 펩티드를 포함한다.　　
"유도체"에는 융합 단백질을 포함한 자연, 합성 또는 재조합 공급원의 단편, 부분, 일부 및 변이체가 포함된다.　 부분 또는 단편에는, 예를 들면, 대상 펩티드의 활성 영역이 포함된다.　 유도체는 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환으로부터 유래될 수 있다.　 아미노산 삽입 유도체에는 단일 또는 다중 아미노산의 서열내 삽입뿐만 아니라 아미노 및/또는 카복실 말단 융합이 포함된다.　 삽입 아미노산 서열 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질의 소정 부위에 도입된 것이지만, 수득된 생성물의 적절한 스크리닝으로 랜덤 삽입도 가능하다.　 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산의 제거를 특징으로 한다.　　
치환 아미노산 변이체는 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된 것이다.　 치환 아미노산 변이체의 예는 보존적 아미노산 치환이다.　 보존적 아미노산 치환에는 전형적으로 하기 그룹: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신 내의 치환이 포함된다.　 아미노산 서열에 대한 부가는 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과의 융합을 포함한다.　 일 실시양태에서, 시스테인 잔기는 본원에서 예시된 바와 같이 세린으로 치환된다.
대상 펩티드의 화학적 및 기능적 등가물은 이러한 분자의 기능적 활성 중 하나 이상을 나타내는 분자로서 이해되어야 하고, 화학적으로 합성되거나 자연 생성물 스크리닝과 같은 스크리닝 프로세스를 통해 동정되는 것과 같은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 고려되는 유사체에는 측쇄의 변형, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 합성 중에 비자연 아미노산 및/또는 이의 유도체의 혼입(incorporating), 및 가교제의 사용 및 단백질성 분자 또는 이들의 유사체에 형태적 제약을 부여하는 기타 방법이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 의해 고려되는 측쇄 변형의 예에는 알데히드와의 반응에 의한 환원성 알킬화, 이어서 NaBH4에 의한 환원; 메틸아세트이미데이트에 의한 아미드화; 아세트산 무수물에 의한 아실화; 시아네이트에 의한 아미노 그룹의 카바모일화; 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)에 의한 아미노 그룹의 트리니트로벤질화; 숙신산 무수물 및 테트라하이드로프탈산 무수물에 의한 아미노 그룹의 아실화; 및 피리독살-5-포스페이트에 의한 리신의 피리독실화, 이어서 NaBH4에 의한 환원과 같은 아미노 그룹의 변형이 포함된다.
아르기닌 잔기의 구아니딘 그룹은 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약에 의한 헤테로사이클릭 축합 생성물의 형성에 의해 변형시킬 수 있다. 카복실 그룹은 O-아실이소우레아 형성에 의한 카보디이미드 활성화, 이어서, 예를 들면, 대응하는 아미드로의 후속 유도체화에 의해 변형시킬 수 있다. 설프하이드릴 그룹은 요오도아세트산 또는 요오도아세트아미드에 의한 카복시메틸화; 시스테인 산으로의 퍼포름산 산화; 다른 티올 화합물과의 혼합 디설파이드의 형성; 말레이미드, 말레산 무수물 또는 기타 치환된 말레이미드와의 반응;　4-클로로머큐리 벤조에이트, 4-클로로머큐리페닐설폰산, 페닐머큐리 클로라이드, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 및 기타 수은을 사용한 수은 유도체 형성; 알칼리성 pH에서 시아네이트에 의한 카바모일화와 같은 방법에 의해 변형시킬 수 있다. 트립토판 잔기는, 예를 들면, N-브로모숙신이미드에 의한 산화 또는 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 설페닐 할라이드에 의한 인돌 환의 알킬화에 의해 변형시킬 수 있다.　 반면에, 티로신 잔기는 테트라니트로메탄에 의한 니트로화에 의해 변화시켜 3-니트로티로신 유도체를 형성할 수 있다.
히스티딘 잔기의 이미다졸 환의 변형은 요오도아세트산 유도체에 의한 알킬화 또는 디에틸피로카보네이트에 의한 N-카보에톡실화에 의해 달성할 수 있다.
단백질 합성 중에 비자연 아미노산 및 유도체를 혼입하는 예로는 노르류신, 4-아미노 부티르산, 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜탄산, 6-아미노헥산산, t-부틸글리신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성질체가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.　　
예를 들면, 가교제는, (CH2)n 스페이서 그룹(n=1 내지 n=6)을 갖는 이관능성 이미도 에스테르, 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르와 같은 호모-이관능성 가교제, 및 일반적으로 N-하이드록시숙신이미드와 같은 아미노-반응성 모이어티 및 또 다른 그룹 특이적-반응성 모이어티를 함유하는 헤테로-이관능성 시약을 사용하여 3D 입체구조를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다.
용해도의 증가, 치료 또는 예방 효능의 증강, 안정성의 증강 또는 단백질 분해에 대한 내성의 증가와 같은 다양한 목적을 위해 본 발명에 따른 펩티드의 구조를 변형시킬 수 있다.　 면역원성을 변형시키기 위해 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같이 아미노산 서열이 변경된 변형 펩티드를 생산할 수 있다.　 유사하게는, 본 발명의 펩티드에 성분을 첨가하여 동일한 결과를 생성할 수 있다.
예를 들면, 펩티드는 T 세포 아네르기(anergy)를 유도하는 능력을 나타내도록 변형시킬 수 있다. 이 경우에, T 세포 수용체에 대한 중요한 결합 잔기는 공지된 기술(예를 들면, 각 잔기의 치환 및 T 세포 반응성의 존재 또는 부재의 결정)을 사용하여 결정할 수 있다. 한 가지 예에서, T 세포 수용체와의 상호작용에 필수적인 것으로 밝혀진 잔기는 필수 아미노산을 또 다른, 바람직하게는 이의 존재가 T 세포 반응성 또는 T 세포 기능을 변화시키는 것으로 밝혀진 유사한 아미노산 잔기로 치환(보존적 치환)함으로써 변형시킬 수 있다.　 또한, T 세포 수용체 상호작용에 필수적이지 않은 아미노산 잔기는 또 다른 아미노산으로 치환함으로써 변형시킬 수 있고, 이어서 이의 혼입은 T 세포 반응성 또는 T 세포 기능을 변경할 수 있지만, 예를 들면, 관련 MHC 단백질과의 결합은 제거하지 않는다.　
보존적 치환의 예는 하기에 상세되어 있고, 하기를 포함한다:
이러한 변형은 본원에 정의된 바와 같이 대상 펩티드의 "돌연변이체"의 범위에 속하는 분자의 생산을 초래할 것이다.　 "돌연변이체"는 비돌연변이 펩티드 대응물에 의해 나타나는 것과는 상이한 하나 이상의 구조적 특징 또는 기능적 활성을 나타내는 펩티드를 지칭하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 펩티드는 또한 자연 대립유전자 변이로부터 발생하는 하나 이상의 다형성을 혼입하도록 변형시킬 수 있고, 본 발명의 범위 내에 속하는 변형된 펩티드를 생성하기 위해 D-아미노산, 비-자연 아미노산 또는 아미노산 유사체를 펩티드에 치환할 수 있다.　 펩티드는 또한 공지된 기술에 의해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 접합에 의해 변형시킬 수 있다.　 리포터 그룹을 부가하여 본 발명에 따라 펩티드의 정제를 용이하게 하고 잠재적으로 용해도를 증가시킬 수도 있다.　 특정 엔도프로테아제 절단 부위의 삽입, 관능기의 부가 또는 덜 소수성 잔기에 의한 소수성 잔기의 치환을 포함하는 기타 널리 공지된 유형의 변형뿐만 아니라 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA의 부위-지시된 돌연변이유발을 또한 사용하여 광범위한 목적에 유용할 수 있는 변형을 도입할 수 있다.　 상기에서 언급된 본 발명에 따른 펩티드에 대한 다양한 변형은 단지 예시로서만 언급된 것이며, 실시할 수 있는 광범위한 변형을 나타내는 것을 의도할 뿐이다.
핵산 및 벡터
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 결합 단백질, 또는 키메라 또는 융합 단백질, 및 펩티드 또는 이들의 유도체, 상동체 또는 유사체를 코딩하는 서열을 코딩하거나 이에 상보적인 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자 조성물을 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위해 사용되거나 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 세포 치료에 사용될 수 있다.
"작제물"이라는 용어는 재조합 핵산 분자를 함유하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 작제물은 벡터(예: 박테리아 벡터, 바이러스 벡터)에 존재하거나, 게놈에 통합될 수 있다. "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 예를 들면, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, RNA 벡터, 또는 염색체, 비염색체, 반-합성 또는 합성 핵산 분자를 포함할 수 있는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 예시적 벡터는 자율 복제(에피솜 벡터) 또는 이들이 연결된 핵산 분자의 발현(발현 벡터)이 가능한 벡터이다.
바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스(예: 아데노-관련 바이러스), 코로나바이러스, 오르토-믹소바이러스(예: 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(예: 광견병(rabies) 및 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스), 파라믹소바이러스(예: 홍역(measles) 및 센다이(Sendai))와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스, 피코르나바이러스(picornavirus) 및 알파바이러스(alphavirus)와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예: 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 1 및 2, 엡스타인-바르 바이러스, 사이토메갈로바이러스), 및 폭스바이러스(예: 백시니아(vaccinia), 계두(fowlpox), 카나리아두(canarypox))를 포함하는 이중-가닥 DNA 바이러스가 포함된다. 기타 바이러스에는, 에를 들면, 노워크 바이러스(Norwalk virus), 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 레오바이러스(reoviruses), 파포바이러스(papovirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus) 및 간염 바이러스 등이 포함된다. 레트로바이러스의 예로는 조류 백혈병-육종(avian leukosis-sarcoma), 포유동물 C형, B형 바이러스, D형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스품바이러스(spumavirus) 등이 포함된다[참조: Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996].
본원에서 사용되는 "렌티바이러스 벡터"는 유전자 전달을 위한 HIV-기반 렌티바이러스 벡터를 의미하고, 이는 통합형 또는 비통합형일 수 있고, 비교적 큰 패키징 용량을 가지며, 다양한 세포 유형에 형질도입될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 일반적으로 3개(패키징, 엔벨로프 및 전달) 또는 그 이상의 플라스미드를 생산자 세포에 일시적으로 형질감염시킨 후에 생성된다. HIV와 마찬가지로, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 표면 당단백질과 세포 표면의 수용체와의 상호작용을 통해 표적 세포에 침입한다. 침입시, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의해 매개되는 역전사를 겪는다. 역전사의 산물은 이중-가닥 선형 바이러스 DNA이고, 이는 감염된 세포의 DNA로의 바이러스 통합을 위한 기질이다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 기능에 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 2개 이상의 핵산 분자가 회합하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는 해당 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있는 경우)에 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. "연결되지 않은"은 관련된 유전적 요소가 서로 밀접하게 연관되어 있지 않고 하나의 기능이 다른 기능에 영향을 미치지 않는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 벡터"는 적절한 숙주에서 핵산 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 함유하는 DNA 작제물을 지칭한다. 이러한 조절 서열에는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적절한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종료를 조절하는 서열이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스 또는 단순히 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적합한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 복제하여 숙주 게놈과 독립적으로 기능하거나, 일부 경우에 게놈 자체에 통합될 수 있다. 본 명세서에서, "플라스미드", "발현 플라스미드", "바이러스" 및 "벡터"는 종종 호환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 "발현"이라는 용어는 유전자 등의 핵산 분자의 코딩 서열에 기초하여 폴리펩티드가 생성되는 프로세스를 지칭한다. 이 프로세스에는 전사, 전사 후 조절, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 조절, 번역 후 변형 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
핵산 분자를 세포에 삽입하는 문맥에서 "도입된"이라는 용어는 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 진핵세포 또는 원핵세포에 핵산 분자의 혼입에 대한 언급이 포함되고, 여기서 핵산 분자는 세포의 게놈(예를 들면, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)에 혼입되거나, 자율 리플리콘으로 전환되거나, 일시적으로 발현(예를 들면, 형질감염된 mRNA)될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "이종" 또는 "외인성" 핵산 분자, 작제물 또는 서열은 숙주 세포에 대해 고유하지 않지만 숙주 세포의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부와 상동성일 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부를 지칭한다. 이종 또는 외인성 핵산 분자, 작제물 또는 서열의 공급원은 상이한 속 또는 종으로부터 유래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이종 또는 외인성 핵산 분자는, 예를 들면, 접합, 형질전환, 형질감염, 전기천공 등에 의해 숙주 세포 또는 숙주 게놈에 부가되고(즉, 내인성 또는 천연이 아님), 여기서 부가된 분자는 숙주 게놈에 통합되거나, 염색체외 유전 물질로서(예: 플라스미드 또는 다른 형태의 자가-복제 벡터로서) 존재할 수 있고, 복수의 카피로 존재할 수 있다. 또한, "이종"은 숙주 세포가 상동성 단백질 또는 활성을 코딩하더라도, 숙주 세포에 도입된 외인성 핵산 분자에 의해 코딩된 비-천연 효소, 단백질 또는 기타 활성을 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 이종 또는 외인성 핵산 분자는 개별 핵산 분자로서, 복수의 개별 조절된 유전자로서, 폴리시스트론 핵산 분자로서, 융합 단백질을 코딩하는 단일 핵산 분자로서 또는 이들의 임의의 조합으로서 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같이, 숙주 세포는 WT-1 항원 펩티드(예를 들면, TCRα 및 TCR-β)에 특이적인 원하는 TCR을 코딩하는 2개 이상의 이종 또는 외인성 핵산 분자를 발현하도록 변형시킬 수 있다. 2개 이상의 외인성 핵산 분자가 숙주 세포에 도입되는 경우, 2개 이상의 외인성 핵산 분자는 단일 핵산 분자(예를 들면, 단일 벡터 상)로서 도입되거나, 별도의 벡터 상에 도입되거나, 단일 부위 또는 복수 부위에서 숙주 염색체에 통합되거나, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있는 것으로 이해된다. 참조된 이종 핵산 분자 또는 단백질 활성의 수는 숙주 세포에 도입된 개별 핵산 분자의 수가 아니라 코딩 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성의 수를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "내인성" 또는 "천연"이라는 용어는 숙주 세포에 정상적으로 존재하는 유전자, 단백질 또는 활성을 지칭한다. 더욱이, 모체 유전자, 단백질 또는 활성과 비교하여 돌연변이, 과발현, 셔플, 복제 또는 기타 변경된 유전자, 단백질 또는 활성은 여전히 특정 숙주 세포에 대해 내인성 또는 천연인 것으로 간주된다. 예를 들면, 제1 유전자의 내인성 조절 서열(예: 프로모터, 번역 감쇠 서열)을 사용하여 제2 천연 유전자 또는 핵산 분자의 발현을 변경 또는 조절할 수 있고, 여기서 제2 천연 유전자 또는 핵산 분자의 발현 또는 조절은 모세포에서 정상 발현 또는 조절과는 상이할 수 있다.
