ES2635335T3 - Receptores de células T específicos de antígeno y epítopos de células T - Google Patents

Receptores de células T específicos de antígeno y epítopos de células T Download PDF

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ES2635335T3
ES2635335T3 ES11761508.8T ES11761508T ES2635335T3 ES 2635335 T3 ES2635335 T3 ES 2635335T3 ES 11761508 T ES11761508 T ES 11761508T ES 2635335 T3 ES2635335 T3 ES 2635335T3
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Özlem TÜRECI
Petra Simon
Tana Omokoko
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Abstract

Un método para proporcionar células linfoides específicas de antígeno que comprende las etapas: (a) proporcionar una única célula T reactiva al antígeno a partir de una muestra que comprende células T, en la que dicha muestra se obtiene de un sujeto previamente expuesto a dicho antígeno y en el que dicha única célula T reactiva al antígeno se aísla de la muestra que comprende células T usando citometría de flujo; (b) proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno; y (c) introducir dicho ácido nucleico en una célula linfoide para proporcionar dichas células linfoides específicas de antígeno.

Description

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DESCRIPCIÓN
Receptores de células T específicos de antígeno y epítopos de células T
Antecedentes de la invención
La evolución del sistema inmune resultó en vertebrados en una red altamente eficaz basada en dos tipos de defensa: la 5 inmunidad innata y la adoptiva
En contraste con el sistema inmune innato evolutivo antiguo que se basa en receptores invariantes que reconocen patrones moleculares comunes asociados con patógenos, la inmunidad adoptiva se basa en receptores de antígenos altamente específicos en células B (linfocitos B) y células T (linfocitos T) y selección clonal.
Aunque las células B aumentan las respuestas inmunes humorales por secreción de anticuerpos, las células T median 10 las respuestas inmunitarias celulares que conducen a la destrucción de células reconocidas.
Las células T desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células en seres humanos y animales. El reconocimiento y la unión de un antígeno particular está mediada por los receptores de células T (TCR) expresados en la superficie de células T.
El receptor de células T (TCR) de una célula T es capaz de interactuar con péptidos inmunogénicos (epítopos) unidos a
15 moléculas de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y presentes en la superficie de células diana. La unión específica de TCR desencadena una cascada de señales dentro de la célula T que conduce a la proliferación y diferenciación en una célula T efectora madura. Para que se pueda dirigir una gran variedad de antígenos, los receptores de células T necesitan tener una gran diversidad.
Esta diversidad se obtiene mediante reordenamiento genético de diferentes segmentos discontinuos de genes que 20 codifican las diferentes regiones estructurales de los TCR. Los TCR están compuestos de una cadena  y una cadena 
o de una cadena  y una cadena . Las cadenas / de TCR están compuestas por una región variable altamente polimórfica N-terminal implicada en el reconocimiento de antígenos y una región constante invariante. En el nivel genético, estas cadenas están separadas en varias regiones, una región variable (V), una región de diversidad (D) (sólo cadena  y ), una región de unión (J) y una región constante (C). Los genes de cadena  humana contienen más de 60 25 variables (V), 2 diversidades (D), más de 10 segmentos de unión (J) y 2 segmentos de región constante (C). Los genes de la cadena  humana contienen más de 50 segmentos V, y más de 60 segmentos J, pero sin segmentos D, así como un segmento C. Los genes de la cadena  murina contienen más de 30 variables (V), 2 diversidades (D), más de 10 segmentos de unión (J) y 2 segmentos de región constante (C). Los genes de la cadena  murina contienen casi 100 segmentos V, 60 segmentos J, sin segmentos D, pero un segmento C. Durante la diferenciación de las células T, se
30 crean genes específicos de receptores de células T mediante el reordenamiento de un gen de la región V, uno D (sólo  y ), uno de J y uno de C. La diversidad de los TCR se amplifica adicionalmente mediante un reordenamiento impreciso de V-(D) -J en el que se introducen y/o suprimen nucleótidos aleatorios en los sitios de recombinación. Dado que la reordenación de los locus del gen TCR se produce en el genoma durante la maduración de las células T, cada célula T madura sólo expresa un TCR / o TCR / específico.
35 La unión de MHC y el antígeno está mediada por las regiones determinantes complementarias 1, 2 y 3 (CDR1, CDR2, CDR3) de TCR. La CDR3 de la cadena  que es más crítica para el reconocimiento y la unión del antígeno está codificada por la unión V-D-J del gen de la cadena  de TCR reordenado.
El TCR es una parte de una maquinaria de señalización compleja, que incluye el complejo heterodimérico de las cadenas  y  de TCR, el coreceptor CD4 o CD8 y el módulo de transducción de señal CD3 (Figura 1). Mientras que las
40 cadenas CD3 transfieren la señal de activación dentro de la célula, el heterodímero / de TCR es el único responsable del reconocimiento del antígeno. De este modo, la transferencia de las cadenas / de TCR ofrece la oportunidad de redirigir las células T hacia cualquier antígeno de interés.
Inmunoterapia
La inmunoterapia específica de antígeno tiene como objetivo potenciar o inducir respuestas inmunes específicas en
45 pacientes para controlar enfermedades infecciosas o malignas. La identificación de un número creciente de antígenos asociados a patógenos y tumores (TAA) condujo a una amplia colección de dianas apropiadas para la inmunoterapia. Las células presentadoras de péptidos inmunogénicos (epítopos) derivados de estos antígenos pueden ser específicamente dirigidas por estrategias de inmunización activa o pasiva. La inmunización activa tiende a inducir y expandir células T específicas de antígeno en el paciente, que son capaces de reconocer y destruir específicamente
50 células enfermas. En contraste, la inmunización pasiva se basa en la transferencia adoptiva de células T, que fueron expandidas y opcionalmente genéticamente modificadas in vitro (terapia de células T adoptiva).
Vacunación
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Las vacunas de tumores tienen como objetivo inducir respuestas inmunitarias específicas de tumores endógenos mediante inmunización activa. Se pueden utilizar diferentes formatos de antígeno para la vacunación de tumores incluyendo células de cáncer completas, proteínas, péptidos o vectores de inmunización tales como ARN, ADN o vectores virales que pueden ser aplicados ya sea directamente in vivo o in vitro por pulsación de DC después de la transferencia al paciente.
El número de estudios clínicos en los que se pueden identificar respuestas inmunitarias inducidas por terapia se aumenta de manera constante debido a mejoras en las estrategias de inmunización y en los métodos para la detección de respuestas inmunitarias específicas de antígeno (Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res. 68, 3931-3940; Schmitt,
M. et al. (2008) Blood 111, 1357-1365; Speiser, D.E. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 3849-3854; Adams,
S. et al. (2008) J. Immunol. 181, 776-784). Sin embargo, en la mayoría de los casos, las respuestas inmunitarias detectadas no se pueden correlacionar sistemáticamente con los resultados clínicos (Curigliano, G. et al. (2006) Ann. Oncol. 17, 750-762; Rosenberg, S.A. et al. (2004) Nat. Med. 10, 909-915).
La definición exacta de los epítopos peptídicos derivados de los antígenos tumorales puede por lo tanto contribuir a mejorar la especificidad y la eficacia de las estrategias de vacunación, así como los métodos para el inmunomonitoreo.
Transferencia celular adoptiva (ACT)
La inmunoterapia basada en ACT se puede definir ampliamente como una forma de inmunización pasiva con células T previamente sensibilizadas que se transfieren a receptores no inmunes o al huésped autólogo después de la expansión ex vivo desde frecuencias precursoras bajas a números de células clínicamente relevantes. Los tipos de células que se han utilizado para los experimentos de ACT son células asesinas activadas por linfocinas (LAK) (Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), linfocitos que infiltran tumores (TILs) (Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), linfocitos donantes después de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) así como clones o líneas de células T específicas de tumores (Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173).
Se demostró que la transferencia de células T adoptiva tiene actividad terapéutica frente a infecciones virales humanas tales como CMV. Mientras que la infección por CMV y la reactivación de virus latentes endógenos está controlada por el sistema inmunológico en individuos sanos, resulta en una morbilidad y mortalidad significativas en individuos inmunodeficientes tales como receptores de trasplante o pacientes con AIDS. Riddell y colaboradores demostraron la reconstitución de la inmunidad viral mediante terapia de células T adoptivas en pacientes suprimidos inmunológicamente después de la transferencia de clones de células T específicos de CD8+ CMV derivados de donantes de trasplantes seropositivos para CMV coincidente con HLA (Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238-241).
Como un enfoque alternativo, las poblaciones de células T específicas derivadas de CMV o EBV derivadas de donantes policlonales se transfirieron a receptores de trasplante, dando como resultado una persistencia incrementada de células T transferidas (Rooney, C.M. et al. (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. et al. (2003) Lancet 362, 1375-1377).
Para la inmunoterapia adoptiva del melanoma, Rosenberg y colaboradores establecieron un enfoque de ACT basado en la infusión de linfocitos infiltrantes de tumores autólogos expandidos in vitro (TIL) aislados de tumores extirpados en combinación con una quimioterapia linfosuprimida no mielosupresora e IL2 de dosis alta. Un estudio clínico publicado recientemente dio como resultado una velocidad de respuesta objetiva de ∼50% de los pacientes tratados que padecen de melanoma metastásico (Dudley, M.E. et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).
Sin embargo, los pacientes deben cumplir varias premisas para ser elegibles para inmunoterapia con ACT. Deben tener tumores que se pueden extirpar. Los tumores deben generar TIL viables bajo condiciones de cultivo celular. Los TIL deben ser reactivos contra los antígenos tumorales, y deben expandirse in vitro a un número suficiente. Especialmente en otros cánceres que el melanoma, es difícil obtener tales TIL reactivos con tumores. Además, la repetición de la estimulación in vitro y la expansión clonal de los linfocitos T humanos normales da como resultado una disminución progresiva de la actividad de la telomerasa y un acortamiento de los telómeros que resulta en senescencia replicativa y disminución del potencial de persistencia de células T transferidas (Shen, X. et al. (2007) J. Immunother. 30: 123-129).
Una estrategia que supera las limitaciones de ACT es la transferencia adoptiva de células T autólogas reprogramadas para expresar un TCR reactivo con tumores de especificidad definida durante un cultivo ex vivo de corta duración seguido de reinfusión en el paciente. Esta estrategia hace que ACT sea aplicable a una variedad de neoplasias malignas comunes incluso si las células T reactivas al tumor están ausentes en el paciente. Dado que la especificidad antigénica de las células T descansa totalmente en el complejo heterodimérico de la cadena  y  de TCR, la transferencia de genes de TCR clonados en células T ofrece la posibilidad de redirigirlos hacia cualquier antígeno de interés. Por lo tanto, la terapia génica de TCR proporciona una estrategia atractiva para desarrollar inmunoterapia específica de antígeno con linfocitos autólogos como opción de tratamiento. Las ventajas principales de la transferencia génica de TCR son la creación de cantidades terapéuticas de células T específicas de antígeno en unos pocos días y la posibilidad de introducir especificidades que no están presentes en el repertorio de TCR endógeno del paciente.
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Varios grupos demostraron que la transferencia génica de TCR es una estrategia atractiva para redirigir la especificidad de antígeno de las células T primarias (Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al. (2000)
J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238). El documento WO 2006/026002 A2 describe métodos de tratamiento de una enfermedad mediada por linfocitos, proliferativos o infecciosos que implican proporcionar una cadena  del receptor de células T (TCR ) que tiene un mayor reconocimiento de la sensibilidad del antígeno que una cadena  de TCR de tipo salvaje e introducir la TCR cadena  directa o indirectamente a un sujeto que tiene la enfermedad en condiciones eficaces para tratar la enfermedad.
La factibilidad de la terapia génica de TCR en humanos se demostró recientemente en ensayos clínicos para el tratamiento del melanoma maligno por Rosenberg y su grupo. La transferencia adoptiva de linfocitos autólogos transducidos retroviralmente con TCR específicos de antígeno de melanocitos/melanoma dio como resultado una regresión del cáncer en hasta 30% de los pacientes tratados con melanoma (Morgan, R.A. et al. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. et al. (2009) Blood 114, 535-546).
Estructuras diana para la inmunoterapia específica del antígeno
El descubrimiento de múltiples antígenos asociados a tumores (TAA) ha proporcionado la base para los conceptos de inmunoterapia específica de antígeno (Novellino, L. et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207). Las TAA son proteínas inusuales expresadas en células tumorales debido a su inestabilidad genética, que no tienen expresión o limitada en células normales. Estas TAA pueden conducir al reconocimiento específico de células malignas por el sistema inmune.
La clonación molecular de TAA mediante la detección de bibliotecas de expresión de ADNc derivadas de tumores utilizando células T específicas de tumores autólogas (van der Bruggen, P. et al. (1991) Science 254, 1643-1647) o anticuerpos de circulación (Sahin, U. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 11810-11813), los enfoques de inmunología inversa, los métodos bioquímicos (Hunt, D.F. et al. (1992) Science 256, 1817-1820), análisis de expresión génica o en las estrategias de clonación in silico (Helftenbein, G. et al. (2008) Gene 414, 76-84) condujo a un número significativo de candidatos diana para estrategias de inmunoterapia. Las TAA caen en varias categorías, incluyendo antígenos de diferenciación, antígenos sobreexpresados, variantes de empalme específicas de tumores, productos génicos mutados, antígenos virales y los llamados antígenos de cáncer de testículo (CTA). La familia de testículos de cáncer es una categoría muy prometedora de TAA, ya que su expresión está restringida a los testículos y una multitud de entidades tumorales diferentes (Scanlan, M.J. et al. (2002) Immunol. Rev. 188, 22-32). Hasta ahora se han descrito más de 50 genes CT (Scanlan, M.J. et al. (2004) Cancer Immun. 4, 1), y algunos de ellos han sido tratados en estudios clínicos (Adams, S. et al. (2008) J. Immunol. 181, 776-784; Atanackovic, D. et al. (2004) J. Immunol. 172, 3289-3296; Chen, Q. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 9363-9368; Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res. 68, 39313940; Davis, I.D. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 10697-10702; Jager, E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A 97, 12198-12203; Marchand, M. et al. (1999) Int. J. Cancer 80, 219-230; Schuler-Thurner, B. et al. (2000) J. Immunol. 165, 3492-3496).
A pesar del creciente número de estructuras diana atractivas para estrategias inmunoterapéuticas, clones o líneas de células T específicos de restricción de HLA definida, sólo existen unos pocos de ellos ((Chaux, P. et al. (1999) J. Immunol. 163, 2928-2936; Zhang, Y. et al. (2002) Tissue Antigens 60, 365-371; Zhao, Y. et al. (2005) J. Immunol. 174, 4415-4423). Para la mayoría de los CTA, incluyendo TPTE, incluso la evidencia para respuestas de células T específicas está ausente.
Descripción de la invención.
Resumen de la invención
Las estrategias inmunoterapéuticas son opciones prometedoras para el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer. La identificación de un número creciente de antígenos asociados a patógenos y tumores condujo a una amplia colección de dianas apropiadas para inmunoterapia.
Mediante la transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de células T (TCR) específico de antígeno definido, estos antígenos pueden ser específicamente dirigidos, conduciendo así a la destrucción selectiva de células malignas o infectadas diana. Dado que la especificidad de TCR está restringida por moléculas MHC altamente polimórficas, la amplia aplicabilidad de la transferencia adoptiva de TCR depende de la generación de una multitud de reactivos de TCR para uso "listo para usar", cubriendo una amplia gama de antígenos y restricciones de MHC. Sin embargo, hasta ahora sólo se ha identificado un número limitado de candidatos TCR apropiados. Esto se debe principalmente al establecimiento laborioso de clones de células T para el aislamiento del gen de TCR.
La presente invención se refiere a métodos eficaces para proporcionar células linfoides específicas de antígeno. Estas células linfoides se pueden usar para proporcionar receptores de células T específicos de antígenos que tienen una restricción definida de MHC y para identificar epítopos de células T inmunológicamente relevantes.
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La presente invención se refiere a un método para proporcionar células linfoides específicas de antígeno que comprende las etapas:
(a)
proporcionar una única célula T reactiva al antígeno a partir de una muestra que comprende células T, en la que dicha muestra se obtiene de un sujeto previamente expuesto a dicho antígeno y en el que dicha única célula T reactiva al antígeno se aísla de la muestra que comprende células T usando citometría de flujo;
(b)
proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno; y
(c)
introducir dicho ácido nucleico en una célula linfoide para proporcionar dichas células linfoides específicas de antígeno.
En una realización, el método comprende además la etapa de determinar la especificidad de epítopo de dichas células linfoides específicas del antígeno y/o la etapa de determinar la restricción de MHC de dichas células linfoides específicas de antígeno.
En una realización preferida, dicha única célula T reactiva al antígeno y dicho ácido nucleico que codifica un receptor de célula T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno son reactivos con un antígeno administrado a un sujeto.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicho epítopo es un péptido presentado por MHC. En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicha etapa de determinar la especificidad de epítopo de dichas células linfoides específicas de antígeno comprende determinar la reactividad de dichas células linfoides específicas de antígeno a moléculas de MHC expuestas, preferiblemente pulsadas, es decir cargadas con, un péptido derivado del antígeno. Preferiblemente, dichas moléculas de MHC son moléculas de MHC expresadas en el sujeto. Preferiblemente, dichas moléculas de MHC están presentes en las células diana. Dicho péptido puede ser parte de una biblioteca de péptidos derivada del antígeno y la biblioteca de péptidos puede comprender un conjunto de péptidos solapados derivados de dicho antígeno. Preferiblemente, el conjunto de péptidos solapados cubre toda la secuencia de dicho antígeno.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicha etapa de determinar la restricción de MHC de dichas células linfoides específicas de antígeno comprende determinar la reactividad de dichas células linfoides específicas de antígeno a moléculas de MHC seleccionadas. Preferiblemente, dichas moléculas MHC seleccionadas están presentes en las células diana. Preferiblemente, dichas moléculas de MHC seleccionadas son moléculas de MHC expresadas en el sujeto. Preferiblemente, dichas moléculas seleccionadas de MHC están presentes en células diana que expresan el antígeno o una parte de los mismos. Preferiblemente, dichas células linfoides específicas de antígeno o su receptor de células T están restringidos a moléculas de MHC expresadas en el sujeto.
Preferiblemente, la determinación de la reactividad de células linfoides específicas de antígeno comprende determinar la secreción de citoquinas por las células linfoides, en la que dicha citoquina puede ser interferón- (IFN). Otros marcadores de activación que se pueden usar son, por ejemplo, CD154 y/o CD137.
En una realización particularmente preferida del método de acuerdo con la presente invención, dicho ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva a antígeno es ARN, preferiblemente ARN transcrito in vitro. Preferiblemente, dicha célula linfoide carece de expresión de la superficie de un TCR endógeno o es específica para un antígeno no relacionado. En una realización, dicha célula linfoide es un linfocito, preferiblemente una célula T.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicha etapa de proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno comprende proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que comprende al menos las secuencias de CDR, preferiblemente al menos la región variable del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicha etapa de proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno comprende aislar ARN, preferiblemente poly-A+ -ARN, a partir de dicha única célula T reactiva al antígeno o una de sus poblaciones clonales, y preferiblemente comprende además la obtención de ADNc a partir de dicho ARN. En una realización, dicha etapa de proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno comprende además amplificar al menos una parte del ADNc que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos las secuencias de CDR, preferiblemente al menos la región variable del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno.
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En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicho sujeto es seropositivo para dicho antígeno o un agente que comprende dicho antígeno. La seropositividad del sujeto se puede determinar determinando una respuesta inmune al antígeno o agente o un componente del mismo.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dichas células T antes de proporcionar una única célula T reactiva al antígeno se someten a una expansión y reexposición específica del antígeno, en el que puede realizarse la expansión y la reexposición específicas del antígeno, exponiendo las células T a células presentadoras de antígenos preferiblemente autólogas que presentan un antígeno. En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicha única célula T reactiva al antígeno es positiva para un marcador de activación tal como IFN o CD137 y CD8 o CD4.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicha única célula T reactiva al antígeno se aísla de la muestra que comprende células T usando citometría de flujo, en el que la clasificación se efectúa sobre la base de la positividad para un marcador de activación, en particular IFN o CD137, y CD8 o CD4.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicho receptor de células T comprende las cadenas  y  del receptor del receptor de células T.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicho ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos las secuencias de CDR, preferiblemente al menos la región variable del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, dicho sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano. Preferiblemente, dicho sujeto tiene una enfermedad que implica células que expresan el antígeno, preferiblemente una enfermedad relacionada con células T. Dicha enfermedad se puede seleccionar del grupo que consiste en trastornos del sistema inmune, infecciones y enfermedades malignas.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que comúnmente se entienden por un experto en la técnica.
Preferiblemente, los términos usados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la bibliografía en el campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo exija de otro modo, la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un miembro declarado, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas, aunque en algunas realizaciones dicho otro miembro, entero o etapas o grupo de miembros, Excluido, es decir, el objeto consiste en la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas se pueden incluir. Los términos "un" y "una" y "el" y referencia similar utilizados en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) se deben interpretar para abarcar tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o claramente contradicho por el contexto.
Todos los métodos descritos en este documento se pueden llevar a cabo en cualquier orden apropiado a menos que se indique lo contrario en este documento o que de otro modo se contradiga claramente con el contexto. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o un lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como"), proporcionado en este documento se pretende meramente ilustrar mejor la invención.
El término "recombinante" en el contexto de la presente invención significa "hecho mediante ingeniería genética". Preferiblemente, un "objeto recombinante" tal como una célula recombinante en el contexto de la presente invención no es de origen natural.
El término "de origen natural" como se usa en este documento se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, se produce naturalmente un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo
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(incluyendo virus) y que puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificado por el hombre en el laboratorio.
El término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta corporal integrada a un antígeno y preferiblemente se refiere a una respuesta inmune celular o a una respuesta inmune tanto celular como humoral. La respuesta inmune puede ser protectora/preventiva/profiláctica y/o terapéutica.
"Inducir una respuesta inmune" puede significar que no hubo respuesta inmune contra un antígeno particular antes de la inducción, pero también puede significar que había un cierto nivel de respuesta inmune contra un antígeno particular antes de la inducción y después de la inducción de dicha respuesta inmune está mejorado. De este modo, "inducir una respuesta inmune" también incluye "potenciar una respuesta inmune". Preferiblemente, después de inducir una respuesta inmune en un sujeto, dicho sujeto está protegido contra el desarrollo de una enfermedad tal como una enfermedad infecciosa, en particular una enfermedad viral como la descrita en este documento, o una enfermedad maligna o la enfermedad se mejora mediante la inducción de una respuesta inmune. Por ejemplo, se puede inducir una respuesta inmune contra un antígeno viral tal como hCMV-pp65 en un paciente que tiene una enfermedad viral o en un sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad viral. Por ejemplo, se puede inducir una respuesta inmune contra un antígeno asociado a tumor tal como NY-ESO-1, TPTE o PLAC1 en un paciente que tiene una enfermedad maligna o en un sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad maligna. Inducir una respuesta inmune en este caso puede significar que se mejora la condición de la enfermedad del sujeto, que el sujeto no desarrolla metástasis, o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad maligna no desarrolla una enfermedad maligna.
Se entiende que una "respuesta inmune celular", una "respuesta celular", una "respuesta celular contra un antígeno" o un término similar significan que incluye una respuesta celular dirigida a células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I o clase II. La respuesta celular se refiere a células llamadas células T o linfocitos T que actúan ya sea como "ayudantes" o "asesinos". Las células T auxiliares (también denominadas células T CD4+) juegan un papel central regulando la respuesta inmune y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) matan células enfermas tales como células infectadas o células malignas, impidiendo la producción de células más enfermas.
El término “antígeno” se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el que se genera una respuesta inmune. Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente invención es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que es preferiblemente específica para el antígeno. El término “antígeno” incluye en particular proteínas, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, especialmente ARN y ADN, y nucleótidos.
Un antígeno es preferiblemente un producto que corresponde a o se deriva de un antígeno de origen natural. Tales antígenos de origen natural pueden incluir o se pueden derivar de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos o un antígeno también puede ser un antígeno asociado a tumor. De acuerdo con la presente invención, un antígeno puede corresponder a un producto de origen natural, por ejemplo, una proteína viral, o una parte de la misma.
El término "agente que comprende un antígeno" se refiere a una entidad que comprende un antígeno tal como un virus que comprende un antígeno viral. Un ejemplo es hCMV que comprende hCMV-pp65.
En una realización preferida, un antígeno es un antígeno asociado a tumor, esto es, un constituyente de células malignas que puede derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular los antígenos que se producen, preferiblemente en gran cantidad, intracelular o como antígenos de superficie en las células malignas.
En particular, el antígeno o sus péptidos deben ser reconocibles por un receptor de células T. Preferiblemente, el antígeno o péptido, si es reconocido por un receptor de células T, es capaz de inducir en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, expansión clonal de la célula T que lleva el receptor de células T reconociendo específicamente el antígeno o péptido. En el contexto de las realizaciones de la presente invención, el antígeno se presenta preferiblemente por una célula, preferiblemente por una célula presentadora de antígeno y/o una célula enferma, en el contexto de moléculas de MHC, lo que da como resultado una reacción inmune contra el antígeno.