"상동" 또는 "동종"이라는 용어는 숙주 세포, 종 또는 균주로부터 발견되거나 이로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들면, 이종 또는 외인성 핵산 분자는 천연 숙주 세포 유전자와 상동성일 수 있고, 임의로 발현 수준의 변화, 상이한 서열, 활성의 변화 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 "서열 동일성"은 최대 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬시키고 필요한 경우 갭을 도입한 후에 또 다른 참조 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 한 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율을 지칭하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않는다. 서열 동일성 백분율 값은 문헌[참조: Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 정의된 바와 같이 NCBI BLAST2.0 소프트웨어를 사용하여 생성할 수 있고, 파라미터는 디폴트 값으로 설정되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주"는 관심 있는 폴리펩티드(예를 들면, 고친화성 또는 증강된 친화성 항-WT-1 TCR)를 생산하기 위해 이종 또는 외인성 핵산 분자에 의한 유전적 변형을 표적으로 하는 세포(예를 들면, Treg 세포) 또는 미생물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 임의로 이종 또는 외인성 단백질의 생합성과 관련되거나 관련되지 않은 원하는 특성을 부여하는 다른 유전적 변형(예를 들면, 검출 가능한 마커의 포함; 결실, 변경 또는 절단된 내인성 TCR; 공-자극 인자 발현의 증가)을 이미 보유하거나 포함하도록 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는, 예를 들면, 변형된 세포의 생존 및/또는 확장의 이점을 촉진하기 위해 숙주 세포에서 면역 신호전달을 조절하는 단백질 또는 융합 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된다(예를 들면, WO 2016/141357의 면역조절 융합 단백질을 참조, 이는 전체가 참조에 의해 본원에 통합됨).
핵산 분자는 원핵세포(예: 이. 콜라이(E. coli)) 또는 진핵세포(예: 효모 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 식물 세포)에서 발현할 수 있는 발현 벡터에 결찰될 수 있다.　 핵산 분자는, 예를 들면, 신호 펩티드와 같은 또 다른 실체를 코딩하는 핵산 분자와 결찰 또는 융합되거나 달리는 회합될 수 있다.　 또한, 이는 3' 또는 5' 말단 부분 또는 3' 및 5' 말단 부분 모두에서 융합, 연결 또는 달리는 회합된 추가 뉴클레오티드 서열 정보를 포함할 수도 있다.　 핵산 분자는 또한 발현 벡터와 같은 벡터의 일부일 수도 있다.　 후자의 실시양태는 본 발명의 결합 단백질 또는 펩티드의 재조합 형태의 생산을 용이하게 한다.
이러한 핵산은 적절한 벡터에 삽입하고 적절한 세포주에 감염시킴으로써 본 발명의 결합 단백질 또는 펩티드 또는 이를 포함하는 단백질의 재조합 생산에 유용할 수 있다.　 이러한 발현 벡터 및 숙주 세포주는 또한 본 발명의 일 양태를 형성한다.
재조합 기술에 의한 펩티드의 생산에 있어서, 본 발명에 따른 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질 또는 펩티드, 또는 핵산 서열과 기능적 등가물을 코딩하는 서열을 갖는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 관련 특정 세포에 적합한 배지에서 배양한다.　 이어서, 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질 또는 펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동 또는 결합 단백질 또는 펩티드에 특이적인 항체를 사용한 면역정제와 같은 당래 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 둘 다로부터 정제할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산은 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포, 효모 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있다.　 적합한 발현 벡터, 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소는 문헌[참조: Sambruck et al (1989)]에서 참조된다.　 다른 적합한 발현 벡터, 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 요소는 당업자에게 널리 공지되어 있다.　 효모에서 적합한 발현 벡터의 예로는 Yep Sec 1(Balderi et al., 1987, Embo J., 6:229-234); pMFa(Kurjan and Herskowitz., 1982, Cell., 30:933-943); JRY88(Schultz et al., 1987, Gene., 54:113-123) 및 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 등이 포함된다.　 이러한 벡터는 바큘로바이러스 및 포유동물 발현 시스템과 마찬가지로 자유롭게 이용할 수 있다.　 예를 들면, 바큘로바이러스 시스템은 곤충 세포에서 발현시키기 위해 시판되고 있는 반면(ParMingen, San Diego, CA), pMsg 벡터는 포유동물 세포에서 발현시키기 위해 시판되고 있다(Pharmacia, Piscataway, NJ).
이. 콜라이에서의 발현을 위해, 적합한 발현 벡터에는 그 중에서 pTrc(Amann et al., 1998, Gene, 69:301-315); pGex(Amrad Corporation, Melbourne, Australia); pMal(N.E. Biolabs, Beverley, MA); pRit5(Pharmacia, Piscataway, NJ); pEt-11d(Novagen, Maddison, WI)[참조: Jameel et al., 1990, J. Virol., 64:3963-3966] 및 pSem(Knapp et al., 1990, Bio Techniques., 8:280-281) 등이 포함된다.　 예를 들면, pTRC 및 pEt-11d의 사용은 융합되지 않은 단백질의 발현을 유도할 수 있다.　 pMal, pRit5, pSem 및 pGex의 사용은 말토오스 E 결합 단백질(pMal), 단백질 A(pRit5), 절단 갈락토시다제(PSEM) 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(pGex)에 융합된 단백질 또는 펩티드의 발현을 유도할 수 있다.　 결합 단백질 또는 펩티드가 융합 단백질로서 발현되는 경우, 캐리어 단백질과 관련 펩티드 사이의 융합 접합부에 효소 절단 부위를 도입하는 것이 특히 유리하다.　 이어서, 본 발명의 결합 단백질 또는 펩티드는 효소 부위에서의 효소적 절단 및 단백질 및 펩티드의 정제를 위한 통상적 기술을 사용한 생화학적 정제를 통해 융합 단백질로부터 회수될 수 있다.　 또한, 상이한 벡터는 구성적 또는 유도적 발현 또는 온도 유도를 허용하는 상이한 프로모터 영역을 갖는다.　 추가로, 재조합적으로 발현된 단백질을 분해하는 능력이 변경된 상이한 이. 콜라이 숙주에서 재조합 펩티드를 발현하는 것이 적절할 수 있다.　 또는, 이. 콜라이에 의해 우선적으로 사용되는 코돈을 사용하도록 핵산 서열을 변경하는 것이 유리할 수 있고, 이러한 핵산 변경은 발현된 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는다.
숙주 세포는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염 또는 전기천공과 같은 종래 기술을 사용하여 본 발명의 핵산을 발현하도록 형질전환할 수 있다.　 숙주 세포를 형질전환하는 적절한 방법은 문헌[참조: Sambruck etal(1989)] 및 기타 실험실 텍스트에서 발견할 수 있다.　 본 발명의 핵산 서열은 표준 기술을 사용하여 화학적으로 합성할 수도 있다.
본 발명에 따른 펩티드의 재조합 생산 외에도, 핵산은 실험 또는 정제 목적의 프로브로서 이용될 수 있다.
치료용 병태
본원에 개시된 본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 세포, 핵산, 벡터 및 조성물의 동정 및 합성은 자가면역, 암 및 감염성 질환과 관련하여 사용하기 위한 다양한 예방적 및 치료적 치료 프로토콜의 개발을 용이하게 한다.　 또한, 본원에서 사용하기 위한 시약의 개발도 촉진된다.　 따라서, 본 발명은 환자의 치료 및/또는 예방 치료에서 펩티드 또는 기능성 유도체, 동족체 또는 유사체의 사용으로 확장되는 것으로 이해되어야 한다.　 이러한 치료 방법에는 하기가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다:
감염성 질환 및 암에는 표 2, 3 및 4에 언급된 모든 것이 포함된다.
자가면역 질환에는 표 1, 3 및 4에 언급된 모든 것이 포함된다.
이식 거부반응 및 이식 거부반응과 관련된 상태.
본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 세포, 핵산, 벡터 및 조성물의 대상체로의 투여는 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 수단이다. 이는, 예를 들면, CD8 T 세포의 세포독성 활성을 증가시켜 항-종양(암과 관련하여) 또는 항-병원체(감염성 질환과 관련하여) 반응을 증강시키기 위해 TCR/펩티드-MHC 클래스 I 디설파이드 결합을 도입함으로써 달성할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, MHC 클래스 I의 문맥에서 CD8 T 세포와 항원 제시 세포(모든 핵화 세포) 사이에 디설파이드 결합의 도입은 감염된(감염성 질환과 관련하여) 또는 변형된(암과 관련하여) 표적 세포의 보다 큰 세포독성 또는 사멸을 초래할 수 있다. 또는, MHC 클래스 I의 문맥에서 CD8 T 세포와 항원 제시 세포(임의의 핵화 세포) 사이에 디설파이드 결합의 도입은 보다 큰 사이토카인/케모카인 생산을 초래하여 염증유발성 반응을 일으킬 수 있다.
본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 잠재적 암의 비제한적 예로는 흑색종(melanoma), 폐암(lung cancer), 신장암(renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 유방암(breast cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 섬유육종(fibrosarcoma)이 포함된다. 바람직하게는, 골암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 두경부암(cancer of the head or neck), 피부 또는 안구내 악성 흑색종(cutaneous or intraocular malignant melanoma), 자궁암(uterine cancer), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문 부위의 암(cancer of the anal region), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 자궁암(uterine cancer), 나팔관의 암종(carcinoma of the fallopian tubes), 자궁내막의 암종(carcinoma of the endometrium), 자궁경부암(carcinoma of the cervix), 질암(carcinoma of the vagina), 외음부암(carcinoma of the vulva), 호지킨병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 식도암(cancer of the esophagus), 소장암(cancer of the small intestine), 내분비계의 암(cancer of the endocrine system), 갑상선암(cancer of the thyroid gland), 부갑상선암(cancer of the parathyroid gland), 부신암(cancer of the adrenal gland), 연조직 육종(sarcoma of soft tissue), 요도암(cancer of the urethra), 음경 암(cancer of the penis), 만성 또는 급성 백혈병(chronic or acute leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 소아 고형 종양(solid tumors of childhood), 림프구성 림프종(lymphocytic lymphoma), 방광암(cancer of the bladder), 신장 또는 요관의 암(cancer of the kidney or ureter), 신장 골반의 암종(carcinoma of the renal pelvis), 중추신경계(CNS) 신생물(neoplasm of the central nervous system), 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생(tumor angiogenesis), 척추축 종양(spinal axis tumor), 뇌간 신경교종(brain stem glioma), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 표피암(epidermoid cancer), 편평세포암(squamous cell cancer), T 세포 림프종(T-cell lymphoma), 석면에 의해 유발된 암을 포함한 환경 유발 암 및 상기 암의 조합.　
TCR/펩티드-MHC 클래스 I 디설파이드 결합을 도입하여 CD8 T 세포의 세포독성 활성을 증가시킴으로써, 이는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 잠재적 감염성 질환의 비제한적 예로는 엡스타인-바르 바이러스, 인플루엔자, 뎅기 바이러스, HIV, C형 간염 바이러스 및 사이토메갈로바이러스가 포함된다.
본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 세포, 핵산, 벡터 및 조성물의 대상체로의 투여는 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 수단이다. 이는, 예를 들면, TCR/펩티드-MHC 클래스 II 디설파이드 결합을 도입하여 Treg 세포의 조절 활성을 증가시키고, 이에 의해 자가면역 반응을 저해 또는 억제함으로써 달성할 수 있다. 본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 잠재적 자가면역 질환의 비제한적 예로는 체강 질환(coeliac disease), 니켈 과민증(nickel hypersensitivity), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 베릴륨 과민증(beryllium hypersensitivity) 및 당뇨병(diabetes)이 포함된다.
본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 세포, 핵산, 벡터 및 조성물의 대상체로의 투여는 이식 거부반응을 치료 또는 예방하는 수단이다. 이는, 예를 들면, TCR/펩티드-MHC 클래스 II 디설파이드 결합을 도입하여 Treg 세포의 조절 활성을 증가시키고, 이에 의해 이식에 대한 면역 반응을 저해 또는 억제함으로써 달성할 수 있다. 이 치료에는 조직 이식편 거부반응과 관련된 염증의 치료가 포함된다. "이식 거부반응" 또는 "이식편 거부반응"은 HLA 항원, 혈액형 항원 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 이식편에 대한 임의의 숙주-개시된 면역 반응을 의미한다. 이식 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환은 초급성(체액성), 급성(T 세포 매개) 또는 만성(원인 불명) 또는 이들의 조합일 수 있다. 따라서, 본 발명은 간, 신장, 췌장, 췌장 섬 세포, 소장, 폐, 심장, 각막, 피부를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 임의의 조직의 초급성, 급성 및/또는 만성 거부반응 및/또는 거부반응과 관련된 증상의 억제 및/또는 개선에 사용된다. 이식편 조직은 임의의 기증자로부터 수득할 수 있고, 임의의 수용자 숙주에 이식하거나 신체의 한 부위로부터 다른 부위로 이식할 수 있다.
"치료 유효량"이라는 문구는 일반적으로 (i) 특정 질환, 상태 또는 장애를 치료하거나, (ii) 특정 질환, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 경감, 개선 또는 제거하거나, (iii) 본원에 기재된 특정 질환, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발증을 지연시키는 본 발명의 결합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 세포의 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "예방하는" 또는 "예방"은 적어도 질환 또는 장애에 걸릴 위험의 가능성(또는 감수성)을 감소시키는 것(즉, 질환에 노출되거나 질환에 걸릴 수 있지만 아직 질환의 증상을 경험하거나 나타내지 않은 개체에게 질환의 임상 증상 중 적어도 하나를 발증시키지 않는 것)을 지칭한다. 이러한 환자를 식별하기 위한 생물학적 및 생리적 파라미터가 본원에 제공되고, 의사에게 널리 공지되어 있다.　
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 바와 같이 질환 또는 상태의 재발 또는 증상의 중증도를 예방 또는 감소시키거나 이의 진행을 억제 또는 최소화하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 예방뿐만 아니라 치료제로서 유용성을 갖는다.　
대상체의 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어에는 질환 또는 상태, 질환 또는 상태의 증상 또는 질환 또는 상태의 위험(또는 감수성)을 지연, 둔화, 안정화, 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 교정, 악화 경감, 개량, 개선 또는 영향을 미치는 목적이 포함된다. "치료"라는 용어는 본원에 기재된 바와 같이 감염성 질환, 암 또는 자가면역 질환 및 관련 질환의 치료 또는 개선에서 성공의 임의의 징후를 지칭하고, 여기에는 완화; 관해; 악화 속도의 감소; 질환의 중증도의 감소; 안정화; 증상의 감소 또는 개인에 의해 상태를 더 견딜 수 있게 하는 것; 변성 또는 쇠퇴 속도의 지연; 변성의 최종 시점의 쇠약을 경감하는 것 또는 대상체의 신체 또는 정신적 웰빙의 개선과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터가 포함된다.
또한, 본원에 기재된 방법은 감염성 질환, 암 또는 자가면역 질환에 대한 기존의 표준적 치료/요법과 조합하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다.　
본원에서 "대상체"는 바람직하게는 인간 대상체이다. 본 발명은 인간에게 적용되지만, 본 발명은 수의학 목적에도 유용하다. 본 발명은 소, 양, 말 및 가금류와 같은 가축 또는 농장 동물; 고양이 및 개와 같은 반려 동물; 및 동물원 동물에 유용하다. 본 발명에 따른 치료를 필요로 하는 개체와 관련하여 "대상체" 및 "개체"라는 용어는 호환 가능한 것으로 이해될 것이다.
조성물
본 발명의 결합 단백질, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 세포, 핵산, 벡터 또는 조성물(이하 "약제"라 함)을 약제학적 조성물의 형태로 투여하는 것은 임의의 편리한 수단에 의해 수행될 수 있다. 약제학적 조성물의 약제는 특정 사례에 의존하는 양으로 투여된 경우에 치료 활성을 나타내는 것으로 고려된다.　 예를 들면, 변화는 인간 또는 동물 및 선택된 약제에 따라 달라진다.　 광범위한 용량이 적용될 수 있다.　 예를 들면, 환자를 고려할 때, 용량당 약 0.01㎍ 내지 약 1mg의 약제가 투여될 수 있다.　 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 용량 섭생을 조정할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 분할 용량을 매일, 매주, 매월 또는 기타 적절한 시간 간격으로 투여하거나, 상황의 긴급성에 따라 지시된 바와 같이 용량을 비례적으로 감소시킬 수 있다.　 또 다른 예에서, 상기 조성물은 관용을 유도하기 위해 초기에 투여되고, 이어서, 필요한 경우, 관용을 유지하기 위해 상기 조성물의 부스터 투여가 실시된다.　 이러한 부스터는, 예를 들면, 매월 투여될 수 있고, 환자의 수명을 포함하여 임의의 기간 동안 투여될 수 있다.
상기 약제는 경구, 정맥내(수용성인 경우), 복강내, 근육내, 피하, 피내(종래의 니들 또는 기타 경피 전달 장치를 사용하거나 사용하지 않고), 경피, 비강내, 설하 또는 좌약 경로 또는 이식(예: 서방형 분자의 사용)과 같은 편리한 방식으로 투여할 수 있다.　 바람직하게는, 상기 조성물은 피내로 투여된다. 약제는 산 부가염 또는 금속 복합체, 예를 들면, 아연, 철 등과의 금속 복합체와 같은 약제학적으로 허용되는 무독성 염의 형태로 투여될 수 있다(이는 본 출원의 목적상 염으로 간주됨). 이러한 산 부가 염의 예는 염산염, 브롬화수소염, 설페이트, 포스페이트, 말레에이트, 아세테이트, 시트레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 말레이트, 아스코르베이트, 타르트레이트 등이다.　 활성 성분을 정제 형태로 투여하는 경우, 정제에는 트라가칸트, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 알긴산과 같은 붕해제; 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제가 함유될 수 있다. 투여용의 펩티드의 맥락에서, 상기 펩티드를 포함하는 조성물은 리포좀의 형태이거나, 나노입자에 접합된 형태일 수 있다. 당업자는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 펩티드를 제형화하기 위한 표준 기술에 친숙할 것이다.　
주사용에 적합한 약제학적 형태에는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액을 일시적으로 제조하기 위한 멸균 분말이 포함되고, 국소 적용에 적합한 크림 또는 기타 형태로 존재할 수 있다.　 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다.　 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다.　 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다.　 강장 조정제는 조제물을 인체 혈장과 등장성으로 유지하여 조직 손상을 회피하는 데 유용하다. 일반적으로, 사용되는 강장제에는 덱스트로스, 트레할로스, 글리세린 및 만니톨 등이 포함된다. 글리세롤 및 염화나트륨도 다른 옵션이지만, 덜 일반적으로 사용된다.　 대부분의 경우, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직하다.　 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 약제를 조성물에 사용함으로써 주사 가능한 조성물의 흡수가 연장될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 상기 열거된 다양한 다른 성분과 혼입한 후 여과 멸균하여 제조한다.　 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매체 및 상기 열거된 성분으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 용매에 다양한 멸균 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 　멸균 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 기술이고, 이는 활성 성분의 분말과 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 원하는 추가 성분을 산출한다.
활성 성분이 적절하게 보호된 경우, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 흡수 가능한 식용 담체와 함께 경구 투여하거나, 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐로 밀봉(enclosed)하거나, 정제로 압축하거나, 식이 식품에 직접 혼입할 수 있다.　 경구 치료 투여의 경우, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되어 섭취 가능한 정제, 협측 정제, 트로치, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.　 이러한 조성물 및 조제물은 적어도 1중량%의 활성 화합물을 함유해야 한다.　 물론, 조성물 및 조제물의 비율은 다양할 수 있고, 편의상 단위 중량의 약 5 내지 약 80중량%일 수 있다.　 이러한 치료학적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물의 양은 적절한 용량이 수득될 수 있도록 하는 양이다.　 본 발명에 따른 바람직한 조성물 또는 조제물은 경구 투여 단위 형태가 약 0.1㎍ 내지 1000㎍의 활성 화합물을 함유하도록 제조된다.
정제, 트로치, 환제, 캡슐 등은 또한 이하에 열거된 성분을 함유할 수 있다: 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제; 및 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미료 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리 향료와 같은 향료가 첨가될 수 있다.　 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다.　 다양한 다른 물질이 코팅으로서 존재하거나, 투여 단위의 물리적 형태를 변형하기 위해 존재할 수 있다.　 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐은 셸락, 당 또는 이들 둘 다로 코팅될 수 있다.　 시럽 또는 엘릭서에는 활성 화합물, 감미료로서 수크로스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료, 체리 또는 오렌지 향료와 같은 향료가 함유될 수 있다.　 물론, 임의의 투여 단위 형태의 제조에 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수하고 사용된 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다.　 또한, 활성 화합물(들)은 서방형 제제 및 제형에 혼입될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 표적 세포를 감염시킬 수 있는 벡터와 같은 유전 분자를 포함할 수 있고, 벡터는 조절제를 코딩하는 핵산 분자를 담지한다.　 예를 들면, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다.
투여 경로는 호흡기(예: 비강내 또는 에어로졸을 통한 경구), 기관내, 비인두, 정맥내, 복강내, 피하, 두개내, 피내, 경피, 근육내, 안구내, 경막내, 뇌내, 비강내, 주입, 경구, 직장내, IV 드립 패치를 통해, 이식 및 설하를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.　 바람직하게는, 상기 투여 경로는 정맥내, 피하, 피내, 경피 또는 비강내, 보다 바람직하게는 정맥내이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 임의의 방법에서 사용되는 경우, 전술한 바와 같은 조성물에 관한 것이다.
실시예
본원에 기재된 관찰 이전에, 세포간 디설파이드 결합은 면역학에서 또는 본 발명자들이 아는 한 생물학에서 기재되어 있지 않았다. 세포간 환경이 상이한 세포의 표면에 발현된 단백질 사이의 디설파이드 결합의 형성에 도움이 되는지 여부는 불분명했다. T 세포 및 항원-제시 세포(APC) 사이의 면역학적 시냅스가 T 세포의 TCR과 APC의 펩티드-MHC 리간드 사이의 디설파이드 결합 형성에 도움이 되는지 여부도 불분명했다. 이러한 디설파이드 결합 형성에 TCR 또는 펩티드의 구조적 재배열이 필요한지 여부는 불분명했다.
TCR-pMHC 상호작용의 친화성 및/또는 수명을 초생리학적 범위로 증가시킨 결과는 의아한 결과를 생성했다. 펩티드-MHC 리간드에 대한 초생리학적 친화성 및 수명을 갖는 일부 조작된 TCR은 최적 이하의 T 세포 활성화를 유도했다. 이러한 결과를 설명하기 위해, TCR-pMHC 복합체는 제한된 시간 동안만 신호를 전달할 수 있고, 항원 감수성은 pMHC를 반복적으로 결합 해제하고 재결합하는 중간-친화성 TCR("연속 결합"으로 기재됨)에 의해 최적화된다는 가설을 세웠다. 디설파이드 결합 형성은 TCR과 pMHC 사이의 "연속 결합"을 방해할 것으로 예상되기 때문에, T 세포 활성화와 양립할 수 없다.
T 세포 활성화에서 TCR과 pMHC 사이의 "연속 결합"에 대한 요건과 일치하여, 사전 형성된 TCR-pMHC 복합체의 인공 가교는 T 세포 활성화를 폐지하는 것으로 밝혀졌다.　
건강한 인간 및 마우스의 성숙 T 세포에서, 아미노산 시스테인은 상보성-결정 영역 3(CDR3)이라고 하는 TCRα 또는 TCRβ 펩티드-결합 부위에 거의 존재하지 않는다. 본 발명자(들)는 이러한 T 세포가 항원-제시 세포와의 장기간 상호작용의 결과로서 흉선에서 발달 중에 선택적으로 제거된다는 가설을 세웠다. 이러한 장기간의 상호작용은 MHC 분자에 의해 제시된 자가-펩티드의 시스테인과 디설파이드 결합을 형성하는 TCR CDR3 중의 시스테인의 직접적 결과이다. 모든 데이터는 이 가설과 일치한다.
실시예 1 - TCR과 펩티드 사이의 디설파이드 결합 형성을 예측하는 방법
TCR-펩티드/MHC 또는 TCR-펩티드/HLA 구조를 단백질 데이터 뱅크(www.rcsb.org)로부터 다운로드하고, Coot 소프트웨어로 분석했다. TCR-펩티드 계면은 TCR CDR3 루프와 펩티드 사이의 밀접한 접촉에 대해 분석했다. TCR과 펩티드 사이의 근접 잔기 쌍을 인 실리코에서 Cys로 돌연변이시켰다. β 탄소 원자의 위치를 변경하지 않고서, 각 Cys 잔기의 회전이성체(배향)를 편집하여 황(S) 원자가 서로 마주보도록 했다. Cys-Cys 쌍에서 황(S) 원자 사이의 원자간 거리는 다음과 같다:
· ≥4 옹스트롬(Å) 또는 서로 충돌하는 S 원자는 디설파이드 결합을 형성할 가능성이 낮은 것으로 분류되었고; 이러한 잔기는 표 3 및 4에서 굵은 글씨가 아닌 문자로 표시되어 있고;
· >3 및 ≤4Å은 TCR 및/또는 펩티드에서 인접 잔기의 일부 이동에 의해 디설파이드 결합을 형성할 수 있음을 나타내고, "낮은 신뢰도"로 분류되었고; 이러한 잔기는 표 3 및 4에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시되어 있고;　
· 0.01 내지 3.0Å는 "높은 신뢰도"로 디설파이드 결합을 형성할 가능성이 높은 것으로 분류되었고; 이러한 잔기는 표 3 및 4에서 굵은 글씨(밑줄 없음)로 표시되어 있다.
또한, S 원자 사이의 각도도 중요하다. S-S 결합에 대해 2β 탄소 원자에 의해 형성된 최적 각도는 90° 또는 -90°에 근접해야 한다. 관찰된 각도가 이러한 최적 각도로부터 >30°떨어져 있는 경우, 구조적 재배열 없이 디설파이드 결합이 형성되지 않을 가능성이 높으며; 이러한 잔기는 표 3 및 4에서 굵은 글씨가 아닌 문자로 표시되어 있다.