En el contexto de la presente invención, los términos “antígeno asociado a tumor” o “antígeno tumoral” se refieren a proteínas que están bajo condiciones normales expresadas específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas de desarrollo específicas, por ejemplo, el antígeno asociado con el tumor puede estar en condiciones normales expresadas específicamente en tejido estomacal, preferiblemente en la mucosa gástrica, en órganos reproductores, por ejemplo, en testículos, en tejido trofoblástico, por ejemplo, en placenta o en células de líneas germinales, y se expresan o se expresan aberrantemente en uno o más tejidos tumorales o cancerígenos. En este contexto, "un número limitado" significa preferiblemente no más de 3, más preferiblemente no más de 2. Los antígenos asociados a tumores en el contexto de la presente invención incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferiblemente antígenos de diferenciación específicos de tipo celular, esto es, proteínas que están bajo condiciones normales específicamente expresadas en cierto tipo de células en una cierta etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo, esto es, proteínas que están bajo condiciones normales específicamente expresadas en testículos y a
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veces en placenta y antígenos específicos de líneas germinales. En el contexto de la presente invención, el antígeno asociado a tumor está asociado preferiblemente con la superficie celular de una célula maligna y preferiblemente no es
o sólo se expresa rara vez en tejidos normales. Preferiblemente, el antígeno asociado a tumor o la expresión aberrante del antígeno asociado a tumor identifica las células malignas. En el contexto de la presente invención, el antígeno asociado a tumor que se expresa por una célula maligna en un sujeto, por ejemplo, un paciente que sufre de una enfermedad maligna es preferiblemente una autoproteína en dicho sujeto. En las realizaciones preferidas, el antígeno asociado a tumor en el contexto de la presente invención se expresa bajo condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, esto es, tejidos u órganos que cuando se dañan por el sistema inmune no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o solo apenas accesibles por el sistema inmune. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno asociado a tumor es idéntica entre el antígeno asociado a tumor que se expresa en tejidos normales y el antígeno asociado a tumor que se expresa en tejidos malignos. Preferiblemente, un antígeno asociado a tumor se presenta por una célula maligna en la que se expresa.
En las realizaciones preferidas, un antígeno es un antígeno viral tal como hCMV-pp65 y la presente invención implica la estimulación de una respuesta de CTL frente a células infectadas que expresan dicho antígeno viral y que presenta preferiblemente dicho antígeno viral con MHC de clase I.
El citomegalovirus es un género herpesvirus del grupo herpesvirus. En humanos es comúnmente conocido como hCMV
o Herpesvirus humano 5 (HHV-5). Todos los herpesvirus comparten una capacidad característica de permanecer latente dentro del cuerpo durante largos períodos.
Las infecciones por hCMV se asocian frecuentemente con las glándulas salivales, aunque pueden encontrarse en todo el cuerpo. La infección por hCMV también puede ser mortal para pacientes inmunocomprometidos (por ejemplo, pacientes con HIV, receptores de trasplante de órganos o neonatos). Otros virus CMV se encuentran en varias especies de mamíferos, pero las especies aisladas de animales difieren de hCMV en términos de estructura genómica, y no se ha informado que causan enfermedad humana.
El hCMV se encuentra en todas las localizaciones geográficas y grupos socioeconómicos, e infecta entre el 50% y el 80% de los adultos en los Estados Unidos (40% en todo el mundo), como lo indica la presencia de anticuerpos en gran parte de la población general. El hCMV es también el virus más frecuentemente transmitido a un feto en desarrollo. La infección por hCMV está más extendida en los países en desarrollo y en las comunidades con menor nivel socioeconómico y representa la causa viral más importante de defectos de nacimiento en los países industrializados.
Dos proteínas CMV, fosfoproteína 65 (pp65, CMV-pp65) y proteína temprana inmediata 1 (IE-1), son objetivos principales de la respuesta inmune celular.
El término "hCMV-pp65" se refiere preferiblemente a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
Siempre que de acuerdo con la invención hCMV-pp65, en particular la SEQ ID NO: 1, una secuencia de epítopos de hCMV-pp65, en particular SEQ ID NO: 108-110, o una secuencia de receptores de células T específica para hCMVpp65, en particular SEQ ID NOs: 4-29, se implique, el objetivo es preferiblemente inducir o determinar una respuesta inmune contra hCMV o una célula diana infectada por hCMV y preferiblemente caracterizada por la presentación de hCMV-pp65, y para diagnosticar, tratar o prevenir una infección por hCMV. Preferiblemente, la respuesta inmune implica la estimulación de una respuesta de CTL anti-hCMV-pp65 frente a células infectadas que expresan hCMV-pp65 y preferiblemente que presentan hCMV-pp65 con MHC de clase I.
En las realizaciones preferidas, un antígeno es un antígeno asociado a tumor tal como NY-ESO-1, TPTE o PLAC1 y la presente invención implica la estimulación de una respuesta CTL antitumoral contra células malignas que expresan dicho antígeno asociado a tumor y que presenta preferiblemente dicho antígeno asociado a tumor con MHC de clase I.
NY-ESO-1 es un antígeno de cáncer/testículo expresado en tejidos adultos normales únicamente en las células germinales testiculares de adultos normales y en diversos cánceres. Induce la inmunidad humoral y celular específica en pacientes con cáncer que expresa NY-ESO-1.
El término "NY-ESO-1" se refiere preferiblemente a la NY-ESO-1 humana y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 de la lista de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
Siempre que de acuerdo con la invención NY-ESO-1, en particular SEQ ID NO: 2, una secuencia de epítopo de NY-ESO-1, en particular SEQ ID NOs: 111-117 y 175 o una secuencia de receptor de células T específica para NY-ESO-1, en particular SEQ ID NOs: 30-47, 140-151, 176 y 177 se implique, el objetivo es preferiblemente inducir o determinar una respuesta inmune contra células malignas que expresan NY-ESO-1 y preferiblemente caracterizada por la presentación de NY-ESO-1, y para diagnosticar, tratar o prevenir una enfermedad maligna que implica células que expresan NY-ESO-1. Preferiblemente, la respuesta inmune implica la estimulación de una respuesta de CTL anti-NY
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ESO-1 frente a células malignas que expresan NY-ESO-1 y que presentan preferiblemente NY-ESO-1 con MHC de clase I.
El término "TPTE" se refiere a "fosfatasa transmembrana con homología de tensina". El término “TPTE” se refiere preferiblemente a TPTE humana y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
La expresión de TPTE en tejidos sanos se limita a los testículos y las cantidades de transcripción están por debajo del límite de detección en todos los demás especímenes de tejido normal. Por el contrario, la expresión de TPTE se encuentra en diferentes tipos de cáncer incluyendo melanoma maligno, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma de células renales y cáncer cervical.
La transcripción de TPTE se inicia durante el curso de la transformación maligna por hipometilación de ADN asociada al cáncer. Además, TPTE promueve la progresión del cáncer y la diseminación metastásica de las células cancerosas. En particular, TPTE es vital para la quimiotaxis eficiente, un procedimiento que está implicado en múltiples aspectos de la progresión del cáncer, incluyendo la invasión del cáncer y metástasis con impacto en el retorno linfocítico dirigido y el destino metastásico de las células cancerosas. La expresión de TPTE en tumores primarios se asocia con una velocidad significativamente mayor de enfermedad metastásica.
Siempre que de acuerdo con la invención TPTE, en particular SEQ ID NO: 3, una secuencia de epítopo de TPTE, en particular SEQ ID NOs: 118-139 y 178-187, o una secuencia de receptor de célula T específica para TPTE, en particular SEQ ID NOs: 48-107 y 188-193 se implique, el objetivo es preferiblemente inducir o determinar una respuesta inmune contra células malignas que expresan TPTE y preferiblemente caracterizada por la presentación de TPTE, y para diagnosticar, tratar o prevenir una enfermedad maligna implicando células que expresan TPTE. Preferiblemente, la respuesta inmune implica la estimulación de una respuesta de CTL anti-TPTE contra células malignas que expresan TPTE y preferiblemente que presentan TPTE con MHC de clase I.
El término "PLAC1" se refiere a "proteína 1 específica de placenta". El término PLAC1 se refiere preferiblemente a PLAC1 humano y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 174 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
PLAC1 es un gen específico de placenta que con frecuencia se activa aberrantemente y se expresa altamente en una variedad de tipos de tumores. La expresión de PLAC1 se ha encontrado, por ejemplo, en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de células renales, cáncer hepático, sarcoma, cáncer de tiroides y cáncer de cabeza y cuello. PLAC1 se expresa en el 82% de los pacientes con cáncer de mama. En cuanto al cáncer de pulmón y al cáncer gástrico, PLAC1 se expresa en 42 y 58% de los casos, respectivamente.
El silenciamiento mediado por ARNi de PLAC1 en células de cáncer de mama MCF-7 y BT-549 perjudica profundamente la motilidad, migración e invasión e induce un bloqueo del ciclo celular G1/S con una abrogación casi completa de la proliferación. La modificación genética de PLAC1 se asocia con disminución de la expresión de ciclina D1 y fosforilación reducida de AKT quinasa. PLAC1 está implicado no sólo en la proliferación celular sino también en la motilidad, migración e invasión celular.
Siempre que de acuerdo con la invención PLAC1, en particular SEQ ID NO: 174, una secuencia de epítopo de PLAC1, en particular SEQ ID NOs: 172, 173 y 196, o una secuencia de receptor de célula T específica para PLAC1, en particular SEQ ID NOs: 152-171, 194 y 195 se implique, el objetivo es preferiblemente inducir o determinar una respuesta inmune contra células malignas que expresan PLAC1 y preferiblemente caracterizada por la presentación de PLAC1, y para diagnosticar, tratar o prevenir una enfermedad maligna que implica células que expresan PLAC1. Preferiblemente, la respuesta inmune implica la estimulación de una respuesta de CTL anti-PLAC1 frente a células malignas que expresan PLAC1 y preferiblemente que presentan PLAC1 con MHC de clase I.
Las secuencias antigénicas descritas anteriormente incluyen cualquier variante de dichas secuencias, en particular mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están presentes naturalmente. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya significación a menudo no está clara. La secuenciación genética completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen dado. Un homólogo de especie es un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos con una especie de origen diferente a la de un ácido nucleico dado o secuencia de aminoácidos. Los términos "CMV-pp65", "NY-ESO-1", "TPTE" y "PLAC1" abarcarán (i) variantes de empalme, (ii) variantes modificadas postraduccionalmente, incluyendo particularmente variantes con diferente glicosilación tal como estado de Nglicosilación, (iii) variantes de conformación, y (iv) variantes relacionadas con la enfermedad y no relacionadas con la enfermedad. Preferiblemente, "CMV-pp65", "NY-ESO-1", "TPTE" o "PLAC1" está presente en su conformación nativa.
"Célula diana" significará una célula que es un objetivo para una respuesta inmune tal como una respuesta inmune celular. Las células diana incluyen células presentadoras de un antígeno o un epítopo de antígeno, esto es, un fragmento de péptido derivado de un antígeno, e incluyen cualquier célula indeseable tal como una célula infectada con
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virus o una célula maligna como se ha descrito anteriormente. En realizaciones preferidas, la célula diana es una célula que expresa un antígeno como se describe en este documento y que presenta preferiblemente dicho antígeno con MHC de clase I.
El término “sujeto expuesto previamente a un antígeno” significa un sujeto tal como un ser humano que previamente tiene contacto con un antígeno y que es preferiblemente seropositivo para el antígeno y/o un agente que comprende el antígeno. Dicha seropositividad se puede determinar determinando una respuesta inmune al antígeno o un agente que comprende el antígeno o un componente de dicho agente distinto del antígeno, por ejemplo, otro antígeno, en el sujeto. Dicha determinación de una respuesta inmune preferiblemente comprende determinar una respuesta de anticuerpo tal como una respuesta de IgG.
El término “epítopo” se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, esto es, a una parte
o fragmento de la molécula que es reconocida por el sistema inmune, por ejemplo, que es reconocida por una célula T, en particular cuando se presentan en el contexto de moléculas de MHC. Un epítopo de una proteína tal como un antígeno asociado a tumor o antígeno viral comprende preferiblemente una parte continua o discontinua de dicha proteína y está preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede ser preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 aminoácidos de longitud. Se prefiere particularmente que el epítopo en el contexto de la presente invención es un epítopo de las células T.
Los términos "epítopo", "fragmento de un antígeno", "péptido antigénico" y "péptido" se usan indistintamente en este documento y preferiblemente se refieren a una representación incompleta de un antígeno que es preferiblemente capaz de provocar una respuesta inmune contra el antígeno o una célula que expresa o comprende y presenta preferiblemente el antígeno. Preferiblemente, los términos se refieren a una parte inmunogénica de un antígeno. Preferiblemente, es una parte de un antígeno que se reconoce (esto es, se une específicamente) mediante un receptor de células T, en particular si se presenta en el contexto de moléculas de MHC. Ciertas porciones inmunogénicas preferidas se unen a una molécula de MHC de clase I o de clase II. Como se usa en este documento, se dice que una parte inmunogénica se “une a” una molécula de MHC de clase I o de clase II si tal unión es detectable usando cualquier ensayo conocido en la técnica.
Preferiblemente, los péptidos antigénicos descritos en este documento que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 y 196 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos son capaces de estimular una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno del que se derivan o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferiblemente caracterizadas por la presentación del antígeno. Preferiblemente, un péptido antigénico es capaz de estimular una respuesta celular frente a una célula caracterizada por la presentación del antígeno con MHC de clase I y preferiblemente es capaz de estimular un CTL sensible al antígeno. Preferiblemente, los péptidos antigénicos descritos en este documento son péptidos presentes en MHC de clase I y/o clase II o se pueden procesar para producir péptidos presentes en MHC de clase I y/o clase II. Preferiblemente, la secuencia unida a la molécula de MHC se selecciona de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 y 196.
Si se va a presentar directamente un péptido antigénico, esto es sin procesamiento, en particular sin escisión, tiene una longitud que es apropiada para la unión a una molécula de MHC, en particular una molécula de MHC de clase I, y preferiblemente es 7-20 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 7-12 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 8-11 aminoácidos de longitud, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, la secuencia de un péptido antigénico que va a estar presente directamente corresponde sustancialmente y es preferiblemente completamente idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 y 196.
Si está presente un péptido antigénico después del procesamiento, en particular después de la escisión, el péptido producido por procesamiento tiene una longitud que es apropiada para la unión a una molécula MHC, en particular una molécula de MHC de clase, y preferiblemente es 7-20 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 7-12 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 8-11 aminoácidos de longitud, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, la secuencia del péptido que se va a presentar después del procesamiento corresponde sustancialmente y es preferiblemente completamente idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 y 196. De este modo, un péptido antigénico descrito en este documento en una realización comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 y 196 y después del procesamiento del péptido antigénico forma una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 y 196.
Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que se corresponden sustancialmente con una secuencia de un péptido que se presenta por moléculas de MHC pueden diferir en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento de TCR del péptido como se presenta por el MHC o por la unión de péptidos a MHC. Tales péptidos sustancialmente correspondientes son preferiblemente también capaces de estimular una respuesta celular específica de antígeno tal como CTL específico de antígeno. Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren de un péptido presente en residuos que no afectan al reconocimiento de TCR, pero mejoran la estabilidad de unión a MHC
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pueden mejorar la inmunogenicidad del péptido antigénico, y se pueden denominar en este documento como "péptidos optimizados". Utilizando el conocimiento existente acerca de cuáles de estos residuos pueden tener más probabilidades de afectar la unión a MHC o al TCR, se puede emplear un enfoque racional para el diseño de péptidos sustancialmente correspondientes. Los péptidos resultantes que son funcionales se contemplan como péptidos antigénicos. Las secuencias, como se ha discutido anteriormente, están abarcadas por el término "variante" utilizado en este documento.
Un péptido antigénico se puede unir a moléculas de MHC tales como moléculas de MHC en la superficie de una célula y, de este modo, puede ser un "péptido de unión a MHC". El término "péptido de unión a MHC" se refiere a un péptido que se une a una molécula de MHC clase I y/o MHC clase II. En el caso de complejos de péptido/MHC de clase I, los péptidos de unión son por lo general de 8-10 aminoácidos de longitud, aunque pueden ser eficaces péptidos más largos
o más cortos. En el caso de los complejos de MHC/péptido de clase II, los péptidos de unión tienen por lo general 10-25 aminoácidos de longitud y son en particular de 13-18 aminoácidos de longitud, mientras que los péptidos más largos y más cortos pueden ser eficaces.
El término "parte" se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia o proteína de aminoácidos, el término "parte" de la misma puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura. Preferiblemente, una parte de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos 80%, y más preferiblemente al menos 90% de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, si la parte es una fracción discontinua dicha fracción discontinua se compone de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más partes de una estructura, siendo cada parte un elemento continuo de la estructura. Por ejemplo, una fracción discontinua de una secuencia de aminoácidos puede estar compuesta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más, preferiblemente no más de 4 partes de dicha secuencia de aminoácidos, en la que cada parte preferiblemente comprende al menos 5 aminoácidos continuos, al menos 10 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 30 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos.
Los términos "parte" y "fragmento" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos o una proteína se refiere a un elemento continuo de dicha estructura. Una porción, una parte o un fragmento de una estructura preferiblemente comprende una
o más propiedades funcionales de dicha estructura. Por ejemplo, una porción, una parte o un fragmento de un epítopo, péptido o proteína es preferiblemente inmunológicamente equivalente al epítopo, péptido o proteína de la que se deriva. En el contexto de la presente invención, una "parte" de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos comprende preferiblemente, preferiblemente, consiste en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 94%, al menos 96%, al menos 98%, al menos 99% de toda la estructura o secuencia de aminoácidos. Las porciones, partes o fragmentos como se ha expuesto anteriormente se abarcan por el término "variante" utilizado en este documento.
"Procesamiento de antígeno" se refiere a la degradación de un antígeno en productos de procesión, que son fragmentos de dicho antígeno (por ejemplo, la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas de MHC para presentación por células, preferiblemente células presentadoras de antígeno a células T específicas.
Una célula presentadora de antígeno (APC) es una célula que muestra antígeno en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo usando su receptor de células T (TCR). Las células presentadoras de antígenos procesan antígenos y los presentan a las células T.
Las células presentadoras de antígenos profesionales son muy eficaces en el antígeno de internalización, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptores, y luego exhiben un fragmento del antígeno, unido a una molécula de MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de moléculas MHC de clase 11-antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Entonces se produce una señal coestimuladora adicional por la célula presentadora de antígeno, que conduce a la activación de la célula T. La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células profesionales que presentan antígenos.
Los principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales son células dendríticas, que tienen el intervalo más amplio de presentación de antígenos, y son probablemente las células presentadoras de antígenos más importantes, macrófagos, células B y ciertas células epiteliales activadas.
Las células presentadoras de antígeno no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas de MHC de clase II requeridas para la interacción con células T naïve; estos se expresan sólo mediante la estimulación de las células presentadoras de antígenos no profesionales por ciertas citoquinas tales como IFN.
Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a células T a través de ambas vías de presentación de antígenos de MHC de clase II y I. Es bien sabido que las células
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dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad antitumoral.
Se pueden obtener células dendríticas y progenitores a partir de sangre periférica, médula ósea, células infiltrantes de tumores, células infiltrantes de tejidos peritumorales, ganglios linfáticos, bazo, piel, sangre de cordón umbilical o cualquier otro tejido o fluido apropiado. Por ejemplo, las células dendríticas se pueden diferenciar ex vivo adicionando una combinación de citoquinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNFa a cultivos de monocitos cosechados de sangre periférica. Alternativamente, las células CD34 positivas recolectadas de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o médula ósea se pueden diferenciar en células dendríticas mediante la adición a las combinaciones de medio de cultivo de GM-CSF, IL-3, TNF, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/u otro(s) compuesto(s) que inducen la diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas.
Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que se pueden usar como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no debe ser interpretada para excluir todas las posibles etapas intermedias de diferenciación.
Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como células presentadoras de antígeno con una alta capacidad para la captación y procesamiento del antígeno, que se correlaciona con la alta expresión del receptor de Fc y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza por lo general por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de superficie celular responsables de la activación de células T, tales como MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB).
La maduración de células dendríticas se denomina como estado de activación de células dendríticas en el que tales células dendríticas que presentan antígenos conducen a cebado de células T, mientras que la presentación por células dendríticas inmaduras resulta en tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), unión de CD40 sobre la superficie celular dendrítica por CD40L, y sustancias liberadas de células sometidas a una muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden derivar cultivando células de médula ósea in vitro con citoquinas, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.
Células tales como células presentadoras de antígeno o células diana se pueden cargar con péptidos presentes en MHC de clase I exponiendo, esto es pulsando, las células con el péptido o transduciendo las células con ácido nucleico, preferiblemente ARN, codificando un péptido o proteína que comprende el péptido que se puede presentar, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica el antígeno.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica como se describe en este documento comprende una célula presentadora de antígeno cargada con péptido antigénico. A este respecto, los protocolos se pueden basar en el cultivo in vitro/diferenciación de células dendríticas modificadas genéticamente de tal manera que presenten artificialmente el péptido antigénico. La producción de células dendríticas modificadas genéticamente puede implicar la introducción de ácidos nucleicos que codifican antígenos o péptidos antigénicos en células dendríticas. La transfección de células dendríticas con ARNm es una técnica prometedora de carga de antígeno para estimular una fuerte inmunidad antitumoral. Dicha transfección puede tener lugar ex vivo, y una composición farmacéutica que comprende dichas células transfectadas puede utilizarse a continuación con fines terapéuticos. Alternativamente, se puede administrar a un paciente un vehículo de administración génica que se dirige a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno, dando como resultado una transfección que se produce in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas, por ejemplo, se puede llevar a cabo generalmente utilizando cualquier método conocido en la técnica, tal como los descritos en el documento WO 97/24447, o el enfoque de pistola génica descrito por Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456-460,1997. La carga de antígeno de células dendríticas se puede lograr incubando células dendríticas o células progenitoras con antígeno, ADN (desnudo o dentro de un vector plasmídico) o ARN; o con bacterias o virus recombinantes que expresan antígenos (por ejemplo, vectores de vacuna, fowlpox, adenovirus o lentivirus).
El término "inmunogenicidad" se refiere a la eficacia relativa de un antígeno para inducir una reacción inmune.
El término "célula inmunorreactiva" en el contexto de la presente invención se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmune. Una "célula inmunorreactiva" es preferiblemente capaz de unirse a un antígeno
o una célula caracterizada por la presentación de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno y mediando una respuesta inmune. Por ejemplo, tales células secretan citoquinas y/o quimiocinas, matan microbios, secretan anticuerpos, reconocen células infectadas o cancerosas, y opcionalmente eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T auxiliares, células T infiltrantes de tumores), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferiblemente, en el contexto de la presente invención, las "células inmunorreactivas" son células T, preferiblemente células T CD4+ y/o CD8+.
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Preferiblemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas MHC tales como en la superficie de las células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como células malignas o células infectadas con virus. Preferiblemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un péptido antigénico derivado de dicho antígeno sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T auxiliar (célula T CD4+) portadora de receptores que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas MHC de clase II, tal sensibilidad o reactividad puede implicar la liberación de citoquinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, tal sensibilidad o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas de MHC clase I, esto es, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, a través de apoptosis o lisis de células mediadas por perforina De acuerdo con la invención, la sensibilidad de CTL puede incluir flujo sostenido de calcio, división celular, producción de citoquinas tales como IFN- y TNF-, inducción de la expresión de marcadores de activación tales como CD44 y CD69, y muerte citolítica específica de células diana que expresan antígeno. La sensibilidad de CTL también se puede determinar usando un informador artificial que indique con precisión la sensibilidad de CTL. Tales CTL que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno y son sensibles o reactivos también se denominan "CTL sensible al antígeno" en este documento. Si la célula es una célula B, tal sensibilidad puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.
De acuerdo con la invención, el término "célula inmunorreactiva" también incluye una célula que puede madurar en una célula inmune (tal como una célula T, en particular una célula T auxiliar o una célula T citolítica) con estimulación apropiada. Las células inmunorreactivas comprenden células madre hematopoyéticas CD34+, células T inmaduras y maduras y células B inmaduras y maduras. Si se desea una producción de células T auxiliares o citolíticas que reconocen un antígeno, la célula inmunorreactiva se pone en contacto con una célula que presenta un antígeno o un péptido antigénico en condiciones que favorecen la producción, diferenciación y/o selección de células T citolíticas y de células T auxiliares. La diferenciación de los precursores de células T en una célula T citolítica, cuando se expone a un antígeno, es similar a la selección clonal del sistema inmune.
Una "célula linfoide" es una célula que, opcionalmente después de una modificación apropiada, por ejemplo, después de la transferencia de un receptor de células T, es capaz de producir una respuesta inmune tal como una respuesta inmune celular, o una célula precursora de dicha célula, e incluye linfocitos, preferiblemente linfocitos T, linfoblastos y células plasmáticas. Una célula linfoide puede ser una célula inmunorreactiva como se describe en este documento. Una célula linfoide preferida es una célula T que carece de expresión endógena de un receptor de células T y que puede ser modificada para expresar dicho receptor de células T sobre la superficie celular.
Los términos “células T” y “linfocitos T” se usan indistintamente en este documento e incluyen células T auxiliares (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.
Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, tales como células B y células asesinas naturales por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptores de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos de células T, cada uno con una función distinta.
Las células T auxiliares ayudan a otros glóbulos blancos en procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T auxiliares se activan cuando se presentan con antígenos peptídicos por moléculas MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). Una vez activados, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citoquinas que regulan o ayudan en la respuesta inmune activa.
Las células T citotóxicas destruyen células tumorales y células viralmente infectadas, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+, ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas uniéndose al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.
Una mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) existente como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real se compone de dos cadenas peptídicas separadas, que se producen a partir de los genes independientes de receptores de células T alfa y beta (TCR y TCR) y se denominan cadenas de TCR  y . Las células T  (células T delta gamma) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. Sin embargo, en las células T, el TCR está formado por una cadena  y una cadena . Este grupo de células T es mucho menos común (2% del total de células T) que las células T.
La estructura del receptor de células T es muy similar a los fragmentos Fab de inmunoglobulina, que son regiones definidas como la cadena ligera y pesada combinada de un brazo de anticuerpo. Cada cadena de TCR es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina y posee un dominio (V) de variable de inmunoglobulina (Ig) N-terminal, un
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dominio (C) de constante de Ig, una región transmembrana/ que atraviesa la membrana celular y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal.
De acuerdo con la invención, el término “región variable de un receptor de células T” se refiere a los dominios variables de las cadenas de TCR.
El dominio variable tanto de la cadena  de TCR como de la cadena  tiene tres regiones determinantes de hipervariables o complementarias (CDR), mientras que la región variable de la cadena  tiene un área adicional de hipervariabilidad (HV4) que normalmente no contacta el antígeno y por lo tanto no se considera una CDR. CDR3 es la CDR principal responsable de reconocer el antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDR1 de la cadena  interactúa con la parte N-terminal del péptido antigénico, mientras que CDR1 de la cadena  interactúa con la parte C-terminal del péptido. Se cree que la CDR2 reconoce el MHC. No se cree que la CDR4 de la cadena  participe en el reconocimiento del antígeno, pero se ha demostrado que interactúa con los superantígenos.
De acuerdo con la invención, el término "al menos una de las secuencias CDR" significa preferiblemente al menos la secuencia CDR3. El término "secuencias CDR de una cadena de receptores de células T" se refiere preferiblemente a CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena  o cadena  de un receptor de células T.
El dominio constante del dominio TCR consiste en secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma enlaces disulfuro, que forma un enlace entre las dos cadenas.
Todas las células T se originan a partir de células madre hematopoyéticas en la médula ósea. Los progenitores hematopoyéticos derivados de células madre hematopoyéticas pueblan el timo y se expanden por división celular para generar una gran población de timocitos inmaduros. Los primeros timocitos no expresan ni CD4 ni CD8, y por lo tanto se clasifican como células doblemente negativas (CD4-CD8-). A medida que avanza a través de su desarrollo, se convierten en timocitos doblemente positivos (CD4+ CD8+), y finalmente maduran a timocitos positivos simples (CD4+ CD8 o CD4-CD8+) que luego son liberados del timo a los tejidos periféricos.
La primera señal en la activación de células T se proporciona mediante la unión del receptor de células T a un péptido corto presentado por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en otra célula. Esto asegura que sólo se activa una célula T con un TCR específico para ese péptido. La célula asociada suele ser una célula presentadora de antígenos profesional (APC), normalmente una célula dendrítica en el caso de respuestas ingenuas, aunque las células B y los macrófagos pueden ser APCs importantes. Los péptidos presentes en las células T CD8+ por moléculas del MHC clase I tienen una longitud de 8-10 aminoácidos; Los péptidos presentes en las células T CD4+ por moléculas del MHC clase II son más largos, ya que los extremos de la hendidura de unión de la molécula del MHC clase II están abiertos.
Las células T se pueden preparar generalmente in vitro o ex vivo, usando procedimientos estándar. Por ejemplo, las células T pueden estar presentes dentro (o aisladas de) médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, usando un sistema de separación de células comercialmente disponible. Alternativamente, las células T se pueden derivar de humanos relacionados o no relacionados, animales no humanos, líneas celulares o cultivos. Una "muestra que comprende células T" puede ser, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
Las células T se pueden estimular con antígeno, péptido, ácido nucleico y/o una célula presentadora de antígeno (APC) que expresan un antígeno. Dicha estimulación se realiza bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que son específicas para un antígeno, un péptido y/o células presentadoras de un antígeno o un péptido.
La activación específica de células T CD4+ o CD8+ puede ser detectada de una variedad de maneras. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen la detección de la proliferación de células T, la producción de citoquinas (por ejemplo, linfoquinas) o la generación de actividad citolítica. Para las células T CD4+, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la proliferación de células T. Para las células T CD8+, un método preferido para detectar la activación específica de células T es la detección de la generación de actividad citolítica.
Con el fin de generar líneas de células T CD8+, se pueden usar células presentadoras de antígeno, preferiblemente células presentadoras de antígenos autólogas, transfectadas con un ácido nucleico que produce el antígeno, como células estimuladoras.
Los ácidos nucleicos tales como las cadenas de receptor de células T (TCR) codificadoras de ARN se pueden introducir en células linfoides tales como células T u otras células con potencial lítico. En una realización apropiada, las cadenas  y  de TCR se clonan a partir de una línea de células T específicas de antígeno y se usan para la terapia de células T adoptivas. Se describen en este documento receptores de células T específicos para un antígeno o péptido antigénico descrito en este documento. En general, los receptores de células T se describen en este documento que reconocen o
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se unen a péptidos antigénicos presentes en el contexto de MHC. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas  y  de un receptor de células T, por ejemplo, un receptor de células T descrito en este documento, puede estar contenido en moléculas de ácido nucleico separadas tales como vectores de expresión o, alternativamente, en una molécula de ácido nucleico única. De acuerdo con lo anterior, el término "un ácido nucleico que codifica un receptor de células T" se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas de receptores de células T en el mismo o preferiblemente en diferentes moléculas de ácido nucleico.
El término "célula inmunorreactiva reactiva con un péptido" se refiere a una célula inmunorreactiva que cuando reconoce el péptido, en particular si se presenta en el contexto de moléculas de MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como células malignas o células infectadas por virus, ejerce funciones efectoras de células inmunorreactivas como se ha descrito anteriormente.
El término "receptor de células T reactivo con un péptido" se refiere a un receptor de células T que cuando está presente en una célula inmunorreactiva reconoce el péptido, en particular si se presenta en el contexto de moléculas de MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como células malignas
o células infectadas con virus, de manera que la célula inmunorreactiva ejerce funciones efectoras de células inmunorreactivas como se ha descrito anteriormente.
El término "célula T reactiva al antígeno" se refiere a una célula T que reconoce un antígeno si se presenta en el contexto de moléculas MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como células malignas o células infectadas por virus y ejerce funciones efectoras de células T como se ha descrito anteriormente.
El término "célula linfoide específica de antígeno" se refiere a una célula linfoide que, en particular cuando se proporciona con un receptor de células T específico de antígeno, reconoce el antígeno si se presenta en el contexto de moléculas de MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como células malignas o células infectadas con virus y preferiblemente ejerce funciones efectoras de células T como se ha descrito anteriormente. Se considera que las células T y otras células linfoides son específicas para el antígeno si las células destruyen células diana que expresan un antígeno y/o presentan un péptido antigénico. La especificidad de células T se puede evaluar usando cualquiera de una variedad de técnicas estándar, por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación. Alternativamente, se puede medir la síntesis de linfoquinas (tales como interferón-)
El término “complejo principal de histocompatibilidad” y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas MHC clase I y MHC clase II y se refieren a un complejo de genes que se produce en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas de MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígeno o células enfermas en reacciones inmunitarias, en donde las proteínas o moléculas de MHC unen péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y muestran tanto antígenos propios (fragmentos peptídicos de la misma célula) como antígenos no autónomos (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T.
La región MHC se divide en tres subgrupos, clase I, clase II y clase III. Las proteínas MHC clase I contienen una cadena  y 2-microglobulina (no parte del MHC codificado por el cromosoma 15). Presentan fragmentos de antígeno a células T citotóxicas. En la mayoría de las células del sistema inmune, específicamente en las células presentadoras de antígeno, las proteínas MHC de clase II contienen cadenas  y  y presentan fragmentos de antígeno a células T auxiliares. La región MHC de clase III codifica para otros componentes inmunes, tales como componentes del complemento y algunos que codifican citoquinas.
En seres humanos, los genes en la región del MHC que codifican las proteínas presentadoras de antígenos en la superficie celular se denominan como genes del antígeno leucocitario humano (HLA). Sin embargo, la abreviatura MHC se utiliza a menudo para referirse a los productos del gen HLA. Los genes HLA incluyen los nueve genes denominados MHC clásicos: [HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, y HLA-DRB1.
En una realización preferida de la invención, una molécula de MHC es una molécula de HLA.
Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno", "célula presentadora de un antígeno", "antígeno presentado por una célula", "antígeno presentado" o expresiones similares se entiende una célula tal como una célula enferma tal como una célula infectada por virus o una célula maligna, o una célula presentadora de antígeno que presenta el antígeno que expresa o un fragmento derivado de dicho antígeno, por ejemplo, por procesamiento del antígeno, en el contexto de moléculas de MHC, en particular moléculas de MHC de Clase I. De manera similar, los términos “enfermedad caracterizada por la presentación de un antígeno” indican una enfermedad que implica células caracterizadas por la presentación de un antígeno, en particular con MHC de clase I. La presentación de un antígeno por una célula se puede realizar transfectando la célula con un ácido nucleico tal como ARN que codifica el antígeno.
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Por "fragmento de un antígeno que se presenta" o expresiones similares se entiende que el fragmento se puede presentar por MHC clase I o clase II, preferiblemente MHC clase I, por ejemplo, cuando se adiciona directamente a las células presentadoras de antígeno. En una realización, el fragmento es un fragmento que se presenta naturalmente por células que expresan un antígeno.
Algunos métodos terapéuticos se basan en una reacción del sistema inmune de un paciente, que da como resultado una lisis de células enfermas que presentan un antígeno con MHC de clase I. A este respecto, por ejemplo, se pueden administrar linfocitos T citotóxicos autólogos específicos para un complejo de un péptido antigénico y una molécula de MHC a un paciente que tiene una enfermedad. Se conoce la producción de tales linfocitos T citotóxicos in vitro. Un ejemplo de un método de diferenciación de células T se puede encontrar en el documento WO-A-9633265. Generalmente, una muestra que contiene células tal como células sanguíneas se toma del paciente y las células se ponen en contacto con una célula que presenta el complejo y que puede causar la propagación de linfocitos T citotóxicos (por ejemplo, células dendríticas). La célula diana puede ser una célula transfectada tal como una célula COS. Estas células transfectadas presentan el complejo deseado en su superficie y, cuando se ponen en contacto con linfocitos T citotóxicos, estimulan la propagación de este último. Los linfocitos T citotóxicos autólogos expandidos por clonación se administran entonces al paciente.
En otro método de selección de linfocitos T citotóxicos, se usan tetrámeros fluorogénicos de complejos de péptido/molécula MHC de clase I para obtener clones de linfocitos T citotóxicos específicos (Altman et al. (1996), Science 274:94-96; Dunbar et al. (1998), Curr. Biol. 8:413-416, 1998).
Además, las células presentadoras del complejo deseado (por ejemplo, células dendríticas) se pueden combinar con linfocitos T citotóxicos de individuos sanos u otra especie (por ejemplo, ratón) que pueden dar lugar a la propagación de linfocitos T citotóxicos específicos con alta afinidad. El receptor de células T de alta afinidad de estos linfocitos T específicos propagados puede clonarse y opcionalmente humanizarse en una extensión diferente, y los receptores de células T así obtenidos se transducen a continuación por transferencia génica, por ejemplo, utilizando vectores retrovirales, en células T de pacientes. La transferencia adoptiva puede entonces llevarse a cabo utilizando estos linfocitos T modificados genéticamente (Stanislawski et al. (2001), Nat Immunol. 2:962-70; Kessels et al. (2001), Nat Immunol. 2:957-61.
Los linfocitos T citotóxicos también se pueden generar in vivo de una manera conocida per se. Un método utiliza células no proliferativas que expresan un complejo MHC de clase I/péptido. Las células usadas aquí serán aquellas que expresan normalmente el complejo, tales como células tumorales irradiadas o células transfectadas con uno o ambos genes necesarios para la presentación del complejo (esto es, el péptido antigénico y la molécula MHC presentadora). Otra forma preferida es la introducción de un antígeno en forma de ARN recombinante que puede ser introducido en células por transferencia liposómica o por electroporación, por ejemplo. Las células resultantes presentan el complejo de interés y son reconocidas por linfocitos T citotóxicos autólogos que luego se propagan.
Se puede conseguir un efecto similar combinando un antígeno o un péptido antigénico con un adyuvante con el fin de hacer posible la incorporación en células presentadoras de antígenos in vivo. El antígeno o péptido antigénico se puede representar como proteína, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno se puede procesar para producir un péptido asociado para la molécula de MHC, mientras que se puede presentar un fragmento del mismo sin necesidad de procesamiento adicional. Este último es el caso en particular, si estos se pueden unir a moléculas de MHC. Se da preferencia a formas de administración en las que el antígeno completo es procesado in vivo por una célula dendrítica, ya que esto también puede producir respuestas de células T auxiliares que son necesarias para una respuesta inmune eficaz (Ossendorp et al., Immunol Lett. (2000), 74:75-9; Ossendorp et al. (1998), J. Exp. Med. 187:693-702. En general, es posible administrar una cantidad eficaz del antígeno asociado a tumor a un paciente mediante inyección intradérmica, por ejemplo. Sin embargo, la inyección también se puede llevar a cabo intranodalmente en un ganglio linfático (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303.
De acuerdo con la invención, se puede usar una "referencia" tal como una muestra de referencia o un organismo de referencia para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los métodos de la invención a partir de una muestra de ensayo o un organismo de ensayo. Por lo general, el organismo de referencia es un organismo sano, en particular un organismo que no padece una enfermedad tal como una enfermedad maligna o una enfermedad viral. Un "valor de referencia" o "nivel de referencia" se puede determinar a partir de una referencia empíricamente midiendo un número suficientemente grande de referencias. Preferiblemente, el valor de referencia se determina midiendo al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 5, preferiblemente al menos 8, preferiblemente al menos 12, preferiblemente al menos 20, preferiblemente al menos 30, preferiblemente al menos 50, o preferiblemente al menos 100 referencias.
El término “inmunoglobulina” se refiere a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulina, preferiblemente a receptores de antígenos tales como anticuerpos o al receptor de células B (BCR). Las inmunoglobulinas se caracterizan por un dominio estructural, esto es, el dominio de la inmunoglobulina, que tiene un pliegue de inmunoglobulina (Ig) característico. El término abarca inmunoglobulinas unidas a la membrana, así como inmunoglobulinas solubles. Las inmunoglobulinas unidas a membrana también se denominan inmunoglobulinas de superficie o inmunoglobulinas de membrana, que generalmente son parte del BCR. Las inmunoglobulinas solubles se denominan generalmente
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anticuerpos. Las inmunoglobulinas generalmente comprenden varias cadenas, por lo general dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro. Estas cadenas se componen principalmente de dominios de inmunoglobulina, tales como el dominio VL (cadena ligera variable), dominio CL (cadena ligera constante) y los dominios CH (cadena pesada constante) CH1, CH2, CH3 y CH4. Hay cinco tipos de cadenas pesadas de inmunoglobulina de mamífero, esto es, , , ,  y  que explican las diferentes clases de anticuerpos, esto es, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. A diferencia de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas solubles, las cadenas pesadas de inmunoglobulinas de membrana o de superficie comprenden un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático corto en su extremo carboxi. En mamíferos hay dos tipos de cadenas ligeras, esto es, lambda y kappa. Las cadenas de inmunoglobulina comprenden una región variable y una región constante. La región constante se conserva esencialmente dentro de los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas, en donde la parte variable es muy diversa y explica el reconocimiento de antígenos.
El término “anticuerpo” se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, e incluye cualquier molécula que comprende una parte de unión a antígeno del mismo. El término “anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales y fragmentos o derivados de los mismos, incluyendo, sin limitación, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos, anticuerpos de cadena única, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo unidos a antígenos y scFv tales como fragmentos Fab y Fab’ y también incluye todas las formas recombinantes de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glicosilados y cualquier fragmento y derivado de anticuerpo que se une al antígeno. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FRs, dispuestas de terminal amino a terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico de complemento.
De acuerdo con la presente invención, un receptor de células T o un anticuerpo es capaz de unirse a una diana predeterminado si tiene una afinidad significativa para dicho objetivo predeterminado y se une a dicho objetivo predeterminado en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" se mide a menudo por constante de disociación de equilibrio (KD). Un receptor de células T o un anticuerpo no es (sustancialmente) capaz de unirse a una diana si no tiene afinidad significativa para dicha diana y no se une significativamente a dicha diana en ensayos convencionales.
Un receptor de células T o un anticuerpo es preferiblemente capaz de unirse específicamente a una diana predeterminada. Un receptor de células T o un anticuerpo es específico para una diana predeterminada si es capaz de unirse a dicha diana predeterminada mientras que no es (sustancialmente) capaz de unirse a otras dianas, es decir, no tiene afinidad significativa con otras dianas y no se une significativamente a otras dianas en ensayos estándar
El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico tal como la inducción de una respuesta inmune humoral y/o celular, la fuerza y/o duración de la reacción inmune inducida, o la especificidad de la reacción inmune inducida. En el contexto de la presente invención, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferiblemente con respecto a los efectos inmunológicos
o propiedades de un péptido o variante de péptido usado para la inmunización. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos cuando se expone al sistema inmune de un sujeto induce una reacción inmune que tiene una especificidad de reacción con la secuencia de aminoácidos de referencia.
El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente invención incluye cualesquiera funciones mediadas por componentes del sistema inmune que resultan, por ejemplo, en la muerte de células infectadas por virus o células tumorales, o en la inhibición de tumores de crecimiento y/o inhibición del desarrollo del tumor, incluyendo la inhibición de la diseminación del tumor y la metástasis. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunitarias en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por células T. Tales funciones comprenden en el caso de una célula T auxiliar (célula T CD4+) el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas MHC de clase II por receptores de células T, la liberación de citocinas y/o activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas de MHC clase I por receptores de células T, la eliminación de células presentadas en el contexto de las moléculas de MHC de clase I, esto es, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, a través de apoptosis o lisis de células mediadas
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por perforina, producción de citoquinas tales como IFN- y TNF-, y la muerte citolítica específica de las células diana que expresan el antígeno.
El término "receptor de células T que tiene la especificidad de otro receptor de células T" significa que los dos receptores de células T, en particular cuando están presentes en una célula inmunorreactiva, reconocen el mismo epítopo, en particular cuando se presentan en el contexto de moléculas de MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como células infectadas con virus o células malignas y proporcionan preferiblemente la célula inmunorreactiva con funciones efectoras como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, la especificidad de unión y/o la afinidad de unión de los receptores de células T son similares o idénticas. En una realización preferida, un "receptor de células T que tiene la especificidad de otro receptor de células T" se refiere a un receptor de células T que comprende al menos las regiones CDR, preferiblemente al menos la región variable del otro receptor de células T. En una realización, los dos receptores de células T son esencialmente idénticos
o idénticos.
De acuerdo con la invención, un ácido nucleico es preferiblemente ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), más preferiblemente ARN, más preferiblemente ARN transcrito in vitro (ARN IVT). Los ácidos nucleicos incluyen de acuerdo con la invención ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas preparadas de forma recombinante y sintetizadas químicamente. Un ácido nucleico puede de acuerdo con la invención estar en forma de una molécula que es monocatenaria o bicatenaria y lineal o cerrada covalentemente para formar un círculo. Se puede emplear un nucleico para su introducción en, esto es, transfección de células, por ejemplo, en la forma de ARN que se puede preparar mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. Además, el ARN se puede modificar antes de su aplicación por secuencias estabilizadoras, taponamiento y poliadenilación.
Los ácidos nucleicos descritos en este documento pueden estar comprendidos en un vector. El término "vector", como se utiliza en este documento, incluye cualquier vector conocido para el experto en la materia incluyendo vectores plasmídicos, vectores cósmidos, vectores fago tales como fago lambda, vectores virales tales como vectores adenovirales o baculovíricos o vectores cromosómicos artificiales tales como cromosomas bacterianos artificiales (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC), o cromosomas artificiales P1 (PAC). Dichos vectores incluyen expresión, así como vectores de clonación. Los vectores de expresión comprenden plásmidos, así como vectores virales y generalmente contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se utilizan generalmente para generar y amplificar un cierto fragmento de ADN deseado y pueden carecer de secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.
Como vector para la expresión de un receptor de células T, cualquiera de un tipo de vector en el que las cadenas de receptor de células T están presentes en diferentes vectores o un tipo de vector en el que las cadenas de receptor de células T están presentes en el mismo vector puede ser usado.
En los casos de la invención en los que una molécula de MHC presenta un antígeno o un péptido antigénico, un ácido nucleico también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha molécula de MHC. La secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de MHC puede estar presente en la misma molécula de ácido nucleico que la secuencia de ácido nucleico que codifica para el antígeno o el péptido antigénico o ambas secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes en diferentes moléculas de ácido nucleico. En este último caso, las dos moléculas de ácido nucleico pueden cotransfectarse en una célula. Si una célula huésped no expresa ni el antígeno ni el péptido antigénico ni la molécula del MHC, ambas secuencias de ácido nucleico que codifican por lo tanto se pueden transfectar en la célula ya sea en la misma molécula de ácido nucleico o en diferentes moléculas de ácido nucleico. Si la célula ya expresa la molécula de MHC, sólo la secuencia de ácido nucleico que codifica para el antígeno o el péptido antigénico se puede transfectar en la célula.
Como se usa en este documento, el término "ARN" significa una molécula que comprende al menos un residuo de ribonucleótido. Por "ribonucleótido" se entiende un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de una unidad estructural beta-D-ribo-furanosa. El término incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado, tal como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleótido, tal como al extremo o los extremos de un ARN o internamente, por ejemplo, en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos no naturales o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados se pueden denominar como análogos o análogos del ARN de origen natural.
De acuerdo con la presente invención, el término "ARN" incluye y preferiblemente se refiere a "ARNm" que significa "ARN mensajero" y se refiere a un "transcrito" que se puede producir usando ADN como plantilla y que codifica un péptido o proteína. El ARNm por lo general comprende una región no traducida 5’, una región codificante de proteína o péptido y una región no traducida 3'. El ARNm tiene un tiempo medio limitado en las células e in vitro. Preferiblemente, el ARNm se produce mediante transcripción in vitro usando una plantilla de ADN. En una realización de la invención, el ARN que se va a introducir en una célula se obtiene mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiada.
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En el contexto de la presente invención, el término "transcripción" se refiere a un procedimiento, en el que el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente invención, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en el que el término "transcripción in vitro" se refiere a un procedimiento en el que ARN, en particular ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, se aplican vectores de clonación para la generación de transcritos. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y están de acuerdo con la presente invención abarcados por el término "vector". De acuerdo con la presente invención, el ARN se puede obtener mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor para cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Se puede obtener una plantilla de ADN para transcripción in vitro clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para la transcripción in vitro. El ADNc se puede obtener por transcripción inversa de ARN. Preferiblemente, se usan vectores de clonación para producir transcritos que generalmente se designan como vectores de transcripción.
El modelo de vector que contiene ADNc puede comprender vectores que llevan diferentes insertos de ADNc que después de la transcripción da como resultado una población de diferentes moléculas de ARN opcionalmente capaces de expresar diferentes factores o pueden comprender vectores que portan sólo una especie de inserto de ADNc que tras la transcripción sólo da como resultado una población de una especie de ARN capaz de expresar sólo un factor. De este modo, es posible producir ARN capaz de expresar un solo factor o producir composiciones de diferentes ARN.
Los ácidos nucleicos descritos de acuerdo con la invención se han aislado preferiblemente. El término “ácido nucleico aislado” significa de acuerdo con la invención que el ácido nucleico fue (i) amplificado in vitro, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) producido de forma recombinante por clonación, (iii) purificado, por ejemplo, por escisión y fraccionamiento electroforético en gel, o (iv) sintetizado, por ejemplo, por síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para la manipulación mediante técnicas de ADN recombinante.
Los ácidos nucleicos pueden, de acuerdo con la invención, estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En realizaciones preferidas, un ácido nucleico está funcionalmente unido a secuencias de control de expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. El término “homólogo” significa que los ácidos nucleicos están también funcionalmente ligados de forma natural y el término "heterólogo" significa que los ácidos nucleicos no están funcionalmente unidos de forma natural.