펩티드 잔기는 (i) MHC 틈새에 매립되어 있거나 (ii) 프롤린인 경우에 인 실리코에서 Cys로 돌연변이되지 않았다. CDR3 잔기는 치환되는 잔기가 Pro 또는 Gly인 경우에 "높은 신뢰도"로 디설파이드 결합을 형성할 가능성이 낮은 것으로 간주되었다.
이러한 분석 결과는 MHC 클래스 I의 경우 표 3에 제시되어 있고, MHC 클래스 II의 경우 표 4에 제시되어 있다. 시스테인으로 치환될 경우, MHC/HLA에 결합된 펩티드에서 대응하는 또는 페어링된 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 가능성이 높은 TCRα 또는 TCRβ의 CDR3 내의 잔기 위치의 개요는 MHCI/HLAI의 경우 도 11에 제시되어 있고, MHCII/HLAII의 경우 도 12에 제시되어 있다.
실시예 2 - 자가면역 질환에서 TCR-Treg 요법을 위한 자가 펩티드/MHC 클래스 II 표적의 동정
자가면역 질환에서 자가-항원 및 고-위험 MHC 클래스 II 대립유전자의 목록이 작성되었다. 하기 예에서, 유형 I 당뇨병, 다발성 경화증(MS) 및 류마티스 관절염의 자가-항원을 Ross KA로부터 취득했다[참조: PLoS One 2014; 9: e101093 and Pianta A et al. J Clin Invest 2017; 127: 2946-56]. 자가-항원 단백질 서열을 수득했다(https://asia.ensembl.org/Homo_sapiens).
자가-항원 단백질 서열로부터 유래된 각 가능한 15-머 펩티드는 NetMHCIIpan(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2)을 사용하여 관련 고-위험 MHC 클래스 II 대립유전자에 대한 결합 친화성을 평가했다.
하기 표는 하기 펩티드를 나타낸다:
a. 잠재적으로 TCR-노출된 위치(P-1, P2, P3, P5, P7 또는 P8)에 Cys를 갖고, 여기서 "P-1"은 P1 위치에 대한 하나의 위치 N-말단을 의미하고,
b. NetMHCIIpan에 의해 평가된 바와 같이, 200,000개의 랜덤 펩티드 중 90% 초과의 MHCII에 대한 예측 결합 친화성을 갖는다.
[표 1]
자가면역 질환의 치료를 위한 자가-펩티드/MHCII 표적:
실시예 3 - 암에서 TCR-T 세포 요법을 위한 자가-펩티드/MHC 클래스 I 표적의 동정　
CTL에 의해 표적화되는 시스테인을 함유하는 자연 발생 암 관련 펩티드는 TANTIGEN 2.0: 종양 T-세포 항원 데이터베이스(http://projects.met-hilab.org/tadb/)를 사용하여 검색했다. "공유 종양 특이적 항원"으로 분류되고 HLA 클래스 I 분자에 의해 제시되는 148개의 펩티드 항원 중에서, 6개 펩티드는 (i) 위치 4, 5, 6, 7 또는 8에 시스테인을 갖고, (ii) CTL 클론의 항원 표적으로서 검증되는 기준을 충족하는 것으로 판명되었다. 이러한 펩티드는 하기 표에서 발견할 수 있다:
[표 2]
시스테인을 함유하고 CTL에 의해 표적화된 암-고환 펩티드 항원
이러한 펩티드에 특이적인 TCR은 시스테인을 도입하도록 조작할 수 있고, CTL의 TCR과 인간 암 세포 상에 발현된 펩티드-HLA 복합체 사이에 디설파이드 결합을 형성함으로써 CTL 활성을 부스팅할 수 있다.　
실시예 4 - 모델 TCR-펩티드 디설파이드 결합을 형성하기 위해 사용되는 TCR 및 펩티드 서열
재료 및 방법
뮤린 6218 TCR은 H2-Db[참조: Day E. B. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2011; doi: 10.1073/pnas.1106851108]에 의해 제시된 인플루엔자 폴리머라제 산성(PA) 펩티드(SSLENFRAYV)에 결합한다. TCR-pMHC 구조[참조: Day E. B. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2011]에 기초하여, 본 발명자들은 CDR3α의 중간 위치(정점)에 Ser 대신 Cys를 갖는 6218 TCR의 변이체(6218αC)가 위치 4에 시스테인을 갖는 PA 펩티드의 변이체(PA4C)와 디설파이드 결합을 형성할 것으로 예측했다. 본 발명자들은 또한 CDR3β의 정점에 Gly 대신 Cys를 갖는 6218 TCR의 변이체(6218βC)와 위치 7에서 Arg가 Lys(K), Ala(A) 또는 Leu(L)로 치환된 PA 및 PA4C 펩티드의 변이체로 실험을 수행했다(도 1).　
실시예 5 - X-선 결정학을 사용한 디설파이드 결합 형성의 확인.
재료 및 방법
TCR 및 펩티드/MHC(pMHC) 분자를 합성하기 위해, 6218 TCR의 마우스 가변 도메인[참조: Day E. B. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2011] 및 인간 불변 도메인을 코딩하는 박테리아 발현에 최적화된 DNA 단편을 pET30 발현 벡터(Genscript)에 클로닝했다. 또한, 6218αC TCR은 Ser110α을 Cys110α으로 치환하여 유사하게 클로닝했다. 6218 TCRα, 6218 TCRβ 및 6218αC TCRα 쇄를 BL21 이. 콜라이 세포에서 봉입체로서 개별적으로 발현시켰다. 기능성 및 가용성 TCR은 기재된 바와 같이 등량의 α- 및 β-쇄를 3일 동안 재폴딩함으로써 생산하고[참조: Day E. B. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2011], 이어서 10mM Tris-HCl(pH 8.0)에 투석했다. 재폴딩된 TCR은 음이온 교환 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제했다. BirA-기질 펩티드에 융합된 인간 β2m 및 H2-Db 중쇄(잔기 1-274)를 BL21 이. 콜라이 세포에서 별도로 발현시키고, 봉입체로서 추출했다. 이러한 봉입체(30mg H2-Db 및 10mg β2m)를 4mg의 PA 펩티드(SSLENFRAYV) 또는 변형 펩티드(Genscript)로 3시간 동안 재폴딩했다. 폴딩된 pMHC 복합체를 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제했다.　　　　　
X-선 결정학을 수행하기 위해, 결정 스크린은 10mM Tris-HCl(pH 8), 150mM NaCl 중의 3mg/mL의 농도로 단백질:저장소 적하 비율 1:1로 20℃에서 시팅-드롭(sitting-drop), 증기 확산을 통해 설정했다. 6218-PA/H2-Db, 6218-PA4C/H2-Db 및 6218αC-PA4C/H2-Db 복합체의 결정은 20%(w/v) PEG3350, 0.2M NaF, 0.05M NaFormate 및 3%(w/v) 1,5-디아미노펜탄 디하이드로클로라이드에서 성장시켰다. PA4C와 복합체를 형성한 H2-Db의 결정은 20%(w/v) PEG2000, 0.1M KSCN 및 2%(w/v) 2-메틸-2,4-펜탄디올에서 3mg/mL로 성장시켰다. 모든 결정은 PEG3350 농도를 30%(w/v)까지 증가시킨 모액 용액을 함유하는 동결보호제 용액에 침적시키고, 이어서 액체 질소에서 급속-냉동했다. 데이터는 호주 ANSTO의 일부인 호주 싱크로트론(Australian Synchrotron)에서 MX2 빔라인으로 AS GUI를 사용하여 수집했다[참조: Aragao D. et al, J Synchrotron Radiat, 2018; doi: 10.1107/S1600577518003120]. 데이터는 XDS(BUILT=20161205)를 사용하여 처리했다[참조: Kabsch W, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010; doi: 10.1107/S0907444909047337]. 데이터는 CCP4 쉬트(버전 7.0.077)로부터의 포인트레스 및 에임레스(Pointless and Aimless) 프로그램[참조: Evans P.R., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011; doi: 10.1107/S090744491003982X]을 사용하여 스케일링 및 감소시켰다. 구조는 CCP4 쉬트(1994)(버전 7.0.077)로부터의 PHASER 프로그램(버전 2.8.3)[참조: McCoy A. J., J Appl Crystallogr 2007; doi: 10.1107/S0021889807021206]을 사용하여 PDB ID: 3PQY로부터 유래된 펩티드를 제외한 모델 H2-Db로 분자 치환에 의해 결정했다. 수동 모델 구축은 COOT(버전 0.8.9.2)를 사용하여 수행했고[참조: Emsley P, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010; doi: 10.1107/S0907444910007493], 이어서 BUSTER(버전 2.10.3)로 개량했다[참조: Smart O. S. et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2012; doi: 10.1107/S0907444911056058]. 모든 분자 그래픽 표현은 PyMOL을 사용하여 작성되었다.
결과
6218 TCR-PA/H2-Db, 6218 TCR-PA4C/H2-Db 및 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체의 중첩은 유사한 결합 모드를 나타냈다(도 2A-C, G). 본 발명자들은 6218αC TCR의 유리 Cys 및 PA4C 펩티드의 P4-Cys 사이의 디설파이드 결합을 관찰했다(도 2F). 이 디설파이드 결합은 펩티드, CDR3 또는 TCR 쇄의 도킹 토폴로지의 구조적 재배열 없이도 형성된다(도 2A-G). 디설파이드 결합 내의 P4-Cys 회전이성체(도 2F)는 비결합 PA4C/H2-Db 구조(도 2B) 및 6218 TCR-PA4C/H2-Db 복합체(도 2E)에서 관찰된 P4-Cys 회전이성체와 구별되었고, 이는 디설파이드 결합 형성이 발생할 때까지 일부 6218αC TCR이 용액에서 PA4C/H2-Db 단량체와 결합 및 방출되는 이유를 설명할 수 있는 잠재적 설명을 제공한다(하기 참조).
실시예 6 - 디설파이드 결합 형성은 펩티드 항원에 대한 T-세포의 감수성을 증가시킨다.　　
재료 및 방법
내인성 TCRβ 쇄를 결여하는 5KC-73.8.20(5KC) 세포[참조: White J. et al., J Exp Med, 1993; doi: 10.1084/jem.177.1.119]를 CD4의 손실에 대해 선별하여 CD4- CD8- 세포주를 확립하고, 10% 태아 송아지 혈청(Gibco, Amarillo, TX, 카탈로그 번호 10437028), 2mM L-글루타민(Gibco, 카탈로그 번호 25030149), 1mM 나트륨 피루베이트(Gibco, 카탈로그 번호 11360070), 100μM 비필수 아미노산(Gibco, 카탈로그 번호 11140050), 5mM HEPES 완충액(Gibco, 카탈로그 번호 15630080), 55μM 2-머캅토에탄올(Gibco, 카탈로그 번호 21985023), 100유닛/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신(Gibco, 카탈로그 번호 15140122)(cDMEM)을 보충한 둘베코 변형된 이글 배지에서 유지했다. 5KC 세포를 마우스 CD8αβ, 및 pMIGII 레트로바이러스 벡터에 코딩된 6218 또는 6218αC TCR을 발현하도록 형질도입하고, CDαβ 및 TCRβ의 동등한 발현에 대해 선별했다. 5×104 형질도입된 5KC 세포를 105 DC2.4 마우스 수지상 세포[참조: Shen Z. et al., The Journal of Immunology 158, 2723-2730 (1997)]와 함께 등급화된 농도의 펩티드 또는 항-CD3(플레이트에 밤새 사전 결합된 10μg/mL)의 부재 또는 존재하에 16시간 동안 인큐베이팅했다. 상청액을 수집하고, BD OptEIA 마우스 IL-2 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 키트를 사용하여 IL-2 농도를 검정했다.　 EC50 및 힐슬로프(h) 값은 그래프패드 프리즘에서 비선형 회귀(4-파라미터 용량-반응 곡선)를 사용하여 측정했다.
결과
펩티드 항원에 대한 T-세포 감수성의 증가는 6218αC TCR로 형질도입된 세포에서 관찰되었다. 6218αC TCR을 발현하는 세포에서 절반-최대 반응(EC50)을 유도하기 위해 1nM의 PA4C가 필요했지만, 6218 TCR 세포에서 유사한 반응을 유도하기 위해서는 49nM이 필요했으며; 6218αC TCR을 발현하는 세포에서는 용량-반응 곡선도 더 큰 h 값으로 입증되는 바와 같이 더욱 급구배였다(도 3).
실시예 7 - 정제된 TCR 및 펩티드/MHC 단백질 사이의 디설파이드 결합의 검정.
재료 및 방법
표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정을 수행하기 위해, 각 가용성 TCR은 아민 커플링을 통해 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 6218αC TCR은 디설파이드-결합된 호모이량체를 형성했고, 이는 10μL/min으로 1mM DTT의 10분간 주사를 사용하여 TCR 이량체화를 제거하지 않는 한 PA/H2-Db 또는 PA4C/H2-Db에 결합하지 않았다. 이어서, DTT-처리된 유동 세포를 실행 완충액에서 3시간 동안 평형화하여 안정된 기준선에 도달하도록 했다. PA/H2-Db 또는 PA4C/H2-Db를, 1:3 희석을 사용하여 농도(1.5μM, 4.4μM, 13.3μM, 40μM 및 120μM)를 증가시켜 일련의 1분간 주사로 TCR 상에 유동시켰다. PA4C/H2-Db 및 6218αC TCR에 대한 해리의 유도를 입증하기 위해, PA4C/H2-Db 샘플을 4℃에서 밤새 2mM DTT로 처리한 후, DTT 부재하에 실행 완충액으로 희석했다. 보다 긴 pMHC 주사 시간을 수반하는 검정에서, 음성 대조군 pMHC(인플루엔자 바이러스 NP265-274/HLA-A*03) 및 양성 대조군 pMHC(PA/H2-Db)의 1분간 연속 주사를 5분 또는 20분간의 PA4C/H2-Db 단량체 주사 전에 수행하고; 이들 검정에서 모든 pMHC 단량체의 농도는 100μM이었다.　 1분 초과의 pMHC 주사 시간을 수반하는 검정의 경우, 센서 칩 사이에 고정화된 6218αC TCR의 양의 차이를 설명하기 위해, 본 발명자들은 공식 K D = [6218αC] × [PA/H2-Db] / [6218αC-PA/H2-Db]을 사용하여 반응 단위(RU)를 정규화했다. K D = 64.1μM 및 [PA/H2-Db] = 100μM이므로, "정규화된 RU" 값 = 1(추정 6218αC TCR 점유율 100%에 상당)은 PA/H2-Db 양성 대조군이 6218αC TCR에 유동할 때에 평형 상태에서 검출된 RU의 1.641×로 설정되었다. 실험은 비특이적 결합을 회피하기 위해 10mM Tris-HCl(pH 8), 150mM NaCl, 소 혈청 알부민 0.1%를 함유하는 0.005% 계면활성제 P20을 사용하여 BIAcore T100 기기로 25℃에서 수행했다. 데이터는 BIAevaluation 3.0을 사용하여 내보냈고, 데이터 포인트는 Prism 버전 9(GraphPad Software, La Jolla California USA)를 사용하여 분석했다.