Un ácido nucleico y una secuencia de control de expresión están "funcionalmente" unidos entre sí, si están unidos covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de expresión. Si el ácido nucleico que se va a traducirse en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de expresión unida funcionalmente a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de expresión da como resultado la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un cambio de marco en la secuencia codificante o dicha secuencia codificante no es capaz de ser traducida a la proteína o péptido deseado.
El término "secuencia de control de expresión" o "elemento de control de expresión" comprende de acuerdo con la invención promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. En realizaciones particulares de la invención, las secuencias de control de expresión pueden ser reguladas. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar en función de la especie o tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias no transcritas en 5’ y no traducidas en 5' y 3’ que están implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción respectivamente, tales como caja TATA, secuencia taponadora, secuencia CAAT, y similares. Más específicamente, las secuencias de control de expresión no transcritas en 5’ comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias de control de expresión también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en dirección 5’.
De acuerdo con la invención, el término “promotor” o “región promotora” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está situada en dirección 5’ (5’) con respecto a la secuencia de ácido nucleico que se expresa y controla la expresión de la secuencia proporcionando un reconocimiento y sitio de unión para ARN-polimerasa. La "región promotora" puede incluir sitios de reconocimiento y unión adicionales para otros factores que están implicados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariótico o eucariótico. Además, un promotor puede ser "inducible" y puede iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor o puede ser "constitutivo" si la transcripción no está controlada por un agente inductor. Un gen que está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o sólo se expresa en una pequeña extensión si un agente inductor está ausente. En presencia del agente inductor, el gen se activa o el nivel de transcripción aumenta. Esto está mediado, en general, por unión de un factor de transcripción específico.
Los promotores que se prefieren de acuerdo con la invención incluyen promotores para la polimerasa SP6, T3 y T7, promotor de ARN U6 humano, promotor CMV, y promotores híbridos artificiales de los mismos (por ejemplo, CMV) donde una parte o partes están fusionadas a una parte o partes de promotores de genes de otras proteínas celulares
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tales como, por ejemplo, GAPDH humana (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), e incluyendo o no incluyendo un intrón o intrones adicionales.
El término "expresión" se usa en este documento en su significado más amplio y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína o péptido. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. La expresión puede ser transitoria o puede ser estable. De acuerdo con la invención, el término expresión también incluye una “expresión aberrante" o "expresión anormal".
"Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa de acuerdo con la invención que la expresión se altera, preferiblemente aumentada, en comparación con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con expresión aberrante o anormal de una cierta proteína, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor. Un aumento en la expresión se refiere a un aumento de al menos 10%, en particular al menos 20%, al menos 50% o al menos 100%, o más. En una realización, la expresión sólo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime.
El término "específicamente expresado" significa que una proteína está esencialmente expresada solamente en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno asociado a tumor expresado específicamente en mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa principalmente en la mucosa gástrica y no se expresa en otros tejidos o no se expresa de forma significativa en otros tipos de tejidos u órganos. De este modo, una proteína que se expresa exclusivamente en células de la mucosa gástrica y en una medida significativamente menor en cualquier otro tejido, tal como el testículo, se expresa específicamente en células de la mucosa gástrica. En algunas realizaciones, también se puede expresar específicamente un antígeno asociado a tumor en condiciones normales en más de un tipo u órgano de tejido, tal como en 2 o 3 tipos u órganos de tejido, pero preferiblemente en no más de 3 tipos diferentes de tejidos u órganos. En este caso, el antígeno asociado a tumor se expresa entonces expresamente en estos órganos. Por ejemplo, si un antígeno asociado a tumor se expresa en condiciones normales, preferiblemente en una extensión aproximadamente igual en pulmón y estómago, dicho antígeno asociado a tumor se expresa específicamente en pulmón y estómago.
El término “traducción” de acuerdo con la invención se refiere al procedimiento en los ribosomas de una célula mediante la cual una cadena de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para formar una proteína
o un péptido.
De acuerdo con la invención, el término “codificación de ácido nucleico codificante” significa que el ácido nucleico, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede expresarse para producir una proteína o péptido que codifica.
De acuerdo con la invención, la estabilidad y la eficacia de la traducción del ARN introducido en una célula se pueden modificar según se requiera. Por ejemplo, el ARN se pueden estabilizar y su traducción aumentada por una o más modificaciones que tienen efectos estabilizadores y/o aumento de la eficacia de la traducción del ARN. Tales modificaciones se describen, por ejemplo, en el documento PCT/EP2006/009448 incorporado en este documento como referencia.
Por ejemplo, el ARN que tiene una secuencia poly-A no enmascarada se traduce más eficientemente que el ARN que tiene una secuencia poly-A enmascarada. El término "secuencia poly-A" o "poly-A+" se refiere a una secuencia de residuos de adenilo (A) que por lo general se encuentra en el extremo 3’ de una molécula de ARN y "secuencia poly-A no enmascarada" significa que la secuencia poly-A en el extremo 3’ de una molécula de ARN termina con una A de la secuencia poly-A y no es seguida por nucleótidos distintos de A situados en el extremo 3', esto es, en dirección 3’, de la secuencia poly-A. Además, una secuencia de poly-A larga de aproximadamente 120 pares de bases da como resultado una estabilidad transcripcional óptima y una eficacia de traducción del ARN.
Por lo tanto, con el fin de aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente invención, puede ser modificado para estar presente junto con una secuencia poly-A, preferiblemente con una longitud de 10 a 500, más preferiblemente de 30 a 300, incluso más preferiblemente de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. En una realización especialmente preferida, la secuencia poly-A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Para aumentar adicionalmente la estabilidad y/o la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la invención, la secuencia poly-A se puede desenmascarar.
Además, la incorporación de una región no traducida en 3’ (UTR) en la región no traducida en 3' de una molécula de ARN puede dar como resultado una mejora en la eficacia de la traducción. Se puede conseguir un efecto sinérgico incorporando dos o más de tales regiones no traducidas en 3’. Las regiones no traducidas en 3’ pueden ser autólogas o heterólogas al ARN en el que se introducen. En una realización particular, la región no traducida en 3’ se deriva del gen de la -globina humana.
Una combinación de las modificaciones descritas anteriormente, esto es, la incorporación de una secuencia poly-A, el desenmascaramiento de una secuencia poly-A y la incorporación de una o más regiones no traducidas en 3’, tiene una influencia sinérgica sobre la estabilidad del ARN y aumento de la eficiencia de la traducción.
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Con el fin de aumentar la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente invención, se puede modificar dentro de la región codificante, esto es, la secuencia que codifica el factor expresado, preferiblemente sin alterar la secuencia del factor expresado, para aumentar el contenido de GC y de este modo, mejorar la traducción en las células.
En realizaciones adicionales de la invención, el ARN que se va a introducir en una célula tiene, en su extremo 5’, una estructura Cap o una secuencia reguladora, que promueve la traducción en la célula huésped. Preferiblemente, el ARN está tapado en su extremo 5’ por una 7-metilguanosina opcionalmente modificada unida por un puente 5'-5' al primer nucleótido transcrito de la cadena de ARNm. Preferiblemente, el extremo 5’ del ARN incluye una estructura Cap que tiene la siguiente fórmula general:
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10 en la que R1 y R2 son independientemente hidroxi o metoxi y W-, X-e Y-son independientemente oxígeno o azufre. En una realización preferida, R1 y R2 son hidroxi y W-, X-e Y-son oxígeno. En una realización preferida adicional, uno de R1 y R2, preferiblemente R1 es hidroxi y el otro es metoxi y W-, X-e Y-son oxígeno. En una realización preferida adicional, R1 y R2 son hidroxi y uno de W-, X-e Y-, preferiblemente X-es azufre mientras que el otro es oxígeno. En una realización preferida adicional, uno de R1 y R2, preferiblemente R2 es hidroxi y el otro es metoxi y uno de W-, X e Y-,
15 preferiblemente X-es azufre mientras que el otro es oxígeno. En todas las realizaciones descritas anteriormente, en particular en aquellas realizaciones donde X-se define como azufre, X-puede ser alternativamente boro o selenio.
En la fórmula anterior, el nucleótido en el lado derecho está conectado a la cadena de ARN a través de su grupo 3’.
Esas estructuras Cap en las que al menos uno de W-, X-e Y-es azufre, esto es, que tienen una unidad estructural fosforotioato, existen en diferentes formas diastereoisómeras, todas las cuales están incluidas en este documento.
20 Además, la presente invención abarca todos los tautómeros y estereoisómeros de la fórmula anterior.
Naturalmente, si de acuerdo con la presente invención se desea disminuir la estabilidad y/o la eficacia de la traducción del ARN, es posible modificar el ARN para interferir con la función de los elementos como se ha descrito anteriormente, incrementando la estabilidad y/o eficacia de la traducción del ARN.
De acuerdo con la presente invención, se puede usar cualquier técnica útil para introducir, esto es, transferir o
25 transfectar, ácidos nucleicos en células. Preferiblemente, el ARN se transfecta en células mediante técnicas estándar. Tales técnicas incluyen electroporación, lipofección y microinyección. En una realización particularmente preferida de la presente invención, el ARN se introduce en células por electroporación.
La electroporación o electropermeabilización se refiere a un aumento significativo de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular causada por un campo eléctrico aplicado externamente. Se utiliza
30 generalmente en biología molecular como una manera de introducir algo de sustancia en una célula.
La electroporación se hace habitualmente con electroporadores, aparatos que crean un campo electromagnético en la solución celular. La suspensión de células se pipetea en una cubeta de vidrio o plástico que tiene dos electrodos de aluminio en sus lados. Para la electroporación, se usa por lo general una suspensión celular de aproximadamente 50 microlitros. Antes de la electroporación se mezcla con el ácido nucleico que se va a transfectar. La mezcla se pipetea en
35 la cubeta, se ajusta la tensión y la capacitancia y se inserta la cubeta en el electroporador. Preferiblemente, el medio líquido se adiciona inmediatamente después de la electroporación (en la cubeta o en un tubo eppendorf) y el tubo se incuba a la temperatura óptima de las células durante una hora o más para permitir la recuperación de las células y opcionalmente la expresión de resistencia a los antibióticos.
De acuerdo con la invención, se prefiere que la introducción de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido en 40 células da como resultado la expresión de dicha proteína o péptido.
El término “péptido” comprende oligo y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 9
o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El
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término “proteína” se refiere a péptidos grandes, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos “péptidos” y “proteínas” son sinónimos y se usan indistintamente en este documento.
Preferiblemente, se han aislado las proteínas y péptidos descritos de acuerdo con la invención. Los términos "proteína aislada" o "péptido aislado" significan que la proteína o péptido ha sido separado de su entorno natural. Una proteína o péptido aislado puede estar en un estado esencialmente purificado. El término "esencialmente purificado" significa que la proteína o péptido está esencialmente libre de otras sustancias con las que está asociado en la naturaleza o in vivo.
La enseñanza dada en este documento con respecto a secuencias de aminoácidos específicas, por ejemplo, Los que se muestran en el listado de secuencias, deben ser interpretados de modo que se refieran también a modificaciones, esto es, variantes, de dichas secuencias específicas que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que presentan propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicas. Una propiedad importante es retener la unión de un péptido a una molécula de MHC y/o a un receptor de células T o de un receptor de células T a su diana o para mantener las funciones efectoras de una célula T. Preferiblemente, una secuencia modificada con respecto a una secuencia específica, cuando reemplaza la secuencia específica en un receptor de células T retiene la unión de dicho receptor de células T a la diana y preferiblemente funciona de dicho receptor de células T o células T que llevan el receptor de células T como se describe en este documento.
Los expertos en la técnica apreciarán que en particular las secuencias de las secuencias CDR, regiones hipervariables y variables se pueden modificar sin perder la capacidad de unirse a una diana. Por ejemplo, las secuencias CDR serán ya sea idénticas o altamente homólogas a las secuencias CDR especificadas en este documento.
Una "variante" de péptido puede retener la inmunogenicidad de un péptido dado (por ejemplo, la capacidad de la variante para reaccionar con líneas o clones de células T no disminuye sustancialmente con relación al péptido dado). En otras palabras, la capacidad de una variante para reaccionar con líneas o clones de células T puede ser aumentada
o no cambiada, con relación al péptido dado, o se puede disminuir en menos del 50%, y preferiblemente menos del 20%, con respecto al péptido dado.
Una variante se puede identificar evaluando su capacidad para unirse a una molécula de MHC. En una realización preferida, un péptido variante tiene una modificación tal que la capacidad del péptido variante para unirse a una molécula de MHC se incrementa con relación al péptido dado. La capacidad del péptido variante para unirse a una molécula de MHC se puede aumentar al menos 2 veces, preferiblemente al menos 3 veces, 4 veces o 5 veces con respecto a la de un péptido dado. De acuerdo con lo anterior, dentro de ciertas realizaciones preferidas, un péptido comprende una variante en la que reside 1 a 3 aminoácidos dentro de una parte inmunogénica, son sustituidos de manera que la capacidad de reaccionar con líneas o clones de células T es estadísticamente mayor que la del péptido no modificado. Tales sustituciones están preferiblemente situadas dentro de un sitio de unión a MHC del péptido. Las sustituciones preferidas permiten un aumento de la unión a las moléculas del MHC clase I o clase II. Ciertas variantes contienen sustituciones conservadoras.
Por "altamente homólogo" se contempla que se pueden hacer de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4, tales como 1 a 3 o 1 ó 2 sustituciones.
El término “variante” de acuerdo con la invención también incluye mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular los que están naturalmente presentes. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya significación a menudo no está clara. La secuenciación genética completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen dado. Un homólogo de especie es un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos con una especie diferente de origen a la de un ácido nucleico dado o secuencia de aminoácidos.
Para los propósitos de la presente invención, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de deleción de aminoácidos que comprenden la deleción en el extremo Nterminal y/o C-terminal de la proteína también se denominan variantes de truncamiento N-terminal y/o C-terminal.
Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible la inserción aleatoria con una selección apropiada del producto resultante.
Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones amino y/o carboxi terminales de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos.
Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como mediante la eliminación de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos. Las deleciones pueden estar en cualquier posición de la proteína.
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Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por al menos un residuo en la secuencia que se retira y se inserta otro residuo en su lugar. Se da preferencia a las modificaciones que están en posiciones en la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre proteínas homólogas o péptidos y/o reemplazar aminoácidos por otros que tienen propiedades similares. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas son cambios conservadores de aminoácidos, esto es, sustituciones de aminoácidos cargados de forma similar o no cargados. Un cambio conservador de aminoácidos implica la sustitución de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos.
Preferiblemente, el grado de similitud, preferiblemente la identidad entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. El grado de similitud o identidad se da preferiblemente para una región de aminoácidos que es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o aproximadamente 100% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consiste en 200 aminoácidos, el grado de similitud o identidad se da preferiblemente por al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180, o aproximadamente 200 aminoácidos, preferiblemente aminoácidos continuos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad se da para la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. La alineación para determinar la similitud de secuencia, preferiblemente la identidad de secuencia se puede hacer con herramientas conocidas en la técnica, preferiblemente usando la mejor alineación de secuencias, por ejemplo, usando Align, usando parámetros estándar, preferiblemente EMBOSS:: needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que ya sea son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos entre las secuencias.
El término "identidad de porcentaje" pretende indicar un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias que se van a comparar, obtenidos después de la mejor alineación, siendo este porcentaje puramente estadístico y estando distribuidas las diferencias entre las dos secuencias aleatoriamente y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineadas óptimamente, realizándose dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede producir, además manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, by means of the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, by means of the similarity search method of Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, o mediante programas informáticos que utilizan estos algoritmos ((GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Las secuencias de aminoácidos homólogas presentan de acuerdo con la invención al menos un al menos 40%, en particular al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y preferiblemente al menos 95%, al menos 98 o al menos 99% de identidad de los residuos de aminoácidos.
Las variantes de secuencia de aminoácidos descritas en este documento se pueden preparar fácilmente por el experto en la materia, por ejemplo, mediante manipulación de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para preparar proteínas y péptidos que tienen sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones, se describe en detalle en Sambrook et al. (1989), por ejemplo. Además, los péptidos y variantes de aminoácidos descritos en este documento se pueden preparar fácilmente con la ayuda de técnicas conocidas de síntesis de péptidos tales como, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida y métodos similares.
La invención incluye derivados de los péptidos o proteínas descritos en este documento que están comprendidos por los términos “péptido” y “proteína”. De acuerdo con la invención, los "derivados" de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, supresiones y/o adiciones individuales o múltiples de cualquier molécula asociada con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. En una realización, los "derivados" de proteínas o
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péptidos incluyen aquellos análogos modificados resultantes de la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivatización, introducción de grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica o unión a un anticuerpo o a otro ligando celular. El término “derivado” también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferiblemente, un péptido modificado tiene una estabilidad incrementada y/o una inmunogenicidad incrementada.
También se incluyen miméticos de péptidos. Tales miméticos pueden comprender aminoácidos unidos a uno o más miméticos de aminoácidos (esto es, uno o más aminoácidos dentro del péptido pueden ser reemplazados por un mimético de aminoácidos) o pueden ser completamente miméticos no péptidos. Un mimético de aminoácidos es un compuesto que es conformacionalmente similar a un aminoácido, por ejemplo, de manera que puede sustituirse por un aminoácido sin disminuir sustancialmente la capacidad de reaccionar con líneas o clones de células T. Un mimético no péptido es un compuesto que no contiene aminoácidos, y que tiene una conformación global que es similar a un péptido, por ejemplo, de tal manera que la capacidad del mimético para reaccionar con líneas o clones de células T no disminuye sustancialmente con relación a la capacidad de un péptido dado.
De acuerdo con la invención, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína preferiblemente tiene una propiedad funcional de la secuencia de aminoácidos, péptido
o proteína, respectivamente, de la cual se ha derivado, esto es, es funcionalmente equivalente. En una realización, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado. En una realización, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica.
Una propiedad particular es la capacidad de formar un complejo con moléculas de MHC y, cuando sea apropiado, generar una respuesta inmune, preferiblemente estimulando células citotóxicas o células T auxiliares.
El término "derivado" significa de acuerdo con la invención que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del que se deriva, en particular un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencia particulares, "derivado" en particular significa que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.
El término “célula” o “célula huésped” es preferiblemente una célula intacta, esto es, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, organelos o material genético. Preferiblemente, una célula intacta es una célula viable, esto es, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferiblemente, dicho término se refiere de acuerdo con la invención a cualquier célula que pueda ser transformada o transfectada con un ácido nucleico exógeno. El término "célula" incluye, de acuerdo con la invención, células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de levadura y células de insecto). El ácido nucleico exógeno se puede encontrar dentro de la célula (i) libremente dispersado como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante, o (iii) integrado en el genoma de la célula huésped o ADN mitocondrial. Se prefieren particularmente células de mamífero, tales como células de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células se pueden derivar de un gran número de tipos de tejido e incluyen células primarias y líneas celulares. Ejemplos específicos incluyen queratinocitos, leucocitos de sangre periférica, células madre de médula ósea y células madre embrionarias. En realizaciones adicionales, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico expresa preferiblemente el péptido o proteína codificada por el ácido nucleico.
La célula puede ser una célula recombinante y puede secretar el péptido o proteína codificados, puede expresarla en la superficie y preferiblemente puede expresar adicionalmente una molécula de MHC que se une a dicho péptido o proteína o un producto de procesión del mismo. En una realización, la célula expresa la molécula de MHC endógenamente. En una realización adicional, la célula expresa la molécula de MHC y/o el péptido o proteína o el producto de procesión del mismo de una manera recombinante. La célula es preferiblemente no proliferativa. En una realización preferida, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago. El término “expansión clonal” se refiere a un procedimiento en el que se multiplica una entidad específica. En el contexto de la presente invención, el término se usa preferiblemente en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.
Una enfermedad asociada con la expresión del antígeno puede ser detectada en base a la presencia de células T que reaccionan específicamente con un péptido en una muestra biológica. Dentro de ciertos métodos, se incuba una muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con un péptido como se describe en este documento, un ácido nucleico que codifica dicho péptido y/o una célula presentadora de antígeno que expresa y/o presenta al menos, una parte inmunogénica de dicho péptido y se detecta la presencia o ausencia de activación específica de las células T. Las muestras biológicas apropiadas incluyen, pero no se limitan a, células T aisladas. Por ejemplo, las células T se pueden aislar de un paciente mediante técnicas de rutina (tal como, mediante centrifugación en
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gradiente de densidad Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica). Para las células T CD4+, la activación se detecta preferiblemente mediante la evaluación de la proliferación de las células T. Para las células T CD8+, la activación se detecta preferiblemente evaluando la actividad citolítica. Un nivel de proliferación que es al menos dos veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que es al menos 20% mayor que en sujetos libres de enfermedad indica la presencia de una enfermedad asociada con la expresión de antígeno en el sujeto.
"Reducir" o "inhibir" como se usa en este documento significa la capacidad de causar una disminución global, preferiblemente de 5% o más, 10% o más, 20% o más, más preferiblemente de 50% o más, y más preferiblemente de 75% o más, en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, esto es una reducción a cero o esencialmente a cero.
Los términos tales como "aumentar" o "mejorar" se refieren preferiblemente a un aumento o mejora de aproximadamente al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 80%, y más preferiblemente al menos 100%.
Los agentes, composiciones y métodos descritos en este documento se pueden usar para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células enfermas que expresan un antígeno y que presentan un péptido antigénico. Ejemplos de enfermedades que pueden ser tratadas y/o prevenidas abarcan todas las enfermedades que expresan uno de los antígenos descritos en este documento. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades virales tales como la infección por hCMV y las enfermedades malignas.
Los agentes, composiciones y métodos descritos en este documento también se pueden utilizar para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en el presente documento.
De acuerdo con la invención, el término “enfermedad” se refiere a cualquier estado patológico, incluyendo infecciones virales y enfermedades malignas, en particular aquellas formas de infecciones víricas y enfermedades malignas descritas en este documento.
Los términos "tejido normal" o "condiciones normales" se refieren al tejido sano o las condiciones en un sujeto sano, esto es, condiciones no patológicas, en las que "sano" significa preferiblemente no viralmente infectado o no canceroso.
“Enfermedad que implica células que expresan un antígeno” significa de acuerdo con la invención que la expresión del antígeno en las células de un tejido u órgano enfermo se incrementa preferiblemente en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos 10%, en particular al menos 20%, al menos 50%, al menos 100%, al menos 200%, al menos 500%, al menos 1000%, al menos 10000% o incluso más. En una realización, la expresión sólo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime. De acuerdo con la invención, las enfermedades que implican o están asociadas con células que expresan un antígeno incluyen infecciones virales y enfermedades malignas, en particular las formas de infecciones víricas y enfermedades malignas descritas en este documento.
La malignidad es la tendencia de una afección médica, especialmente tumores, a empeorar progresivamente y potencialmente resultar en muerte. Se caracteriza por las propiedades de anaplasia, invasividad y metástasis. Maligno es un término médico adjetivo correspondiente utilizado para describir una enfermedad grave y progresivamente empeorando. El término "enfermedad maligna", como se utiliza en este documento, se refiere preferiblemente a cáncer
o a una enfermedad tumoral. De manera similar, el término "células malignas" como se usa en este documento preferiblemente se refiere a células cancerosas o células tumorales. Un tumor maligno puede ser contrastado con un tumor benigno no canceroso en que una malignidad no es autolimitada en su crecimiento, es capaz de invadir en tejidos adyacentes, y puede ser capaz de extenderse a tejidos distantes (metástasis), mientras que un tumor benigno tiene ninguna de esas propiedades. El tumor maligno es esencialmente sinónimo de cáncer. La malignidad, la neoplasia maligna y el tumor maligno son esencialmente sinónimo de cáncer.
De acuerdo con la invención, el término “tumor” o “enfermedad tumoral” se refiere a un hinchamiento o lesión formada por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales). Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece por una proliferación celular rápida, incontrolada y continúa creciendo después de que cesen los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran parcial o total falta de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigna, premaligna o maligna.
Un tumor benigno es un tumor que carece de las tres propiedades malignas de un cáncer. De este modo, por definición, un tumor benigno no crece de manera ilimitada, agresiva, no invade los tejidos circundantes y no se extiende a tejidos no adyacentes (metástasis). Ejemplos comunes de tumores benignos incluyen lunares y fibromas uterinos.
El término "benigno" implica una enfermedad leve y no progresiva, y, de hecho, muchos tipos de tumores benignos son inofensivos para la salud. Sin embargo, algunas neoplasias que se definen como "tumores benignos" porque carecen de
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las propiedades invasivas de un cáncer, pueden producir efectos negativos para la salud. Ejemplos de esto incluyen tumores que producen un “efecto de masa” (compresión de órganos vitales tales como vasos sanguíneos) o tumores "funcionales" de tejidos endocrinos, que pueden sobreproducir ciertas hormonas (ejemplos incluyen adenomas tiroideos, adenomas adrenocorticales, y adenomas hipofisarios).