결과
PA4C/H2-Db는 결합 상 중에 6218 및 6218αC TCR과 유사하게 결합했지만, pMHC와 TCR의 해리는 영향을 받았다. 6218αC TCR의 센서그램은 PA4C/H2-Db의 주사 후에 기준선으로 복귀하지 않았고, 이는 6218αC TCR을 PA4C/H2-Db에 단시간 노출시키면, 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체의 상이한 단수명 및 장수명 서브집단이 생성되었음을 시사한다(도 4A). 디설파이드 결합 형성을 억제하는 환원제인 디티오트레이톨(DTT)의 첨가는 PA4C/H2-Db 주사 종료 후에 6218αC TCR 센서그램을 기준선으로 복귀시키고, 이는 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체의 장수명 하위집단이 디설파이드 결합 형성에 의존한다는 것을 입증했다(도 4B). 주사 시간을 1분에서 5분 또는 20분으로 증가시키면, PA4C/H2-Db 주사 종료 후에도 지속되는 결합의 비율이 증가했다(도 4C). 장수명의 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체는 1시간 동안 지속되는 반면(도 4A), 단수명의 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체의 반감기는 1초 미만이었다(도 4D).　 단수명의 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체는 수초 내에 반전하는 반면, 장수명의 복합체는 수분 단위로 축적되었기 때문에, 6218αC TCR과 PA4C/H2-Db 사이의 대부분의 회합은 디설파이드 결합 형성을 초래하지 않았다. 이러한 데이터는 디설파이드 결합 형성에 의해 공유 결합된 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체가 지속할 수 있을 때까지 6218αC TCR과 PA4C/H2-Db 사이에서 발생하는 가역적 상호작용과 일치한다.　
실시예 8 - CDR3 내의 노출된 시스테인은 흉선에서 역치 이상의 TCR 신호전달 및 T-세포 관용 유도를 촉진한다.
재료 및 방법
"절단 가능한" P2A 펩티드에 의해 분리된 6218 TCRα 및 TCRβ 유전자를 코딩하는 DNA를 합성했다(Genscript Biotech Corporation, Piscataway, NJ). Cys-코딩 코돈은 PCR 돌연변이유발을 사용하여 CDR3α(Ser110α을 Cys110α으로 치환) 또는 CDR3β(Gly109β을 Cys109β로 치환) 서열에 도입했다. DNA 작제물은 내부 리보솜 진입 부위의 조절하에 GFP를 코딩하는 pMSCV-IRES-GFP II(pMIGII) 벡터에 클로닝했다[참조: Holst J. et al., Nat Protoc, 2006; doi: 10.1038/nprot.2006.61]. Rag1 -/- BM 세포는 기재된 바와 같이 시험관내에서 레트로바이러스로 형질도입시켰다[참조: Holst J. et al., Nat Protoc, 2006]. C57BL/6(B6) 마우스로부터의 BM 세포는 마우스 CD3ε 마이크로비드(MicroBead) 키트(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany, 카탈로그 번호 130-094-973) 및 autoMACS 기계(Miltenyi)를 사용하여 T 세포를 고갈시켰다. 레트로바이러스에 노출된 Rag1 -/- 　BM 세포 및 T 세포-고갈된 B6 BM 세포를 1:1로 혼합한 후, 1일 전에 x-선을 조사(4시간 간격으로 제공된 5 Gy의 2회 선량)한 Rag1 -/- 　수용자당 2×106 초과의 세포를 정맥내 주사했다. TCR-레트로제닉 마우스를 BM 전달의 37일 후에 분석했다.
TCR-레트로제닉 마우스의 분석을 위해, 흉선, 비장 또는 소장 샘플의 단일-세포 현탁액을 제조했다. CCR7+ 세포를 검출하기 위해, 단일-세포 흉선세포 현탁액은 피코에리트린(PE)-접합 항-CCR7(BioLegend, San Diego, CA, 카탈로그 번호 120105)을 함유한 사전-예열된 FACS 완충액(2% v/v 열-불활성화 소 혈청 및 0.01% m/v 나트륨 아지드를 함유하는 PBS)에서 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅했다. 달리는 또는 추가로, 세포를 다양한 항-마우스 항체의 조합을 함유하는 FACS 완충액에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅했다: 브릴리언트 바이올렛 510 항-TCRβ(BioLegend, 카탈로그 번호 109233), 알렉사 플루오르 700 항-CD4(BioLegend, 카탈로그 번호 100430), APC/Fire 항-CD8α(BioLegend, 카탈로그 번호 100766), PE/Cy7 항-CD8β.2(BioLegend, 카탈로그 번호 140416), VioBlue 항-CD45(Miltenyi, 카탈로그 번호 130-102-430) 및 요오드화프로피듐 용액(BioLegend, 카탈로그 번호 421301). 이어서, 샘플을 FACS 완충액으로 세척하고, LSRFortessa X-20 유세포 분석기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 분석했다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어(FlowJo LLC, Ashland, Oregon)를 사용하여 분석했다.
결과
GFP+ 흉선세포 빈도는 발달의 미성숙 CCR7- 단계를 포함하는 6218αC 및 6218βC 그룹에서 현저히 낮았다(도 5A). 6218 TCR은 CCR7의 높은 발현을 특징으로 하는 나이브 T 세포의 효율적 흉선 분화를 유도했지만, 6218αC 및 6218βC TCR은 그렇지 않았다(도 5A). 비장에서, 종래 CD8+ T 세포의 특징인 CD8αβ를 발현하는 GFP+ TCRβ+ 세포의 수는 6218 그룹에서 가장 높았다(도 5B). 그러나, 장내 CD8αα 상피내 림프구(IEL) 집단은 6218αC 및 6218βC 그룹에서 더 많았다(도 5C). 흉선세포 결실의 유도 및 CD8αα IEL 분화는 6218αC 및 6218βC TCR이 6218 TCR보다 더 강력한 TCR 신호전달을 유도했다는 것을 나타낸다.　
실시예 9 - CDR3 내의 노출된 시스테인은 흉선 내의 발달 T 세포의 풍부도 및 분포에 영향을 미친다.
재료 및 방법
TCR-레트로제닉 마우스의 흉선 샘플을 50% 에탄올/5% 아세트산/45% 물에 10분간 침지한 후, 10% 중성 완충 포르말린에 밤새 옮겼다. 이어서, 고정 샘플은, 파라플라스트 왁스(P3558, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에 임베딩(embedding)하고 RM2235 마이크로톰(Leica)을 사용하여 4μm의 두께로 슈퍼프로스트 플러스 슬라이드에 절편화하기 전에, Peloris II 조직 프로세서(Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 4시간 사이클의 등급화된 에탄올 및 자일렌에 노출시켰다. 1차 항체, 치킨 항-GFP(ab13970, Abcam, Cambridge, UK) 및 래빗 항-사이토케라틴 14(K14)(ab197893, Abcam)는 200분의 1로 희석하여 사용했고; 2차 항체, 염소 항-치킨 IgY A647(ab150175, Abcam) 및 당나귀 항-래빗 IgG A488(711-545-152, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)은 500분의 1로 희석하여 사용했다. 염색은 Autostainer Link 48(Dako, Glostrup, Denmark)을 사용하여 하기 인큐베이션으로 수행했으며, 각각은 세척 완충액(K8007, Agilent, Santa Clara, CA)에서 5분간 1회 또는 2회의 인큐베이션에 의해 산재시켰다: 98℃에서 30분 동안 표적 회복 용액 S1699(Agilent), 실온(RT)에서 60분 동안 단백질 블록 X0909(Agilent), RT에서 60분 동안 1차 항체, RT에서 60분 동안 2차 항체, RT에서 15분 동안 DAPI. 이미지화는 0.75 NA의 UPLS APO 20× 렌즈를 갖는 올림푸스 VS120 가상 슬라이드 현미경으로 수행되었고, 올림푸스 XM10 디지털 카메라로 촬영되었다. DAPI/FITC/CY5 필터 세트를 모든 섹션에 동일한 노출 설정으로 사용했다. GFP+ 세포 밀도는 피질을 K14- 영역으로 정의하고 수질을 K14+ 영역으로 정의하여 Fiji[참조: J. Schindelin J. et al., Nat Methods, 2012; doi: 10.1038/nmeth.2019]를 사용하여 측정했다. 이미지는 cellSens Dimension 버전 4.1 소프트웨어(Olympus Corporation, Tokyo, Japan)를 사용하여 생성되었다.
결과
6218 TCR을 발현하는 GFP+ 흉선세포는 흉선의 피질과 수질에 있었고, 이는 나이브 T 세포 분화 중에 피질에서 수질로의 예상된 이동을 반영한다(도 6). 이에 비해, 6218αC를 발현하는 GFP+ 　흉선세포는 흉선 절편의 피질 및 수질 영역에서 더 적게 검출되었고, 이는 발달의 중지, 변경 또는 정지와 일치한다(도 6).
실시예 10 - 펩티드의 P7에서의 치환은 시스테인 잔기와 관계없이 TCR이 pMHC 사량체에 결합할 확률에 영향을 미친다.
재료 및 방법
TCR 형질감염체를 제조하기 위해, cDMEM에서 유지된 293T(인간 배아 신장 세포주) 세포를 FuGENE 6 형질감염 시약(Promega Corporation, 카탈로그 번호 E2691) 및 GFP를 코딩하는 2개의 pMIG II 플라스미드와 혼합했다. 하나의 플라스미드에는 2A 펩티드에 의해 분리된 마우스 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ을 코딩하는 DNA 서열이 함유되어 있었다. 또 다른 플라스미드에는 2A 펩티드를 코딩하는 DNA에 의해 분리된 6218 또는 6218αC TCR의 TCRα 및 TCRβ 쇄를 코딩하는 DNA 서열이 함유되어 있었다. 형질감염 48시간 후, TCR 형질감염체를 PE-접합된 pMHC 사량체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 세포를 세척하고, APC 항-TCRβ(BioLegend, 카탈로그 번호 109212) 및 LIVE/DEAD Fixable Aqua 사멸 세포 염색(Thermofisher, Waltham, MA, 카탈로그 번호 L34957)으로 30분간 인큐베이팅하고, 이어서 유세포 분석 전에 세척했다. pMHC 사량체를 제조하기 위해, 상기 기재된 펩티드 변이체로 제조한 pMHC 분자는 D-비오틴(Astral Scientific, Sydney, Australia, 카탈로그 번호 BIOBB0078)을 첨가한 BirA 비오틴 리가제를 사용하여 비오틴화하고, 4:1 몰 비율로 PE-스트렙트아비딘(BioLegend, 카탈로그 번호 405204)을 첨가하여 사량체화했다. BirA 비오틴 리가제를 코딩하는 DNA는 His-tag를 갖는 pcDNA3.1 발현 벡터(Genscript Biotech)에 클로닝하고, 단백질을 BL21 이. 콜라이 세포에서 발현시키고, 이어서 Ni-NTA 아가로스 비드(Machery-Nagel, Duren, Germany, 카탈로그 번호 745400.100)를 사용하여 정제했다.
결과
세포-기반 pMHC 사량체 결합 검정에서, PA4C 펩티드의 P7 치환은 검출 가능한 결합의 부재를 포함하여 결합 수준의 등급화를 초래했지만, 본 발명자들은 등급화의 각 단계에서 6218 및 6218αC TCR에 대해 유사한 결과를 수득했다(도 7).
실시예 11 - 펩티드의 P7에서의 치환은 시스테인 잔기에 관계없이 정제된 TCR과 pMHC 단백질 사이의 결합 확률에 영향을 미친다.
재료 및 방법
SPR 검정은 상기 기재된 바와 같이 pMHC 농도를 증가시키면서 일련의 1분간 주사를 사용하여 수행했다(최대 농도 120μM 또는 PA4C7L/H2-Db 및 PA7L/H2-Db의 경우, 최대 농도 240μM).　
결과
SPR 결과는 각 P7 치환이 6218 및 6218αC TCR 모두에 대한 결합을 감소시키는 것으로 나타났다(도 8).
실시예 12 - 디설파이드 결합 형성은 펩티드/MHC로부터 TCR의 해리를 방지한다.