Los tumores benignos por lo general están rodeados por una superficie externa que inhibe su capacidad para comportarse de una manera maligna. En algunos casos, ciertos tumores "benignos" pueden dar lugar posteriormente a cánceres, que resultan de cambios genéticos adicionales en una subpoblación de células neoplásicas del tumor. Un ejemplo destacado de este fenómeno es el adenoma tubular, un tipo común de pólipo del colon que es un precursor importante para el cáncer de colon. Las células en los adenomas tubulares, como la mayoría de los tumores que con frecuencia progresan al cáncer, muestran ciertas anomalías de maduración celular y aparición colectivamente conocidas como displasia. Estas anomalías celulares no se observan en los tumores benignos que rara vez o nunca se convierten en cancerosos, pero se observan en otras anormalidades precancerosas del tejido que no forman masas discretas, tales como las lesiones precancerosas del cuello uterino. Algunas autoridades prefieren referirse a los tumores displásicos como "premalignos", y reservar el término "benigno" para los tumores que rara vez o nunca dan lugar a cáncer.
La neoplasia es una masa anormal de tejido como resultado de una neoplasia. La neoplasia (nuevo crecimiento en griego) es la proliferación anormal de células. El crecimiento de las células excede, y es descoordinado con el de los tejidos normales alrededor de este. El crecimiento persiste de la misma manera excesiva incluso después del cese de los estímulos. Por lo general, causa un bulto o tumor. Las neoplasias pueden ser benignas, premalignas o malignas.
El "crecimiento de un tumor" o "crecimiento tumoral" de acuerdo con la invención se refiere a la tendencia de un tumor a aumentar su tamaño y/o a la tendencia de las células tumorales a proliferar.
Preferiblemente, una "enfermedad maligna" de acuerdo con la invención es una enfermedad de cáncer o enfermedad de tumor, y una célula maligna es una célula de cáncer o célula de tumor. Preferiblemente, una "enfermedad maligna" se caracteriza por células que expresan un antígeno asociado a tumor tal como NY-ESO-1, TPTE o PLAC1.
Cáncer (término médico: neoplasia maligna) es una clase de enfermedades en las que un grupo de células muestra un crecimiento incontrolado (división más allá de los límites normales), invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y algunas veces metástasis (propagación a otras localizaciones en el cuerpo vía linfa o sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados, y no invaden ni metastatizan. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no lo hacen.
Los cánceres se clasifican por el tipo de célula que se asemeja al tumor y, por lo tanto, al tejido que se supone es el origen del tumor. Estas son la histología y la ubicación, respectivamente.
El término “cáncer” de acuerdo con la invención comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer de recto, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer suprarrenal, cáncer de la tiroides, cáncer de sangre, cáncer de piel, cáncer del cerebro, cáncer cervical, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglios linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, de nariz y de garganta (ENT), cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer del útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y metástasis de los mismos. Ejemplos de los mismos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas cervicales o metástasis de los tipos de cáncer o los tumores descritos anteriormente. El término cáncer de acuerdo con la invención también comprende metástasis de cáncer.
Los principales tipos de cáncer de pulmón son el carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Existen tres subtipos principales de los carcinomas de pulmón de células no pequeñas: carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes. Los adenocarcinomas representan aproximadamente el 10% de los cánceres de pulmón. Este cáncer generalmente se observa periféricamente en los pulmones, en oposición al cáncer de pulmón de células pequeñas y al cáncer de pulmón de células escamosas, que ambos tienden a ser localizados más centralmente.
El cáncer de piel es un crecimiento maligno en la piel. Los cánceres de piel más comunes son el cáncer de células basales, el cáncer de células escamosas y el melanoma. El melanoma maligno es un tipo grave de cáncer de piel. Se debe al crecimiento incontrolado de células de pigmento, llamadas melanocitos.
De acuerdo con la invención, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, incluyendo las formas comunes de mama, próstata, pulmón y cáncer de colon.
El "carcinoma bronquiolar" es un carcinoma del pulmón, que se cree derivado del epitelio de los bronquiolos terminales, en el que el tejido neoplásico se extiende a lo largo de las paredes alveolares y crece en pequeñas masas dentro de los alvéolos. La mucina puede ser demostrada en algunas de las células y en el material en los alvéolos, que también incluye células desnudadas.
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El "adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido también es parte de una categoría de tejido más grande conocida como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y los órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente de ectodermo, endodermo y mesodermo. Para ser clasificadas como adenocarcinoma, las células no necesariamente necesitan ser parte de una glándula, siempre y cuando tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, incluyendo humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular de los que se derivan, mientras que los mal diferenciados no pueden. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza omnipresente de las glándulas dentro del cuerpo. Mientras que cada glándula puede no secretar la misma sustancia, mientras exista una función exocrina a la célula, se considera glandular y su forma maligna por lo tanto se denomina adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y a menudo metastatizan dado el tiempo suficiente para hacerlo. El adenocarcinoma ovárico es el tipo más común de carcinoma ovárico. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma endometrioide.
El carcinoma de células renales también conocido como cáncer de células renales o adenocarcinoma de células renales es un cáncer de riñón que se origina en el revestimiento del túbulo contorneado proximal, los tubos muy pequeños en el riñón que filtran la sangre y eliminan los productos de desecho. El carcinoma de células renales es con mucho el tipo más común de cáncer de riñón en adultos y el más letal de todos los tumores genitourinarios. Distintos subtipos de carcinoma de células renales son el carcinoma de células renales de células claras y el carcinoma de células renales papilares. El carcinoma de células renales de células claras es la forma más común de carcinoma de células renales. Cuando se observan bajo un microscopio, las células que forman el carcinoma de células renales de células claras aparecen muy pálidas o claras. El carcinoma de células renales papilares es el segundo subtipo más común. Estos cánceres forman pequeñas proyecciones parecidas a los dedos (llamadas papilas) en algunos, si no la mayoría, de los tumores.
El linfoma y la leucemia son malignidades derivadas de células hematopoyéticas (formadoras de sangre).
El tumor blástico o blastoma es un tumor (usualmente maligno) que se asemeja a un tejido inmaduro o embrionario. Muchos de estos tumores son más comunes en los niños.
Por “metástasis” se entiende la diseminación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un procedimiento muy complejo y depende de la separación de las células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para entrar en la cavidad corporal y los vasos y luego, después de ser transportado por la sangre, infiltración de órganos diana. Por último, el crecimiento de un nuevo tumor, esto es, un tumor secundario o tumor metastásico, en el sitio diana depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células tumorales o componentes pueden permanecer y desarrollar potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la invención se refiere a "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.
Las células de un tumor secundario o metastásico son como las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que, si el cáncer de ovario se metastatiza en el hígado, el tumor secundario se compone de células ováricas anormales, no de células hepáticas anormales. El tumor en el hígado se denomina cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.
En el cáncer de ovario, la metástasis puede ocurrir de las siguientes maneras: por contacto directo o extensión, puede invadir tejidos cercanos u órganos situados cerca o alrededor del ovario, tales como las trompas de Falopio, útero, vejiga, recto, etc.; por la siembra o el vertimiento en la cavidad abdominal, que es la forma más común de propagación del cáncer de ovario. Las células cancerosas rompen la superficie de la masa ovárica y "caen" a otras estructuras en el abdomen tal como el hígado, el estómago, el colon o el diafragma; librándose de la masa ovárica, invadiendo los vasos linfáticos y luego propagándose a otras áreas del cuerpo u órganos distantes tales como el pulmón o el hígado; librándose de la masa ovárica, invadiendo el sistema sanguíneo y propagándose a otras áreas del cuerpo u órganos distantes.
De acuerdo con la invención, el cáncer de ovario metastásico incluye cáncer en las trompas de Falopio, cáncer en órganos del abdomen tales como cáncer en el intestino, cáncer en el útero, cáncer en la vejiga, cáncer en el recto, cáncer en el hígado, cáncer en el estómago, cáncer en el colon, cáncer en el diafragma, cáncer en los pulmones, cáncer en el revestimiento del abdomen o pelvis (peritoneo), y cáncer en el cerebro. Del mismo modo, el cáncer de pulmón metastásico se refiere a cáncer que se ha diseminado desde los pulmones a sitios distantes y/o varios sitios en el cuerpo e incluye cáncer en el hígado, cáncer en las glándulas suprarrenales, cáncer en los huesos y cáncer en el cerebro.
Una recaída o recurrencia ocurre cuando una persona es afectada de nuevo por una afección que los afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido de una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y de nuevo desarrolla dicha enfermedad, dicha enfermedad recién desarrollada puede considerarse como recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la invención, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral
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puede, pero no necesariamente ocurre en el sitio de la enfermedad tumoral original. De este modo, por ejemplo, si un paciente ha sufrido de tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones en las que un tumor se produce en un sitio diferente al sitio del tumor original, así como en el sitio del tumor original. Preferiblemente, el tumor original para el cual el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.
Por "tratamiento" se entiende administrar un compuesto o composición como se describe en este documento a un sujeto con el fin de prevenir o eliminar una enfermedad, incluyendo la reducción del tamaño de un tumor o el número de tumores en un sujeto; detener o retardar una enfermedad en un sujeto; inhibir o retardar el desarrollo de una nueva enfermedad en un sujeto; disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas y/o recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que previamente ha tenido una enfermedad; y/o prolongar, esto es, aumentar la vida útil del sujeto.
En particular, el término "tratamiento de una enfermedad" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, retardar o inhibir la progresión o empeoramiento, o prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o los síntomas de los mismos.
Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto, esto es un paciente, que se identifica como teniendo una probabilidad mayor que la normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido o tiene actualmente una enfermedad, en particular el cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que tal sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen, o que han tenido, un cáncer, también tienen un mayor riesgo de metástasis de cáncer.
El término “inmunoterapia” se refiere a un tratamiento que implica una reacción inmune específica. En el contexto de la presente invención, términos tales como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención o tratamiento o ambos de la aparición y/o la propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrollará una enfermedad o retrasa el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, una persona en riesgo de un tumor, como se describió anteriormente, sería un candidato para la terapia para prevenir un tumor.
Una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración profiláctica de la composición descrita en este documento protege preferiblemente al receptor del desarrollo de una enfermedad. Una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración terapéutica de la composición descrita en este documento puede conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de la enfermedad. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento de la enfermedad, en particular una interrupción de la progresión de la enfermedad, que conduce preferiblemente a la eliminación de la enfermedad.
La inmunoterapia se puede realizar utilizando cualquiera de una variedad de técnicas, en las que los agentes proporcionados en este documento funcionan para eliminar células que expresan antígenos de un paciente. Tal eliminación puede tener lugar como resultado de aumentar o inducir una respuesta inmune en un paciente específico para un antígeno o una célula que expresa un antígeno.
En ciertas realizaciones, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmune endógeno del huésped para reaccionar contra células enfermas con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmune (tales como péptidos y ácidos nucleicos como se describe en este documento).
En realizaciones adicionales, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica la administración de agentes con una reactividad inmunitaria tumoral establecida (tales como células efectoras) que pueden mediar directa o indirectamente los efectos antitumorales y no necesariamente dependen de un sistema inmune de huésped intacto. Ejemplos de células efectoras incluyen linfocitos T (tales como linfocitos T citotóxicos CD8+ y linfocitos auxiliares T CD4+), y células presentadoras de antígenos (tales como células dendríticas y macrófagos). Los receptores de células T específicos para los péptidos indicados en este documento se pueden clonar, expresar y transferir a otras células efectoras para inmunoterapia adoptiva.
Como se ha indicado anteriormente, los péptidos inmunorreactivos como se describen en este documento se pueden utilizar para expandir rápidamente cultivos de células T específicas de antígenos con el fin de generar un número suficiente de células para inmunoterapia. En particular, las células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas, macrófagos, monocitos, fibroblastos y/o células B, pueden ser pulsadas con péptidos inmunorreactivos o transfectadas con uno o más ácidos nucleicos usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Las células efectoras cultivadas para uso en terapia deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente, y sobrevivir a largo plazo in vivo. Los estudios han demostrado que las células efectoras cultivadas se pueden inducir a crecer in vivo y a sobrevivir a largo plazo en cantidades sustanciales mediante estimulación repetida con antígeno suplementado con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever et al., 1997, Immunological Reviews 157, 177).
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Alternativamente, un ácido nucleico que expresa un péptido indicado en este documento se puede introducir en células presentadoras de antígeno tomadas de un paciente y propagadas por clonación ex vivo para el trasplante de nuevo al mismo paciente.
Las células transfectadas se pueden reintroducir en el paciente utilizando cualquier medio conocido en la técnica, preferiblemente en forma estéril por administración intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.
Los métodos descritos en este documento pueden implicar la administración de células T autólogas que se han activado en respuesta a una célula presentadora del antígeno que expresa el péptido o del péptido. Tales células T pueden ser CD4+ y/o CD8+, y se pueden proliferar como se ha descrito anteriormente. Las células T se pueden administrar al sujeto en una cantidad eficaz para inhibir el desarrollo de una enfermedad.
Los agentes y composiciones descritos en este documento se pueden usar solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogos, singénicos, alogénicos o no relacionados).
El término "inmunización" o "vacunación" describe el procedimiento de tratar un sujeto con el fin de inducir una respuesta inmune por razones terapéuticas o profilácticas.
El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.
Los términos "sujeto", "individuo", "organismo" o "paciente" se usan indistintamente y se refieren a vertebrados, preferiblemente mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son seres humanos, primates no humanos, animales domesticados tales como perros, gatos, ovejas, ganado vacuno, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, cobayas, etc., así como animales en cautiverio tales como animales de zoológicos. El término "animal", como se utiliza en este documento, también incluye seres humanos. El término “sujeto” también puede incluir un paciente, esto es, un animal, preferiblemente un ser humano que tiene una enfermedad, preferiblemente una enfermedad como se describe en este documento.
El término "autólogo" se utiliza para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "trasplante autólogo" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Tales procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que de otro modo da como resultado el rechazo.
El término "heterólogo" se utiliza para describir algo que consta de múltiples elementos diferentes. Como ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a un individuo diferente constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta del sujeto.
Como parte de la composición para una inmunización o una vacunación, preferiblemente uno o más agentes como se describe en este documento se administran junto con uno o más adyuvantes para inducir una respuesta inmune o para aumentar una respuesta inmune. El término "adyuvante" se refiere a compuestos que prolongan o mejoran o aceleran una respuesta inmune. Sin embargo, la composición descrita en este documento preferiblemente ejerce su efecto sin adición de adyuvantes. Sin embargo, la composición descrita en la presente puede contener cualquier adyuvante conocido. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tales como emulsiones de aceite (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (tales como alumbre), productos bacterianos (tales como toxina de Bordetella pertussis), liposomas y complejos inmunoestimulantes. Ejemplos de adyuvantes son monofosforil-lípido-A (MPL SmithKline Beecham). Saponinas tales como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham, WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 y QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), adyuvante incompleto de Freund adyuvante completo de Freund, vitamina E, montanide, alumbre, oligonucleótidos CpG (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), y diversas emulsiones de agua en aceite que se preparan a partir de aceites biológicamente degradables tales como escualeno y/o tocoferol.
De acuerdo con la invención, una "muestra" puede ser cualquier muestra útil de acuerdo con la presente invención, en particular una muestra biológica como una muestra de tejido, incluyendo fluidos corporales, y/o una muestra celular y se puede obtener en el método convencional tal como por biopsia de tejido, incluyendo biopsia por punción, y tomando sangre, aspiración bronquial, esputo, orina, heces u otros fluidos corporales. De acuerdo con la invención, el término "muestra" también incluye muestras procesadas tales como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo, ácido nucleico y aislados de péptido/proteína.
También se pueden administrar otras sustancias que estimulan una respuesta inmune del paciente. Es posible, por ejemplo, usar citocinas en una vacunación, debido a sus propiedades reguladoras sobre los linfocitos. Tales citoquinas comprenden, por ejemplo, interleuquina-12 (IL-12) que se ha demostrado que aumenta las acciones protectoras de las vacunas (véase Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.
Existen varios compuestos que potencian una respuesta inmune y que por lo tanto pueden ser utilizados en una vacunación. Dichos compuestos comprenden moléculas coestimulantes proporcionadas en forma de proteínas o ácidos nucleicos tales como B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente).
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Los agentes terapéuticamente activos descritos en este documento se pueden administrar por cualquier vía convencional, incluyendo por inyección o infusión. La administración se puede llevar a cabo, por ejemplo, por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o transdérmica.
Los agentes descritos en este documento se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso de tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende retardar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección también puede ser un retraso del inicio o una prevención del inicio de dicha enfermedad o de dicha afección.
Una cantidad eficaz de un agente descrito en este documento dependerá de la afección que se va a tratar, de la gravedad de la enfermedad, de los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, el estado fisiológico, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia acompañante (si está presente), la vía de administración específica y factores similares. De acuerdo con lo anterior, las dosis administradas de los agentes descritos en este documento pueden depender de diversos de tales parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas por una vía de administración diferente, más localizada).
Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento son preferiblemente estériles y contienen una cantidad eficaz de la sustancia terapéuticamente activa para generar la reacción deseada o el efecto deseado.
Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento se administran generalmente en cantidades farmacéuticamente compatibles y en una preparación farmacéuticamente compatible. El término "farmacéuticamente compatible" se refiere a un material no tóxico que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica. Las preparaciones de este tipo pueden contener normalmente sales, sustancias reguladoras, conservantes, portadores, que complementan sustancias que mejoran la inmunidad tales como adyuvantes, por ejemplo, Oligonucleótidos CpG, citoquinas, quimiocinas, saponina, GM-CSF y/o ARN y, cuando sea apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente compatibles. Sin embargo, las sales que no son farmacéuticamente compatibles se pueden utilizar para preparar sales farmacéuticamente compatibles y se incluyen. Las sales farmacológica y farmacéuticamente compatibles de este tipo comprenden de manera no limitativa las preparadas a partir de los ácidos siguientes: ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales farmacéuticamente compatibles también se pueden preparar como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.
Una composición farmacéutica descrita en este documento puede comprender un portador farmacéuticamente compatible. El término portador se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de una naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina para facilitar la aplicación. El término "portador farmacéuticamente compatible" como se utiliza en este documento incluye uno o más materiales de relleno, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidos o líquidos compatibles, que son apropiados para la administración a un paciente. Los componentes de la composición farmacéutica descrita en este documento son usualmente tales que no se produce ninguna interacción que afecte sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden contener sustancias reguladoras apropiadas tales como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener también, cuando sea apropiado, conservantes apropiados tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.
Las composiciones farmacéuticas se proporcionan usualmente en una forma de dosificación uniforme y se pueden preparar de una manera conocida per se. Las composiciones farmacéuticas como se describen en este documento pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, comprimidos para deshacer en la boca, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires o en forma de una emulsión, por ejemplo.
Las composiciones apropiadas para administración parenteral comprenden usualmente una preparación estéril acuosa
o no acuosa del compuesto activo, que es preferiblemente isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de soportes y solventes compatibles son la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, usualmente se usan aceites fijos estériles como medio de solución o suspensión.
Figuras
Figura 1: Representación del complejo TCR-CD3. Los motivos de activación a base de tirosina inmunorreceptor CD3 intracitoplasmáticos (ITAM) están indicados como cilindros (adaptados de "The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).
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Figura 2. Plataforma tecnológica para el aislamiento/validación de TCR. El enfoque integra todas las etapas desde el aislamiento de células T específicas de antígeno (parte superior) hasta la clonación de TCR (parte central) y la validación de TCR (parte inferior). Los pacientes son examinados para determinar las respuestas de los autoanticuerpos contra el antígeno de interés por CrELISA (ensayo de inmunoabsorción de enzima ligada de lisado en bruto). Las células T específicas de antígeno de donantes seropositivos se estimulan con DC autólogas cargadas de ARN o péptido y las células T CD8+ o CD4+ que segregan IFN se aíslan mediante citometría de flujo (parte superior). Las células únicas se recogen en placas de pozos múltiples y se someten a síntesis y enriquecimiento de ADNc de primera cadena mediante una etapa de amplificación de PCR global. Las regiones variables de / de TCR se clonan en vectores para la transcripción in vitro (IVT) que contiene los casetes de la región constante (parte central). Los ARN de la cadena de TCR / se transfieren en células T CD4+ o CD8+, cocultivadas con APC que expresa el antígeno apropiado y las moléculas de HLA y se ensayan para la reprogramación funcional de células T modificadas genéticamente (parte inferior).
Figura 3. Clasificación por citometría de flujo de células T CD8+ específicas de pp65 de un donante seropositivo para CMV después de una semana de expansión. Las células T CD8+ secretoras de IFNg se aislaron después de la reintroducción con iDC autólogas pp65 ARN transfectadas. Control: iDC transfectadas con ARN de eGFP.
Figura 4. Verificación de la expresión de la superficie de TCR en células SupT1 transfectadas con TCR analizadas por citometría de flujo. Las células SupT1 electroporadas con ARN de cadena / de TCR fueron teñidas con un anticuerpo del pan TCR y analizados por citometría de flujo. Las células SupT1 electroporadas sin ARN sirvieron como un control negativo.
Figura 5. Pruebas de especificidad de TCR obtenidos de células T CD8+ específicas de CMV-pp65 de un donante seropositivo para CMV después de la expansión in vitro mediante IFN-ELISPOT. Se probaron células IVSB modificadas genéticamente por TCR en iDC autólogas cargadas con antígeno y células K562-A*0201 para reconocimiento específico de ARN pp65 IVT, pp65495-503 o mezcla de péptidos pp65. Los péptidos parcialmente solapados derivados de TPTE se usaron como mezcla de péptidos control y se usó SSX-2241-249 como control de péptido único. El epítopo Tyr368-376 derivado de tirosinasa se aplicó como un control positivo. TCR control: TCR clonado de un donante seronegativo para CMV.
Figura 6. Determinación de la restricción de HLA y la especificidad de péptido de TCRCD8-CMV#1 por IFN-ELISPOT. Las células IVSB TCR-transgénicas fueron analizadas para el reconocimiento de las células K562 que expresan alelos de HLA clase I seleccionados del donante pulsado con péptidos solapados de pp65 o sin antígeno como un control. Las células K562-B*3501 se usaron posteriormente para analizar el reconocimiento mediado por TCRCD8-CMV#1 de péptidos 15-mer individuales derivados de CMV-pp65.
Figura 7. Pruebas de especificidad de TCR clonados de células T CD8+ específicas de CMV-pp65 aisladas ex vivo de un donante seropositivo para CMV por IFN-ELISPOT. Las células IVSB fueron transfectadas con ARN de cadena / TCR y estimulado con K562-A*0201 pulsado con pp65495-503. El péptido no relacionado SSX-2241-249 y un TCR clonado de un donante seronegativo para CMV sirvió como negativo, el epítopo Tyr368-376 derivado de tirosinasa sirvió como control positivo.
Figura 8. Muerte específica de células diana mediante células T transfectadas con TCR analizadas por ensayo de citotoxicidad con luciferasa. Se usaron células diana K562 pulsadas con péptidos que expresan el alelotipo HLA apropiado como dianas para células IVSB modificadas genéticamente con TCR específicos de CMV-pp65. Como referencia, se analizó la muerte de células diana pulsadas con Tyr368-376 mediada por el receptor endógeno. Se usó un TCR obtenido de un donante seronegativo para CMV como control para excluir la lisis inespecífica. E:T:proporción efector-objetivo.
Figura 9. Prueba de especificidad de TCR aislados de células T CD8+ específicas de NY-ESO-1 por IFN-ELISPOT. TCRCD8-NY#2 y-# 5 se transfirieron a células IVSB y se probaron para el reconocimiento de las iDC autólogas cargadas con ARN NY-ESO-1 o mezcla de péptidos. Controles negativos: iDC pulsadas con mezcla de péptidos TPTE; un TCR control aislado de un donante sano. Control positivo: K562-A*0201 pulsado con Tyr368-376.
Figura 10. Identificación de elementos restrictivos de HLA para los TCR específicos de NY-ESO-1 por IFN-ELISPOT. Las células IVSB modificadas genéticamente por TCR fueron analizadas por IFNg-ELISPOT para el reconocimiento de las células K562 transfectadas con alelos individuales de HLA clase I del donante y pulsado con mezcla de péptidos NY-ESO-1. Controles negativos: mezcla de péptidos de HIV-gag; K562 electroporadas sin ARN de HLA (simulado). Control positivo: Péptido Tyr368-376.
Figura 11: Identificación de péptidos 15mer reconocidos por los TCR específicos de NY-ESO-1 por IFN-ELISPOT. Las células T IVSB transfectadas con TCR se analizaron para el reconocimiento de las células K562 que expresan el alelo de HLA clase I apropiado y pulsado con 15mers individuales parcialmente solapados derivados de NY-ESO-1.
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Figura 12. Cartografía de epítopos para los TCR específicos de NY-ESO-1 por IFN-ELISPOT. Las células IVSB transfectadas con TCRCD8-NY#5, #6, #8 o #15 se analizaron para el reconocimiento de las células K562-B*3508 pulsadas con péptidos nonamer individuales que cubrían los aminoácidos 77-107 de la proteína NY-ESO-1.
Figura 13. Muerte específica de células diana mediada por TCRCD8-NY#2 analizada por ensayo de citotoxicidad con luciferasa. Se analizó la lisis específica de células K562-A*6801 pulsadas con mezcla de péptidos NY-ESO-1 por células IVSB transfectadas con TCRCD8-NY#2 usando diferentes proporciones efector-objetivo (E:T). Control: células diana pulsadas con mezcla de péptidos TPTE.
Figura 14: Determinación de los elementos de restricción de HLA para los TCR específicos de NY-ESO-1 obtenidos a partir de células T CD4+ por IFN-ELISPOT. Se analizaron células T CD4+ transfectadas con TCR para el reconocimiento de K562 que expresan alelos individuales HLA de clase II del paciente pulsado con mezcla de péptidos de ya sea NY-ESO-1 o HIV-gag como control negativo.
Figura 15. Cartografía de epítopos para TCRCD4-NY # 5 por IFN-ELISPOT. Se probaron células T CD4+ modificadas genéticamente con TCR para el reconocimiento de las células K562 que expresan el alelo HLA de clase II apropiado y pulsado con 15-mers solapados parcialmente representando la proteína NY-ESO-1.
Figura 16. Determinación de la restricción de HLA y especificidad del péptido de TCRCD8-TPT#3 por IFN-ELISPOT. Las células IVSB transfectadas con TCR se analizaron para el reconocimiento de células K562 que expresan moléculas HLA de clase I del paciente pulsadas con mezcla de péptidos TPTE (parte superior). Se usaron las células K562-B*3501 pulsadas con 15mer individual que representa el antígeno completo (parte central) y péptidos 9-mer que cubrían los aminoácidos 521-535 de TPTE (parte inferior) para definir el epítopo reconocido por TCRCD8-TPT # 3. Los aminoácidos de anclaje del epítopo reconocido para la unión a HLA B*3501 se muestran en negrita.
Figura 17. Determinación de los elementos de restricción de HLA para TCR específicos de TPTE aislados de células T CD4+ por IFNy-ELISPOT. Se analizaron células T CD4+ transfectadas con TCR para el reconocimiento de células K562 transfectadas con alelos HLA de clase II del paciente y pulsadas con péptidos solapados correspondientes a TPTE o HIV-gag como control.
Figura 18. Cartografía de epítopos para TCR específicos de TPTE aislados de células T CD4+ por IFN-ELISPOT. Las localizaciones de epítopo de TCR se determinaron usando células T CD4+ transfectadas con TCR en combinación con células K562 transfectadas con el antígeno HLA clase II apropiado y pulsadas con péptidos 15-mer individuales parcialmente solapados que cubren la proteína TPTE.
Figura 19. Clasificación por citometría de flujo de células T CD8+ específicas de PLAC1 obtenidas de ratones inmunizados. Se pulsaron células de bazo de ratones transgénicos HLA A*0201 inmunizados con PLAC1 (ratones A2.1/DR1) con péptidos solapados correspondientes a PLAC1 o un antígeno control (WT1). 24 h después las células se cosecharon, se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo y se aislaron células CD3+/CD8+/CD137+. Los gráficos de histograma fueron cerradas en células CD3+/CD8+. M1-5: ratones inmunizados con PLAC1; Con1-3: ratones de control.
Figura 20. Prueba de especificidad de TCRs clonados de células T CD8+ de ratones inmunizados con PLAC1 por IFN-ELISPOT. Se probaron células IVSB modificadas con TCR para el reconocimiento de células K562-A*0201 pulsadas con péptidos solapados que corresponden a PLAC1 o NY-ESO-1 como antígeno control. Como control positivo, se analizó la secreción de IFN en respuesta a las células diana pulsadas con Tyr368-376.
Figura 21. Determinación de la especificidad peptídica de TCRCD8-Pl # 8 por IFN-ELISPOT. Se ensayaron células T CD8+ transfectadas con TCR para el reconocimiento específico de células K562-A*0201 pulsadas con péptidos 15-mer individuales parcialmente solapados que cubren la proteína PLAC1.
Figura 22. Definición de epítopos inmunodominantes restringidos por A*0201 reconocidos por TCR específicos de PLAC1 por IFN-ELISPOT. Las células IVSB transfectadas con TCR se analizaron para el reconocimiento de células K562-A*0201 pulsadas con péptidos 9-mer individuales que cubren los aminoácidos 25-43 de PLAC1 para definir el epítopo reconocido por TCRCD8-Pl # 11. Los péptidos reconocidos se muestran en negrita. Control positivo: péptido PLAC1 15-mer 7.
Ejemplos
Las técnicas y métodos usados se describen en este documento o se llevan a cabo de una manera conocida per se y como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Todos los métodos incluyendo el uso de kits y reactivos se llevan a cabo según la información del fabricante, a menos que se indique específicamente.
Ejemplo 1: Materiales y métodos
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Serotipificación
Se utilizó un ELISA basado en lisados en bruto de bacterias (ensayo de inmunoabsorción de enzima ligada lisado en bruto o CrELISA) que expresaba ya sea NY-ESO-1 de longitud completa o el extremo N-terminal de TPTE (aminoácidos 1-51) de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente para la determinación de autoanticuerpos IgG (Tureci, O. et al. (2004), J. Immunol., Methods 289, 191-199). La seropositividad a CMV se analizó mediante un ELISA estándar que detecta respuestas de IgG policlonales específicas de CMV.
Líneas celulares y reactivos
Las líneas celulares de linfoma humano SupT1 (ATCC no. CRL-1942) o Jurkat76 (Heemskerk, M.H. et al. (2003), Blood 102, 3530-3540), ambas carentes de expresión de la superficie de TCR endógeno, se cultivaron bajo condiciones estándar la línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón NIH3T3 (DSMZ no. ACC 59) y la línea celular de leucemia mieloide crónica humana K562 (Lozzio, C.B. & Lozzio, B.B (1975), Blood 45, 321-334). Se usaron células K562 transitoriamente o establemente transfectadas con alelotipos HLA (Britten, C.M. et al. (2002), J. Immunol. Methods 259, 95-110) (denominadas, por ejemplo, como K562-A*0201) para ensayos de validación. La línea celular primordial de fibroblastos de prepucio recién nacido humano primario CCD-1079Sk (ATCC No. CRL-2097) se cultivó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La línea de células CTL monospecíficas IVSB específica para el epítopo derivado de la tirosinasa restringida por HLA A*0201 Tyr368-376 (Wolfel, T. et al. (1993), Int. J. Cancer 55, 237-244; Wolfel, T. et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24, 759-764) se cultivó en medio AIM-V (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con suero AB humano al 10% (Lonza, Basilea, Suiza), 350 IU/ml de IL-2 (Richter-Helm BioLogics, Hamburgo, Alemania), 5 ng/ml de IL-7 (PeproTech, Frankfurt, Alemania) y 10 ng/ml de IL-15 (R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemania) y estimulados semanalmente con células SK29-Mel y AK-EBV irradiadas.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), monocitos y células dendríticas (DC)
Las PBMC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) a partir de capas leucocitarias o de muestras de sangre. Los alelotipos HLA se determinaron por métodos estándar de PCR. Los monocitos se enriquecieron con microperlas anti-CD 14 (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemania). Las CD inmaduras (iDC) se obtuvieron diferenciando los monocitos durante 5 días en medio de cultivo suplementado con citoquina como se describe en Kreiter et al. (2007), Cancer Immunol. Immunother., CII, 56, 1577-87.
Péptidos y pulsos peptídicos de células estimuladoras
Las mezclas de péptidos 15-mer libres de N y C-terminal con 11 solapamientos de aminoácidos correspondientes a secuencias de CMV-pp65, HIV-gag, TPTE, NY-ESO-I o PLAC1 (denominado como mezcla de péptidos antigénicos) fueron sintetizados por química estándar en fase sólida (JPT GmbH, Berlín, Alemania) y disueltos en DMSO hasta una concentración final de 0.5 mg/ml. Los péptidos nonamer fueron reconstituidos en PBS al 10% de DMSO. Para estimular las células de estimulación se cosecharon durante 1 h a 37ºC en medio de cultivo utilizando diferentes concentraciones de péptidos.
Vectores para la transcripción in vitro (IVT) de ARN
Todas las construcciones son variantes del plásmido pST1-sec-insert-2gUTR-A(120)-Sap1 descrito previamente (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017). Para obtener plásmidos que codifican cadenas de TCR humanas, el ADNc que codifica las regiones constantes de TCR- o TCR-1 y TCR-2 se amplificó a partir de células T CD8+ humanas y se clonó en este esqueleto. Para la generación de plásmidos que codifican cadenas TCR murinas, se ordenaron ADNc que codifican para las regiones constantes TCR-,-1y -2 de un proveedor comercial y se clonaron análogamente (números de acceso de GenBank M14506, M64239 y X67127, respectivamente). Se introdujeron productos de PCR V(D)J específicos en tales casetes para producir cadenas TCR de longitud completa (denominadas como pST1-humano/murino TCR-2gUTR-A(120)).
Análogamente, se insertaron en este esqueleto los alelos individuales de HLA clase I y II clonados de PBMCs de donantes y ADNc de beta-2-microgobulina (B2M) de DC humanas (denominadas como pST1-HLA clase I/II-2gUTR-A
(120) y pST1-B2M-2gUTR-A (120)).
Los plásmidos que codifican el antígeno pp65 de CMV (pST1-sec-pp65-MITD-2gUTR-A(120)) y NY-ESO-I (pST1-secNY-ESO-1-MITD-2gUTR-A(120)) unido a una señal de secreción (sec) y la señal de tráfico de MHC clase I (MITD) se describieron previamente (Kreiter, S. et al. (2008), J. Immunol. 180, 309-318). Se generó el plásmido codificante PLAC1 pST1-sec-PLAC1-MITD-2gUTR-A(120) por clonación de un ADNc obtenido de un proveedor comercial (número de acceso GenBank NM_021796) en el Kreiter et al. esqueleto. Se generaron los plásmidos que codifican TPTE pST1
gUTR-TPTE-2ßgUTR-A(120) y pST1-gUTR-TPTE-MITD-2gUTR-A(120) por clonación de un ADNc obtenido de un proveedor comercial (número de acceso GenBank AF007118) en una variante del vector Holtkamp et al. presentadora de una región alfa-globina 5'-no traducida adicional.
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Los cebadores se compraron a Operon Biotechnologies, Colonia, Alemania.
Generación de ARN transcrito (IVT) in vitro y transferencia a células
La generación de ARN de IVT se realizó como se ha descrito anteriormente (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017) y se adicionó a células suspendidas en medio X-VIVO 15 (Lonza, Basilea, Suiza) en una cubeta de
5 electroporación estéril pre-enfriada de brecha de 4 mm (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemania). La electroporación se realizó con un aparato Gene-Pulser-II (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemania) (células T 450 V/250 F, células IVSB T 350 V/200 F SupT1 ATCC No. CRL-1942): 300 V/200 F, DC humana: 300 V/150 F, K562: 200 V/300 F).
La expansión in vitro de células T específicas de antígeno
10 Se sembraron 2.5x106 PBMCs/pozo en placas de 24 pozos, se pulsaron con mezcla de péptidos y se cultivaron durante 1 semana en medio de cultivo completo suplementado con suero AB al 5%, 10 U/ml del IL-2 y 5 ng/ml de IL-7. Para algunos experimentos, se purificaron células T CD8+ o CD4+ de PBMC mediante clasificación por células magnéticas positivas (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemania) y luego se expandieron mediante cocultivo de 2x106 efectores con 3x105 DC autólogas, ya sea electroporadas con ARN que codifican el antígeno o pulsadas con la mezcla de
15 péptidos solapados, durante 1 semana en medio completo suplementado con suero AB al 5%, 10 U/ml de IL-2, y 5 ng/ml de IL-7.
Clasificación de célula única de células T CD8+ o CD4+ específicas de antígeno después del ensayo de secreción de IFN 
La clasificación por citometría de flujo de células T CD8+ o CD4+ específicas de antígeno únicas se realizó ya sea
20 directamente ex vivo a partir de células T recién aisladas o PBMC o después de una semana de expansión específica de antígeno. Se estimularon 2 x 106 células T o PBMC o con 3x105 DC autólogas cargadas con mezcla de péptidos o transfectadas con ARN de IVT que codifica el antígeno respectivo o un antígeno control durante 4 a 15 horas dependiendo del modo de estimulación. Las células se cosecharon, se trataron con un anticuerpo anti-IFN conjugado con ficoeritrina (PE), un anticuerpo anti-CD8 conjugado con fluoresceinisotiocianato (FITC) y un anticuerpo anti-CD4
25 conjugado con aloficocianina (APC) de acuerdo con el kit de ensayo de secreción de IFN (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemania). La clasificación se realizó en un citómetro de flujo BD FACS Aria (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Se clasificaron células doblemente positivas para IFN y CD8 o CD4 y se recogió una célula por pozo en una placa de fondo en forma en V de 96 pozos (Greiner Bio-One GmbH, Solingen, Alemania) que contiene fibroblastos de ratón NIH3T3 como células alimentadoras, se centrifugaron a 4ºC y se almacenaron inmediatamente a -80ºC.
30 Imprimación in vivo de células T por inmunización intranodal de ratones HLA A2.1/DR1 con ARN de IVT
Las células T de ratones A2.1/DR1 (Pajot A. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) se imprimieron in vivo contra el antígeno de interés mediante inmunización intranodal repetitiva usando ARN de IVT que codifica el antígeno (Kreiter S. et al. (2010), Cancer Research 70, 9031-40). Para las inmunizaciones intranodales, los ratones se anestesiaron con xilazina/ketamina. El ganglio linfático inguinal fue expuesto quirúrgicamente, se inyectaron lentamente 10 L de ARN (20
35 g) diluido en solución de Ringer y se inyectaron lentamente agua libre de Rnasa utilizando una jeringa de 0.3 ml de un solo uso con una aguja ultrafina (31G, BD Biosciences) y la herida se cerró. Después de seis ciclos de inmunización, los ratones se sacrificaron y se aislaron células de bazo.
Cosecha de células del bazo
Después de su disección bajo condiciones estériles, los bazos se transfirieron a tubos falcon que contienen PBS. Los
40 bazos se rompieron mecánicamente con fórceps y las suspensiones celulares se obtuvieron con un filtro celular (40 m). Los esplenocitos se lavaron con PBS centrifugado y se resuspendieron en una solución reguladora hipotónica para la lisis de los eritrocitos. Después de 5 min de incubación a RT, la reacción se detuvo adicionando 20-30 ml de medio o PBS. Las células del bazo se centrifugaron y lavaron dos veces con PBS.
Clasificación de célula única de células T CD8+ específicas del antígeno después de la tinción con CD137
45 Para la restimulación específica de antígeno se sembraron células de bazo de 2.5x106/pozo de ratones A2.1/DR1 inmunizados en una placa de 24 pozos y se pulsaron con una mezcla de péptidos solapados que codifican el antígeno de interés o un antígeno control. Después de 24 h se cosecharon las células de incubación, se tiñeron con un anticuerpo anti-CD3 conjugado con FITC, un anticuerpo anti-CD4 conjugado con PE, un anticuerpo anti-CD8 conjugado con PerCP-Cy5.5 y un anticuerpo anti-CD137 conjugado con Dylight-649. La clasificación se realizó en un citómetro de flujo
50 BD FACS Aria (BD Biosciences). Se clasificaron las células positivas para CD137, CD3 y CD8 o CD4, se cosechó una célula por pozo en una placa de fondo en V de 96 pozos (Greiner Bio-One) que contiene células CCD-1079Sk humanas como células alimentadoras, se centrifugaron a 4ºC y se almacena inmediatamente a -80ºC.
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Extracción de ARN, síntesis de ADNc basada en SMART y amplificación inespecífica de células clasificadas
El ARN de células T clasificadas se extrajo con el Kit RNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se utilizó un protocolo BD SMART modificado para la síntesis de ADNc: se combinó la transcriptasa inversa BD PowerScript (BD Clontech, Mountain View, CA) con un cebador oligo(dT)-T largo para imprimación de la reacción de síntesis de primera cadena y TS-short (Eurogentec SA, Seraing, Bélgica), introduciendo una secuencia oligo(riboG) para permitir la creación de una plantilla extendida mediante la actividad transferasa terminal de la transcriptasa inversa y para el cambio de plantilla (Matz, M. et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1558-1560). El ADNc de primera cadena sintetizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante se sometió a 21 ciclos de amplificación con 5 U de Polimerasa de ADN PfuUltra Hotstart High-Fidelity (Stratagene, La Jolla, CA) y cebador 0.48 M de cebador TS-PCR en presencia de dNTP 200 M (condiciones de ciclo: 2 min a 95ºC, durante 30 s a 94ºC, 30 s a 65ºC, 1 min a 72ºC para una extensión final de 6 min a 72ºC). Se controló la amplificación exitosa de los genes de TCR con cebadores específicos de región TCR- específica de la región murina o humana y se realizaron solo PCR de V/V humanos o murinos consecutivos si se detectaron bandas fuertes.
Se sintetizó ADNc de primera cadena para la amplificación de secuencias de HLA de clase I o II con cebador de SuperScriptII transcriptasa inversa (Invitrogen) y Oligo(dT) con 1-5 g de ARN extraído de PBMC derivadas de pacientes.
Diseño de cebadores de PCR para la amplificación de TCR y HLA
Para el diseño de cebadores de consenso TCR humanos, todos los genes 67 TCR-V y 54 TCR-V (marcos de lectura abierta y pseudogenes) como se enumeran en la base de datos ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org).) Junto con sus secuencias líderes correspondientes se alinearon con el editor de alineación de secuencia BioEdit (por ejemplo, http://www.bio-soft.net). Se diseñaron cebadores hacia adelante de 24 a 27 pb de longitud con un máximo de 3 bases degeneradas, un contenido de GC entre 40-60% y un G o C en el extremo 3’ se diseñaron para hibridar a tantas secuencias de líder como sea posible y se equipan con una extensión 5' de 15 pb que presenta un sitio de enzimas de restricción raro y la secuencia de Kozak. Los cebadores inversos se diseñaron para hibridar a los primeros exones de los genes de región constante, con el cebador TRACex1_as uniéndose a secuencias correspondientes a los aminoácidos 7 a 16 de C y TRBCex1_as a aminoácidos (aa) 8 a 16 en C1y C2. Ambos oligonucleótidos se sintetizaron con un fosfato 5’. Los cebadores se empaquetaron en piscinas de 2-5 oligos directos con temperatura de hibridación idéntica.
Esta estrategia se repitió para el diseño de cebadores de consenso de TCR murinos, alineando 129 TCR-V enumerados y 35 genes TCR-V enumerados. Los cebadores inversos mTRACex1_as y mTRBCex1_as son homólogos a secuencias correspondientes a aa 24 a 31 y 8 a 15, respectivamente.
Los cebadores de consenso de HLA se diseñaron alineando todas las secuencias de HLA clase I y II enumeradas en Anthony Nolan Research Institute website (www.anthonynolan.com) con el editor de alineación de secuencias BioEdit. Los cebadores hacia adelante de 23 a 27 pb de longitud con un máximo de 3 bases degeneradas, pero que conservan el código de hibridación tanto como sea posible las secuencias HLA de un locus fueron equipados con una 5'-fosfato y extensión de la secuencia de Kozak. Los cebadores inversos se diseñaron de forma análoga, pero sin introducción de bases oscilantes y equipados con una extensión 5’ de 14 pb que codifica un sitio de enzima de restricción AsiSI.
Amplificación por PCR y clonación de las secuencias V(D)J y HLA
Se sometieron 3-6 l de ADNc preamplificado de células T aisladas a 40 ciclos de PCR en presencia de 0.6 M de mezcla de oligo específico para V/V, 0.6 M de C o C-oligo, 200 M de dNTP Y 5 U Pfu de polimerasa (condiciones de ciclación: 2 min a 95ºC, 30 s a 94ºC, 30 s, temperatura de hibridación, 1 min a 72ºC, tiempo de extensión final de 6 min a 72ºC). Los productos de PCR se analizaron usando el sistema de electroforesis capilar de Qiagen. Las muestras con bandas de 400-500 pb se fraccionaron por tamaño en geles de agarosa, se extirparon las bandas y se purificaron usando un kit de extracción de gel (Qiagen, Hilden, Alemania). El análisis de secuencias se realizó para revelar la secuencia tanto del dominio V(D)J como de la región constante , como cebador TRBCex1_as y mTRBCex1_as, respectivamente, coinciden con ambos genes 1y 2 de región constante TCR en humanos y ratón, respectivamente. El ADN se digirió y se clonó en los vectores IVT que contienen el esqueleto apropiado para una cadena / de TCR completa.
Las secuencias de HLA se amplificaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 2.5 U de Pfu de polimerasa a partir de ADNc específico del donante usando cebadores específicos sentido y antisentido de HLA clase I o II. Como la transcripción de los genes DRB3 es al menos cinco veces menor que la de los genes DRB1 (Berdoz, J. et al. (1987)
J. Immunol. 139, 1336-1341), la amplificación de los genes DRB3 se llevó a cabo en dos etapas usando un enfoque de PCR anidado. Los fragmentos de PCR se purificaron, se digirieron con AsiSI y se clonaron en el vector IVT digerido con EcoRV y AsiSI. Los sitios EciI o SapI dentro de los insertos fueron mutados utilizando kits de mutagénesis de sitio dirigida QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA).
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Análisis de citometría de flujo
La expresión de la superficie celular de los genes TCR transfectados se analizó por citometría de flujo utilizando anticuerpo anti-TCR conjugado con PE contra la familia de la región variable apropiada o la región constante de la cadena  TCR (Beckman Coulter Inc., Fullerton, EE.UU.) y anticuerpos anti-CD8/-CD4 marcados con FITC/APC (BD
5 Biosciences). Los antígenos HLA se detectaron mediante tinción con anticuerpos específicos de HLA clase II marcados con FITC (Beckman Coulter Inc., Fullerton, USA) y anticuerpos específicos de HLA clase II marcados con PE (BD Biosciences). El análisis de citometría de flujo se realizó en un citómetro de flujo analítico FACS Calibur utilizando el software Cellquest-Pro (BD Biosciences).
Ensayo de citotoxicidad por luciferasa
10 Para la evaluación de la citotoxicidad mediada por células, se estableció un ensayo basado en bioluminiscencia como una alternativa y optimización para la liberación de 51Cr. En contraste con el ensayo estándar de liberación de cromo, este ensayo mide la actividad lítica de las células efectoras calculando el número de células diana que expresan luciferasa viables después de la coincubación. Las células diana se transfectaron estable o transitoriamente con el gen de luciferasa que codifica la luciferasa de la luciérnaga de la luciérnaga Photinus pyralis (EC 1.13.12.7). La luciferasa es
15 una enzima que cataliza la oxidación de la luciferina. La reacción es dependiente de ATP y tiene lugar en dos etapas:
luciferina + ATP → adenilato de luciferilo + PPi
adenilato de luciferilo + O2 → oxiluciferina + AMP + luz
Las células diana se sembraron en placas a una concentración de 104 células por pozo en placas blancas de 96 pozos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) y se cocultivaron con un número variable de células T transfectadas con TCR en un
20 volumen final de 100 l. Se adicionaron a las células 3 h más tarde 50 l de una mezcla de reacción que contiene D-Luciferina (BD Biosciences) (Luciferina (1 g/l), solución reguladora HEPES (50 mM, pH), Adenosina 5'-trifosfatasa (ATPasa, 0.4 mU/l, Sigma -Aldrich, St. Louis, EE.UU.). Mediante la adición de la ATPasa a la mezcla de reacción, se redujo la luminiscencia resultante de la luciferasa liberada de las células muertas.
Después de un tiempo de incubación total de 4 h, se midió la bioluminiscencia emitida por células viables usando el
25 lector Tecan Infinite 200 (Tecan, Crailsheim, Alemania). La actividad de eliminación de células se calculó con respecto a los valores de luminiscencia obtenidos después de la lisis celular completa inducida por la adición de Triton-X 100 al 2% y en relación con la luminiscencia emitida por las células diana solas. La producción de datos se realizó en cuenta por segundo (CPS) y el porcentaje de lisis específica se calculó como sigue:
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30 Se evaluó la luminiscencia máxima (conteos máximos por segundo, CPSmax) después de la incubación de células diana sin efectores y se evaluó una luminiscencia mínima (CPSmin) después del tratamiento de dianas con detergente Triton-X-100 para lisis completa.
ELISPOT (Ensayo inmunoSPOT ligado a enzimas)
Las placas de microtitulación (Millipore, Bedford, MA, USA) se recubrieron durante la noche a temperatura ambiente con
35 un anticuerpo anti-IFN 1-Dlk (Mabtech, Estocolmo, Suecia) y se bloquearon con albúmina humana al 2% (CSL Behring, Marburg, Alemania). Se sembraron en placas 2-5x104/pozo de células estimuladoras presentadoras a antígenos por triplicado junto con 0.3-3x105/pozo de células efectoras CD4+ o CD8+ transfectadas con TCR de 24 h después de la electroporación. Las placas se incubaron durante la noche (37ºC, 5% de CO2), se lavaron con PBS al 0.05% de Tween 20 y se incubaron durante 2 horas con el anti-IFN biotinilado mAB 7-B6-1 (Mabtech) a una concentración final de 1
40 g/ml a 37ºC. Se adicionó a los pozos peroxidasa H de rábano picante ligada a avidina (Vectastain Elite Kit, Vector Laboratories, Burlingame, EE.UU.), se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y se desarrolló con 3-amino-9etilcarbazol (Sigma, Deisenhofen, Alemania).