재료 및 방법
고정화 TCR은 상기 기재된 바와 같이 SPR 검정을 위해 제조했다. 본 발명자들은 20분 또는 50분의 시험 pMHC 단량체[PA4C/H2-Db, PA4C7K/H2-Db, PA4C7A/H2-Db 또는 PA4C7L/H2-Db] 주사의 전에 음성 대조군 pMHC(인플루엔자 바이러스 NP265-274 /HLA-A*03) 및 양성 대조군 pMHC(PA/H2-Db)의 연속 1분간 주사를 수행하고, 이어서 완충액 주사를 수행했다. 모든 pMHC 단량체의 농도는 100μM였다. SPR 데이터는 상기 기재된 바와 같이 분석하고, "정규화된 RU"로 표시했다. 사량체 해리 검정의 경우, TCR 형질감염체를 RT에서 1시간 동안 5μg/mL pMHC 사량체로 염색하고, 이어서 25μg/mL 항-H2-Db/Kb(BD Biosciences, 클론 28-8-6, 카탈로그 번호 553575)로 10, 30 또는 60분 동안 세척 및 인큐베이팅하여 사량체 재결합을 방지하고, 이어서 유세포 분석 전에 세척하고 항-TCRβ-APC 및 LIVE/DEAD 염색으로 염색했다. 그래프는 항-H2-Db/Kb(시간 = 0분)를 포함하지 않는 대응하는 샘플의 백분율로서 사량체+ 세포 빈도를 나타낸다. 기호는 2회의 실험으로부터 수집된 조건당 4개 샘플 범위의 평균 및 에러 바를 나타낸다.
결과
확장된 SPR 주사 시간은 모든 P4-Cys-함유 pMHC 단량체 및 6218αC TCR 사이의 지속적 상호작용을 나타냈다(도 9A). 추가로, P4-Cys-함유 pMHC 사량체는 6218αC TCR을 발현하는 세포로부터 해리되지 않았다(도 9B). 따라서, P7 치환은 SPR 및 사량체 검정(도 7 및 8)에서 TCR이 pMHC에 결합하는 확률을 감소시켰지만, 모든 P4-Cys-함유 pMHC 분자와 6218αC TCR 사이에는 지속적 상호작용이 여전히 발생하여 디설파이드 결합 형성과 일치했다(도 9).　
실시예 13 - 디설파이드 결합 형성은 펩티드 항원에 대한 T 세포 감수성과 식별성 사이의 상충관계를 나타낸다.　　
재료 및 방법
5KC T 세포 및 DC2.4 마우스 수지상 세포를 사용한 T-세포 자극 검정은 PA4C, PA4C7K, PA4C7A, PA, PA7K 및 PA4C7L 펩티드를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행했다.　
결과
6218 TCR을 발현하는 세포는 P7 치환을 갖는 임의의 펩티드에 의해 활성화되지 않은 반면, 6218αC TCR을 발현하는 세포는 P4-Cys를 갖는 모든 펩티드에 의해 활성화되었다(도 10A). 따라서, 공유 항원 인식(도 3)과 비교하여 비공유에서 낮은 T-세포 감수성은 펩티드 항원의 우수한 식별성과 커플링되어 있다(도 10A). 그러나, P4-Cys-함유 펩티드에 대한 EC50 및 용량-반응 곡선(h)의 급구배가 사량체 및 SPR 검정에서 6218αC TCR에 결합할 확률의 계층과 대응했기 때문에 펩티드 식별성의 수준은 공유 항원 인식에서 유지되었다(도 7 및 8).　
따라서, 본 발명자들은 모델 TCR-pMHC 조합에 Cys 잔기를 도입하고 펩티드의 P7에 추가 치환을 수행함으로써 TCR과 pMHC 사이의 관찰된 결합이 생리학적 항바이러스 범위로부터 사량체 및 SPR 검정에서 검출 한계 이하로 변화하는 상호작용을 조사했다. Cys 잔기는 공유 결합된 TCR-pMHC 복합체의 해리를 방지하는 디설파이드 결합의 형성과 일치하여 TCR과 pMHC 사이의 지속적 결합을 가능하게 했다. 그러나, 결합 등급화의 각 단계에서, Cys 잔기는 세포-기반 사량체 검정에서 형광에 거의 영향을 미치지 않았거나 SPR 검정에서 K D 값에 거의 영향을 미치지 않았다(도 10B).
TCR이 pMHC에 결합하는 유사한 확률에 근거하여, 공배양 검정에서 약 1nM의 PA4C 펩티드는 6218 TCR 또는 6218αC TCR을 발현하는 세포에서 유사한 속도의 TCR-pMHC 복합체 형성을 유도할 것으로 예상할 수 있다. 6218 TCR을 발현하는 세포가 아닌 6218αC TCR을 발현하는 세포를 활성화하는 약 1nM의 PA4C 펩티드의 능력은 아마도 TCR-pMHC 복합체 형성 속도의 차이 때문이 아니라, TCR 신호전달 캐스케이드를 활성화하기에 충분히 오래 지속되는 공유 결합된 6218αC TCR-PA4C/H2-Db 복합체에 의해 설명될 수 있을 것이다. 그러나, 6218αC TCR을 발현하는 세포는 활성화되기 위해 >2nM의 PA4C7A 또는 PA4C7L 펩티드가 필요했다. 이는 6218αC TCR에 결합할 확률이 PA4C7A/H2-Db 및 PA4C7L/H2-Db의 경우 PA4C/H2-Db와 비교하여 낮은 것에 기인한다.　 낮은 pMHC 밀도에서, 비공유 항원 인식 중에 TCR-pMHC 상호작용의 수명이 제한 인자인 반면, 공유 항원 인식 중에 TCR이 pMHC에 결합하는 확률이 제한 인자였다.
실시예 14 - 시스테인-연결 T 세포 운명 왜곡에서 Zap70 및 MHC의 역할.
TCR 신호전달 단백질인 Zap70의 기능이 감쇠된 마우스에서, 정상적으로 결실된 흉선세포는 CD4+ 또는 CD8αβ+ T-conv 세포로 비정상적으로 발달한다. 이 발견을 설명하기 위해, 강력한 TCR 신호전달을 유도해야 하는 TCR-pMHC 상호작용은 돌연변이체 Zap70을 통한 신호 전달의 감쇠에 기인하여 약한 TCR 신호전달만을 유도하는 것으로 생각된다. Cys-함유 CDR3이 생체내에서 정상적으로 강력한 TCR 신호전달을 유도하는지 시험하기 위해, 본 발명자들은 Cys-함유 CDR3을 갖는 흉선세포가 Zap70mrd/mrt 마우스에서 T-conv 세포로 비정상적으로 발달한다는 증거를 찾았다. 본 발명자들은 6218, 6218αC 또는 6218βC TCR로 형질도입된 Zap70mrd/mrt BM 세포를 갖는 TCR-레트로제닉 마우스를 분석했다. 비장내에서 GFP+ TCRβ+ 세포의 수는, 상대적으로 낮았지만, 이러한 TCR이 Zap70mrd/mrt 세포에서 발현되는 경우에 유사했다(도 13A). 이러한 데이터는 Cys-함유 CDR3이 생체내에서 정상적으로 강력한 TCR 신호전달을 유도한다는 가설을 서포트한다.
상기 TCR-레트로제닉 실험은 CDR3의 Cys가 T 세포의 운명을 왜곡한다는 기능적 증거를 제공하지만, 이러한 실험은 모노클로날 T 세포 집단에 한정되었다. 이러한 발견을 일반화하기 위해, 본 발명자들은 TCR-pMHC 신호전달에 유전적 결함을 갖는 마우스를 포함하여 폴리클로날 T 세포 집단의 TCR 레퍼토리를 서열분석했다.　
재료 및 방법
전체 흉선 또는 비장 현탁액은 선별 완충액(2% v/v 열-불활성화 태아 송아지 혈청 및 2mM EDTA를 함유한 PBS)에 70μm 체에 기관을 통과시킴으로써 제조했다. 소장을 먼저 종방향으로 절단하고, 이어서 세척 배지(WM, 2.5% v/v 열-불활성화 소 혈청 및 10mM HEPES를 함유한 DMEM)로 습윤 상태로 유지하면서 약 0.5cm 길이의 조각으로 절단하고, 약 15mL 빙냉 WM을 함유하는 50mL 튜브에 넣었다. 장 내용물을 5초 동안 와동 사이클에 의해 제거하고, 이어서 스트레이너를 사용하여 장 조직을 유지하고 상청액이 투명해질 때까지 15mL WM에 재현탁함으로써 상청액을 제거했다.　
이어서, 조직 조각을 37℃에서 15분 동안 해리 완충액(5% v/v 열 불활성화 소 혈청 및 2mM EDTA를 함유하는 칼슘- 및 마그네슘-비함유 PBS)에서 온화하게 회전시키면서 인큐베이팅했다. 15초 동안 와동시킨 후, 스트레이너를 사용하여 조직 조각을 제거하여 폐기하고, 상청액을 70μm 체에 통과시키고, 원심분리에 의해 펠릿화하고, 40% 퍼콜 5mL에 재현탁하고, 15mL 튜브 중의 80% 퍼콜 5mL에 중첩시켰다.　
20℃에서 900g으로 20분간 원심분리한 후, 계면의 물질을 수집하고, 10mL의 선별 완충액을 함유하는 신선한 15mL 튜브로 옮기고, 펠렛화하고, FACS 분석을 위한 형광 접합된 항체와 함께 인큐베이팅했다.　
흉선세포의 CCR7 염색을 위해, 현탁액은 피코에리트린(PE)-접합 항-CCR7(BioLegend, San Diego, CA, 카탈로그 번호 120105)을 함유하는 1mL 예열된 선별 완충액에서 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅했다. 다른 세포 표면 마커의 염색을 위해, 각 흉선 또는 비장 샘플을 1mL 선별 완충액에서 인큐베이팅하고, 각 소장 샘플을 형광 접합 항체를 함유하는 0.5mL 선별 완충액에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅했다.　
세척 후, 세포를 40μm 체에 통과시킨 후, Influx Cell Sorter 기기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey)를 사용하여 T 세포 서브세트(일반적으로 샘플당 5×104 세포)을 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Hilden, Germany, 카탈로그 번호 74106)로부터의 350□L 완충액 RLT를 함유하는 1.5mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 선별했다. 이어서, 샘플을 드라이아이스로 압입하여 동결하고, RNA를 단리할 때까지 -80℃에서 저장했다.　
용출 용적이 22μL인 RNeasy Mini 키트를 사용하여 RNA를 단리하고, 이 중 12μL를 사용하여 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 205311)로 cDNA를 합성했다. 반응당 5μL의 cDNA를 사용하여, TCRβ 전사물은 Q5® 고충실도 PCR 키트(New England BioLabs, lpswich, MA, 카탈로그 번호 E0555L) 및 19 Trbv-특이적 전방 프라이머 및 단일 Trbc-특이적 역방 프라이머의 혼합물을 사용하여 PCR 증폭시키고, TCRα 전사물은 23 또는 24 Trav-특이적 전방 프라이머 및 단일 Trac-특이적 역방 프라이머(GeneWorks, Adelaide, Australia로부터 구입)의 혼합물을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 전방 및 역방 프라이머는 상이한 5' 오버행 어댑터 서열을 갖고, 이는 Nextera XT DNA 라이브러리 제조 키트(Illumina, San Diego, CA, 카탈로그 번호 FC-131-1096)를 사용한 2차 PCR에서 샘플-특이적 지수 및 P5/P7 서열분석 어댑터의 부가를 가능하게 했다. 제2 PCR 전에, AMPure XP 자기 비드(Beckman Coulter, Brea, CA, 카탈로그 번호 A63881)를 사용하여 >100bp의 앰플리콘을 농후화시켰다. 제1 PCR의 조건은 98℃에서 5분, 98℃에서 10초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 20사이클, 이어서 72℃에서 2분이었다. 제2 PCR의 조건은 72℃에서 3분 및 98℃에서 30초, 98℃에서 10초, 63℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 20사이클, 이어서 72℃에서 1분이었다.　
QIAXcel 모세관 전기영동 기계(Qiagen)을 사용하여 앰플리콘 농도를 측정한 후, 최대 270개 샘플의 등몰량 앰플리콘을 단일 튜브에 풀링하고, AMPure XP 자기 비드를 사용하여 농축하고, 이어서 300 내지 500bp 앰플리콘을 겔-정제하고, 이어서 6개 염기의 짧은 판독 1 및 이어서 145개 염기의 판독 2로 NextSeq 기계(Illumina)에서 서열분석했다.
분자 식별자 그룹-기반 에러 수정(MIGEC) 소프트웨어(버전 1.2.6)를 사용하여 마우스 TCR 유전자에 서열을 정렬했다. 후속 분석은 RStudio 소프트웨어(버전 2022.02.3 빌드 492)를 사용하여 수행했다. 프레임 외이거나 정지 코돈을 함유하는 CDR3을 갖는 서열은 제외되었다. 클론은 Trav 또는 Trbv 유전자 및 CDR3 뉴클레오티드 서열의 고유한 조합으로 정의했다. 각 클론은 판독 수에 관계없이 샘플당 1회만 계수했다.　
CDR3의 길이는 CDR3으로부터 보존된 N-말단 Cys 및 C-말단 Trp 또는 Phe를 제외하는 CDR3-IMGT 정의를 사용하여 결정했다. n개 아미노산의 CDR3 서열의 경우, (n/2 + 1) 이하의 최대 위치의 아미노산을 중앙 CDR3 위치(정점)로서 정의했다. 각 샘플의 시스테인 지수는 CDR3 정점의 2 위치 이내에 Cys를 갖는 클론의 백분율과 동등하다. 임의의 소정 샘플에서 1 또는 2회만 검출된 서열은 시스테인 지수 계산으로부터 제외되었다. CDR3 정점의 2개 위치 내에 Cys를 갖는 클론형이 0개인 샘플의 경우, 시스테인 지수는 샘플 내의 클론 수의 역수로서 정의하여 백분율로 표시했다. Trbv1 서열은 8 아미노산 길이 미만의 CDR3 서열의 정점의 2 위치 이내인 CDR3 위치 2에 생식세포-코딩된 Cys를 가질 수 있기 때문에, 본 발명자들은 CDR3 길이가 8 아미노산 미만인 Trbv1 서열을 제외했다.