Ejemplo 2: Aislamiento de los TCR específicos para el antígeno viral CMV-pp65
El protocolo de aislamiento/validación de TCR (Figura 2) se estableció utilizando el citomegalovirus humano (CMV)
45 fosfoproteína 65 (CMV-pp65, pp65, fosfoproteína de matriz inferior de 65kDa, UL83) como antígeno modelo, que es conocido por inducir altas frecuencias de células T específicas de antígeno en la sangre periférica de donantes sanos.
El CMV es un -herpesvirus omnipresente que infecta al huésped a través de fluidos corporales tales como sangre o saliva. En individuos sanos, la infección primaria por CMV y la reactivación de virus latentes endógenos está controlada por el sistema inmunológico, mientras que, en individuos inmunocomprometidos, tales como receptores de trasplante o
50 pacientes con AIDS, resulta en morbilidad y mortalidad significativas.
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La proteína de tegumento viral pp65 es uno de los objetivos principales de linfocitos T citotóxicos específicos de CMV, que están presentes en altas frecuencias en la sangre periférica de individuos seropositivos no inmunocomprometidos (Kern, F. et al. (1999), J. Virol. 73, 8179-8184; Wills, M.R. et al. (1996), J. Virol. 70, 7569-7579; Laughlin-Taylor, E. et al. (1994), J. Med. Virol. 43, 103-110). Se aislaron células T CD8+ secretoras de IFN específicas de CMV-pp65 de un donante sano seropositivo mediante citometría de flujo después de una semana de expansión específica de antígeno y reexposición con DC autólogas transfectadas con ARN de IVT que codifican el antígeno pp65 completo (Figura 2 parte superior, Figura 3).
Las regiones variables / de TCR se amplificaron a partir de células T únicas usando un conjunto de oligonucleótidos parcialmente degenerados, específicos de secuencia. Los productos de amplificación se clonaron dirigidos al sitio en vectores que contienen las regiones constantes / de TCR proporcionando plantillas de longitud completa para la transcripción in vitro instantánea (Figura 2 parte central).
Para la verificación de la expresión de la superficie celular se transfirieron ARN / de TCR en células SupT1 que de otro modo carecían de expresión de cadenas endógenas de TCR y se analizaron por citometría de flujo (Figura 4).
Para la validación funcional de los TCR clonados, se transfectó la línea de células T monospecíficas IVSB que reconoce el epítopo derivado de tirosinasa Tyr368-376 (Wölfel T. et al. (1994), Eur. J. Immunol 24, 759-64) con ARN de TCR y se analizó la secreción de citoquinas específicas en respuesta al antígeno pp65 por IFN-ELISPOT (Figura 2 en la parte inferior, Figura 5). Cuando los TCR se generaron por estimulación con antígeno completo, se evaluaron para mediar el reconocimiento específico de DC autólogas ya sea pulsadas con mezcla de péptidos pp65 o pp65 codificando ARN de IVT. Se usó una mezcla de péptidos de TPTE no relacionado como control. TCRCD8-CMV#1 y TCRCD8-CMV#4, ambas células diana que expresan pp65 específicamente reconocidas en comparación con un TCR control aislado de un donante seronegativo para CMV.
Para determinar el elemento restrictivo de HLA, se analizaron células IVSB transfectadas con TCRCD8-CMV#1 para la secreción de IFN específica después de cocultivo con células K562 pulsadas con péptidos que expresan alelos HLA seleccionados del paciente (Figura 6 parte superior). HLA B*3501 se identificó como elemento de restricción. El análisis de 15-mers individuales de la mezcla de péptidos pp65 reveló el reconocimiento de los péptidos P30, P31 y P32, con la reactividad disminuyendo gradualmente (Figura 6 parte inferior). Esto localizó el epítopo reconocido por TCRCD8-CMV#1 dentro de la región de los aminoácidos 117-131 de pp65, lo que sugiere su identidad con el epítopo restringido de HLAB*3501-restrito anteriormente reportado y altamente inmunogénico CMV-pp65123-131 (Seq. IPSINVHHY) (Gavin, M.A. et al. (1993), J. Immunol. 151, 3971-3980).
Después de un aislamiento exitoso de TCR de células T CD8+ específicas de pp65 expandidas in vitro a una alta frecuencia, el protocolo de aislamiento de TCR se aplicó a células T clasificadas ex vivo presentes con frecuencias más bajas.
Se estimularon células T CD8+ purificadas magnéticamente a partir de PBMC de un donante positivo HLA A*0201 con células diana autólogas pulsadas con el epítopo inmunodominante restringido de HLA A*0201, pp65495-503 y las células T secretoras activadas de IFN se clasificaron por citometría de flujo.
Se analizó la especificidad de los TCR obtenidos ex vivo a partir de las células T CD8+ después de la presensibilización con pp65495-503 en un ensayo IFN-ELISPOT. Como se muestra en la figura 7, cuatro de los seis TCR fueron capaces de redirigir las células IVSB para reconocer las células K562-A*0201 pulsadas con pp65495-503 en comparación con un péptido de control. Por el contrario, las células IVSB equipadas con un TCR control aislado de un donante seronegativo para CMV no secretaron IFN sobre cocultivo con células K562-A*0201 pulsadas con pp65495-503.
Con el fin de demostrar que los TCR específicos de pp65 clonados son también capaces de mediar la función efectora citolítica, se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa utilizando células IVSB transfectadas con TCRCD8-CMV#1 o TCRCD8-CMV#14.
Se comparó la muerte específica de células diana apropiadas (células K562-B*3501 pulsadas con células pp65117-131 y K562-A*0201 pulsadas con péptido pp65495-503, respectivamente) con la muerte de células K562-A*0201 pulsadas con Tyr368-376 mediadas por el TCR endógeno de los efectores IVSB (Figura 8).
La titulación de la proporción efector-objetivo (E:T) confirmó que las células diana pulsadas con el péptido pp65 apropiado se lisaron específicamente mediante células IVSB transfectadas con TCR. Hasta el 85% de las células diana se mataron por células IVSB transfectadas con TCRCD8-CMV#1 y TCRCD8-CMV#14, respectivamente. Sorprendentemente, los TCR recombinantes mediaron la lisis igualmente eficaz como el TCR natural en una amplia gama de proporciones E:T.
En resumen, se aislaron 13 TCR específicos de hCMV-pp65 a partir de células T CD4+ y CD8+ obtenidas de cuatro diferentes donantes seropositivos de CMV, ya sea ex vivo o después de la expansión específica del antígeno, como se muestra en la tabla 1.
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Ejemplo 3 Aislamiento de los TCR específicos para el antígeno tumoral NY-ESO-1
Después de estudios de prueba de concepto usando CMV-pp65 como un antígeno de modelo viral generando altas frecuencias de células T específicas de antígeno, se evaluó la capacidad de nuestro enfoque para clonar TCR de poblaciones de células T específicas de antígeno tumoral de baja abundancia. Las frecuencias de células T
5 preexistentes contra las autoproteínas asociadas a tumores son generalmente mucho más bajas que las frecuencias de células T provocadas por virus persistentes. Para la aplicación de nuestro método a la configuración del tumor se recurrió al antígeno tumoral altamente inmunogénico NY-ESO-1.
NY-ESO-1 es un antígeno de cáncer/testículo expresado en tejidos adultos normales únicamente en las células germinales testiculares. NYESO-1 (sinónimos: CTG. CTAG, CTAG1, ESO1, LAGE-2, LAGE2, LAGE2A, LAGE2B, 10 OTTHUMP00000026025, OTTHUMP00000026042) es uno de los antígenos de cáncer de testículo mejor caracterizados identificados por SEREX (Chen, Y.T. et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1914-1918), que se expresa en una variedad de neoplasmas malignos, incluyendo melanomas, esófago, mama, próstata, tracto urinario, cáncer de ovario y pulmón (Chen, Y.T. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1914-1918; Jungbluth, A.A. et al. (2001) Int. J. Cancer 92, 856-860; Schultz-Thater, E. et al. (2000) Br. J. Cancer 83, 204-208). Debido a su inmunogenicidad natural es 15 favorecido como antígeno modelo para las estrategias de vacunación tumoral. NY-ESO-1 frecuentemente provoca respuestas de anticuerpos de alto título en pacientes que portan tumores que expresan NY-ESO-1 y se demostró que las respuestas de autoanticuerpos frente a NY-ESO-1 están frecuentemente asociadas con la presencia de células T CD8+ y CD4+ específicas de antígeno (Zeng, G. et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 3964-3969; Jager, E. et al. (1998), J. Exp. Med. 187, 265-270; Gnjatic, S. et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 8862-8867; Valmori, D.
20 et al. (2007), Clin. Immunol. 122, 163-172).
Se seleccionó un paciente con NSCLC basado en su reactividad de autoanticuerpos contra NY-ESO-1, pulsó sus PBMC en masa con mezcla de péptidos NY-ESO-1 y se expandió durante una semana. Después de la exposición a las DC transfectados con ARN NY-ESO-1 autólogas, se clasificaron células T CD8+ que secretan IFN y se clonaron los TCR de células únicas. La validación de los TCR identificados para el reconocimiento específico de las células diana que
25 expresan NY-ESO-1 mediante el ensayo IFNELISPOT dio como resultado siete TCR específicos de NY-ESO-1 funcionales obtenidos de este paciente. Como se muestra en la figura 9, los TCR reconocieron a las DC pulsadas con mezcla de péptidos NY-ESO-1 o transfectados con ARN NY-ESO-1, confirmando este último el reconocimiento de un epítopo naturalmente procesado.
Las restricciones de HLA de los TCR específicos de NY-ESO-1 se determinaron mediante IFN-ELISPOT utilizando los
30 efectores de IVSB transfectados con TCR cocultivados con células K562 que expresan alelos HLA de clase I individuales del paciente y pulsadas con mezcla de péptidos NY-ESO-1. Un resultado representativo se muestra en la figura 10.
Para la cartografía de epítopos, las células T de IVSB se transfectaron con TCR específico de NY-ESO-1 y se cocultivaron con células K562 que expresan el antígeno HLA apropiado pulsado con péptidos 15mer individuales
35 solapados que abarcaban la proteína NY-ESO-1. La reactividad de células T transfectadas con TCR frente a los péptidos NY-ESO-1 se ensayó en ensayos IFN-ELISPOT (Figura 11).
Sorprendentemente, los epítopos de los siete TCR se localizaron en los aminoácidos 85-111 de la proteína NY-ESO-1 (Figura 11, 12). Se sabe que esta región experimenta una escisión proteosómica eficiente debido a secuencias hidrófobas y se procesa en múltiples epítopos con diversas restricciones de HLA (Valmori, D. et al. (2007), Clin.
40 Immunol. 122, 163-172). Mediante la selección de nonameros en serie, se redujo el epítopo restringido HLA-B*3508 de TCRCD8-NY#5, #6, #8 y #15 NY-ESO-192-100 (seq. LAMPFATPM) (Figura 12).
Con el fin de demostrar que los TCR específicos de NY-ESO-1 aislados a partir de células T CD8+ son capaces de mediar las funciones efectoras citolíticas, se analizaron células IVSB transgénicas de TCR para la muerte específica de células K562-A*6801 pulsadas con péptido. Como se muestra en la figura 13, los efectores IVSB fueron reprogramados
45 por TCRCD8-NY#2 para lisar específicamente células diana a diferentes proporciones E:T.
La validación de TCR aislados de células T CD4+ de otros dos pacientes con NSCLC seropositivos dio como resultado la clonación de 9 TCRs funcionales independientes específicos de NY-ESO-1. La determinación de los elementos de restricción (figura 14) y el confinamiento de las localizaciones de los epítopos (Figura 15) revelaron que 7 de estos epítopos reconocidos por TCR en un tramo de péptido que comprende aa 117-147 en el contexto de diferentes
50 alelotipos HLA de clase II, sugiriendo un punto caliente para epítopos de células T auxiliares (Tabla 5).
Hasta la fecha, se clonaron 16 TCR específico de NY-ESO-1 a partir de CD4+ y CD8+ derivados de tres pacientes con NSCLC diferentes y se caracterizaron con respecto a la restricción de HLA y la especificidad del péptido (Tabla 2).
Ejemplo 4: Aislamiento de TCR específicos para el antígeno tumoral TPTE
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TPTE (fosfatasa transmembrana con homología de Tensin, sinónimos: CT44, PTEN2, EC 3.1.3.48, OTTHUMP00000082790), es una fosfatasa lipídica específica de células de esperma que se transcribe aberrantemente en muchos cánceres humanos (Chen, H. et al. (1999), Hum. Genet. 105, 399-409; Dong, X.Y. et al. (2003), Br. J. Cancer 89, 291-297; Singh, A.P. et al. (2008), Cancer Lett. 259, 28-38), pero se sabe poco sobre su inmunogenicidad y las respuestas de células T no se han informado hasta el momento.
Con el fin de aislar TCR específicos de TPTE, se seleccionaron 3 pacientes con NSCLC que mostraban valores de absorbancia significativos en la preselección por CrELISA para la expansión específica de antígeno y clasificación por citometría de flujo de células T CD8+ y CD4+ específicas de TPTE.
Los TCR aislados de células T CD8+ se validaron para el reconocimiento de células diana que expresan TPTE y se caracterizaron con respecto a la restricción de HLA y la especificidad de epítopo como se muestra de forma de ejemplo para TCRCD8TPT#3 en la figura 16. Se mostró que este TCR reprogramaba células IVSB para reconocimiento específico de péptidos TPTE presentadores de células K562 en HLA B*3501 (Figura 16 parte superior). El epítopo restringido por HLA-B*3501 podía localizarse en TPTE 15-mers P130, P131 y P132, con mayor reactividad al péptido P131 que representaba los aminoácidos 521-535 de TPTE (figura 16 parte central). Mediante el análisis de nonameros en serie que cubren esta región, se podría definir el nuevo epítopo TPTE527-535 (seq. YPSDFAVEI), que cumple con los requisitos de un motivo de unión B*3501 con prolina como residuo de anclaje en la posición 2, ácido aspártico como un residuo cargado en la posición 4 e isoleucina como un aminoácido hidrófobo en la posición 9 (Falk, K. et al. (1993), Immunogenetics 38, 161-162) (Figure 16 parte inferior).
Análogamente, los TCR aislados de células T CD4+ se validaron para el reconocimiento específico de células K562 que expresan TPTE y alelos individuales de HLA clase II del donante (Figura 17). Después de la determinación de TCR específico de TPTE de restricciones HLA fueron analizados para el reconocimiento de péptidos 15mer TPTE con el fin de localizar los epítopos reconocidos (Figura 18].
Hasta el momento se identificaron un total de 31 TCR reactivos a TPTE funcionales, de los cuales dos se derivan de células CD8+ y 29 se derivan de células T CD4+ de tres pacientes NSCLC diferentes (Tabla 3). La cartografía fina de los epítopos mediante el uso de células diana K562 que expresan el alelo HLA pulsado de un solo péptido, describe que los epítopos estaban distribuidos por toda la secuencia de la proteína TPTE (Tabla 5).
Ejemplo 5: Aislamiento de TCR específicos de PLAC1 de alta afinidad de células T de ratones A2.1/DR1 inmunizados
El gen específico de trofoblasto PLAC1 (PLACenta-specific 1, sinónimos: OTTHUMP00000024066, antígeno de cáncer/ testículo 92) es un nuevo miembro de genes placentarios asociados al cáncer (Koslowski M. et al. (2007), Cancer Research 67, 9528-34). PLAC1 se expresa ectópicamente en una amplia gama de tumores malignos humanos, más frecuentemente en cáncer de mama, y está esencialmente involucrado en la proliferación, migración e invasión de células cancerosas.
Para obtener TCRs específicos para PLAC1, se cambia la fuente de células T específicas de antígeno. Como los TCR aislados del repertorio natural de pacientes con cáncer son usualmente de baja afinidad debido a mecanismos de tolerancia central, se aplicó un enfoque alternativo que evita la tolerancia para generar células T de alta afinidad específicas para PLAC1. Las células T de ratones transgénicos HLA A2.1/DR1 (Pajot A. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) se imprimieron in vivo contra el antígeno PLAC1 humano mediante inmunización intranodal repetitiva usando ARN de IVT codificante de PLAC1 (Kreiter S. et al. (2010), Cancer Research 70, 9031-40). Las células de bazo obtenidas de estos ratones se reiniciaron con péptidos solapados de PLAC1, después de la detección y aislamiento de células T específicas de antígeno basadas en su regulación positiva inducida por la activación de CD137 (Figura 19). En particular, en los cinco ratones un porcentaje significativo de PLAC1 células T específicas (que van desde 16-48% de las células CD8+) se pudo establecer por inmunización intranodal con ARN de IVT PLAC1.
Para la validación de TCR clonados de células T CD8+ murinas, se analizaron células IVSB modificadas genéticamente con TCR para determinar la secreción específica de citoquinas en respuesta a células K562-A*0201 pulsadas con péptido PLAC1 por IFN-ELISPOT (Figura 20). Se demostró que un total de 11 TCR median el reconocimiento específico de células K562-A*0201 pulsadas con péptidos derivados de PLAC1 en comparación con un antígeno control. Sorprendentemente, la secreción de IFN mediada por los TCR específicos de PLAC1 fue incluso mayor en comparación con los mediados por el TCR endógeno de los efectores de IVSB. La cartografía de epítopos mediante el uso de células diana K562 que expresan el alelo HLA pulsado de péptido único, reveló que todos los TCR específicos de PLAC1 identificados reconocen los péptidos 15mer 7 y 8 que representan el aminoácido 25-43 de PLAC1 (Figura 21). Por selección de nonameros serie que cubre esta región, se identificaron dos epítopos restringidos de HLA-A*0201: PLAC1 aminoácidos 28-36 y aminoácidos 30-41, con mejor reconocimiento de los aminoácidos 31-39 (Figura 22, Tabla 5). De forma notable, todos los TCR específicos de PLAC1 obtenidos a partir de 4 ratones diferentes mostraron reconocer estos dos epítopos indicando procesión preferente de estos péptidos PLAC1, así como unión y presentación eficaces en HLA A*0201. Todos los TCR mediaron aumento de la secreción de IFN en respuesta a los aminoácidos 3139 en comparación con los aminoácidos 28-36. Este último fue reconocido adecuadamente por algunos de los TCR solamente.
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Por clonación de 11 TCRs específicos de PLAC1 (Tabla 4) e identificación de dos epítopos PLAC1 inmunodominantes presentes en HLA A*0201 (Tabla 5) podríamos mostrar que las células T de ratones A2/DR1 cebados in vivo por vacunación intranodal con el ARN IVT que codifica el antígeno son explotables como fuente para el aislamiento de TCR.
Conclusión
5 Hemos sido capaces de establecer una tecnología de plataforma versátil para clonación eficiente y rápida caracterización de TCR inmunológicamente relevantes de pequeñas poblaciones de células T específicas de antígeno sin necesidad de generación de clones o líneas de células T y conocimiento previo de elementos de restricción o epítopos de células T.
El uso de nuestro método de aislamiento/validación de TCR para antígenos virales y tumorales dio como resultado el
10 descubrimiento de más de 70 TCR específicos de antígenos (Tabla 1, 2, 3, 4), de los cuales más de la mitad estaban dirigidos contra nuevos HLA presentes en epítopos (Tabla 5).
De forma notable, a partir de donantes individuales se han clonado en paralelo varias especificidades de TCR derivadas de linfocitos T CD8+ así como CD4+ y se ha demostrado que reprograman los efectores de células T para el reconocimiento del antígeno respectivo.
15 Este enfoque permite la generación de una gran biblioteca de TCRs de manera oportuna para uso "listo para usar" llenando la brecha entre la disponibilidad de una gran cantidad de estructuras diana y el número pequeño de candidatos de TCR apropiados para las aproximaciones de la terapia específica del antígeno en el campo del cáncer, la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas.