결과　
야생형 마우스(좌측 패널, 도 13B)에서, Cys-함유 CDR3은 선택전 흉선세포와 비교하여 CD8αα IEL에서 농후화되고 CD4+ 및 CD8+ T-conv 세포에서 고갈되었다. 그러나, Zap70mrd/mrt 마우스의 선택전 흉선세포 및 성숙 T 세포 서브세트는 유사한 빈도의 Cys-함유 CDR3을 가졌고(중앙 패널, 도 13B), 이는 Cys-함유 CDR3을 갖는 폴리클로날 흉선세포가 Zap70mrd/mrt 마우스에서 T-conv 세포로 이상 발달한다는 것을 나타낸다. Cys-함유 CDR3의 효과가 pMHC 리간드에 의존하는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 MHC 단백질의 세포-표면 발현을 결여하는 B2m -/- H2-Aa -/- 마우스의 TCR 레퍼토리를 서열분석했다. 본 발명자들은 B2m -/- H2-Aa -/- 　마우스로부터 선택전 흉선세포 및 성숙 T 세포에서 유사한 빈도의 Cys-함유 CDR3을 발견했다(우측 패널, 도 13B). 종합하면, 이러한 결과는 성숙 TCR 레퍼토리에서 Cys의 차별적 발현이 흉선의 pMHC 리간드에 반응하여 강력한 TCR 신호전달을 유도하는 Cys-함유 CDR3의 직접 결과인 것을 입증한다.
실시예 15 - TCR-pMHC 결합에 대한 Cys의 상황-의존적 효과.　
재료 및 방법　
상기 기재된 바와 같이 제조한 CD3 및 6218, 6218αC 또는 6218βC TCR을 발현하는 293T TCR 형질감염체는 PA 또는 PA4C가 로딩된 H2-Db의 사량체와 함께 인큐베이팅하고, FACS에 의해 분석했다.
결과　
PA/H2-Db 및 PA4C/H2-Db 사량체는 6218 또는 6218αC TCR을 발현하는 세포에 결합하지만, 6218βC TCR을 발현하는 세포에는 결합하지 않는다(도 14). 6218βC TCR에 대한 결합의 부재는 Gly로부터 Cys로의 치환이 더 큰 측쇄를 도입하기 때문에 예상되었고, 이는 CDR3β 루프의 형태를 변경하고 펩티드의 P7에서 주쇄 및 Arg 사이의 긴밀한 상호작용을 방해할 가능성이 있다. 이러한 Cys 치환이 TCR-pMHC 계면에 미치는 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 X-선 결정학을 적용했다(실시예 5, 도 2 참조).
실시예 16 - 유형 IV 콜라겐(α3)의 굿파스처 질환의 α3 쇄와 디설파이드 결합을 형성하도록 조작된 TCR
인간 자가면역 질환 중 최고로 이해된 질환은 굿파스처 질환이고, 이는 MHC 클래스 II(MHCII) 대립유전자, HLA-DRB1*15:01(DR15)과 관련되어 있다. DR15+ 인간 및 마우스는 신장 및 폐에서 기저막의 성분인 유형 IV 콜라겐(α3)의 α3 쇄에 대한 염증유발성 T 세포 및 B 세포 반응으로 인해 굿파스처 질환을 발증한다. 그러나, MHCII 대립유전자인 HLA-DRB1*01:01(DR1)의 공-발현은 굿파스처 질환을 예방하는 α3/DR1-특이적 T-reg 세포의 형성을 유도한다.　
놀랍게도, DR15 및 DR1은 각각 동일한 펩티드를 CD4+ T 세포에 제시함으로써 이 질환에 대한 감수성과 내성을 부여한다. 그러나, 펩티드 앵커 잔기는 DR15 대 DR1에 의해 제시될 때에 TCR이 펩티드의 상이한 아미노산을 "인식(see)"하도록 한 위치씩 오프셋되어 있다[참조: Ooi, J. D. et al. Dominant protection from HLA-linked autoimmunity by antigen-specific regulatory T cells. Nature. 545, 243-247 (2017). doi: 10.1038/nature22329].　
α3/DR15 항원에 결합하는 CD4 + T 세포 하이브리도마의 생성
굿파스처 질환 병인을 연구하기 위해, 본 발명자들은 α3/DR15 항원에 결합하는 CD4+ T 세포 하이브리도마를 생성했다.
T 세포 하이브리도마를 생성하기 위해, 80일령의 2마리 암컷 DR15-유전자도입 Fcgr2b -/- 마우스를 각각 총 100μL 용적의 완전 프로인트 애주번트에서 유화시킨 100㎍ α3 펩티드(KKDWVSLWKGFSFKK; 서열번호 211)로 피하 면역화시키고, 이어서 7일 및 14일 후에 총 100μL 용적의 불완전 프로인트 애주번트에서 유화시킨 α3 펩티드 100μg으로 재-면역화시켰다(총 3회 면역화). N- 및 C- 말단의 리신 잔기는 α3 펩티드를 수용액에 더 가용성으로 되게 한다.　
마우스를 제1 면역화의 34일 후에 사멸시키고, EasySep 마우스 기억 CD4+ T 세포 단리 키트(StemCell Technologies, 카탈로그 번호 19767)를 사용하여 풀링된 비장 및 림프절 세포로부터 CD4+ 기억 T 세포를 단리했다. 2×105 CD4+ 기억 T 세포를 24웰 플레이트의 단일 웰에서 500μL 배양 배지에서 30U/mL 인간 IL-2(Genscript, 카탈로그 번호 Z00368-1)의 존재하에 T-세포 확장 및 활성화용의 2×105 Dynabeads 마우스 T-활성화인자 CD3/CD28(Thermofisher Scientific, 카탈로그 번호 11453D)과 함께 배양했다.　
48시간 배양 후, 2.2×105 CD4+ T 세포를 107 BWZ.36 세포와 융합시키고[참조: Sanderson and Shastri, Int Immunol. 1994 Mar;6(3):369-76], 세포 분취물을 화이트(White) 등의 프로토콜에 따라 96웰 플레이트에서 웰당 100μL 하이브리도마 배지(NFAT-lacZ 도입유전자를 유지하기 위한 cDMEM + 400μg/mL 하이그로마이신)에서 배양하고, 융합 후 2일차에 2×HAT Supplement(ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 21060017)를 함유하는 100μL의 하이브리도마 배지를 첨가했다[참조: White et al., 2000;134:185-93].　
융합 후 10일차에, 각 96-웰 플레이트의 모든 웰로부터의 용적의 절반을 풀링하고, α3 펩티드(α3/DR15-APC, NIH 사량체 코어 시설, Emory University, Altanta)가 로딩된 APC-접합 HLA-DR15 사량체와 함께 인큐베이팅하여 α3/DR15-APC+ 세포의 상승된 빈도(0.2%)를 갖는 1개 플레이트를 동정했다.
융합 후 14일차에, 관심 있는 96웰 플레이트의 모두로부터 풀링된 세포(10일차에 동정)를 α3/DR15-APC 사량체와 함께 인큐베이팅하고, 420 α3/DR15-APC+ 세포를 유입 세포 선별기 기구(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey)를 사용하여 96-웰 플레이트의 단일 웰에 1× HAT 보충제를 함유하는 100μL 하이브리도마 배지로 FACS 선별했다.　
융합 후 27일차에, 동일한 프로토콜을 사용하여 750 α3/DR15-APC+ 세포를 1× HT 보충제(ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 41065012)를 함유하는 100μL 하이브리도마 배지로 선별했다.　
융합 후 40일차에, 동일한 프로토콜을 사용하여 개별 α3/DR15-APC+ 세포를 96-웰 플레이트의 별도 웰에서 200μL 하이브리도마 배지로 선별했다.　
융합 후 50일차에, 확장 클론의 FACS 분석은 >98%의 세포가 α3/DR15-APC+ 및 CD4+인 것을 입증했다(도 15).
　TCR-노출된 위치에 시스테인 치환을 갖는 α3 펩티드의 변이체에 대한 반응성을 동정하기 위한 T 세포 하이브리도마 활성화 검정
LS1로 표시된 이 하이브리도마는 BWZ.36 세포로부터 유래한 유도성 NFAT-lacZ β-갈락토시다제 도입유전자를 갖는다[참조: Sanderson and Shastri, Int Immunol. 1994 Mar;6(3):369-76]. 펩티드-의존적 TCR 결합은 활성화된 세포에서 NFAT 프로모터로부터의 전사를 유도하고 lacZ β-갈락토시다제(lacZ)의 번역을 유도하며, 여기서 lacZ는 이의 기질인 플루오로데옥시글루코스(FDG)를 플루오레세인으로 전환한다. DR15+ 항원-제시 세포를 제공하기 위해, 나이브 DR15-transgenic.Fcgr2b -/- 마우스로부터의 비장세포를 CellTrace Violet(CTV, ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 C34557)로 표지했다. 다양한 펩티드 중 하나(50μg/mL)의 부재 또는 존재하에 200μL cDMEM에서 LS1 세포와 함께 CTV+ DR15+ 항원-제시 세포를 배양했다. 16시간 후, 세포에 FDG를 삼투압적으로 로딩하고[참조: Nolan et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 Apr;85(8):2603-7], FACS에 의해 분석했다. 플루오레세인은 α3 펩티드와 함께 배양한 CTV-(LS1) 세포에서 검출되었지만, α3 펩티드의 부재하에 배양된 유사한 세포에서는 검출되지 않았다(도 16).
본 발명자들은 디설파이드 결합을 LS1-α3/DR15 복합체로 조작하기 때문에, 본 발명자들은 LS1 TCR이 TCR-노출 위치에 시스테인 치환을 갖는 α3 펩티드의 변이체와 반응했는지 여부를 시험했다[참조: Ooi, J. D. et al. Nature. 545, 243-247 (2017)](도 16). LS1 세포는 위치 (P)2의 세린(α3_S2C; KKDWVCLWKGFSFKK; 서열번호 212) 또는 P8의 세린(α3_S8C; KKDWVSLWKGFCFKK; 서열번호 213)이 시스테인 치환된 변이체 펩티드에 의해 활성화되었다. LS1 세포는 P-1에서 트립토판(α3_W-1C; KKDCVSLWKGFSFKK; 서열번호 214) 또는 P5의 리신(α3_K5C; KKDWVSLWCGFSFKK; 서열번호 215)이 시스테인 치환된 α3 펩티드의 변이체에 의해 활성화되지 않았고, 미엘린 염기성 단백질(MBP)(KKENPVVHFFKNIVTPKK; 서열번호 216)로부터의 음성 대조군 펩티드에 의해 활성화되지도 않는다. 따라서, LS1 세포에 의해 발현되는 TCR은 α3/DR15 및 α3/DR15와 밀접한 관련되는 일부 리간드(전부는 아님)에 의한 T 세포 활성화를 촉진한다. 다시 말해, 이러한 데이터는, 이전에 특성화된 다수의 항-미생물 또는 자가면역 TCR-pMHC 상호작용과 마찬가지로, 입증 가능한 특이성으로 LS1 TCR이 α3/DR15에 결합한다는 것을 시사한다.　
시스테인 치환을 위한 잔기 후보를 동정하기 위해 LS1 세포에 의해 발현되는 TCRα 및 TCRβ 쇄의 서열분석　
LS1 하이브리도마에 의해 발현되는 TCR 쇄를 서열분석하기 위해, LS1 세포로부터 단리된 RNA를 주형 스위칭 RT 효소 믹스(New England BioLabs, 카탈로그 번호 M0466L)를 사용하여 역전사시켰다. 역전사 프라이머는 TCRα의 경우 CGTCTGAACTGGGTAGGTG(서열번호 217)이고, TCRβ의 경우 CTGAAAGCCCATGGAACTGC(서열번호 218)이었다. 주형 스위치 DNA-RNA 올리고뉴클레오티드 프라이머는 GAATTCACCTATCAACGCAGAGTACATXXX(여기서, X는 리보구아노신(rG)을 나타냄, 서열번호 219)이었다. cDNA는 TCRα의 경우 전방 프라이머 AATTGAATTCACCTATCAACGCAGAG(서열번호 220) 및 역방 프라이머 AATTCTCGAGAAGTCGGTGAACAGGCAGAG(서열번호 221), 또는 TCRβ의 경우 역방 프라이머 AATTCTCGAGTGGACCTCCTTGCCATTCAC(서열번호 222)를 사용하여 PCR에서 주형으로 사용되었다. PCR 생성물을 EcoRI 및 XhoI로 소화하고, 이어서 10-β 적격 이. 콜라이(New England BioLabs, 카탈로그 번호 C3019H)의 형질전환에 사용된 pMSCV-IRES-mCherry FP 플라스미드(Addgene, 카탈로그 번호 52114)에 결찰시켰다. 후속 이. 콜라이 배양물로부터 단리 및 정제된 미니프렙 DNA를 프라이머 CCTCACATTGCCAAAAGACG(서열번호 223)를 사용하여 생거(Sanger) 서열분석에 제공했다.
서열은 IMGT/V-Quest(https://www.imgt.org/IMGT_vquest/input)를 사용하여 마우스 TCR 뉴클레오티드 서열에 정렬시켰다. LS1 T 세포 하이브리도마(LS1 TCR)에 의해 발현되는 TCRα 및 TCRβ 쇄의 가변(TRAV/TRBV) 및 접합(TRAJ/TRBJ) 유전자 세그먼트와 CDR3 아미노산 서열에 대한 상세는 도 17에 제시되어 있다.　　
α3_W-1C 펩티드가 LS1 세포를 활성화하지 못한다는 것은 LS1 TCR이 α3 펩티드의 P-1에서 트립토판과 접촉한다는 것을 시사한다. LS1 TCR은 α3/DR15 리간드의 중심에 도킹하지 않을 수 있지만, 대신에 α3 펩티드의 N-말단 부분을 향해 추가로 도킹할 수 있다. MBP/DR15에 특이적이고 다발성 경화증을 갖는 환자로부터 유래한 Ob.1A12 TCR[참조: Wucherpfennig et al., J Exp Med. 1994 Jan 1;179(1):279-90. doi: 10.1084/jem.179.1.279]은 펩티드의 N-말단 부분을 향해 이동하는 비전통적 도킹 토폴로지를 갖는다[참조: Hahn et al. Unconventional topology of self peptide-major histocompatibility complex binding by a human autoimmune T cell receptor. Nat Immunol. 6, 490-496 (2005). doi: 10.1038/ni1187]. Ob.1A12 TCR의 중심은 다른 TCR-pMHC 복합체에서 빈번히 관찰되는 바와 같이 펩티드의 P5가 아닌 펩티드의 P2 상에 위치한다[참조: Hahn et al. 2005].
Ob.1A12 TCR은 CDR3β(14aa)보다 짧은 CDR3α(12aa)를 갖는다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 LS1에서 CDR3α(10aa)가 CDR3β(13aa)보다 더 짧다는 것을 발견했다. 이러한 비대칭성은 Ob.1A12-MBP/DR15 복합체에서 관찰된 바와 같이 LS1 TCR이 α3/DR15 리간드 상에서 DR15β 헬릭스를 향해 경사진 도킹 토폴로지로 향하게 할 수 있다[참조: Hahn et al. 2005]. LS1 TCR은 P2에서 세린 또는 시스테인을 갖는 α3 펩티드의 버전과 반응한다. α3_S2C 변이체는 CDR3α 또는 CDR3β에서 시스테인 치환을 갖는 LS1 TCR의 변이체와 S-S 결합 형성을 가능하게 하는 우수한 후보인 것으로 보인다.
LS1-α3/DR15 복합체로 디설파이드 결합의 조작
본 발명자들은 굵은 이탤릭체로 제시된 각 CDR3 위치에 시스테인 치환을 갖는 LS1 TCR의 10개 변이체를 제작할 것이다: CDR3α의 경우 ALSSGSWQLI(서열번호 224) 및 CDR3β의 경우 ASGEGQGRGERLF(서열번호 225)(도 17). 본 발명자들은 LS1 또는 상기 기재된 이의 10개 변이체 중 하나를 발현하는 T 세포주를 작제하고, α3, α3W-1C, α3S2C, α3K5C, α3S8C 또는 위치 3에 류신 대신 시스테인을 갖는 변이체(α3L3C, KKDWVSCWKGFSFKK, 서열번호 226)와 함께 인큐베이팅된 DR15+ 항원-제시 세포에 대한 이들 T 세포주의 반응성을 시험할 것이다. 디설파이드 결합 형성은 펩티드 항원에 대한 T 세포 감수성을 증가시킬 것으로 예상되고, 이는 시험관내에서 낮은 농도의 펩티드 항원에 반응하는 T 세포 활성화에 의해 입증되었다.　
디설파이드 결합 형성을 확인하기 위해, 관심 있는 각 TCR은 마우스 CD3과 함께 293T 세포에 형질감염시켜 세포 표면 TCR 발현을 달성한다. 본 발명자들은 관심 있는 펩티드(예: α3W-1C, α3S2C, α3K5C, α3S8C, α3L3C)를 함유하는 DR15 사량체를 수득할 수 있다. 본 발명자들은 항-MHCII 항체, 클론 L243의 존재하에서 각 TCR/펩티드 조합을 스크리닝하기 위해 사량체 해리 검정(본원에 기재된 바와 같음)을 사용할 것이다[참조: Lampson and Levy, J Immunol. 1980 Jul;125(1):293-9]. 사량체 해리의 결여는 TCR과 펩티드 사이의 디설파이드 결합의 증거를 제공한다.　
조작된 LS1-α3/DR15 복합체를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 CD4+ T 세포 활성화에 대한 공유 항원 인식의 효과의 조사
LS1-α3/DR15 복합체로 디설파이드 결합의 조작에 의해 시험관내 및 생체내에서 CD4+ T 세포 활성화에 대한 공유 항원 인식의 효과의 연구가 가능해질 것이다. 예를 들면, T-reg 기능은 본원에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 시험관내에서 평가할 수 있다. 생체내 실험을 가능하게 하기 위해, α3 펩티드를 코딩하는 DR15-유전자도입 Fcgr2b -/- 마우스 생식세포 DNA는 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 사용하여 원하는 위치에 시스테인을 도입하도록 변형할 수 있다. 이 접근법은 α3 단백질과 펩티드가 인간 및 인간화 마우스 모델에서 자가면역 질환에 대한 보호 및 감수성에 중요한 패턴으로 발현되고 T 세포에 제시된다는 이점을 갖는다. 이러한 접근법은 표적 항원과 디설파이드 결합을 형성하도록 조작된 TCR-Treg 세포가 자가면역 질환의 치료에 우수한 효능을 부여하는지 여부를 시험할 수 있는 신규 모델을 제공할 수 있다.　
본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 본문 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 2개 이상의 개별 특징의 모든 대안적 조합으로 확장되는 것으로 이해될 것이다. 이러한 모든 상이한 조합은 본 발명의 다양한 대안적 양태를 구성한다.
명확화 및 의심의 회피를 위해, 본원에 사용되고 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, "포함하다(comprise)"라는 용어와 "포함하는(comprising)", "포함한다(comprises)" 및 "포함된(comprised)" 등의 용어의 변형은 추가의 부가, 구성요소, 정수 또는 단계를 배제하는 것을 의도하는 것은 아니다.
[표 3]
TCR/펩티드-MHC 클래스 I 복합체의 잠재적 디설파이드 결합(방법에 대해서는 실시예 1 참조):
[표 4]
TCR/펩티드-MHC 클래스 II 복합체의 잠재적 디설파이드 결합:
# MHC 클래스 I에 의해 제시된 펩티드의 경우, 제시된 최초 아미노산은 P1으로 지정된다.
* 굵은 글씨 및 밑줄 표시된 문자의 잔기 쌍은 시스테인과 교환되면 디설파이드 결합을 형성할 수 있고, 굵은 글씨의 잔기 쌍은 시스테인으로 교환된 경우에 디설파이드 결합을 형성할 것으로 예측된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (50)

  1. HLA 분자에 결합된 펩티드와 접촉할 수 있는 상보성-결정 영역(complementary-determining region; CDR)을 포함하는 가변 도메인(variable domian)을 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 CDR은 HLA 분자에 결합된 펩티드 내의 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 시스테인을 포함하고, 상기 시스테인은 기존 잔기(residue)의 돌연변이 또는 변형에 의해 CDR에 도입되는, 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이 항원 결합 단백질인, 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 결합 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 T 세포 수용체 또는 이의 단편인, 결합 단백질.
  5. 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 키메라(chimeric) 또는 융합(fusion) 단백질인, 결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 키메라 항원 수용체(CAR)인, 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 CDR3인, 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 α 쇄 가변 도메인(Vα) 또는 β 쇄 가변 도메인(Vβ)을 포함하는, 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 시스테인을 함유하는 CDR이 α 쇄 가변 도메인에 존재하는, 결합 단백질.
  10. 제8항에 있어서, 상기 시스테인을 함유하는 CDR이 β 쇄 가변 도메인에 존재하는, 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 상기 지시된 위치에 존재하는 시스테인 잔기를 갖는 표 3 또는 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는, 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HLA가 HLA 클래스 I인, 결합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 HLA 클래스 I이 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C인, 결합 단백질.
  14. 제12항에 있어서, 상기 HLA 클래스 I이 HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G인, 결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HLA가 HLA 클래스 II인, 결합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 상기 HLA 클래스 II가 HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ인, 결합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, HLA 분자에 결합된 펩티드의 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 상기 시스테인이 위치 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에서 상기 CDR에 존재하고, 상기 넘버링(numbering)은 상기 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것(즉, 상기 CDR의 N-말단에서의 아미노산이 위치 1)인, 결합 단백질.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하고, 상기 시스테인이 위치 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에서 상기 CDR에 존재하고, 상기 넘버링이 상기 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것(즉, 상기 CDR의 N-말단에서의 아미노산이 위치 1)이고, 이에 의해 HLA 클래스 I 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인, 바람직하게는 위치 P4, P5 또는 P6에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는, 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하고, 상기 시스테인이 위치 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에서 상기 CDR에 존재하고, 상기 넘버링이 상기 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것(즉, 상기 CDR의 N-말단에서의 아미노산이 위치 1)이고, 이에 의해 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인, 바람직하게는 위치 P4, P5, P6, P7, P8 또는 P9에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는, 결합 단백질.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하고, 상기 시스테인이 위치 5, 6, 7, 8 또는 11에서 CDR에 존재하고, 상기 넘버링이 상기 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것(즉, 상기 CDR의 N-말단에서의 아미노산이 위치 1)이고, 이에 의해 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인, 보다 바람직하게는 위치 P1, P2 또는 P5에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는, 결합 단백질.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하고, 상기 시스테인이 위치 5, 6, 7, 8 또는 9에서 상기 CDR에 존재하고, 상기 넘버링이 상기 CDR의 N-말단의 아미노산에 대한 것(즉, 상기 CDR의 N-말단에서의 아미노산이 위치 1)이고, 이에 의해 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩티드에 존재하는 시스테인, 보다 바람직하게는 위치 P4, P5, P6, P7 또는 P8에 존재하는 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는, 결합 단백질.
  22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하고, 상기 시스테인이 HLA 클래스 I 분자에 결합된 표 3에 제시된 펩티드에 존재하는 상기 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하는, 결합 단백질.
  23. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하고, 상기 시스테인이 HLA 클래스 I 분자에 결합된 표 3에 제시된 펩티드에 존재하는 상기 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하는, 결합 단백질.
  24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 TCR α-쇄 가변 도메인에 존재하고, 상기 시스테인이 HLA 클래스 II 분자에 결합된 표 2 또는 3에 제시된 펩티드에 존재하는 상기 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하는, 결합 단백질.
  25. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR이 TCR β-쇄 가변 도메인에 존재하고, 상기 시스테인이 HLA 클래스 II 분자에 결합된 표 1 또는 4에 제시된 펩티드에 존재하는 상기 시스테인과 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에서 CDR에 존재하는, 결합 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 가용성 형태(soluble form)인, 결합 단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는 핵산.
  28. 제27항의 핵산을 포함하는 벡터(vector).
  29. 제28항의 벡터를 포함하는 세포.
  30. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 이의 표면에 발현하는 세포.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포가 면역 세포인, 세포.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포가 NK 세포인, 세포.
  33. 제31항에 있어서, 상기 세포가 T 세포인, 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 T 세포가 CD4+ T 세포인, 세포.
  35. 제33항에 있어서 상기 T 세포가 CD8+ T 세포인, 세포.
  36. 제33항에 있어서, 상기 T 세포가 T 조절 세포인, 세포.
  37. 자가면역 질환(autoimmune disease)의 치료에 사용하기 위한 T 조절 세포의 집단(population)을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    - T 조절 세포의 집단을 제공하는 단계,
    - 제27항의 핵산 또는 제28항의 벡터를 T 조절 세포의 집단에 도입하는 단계 및
    - T 조절 세포의 표면 상에서 결합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계
    를 포함하고,
    이에 의해, 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 T 조절 세포의 집단을 제조하는, 방법.
  38. 이식 거부반응(transplant rejection)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 T 조절 세포의 집단을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    - T 조절 세포의 집단을 제공하는 단계,
    - 제27항의 핵산 또는 제28항의 벡터를 T 조절 세포의 집단에 도입하는 단계 및
    - T 조절 세포의 표면 상에서 결합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계
    를 포함하고,
    이에 의해, 이식 거부반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 T 조절 세포의 집단을 제조하는, 방법.
  39. 암 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 세포독성 T 세포의 집단을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    - 세포독성 T 세포의 집단을 제공하는 단계,
    - 제27항의 핵산 또는 제28항의 벡터를 세포독성 T 세포의 집단에 도입하는 단계 및
    - 세포독성 T 세포의 표면 상에서 결합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건을 제공하는 단계
    를 포함하고,
    이에 의해, 암 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 세포독성 T 세포의 집단을 제조하는, 방법.
  40. 대상체(subject)에서 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포를 상기 대상체에게 투여하여, 상기 대상체에서 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는, 방법.
  41. 대상체에서 이식 거부반응을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포를 상기 대상체에게 투여하여, 상기 대상체에서 이식 거부반응을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는, 방법.
  42. 대상체에서 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포를 상기 대상체에게 투여하여, 상기 대상체에서 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는, 방법.
  43. 대상체에서 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
  44. 대상체에서 이식 거부반응을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
  45. 대상체에서 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
  46. 대상체에서 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포.
  47. 대상체에서 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포.
  48. 대상체에서 이식 거부반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제27항의 핵산, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 세포.
  49. 비-돌연변이 TCR(unmutated TCR)과 비교하여 HLA(pHLA)에 결합된 표적 펩티드와의 해리 속도가 저하된 돌연변이체 TCR을 동정하는 방법으로서, 상기 방법은
    - 돌연변이를 갖는 복수의 TCR을 생성하여 α 쇄 CDR3 서열 및/또는 β 쇄 CDR3 서열에 시스테인 잔기를 도입하는 단계,
    - 상기 복수의 TCR의 구성원과 표적 pHLA와의 상호작용을 결정하는 단계 및
    - 비-돌연변이된 TCR과 비교하여 상기 표적 pHLA와의 해리 속도가 저하된 하나 이상의 구성원을 선택하는 단계
    를 포함하고,
    여기서, 상기 해리 속도의 저하는 디설파이드 결합의 형성에 의한 것인, 방법.
  50. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 결합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 제29항의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
KR1020247015364A 2021-10-12 2022-10-12 변형된 결합 단백질 및 이의 치료적 용도 KR20240099260A (ko)

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