Tablas
20 Tabla 1: TCR específico de hCMV pp65
Designación
Cadena alfaa de TCR cadena betaa de TCR restricciónb de clase I/II HLA Región reconocida
TCRCD8-CMV#1
V1.2 J24_2 C V3.1 D2 J2.1 C2 B*3501 aa 117-139, mejor 117131
TCR CD8-CNW#4
V3 J43 C V6.5 D1 J1.2 C1 A*0201 aa 495-503
TCR CD8-CMV#8
V22 J58 C V10.1 D J1.4 C1 A*0201 aa 495-503
TCR CD8-CMV#9
V19 J26 C V 13 D2 J2.1 C2 pendiente pendiente
TCR CD8-CMV#10
V24 J49 C V6.5 D1 J1.2 C1 A*0201 aa 495-503
TCR CD8-CMV#11
V16 J36 C V25.1 D1 J2.2 C2 A*0201 aa 495-503
TCR CD8-CMV#12
V39 J58 C V9 D2 J2.2 C2 A*0201 aa 495-503
TCR CD8-CMV#14
V24 J21 C V3.1 D2 J2.2 C2 A*0201 aa 495-503
TCR CD8-CMV#15
V12.3 J43 C V12.4 D1 J1.4 C1° A*0201 aa 495-503
TCR CD8-CMV#16
V13.1 2 J50 C V25.1 J1.3 Cl A*0201 aa 495-503
TCRCD4-CMV#1
V21 J43 C V3.1 D1 J1.1 C1 DRB1*0701 aa 117-139
TCR CD4-CMV#3
V8.6_2 J37_2.C V6.1 D1 J1.2 C1 DRB1*0701 aa 337-359
TCR CD4-CMV#5
V22 J49 C V6.2 D2 J2.3 C2d DRB1*0701 aa 337-359
Tabla 2: TCR específico de NY-ESO-1 Tabla 3: TCR específico de TPTE Tabla 4: TCR específico de PLAC1 Tabla 5: Epítopos de células T derivados de los antígenos hCMV pp65, NY-ESO-I, TPTE, PLAC1
Designación
Cadena TCR alfaa de Cadena betaa de TCR Restricciónb clase I/II HLA de Región reconocida
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TCRCD8-NY#2
V3 J28 C V20.1 2 J2.3 C2 A*6801 aa 93-107
TCR CD8-NY#5
V24 J3 C V7.6 D2 J2.2 C2 B*3508 aa 92-100
TCR CD8-NY#6
V17_J47_2 C V12.3 D2 J2.1 C2 B*3508 aa 92-100
TCR CD8-NY#8
V8.6_2_J9 C V28.1 D1 J1.1 C1 B*3508 aa 92-100
TCR CD8-NY#12
V1.1 J23 C V4.1 D2 J2.1 C2 B*0702 aa 97-111
TCR CD8-NY#13
V5 J33 C V5.5_2 D1 J2.5 C2 A*6801 aa 93-107
TCR CD8-NY#15
V12.2_2 J53 C V4.1 D2 J2.5 C2 B*3508 aa 92-100
TCRCD4-NY#1
V22_J20 C V9 D1 J1.1 C1 DRB1*0401 aa 165-180
TCR CD4-NY#3
V12.3_J54 C V11.2 D2 J2.2 C2 DRB1*0401 aa 117-139
TCR CD4-NY#5
V8.4_3_J48 C V4.1D1 J1.5 C1 DRB1*1101 aa 117-139
TCR CD4-NY#7
V8.6_2J13_2 C V20.1 D2 J2.5 C2 DRB1*1101 DRB1*1601 aa 117-139
TCR CD4-NY#10
V9.2 3 J42 C V7.9 3 D2 J2.7 C2 DRB5*0202 aa 85-99
TCR CD4-NY#11
V8.1 J23 C V11.2 D1 J1.2 C1 DRB1*1101 aa 117-139
TCR CD4-NY#13
V21 2 J24 2 C V7.9 3 D1 J2.3 C2 DRB5*0202 aa 129-147
TCR CD4-NY#16
V8.4_3 J10 C V20.1 D1 J1.5 C1 DRB3 *0201 aa 117-139
TCRCD4-NY#14
V8.4_3 J37_2 C V3.1 D2 J1.3 C1 DRB3 *0201 aa 121-135
Designación
Cadena alfaa de TCR Cadena betaa de TCR Restricciónb de clase I/II HLA Región reconocida
TCRCD8-TPT#3
V27 J16 C V7.9 D2 J2.2 C2 B*3501 aa 527-535
TCRCD8-TPT#35
V19 J17 C V6.2/V6.3 D1 J1.2 C1d B*0702 aa 188-196
TCR CD4-TPT#4
V14/DV4 J48 C V29.1 D1 J1.2 C1 DRB4*0101 aa 405-423
TCR CD4-TPT#5
V38.2/DV8 J40 C V4.2 D2 J2.7 C2 DRB1*1401 aa 417-435
TCR CD4-TPT#6
V12.3 J35 C V5.4 D1 J1.3 C1 DRB1*1401 aa 53-71
TCR CD4-TPT#8
V38.1 J45 C V3.1 D1 J2.7 C2 DRB3*0201/2 aa 181-195
TCR CD4-TPT#11
V17 J27 C V6.6 2 D1 J2.3 C2 DRB1*0701 aa 109-127
TCR CD4-TPT#13
V20_2 J29 C V 19 D2 J2.1 C2 DRB1*1401 aa 497-515
TCR CD4-TPT#17
V29/DV5 J49 C V7.2 D1 J2.7 C2 DRB5*0202 aa 177-195
TCR CD4-TPT#27
V13.1_2 J45 C V19 D1 J1.1 C1 DRB3*0301 aa 181-195
TCR CD4-TPT#33
V29/DV5 J42 C V24.1 D2 J2.1 C2 DRB5*0202 aa 217-231
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TCR CD4-TPT#38
V39 J18 C V5.5 2 D1 J1.4 C1 DRB1*1601 aa 277-291
TCR CD4-TPT#42
V25 J10 C V7.8 D2 J2.7 C2 DRB1*1301 aa 269-283
TCR CD4-TPT#45
V 13.2 J23 C V20.1 D1 J1.2 C1 DRB1*1501 aa 413-427
TCR CD4-TPT#48
V8.3 J43 C V28 D1 J1.1 C1 DRB1*1501 aa 173-187
TCR CD4-TPT#49
V38.1 J49 C V19 D2 J2.2 C2 DRB1*1501 aa 393-411
TCR CD4-TPT#51
V13.1_2 J53 C V14 D1 J1.1 C1 DRB1*1301 aa 217-231
TCR CD4-TPT#52
V8.3 J54 C V6.1 D2 J2.7 C2 DRB1*1501 aa 117-135
TCR CD4-TPT#54g
V9.2 J23 C V20.1 D1 J1.1 C1 DQB1*0602/03; DQA*0102/03 aa 53-67 aa 77-91 aa 245-259
TCR CD4-TPT#55
V38.2/DV8 J34 C V5.1 J2.1 C2 DRB1*1301 aa 177-195
TCR CD4-TPT#57
V8.1 J27 C V5.1 D2 J2.7 C2 DRB1*1501 aa 81-95
TCR CD4-TPT#59
V39 J49 C V7.9_3 D2 J2.4 C2 DRB1*1301 aa 141-155
TCR CD4-TPT#67
V12.3 J9 C V5.1 D2 J2.7 C2 DRB1*1501 aa 173-187
TCR CD4-TPT#76
V8.3 J57 C V19 D2_2 J2.7 C2 DQA1*0102/DQB1*0602 DQA1*0103/DQB1*0602 DQA1*0103/DQB1*0603 aa 453-467
TCR CD4-TPT#77
V14/DV4_3 J50 C V20.1 D2 J2.2 C2 DRB1*1301 aa 417-435
TCR CD4-TPT#78
V8.6_2 J21 C V2 D1 J1.6_2 C1 DRB1*1301 aa 221-235
TCR CD4-TPT#79g
V38.2/DV8 J39 C V5.1 D2 J2.1 C2 DRB1*1501 aa 149-163 aa 157-171 aa 173-187
TCR CD4-TPT#82
V38.2/DV8 J39 C V19 DI J2.7 C2 DRB1*1301 aa 409-423
TCR CD4-TPT#87
V39 J31 C V5.1 J2.6 C2 DRB1*1301 aa 177-195
TCR CD4-TPT#91
V20_2 J53 C V6.1 D1 J2.7 C2 DRB1*1501 aa 173 -187
TCR CD4-TPT#9g
V23/DV6 J49 C V3.1 D1 J1.2 C1 DRB1*0701 aa 121-135 aa 145-159
Designación
Cadena alfaa TCR de Cadena betaa TCR de Restricciónb clase I/II HLA de Región reconocida
TCRCD8-mP1#2
V6D.6_5 J33 C V2 D1 J1.3 C1 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
imagen32
TCR CD8-mP1#8
V9D.1 J12 Ce V5 D2 J2.1 C2 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
TCR CD8-mP1#9
V4D.4_2 J44 C V2 D2 J2.7 C2 A*0201 aa 25-43
TCR CD8-mP1#11
V6D.6_2 2 J9_2 C V2 D1 J1.3 C1 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
TCR CD8-mP1#12
V4D.4_2 J27 C V30 D1 J2.2 C2 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
TCR CD8-mP1#14
V9D.1_2 J12 C V5 D1 J1.1 C1 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
TCR CD8-mP1#17
V14.1 J31 Cf V 13.2 D2 J2.1 C2 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
TCR CD8-mP1#19
V6D.3 J22 C V13.3 D1 J1.6 C1 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
TCR CD8-mP1#20
V12.3_3 J38 C V5 D2 J1.1 C1 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
TCR CD8-mP1#22
V13D.2 J34_2 C V20 D1 J2.1 C2 A*0201 aa 28-36, 30-41, mejor 3139
TCR CD8-mP1#25
V8.1_3 J21 C V31 D2 J2.1 C2 A*0201 aa 25-43
"Designaciones de los genes TCR V(D)J de acuerdo con la nomenclatura IMGT; Ejemplo: Vß7.9 es el noveno gen del subgrupo 7 del gen V, mientras que V7.9_3 es el tercer alelo del gen 9 del subgrupo 7. Los alelos son sólo especificados por un subrayado, si difieren del alelo 1. bDesignaciones de los alelos HLA comienzan con HLA-y el nombre del locus, luego * y un número de dígitos que especifican el alelo. Los dos primeros dígitos especifican un grupo de alelos. Los dígitos de la tercera a la cuarta especifican un alelo sinónimo. Los dígitos cinco a seis indican cualquier mutación sinónima dentro del marco de codificación del gen. Los séptimos y octavos dígitos distinguen mutaciones fuera de la región codificante c El gen beta de TCR es V12.4_1 o V12.4_2 d El gen beta de TCR es V6.2 o V6.3 e El gen TCR alfa es V9D.1_1 o V9D.1_2 f El gen tCR alfa es J31_1 o J31_2 g TCR promiscuos que reconocen más de un epítopo aa = aminoácidos
Antígeno
Epítopo Secuencia de aminoácidos Restricción de HLA clase I/II SEQ ID NO:
aa 117-139, mejor 117131
PLKMLNIPSINVHHYPSAAERKH B*3501 108
hCMV pp65
aa 495-503 NLVPMVATV A*0201 109
aa 117-139
PLKMLNIPSINVHHYPSAAERKH DRB1*0701 108
aa 337-359
VELRQYDPVAALFFFDIDLLLQR DRB1*0701 110
imagen33
NY-ESO-I
aa 92-100 LAM+PFATPM B*3508 111
aa 93-107
AMPFATPMEAELARR A*6801 112
aa 97-111
ATPMEAELARRSLAQ B*0702 113
aa 85-99
SRLLEFYLAMPFATP DRB5*0202 114
aa 117-139
PVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTA DRB1*0401 115
aa 117-139
PVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTA DRB1*1101 115
aa 117-139
PVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTA DRB1*1601 115
aa 117-139
PVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTA DRB3*0201 115
aa 129-147
SGNILTIRLTAADHRQLQL DRB5*0202 116
aa 165-180
CFLPVFLAQPPSGQRR DRB1*0401 117
aa 121-135
VLLKEFTVSGNILTI DRB3*0201 175
TPTE aa
aa 185-199 RNIPRWTHLLRLLRL B*0702 118
aa 527-535
YPSDFAVEI B*3501 119
aa 53-71
SPISESVLARLSKFEVEDA DRB1*1401 120
aa 81-95
IKKIVHSIVSSFAFG DRB1*1501 121
aa 109-127
ILADLIFTDSKLYIPLEYR DRB1*0701 122
aa 117-135
DSKLYIPLEYRSISLAIAL DRB1*1501 123
aa 141-155
VLLRVFVERRQQYFS DRB1*1301 124
aa 173-187
DVVYIFFDIKLLRNI DRB1*1501 125
aa 177-191
IFFDIKLLRNIPRWT DRB1*1501 126
aa 177-195
IFFDIKLLRNIPRWTHLLR DRB1*1301 127
aa 177-195
IFFDIKLLRNIPRWTHLLR DRB5*0202 127
aa 181-195
IKLLRNIPRWTHLLR DRB3*0201/2 128
aa 181-195
IKLLRNIPRWTHLLR DRB3*0301 128
aa 217-231
KLIRRRVSENKRRYT DRB1*1301 129
aa 217-231
KLIRRRVSENKRRYT DRB5*0202 129
aa 221-235
RRVSENKRRYTRDGF DRB1*1301 130
aa 269-283
RFLDKKHRNHYRVYN DRB1*1301 131
aa 277-291
NHYRVYNLCSERAYD DRB1*1601 132
aa 393-411
YVAYFAQVKHLYNWNLPPR DRB1*1501 133
aa 405-423
NWNLPPRRILFIKHFIIYS DRB4*0101 134
imagen34
aa 409-423
PPRRILFIKHFIIYS DRB1*1301 135
aa 413-427
ILFIKHFIIYSIPRY DRB1*1501 136
aa 417-435
KHFIIYSIPRYVRDLKIQI DRB1*1301 137
aa 417-435
KHFIIYSIPRYVRDLKIQI DRB1*1401 137
aa 453-467
VLDNITTDKILIDVF DQA1*0102/B1*0602 138
aa 453-467
VLDNITTDKILIDVF DQA1*0103/B1*0602 138
aa 453-467
VLDNITTDKILIDVF DQA1*0103/B1*0603 138
aa 497-515
WLHTSFIENNRLYLPKNEL DRB1*1401 139
aa 102-110
VLLDVTLIL A*0201 178
aa 164-172
AIIVILLLV A*0201 179
aa 188-196
PRWTHLLRL B*0702 180
aa 53-67
SPISESVLARLSKFE DQA1*0102/DQB1*0 602 181
aa 77-91
YDSKIKKIVHSIVSS DQA1*0102/DQB1*0 602 182
aa 121-135
YIPLEYRSISLAIAL DRB1*0701 183
aa 145-159
VFVERRQQYFSDLFN DRB1*0701 184
aa 149-163
RRQQYFSDLFNILDT DRB1*1501 185
aa 157-171
LFNILDTAIIVILLL DRB1*1501 186
aa 245-259
RIIAMSFPSSGRQSF DQA1*0102/DQB1*0 187
PLAC1
aa 28-36 VLCSIDWFM A*0201 172
aa 30-41, mejor 31-39
CSIDWFMVTVHP A*0201 173
aa 25-43
PMTVLCSIDWFMVTVHPFM A*0201 196
A continuación, se muestran las secuencias receptoras de células T obtenidas. Las secuencias subrayadas son las secuencias del CDR, en las que la primera secuencia en cada cadena de receptores de células T es CDR1, seguida por CDR2 y CDR3.
1. Receptores de células T específicos de hCMV pp65 TCRCD8-CMV#1: SEQ ID NO:4; >V1.2 J24_2 C (V->A)
imagen35
SEQ ID NO:5; >V3.1 D2 J2.1 C2 (C->T)
imagen36
TCRCD8-CMV#4: SEQ ID NO:6; >V3 J43 C
imagen37
SEQ ID NO:7; >V6.5 D1 J1.2 C1 (S->R)
imagen38
TCRCD8-CMV#8: SEQ ID NO:8; >V22 J58 C
imagen39
10 SEQ ID NO:9; >V10.1 D J1.4 C1
imagen40
TCRCD8-CMV#9: SEQ ID NO:10; >V19 J26 C
imagen41
15 SEQ ID NO:11; >V13 D2 J2.1 C2 (MLSLPDSAWN->MG)
imagen42
TCR CD8-CMV#10: SEQ ID NO:12; >V 24 J49 C
imagen43
SEQ ID NO:13; >V6.5 D1 J1.2 C1
imagen44
TCR CD8-CMV#11: SEQ ID NO:14; >V16 J36 C
imagen45
10 SEQ ID NO:15; >V25.1 D1 J2.2 C2 (T->G; M->G)
imagen46
TCR CD8-CMV#12: SEQ ID NO:16; >V39 J58 C
imagen47
imagen48
SEQ ID NO:17; >V9 D2 J2.2 C2 (F->T)
imagen49
TCR CD8-CMV#14: SEQ ID NO:18; >V 24 J21 C
imagen50
SEQ ID NO:19; >V3.1 D2 J2.2 C2 (C->T)
imagen51
TCRCD8-CMV#15: SEQ ID NO:20; >V12.3 J43 C
imagen52
SEQ ID NO:21; >V12.4 D1 J1.4 C1
imagen53
TCR CD8-CMV#16: SEQ ID NO:22; >V13.1_2 J50 C
imagen54
SEQ ID NO:23; >V25.1 J1.3 C1 (TI->GT)
imagen55
TCRCD4-CMV#1: SEQ ID NO:24; >V21 J43 C
imagen56
SEQ ID NO:25; >V 
imagen57
10 TCRCD4-CMV#3: SEQ ID NO:26; >V8.6_2 J37_2 C
imagen58
SEQ ID NO:27; >V6.1 D1 J1.2 C1 (I->L)
imagen59
imagen60
TCRCD4-CMV#5: SEQ ID NO:28; >V22 J49 C
imagen61
 6.2 D2 J2.3 C2 (G->A)
imagen62
2. Receptores de células T específicos de NY-ESO-I TCR CD8-NY#2: SEQ ID NO:30; >V3 J28 C
imagen63
10 SEQ ID NO:31; >V20.1_2 J2.3 C2
imagen64
TCRCD8-NY#5: SEQ ID NO:32; >V24 J3 C
imagen65
15 SEQ ID NO:33; >V7.6 D2 J2.2 C2 (S->R)
imagen66
TCRCD8-NY#6: SEQ ID NO:34; >V17 J47_2C
imagen67
SEQ ID NO:35; >V12.3 D2 J2.1 C2 (F->L)
imagen68
TCR -NY#8: SEQ ID NO:36; >V8.6_2 J9 C (A->V)
imagen69
10 SEQ ID NO:37; >V28.1 D1 J1.1 C1
imagen70
TCRCD8-NY#12: SEQ ID NO:38; >V1.1 J23 C
imagen71
SEQ ID NO:39; >V4.1 D2 J2.1 C2 (C->S)
imagen72
TCRCD8-NY#13: SEQ ID NO:40; >V5 J33 C
imagen73
SEQ ID NO:41; >V5.5_2 D1 J2.5 C2 (PG->TR; C->F)
imagen74
TCRCD8 : 10 SEQ ID NO:42; >V12.2_2 J53 C (K->I)
imagen75
SEQ ID NO:43; >V4.1 D2 J2.5 C2 (C->S)
imagen76
imagen77
TCRCD4-NY#1: SEQ ID NO:44; >V22 J20 C (Donante SNP N->K)
imagen78
SEQ ID NO:45; >V9 D1 J1.1 C1 (F->T)
imagen79
TCRCD4-NY#3: SEQ ID NO:46; >V 12.3 J54 C
imagen80
SEQ ID NO:47; >V11.2 D2 J2.2 C2
imagen81
TCRCD4-NY#5: SEQ ID NO: 140; >V8.4_3 J48 C
imagen82
SEQ ID NO: 141; >V4.1 D1 J1.5 C1 (GCKL→SNQV)
imagen83
TCRCD4-NY#7: SEQ ID NO:142; >Va8.6_2 J13_2 C
imagen84
SEQ ID NO: 143; >V20.1 D2 J2.5 C2
imagen85
TCRCD4-NY#10: SEQ ID NO: 144; >V9.2_3 J42 C
imagen86
10  7.9_3 D2 J2.7 C2 (S→R)
imagen87
TCRcD4-NY11: SEQ ID NO: 146; >V8.1 J23 C
imagen88
imagen89
SEQ ID NO: 147; >V11.2 D1 J1.2 C1
imagen90
TCRCD4-NY#13: SEQ ID NO: 148; >V21_2 J24_2 C
imagen91
SEQ ID NO: 149; >V7.9_3 D1 J2.3 C2 (S→R)
imagen92
TCRCD4-NY#16:  8.4_3 J10 C
imagen93
SEQ ID NO: 151; >V20.1 D1 J1.5 C1
imagen94
TCRCD4-NY#14: SEQ ID NO: 176; >V8.4_3 J37 2 C
imagen95
SEQ ID NO: 177; >V3.1 D2 J1.3 C1
imagen96
3. Receptores de células T específicos de TPTE: TCR CD8-TPT#3: SEQ ID NO:48; >V27 J16 C
imagen97
SEQ ID NO:49; >V7.9 D2 J2.2 C2
imagen98
10 TCR CD8-TPT#35: SEQ ID NO:50; >V 19 J17 C
imagen99
SEQ ID NO:51; >V12.4 D2 J2.7 C2 (L->F)
imagen100
15 TCRCD4-TPT#4:
imagen101
SEQ ID NO:52; >V14/DV4 J48 C
imagen102
SEQ ID NO:53; >V29.1 D1 J1.2 C1
imagen103
TCRCD4-TPT#5: SEQ ID NO:54; >V38.2/DV8 J40 C
imagen104
SEQ ID NO:55; >V4.2 D2 J2.7 C2 (GCRL->SNQV)
imagen105
10 TCRCD4-TPT#6: SEQ ID NO:56; >V12.3 J35 C
imagen106
SEQ ID NO:57; >V 
imagen107
TCRCD4-TPT#8: SEQ ID NO:58; >V38.1 J45 C
imagen108
SEQ ID NO:59; >V3.1 D1 J2.7 C2 (C->T)
imagen109
TCRCD4-TPT#11: SEQ ID NO:60; >V17 J27 C
imagen110
10 SEQ ID NO:61; >V 
imagen111
TCRCD4-TPT#13: SEQ ID NO:62; >V20_2 J29 C
imagen112
SEQ ID NO:63; >V19 D2 J2.1 C2
imagen113
TCRCD4-TPT#17: SEQ ID NO:64; >V29/DV5 J49 C
imagen114
SEQ ID NO:65; >V7.2 D1 J2.7 C2
imagen115
TCRCD4-TPT#27: 10 SEQ ID NO:66; >V13.1_2 J45 C (Donante SNP N->K)
imagen116
SEQ ID NO:67; >V 19 D1 J1.1 C1
imagen117
TCRCD4-TPT#33:
imagen118
SEQ ID NO:68; >V29/DV5 J42 C (Donante SNP N->K)
imagen119
SEQ ID NO:69; >V24.1 D2 J2.1 C2
imagen120
TCRCD4-TPT#38: SEQ ID NO:70; >V39 J18 C (Donante SNP N->K)
imagen121
SEQ ID NO:71; >V5.5_2 D1 J1.4 C1 (PG->TR)
imagen122
10 TCRCD4-TPT#42: SEQ ID NO:72; > V25 J10 C
imagen123
SEQ ID NO:73; > V 7.8 D2 J2.7 C2 (GTR->DIW; L->V)
imagen124
15 TCRCD4-TPT#45: SEQ ID NO:74; > V13.2 J23 C
imagen125
imagen126
SEQ ID NO:75; > V20.1 D1 J1.2 C1 (ISLLLPGSLAG faltantes después de GPG)
imagen127
TCRCD4-TPT#48: SEQ ID NO:76; > V38.2/DV8 J42 C
imagen128
SEQ ID NO:77; > V28 D1 J1.1 C1
imagen129
10 TCRCD4-TPT#49: SEQ ID NO:78; > V38.1 J49 C
imagen130
SEQ ID NO:79; > V19 D2 J2.2 C2
imagen131
imagen132
TCRCD4-TPT#51: SEQ ID NO:80; > V13.1_2 J53 C
imagen133
SEQ ID NO:81; >V14 D1 J1.1 C1
imagen134
TCRCD4-TPT#52: SEQ ID NO:82; > V8.3 J54 C (MA adicional)
imagen135
SEQ ID NO:83; > V6.1 D2 J2.7 C2 (I->L)
imagen136
TCRCD4-TPT#54: SEQ ID NO:84; > V9.2 J23 C
imagen137
SEQ ID NO:85; > V 20.1 D1 J1.1 C1 (ISLLLPGSLAG faltantes después de GPG)
imagen138
TCRCD4-TPT#55: SEQ ID NO:86; > V38.2/DV8 J34 C
imagen139
SEQ ID NO:87; > V5.1 J2.1 C2
imagen140
TCRCD4-TPT#57: SEQ ID NO:88; > VaS.l J27 C
imagen141
10 SEQ ID NO:89; > V5.1 D2 J2.7 C2
imagen142
TCRCD4-TPT#59: SEQ ID NO:90; > V39 J49 C
imagen143
imagen144
SEQ ID NO:91; > V7.9 3 D2 J2.4 C2 (S->R)
imagen145
TCRCD4-TPT#67: SEQ ID NO:92; > V12.3 J9 C
imagen146
SEQ ID NO:93; > V5.1 D2 J2.7 C2
imagen147
TCRCD4-TPT#76: SEQ ID NO:94; > V8.3 J57 C
imagen148
SEQ ID NO:95; > V 19 D2_2 J2.7 C2
imagen149
TCRCD4-TPT#77: SEQ ID NO:96; > V14/DV4_3 J50 C
imagen150
SEQ ID NO:97; > V20.1 D2 J2.2 C2 (ISLLLPGSLAG está descartada después de GPG)
imagen151
TCRCD4-TPT#78: SEQ ID NO:98; > V8.6_2 J21 C
imagen152
SEQ ID NO:99; > V2 D1 J1.6_2 C1 (L->I)
imagen153
TCRCD4-TPT#79: 10 SEQ ID NO: 100: > Va38.2/DV8 J39 C
imagen154
SEQ ID N0:101: > V5.1 D2 J2.1 C2
imagen155
TCRCD4-TPT#82:
imagen156
SEQ ID NO:102; > V38.2/DV8 J39 C
imagen157
SEQ ID NO:103; > V19 D1 J2.7 C2
imagen158
TCRCD4-TPT#87: SEQ ID NO:104; > V39J31 C
imagen159
SEQ ID NO:105; > V5.1 J2.6 C2
imagen160
10 TCRCD4-TPT#91: SEQ ID NO:106; > V20_2 J53 C
imagen161
SEQ ID NO:107; > V 6.1 D1 J2.7 C2 (I->L)
imagen162
15 TCR CD8-TPT#35/2: SEQ ID NO:188; >V19 J17 C
imagen163
SEQ ID NO:189; >V6.2 o V6.3 D1 J1.2 C1 (A →V)
imagen164
TCRCD4-TPT#9: SEQ ID NO:190; >V23/DV6 J49 C
imagen165
SEQ ID NO:191; >V3.1 D1 J1.2 C1 (C→T)
imagen166
TCRCD4-TPT#48/2: 10 SEQ ID NO:192; >V8.3 J43 C (E →V)
imagen167
SEQ ID NO:193; >V28 D1 J1.1 C1
imagen168
4. Receptores de células T específicos de PLAC1
imagen169
TCR CD8-mPL#2:
SEQ ID NO:152; >V6D.6_5 J33 C (DFS o DSS →NSF)
imagen170
SEQ ID NO:153; >V2 D1 J1.3 C1
imagen171
TCRCD8-mPL#8: SEQ ID NO:154; >V9D.1_1 o V9D.1_2 J12 C (L→F)
imagen172
SEQ ID NO:155; >V5 D2 J2.1 C2
imagen173
TCRCD8-mPL#9: SEQ ID NO:156; >V4D.4_2 J44 C (Q→E)
imagen174
SEQ ID NO:157; >V2 D2 J2.7 C2
imagen175
imagen176
TCRCD8-mPL#11: SEQ ID NO:158; >V6D.6_2 J9_2 C (DF→NS)
imagen177
SEQ ID NO:159; >V2 D1 J1.3 C1
imagen178
TCRCD8-mPL#12: SEQ ID NO:160; >V4D.4_2 J27 C (Q→E)
imagen179
SEQ ID NO:161; >V30 D1 J2.2 C2
imagen180
TCRCD8-mPL#14: SEQ ID NO:162; >V9D.1_2 J12 C
imagen181
SEQ ID NO:163; >V5 D1 J1.1 C1
imagen182
TCRCD8-mPL#17: SEQ ID NO:164; >V14.1 J31_1 oder_2 C
imagen183
SEQ ID NO:165; >V13.2 D2 J2.1 C2
imagen184
TCRCD8-mPL#19: SEQ ID NO:166; >V6D.3 J22 C
imagen185
10 SEQ ID NO:167; >V13.3 D1 J1.6 C1
imagen186
TCRCD8-mPL#20: SEQ ID NO:168; >V12.3_3 J38 C
imagen187

Claims (2)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un método para proporcionar células linfoides específicas de antígeno que comprende las etapas:
    (a) proporcionar una única célula T reactiva al antígeno a partir de una muestra que comprende células T, en la que
    dicha muestra se obtiene de un sujeto previamente expuesto a dicho antígeno y en el que dicha única célula T reactiva 5 al antígeno se aísla de la muestra que comprende células T usando citometría de flujo;
    (b)
    proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno; y
    (c)
    introducir dicho ácido nucleico en una célula linfoide para proporcionar dichas células linfoides específicas de antígeno.
    10 2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico es ARN.
  2. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha etapa de proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que tiene la especificidad del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno comprende proporcionar un ácido nucleico que codifica un receptor de células T, que comprende al menos las secuencias CDR, preferiblemente al menos, la región variable del receptor de células T de dicha única célula T reactiva al antígeno.
    15 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho sujeto es seropositivo para dicho antígeno
    o un agente que comprende dicho antígeno.
    276
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